コラーゲン線維ゲルおよびその用途
【課題】細胞の牽引力により収縮しない細胞培養用コラーゲン線維ゲルの提供。
【解決手段】コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にあるコラーゲン分子間が架橋されているコラーゲン線維ゲルは、細胞培養用の培地として有用であり、細胞培養用容器と一体に成形することで容易に細胞培養基材を製造することができる。このようなコラーゲン線維ゲルは、ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、ｐＨ１〜５のコラーゲン水溶液および水溶性カルボジイミドを混合し、線維化途上に架橋が導入される方法で製造することができる。コラーゲンとしては水溶液での変性温度が２５℃を超える魚皮由来コラーゲンが望ましい。
【解決手段】コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にあるコラーゲン分子間が架橋されているコラーゲン線維ゲルは、細胞培養用の培地として有用であり、細胞培養用容器と一体に成形することで容易に細胞培養基材を製造することができる。このようなコラーゲン線維ゲルは、ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、ｐＨ１〜５のコラーゲン水溶液および水溶性カルボジイミドを混合し、線維化途上に架橋が導入される方法で製造することができる。コラーゲンとしては水溶液での変性温度が２５℃を超える魚皮由来コラーゲンが望ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養基材として用いられるコラーゲン線維ゲルに関する。さらに詳しくいえば、コラーゲン線維を架橋してなり、接着・増殖した細胞の牽引力によって収縮しない硬さを持つコラーゲン線維ゲル、およびそのコラーゲン線維ゲルを用いた動物移植用培養基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、少なくとも部分的に螺旋構造（コラーゲン螺旋）を有するタンパク質または糖タンパク質として定義される。３本のポリペプチド鎖から形成される３重螺旋で、分子量１０万程度の各ポリペプチド鎖にはグリシン残基が３個目ごとに、またその他のアミノ酸残基としてプロリン残基、ヒドロキシプロリン残基が高頻度に現れる。コラーゲンは無脊椎動物あるいは脊椎動物の組織、特に皮膚から多く抽出することができる。コラーゲン分子には構造の違いによって１９種類の型の存在が報告されており、さらに同じ型に分類されるコラーゲンにも数種類の異なる分子種が存在する場合がある。
【０００３】
中でも、Ｉ、II、III型およびIV型コラーゲンが主にバイオマテリアルの原料として用いられている。Ｉ型はほとんどの結合組織に存在し、細胞外マトリックスを構成する。生体内で最も量の多いコラーゲン型である。特に腱、真皮および骨に多く、工業的にはコラーゲンはこれらの部位から抽出される場合が多い。II型は軟骨を形成するコラーゲンである。III型は少量ではあるがＩ型と同様の部位に存在することが多い。IV型は基底膜を形成するコラーゲンである。Ｉ、IIおよびIII型はコラーゲン線維として生体内に存在し、主に組織あるいは器官の強度を保つ役割をはたしている。ＩＶ型は線維形成能力を有しないが、４分子で構成される網目状会合体を形成し、基底膜における細胞分化に関与しているとされる。本明細書において、以下コラーゲンという呼称はＩ、II、III型あるいはそれら２種類以上の混合物を示すこととする。
【０００４】
コラーゲン線維は上記コラーゲン分子が自己組織化したナノサイズのファイバー状構造体であり、コラーゲン分子が直列かつ並列にパッキングされた特有の線維構造を有する。工業的には酸、アルカリ、あるいはタンパク質分解酵素を用いて組織内コラーゲン線維から可溶化されたコラーゲンが製造される。
【０００５】
可溶性コラーゲンは、コラーゲン分子が数分子以下の集合体にまで微細化されていて、水あるいは塩水溶液に溶解して均一な透明溶液を形成する。一度可溶化されたコラーゲン分子は条件次第で試験管内でコラーゲン線維を再形成することが知られている。この現象は線維化（fibril formationあるいはfibrillation）と呼ばれ、その性質についてはBiochemical Journal, 316, p1-11 (1996)（非特許文献１）に詳細に記載されている。
【０００６】
コラーゲンに熱を加えるとコラーゲンの三重螺旋構造がほぐれ、それぞれのポリペプチド鎖がランダムコイル状の熱変性物を与える。そのような構造変化を起こす温度は変性温度と呼ばれ、熱変性物はゼラチンと呼ばれる。ゼラチンはコラーゲンに比べ水溶性が高い他に、生体内プロテアーゼに対する感受性が高いことが知られている。溶媒の条件によってはゼラチンがコラーゲン螺旋構造を部分的に回復することが知られている。ゼラチンはコラーゲン線維形成能を失っているが、部分的にコラーゲン螺旋構造を回復させることでコラーゲン線維形成能を回復できることが知られている。
コラーゲンの変性温度は溶液状態の時に最も低くなる。また、コラーゲンは一般に生物原料から得られるが、生物から得たコラーゲンの変性温度はその生物の生活環境温度と密接に関係していると言われる。水溶液でのコラーゲンの変性温度は、哺乳類では３８℃前後であるが、魚類はおおむね哺乳類よりも低く、特に鮭等の寒流系の魚類では２０℃を下回る場合もある。
【０００７】
コラーゲンは細胞外マトリックスの主成分であり、細胞接着基質として機能する。生体内に埋植しても異物として認識されず、分解・吸収され、最終的には消失する。このため、細胞培養基材や医療用具、最近ではティッシュエンジニアリングの足場材料として広く利用されている。特に、近年の幹細胞生物学の急速な発展と再生医療への期待から、細胞培養基材としてのコラーゲンの有用性が見直されつつある。
【０００８】
コラーゲン培養基材としては、可溶性コラーゲンをコーティングしたディッシュ、可溶性コラーゲンを化学架橋剤で固化させたゲル、および線維化による物理ゲルを作製するための可溶性コラーゲンの水溶液が開発されている。
【０００９】
コラーゲンコートディッシュは乾燥しているため取り扱いが容易であるが、次に示すような幾つかの難点がある。
１）生体内コラーゲンが持つ線維構造を持っていない。
２）コーティング層がディッシュに密着しているため、細胞移植用の基材としての利用が難しい。
３）コーティング層が薄く緻密なため、水溶性物質を含浸させることが難しい。
【００１０】
可溶性コラーゲンを化学架橋剤で固化させたゲルについては、例えばコラーゲン溶液に化学架橋剤を混合してゲル化させた眼科用コラーゲンゲル成形物（特開平１１−１９７２３４号公報（特許文献１））、グリコサミノグリカンとコラーゲンの混合溶液を水溶性カルボジイミドで架橋した組織再生マトリックス用ゲル（特開２００２−８０５０１号公報（特許文献２））などが開示されている。これらコラーゲンゲルは細胞と一体化させて取り扱うことができ、ゲル内に水溶性物質を含浸させることが容易である。しかし、コラーゲンコートディッシュ生体内コラーゲンが持つ線維構造を持っていないため、生体内類似環境を提供する細胞培養基材としては必ずしも好ましくない。
【００１１】
一方、コラーゲン線維からなるゲルは、細胞外マトリックスと極めて類似したコラーゲン構造を持つ。酸性のコラーゲン水溶液と中性の緩衝液を混合し、モノメリックなコラーゲンを線維へと自己組織化させる方法（榎並ら,「コラーゲン・ゲル培養法（Ｉ）」,組織培養,13(1), 26-30, 1987（非特許文献２）、Journal of Agricultural Food Chemistry, 48, p.2028-2032 (2000)（非特許文献３））により作製される。得られるゲルはコラーゲン線維の絡み合いからなる物理ゲルであり、機械的強度が低く、細胞が基材に与える牽引力により収縮するという問題があった。ゲルが収縮すると、基材の物理的性質と細胞密度が変化するため、細胞の特性に及ぼす基材の硬さの影響や細胞の増殖性などを定量的に把握することが困難になる。また、コラーゲン線維が緻密になりゲルの透明性が失われるため、光学顕微鏡による細胞の観察が困難になる。
