コンビナトリアルドラッグについての薬物の候補物質を同定および選択する方法
新規なコンビナトリアルドラッグの開発における機能的作用に起因する化学的存在を同定かつ選択する方法が提供される。２またはそれ以上の化合物のコンビネーションは相乗作用を示す。該化合物は、例えば、抗体、抗生物質、抗腫瘍剤、抗ＡＩＤＳ剤、抗成長因子、抗ウイルス剤、可溶性受容体、サイトカイン、ＲＮＡｉ、ワクチンおよびその混合物であり得る。該方法は、ａ）各々が化学的存在を含むｎ個のサンプルを準備し、ｂ）ｎ個のサンプルの２またはそれ以上を可能なすべてのコンビネーションにて混合し、ｃ）この混合物を機能性アッセイに供し、該機能的作用に起因する存在を同定することを含む。工程ａ−ｃは機能的作用に起因する工程ｃからの化学的存在に対して繰り返される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能的作用を有する、あるいはその作用に起因する化学的存在を同定および選択する方法に関する。この同定および選択は、２種またはそれ以上の化合物を一緒に組み合わせることが相乗作用、例えば疾患の治療または予防の改善をもたらしうる化学的存在の組み合わせを同定することについて相乗作用を示す、新規なコンビナトリアルドラッグの創薬および開発において有用である。本発明はまた、最適な効能および薬効を示すコンビナトリアルドラッグを得るために、化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定および選択する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト抗体応答は天然のポリクローナルによるものである。これまで開発され、市販されてきた組換え抗体産物のほとんど大部分はモノクローナル抗体であり、近年においては、新規な一連のポリクローナル抗体産物もまた開発されている。これらは２種またはそれ以上の異なる抗体を含む組換え抗体組成物であり、その各々が工業的に生産されている、組換えモノクローナル抗体の「カクテル」として、あるいは単一のバッチにて生産される組換えポリクローナル抗体として、産生され得る。後者の方法はWibergら、Biotechnol. Bioeng. 94: 396-405 (2006) に記載されている。Logtenberg（Tends in Biotechnology, 25 (9): 390-394, 2007）は抗体コンビネーションまたはカクテルの関する文献を報告しており、ウイルス、トキシンまたは成長因子などの可溶性分子、ならびにＨＥＲ−２などの細胞結合分子および癌関連の細胞表面分子を含む、多くの標的に対する抗体カクテルの相乗作用または相加作用の例を記載する。Logtenbergは相乗的な抗体のコンビネーションの設計の仕方についていかなる指針も提供していない。
【０００３】
Bregenholt & Haurum（Expert Opin Biol Ther. 2004 Mar; 4 (3): 387-96）は、ウイルスおよび細菌などの大集団における生物兵器である物質に対する幅広い保護を提供するためには、微生物が認識されているエピトープでの変異を介して中和抗体から逃れることを防止するため、病原体特異的ポリクローナル抗体は所定の表現型に対する広範囲の反応性に及ぶことが理想的であると教示している。
【０００４】
Bregenholtら（Curr Pharm Des. 2006; 12 (16): 2007-2015）はウイルス特異的ポリクローナル抗体薬の設計に関する指針を記載する。彼らは、抗体レパートリーは、できる限り中和ヒト免疫応答の酷似する抗体組成物を維持しながらも、できるだけ広い一連の中和エピトープを含むように選択されるべきであると結論付けている。
【０００５】
ＷＯ２００７／１０１４４１は組換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を開示する。特に、ＧおよびＦの両方の蛋白上の複数のエピトープを対象とする、抗ＲＳＶ組換えポリクローナル抗体（ｒｐＡｂ）を開示する。保存されている群に属し、サブタイプ特異的群および株特異的群にも属する可能性のあるＧ蛋白エピトープは抗ＲＳＶｒｐＡｂでカバーされることが好ましい。
【０００６】
ＷＯ２００６／００７８５０はモノクローナル抗ＲｈＤ抗体よりも利点のある可能性のある組換えポリクローナル抗ＲｈｅｓｕｓＤ抗体を開示する。１種より多くの抗体があらゆる可能性のあるＲＤエピトープをカバーすることで、抗ＲｈＤｒｐＡｂ組成物はＲｈＤ（−）およびＲｈＤ（＋）サブタイプに関わりなくＲｈＤ（＋）の子供を有するＲｈＤＶＩの両方の女性の予防的処置に用いることができる。
【０００７】
ＷＯ２００７／０６５４３３は組換えポリクローナル抗オルトポックスウイルス抗体を開示する。ポリクローナル抗体は、複数のＩＭＶおよび／またはＥＥＶ粒子の蛋白を、好ましくはまた、個々のＩＭＶ／ＥＥＶ蛋白上の複数のエピトープを対象とする別個の抗体を含むのが有利であると記載されている。さらには、抗オルトポックスウイルスｒｐＡｂの所望の成分としての、オルトポックスウイルス関連の補体活性化のレギュレータ（ＲＣＡ）に対する反応性を有する抗体も記載されている。
【０００８】
Devauxら（Mol. Cell. Chem. 74: 117-128（1987）は、２種の異なる抗体のコンビネーションに対して、共同作用の可能性について試験するアッセイの実施を含め、スタフィロコッカス・アウレウス・ヌクレアーゼを阻害するのにモノクローナル抗体の使用を開示する。
【０００９】
モノクローナル抗体は、次第に、例えば細胞増殖抑制剤、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤および他の抗体（例えば、Avastin（登録商標）と一緒に用いられるHerceptin（登録商標））とのコンビネーション療法にて用いられる。これらの治療方法では、その最適なコンビネーションが選択されることを確実にするためにコンビネーション療法を合理的に設計する必要がある。
【００１０】
臨床的に組み合わせて用いられる他の化合物として、抗生物質、抗癌剤、抗ＡＩＤＳ剤、抗成長因子、抗ウイルス剤、可溶性受容体、ＲＮＡｉおよびワクチンが挙げられる。
【００１１】
コンビナトリアルドラッグを設計する場合、２種の異なる目標に狙いを定めることができる。コンビナトリアルドラッグの一の型において、化合物は同じ機能を有するか、または同じ機能に起因するかもしれないが、組み合わせて一緒に投与されると、相乗作用を示す。コンビナトリアルドラッグのもう一つ別の型において、化合物は異なる機能を示し、そのために複数の医学的症状を治療することのできる一の薬物を開発することができる。
【００１２】
膨大な数の可能性のある薬物の候補体が混合して含まれている場合、最適なドラッグ設計は最初から明らかでないが、経験的に確立されているに違いない場合を含め、相乗作用が得られることを確実にするであろう合理的なドラッグの設計に対する要求がある。例えば、抗体を小分子ドラッグと混合してコンビネーション治療を提供する、より複雑な場合でも、合理的なドラッグの設計に対する要求がある。
【００１３】
異なるドラッグ候補体の最適な混合物を同定するチャレンジは特にポリクローナル抗体組成物と関連するものであり、その目的は特定の標的抗原と特異的に結合する異なるモノクローナル抗体の混合物を提供することであり、それによりヒトおよびヒト以外の動物に存在するような自然の抗体応答をできるだけ広い範囲まで模倣するものである。一のチャレンジは、正に、個々のポリクローナル抗体組成物にある異なる抗体の「最適な」数を決定することであり、例えば、２または３種の抗体が、５または１０種の抗体によって得られる作用と略同様に良好な治療作用を提供するかどうかを決定することである。仮に、例えば、生成費用を考慮して、組成物中の異なる抗体の概数が予め決定されるとしても、最適なコンビネーションを同定する作業は決して取るに足らないものではない。例えば、その目的が５種の抗体を含むポリクローナル抗体を提供することであり、３０種の候補体の抗体があり、その中から選択すべき場合には、５種の抗体の独特なコンビネーションの数は１４２５０６通りであり、６種の抗体を含むポリクローナル抗体が３６種の候補体の抗体より選択する場合には、その独特なコンビネーションの数は二百万近くになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、所望の機能的作用を有する混合物を同定するために、複数の化学的存在から、典型的には１０種より多くの存在から、２種またはそれ以上の存在の混合物を評価する合理的方法を提供することである。この方法により同定された混合物は一の特異的機能性パラメータについて相乗作用を示すか、あるいは該混合物は異なる機能的作用を有する異なる化学的存在が同じドラッグ中に一緒に存在するということから２種またはそれ以上の機能的作用を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、第一の態様において、本発明は、所望の機能的作用を示す少なくとも２種の化学的存在を含む混合物を提供するために、機能的作用を有する、または該作用に起因する化学的存在を同定かつ選択する方法であって、
ａ）各々が試験されるべき化学的存在を含む、ｎ個のサンプルを準備し；
ｂ）２種またはそれ以上の当該ｎ個のサンプルを可能なすべてのコンビネーションで混合し、第一の試験されるべき混合物のセットを得；
ｃ）該第一の混合物のセットを機能性パラメータの測定能を有する機能性アッセイに付し、その機能的作用に起因している化学的存在を同定し；
ｄ）各々が工程ｃ）において機能的作用に起因している化学的存在を含むｍ個のサンプルを選択し、ここでｍはｎよりも小さく；
ｅ）該ｍ個のサンプルを可能なすべてのコンビネーションにて混合し、第二の試験されるべき混合物のセットを得；
ｆ）該第二の混合物のセットを機能性パラメータの測定能を有する機能性アッセイに付し、その機能的作用に起因している化学的存在を同定し；および
ｇ）所望の機能的作用を有する混合物を選択する
工程を含む、方法に関する。
【００１６】
上記した方法は、合理的手段にて、試験されるべきｎ個のサンプルの可能なすべての混合物についての情報を提供する点で独特なものである。可能なすべての混合物を機能的作用について調査し、最適な機能的作用を示す混合物を同定し、また他の化合物の機能を強化する化合物を選択することも可能となる。
【００１７】
多種のサンプルが試験されるべき状況では、上記した本発明の基本的な方法は、付加的な工程を含めることでさらに合理化されてもよい。第一に、ｎ個のサンプルをサブグループに分け、その後で各サブグループ中のサンプルを工程ａ）、ｂ）およびｃ）に供し、所望によりまた工程ｄ）、ｅ）およびｆ）に供してもよい。各グループにおいて、ついで、工程ｃ）、および所望により工程ｆ）において得られた結果に基づいて、例えば効能または薬効基準に基づいて、サンプルを選択し、ついでこれらの最も効能のある化学的存在だけを含む新しい混合物を混合して試験する。このように、混合物を調製し、機能性アッセイを行うことで行われるべき仕事の量は最低に維持される。別の状況で、かなりの数の化学的存在を含む混合物が目標とされてもよく、かかる場合には、小数の化学的存在を含む最も効能がある混合物を最初に同定して選択し、その後でこれらの選択された混合物を混合して分析される。このように、本発明の方法は、最低の時間および労力で最も効能があり、効果的な混合物を同定する系統的かつ合理的な方法を提供するように修飾される。
本発明の方法のこの系統的かつ合理的な操作方法によれば、本発明の方法は、自動操作に、例えばロボットによる操作に十分に適合される。
【００１８】
もう一つ別の態様において、本発明は、少なくとも２種の化学的存在を含む混合物中で、化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定かつ選択する方法であって、該混合物が所望の機能的作用を示し、
ａａ）各々が一の化学的存在を混合物中にあるように含むｐ個のサンプルを準備し；
ｂｂ）該ｐ個のサンプルの各々をｑ倍に希釈し、ｐ個の一連のサンプルを得、その各々が同じ化学的存在を異なる濃度で含み、
ｃｃ）工程ａａ）およびｂｂ）にて得られたサンプルの２種またはそれ以上を可能なすべてのコンビネーションで混合して、試験されるべき混合物を得、
ｄｄ）該混合物を機能的作用の測定能を有する機能性アッセイに供して、測定される機能的作用と混合物中の化学的存在の濃度との関係を同定し、および
ｅｅ）所望の機能的作用を有する混合物を選択する
ことを含む、方法に関する。
【００１９】
この操作により、混合物中に存在する化学的存在の間の最適な化学量論的割合が系統的かつ合理的な方法にて同定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】一群のドラッグの最も効能のあるコンビネーションを同定するのに、本発明の選択的方法を行うための一の方法の斜視図を示す。
【図２】８種のドラッグ候補体の第一、第二および第三層を９６ウェルプレートに添加した後のレシーバープレートのレイアウトの斜視図を示す。Ａ）層１、Ｂ）層１＋２、およびＣ）層１＋２＋３。８種のドラッグ候補体は異なるグレーの色合いで示される。
【図３】種々の抗体を含有する混合物についてのＡ４３１ＮＳ細胞成長の％ＭＡＣ（％代謝活性細胞）の散布図を示す。各ドットは６つの試験ウェルの平均を示す。個々の抗生物質を含有するすべての混合物の中央％ＭＡＣも示す。点線はＡ４３１ＮＳ細胞成長に対して効果のないレベルを示す。
【図４】上図は、最も高い薬効を有する２０種の抗体の混合物の平均％ＭＡＣをＳＥＭと共に示す棒グラフであり、下図にて最終グループにて個々の抗体を含有するすべての混合物についてのＡ４３１ＮＳ細胞増殖の％ＭＡＣの散布図を示す。各ドットは６つの試験ウェルの平均を示す。すべての抗体の混合物の中央％ＭＡＣも示す。点線はＡ４３１ＮＳ細胞成長に対して効果のないレベルを示す。
【図５】上図は、最も高い薬効を有する２０種の抗体の混合物の平均％ＭＡＣをＳＥＭと共に示す棒グラフである。下図にて、最終グループにてすべての２−ミックス含有の抗体についてのＡ４３１ＮＳ細胞増殖の％ＭＡＣの散布図を示す。各ドットは６つの試験ウェルの平均を示す。すべての抗体の混合物の中央％ＭＡＣも示す。点線はＡ４３１ＮＳ細胞成長に対して効果のないレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本明細書中で使用される「化学的存在」なる語は、化合物または２種またはそれ以上の化合物のコンビネーションを意味し、そのコンビネーションにて２種またはそれ以上の化合物の間の化学量論的割合は一定値で固定される。
【００２２】
本明細書中で使用される「ｎ個のサンプルの２種またはそれ以上を可能なすべてのコンビネーションで混合する」なる記載は、各混合物にて所定の数の化学的存在を有する、ｎ個のサンプルの可能なすべてのコンビネーションを生成することをいう。例えば、３つのサンプル（すなわち、３種の異なる化学的存在）を可能なすべてのコンビネーションで混合する場合では、ｎ個のサンプルのいずれかのうち３種の異なる部分を含む可能なすべての混合物が生成される。これは３種の異なるサンプルの各々の一部を含む混合物（すなわち、３種の異なる化学的存在を含有する混合物）ならびに一のサンプルの二部（一の化学的存在）と異なるサンプルの一部（異なる化学的存在）とを一緒に含む混合物、および単一のサンプルの三部（すなわち、単一の化学的存在を含有する）を含む混合物を包含する。数学的には、コンビネーションの数は：
【数１】
［式中、ｎは試験されるべきサンプルの数であり、ｋは各混合物中にて混合されるサンプルの数である］
として記載することができる。
【００２３】
かくして、混合物の数は、試験されるべきサンプルの数および各混合物中にて一緒に混合されるサンプルの数に依存する。例えば、４種のサンプルを３種のサンプルを含む混合物にて試験する場合には、その場合のコンビネーションの数は：
【数２】
に等しく、２０のコンビネーションに相当する。
【００２４】
４種のサンプルＡ、Ｂ、ＣおよびＤを指定した場合、次の２０のコンビネーションが得られる：
【表１】
【００２５】
本明細書において使用する「ポリクローナル蛋白」または「多クローン性」は、異なるが相同な蛋白分子を含む蛋白組成物をいい、好ましくは、免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される。かくして、各蛋白分子は、組成物の他の分子に相同であるが、また、ポリクローナル蛋白の個々のメンバー間のアミノ酸配列の差異によって特徴付けられる、可変ポリペプチド配列の１つもしくはそれ以上のストレッチを含有する。そのようなポリクローナル蛋白の既知の例として、抗体または免疫グロブリン分子、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体が挙げられる。ポリクローナル蛋白は、蛋白分子の所定のサブセットよりなっていてもよく、所望の標的に対する結合活性の共有などの共通の特性により定義される、所定のサブセットの蛋白分子、例えば、所望の標的抗原に対して結合特異性を示すポリクローナル抗体からなっていてもよい。
【００２６】
「抗体」なる語は、血清の機能的成分をいい、分子のコレクション（抗体もしくは免疫グロブリン、フラグメントなど）または１つの分子（抗体分子もしくは免疫グロブリン分子）のいずれかをいうことが多い。抗体分子は、特異的抗原決定基（抗原もしくは抗原エピトープ）に結合するか、または反応することが可能であり、次いで、免疫学的エフェクター機構の誘導をもたらし得る。個々の抗体分子は、通常、単一特異性として認識され、抗体分子の組成物は、モノクローナル（即ち、同一の抗体分子よりなる）であってもよく、あるいはポリクローナル（即ち、同じ抗原または別々の異なる抗原上の同じもしくは異なるエピトープと反応する異なる抗体分子よりなる）であってもよい。ポリクローナル抗体を構成する別々の異なる抗体分子は「メンバー」と称することもできる。各抗体分子は、それが、その対応する抗原に特異的に結合することを可能にする独特な構造を有し、すべての天然の抗体分子は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖の全体的に同じ基本構造を有する。抗体はまた、包括的に免疫グロブリンとしても公知である。本明細書において使用する抗体なる語は、広い意味で用いられ、無傷の抗体、キメラ、ヒト化、完全なヒトおよび一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ‘、（Ｆａｂ’）２，ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメント、ならびに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＭのような多量体形態を含む。
【００２７】
「ポリクローナル抗体」なる語は、同じもしくは異なる抗原上のいくつかの異なる特異的抗原決定基に結合または反応することが可能な異なる（種々の）抗体分子の組成物をいう。通常、ポリクローナル抗体の可変性は、ポリクローナル抗体のいわゆる可変領域、特にＣＤＲ領域に局在する。ポリクローナル抗体のメンバーが抗原に結合すると言われる場合、このことは１００ｎＭより低い、好ましくは１０ｎＭより低い、さらに好ましくは１ｎＭより低い結合定数を有する結合をいう。
【００２８】
本明細書にて使用される「２−ミックス」または「３−ミックス」は、各々、２または３の異なる化学的存在、例えば２または３の異なる抗体を含有する混合物をいう。
【００２９】
「免疫グロブリン」なる語は、一般に、血液または血清において見られる抗体の混合物の総称として使用されるが、他の供給源に由来する抗体の混合物を示すために使用されてもよく、あるいは「抗体」なる語で同意語として用いられてもよい。ヒト抗体分子の種類は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭである。各種類のメンバーは同じアイソタイプのものであるようである。ＩｇＡおよびＩｇＧアイソタイプはさらにサブタイプに細分類される。ＩｇＡおよびＩｇＧのサブタイプは、通常、各々、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４をいう。
【００３０】
「同族ＶＨおよびＶＬをコードするペア」または「ＶＨおよびＶＬ配列の同族ペア」なる語は、同じ細胞内に含まれる、または同じ細胞から誘導されるＶＨおよびＶＬをコードする配列のもともとのペアをいう。かくして、同族ＶＨおよびＶＬペアは、そのような細胞が誘導されるドナーに元々存在するＶＨおよびＶＬペア形成を表す。「ＶＨおよびＶＬをコードするペアから発現される抗体」なる語は、抗体または抗体フラグメントが、ベクター、プラスミド、もしくはＶＨおよびＶＬをコードする配列を含有する類似物から産生されることを示す。同族ＶＨおよびＶＬをコードするペアが完全抗体またはその安定なフラグメントのいずれかとして発現される場合、それらは、それらが誘導される細胞から元々発現される抗体の結合アフィニティーおよび特異性を保持する。同族ペアの組成物はまた、同族ペアのレパートリーとも呼ばれ、そして個々に維持されてもよく、またはプールされてもよい。
【００３１】
「エピトープ」なる語は、一般に、抗体が結合するであろう抗原上の部位をいう。抗原は免疫応答を刺激する物質、例えば、トキシン、ウイルス、細菌、蛋白またはＤＮＡである。抗原は、それが極めて小さくない限り、１つを超えるエピトープを有することも多い。同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体は、エピトープの局在に依存して、その結合する抗原の活性に様々な作用を有しうる。抗原の活性部位のエピトープに結合する抗体は、抗原の機能を完全に遮断し得るが、一方、異なるエピトープに結合する別の抗体は、抗原の活性に全くもしくはほとんど作用しないかもしれない。しかし、そのような抗体は、それでも補体または他のエフェクター機構を活性化し、それによって抗原の排除をもたらすかもしれない。
【００３２】
「受容体」は細胞の原形質膜または細胞質のいずれかに組み込まれている蛋白分子であり、それに可動性シグナル化（または「シグナル」）分子が結合してもよい。受容体に結合する分子は「リガンド」と称され、蛋白、ペプチド、神経伝達物質、ホルモン、医療用ドラッグまたはトキシンであってもよい。かかる結合が起こると、受容体は構造変化を受け、それは、通常、細胞応答を開始させる。しかしながら、あるリガンドは、いずれの応答も誘発することなく、単に受容体を遮断するにすぎない（例えば、アンタゴニスト）。受容体でのリガンド誘発の変化は、リガンドの生物学的活性を構成する生理学的変化をもたらす。「可溶性受容体」は膜貫通領域のない受容体である。可溶性受容体は、シグナルを発することはできないが、膜結合受容体と同様にそのリガンドに結合しうる。
【００３３】
「相乗」とは、一の系の最終結果がそれぞれの部分の合計よりも大きい状況をいうのに用いられる語である。相乗の反対が拮抗であり、２種の試薬を組み合わせて、その個々の作用から推定される作用よりも小さい全体としての作用を有する現象である。相乗はまた：ａ）全体の作用がその個々の作用の合計よりも大きいところの相互に有利な結合；ｂ）結合した作用が個々の要素の作用の合計よりも好まれるところの劇的な状況；ｃ）部分が別々に行動することで予測できない全体の系の行動；または２種またはそれ以上の刺激またはドラッグの共同作用を意味する。本明細書においては、「相乗」は、一般に、後者の定義をいい、すなわち、２種またはそれ以上のドラッグ、例えば２種またはそれ以上の抗体のコンビネーションの、所定の条件での全体の作用が、個々の作用の合計よりも大きいことをいう。
【００３４】
詳細な記載
本発明は、化合物を試験するのに用いることのできる機能性アッセイの型、および本発明の方法にて用いることのできる化学的存在の型を含め、該方法を如何に実施するかについてより詳細に記載されるであろう。
【００３５】
発明の方法の記載
本発明の方法は、所望の機能的作用を有する少なくとも２種の化学的存在を含む混合物を得るのに、機能的作用に起因する化学的存在および／または機能的作用を有する化学的存在を同定かつ選択するように設計される。該方法は、一のドラッグ中に２、３またはそれ以上の化合物が合わされた場合に存在しうる相乗的またはコンビナトリアル作用を同定することができるため、該方法は、特に新規なコンビナトリアルドラッグ、とりわけ組換えポリクローナル抗体を同定するのに適している。しかしながら、該方法はまた、例えば農薬または化粧品の場合における所望の相乗作用または２種の異なる機能的作用のいずれかを示す、少なくとも２種の活性な化合物を含む、他の製品の開発における使用を見出すことができる。
【００３６】
本発明の方法は、少なくとも７つの工程、すなわち、上記した工程ａ）ないしｇ）からなる。工程ａ）においては、複数のサンプル（ｎ個のサンプル）を準備する。そのサンプルの各々は試験されるべき一の化学的存在を含む。工程ｂ）にて、そのｎ個のサンプルのうち少なくとも２個を可能な全てのコンビネーションにて混合し、第一のセットの試験されるべき混合物を得る。このようにして、複数の混合物を系統的に得、可能な全ての混合物の検査を確保する。工程ｃ）にて、第一のセットの混合物の各々を、機能性パラメータの測定を可能とする機能性アッセイに供し、その機能的作用に起因する化学的存在を同定する。工程ｄ）にて、機能性アッセイからの情報を用いて、その各々が所望の機能的作用に起因する化学的存在を含む複数のサンプルを選択する。この工程で選択されるサンプルの数（ｍ）はサンプルの最初の数（ｎ）より小さい。本発明の基本的な方法は、４つの付加的な工程ｅ）−ｇ）を含む。工程ｅ）にて，ｍ個のサンプルの２またはそれ以上を可能なすべてのコンビネーションにて混合し、第二のセットの試験されるべき混合物を得る。工程ｆ）にて、第二のセットの混合物を機能性パラメータの測定を可能とする機能性アッセイに供し、その機能的作用に起因する化学的存在を同定する。ついで、この機能性アッセイからの情報を用い、工程ｇ）にて所望の機能的作用を有する混合物を選択する。工程ｆ）にて行われる機能性アッセイは、典型的には、工程ｃ）で行われる機能性アッセイと同じであろう。しかしながら、これら２つの工程にて、２種の異なる機能性アッセイを行うことも可能である。もう一つ別の方法は、例えば、工程ｃ）およびｆ）にて同じ機能性アッセイを行うことであるが、混合、アッセイおよび選択の１または複数のさらなるラウンドでは異なる機能性アッセイを行うことである。もちろん、所定のいずれの工程においても、２またはそれ以上の異なる機能性アッセイを行うことも、単一のアッセイでよりも２またはそれ以上のアッセイでの選択を基礎とすることも可能である。
【００３７】
上記した方法において、ｎ個の異なるサンプルを機能的作用について試験する。これらのｎ個のサンプルは試験されるべきサンプルの総数に等しいか、またはｎ個のサンプルは、該サンプルを混合し、基本的な工程ａ）−ｇ）に供される前に、複数のサブグループに分割される、多数のサンプルを出発点とするサブグループを構成してもよい。
【００３８】
さらに具体的には、試験すべきサンプルの数が一の限定された数にすぎない場合、試験すべき混合物の数が十分に限定され、そのすべてを、不当に負担することなく、機能性アッセイに供することができるため、上記した７つの工程、すなわち工程ａ）ないしｇ）だけを含む方法が行われる。しかしながら、多数のサンプルを試験する必要がある場合、その場合、試験すべき混合物の可能なすべてのコンビネーションの数もまた大きく、その機能的作用を測定するには過度の労力が必要とされる。かかるケースにおいて、本発明の方法を合理的なものとするのに、もう一つ別の系統的方法を用いて目的とする化学的存在を選択してもよい。
【００３９】
かくして、多数のサンプルを試験しなければならない、および／または各混合物において多数のサンプルがある場合には、最初に、試験されるべきサンプルの数を、各々がｎ個のサンプルを含む、より小さなサブグループに分け、その後で各サブグループの２またはそれ以上のｎ個のサンプルを工程ｂ）において可能なすべてのコンビネーションにて混合し、該混合物を工程ｃ）にて機能性アッセイに供するのが都合がよい可能性がある。
【００４０】
しかしながら、各サブグループにあるサンプルが可能なすべてのコンビネーションにて混合されるにすぎず、この時点で試験されるべきサンプルの可能なすべての混合物が混合され、機能性アッセイに供されているわけではないから、この方法では最適な混合物が試験されない可能性がある。第一のラウンド（工程ａ）−ｄ））にて試験されていないコンビネーションについてのさらなる情報は、典型的には、工程ｅ）−ｇ）に示されるような、混合、機能性アッセイによる試験および選択という新たなラウンドにより得られるであろう。このケースでは、選択されるｍ個のサンプルを異なるサブグループより開始し、新たな混合物を形成することが好ましい。サンプルを選択するための種々の方法が後記されるであろう。
【００４１】
