サルアデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用
本発明は、血清陽性率が改善された新規のアデノウイルス株に関する。一態様では、本発明はヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質等のアデノウイルスカプシドタンパク質の単離ポリペプチド、及びその断片、並びにそれをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明による単離ポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明による単離ポリヌクレオチド又は単離ポリペプチドを含むアデノウイルス、並びに上記ベクター、アデノウイルス、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む医薬組成物も提供される。本発明は、疾患の療法又は予防法への単離ポリヌクレオチド、単離ポリペプチド、ベクター、アデノウイルス及び／又は医薬組成物の使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清陽性率が改善された新規のアデノウイルス株に関する。一態様では、本発明はヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質等のアデノウイルスカプシドタンパク質の単離ポリペプチド、並びにその断片、並びにそれをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明による単離ポリヌクレオチドを含むベクター、並びに本発明による単離ポリヌクレオチド又は単離ポリペプチドを含むアデノウイルス、並びに上記ベクター、アデノウイルス、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む医薬組成物も提供される。本発明は、疾患の療法又は予防法への単離ポリヌクレオチド、単離ポリペプチド、ベクター、アデノウイルス及び／又は医薬組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルス（Ａｄ）は、非エンベロープ正２０面体カプシド構造を有する、両生類、鳥類及び哺乳類に見られる二重鎖ＤＮＡウイルスの大きなファミリーを構成している（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスは宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、幾つかの哺乳動物種の多数の細胞型（分裂細胞及び非分裂細胞の両方を含む）に形質導入することができる。
【０００３】
概して、アデノウイルスＤＮＡは典型的には非常に安定であり、形質転換又は腫瘍形成が起こらない限り、エピソーム性（例えば染色体外性）であり続ける。加えて、アデノウイルスベクターは、臨床グレードの組成物の製薬規模の生産に容易に適用可能である、明確に定義された生産システムにおいて高収率で増殖させることができる。これらの特性及びよく特徴付けられたその分子遺伝学のために、組換えアデノウイルスベクターはワクチン担体としての使用に対する有力な候補である。組換えアデノウイルスベクターの生産は、機能しないように欠失させた又は改変したアデノウイルス遺伝子産物の機能を補完することが可能なパッケージング細胞株の使用に依存し得る。
【０００４】
現在、よく特徴付けられた２つのヒト亜群Ｃアデノウイルス血清型（すなわち、ｈＡｄ２及びｈＡｄ５）が、遺伝子療法に使用される大半のアデノウイルスベクターのウイルス骨格の供給源として広く使用されている。複製欠損ヒトアデノウイルスベクターも、様々な感染因子に由来する様々な免疫原の送達のためのワクチン担体として試験されている。実験動物（例えば齧歯類、イヌ及び非ヒト霊長類）において行われた研究から、免疫原及び他の抗原をコードする導入遺伝子を運搬する組換え複製欠損ヒトアデノウイルスベクターが、導入遺伝子産物に対する体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を引き起こすことが示される。概して、研究者らは、免疫応答を引き起こすことが予想される組換えアデノウイルスベクターを高用量で利用する免疫化プロトコルを用いるか、又は異なる血清型に由来するが、同じ導入遺伝子産物を運搬するアデノウイルスベクターの連続投与をブースト免疫化として採用する免疫化プロトコルを用いることにより、非ヒト実験系においてヒトアデノウイルスベクターをワクチン担体として使用することの成功を報告している（非特許文献５）。
【０００５】
ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ベースのウイルスベクターが、種々の遺伝子療法及びワクチン適用に対して開発されている。Ａｄ５ベースのベクターは動物モデルにおいては極めて効率的であるが、ヒトにおいてＡｄ５野生型ウイルスに対する既存の免疫が存在することが、遺伝子形質導入の効率を低下させることが臨床試験において実証されている。特に、Ａｄ５ベクターに基づくワクチン臨床試験に参加する被験体において、２００を超える中和抗体力価で、免疫化効率の明らかな低下が実証された。Ａｄ５ベクターワクチン（vectored vaccine）の最も広範な特性化は、Merckによって行われたＨＩＶワクチンのＳＴＥＰ試験において得られた（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Straus, Adenovirus infections in humans; The Adenoviruses, 451-498,1984
【非特許文献２】Hierholzer et al.,J. Infect. Dis., 158: 804-813, 1988
【非特許文献３】Schnurr and Dondero, Intervirology., 36:79-83, 1993
【非特許文献４】Jong et al., J. Clin. Microbiol., 37: 3940-3945: 1999
【非特許文献５】Mastrangeli, et.al., Human Gene Therapy, 7: 79-87 (1996)
【非特許文献６】Moore JP et al. Science. 2008 May 9; 320(5877): 753-5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このワクチン研究は、ＨＩＶ感染リスクの高い被験体における概念研究を証明するものとして、異なるＨＩＶ抗原を発現する３つのＡｄ５ベクターの同時注入に基づいていた。このデータによって驚くべきことに、予防効果ではなく、ワクチン接種した被験体（Ａｄ５に対する既存の免疫を有する）におけるＨＩＶ感染率の増加が明らかとなった。この矛盾した観察結果についての機構は未だ明らかではないが、この結果から、健常な被験体におけるワクチン適用に対して、ヒト起源のアデノウイルスをベースとするベクターの安全性及び効率に関するさらなる問題が提起された。種々のワクチン療法及び遺伝子療法においてこれまでに得られた全ての結果を総合すると、Ａｄ５ベクターを用いた試験等の臨床試験において、ヒトにおける既存の免疫が非常に低いか、又は存在しないことを特徴とするアデノウイルスの必要性が高まっている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本発明は、アデノウイルスファイバータンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、アデノウイルスヘキソンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドに関する：
（ａ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００１０】
本発明によりアデノウイルスペントンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドも提供される：
（ａ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００１１】
本発明はまた、上で概説した本発明による単離ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むポリヌクレオチドにも関する。本発明はさらに、本発明による単離ポリヌクレオチド、又はその機能的誘導体によってコードされる単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１３】
本発明による単離ポリヌクレオチド、及び／又は少なくとも１つの本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを含む組換えアデノウイルス、好ましくは複製不全アデノウイルスも提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、アジュバント及び以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つを含む組成物である：
（ｉ）１つ又は複数の本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；
（ｉｉ）本発明による単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明によるベクター；
（ｉｖ）本発明による組換えアデノウイルス；及び、
任意で、薬学的に許容可能な賦形剤。
【００１５】
本発明はさらに、以下のものの少なくとも１つを含む細胞に関する：
（ｉ）１つ又は複数の本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；
（ｉｉ）本発明によるの単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明によるベクター；
（ｉｖ）本発明による組換えアデノウイルス。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、疾患の療法又は予防法への、本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；本発明による単離ポリヌクレオチド；本発明によるベクター；本発明による組換えアデノウイルス；及び／又は本発明による組成物の使用に関する。
【００１７】
以下の図面は本発明の一例にすぎず、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定するとは決して解釈されるべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、本発明の様々なアデノウイルス分離株のヘキソンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。上記新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のヘキソンタンパク質が示される。超可変ドメイン１〜７が、それぞれ「ＨＶＲ１〜６」及び「ＨＶＲ７」として表される。
【図１−２】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、本発明の様々なアデノウイルス分離株のヘキソンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。上記新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のヘキソンタンパク質が示される。超可変ドメイン１〜７が、それぞれ「ＨＶＲ１〜６」及び「ＨＶＲ７」として表される。
【図１−３】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、本発明の様々なアデノウイルス分離株のヘキソンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。上記新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のヘキソンタンパク質が示される。超可変ドメイン１〜７が、それぞれ「ＨＶＲ１〜６」及び「ＨＶＲ７」として表される。
【図１−４】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、本発明の様々なアデノウイルス分離株のヘキソンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。上記新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のヘキソンタンパク質が示される。超可変ドメイン１〜７が、それぞれ「ＨＶＲ１〜６」及び「ＨＶＲ７」として表される。
【図２−１】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のファイバータンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図２−２】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のファイバータンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図２−３】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のファイバータンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図３−１】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のペントンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図３−２】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のペントンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図３−３】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のペントンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図４】野生型ウイルスゲノム及び対応するシャトルプラスミドとの相同組換えによる複製欠損アデノウイルスベクターの構成図である。実施例２も参照されたい。
【図５−１】ＨＩＶ ｇａｇタンパク質の発現のための発現カセット（配列番号１）を含む、組換えアデノウイルスをワクチン接種したマウスにおける細胞性免疫応答を示す図である。組換えヒトＡｄ５及びチンパンジーＣｈＡｄ５５のワクチン接種効力を比較した。免疫応答は、Ｂａｌｂ／ＣマウスにおいてマッピングされたＣＤ８ ＨＩＶ ｇａｇエピトープを有する細胞をインキュベートすることによる、インターフェロン−γ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって測定した。結果は、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞の数として報告した。
【図５−２】ＨＩＶ ｇａｇタンパク質の発現のための発現カセット（配列番号１）を含む、組換えアデノウイルスをワクチン接種したマウスにおける細胞性免疫応答を示す図である。組換えヒトＡｄ５並びにボノボＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３アデノウイルスのワクチン接種効力を比較した。免疫応答は、Ｂａｌｂ／ＣマウスにおいてマッピングされたＣＤ８ ＨＩＶ ｇａｇエピトープを有する細胞をインキュベートすることによる、インターフェロン−γ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって測定した。結果は、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞の数として報告した。
【図６】ヨーロッパ人起源のヒト血清のパネルに対し、新規のアデノウイルスベクターの血清陽性率を評価した結果を示す図である。ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）及びチンパンジーアデノウイルスＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３及びＣＶ−６８の血清陽性率を、同じパネルに対し並行して評価した。データは免疫発生（immunoprevalence）を示す被験体の％として表す。中和抗体はＡｄ５及びＣＶ−６８アデノウイルスについてのみ検出され、本発明の新規のアデノウイルスのいずれについても検出されなかった。
【図７−１】ＢＡＬＢ／ｃマウスのＰａｎＡｄ ＨＳＶ免疫化を示す図である。
【図７−２】ＢＡＬＢ／ｃマウスのＰａｎＡｄ癌Ａｇ免疫化を示す図である。
【図８】プライミング／ブーストワクチン接種実験における、カニクイザル（Macaca fascicularis）のＰａｎＡｄ ＨＩＶ ｇａｇ免疫化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明を下記で詳細に説明する前に、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコル及び試薬は変わることがあるため、本発明がこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書中で使用される専門用語が、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。特に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２０】
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel,Switzerland)に記載されるように、"Pharmaceutical Substances:Syntheses, Patents, Applications" Axel Kleemannand Jurgen Engelによる, Thieme Medical Publishing, 1999、"MerckIndex: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals",Susan Budavari et al.編, CRCPress, 1996、及びUnited States Pharmacopeia-25/NationalFormulary-20, the United States PharmcopeialConvention, Inc., Rockville Md.により出版, 2001に記載されるように定義される。
【００２１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という語、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等の変化形は、記載の特徴、整数若しくは工程、又は特徴、整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の特徴、整数若しくは工程、又は特徴、整数若しくは工程の群を排除することを意味しないことが理解されよう。以下の節では、本発明の種々の態様がより詳細に定義される。そのように定義される各々の態様は、そうではないことが明らかに示されない限り、任意の他の態様（単数又は複数）と組み合わせてもよい。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴を、好ましい又は有利であると示される任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合わせてもよい。
【００２２】
幾つかの文献が本明細書の本文全体を通して引用される。上記又は下記を問わず本明細書中に引用される各々の文献（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、取扱説明書等を含む）は、その全体が参照により本明細書中に援用される。本明細書中の記載のいずれも、本発明が先行発明に基づいてかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。
【００２３】
以下で、本明細書中で頻繁に使用される用語の定義を幾つか提示する。これらの用語は、その使用の各々の例において、本明細書の残りの部分で、それぞれ定義される意味及び好ましい意味を有するものとする。
【００２４】
概して、アデノウイルスゲノムはよく特徴付けられている。同様に位置した特異的オープンリーディングフレーム、例えば各々のウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子の位置に関して、アデノウイルスゲノムの全体構成の全体的保存が見られる。アデノウイルスゲノムの各々の末端（extremity）は、ウイルス複製に必要とされる逆方向末端反復（ＩＴＲ）として知られる配列を含む。ウイルスは、感染性ビリオンを産生するのに必要とされる一部の構造タンパク質のプロセシングに必要とされるウイルスコードプロテアーゼも含んでいる。アデノウイルスゲノムの構造は、宿主細胞への形質導入に続いてウイルス遺伝子が発現される順序に基づいて記載される。より具体的には、ウイルス遺伝子は、転写がＤＮＡ複製の開始の前に起こるか、又は後に起こるかに応じて初期（Ｅ）遺伝子又は後期（Ｌ）遺伝子と称される。形質導入の初期段階では、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４遺伝子がウイルス複製に向けた宿主細胞の準備をするために発現される。感染の後期においては、ウイルス粒子の構造成分をコードする後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５の発現が活性化される。
【００２５】
以下の表１は、本明細書中で言及される配列の概要を提示するものである：
【００２６】
【表１】
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「単離（isolated）」分子という用語は、それが天然に関連する他の分子を実質的に含まない分子を指す。単離した分子はしたがって、天然で、すなわち実験的状況の外部で生きている動物においてそれが接近又は接触し得る他の分子を含まない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「ペプチド（peptides）」及び「ポリペプチド（polypeptides）」という用語は、全体を通して区別なく使用される。これらの用語は天然ペプチド、例えば天然タンパク質、及び天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を含み得る合成ペプチドの両方を指す。ペプチドは、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸の側鎖又は遊離アミノ末端若しくはカルボキシ末端を修飾することによって化学修飾されていてもよい。この化学修飾には、さらなる化学的部分の付加及びアミノ酸の側鎖中の官能基の修飾（グリコシル化等）が含まれる。ペプチドは、好ましくは少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は少なくとも１００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも８個又は少なくとも３０個のアミノ酸を有する重合体である。本明細書中で開示されるポリペプチド及びタンパク質はアデノウイルスに由来するため、本明細書中で使用される単離ポリペプチド又は単離タンパク質の分子量は２００ｋＤａを超えないことが好ましい。
【００２９】
「ベクター」という用語は、本明細書中で使用される場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（例えば、従来技術、例えば国際公開第２００５／０７１０９３号から知られる非複製Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ２６、Ａｄ３５、Ａｄ４９、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２ベクター又は複製可能Ａｄ４及びＡｄ７ベクター）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えばＡＡＶ５型）、αウイルスベクター（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）及びＶＥＥ−ＳＩＮキメラ）、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えばワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ＮＹＶＡＣ（ワクシニアウイルスコペンハーゲン株に由来する）、並びにアビポックスウイルスベクター：カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ）ベクター及び鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）ベクター）及び水疱性口内炎ウイルスベクター等のウイルスベクター、ウイルス様粒子又は細菌胞子を含む当業者に既知の任意のベクターを含む。ベクターには、発現ベクター、クローニングベクター、及び宿主細胞において組換えアデノウイルスを生成するのに有用なベクターも含まれる。
【００３０】
「発現カセット」という用語は、その転写調節配列及び翻訳調節配列と共に発現される少なくとも１つの核酸配列を含む核酸分子を指す。発現カセットを変更することによって、それが組み込まれるベクターに別の配列又は配列の組み合わせの発現を指示させる。制限部位（５’末端及び３’末端に存在するように改変することが好ましい）のために、カセットは容易に挿入、除去するか、又は別のカセットと置き換えることができる。好ましくは、発現カセットは、下記でさらに記載されるプロモーター、開始部位及び／又はポリアデニル化部位等の所与の遺伝子の効率的な発現のためのｃｉｓ調節要素を含む。
【００３１】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方、すなわち、抗原又はハプテンに結合することが可能な任意の免疫グロブリンタンパク質又はその一部分を指す。抗原結合部分は組換えＤＮＡ技法、又は無傷抗体の酵素的切断若しくは化学的切断によって作製することができる。幾つかの実施形態では、抗原結合部分はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）変異体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体（diabodies）、及びポリペプチドに特異的抗原結合をもたらすのに十分な抗体の少なくとも一部分を含有するポリペプチドを含む。
【００３２】
本発明の文脈内で哺乳動物において免疫応答を誘発する／発生させるための免疫原／抗原の投与は「プライミング」と称され、哺乳動物において上記免疫原／抗原に対する免疫応答を増強するための免疫原／抗原、例えば特定の病原体（ビリオン又はウイルス病原体、病原性細菌の抗原又は腫瘍抗原等）の投与は「ブースト」と称される。「異種プライム−ブースト」という表現は、哺乳動物において免疫応答を誘発する／発生させる（プライミング）ためのベクターと、哺乳動物において免疫応答を増強する（ブースト）ためのベクターとが異なることを意味する。「異種プライム−ブースト」は被験体、例えば患者が第１のベクターに対する抗体を既に生じており、ブーストが必要とされる場合に有用である。したがって、異種プライム−ブーストの好ましい実施形態では、例えばワクチン接種及び／又は遺伝子療法のために２つの異なるアデノウイルスが使用され得る。この文脈においては、第１のアデノウイルスによるプライミングにおいて誘発される抗体応答によって、ブーストのために投与される第２のアデノウイルス粒子の７０％超、又は好ましくは８０％超が、プライミング及びブーストを受けた動物の細胞の核内に侵入することが妨げられない場合、第１及び第２のアデノウイルスは十分に異なるとされる。
【００３３】
「複製可能」組換えアデノウイルス（ＡｄＶ）という用語は、細胞中に含まれる任意の組換えヘルパータンパク質の非存在下で、宿主細胞において複製することのできるアデノウイルスを指す。好ましくは、「複製可能」アデノウイルスは、以下の無傷の又は機能的に必須の（functional essential）初期遺伝子を含む：Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４。特定の動物から単離した野生型アデノウイルスは、その動物において複製可能である。
【００３４】
「複製欠損」組換えＡｄＶという用語は、少なくとも機能的欠失、すなわち遺伝子を完全に除去することなくその遺伝子の機能を損なう欠失、例えば人工停止コドンの導入、活性部位若しくは相互作用ドメインの欠失若しくは突然変異、遺伝子の調節配列の突然変異若しくは欠失等、又はウイルス複製に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４から選択されるアデノウイルス遺伝子の１つ又は複数等）の完全除去を含むように改変されたために複製不能となったアデノウイルスを指す。本発明の組換えチンパンジーアデノウイルスベクターは好ましくは複製欠損である。
【００３５】
「同一性」又は「同一な」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質の配列との関連では、最大一致でアラインメントした場合に２つの配列中の残基数が同一であることを指す。具体的には、２つの配列の配列同一度（percent sequence identity）は、核酸配列であるか又はアミノ酸配列であるかを問わず、アラインメントした２つの配列間の完全な一致の数を短い方の配列の長さで除し、１００を乗じたものである。２つの配列をアラインメントするために使用することのできるアラインメントツールは当業者に既知であり、例えばワールドワイドウェブ、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）上で得ることができる。２つの配列間のアラインメントは標準的な設定、ＡｌｉｇｎについてはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、好ましくはＭａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を用いて実行することができる。満足のいくアラインメントを得るには、いずれかの配列にギャップを挿入する必要があり得ることが、当業者には理解される。２つのポリペプチド間の「最良の配列アラインメント」は、最大数のアラインメントした同一残基をもたらすアラインメントとして定義される。
【００３６】
アデノウイルス
アデノウイルス（Ａｄ）は、幾つかの鳥類及び哺乳類の宿主において同定された非エンベロープ正２０面体ウイルスである。ヒトアデノウイルス（ｈＡｄ）は、既知の全てのヒトＡｄ及び動物（例えばウシ、ブタ、イヌ、マウス、ウマ、サル及びヒツジ）起源の多くのＡｄを含むマストアデノウイルス属に属する。ヒトアデノウイルスは概して、ラット赤血球及びアカゲザル赤血球の血球凝集特性、ＤＮＡ相同性、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含有率並びに発癌性を含む多数の生物学的、化学的、免疫学的及び構造的基準に基づいて、６つの亜群（Ａ〜Ｆ）に分けられる（Straus, 1984, The Adenoviruses中, ed. H.Ginsberg, pps. 451-498, New York: PlenusPress、及びHorwitz, 1990; Virology中, eds. B. N. Fields and D.M. Knipe, pps. 1679-1721）。
【００３７】
アデノウイルスビリオンは正２０面体対称性を有し、その直径は血清型に応じて６０ｎｍ〜９０ｎｍである。正２０面体カプシドは、ヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ＩＩＩ）及び突出した（knobbed）ファイバー（ＩＶ）タンパク質という３つの主要タンパク質から構成される（W.C. Russel, J. Gen.Virol.,81: 2573-2604 (2000)）。ヒトにおいて観察される既存の免疫の一態様は体液性免疫であり、アデノウイルスタンパク質に特異的な抗体の産生及び存続をもたらし得る。アデノウイルスによって引き起こされる体液性応答は、主に３つの主要構造タンパク質：ヘキソン、ペントン及びファイバーに向けられる。
【００３８】
これまでに５１個の異なるヒトアデノウイルス血清型が認識され、それらの血球凝集特性、並びに生物物理学的及び生化学的基準に基づいて亜群に分類されている。公表された報告によって、複数の血清型に対する抗体を含む力価が一般的であり（Dambrosio, E.(1982) J. Hyg. (London) 89: 209-219）、力価の大部分が中和活性を有することが確立されている。
【００３９】
先述のように、組換えアデノウイルスは遺伝子療法において、また、ワクチンとして有用である。チンパンジーアデノウイルスベースのウイルスベクターは、遺伝子ワクチンの開発のためのヒト由来Ａｄベクターの使用に代わるものである（Farina SF, J Virol. 2001 Dec; 75(23): 11603-13.、Fattori E, Gene Ther. 2006 Jul; 13(14): 1088-96）。チンパンジーから単離したアデノウイルスは、ヒト起源の細胞におけるそれらの効率的な増殖によって実証されるように、ヒトから単離したアデノウイルスと近縁関係にある。しかしながら、ヒト及びチンパンジーのアデノウイルスは近縁であるために、この２つのウイルス種間の血清学的交差反応性が予想され得る。
【００４０】
この仮説はチンパンジーアデノウイルスを単離し、特性化することで確認された。それでもなお、チンパンジーに由来するアデノウイルス分離株は、共通するヒトアデノウイルスエピトープの血清型との交差反応性の低減を示した。したがって、チンパンジーアデノウイルス（本明細書中でナミチンパンジー（common chimpanzee）アデノウイルスについては「ＣｈＡｄ」、ボノボチンパンジーアデノウイルスについては「ＰａｎＡｄ」とも略記される）は、共通するヒトアデノウイルスの血清型に対するヒトの既存の免疫に関連した有害作用を低減することの基礎をもたらす。しかしながら、これまでに単離されたチンパンジーアデノウイルスに対して、低度から中程度の中和力価がヒト血清サブセットにおいて検出され、したがってチンパンジーアデノウイルスの既知の全ての血清型は、依存としてヒト血清によって或る程度中和される。