【００１２】
本発明者らは、コラーゲンの線維化途上に線維間の架橋反応を起こすコラーゲン線維ゲルの作製方法を開発し、従来の方法では困難であったコラーゲン線維ゲルの強度の大幅な向上を達成した（特許第４０６４４３５号（特許文献３））。しかし、細胞培養に用いた場合、細胞の種類によっては、細胞増殖による牽引力の増加によりゲルが収縮する場合があった。
【００１３】
本発明者らは、細胞の牽引力に対する抵抗性はゲルの弾性率で決まり、弾性率がコラーゲン濃度とともに増加することを見出した。更に前記問題点を改善すべく鋭意研究を重ねた結果、コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にあるコラーゲン線維ゲルが細胞培養による収縮を起こさず、ゲルの硬さが均質であり、細胞培養基材および動物移植用細胞基材として極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平１１−１９７２３４号公報
【特許文献２】特開２００２−８０５０１号公報
【特許文献３】特許第４０６４４３５号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Biochemical Journal, 316, p1-11 (1996)
【非特許文献２】榎並ら,「コラーゲン・ゲル培養法（Ｉ）」,組織培養,13(1), 26-30, 1987
【非特許文献３】Journal of Agricultural Food Chemistry, 48, p.2028-2032 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、細胞の牽引力により収縮しない細胞培養用コラーゲン線維ゲル、およびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従来のコラーゲンゲルの製造方法では、コラーゲンゲルの硬さが不十分であり、細胞培養時に細胞の牽引力による収縮をきたし、細胞の特性に及ぼす基材の硬さの影響や細胞の増殖性などを定量的に把握することが困難になる。また、光学顕微鏡による細胞の観察が困難になる。
【００１８】
本発明者らは、前記問題点を改善すべく鋭意研究を重ねた結果、コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にあるコラーゲン線維ゲルが細胞培養による収縮を起こさず、ゲルの硬さが均質であり、細胞培養基材および動物移植用細胞基材として極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【００１９】
すなわち、本発明は下記のコラーゲン線維ゲル、およびその用途を提供する。
［１］コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にある、コラーゲン分子間が架橋されているコラーゲン線維ゲル。
［２］ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、ｐＨ１〜５のコラーゲン水溶液および水溶性カルボジイミドを混合し、線維化途上に架橋が導入される方法で作製された前記１に記載のコラーゲン線維ゲル。
［３］コラーゲンが魚皮由来であり、前記コラーゲン水溶液のコラーゲンの変性温度が２５℃を超えるものである前記２に記載のコラーゲン線維ゲル。
［４］前記１〜３のいずれかに記載のコラーゲン繊維ゲルを含む細胞培養用の培地。
［５］前記４に記載の培地と細胞培養用容器とを含む細胞培養基材。
［６］前記１〜３のいずれかに記載のコラーゲン線維ゲルおよび前記ゲルに一体化してなる培養細胞とを有する動物移植材料。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１のコラーゲン線維ゲル中のコラーゲン線維のＳＥＭ写真である。
【図２】細胞培養１０日目における実施例１、比較例１および比較例２のコラーゲン線維ゲルのサイズである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、コラーゲン濃度と弾性率を特定の範囲に調節することにより、細胞培養による収縮を起こさず、ゲルの硬さが均質であり、細胞培養基材および動物移植用細胞基材として極めて有用なコラーゲン線維ゲルを提供することを要旨とする。
【００２２】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその型について特に限定されるものではないが、工業的な利用という観点から、収量の多いＩ型コラーゲンあるいはそれを主成分とするコラーゲンが好ましい。
【００２３】
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその分子構造について特に限定されるものではない。コラーゲン分子の両末端に存在する非螺旋領域（テロペプチド）は抗原性を有するという報告がある。用途によっては除去されるべき場合があるが、線維化能を有する限りはテロペプチドが除去されていても除去されていなくても構わない。
【００２４】
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその変性について特に限定されるものではない。一度変性させたコラーゲンでも、部分的にコラーゲン螺旋構造を回復し、線維化能を回復することが知られている。本発明を達成するには、線維化能の観点から、螺旋率（％）が５０以上であることが好ましい。上記螺旋率（％）とはJournal of Food Chemistry, 60, p.1233 (1995)に記載されている螺旋回復率（％）と同義である。すなわち、旋光度計で測定した比旋光度より求めた螺旋回復率（％）のことを示す。
【００２５】
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその由来について特に限定されるものではないが、資源量およびコラーゲン収率の観点から脊椎動物の真皮に由来するコラーゲンが好ましく用いられる。中でも、ＢＳＥ等の病原体を保有する可能性が家畜よりも潜在的に低い魚皮コラーゲンが特に好ましく用いられる。
【００２６】
本発明に用いられるコラーゲンが魚皮コラーゲンの場合、その変性温度は２５℃以上でなければならない。変性温度が２５℃を下回ると、熱変性による収縮力が加わり、細胞の牽引力により収縮しやすくなる場合がある。
【００２７】
本発明におけるコラーゲンの変性温度とは、ゲル作製に用いる可溶性コラーゲンの水溶液の温度上昇による粘度変化から求められる。具体的には、可溶性コラーゲンの水溶液の温度を１０℃から５０℃まで段階的に上昇させて変性させ、粘度（単位：パスカル・秒）が１０℃における粘度の５％未満に達したときの温度を変性温度とする。粘度は回転粘度計もしくは動的粘弾性測定装置を用いて測定される。
【００２８】
本発明におけるコラーゲン線維とは、文献（Journal of Agricultural Food Chemistry, 48, p.2028-2032 (2000)）の走査型電子顕微鏡写真に示されているような糸状構造のことを意味する。
【００２９】
本発明のコラーゲン線維ゲルのコラーゲン濃度は０．２５％〜０．５３％の範囲である。コラーゲン濃度が０．２５％未満の場合、細胞の牽引力に抵抗する硬さを得ることが難しい。コラーゲン濃度が０．５３％以上の場合、ゲル作製に用いるコラーゲン水溶液の粘度が高いため、架橋剤や緩衝液との混合が不十分となりゲルの均質性が損なわれる。ゲルの硬さは幹細胞の分化に影響するため（Even-Ram et al., Cell, 126, 645-647 (2006)）、ゲルの硬さが不均一だと細胞培養基材として好ましくない。さらに好ましくは０．３０％を超えるコラーゲン濃度である。