ｍ個のサンプルを選択した後、該ｍ個のサンプルのうち少なくとも２個を工程（ｅ）ｎｉｔｅ可能なすべてのコンビネーションにて混合することで新たな混合物を形成する。このようにして、新たな混合物を得、それをその後で工程（ｆ）の機能性アッセイに供し、そこで機能性パラメータを測定して、機能的作用を有するか、その作用に起因する化学的存在を同定する。
【００４２】
工程ａ）にて準備されたサンプルの数（ｎ個のサンプル）が非常に大きい場合で、複数の工程で試験されるべきサンプルの数を選択することが有益である場合において、その機能性アッセイを行う必要のある混合物の数は、最も合理的であるように、限定される。このことは、最も適切には、工程ｄ）、ｅ）およびｆ）を繰り返すことでなされる。このようにして、工程ｃ）にて選択されるサンプルはサブプールに分けられ、その各々はｍ個のサンプルを含み、それに対して工程ｄ）、ｅ）およびｆ）を実施する。各繰り返しにおいて、選択されるサンプルの数は減少する。当業者であれば、異なるプールからのサンプルに対して実施される工程が並行してまたは連続して行われうることが分かるであろう。
【００４３】
本発明の方法は、２個のサンプルを含有する混合物を試験することを包含する。しかしながら、該方法は、工程ｂ）のｎ個のサンプルのうち３個、または所望により３個より多くを可能なすべてのコンビネーションにて混合することでなされることが好ましい。また、工程ｅ）のｍ個のサンプルのうち３個、または所望により３個より多くを混合することが好ましい。当業者は３個より多くのサンプル、例えば、４、５、６または７個のサンプルを、さらには８、９、１０またはそれ以上のサンプルを混合することで得られる混合物もまた本発明の方法の範囲内にあることを認識するであろう。
【００４４】
あるケースでは、その目標は比較的多くの異なる化学的存在を含む混合物を同定することかもしれない。そのような混合物の一例が、例えば５−１５種の異なる個々の抗体を含有するように設計された組換えポリクローナル抗体である。そのようなケースにおいて、その過程は、最初に、例えば、３種の異なる抗体または他の化学的存在を試験する、少数の異なる化学的存在だけを含む混合物を試験し、ついでその後で２個またはそれ以上の選択された混合物を混合し、ついでその新たな混合物を機能性アッセイに供することで、工程ｅ）−ｇ）にて、試験のための新たな混合物を形成し、選択することで、合理化されてもよい。かくして、混合、試験および選択の第二ラウンドでは、例えば最初の機能性アッセイ（工程ｃ））に基づく、３種の異なる化学的存在の混合物は、工程ｅ）にて混合される「サンプル」であると考えることができ、その結果、工程ｆ）の機能性アッセイに供されるサンプルは、工程ｃ）にてアッセイされた最初の混合物よりも、多数の異なる化学的存在を含有するであろう。本発明の基礎となる方法の変形は、工程ｃ）の後に行う以下の工程により規定されてもよい：
ｄ１）所望の機能的作用を有するｍ１個の混合物を選択し；
ｅ１）工程ｄ１）より選択されるｍ１個の混合物のうち２、３、４または５個を可能なすべてのコンビネーションにて混合し；
ｆ１）工程ｅ１）の混合物を、機能性パラメータを測定することのできる機能性アッセイに供し、機能的作用に起因する混合物を同定し；および
ｇ１）工程ｅ１）の混合物より、所望の機能的作用を有する第二の混合物を選択する。
【００４５】
工程ａ）−ｇ）に示される本発明の基礎となる方法は、必要であれば、例えば、試験されるべきサンプルの総数（ｎ）および最終混合物中にある所望の異なる化学的存在の数に応じて、変形することができる。基礎となる方法は、混合、アッセイおよび選択の少なくとも２つのラウンド、すなわち工程ｂ）、ｃ）およびｄ）からなる一のラウンドと、工程ｅ）、ｆ）およびｇ）からなるもう一つ別のラウンドを含む。しかしながら、状況に応じて、これらのラウンドの一方または両方は１回またはそれ以上の回数繰り返されてもよい。
【００４６】
非常に多くの化学的存在、例えば約２５種までの異なる個々の抗体を含有する組換えポリクローナル抗体を含む混合物を意図とする場合、その時には該方法は３以上の工程、すなわち工程ｈ）、ｉ）およびｊ）を含んでもよい。工程ｈ）においては、工程ｇ１）で得られた混合物から選択された２、３、４または５個を混合し、その後の工程ｉ）にて該混合物を機能性パラメータを測定することのできる機能性アッセイに供し、機能的作用を有する混合物を同定する。最終工程である工程ｊ）において、所望の機能的作用を有する第三の混合物を選択する。
【００４７】
上記した型の基礎となる操作にさらなる工程またはさらなるラウンドを含ませることで該発明を拡張することも当業者の範囲内であろう。
【００４８】
機能的作用を有する、または該作用に起因する化学的存在を含むサンプルの適当な同定を行うためには、検査される化学的存在が一度だけ出現する、サンプルだけを比較ことが好ましい。例えば、抗体３−ミックスのケースにおいて、３種の異なる抗体を含有するサンプル（すなわち、一の抗体の二つの部分および別の抗体の一の部分、または単一の抗体の三つの部分を含有するサンプルを除く）だけを比較することが望ましい。後記されるように、本発明はまた、化学的存在の間の最適な化学量論的割合が同定され得る方法を提供し、そのために、異なる濃度で存在する化学的存在による機能的作用に対する起因を排除するのに、異なる化学的存在の濃度が同定される混合物だけを比較することが望ましい。この方法を用いる場合、各々、工程ｅ１）および工程ｈ）にて調製される混合物中に化学的存在が１回だけ現れることが好ましい。
【００４９】
機能的作用を有する、または該作用に起因する化学的存在を含むサンプルを選択する場合には、多くの異なる方法を用いることができる。一の方法にて、化学的存在Ａが機能的作用を有るか、該作用に起因するかどうかについての同定は、化学的存在Ａを含む混合物の機能的作用を、化学的存在Ａを含まない少なくとも一つの混合物の機能的作用と比較することでなされる。例えば、３つの機能的存在を含有する混合物のケースでは、化学的存在Ａが機能的作用を有するか、またはそれに起因するかどうかについての同定は、化学的存在Ａおよび／または化学的存在Ｂを含む３つのサンプルを可能なすべてのコンビネーションで混合し、例えば化学的存在Ａの一の部分および化学的存在Ｂの二の部分、および化学的存在Ａの二の部分および化学的存在Ｂの一の部分を含む混合物の機能的作用を、化学的存在Ｂの三の部分を含む混合物の機能的作用と比較することでなされる。
【００５０】
もう一つ別の方法において、化学的存在Ａが機能的作用を有するか、またはその作用に起因するかどうかについての同定は、化学的存在Ａと他の化学的存在を一緒に含む混合物の機能的作用を、化学的存在Ａを含むだけの混合物の機能的作用と比較することでなされる。
【００５１】
さらにもう一つ別の方法において、化学的存在Ａが機能的作用を有するかどうかについての同定は、化学的存在Ａを含む混合物の機能的作用を、標準値と比較することでなされる。この標準値は所定の値であることが好ましい。化学的存在Ａを含む混合物の同定された機能的作用は、化学的存在Ａについて機能的作用を有するか、またはそれに起因すると定められた次元において、所定の値よりも高いか、等しいか、または低いかのいずれかでなければならない。あるケースにおいては、標準値は、化学的存在Ａを含む混合物の機能的作用の同定が、化学的存在Ａについて機能的作用を有するか、またはそれに起因すると定められた次元になければならない範囲内の区間にあってもよい。他のケースにおいて、標準値は分析アッセイを行うことで測定されるパラメータの平均値、例えば、混合物を機能性アッセイに供した場合に測定されるすべての値の平均値であってもよい。
【００５２】
機能的作用を有するか、または該作用に起因する化学的存在を同定するための一の好ましい方法は、その機能的作用を有する混合物中で最も頻繁に出現する化学的存在を同定することである。最も薬効および効能がある混合物の化学組成を確立し、どの化学的存在がそれらの混合物中に最も頻繁に出現するかを同定することで、特定の化学的存在がその機能的作用に起因しているか、時にどのように起因しているかについての良好な指標を得ることができる。この方法は以下の実施例３に用いられており、その機能性アッセイの結果は抗体９９２が上位２０の有効な混合物のうちの１９の混合物で認められ（図４を参照のこと）、かくしてこの抗体が他の抗−ＥＧＦＲ抗体とのコンビネーションにおいて非常によく活動していると結論付けることができる。
【００５３】
試験されるべきサンプルの数は、検査されるべき化学的存在が同じ型（例えば、抗体）であるかどうか、あるいは化学的存在が異なる型（例えば、小分子ドラッグと合した抗体）であるかどうかについて、調査されるコンビナトリアルドラッグの型に応じて著しく変化しうる。ｎは３またはそれ以上の整数であり、例えば３と１４４０の間、好ましくは３と３６０、例えば３と１２０の間、あるいはさらに好ましくは３と２４、例えば３と１２の間の整数である。
【００５４】
開始時のサンプルの数に応じて、工程ｄ）の選択されるサンプルの数（ｍ個のサンプル）もまた著しく変化しうる。しかしながら、ｍは３またはそれ以上の数値、例えば３と７２０の間、好ましくは３と３６０、例えば３と１２０の間、あるいはさらに好ましくは３と２４、例えば３と１２の間の整数である。
【００５５】
本発明においては、ある化学的存在の不在下でのパラメータと比較した場合に、その化学的存在があることで変化しうる機能性パラメータを測定することで、化学的存在または化学的存在の混合物の機能的作用が機能性アッセイにおいて同定される。測定されるべき機能性パラメータは、例えば、以下のいずれかである：
・物理的作用の発揮−これは、例えば蛍光発光、または吸光度または他の電磁気照射であり得る；
・リガンドまたは抗原との結合−典型例が受容体分子または抗体の結合である；
・触媒活性、例えば酵素活性の発揮；
・触媒活性、例えば酵素活性に対する多感性；
・試薬の生物膜を通過する改変された輸送の促進；
・試薬の細胞内コンパートメントにおける改変された転位の促進；
・真核生物細胞の集団中の少なくとも１つの遺伝子の発現に対する影響−すなわち、化合物の発現調節剤としての機能（例えば、転写レベルに対する）がアッセイされ得る；
・真核生物細胞の集団の成長または代謝作用に対する影響−成長調節剤の変異バージョンをコードするライブラリーをスクリーニングする場合において都合がよい；
・標的細胞に対する影響−例えば、増殖、抗増殖、分化、アポトーシス、代謝作用またはドラッグ感受性に対する化合物の作用について試験することが可能であり、そのいずれも、例えば抗癌剤として機能しうる生成物の発現についてスクリーニングした場合に関連するものであってもよい；
・病原体に対する影響−ウイルス中和、ウイルスとの結合または殺ウイルスについてアッセイすることが可能であり、同様に細菌との結合、殺菌、食作用、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ等についてアッセイすることも可能である；
・二次免疫作用に対する影響；
・化合物の発現、製造または処方能に対する影響；
・安定性に対する影響。
【００５６】
「所望の機能的作用」なる語は機能性パラメータの所望の変更をいう。その機能性パラメータの望ましい変更は、アッセイされる化学的存在の特性およびインビトロおよびインビボでの意図される作用に依存するのは明らかである。典型的には、所望の機能的作用は問題の化学的存在が特定の条件で医薬の改善を提供する能力を有することを示唆する作用である。例えば、試験されるべき化学的存在が抗ＡＩＤＳ剤として用いられる物である場合、その所望の機能的作用はＨＩＶとの結合またはＨＩＶの中和を強化することができ、あるいはＨＩＶ感染細胞の不活化を向上させることができる。
【００５７】
新しいドラッグおよびドラッグコンビネーションを開発する場合、相乗作用を有する新規な製剤が、あるいは一より多くの機能的作用を有する新規な製剤が求められる。例えば、一方で癌を治療するドラッグを開発することにとって興味深く、他方では化学療法の副作用を減少させることにとって興味深い。もう一つ別の例として、１種より多くのウイルスを同時に根絶するインフルエンザワクチンは興味深いワクチンである。
【００５８】
かかる場合には、本発明の方法は、治療されるべき混合物を２またはそれ以上の機能性アッセイに供するように、各機能性アッセイが機能性パラメータを測定することができ、各混合物の２またはそれ以上の機能性パラメータを独立して測定するために、改変されてもよい。これらのアッセイは並行してまたは連続して行われてもよい。試験されるべき機能性パラメータは、例えば、真核生物細胞の集団の成長または代謝作用に対する影響であってもよく、あるいは標的細胞に対する影響であってもよい。
【００５９】
本発明の方法を実施するいずれのモードも使用することができる。しかしながら、製造される混合物の数および実施される機能性アッセイの数を考えれば、操作モードはある種の自動操作を含むことが好ましい。したがって、一の操作モードにおいて、該方法はマルチウェルプレートで行われる。これらのプレートは実験室では標準的な装置であり、当業者はかかるプレートを用いて実験をどのように行うかが分かっている。検査されるべき混合物を調製するのに行う必要のある労力が抑えられるため、該混合物は自動液体処理装置を用いて混合されることが好ましい。機能性アッセイもまた、ロボットを用いる装置および当該分野にて既知の方法によって実施されてもよい。
【００６０】
本発明のもう一つ別の態様は、少なくとも２つの化学的存在を含む混合物中での化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定かつ選択し、所望の機能的作用を得る方法を提供することである。当該方法はコンビナトリアルドラッグの最適濃度を見つける助けともなる。例えば、２またはそれ以上の抗体が同じ混合物中に存在する場合、特異的な標的に結合するために競合が生じる可能性があることは周知である。この競合は、一部、混合物中に存在する異なる抗体の濃度に依存し、その結果、特異的抗体の濃度が高ければ高いほど、抗体が競合して標的に結合する可能性が高くなるようである。かくして、コンビナトリアルドラッグの最適な相乗作用を達成するために、化学的存在の各々の濃度ならびに異なる化学的存在の間の化学量論的割合は最適化されることが好ましい。
【００６１】
混合物中の化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定かつ選択する本発明の方法は、少なくとも５つの工程を含む。第一の工程、工程ａａ）において、各々、混合物中に一つの化学的存在が存在して含む、ｐ個のサンプルが提供される。次に、工程ｂｂ）において、該ｐ個のサンプルは各々、ｑ倍に希釈され、各々、同じ化学的存在を含むが、その濃度が異なる、ｐ個の一連のサンプルを得る。その後、工程ｃｃ）において、工程ａａ）およびｂｂ）にて得られて２またはそれ以上のサンプルを可能なすべてコンビネーションにて混合し、試験されるべき混合物を得、ついで工程ｄｄ）にて工程ｃｃ）にて得られた混合物を機能的作用を測定することのできる機能性アッセイに供して、測定される機能的作用と混合物中の化学的存在の濃度の間の関係を同定する。最終工程、工程ｅｅ）にて、所望の機能的作用を有する混合物を選択する。
【００６２】
工程ａａ）にて準備されるサンプルの数は検査されるべき混合物中に存在する異なる化学的存在の数に対応している。かくして、３つの異なる化学的存在を含むコンビナトリアルドラッグを意図とする場合、ｐは３に等しい。しかしながら、好ましくは、ｐは２またはそれ以上の値を有する整数であり、より好ましくは２と２４の間の値、さらにより好ましくは２と１２の間の値を有する。
【００６３】
主に、工程ｂｂ）においては、サンプルは当該分野にて知られている適当な倍率に希釈され得る。しかしながら、サンプルは２、５、１０、２０、５０または１００倍に希釈されることが好ましい。いずれのサンプルも数倍に希釈され、各サンプルが異なる濃度を有する、一連のサンプルを得ることができる。好ましい方法はサンプルが１、２、３、４または５倍に希釈されているものである。
【００６４】
本発明のもう一つ別の態様において、本発明の方法により最適であると同定される混合物は、医薬として、あるいは医薬の製造のために用いることができる。しかしながら、上記したように、本発明の方法により選択かつ同定される混合物はドラッグに適するだけでなく、２またはそれ以上の化合物を含む他の生成物、例えば農薬または化粧品にも適している。
【００６５】
本発明に従って選択されうる化合物の例
一般に、ヒトおよび動物に投与された場合に、効果的な作用のあることが知られている化合物は、本発明の方法にて試験する対象であろう。しかしながら、効果的な作用、例えば、医薬としての作用を有することが分かっていない化合物もまた、不明な作用または１または複数の他の化合物と組み合わせて試験されると、明らかになるかもしれない、おそらくは相乗作用を見出すために試験されてもよい。
【００６６】
本発明の方法において、試験されるべき化学的存在に含まれる化合物は、医学的症状の治療または予防用の化合物であってもよく、あるいは医学的症状の緩和用、あるいはヒトまたは動物の健康用の化合物であってもよい。しかしながら、本発明の方法にて試験されるべき化合物は、抗体、抗生物質、抗がん剤、抗ＡＩＤＳ剤、抗成長因子、抗ウイルス剤、生物製剤（例えば、可溶性受容体、サイトカインおよび他の蛋白を包含する）、ＲＮＡｉ、ワクチンおよびそれらの混合物からなる群より選択されることが好ましい。
【００６７】
試験されるべき化学的存在に含まれる化合物が抗体である場合には、機能性アッセイに供される混合物は、２または複数の抗体のコンビネーション、あるいは少なくとも一つの抗体が、例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗がん剤、抗自己免疫疾患剤、およびＲＮＡｉからなる群より選択される１または複数の他の化合物と合されるコンビネーションであってもよい。試験されるべき化学的存在に含まれる化合物は抗体であることが好ましく、試験されるべき化学的存在に含まれる化合物はモノクローナル抗体であることがより好ましい。本発明は、組換えポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のカクテルとして産生され得るモノクローナル抗体の最適なコンビネーションを同定するために、モノクローナル抗体の多数のコンビネーションを試験するのに特に適している。
【００６８】
抗体
本発明の方法に用いることができる化合物の一群は、エピトープを特異的に認識し、かつ結合する抗体またはその機能性等価物を包含する。
【００６９】
抗体またはその機能性等価物は、当該分野にて公知の抗体、例えば哺乳動物より誘導されるモノクローナル抗体または合成抗体、例えば一本鎖抗体または抗体フラグメントを含むハイブリッドであってもよい。加えて、抗体の機能性等価物は抗体フラグメント、特にエピトープ結合フラグメントであってもよい。さらには、抗体またはその機能性等価物は抗体を模倣する小分子であってもよい。天然の抗体は、重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンである。本発明の好ましい実施態様において、個々の抗体はモノクローナル抗体であり、該発明は組換え抗体「カクテル」または組換えポリクローナル抗体にて用いるのに適するモノクローナル抗体の混合物を同定するのに用いられる。
【００７０】
本発明の抗体はまた、二特異的抗体、すなわち２種の異なるエピトープを特異的に認識する抗体であってもよい。二特異的抗体は、一般に、モノクローナル抗体から始まって調製されてもよく、あるいは組換え技法を用いて調製されてもよい。本発明の抗体はまた、三特異的抗体であってもよい。
【００７１】
抗体の機能性等価物は、一の好ましい実施態様において、抗体のフラグメント、好ましくは抗原結合フラグメントまたは可変領域であってもよい。本発明で有用な抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂフラグメントと称される、２つの同一の抗原結合フラグメントを産生し、各々は、単一の抗原結合部位および残りの「Ｆｃ」フラグメントを有する。ペプシン処理で、抗原との交差連結能を有する２つの抗原結合フラグメント、および残りの他のフラグメント（ｐＦｃ’と称される）を有するＦ（ａｂ‘）２フラグメントが得られる。かかるフラグメントはまた、重鎖および軽鎖コーディング領域の関連する部分を発現ベクターに挿入することにより、組換え技法で産生されてもよい。付加的なフラグメントは、ジアボデー（diabodies）、線形抗体、一本鎖抗体分子および抗体フラグメントより形成される多特異的抗体を包含しうる。本明細書にて用いられる、抗体と関連する「機能性フラグメント」は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントをいう。好ましい抗体フラグメントは、抗体のその抗原との選択的結合性をいくらかまたは本質的にすべて保持する。
【００７２】
一の実施態様において、該抗体は、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有し、遺伝子融合した一本鎖分子としての適当なポリペプチドリンカーにより連結されている、遺伝子操作により作製された分子として定義される一本鎖抗体である。かかる一本鎖抗体はまた、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントとも称される。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それでｓｃＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成できるようにする。適当なリンカーを用いて、一本鎖Ｆａｂフラグメントも調製できる。
【００７３】
可変重鎖および可変軽鎖をコードするペアの単離および選択
抗体は、通常のモノクローナル抗体法、例えば、KohlerおよびMilstein, Nature 256: 495 (1975) の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、種々の方法により産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の技は、例えば、Ｂ−リンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換あるいはヒト抗体遺伝子のライブラリーを用いるファージ提示技術が用いられうる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体としての産生に適する完全なヒト抗体を単離する一の好ましい方法が、SymplexTM技術（Meijerら、J Mol Biol. 2006 5月5日; 358 (3): 764-72; およびＷＯ２００５／０４２７７４）であり、元々の重鎖および軽鎖のペアリングを維持し、ハイブリドーマ技術を必要とする細胞培養工程を回避する一方で、高い複雑性および多様性を有する抗体レパートリーを生成することができる。
【００７４】
抗体を産生する方法は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をコードする配列を適当な供給源から単離し、それによりＶＨおよびＶＬをコードするペアのレパートリーを生成することを含む。一般に、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を含有する適当な供給源は、適当な免疫応答と関連する標的に対して反応した１または複数の個体から由来の血液、脾臓または骨髄サンプルなどのリンパ球含有の細胞フラクションである。好ましくは、リンパ球含有のフラクションは、関連する標的と反応した、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するヒトまたはトランスジェニック動物より集める。集めたリンパ球含有の細胞フラクションをさらに豊富にし、特定のリンパ球集団、例えばＢリンパ球を得た。豊富化は、例えばＢ細胞および／または形質細胞の場合、結合特異性細胞表面マーカー蛋白の利点を考慮して、電磁ビーズ細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）および／または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて行うことが好ましい。リンパ球含有の細胞フラクションをＢ細胞および形質細胞について豊富化させることが好ましい。ましてやなおさら、高ＣＤ１９およびＣＤ３８発現および中間ＣＤ４５発現の細胞を血液より単離することが好ましい。これらの細胞は、時に、循環形質細胞、初期形質細胞またはプラズマブラスト（plasma blast）と称され、本願においては簡単にアスプラズマ（asplasma）細胞という。
【００７５】
一般に、ＶＨおよびＶＬをコードする配列の単離は、ＶＨおよびＶＬをコードする配列をベクターにて合わせ、ＶＨおよびＶＬをコードする配列のペアのライブラリーを生成する方法にて行うことができる。典型的な方法にて、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を無作為にベクターにて合わせ、ＶＨおよびＶＬをコードする配列のペアのコンビナトリアルライブラリーを生成する。ＶＨおよびＶＬをコードする配列の単離は、例えば、トランスジェニック動物の使用（さらには後記を参照）を含む、ファージ提示およびハイブリドーマ技術により行われ得る。
【００７６】
本発明においては、重鎖および軽鎖の元々のペアリングを維持し、ヒトであれ、動物であれ、ドナーにおける天然の免疫応答により生成される抗体のポテンシーおよびアフィニティーを維持することが好ましい。このことは、ドナーにて元々存在するＶＨおよびＶＬのペアリングの維持を含み、それにより配列ペアのレパートリーを生成し、その各々のペアが、配列を単離するドナーにより産生される抗体に元々存在するＶＨおよびＶＬペアに相当する、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をコードする。これはまた、ＶＨおよびＶＬをコードする配列の同族ペアと称され、抗体は同族抗体とも称される。一の好ましい実施態様において、コンビナトリアルまたは同族の、本発明のＶＨおよびＶＬをコードするペアをヒトドナーより得、したがって該配列は完全にヒト配列である。また、ＶＨおよびＶＬをコードするペアは、例えば、HuMAb-Mouse （登録商標）技術 (Medarex) またはXenoMouse（登録商標）技術 (Abgenix/Amgen) を用いて、ヒト抗体の産生能を有するトランスジェニック動物より得ることができる。
【００７７】
ＶＨおよびＶＬをコードする配列の同族ペアの生成についてはいくつかの異なる方法がある。一の方法はリンパ球含有の細胞フラクションと区別される単一細胞からのＶＨおよびＶＬをコードする配列を増殖および単離することを含む。ＶＨおよびＶＬをコードする配列を別々に増殖して第２工程にてペアを形成させるか、または増殖の間にペアを形成させてもよい（Coronellaら、2000 Nucleic Acids Res. 28: E85; Babcookら、1996 PNAS 93: 7843-7848）。別の方法は、インセル（in-cell）増殖およびＶＨおよびＶＬをコードする配列のペア形成を含む（Embletonら、1992. Nucleic Acids Res. 20: 3831-3837; Chapalら、1997 Bio Techniques 23: 518-524）。
【００７８】
ドナーにおけるＶＨおよびＶＬ配列の多様性と似ているＶＨおよびＶＬをコードする配列ペアのレパートリーを得るために、例えば、Meijerら（J Mol Biol. 2006 5月5日; 358 (3): 764-72）およびＷＯ２００５／０４２７７４（出店明示により本明細書の一部とする）に記載されるように、出来るだけＶＨおよびＶＬのペアのスクランブリング（ランダムコンビネーション）を少なくした、ハイスループット法が好ましい。
【００７９】
好ましくは、メンバーペアが標的とのチャレンジに対する体液性免疫応答に関与する遺伝子ペアを映す、ＶＨおよびＶＬをコードするペアのレパートリーは、以下の工程を含む方法に従って製造される：ｉ）関連する標的に対して結合する１または複数のドナーからのリンパ球含有の細胞フラクションを準備する工程；ｉｉ）該細胞フラクションからのＢ細胞または形質細胞を所望により豊富化させてもよい工程；ｉｉｉ）該細胞フラクションからの細胞を個々に複数の容器に分解することで単離された単一細胞の集団を得る工程；ｉｖ）該単離された単一細胞から誘導されるテンプレートを用いてマルチプレットオーバーラップエクステンションＲＴ−ＰＣＲ操作にてＶＨおよびＶＬをコードするペアを増殖させ、かつ結合させる工程；およびｖ）結合したＶＨおよびＶＬをコードするペアをネスト化されたＰＣＲを所望により実施してもよい工程。本発明の方法を実施する前に、単離された同族ＶＨおよびＶＬをコードするペアは上記したようにスクリーニング操作に供されることが好ましい。
【００８０】