【００４１】
本発明は、新規のチンパンジーアデノウイルス株、すなわちナミチンパンジー（Pan troglodytes）から単離されるＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、並びにボノボ（Pan paniscus）から単離されるＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３を単離することができたという予想外の発見を含む。これら新規の株は全て、ヒトにおいて測定可能な血清陽性率を示さない。すなわち、これらのアデノウイルス株は、試験した全てのヒト血清が中和抗体の存在について完全に陰性であったという点で、これまでに記載されたチンパンジーアデノウイルスの中で例外的なものである。この文脈で中和抗体とは、アデノウイルスのエピトープに結合し、それが宿主細胞において増殖感染を生じるのを防ぐか、又は形質導入遺伝子を発現する複製欠損ベクターによる標的細胞への形質導入を防ぐ（例えば、アデノウイルスＤＮＡは宿主細胞に侵入することが可能である）抗体を指す。従来技術の全てのチンパンジー由来アデノウイルスについて中和抗体が観察されたが、新規のアデノウイルス型ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３は、ヒトにおいてこれらのアデノウイルス型に対する既存の中和抗体が完全に存在しないことを特徴とする。したがって、これらのアデノウイルスによって、例えば免疫化及び／又は遺伝子療法に使用することのできる有益な医学的ツールが提供される。
【００４２】
下記でさらに詳述するように、本発明は一態様において、最も表面露出したアデノウイルスエピトープを示すアデノウイルスカプシドタンパク質、すなわちヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質の新規の配列を提供する。既に述べたように、本発明によるウイルスに特異的な中和抗体はヒト血清中に含まれない。したがって、上述した新規のチンパンジーヘキソン、ペントン及びファイバータンパク質配列の利点の１つは、これらのタンパク質の配列を、例えば医療目的で改変された従来技術のアデノウイルスを増強するために使用することができるということである。例えば、本発明のカプシドタンパク質又はその機能的断片は、例えば主要構造カプシドタンパク質又はその機能的断片の１つ又は複数を、それぞれ異なるアデノウイルス、例えば従来技術のアデノウイルスのものに置き換え／置換して、ヒトにおける血清陽性率が低減した、改良された組換えアデノウイルスを得るために使用することができる。本発明の新規のアデノウイルスは（記載のように再設計したアデノウイルスも）、投与した場合にヒトにおいて有意な抑制性免疫応答を生じることがなく、それらの全体的な導入効率及び感染性は増強される。そのため、このように改良されたアデノウイルスは、宿主細胞への侵入及び抗原カセットの発現が中和抗体の任意の有意な力価によって妨げられないため、例えばより効果的なワクチンであることが予想される。加えて、実施例において示されるように、ＨＩＶ ｇａｇに対する強力な免疫応答がＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３分離株のヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質を含む組換えＨＩＶ−ｇａｇコードアデノウイルスをワクチン接種した未処置（naive）マウスにおいても引き起こされた。ＣｈＡｄ５５−ｇａｇ、ＣｈＡｄ７３−ｇａｇ、ＣｈＡｄ８３−ｇａｇ、ＣｈＡｄ１４６−ｇａｇ、ＣｈＡｄ１４７−ｇａｇ、ＰａｎＡｄ１−ｇａｇ、ＰａｎＡｄ２−ｇａｇ及びＰａｎＡｄ３−ｇａｇアデノウイルスによって引き起こされた免疫応答は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質を発現する従来技術の組換えヒトＡｄ５ベクターをベースとしてこれまでに開発された最も強力なベクターを用いて観察された応答に匹敵する（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ中のＥＬＩｓｐｏｔアッセイのデータを参照されたい）。
【００４３】
先に述べたように、アデノウイルスによって引き起こされる体液性応答は、主に３つの主要アデノウイルス構造タンパク質：ヘキソン、ペントン及びファイバー（これらは全てアデノウイルスカプシドの一部であり、ウイルス粒子の外部に露出したポリペプチド配列を含む）に向けられる（Madisch I, et al.,J. Virol. 2005 Dec; 79(24): 15265-76、及びMadisch I, et al.,J Virol. 2007 Aug; 81(15): 8270-81、及びPichla-Gollon SL,et al., J. Virol. 2007 Feb; 81(4): 1680-9も参照されたい）。
【００４４】
図１に示した多重配列アラインメントにおいて示されるように、本発明のＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７群の新規のアデノウイルス分離株は、非常によく似たヘキソンタンパク質配列を有する。このアラインメントにおいては、ビリオンの外側に位置し、その表面の大部分を覆うヘキソン分子の最上部にあるループ中に生じる超可変領域（ＨＶＲ）も標識される（Jophn J. Rux et. Al, J. of Virology, Sept 2003, vol. 77, no.17を参照されたい）。新規のチンパンジーアデノウイルスのさらなるカプシドタンパク質ファイバー及びペントンの配列関連性が、それぞれ図２及び図３中に提示される。３つ全ての構造カプシドタンパク質が低い血清陽性率に寄与することが予想され、したがってアデノウイルスと既存の中和抗体との親和性を抑制するため、例えば血清陽性率の低減した組換えキメラアデノウイルスを製造するために相互に独立して、又は組み合わせて使用することができる。
【００４５】
それゆえ、第１の態様では、本発明は、アデノウイルスファイバータンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれか、すなわち、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号５０、又は配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれか、すなわち、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号５０、又は配列番号５３に記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれか、すなわち、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号５０、又は配列番号５３のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００４６】
「アデノウイルスファイバータンパク質」とは、アデノウイルス中に含まれる突出したファイバー（ＩＶ）タンパク質を意味する。好ましい実施形態では、本発明の第１の態様及び下記に記載されるその好ましい実施形態に含まれる単離ポリヌクレオチドは、ファイバータンパク質、又は感染性アデノウイルスビリオンにおいてファイバータンパク質若しくはその断片と同じ機能を有するその機能的誘導体をコードする。したがって、上記ファイバー又は機能的ファイバー誘導体を好ましくはカプシドタンパク質として含む組換えアデノウイルスは、宿主細胞に侵入することが可能である。組換えアデノウイルスが宿主細胞に侵入することができるか否かは、容易に決定することができる。例えば、宿主細胞をアデノウイルスと接触させた後、組換え宿主細胞を洗浄して溶解し、例えばアデノウイルスＲＮＡ及び／又はＤＮＡに特異的な適切なハイブリダイゼーションプローブを用いて、アデノウイルスＲＮＡ及び／又はＤＮＡが宿主細胞中に見られるか否かを決定することができる。代替的又は付加的には、宿主細胞を組換えアデノウイルスと接触させた後、洗浄して溶解し、例えばウエスタンブロットを用いてアデノウイルス特異的抗体によって調べてもよい。さらに別の代替形態では、例えばｉｎ ｖｉｖｏで、宿主細胞において遺伝子産物を発現するのに好適な発現カセットを含む組換えアデノウイルスを感染させた際に、宿主細胞が遺伝子産物、例えば蛍光タンパク質を発現するか否かを観察する。
【００４７】
ファイバータンパク質及びその機能的誘導体が、アデノウイルスペントンタンパク質（配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び／又は配列番号５５等）に対して親和性を有することがさらに好ましい。タンパク質間親和性を試験する方法は当業者には十分理解される。第１のタンパク質が第２のタンパク質（チンパンジー由来アデノウイルスのペントンタンパク質等）に結合することが可能であるか否かを決定するためには、例えば遺伝学的な酵母ツーハイブリッド法、又はプルダウン法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイ若しくはプラズモン共鳴アッセイ等の生化学的アッセイを使用することができる。プルダウン法又はプラズモン共鳴アッセイを用いる場合、生化学の技術分野でよく知られているように、タンパク質の少なくとも１つをＨＩＳタグ、ＧＳＴタグ等のアフィニティータグと融合させることが有用である。そのグリコシル化形態のアデノウイルスファイバータンパク質は、さらに三量化することが可能である。したがって、本発明の第１の態様によるポリヌクレオチドによってコードされるファイバータンパク質又はその断片が、グリコシル化する及び／又は三量体を形成することが可能であることも好ましい。
【００４８】
本願全体を通して使用される場合、タンパク質又はポリペプチドの「機能的誘導体」という表現は概して、修飾型のタンパク質又はポリペプチド（例えばタンパク質又はポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸が欠失、挿入、修飾及び／又は置換され得る）を指す。誘導体は、上記でも言及したように、そのカプシド中にこの誘導体を含むキメラアデノウイルスが宿主細胞に感染することが可能な場合、機能的である。さらに、「機能的誘導体」との関連では、挿入とは元のポリペプチド又はタンパク質への１つ又は複数のアミノ酸の挿入を指す。機能的誘導体が１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個又は１００個を超えるアミノ酸変化（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸）を含まないことが好ましい。別の実施形態では、タンパク質又はポリペプチドの全アミノ酸の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％又は２０％以下（最も好ましくは５％以下）しか変化しない（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸である）ことが好ましい。タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸は、修飾、例えば化学修飾されていてもよい。例えば、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸の側鎖又は遊離アミノ末端若しくはカルボキシ末端は、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化等によって修飾されていてもよい。当該技術分野でよく知られているように、化学修飾をｉｎ ｖｉｖｏ、例えば宿主細胞中で行ってもよい。例えば、タンパク質のアミノ酸配列中に存在する好適な化学修飾モチーフ、例えばグリコシル化配列モチーフによってタンパク質をグリコシル化する。誘導体における置換は保存的置換であっても又は非保存的置換であってもよいが、保存的置換が好ましい。幾つかの実施形態では、天然アミノ酸と非天然アミノ酸との交換も置換に含まれる。保存的置換には、アミノ酸を置換されるアミノ酸によく似た化学的性質を有する別のアミノ酸に置換することが含まれる。好ましくは、保存的置換は以下のものからなる群から選択される置換である：
（ｉ）別の異なる塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換；
（ｉｉ）別の異なる酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換；
（ｉｉｉ）別の異なる芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換；
（ｉｖ）別の異なる非極性脂肪族アミノ酸による非極性脂肪族アミノ酸の置換；及び
（ｖ）別の異なる極性非荷電アミノ酸による極性非荷電アミノ酸の置換。
【００４９】
塩基性アミノ酸は好ましくはアルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群から選択される。酸性アミノ酸は好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸である。芳香族アミノ酸は好ましくはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン及びイソロイシンからなる群から選択される。極性非荷電アミノ酸は好ましくはセリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択される。保存的アミノ酸置換に対して、非保存的アミノ酸置換は、上記で概説される保存的置換（ｉ）〜（ｖ）に該当しない或るアミノ酸と任意のアミノ酸との交換である。
【００５０】
機能的誘導体が欠失を含む場合には、誘導体において、参照ポリペプチド又はタンパク質配列中に存在する１つ又は幾つかのアミノ酸が除去されている。しかしながら、欠失は、誘導体が含むアミノ酸が全体で２００個未満になるほど広範囲ではない。
【００５１】
配列同一性を決定する手段は既に上記に記載している。加えて、２つの配列間の同一度は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877の数学アルゴリズムを用いることによっても決定することができる。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のＢＬＡＳＴＮプログラム及びＢＬＡＳＴＰプログラムにも組み込まれている。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを利用する場合、これらのプログラムのデフォルトのパラメータを使用することが好ましい。
【００５２】
先に述べたように、アデノウイルスヘキソンタンパク質の超可変ドメインはアデノウイルスの外部に露出している。そのため中和抗体は、アデノウイルスカプシドのこれらの領域を認識し、結合することができる。したがって、本発明の新規のアデノウイルス分離株の１つに由来するヘキソンタンパク質を含むカプシドを有するアデノウイルスは、ヒトにおける血清陽性率が改善されている、すなわちより低くなっている。それゆえ、第２の態様では、本発明は、アデノウイルスヘキソンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれか、すなわち、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５１、又は配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれか、すなわち、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５１、又は配列番号５４に記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれか、すなわち、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５１、又は配列番号５４のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９．９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明の第２の態様及び下記に記載されるその好ましい実施形態に含まれる単離ポリヌクレオチドは、ヘキソンタンパク質、又は感染性アデノウイルスビリオンにおいてヘキソンタンパク質若しくはその断片と同じ機能を有するその機能的誘導体をコードする。したがって、上記ヘキソン又は機能的ヘキソンー誘導体を好ましくはカプシドタンパク質として含む組換えアデノウイルスは、宿主細胞に侵入することが可能である。ヘキソンタンパク質の機能的誘導体を生成するのに好適な方法の１つが、米国特許第５，９２２，３１５号（参照により援用される）に記載されている。この方法では、アデノウイルスヘキソンの少なくとも１つのループ領域を、別のアデノウイルス血清型の少なくとも１つのループ領域に変更する。例えば、本発明のヘキソンタンパク質のループ領域を用いて、従来技術のアデノウイルスの対応するヘキソンループを置換して、改良されたハイブリッドアデノウイルスを生成することができる。同様に（Analogously）、本発明のペントンタンパク質及びファイバータンパク質の誘導体も生成することができる。
【００５４】
第３の態様では、本発明は、アデノウイルスペントンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれか、すなわち、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５２、又は配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれか、すなわち、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５２、又は配列番号５５に記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれか、すなわち、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５２、又は配列番号５５のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００５５】
ペントンタンパク質及びその機能的誘導体が、アデノウイルスファイバータンパク質（配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び／又は配列番号５３等）に対する親和性を有することが好ましい。上記に記載されるように、タンパク質間親和性を試験する方法は当業者には十分理解される。「アデノウイルスペントンタンパク質」とは、アデノウイルス中に含まれるペントンベース（ＩＩＩ）タンパク質を意味する。アデノウイルスペントンタンパク質は、正２０面体対称のカプシドの角に局在することを特徴とする。先述のように、本発明の第１、第２及び／又は第３の態様並びに本明細書中で下記に記載されるその好ましい実施形態のポリヌクレオチドの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは１つ又は複数のポリペプチドをコードし、上記１つ又は複数のポリペプチドを好ましくはカプシドタンパク質（複数可）として含む組換えアデノウイルスは、宿主細胞に感染する、すなわち侵入することが可能である。
【００５６】
以下で、本発明の第１、第２及び第３の態様の好ましい実施形態を、本明細書中で開示される新規のチンパンジーアデノウイルス分離株の各々について明記する。
【００５７】
アデノウイルスＣｈＡｄ５５
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００５８】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００５９】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９．９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６０】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えばＡｄ５ゲノムを参照として用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００６１】
アデノウイルスＣｈＡｄ７３
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％若しくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６２】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６３】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６４】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えばＡｄ５ゲノムを参照として用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００６５】
アデノウイルスＣｈＡｄ８３
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【００６６】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６７】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６８】
最も好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６５からなる配列、又は配列番号６５からなるが、配列番号６５のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４のいずれかを欠いている、最も好ましくは配列番号６５のゲノム領域Ｅ１、Ｅ３及びＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一な、最も好ましくは少なくとも９９％又は１００％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。
【００６９】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えば配列番号６５に示されるＣｈＡｄ８３ゲノムを用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００７０】
アデノウイルスＣｈＡｄ１４６
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
【００７１】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７２】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７３】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えばＡｄ５ゲノムを参照として用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００７４】
アデノウイルスＣｈＡｄ１４７
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７５】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７６】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくと９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７７】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えばＡｄ５ゲノムを参照として用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００７８】
アデノウイルスＰａｎＡｄ１
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７９】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８０】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８１】
最も好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１３からなる配列、又は配列番号１３からなるが、配列番号１３のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４のいずれかを欠いている、最も好ましくは配列番号１３のゲノム領域Ｅ１、Ｅ３及びＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一な、最も好ましくは少なくとも９９％又は１００％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。
【００８２】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えば配列番号１３に示されるＰａｎＡｄ１ゲノムを用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００８３】
アデノウイルスＰａｎＡｄ２
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８４】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８５】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８６】
最も好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６２からなる配列、又は配列番号６２からなるが、配列番号６２のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４のいずれかを欠いている、最も好ましくは配列番号６２のゲノム領域Ｅ１、Ｅ３及びＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一な、最も好ましくは少なくとも９９％又は１００％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。
【００８７】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えば配列番号６２に示されるＰａｎＡｄ１ゲノムを用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００８８】
アデノウイルスＰａｎＡｄ３
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８９】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００９０】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。
【００９１】
最も好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６３からなる配列、又は配列番号６３からなるが、配列番号６３のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４のいずれかを欠いている、最も好ましくは配列番号６３のゲノム領域Ｅ１、Ｅ３及びＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一な、最も好ましくは少なくとも９９％又は１００％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。
【００９２】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えば配列番号６３に示されるＰａｎＡｄ１ゲノムを用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００９３】
組換えアデノウイルスでは、本発明の第１、第２及び第３の態様、及び本明細書中に開示されるそれぞれの好ましい実施形態によるファイバータンパク質、ヘキソンタンパク質及びペントンタンパク質は各々、個々に上記組換えアデノウイルスと、ヒト及び／又は齧歯類の中和抗体との相互作用の低減に寄与する。したがって、上記本発明のファイバータンパク質、ヘキソンタンパク質及び／又はペントンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、増強された組換えアデノウイルスを構築するのに有用である。したがって、さらなる第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様、本発明の第２の態様及び本発明の第３の態様によるポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの群から選択される、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは３つの単離ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。したがって、最も好ましくは第４の態様は、本発明の第１、第２及び第３の態様を含む単離ポリヌクレオチドである。好ましい実施形態では、本発明の第４の態様によるポリヌクレオチドは：
（ｉ）本発明の第１、第２又は第３の態様による１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（ｉｉ）本発明の第１の態様によるポリヌクレオチド及び本発明の第２の態様によるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明の第１の態様によるポリヌクレオチド及び本発明の第３の態様によるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（ｉｖ）本発明の第２の態様によるポリヌクレオチド及び本発明の第３の態様によるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；並びに
（ｖ）本発明の第１、第２及び第３の態様によるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドであり、
（ｉ）〜（ｖ）によるポリヌクレオチド中に含まれる上記ポリヌクレオチドが、同じアデノウイルス分離株から選択される、例えばファイバータンパク質、ヘキソンタンパク質及びペントンタンパク質又はその機能的誘導体をそれぞれコードする３つ全てのポリヌクレオチドが、以下のアデノウイルスのうち１つのみに由来することが好ましい：ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３。さらに、本発明の第４の態様又はその好ましい実施形態において、例えば上記に概説されるように、各々の「機能的誘導体」が、１０個、５個又は３個を超えるアミノ酸変化（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸）を含まないことが好ましい。
【００９４】
下記表２では、上記で概説される本発明の第４の態様のポリヌクレオチドの多数の特に好ましい実施形態を挙げている。表２中に示されるポリヌクレオチドＡ１〜ＡＦ１から選択されるポリヌクレオチドが好ましく、この場合、ポリヌクレオチドは本発明の第１、第２及び第３の態様の代替形態（ｃ）による３つのポリヌクレオチドを含み、その各々がアデノウイルスファイバー、ヘキソン及びペントンタンパク質又はその機能的誘導体をそれぞれコードする。下記表２に、上記３つのコードされるタンパク質の各々が、その全長にわたって、同様に表２中に示される配列番号に記載のアミノ酸配列に対して有する必要のある最小配列同一性（すなわち、少なくとも表示の配列同一性）を示す：
【００９５】
【表２】
【００９６】
例えば、上記表１中に示されるような好ましいポリヌクレオチドＡ１は以下のものを含む：
（ｉ）配列番号１４と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号２０と、その全長にわたって少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）配列番号２６と、その全長にわたって少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００９７】
上記で言及したように、表２に挙げられるポリヌクレオチドの上記「機能的誘導体」が、１０個を超えるアミノ酸変化（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸）を含まないことが最も好ましい。
【００９８】
下記表３には、本発明の第４の態様のポリヌクレオチドのさらに好ましい実施形態を挙げている。表３から選択されるポリヌクレオチドＡ２〜Ｊ２から選択されるポリヌクレオチドが好ましく、この場合、ポリヌクレオチドは「ポリヌクレオチド１」、「ポリヌクレオチド２」及び「ポリヌクレオチド３」と表される３つのポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは各々、その全長にわたって、表３中に示される配列番号に記載の対応するポリヌクレオチドに対して少なくとも表示の配列同一性を有する：
【００９９】
【表３】
【０１００】
したがって、例としては、上記表３の好ましい実施形態Ａ２（「Ａ２−ＣｈＡｄ５５」）は以下のものを含むポリヌクレオチドである：
（ｉ）配列番号３２と、その全長にわたって少なくとも９８％同一なポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号３８と、その全長にわたって少なくとも９８％同一なポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）配列番号４４と、その全長にわたって少なくとも９８％同一なポリヌクレオチド。
【０１０１】