【００３０】
本発明のコラーゲン線維ゲルの弾性率は６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲である。弾性率が６０ｋＰａ未満の場合、細胞の牽引力に抵抗することができなくなり、ゲルが収縮する場合がある。弾性率が１２０ｋＰａを超えるゲルを作製するためにはゲルのコラーゲン濃度を０．５％以上にする必要があり、上述の理由によりゲルの均質性が損なわれるため好ましくない。
【００３１】
本発明のコラーゲン線維ゲルの弾性率は、拘束下のゲルへの貫入試験により求める。具体的には、内径３５ｍｍのディッシュ（６ウェルプレートも可）に厚さ２〜４ｍｍで作製したゲルに内径５ｍｍの円柱状プローブを押し込み、得られた応力−ひずみ曲線の初期の直線領域の傾き（ひずみ０．０６未満）から求められる。
【００３２】
本発明のコラーゲン線維ゲルは、コラーゲン線維を構成しているコラーゲン分子間を架橋する方法により製造することができ、コラーゲン線維ゲルの弾性率を効果的に高められるという観点から、特許文献３に開示されているコラーゲンの線維化途上に架橋反応を起こす方法が好ましく用いられる。具体的方法としては、例えば、ｐＨ１〜５、好ましくはｐＨ３程度の、濃度３％以下のコラーゲン水溶液に、架橋剤を含有するｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７程度のリン酸ナトリウム緩衝液を、原料となるコラーゲンの変性温度以下の温度（例えば１０℃程度）で混合し、所定のコラーゲン濃度を有する溶液を得た後、静置等する方法が挙げられる。
【００３３】
コラーゲン水溶液は、例えば脊椎動物の真皮を原料として公知の酸抽出法により製造することができる。コラーゲン水溶液の濃度は、いったん沈殿もしくは乾燥させたコラーゲンを溶解する際のコラーゲン／溶媒の重量比により調節できる。コラーゲン濃度が３％を超えると粘度が高くなり、リン酸ナトリウム緩衝液との混合不十分により不均一なゲルが生じる場合があるので好ましくない。好ましい濃度は１％以下である。
架橋剤の濃度については、リン酸ナトリウム緩衝液中の濃度よりもむしろ、コラーゲン水溶液と混合した後の濃度（ゲル中の濃度）がゲル形成の成否やゲルの物性を左右する。コラーゲン線維ゲル中の架橋剤濃度は５〜８０ｍＭの範囲が好ましい。コラーゲン線維ゲル中の架橋剤濃度が５ｍＭ未満の場合、コラーゲン分子に架橋が導入されにくくなり、ゲルの弾性率が不足する場合があり好ましくない。一方、架橋剤濃度が８０ｍＭを超えると、コラーゲン水溶液とリン酸ナトリウム緩衝液混合後のゲル化速度が速過ぎて、成形性が悪化する場合があり好ましくない。より好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲である。
【００３４】
ゲル化速度が速過ぎて成形性が悪い場合、必要に応じて、線維化抑制剤として塩化ナトリウムなどの無機塩を添加することができる。添加する無機塩の濃度は、コラーゲン線維ゲル中の濃度として３０〜１５０ｍＭの範囲が好ましい。ゲル中の無機塩の濃度が３０ｍＭ未満の場合、コラーゲンの線維化が速すぎてコラーゲン線維ネットワークが発達せず、ゲルが弱くなる場合がある。ゲル中の無機塩の濃度が１５０ｍＭを超える場合、コラーゲン線維化が抑制され、ゲルが弱くなる場合がある。より好ましくは５０〜１３０ｍＭの範囲である。
【００３５】
コラーゲン線維ゲルの弾性率は、製造条件によって変更することが可能である。具体的にはコラーゲン濃度、架橋剤濃度、線維化抑制剤の濃度などを調整することにより弾性率を変更することができる。あるコラーゲン濃度から上記の方法により得られるコラーゲン線維ゲルの弾性率の最大値は、コラーゲン濃度にほぼ比例して増加する。一方で、あるコラーゲン濃度において、無機塩もしくは架橋剤の濃度を変えてコラーゲンの線維化速度を増減させることにより、コラーゲン線維ゲルの弾性率を調節することができる。
【００３６】
本発明のコラーゲン線維ゲルにおいて、コラーゲン分子間を架橋するために用いられる架橋剤は、タンパク質を架橋でき、水溶性を有するものであれば特に限定されるものではない。タンパク質の架橋剤については、文献（Biomaterials, 18, p.95-105 (1997)）に詳細に記載されている。中でも、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド系架橋剤、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミド系架橋剤、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのイソシアネート系架橋剤、エチレングリコールジエチルエーテルなどのポリエポキシ系架橋剤が経済性、安全性および操作性の観点から好ましく用いられる。特に、ＥＤＣ、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩などの水溶性カルボジイミドをｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液に溶かした溶液として使用することが好ましい。
【００３７】
本発明のコラーゲン線維ゲルを細胞培養の培地として用いることができる。本発明のゲルを細胞培養用容器内で成形することで、容器と一体化した培養基材とすることが好ましい。細胞培養用容器の種類については特に限定されないが、細胞培養用消耗品として広く用いられているプラスチック製のディッシュやプレートなどが好ましく用いられる。プラスチックとコラーゲンは親和性が低く、ガラス等に比べゲルを剥がしやすい。
【００３８】
本発明のコラーゲン線維ゲルに細胞を接着・増殖させ、あるいは必要に応じて分化させ、動物移植に用いることができる。培養細胞としては、例えば、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞、あるいは間葉系幹細胞などの体性幹細胞が挙げられる。本発明のコラーゲン線維ゲルと骨（コラーゲンを主成分とする）との生化学的類似性から、特に、間葉系幹細胞の一種である骨髄由来幹細胞の骨分化誘導に好ましく用いることができる。
本発明のコラーゲン線維ゲルは実質的にコラーゲンのみから成るため、既に実用化されているコラーゲン製創傷被覆材などと同様に生体に接触させても安全に用いることができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例と比較例を挙げてより具体的に説明するが、本発明は下記に記載範囲に限定されるものではない。
【００４０】
はじめに各種測定方法を示す。
１．コラーゲン線維の観察
以下の操作により、コラーゲン線維ゲル中のコラーゲン線維を観察した。コラーゲン線維ゲルを２．５％のグルタルアルデヒド水溶液に２４時間浸した後、２０、５０、７５、および９９（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液に各３０分ずつ順次浸し、コラーゲン線維ゲルを脱水した。これを酢酸イソペンチルに１５分ずつ２回浸した後、二酸化炭素による臨界点乾燥を行なった。乾燥したコラーゲン線維ゲルにイオンコーターを用いてタングステンを蒸着し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用試料とした。ＳＥＭ観察は日立製Ｓ−３２００Ｎを用いて、倍率１５，０００倍で行なった。
【００４１】
２．コラーゲン線維ゲルの弾性率の測定
以下の操作により、コラーゲンゲルのゲル強度を求めた。
細胞培養用６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ製）に、厚み２〜３ｍｍになるようにコラーゲン線維ゲルを作製した。強度試験機（ＴＡ．ＸＴｐｌｕｓ、英弘精機製）を用いて、ゲルに対して内径５ｍｍの円柱プローブを速度０．５ｍｍ／秒で押し込み、得られた応力−ひずみ曲線の初期の直線領域の傾き（ひずみ０．０６未満）から弾性率を求めた。測定は６個のゲルについて行なった。