該ＶＨおよびＶＬ配列ペアが生成されると、ＶＨおよびＶＬペアをコードする配列を関連する標的に対する結合反応性で同定するスクリーニング操作を行う。標的に対する結合剤についてのスクリーニングは、一般に、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡおよび／またはイムノドットアッセイなどの免疫検出アッセイを用いて実施される。
【００８１】
スクリーニングで選択されるＶＨおよびＶＬペアをコードする配列は、一般に、配列決定に供され、可変領域の多様性について分析される。特に、ＣＤＲ領域の多様性にとって興味深いが、ＶＨおよびＶＬファミリの提示にとっても興味深い。これらの分析に基づいて、１または複数のドナーより単離される剤結合抗体の多様性全体を提示するＶＨおよびＶＬペアをコードする配列を選択する。好ましくは、ＣＤＲ領域全体で異なる配列（ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）が選択される。異なるＶＨおよびＶＬファミリに属する１または複数の同一または極めて類似するＣＤＲ領域を有する配列があれば、これらも選択される。ＶＨおよびＶＬ配列ペアの選択も、可変重鎖のＣＤＲ３領域の多様性に基づいて行われ得る。配列のプライミングおよび増殖の間に、可変領域のフレームワーク領域にて変異が生じてもよい。配列をドナーの配列と完全に対応させるため、例えば、配列が可変領域のフレームワーク領域などのすべての保存領域にて完全にヒトであるように、そのようなエラーは訂正されることが好ましい。
【００８２】
ＶＨおよびＶＬペアをコードする選択された配列のコレクションの多様性全体が、異なる標的とのチャレンジに対する体液応答にて遺伝子レベルで見られる多様性を高度に代表することが確認される場合、選択されるＶＨおよびＶＬをコードするペアのコレクションより発現される抗体の特異性全体もまた、チャレンジされたドナーにて産生される抗体の特異性に関して代表すると考えられる。
【００８３】
トランスジェニック動物およびハイブリドーマを用いて産生される抗体
一の実施態様において、モノクローナル抗体は、マウス系よりもヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックまたはトランス染色体動物を用いて産生され得る。これらは、HuMab（登録商標）マウス、XenoMouse（登録商標）およびKMマウスなどのトランスジェニックおよびトランス染色体マウスを包含し、本明細書では包括的に「トランスジェニックマウス」という。
【００８４】
HuMAb-Mouse（登録商標）は、再配列されていないヒト重鎖（μおよびΥ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリンのミニ遺伝子を内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的とされる変異と一緒に含有する（Lonberg, N.ら、(1994) Nature 368 (6474): 856-859）。したがって、マウスは免疫化に対する応答においてマウスＩｇＭまたはκの発現の減少を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖のトランス遺伝子はクラススイッチおよび体細胞変異を経験し、高アフィニティヒトＩｇＧ、κモノクローナル抗体を産生する（Lonberg, N.ら、(1994), 前掲；lonberg, N.ら、(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonverg, N. およびHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93 およびHarding, F.およびLonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546）。HuMab（登録商標）マウスの調製は、Taylor, L.ら、(1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J.ら、(1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillonら、(1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg ら、(1994) Nature 368 (6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. ら (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. およびHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. およびLonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D.ら. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に詳細に記載されている）。さらには、US Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; and 5,770,429; すべてLonberg およびKay対するものである, ならびにUS 5,545,807 Suraniらに対する; WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 およびWO 01/09187を参照のこと。
【００８５】
ＫＭマウスはヒト重鎖トランス染色体およびヒトカッパ軽鎖トランス遺伝子を含有する。マウスの免疫化がマウス免疫グロブリンよりもヒト免疫グロブリンの産生をもたらすように、ＫＭマウスにおける内因性マウス重鎖および軽鎖遺伝子もまた中断されている。ＫＭマウスの構造およびヒト免疫グロブリンを産生するその使用がＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
【００８６】
ヒトモノクローナル抗体を産生するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックまたはトランス染色体マウス（例えば、ＨＣＯ１２、ＨＣＯ７またはＫＭマウス）が、例えば、Lonbergら、(1994)、前掲；Fishwildら、(1996)、前掲；およびＷＯ９８／２４８８４によって記載されるように、抗原および／または抗原を発現する細胞に富む調製物で免疫化され得る。別法として、マウスは該抗原をコードするＤＮＡで免疫化され得る。好ましくは、マウスは、最初の注入の際に６−１６週齢であろう。例えば、抗原に富む調製物（５−５０μｇ）を用いてHuMAb（登録商標）マウスを腹腔内にて免疫化することができる。純粋なまたは抗原に富む調製物を用いての免疫化が抗体を産生しない場合には、マウスを抗原を発現する細胞、例えば細胞株で免疫化し、免疫応答を促進することもできる。
【００８７】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するには、免疫化したマウスから脾臓細胞およびリンパ節細胞を単離し、それをマウス骨髄腫細胞株のような適当な免疫化細胞株に融合させ得る。ついで、得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生のためにスクリーンに付すことができる。例えば、免疫化したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞の５０％ＰＥＧ（ｗ／ｖ）との懸濁液を、ＳＰ２／０の非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣC，ＣＲＬ１５８１）に融合させ得る。細胞を約１ｘ１０５／ウェルで平底マイクロタイタープレートに置き、つづいて２週間、通常の試薬の他に、１０％ウシクローン血清、５−１０％オリゲンハイブリドーマクローン因子（ＩＧＥN）および１ｘＨＡＴ（シグマ）を含有する選択的培地でインキュベートさせることができる。約２週間後、ＨＡＴがＨＴと置き換えられている培地で細胞を培養させることができる。ついで、個々のウェルをＥＬＩＳＡによりヒトカッパ−軽鎖含有の抗体についてスクリーンに付し、ＦＡＣＳ分析に付すこともできる。広範囲に及ぶハイブリドーマ増殖が培地にて起こり、それは、通常、１０−１４日後に観察され得る。抗体を分泌するハイブリドーマを再びプレートに置き、再びスクリーンに付し、ヒトＩｇＧについてなおも陽性であるならば、限定希釈に付すことでモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローンすることができる。ついで、安定したサブクローンをインビトロにて培養し、特徴化のために組織培地にて抗体を生成することができる。
【００８８】
本発明のヒト抗体はまた、例えば、当該分野にて周知であるような、組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法を用いて宿主細胞トランスフェクトーマにて産生され得る。例えば、Morrison, S. (1985) Science 229: 1202を参照のこと。
【００８９】
特定の実施態様において、ａ）１または複数のモノクローナル抗体、好ましくは少なくとも２つのモノクローナル抗体と、ｂ）ａ）の１または複数の抗体とのコンビネーションにて相乗的またはその他の有利な機能的作用を提供する少なくとも１の付加的な治療剤との有利なコンビネーションを同定するために、本発明の方法を用いることが興味深いかもしれない。例えば、抗体が細菌感染を予防または治療するためのものである場合、２またはそれ以上のモノクローナル抗体と、少なくとも１つの非抗体の抗菌剤（例えば、後記する抗生物質を参照のこと）との最適なコンビネーションを同定することが有利でありうる。同様に、抗体が癌または腫瘍増殖を予防または治療するためのものである場合、２またはそれ以上の抗癌モノクローナル抗体と、少なくとも１の非抗体の抗癌剤（後記する抗癌剤を参照のこと）との最適なコンビネーションを同定することが有利でありうる。同じことが、抗体がＡＩＤＳまたはもう一つ別のウイルス疾患の予防または治療を対象とする場合で、２またはそれ以上のかかる抗ＨＩＶまたは他の抗ウイルスモノクローナル抗体と、各々、少なくとも１の非抗体の抗ＨＩＶ剤または抗ウイルス剤（後記する抗ＨＩＶおよび他の抗ウイルス剤を参照のこと）との最適なコンビネーションを同定することが有利である場合において、当てはまる。この同じ方法が、すなわち１または複数のモノクローナル抗体、好ましくは少なくとも２つのモノクローナル抗体の、その抗体と同じ症状（あるいは関連する症状を対象とするものであってもよい）を予防または治療することを対象とする少なくとも１の非抗体剤とのコンビネーションが、例えば、自己免疫疾患を対象とするモノクローナル抗体と、同じ自己免疫疾患を対象とする既知または新規な非抗体とのコンビネーションと同様に、他の適応症に用いられてもよい。
【００９０】
抗生物質
抗生物質は、細菌および真菌を含む、微生物を殺し、またはその増殖を止める分子として定義されてもよい。細菌を殺す抗生物質はまた殺菌剤とも言われ、細菌の増殖を止める抗生物質は静菌剤とも称される。
【００９１】
コンビナトリアルドラッグにおいて配合される場合のその機能的作用について試験することが興味深いとされ得る抗生物質は、β−ラクタム抗生物質、例えばペニシリン類（例えば、アモキシシリン）、セファロスポリン類、カルバペネム類、モノバクタム類等、テトラサイクリン類、例えばテトラサイクリン、マクロライド抗生物質、例えばエリスロマイシン、アミノグリコシド類、例えばゲンタミシン、トバラマイシンおよびアミカシン、キノロン類、例えばチプロフロキサシン、環状ペプチド、例えばバンコマイシン、ストレプトグラミン類およびポリミキシン類、リンコサミド類、例えばクリンダマイシン、オキサゾリジノン類、例えばリネゾリド、およびサルファ系抗生物質、例えばサルフィスオキサゾールを包含する。
【００９２】
抗癌剤
抗癌剤（化学療法薬とも知られる）は、有糸分裂（細胞分裂）を損傷し、急速に分裂する細胞を効果的に標的とするドラッグとして定義され得る。これらのドラッグは細胞に対する損傷を引き起こすため、該ドラッグはまた細胞傷害性とも称される。これらのドラッグのいくつかは細胞にアポトーシス、いわゆる「プログラムされた細胞死」を経験させる。
【００９３】
その必要なヒトの治療に用いられる場合、これらのドラッグが頻繁に他の癌治療、例えば放射線療法または手術と組み合わせて用いられることはよく知られている。別法として、患者は同時にいくつかの異なるドラッグで治療されてもよい。ドラッグはその機構および副作用において異なるが、コンビナトリアル投与の最も大きな利点は、一の該抗癌剤に対する耐性が進化する機会が最小となることである。かくして、コンビナトリアルドラッグとして用いた場合の相乗作用について抗癌剤を試験することは、上記した１または複数のモノクローナル抗体と一緒にそのような１または複数の剤を試験することと極めて関連することである。
【００９４】
抗癌剤の大部分はアルキル化剤、抗代謝産物、抗腫瘍抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤および他の抗腫瘍剤に分類され得る。これらのドラッグはすべて細胞分裂またはＤＮＡの合成および機能にある程度まで影響を及ぼす。加えて、ＤＮＡに直接干渉しない剤も開発された。これらはモノクローナル抗体およびチロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブメシラートを包含し、それは特定の型の癌（慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍）における分子異常性を直接標的とする。加えて、これらの細胞に直接攻撃することなく、腫瘍細胞の動きを調節するドラッグもまた、抗癌剤と称される。ホルモンもこのカテゴリーに入る。
【００９５】
アルキル基を条件下で多くの電気陰性基に添加することのできるアルキル化剤が細胞中にある。シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンがアルキル化剤の例である。この群に属する他の基としてメクロレタミン、シクロホスファミドおよびクロラムブシルが挙げられ、細胞ＤＮＡを化学的に修飾する働きをする。
【００９６】
抗代謝産物はプリン（アゾチオプリン、メルカプトプリン）またはピリミジンになりすまし、細胞サイクルの「Ｓ」期の間にこれら物質のＤＮＡへの組み込みを妨げ、正常な発達および分割を停止させる。それらはまた、ＲＮＡ合成に影響を与える。
【００９７】
抗腫瘍抗生物質（抗新生物剤および細胞傷害性抗生物質としても知られている）は、腫瘍の発達を阻害および根絶するドラッグである。この群に属するアントラサイクリンはまた、抗生物質としても作用する抗癌剤のファミリーである。アントラサイクリンはＤＮＡの構造を崩壊させ、その機能を終了させることで細胞分裂を防止させるように機能する。ＤＮＡマイナー・グルーブの塩基対中に挿入すること、またはＤＮＡのリボースのフリーラジカルの損傷させることのいずれかがその機能である。アントラサイクリンの一例として、ダウノルビシン、ソキソルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンに言及することができる。抗腫瘍抗生物質の群に属するドラッグの他の例として、アンチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびミトマイシンが挙げられる。
【００９８】
植物アルカロイドは植物より誘導され、微小管機能を防止することで細胞分裂を遮断する。微小管は細胞分裂に不可欠であり、それが無ければ、細胞分裂は起こり得ない。植物アルカロイドの主たる例として、ビンカ・アルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシン、ならびにタキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルが挙げられる。
【００９９】
トポイソメラーゼ阻害剤はＤＮＡのトポロジーを維持する必須酵素である。トポイソメラーゼＩ型およびＩＩ型の阻害は、適当なＤＮＡ超らせん形成を壊すことにより、ＤＮＡの転写および複製の両方を妨げる。トポイソメラーゼＩ型阻害剤の例として、カンプトテシン、例えばイリノテカンおよびトポテカンが挙げられ、それに対してトポイソメラーゼＩＩ型阻害剤の例として、アムサクリン、エトポシドホスファートおよびテニポシドが挙げられる。
【０１００】
抗ＡＩＤＳ剤
抗レトロウイルス剤としても知られる、抗ＡＩＤＳまたは抗ＨＩＶ剤は、レトロウイルス、主にＨＩＶの感染の治療のために設計される。数種のかかるドラッグ（典型的には３または４種）がコンビネーションで使用される場合、その方法は極めて活性な抗レトロウイルス療法またはＨＡＡＲＴとして知られている。かくして、コンビナトリアルドラッグ療法はＨＩＶおよびＡＩＤＳの治療における周知の方法である。したがって、この種の剤は、それを単独でまたは上記したような１または複数のモノクローナル抗体とのコンビネーションにて、本発明の方法にて試験されることと深く関連している。
【０１０１】
抗ＡＩＤＳ剤は該ドラッグが阻害するレトロウイルスの生活環の期により広く分類される。抗ＡＩＤＳ剤の一のクラスがヌクレオシドおよびヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）であり、新たに合成されるウイルスＤＮＡに挿入され、そのさらなる伸長を防止することで逆転写を防止する。ジドブジン、ラミブジン、エントリシタビン、アバカビル、テノホビル、ジソプロキシル・フマラートおよびスタブジンが、この群に属する剤の例である。
【０１０２】
抗ＡＩＤＳ剤のもう一つ別のクラスが、酵素と結合することで逆転写酵素を直接阻害し、その機能を阻害する、非ヌクレオシド逆転写阻害剤（ｎＮＲＴＩ）である。エトラビリン、デラビルジンおよびエファビレンズネビラピンが、この群における剤の例である。
【０１０３】
プロテアーゼ阻害剤（ＰＩs）は、ウイルス集合を標的とし、新しいバイロンの最終の集合についての新生蛋白を切断するのに、ＨＩＶによって使用される酵素である、プロテアーゼの活性を阻害する、抗ＡＩＤＳ剤のさらにもう一つ別のクラスである。アンプレナビル、チプラナビル、インジナビル、サクイナビル、ホサムプレナビル、ニトナビル、ダルナビル、アタザナビルおよびネルフィナビルがこの群に属する剤の例である。
【０１０４】
もう一つ別のクラスがインテグラーゼ阻害剤であり、ウイルスＤＮＡの感染細胞のＤＮＡへの融合に関与する、インテグラーゼ酵素を阻害する。最近では臨床試験にて数種のインテグラーゼ阻害剤がある。ラルテグラビルが２００７年１０月にＦＤＡの承認を受けた最初のこのような剤であった。
【０１０５】
もう一つ別のクラスの抗ＡＩＤＳ剤がエントリー阻害剤（または融合阻害剤）である。これらの剤は、いくつかの標的の一つを遮断することで、ＨＩＶ−１の宿主細胞への結合、融合およびエントリーを妨げる。マラビロックおよびエンフビルチドがこのクラスで最近になって利用可能な２種の剤である。
【０１０６】
もう一つ別のクラスが成熟阻害剤である。このクラスの剤は、ウイルスカプシドポリ蛋白を切断し、それによってポリ蛋白の成熟カプシド蛋白への変換を遮断することで、ｇａｇプロセシングの最終工程を阻害する（２４頁）。これらのウイルス粒子は不完全なコアを有し、放出されるバイロンは主に非感染性粒子のみからなる。ベビリマットおよびビベコンがこの群の剤に属する。
【０１０７】
この技術分野において、相乗作用のエンハンサーのあることもよく知られている。相乗作用のエンハンサーは、単独では抗レトロウイルス特性を有しないし、単独療法には不適当または非実践的であるが、該エンハンサーが抗ウイルス剤と一緒に服用されると、（時に抗レトロウイルスの代謝作用を改変することで）１または複数のそれらのドラッグの作用を強化する。かくして、「抗ＡＩＤＳ剤」なる語が用いられる場合、これらの相乗作用のエンハンサーも含まれるものと理解すべきである。
【０１０８】
腫瘍によって分泌される成長因子を標的とする剤は血管形成を根絶し、かくして腫瘍の増殖を軽減させることができる。かかる剤の一例がベバシズマブ（Avastin）であり、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を対象とするシグナル遮断血管形成阻害剤として入手可能である。腫瘍血管形成に関与する他の成長因子は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および表皮増殖因子（ＥＧＦ）を包含する。
【０１０９】
抗ウイルス剤
抗ウイルス剤はウイルスに対して細胞防御を刺激する能力を有する物質として定義される。抗ウイルス剤は、例えば、細胞のＤＮＡ合成を軽減させ、それで細胞をウイルス遺伝子に対してより耐性とし、細胞の免疫応答を強化するか、またはウイルス複製を抑制する。抗ウイルス剤は２または３のウイルス疾患だけを治療するのに用いることができる。というのも、ウイルス複製は治療される身体における細胞と密接に関連付けられ、ウイルス複製を顕著に防止するドラッグは治療される身体にも毒であると考えられるからである。
【０１１０】
抗ウイルス剤は２つの群：ヌクレオシドアナログおよびインターフェロンに分類することができる。抗ＡＩＤＳ剤は別に上記されている。
【０１１１】
ヌクレオシドアナログはヌクレオシドと似た合成化合物であるが、不完全または異常なオキシ−リボースまたはリボース基を有する。これらの化合物は感染細胞内で三リン酸塩の形態にリン酸化される。このようにして、ドラッグはウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ中への組み込みについて正常なヌクレオチドと競合する。増殖する核酸鎖への組み込みはウイルスポリメラーゼとの不可逆な結合および連鎖停止をもたらす。ヌクレオシドアナログの例はアシクロビル、ガンシクロビル、イドクリジン、リバビリン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジンおよびジゾブジンである。
【０１１２】
インターフェロンは３つのクラス、すなわち、アルファ−、ベータ−およびガンマ−インターフェロンに分類することができる。アルファ−およびベータ−インターフェロンはウイルス感染した細胞によって分泌される。それらは隣接する細胞の特異的な受容体に結合し、細胞をウイルスによる感染から保護する。それらはウイルスによる侵入に対して中間的な保護宿主応答の一部を形成する。これらの直接的な抗ウイルス作用に加えて、アルファ−およびベータ−インターフェロンもまた、感染した細胞の表面でのクラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子の発現を強化し、かくしてウイルス抗原の特異的免疫細胞への提示を亢進する。組換えアルファ−およびベータ−インターフェロンが入手可能であり、慢性Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス感染の治療に用いることができる。ガンマ−インターフェロン（免疫インターフェロンとしても知られる）はＴＨ１ ＣＤ４細胞により分泌されるサイトカインである。その機能は特異的Ｔ細胞媒介免疫応答を強化することである。
【０１１３】
可溶性受容体
「受容体」なる語は、本願明細書において、受容体−リガンド結合との関連でその語の通常の意味に従って用いられるが、抗体を含むものとして解釈されるべきではない。「可溶性」なる語は、サイトカイン受容体の分野にて理解されるように、細胞膜結合のカウンターパートから受容体を区別される。可溶性受容体は細胞外（リガンド結合）ドメインを含むが、受容体を細胞表面上で保持させる、膜貫通領域を欠く。同様に、可溶性受容体は、一般に、細胞内（細胞質）ドメインを欠く。
【０１１４】
特定の受容体の天然の可溶性形態が存在することが分かっている。例えば、可溶性受容体が種々のホルモン；例えば、インスリン受容体、ＩＬ−２受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩＩ）受容体、ＥＧＦ受容体、血小板誘発の成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、およびＦｃ受容体について天然に存在することが知られている。これらの可溶性または末端切断された受容体はその膜結合カウンターパートの結合特性と同様の特性を有するようである。可溶性受容体は組換え発現を介して他のポリペプチド、例えばＦｃ受容体、およびリガンドにライゲートされ得る。
【０１１５】
活性化の不足（例えば、リガンドの欠如）または活性化の過剰（例えば、リガンドの過剰）の形態の、シグナルトランスダクション経路の異常性は、関節炎、癌、ＡＩＤＳおよび糖尿病などの病態および疾患の根本原因である。これらの衰弱化させる疾患を治療するための現在の治療法の一つが、受容体デコイ、例えば細胞外リガンド結合ドメインのみからなる可溶性受容体を用い、リガンドを封じ、そうして受容体の活性化過剰を克服することを含むものである。この方法の一例は、Immunex/Amgenにより、Enbrel（登録商標）、ダイマー可溶性ＴＮＦ−アルファ受容体イムノグロブリン（ＩｇＧ）融合蛋白をクリエートすることである。ＴＮＦファミリーのサイトカインは、感染または組織損傷に対する応答において身体により産生される主たるプロ炎症性シグナルの一つである。しかしながら、例えば、感染または組織損傷のない状態での、これらのサイトカインの異常な産生は、関節炎および乾癬などの疾患の根本原因の一つである。したがって、ジスルフィド結合を介して同時２量体化を可能とする、可溶性ＴＮＦ−アルファ受容体とイムノグロブリンＧ１のＦｃ領域との融合は、ダイマー可溶性ＴＮＦ−アルファ受容体の分泌を可能とする。モノマー可溶性受容体との比較において、ダイマーＴＮＦ−アルファ受容体ＩＩ−Ｆｃ融合はホモトリマーリガンドへのアフィニティを著しく増加させた。このことは、構造的に高いＴＮＦ−アルファが重要な因果的役割を果たしている、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫疾患の治療における臨床的使用ための分子基準を提供する。
【０１１６】
多くの疾患の発病におけるその基本的な関与のため、サイトカインは生物療法の方法についての標的のもう一つ別のクラスを構成する。サイトカイン受容体の可溶性形態がサイトカイン活性の内因性調節に関与するとの知見は、免疫治療剤としてのその潜在的用途にて実質的な興味を惹起する。
【０１１７】
ＲＮＡｉ’ｓ
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、翻訳段階での、または特定の遺伝子の転写を妨害することによる、遺伝子発現を阻害するメカニズムである。ＲＮＡｉターゲットは、ウイルスおよびトランスポゾン由来のＲＮＡを含み（いくつかの形態の固有の免疫応答に重要である）、また、これらは発育の調節およびゲノム維持に役割を果たす。ＲＮＡｉパスウェイは、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）酵素により開始され、長鎖ｄｓＲＮＡ分子を２０〜２５塩基対の短鎖フラグメントに切断する。ついで、ガイドストランドとして知られている各々のフラグメントの２本鎖の１つを、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に導入し、相補配列とペアを為す。この認識事象の最もよく知られた研究結果は、転写後遺伝子サイレンシングである。これは、ガイドストランドが、特異的に、ｍＲＮＡ分子と対をなし、ＲＩＳＣ複合体の触媒成分であるアルゴノート（ａｒｇｏｎａｕｔｅ）による切断を誘発するときに生じる。他の結果は、遺伝子が転写する程度に影響を与える遺伝子−ヒストン修飾およびＤＮＡメチル化−へのエピジェネティックな変化である。
【０１１８】
ＲＮＡ干渉は、特に、トランスポゾンにより自己増殖を阻害することができる植物において、ウイルスおよび他の外来遺伝物質への免疫応答に必要不可欠である。一般的に、動物は、植物よりもダイサー酵素の変異体の発現が少ない。いくらかの動物におけるＲＮＡｉは、抗ウイルス応答を与えることが示されている。
【０１１９】
ＲＮＡ干渉パスウェイは、実験生物学において、細胞培養およびインビボでモデル生物において、遺伝子の機能を研究するために利用される。二本鎖ＲＮＡを、興味ある遺伝子に相補的な配列で合成し、細胞または生物に導入し、そこで、外来遺伝子物質として認識させ、ＲＮＡｉパスウェイを活性化する。この機構を用いて、研究者らは、標的遺伝子の発現を劇的に減少させることができる。この減少効果の研究は、遺伝子産物の生理学的役割を示し得る。ＲＮＡｉは、総合的には、遺伝子の発現を無効にすることができないので、この技術は「ノックダウン」とも称され、遺伝子発現を完全に排除する「ノックアウト」法とは区別される。
【０１２０】
治療においてＲＮＡ干渉を利用することができる。長鎖ｄｓＲＮＡストランドを動物細胞に導入することは、インターフェロン応答のために困難であるが、短鎖干渉ＲＮＡミミックの使用は、より成功し易い。臨床試験に到達した最初の適用は、黄斑変性および呼吸器合胞体ウイルスの治療であり、ＲＮＡｉはまた、マウスモデルで、誘発した肝不全を好転させるのに有効であることが示された。