下記表４には、上記で概説される本発明の第４の態様のポリヌクレオチドの多数のさらなる特に好ましい実施形態を挙げている。表４中に示されるポリヌクレオチドＡ３〜Ｈ３から選択されるポリヌクレオチドが好ましく、この場合、ポリヌクレオチドは表示の配列番号に記載のアデノウイルスファイバー、ヘキソン及びペントンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、３つ全てのタンパク質及び／又はコードされる機能的誘導体は合計して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個以下、又は１００個を超える、好ましくは２０個以下の欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含む：
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
本発明の第４の態様のポリヌクレオチドの別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表４中に示されるそれぞれの配列番号に記載の同じ株のアデノウイルスファイバー及びヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードする。本発明の第４の態様のポリヌクレオチドのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、表４中に示されるそれぞれの配列番号に記載の同じ株のアデノウイルスファイバー及びペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードする。本発明の第４の態様のポリヌクレオチドのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、表４中に示されるそれぞれの配列番号に記載の同じ株のアデノウイルスヘキソン及びペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードする。この文脈では、上記機能的誘導体は各々の場合において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個未満、最も好ましくは３個未満の欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含む。
【０１０４】
本発明の第４の態様のさらに好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つからなる配列、又は（ｉｉ）ゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８、Ｅ３ ＯＲＦ９、Ｅ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及び／又はＥ４ ＯＲＦ１の１つ又は複数を欠いている配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５のいずれか１つからなる配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％又は１００％、好ましくは９８％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。したがって、上述した１つ又は複数のゲノム領域は、好ましくはアラインメントにおいて同一度を決定する際に考慮されない。本発明の単離ポリヌクレオチドの別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５を含むか、又はそれらからなり、この場合、ゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８、Ｅ３ ＯＲＦ９、Ｅ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及びＥ４ ＯＲＦ１の１つ又は複数が、配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のそれぞれから欠失しているか、又は本明細書中で記載されるような異種タンパク質をコードする形質導入遺伝子若しくは発現カセットで置換されている。最も好ましい実施形態では、アデノウイルス領域Ｅ１、Ｅ３及び／又はＥ４は、実施例２においても例示されるように欠失している。表示のゲノム領域の１つ又は複数を欠いている上述の好ましいポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、又は異種タンパク質をコードするかかるポリヌクレオチド配列を含む発現カセットをさらに含んでいてもよい。異種タンパク質をコードする上記ポリヌクレオチド配列、及び異種タンパク質をコードするかかるポリヌクレオチド配列を含む上記発現カセットは、当該技術分野でよく知られ、下記実施例においても記載されるように、例えば本発明のポリヌクレオチドの欠失領域に挿入されていてもよい。上記異種タンパク質は、本明細書中で記載されるような標的細胞への送達のための分子、例えば抗原タンパク質若しくはその断片、好ましくはＨＩＶ ｇａｇタンパク質等の病原体の抗原タンパク質若しくは断片、腫瘍抗原、又は実施例で記載されるように単純ヘルペスウイルスのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。したがって、好ましい実施形態では、本発明による単離ポリヌクレオチドは、ウイルス抗原、病原性細菌の抗原及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗原をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一実施形態では、上記異種タンパク質はしたがって、ＲＮＡウイルス抗原、病原性細菌の抗原及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗原であってもよい。抗原とは、哺乳動物において免疫応答を引き起こすことが可能な任意のタンパク質又はペプチドを指す。抗原は、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、最も好ましくは８個〜１２個のアミノ酸を含む。したがって、配列同一性を決定する際には、ゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４は好ましくはアラインメントにおいて考慮されない。すなわち、アラインメントは、配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５の全配列からなるが、ゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、及び／又は異種ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド、若しくはかかるポリヌクレオチドを含む発現カセットを除外した配列を用いて行われる。上記でも言及されるように、本発明の第４の態様及びその全ての好ましい実施形態によるポリヌクレオチドは、機能的ヘキソン、ペントン及び／又はファイバーカプシドタンパク質、又はその機能的誘導体をコードする（例えば、コードされるタンパク質が、感染性アデノウイルスビリオンにおいてそれぞれのカプシドタンパク質又はその断片と同じ機能を有する）ことが好ましい。したがって、そのカプシド内に上記コードされる組換えペントン、ヘキソン及び／又はファイバータンパク質、又はその機能的誘導体を含む組換えアデノウイルスは、宿主細胞に侵入することが可能である。本発明による、又は本発明のポリヌクレオチドによってコードされるカプシドタンパク質又はその機能的誘導体は、ヒトにおいて血清陽性率を有しないことがさらに好ましい。
【０１０５】
本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチドによって単離タンパク質、すなわち本発明の第１、第２及び／又は第３の態様による単離ポリヌクレオチド又はその機能的誘導体によってコードされる単離アデノウイルスカプシドポリペプチドをさらに提供する。この文脈においては、「機能的誘導体」は一実施形態では、５個、１０個又は２５個以下のアミノ酸変化（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸）を含む。
【０１０６】
本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチドを含むベクターにさらに関する。
【０１０７】
好ましくは、ベクターはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４からなるゲノム領域の群から選択されるゲノム領域に遺伝子を含まない、及び／又はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４の群から選択されるゲノム領域の少なくとも１つの遺伝子を含み、この場合、上記少なくとも１つの遺伝子は、少なくとも１つの遺伝子を非機能的にする欠失及び／又は突然変異を含む。これらの遺伝子産物の１つを非機能的にする可能性の１つは、１つ又は複数の人工停止コドン（例えばＴＡＡ）をこれらの遺伝子内のオープンリーディングフレームに導入することである。ウイルスを複製欠損にする方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Brody et al, 1994 Ann NY Acad Sci., 716:90-101を参照されたい）。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のヘキソンタンパク質；ペントンタンパク質；ファイバータンパク質；ヘキソンタンパク質及びペントンタンパク質；ヘキソンタンパク質及びファイバータンパク質；ペントンタンパク質及びファイバータンパク質；又はヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、さらなるアデノウイルスポリヌクレオチドをさらに含む。このため、好ましい一実施形態では、本発明による単離ポリヌクレオチドは、以下のものの少なくとも１つを含む：
（ａ）アデノウイルス５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）；
（ｂ）アデノウイルスＥ１ａ領域、又は１３Ｓ領域、１２Ｓ領域及び９Ｓ領域の中から選択されるその断片；
（ｃ）アデノウイルスＥ１ｂ領域、又はスモールＴ領域、ラージＴ領域及びＩＸ領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｄ）アデノウイルスＥ２ｂ領域、又はスモールｐＴＰ領域、ポリメラーゼ領域及びＩＶａ２領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｅ）アデノウイルスＬ１領域、又は２８．１ｋＤタンパク質、ポリメラーゼ、アグノタンパク質、５２／５５ｋＤａタンパク質及びＩＩＩａタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｆ）アデノウイルスＬ２領域、又は本発明のペントンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＬ２領域、又はペントンタンパク質若しくは本発明のペントンタンパク質、ＶＩＩタンパク質、Ｖタンパク質及びＭｕタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｇ）アデノウイルスＬ３領域、又は本発明のヘキソンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＬ３領域、又はＶＩタンパク質、ヘキソンタンパク質若しくは本発明のヘキソンタンパク質、及びエンドプロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｈ）アデノウイルスＥ２ａ領域；
（ｉ）アデノウイルスＬ４領域、又は１００ｋＤタンパク質、３３ｋＤホモログ及びＶＩＩＩタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｊ）アデノウイルスＥ３領域、又はＥ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８及びＥ３ ＯＲＦ９からなる群から選択されるその断片；
（ｋ）アデノウイルスＬ５領域、又は本発明のファイバータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＬ５領域、ファイバータンパク質又は本発明のファイバータンパク質をコードするその断片；
（ｌ）アデノウイルスＥ４領域、又はＥ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及びＥ４ ＯＲＦ１からなる群から選択されるその断片；特に、上記Ｅ４領域のＯＲＦ６、及び／又は
（ｍ）アデノウイルス３’−ＩＴＲ。
【０１０９】
上述したポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、上記でも記載したように、好ましくはポリヌクレオチドが上記に概説されるゲノム領域のＯＲＦ（例えば、実施例２において規定されるような領域Ｅ３及び／又はＥ４等）を含まない、及び／又は少なくとも１つの遺伝子を非機能的にする欠失及び／又は突然変異を含むアデノウイルス遺伝子を含むことが望ましい場合がある。これらの好ましい実施形態では、好適なアデノウイルス領域は上述した遺伝子（複数可）を含まないように、又は選択された遺伝子（複数可）を非機能的にするように修飾される。任意のアデノウイルス遺伝子の欠失は、本明細書中で記載されるようなミニ遺伝子カセット等の形質導入遺伝子を挿入する空間を作り出す。さらに、当該技術分野でよく知られているように、遺伝子の欠失を用いて、パッケージング細胞株又はヘルパーウイルスを使用しない限り複製することが不可能なアデノウイルスベクターを生成することができる。したがって、特定の遺伝子／領域の欠失又は機能喪失突然変異の１つ又は複数を含む、上記に概説されるポリヌクレオチドを含む最終的な組換えアデノウイルスは、例えば遺伝子療法又はワクチン接種に対してより安全な組換えアデノウイルスを提供することができる。
【０１１０】
特に好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは以下のものの少なくとも１つを含む：
（ａ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５のいずれか１つの５’−逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域；
（ｂ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ１ａ領域、又は１３Ｓ領域、１２Ｓ領域及び９Ｓ領域の中から選択されるその断片；
（ｃ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ１ｂ領域、又はスモールＴ領域、ラージＴ領域及びＩＸ領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｄ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ２ｂ領域、又はスモールｐＴＰ領域、ポリメラーゼ領域及びＩＶａ２領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｅ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ１領域、又は２８．１ｋＤタンパク質、ポリメラーゼ、アグノタンパク質、５２／５５ｋＤａタンパク質及びＩＩＩａタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｆ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ２領域、又は配列番号３１、配列番号５２若しくは配列番号５５のアミノ酸配列を有するペントンタンパク質、ＶＩＩタンパク質、Ｖタンパク質及びＭｕタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｇ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ３領域、又はＶＩタンパク質、配列番号２５、配列番号５１若しくは配列番号５４のアミノ酸配列を有するヘキソンタンパク質、及びエンドプロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｈ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ２ａ領域；
（ｉ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ４領域、又は１００ｋＤタンパク質、３３ｋＤホモログ及びＶＩＩＩタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｊ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ３領域、又はＥ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８及びＥ３ ＯＲＦ９からなる群から選択されるその断片；
（ｋ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ５領域、又は配列番号１９、配列番号５０若しくは配列番号５３のアミノ酸配列を有するファイバータンパク質をコードするその断片；
（ｌ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ４領域、又はＥ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及びＥ４ ＯＲＦ１からなる群から選択されるその断片、又はＡｄ５ Ｅ４領域のＯＲＦ６（配列番号６４）；並びに
（ｍ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５のいずれか１つの３’−ＩＴＲ。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、以下のアデノウイルスタンパク質の１つ又は複数、好ましくは全てをさらにコードする：ＶＩタンパク質、ＶＩＩＩタンパク質、ＩＸタンパク質、ＩＩＩａタンパク質及びＩＶａ２タンパク質。好ましくは、これらのタンパク質は、本明細書中で開示されるＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３ゲノム配列のそれぞれのオープンリーディングフレームによって（by from）コードされる。上記で明記したアデノウイルスタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを決定する方法は、組換えアデノウイルスの技術分野の当業者には十分理解される。当業者はアデノウイルスゲノムの構造も知っており、過度の負担なく、本明細書中で概説される個々のアデノウイルス領域及びＯＲＦを、例えば本発明の新規のアデノウイルスゲノムＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３のいずれかにマッピングすることができる。
【０１１２】
本発明の１つ又は複数のアデノウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド、好ましくはｃＤＮＡを発現させるために、上記ポリヌクレオチドを、転写を指示する強いプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングすることができる。好適な細菌プロモーターは当該技術分野で既知であり（例えば大腸菌、バシラス属及びサルモネラ）、かかる発現系のためのキットは市販されている。同様に、哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞用の真核細胞発現系が当該技術分野で既知であり、これも市販されている。
【０１１３】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的には、宿主細胞におけるアデノウイルスタンパク質をコードする核酸の発現に必要とされるさらなる要素の全てを含有する転写ユニット又は発現カセットを含有する。典型的な発現カセットはしたがって、アデノウイルスタンパク質／ポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能に連結したプロモーター、及び転写産物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終止コドンを含有する。カセットのさらなる要素としては、例えばエンハンサーを挙げることができる。発現カセットは、効率的な終結をもたらすために構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有しなくてはならない。終結領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から得ても、又は異なる遺伝子から得てもよい。
【０１１４】
遺伝子情報を細胞へと輸送するのに使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞又は原核細胞における発現に使用される従来のベクターをいずれも使用することができる。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ等のプラスミド、並びにＧＳＴ及びＬａｃＺ等の融合発現系が挙げられるが、効果的に採用することのできる、当該技術分野で当業者に既知のさらに多くの細菌発現ベクターが存在する。
【０１１５】
真核細胞ウイルスに由来する調節要素を含有する発現ベクターは、典型的には真核細胞発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、及びエプスタインバーウイルスに由来するベクター中で使用される。他の例示的な真核細胞ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＩＲＥＳ、及び例えばＨＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現に効果的であることが示される他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０１１６】
幾つかの発現系は、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ等の遺伝子増幅をもたらすマーカーを有する。代替的には、遺伝子増幅を伴わない高収率発現系も好適である。
【０１１７】
同様に発現ベクター中に含まれ得る要素としては、大腸菌において機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする薬剤耐性マーカーをコードする遺伝子、及び真核細胞配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域中の特有の制限部位が挙げられる。選択される特定の薬剤耐性遺伝子は重要ではなく、当該技術分野で既知の多くの薬剤耐性遺伝子のいずれも好適である。必要に応じて、原核細胞配列が任意で、真核細胞におけるＤＮＡの複製を干渉しないよう選択される。
【０１１８】
標準的なトランスフェクション方法を、細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株又は昆虫細胞株を作製するために使用することができる。外来ポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する既知の手順をいずれも使用することができる。例えば、市販のリポソームベースのトランスフェクションキット（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Invitrogen）等）、市販の脂質ベースのトランスフェクションキット（Ｆｕｇｅｎｅ（Roche Diagnostics）等）、ポリエチレングリコールベースのトランスフェクションキット、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃（バイオリスティック）、エレクトロポレーション又はウイルス感染、及びクローニングしたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ若しくは他の外来遺伝子物質を宿主細胞に導入する他の既知の方法のいずれかが使用され得る。使用される特定の遺伝子工学手順は、少なくとも１つの遺伝子を、受容体を発現することが可能な宿主細胞に首尾よく導入することが可能であればよい。
【０１１９】
発現されたアデノウイルスタンパク質を、任意で標準的な技法を用いて精製することができる。例えば、沈殿工程及びクロマトグラフィー工程（その内容及び順序は回収される特定の組換え物質によって異なる）を行う前に、細胞を機械的に又は浸透圧衝撃によって溶解してもよい。代替的には、タンパク質発現の技術分野で既知のように、組換えタンパク質を分泌させて、組換え細胞を培養した培養培地から回収してもよい。
【０１２０】
好ましい一実施形態では、本発明のベクターはプラスミドベクター、例えば発現ベクターである。本発明によるプラスミドベクターも、組換えアデノウイルスの作製に使用することができる。
【０１２１】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明による単離ポリヌクレオチド及び／又は少なくとも１つの本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを含む組換えアデノウイルス、好ましくは複製不全アデノウイルスである。好ましくは、本発明の組換えアデノウイルスは、本発明のヘキソンタンパク質、ファイバータンパク質及びペントンタンパク質、例えば上記表２中で概説されるような組み合わせを含む。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスはヒト細胞に感染することが可能であること、好ましくは先にチンパンジーアデノウイルスに曝露していないヒトに由来するヒト血清中で、上記アデノウイルスを１時間インキュベートした後にヒト細胞に感染することが可能であることを特徴とする。
【０１２２】
本発明の新規のヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質の配列情報を提示するが、上記組換えアデノウイルスは、例えば通常のアデノウイルスタンパク質から構成されるが、少なくとも１つの本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチド又はその機能的誘導体を含むカプシドを有する組換えアデノウイルスを構築することによって得ることができる。この点で、組換えアデノウイルスが、本発明のペントンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＬ２領域、本発明のヘキソンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＬ３領域、及び／又は本発明のファイバータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＬ５領域を含むことが好ましい。最も好ましくは、上記組換えアデノウイルスは、少なくとも本発明のペントンタンパク質、ヘキソンタンパク質及びファイバータンパク質をそれぞれコードするＬ２領域、Ｌ３領域及びＬ５領域を含む。
【０１２３】
組換えアデノウイルスを構築する方法は当該技術分野で既知である。組換えアデノウイルスの作製に有用な技法は、例えばGraham & Prevec, 1991 Methods inMolecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. Murray, EJ.),p. 109、及びHitt et al., 1997 "Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer intoMammalian Cells" Advances in Pharmacology 40: 137-206に概説されている。さらなる方法は国際公開第２００６／０８６２８４号に記載されている。複製欠損アデノウイルスの作製については、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４遺伝子産物の１つ又は幾つかを、それらのウイルスは、例えば上述した遺伝子産物のうち１つを欠いているため、複製不全である組換えアデノウイルスの増殖及びレスキューに使用することのできる補完細胞株において発現させてもよい。かかる細胞株の使用は上記で概説される参照文献にも記載されている。
【０１２４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（又は本明細書中に記載される上記本発明のポリヌクレオチドを含むベクター）は、組換えアデノウイルス粒子を作製するために使用される。組換えアデノウイルスは好ましくは、例えばＥ１ａ領域又はＥ１ｂ領域等の１つ又は複数のアデノウイルス領域において上記で言及したように機能的に欠失しており、任意で他の突然変異、例えば他のアデノウイルス遺伝子での温度感受性突然変異又は欠失を有する。他の実施形態では、組換えアデノウイルスにおいて無傷のＥ１ａ領域及び／又はＥ１ｂ領域を保持することが望ましい。このような無傷Ｅ１領域は、アデノウイルスゲノムにおけるその固有の位置に位置していても、又は固有のアデノウイルスゲノムの欠失部位（例えばＥ３領域）に置かれてもよい。
【０１２５】
宿主、例えばヒト（又は他の哺乳動物）細胞への遺伝子の送達のためのアデノウイルスベクターの構築においては、様々なアデノウイルス核酸配列を本発明のベクターにおいて採用することができる。例えば、アデノウイルス後初期（delayed early）遺伝子Ｅ３の全部又は一部を、組換えウイルスの一部を形成するアデノウイルス配列から取り除いてもよい。サルＥ３の機能は、組換えウイルス粒子の機能及び作製とは無関係であると考えられる。幾つかの実施形態では、少なくともＥ４遺伝子のＯＲＦ６領域、より望ましくはこの領域の機能が余分であることから、全Ｅ４領域の欠失を有するアデノウイルスベクターも構築することができる。本発明のさらに別のベクターは、後初期遺伝子Ｅ２ａにおいて欠失を有する。欠失は、サルアデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれにおいても作り出すことができる。同様に、中期遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２における欠失は幾つかの目的にとって有用であり得る。他の欠失を他の構造又は非構造アデノウイルス遺伝子において作り出してもよい。上記で論考した欠失は個々に使用することができる。すなわち、本発明に使用されるアデノウイルス配列は単一の領域にのみ欠失を含有し得る。代替的には、それらの生物活性を破壊するのに効果的な全遺伝子又はその一部分の欠失を任意の組み合わせで使用してもよい。例えば、本発明によるベクターの一例においては、アデノウイルス配列はＥ１領域及びＥ４領域、又はＥ１領域、Ｅ２ａ領域及びＥ３領域、又はＥ１領域及びＥ３領域、又はＥ３の欠失の有無を問わず、Ｅ１領域、Ｅ２ａ領域及びＥ４領域の欠失等を有し得る。上記で論考したように、かかる欠失を温度感受性突然変異等の他のアデノウイルス遺伝子突然変異と組み合わせて用いて、所望の結果を達成することができる。
【０１２６】
任意の必須アデノウイルス配列（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｌ１又はＬ４から選択される領域）を欠いているアデノウイルスベクターを、アデノウイルス粒子のウイルス感染及び増殖に必要とされる失われたアデノウイルス遺伝子の産物の存在下で培養することができる。これらのヘルパー機能は、アデノウイルスベクターを、１つ又は複数のヘルパー構築物（例えば、プラスミド又はウイルス）又はパッケージング宿主細胞（上記でも記載した補完細胞株）の存在下で培養することによってもたらされ得る。例えば、本明細書中に含まれる実施例、及び１９９６年５月９日付けで公開された国際公開第９６／１３５９７号（参照により本明細書中に援用される）において「最小の」ヒトアデノウイルスベクターの作製について記載された技法を参照されたい。
【０１２７】
有用なヘルパーウイルスは、本発明のアデノウイルスベクターの好ましい実施形態において欠失した、及び／又はベクターをトランスフェクトするパッケージング細胞株によって発現されないそれぞれの遺伝子を補完する、選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含有する。一実施形態では、ヘルパーウイルスは複製欠損であり、上記で記載した配列に加えて様々なアデノウイルス遺伝子を含有する。
【０１２８】
ヘルパーウイルスは、Wu et al, J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989)、K. J. Fisher and J. M. Wilson, Biochem.J., 299: 49 (April 1, 1994)に記載されるように、ポリカチオン複合体に形成してもよい。ヘルパーウイルスは任意で第２のレポーターミニ遺伝子を含有し得る。多くのかかるレポーター遺伝子が当該技術分野で既知である。ヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子（アデノウイルスベクター上の形質導入遺伝子とは異なる）の存在によって、Ａｄベクター及びヘルパーウイルスの両方を独立してモニタリングすることが可能となる。この第２のレポーターは、得られる組換えウイルスとヘルパーウイルスとを精製の際に分離することを容易にするために使用され得る。
【０１２９】
本明細書中の好ましい実施形態との関連で記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失した組換えアデノウイルス（Ａｄ）を生成するには、欠失した遺伝子領域の機能を、ウイルスの複製及び感染性に必須である場合に、ヘルパーウイルス又は細胞株、すなわち補完細胞株又はパッケージング細胞株によって組換えウイルスに与えることが好ましい。多くの場合、ヒトＥ１を発現する細胞株を用いて、組換えアデノウイルスを生成するのに使用されるベクターをトランス補完する（transcomplement）ことができる。このことは、本発明のポリヌクレオチド配列及び現在利用可能なパッケージング細胞に見られるヒトアデノウイルスＥ１配列の間の多様性のために、現在のヒトＥ１含有細胞の使用によって、複製及び産生プロセスにおいて複製可能アデノウイルスの生成が妨げられるため、特に有利である。しかしながら、或る特定の状況では、Ｅ１を欠失した組換えアデノウイルスの作製のためにＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を利用することが望ましい。