【００４２】
３．コラーゲン線維ゲル上での細胞培養と収縮の定量
ｗｅｌｌの内径が２２ｍｍの１２ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ製）に厚みが２〜３ｍｍになるように作製したコラーゲン線維ゲルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、ラット骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を播種した。３７℃、５％ＣＯ2条件下α−ＭＥＭ（１５％ウシ胎児血清含有）で２日間培養した後、アスコルビン酸、β−グリセロフォスフェイト、デキサメタゾンをα−ＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清含有）に添加し骨分化誘導を行った（ＤＥＸ＋）。非分化誘導群にはデキサメタゾンを加えない以外は上記組成と同じ培地を使用した（ＤＥＸ−）。細胞を播種しなかったゲル（Ｂｌａｎｋ）は、α−ＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清含有）を使用した。３日毎に培地交換を行い、１０日間培養を行った。培養１０日目のコラーゲン線維ゲルを回収し、内径を測定した。
【００４３】
実施例１：
１．テラピアの皮からの可溶性コラーゲンの製造
（１）コラーゲンの抽出
原料の魚皮として、鱗と身が除去され、天日で乾燥されたテラピア（日本名イズミダイ）の皮を用いた。クロロホルムとメタノールを等容積混合した溶液０．７Ｌに、魚皮１００ｇを１２時間浸漬して脱脂した。この操作を再度行った後、魚皮を７０％エタノール０．７Ｌで５回繰り返し洗浄し、流水で６時間洗浄してエタノールを除去した。脱脂した魚皮を１０℃の０．５Ｍ酢酸１．２Ｌに浸漬し、３日間静置した。膨潤した魚皮をナイロンメッシュでろ過し、ろ液を１０，０００×ｇで３０分遠心して不溶物を沈殿させ、上清をメンブランフィルターでろ過し、ろ液１．０Ｌを回収した。
（２）コラーゲンの精製
上記コラーゲン溶液１．０Ｌに対し、終濃度０．７Ｍになるように塩化ナトリウムを加え、２４時間撹拌した。塩析により生じた白い不溶物を１０，０００×ｇで３０分遠心して沈殿を回収し、沈殿を０．５Ｍ酢酸１Ｌに加え、撹拌して溶解した。この操作を３回繰り返して、無色透明なコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液を、セルロースチューブを用いて精製水とｐＨ３希塩酸に対して透析し、濃度０．９％のコラーゲン水溶液を得た。得られたコラーゲンの変性温度は３６℃であった。
【００４４】
２．コラーゲンゲルの作製
２１０ｍＭの塩化ナトリウムを含有したｐＨ７、３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を溶媒として、３５ｍＭのＥＤＣ水溶液を調製し、１０℃に冷却した。このＥＤＣ水溶液５ｍＬと、同じく１０℃に冷却した０．８％のコラーゲン水溶液１０ｍＬを混合し、６ｗｅｌｌおよび１２ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ製）に、深さ２〜３ｍｍになるように流し込み、室温で１時間静置し、ゲル化を完了させた。ゲルを１０℃の冷蔵庫に静置し、２４時間以上経過したものを力学試験および細胞試験に用いた。
【００４５】
３．コラーゲン線維ゲルの線維構造、弾性率、および細胞培養によるコラーゲン線維ゲルの収縮
ＳＥＭにより観察したコラーゲン線維ゲルのコラーゲン線維構造を図１に、弾性率を表１に示す。また、細胞培養１０日目におけるコラーゲン線維ゲルの収縮を表１に、サイズを図２に示す。
【００４６】
実施例２：
２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有したｐＨ７、３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を溶媒として、４０ｍＭのＥＤＣ水溶液を調製し、１０℃に冷却した。このＥＤＣ水溶液８ｍＬと、同じく１０℃に冷却した０．５％のコラーゲン水溶液１３ｍＬを混合し、６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ製）に、深さ２〜３ｍｍになるように流し込み、室温で１時間静置し、ゲル化を完了させた。ゲルを１０℃の冷蔵庫に静置し、２４時間以上経過したものを力学試験に用いた。
【００４７】
比較例１：
コラーゲン線維ゲルの作製に用いるＥＤＣ水溶液の溶媒を１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含有したｐＨ７、３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に変更し、ＥＤＣの濃度を２４ｍＭに変更し、酸性コラーゲン水溶液とＥＤＣ水溶液の混合比を５／１２（ｍＬ／ｍＬ）に変更した以外は、実施例１と同様の方法でコラーゲン線維ゲルを作製した。ＳＥＭにより観察したコラーゲン線維ゲルのコラーゲン線維構造は図１と同様であった。弾性率を表１に示す。細胞培養１０日目におけるコラーゲン線維ゲルの収縮を表１に、サイズを図２に示す。
【００４８】
比較例２：
コラーゲン線維ゲルの作製に用いるＥＤＣ水溶液の溶媒を６０ｍＭの塩化ナトリウムを含有したｐＨ７、３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に変更し、ＥＤＣの濃度を２４ｍＭに変更し、酸性コラーゲン水溶液とＥＤＣ水溶液の混合比を４／１６（ｍＬ／ｍＬ）に変更した以外は、実施例１と同様の方法でコラーゲン線維ゲルを作製した。ＳＥＭにより観察したコラーゲン線維ゲルのコラーゲン線維構造は図１と同様であった。弾性率を表１に示す。細胞培養１０日目におけるコラーゲン線維ゲルの収縮を表１に、サイズを図２に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
図１から明らかなように、本発明のコラーゲン線維ゲルはナノサイズの太さを持つコラーゲン線維特有の構造を有していた。表１と図２から明らかなように、本発明のコラーゲン線維ゲルは弾性率が高く、細胞培養によっても収縮しない。一方、比較例として示したコラーゲン濃度および弾性率が低いコラーゲン線維ゲルは、細胞を播種しない場合は収縮しないが、細胞培養１０日目で収縮した。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のコラーゲン線維ゲルは硬く、細胞培養時の細胞の牽引力によって収縮しない。このため、細胞培養基材あるいは培養細胞と一体化させて動物移植用基材として好適に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養基材として用いられるコラーゲン線維ゲルに関する。さらに詳しくいえば、コラーゲン線維を架橋してなり、接着・増殖した細胞の牽引力によって収縮しない硬さを持つコラーゲン線維ゲル、およびそのコラーゲン線維ゲルを用いた動物移植用培養基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、少なくとも部分的に螺旋構造（コラーゲン螺旋）を有するタンパク質または糖タンパク質として定義される。３本のポリペプチド鎖から形成される３重螺旋で、分子量１０万程度の各ポリペプチド鎖にはグリシン残基が３個目ごとに、またその他のアミノ酸残基としてプロリン残基、ヒドロキシプロリン残基が高頻度に現れる。コラーゲンは無脊椎動物あるいは脊椎動物の組織、特に皮膚から多く抽出することができる。コラーゲン分子には構造の違いによって１９種類の型の存在が報告されており、さらに同じ型に分類されるコラーゲンにも数種類の異なる分子種が存在する場合がある。