【０１２１】
他の提案された臨床用途は、癌細胞での遺伝子発現の阻害、ＨＩＶに対するホスト受容体およびコレセプターのノックダウン、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎遺伝子のサイレンシング、インフルエンザ遺伝子発現のサイレンシング、および麻疹ウイルスの複写の阻害を含む、抗ウイルス療法に関する。神経変性疾患の有効な治療もまた提案されており、特にポリグルタミン疾患、例えばハンチントン病が注目されている。ＲＮＡ干渉はまた、腫瘍細胞で差異的にアップレギュレートされる遺伝子または細胞分裂に関連する遺伝子のサイレンシングにより癌を治療する可能性ある方法と考えられている。臨床での適用のためのＲＮＡｉの使用における主要な研究は、安全なデリバリー方法の開発であり、これまでは、遺伝子療法に関して提案されるものと同様のウイルスベクターシステムに主に関与していた。
【０１２２】
ワクチン
ワクチンは、特定の疾患に対する免疫を確立するまたは改善するために用いられる生物学的調製物である。ワクチンは、予防的（例えば、自然または「野生」の病原体による将来の感染の影響を防止または改善するため）または治療的（例えば、例えば癌のような病状の治療に用いるためのワクチン）であり得る。ワクチンは、死滅または不活化生物またはそれらかの精製産物から製造され得る。慣用的なワクチンは４つのタイプがある。
【０１２３】
一のタイプは、死滅微生物を含有するワクチンである。これらは、前もって化学的または熱的に死滅させた毒性の微生物である。例えば、インフルエンザ、コレラ、腺ペストおよびＡ型肝炎に対するワクチンがある。
【０１２４】
別のタイプは、弱毒生ウイルス・微生物を含有するワクチンである。これらは、その毒性に望ましい条件下で培養された生きた微生物、または、危険な微生物に密接に関連するが、それ自体危険性が少ない生きた微生物であり、広範囲の免疫応答を生じさせる。これらは、典型的には、持続的な免疫応答を惹起し、健康な成人にはより好ましいタイプである。例としては、黄熱病、麻疹、風疹およびおたふく風邪がある。生ツベルクリンワクチンは、感染性株ではないが、「ＢＣＧ」と称される関連株である。これは、米国において頻繁に用いられている。
【０１２５】
第三のタイプのワクチンは、トキソイドである。トキソイドは、毒性が化学的（ホルマリン）または熱処理により弱化または抑制されているが、他の特性、典型的には免疫原性が維持されたバクテリア毒素（通常、外毒素）である。トキソイドは、オリジナルの毒素への免疫応答を惹起し、または他の抗原への応答を増加させるので、ワクチンとして有用である。例えば、破傷風トキソイドは、破傷風を引き起こす破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）により産生されたテタノスパスミンから誘導される。破傷風トキソイドは、プラズマリッチワクチンの開発に用いられる。
【０１２６】
第四のタイプのワクチンは、サブユニットと称される。不活化または弱毒化微生物（「ホールエージェント（ｗｈｏｌｅ−ａｇｅｎｔ）」ワクチンを構成するもの）を免疫系に誘導するというよりも、そのフラグメントが免疫応答を与えることができる。例としては、ウイルスの表面タンパク質（酵母で酸性される）からのみ構成されるＨＢＶに対するサブユニットワクチン、およびヒトパローマウイルス（ＨＰＶ）に対するウイルスの主要なカプシド蛋白で構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）が挙げられる。
【０１２７】
多くの革新的なワクチンがまた、開発され、使用されている。これらは、コンジュゲート、組み換えベクターおよびＤＮＡワクチン接種を含む。コンジュゲート法は、ある種の細菌が、免疫原性に乏しい莢膜多糖類を有する事実の利用を可能にする。これらの莢膜をタンパク質（例えば、毒素）に結合させることにより、免疫系は、多糖類を蛋白抗原として認識することができる。このアプローチは、ヘモフィリス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｂワクチンに用いられている。組み換えベクター法においては、一の微生物および他のＤＮＡの生理学を組み合わせ、それにより、複雑な感染プロセスを有する疾患に対して免疫を与える。ＤＮＡワクチン接種は、感染性病原体のＤＮＡから作られる新しいタイプのワクチンである。これは、ヒトまたは動物細胞へのウイルスまたは細菌ＤＮＡの挿入（および発現、免疫認識機構を作動させる）により為される。発現されたタンパク質を認識する免疫系の細胞は、それらタンパク質およびそれらを発現する細胞に対する攻撃を増加させるだろう。これらの細胞は長期間生存するので、正常にこれらのタンパク質を発現する病原体と後に遭遇した場合、これら病原体はすぐに免疫系により攻撃されるだろう。ＤＮＡワクチンの一の利点は、非常に容易に生産し、貯蔵できることである。
【０１２８】
実施例
実施例１
高い効能および薬効を有するコンビナトリアルドラッグを選択することができるように、ハイスループット方法にて極めて多くのコンビネーションをスクリーンすることができる必要がある。かかる作業はささいなことではなく、４０種の候補ドラッグは１０のコンビネーションにおいて８００万通り以上で組み合わせることができる。最も興味深い混合物が「独特なコンビネーション」と称されるもので、候補ドラッグを重複して含まない混合物である。ｎの数の候補ドラッグのｒの候補ドラッグの混合物における独特なコンビネーション（ＵＣ）の数は、次式：
【数３】
より計算できる。
【０１２９】
この関数は放物曲線を記載する。極めて多くのコンビネーションを試験することの一の解決手段が候補ドラッグを群に分割し、より小さな混合物でそのコンビネーションを試験することである。これらのより小さな混合物の最適なコンビネーションが同定されれば、それらを組み合わせてより大きなコンビネーションを作製し、ついでそれを試験してもよい。その選択過程の概略は図１に見ることができる。
【０１３０】
方法
単一ドラッグとしての既知の活性を有する一連の候補ドラッグを３２までの群に分け、ついで、これら候補ドラッグの可能なすべての３−ミックスを１、２またはそれ以上の機能性アッセイにて活性について試験する。各群において、その多くが該混合物の活性に起因する候補ドラッグを選択し、必要ならば１または複数の群に分け、再び可能なすべての３−ミックスにて試験する（図１）。この過程を選択される候補ドラッグの数が１２またはそれ以下になるまで繰り返す。ついで、１２の候補ドラッグを可能なすべての２−および３−ミックスで試験し、これらコンビネーションの薬効が上位２０について滴定を行う。ついで、最も効能のある２−および３−ミックスをリード候補として選択する。ついで、最も効能のある独特な２−および３−ミックス（重複する候補ドラッグを含まない）を選択し、単一のドラッグとして処理する。ついで、これらの所定のドラッグコンビネーションの可能なすべての２−および３−ミックスを試験し、これらの混合物のコンビネーションの効能が上位２０について滴定を行う。滴定終了後、候補ドラッグの最も効能のある４、５、６、７、８または９のミックスをリード候補として選択することができる。最後に、リード候補を一連のアッセイにて比較し、最適なドラッグコンビネーションを決定することができる。
【０１３１】
実施例２
実施例２は３２までの候補ドラッグをハイスループット法にて２、３、４および５のミックスを生成する方法を記載する。
【０１３２】
方法
候補ドラッグの選択される数は、９６ウェルプレートで８までの群に、３８４ウェルプレートで１６までの群に、そして１５３６ウェルプレートで３２までの群に分けられる。ついで、候補ドラッグを適当な濃度に希釈し、ソースプレート（フィーダープレート）に移し、その第一のソースプレートは各ウェルにて一の候補ドラッグの列を含有する。第２のソースプレートは各ウェルにて一の候補ドラッグの列を含有する。Biomek（登録商標）３０００ラボラトリーオートメーションワークステーション（beckman Coulter）などの自動ピペットシステムを用いて特定容量の候補ドラッグをソースプレートの第一の列から８９６ウェルプレート、１６３８４ウェルプレートまたは３２１５３６ウェルプレートの全ての列に移す。同様の容量の候補ドラッグを第二のソースプレートの列からレシーバープレート（デスティネーションプレート）上の対応する列に移すことで、候補ドラッグの次の層を加える。
【０１３３】
第三の層は、第二のソースプレートの第一の列の同様の容量の内容物を第一のレシーバープレートのすべての列に移し、ついで第二のソースプレートの第二の列の内容物を第二のレシーバープレートのすべての列に移すことで添加される。８候補ドラッグを第一、第二および第三の層の９６ウェルプレートに添加終了した後のレシーバープレートのレイアウトの略図を図２に示す。Ａ）層１、Ｂ）層１＋２、およびＣ）層１＋２＋３。８候補ドラッグを異なるグレーの色合いで示す。
【０１３４】
候補ドラッグの第四または第五の層は、４つの層では候補ドラッグの数だけレシーバープレートの数を増やし、５つの層では再び候補ドラッグの数だけレシーバープレートの数を増やす、最終過程を繰り返すことで添加され得る。８候補ドラッグで９６ウェルプレートの場合には、これで４つの層で６４プレートおよび５つの層で５１２プレートを提供する。
【０１３５】
結果
この型のマトリックス様フォーマットでは、候補ドラッグの混合物を生成するのに明らかに有利な点がいくつかある。一の有利な点は、すべての独特な混合物がレシーバープレート上の異なる部位に配置されている複数のウェル（図２の場合には６ウェル）で生成されることである（図２）。これは、プレート間およびプレート内の変化、ならびに可能性のある生物学的変化を等しくするような、候補ドラッグの機能性試験には最適である。一の候補ドラッグの２／３を、別の候補ドラッグの１／３を含有する混合物もまた生成される。これらをまた異なるプレートに置き、トリプリケートにて観察する。傾斜（skewed）混合物と称される、これらの混合物は、個々の候補ドラッグのコンビネーションへの分布について有用な情報を提供しうる。
【０１３６】
実施例３
この実施例は、２３の抗体を１２抗体の群に分け、ついで３８４ウェルフォーマットにて標準的な生存アッセイにて３つの抗体をすべてのコンビネーションにて試験することで、実施例１および２に記載される方法を説明する。２３のうち１２の最も効能のある抗体を選択し、３つの抗体の可能なすべてのコンビネーションにて再び試験する。
【０１３７】
方法
９９２、１０２４、１０３０、１１８３、１１９４，１２１１、１２１４、１２４２、１２５４、１２５５、１２５７、１２６０、１２６１、１２７７、１２８４、１３０５、１３０８、１３１７、１３２０、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６と番号を付した、ヒトＥＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）への結合が確認されている２３の抗体をスクリーニングするのに選択した。各抗体を１ｘＰＢＳ中にて４０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６−ウェルのソースプレートに加えた。各群において、Biomek（登録商標）３０００ラボラトリーオートメーションワークステーション（beckman Coulter）を用い、Ａ行が２μｌの第一の抗体を含有し、Ｂ行が２μｌの第二の抗体を含有し、１２すべてのプレート上の１２の行が抗体を含有するようになるまで同様に、２μｌの１２抗体を３０μｌの培地を含有する１２３８４ウェルプレートのウェルに加えた。ついで、次の層の抗体を加えた；この時点で第一の抗体は列１に加えられており、第二の抗体は列２に加えられており、１２のすべてのプレート上のすべてのウェルが２つの抗体を含有するまで同様に加えられた。ついで、第三の層を、２μｌの抗体１をプレート１上のすべてのウェルに、２μｌの抗体２をプレート２のすべてのウェルに、すべてのウェルが３つの抗体を６μｌの容量で含有するまで同様に、ピペットを用いて添加することで加えた。各ウェルでの最終の抗体濃度は４μｇ／ｍｌであった。
【０１３８】
ついで、５００Ａ４３１ＮＳ細胞を含有する３０μｌの培地を、抗体含有のすべてのウェル、ならびに陰性対照として用いられる抗体を含まない２つの行に加えた。ついで、該プレートを３７℃で加湿されたインキュベータ中で３日間インキュベートし、その後で１ｘＰＢＳ中に１：１で希釈された８μｌの細胞増殖試薬ＷＳＴ−１をすべてのプレート上のウェルに添加した。その後で、該プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ついで、該プレートをオービタルシェーカーに移し、さらに１時間インキュベートした。吸光度をＥＬＩＳＡリーダー上で４５０および６２０ｎｍ（標準波長）で測定した。代謝活性な細胞（ＭＡＣ）の量を以下のようにして非処理対照のパーセントとして計算した。
【数４】
代謝活性は生存細胞の数と相関関係にあるとみなした。
【０１３９】
結果
２３の抗体を２つの１２の無作為な群に分け、群１は抗体９９２、１０２４、１０３０、１２１１、１２１４、１２５４、１２５５、１２６０、１２６１、１２７７、１２８４および１３２０を含有し、その一方で群２は抗体１１８３、１１９４、１２４２、１２５５、１２５７、１３０５、１３０８、１３１７、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６を含有した。奇数であるため、抗体１２５５が両方の群に含まれている。各群にある抗体の可能なすべての３−ミックスを上記したように生成し、細胞増殖に対する作用について試験した。％ＭＡＣを１２のモノクローナル抗体、２２０の独特な抗体の混合物、および１３２の傾斜混合物について計算した。ついで、該混合物を細胞培養に対するその作用に関してランク付けした。その多くが該混合物の効能に起因する抗体を選択することができるために、特定の抗体を含有する混合物について％ＭＡＣを該抗体に対してプロットし、中央％ＭＡＣを計算した。群１および群２にて抗体を含有する混合物についての％ＭＡＣの散布図を図３に示すことができる。群１の抗体９９２、１０２４、１０３０、１２５４、１２６１および１３２０が混合物の中で最も効能があり、それに対して抗体１２５７、１３０８、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６が群２の混合物の中で最も効果があることは明らかである。群１の抗体はまた、群２の抗体の混合物と比べてより効能があることも明らかであるが、それらは異なる実験の結果であるため、該群を直接比較することはできない。最終群のために各群からの６の抗体を選択した。これらは、９９２、１０２４、１０３０、１２５７、１２６１、１２８４、１３０８、１３２０、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６であった。２０の最も効能のある混合物の％ＭＡＣおよびスクリーニングの第２ラウンドの結果の散布図を図４に示す。最も高い効能を有する２つの混合物は、９９２＋１３０８＋１５６６および９９２＋１３０８＋１３２０であった。実際に、最も高い効能を有する混合物のうち１９は抗体９９２を含有し、このことはこの抗体が他の抗ＥＧＦＲ抗体とのコンビネーションにて十分な働きをすることを示す。抗体９９２はそれ単独で相当高い効能を有するが、他の抗体により増大することが見出された。
【０１４０】
実施例４
この実施例は実施例３にて選択された１２の抗体の可能なすべての２−ミックスを同様の生存アッセイにて試験した結果を記載する。
【０１４１】
方法
その多くが３−ミックスの効能に起因することが判明した１２の抗体、すなわち、９９２、１０２４、１０３０、１２５７、１２６１、１２８４、１３０８、１３２０、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６を可能なすべての２−ミックスにて試験した。各抗体を１ｘＰＢＳ中にて４０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６−ウェルのソースプレートに加えた。各群において、Biomek（登録商標）３０００ラボラトリーオートメーションワークステーション（beckman Coulter）を用い、Ａ行が３μｌの第一の抗体を含有し、Ｂ行が３μｌの第二の抗体を含有し、１２のすべてが抗体を含有するまで同様に、３μｌの１２抗体を３０μｌの培地を含有する３８４ウェルプレートの１のウェルに加えた。ついで、次の層の抗体を加えた；この時点で第一の抗体は列１に加えられており、第二の抗体は列２に加えられており、１２のすべてのプレート上のすべてのウェルが２つの抗体を６μｌの総容量にて含有するまで同様に加えられた。各ウェルでの最終の抗体濃度は４μｇ／ｍｌであった。
【０１４２】
ついで、５００Ａ４３１ＮＳ細胞を含有する３０μｌの培地を、抗体含有のすべてのウェル、ならびに陰性対照として用いられる抗体を含まない２つの行に加えた。ついで、該プレートを３７℃で加湿されたインキュベータ中で３日間インキュベートし、その後で１ｘＰＢＳ中に１：１で希釈された８μｌの細胞増殖試薬ＷＳＴ−１をすべてのプレート上のウェルに添加した。その後で、該プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ついで、該プレートをオービタルシェーカーに移し、さらに１時間インキュベートした。吸光度をＥＬＩＳＡリーダー上で４５０および６２０ｎｍ（標準波長）で測定した。代謝活性な細胞（ＭＡＣ）の量を上記したようにして計算した。
【０１４３】
結果
％ＭＡＣを１２のモノクローナル抗体および６６の独特な抗体の混合物について計算した。ついで、該混合物をその細胞増殖に対する作用についてランク付けし、最も高い効能を有する２０の混合物を図５（上図）に示した。抗体９９２と１０２４のコンビネーションが最も高い効能を有する。該混合物について％ＭＡＣの散布図を図５（下図）に示すことができる。ここでも、抗体９９２が他の抗体とのコンビネーションにおいて優れた作用を示すことは明らかである。
【０１４４】
本願明細書にて引用されている特許および非特許文献はすべて、その内容を出典明示により本発明の一部とする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能的作用を有する、あるいはその作用に起因する化学的存在を同定および選択する方法に関する。この同定および選択は、２種またはそれ以上の化合物を一緒に組み合わせることが相乗作用、例えば疾患の治療または予防の改善をもたらしうる化学的存在の組み合わせを同定することについて相乗作用を示す、新規なコンビナトリアルドラッグの創薬および開発において有用である。本発明はまた、最適な効能および薬効を示すコンビナトリアルドラッグを得るために、化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定および選択する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト抗体応答は天然のポリクローナルによるものである。これまで開発され、市販されてきた組換え抗体産物のほとんど大部分はモノクローナル抗体であり、近年においては、新規な一連のポリクローナル抗体産物もまた開発されている。これらは２種またはそれ以上の異なる抗体を含む組換え抗体組成物であり、その各々が工業的に生産されている、組換えモノクローナル抗体の「カクテル」として、あるいは単一のバッチにて生産される組換えポリクローナル抗体として、産生され得る。後者の方法はWibergら、Biotechnol. Bioeng. 94: 396-405 (2006) に記載されている。Logtenberg（Tends in Biotechnology, 25 (9): 390-394, 2007）は抗体コンビネーションまたはカクテルの関する文献を報告しており、ウイルス、トキシンまたは成長因子などの可溶性分子、ならびにＨＥＲ−２などの細胞結合分子および癌関連の細胞表面分子を含む、多くの標的に対する抗体カクテルの相乗作用または相加作用の例を記載する。Logtenbergは相乗的な抗体のコンビネーションの設計の仕方についていかなる指針も提供していない。
【０００３】
Bregenholt & Haurum（Expert Opin Biol Ther. 2004 Mar; 4 (3): 387-96）は、ウイルスおよび細菌などの大集団における生物兵器である物質に対する幅広い保護を提供するためには、微生物が認識されているエピトープでの変異を介して中和抗体から逃れることを防止するため、病原体特異的ポリクローナル抗体は所定の表現型に対する広範囲の反応性に及ぶことが理想的であると教示している。
【０００４】
Bregenholtら（Curr Pharm Des. 2006; 12 (16): 2007-2015）はウイルス特異的ポリクローナル抗体薬の設計に関する指針を記載する。彼らは、抗体レパートリーは、できる限り中和ヒト免疫応答の酷似する抗体組成物を維持しながらも、できるだけ広い一連の中和エピトープを含むように選択されるべきであると結論付けている。
【０００５】
ＷＯ２００７／１０１４４１は組換えポリクローナル抗ＲＳＶ抗体を開示する。特に、ＧおよびＦの両方の蛋白上の複数のエピトープを対象とする、抗ＲＳＶ組換えポリクローナル抗体（ｒｐＡｂ）を開示する。保存されている群に属し、サブタイプ特異的群および株特異的群にも属する可能性のあるＧ蛋白エピトープは抗ＲＳＶｒｐＡｂでカバーされることが好ましい。
【０００６】
ＷＯ２００６／００７８５０はモノクローナル抗ＲｈＤ抗体よりも利点のある可能性のある組換えポリクローナル抗ＲｈｅｓｕｓＤ抗体を開示する。１種より多くの抗体があらゆる可能性のあるＲＤエピトープをカバーすることで、抗ＲｈＤｒｐＡｂ組成物はＲｈＤ（−）およびＲｈＤ（＋）サブタイプに関わりなくＲｈＤ（＋）の子供を有するＲｈＤＶＩの両方の女性の予防的処置に用いることができる。
【０００７】
ＷＯ２００７／０６５４３３は組換えポリクローナル抗オルトポックスウイルス抗体を開示する。ポリクローナル抗体は、複数のＩＭＶおよび／またはＥＥＶ粒子の蛋白を、好ましくはまた、個々のＩＭＶ／ＥＥＶ蛋白上の複数のエピトープを対象とする別個の抗体を含むのが有利であると記載されている。さらには、抗オルトポックスウイルスｒｐＡｂの所望の成分としての、オルトポックスウイルス関連の補体活性化のレギュレータ（ＲＣＡ）に対する反応性を有する抗体も記載されている。
【０００８】
Devauxら（Mol. Cell. Chem. 74: 117-128（1987）は、２種の異なる抗体のコンビネーションに対して、共同作用の可能性について試験するアッセイの実施を含め、スタフィロコッカス・アウレウス・ヌクレアーゼを阻害するのにモノクローナル抗体の使用を開示する。
【０００９】
モノクローナル抗体は、次第に、例えば細胞増殖抑制剤、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤および他の抗体（例えば、Avastin（登録商標）と一緒に用いられるHerceptin（登録商標））とのコンビネーション療法にて用いられる。これらの治療方法では、その最適なコンビネーションが選択されることを確実にするためにコンビネーション療法を合理的に設計する必要がある。
【００１０】
臨床的に組み合わせて用いられる他の化合物として、抗生物質、抗癌剤、抗ＡＩＤＳ剤、抗成長因子、抗ウイルス剤、可溶性受容体、ＲＮＡｉおよびワクチンが挙げられる。
【００１１】
コンビナトリアルドラッグを設計する場合、２種の異なる目標に狙いを定めることができる。コンビナトリアルドラッグの一の型において、化合物は同じ機能を有するか、または同じ機能に起因するかもしれないが、組み合わせて一緒に投与されると、相乗作用を示す。コンビナトリアルドラッグのもう一つ別の型において、化合物は異なる機能を示し、そのために複数の医学的症状を治療することのできる一の薬物を開発することができる。
【００１２】
膨大な数の可能性のある薬物の候補体が混合して含まれている場合、最適なドラッグ設計は最初から明らかでないが、経験的に確立されているに違いない場合を含め、相乗作用が得られることを確実にするであろう合理的なドラッグの設計に対する要求がある。例えば、抗体を小分子ドラッグと混合してコンビネーション治療を提供する、より複雑な場合でも、合理的なドラッグの設計に対する要求がある。
【００１３】
異なるドラッグ候補体の最適な混合物を同定するチャレンジは特にポリクローナル抗体組成物と関連するものであり、その目的は特定の標的抗原と特異的に結合する異なるモノクローナル抗体の混合物を提供することであり、それによりヒトおよびヒト以外の動物に存在するような自然の抗体応答をできるだけ広い範囲まで模倣するものである。一のチャレンジは、正に、個々のポリクローナル抗体組成物にある異なる抗体の「最適な」数を決定することであり、例えば、２または３種の抗体が、５または１０種の抗体によって得られる作用と略同様に良好な治療作用を提供するかどうかを決定することである。仮に、例えば、生成費用を考慮して、組成物中の異なる抗体の概数が予め決定されるとしても、最適なコンビネーションを同定する作業は決して取るに足らないものではない。例えば、その目的が５種の抗体を含むポリクローナル抗体を提供することであり、３０種の候補体の抗体があり、その中から選択すべき場合には、５種の抗体の独特なコンビネーションの数は１４２５０６通りであり、６種の抗体を含むポリクローナル抗体が３６種の候補体の抗体より選択する場合には、その独特なコンビネーションの数は二百万近くになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、所望の機能的作用を有する混合物を同定するために、複数の化学的存在から、典型的には１０種より多くの存在から、２種またはそれ以上の存在の混合物を評価する合理的方法を提供することである。この方法により同定された混合物は一の特異的機能性パラメータについて相乗作用を示すか、あるいは該混合物は異なる機能的作用を有する異なる化学的存在が同じドラッグ中に一緒に存在するということから２種またはそれ以上の機能的作用を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、第一の態様において、本発明は、所望の機能的作用を示す少なくとも２種の化学的存在を含む混合物を提供するために、機能的作用を有する、または該作用に起因する化学的存在を同定かつ選択する方法であって、
ａ）各々が試験されるべき化学的存在を含む、ｎ個のサンプルを準備し；
ｂ）２種またはそれ以上の当該ｎ個のサンプルを可能なすべてのコンビネーションで混合し、第一の試験されるべき混合物のセットを得；
ｃ）該第一の混合物のセットを機能性パラメータの測定能を有する機能性アッセイに付し、その機能的作用に起因している化学的存在を同定し；
ｄ）各々が工程ｃ）において機能的作用に起因している化学的存在を含むｍ個のサンプルを選択し、ここでｍはｎよりも小さく；
ｅ）該ｍ個のサンプルを可能なすべてのコンビネーションにて混合し、第二の試験されるべき混合物のセットを得；
ｆ）該第二の混合物のセットを機能性パラメータの測定能を有する機能性アッセイに付し、その機能的作用に起因している化学的存在を同定し；および
ｇ）所望の機能的作用を有する混合物を選択する
工程を含む、方法に関する。
【００１６】
上記した方法は、合理的手段にて、試験されるべきｎ個のサンプルの可能なすべての混合物についての情報を提供する点で独特なものである。可能なすべての混合物を機能的作用について調査し、最適な機能的作用を示す混合物を同定し、また他の化合物の機能を強化する化合物を選択することも可能となる。
【００１７】
多種のサンプルが試験されるべき状況では、上記した本発明の基本的な方法は、付加的な工程を含めることでさらに合理化されてもよい。第一に、ｎ個のサンプルをサブグループに分け、その後で各サブグループ中のサンプルを工程ａ）、ｂ）およびｃ）に供し、所望によりまた工程ｄ）、ｅ）およびｆ）に供してもよい。各グループにおいて、ついで、工程ｃ）、および所望により工程ｆ）において得られた結果に基づいて、例えば効能または薬効基準に基づいて、サンプルを選択し、ついでこれらの最も効能のある化学的存在だけを含む新しい混合物を混合して試験する。このように、混合物を調製し、機能性アッセイを行うことで行われるべき仕事の量は最低に維持される。別の状況で、かなりの数の化学的存在を含む混合物が目標とされてもよく、かかる場合には、小数の化学的存在を含む最も効能がある混合物を最初に同定して選択し、その後でこれらの選択された混合物を混合して分析される。このように、本発明の方法は、最低の時間および労力で最も効能があり、効果的な混合物を同定する系統的かつ合理的な方法を提供するように修飾される。
本発明の方法のこの系統的かつ合理的な操作方法によれば、本発明の方法は、自動操作に、例えばロボットによる操作に十分に適合される。
【００１８】