【０１３０】
所望に応じて、本明細書中で提示される配列を、選択された親細胞株（例えばＨｅＬａ細胞等）における発現のためのプロモーターの転写調節下で、最低でもＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３アデノウイルスに由来するアデノウイルスＥ１遺伝子を発現するパッケージング細胞又は細胞株を生成するために利用してもよい。誘導性プロモーター又は構成的プロモーターをこの目的で採用することができる。プロモーターの例は、例えば本明細書中に記載される実施例において提示される。かかるＥ１発現細胞株は、組換えアデノウイルスＥ１欠失ベクターの生成において有用である。付加的又は代替的には、本発明は、組換えアデノウイルスベクターの生成に使用されるものと基本的に同じ手順を用いて構築することのできる、１つ又は複数のアデノウイルス遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ及び／又はＥ４ ＯＲＦ６、好ましくはＡｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６（下記実施例も参照されたい）を発現する細胞株を提供する。かかる細胞株は、これらの産物をコードする必須遺伝子において欠失したアデノウイルスベクターをトランス補完するか、又はヘルパー依存ウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）のパッケージングに必要とされるヘルパー機能をもたらすために利用することができる。
【０１３１】
概して、例えばミニ遺伝子を含む本発明のベクターをトランスフェクションによって送達する場合、ベクターは、約１×１０４個〜約１×１０３個の細胞、好ましくは約１×１０５個の細胞につき約０．１μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、好ましくは約１０μｇ〜約５０μｇのＤＮＡという量で送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法及び選択された宿主細胞といった因子を考慮して調整され得る。宿主細胞へのベクターの導入は、トランスフェクション及び感染を含む当該技術分野で既知であるか、又は本明細書中で開示される任意の手段によって、例えばＣａＰＯ４トランスフェクション又はエレクトロポレーションを用いて達成することができる。
【０１３２】
所望のミニ遺伝子含有組換えアデノウイルスの構築及び組み立てについては、一例では当該技術分野でよく知られているように、ベクターをヘルパーウイルスの存在下で、パッケージング細胞株にｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトして、ヘルパー配列とベクター配列との間で相同組換えを起こし、それによりベクターにおいてアデノウイルス−導入遺伝子配列を複製させ、ビリオンカプシド内にパッケージングさせて、組換えウイルスベクター粒子を得ることができる。本発明の組換えアデノウイルスは、例えば選択された形質導入遺伝子を選択された宿主細胞内に移入するのに有用である。
【０１３３】
本発明のアデノウイルスの好ましい実施形態では、アデノウイルスはヒト被験体において５％未満の血清陽性率を有し、好ましくはヒト被験体において血清陽性率を有さず、最も好ましくは先にチンパンジーアデノウイルスと接触させていないヒト被験体において血清陽性率を有しない。この文脈では、ヒト被験体はヨーロッパ人、アフリカの先住民、アジア人、アメリカの先住民及びオセアニアの先住民から選択される民族集団に属することが好ましい。ヒト被験体の民族起源を特定する方法は、当該技術分野に含まれる（例えば、国際公開第２００３／１０２２３６号を参照されたい）。
【０１３４】
本発明による組換えアデノウイルスのさらに好ましい実施形態では、アデノウイルスＤＮＡは、哺乳動物標的細胞に侵入することが可能である、すなわち感染性である。本発明の感染性組換えアデノウイルスは、下記でも記載されるように、ワクチンとして、また、遺伝子療法に使用することができる。したがって、別の実施形態では、組換えアデノウイルスが標的細胞への送達のための分子を含むことが好ましい。好ましくは、標的細胞は哺乳動物細胞、例えばチンパンジー細胞、齧歯類細胞又はヒト細胞である。例えば、標的細胞への送達のための分子は、本明細書中で定義される発現カセットであり得る。発現カセットをアデノウイルスのゲノムに導入する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、上記で提示される文献引用を参照されたい）。一例では、例えばミニ遺伝子又はアンチジーンをコードする発現カセットを含む本発明の組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４から選択されるアデノウイルスのゲノム領域を上記発現カセットに置き換えることによって生成することができる。本発明のアデノウイルスのゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４は、ヒトＡｄ５に由来するもののような既知のアデノウイルスゲノム及び注釈されたアデノウイルスゲノムとのアラインメントによって容易に同定することができる（Birgitt Tauber and Thomas Dobner, Oncogene (2001) 20, p. 7847-7854、及び同様にAndrew J. Davison, et al., "Genetic content and evolution ofadenoviruses", Journal of General Virology (2003), 84, p. 2895-2908を参照されたい）。標的細胞への送達のための分子を含む改変アデノウイルスを生成する方法の非限定的な例は、下記の実施例１及び実施例２並びに図４にも提示される。
【０１３５】
標的細胞への送達のための分子は好ましくはポリヌクレオチドであるが、好ましくは治療活性又は診断活性を有するポリペプチド又は小分子化合物（small chemical compound）であってもよい。特に好ましい一実施形態では、標的細胞への送達のための分子は、アデノウイルス５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、遺伝子（例えば配列番号１）及び３’ＩＴＲを含むポリヌクレオチドである。組換えアデノウイルスが、例えばパッケージング細胞株内で産生された場合に、カプシドが分子を取り囲み、パッケージングすることができるような分子の分子サイズを選択する必要があることは当業者には明らかである。したがって、遺伝子は、例えば７０００個まで、最大で８０００個までの塩基対を有し得るミニ遺伝子であるのが好ましい。
【０１３６】
好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスに含まれる標的細胞への送達のための分子は、抗原タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドである。抗原タンパク質又はその断片は、哺乳動物において免疫応答を引き起こすことが可能であり、特に好ましい実施形態では、実施例に示されるように、配列番号１に記載のポリヌクレオチドによってコードされるＨＩＶのｇａｇタンパク質であり得る。
【０１３７】
特に好ましい実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスは、ＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Culture，Porton Down，Salisbury，SP4 OJG，UK）に寄託された、０８１１０６０１（ＣｈＡｄ８３）、０８１１０６０２（ＣｈＡｄ７３）、０８１１０６０３（ＣｈＡｄ５５）、０８１１０６０４（ＣｈＡｄ１４７）及び０８１１０６０５（ＣｈＡｄ１４６）からなる群から選択される受託番号を有するアデノウイルスである。上述したアデノウイルス株（ラテン名：Mastadenovirus, Adenoviridae）の寄託は、２００８年１１月６日付けでOkairos AG（Elisabethenstr. 3，4051 Basel，Switzerland）によって行われた。
【０１３８】
これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って維持される。これらの寄託は、単に当業者の便宜を図るために行ったものであり、米国特許法第１１２条に基づいて寄託が必要とされることを認めるものではない。米国特許法施行規則１．８０８条（ｂ）項に明記される要件を除いて、寄託されている材料の公衆への提供可能性に関する制限は全て、特許が付与されたとき、取消不能の条件で撤回される。
【０１３９】
本発明の組換えアデノウイルスの別の好ましい実施形態は、０８１１０６０１（ＣｈＡｄ８３）、０８１１０６０２（ＣｈＡｄ７３）、０８１１０６０３（ＣｈＡｄ５５）、０８１１０６０４（ＣｈＡｄ１４７）及び０８１１０６０５（ＣｈＡｄ１４６）からなる群から選択されるアデノウイルスに由来するアデノウイルスである。好ましくは、上述の寄託されたアデノウイルスの１つに由来するアデノウイルスは、そのゲノムに機能的欠失、欠失又は修飾を導入することによって、例えば複製不全アデノウイルス及び／又は宿主細胞において形質導入遺伝子を発現することが可能なアデノウイルスが得られるように変更されている。例えば、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、Ｅ２Ｂ遺伝子、Ｅ３遺伝子及びＥ４遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子は欠失させる、非機能的にする、及び／又は上記に概説される発現カセットと置き換えることができる。さらに、別のアデノウイルスの１つ又は複数の遺伝子を、好ましくは欠失した遺伝子に導入してもよい。寄託された株にこれらのゲノム変化を導入する方法は、当業者には十分理解される。この点において、寄託された株の好ましい修飾形態である、標的細胞への送達のための分子を含む修飾アデノウイルスを生成する方法は上記で記載した。
【０１４０】
さらなる態様では、免疫学的アジュバント及び以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つを含む組成物が提供される：
（ｉ）本発明による単離タンパク質；
（ｉｉ）本発明による単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明によるベクター；
（ｉｖ）本発明による組換えアデノウイルス；及び、
任意で、薬学的に許容可能な賦形剤。
【０１４１】
アジュバントを含む本発明による組成物は、例えばヒト被験体に対するワクチンとして使用することができる。本明細書中で簡潔に「アジュバント」とも称される免疫学的アジュバントは、抗原単独での投与と比較して、抗原／免疫原に対する免疫応答を加速し、延長し、及び／又はその質及び／又は強度を増強し、したがって、所与の任意のワクチンに必要とされる抗原／免疫原の量、及び／又は対象の抗原／免疫原に対する適切な免疫応答を生じさせるのに必要とされる注射の頻度を低減する。
【０１４２】
本発明による組成物との関連で使用され得るアジュバントの例は、水酸化アルミニウムのゲル状沈殿（水酸化アルミニウムゲル（alum））；ＡｌＰＯ４；アルハイドロゲル；グラム陰性菌の外膜に由来する細菌産物、特にモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド及びその誘導体；フロイント不完全アジュバント；リポソーム、特に中性リポソーム、組成物及び任意でサイトカインを含有するリポソーム；非イオン性ブロック共重合体；ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバント（Drane et al., 2007）；ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）、特にホスホロチオエート（ＰＴＯ）骨格（ＣｐＧ ＰＴＯ ＯＤＮ）又はホスホジエステル（ＰＯ）骨格（ＣｐＧ ＰＯ ＯＤＮ）を有するＣｐＧ ＯＤＮを含む非メチル化ＤＮＡ；合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、特にＨＳＰ ７０；二本鎖ＲＮＡ及びその合成誘導体、特にＰｏｌｙ Ｉ：ｐｏｌｙ Ｃ；ポリカチオン性ペプチド、特にポリ−Ｌ−アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラジェリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−（ＩＬ−）２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１８、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン、特にインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α；２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）；及び合成オリゴペプチド、特にＭＨＣＩＩ提示ペプチドである。ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロック共重合体等といったポリオキシエチレン（ＰＯＥ）及びポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）を含有する非イオン性ブロック共重合体を、アジュバントとして使用することができる（Newman et al., 1998）。このタイプのアジュバントは活性成分として核酸を含む組成物に特に有用である。
【０１４３】
任意で、様々な薬学的に許容可能な賦形剤を使用してもよい。好ましい薬学的に許容可能な賦形剤は、本発明による使用を論考する際に下記で言及される。
【０１４４】
特異的受容体の活性化は免疫応答を刺激し得る。かかる受容体は当業者に既知であり、例えばサイトカイン受容体、特にＩ型サイトカイン受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体、ＴＮＦ受容体；並びに転写因子として作用するビタミンＤ受容体；並びにＴｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９が挙げられる。かかる受容体に対する作動薬はアジュバント活性を有する、すなわち免疫賦活性である。好ましい実施形態では、本発明の組成物のアジュバントは、１つ又は複数のＴｏｌｌ様受容体作動薬であり得る。より好ましい実施形態では、アジュバントはＴｏｌｌ様受容体４作動薬である。特定の好ましい実施形態では、アジュバントはＴｏｌｌ様受容体９作動薬であり、好ましくはヌクレオチドtccatgacgttcctgacgtt（配列番号２）によってコードされる。
【０１４５】
さらなる態様では、本発明は、以下のものの少なくとも１つを含む細胞、好ましくは非サル細胞を提供する：
（ｉ）本発明による単離タンパク質；
（ｉｉ）本発明による単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明によるベクター；
（ｉｖ）本発明による組換えアデノウイルス。
【０１４６】
細胞は、大腸菌細胞等の細菌細胞、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）若しくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母細胞、植物細胞、ＳＦ９細胞若しくはＨｉ５細胞等の昆虫細胞、又は哺乳動物細胞から選択され得る。哺乳動物細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨＥＬＡ細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｕｈ７．５）、Ｈｅｐ Ｇ２ヒト肝細胞癌細胞、Ｈｅｐ ３Ｂヒト肝細胞癌細胞等である。
【０１４７】
細胞が、（ｉｉ）に記載の単離ポリヌクレオチドを含む場合、このポリヌクレオチドは、（ｉ）それ自体が自由に分散するか、又は（ｉｉ）宿主細胞ゲノム又はミトコンドリアＤＮＡに組み込まれて細胞中に存在し得る。
【０１４８】
さらなる好ましい実施形態では、細胞は好ましくは２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６（商標）である、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群から選択されるアデノウイルス遺伝子を少なくとも１つ発現する宿主細胞である。
【０１４９】
疾患の療法又は予防法への、本発明による単離ポリペプチド、本発明による単離タンパク質、本発明によるベクター、本発明による組換えアデノウイルス、及び／又は本発明による組成物の使用も提供される。
【０１５０】
アデノウイルスベクターはワクチンベクターとしての大きな可能性が実証されている。前臨床研究及び臨床研究から、ベクター設計、確実な抗原発現及びこの系を用いた予防免疫の実現可能性が実証されている。したがって、好ましい実施形態は、療法又は予防法が、例えばヒト被験体に対するワクチン接種である本発明による使用である。アデノウイルスをワクチン接種に対して使用及び作製する方法の詳細な指示は、当該技術分野に含まれ、当業者に既知の十分な文献に提示されている。
【０１５１】
使用がワクチン接種である場合、本発明の組換えアデノウイルスは、好ましくは１×１０８個〜１×１０１１個のウイルス粒子（すなわち１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、２．５×１０１０個又は５×１０１０個の粒子）という免疫学的及び／又は予防的に効果的な用量で投与することができる。さらに、ブーストを必要とするワクチン接種については、上記で定義される「異種プライム−ブースト」方法を適用することが好ましい。さらに、本発明による単離ポリヌクレオチド、本発明による単離タンパク質、本発明によるベクター、本発明による組換えアデノウイルス及び／又は本発明による医薬組成物をワクチン中で用いる場合、ワクチンがアジュバントを含むことが好ましい。好ましい免疫学的アジュバントは本明細書中で言及されており、かかるワクチン中で使用することができる。
【０１５２】
本発明によるポリヌクレオチド又は組換えアデノウイルスタンパク質又はそれらの断片を用いて作製される組換えアデノウイルスは、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡを宿主細胞に形質導入するために使用することができる。したがって、好ましくは感染性、すなわち宿主細胞に侵入することが可能ではあるが複製欠損のアデノウイルスを、任意の特別なタンパク質又はポリペプチドを宿主細胞において発現させるために作製することができる。したがって、好ましい実施形態では、本発明による使用において挙げられる療法は遺伝子療法である。本発明による単離ポリヌクレオチド、単離タンパク質、ベクター、組換えアデノウイルス及び／又は医薬組成物を遺伝子療法に使用し、治療を受ける被験体に投与する場合、治療によって患者の１つ又は複数の細胞がトランスフェクトされる、すなわち形質導入されるように十分に大きな用量で投与することが好ましい。本発明による組換えアデノウイルス及び／又は医薬組成物は、本明細書中で開示される好ましい投与手段のいずれかによって投与される場合、好ましくは１×１０８個〜５×１０１１個のウイルス粒子（すなわち１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、２．５×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個、又は最も好ましくは５×１０１１個の粒子）という効果的な用量で投与することが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の組換えアデノウイルス中に含まれる好ましくは異種のポリヌクレオチドは、被験体の宿主細胞においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることが可能であり、この場合、タンパク質又はポリペプチドが、上記宿主細胞からのタンパク質又はポリペプチドの分泌をもたらすシグナルペプチドを含む。例えば、或る特定のタンパク質を必要とする患者は、分泌可能な形態のそのタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む本発明のアデノウイルスを用いて治療することができる。
【０１５３】
本発明の使用のさらなる実施形態では、本発明による単離ポリヌクレオチド、単離タンパク質、ベクター、アデノウイルス及び／又は医薬組成物（以下で本発明による医薬品と称される）は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤；担体；増量剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤及び吸着剤を含む賦形剤；及び／又は防腐剤をさらに含むように配合される。
【０１５４】
本発明による医薬品は、経口投与、直腸投与、胃内（intragastrical）投与、及び非経口投与、例えば静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮内投与、皮下投与、及び同様の投与経路を含む既知の様々な経路によって投与することができる。非経口投与、筋肉内投与及び静脈内投与が好ましい。好ましくは、本発明による医薬品はシロップ剤、注入液又は注射液、錠剤、カプセル、キャプレット、舐剤、リポソーム、坐薬、硬膏、バンドエイド、徐放性カプセル、粉末剤又は徐放製剤として調剤される。好ましくは、希釈剤は水、緩衝液、緩衝塩溶液又は塩溶液であり、担体は好ましくはカカオバター及びビテベソールからなる群から選択される。
【０１５５】
本発明の使用における本発明による医薬品の投与に特に好ましい医薬品形態は、注射用途（injectable use）に好適な形態であり、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。典型的には、かかる溶液又は分散液は、例えば水緩衝水溶液、例えば生体適合性緩衝液、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリオール、それらの好適な混合物、界面活性剤又は植物油を含有する溶媒又は分散媒を含む。
【０１５６】
注入液又は注射液の調製は、抗菌剤又は抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸又はチメロサールのような防腐剤の添加が挙げられるが、これに限定されない、当該技術分野において承認されている様々な技法によって達成することができる。さらに、糖又は塩、特に塩化ナトリウム等の等張剤を注入液又は注射液に加えてもよい。
【０１５７】
本発明の好ましい希釈剤は、水、生理学的に（physiological）許容可能な緩衝液、生理学的に許容可能な緩衝塩溶液又は塩溶液である。好ましい担体はカカオバター及びビテベソールである。様々な医薬品形態の本発明による医薬品と共に使用することのできる賦形剤は、以下の非限定的なリストから選択することができる：
ａ）ラクトース、マンニトール、結晶性ソルビトール、リン酸水素二カリウム（dibasic phosphates）、リン酸カルシウム、糖類、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；
ｂ）ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、硬化植物油、ロイシン、グリセリド及びフマル酸ステアリルナトリウム等の滑剤；
ｃ）デンプン、クロスカルメロースナトリウム、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の崩壊剤。
【０１５８】
他の好適な賦形剤は、米国薬剤師会により出版された医薬品添加物ハンドブック（Handbook of Pharmaceutical Excipients）（参照により本明細書中に援用される）に見ることができる。
【０１５９】
一定量の本発明による医薬品が疾患の療法又は予防法に好ましい。しかしながら、疾患の重症度、疾患の種類、及び治療を受けるそれぞれの患者（例えば患者の全身健康状態等）に応じて、異なる用量の本発明による医薬品が治療効果又は予防効果を引き起こすのに必要とされることが理解される。適切な用量の決定は主治医の裁量による。
【０１６０】
本発明による医薬品が予防的に使用される場合、ワクチンとして調剤することができる。この場合、本発明による医薬品は、上記で概説される好ましい用量及び特に好ましい用量で投与するのが好ましい。好ましくは、ワクチンの投与は、ワクチン接種した被験体が、十分な抗体を本発明による医薬品に対して生成するまで、規定の期間にわたって少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回又は少なくとも１０回繰り返し、それぞれの疾患を発症するリスクを減少させる。この場合の期間は通常、ワクチンの抗原性に応じて変化する。この期間は４週間、３ヶ月、６ヶ月又は３年間を超えないのが好ましい。一実施形態では、本発明によるアデノウイルスがワクチン接種を目的として使用される場合、ヘキソンタンパク質の超可変ドメインの少なくとも１つを、ワクチン接種が対象とするそれぞれの病因物質の免疫原性エピトープによって置き換えることができる。ワクチンは典型的には、上記に概説される１つ又は複数のアジュバントを含有する。ワクチン接種及びそれに関する方法の使用についての詳細な概要は、Bangari DS and Mittal SK (2006) Vaccine, 24(7), p. 849-862（Zhou D, et al., Expert Opin Biol Ther. 2006 Jan;6(1):63-72も参照されたい）、及びFolgori A, et al.,Nat Med. 2006 Feb;12(2):190-7（Draper SJ, et al., NatMed. 2008 Aug;14(8):819-21. Epub 2008 Jul 27も参照されたい）に提示されている。
【０１６１】
本発明の様々な変更形態及び変形形態が、本発明の範囲を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、クレームされる本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されるものではないことが理解されよう。実際に、関連分野の当業者に明らかな本発明を実施する記載の形態の様々な変更形態は、本発明に包含されることが意図される。
【実施例】
【０１６２】
実施例１：アデノウイルスの単離及び特性化
ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７は、欧州及び米国の様々な施設に収容された健常な動物から得られたチンパンジーアデノウイルスの群である。ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７には、ヒト血清との検出可能な反応性を有しないという性質がある。ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３は、欧州及び米国の様々な施設に収容された健常なボノボ（Pan Paniscus）から単離した新たなアデノウイルスである。ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３には、ヒト血清との検出可能な反応性を有しないという性質がある。
【０１６３】
ナミチンパンジー及びボノボのアデノウイルスストックを、最初の継代増幅の後に、９６ウェルプレートに播種した２９３細胞に感染させることによってクローニングした。このウイルスクローニングは、最初の継代ウイルス増幅の後に得られる細胞溶解物の限界希釈によって行った。５つの単離したクローンを取り、連続的に増殖させた。３回〜４回の連続継代増幅の後、アデノウイルスの大規模調製を、５つの二層セルファクトリー（cell-facties）（NUNC）上に播種した（planted）細胞（１つのセルファクトリーにつき２億個の細胞）について行った。２回の塩化セシウム密度勾配超遠心分離工程によって、細胞溶解物から精製ウイルス粒子を得た。
【０１６４】
ゲノムＤＮＡを、３×１０１２ｐｐの精製ウイルス調製物から、１％ＳＤＳ−ＴＥＮ中でのプロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いた消化（５５℃で２時間）によって単離した。フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿の後、ゲノムＤＮＡを水中に再懸濁し、ゲノムシークエンシングを行った。
【０１６５】
この新たな分離株の初期分類は、ヘキソン遺伝子の超可変領域７（ＨＶＲ７）の配列分析によって得られた。この目的で、ＨＶＲ７に隣接する高度に保存された領域について２つのプライマーを設計した：TGTCCTACCARCTCTTGCTTGA（配列番号３）及びGTGGAARGGCACGTAGCG（配列番号４）。ＨＶＲ７を精製ウイルスＤＮＡ又は粗２９３溶解物を鋳型として用いたＰＣＲによって増幅した後、シークエンシングした。分離株に関するより詳細な情報は、超可変領域１〜６をシークエンシングすることによって得た。ＨＶＲ１〜ＨＶＲ６を含有するＤＮＡ領域を、オリゴヌクレオチドＨＶＲ１−６ｆｄ、CAYGATGTGACCACCGACCG（配列番号５）及びＨＶＲ１-６ｒｅｖ、GTGTTYCTGTCYTGCAAGTC（配列番号６）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＨＶＲの配列分析に基づくと、新たな単離ウイルスは、ヒトＡｄウイルス分類（Horowitz, MS (1990), Adenoviridae and theirreplication. In Virology B.N. Fields and D.M. Knipe, eds (raven Press, New York) pp.1679-1740）の亜群Ｅ（ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７）と、亜群Ｃ（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３）とに分類された。
【０１６６】
ヒト及びチンパンジーのアデノウイルスヘキソンアミノ酸配列のアラインメントによって系統樹を得た。この結果は、Ａｌｉｇｎ Ｘプログラム（Informax, Inc）を用いることによる、ヘキソンＨＶＲ１〜ＨＶＲ６及びＨＶＲ７に限局したヌクレオチド配列アラインメントに基づく初期分類と一致しており、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７分離株と、ヒトＡｄ４（亜群Ｅ）との緊密な系統発生的関係が実証され、ボノボアデノウイルス分離株ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３はヒトＡｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６（亜群Ｃ）に関連している。
【０１６７】
実施例２：ベクター構築
ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３、並びにＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７ウイルスゲノムを、下記に詳述する戦略に従ってプラスミドベクターにクローニングした。ベクターゲノムの全ての操作は、標準的な技法に従って大腸菌において行った。ベクター系は、ＣｈＡｄ及びＰａｎＡｄの骨格からＥ１領域及びＥ３領域を欠失させることによって開発した。Ｅ１領域を、動物モデルにおける免疫学的効力の評価のために、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター及びＢＧＨｐＡシグナル含有ＨＣＶ非構造領域（ＨＣＶ ＮＳ）及びＨＩＶ ｇａｇ（配列番号１）遺伝子に基づく発現カセットに置換した。加えて、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）を発現するＣｈＡｄベクター及びＰａｎＡｄベクターを、中和アッセイのために構築した。ベクターを２９３細胞中で増殖させて、標準的なプロトコルに従ったＣｓＣｌ勾配によって精製した。
【０１６８】
ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ ΔＥ１ベクターの構築は、下記に示す工程によって行った。
【０１６９】
Ｉ．ＰａｎＡｄシャトルベクターの構築
ＰａｎＡｄ１ゲノムを使用して、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３の全ゲノムの相同組換えによるクローニングのためのシャトルベクターを構築した。簡潔に述べると、ボノボアデノウイルス１のクローニングに使用されるシャトルベクター（本明細書中でｐＢＡｄ１ＲＬＤ＿ＥＧＦＰと称される）を以下のように構築した：
ＰａｎＡｄ１左端（ｎｔ １〜ｎｔ ４５０）を、ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化したオリゴヌクレオチド５’−ATCTGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATTTTG−３’（配列番号７）及び５’−TCAGGAACTAGTTCCGTATACCTATAATAATAAAACGGAGACTTTG−３’（配列番号８）を用いたＰＣＲによって増幅した後、ｐＢＡｄ１−Ｌを生成することによってＨＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｂｇｈ ｐｏｌｙＡカセットを既に含有するプラスミドベクターにライゲーションした。次いで、ＰａｎＡｄ１右端（ｎｔ ３７３６２〜ｎｔ ３７７７２）を、オリゴヌクレオチド５’−TCCAGCGGCGCGCCAGACCCGAGTCTTACCAGGA−３’（配列番号９）及び５’−ATTCAGGATCCGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATTTTG−３’（配列番号１０）を用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＢＡｄ１−Ｌにクローニングすることにより、プラスミドｐＢＡｄ１−ＲＬを作製した。
【０１７０】