【０００３】
中でも、Ｉ、II、III型およびIV型コラーゲンが主にバイオマテリアルの原料として用いられている。Ｉ型はほとんどの結合組織に存在し、細胞外マトリックスを構成する。生体内で最も量の多いコラーゲン型である。特に腱、真皮および骨に多く、工業的にはコラーゲンはこれらの部位から抽出される場合が多い。II型は軟骨を形成するコラーゲンである。III型は少量ではあるがＩ型と同様の部位に存在することが多い。IV型は基底膜を形成するコラーゲンである。Ｉ、IIおよびIII型はコラーゲン線維として生体内に存在し、主に組織あるいは器官の強度を保つ役割をはたしている。ＩＶ型は線維形成能力を有しないが、４分子で構成される網目状会合体を形成し、基底膜における細胞分化に関与しているとされる。本明細書において、以下コラーゲンという呼称はＩ、II、III型あるいはそれら２種類以上の混合物を示すこととする。
【０００４】
コラーゲン線維は上記コラーゲン分子が自己組織化したナノサイズのファイバー状構造体であり、コラーゲン分子が直列かつ並列にパッキングされた特有の線維構造を有する。工業的には酸、アルカリ、あるいはタンパク質分解酵素を用いて組織内コラーゲン線維から可溶化されたコラーゲンが製造される。
【０００５】
可溶性コラーゲンは、コラーゲン分子が数分子以下の集合体にまで微細化されていて、水あるいは塩水溶液に溶解して均一な透明溶液を形成する。一度可溶化されたコラーゲン分子は条件次第で試験管内でコラーゲン線維を再形成することが知られている。この現象は線維化（fibril formationあるいはfibrillation）と呼ばれ、その性質についてはBiochemical Journal, 316, p1-11 (1996)（非特許文献１）に詳細に記載されている。
【０００６】
コラーゲンに熱を加えるとコラーゲンの三重螺旋構造がほぐれ、それぞれのポリペプチド鎖がランダムコイル状の熱変性物を与える。そのような構造変化を起こす温度は変性温度と呼ばれ、熱変性物はゼラチンと呼ばれる。ゼラチンはコラーゲンに比べ水溶性が高い他に、生体内プロテアーゼに対する感受性が高いことが知られている。溶媒の条件によってはゼラチンがコラーゲン螺旋構造を部分的に回復することが知られている。ゼラチンはコラーゲン線維形成能を失っているが、部分的にコラーゲン螺旋構造を回復させることでコラーゲン線維形成能を回復できることが知られている。
コラーゲンの変性温度は溶液状態の時に最も低くなる。また、コラーゲンは一般に生物原料から得られるが、生物から得たコラーゲンの変性温度はその生物の生活環境温度と密接に関係していると言われる。水溶液でのコラーゲンの変性温度は、哺乳類では３８℃前後であるが、魚類はおおむね哺乳類よりも低く、特に鮭等の寒流系の魚類では２０℃を下回る場合もある。
【０００７】
コラーゲンは細胞外マトリックスの主成分であり、細胞接着基質として機能する。生体内に埋植しても異物として認識されず、分解・吸収され、最終的には消失する。このため、細胞培養基材や医療用具、最近ではティッシュエンジニアリングの足場材料として広く利用されている。特に、近年の幹細胞生物学の急速な発展と再生医療への期待から、細胞培養基材としてのコラーゲンの有用性が見直されつつある。
【０００８】
コラーゲン培養基材としては、可溶性コラーゲンをコーティングしたディッシュ、可溶性コラーゲンを化学架橋剤で固化させたゲル、および線維化による物理ゲルを作製するための可溶性コラーゲンの水溶液が開発されている。
【０００９】
コラーゲンコートディッシュは乾燥しているため取り扱いが容易であるが、次に示すような幾つかの難点がある。
１）生体内コラーゲンが持つ線維構造を持っていない。
２）コーティング層がディッシュに密着しているため、細胞移植用の基材としての利用が難しい。
３）コーティング層が薄く緻密なため、水溶性物質を含浸させることが難しい。
【００１０】
可溶性コラーゲンを化学架橋剤で固化させたゲルについては、例えばコラーゲン溶液に化学架橋剤を混合してゲル化させた眼科用コラーゲンゲル成形物（特開平１１−１９７２３４号公報（特許文献１））、グリコサミノグリカンとコラーゲンの混合溶液を水溶性カルボジイミドで架橋した組織再生マトリックス用ゲル（特開２００２−８０５０１号公報（特許文献２））などが開示されている。これらコラーゲンゲルは細胞と一体化させて取り扱うことができ、ゲル内に水溶性物質を含浸させることが容易である。しかし、コラーゲンコートディッシュ生体内コラーゲンが持つ線維構造を持っていないため、生体内類似環境を提供する細胞培養基材としては必ずしも好ましくない。
【００１１】
一方、コラーゲン線維からなるゲルは、細胞外マトリックスと極めて類似したコラーゲン構造を持つ。酸性のコラーゲン水溶液と中性の緩衝液を混合し、モノメリックなコラーゲンを線維へと自己組織化させる方法（榎並ら,「コラーゲン・ゲル培養法（Ｉ）」,組織培養,13(1), 26-30, 1987（非特許文献２）、Journal of Agricultural Food Chemistry, 48, p.2028-2032 (2000)（非特許文献３））により作製される。得られるゲルはコラーゲン線維の絡み合いからなる物理ゲルであり、機械的強度が低く、細胞が基材に与える牽引力により収縮するという問題があった。ゲルが収縮すると、基材の物理的性質と細胞密度が変化するため、細胞の特性に及ぼす基材の硬さの影響や細胞の増殖性などを定量的に把握することが困難になる。また、コラーゲン線維が緻密になりゲルの透明性が失われるため、光学顕微鏡による細胞の観察が困難になる。
【００１２】
本発明者らは、コラーゲンの線維化途上に線維間の架橋反応を起こすコラーゲン線維ゲルの作製方法を開発し、従来の方法では困難であったコラーゲン線維ゲルの強度の大幅な向上を達成した（特許第４０６４４３５号（特許文献３））。しかし、細胞培養に用いた場合、細胞の種類によっては、細胞増殖による牽引力の増加によりゲルが収縮する場合があった。
【００１３】
本発明者らは、細胞の牽引力に対する抵抗性はゲルの弾性率で決まり、弾性率がコラーゲン濃度とともに増加することを見出した。更に前記問題点を改善すべく鋭意研究を重ねた結果、コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にあるコラーゲン線維ゲルが細胞培養による収縮を起こさず、ゲルの硬さが均質であり、細胞培養基材および動物移植用細胞基材として極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平１１−１９７２３４号公報
【特許文献２】特開２００２−８０５０１号公報
【特許文献３】特許第４０６４４３５号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Biochemical Journal, 316, p1-11 (1996)
【非特許文献２】榎並ら,「コラーゲン・ゲル培養法（Ｉ）」,組織培養,13(1), 26-30, 1987
【非特許文献３】Journal of Agricultural Food Chemistry, 48, p.2028-2032 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、細胞の牽引力により収縮しない細胞培養用コラーゲン線維ゲル、およびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従来のコラーゲンゲルの製造方法では、コラーゲンゲルの硬さが不十分であり、細胞培養時に細胞の牽引力による収縮をきたし、細胞の特性に及ぼす基材の硬さの影響や細胞の増殖性などを定量的に把握することが困難になる。また、光学顕微鏡による細胞の観察が困難になる。
【００１８】