もう一つ別の態様において、本発明は、少なくとも２種の化学的存在を含む混合物中で、化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定かつ選択する方法であって、該混合物が所望の機能的作用を示し、
ａａ）各々が一の化学的存在を混合物中にあるように含むｐ個のサンプルを準備し；
ｂｂ）該ｐ個のサンプルの各々をｑ倍に希釈し、ｐ個の一連のサンプルを得、その各々が同じ化学的存在を異なる濃度で含み、
ｃｃ）工程ａａ）およびｂｂ）にて得られたサンプルの２種またはそれ以上を可能なすべてのコンビネーションで混合して、試験されるべき混合物を得、
ｄｄ）該混合物を機能的作用の測定能を有する機能性アッセイに供して、測定される機能的作用と混合物中の化学的存在の濃度との関係を同定し、および
ｅｅ）所望の機能的作用を有する混合物を選択する
ことを含む、方法に関する。
【００１９】
この操作により、混合物中に存在する化学的存在の間の最適な化学量論的割合が系統的かつ合理的な方法にて同定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】一群のドラッグの最も効能のあるコンビネーションを同定するのに、本発明の選択的方法を行うための一の方法の斜視図を示す。
【図２】８種のドラッグ候補体の第一、第二および第三層を９６ウェルプレートに添加した後のレシーバープレートのレイアウトの斜視図を示す。Ａ）層１、Ｂ）層１＋２、およびＣ）層１＋２＋３。８種のドラッグ候補体は異なるグレーの色合いで示される。
【図３】種々の抗体を含有する混合物についてのＡ４３１ＮＳ細胞成長の％ＭＡＣ（％代謝活性細胞）の散布図を示す。各ドットは６つの試験ウェルの平均を示す。個々の抗生物質を含有するすべての混合物の中央％ＭＡＣも示す。点線はＡ４３１ＮＳ細胞成長に対して効果のないレベルを示す。
【図４】上図は、最も高い薬効を有する２０種の抗体の混合物の平均％ＭＡＣをＳＥＭと共に示す棒グラフであり、下図にて最終グループにて個々の抗体を含有するすべての混合物についてのＡ４３１ＮＳ細胞増殖の％ＭＡＣの散布図を示す。各ドットは６つの試験ウェルの平均を示す。すべての抗体の混合物の中央％ＭＡＣも示す。点線はＡ４３１ＮＳ細胞成長に対して効果のないレベルを示す。
【図５】上図は、最も高い薬効を有する２０種の抗体の混合物の平均％ＭＡＣをＳＥＭと共に示す棒グラフである。下図にて、最終グループにてすべての２−ミックス含有の抗体についてのＡ４３１ＮＳ細胞増殖の％ＭＡＣの散布図を示す。各ドットは６つの試験ウェルの平均を示す。すべての抗体の混合物の中央％ＭＡＣも示す。点線はＡ４３１ＮＳ細胞成長に対して効果のないレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本明細書中で使用される「化学的存在」なる語は、化合物または２種またはそれ以上の化合物のコンビネーションを意味し、そのコンビネーションにて２種またはそれ以上の化合物の間の化学量論的割合は一定値で固定される。
【００２２】
本明細書中で使用される「ｎ個のサンプルの２種またはそれ以上を可能なすべてのコンビネーションで混合する」なる記載は、各混合物にて所定の数の化学的存在を有する、ｎ個のサンプルの可能なすべてのコンビネーションを生成することをいう。例えば、３つのサンプル（すなわち、３種の異なる化学的存在）を可能なすべてのコンビネーションで混合する場合では、ｎ個のサンプルのいずれかのうち３種の異なる部分を含む可能なすべての混合物が生成される。これは３種の異なるサンプルの各々の一部を含む混合物（すなわち、３種の異なる化学的存在を含有する混合物）ならびに一のサンプルの二部（一の化学的存在）と異なるサンプルの一部（異なる化学的存在）とを一緒に含む混合物、および単一のサンプルの三部（すなわち、単一の化学的存在を含有する）を含む混合物を包含する。数学的には、コンビネーションの数は：
【数１】
［式中、ｎは試験されるべきサンプルの数であり、ｋは各混合物中にて混合されるサンプルの数である］
として記載することができる。
【００２３】
かくして、混合物の数は、試験されるべきサンプルの数および各混合物中にて一緒に混合されるサンプルの数に依存する。例えば、４種のサンプルを３種のサンプルを含む混合物にて試験する場合には、その場合のコンビネーションの数は：
【数２】
に等しく、２０のコンビネーションに相当する。
【００２４】
４種のサンプルＡ、Ｂ、ＣおよびＤを指定した場合、次の２０のコンビネーションが得られる：
【表１】
【００２５】
本明細書において使用する「ポリクローナル蛋白」または「多クローン性」は、異なるが相同な蛋白分子を含む蛋白組成物をいい、好ましくは、免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される。かくして、各蛋白分子は、組成物の他の分子に相同であるが、また、ポリクローナル蛋白の個々のメンバー間のアミノ酸配列の差異によって特徴付けられる、可変ポリペプチド配列の１つもしくはそれ以上のストレッチを含有する。そのようなポリクローナル蛋白の既知の例として、抗体または免疫グロブリン分子、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体が挙げられる。ポリクローナル蛋白は、蛋白分子の所定のサブセットよりなっていてもよく、所望の標的に対する結合活性の共有などの共通の特性により定義される、所定のサブセットの蛋白分子、例えば、所望の標的抗原に対して結合特異性を示すポリクローナル抗体からなっていてもよい。
【００２６】
「抗体」なる語は、血清の機能的成分をいい、分子のコレクション（抗体もしくは免疫グロブリン、フラグメントなど）または１つの分子（抗体分子もしくは免疫グロブリン分子）のいずれかをいうことが多い。抗体分子は、特異的抗原決定基（抗原もしくは抗原エピトープ）に結合するか、または反応することが可能であり、次いで、免疫学的エフェクター機構の誘導をもたらし得る。個々の抗体分子は、通常、単一特異性として認識され、抗体分子の組成物は、モノクローナル（即ち、同一の抗体分子よりなる）であってもよく、あるいはポリクローナル（即ち、同じ抗原または別々の異なる抗原上の同じもしくは異なるエピトープと反応する異なる抗体分子よりなる）であってもよい。ポリクローナル抗体を構成する別々の異なる抗体分子は「メンバー」と称することもできる。各抗体分子は、それが、その対応する抗原に特異的に結合することを可能にする独特な構造を有し、すべての天然の抗体分子は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖の全体的に同じ基本構造を有する。抗体はまた、包括的に免疫グロブリンとしても公知である。本明細書において使用する抗体なる語は、広い意味で用いられ、無傷の抗体、キメラ、ヒト化、完全なヒトおよび一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ‘、（Ｆａｂ’）２，ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメント、ならびに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＭのような多量体形態を含む。
【００２７】
「ポリクローナル抗体」なる語は、同じもしくは異なる抗原上のいくつかの異なる特異的抗原決定基に結合または反応することが可能な異なる（種々の）抗体分子の組成物をいう。通常、ポリクローナル抗体の可変性は、ポリクローナル抗体のいわゆる可変領域、特にＣＤＲ領域に局在する。ポリクローナル抗体のメンバーが抗原に結合すると言われる場合、このことは１００ｎＭより低い、好ましくは１０ｎＭより低い、さらに好ましくは１ｎＭより低い結合定数を有する結合をいう。
【００２８】
本明細書にて使用される「２−ミックス」または「３−ミックス」は、各々、２または３の異なる化学的存在、例えば２または３の異なる抗体を含有する混合物をいう。
【００２９】
「免疫グロブリン」なる語は、一般に、血液または血清において見られる抗体の混合物の総称として使用されるが、他の供給源に由来する抗体の混合物を示すために使用されてもよく、あるいは「抗体」なる語で同意語として用いられてもよい。ヒト抗体分子の種類は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭである。各種類のメンバーは同じアイソタイプのものであるようである。ＩｇＡおよびＩｇＧアイソタイプはさらにサブタイプに細分類される。ＩｇＡおよびＩｇＧのサブタイプは、通常、各々、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４をいう。
【００３０】
「同族ＶＨおよびＶＬをコードするペア」または「ＶＨおよびＶＬ配列の同族ペア」なる語は、同じ細胞内に含まれる、または同じ細胞から誘導されるＶＨおよびＶＬをコードする配列のもともとのペアをいう。かくして、同族ＶＨおよびＶＬペアは、そのような細胞が誘導されるドナーに元々存在するＶＨおよびＶＬペア形成を表す。「ＶＨおよびＶＬをコードするペアから発現される抗体」なる語は、抗体または抗体フラグメントが、ベクター、プラスミド、もしくはＶＨおよびＶＬをコードする配列を含有する類似物から産生されることを示す。同族ＶＨおよびＶＬをコードするペアが完全抗体またはその安定なフラグメントのいずれかとして発現される場合、それらは、それらが誘導される細胞から元々発現される抗体の結合アフィニティーおよび特異性を保持する。同族ペアの組成物はまた、同族ペアのレパートリーとも呼ばれ、そして個々に維持されてもよく、またはプールされてもよい。
【００３１】
「エピトープ」なる語は、一般に、抗体が結合するであろう抗原上の部位をいう。抗原は免疫応答を刺激する物質、例えば、トキシン、ウイルス、細菌、蛋白またはＤＮＡである。抗原は、それが極めて小さくない限り、１つを超えるエピトープを有することも多い。同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体は、エピトープの局在に依存して、その結合する抗原の活性に様々な作用を有しうる。抗原の活性部位のエピトープに結合する抗体は、抗原の機能を完全に遮断し得るが、一方、異なるエピトープに結合する別の抗体は、抗原の活性に全くもしくはほとんど作用しないかもしれない。しかし、そのような抗体は、それでも補体または他のエフェクター機構を活性化し、それによって抗原の排除をもたらすかもしれない。
【００３２】
「受容体」は細胞の原形質膜または細胞質のいずれかに組み込まれている蛋白分子であり、それに可動性シグナル化（または「シグナル」）分子が結合してもよい。受容体に結合する分子は「リガンド」と称され、蛋白、ペプチド、神経伝達物質、ホルモン、医療用ドラッグまたはトキシンであってもよい。かかる結合が起こると、受容体は構造変化を受け、それは、通常、細胞応答を開始させる。しかしながら、あるリガンドは、いずれの応答も誘発することなく、単に受容体を遮断するにすぎない（例えば、アンタゴニスト）。受容体でのリガンド誘発の変化は、リガンドの生物学的活性を構成する生理学的変化をもたらす。「可溶性受容体」は膜貫通領域のない受容体である。可溶性受容体は、シグナルを発することはできないが、膜結合受容体と同様にそのリガンドに結合しうる。
【００３３】
「相乗」とは、一の系の最終結果がそれぞれの部分の合計よりも大きい状況をいうのに用いられる語である。相乗の反対が拮抗であり、２種の試薬を組み合わせて、その個々の作用から推定される作用よりも小さい全体としての作用を有する現象である。相乗はまた：ａ）全体の作用がその個々の作用の合計よりも大きいところの相互に有利な結合；ｂ）結合した作用が個々の要素の作用の合計よりも好まれるところの劇的な状況；ｃ）部分が別々に行動することで予測できない全体の系の行動；または２種またはそれ以上の刺激またはドラッグの共同作用を意味する。本明細書においては、「相乗」は、一般に、後者の定義をいい、すなわち、２種またはそれ以上のドラッグ、例えば２種またはそれ以上の抗体のコンビネーションの、所定の条件での全体の作用が、個々の作用の合計よりも大きいことをいう。
【００３４】
詳細な記載
本発明は、化合物を試験するのに用いることのできる機能性アッセイの型、および本発明の方法にて用いることのできる化学的存在の型を含め、該方法を如何に実施するかについてより詳細に記載されるであろう。
【００３５】
発明の方法の記載
本発明の方法は、所望の機能的作用を有する少なくとも２種の化学的存在を含む混合物を得るのに、機能的作用に起因する化学的存在および／または機能的作用を有する化学的存在を同定かつ選択するように設計される。該方法は、一のドラッグ中に２、３またはそれ以上の化合物が合わされた場合に存在しうる相乗的またはコンビナトリアル作用を同定することができるため、該方法は、特に新規なコンビナトリアルドラッグ、とりわけ組換えポリクローナル抗体を同定するのに適している。しかしながら、該方法はまた、例えば農薬または化粧品の場合における所望の相乗作用または２種の異なる機能的作用のいずれかを示す、少なくとも２種の活性な化合物を含む、他の製品の開発における使用を見出すことができる。
【００３６】
本発明の方法は、少なくとも７つの工程、すなわち、上記した工程ａ）ないしｇ）からなる。工程ａ）においては、複数のサンプル（ｎ個のサンプル）を準備する。そのサンプルの各々は試験されるべき一の化学的存在を含む。工程ｂ）にて、そのｎ個のサンプルのうち少なくとも２個を可能な全てのコンビネーションにて混合し、第一のセットの試験されるべき混合物を得る。このようにして、複数の混合物を系統的に得、可能な全ての混合物の検査を確保する。工程ｃ）にて、第一のセットの混合物の各々を、機能性パラメータの測定を可能とする機能性アッセイに供し、その機能的作用に起因する化学的存在を同定する。工程ｄ）にて、機能性アッセイからの情報を用いて、その各々が所望の機能的作用に起因する化学的存在を含む複数のサンプルを選択する。この工程で選択されるサンプルの数（ｍ）はサンプルの最初の数（ｎ）より小さい。本発明の基本的な方法は、４つの付加的な工程ｅ）−ｇ）を含む。工程ｅ）にて，ｍ個のサンプルの２またはそれ以上を可能なすべてのコンビネーションにて混合し、第二のセットの試験されるべき混合物を得る。工程ｆ）にて、第二のセットの混合物を機能性パラメータの測定を可能とする機能性アッセイに供し、その機能的作用に起因する化学的存在を同定する。ついで、この機能性アッセイからの情報を用い、工程ｇ）にて所望の機能的作用を有する混合物を選択する。工程ｆ）にて行われる機能性アッセイは、典型的には、工程ｃ）で行われる機能性アッセイと同じであろう。しかしながら、これら２つの工程にて、２種の異なる機能性アッセイを行うことも可能である。もう一つ別の方法は、例えば、工程ｃ）およびｆ）にて同じ機能性アッセイを行うことであるが、混合、アッセイおよび選択の１または複数のさらなるラウンドでは異なる機能性アッセイを行うことである。もちろん、所定のいずれの工程においても、２またはそれ以上の異なる機能性アッセイを行うことも、単一のアッセイでよりも２またはそれ以上のアッセイでの選択を基礎とすることも可能である。
【００３７】
上記した方法において、ｎ個の異なるサンプルを機能的作用について試験する。これらのｎ個のサンプルは試験されるべきサンプルの総数に等しいか、またはｎ個のサンプルは、該サンプルを混合し、基本的な工程ａ）−ｇ）に供される前に、複数のサブグループに分割される、多数のサンプルを出発点とするサブグループを構成してもよい。
【００３８】
さらに具体的には、試験すべきサンプルの数が一の限定された数にすぎない場合、試験すべき混合物の数が十分に限定され、そのすべてを、不当に負担することなく、機能性アッセイに供することができるため、上記した７つの工程、すなわち工程ａ）ないしｇ）だけを含む方法が行われる。しかしながら、多数のサンプルを試験する必要がある場合、その場合、試験すべき混合物の可能なすべてのコンビネーションの数もまた大きく、その機能的作用を測定するには過度の労力が必要とされる。かかるケースにおいて、本発明の方法を合理的なものとするのに、もう一つ別の系統的方法を用いて目的とする化学的存在を選択してもよい。
【００３９】
かくして、多数のサンプルを試験しなければならない、および／または各混合物において多数のサンプルがある場合には、最初に、試験されるべきサンプルの数を、各々がｎ個のサンプルを含む、より小さなサブグループに分け、その後で各サブグループの２またはそれ以上のｎ個のサンプルを工程ｂ）において可能なすべてのコンビネーションにて混合し、該混合物を工程ｃ）にて機能性アッセイに供するのが都合がよい可能性がある。
【００４０】
しかしながら、各サブグループにあるサンプルが可能なすべてのコンビネーションにて混合されるにすぎず、この時点で試験されるべきサンプルの可能なすべての混合物が混合され、機能性アッセイに供されているわけではないから、この方法では最適な混合物が試験されない可能性がある。第一のラウンド（工程ａ）−ｄ））にて試験されていないコンビネーションについてのさらなる情報は、典型的には、工程ｅ）−ｇ）に示されるような、混合、機能性アッセイによる試験および選択という新たなラウンドにより得られるであろう。このケースでは、選択されるｍ個のサンプルを異なるサブグループより開始し、新たな混合物を形成することが好ましい。サンプルを選択するための種々の方法が後記されるであろう。
【００４１】
ｍ個のサンプルを選択した後、該ｍ個のサンプルのうち少なくとも２個を工程（ｅ）ｎｉｔｅ可能なすべてのコンビネーションにて混合することで新たな混合物を形成する。このようにして、新たな混合物を得、それをその後で工程（ｆ）の機能性アッセイに供し、そこで機能性パラメータを測定して、機能的作用を有するか、その作用に起因する化学的存在を同定する。
【００４２】
工程ａ）にて準備されたサンプルの数（ｎ個のサンプル）が非常に大きい場合で、複数の工程で試験されるべきサンプルの数を選択することが有益である場合において、その機能性アッセイを行う必要のある混合物の数は、最も合理的であるように、限定される。このことは、最も適切には、工程ｄ）、ｅ）およびｆ）を繰り返すことでなされる。このようにして、工程ｃ）にて選択されるサンプルはサブプールに分けられ、その各々はｍ個のサンプルを含み、それに対して工程ｄ）、ｅ）およびｆ）を実施する。各繰り返しにおいて、選択されるサンプルの数は減少する。当業者であれば、異なるプールからのサンプルに対して実施される工程が並行してまたは連続して行われうることが分かるであろう。
【００４３】
本発明の方法は、２個のサンプルを含有する混合物を試験することを包含する。しかしながら、該方法は、工程ｂ）のｎ個のサンプルのうち３個、または所望により３個より多くを可能なすべてのコンビネーションにて混合することでなされることが好ましい。また、工程ｅ）のｍ個のサンプルのうち３個、または所望により３個より多くを混合することが好ましい。当業者は３個より多くのサンプル、例えば、４、５、６または７個のサンプルを、さらには８、９、１０またはそれ以上のサンプルを混合することで得られる混合物もまた本発明の方法の範囲内にあることを認識するであろう。
【００４４】
あるケースでは、その目標は比較的多くの異なる化学的存在を含む混合物を同定することかもしれない。そのような混合物の一例が、例えば５−１５種の異なる個々の抗体を含有するように設計された組換えポリクローナル抗体である。そのようなケースにおいて、その過程は、最初に、例えば、３種の異なる抗体または他の化学的存在を試験する、少数の異なる化学的存在だけを含む混合物を試験し、ついでその後で２個またはそれ以上の選択された混合物を混合し、ついでその新たな混合物を機能性アッセイに供することで、工程ｅ）−ｇ）にて、試験のための新たな混合物を形成し、選択することで、合理化されてもよい。かくして、混合、試験および選択の第二ラウンドでは、例えば最初の機能性アッセイ（工程ｃ））に基づく、３種の異なる化学的存在の混合物は、工程ｅ）にて混合される「サンプル」であると考えることができ、その結果、工程ｆ）の機能性アッセイに供されるサンプルは、工程ｃ）にてアッセイされた最初の混合物よりも、多数の異なる化学的存在を含有するであろう。本発明の基礎となる方法の変形は、工程ｃ）の後に行う以下の工程により規定されてもよい：
ｄ１）所望の機能的作用を有するｍ１個の混合物を選択し；
ｅ１）工程ｄ１）より選択されるｍ１個の混合物のうち２、３、４または５個を可能なすべてのコンビネーションにて混合し；
ｆ１）工程ｅ１）の混合物を、機能性パラメータを測定することのできる機能性アッセイに供し、機能的作用に起因する混合物を同定し；および
ｇ１）工程ｅ１）の混合物より、所望の機能的作用を有する第二の混合物を選択する。
【００４５】
工程ａ）−ｇ）に示される本発明の基礎となる方法は、必要であれば、例えば、試験されるべきサンプルの総数（ｎ）および最終混合物中にある所望の異なる化学的存在の数に応じて、変形することができる。基礎となる方法は、混合、アッセイおよび選択の少なくとも２つのラウンド、すなわち工程ｂ）、ｃ）およびｄ）からなる一のラウンドと、工程ｅ）、ｆ）およびｇ）からなるもう一つ別のラウンドを含む。しかしながら、状況に応じて、これらのラウンドの一方または両方は１回またはそれ以上の回数繰り返されてもよい。
【００４６】
非常に多くの化学的存在、例えば約２５種までの異なる個々の抗体を含有する組換えポリクローナル抗体を含む混合物を意図とする場合、その時には該方法は３以上の工程、すなわち工程ｈ）、ｉ）およびｊ）を含んでもよい。工程ｈ）においては、工程ｇ１）で得られた混合物から選択された２、３、４または５個を混合し、その後の工程ｉ）にて該混合物を機能性パラメータを測定することのできる機能性アッセイに供し、機能的作用を有する混合物を同定する。最終工程である工程ｊ）において、所望の機能的作用を有する第三の混合物を選択する。
【００４７】
上記した型の基礎となる操作にさらなる工程またはさらなるラウンドを含ませることで該発明を拡張することも当業者の範囲内であろう。
【００４８】
機能的作用を有する、または該作用に起因する化学的存在を含むサンプルの適当な同定を行うためには、検査される化学的存在が一度だけ出現する、サンプルだけを比較ことが好ましい。例えば、抗体３−ミックスのケースにおいて、３種の異なる抗体を含有するサンプル（すなわち、一の抗体の二つの部分および別の抗体の一の部分、または単一の抗体の三つの部分を含有するサンプルを除く）だけを比較することが望ましい。後記されるように、本発明はまた、化学的存在の間の最適な化学量論的割合が同定され得る方法を提供し、そのために、異なる濃度で存在する化学的存在による機能的作用に対する起因を排除するのに、異なる化学的存在の濃度が同定される混合物だけを比較することが望ましい。この方法を用いる場合、各々、工程ｅ１）および工程ｈ）にて調製される混合物中に化学的存在が１回だけ現れることが好ましい。
【００４９】
機能的作用を有する、または該作用に起因する化学的存在を含むサンプルを選択する場合には、多くの異なる方法を用いることができる。一の方法にて、化学的存在Ａが機能的作用を有るか、該作用に起因するかどうかについての同定は、化学的存在Ａを含む混合物の機能的作用を、化学的存在Ａを含まない少なくとも一つの混合物の機能的作用と比較することでなされる。例えば、３つの機能的存在を含有する混合物のケースでは、化学的存在Ａが機能的作用を有するか、またはそれに起因するかどうかについての同定は、化学的存在Ａおよび／または化学的存在Ｂを含む３つのサンプルを可能なすべてのコンビネーションで混合し、例えば化学的存在Ａの一の部分および化学的存在Ｂの二の部分、および化学的存在Ａの二の部分および化学的存在Ｂの一の部分を含む混合物の機能的作用を、化学的存在Ｂの三の部分を含む混合物の機能的作用と比較することでなされる。
【００５０】
もう一つ別の方法において、化学的存在Ａが機能的作用を有するか、またはその作用に起因するかどうかについての同定は、化学的存在Ａと他の化学的存在を一緒に含む混合物の機能的作用を、化学的存在Ａを含むだけの混合物の機能的作用と比較することでなされる。
【００５１】
さらにもう一つ別の方法において、化学的存在Ａが機能的作用を有するかどうかについての同定は、化学的存在Ａを含む混合物の機能的作用を、標準値と比較することでなされる。この標準値は所定の値であることが好ましい。化学的存在Ａを含む混合物の同定された機能的作用は、化学的存在Ａについて機能的作用を有するか、またはそれに起因すると定められた次元において、所定の値よりも高いか、等しいか、または低いかのいずれかでなければならない。あるケースにおいては、標準値は、化学的存在Ａを含む混合物の機能的作用の同定が、化学的存在Ａについて機能的作用を有するか、またはそれに起因すると定められた次元になければならない範囲内の区間にあってもよい。他のケースにおいて、標準値は分析アッセイを行うことで測定されるパラメータの平均値、例えば、混合物を機能性アッセイに供した場合に測定されるすべての値の平均値であってもよい。
【００５２】
機能的作用を有するか、または該作用に起因する化学的存在を同定するための一の好ましい方法は、その機能的作用を有する混合物中で最も頻繁に出現する化学的存在を同定することである。最も薬効および効能がある混合物の化学組成を確立し、どの化学的存在がそれらの混合物中に最も頻繁に出現するかを同定することで、特定の化学的存在がその機能的作用に起因しているか、時にどのように起因しているかについての良好な指標を得ることができる。この方法は以下の実施例３に用いられており、その機能性アッセイの結果は抗体９９２が上位２０の有効な混合物のうちの１９の混合物で認められ（図４を参照のこと）、かくしてこの抗体が他の抗−ＥＧＦＲ抗体とのコンビネーションにおいて非常によく活動していると結論付けることができる。
【００５３】
試験されるべきサンプルの数は、検査されるべき化学的存在が同じ型（例えば、抗体）であるかどうか、あるいは化学的存在が異なる型（例えば、小分子ドラッグと合した抗体）であるかどうかについて、調査されるコンビナトリアルドラッグの型に応じて著しく変化しうる。ｎは３またはそれ以上の整数であり、例えば３と１４４０の間、好ましくは３と３６０、例えば３と１２０の間、あるいはさらに好ましくは３と２４、例えば３と１２の間の整数である。
【００５４】
開始時のサンプルの数に応じて、工程ｄ）の選択されるサンプルの数（ｍ個のサンプル）もまた著しく変化しうる。しかしながら、ｍは３またはそれ以上の数値、例えば３と７２０の間、好ましくは３と３６０、例えば３と１２０の間、あるいはさらに好ましくは３と２４、例えば３と１２の間の整数である。
【００５５】
本発明においては、ある化学的存在の不在下でのパラメータと比較した場合に、その化学的存在があることで変化しうる機能性パラメータを測定することで、化学的存在または化学的存在の混合物の機能的作用が機能性アッセイにおいて同定される。測定されるべき機能性パラメータは、例えば、以下のいずれかである：
・物理的作用の発揮−これは、例えば蛍光発光、または吸光度または他の電磁気照射であり得る；
・リガンドまたは抗原との結合−典型例が受容体分子または抗体の結合である；
・触媒活性、例えば酵素活性の発揮；
・触媒活性、例えば酵素活性に対する多感性；
・試薬の生物膜を通過する改変された輸送の促進；
・試薬の細胞内コンパートメントにおける改変された転位の促進；
・真核生物細胞の集団中の少なくとも１つの遺伝子の発現に対する影響−すなわち、化合物の発現調節剤としての機能（例えば、転写レベルに対する）がアッセイされ得る；
・真核生物細胞の集団の成長または代謝作用に対する影響−成長調節剤の変異バージョンをコードするライブラリーをスクリーニングする場合において都合がよい；
・標的細胞に対する影響−例えば、増殖、抗増殖、分化、アポトーシス、代謝作用またはドラッグ感受性に対する化合物の作用について試験することが可能であり、そのいずれも、例えば抗癌剤として機能しうる生成物の発現についてスクリーニングした場合に関連するものであってもよい；
・病原体に対する影響−ウイルス中和、ウイルスとの結合または殺ウイルスについてアッセイすることが可能であり、同様に細菌との結合、殺菌、食作用、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ等についてアッセイすることも可能である；
・二次免疫作用に対する影響；
・化合物の発現、製造または処方能に対する影響；
・安定性に対する影響。
【００５６】
「所望の機能的作用」なる語は機能性パラメータの所望の変更をいう。その機能性パラメータの望ましい変更は、アッセイされる化学的存在の特性およびインビトロおよびインビボでの意図される作用に依存するのは明らかである。典型的には、所望の機能的作用は問題の化学的存在が特定の条件で医薬の改善を提供する能力を有することを示唆する作用である。例えば、試験されるべき化学的存在が抗ＡＩＤＳ剤として用いられる物である場合、その所望の機能的作用はＨＩＶとの結合またはＨＩＶの中和を強化することができ、あるいはＨＩＶ感染細胞の不活化を向上させることができる。
【００５７】