続いて、ｐＩＸコード領域を含有するＰａｎＡｄ１ ＤＮＡ断片（ｎｔ ３４９８〜ｎｔ ４０３９）を、オリゴヌクレオチド５’−TATTCTGCGATCGCTGAGGTGGGTGAGTGGGCG−３’（配列番号１１）及び５’−TTACTGGCGCGCCTGCCTCGAGTAAACGGCATTTGCAGGAGAAG−３’（配列番号１２）を用いたＰＣＲによって増幅した後、ｐＢＡｄ１−ＲＬにクローニングして、プラスミドｐＢＡｄ１ＲＬＤ ＥＧＦＰシャトルを得た。分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）に対する発現カセット、ＨＩＶ ｇａｇ、ＨＣＶ非構造領域（ＮＳ）遺伝子を含有するシャトルプラスミドも、ｐＢＡｄ１ＲＬＤ ＥＧＦＰシャトル中のＥＧＦＰ遺伝子を置換することによって構築した。
【０１７１】
ＨＩＶ ｇａｇ ＨＣＶ ＮＳ領域、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ｐｏｌｙＡ）をベースとするＳＥＡＰ及びＥＧＦＰ発現カセットを、Emini et al.の国際公開第０３／０３１５８８号に記載されるように構築した。ウイルスＤＮＡカセットは、両方のＩＴＲの末端のみに存在する制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含有し、プラスミドＤＮＡからのウイルスＤＮＡの放出が可能となるように設計した。
【０１７２】
ＩＩ．ΔＥ１ ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ベクターの構築
ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ベクターを、大腸菌株ＢＪ５１８３における相同組換えによって構築した。ＢＪ５１８３細胞を、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３の精製ウイルスＤＮＡ及びｐＢＡｄ１ＲＬＤ−ＥＧＦＰ又はｐＢＡｄ１ＲＬＤ−Ｇａｇによって同時形質転換させた。ｐＩＸ遺伝子、線状化ｐＢＡｄ１ＲＬＤ−ＥＧＦＰ又はｐＢＡｄ１ＲＬＤ−Ｇａｇの末端に存在する右側のＩＴＲ ＤＮＡ配列、及びウイルスゲノムＤＮＡの間の相同組換えでは、発現カセットにより置換されたＥ１領域を同時に欠失させることによってプラスミドベクターへのその挿入が可能となった。この戦略によって、ＥＧＦＰ又はＨＩＶ ｇａｇ形質導入遺伝子を発現するプレアデノプラスミドｐＰａｎＡｄ１、ｐＰａｎＡｄ２及びｐＰａｎＡｄ３の構築が可能となった。次いで、ＳＥＡＰ又はＨＣＶ−ＮＳ発現カセットを、ＥＧＦＰ又はＧａｇ発現カセットを置き換えることによってｐＰａｎＡｄ１、ｐＰａｎＡｄ２及びｐＰａｎＡｄ３ベクターにクローニングした。
【０１７３】
ＩＩＩ．Ｅ３領域の欠失
Ｅ３領域の欠失を、大腸菌におけるクローニング及び相同組換えの幾つかの工程を含む戦略を用いることによって、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ベクター骨格に導入した。ＰａｎＡｄ１ Ｅ３欠失は、ゲノムＰａｎＡｄ１配列のヌクレオチド２８６３６からヌクレオチド３２５９６までにわたり（配列番号１３）、ＰａｎＡｄ２ Ｅ３欠失は、ゲノムＰａｎＡｄ２配列のヌクレオチド２８６５３からヌクレオチド３２５９９までにわたり（配列番号６２）、ＰａｎＡｄ３ Ｅ３欠失は、ゲノムＰａｎＡｄ３配列のヌクレオチド２８６８４からヌクレオチド３２６４０までにわたる（配列番号６３）。
【０１７４】
ＩＶ．Ｅ４領域の欠失
ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３の固有のＥ４領域を欠失させ、Ａｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６コード配列（配列番号６４）と置き換えた。ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３骨格中に導入されたＥ４欠失の座標は以下である：
ＰａｎＡｄ１ Ｅ４欠失は、ヌクレオチド３４６９０から３７３６９までにわたり（配列番号１３）；
ＰａｎＡｄ２ Ｅ４欠失は、ヌクレオチド３４６９６から３７４００までにわたり（配列番号６２）；
ＰａｎＡｄ３ Ｅ４欠失は、ヌクレオチド３４６９０から３７３６９までにわたる（配列番号６３）。
【０１７５】
欠失領域は全てのＰａｎＡｄ Ｅ４ ｏｒｆを含有する一方で、Ｅ４固有のプロモーター及びポリアデニル化シグナルは欠失していなかった。
【０１７６】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ｐｏｌｙＡ）をベースとするＨＩＶ ｇａｇ及びＨＣＶ ＮＳ領域発現カセットを、Emini et al.の国際公開第０３／０３１５８８号に記載されるように構築し、ＨＣＭＶ及びＢｇｈ ｐｏｌｙＡのＤＮＡ配列間の相同性を利用した大腸菌株ＢＪ５１８３における相同組換えによってＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ ΔＥ１ ＥＧＦＰベクターに挿入した。
【０１７７】
Ｖ．ＣｈＡｄ５５ ＤＥ１発現ベクターの構築及びレスキュー
ＣｈＡｄ５５のクローニングのためのシャトルベクターの構築
ＣｈＡｄ５５シャトルを、ＰａｎＡｄベクターについて上記で記載したものと同じ戦略に従うことによって構築した後、ＣｈＡｄ５５ウイルスゲノムのクローニングに使用した。この目的で、ウイルスゲノムの右端及び左端を含有するシャトルベクターｐＡＲＳ ＣｈＡｄ５５（ＩＴＲ遺伝子からｐＩＸ遺伝子までの左端からＥ１領域を欠失させ、発現カセットで置換した）を、ＡｓｃＩ制限酵素で線状化し、ＣｈＡｄ５５精製ウイルスＤＮＡと共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。ｐＩＸ遺伝子から、線状化ｐＡＲＳ ＣｈＡｄ５５及びＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７精製ウイルスゲノムＤＮＡの末端に存在する右側のＩＴＲまでのＤＮＡ配列間の相同組換えによって、Ｅ１領域を同時に欠失させることによるプラスミドベクターへのそれらの挿入が可能となった。チンパンジーアデノウイルス５５（ＣｈＡｄ５５）ゲノムのクローニング戦略の図を図４に提示する。
【０１７８】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ｐｏｌｙＡ）をベースとする発現カセットを、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子、ＨＣＶ ＮＳ遺伝子を発現するように構築した。全ての発現カセットを、相同組換えによってΔＥ１アデノウイルスプレプラスミドに移動するようにｐＡＲＳ ＣｈＡｄ５５ベクターの単一のＳｎａＢＩ部位に挿入した。
【０１７９】
実施例３：免疫化実験
ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ベクターの潜在的組換えワクチンとしての有効性を、マウスにおいてＨＩＶ ｇａｇ形質導入遺伝子を発現するベクターを用いて評価した。ＣｈＡｄ５５ ｇａｇのベクター効力を、並行して行った免疫化実験においてヒトＡｄ５ ｇａｇと比較した。１０匹の動物の群について、大腿四頭筋に１０８ｖｐ／マウスのベクター用量でＡｄ５ ｇａｇ又はＣｈＡｄ５５ ｇａｇを注射した（図５Ａ）。別個の実験においては、５匹の動物の群に、１０８ｖｐ／マウスのベクター用量でＡｄ５ ｇａｇ又はＰａｎＡｄ１ ｇａｇ、ＰａｎＡｄ２ ｇａｇ及びＰａｎＡｄ３ ｇａｇを注射した（図５Ｂ）。ＣｈＡｄ７３ ｇａｇ、ＣｈＡｄ８３ ｇａｇ、ＣｈＡｄ１４６ ｇａｇ及びＣｈａｄ１４７ ｇａｇの効力を、ＣｈＡｄ５５ ｇａｇと並行して、５匹のマウスの群を１０８ｖｐ／マウスのベクター用量で免疫化することによって同様に決定した（図５Ｃ）。ＨＩＶ ｇａｇに対して引き起こされる免疫応答を、脾細胞に対するインターフェロン−γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定した。ヒトＡｄ５ ｇａｇベクターと比較した、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、並びにＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３を用いた免疫化実験の結果から、本発明の新規のアデノウイルスが、特異的免疫応答を引き起こす上で、従来技術の組換えアデノウイルスＡｄ５と少なくとも同程度効果的であることが示される。
【０１８０】
実施例４：中和研究
ヒト血清におけるナミチンパンジーアデノウイルス５５、７３、８３、１４６、１４７並びにボノボアデノウイルス１型、２型及び３型に対する中和抗体の陽性率を評価するために中和アッセイを行った。このアッセイによって、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を運搬して、ヒト２９３細胞に形質導入するＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３の能力に対する血清プレインキュベーションの影響を評価した。中和力価は、血清の非存在下でウイルスを有する陽性対照において観察される、ＳＥＡＰ活性の５０％の低減をもたらす血清の希釈率として定義される。各々の血清試料を様々な希釈率（１８倍希釈から始め、４倍ずつ増加させて４６０８倍までの５つ）で試験した。試料を３７℃で１時間プレインキュベートした後、９６ウェルプレートに播種した２９３細胞（３×１０４細胞／ウェル）に添加した。ヒト血清パネルを中和活性について試験した。並行して、同じパネルをＡｄ５、並びにチンパンジー及びボノボＡｄ ＳＥＡＰベクターについて試験した。結果を図６に提示する。この結果から、チンパンジーアデノウイルスに対する血清陽性率が、ヒトアデノウイルスＡｄ５よりも低いことが示される。しかしながら、概して、既に記載されたＣｈＡｄ（ＣＶ−６８）に対する中和抗体の存在を、被験体のサブセットにおいて検出することができる。対照的に、これまでに試験された全てのヒト血清は、ＣｈＡｄ５５、並びにＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３を非常に低い力価であっても中和することができなかった。同じことがＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７についても観察された。したがって、新規のアデノウイルス分離株ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、並びにＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３は、一般的なヒトＡｄ血清型（Ａｄ５等）ベースのウイルスベクターの投与を制限する、既存の抗ヒトＡｄ免疫の問題に対する理想的な解決策を示す。
【０１８１】
実施例５：Ａｄ５ベクターと比較したＰａｎＡｄ１ベクター及びＰａｎＡｄ３ベクターの免疫化効率
ＰａｎＡｄ１ベクター及びＰａｎＡｄ３ベクターの潜在的な組換えワクチンとしての有効性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原を発現するベクター及び癌抗原を発現するベクターを用いて評価した。ＨＳＶ Ａｇ及び癌Ａｇを発現するＰａｎＡｄ１及びＰａｎＡｄ３のベクター効力を、ヒトＡｄ５ベースの対応するベクターと比較した。
【０１８２】
抗ウイルス効力を評価するために、９つのＢＡＬＢ／ｃマウス群について、漸増用量（１０７ｖｐ／マウスから始めて１０９ｖｐ／マウスまで）のベクターを、ＰａｎＡｄ１−ＨＳＶ、ＰａｎＡｄ３−ＨＳＶ及びＡｄ５−ＨＳＶと並行して大腿四頭筋に注射した（図７Ａを参照されたい）。ＨＳＶ抗原に対して引き起こされる免疫応答を、抗原の全アミノ酸配列を含むペプチドプールと共にインキュベートしたマウス脾細胞に対するインターフェロン−γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定した。ヒトＡｄ５ベクターと比較した、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３を用いた免疫化実験の結果を図７に報告するが、本発明の新規のアデノウイルスが試験した各々の濃度で、特異的免疫応答を引き起こす上で従来技術の組換えアデノウイルスＡｄ５よりも効果的であることが示された。このことは、ＰａｎＡｄ１ベクター及びＰａｎＡｄ３ベクターで免疫化したマウスにおいて観察される抗原特異的Ｔ細胞が、より高頻度であることによって明らかに実証される。
【０１８３】
ＰａｎＡｄベクターが抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き起こす効率を、漸増用量（１０７ｖｐ／マウスから始めて１０９ｖｐ／マウスまで）のベクターを大腿四頭筋に注射することによってＢＡＬＢ／ｃマウスの群を免疫化することで評価した。２つのＢＡＬＢ／Ｃマウス群に、１０７ｖｐ／マウス及び１０９ｖｐ／マウスで腫瘍抗原を発現するＡｄ５ベクターを注射した。並行して、３つのＢＡＬＢ／ｃマウス群を、同じ腫瘍抗原を運搬する１０７ｖｐ、１０８ｖｐ、１０９ｖｐのＰａｎＡｄ１ベクター又はＰａｎＡｄ３ベクターで免疫化した。Ｔ細胞応答を、マッピングされたＣＤ８エピトープを示す単一のペプチドを用いて、脾細胞に対するインターフェロン−γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定した。図７Ｂに示される結果から、ＰａｎＡｄベクターで免疫化した動物群において、Ａｄ５ベクターで免疫化した動物群と比較して、最も低いワクチン用量で応答する動物の頻度がより高く、抗原特異的Ｔ細胞の頻度がより高いことが実証される。
【０１８４】
実施例６：ＰａｎＡｄベクターでのカニクイザルの免疫化
３匹のカニクイザルの２つの群を、異種プライム／ブースト計画でＣｓＣｌ精製ＰａｎＡｄ１及びＰａｎＡｄ３を筋肉内注射することによって免疫化した。群１の各々の動物には１０８ｖｐの用量、群２の動物には１０１０ｖｐの用量のＰａｎＡｄ３ Ｇａｇベクターを、０週目に三角筋に注射した。次いで、１３週目に両群の全ての動物を、１０１０ｖｐのＰａｎＡｄ１ Ｇａｇの単回投与によってブーストした。
【０１８５】
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって種々の時点でＣＭＩを測定した。このアッセイによって、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球応答が測定される。ＨＩＶ Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列に基づくペプチドを、これらのアッセイに使用するために調製し、アデノウイルスベクターをワクチン接種したサルにおける免疫応答を測定した。個々のペプチドは、１０個のアミノ酸によって相殺される重複する２０ｍｅｒである。
【０１８６】
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、抗原特異的Ｔリンパ球応答の定量的決定がもたらされる。ＰＢＭＣを段階希釈し、抗アカゲザルＩＦＮ−γ抗体（ＭＤ−１，U-Cytech）をコーティングしたマイクロプレートのウェルに入れた。これをＨＩＶ Ｇａｇペプチドプールと共に２０時間培養すると、前駆細胞の再刺激及びＩＦＮ−γの分泌が得られる。細胞を洗い流して、細胞が位置する集中領域において抗体コーティングウェルに結合した分泌ＩＦＮを残した。捕捉されたＩＦＮは、ビオチン化抗アカゲザルＩＦＮ抗体（検出Ａｂ、U-Cytech）、続いてアルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（Pharmingen，１３０４３Ｅ）を用いて検出される。不溶性アルカリフォスファターゼ基質の添加によって、細胞が位置していた部位のウェルに暗いスポットが生じ、ＩＦＮ−γを分泌したＴ細胞と同じ数のスポットが残る。
【０１８７】
ウェル当たりのスポットの数は、抗原特異的Ｔ細胞の前駆体頻度と直接関係する。γインターフェロンは最も一般的であり、活性化Ｔリンパ球によって合成及び分泌される最も豊富なサイトカインの１つであるため、このアッセイにおいて（特異的抗γインターフェロンモノクローナル抗体を用いて）可視化するサイトカインとして選択した。このアッセイについては、ＰＢＭＣ１００万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を、ペプチド抗原の存在下及び非存在下（媒体対照）で試料について決定する。１回目の投与後及び２回目の投与後の種々の時点で得られる、ＰＢＭＣに対するカニクイザルによるデータを図８に示す。両方の投与の時点でＰａｎＡｄ３によってプライミングした全ての動物が、ＨＩＶ Ｇａｇに対するＴ細胞応答を示し、２回目のＰａｎＡｄ１の注射によって効率的にブーストされ、ヘキソン、ペントン及びファイバーの配列アラインメントによって既に示唆されているように、ＰａｎＡｄ１及びＰａｎＡｄ３が、異種プライム−ブースト免疫化計画において組み合わせることのできる異なる血清型であることが実証される。したがって、本発明の別の態様では、異種プライム−ブースト免疫化への本発明の２つの組換えアデノウイルスの使用が提供され、この場合、本発明の２つの組換えアデノウイルスは異なるアデノウイルス血清型、最も好ましくは本明細書中で記載されるＰａｎＡｄ１及びＰａｎＡｄ３である。
【０１８８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清陽性率が改善された新規のアデノウイルス株に関する。一態様では、本発明はヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質等のアデノウイルスカプシドタンパク質の単離ポリペプチド、並びにその断片、並びにそれをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明による単離ポリヌクレオチドを含むベクター、並びに本発明による単離ポリヌクレオチド又は単離ポリペプチドを含むアデノウイルス、並びに上記ベクター、アデノウイルス、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む医薬組成物も提供される。本発明は、疾患の療法又は予防法への単離ポリヌクレオチド、単離ポリペプチド、ベクター、アデノウイルス及び／又は医薬組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルス（Ａｄ）は、非エンベロープ正２０面体カプシド構造を有する、両生類、鳥類及び哺乳類に見られる二重鎖ＤＮＡウイルスの大きなファミリーを構成している（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスは宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、幾つかの哺乳動物種の多数の細胞型（分裂細胞及び非分裂細胞の両方を含む）に形質導入することができる。
【０００３】
概して、アデノウイルスＤＮＡは典型的には非常に安定であり、形質転換又は腫瘍形成が起こらない限り、エピソーム性（例えば染色体外性）であり続ける。加えて、アデノウイルスベクターは、臨床グレードの組成物の製薬規模の生産に容易に適用可能である、明確に定義された生産システムにおいて高収率で増殖させることができる。これらの特性及びよく特徴付けられたその分子遺伝学のために、組換えアデノウイルスベクターはワクチン担体としての使用に対する有力な候補である。組換えアデノウイルスベクターの生産は、機能しないように欠失させた又は改変したアデノウイルス遺伝子産物の機能を補完することが可能なパッケージング細胞株の使用に依存し得る。
【０００４】
現在、よく特徴付けられた２つのヒト亜群Ｃアデノウイルス血清型（すなわち、ｈＡｄ２及びｈＡｄ５）が、遺伝子療法に使用される大半のアデノウイルスベクターのウイルス骨格の供給源として広く使用されている。複製欠損ヒトアデノウイルスベクターも、様々な感染因子に由来する様々な免疫原の送達のためのワクチン担体として試験されている。実験動物（例えば齧歯類、イヌ及び非ヒト霊長類）において行われた研究から、免疫原及び他の抗原をコードする導入遺伝子を運搬する組換え複製欠損ヒトアデノウイルスベクターが、導入遺伝子産物に対する体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を引き起こすことが示される。概して、研究者らは、免疫応答を引き起こすことが予想される組換えアデノウイルスベクターを高用量で利用する免疫化プロトコルを用いるか、又は異なる血清型に由来するが、同じ導入遺伝子産物を運搬するアデノウイルスベクターの連続投与をブースト免疫化として採用する免疫化プロトコルを用いることにより、非ヒト実験系においてヒトアデノウイルスベクターをワクチン担体として使用することの成功を報告している（非特許文献５）。
【０００５】
ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ベースのウイルスベクターが、種々の遺伝子療法及びワクチン適用に対して開発されている。Ａｄ５ベースのベクターは動物モデルにおいては極めて効率的であるが、ヒトにおいてＡｄ５野生型ウイルスに対する既存の免疫が存在することが、遺伝子形質導入の効率を低下させることが臨床試験において実証されている。特に、Ａｄ５ベクターに基づくワクチン臨床試験に参加する被験体において、２００を超える中和抗体力価で、免疫化効率の明らかな低下が実証された。Ａｄ５ベクターワクチン（vectored vaccine）の最も広範な特性化は、Merckによって行われたＨＩＶワクチンのＳＴＥＰ試験において得られた（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Straus, Adenovirus infections in humans; The Adenoviruses, 451-498,1984
【非特許文献２】Hierholzer et al.,J. Infect. Dis., 158: 804-813, 1988
【非特許文献３】Schnurr and Dondero, Intervirology., 36:79-83, 1993
【非特許文献４】Jong et al., J. Clin. Microbiol., 37: 3940-3945: 1999
【非特許文献５】Mastrangeli, et.al., Human Gene Therapy, 7: 79-87 (1996)
【非特許文献６】Moore JP et al. Science. 2008 May 9; 320(5877): 753-5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このワクチン研究は、ＨＩＶ感染リスクの高い被験体における概念研究を証明するものとして、異なるＨＩＶ抗原を発現する３つのＡｄ５ベクターの同時注入に基づいていた。このデータによって驚くべきことに、予防効果ではなく、ワクチン接種した被験体（Ａｄ５に対する既存の免疫を有する）におけるＨＩＶ感染率の増加が明らかとなった。この矛盾した観察結果についての機構は未だ明らかではないが、この結果から、健常な被験体におけるワクチン適用に対して、ヒト起源のアデノウイルスをベースとするベクターの安全性及び効率に関するさらなる問題が提起された。種々のワクチン療法及び遺伝子療法においてこれまでに得られた全ての結果を総合すると、Ａｄ５ベクターを用いた試験等の臨床試験において、ヒトにおける既存の免疫が非常に低いか、又は存在しないことを特徴とするアデノウイルスの必要性が高まっている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本発明は、アデノウイルスファイバータンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、アデノウイルスヘキソンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドに関する：
（ａ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００１０】
本発明によりアデノウイルスペントンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドも提供される：
（ａ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００１１】
本発明はまた、上で概説した本発明による単離ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むポリヌクレオチドにも関する。本発明はさらに、本発明による単離ポリヌクレオチド、又はその機能的誘導体によってコードされる単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１３】
本発明による単離ポリヌクレオチド、及び／又は少なくとも１つの本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを含む組換えアデノウイルス、好ましくは複製不全アデノウイルスも提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、アジュバント及び以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つを含む組成物である：
（ｉ）１つ又は複数の本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；
（ｉｉ）本発明による単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明によるベクター；
（ｉｖ）本発明による組換えアデノウイルス；及び、
任意で、薬学的に許容可能な賦形剤。
【００１５】
本発明はさらに、以下のものの少なくとも１つを含む細胞に関する：
（ｉ）１つ又は複数の本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；
（ｉｉ）本発明によるの単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明によるベクター；
（ｉｖ）本発明による組換えアデノウイルス。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、疾患の療法又は予防法への、本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；本発明による単離ポリヌクレオチド；本発明によるベクター；本発明による組換えアデノウイルス；及び／又は本発明による組成物の使用に関する。
【００１７】
以下の図面は本発明の一例にすぎず、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定するとは決して解釈されるべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、本発明の様々なアデノウイルス分離株のヘキソンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。上記新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のヘキソンタンパク質が示される。超可変ドメイン１〜７が、それぞれ「ＨＶＲ１〜６」及び「ＨＶＲ７」として表される。
【図１−２】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、本発明の様々なアデノウイルス分離株のヘキソンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。上記新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のヘキソンタンパク質が示される。超可変ドメイン１〜７が、それぞれ「ＨＶＲ１〜６」及び「ＨＶＲ７」として表される。
【図１−３】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、本発明の様々なアデノウイルス分離株のヘキソンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。上記新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のヘキソンタンパク質が示される。超可変ドメイン１〜７が、それぞれ「ＨＶＲ１〜６」及び「ＨＶＲ７」として表される。
【図１−４】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、本発明の様々なアデノウイルス分離株のヘキソンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。上記新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のヘキソンタンパク質が示される。超可変ドメイン１〜７が、それぞれ「ＨＶＲ１〜６」及び「ＨＶＲ７」として表される。
【図２−１】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のファイバータンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図２−２】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のファイバータンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図２−３】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のファイバータンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図３−１】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のペントンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図３−２】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のペントンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図３−３】Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗをデフォルト設定で用いた、アデノウイルスＣｈＡｄ５５及びさらなる新規のチンパンジーアデノウイルス分離株（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７として表される）のペントンタンパク質間の多重配列アラインメントを示す図である。
【図４】野生型ウイルスゲノム及び対応するシャトルプラスミドとの相同組換えによる複製欠損アデノウイルスベクターの構成図である。実施例２も参照されたい。
【図５−１】ＨＩＶ ｇａｇタンパク質の発現のための発現カセット（配列番号１）を含む、組換えアデノウイルスをワクチン接種したマウスにおける細胞性免疫応答を示す図である。組換えヒトＡｄ５及びチンパンジーＣｈＡｄ５５のワクチン接種効力を比較した。免疫応答は、Ｂａｌｂ／ＣマウスにおいてマッピングされたＣＤ８ ＨＩＶ ｇａｇエピトープを有する細胞をインキュベートすることによる、インターフェロン−γ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって測定した。結果は、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞の数として報告した。
【図５−２】ＨＩＶ ｇａｇタンパク質の発現のための発現カセット（配列番号１）を含む、組換えアデノウイルスをワクチン接種したマウスにおける細胞性免疫応答を示す図である。組換えヒトＡｄ５並びにボノボＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３アデノウイルスのワクチン接種効力を比較した。免疫応答は、Ｂａｌｂ／ＣマウスにおいてマッピングされたＣＤ８ ＨＩＶ ｇａｇエピトープを有する細胞をインキュベートすることによる、インターフェロン−γ ＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって測定した。結果は、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞の数として報告した。
【図６】ヨーロッパ人起源のヒト血清のパネルに対し、新規のアデノウイルスベクターの血清陽性率を評価した結果を示す図である。ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）及びチンパンジーアデノウイルスＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３及びＣＶ−６８の血清陽性率を、同じパネルに対し並行して評価した。データは免疫発生（immunoprevalence）を示す被験体の％として表す。中和抗体はＡｄ５及びＣＶ−６８アデノウイルスについてのみ検出され、本発明の新規のアデノウイルスのいずれについても検出されなかった。
【図７−１】ＢＡＬＢ／ｃマウスのＰａｎＡｄ ＨＳＶ免疫化を示す図である。
【図７−２】ＢＡＬＢ／ｃマウスのＰａｎＡｄ癌Ａｇ免疫化を示す図である。
【図８】プライミング／ブーストワクチン接種実験における、カニクイザル（Macaca fascicularis）のＰａｎＡｄ ＨＩＶ ｇａｇ免疫化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明を下記で詳細に説明する前に、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコル及び試薬は変わることがあるため、本発明がこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書中で使用される専門用語が、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。特に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２０】
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel,Switzerland)に記載されるように、"Pharmaceutical Substances:Syntheses, Patents, Applications" Axel Kleemannand Jurgen Engelによる, Thieme Medical Publishing, 1999、"MerckIndex: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals",Susan Budavari et al.編, CRCPress, 1996、及びUnited States Pharmacopeia-25/NationalFormulary-20, the United States PharmcopeialConvention, Inc., Rockville Md.により出版, 2001に記載されるように定義される。