本発明者らは、前記問題点を改善すべく鋭意研究を重ねた結果、コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にあるコラーゲン線維ゲルが細胞培養による収縮を起こさず、ゲルの硬さが均質であり、細胞培養基材および動物移植用細胞基材として極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【００１９】
すなわち、本発明は下記のコラーゲン線維ゲル、およびその用途を提供する。
［１］コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にある、コラーゲン分子間が架橋されているコラーゲン線維ゲル。
［２］ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、ｐＨ１〜５のコラーゲン水溶液および水溶性カルボジイミドを混合し、線維化途上に架橋が導入される方法で作製された前記１に記載のコラーゲン線維ゲル。
［３］コラーゲンが魚皮由来であり、前記コラーゲン水溶液のコラーゲンの変性温度が２５℃を超えるものである前記２に記載のコラーゲン線維ゲル。
［４］前記１〜３のいずれかに記載のコラーゲン繊維ゲルを含む細胞培養用の培地。
［５］前記４に記載の培地と細胞培養用容器とを含む細胞培養基材。
［６］前記１〜３のいずれかに記載のコラーゲン線維ゲルおよび前記ゲルに一体化してなる培養細胞とを有する動物移植材料。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１のコラーゲン線維ゲル中のコラーゲン線維のＳＥＭ写真である。
【図２】細胞培養１０日目における実施例１、比較例１および比較例２のコラーゲン線維ゲルのサイズである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、コラーゲン濃度と弾性率を特定の範囲に調節することにより、細胞培養による収縮を起こさず、ゲルの硬さが均質であり、細胞培養基材および動物移植用細胞基材として極めて有用なコラーゲン線維ゲルを提供することを要旨とする。
【００２２】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその型について特に限定されるものではないが、工業的な利用という観点から、収量の多いＩ型コラーゲンあるいはそれを主成分とするコラーゲンが好ましい。
【００２３】
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその分子構造について特に限定されるものではない。コラーゲン分子の両末端に存在する非螺旋領域（テロペプチド）は抗原性を有するという報告がある。用途によっては除去されるべき場合があるが、線維化能を有する限りはテロペプチドが除去されていても除去されていなくても構わない。
【００２４】
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその変性について特に限定されるものではない。一度変性させたコラーゲンでも、部分的にコラーゲン螺旋構造を回復し、線維化能を回復することが知られている。本発明を達成するには、線維化能の観点から、螺旋率（％）が５０以上であることが好ましい。上記螺旋率（％）とはJournal of Food Chemistry, 60, p.1233 (1995)に記載されている螺旋回復率（％）と同義である。すなわち、旋光度計で測定した比旋光度より求めた螺旋回復率（％）のことを示す。
【００２５】
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその由来について特に限定されるものではないが、資源量およびコラーゲン収率の観点から脊椎動物の真皮に由来するコラーゲンが好ましく用いられる。中でも、ＢＳＥ等の病原体を保有する可能性が家畜よりも潜在的に低い魚皮コラーゲンが特に好ましく用いられる。
【００２６】
本発明に用いられるコラーゲンが魚皮コラーゲンの場合、その変性温度は２５℃以上でなければならない。変性温度が２５℃を下回ると、熱変性による収縮力が加わり、細胞の牽引力により収縮しやすくなる場合がある。
【００２７】
本発明におけるコラーゲンの変性温度とは、ゲル作製に用いる可溶性コラーゲンの水溶液の温度上昇による粘度変化から求められる。具体的には、可溶性コラーゲンの水溶液の温度を１０℃から５０℃まで段階的に上昇させて変性させ、粘度（単位：パスカル・秒）が１０℃における粘度の５％未満に達したときの温度を変性温度とする。粘度は回転粘度計もしくは動的粘弾性測定装置を用いて測定される。
【００２８】
本発明におけるコラーゲン線維とは、文献（Journal of Agricultural Food Chemistry, 48, p.2028-2032 (2000)）の走査型電子顕微鏡写真に示されているような糸状構造のことを意味する。
【００２９】
本発明のコラーゲン線維ゲルのコラーゲン濃度は０．２５％〜０．５３％の範囲である。コラーゲン濃度が０．２５％未満の場合、細胞の牽引力に抵抗する硬さを得ることが難しい。コラーゲン濃度が０．５３％以上の場合、ゲル作製に用いるコラーゲン水溶液の粘度が高いため、架橋剤や緩衝液との混合が不十分となりゲルの均質性が損なわれる。ゲルの硬さは幹細胞の分化に影響するため（Even-Ram et al., Cell, 126, 645-647 (2006)）、ゲルの硬さが不均一だと細胞培養基材として好ましくない。さらに好ましくは０．３０％を超えるコラーゲン濃度である。
【００３０】
本発明のコラーゲン線維ゲルの弾性率は６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲である。弾性率が６０ｋＰａ未満の場合、細胞の牽引力に抵抗することができなくなり、ゲルが収縮する場合がある。弾性率が１２０ｋＰａを超えるゲルを作製するためにはゲルのコラーゲン濃度を０．５％以上にする必要があり、上述の理由によりゲルの均質性が損なわれるため好ましくない。
【００３１】
本発明のコラーゲン線維ゲルの弾性率は、拘束下のゲルへの貫入試験により求める。具体的には、内径３５ｍｍのディッシュ（６ウェルプレートも可）に厚さ２〜４ｍｍで作製したゲルに内径５ｍｍの円柱状プローブを押し込み、得られた応力−ひずみ曲線の初期の直線領域の傾き（ひずみ０．０６未満）から求められる。
【００３２】
本発明のコラーゲン線維ゲルは、コラーゲン線維を構成しているコラーゲン分子間を架橋する方法により製造することができ、コラーゲン線維ゲルの弾性率を効果的に高められるという観点から、特許文献３に開示されているコラーゲンの線維化途上に架橋反応を起こす方法が好ましく用いられる。具体的方法としては、例えば、ｐＨ１〜５、好ましくはｐＨ３程度の、濃度３％以下のコラーゲン水溶液に、架橋剤を含有するｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７程度のリン酸ナトリウム緩衝液を、原料となるコラーゲンの変性温度以下の温度（例えば１０℃程度）で混合し、所定のコラーゲン濃度を有する溶液を得た後、静置等する方法が挙げられる。
【００３３】
コラーゲン水溶液は、例えば脊椎動物の真皮を原料として公知の酸抽出法により製造することができる。コラーゲン水溶液の濃度は、いったん沈殿もしくは乾燥させたコラーゲンを溶解する際のコラーゲン／溶媒の重量比により調節できる。コラーゲン濃度が３％を超えると粘度が高くなり、リン酸ナトリウム緩衝液との混合不十分により不均一なゲルが生じる場合があるので好ましくない。好ましい濃度は１％以下である。
架橋剤の濃度については、リン酸ナトリウム緩衝液中の濃度よりもむしろ、コラーゲン水溶液と混合した後の濃度（ゲル中の濃度）がゲル形成の成否やゲルの物性を左右する。コラーゲン線維ゲル中の架橋剤濃度は５〜８０ｍＭの範囲が好ましい。コラーゲン線維ゲル中の架橋剤濃度が５ｍＭ未満の場合、コラーゲン分子に架橋が導入されにくくなり、ゲルの弾性率が不足する場合があり好ましくない。一方、架橋剤濃度が８０ｍＭを超えると、コラーゲン水溶液とリン酸ナトリウム緩衝液混合後のゲル化速度が速過ぎて、成形性が悪化する場合があり好ましくない。より好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲である。