新しいドラッグおよびドラッグコンビネーションを開発する場合、相乗作用を有する新規な製剤が、あるいは一より多くの機能的作用を有する新規な製剤が求められる。例えば、一方で癌を治療するドラッグを開発することにとって興味深く、他方では化学療法の副作用を減少させることにとって興味深い。もう一つ別の例として、１種より多くのウイルスを同時に根絶するインフルエンザワクチンは興味深いワクチンである。
【００５８】
かかる場合には、本発明の方法は、治療されるべき混合物を２またはそれ以上の機能性アッセイに供するように、各機能性アッセイが機能性パラメータを測定することができ、各混合物の２またはそれ以上の機能性パラメータを独立して測定するために、改変されてもよい。これらのアッセイは並行してまたは連続して行われてもよい。試験されるべき機能性パラメータは、例えば、真核生物細胞の集団の成長または代謝作用に対する影響であってもよく、あるいは標的細胞に対する影響であってもよい。
【００５９】
本発明の方法を実施するいずれのモードも使用することができる。しかしながら、製造される混合物の数および実施される機能性アッセイの数を考えれば、操作モードはある種の自動操作を含むことが好ましい。したがって、一の操作モードにおいて、該方法はマルチウェルプレートで行われる。これらのプレートは実験室では標準的な装置であり、当業者はかかるプレートを用いて実験をどのように行うかが分かっている。検査されるべき混合物を調製するのに行う必要のある労力が抑えられるため、該混合物は自動液体処理装置を用いて混合されることが好ましい。機能性アッセイもまた、ロボットを用いる装置および当該分野にて既知の方法によって実施されてもよい。
【００６０】
本発明のもう一つ別の態様は、少なくとも２つの化学的存在を含む混合物中での化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定かつ選択し、所望の機能的作用を得る方法を提供することである。当該方法はコンビナトリアルドラッグの最適濃度を見つける助けともなる。例えば、２またはそれ以上の抗体が同じ混合物中に存在する場合、特異的な標的に結合するために競合が生じる可能性があることは周知である。この競合は、一部、混合物中に存在する異なる抗体の濃度に依存し、その結果、特異的抗体の濃度が高ければ高いほど、抗体が競合して標的に結合する可能性が高くなるようである。かくして、コンビナトリアルドラッグの最適な相乗作用を達成するために、化学的存在の各々の濃度ならびに異なる化学的存在の間の化学量論的割合は最適化されることが好ましい。
【００６１】
混合物中の化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定かつ選択する本発明の方法は、少なくとも５つの工程を含む。第一の工程、工程ａａ）において、各々、混合物中に一つの化学的存在が存在して含む、ｐ個のサンプルが提供される。次に、工程ｂｂ）において、該ｐ個のサンプルは各々、ｑ倍に希釈され、各々、同じ化学的存在を含むが、その濃度が異なる、ｐ個の一連のサンプルを得る。その後、工程ｃｃ）において、工程ａａ）およびｂｂ）にて得られて２またはそれ以上のサンプルを可能なすべてコンビネーションにて混合し、試験されるべき混合物を得、ついで工程ｄｄ）にて工程ｃｃ）にて得られた混合物を機能的作用を測定することのできる機能性アッセイに供して、測定される機能的作用と混合物中の化学的存在の濃度の間の関係を同定する。最終工程、工程ｅｅ）にて、所望の機能的作用を有する混合物を選択する。
【００６２】
工程ａａ）にて準備されるサンプルの数は検査されるべき混合物中に存在する異なる化学的存在の数に対応している。かくして、３つの異なる化学的存在を含むコンビナトリアルドラッグを意図とする場合、ｐは３に等しい。しかしながら、好ましくは、ｐは２またはそれ以上の値を有する整数であり、より好ましくは２と２４の間の値、さらにより好ましくは２と１２の間の値を有する。
【００６３】
主に、工程ｂｂ）においては、サンプルは当該分野にて知られている適当な倍率に希釈され得る。しかしながら、サンプルは２、５、１０、２０、５０または１００倍に希釈されることが好ましい。いずれのサンプルも数倍に希釈され、各サンプルが異なる濃度を有する、一連のサンプルを得ることができる。好ましい方法はサンプルが１、２、３、４または５倍に希釈されているものである。
【００６４】
本発明のもう一つ別の態様において、本発明の方法により最適であると同定される混合物は、医薬として、あるいは医薬の製造のために用いることができる。しかしながら、上記したように、本発明の方法により選択かつ同定される混合物はドラッグに適するだけでなく、２またはそれ以上の化合物を含む他の生成物、例えば農薬または化粧品にも適している。
【００６５】
本発明に従って選択されうる化合物の例
一般に、ヒトおよび動物に投与された場合に、効果的な作用のあることが知られている化合物は、本発明の方法にて試験する対象であろう。しかしながら、効果的な作用、例えば、医薬としての作用を有することが分かっていない化合物もまた、不明な作用または１または複数の他の化合物と組み合わせて試験されると、明らかになるかもしれない、おそらくは相乗作用を見出すために試験されてもよい。
【００６６】
本発明の方法において、試験されるべき化学的存在に含まれる化合物は、医学的症状の治療または予防用の化合物であってもよく、あるいは医学的症状の緩和用、あるいはヒトまたは動物の健康用の化合物であってもよい。しかしながら、本発明の方法にて試験されるべき化合物は、抗体、抗生物質、抗がん剤、抗ＡＩＤＳ剤、抗成長因子、抗ウイルス剤、生物製剤（例えば、可溶性受容体、サイトカインおよび他の蛋白を包含する）、ＲＮＡｉ、ワクチンおよびそれらの混合物からなる群より選択されることが好ましい。
【００６７】
試験されるべき化学的存在に含まれる化合物が抗体である場合には、機能性アッセイに供される混合物は、２または複数の抗体のコンビネーション、あるいは少なくとも一つの抗体が、例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗がん剤、抗自己免疫疾患剤、およびＲＮＡｉからなる群より選択される１または複数の他の化合物と合されるコンビネーションであってもよい。試験されるべき化学的存在に含まれる化合物は抗体であることが好ましく、試験されるべき化学的存在に含まれる化合物はモノクローナル抗体であることがより好ましい。本発明は、組換えポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のカクテルとして産生され得るモノクローナル抗体の最適なコンビネーションを同定するために、モノクローナル抗体の多数のコンビネーションを試験するのに特に適している。
【００６８】
抗体
本発明の方法に用いることができる化合物の一群は、エピトープを特異的に認識し、かつ結合する抗体またはその機能性等価物を包含する。
【００６９】
抗体またはその機能性等価物は、当該分野にて公知の抗体、例えば哺乳動物より誘導されるモノクローナル抗体または合成抗体、例えば一本鎖抗体または抗体フラグメントを含むハイブリッドであってもよい。加えて、抗体の機能性等価物は抗体フラグメント、特にエピトープ結合フラグメントであってもよい。さらには、抗体またはその機能性等価物は抗体を模倣する小分子であってもよい。天然の抗体は、重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリンである。本発明の好ましい実施態様において、個々の抗体はモノクローナル抗体であり、該発明は組換え抗体「カクテル」または組換えポリクローナル抗体にて用いるのに適するモノクローナル抗体の混合物を同定するのに用いられる。
【００７０】
本発明の抗体はまた、二特異的抗体、すなわち２種の異なるエピトープを特異的に認識する抗体であってもよい。二特異的抗体は、一般に、モノクローナル抗体から始まって調製されてもよく、あるいは組換え技法を用いて調製されてもよい。本発明の抗体はまた、三特異的抗体であってもよい。
【００７１】
抗体の機能性等価物は、一の好ましい実施態様において、抗体のフラグメント、好ましくは抗原結合フラグメントまたは可変領域であってもよい。本発明で有用な抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂフラグメントと称される、２つの同一の抗原結合フラグメントを産生し、各々は、単一の抗原結合部位および残りの「Ｆｃ」フラグメントを有する。ペプシン処理で、抗原との交差連結能を有する２つの抗原結合フラグメント、および残りの他のフラグメント（ｐＦｃ’と称される）を有するＦ（ａｂ‘）２フラグメントが得られる。かかるフラグメントはまた、重鎖および軽鎖コーディング領域の関連する部分を発現ベクターに挿入することにより、組換え技法で産生されてもよい。付加的なフラグメントは、ジアボデー（diabodies）、線形抗体、一本鎖抗体分子および抗体フラグメントより形成される多特異的抗体を包含しうる。本明細書にて用いられる、抗体と関連する「機能性フラグメント」は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントをいう。好ましい抗体フラグメントは、抗体のその抗原との選択的結合性をいくらかまたは本質的にすべて保持する。
【００７２】
一の実施態様において、該抗体は、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有し、遺伝子融合した一本鎖分子としての適当なポリペプチドリンカーにより連結されている、遺伝子操作により作製された分子として定義される一本鎖抗体である。かかる一本鎖抗体はまた、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントとも称される。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それでｓｃＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成できるようにする。適当なリンカーを用いて、一本鎖Ｆａｂフラグメントも調製できる。
【００７３】
可変重鎖および可変軽鎖をコードするペアの単離および選択
抗体は、通常のモノクローナル抗体法、例えば、KohlerおよびMilstein, Nature 256: 495 (1975) の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、種々の方法により産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の技は、例えば、Ｂ−リンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換あるいはヒト抗体遺伝子のライブラリーを用いるファージ提示技術が用いられうる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体としての産生に適する完全なヒト抗体を単離する一の好ましい方法が、SymplexTM技術（Meijerら、J Mol Biol. 2006 5月5日; 358 (3): 764-72; およびＷＯ２００５／０４２７７４）であり、元々の重鎖および軽鎖のペアリングを維持し、ハイブリドーマ技術を必要とする細胞培養工程を回避する一方で、高い複雑性および多様性を有する抗体レパートリーを生成することができる。
【００７４】
抗体を産生する方法は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をコードする配列を適当な供給源から単離し、それによりＶＨおよびＶＬをコードするペアのレパートリーを生成することを含む。一般に、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を含有する適当な供給源は、適当な免疫応答と関連する標的に対して反応した１または複数の個体から由来の血液、脾臓または骨髄サンプルなどのリンパ球含有の細胞フラクションである。好ましくは、リンパ球含有のフラクションは、関連する標的と反応した、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するヒトまたはトランスジェニック動物より集める。集めたリンパ球含有の細胞フラクションをさらに豊富にし、特定のリンパ球集団、例えばＢリンパ球を得た。豊富化は、例えばＢ細胞および／または形質細胞の場合、結合特異性細胞表面マーカー蛋白の利点を考慮して、電磁ビーズ細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）および／または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて行うことが好ましい。リンパ球含有の細胞フラクションをＢ細胞および形質細胞について豊富化させることが好ましい。ましてやなおさら、高ＣＤ１９およびＣＤ３８発現および中間ＣＤ４５発現の細胞を血液より単離することが好ましい。これらの細胞は、時に、循環形質細胞、初期形質細胞またはプラズマブラスト（plasma blast）と称され、本願においては簡単にアスプラズマ（asplasma）細胞という。
【００７５】
一般に、ＶＨおよびＶＬをコードする配列の単離は、ＶＨおよびＶＬをコードする配列をベクターにて合わせ、ＶＨおよびＶＬをコードする配列のペアのライブラリーを生成する方法にて行うことができる。典型的な方法にて、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を無作為にベクターにて合わせ、ＶＨおよびＶＬをコードする配列のペアのコンビナトリアルライブラリーを生成する。ＶＨおよびＶＬをコードする配列の単離は、例えば、トランスジェニック動物の使用（さらには後記を参照）を含む、ファージ提示およびハイブリドーマ技術により行われ得る。
【００７６】
本発明においては、重鎖および軽鎖の元々のペアリングを維持し、ヒトであれ、動物であれ、ドナーにおける天然の免疫応答により生成される抗体のポテンシーおよびアフィニティーを維持することが好ましい。このことは、ドナーにて元々存在するＶＨおよびＶＬのペアリングの維持を含み、それにより配列ペアのレパートリーを生成し、その各々のペアが、配列を単離するドナーにより産生される抗体に元々存在するＶＨおよびＶＬペアに相当する、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をコードする。これはまた、ＶＨおよびＶＬをコードする配列の同族ペアと称され、抗体は同族抗体とも称される。一の好ましい実施態様において、コンビナトリアルまたは同族の、本発明のＶＨおよびＶＬをコードするペアをヒトドナーより得、したがって該配列は完全にヒト配列である。また、ＶＨおよびＶＬをコードするペアは、例えば、HuMAb-Mouse （登録商標）技術 (Medarex) またはXenoMouse（登録商標）技術 (Abgenix/Amgen) を用いて、ヒト抗体の産生能を有するトランスジェニック動物より得ることができる。
【００７７】
ＶＨおよびＶＬをコードする配列の同族ペアの生成についてはいくつかの異なる方法がある。一の方法はリンパ球含有の細胞フラクションと区別される単一細胞からのＶＨおよびＶＬをコードする配列を増殖および単離することを含む。ＶＨおよびＶＬをコードする配列を別々に増殖して第２工程にてペアを形成させるか、または増殖の間にペアを形成させてもよい（Coronellaら、2000 Nucleic Acids Res. 28: E85; Babcookら、1996 PNAS 93: 7843-7848）。別の方法は、インセル（in-cell）増殖およびＶＨおよびＶＬをコードする配列のペア形成を含む（Embletonら、1992. Nucleic Acids Res. 20: 3831-3837; Chapalら、1997 Bio Techniques 23: 518-524）。
【００７８】
ドナーにおけるＶＨおよびＶＬ配列の多様性と似ているＶＨおよびＶＬをコードする配列ペアのレパートリーを得るために、例えば、Meijerら（J Mol Biol. 2006 5月5日; 358 (3): 764-72）およびＷＯ２００５／０４２７７４（出店明示により本明細書の一部とする）に記載されるように、出来るだけＶＨおよびＶＬのペアのスクランブリング（ランダムコンビネーション）を少なくした、ハイスループット法が好ましい。
【００７９】
好ましくは、メンバーペアが標的とのチャレンジに対する体液性免疫応答に関与する遺伝子ペアを映す、ＶＨおよびＶＬをコードするペアのレパートリーは、以下の工程を含む方法に従って製造される：ｉ）関連する標的に対して結合する１または複数のドナーからのリンパ球含有の細胞フラクションを準備する工程；ｉｉ）該細胞フラクションからのＢ細胞または形質細胞を所望により豊富化させてもよい工程；ｉｉｉ）該細胞フラクションからの細胞を個々に複数の容器に分解することで単離された単一細胞の集団を得る工程；ｉｖ）該単離された単一細胞から誘導されるテンプレートを用いてマルチプレットオーバーラップエクステンションＲＴ−ＰＣＲ操作にてＶＨおよびＶＬをコードするペアを増殖させ、かつ結合させる工程；およびｖ）結合したＶＨおよびＶＬをコードするペアをネスト化されたＰＣＲを所望により実施してもよい工程。本発明の方法を実施する前に、単離された同族ＶＨおよびＶＬをコードするペアは上記したようにスクリーニング操作に供されることが好ましい。
【００８０】
該ＶＨおよびＶＬ配列ペアが生成されると、ＶＨおよびＶＬペアをコードする配列を関連する標的に対する結合反応性で同定するスクリーニング操作を行う。標的に対する結合剤についてのスクリーニングは、一般に、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡおよび／またはイムノドットアッセイなどの免疫検出アッセイを用いて実施される。
【００８１】
スクリーニングで選択されるＶＨおよびＶＬペアをコードする配列は、一般に、配列決定に供され、可変領域の多様性について分析される。特に、ＣＤＲ領域の多様性にとって興味深いが、ＶＨおよびＶＬファミリの提示にとっても興味深い。これらの分析に基づいて、１または複数のドナーより単離される剤結合抗体の多様性全体を提示するＶＨおよびＶＬペアをコードする配列を選択する。好ましくは、ＣＤＲ領域全体で異なる配列（ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）が選択される。異なるＶＨおよびＶＬファミリに属する１または複数の同一または極めて類似するＣＤＲ領域を有する配列があれば、これらも選択される。ＶＨおよびＶＬ配列ペアの選択も、可変重鎖のＣＤＲ３領域の多様性に基づいて行われ得る。配列のプライミングおよび増殖の間に、可変領域のフレームワーク領域にて変異が生じてもよい。配列をドナーの配列と完全に対応させるため、例えば、配列が可変領域のフレームワーク領域などのすべての保存領域にて完全にヒトであるように、そのようなエラーは訂正されることが好ましい。
【００８２】
ＶＨおよびＶＬペアをコードする選択された配列のコレクションの多様性全体が、異なる標的とのチャレンジに対する体液応答にて遺伝子レベルで見られる多様性を高度に代表することが確認される場合、選択されるＶＨおよびＶＬをコードするペアのコレクションより発現される抗体の特異性全体もまた、チャレンジされたドナーにて産生される抗体の特異性に関して代表すると考えられる。
【００８３】
トランスジェニック動物およびハイブリドーマを用いて産生される抗体
一の実施態様において、モノクローナル抗体は、マウス系よりもヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックまたはトランス染色体動物を用いて産生され得る。これらは、HuMab（登録商標）マウス、XenoMouse（登録商標）およびKMマウスなどのトランスジェニックおよびトランス染色体マウスを包含し、本明細書では包括的に「トランスジェニックマウス」という。
【００８４】
HuMAb-Mouse（登録商標）は、再配列されていないヒト重鎖（μおよびΥ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリンのミニ遺伝子を内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的とされる変異と一緒に含有する（Lonberg, N.ら、(1994) Nature 368 (6474): 856-859）。したがって、マウスは免疫化に対する応答においてマウスＩｇＭまたはκの発現の減少を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖のトランス遺伝子はクラススイッチおよび体細胞変異を経験し、高アフィニティヒトＩｇＧ、κモノクローナル抗体を産生する（Lonberg, N.ら、(1994), 前掲；lonberg, N.ら、(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonverg, N. およびHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93 およびHarding, F.およびLonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546）。HuMab（登録商標）マウスの調製は、Taylor, L.ら、(1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J.ら、(1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillonら、(1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg ら、(1994) Nature 368 (6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. ら (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. およびHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. およびLonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D.ら. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に詳細に記載されている）。さらには、US Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; and 5,770,429; すべてLonberg およびKay対するものである, ならびにUS 5,545,807 Suraniらに対する; WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 およびWO 01/09187を参照のこと。
【００８５】
ＫＭマウスはヒト重鎖トランス染色体およびヒトカッパ軽鎖トランス遺伝子を含有する。マウスの免疫化がマウス免疫グロブリンよりもヒト免疫グロブリンの産生をもたらすように、ＫＭマウスにおける内因性マウス重鎖および軽鎖遺伝子もまた中断されている。ＫＭマウスの構造およびヒト免疫グロブリンを産生するその使用がＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
【００８６】
ヒトモノクローナル抗体を産生するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックまたはトランス染色体マウス（例えば、ＨＣＯ１２、ＨＣＯ７またはＫＭマウス）が、例えば、Lonbergら、(1994)、前掲；Fishwildら、(1996)、前掲；およびＷＯ９８／２４８８４によって記載されるように、抗原および／または抗原を発現する細胞に富む調製物で免疫化され得る。別法として、マウスは該抗原をコードするＤＮＡで免疫化され得る。好ましくは、マウスは、最初の注入の際に６−１６週齢であろう。例えば、抗原に富む調製物（５−５０μｇ）を用いてHuMAb（登録商標）マウスを腹腔内にて免疫化することができる。純粋なまたは抗原に富む調製物を用いての免疫化が抗体を産生しない場合には、マウスを抗原を発現する細胞、例えば細胞株で免疫化し、免疫応答を促進することもできる。
【００８７】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するには、免疫化したマウスから脾臓細胞およびリンパ節細胞を単離し、それをマウス骨髄腫細胞株のような適当な免疫化細胞株に融合させ得る。ついで、得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生のためにスクリーンに付すことができる。例えば、免疫化したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞の５０％ＰＥＧ（ｗ／ｖ）との懸濁液を、ＳＰ２／０の非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣC，ＣＲＬ１５８１）に融合させ得る。細胞を約１ｘ１０５／ウェルで平底マイクロタイタープレートに置き、つづいて２週間、通常の試薬の他に、１０％ウシクローン血清、５−１０％オリゲンハイブリドーマクローン因子（ＩＧＥN）および１ｘＨＡＴ（シグマ）を含有する選択的培地でインキュベートさせることができる。約２週間後、ＨＡＴがＨＴと置き換えられている培地で細胞を培養させることができる。ついで、個々のウェルをＥＬＩＳＡによりヒトカッパ−軽鎖含有の抗体についてスクリーンに付し、ＦＡＣＳ分析に付すこともできる。広範囲に及ぶハイブリドーマ増殖が培地にて起こり、それは、通常、１０−１４日後に観察され得る。抗体を分泌するハイブリドーマを再びプレートに置き、再びスクリーンに付し、ヒトＩｇＧについてなおも陽性であるならば、限定希釈に付すことでモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローンすることができる。ついで、安定したサブクローンをインビトロにて培養し、特徴化のために組織培地にて抗体を生成することができる。
【００８８】
本発明のヒト抗体はまた、例えば、当該分野にて周知であるような、組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法を用いて宿主細胞トランスフェクトーマにて産生され得る。例えば、Morrison, S. (1985) Science 229: 1202を参照のこと。
【００８９】
特定の実施態様において、ａ）１または複数のモノクローナル抗体、好ましくは少なくとも２つのモノクローナル抗体と、ｂ）ａ）の１または複数の抗体とのコンビネーションにて相乗的またはその他の有利な機能的作用を提供する少なくとも１の付加的な治療剤との有利なコンビネーションを同定するために、本発明の方法を用いることが興味深いかもしれない。例えば、抗体が細菌感染を予防または治療するためのものである場合、２またはそれ以上のモノクローナル抗体と、少なくとも１つの非抗体の抗菌剤（例えば、後記する抗生物質を参照のこと）との最適なコンビネーションを同定することが有利でありうる。同様に、抗体が癌または腫瘍増殖を予防または治療するためのものである場合、２またはそれ以上の抗癌モノクローナル抗体と、少なくとも１の非抗体の抗癌剤（後記する抗癌剤を参照のこと）との最適なコンビネーションを同定することが有利でありうる。同じことが、抗体がＡＩＤＳまたはもう一つ別のウイルス疾患の予防または治療を対象とする場合で、２またはそれ以上のかかる抗ＨＩＶまたは他の抗ウイルスモノクローナル抗体と、各々、少なくとも１の非抗体の抗ＨＩＶ剤または抗ウイルス剤（後記する抗ＨＩＶおよび他の抗ウイルス剤を参照のこと）との最適なコンビネーションを同定することが有利である場合において、当てはまる。この同じ方法が、すなわち１または複数のモノクローナル抗体、好ましくは少なくとも２つのモノクローナル抗体の、その抗体と同じ症状（あるいは関連する症状を対象とするものであってもよい）を予防または治療することを対象とする少なくとも１の非抗体剤とのコンビネーションが、例えば、自己免疫疾患を対象とするモノクローナル抗体と、同じ自己免疫疾患を対象とする既知または新規な非抗体とのコンビネーションと同様に、他の適応症に用いられてもよい。
【００９０】
抗生物質
抗生物質は、細菌および真菌を含む、微生物を殺し、またはその増殖を止める分子として定義されてもよい。細菌を殺す抗生物質はまた殺菌剤とも言われ、細菌の増殖を止める抗生物質は静菌剤とも称される。
【００９１】
コンビナトリアルドラッグにおいて配合される場合のその機能的作用について試験することが興味深いとされ得る抗生物質は、β−ラクタム抗生物質、例えばペニシリン類（例えば、アモキシシリン）、セファロスポリン類、カルバペネム類、モノバクタム類等、テトラサイクリン類、例えばテトラサイクリン、マクロライド抗生物質、例えばエリスロマイシン、アミノグリコシド類、例えばゲンタミシン、トバラマイシンおよびアミカシン、キノロン類、例えばチプロフロキサシン、環状ペプチド、例えばバンコマイシン、ストレプトグラミン類およびポリミキシン類、リンコサミド類、例えばクリンダマイシン、オキサゾリジノン類、例えばリネゾリド、およびサルファ系抗生物質、例えばサルフィスオキサゾールを包含する。