【００２１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という語、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等の変化形は、記載の特徴、整数若しくは工程、又は特徴、整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の特徴、整数若しくは工程、又は特徴、整数若しくは工程の群を排除することを意味しないことが理解されよう。以下の節では、本発明の種々の態様がより詳細に定義される。そのように定義される各々の態様は、そうではないことが明らかに示されない限り、任意の他の態様（単数又は複数）と組み合わせてもよい。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴を、好ましい又は有利であると示される任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合わせてもよい。
【００２２】
幾つかの文献が本明細書の本文全体を通して引用される。上記又は下記を問わず本明細書中に引用される各々の文献（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、取扱説明書等を含む）は、その全体が参照により本明細書中に援用される。本明細書中の記載のいずれも、本発明が先行発明に基づいてかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。
【００２３】
以下で、本明細書中で頻繁に使用される用語の定義を幾つか提示する。これらの用語は、その使用の各々の例において、本明細書の残りの部分で、それぞれ定義される意味及び好ましい意味を有するものとする。
【００２４】
概して、アデノウイルスゲノムはよく特徴付けられている。同様に位置した特異的オープンリーディングフレーム、例えば各々のウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子の位置に関して、アデノウイルスゲノムの全体構成の全体的保存が見られる。アデノウイルスゲノムの各々の末端（extremity）は、ウイルス複製に必要とされる逆方向末端反復（ＩＴＲ）として知られる配列を含む。ウイルスは、感染性ビリオンを産生するのに必要とされる一部の構造タンパク質のプロセシングに必要とされるウイルスコードプロテアーゼも含んでいる。アデノウイルスゲノムの構造は、宿主細胞への形質導入に続いてウイルス遺伝子が発現される順序に基づいて記載される。より具体的には、ウイルス遺伝子は、転写がＤＮＡ複製の開始の前に起こるか、又は後に起こるかに応じて初期（Ｅ）遺伝子又は後期（Ｌ）遺伝子と称される。形質導入の初期段階では、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４遺伝子がウイルス複製に向けた宿主細胞の準備をするために発現される。感染の後期においては、ウイルス粒子の構造成分をコードする後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５の発現が活性化される。
【００２５】
以下の表１は、本明細書中で言及される配列の概要を提示するものである：
【００２６】
【表１】
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「単離（isolated）」分子という用語は、それが天然に関連する他の分子を実質的に含まない分子を指す。単離した分子はしたがって、天然で、すなわち実験的状況の外部で生きている動物においてそれが接近又は接触し得る他の分子を含まない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「ペプチド（peptides）」及び「ポリペプチド（polypeptides）」という用語は、全体を通して区別なく使用される。これらの用語は天然ペプチド、例えば天然タンパク質、及び天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を含み得る合成ペプチドの両方を指す。ペプチドは、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸の側鎖又は遊離アミノ末端若しくはカルボキシ末端を修飾することによって化学修飾されていてもよい。この化学修飾には、さらなる化学的部分の付加及びアミノ酸の側鎖中の官能基の修飾（グリコシル化等）が含まれる。ペプチドは、好ましくは少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は少なくとも１００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも８個又は少なくとも３０個のアミノ酸を有する重合体である。本明細書中で開示されるポリペプチド及びタンパク質はアデノウイルスに由来するため、本明細書中で使用される単離ポリペプチド又は単離タンパク質の分子量は２００ｋＤａを超えないことが好ましい。
【００２９】
「ベクター」という用語は、本明細書中で使用される場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（例えば、従来技術、例えば国際公開第２００５／０７１０９３号から知られる非複製Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ２６、Ａｄ３５、Ａｄ４９、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２ベクター又は複製可能Ａｄ４及びＡｄ７ベクター）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えばＡＡＶ５型）、αウイルスベクター（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）及びＶＥＥ−ＳＩＮキメラ）、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えばワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ＮＹＶＡＣ（ワクシニアウイルスコペンハーゲン株に由来する）、並びにアビポックスウイルスベクター：カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ）ベクター及び鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）ベクター）及び水疱性口内炎ウイルスベクター等のウイルスベクター、ウイルス様粒子又は細菌胞子を含む当業者に既知の任意のベクターを含む。ベクターには、発現ベクター、クローニングベクター、及び宿主細胞において組換えアデノウイルスを生成するのに有用なベクターも含まれる。
【００３０】
「発現カセット」という用語は、その転写調節配列及び翻訳調節配列と共に発現される少なくとも１つの核酸配列を含む核酸分子を指す。発現カセットを変更することによって、それが組み込まれるベクターに別の配列又は配列の組み合わせの発現を指示させる。制限部位（５’末端及び３’末端に存在するように改変することが好ましい）のために、カセットは容易に挿入、除去するか、又は別のカセットと置き換えることができる。好ましくは、発現カセットは、下記でさらに記載されるプロモーター、開始部位及び／又はポリアデニル化部位等の所与の遺伝子の効率的な発現のためのｃｉｓ調節要素を含む。
【００３１】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方、すなわち、抗原又はハプテンに結合することが可能な任意の免疫グロブリンタンパク質又はその一部分を指す。抗原結合部分は組換えＤＮＡ技法、又は無傷抗体の酵素的切断若しくは化学的切断によって作製することができる。幾つかの実施形態では、抗原結合部分はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）変異体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体（diabodies）、及びポリペプチドに特異的抗原結合をもたらすのに十分な抗体の少なくとも一部分を含有するポリペプチドを含む。
【００３２】
本発明の文脈内で哺乳動物において免疫応答を誘発する／発生させるための免疫原／抗原の投与は「プライミング」と称され、哺乳動物において上記免疫原／抗原に対する免疫応答を増強するための免疫原／抗原、例えば特定の病原体（ビリオン又はウイルス病原体、病原性細菌の抗原又は腫瘍抗原等）の投与は「ブースト」と称される。「異種プライム−ブースト」という表現は、哺乳動物において免疫応答を誘発する／発生させる（プライミング）ためのベクターと、哺乳動物において免疫応答を増強する（ブースト）ためのベクターとが異なることを意味する。「異種プライム−ブースト」は被験体、例えば患者が第１のベクターに対する抗体を既に生じており、ブーストが必要とされる場合に有用である。したがって、異種プライム−ブーストの好ましい実施形態では、例えばワクチン接種及び／又は遺伝子療法のために２つの異なるアデノウイルスが使用され得る。この文脈においては、第１のアデノウイルスによるプライミングにおいて誘発される抗体応答によって、ブーストのために投与される第２のアデノウイルス粒子の７０％超、又は好ましくは８０％超が、プライミング及びブーストを受けた動物の細胞の核内に侵入することが妨げられない場合、第１及び第２のアデノウイルスは十分に異なるとされる。
【００３３】
「複製可能」組換えアデノウイルス（ＡｄＶ）という用語は、細胞中に含まれる任意の組換えヘルパータンパク質の非存在下で、宿主細胞において複製することのできるアデノウイルスを指す。好ましくは、「複製可能」アデノウイルスは、以下の無傷の又は機能的に必須の（functional essential）初期遺伝子を含む：Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４。特定の動物から単離した野生型アデノウイルスは、その動物において複製可能である。
【００３４】
「複製欠損」組換えＡｄＶという用語は、少なくとも機能的欠失、すなわち遺伝子を完全に除去することなくその遺伝子の機能を損なう欠失、例えば人工停止コドンの導入、活性部位若しくは相互作用ドメインの欠失若しくは突然変異、遺伝子の調節配列の突然変異若しくは欠失等、又はウイルス複製に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４から選択されるアデノウイルス遺伝子の１つ又は複数等）の完全除去を含むように改変されたために複製不能となったアデノウイルスを指す。本発明の組換えチンパンジーアデノウイルスベクターは好ましくは複製欠損である。
【００３５】
「同一性」又は「同一な」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質の配列との関連では、最大一致でアラインメントした場合に２つの配列中の残基数が同一であることを指す。具体的には、２つの配列の配列同一度（percent sequence identity）は、核酸配列であるか又はアミノ酸配列であるかを問わず、アラインメントした２つの配列間の完全な一致の数を短い方の配列の長さで除し、１００を乗じたものである。２つの配列をアラインメントするために使用することのできるアラインメントツールは当業者に既知であり、例えばワールドワイドウェブ、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）上で得ることができる。２つの配列間のアラインメントは標準的な設定、ＡｌｉｇｎについてはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、好ましくはＭａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を用いて実行することができる。満足のいくアラインメントを得るには、いずれかの配列にギャップを挿入する必要があり得ることが、当業者には理解される。２つのポリペプチド間の「最良の配列アラインメント」は、最大数のアラインメントした同一残基をもたらすアラインメントとして定義される。
【００３６】
アデノウイルス
アデノウイルス（Ａｄ）は、幾つかの鳥類及び哺乳類の宿主において同定された非エンベロープ正２０面体ウイルスである。ヒトアデノウイルス（ｈＡｄ）は、既知の全てのヒトＡｄ及び動物（例えばウシ、ブタ、イヌ、マウス、ウマ、サル及びヒツジ）起源の多くのＡｄを含むマストアデノウイルス属に属する。ヒトアデノウイルスは概して、ラット赤血球及びアカゲザル赤血球の血球凝集特性、ＤＮＡ相同性、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含有率並びに発癌性を含む多数の生物学的、化学的、免疫学的及び構造的基準に基づいて、６つの亜群（Ａ〜Ｆ）に分けられる（Straus, 1984, The Adenoviruses中, ed. H.Ginsberg, pps. 451-498, New York: PlenusPress、及びHorwitz, 1990; Virology中, eds. B. N. Fields and D.M. Knipe, pps. 1679-1721）。
【００３７】
アデノウイルスビリオンは正２０面体対称性を有し、その直径は血清型に応じて６０ｎｍ〜９０ｎｍである。正２０面体カプシドは、ヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ＩＩＩ）及び突出した（knobbed）ファイバー（ＩＶ）タンパク質という３つの主要タンパク質から構成される（W.C. Russel, J. Gen.Virol.,81: 2573-2604 (2000)）。ヒトにおいて観察される既存の免疫の一態様は体液性免疫であり、アデノウイルスタンパク質に特異的な抗体の産生及び存続をもたらし得る。アデノウイルスによって引き起こされる体液性応答は、主に３つの主要構造タンパク質：ヘキソン、ペントン及びファイバーに向けられる。
【００３８】
これまでに５１個の異なるヒトアデノウイルス血清型が認識され、それらの血球凝集特性、並びに生物物理学的及び生化学的基準に基づいて亜群に分類されている。公表された報告によって、複数の血清型に対する抗体を含む力価が一般的であり（Dambrosio, E.(1982) J. Hyg. (London) 89: 209-219）、力価の大部分が中和活性を有することが確立されている。
【００３９】
先述のように、組換えアデノウイルスは遺伝子療法において、また、ワクチンとして有用である。チンパンジーアデノウイルスベースのウイルスベクターは、遺伝子ワクチンの開発のためのヒト由来Ａｄベクターの使用に代わるものである（Farina SF, J Virol. 2001 Dec; 75(23): 11603-13.、Fattori E, Gene Ther. 2006 Jul; 13(14): 1088-96）。チンパンジーから単離したアデノウイルスは、ヒト起源の細胞におけるそれらの効率的な増殖によって実証されるように、ヒトから単離したアデノウイルスと近縁関係にある。しかしながら、ヒト及びチンパンジーのアデノウイルスは近縁であるために、この２つのウイルス種間の血清学的交差反応性が予想され得る。
【００４０】
この仮説はチンパンジーアデノウイルスを単離し、特性化することで確認された。それでもなお、チンパンジーに由来するアデノウイルス分離株は、共通するヒトアデノウイルスエピトープの血清型との交差反応性の低減を示した。したがって、チンパンジーアデノウイルス（本明細書中でナミチンパンジー（common chimpanzee）アデノウイルスについては「ＣｈＡｄ」、ボノボチンパンジーアデノウイルスについては「ＰａｎＡｄ」とも略記される）は、共通するヒトアデノウイルスの血清型に対するヒトの既存の免疫に関連した有害作用を低減することの基礎をもたらす。しかしながら、これまでに単離されたチンパンジーアデノウイルスに対して、低度から中程度の中和力価がヒト血清サブセットにおいて検出され、したがってチンパンジーアデノウイルスの既知の全ての血清型は、依存としてヒト血清によって或る程度中和される。
【００４１】
本発明は、新規のチンパンジーアデノウイルス株、すなわちナミチンパンジー（Pan troglodytes）から単離されるＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、並びにボノボ（Pan paniscus）から単離されるＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３を単離することができたという予想外の発見を含む。これら新規の株は全て、ヒトにおいて測定可能な血清陽性率を示さない。すなわち、これらのアデノウイルス株は、試験した全てのヒト血清が中和抗体の存在について完全に陰性であったという点で、これまでに記載されたチンパンジーアデノウイルスの中で例外的なものである。この文脈で中和抗体とは、アデノウイルスのエピトープに結合し、それが宿主細胞において増殖感染を生じるのを防ぐか、又は形質導入遺伝子を発現する複製欠損ベクターによる標的細胞への形質導入を防ぐ（例えば、アデノウイルスＤＮＡは宿主細胞に侵入することが可能である）抗体を指す。従来技術の全てのチンパンジー由来アデノウイルスについて中和抗体が観察されたが、新規のアデノウイルス型ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３は、ヒトにおいてこれらのアデノウイルス型に対する既存の中和抗体が完全に存在しないことを特徴とする。したがって、これらのアデノウイルスによって、例えば免疫化及び／又は遺伝子療法に使用することのできる有益な医学的ツールが提供される。
【００４２】
下記でさらに詳述するように、本発明は一態様において、最も表面露出したアデノウイルスエピトープを示すアデノウイルスカプシドタンパク質、すなわちヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質の新規の配列を提供する。既に述べたように、本発明によるウイルスに特異的な中和抗体はヒト血清中に含まれない。したがって、上述した新規のチンパンジーヘキソン、ペントン及びファイバータンパク質配列の利点の１つは、これらのタンパク質の配列を、例えば医療目的で改変された従来技術のアデノウイルスを増強するために使用することができるということである。例えば、本発明のカプシドタンパク質又はその機能的断片は、例えば主要構造カプシドタンパク質又はその機能的断片の１つ又は複数を、それぞれ異なるアデノウイルス、例えば従来技術のアデノウイルスのものに置き換え／置換して、ヒトにおける血清陽性率が低減した、改良された組換えアデノウイルスを得るために使用することができる。本発明の新規のアデノウイルスは（記載のように再設計したアデノウイルスも）、投与した場合にヒトにおいて有意な抑制性免疫応答を生じることがなく、それらの全体的な導入効率及び感染性は増強される。そのため、このように改良されたアデノウイルスは、宿主細胞への侵入及び抗原カセットの発現が中和抗体の任意の有意な力価によって妨げられないため、例えばより効果的なワクチンであることが予想される。加えて、実施例において示されるように、ＨＩＶ ｇａｇに対する強力な免疫応答がＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３分離株のヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質を含む組換えＨＩＶ−ｇａｇコードアデノウイルスをワクチン接種した未処置（naive）マウスにおいても引き起こされた。ＣｈＡｄ５５−ｇａｇ、ＣｈＡｄ７３−ｇａｇ、ＣｈＡｄ８３−ｇａｇ、ＣｈＡｄ１４６−ｇａｇ、ＣｈＡｄ１４７−ｇａｇ、ＰａｎＡｄ１−ｇａｇ、ＰａｎＡｄ２−ｇａｇ及びＰａｎＡｄ３−ｇａｇアデノウイルスによって引き起こされた免疫応答は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質を発現する従来技術の組換えヒトＡｄ５ベクターをベースとしてこれまでに開発された最も強力なベクターを用いて観察された応答に匹敵する（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ中のＥＬＩｓｐｏｔアッセイのデータを参照されたい）。
【００４３】
先に述べたように、アデノウイルスによって引き起こされる体液性応答は、主に３つの主要アデノウイルス構造タンパク質：ヘキソン、ペントン及びファイバー（これらは全てアデノウイルスカプシドの一部であり、ウイルス粒子の外部に露出したポリペプチド配列を含む）に向けられる（Madisch I, et al.,J. Virol. 2005 Dec; 79(24): 15265-76、及びMadisch I, et al.,J Virol. 2007 Aug; 81(15): 8270-81、及びPichla-Gollon SL,et al., J. Virol. 2007 Feb; 81(4): 1680-9も参照されたい）。
【００４４】
図１に示した多重配列アラインメントにおいて示されるように、本発明のＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７群の新規のアデノウイルス分離株は、非常によく似たヘキソンタンパク質配列を有する。このアラインメントにおいては、ビリオンの外側に位置し、その表面の大部分を覆うヘキソン分子の最上部にあるループ中に生じる超可変領域（ＨＶＲ）も標識される（Jophn J. Rux et. Al, J. of Virology, Sept 2003, vol. 77, no.17を参照されたい）。新規のチンパンジーアデノウイルスのさらなるカプシドタンパク質ファイバー及びペントンの配列関連性が、それぞれ図２及び図３中に提示される。３つ全ての構造カプシドタンパク質が低い血清陽性率に寄与することが予想され、したがってアデノウイルスと既存の中和抗体との親和性を抑制するため、例えば血清陽性率の低減した組換えキメラアデノウイルスを製造するために相互に独立して、又は組み合わせて使用することができる。
【００４５】
それゆえ、第１の態様では、本発明は、アデノウイルスファイバータンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれか、すなわち、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号５０、又は配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれか、すなわち、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号５０、又は配列番号５３に記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び配列番号５３のいずれか、すなわち、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号５０、又は配列番号５３のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００４６】
「アデノウイルスファイバータンパク質」とは、アデノウイルス中に含まれる突出したファイバー（ＩＶ）タンパク質を意味する。好ましい実施形態では、本発明の第１の態様及び下記に記載されるその好ましい実施形態に含まれる単離ポリヌクレオチドは、ファイバータンパク質、又は感染性アデノウイルスビリオンにおいてファイバータンパク質若しくはその断片と同じ機能を有するその機能的誘導体をコードする。したがって、上記ファイバー又は機能的ファイバー誘導体を好ましくはカプシドタンパク質として含む組換えアデノウイルスは、宿主細胞に侵入することが可能である。組換えアデノウイルスが宿主細胞に侵入することができるか否かは、容易に決定することができる。例えば、宿主細胞をアデノウイルスと接触させた後、組換え宿主細胞を洗浄して溶解し、例えばアデノウイルスＲＮＡ及び／又はＤＮＡに特異的な適切なハイブリダイゼーションプローブを用いて、アデノウイルスＲＮＡ及び／又はＤＮＡが宿主細胞中に見られるか否かを決定することができる。代替的又は付加的には、宿主細胞を組換えアデノウイルスと接触させた後、洗浄して溶解し、例えばウエスタンブロットを用いてアデノウイルス特異的抗体によって調べてもよい。さらに別の代替形態では、例えばｉｎ ｖｉｖｏで、宿主細胞において遺伝子産物を発現するのに好適な発現カセットを含む組換えアデノウイルスを感染させた際に、宿主細胞が遺伝子産物、例えば蛍光タンパク質を発現するか否かを観察する。
【００４７】
ファイバータンパク質及びその機能的誘導体が、アデノウイルスペントンタンパク質（配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び／又は配列番号５５等）に対して親和性を有することがさらに好ましい。タンパク質間親和性を試験する方法は当業者には十分理解される。第１のタンパク質が第２のタンパク質（チンパンジー由来アデノウイルスのペントンタンパク質等）に結合することが可能であるか否かを決定するためには、例えば遺伝学的な酵母ツーハイブリッド法、又はプルダウン法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイ若しくはプラズモン共鳴アッセイ等の生化学的アッセイを使用することができる。プルダウン法又はプラズモン共鳴アッセイを用いる場合、生化学の技術分野でよく知られているように、タンパク質の少なくとも１つをＨＩＳタグ、ＧＳＴタグ等のアフィニティータグと融合させることが有用である。そのグリコシル化形態のアデノウイルスファイバータンパク質は、さらに三量化することが可能である。したがって、本発明の第１の態様によるポリヌクレオチドによってコードされるファイバータンパク質又はその断片が、グリコシル化する及び／又は三量体を形成することが可能であることも好ましい。
【００４８】
本願全体を通して使用される場合、タンパク質又はポリペプチドの「機能的誘導体」という表現は概して、修飾型のタンパク質又はポリペプチド（例えばタンパク質又はポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸が欠失、挿入、修飾及び／又は置換され得る）を指す。誘導体は、上記でも言及したように、そのカプシド中にこの誘導体を含むキメラアデノウイルスが宿主細胞に感染することが可能な場合、機能的である。さらに、「機能的誘導体」との関連では、挿入とは元のポリペプチド又はタンパク質への１つ又は複数のアミノ酸の挿入を指す。機能的誘導体が１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個又は１００個を超えるアミノ酸変化（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸）を含まないことが好ましい。別の実施形態では、タンパク質又はポリペプチドの全アミノ酸の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％又は２０％以下（最も好ましくは５％以下）しか変化しない（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸である）ことが好ましい。タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸は、修飾、例えば化学修飾されていてもよい。例えば、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸の側鎖又は遊離アミノ末端若しくはカルボキシ末端は、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化等によって修飾されていてもよい。当該技術分野でよく知られているように、化学修飾をｉｎ ｖｉｖｏ、例えば宿主細胞中で行ってもよい。例えば、タンパク質のアミノ酸配列中に存在する好適な化学修飾モチーフ、例えばグリコシル化配列モチーフによってタンパク質をグリコシル化する。誘導体における置換は保存的置換であっても又は非保存的置換であってもよいが、保存的置換が好ましい。幾つかの実施形態では、天然アミノ酸と非天然アミノ酸との交換も置換に含まれる。保存的置換には、アミノ酸を置換されるアミノ酸によく似た化学的性質を有する別のアミノ酸に置換することが含まれる。好ましくは、保存的置換は以下のものからなる群から選択される置換である：
（ｉ）別の異なる塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換；
（ｉｉ）別の異なる酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換；
（ｉｉｉ）別の異なる芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換；
（ｉｖ）別の異なる非極性脂肪族アミノ酸による非極性脂肪族アミノ酸の置換；及び
（ｖ）別の異なる極性非荷電アミノ酸による極性非荷電アミノ酸の置換。
【００４９】
塩基性アミノ酸は好ましくはアルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群から選択される。酸性アミノ酸は好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸である。芳香族アミノ酸は好ましくはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン及びイソロイシンからなる群から選択される。極性非荷電アミノ酸は好ましくはセリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択される。保存的アミノ酸置換に対して、非保存的アミノ酸置換は、上記で概説される保存的置換（ｉ）〜（ｖ）に該当しない或るアミノ酸と任意のアミノ酸との交換である。
【００５０】
機能的誘導体が欠失を含む場合には、誘導体において、参照ポリペプチド又はタンパク質配列中に存在する１つ又は幾つかのアミノ酸が除去されている。しかしながら、欠失は、誘導体が含むアミノ酸が全体で２００個未満になるほど広範囲ではない。
【００５１】
配列同一性を決定する手段は既に上記に記載している。加えて、２つの配列間の同一度は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877の数学アルゴリズムを用いることによっても決定することができる。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のＢＬＡＳＴＮプログラム及びＢＬＡＳＴＰプログラムにも組み込まれている。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを利用する場合、これらのプログラムのデフォルトのパラメータを使用することが好ましい。
【００５２】
先に述べたように、アデノウイルスヘキソンタンパク質の超可変ドメインはアデノウイルスの外部に露出している。そのため中和抗体は、アデノウイルスカプシドのこれらの領域を認識し、結合することができる。したがって、本発明の新規のアデノウイルス分離株の１つに由来するヘキソンタンパク質を含むカプシドを有するアデノウイルスは、ヒトにおける血清陽性率が改善されている、すなわちより低くなっている。それゆえ、第２の態様では、本発明は、アデノウイルスヘキソンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれか、すなわち、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５１、又は配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれか、すなわち、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５１、又は配列番号５４に記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２０〜配列番号２５、配列番号５１及び配列番号５４のいずれか、すなわち、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号５１、又は配列番号５４のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９．９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明の第２の態様及び下記に記載されるその好ましい実施形態に含まれる単離ポリヌクレオチドは、ヘキソンタンパク質、又は感染性アデノウイルスビリオンにおいてヘキソンタンパク質若しくはその断片と同じ機能を有するその機能的誘導体をコードする。したがって、上記ヘキソン又は機能的ヘキソンー誘導体を好ましくはカプシドタンパク質として含む組換えアデノウイルスは、宿主細胞に侵入することが可能である。ヘキソンタンパク質の機能的誘導体を生成するのに好適な方法の１つが、米国特許第５，９２２，３１５号（参照により援用される）に記載されている。この方法では、アデノウイルスヘキソンの少なくとも１つのループ領域を、別のアデノウイルス血清型の少なくとも１つのループ領域に変更する。例えば、本発明のヘキソンタンパク質のループ領域を用いて、従来技術のアデノウイルスの対応するヘキソンループを置換して、改良されたハイブリッドアデノウイルスを生成することができる。同様に（Analogously）、本発明のペントンタンパク質及びファイバータンパク質の誘導体も生成することができる。
【００５４】
第３の態様では、本発明は、アデノウイルスペントンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれか、すなわち、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５２、又は配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれか、すなわち、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５２、又は配列番号５５に記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、上記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２６〜配列番号３１、配列番号５２及び配列番号５５のいずれか、すなわち、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５２、又は配列番号５５のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【００５５】