【００３４】
ゲル化速度が速過ぎて成形性が悪い場合、必要に応じて、線維化抑制剤として塩化ナトリウムなどの無機塩を添加することができる。添加する無機塩の濃度は、コラーゲン線維ゲル中の濃度として３０〜１５０ｍＭの範囲が好ましい。ゲル中の無機塩の濃度が３０ｍＭ未満の場合、コラーゲンの線維化が速すぎてコラーゲン線維ネットワークが発達せず、ゲルが弱くなる場合がある。ゲル中の無機塩の濃度が１５０ｍＭを超える場合、コラーゲン線維化が抑制され、ゲルが弱くなる場合がある。より好ましくは５０〜１３０ｍＭの範囲である。
【００３５】
コラーゲン線維ゲルの弾性率は、製造条件によって変更することが可能である。具体的にはコラーゲン濃度、架橋剤濃度、線維化抑制剤の濃度などを調整することにより弾性率を変更することができる。あるコラーゲン濃度から上記の方法により得られるコラーゲン線維ゲルの弾性率の最大値は、コラーゲン濃度にほぼ比例して増加する。一方で、あるコラーゲン濃度において、無機塩もしくは架橋剤の濃度を変えてコラーゲンの線維化速度を増減させることにより、コラーゲン線維ゲルの弾性率を調節することができる。
【００３６】
本発明のコラーゲン線維ゲルにおいて、コラーゲン分子間を架橋するために用いられる架橋剤は、タンパク質を架橋でき、水溶性を有するものであれば特に限定されるものではない。タンパク質の架橋剤については、文献（Biomaterials, 18, p.95-105 (1997)）に詳細に記載されている。中でも、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド系架橋剤、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミド系架橋剤、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのイソシアネート系架橋剤、エチレングリコールジエチルエーテルなどのポリエポキシ系架橋剤が経済性、安全性および操作性の観点から好ましく用いられる。特に、ＥＤＣ、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩などの水溶性カルボジイミドをｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液に溶かした溶液として使用することが好ましい。
【００３７】
本発明のコラーゲン線維ゲルを細胞培養の培地として用いることができる。本発明のゲルを細胞培養用容器内で成形することで、容器と一体化した培養基材とすることが好ましい。細胞培養用容器の種類については特に限定されないが、細胞培養用消耗品として広く用いられているプラスチック製のディッシュやプレートなどが好ましく用いられる。プラスチックとコラーゲンは親和性が低く、ガラス等に比べゲルを剥がしやすい。
【００３８】
本発明のコラーゲン線維ゲルに細胞を接着・増殖させ、あるいは必要に応じて分化させ、動物移植に用いることができる。培養細胞としては、例えば、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞、あるいは間葉系幹細胞などの体性幹細胞が挙げられる。本発明のコラーゲン線維ゲルと骨（コラーゲンを主成分とする）との生化学的類似性から、特に、間葉系幹細胞の一種である骨髄由来幹細胞の骨分化誘導に好ましく用いることができる。
本発明のコラーゲン線維ゲルは実質的にコラーゲンのみから成るため、既に実用化されているコラーゲン製創傷被覆材などと同様に生体に接触させても安全に用いることができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例と比較例を挙げてより具体的に説明するが、本発明は下記に記載範囲に限定されるものではない。
【００４０】
はじめに各種測定方法を示す。
１．コラーゲン線維の観察
以下の操作により、コラーゲン線維ゲル中のコラーゲン線維を観察した。コラーゲン線維ゲルを２．５％のグルタルアルデヒド水溶液に２４時間浸した後、２０、５０、７５、および９９（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液に各３０分ずつ順次浸し、コラーゲン線維ゲルを脱水した。これを酢酸イソペンチルに１５分ずつ２回浸した後、二酸化炭素による臨界点乾燥を行なった。乾燥したコラーゲン線維ゲルにイオンコーターを用いてタングステンを蒸着し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用試料とした。ＳＥＭ観察は日立製Ｓ−３２００Ｎを用いて、倍率１５，０００倍で行なった。
【００４１】
２．コラーゲン線維ゲルの弾性率の測定
以下の操作により、コラーゲンゲルのゲル強度を求めた。
細胞培養用６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ製）に、厚み２〜３ｍｍになるようにコラーゲン線維ゲルを作製した。強度試験機（ＴＡ．ＸＴｐｌｕｓ、英弘精機製）を用いて、ゲルに対して内径５ｍｍの円柱プローブを速度０．５ｍｍ／秒で押し込み、得られた応力−ひずみ曲線の初期の直線領域の傾き（ひずみ０．０６未満）から弾性率を求めた。測定は６個のゲルについて行なった。
【００４２】
３．コラーゲン線維ゲル上での細胞培養と収縮の定量
ｗｅｌｌの内径が２２ｍｍの１２ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ製）に厚みが２〜３ｍｍになるように作製したコラーゲン線維ゲルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、ラット骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を播種した。３７℃、５％ＣＯ2条件下α−ＭＥＭ（１５％ウシ胎児血清含有）で２日間培養した後、アスコルビン酸、β−グリセロフォスフェイト、デキサメタゾンをα−ＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清含有）に添加し骨分化誘導を行った（ＤＥＸ＋）。非分化誘導群にはデキサメタゾンを加えない以外は上記組成と同じ培地を使用した（ＤＥＸ−）。細胞を播種しなかったゲル（Ｂｌａｎｋ）は、α−ＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清含有）を使用した。３日毎に培地交換を行い、１０日間培養を行った。培養１０日目のコラーゲン線維ゲルを回収し、内径を測定した。
【００４３】
実施例１：
１．テラピアの皮からの可溶性コラーゲンの製造
（１）コラーゲンの抽出
原料の魚皮として、鱗と身が除去され、天日で乾燥されたテラピア（日本名イズミダイ）の皮を用いた。クロロホルムとメタノールを等容積混合した溶液０．７Ｌに、魚皮１００ｇを１２時間浸漬して脱脂した。この操作を再度行った後、魚皮を７０％エタノール０．７Ｌで５回繰り返し洗浄し、流水で６時間洗浄してエタノールを除去した。脱脂した魚皮を１０℃の０．５Ｍ酢酸１．２Ｌに浸漬し、３日間静置した。膨潤した魚皮をナイロンメッシュでろ過し、ろ液を１０，０００×ｇで３０分遠心して不溶物を沈殿させ、上清をメンブランフィルターでろ過し、ろ液１．０Ｌを回収した。
（２）コラーゲンの精製
上記コラーゲン溶液１．０Ｌに対し、終濃度０．７Ｍになるように塩化ナトリウムを加え、２４時間撹拌した。塩析により生じた白い不溶物を１０，０００×ｇで３０分遠心して沈殿を回収し、沈殿を０．５Ｍ酢酸１Ｌに加え、撹拌して溶解した。この操作を３回繰り返して、無色透明なコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液を、セルロースチューブを用いて精製水とｐＨ３希塩酸に対して透析し、濃度０．９％のコラーゲン水溶液を得た。得られたコラーゲンの変性温度は３６℃であった。