【００９２】
抗癌剤
抗癌剤（化学療法薬とも知られる）は、有糸分裂（細胞分裂）を損傷し、急速に分裂する細胞を効果的に標的とするドラッグとして定義され得る。これらのドラッグは細胞に対する損傷を引き起こすため、該ドラッグはまた細胞傷害性とも称される。これらのドラッグのいくつかは細胞にアポトーシス、いわゆる「プログラムされた細胞死」を経験させる。
【００９３】
その必要なヒトの治療に用いられる場合、これらのドラッグが頻繁に他の癌治療、例えば放射線療法または手術と組み合わせて用いられることはよく知られている。別法として、患者は同時にいくつかの異なるドラッグで治療されてもよい。ドラッグはその機構および副作用において異なるが、コンビナトリアル投与の最も大きな利点は、一の該抗癌剤に対する耐性が進化する機会が最小となることである。かくして、コンビナトリアルドラッグとして用いた場合の相乗作用について抗癌剤を試験することは、上記した１または複数のモノクローナル抗体と一緒にそのような１または複数の剤を試験することと極めて関連することである。
【００９４】
抗癌剤の大部分はアルキル化剤、抗代謝産物、抗腫瘍抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤および他の抗腫瘍剤に分類され得る。これらのドラッグはすべて細胞分裂またはＤＮＡの合成および機能にある程度まで影響を及ぼす。加えて、ＤＮＡに直接干渉しない剤も開発された。これらはモノクローナル抗体およびチロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブメシラートを包含し、それは特定の型の癌（慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍）における分子異常性を直接標的とする。加えて、これらの細胞に直接攻撃することなく、腫瘍細胞の動きを調節するドラッグもまた、抗癌剤と称される。ホルモンもこのカテゴリーに入る。
【００９５】
アルキル基を条件下で多くの電気陰性基に添加することのできるアルキル化剤が細胞中にある。シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンがアルキル化剤の例である。この群に属する他の基としてメクロレタミン、シクロホスファミドおよびクロラムブシルが挙げられ、細胞ＤＮＡを化学的に修飾する働きをする。
【００９６】
抗代謝産物はプリン（アゾチオプリン、メルカプトプリン）またはピリミジンになりすまし、細胞サイクルの「Ｓ」期の間にこれら物質のＤＮＡへの組み込みを妨げ、正常な発達および分割を停止させる。それらはまた、ＲＮＡ合成に影響を与える。
【００９７】
抗腫瘍抗生物質（抗新生物剤および細胞傷害性抗生物質としても知られている）は、腫瘍の発達を阻害および根絶するドラッグである。この群に属するアントラサイクリンはまた、抗生物質としても作用する抗癌剤のファミリーである。アントラサイクリンはＤＮＡの構造を崩壊させ、その機能を終了させることで細胞分裂を防止させるように機能する。ＤＮＡマイナー・グルーブの塩基対中に挿入すること、またはＤＮＡのリボースのフリーラジカルの損傷させることのいずれかがその機能である。アントラサイクリンの一例として、ダウノルビシン、ソキソルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンに言及することができる。抗腫瘍抗生物質の群に属するドラッグの他の例として、アンチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびミトマイシンが挙げられる。
【００９８】
植物アルカロイドは植物より誘導され、微小管機能を防止することで細胞分裂を遮断する。微小管は細胞分裂に不可欠であり、それが無ければ、細胞分裂は起こり得ない。植物アルカロイドの主たる例として、ビンカ・アルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシン、ならびにタキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルが挙げられる。
【００９９】
トポイソメラーゼ阻害剤はＤＮＡのトポロジーを維持する必須酵素である。トポイソメラーゼＩ型およびＩＩ型の阻害は、適当なＤＮＡ超らせん形成を壊すことにより、ＤＮＡの転写および複製の両方を妨げる。トポイソメラーゼＩ型阻害剤の例として、カンプトテシン、例えばイリノテカンおよびトポテカンが挙げられ、それに対してトポイソメラーゼＩＩ型阻害剤の例として、アムサクリン、エトポシドホスファートおよびテニポシドが挙げられる。
【０１００】
抗ＡＩＤＳ剤
抗レトロウイルス剤としても知られる、抗ＡＩＤＳまたは抗ＨＩＶ剤は、レトロウイルス、主にＨＩＶの感染の治療のために設計される。数種のかかるドラッグ（典型的には３または４種）がコンビネーションで使用される場合、その方法は極めて活性な抗レトロウイルス療法またはＨＡＡＲＴとして知られている。かくして、コンビナトリアルドラッグ療法はＨＩＶおよびＡＩＤＳの治療における周知の方法である。したがって、この種の剤は、それを単独でまたは上記したような１または複数のモノクローナル抗体とのコンビネーションにて、本発明の方法にて試験されることと深く関連している。
【０１０１】
抗ＡＩＤＳ剤は該ドラッグが阻害するレトロウイルスの生活環の期により広く分類される。抗ＡＩＤＳ剤の一のクラスがヌクレオシドおよびヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）であり、新たに合成されるウイルスＤＮＡに挿入され、そのさらなる伸長を防止することで逆転写を防止する。ジドブジン、ラミブジン、エントリシタビン、アバカビル、テノホビル、ジソプロキシル・フマラートおよびスタブジンが、この群に属する剤の例である。
【０１０２】
抗ＡＩＤＳ剤のもう一つ別のクラスが、酵素と結合することで逆転写酵素を直接阻害し、その機能を阻害する、非ヌクレオシド逆転写阻害剤（ｎＮＲＴＩ）である。エトラビリン、デラビルジンおよびエファビレンズネビラピンが、この群における剤の例である。
【０１０３】
プロテアーゼ阻害剤（ＰＩs）は、ウイルス集合を標的とし、新しいバイロンの最終の集合についての新生蛋白を切断するのに、ＨＩＶによって使用される酵素である、プロテアーゼの活性を阻害する、抗ＡＩＤＳ剤のさらにもう一つ別のクラスである。アンプレナビル、チプラナビル、インジナビル、サクイナビル、ホサムプレナビル、ニトナビル、ダルナビル、アタザナビルおよびネルフィナビルがこの群に属する剤の例である。
【０１０４】
もう一つ別のクラスがインテグラーゼ阻害剤であり、ウイルスＤＮＡの感染細胞のＤＮＡへの融合に関与する、インテグラーゼ酵素を阻害する。最近では臨床試験にて数種のインテグラーゼ阻害剤がある。ラルテグラビルが２００７年１０月にＦＤＡの承認を受けた最初のこのような剤であった。
【０１０５】
もう一つ別のクラスの抗ＡＩＤＳ剤がエントリー阻害剤（または融合阻害剤）である。これらの剤は、いくつかの標的の一つを遮断することで、ＨＩＶ−１の宿主細胞への結合、融合およびエントリーを妨げる。マラビロックおよびエンフビルチドがこのクラスで最近になって利用可能な２種の剤である。
【０１０６】
もう一つ別のクラスが成熟阻害剤である。このクラスの剤は、ウイルスカプシドポリ蛋白を切断し、それによってポリ蛋白の成熟カプシド蛋白への変換を遮断することで、ｇａｇプロセシングの最終工程を阻害する（２４頁）。これらのウイルス粒子は不完全なコアを有し、放出されるバイロンは主に非感染性粒子のみからなる。ベビリマットおよびビベコンがこの群の剤に属する。
【０１０７】
この技術分野において、相乗作用のエンハンサーのあることもよく知られている。相乗作用のエンハンサーは、単独では抗レトロウイルス特性を有しないし、単独療法には不適当または非実践的であるが、該エンハンサーが抗ウイルス剤と一緒に服用されると、（時に抗レトロウイルスの代謝作用を改変することで）１または複数のそれらのドラッグの作用を強化する。かくして、「抗ＡＩＤＳ剤」なる語が用いられる場合、これらの相乗作用のエンハンサーも含まれるものと理解すべきである。
【０１０８】
腫瘍によって分泌される成長因子を標的とする剤は血管形成を根絶し、かくして腫瘍の増殖を軽減させることができる。かかる剤の一例がベバシズマブ（Avastin）であり、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を対象とするシグナル遮断血管形成阻害剤として入手可能である。腫瘍血管形成に関与する他の成長因子は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および表皮増殖因子（ＥＧＦ）を包含する。
【０１０９】
抗ウイルス剤
抗ウイルス剤はウイルスに対して細胞防御を刺激する能力を有する物質として定義される。抗ウイルス剤は、例えば、細胞のＤＮＡ合成を軽減させ、それで細胞をウイルス遺伝子に対してより耐性とし、細胞の免疫応答を強化するか、またはウイルス複製を抑制する。抗ウイルス剤は２または３のウイルス疾患だけを治療するのに用いることができる。というのも、ウイルス複製は治療される身体における細胞と密接に関連付けられ、ウイルス複製を顕著に防止するドラッグは治療される身体にも毒であると考えられるからである。
【０１１０】
抗ウイルス剤は２つの群：ヌクレオシドアナログおよびインターフェロンに分類することができる。抗ＡＩＤＳ剤は別に上記されている。
【０１１１】
ヌクレオシドアナログはヌクレオシドと似た合成化合物であるが、不完全または異常なオキシ−リボースまたはリボース基を有する。これらの化合物は感染細胞内で三リン酸塩の形態にリン酸化される。このようにして、ドラッグはウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ中への組み込みについて正常なヌクレオチドと競合する。増殖する核酸鎖への組み込みはウイルスポリメラーゼとの不可逆な結合および連鎖停止をもたらす。ヌクレオシドアナログの例はアシクロビル、ガンシクロビル、イドクリジン、リバビリン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジンおよびジゾブジンである。
【０１１２】
インターフェロンは３つのクラス、すなわち、アルファ−、ベータ−およびガンマ−インターフェロンに分類することができる。アルファ−およびベータ−インターフェロンはウイルス感染した細胞によって分泌される。それらは隣接する細胞の特異的な受容体に結合し、細胞をウイルスによる感染から保護する。それらはウイルスによる侵入に対して中間的な保護宿主応答の一部を形成する。これらの直接的な抗ウイルス作用に加えて、アルファ−およびベータ−インターフェロンもまた、感染した細胞の表面でのクラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子の発現を強化し、かくしてウイルス抗原の特異的免疫細胞への提示を亢進する。組換えアルファ−およびベータ−インターフェロンが入手可能であり、慢性Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス感染の治療に用いることができる。ガンマ−インターフェロン（免疫インターフェロンとしても知られる）はＴＨ１ ＣＤ４細胞により分泌されるサイトカインである。その機能は特異的Ｔ細胞媒介免疫応答を強化することである。
【０１１３】
可溶性受容体
「受容体」なる語は、本願明細書において、受容体−リガンド結合との関連でその語の通常の意味に従って用いられるが、抗体を含むものとして解釈されるべきではない。「可溶性」なる語は、サイトカイン受容体の分野にて理解されるように、細胞膜結合のカウンターパートから受容体を区別される。可溶性受容体は細胞外（リガンド結合）ドメインを含むが、受容体を細胞表面上で保持させる、膜貫通領域を欠く。同様に、可溶性受容体は、一般に、細胞内（細胞質）ドメインを欠く。
【０１１４】
特定の受容体の天然の可溶性形態が存在することが分かっている。例えば、可溶性受容体が種々のホルモン；例えば、インスリン受容体、ＩＬ−２受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩＩ）受容体、ＥＧＦ受容体、血小板誘発の成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、およびＦｃ受容体について天然に存在することが知られている。これらの可溶性または末端切断された受容体はその膜結合カウンターパートの結合特性と同様の特性を有するようである。可溶性受容体は組換え発現を介して他のポリペプチド、例えばＦｃ受容体、およびリガンドにライゲートされ得る。
【０１１５】
活性化の不足（例えば、リガンドの欠如）または活性化の過剰（例えば、リガンドの過剰）の形態の、シグナルトランスダクション経路の異常性は、関節炎、癌、ＡＩＤＳおよび糖尿病などの病態および疾患の根本原因である。これらの衰弱化させる疾患を治療するための現在の治療法の一つが、受容体デコイ、例えば細胞外リガンド結合ドメインのみからなる可溶性受容体を用い、リガンドを封じ、そうして受容体の活性化過剰を克服することを含むものである。この方法の一例は、Immunex/Amgenにより、Enbrel（登録商標）、ダイマー可溶性ＴＮＦ−アルファ受容体イムノグロブリン（ＩｇＧ）融合蛋白をクリエートすることである。ＴＮＦファミリーのサイトカインは、感染または組織損傷に対する応答において身体により産生される主たるプロ炎症性シグナルの一つである。しかしながら、例えば、感染または組織損傷のない状態での、これらのサイトカインの異常な産生は、関節炎および乾癬などの疾患の根本原因の一つである。したがって、ジスルフィド結合を介して同時２量体化を可能とする、可溶性ＴＮＦ−アルファ受容体とイムノグロブリンＧ１のＦｃ領域との融合は、ダイマー可溶性ＴＮＦ−アルファ受容体の分泌を可能とする。モノマー可溶性受容体との比較において、ダイマーＴＮＦ−アルファ受容体ＩＩ−Ｆｃ融合はホモトリマーリガンドへのアフィニティを著しく増加させた。このことは、構造的に高いＴＮＦ−アルファが重要な因果的役割を果たしている、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫疾患の治療における臨床的使用ための分子基準を提供する。
【０１１６】
多くの疾患の発病におけるその基本的な関与のため、サイトカインは生物療法の方法についての標的のもう一つ別のクラスを構成する。サイトカイン受容体の可溶性形態がサイトカイン活性の内因性調節に関与するとの知見は、免疫治療剤としてのその潜在的用途にて実質的な興味を惹起する。
【０１１７】
ＲＮＡｉ’ｓ
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、翻訳段階での、または特定の遺伝子の転写を妨害することによる、遺伝子発現を阻害するメカニズムである。ＲＮＡｉターゲットは、ウイルスおよびトランスポゾン由来のＲＮＡを含み（いくつかの形態の固有の免疫応答に重要である）、また、これらは発育の調節およびゲノム維持に役割を果たす。ＲＮＡｉパスウェイは、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）酵素により開始され、長鎖ｄｓＲＮＡ分子を２０〜２５塩基対の短鎖フラグメントに切断する。ついで、ガイドストランドとして知られている各々のフラグメントの２本鎖の１つを、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に導入し、相補配列とペアを為す。この認識事象の最もよく知られた研究結果は、転写後遺伝子サイレンシングである。これは、ガイドストランドが、特異的に、ｍＲＮＡ分子と対をなし、ＲＩＳＣ複合体の触媒成分であるアルゴノート（ａｒｇｏｎａｕｔｅ）による切断を誘発するときに生じる。他の結果は、遺伝子が転写する程度に影響を与える遺伝子−ヒストン修飾およびＤＮＡメチル化−へのエピジェネティックな変化である。
【０１１８】
ＲＮＡ干渉は、特に、トランスポゾンにより自己増殖を阻害することができる植物において、ウイルスおよび他の外来遺伝物質への免疫応答に必要不可欠である。一般的に、動物は、植物よりもダイサー酵素の変異体の発現が少ない。いくらかの動物におけるＲＮＡｉは、抗ウイルス応答を与えることが示されている。
【０１１９】
ＲＮＡ干渉パスウェイは、実験生物学において、細胞培養およびインビボでモデル生物において、遺伝子の機能を研究するために利用される。二本鎖ＲＮＡを、興味ある遺伝子に相補的な配列で合成し、細胞または生物に導入し、そこで、外来遺伝子物質として認識させ、ＲＮＡｉパスウェイを活性化する。この機構を用いて、研究者らは、標的遺伝子の発現を劇的に減少させることができる。この減少効果の研究は、遺伝子産物の生理学的役割を示し得る。ＲＮＡｉは、総合的には、遺伝子の発現を無効にすることができないので、この技術は「ノックダウン」とも称され、遺伝子発現を完全に排除する「ノックアウト」法とは区別される。
【０１２０】
治療においてＲＮＡ干渉を利用することができる。長鎖ｄｓＲＮＡストランドを動物細胞に導入することは、インターフェロン応答のために困難であるが、短鎖干渉ＲＮＡミミックの使用は、より成功し易い。臨床試験に到達した最初の適用は、黄斑変性および呼吸器合胞体ウイルスの治療であり、ＲＮＡｉはまた、マウスモデルで、誘発した肝不全を好転させるのに有効であることが示された。
【０１２１】
他の提案された臨床用途は、癌細胞での遺伝子発現の阻害、ＨＩＶに対するホスト受容体およびコレセプターのノックダウン、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎遺伝子のサイレンシング、インフルエンザ遺伝子発現のサイレンシング、および麻疹ウイルスの複写の阻害を含む、抗ウイルス療法に関する。神経変性疾患の有効な治療もまた提案されており、特にポリグルタミン疾患、例えばハンチントン病が注目されている。ＲＮＡ干渉はまた、腫瘍細胞で差異的にアップレギュレートされる遺伝子または細胞分裂に関連する遺伝子のサイレンシングにより癌を治療する可能性ある方法と考えられている。臨床での適用のためのＲＮＡｉの使用における主要な研究は、安全なデリバリー方法の開発であり、これまでは、遺伝子療法に関して提案されるものと同様のウイルスベクターシステムに主に関与していた。
【０１２２】
ワクチン
ワクチンは、特定の疾患に対する免疫を確立するまたは改善するために用いられる生物学的調製物である。ワクチンは、予防的（例えば、自然または「野生」の病原体による将来の感染の影響を防止または改善するため）または治療的（例えば、例えば癌のような病状の治療に用いるためのワクチン）であり得る。ワクチンは、死滅または不活化生物またはそれらかの精製産物から製造され得る。慣用的なワクチンは４つのタイプがある。
【０１２３】
一のタイプは、死滅微生物を含有するワクチンである。これらは、前もって化学的または熱的に死滅させた毒性の微生物である。例えば、インフルエンザ、コレラ、腺ペストおよびＡ型肝炎に対するワクチンがある。
【０１２４】
別のタイプは、弱毒生ウイルス・微生物を含有するワクチンである。これらは、その毒性に望ましい条件下で培養された生きた微生物、または、危険な微生物に密接に関連するが、それ自体危険性が少ない生きた微生物であり、広範囲の免疫応答を生じさせる。これらは、典型的には、持続的な免疫応答を惹起し、健康な成人にはより好ましいタイプである。例としては、黄熱病、麻疹、風疹およびおたふく風邪がある。生ツベルクリンワクチンは、感染性株ではないが、「ＢＣＧ」と称される関連株である。これは、米国において頻繁に用いられている。
【０１２５】
第三のタイプのワクチンは、トキソイドである。トキソイドは、毒性が化学的（ホルマリン）または熱処理により弱化または抑制されているが、他の特性、典型的には免疫原性が維持されたバクテリア毒素（通常、外毒素）である。トキソイドは、オリジナルの毒素への免疫応答を惹起し、または他の抗原への応答を増加させるので、ワクチンとして有用である。例えば、破傷風トキソイドは、破傷風を引き起こす破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）により産生されたテタノスパスミンから誘導される。破傷風トキソイドは、プラズマリッチワクチンの開発に用いられる。
【０１２６】
第四のタイプのワクチンは、サブユニットと称される。不活化または弱毒化微生物（「ホールエージェント（ｗｈｏｌｅ−ａｇｅｎｔ）」ワクチンを構成するもの）を免疫系に誘導するというよりも、そのフラグメントが免疫応答を与えることができる。例としては、ウイルスの表面タンパク質（酵母で酸性される）からのみ構成されるＨＢＶに対するサブユニットワクチン、およびヒトパローマウイルス（ＨＰＶ）に対するウイルスの主要なカプシド蛋白で構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）が挙げられる。
【０１２７】
多くの革新的なワクチンがまた、開発され、使用されている。これらは、コンジュゲート、組み換えベクターおよびＤＮＡワクチン接種を含む。コンジュゲート法は、ある種の細菌が、免疫原性に乏しい莢膜多糖類を有する事実の利用を可能にする。これらの莢膜をタンパク質（例えば、毒素）に結合させることにより、免疫系は、多糖類を蛋白抗原として認識することができる。このアプローチは、ヘモフィリス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｂワクチンに用いられている。組み換えベクター法においては、一の微生物および他のＤＮＡの生理学を組み合わせ、それにより、複雑な感染プロセスを有する疾患に対して免疫を与える。ＤＮＡワクチン接種は、感染性病原体のＤＮＡから作られる新しいタイプのワクチンである。これは、ヒトまたは動物細胞へのウイルスまたは細菌ＤＮＡの挿入（および発現、免疫認識機構を作動させる）により為される。発現されたタンパク質を認識する免疫系の細胞は、それらタンパク質およびそれらを発現する細胞に対する攻撃を増加させるだろう。これらの細胞は長期間生存するので、正常にこれらのタンパク質を発現する病原体と後に遭遇した場合、これら病原体はすぐに免疫系により攻撃されるだろう。ＤＮＡワクチンの一の利点は、非常に容易に生産し、貯蔵できることである。
【０１２８】
実施例
実施例１
高い効能および薬効を有するコンビナトリアルドラッグを選択することができるように、ハイスループット方法にて極めて多くのコンビネーションをスクリーンすることができる必要がある。かかる作業はささいなことではなく、４０種の候補ドラッグは１０のコンビネーションにおいて８００万通り以上で組み合わせることができる。最も興味深い混合物が「独特なコンビネーション」と称されるもので、候補ドラッグを重複して含まない混合物である。ｎの数の候補ドラッグのｒの候補ドラッグの混合物における独特なコンビネーション（ＵＣ）の数は、次式：
【数３】
より計算できる。
【０１２９】
この関数は放物曲線を記載する。極めて多くのコンビネーションを試験することの一の解決手段が候補ドラッグを群に分割し、より小さな混合物でそのコンビネーションを試験することである。これらのより小さな混合物の最適なコンビネーションが同定されれば、それらを組み合わせてより大きなコンビネーションを作製し、ついでそれを試験してもよい。その選択過程の概略は図１に見ることができる。
【０１３０】
方法
単一ドラッグとしての既知の活性を有する一連の候補ドラッグを３２までの群に分け、ついで、これら候補ドラッグの可能なすべての３−ミックスを１、２またはそれ以上の機能性アッセイにて活性について試験する。各群において、その多くが該混合物の活性に起因する候補ドラッグを選択し、必要ならば１または複数の群に分け、再び可能なすべての３−ミックスにて試験する（図１）。この過程を選択される候補ドラッグの数が１２またはそれ以下になるまで繰り返す。ついで、１２の候補ドラッグを可能なすべての２−および３−ミックスで試験し、これらコンビネーションの薬効が上位２０について滴定を行う。ついで、最も効能のある２−および３−ミックスをリード候補として選択する。ついで、最も効能のある独特な２−および３−ミックス（重複する候補ドラッグを含まない）を選択し、単一のドラッグとして処理する。ついで、これらの所定のドラッグコンビネーションの可能なすべての２−および３−ミックスを試験し、これらの混合物のコンビネーションの効能が上位２０について滴定を行う。滴定終了後、候補ドラッグの最も効能のある４、５、６、７、８または９のミックスをリード候補として選択することができる。最後に、リード候補を一連のアッセイにて比較し、最適なドラッグコンビネーションを決定することができる。
【０１３１】
実施例２
実施例２は３２までの候補ドラッグをハイスループット法にて２、３、４および５のミックスを生成する方法を記載する。
【０１３２】
方法
候補ドラッグの選択される数は、９６ウェルプレートで８までの群に、３８４ウェルプレートで１６までの群に、そして１５３６ウェルプレートで３２までの群に分けられる。ついで、候補ドラッグを適当な濃度に希釈し、ソースプレート（フィーダープレート）に移し、その第一のソースプレートは各ウェルにて一の候補ドラッグの列を含有する。第２のソースプレートは各ウェルにて一の候補ドラッグの列を含有する。Biomek（登録商標）３０００ラボラトリーオートメーションワークステーション（beckman Coulter）などの自動ピペットシステムを用いて特定容量の候補ドラッグをソースプレートの第一の列から８９６ウェルプレート、１６３８４ウェルプレートまたは３２１５３６ウェルプレートの全ての列に移す。同様の容量の候補ドラッグを第二のソースプレートの列からレシーバープレート（デスティネーションプレート）上の対応する列に移すことで、候補ドラッグの次の層を加える。
【０１３３】
第三の層は、第二のソースプレートの第一の列の同様の容量の内容物を第一のレシーバープレートのすべての列に移し、ついで第二のソースプレートの第二の列の内容物を第二のレシーバープレートのすべての列に移すことで添加される。８候補ドラッグを第一、第二および第三の層の９６ウェルプレートに添加終了した後のレシーバープレートのレイアウトの略図を図２に示す。Ａ）層１、Ｂ）層１＋２、およびＣ）層１＋２＋３。８候補ドラッグを異なるグレーの色合いで示す。
【０１３４】
候補ドラッグの第四または第五の層は、４つの層では候補ドラッグの数だけレシーバープレートの数を増やし、５つの層では再び候補ドラッグの数だけレシーバープレートの数を増やす、最終過程を繰り返すことで添加され得る。８候補ドラッグで９６ウェルプレートの場合には、これで４つの層で６４プレートおよび５つの層で５１２プレートを提供する。
【０１３５】
結果
この型のマトリックス様フォーマットでは、候補ドラッグの混合物を生成するのに明らかに有利な点がいくつかある。一の有利な点は、すべての独特な混合物がレシーバープレート上の異なる部位に配置されている複数のウェル（図２の場合には６ウェル）で生成されることである（図２）。これは、プレート間およびプレート内の変化、ならびに可能性のある生物学的変化を等しくするような、候補ドラッグの機能性試験には最適である。一の候補ドラッグの２／３を、別の候補ドラッグの１／３を含有する混合物もまた生成される。これらをまた異なるプレートに置き、トリプリケートにて観察する。傾斜（skewed）混合物と称される、これらの混合物は、個々の候補ドラッグのコンビネーションへの分布について有用な情報を提供しうる。
【０１３６】
実施例３
この実施例は、２３の抗体を１２抗体の群に分け、ついで３８４ウェルフォーマットにて標準的な生存アッセイにて３つの抗体をすべてのコンビネーションにて試験することで、実施例１および２に記載される方法を説明する。２３のうち１２の最も効能のある抗体を選択し、３つの抗体の可能なすべてのコンビネーションにて再び試験する。
【０１３７】
方法
９９２、１０２４、１０３０、１１８３、１１９４，１２１１、１２１４、１２４２、１２５４、１２５５、１２５７、１２６０、１２６１、１２７７、１２８４、１３０５、１３０８、１３１７、１３２０、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６と番号を付した、ヒトＥＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）への結合が確認されている２３の抗体をスクリーニングするのに選択した。各抗体を１ｘＰＢＳ中にて４０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６−ウェルのソースプレートに加えた。各群において、Biomek（登録商標）３０００ラボラトリーオートメーションワークステーション（beckman Coulter）を用い、Ａ行が２μｌの第一の抗体を含有し、Ｂ行が２μｌの第二の抗体を含有し、１２すべてのプレート上の１２の行が抗体を含有するようになるまで同様に、２μｌの１２抗体を３０μｌの培地を含有する１２３８４ウェルプレートのウェルに加えた。ついで、次の層の抗体を加えた；この時点で第一の抗体は列１に加えられており、第二の抗体は列２に加えられており、１２のすべてのプレート上のすべてのウェルが２つの抗体を含有するまで同様に加えられた。ついで、第三の層を、２μｌの抗体１をプレート１上のすべてのウェルに、２μｌの抗体２をプレート２のすべてのウェルに、すべてのウェルが３つの抗体を６μｌの容量で含有するまで同様に、ピペットを用いて添加することで加えた。各ウェルでの最終の抗体濃度は４μｇ／ｍｌであった。