ペントンタンパク質及びその機能的誘導体が、アデノウイルスファイバータンパク質（配列番号１４〜配列番号１９、配列番号５０及び／又は配列番号５３等）に対する親和性を有することが好ましい。上記に記載されるように、タンパク質間親和性を試験する方法は当業者には十分理解される。「アデノウイルスペントンタンパク質」とは、アデノウイルス中に含まれるペントンベース（ＩＩＩ）タンパク質を意味する。アデノウイルスペントンタンパク質は、正２０面体対称のカプシドの角に局在することを特徴とする。先述のように、本発明の第１、第２及び／又は第３の態様並びに本明細書中で下記に記載されるその好ましい実施形態のポリヌクレオチドの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは１つ又は複数のポリペプチドをコードし、上記１つ又は複数のポリペプチドを好ましくはカプシドタンパク質（複数可）として含む組換えアデノウイルスは、宿主細胞に感染する、すなわち侵入することが可能である。
【００５６】
以下で、本発明の第１、第２及び第３の態様の好ましい実施形態を、本明細書中で開示される新規のチンパンジーアデノウイルス分離株の各々について明記する。
【００５７】
アデノウイルスＣｈＡｄ５５
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００５８】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００５９】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９．９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６０】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えばＡｄ５ゲノムを参照として用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００６１】
アデノウイルスＣｈＡｄ７３
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％若しくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６２】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６３】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６４】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えばＡｄ５ゲノムを参照として用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００６５】
アデノウイルスＣｈＡｄ８３
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【００６６】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６７】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００６８】
最も好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６５からなる配列、又は配列番号６５からなるが、配列番号６５のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４のいずれかを欠いている、最も好ましくは配列番号６５のゲノム領域Ｅ１、Ｅ３及びＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一な、最も好ましくは少なくとも９９％又は１００％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。
【００６９】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えば配列番号６５に示されるＣｈＡｄ８３ゲノムを用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００７０】
アデノウイルスＣｈＡｄ１４６
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
【００７１】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７２】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７３】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えばＡｄ５ゲノムを参照として用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００７４】
アデノウイルスＣｈＡｄ１４７
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７５】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７６】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくと９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７７】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えばＡｄ５ゲノムを参照として用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００７８】
アデノウイルスＰａｎＡｄ１
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００７９】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８０】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８１】
最も好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１３からなる配列、又は配列番号１３からなるが、配列番号１３のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４のいずれかを欠いている、最も好ましくは配列番号１３のゲノム領域Ｅ１、Ｅ３及びＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一な、最も好ましくは少なくとも９９％又は１００％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。
【００８２】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えば配列番号１３に示されるＰａｎＡｄ１ゲノムを用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００８３】
アデノウイルスＰａｎＡｄ２
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８４】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５１のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８５】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８６】
最も好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６２からなる配列、又は配列番号６２からなるが、配列番号６２のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４のいずれかを欠いている、最も好ましくは配列番号６２のゲノム領域Ｅ１、Ｅ３及びＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一な、最も好ましくは少なくとも９９％又は１００％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。
【００８７】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えば配列番号６２に示されるＰａｎＡｄ１ゲノムを用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００８８】
アデノウイルスＰａｎＡｄ３
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスファイバータンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００８９】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくは少なくとも９９．９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００９０】
本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するアデノウイルスペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードし、機能的誘導体は（ｉ）１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個若しくは１００個を超える、好ましくは１０個を超える欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号５５のアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する。
【００９１】
最も好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６３からなる配列、又は配列番号６３からなるが、配列番号６３のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４のいずれかを欠いている、最も好ましくは配列番号６３のゲノム領域Ｅ１、Ｅ３及びＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一な、最も好ましくは少なくとも９９％又は１００％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。
【００９２】
さらなる態様では、本発明は第１の、第２の、第３の、第１及び第２の、第１及び第３の、第２及び第３の、又は第１、第２及び第３の態様を含むポリヌクレオチドに関する。この又はこれらのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、例えば配列番号６３に示されるＰａｎＡｄ１ゲノムを用いた場合に、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを含むことが好ましい。ポリヌクレオチドが、アデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列も含むことが好ましい。
【００９３】
組換えアデノウイルスでは、本発明の第１、第２及び第３の態様、及び本明細書中に開示されるそれぞれの好ましい実施形態によるファイバータンパク質、ヘキソンタンパク質及びペントンタンパク質は各々、個々に上記組換えアデノウイルスと、ヒト及び／又は齧歯類の中和抗体との相互作用の低減に寄与する。したがって、上記本発明のファイバータンパク質、ヘキソンタンパク質及び／又はペントンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、増強された組換えアデノウイルスを構築するのに有用である。したがって、さらなる第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様、本発明の第２の態様及び本発明の第３の態様によるポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの群から選択される、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは３つの単離ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。したがって、最も好ましくは第４の態様は、本発明の第１、第２及び第３の態様を含む単離ポリヌクレオチドである。好ましい実施形態では、本発明の第４の態様によるポリヌクレオチドは：
（ｉ）本発明の第１、第２又は第３の態様による１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（ｉｉ）本発明の第１の態様によるポリヌクレオチド及び本発明の第２の態様によるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明の第１の態様によるポリヌクレオチド及び本発明の第３の態様によるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
（ｉｖ）本発明の第２の態様によるポリヌクレオチド及び本発明の第３の態様によるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；並びに
（ｖ）本発明の第１、第２及び第３の態様によるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドであり、
（ｉ）〜（ｖ）によるポリヌクレオチド中に含まれる上記ポリヌクレオチドが、同じアデノウイルス分離株から選択される、例えばファイバータンパク質、ヘキソンタンパク質及びペントンタンパク質又はその機能的誘導体をそれぞれコードする３つ全てのポリヌクレオチドが、以下のアデノウイルスのうち１つのみに由来することが好ましい：ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３。さらに、本発明の第４の態様又はその好ましい実施形態において、例えば上記に概説されるように、各々の「機能的誘導体」が、１０個、５個又は３個を超えるアミノ酸変化（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸）を含まないことが好ましい。
【００９４】
下記表２では、上記で概説される本発明の第４の態様のポリヌクレオチドの多数の特に好ましい実施形態を挙げている。表２中に示されるポリヌクレオチドＡ１〜ＡＦ１から選択されるポリヌクレオチドが好ましく、この場合、ポリヌクレオチドは本発明の第１、第２及び第３の態様の代替形態（ｃ）による３つのポリヌクレオチドを含み、その各々がアデノウイルスファイバー、ヘキソン及びペントンタンパク質又はその機能的誘導体をそれぞれコードする。下記表２に、上記３つのコードされるタンパク質の各々が、その全長にわたって、同様に表２中に示される配列番号に記載のアミノ酸配列に対して有する必要のある最小配列同一性（すなわち、少なくとも表示の配列同一性）を示す：
【００９５】
【表２】
【００９６】
例えば、上記表１中に示されるような好ましいポリヌクレオチドＡ１は以下のものを含む：
（ｉ）配列番号１４と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号２０と、その全長にわたって少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）配列番号２６と、その全長にわたって少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００９７】
上記で言及したように、表２に挙げられるポリヌクレオチドの上記「機能的誘導体」が、１０個を超えるアミノ酸変化（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸）を含まないことが最も好ましい。
【００９８】
下記表３には、本発明の第４の態様のポリヌクレオチドのさらに好ましい実施形態を挙げている。表３から選択されるポリヌクレオチドＡ２〜Ｊ２から選択されるポリヌクレオチドが好ましく、この場合、ポリヌクレオチドは「ポリヌクレオチド１」、「ポリヌクレオチド２」及び「ポリヌクレオチド３」と表される３つのポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは各々、その全長にわたって、表３中に示される配列番号に記載の対応するポリヌクレオチドに対して少なくとも表示の配列同一性を有する：
【００９９】
【表３】
【０１００】
したがって、例としては、上記表３の好ましい実施形態Ａ２（「Ａ２−ＣｈＡｄ５５」）は以下のものを含むポリヌクレオチドである：
（ｉ）配列番号３２と、その全長にわたって少なくとも９８％同一なポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号３８と、その全長にわたって少なくとも９８％同一なポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）配列番号４４と、その全長にわたって少なくとも９８％同一なポリヌクレオチド。
【０１０１】
下記表４には、上記で概説される本発明の第４の態様のポリヌクレオチドの多数のさらなる特に好ましい実施形態を挙げている。表４中に示されるポリヌクレオチドＡ３〜Ｈ３から選択されるポリヌクレオチドが好ましく、この場合、ポリヌクレオチドは表示の配列番号に記載のアデノウイルスファイバー、ヘキソン及びペントンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、３つ全てのタンパク質及び／又はコードされる機能的誘導体は合計して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個以下、又は１００個を超える、好ましくは２０個以下の欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含む：
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
本発明の第４の態様のポリヌクレオチドの別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表４中に示されるそれぞれの配列番号に記載の同じ株のアデノウイルスファイバー及びヘキソンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードする。本発明の第４の態様のポリヌクレオチドのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、表４中に示されるそれぞれの配列番号に記載の同じ株のアデノウイルスファイバー及びペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードする。本発明の第４の態様のポリヌクレオチドのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、表４中に示されるそれぞれの配列番号に記載の同じ株のアデノウイルスヘキソン及びペントンタンパク質、又はその機能的誘導体をコードする。この文脈では、上記機能的誘導体は各々の場合において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個未満、最も好ましくは３個未満の欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸を含む。
【０１０４】
本発明の第４の態様のさらに好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つからなる配列、又は（ｉｉ）ゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８、Ｅ３ ＯＲＦ９、Ｅ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及び／又はＥ４ ＯＲＦ１の１つ又は複数を欠いている配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５のいずれか１つからなる配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％又は１００％、好ましくは９８％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む。したがって、上述した１つ又は複数のゲノム領域は、好ましくはアラインメントにおいて同一度を決定する際に考慮されない。本発明の単離ポリヌクレオチドの別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５を含むか、又はそれらからなり、この場合、ゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８、Ｅ３ ＯＲＦ９、Ｅ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及びＥ４ ＯＲＦ１の１つ又は複数が、配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のそれぞれから欠失しているか、又は本明細書中で記載されるような異種タンパク質をコードする形質導入遺伝子若しくは発現カセットで置換されている。最も好ましい実施形態では、アデノウイルス領域Ｅ１、Ｅ３及び／又はＥ４は、実施例２においても例示されるように欠失している。表示のゲノム領域の１つ又は複数を欠いている上述の好ましいポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、又は異種タンパク質をコードするかかるポリヌクレオチド配列を含む発現カセットをさらに含んでいてもよい。異種タンパク質をコードする上記ポリヌクレオチド配列、及び異種タンパク質をコードするかかるポリヌクレオチド配列を含む上記発現カセットは、当該技術分野でよく知られ、下記実施例においても記載されるように、例えば本発明のポリヌクレオチドの欠失領域に挿入されていてもよい。上記異種タンパク質は、本明細書中で記載されるような標的細胞への送達のための分子、例えば抗原タンパク質若しくはその断片、好ましくはＨＩＶ ｇａｇタンパク質等の病原体の抗原タンパク質若しくは断片、腫瘍抗原、又は実施例で記載されるように単純ヘルペスウイルスのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。したがって、好ましい実施形態では、本発明による単離ポリヌクレオチドは、ウイルス抗原、病原性細菌の抗原及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗原をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一実施形態では、上記異種タンパク質はしたがって、ＲＮＡウイルス抗原、病原性細菌の抗原及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗原であってもよい。抗原とは、哺乳動物において免疫応答を引き起こすことが可能な任意のタンパク質又はペプチドを指す。抗原は、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、最も好ましくは８個〜１２個のアミノ酸を含む。したがって、配列同一性を決定する際には、ゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４は好ましくはアラインメントにおいて考慮されない。すなわち、アラインメントは、配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５の全配列からなるが、ゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、及び／又は異種ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド、若しくはかかるポリヌクレオチドを含む発現カセットを除外した配列を用いて行われる。上記でも言及されるように、本発明の第４の態様及びその全ての好ましい実施形態によるポリヌクレオチドは、機能的ヘキソン、ペントン及び／又はファイバーカプシドタンパク質、又はその機能的誘導体をコードする（例えば、コードされるタンパク質が、感染性アデノウイルスビリオンにおいてそれぞれのカプシドタンパク質又はその断片と同じ機能を有する）ことが好ましい。したがって、そのカプシド内に上記コードされる組換えペントン、ヘキソン及び／又はファイバータンパク質、又はその機能的誘導体を含む組換えアデノウイルスは、宿主細胞に侵入することが可能である。本発明による、又は本発明のポリヌクレオチドによってコードされるカプシドタンパク質又はその機能的誘導体は、ヒトにおいて血清陽性率を有しないことがさらに好ましい。
【０１０５】
本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチドによって単離タンパク質、すなわち本発明の第１、第２及び／又は第３の態様による単離ポリヌクレオチド又はその機能的誘導体によってコードされる単離アデノウイルスカプシドポリペプチドをさらに提供する。この文脈においては、「機能的誘導体」は一実施形態では、５個、１０個又は２５個以下のアミノ酸変化（すなわち欠失、挿入、修飾及び／又は置換されたアミノ酸）を含む。
【０１０６】
本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチドを含むベクターにさらに関する。
【０１０７】
好ましくは、ベクターはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４からなるゲノム領域の群から選択されるゲノム領域に遺伝子を含まない、及び／又はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４の群から選択されるゲノム領域の少なくとも１つの遺伝子を含み、この場合、上記少なくとも１つの遺伝子は、少なくとも１つの遺伝子を非機能的にする欠失及び／又は突然変異を含む。これらの遺伝子産物の１つを非機能的にする可能性の１つは、１つ又は複数の人工停止コドン（例えばＴＡＡ）をこれらの遺伝子内のオープンリーディングフレームに導入することである。ウイルスを複製欠損にする方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Brody et al, 1994 Ann NY Acad Sci., 716:90-101を参照されたい）。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のヘキソンタンパク質；ペントンタンパク質；ファイバータンパク質；ヘキソンタンパク質及びペントンタンパク質；ヘキソンタンパク質及びファイバータンパク質；ペントンタンパク質及びファイバータンパク質；又はヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、さらなるアデノウイルスポリヌクレオチドをさらに含む。このため、好ましい一実施形態では、本発明による単離ポリヌクレオチドは、以下のものの少なくとも１つを含む：
（ａ）アデノウイルス５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）；
（ｂ）アデノウイルスＥ１ａ領域、又は１３Ｓ領域、１２Ｓ領域及び９Ｓ領域の中から選択されるその断片；
（ｃ）アデノウイルスＥ１ｂ領域、又はスモールＴ領域、ラージＴ領域及びＩＸ領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｄ）アデノウイルスＥ２ｂ領域、又はスモールｐＴＰ領域、ポリメラーゼ領域及びＩＶａ２領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｅ）アデノウイルスＬ１領域、又は２８．１ｋＤタンパク質、ポリメラーゼ、アグノタンパク質、５２／５５ｋＤａタンパク質及びＩＩＩａタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｆ）アデノウイルスＬ２領域、又は本発明のペントンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＬ２領域、又はペントンタンパク質若しくは本発明のペントンタンパク質、ＶＩＩタンパク質、Ｖタンパク質及びＭｕタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｇ）アデノウイルスＬ３領域、又は本発明のヘキソンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＬ３領域、又はＶＩタンパク質、ヘキソンタンパク質若しくは本発明のヘキソンタンパク質、及びエンドプロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｈ）アデノウイルスＥ２ａ領域；
（ｉ）アデノウイルスＬ４領域、又は１００ｋＤタンパク質、３３ｋＤホモログ及びＶＩＩＩタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｊ）アデノウイルスＥ３領域、又はＥ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８及びＥ３ ＯＲＦ９からなる群から選択されるその断片；
（ｋ）アデノウイルスＬ５領域、又は本発明のファイバータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＬ５領域、ファイバータンパク質又は本発明のファイバータンパク質をコードするその断片；
（ｌ）アデノウイルスＥ４領域、又はＥ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及びＥ４ ＯＲＦ１からなる群から選択されるその断片；特に、上記Ｅ４領域のＯＲＦ６、及び／又は
（ｍ）アデノウイルス３’−ＩＴＲ。
【０１０９】
上述したポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、上記でも記載したように、好ましくはポリヌクレオチドが上記に概説されるゲノム領域のＯＲＦ（例えば、実施例２において規定されるような領域Ｅ３及び／又はＥ４等）を含まない、及び／又は少なくとも１つの遺伝子を非機能的にする欠失及び／又は突然変異を含むアデノウイルス遺伝子を含むことが望ましい場合がある。これらの好ましい実施形態では、好適なアデノウイルス領域は上述した遺伝子（複数可）を含まないように、又は選択された遺伝子（複数可）を非機能的にするように修飾される。任意のアデノウイルス遺伝子の欠失は、本明細書中で記載されるようなミニ遺伝子カセット等の形質導入遺伝子を挿入する空間を作り出す。さらに、当該技術分野でよく知られているように、遺伝子の欠失を用いて、パッケージング細胞株又はヘルパーウイルスを使用しない限り複製することが不可能なアデノウイルスベクターを生成することができる。したがって、特定の遺伝子／領域の欠失又は機能喪失突然変異の１つ又は複数を含む、上記に概説されるポリヌクレオチドを含む最終的な組換えアデノウイルスは、例えば遺伝子療法又はワクチン接種に対してより安全な組換えアデノウイルスを提供することができる。
【０１１０】
特に好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは以下のものの少なくとも１つを含む：
（ａ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５のいずれか１つの５’−逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域；
（ｂ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ１ａ領域、又は１３Ｓ領域、１２Ｓ領域及び９Ｓ領域の中から選択されるその断片；
（ｃ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ１ｂ領域、又はスモールＴ領域、ラージＴ領域及びＩＸ領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｄ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ２ｂ領域、又はスモールｐＴＰ領域、ポリメラーゼ領域及びＩＶａ２領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｅ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ１領域、又は２８．１ｋＤタンパク質、ポリメラーゼ、アグノタンパク質、５２／５５ｋＤａタンパク質及びＩＩＩａタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｆ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ２領域、又は配列番号３１、配列番号５２若しくは配列番号５５のアミノ酸配列を有するペントンタンパク質、ＶＩＩタンパク質、Ｖタンパク質及びＭｕタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｇ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ３領域、又はＶＩタンパク質、配列番号２５、配列番号５１若しくは配列番号５４のアミノ酸配列を有するヘキソンタンパク質、及びエンドプロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｈ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ２ａ領域；
（ｉ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ４領域、又は１００ｋＤタンパク質、３３ｋＤホモログ及びＶＩＩＩタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｊ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ３領域、又はＥ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８及びＥ３ ＯＲＦ９からなる群から選択されるその断片；