【００４４】
２．コラーゲンゲルの作製
２１０ｍＭの塩化ナトリウムを含有したｐＨ７、３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を溶媒として、３５ｍＭのＥＤＣ水溶液を調製し、１０℃に冷却した。このＥＤＣ水溶液５ｍＬと、同じく１０℃に冷却した０．８％のコラーゲン水溶液１０ｍＬを混合し、６ｗｅｌｌおよび１２ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ製）に、深さ２〜３ｍｍになるように流し込み、室温で１時間静置し、ゲル化を完了させた。ゲルを１０℃の冷蔵庫に静置し、２４時間以上経過したものを力学試験および細胞試験に用いた。
【００４５】
３．コラーゲン線維ゲルの線維構造、弾性率、および細胞培養によるコラーゲン線維ゲルの収縮
ＳＥＭにより観察したコラーゲン線維ゲルのコラーゲン線維構造を図１に、弾性率を表１に示す。また、細胞培養１０日目におけるコラーゲン線維ゲルの収縮を表１に、サイズを図２に示す。
【００４６】
実施例２：
２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有したｐＨ７、３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を溶媒として、４０ｍＭのＥＤＣ水溶液を調製し、１０℃に冷却した。このＥＤＣ水溶液８ｍＬと、同じく１０℃に冷却した０．５％のコラーゲン水溶液１３ｍＬを混合し、６ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ製）に、深さ２〜３ｍｍになるように流し込み、室温で１時間静置し、ゲル化を完了させた。ゲルを１０℃の冷蔵庫に静置し、２４時間以上経過したものを力学試験に用いた。
【００４７】
比較例１：
コラーゲン線維ゲルの作製に用いるＥＤＣ水溶液の溶媒を１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含有したｐＨ７、３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に変更し、ＥＤＣの濃度を２４ｍＭに変更し、酸性コラーゲン水溶液とＥＤＣ水溶液の混合比を５／１２（ｍＬ／ｍＬ）に変更した以外は、実施例１と同様の方法でコラーゲン線維ゲルを作製した。ＳＥＭにより観察したコラーゲン線維ゲルのコラーゲン線維構造は図１と同様であった。弾性率を表１に示す。細胞培養１０日目におけるコラーゲン線維ゲルの収縮を表１に、サイズを図２に示す。
【００４８】
比較例２：
コラーゲン線維ゲルの作製に用いるＥＤＣ水溶液の溶媒を６０ｍＭの塩化ナトリウムを含有したｐＨ７、３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に変更し、ＥＤＣの濃度を２４ｍＭに変更し、酸性コラーゲン水溶液とＥＤＣ水溶液の混合比を４／１６（ｍＬ／ｍＬ）に変更した以外は、実施例１と同様の方法でコラーゲン線維ゲルを作製した。ＳＥＭにより観察したコラーゲン線維ゲルのコラーゲン線維構造は図１と同様であった。弾性率を表１に示す。細胞培養１０日目におけるコラーゲン線維ゲルの収縮を表１に、サイズを図２に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
図１から明らかなように、本発明のコラーゲン線維ゲルはナノサイズの太さを持つコラーゲン線維特有の構造を有していた。表１と図２から明らかなように、本発明のコラーゲン線維ゲルは弾性率が高く、細胞培養によっても収縮しない。一方、比較例として示したコラーゲン濃度および弾性率が低いコラーゲン線維ゲルは、細胞を播種しない場合は収縮しないが、細胞培養１０日目で収縮した。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のコラーゲン線維ゲルは硬く、細胞培養時の細胞の牽引力によって収縮しない。このため、細胞培養基材あるいは培養細胞と一体化させて動物移植用基材として好適に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にある、コラーゲン分子間が架橋されているコラーゲン線維ゲル。
【請求項２】
ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、ｐＨ１〜５のコラーゲン水溶液および水溶性カルボジイミドを混合し、線維化途上に架橋が導入される方法で作製された請求項１に記載のコラーゲン線維ゲル。
【請求項３】
コラーゲンが魚皮由来であり、前記コラーゲン水溶液のコラーゲンの変性温度が２５℃を超えるものである請求項２に記載のコラーゲン線維ゲル。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン繊維ゲルを含む細胞培養用の培地。
【請求項５】
請求項４に記載の培地と細胞培養用容器とを含む細胞培養基材。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン線維ゲルおよび前記ゲルに一体化してなる培養細胞とを有する動物移植材料。
【請求項１】
コラーゲン濃度が０．２５％〜０．５３％の範囲にあり、弾性率が６０ｋＰａ〜１２０ｋＰａの範囲にある、コラーゲン分子間が架橋されているコラーゲン線維ゲル。
【請求項２】
ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、ｐＨ１〜５のコラーゲン水溶液および水溶性カルボジイミドを混合し、線維化途上に架橋が導入される方法で作製された請求項１に記載のコラーゲン線維ゲル。
【請求項３】
コラーゲンが魚皮由来であり、前記コラーゲン水溶液のコラーゲンの変性温度が２５℃を超えるものである請求項２に記載のコラーゲン線維ゲル。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン繊維ゲルを含む細胞培養用の培地。
【請求項５】
請求項４に記載の培地と細胞培養用容器とを含む細胞培養基材。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン線維ゲルおよび前記ゲルに一体化してなる培養細胞とを有する動物移植材料。
【図２】
【図１】
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１２６６８１（Ｐ２０１２−１２６６８１Ａ）
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８００３６（Ｐ２０１０−２８００３６）
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）地方独立行政法人 東京都立産業技術研究センター 平成２２年度 研究発表会要旨集 （２）第６２回 日本生物工学会大会 講演要旨集
【出願人】（５０６２０９４２２）地方独立行政法人 東京都立産業技術研究センター (134)
【出願人】（５９４０３８０２５）井原水産株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）地方独立行政法人 東京都立産業技術研究センター 平成２２年度 研究発表会要旨集 （２）第６２回 日本生物工学会大会 講演要旨集
【出願人】（５０６２０９４２２）地方独立行政法人 東京都立産業技術研究センター (134)
【出願人】（５９４０３８０２５）井原水産株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
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