【０１３８】
ついで、５００Ａ４３１ＮＳ細胞を含有する３０μｌの培地を、抗体含有のすべてのウェル、ならびに陰性対照として用いられる抗体を含まない２つの行に加えた。ついで、該プレートを３７℃で加湿されたインキュベータ中で３日間インキュベートし、その後で１ｘＰＢＳ中に１：１で希釈された８μｌの細胞増殖試薬ＷＳＴ−１をすべてのプレート上のウェルに添加した。その後で、該プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ついで、該プレートをオービタルシェーカーに移し、さらに１時間インキュベートした。吸光度をＥＬＩＳＡリーダー上で４５０および６２０ｎｍ（標準波長）で測定した。代謝活性な細胞（ＭＡＣ）の量を以下のようにして非処理対照のパーセントとして計算した。
【数４】
代謝活性は生存細胞の数と相関関係にあるとみなした。
【０１３９】
結果
２３の抗体を２つの１２の無作為な群に分け、群１は抗体９９２、１０２４、１０３０、１２１１、１２１４、１２５４、１２５５、１２６０、１２６１、１２７７、１２８４および１３２０を含有し、その一方で群２は抗体１１８３、１１９４、１２４２、１２５５、１２５７、１３０５、１３０８、１３１７、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６を含有した。奇数であるため、抗体１２５５が両方の群に含まれている。各群にある抗体の可能なすべての３−ミックスを上記したように生成し、細胞増殖に対する作用について試験した。％ＭＡＣを１２のモノクローナル抗体、２２０の独特な抗体の混合物、および１３２の傾斜混合物について計算した。ついで、該混合物を細胞培養に対するその作用に関してランク付けした。その多くが該混合物の効能に起因する抗体を選択することができるために、特定の抗体を含有する混合物について％ＭＡＣを該抗体に対してプロットし、中央％ＭＡＣを計算した。群１および群２にて抗体を含有する混合物についての％ＭＡＣの散布図を図３に示すことができる。群１の抗体９９２、１０２４、１０３０、１２５４、１２６１および１３２０が混合物の中で最も効能があり、それに対して抗体１２５７、１３０８、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６が群２の混合物の中で最も効果があることは明らかである。群１の抗体はまた、群２の抗体の混合物と比べてより効能があることも明らかであるが、それらは異なる実験の結果であるため、該群を直接比較することはできない。最終群のために各群からの６の抗体を選択した。これらは、９９２、１０２４、１０３０、１２５７、１２６１、１２８４、１３０８、１３２０、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６であった。２０の最も効能のある混合物の％ＭＡＣおよびスクリーニングの第２ラウンドの結果の散布図を図４に示す。最も高い効能を有する２つの混合物は、９９２＋１３０８＋１５６６および９９２＋１３０８＋１３２０であった。実際に、最も高い効能を有する混合物のうち１９は抗体９９２を含有し、このことはこの抗体が他の抗ＥＧＦＲ抗体とのコンビネーションにて十分な働きをすることを示す。抗体９９２はそれ単独で相当高い効能を有するが、他の抗体により増大することが見出された。
【０１４０】
実施例４
この実施例は実施例３にて選択された１２の抗体の可能なすべての２−ミックスを同様の生存アッセイにて試験した結果を記載する。
【０１４１】
方法
その多くが３−ミックスの効能に起因することが判明した１２の抗体、すなわち、９９２、１０２４、１０３０、１２５７、１２６１、１２８４、１３０８、１３２０、１４４９、１５６４、１５６５および１５６６を可能なすべての２−ミックスにて試験した。各抗体を１ｘＰＢＳ中にて４０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６−ウェルのソースプレートに加えた。各群において、Biomek（登録商標）３０００ラボラトリーオートメーションワークステーション（beckman Coulter）を用い、Ａ行が３μｌの第一の抗体を含有し、Ｂ行が３μｌの第二の抗体を含有し、１２のすべてが抗体を含有するまで同様に、３μｌの１２抗体を３０μｌの培地を含有する３８４ウェルプレートの１のウェルに加えた。ついで、次の層の抗体を加えた；この時点で第一の抗体は列１に加えられており、第二の抗体は列２に加えられており、１２のすべてのプレート上のすべてのウェルが２つの抗体を６μｌの総容量にて含有するまで同様に加えられた。各ウェルでの最終の抗体濃度は４μｇ／ｍｌであった。
【０１４２】
ついで、５００Ａ４３１ＮＳ細胞を含有する３０μｌの培地を、抗体含有のすべてのウェル、ならびに陰性対照として用いられる抗体を含まない２つの行に加えた。ついで、該プレートを３７℃で加湿されたインキュベータ中で３日間インキュベートし、その後で１ｘＰＢＳ中に１：１で希釈された８μｌの細胞増殖試薬ＷＳＴ−１をすべてのプレート上のウェルに添加した。その後で、該プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ついで、該プレートをオービタルシェーカーに移し、さらに１時間インキュベートした。吸光度をＥＬＩＳＡリーダー上で４５０および６２０ｎｍ（標準波長）で測定した。代謝活性な細胞（ＭＡＣ）の量を上記したようにして計算した。
【０１４３】
結果
％ＭＡＣを１２のモノクローナル抗体および６６の独特な抗体の混合物について計算した。ついで、該混合物をその細胞増殖に対する作用についてランク付けし、最も高い効能を有する２０の混合物を図５（上図）に示した。抗体９９２と１０２４のコンビネーションが最も高い効能を有する。該混合物について％ＭＡＣの散布図を図５（下図）に示すことができる。ここでも、抗体９９２が他の抗体とのコンビネーションにおいて優れた作用を示すことは明らかである。
【０１４４】
本願明細書にて引用されている特許および非特許文献はすべて、その内容を出典明示により本発明の一部とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の機能的作用を示す少なくとも２種の化学的存在を含む混合物を提供するために、機能的作用を有する、または該作用に起因する化学的存在を同定かつ選択する方法であって、
ａ）各々が試験されるべき１の化学的存在を含む、ｎ個のサンプルを準備し；
ｂ）２またはそれ以上の当該ｎ個のサンプルを可能なすべてのコンビネーションで混合し、第一の試験されるべき混合物のセットを得；
ｃ）該第一の混合物のセットを機能性パラメータの測定能を有する機能性アッセイに付し、その機能的作用に起因している化学的存在を同定し；
ｄ）各々が工程ｃ）において機能的作用に起因している化学的存在を含むｍ個のサンプルを選択し、ここでｍはｎよりも小さく；
ｅ）該ｍ個のサンプルを可能なすべてのコンビネーションにて混合し、第二の試験されるべき混合物のセットを得；
ｆ）該第二の混合物のセットを機能性パラメータの測定能を有する機能性アッセイに付し、その機能的作用に起因している化学的存在を同定し；および
ｇ）所望の機能的作用を有する混合物を選択する
工程を含む、方法。
【請求項２】
工程ｄ）、ｅ）およびｆ）が、各々がｍ個の選択されたサンプルを含む、別個のサブプールにて繰り返される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｄ）、ｅ）およびｆ）が、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返され、該工程が並行してまたは同時に繰り返される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
３つの化学的存在を含む混合物が、工程ｂ）にてｎ個のサンプルのうち３個を混合することで、同定かつ選択される、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
３つの化学的存在を含む混合物が、工程ｂ）にてｎ個のサンプルのうち３個を混合し、工程ｅ）にてｍ個のサンプルのうち３個を混合することで、同定かつ選択される、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｄ１）所望の機能的作用を有するｍ１個の混合物を選択し；
ｅ１）工程ｄ１）より選択されるｍ１個の混合物のうち２、３、４または５個を可能なすべてのコンビネーションにて混合し；
ｆ１）工程ｅ１）の混合物を、機能性パラメータを測定することのできる機能性アッセイに供し、機能的作用に起因する混合物を同定し；および
ｇ１）工程ｅ１）の混合物より、所望の機能的作用を有する第二の混合物を選択する
工程を含む、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ｈ）工程ｇ１）で得られた混合物から選択される２、３、４または５個を混合し；
ｉ）該混合物を機能性パラメータを測定することのできる機能性アッセイに供し、機能的作用に起因する混合物を同定し；および
ｊ）所望の機能的作用を有する第三の混合物を選択する
工程をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
化学的存在が工程ｅ１）にて混合されたいずれかの混合物にて一度だけ出現する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
化学的存在が工程ｈ）にて混合されたいずれかの混合物にて一度だけ出現する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
特定の化学的存在が機能的作用に起因するかどうかの同定が、該化学的存在を含む混合物の機能的作用を、該化学的存在を含まない１または複数の混合物の機能的作用と比較することでなされる、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
特定の化学的存在が機能的作用に起因するかどうかの同定が、該化学的存在および他の化学的存在を含む混合物の機能的作用を、該化学的存在を含むだけの混合物の機能的作用と比較することでなされる、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
特定の化学的存在が機能的作用に起因するかどうかの同定が、該化学的存在を含む混合物の機能的作用を、標準値と比較することでなされる、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
標準値が所定の値であり、化学的存在を含む混合物の同定された機能的作用が、化学的存在について機能的作用に起因するとの次元において、所定の値よりも高いか、等しいか、または低いかのいずれかでなければならず、あるいは標準値が、化学的存在を含む混合物の機能的作用の同定が、化学的存在について機能的作用に起因するとの次元になければならない範囲内の区間にあってもよい、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
機能的作用に起因する化学的存在の同定が、その機能的作用を有する混合物中で最も頻繁に現れる化学的存在を同定することでなされる、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ｎが３またはそれ以上の数、好ましくは３と１４４０の間、より好ましくは３と３６０の間、さらにより好ましくは３と１２０の間、さらにより好ましくは３と２４の間、特に好ましくは３と１２の間の数を有する整数である、請求項１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ｎが３またはそれ以上の数、好ましくは３と７２０の間、より好ましくは３と３６０の間、さらにより好ましくは３と１２０の間、さらにより好ましくは３と２４の間、特に好ましくは３と１２の間の数を有する整数である、請求項１ないし１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
試験されるべき化学的存在のいずれかに含まれる化合物が、抗体、抗生物質、抗癌剤、抗ＡＩＤＳ剤、抗成長因子、抗ウイルス剤、可溶性受容体、サイトカイン、ＲＮＡｉ、ワクチンおよびその混合物からなる群より選択される、請求項１ないし１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
試験されるべき化学的存在に含まれる化合物が２またはそれ以上の抗体のコンビネーションであるか；または少なくとも１の非抗体化合物とのコンビネーションの１または複数の抗体であり、例えば、非抗体化合物が、抗生物質、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗自己免疫疾患剤、およびＲＮＡｉからなる群より選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
試験されるべき化学的存在に含まれる化合物がモノクローナル抗体である、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
試験されるべき化学的存在に含まれる化合物が、ａ）１または複数のモノクローナル抗体、およびｂ）ａ）の１または複数の抗体とのコンビネーションにて所望の機能的作用を提供する少なくとも１の付加的な治療剤を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
測定されるべき機能性パラメータが、
物理的作用の発揮、リガンドとの結合、触媒活性の発揮、触媒活性に対する多感性、剤の生物膜を通過する改変された輸送の促進、剤の細胞内コンパートメントにおける改変された転位の促進、真核生物細胞の集団中の少なくとも１つの遺伝子の発現に対する影響、真核生物細胞の集団の成長または代謝作用に対する影響、標的細胞に対する影響、病原体に対する影響、二次免疫作用に対する影響、化合物の発現、製造または処方能に対する影響、および安定性に対する影響からなる群より選択される、請求項１ないし２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
試験されるべき混合物が機能性パラメータの測定能を有する２またはそれ以上の機能性アッセイに供され、各混合物の２またはそれ以上の機能性パラメータを独立して測定する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
機能性パラメータが、真核生物細胞の集団の成長または代謝作用に対する影響、標的細胞に対する影響、または標的細胞に対する化合物の影響である、請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
マルチウェルプレートにおいて、および／または自動ピペットを使用し、および／またはロボットを使用して行われる、請求項１ないし２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも２の化学的存在を含む混合物中で、化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定かつ選択する方法であって、該混合物が所望の機能的作用を示し、
ａａ）各々が一の化学的存在を混合物中にあるように含むｐ個のサンプルを準備し、
ｂｂ）該ｐ個のサンプルの各々をｑ倍に希釈し、ｐ個の一連のサンプルを得、その各々が同じ化学的存在を異なる濃度で含み、
ｃｃ）工程ａａ）およびｂｂ）にて得られた２またはそれ以上のサンプルを可能なすべてのコンビネーションで混合して、試験されるべき混合物を得、
ｄｄ）該混合物を機能的作用の測定能を有する機能性アッセイに供して、測定される機能的作用と混合物中の化学的存在の濃度との関係を同定し、および
ｅｅ）所望の機能的作用を有する混合物を選択する
ことを含む、方法。
【請求項２６】
サンプルが、工程ｂｂ）にて、２、５、１０、２０、５０または１００倍に希釈される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ｐが２またはそれ以上の整数であり、より好ましくは２と２４の間の、さらにより好ましくは２と１２の間の整数である、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
ｑが１、２、３、４または５の数値の整数である、請求項２５ないし２７のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
所望の機能的作用を示す少なくとも２種の化学的存在を含む混合物を提供するために、機能的作用を有する、または該作用に起因する化学的存在を同定かつ選択する方法であって、
ａ）各々が試験されるべき１の化学的存在を含む、ｎ個のサンプルを準備し；
ｂ）２またはそれ以上の当該ｎ個のサンプルを可能なすべてのコンビネーションで混合し、第一の試験されるべき混合物のセットを得；
ｃ）該第一の混合物のセットを機能性パラメータの測定能を有する機能性アッセイに付し、その機能的作用に起因している化学的存在を同定し；
ｄ）各々が工程ｃ）において機能的作用に起因している化学的存在を含むｍ個のサンプルを選択し、ここでｍはｎよりも小さく；
ｅ）該ｍ個のサンプルを可能なすべてのコンビネーションにて混合し、第二の試験されるべき混合物のセットを得；
ｆ）該第二の混合物のセットを機能性パラメータの測定能を有する機能性アッセイに付し、その機能的作用に起因している化学的存在を同定し；および
ｇ）所望の機能的作用を有する混合物を選択する
工程を含む、方法。
【請求項２】
工程ｄ）、ｅ）およびｆ）が、各々がｍ個の選択されたサンプルを含む、別個のサブプールにて繰り返される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｄ）、ｅ）およびｆ）が、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返され、該工程が並行してまたは同時に繰り返される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
３つの化学的存在を含む混合物が、工程ｂ）にてｎ個のサンプルのうち３個を混合することで、同定かつ選択される、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
３つの化学的存在を含む混合物が、工程ｂ）にてｎ個のサンプルのうち３個を混合し、工程ｅ）にてｍ個のサンプルのうち３個を混合することで、同定かつ選択される、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｄ１）所望の機能的作用を有するｍ１個の混合物を選択し；
ｅ１）工程ｄ１）より選択されるｍ１個の混合物のうち２、３、４または５個を可能なすべてのコンビネーションにて混合し；
ｆ１）工程ｅ１）の混合物を、機能性パラメータを測定することのできる機能性アッセイに供し、機能的作用に起因する混合物を同定し；および
ｇ１）工程ｅ１）の混合物より、所望の機能的作用を有する第二の混合物を選択する
工程を含む、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ｈ）工程ｇ１）で得られた混合物から選択される２、３、４または５個を混合し；
ｉ）該混合物を機能性パラメータを測定することのできる機能性アッセイに供し、機能的作用に起因する混合物を同定し；および
ｊ）所望の機能的作用を有する第三の混合物を選択する
工程をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
化学的存在が工程ｅ１）にて混合されたいずれかの混合物にて一度だけ出現する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
化学的存在が工程ｈ）にて混合されたいずれかの混合物にて一度だけ出現する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
特定の化学的存在が機能的作用に起因するかどうかの同定が、該化学的存在を含む混合物の機能的作用を、該化学的存在を含まない１または複数の混合物の機能的作用と比較することでなされる、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
特定の化学的存在が機能的作用に起因するかどうかの同定が、該化学的存在および他の化学的存在を含む混合物の機能的作用を、該化学的存在を含むだけの混合物の機能的作用と比較することでなされる、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
特定の化学的存在が機能的作用に起因するかどうかの同定が、該化学的存在を含む混合物の機能的作用を、標準値と比較することでなされる、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
標準値が所定の値であり、化学的存在を含む混合物の同定された機能的作用が、化学的存在について機能的作用に起因するとの次元において、所定の値よりも高いか、等しいか、または低いかのいずれかでなければならず、あるいは標準値が、化学的存在を含む混合物の機能的作用の同定が、化学的存在について機能的作用に起因するとの次元になければならない範囲内の区間にあってもよい、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
機能的作用に起因する化学的存在の同定が、その機能的作用を有する混合物中で最も頻繁に現れる化学的存在を同定することでなされる、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ｎが３またはそれ以上の数、好ましくは３と１４４０の間、より好ましくは３と３６０の間、さらにより好ましくは３と１２０の間、さらにより好ましくは３と２４の間、特に好ましくは３と１２の間の数を有する整数である、請求項１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ｎが３またはそれ以上の数、好ましくは３と７２０の間、より好ましくは３と３６０の間、さらにより好ましくは３と１２０の間、さらにより好ましくは３と２４の間、特に好ましくは３と１２の間の数を有する整数である、請求項１ないし１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
試験されるべき化学的存在のいずれかに含まれる化合物が、抗体、抗生物質、抗癌剤、抗ＡＩＤＳ剤、抗成長因子、抗ウイルス剤、可溶性受容体、サイトカイン、ＲＮＡｉ、ワクチンおよびその混合物からなる群より選択される、請求項１ないし１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
試験されるべき化学的存在に含まれる化合物が２またはそれ以上の抗体のコンビネーションであるか；または少なくとも１の非抗体化合物とのコンビネーションの１または複数の抗体であり、例えば、非抗体化合物が、抗生物質、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗自己免疫疾患剤、およびＲＮＡｉからなる群より選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
試験されるべき化学的存在に含まれる化合物がモノクローナル抗体である、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
試験されるべき化学的存在に含まれる化合物が、ａ）１または複数のモノクローナル抗体、およびｂ）ａ）の１または複数の抗体とのコンビネーションにて所望の機能的作用を提供する少なくとも１の付加的な治療剤を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
測定されるべき機能性パラメータが、
物理的作用の発揮、リガンドとの結合、触媒活性の発揮、触媒活性に対する多感性、剤の生物膜を通過する改変された輸送の促進、剤の細胞内コンパートメントにおける改変された転位の促進、真核生物細胞の集団中の少なくとも１つの遺伝子の発現に対する影響、真核生物細胞の集団の成長または代謝作用に対する影響、標的細胞に対する影響、病原体に対する影響、二次免疫作用に対する影響、化合物の発現、製造または処方能に対する影響、および安定性に対する影響からなる群より選択される、請求項１ないし２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
試験されるべき混合物が機能性パラメータの測定能を有する２またはそれ以上の機能性アッセイに供され、各混合物の２またはそれ以上の機能性パラメータを独立して測定する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
機能性パラメータが、真核生物細胞の集団の成長または代謝作用に対する影響、標的細胞に対する影響、または標的細胞に対する化合物の影響である、請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
マルチウェルプレートにおいて、および／または自動ピペットを使用し、および／またはロボットを使用して行われる、請求項１ないし２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも２の化学的存在を含む混合物中で、化学的存在の間の最適な化学量論的割合を同定かつ選択する方法であって、該混合物が所望の機能的作用を示し、
ａａ）各々が一の化学的存在を混合物中にあるように含むｐ個のサンプルを準備し、
ｂｂ）該ｐ個のサンプルの各々をｑ倍に希釈し、ｐ個の一連のサンプルを得、その各々が同じ化学的存在を異なる濃度で含み、
ｃｃ）工程ａａ）およびｂｂ）にて得られた２またはそれ以上のサンプルを可能なすべてのコンビネーションで混合して、試験されるべき混合物を得、
ｄｄ）該混合物を機能的作用の測定能を有する機能性アッセイに供して、測定される機能的作用と混合物中の化学的存在の濃度との関係を同定し、および
ｅｅ）所望の機能的作用を有する混合物を選択する
ことを含む、方法。
【請求項２６】
サンプルが、工程ｂｂ）にて、２、５、１０、２０、５０または１００倍に希釈される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ｐが２またはそれ以上の整数であり、より好ましくは２と２４の間の、さらにより好ましくは２と１２の間の整数である、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
ｑが１、２、３、４または５の数値の整数である、請求項２５ないし２７のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５０４７７０（Ｐ２０１２−５０４７７０Ａ）
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３０３６６（Ｐ２０１１−５３０３６６）
【出願日】平成２１年１０月６日（２００９．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０２６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４０３５６
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０５２５７６８２）シムフォゲン・アクティーゼルスカブ (24)
【氏名又は名称原語表記】ＳＹＭＰＨＯＧＥＮ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月６日（２００９．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００９／０５０２６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４０３５６
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０５２５７６８２）シムフォゲン・アクティーゼルスカブ (24)
【氏名又は名称原語表記】ＳＹＭＰＨＯＧＥＮ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
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