（ｋ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＬ５領域、又は配列番号１９、配列番号５０若しくは配列番号５３のアミノ酸配列を有するファイバータンパク質をコードするその断片；
（ｌ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３若しくは配列番号６５のいずれか１つのアデノウイルスＥ４領域、又はＥ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及びＥ４ ＯＲＦ１からなる群から選択されるその断片、又はＡｄ５ Ｅ４領域のＯＲＦ６（配列番号６４）；並びに
（ｍ）配列番号１３、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６５のいずれか１つの３’−ＩＴＲ。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、以下のアデノウイルスタンパク質の１つ又は複数、好ましくは全てをさらにコードする：ＶＩタンパク質、ＶＩＩＩタンパク質、ＩＸタンパク質、ＩＩＩａタンパク質及びＩＶａ２タンパク質。好ましくは、これらのタンパク質は、本明細書中で開示されるＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３ゲノム配列のそれぞれのオープンリーディングフレームによって（by from）コードされる。上記で明記したアデノウイルスタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを決定する方法は、組換えアデノウイルスの技術分野の当業者には十分理解される。当業者はアデノウイルスゲノムの構造も知っており、過度の負担なく、本明細書中で概説される個々のアデノウイルス領域及びＯＲＦを、例えば本発明の新規のアデノウイルスゲノムＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３のいずれかにマッピングすることができる。
【０１１２】
本発明の１つ又は複数のアデノウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド、好ましくはｃＤＮＡを発現させるために、上記ポリヌクレオチドを、転写を指示する強いプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングすることができる。好適な細菌プロモーターは当該技術分野で既知であり（例えば大腸菌、バシラス属及びサルモネラ）、かかる発現系のためのキットは市販されている。同様に、哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞用の真核細胞発現系が当該技術分野で既知であり、これも市販されている。
【０１１３】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的には、宿主細胞におけるアデノウイルスタンパク質をコードする核酸の発現に必要とされるさらなる要素の全てを含有する転写ユニット又は発現カセットを含有する。典型的な発現カセットはしたがって、アデノウイルスタンパク質／ポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能に連結したプロモーター、及び転写産物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終止コドンを含有する。カセットのさらなる要素としては、例えばエンハンサーを挙げることができる。発現カセットは、効率的な終結をもたらすために構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有しなくてはならない。終結領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から得ても、又は異なる遺伝子から得てもよい。
【０１１４】
遺伝子情報を細胞へと輸送するのに使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞又は原核細胞における発現に使用される従来のベクターをいずれも使用することができる。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ等のプラスミド、並びにＧＳＴ及びＬａｃＺ等の融合発現系が挙げられるが、効果的に採用することのできる、当該技術分野で当業者に既知のさらに多くの細菌発現ベクターが存在する。
【０１１５】
真核細胞ウイルスに由来する調節要素を含有する発現ベクターは、典型的には真核細胞発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、及びエプスタインバーウイルスに由来するベクター中で使用される。他の例示的な真核細胞ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＩＲＥＳ、及び例えばＨＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現に効果的であることが示される他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０１１６】
幾つかの発現系は、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ等の遺伝子増幅をもたらすマーカーを有する。代替的には、遺伝子増幅を伴わない高収率発現系も好適である。
【０１１７】
同様に発現ベクター中に含まれ得る要素としては、大腸菌において機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする薬剤耐性マーカーをコードする遺伝子、及び真核細胞配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域中の特有の制限部位が挙げられる。選択される特定の薬剤耐性遺伝子は重要ではなく、当該技術分野で既知の多くの薬剤耐性遺伝子のいずれも好適である。必要に応じて、原核細胞配列が任意で、真核細胞におけるＤＮＡの複製を干渉しないよう選択される。
【０１１８】
標準的なトランスフェクション方法を、細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株又は昆虫細胞株を作製するために使用することができる。外来ポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する既知の手順をいずれも使用することができる。例えば、市販のリポソームベースのトランスフェクションキット（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Invitrogen）等）、市販の脂質ベースのトランスフェクションキット（Ｆｕｇｅｎｅ（Roche Diagnostics）等）、ポリエチレングリコールベースのトランスフェクションキット、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃（バイオリスティック）、エレクトロポレーション又はウイルス感染、及びクローニングしたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ若しくは他の外来遺伝子物質を宿主細胞に導入する他の既知の方法のいずれかが使用され得る。使用される特定の遺伝子工学手順は、少なくとも１つの遺伝子を、受容体を発現することが可能な宿主細胞に首尾よく導入することが可能であればよい。
【０１１９】
発現されたアデノウイルスタンパク質を、任意で標準的な技法を用いて精製することができる。例えば、沈殿工程及びクロマトグラフィー工程（その内容及び順序は回収される特定の組換え物質によって異なる）を行う前に、細胞を機械的に又は浸透圧衝撃によって溶解してもよい。代替的には、タンパク質発現の技術分野で既知のように、組換えタンパク質を分泌させて、組換え細胞を培養した培養培地から回収してもよい。
【０１２０】
好ましい一実施形態では、本発明のベクターはプラスミドベクター、例えば発現ベクターである。本発明によるプラスミドベクターも、組換えアデノウイルスの作製に使用することができる。
【０１２１】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明による単離ポリヌクレオチド及び／又は少なくとも１つの本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを含む組換えアデノウイルス、好ましくは複製不全アデノウイルスである。好ましくは、本発明の組換えアデノウイルスは、本発明のヘキソンタンパク質、ファイバータンパク質及びペントンタンパク質、例えば上記表２中で概説されるような組み合わせを含む。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスはヒト細胞に感染することが可能であること、好ましくは先にチンパンジーアデノウイルスに曝露していないヒトに由来するヒト血清中で、上記アデノウイルスを１時間インキュベートした後にヒト細胞に感染することが可能であることを特徴とする。
【０１２２】
本発明の新規のヘキソンタンパク質、ペントンタンパク質及びファイバータンパク質の配列情報を提示するが、上記組換えアデノウイルスは、例えば通常のアデノウイルスタンパク質から構成されるが、少なくとも１つの本発明による単離アデノウイルスカプシドポリペプチド又はその機能的誘導体を含むカプシドを有する組換えアデノウイルスを構築することによって得ることができる。この点で、組換えアデノウイルスが、本発明のペントンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＬ２領域、本発明のヘキソンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＬ３領域、及び／又は本発明のファイバータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＬ５領域を含むことが好ましい。最も好ましくは、上記組換えアデノウイルスは、少なくとも本発明のペントンタンパク質、ヘキソンタンパク質及びファイバータンパク質をそれぞれコードするＬ２領域、Ｌ３領域及びＬ５領域を含む。
【０１２３】
組換えアデノウイルスを構築する方法は当該技術分野で既知である。組換えアデノウイルスの作製に有用な技法は、例えばGraham & Prevec, 1991 Methods inMolecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. Murray, EJ.),p. 109、及びHitt et al., 1997 "Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer intoMammalian Cells" Advances in Pharmacology 40: 137-206に概説されている。さらなる方法は国際公開第２００６／０８６２８４号に記載されている。複製欠損アデノウイルスの作製については、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４遺伝子産物の１つ又は幾つかを、それらのウイルスは、例えば上述した遺伝子産物のうち１つを欠いているため、複製不全である組換えアデノウイルスの増殖及びレスキューに使用することのできる補完細胞株において発現させてもよい。かかる細胞株の使用は上記で概説される参照文献にも記載されている。
【０１２４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（又は本明細書中に記載される上記本発明のポリヌクレオチドを含むベクター）は、組換えアデノウイルス粒子を作製するために使用される。組換えアデノウイルスは好ましくは、例えばＥ１ａ領域又はＥ１ｂ領域等の１つ又は複数のアデノウイルス領域において上記で言及したように機能的に欠失しており、任意で他の突然変異、例えば他のアデノウイルス遺伝子での温度感受性突然変異又は欠失を有する。他の実施形態では、組換えアデノウイルスにおいて無傷のＥ１ａ領域及び／又はＥ１ｂ領域を保持することが望ましい。このような無傷Ｅ１領域は、アデノウイルスゲノムにおけるその固有の位置に位置していても、又は固有のアデノウイルスゲノムの欠失部位（例えばＥ３領域）に置かれてもよい。
【０１２５】
宿主、例えばヒト（又は他の哺乳動物）細胞への遺伝子の送達のためのアデノウイルスベクターの構築においては、様々なアデノウイルス核酸配列を本発明のベクターにおいて採用することができる。例えば、アデノウイルス後初期（delayed early）遺伝子Ｅ３の全部又は一部を、組換えウイルスの一部を形成するアデノウイルス配列から取り除いてもよい。サルＥ３の機能は、組換えウイルス粒子の機能及び作製とは無関係であると考えられる。幾つかの実施形態では、少なくともＥ４遺伝子のＯＲＦ６領域、より望ましくはこの領域の機能が余分であることから、全Ｅ４領域の欠失を有するアデノウイルスベクターも構築することができる。本発明のさらに別のベクターは、後初期遺伝子Ｅ２ａにおいて欠失を有する。欠失は、サルアデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれにおいても作り出すことができる。同様に、中期遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２における欠失は幾つかの目的にとって有用であり得る。他の欠失を他の構造又は非構造アデノウイルス遺伝子において作り出してもよい。上記で論考した欠失は個々に使用することができる。すなわち、本発明に使用されるアデノウイルス配列は単一の領域にのみ欠失を含有し得る。代替的には、それらの生物活性を破壊するのに効果的な全遺伝子又はその一部分の欠失を任意の組み合わせで使用してもよい。例えば、本発明によるベクターの一例においては、アデノウイルス配列はＥ１領域及びＥ４領域、又はＥ１領域、Ｅ２ａ領域及びＥ３領域、又はＥ１領域及びＥ３領域、又はＥ３の欠失の有無を問わず、Ｅ１領域、Ｅ２ａ領域及びＥ４領域の欠失等を有し得る。上記で論考したように、かかる欠失を温度感受性突然変異等の他のアデノウイルス遺伝子突然変異と組み合わせて用いて、所望の結果を達成することができる。
【０１２６】
任意の必須アデノウイルス配列（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｌ１又はＬ４から選択される領域）を欠いているアデノウイルスベクターを、アデノウイルス粒子のウイルス感染及び増殖に必要とされる失われたアデノウイルス遺伝子の産物の存在下で培養することができる。これらのヘルパー機能は、アデノウイルスベクターを、１つ又は複数のヘルパー構築物（例えば、プラスミド又はウイルス）又はパッケージング宿主細胞（上記でも記載した補完細胞株）の存在下で培養することによってもたらされ得る。例えば、本明細書中に含まれる実施例、及び１９９６年５月９日付けで公開された国際公開第９６／１３５９７号（参照により本明細書中に援用される）において「最小の」ヒトアデノウイルスベクターの作製について記載された技法を参照されたい。
【０１２７】
有用なヘルパーウイルスは、本発明のアデノウイルスベクターの好ましい実施形態において欠失した、及び／又はベクターをトランスフェクトするパッケージング細胞株によって発現されないそれぞれの遺伝子を補完する、選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含有する。一実施形態では、ヘルパーウイルスは複製欠損であり、上記で記載した配列に加えて様々なアデノウイルス遺伝子を含有する。
【０１２８】
ヘルパーウイルスは、Wu et al, J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989)、K. J. Fisher and J. M. Wilson, Biochem.J., 299: 49 (April 1, 1994)に記載されるように、ポリカチオン複合体に形成してもよい。ヘルパーウイルスは任意で第２のレポーターミニ遺伝子を含有し得る。多くのかかるレポーター遺伝子が当該技術分野で既知である。ヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子（アデノウイルスベクター上の形質導入遺伝子とは異なる）の存在によって、Ａｄベクター及びヘルパーウイルスの両方を独立してモニタリングすることが可能となる。この第２のレポーターは、得られる組換えウイルスとヘルパーウイルスとを精製の際に分離することを容易にするために使用され得る。
【０１２９】
本明細書中の好ましい実施形態との関連で記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失した組換えアデノウイルス（Ａｄ）を生成するには、欠失した遺伝子領域の機能を、ウイルスの複製及び感染性に必須である場合に、ヘルパーウイルス又は細胞株、すなわち補完細胞株又はパッケージング細胞株によって組換えウイルスに与えることが好ましい。多くの場合、ヒトＥ１を発現する細胞株を用いて、組換えアデノウイルスを生成するのに使用されるベクターをトランス補完する（transcomplement）ことができる。このことは、本発明のポリヌクレオチド配列及び現在利用可能なパッケージング細胞に見られるヒトアデノウイルスＥ１配列の間の多様性のために、現在のヒトＥ１含有細胞の使用によって、複製及び産生プロセスにおいて複製可能アデノウイルスの生成が妨げられるため、特に有利である。しかしながら、或る特定の状況では、Ｅ１を欠失した組換えアデノウイルスの作製のためにＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を利用することが望ましい。
【０１３０】
所望に応じて、本明細書中で提示される配列を、選択された親細胞株（例えばＨｅＬａ細胞等）における発現のためのプロモーターの転写調節下で、最低でもＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２又はＰａｎＡｄ３アデノウイルスに由来するアデノウイルスＥ１遺伝子を発現するパッケージング細胞又は細胞株を生成するために利用してもよい。誘導性プロモーター又は構成的プロモーターをこの目的で採用することができる。プロモーターの例は、例えば本明細書中に記載される実施例において提示される。かかるＥ１発現細胞株は、組換えアデノウイルスＥ１欠失ベクターの生成において有用である。付加的又は代替的には、本発明は、組換えアデノウイルスベクターの生成に使用されるものと基本的に同じ手順を用いて構築することのできる、１つ又は複数のアデノウイルス遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ及び／又はＥ４ ＯＲＦ６、好ましくはＡｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６（下記実施例も参照されたい）を発現する細胞株を提供する。かかる細胞株は、これらの産物をコードする必須遺伝子において欠失したアデノウイルスベクターをトランス補完するか、又はヘルパー依存ウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）のパッケージングに必要とされるヘルパー機能をもたらすために利用することができる。
【０１３１】
概して、例えばミニ遺伝子を含む本発明のベクターをトランスフェクションによって送達する場合、ベクターは、約１×１０４個〜約１×１０３個の細胞、好ましくは約１×１０５個の細胞につき約０．１μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、好ましくは約１０μｇ〜約５０μｇのＤＮＡという量で送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法及び選択された宿主細胞といった因子を考慮して調整され得る。宿主細胞へのベクターの導入は、トランスフェクション及び感染を含む当該技術分野で既知であるか、又は本明細書中で開示される任意の手段によって、例えばＣａＰＯ４トランスフェクション又はエレクトロポレーションを用いて達成することができる。
【０１３２】
所望のミニ遺伝子含有組換えアデノウイルスの構築及び組み立てについては、一例では当該技術分野でよく知られているように、ベクターをヘルパーウイルスの存在下で、パッケージング細胞株にｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトして、ヘルパー配列とベクター配列との間で相同組換えを起こし、それによりベクターにおいてアデノウイルス−導入遺伝子配列を複製させ、ビリオンカプシド内にパッケージングさせて、組換えウイルスベクター粒子を得ることができる。本発明の組換えアデノウイルスは、例えば選択された形質導入遺伝子を選択された宿主細胞内に移入するのに有用である。
【０１３３】
本発明のアデノウイルスの好ましい実施形態では、アデノウイルスはヒト被験体において５％未満の血清陽性率を有し、好ましくはヒト被験体において血清陽性率を有さず、最も好ましくは先にチンパンジーアデノウイルスと接触させていないヒト被験体において血清陽性率を有しない。この文脈では、ヒト被験体はヨーロッパ人、アフリカの先住民、アジア人、アメリカの先住民及びオセアニアの先住民から選択される民族集団に属することが好ましい。ヒト被験体の民族起源を特定する方法は、当該技術分野に含まれる（例えば、国際公開第２００３／１０２２３６号を参照されたい）。
【０１３４】
本発明による組換えアデノウイルスのさらに好ましい実施形態では、アデノウイルスＤＮＡは、哺乳動物標的細胞に侵入することが可能である、すなわち感染性である。本発明の感染性組換えアデノウイルスは、下記でも記載されるように、ワクチンとして、また、遺伝子療法に使用することができる。したがって、別の実施形態では、組換えアデノウイルスが標的細胞への送達のための分子を含むことが好ましい。好ましくは、標的細胞は哺乳動物細胞、例えばチンパンジー細胞、齧歯類細胞又はヒト細胞である。例えば、標的細胞への送達のための分子は、本明細書中で定義される発現カセットであり得る。発現カセットをアデノウイルスのゲノムに導入する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、上記で提示される文献引用を参照されたい）。一例では、例えばミニ遺伝子又はアンチジーンをコードする発現カセットを含む本発明の組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４から選択されるアデノウイルスのゲノム領域を上記発現カセットに置き換えることによって生成することができる。本発明のアデノウイルスのゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４は、ヒトＡｄ５に由来するもののような既知のアデノウイルスゲノム及び注釈されたアデノウイルスゲノムとのアラインメントによって容易に同定することができる（Birgitt Tauber and Thomas Dobner, Oncogene (2001) 20, p. 7847-7854、及び同様にAndrew J. Davison, et al., "Genetic content and evolution ofadenoviruses", Journal of General Virology (2003), 84, p. 2895-2908を参照されたい）。標的細胞への送達のための分子を含む改変アデノウイルスを生成する方法の非限定的な例は、下記の実施例１及び実施例２並びに図４にも提示される。
【０１３５】
標的細胞への送達のための分子は好ましくはポリヌクレオチドであるが、好ましくは治療活性又は診断活性を有するポリペプチド又は小分子化合物（small chemical compound）であってもよい。特に好ましい一実施形態では、標的細胞への送達のための分子は、アデノウイルス５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、遺伝子（例えば配列番号１）及び３’ＩＴＲを含むポリヌクレオチドである。組換えアデノウイルスが、例えばパッケージング細胞株内で産生された場合に、カプシドが分子を取り囲み、パッケージングすることができるような分子の分子サイズを選択する必要があることは当業者には明らかである。したがって、遺伝子は、例えば７０００個まで、最大で８０００個までの塩基対を有し得るミニ遺伝子であるのが好ましい。
【０１３６】
好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスに含まれる標的細胞への送達のための分子は、抗原タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドである。抗原タンパク質又はその断片は、哺乳動物において免疫応答を引き起こすことが可能であり、特に好ましい実施形態では、実施例に示されるように、配列番号１に記載のポリヌクレオチドによってコードされるＨＩＶのｇａｇタンパク質であり得る。
【０１３７】
特に好ましい実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスは、ＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Culture，Porton Down，Salisbury，SP4 OJG，UK）に寄託された、０８１１０６０１（ＣｈＡｄ８３）、０８１１０６０２（ＣｈＡｄ７３）、０８１１０６０３（ＣｈＡｄ５５）、０８１１０６０４（ＣｈＡｄ１４７）及び０８１１０６０５（ＣｈＡｄ１４６）からなる群から選択される受託番号を有するアデノウイルスである。上述したアデノウイルス株（ラテン名：Mastadenovirus, Adenoviridae）の寄託は、２００８年１１月６日付けでOkairos AG（Elisabethenstr. 3，4051 Basel，Switzerland）によって行われた。
【０１３８】
これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って維持される。これらの寄託は、単に当業者の便宜を図るために行ったものであり、米国特許法第１１２条に基づいて寄託が必要とされることを認めるものではない。米国特許法施行規則１．８０８条（ｂ）項に明記される要件を除いて、寄託されている材料の公衆への提供可能性に関する制限は全て、特許が付与されたとき、取消不能の条件で撤回される。
【０１３９】
本発明の組換えアデノウイルスの別の好ましい実施形態は、０８１１０６０１（ＣｈＡｄ８３）、０８１１０６０２（ＣｈＡｄ７３）、０８１１０６０３（ＣｈＡｄ５５）、０８１１０６０４（ＣｈＡｄ１４７）及び０８１１０６０５（ＣｈＡｄ１４６）からなる群から選択されるアデノウイルスに由来するアデノウイルスである。好ましくは、上述の寄託されたアデノウイルスの１つに由来するアデノウイルスは、そのゲノムに機能的欠失、欠失又は修飾を導入することによって、例えば複製不全アデノウイルス及び／又は宿主細胞において形質導入遺伝子を発現することが可能なアデノウイルスが得られるように変更されている。例えば、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、Ｅ２Ｂ遺伝子、Ｅ３遺伝子及びＥ４遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子は欠失させる、非機能的にする、及び／又は上記に概説される発現カセットと置き換えることができる。さらに、別のアデノウイルスの１つ又は複数の遺伝子を、好ましくは欠失した遺伝子に導入してもよい。寄託された株にこれらのゲノム変化を導入する方法は、当業者には十分理解される。この点において、寄託された株の好ましい修飾形態である、標的細胞への送達のための分子を含む修飾アデノウイルスを生成する方法は上記で記載した。
【０１４０】
さらなる態様では、免疫学的アジュバント及び以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つを含む組成物が提供される：
（ｉ）本発明による単離タンパク質；
（ｉｉ）本発明による単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明によるベクター；
（ｉｖ）本発明による組換えアデノウイルス；及び、
任意で、薬学的に許容可能な賦形剤。
【０１４１】
アジュバントを含む本発明による組成物は、例えばヒト被験体に対するワクチンとして使用することができる。本明細書中で簡潔に「アジュバント」とも称される免疫学的アジュバントは、抗原単独での投与と比較して、抗原／免疫原に対する免疫応答を加速し、延長し、及び／又はその質及び／又は強度を増強し、したがって、所与の任意のワクチンに必要とされる抗原／免疫原の量、及び／又は対象の抗原／免疫原に対する適切な免疫応答を生じさせるのに必要とされる注射の頻度を低減する。
【０１４２】
本発明による組成物との関連で使用され得るアジュバントの例は、水酸化アルミニウムのゲル状沈殿（水酸化アルミニウムゲル（alum））；ＡｌＰＯ４；アルハイドロゲル；グラム陰性菌の外膜に由来する細菌産物、特にモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド及びその誘導体；フロイント不完全アジュバント；リポソーム、特に中性リポソーム、組成物及び任意でサイトカインを含有するリポソーム；非イオン性ブロック共重合体；ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバント（Drane et al., 2007）；ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）、特にホスホロチオエート（ＰＴＯ）骨格（ＣｐＧ ＰＴＯ ＯＤＮ）又はホスホジエステル（ＰＯ）骨格（ＣｐＧ ＰＯ ＯＤＮ）を有するＣｐＧ ＯＤＮを含む非メチル化ＤＮＡ；合成リポペプチド誘導体、特にＰａｍ３Ｃｙｓ；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、特にＨＳＰ ７０；二本鎖ＲＮＡ及びその合成誘導体、特にＰｏｌｙ Ｉ：ｐｏｌｙ Ｃ；ポリカチオン性ペプチド、特にポリ−Ｌ−アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラジェリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−（ＩＬ−）２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１８、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン、特にインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α；２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）；及び合成オリゴペプチド、特にＭＨＣＩＩ提示ペプチドである。ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロック共重合体等といったポリオキシエチレン（ＰＯＥ）及びポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）を含有する非イオン性ブロック共重合体を、アジュバントとして使用することができる（Newman et al., 1998）。このタイプのアジュバントは活性成分として核酸を含む組成物に特に有用である。
【０１４３】
任意で、様々な薬学的に許容可能な賦形剤を使用してもよい。好ましい薬学的に許容可能な賦形剤は、本発明による使用を論考する際に下記で言及される。
【０１４４】
特異的受容体の活性化は免疫応答を刺激し得る。かかる受容体は当業者に既知であり、例えばサイトカイン受容体、特にＩ型サイトカイン受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体、ＴＮＦ受容体；並びに転写因子として作用するビタミンＤ受容体；並びにＴｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９が挙げられる。かかる受容体に対する作動薬はアジュバント活性を有する、すなわち免疫賦活性である。好ましい実施形態では、本発明の組成物のアジュバントは、１つ又は複数のＴｏｌｌ様受容体作動薬であり得る。より好ましい実施形態では、アジュバントはＴｏｌｌ様受容体４作動薬である。特定の好ましい実施形態では、アジュバントはＴｏｌｌ様受容体９作動薬であり、好ましくはヌクレオチドtccatgacgttcctgacgtt（配列番号２）によってコードされる。
【０１４５】
さらなる態様では、本発明は、以下のものの少なくとも１つを含む細胞、好ましくは非サル細胞を提供する：
（ｉ）本発明による単離タンパク質；
（ｉｉ）本発明による単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）本発明によるベクター；
（ｉｖ）本発明による組換えアデノウイルス。
【０１４６】
細胞は、大腸菌細胞等の細菌細胞、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）若しくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母細胞、植物細胞、ＳＦ９細胞若しくはＨｉ５細胞等の昆虫細胞、又は哺乳動物細胞から選択され得る。哺乳動物細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨＥＬＡ細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｕｈ７．５）、Ｈｅｐ Ｇ２ヒト肝細胞癌細胞、Ｈｅｐ ３Ｂヒト肝細胞癌細胞等である。
【０１４７】
細胞が、（ｉｉ）に記載の単離ポリヌクレオチドを含む場合、このポリヌクレオチドは、（ｉ）それ自体が自由に分散するか、又は（ｉｉ）宿主細胞ゲノム又はミトコンドリアＤＮＡに組み込まれて細胞中に存在し得る。
【０１４８】
さらなる好ましい実施形態では、細胞は好ましくは２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６（商標）である、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群から選択されるアデノウイルス遺伝子を少なくとも１つ発現する宿主細胞である。
【０１４９】
疾患の療法又は予防法への、本発明による単離ポリペプチド、本発明による単離タンパク質、本発明によるベクター、本発明による組換えアデノウイルス、及び／又は本発明による組成物の使用も提供される。
【０１５０】
アデノウイルスベクターはワクチンベクターとしての大きな可能性が実証されている。前臨床研究及び臨床研究から、ベクター設計、確実な抗原発現及びこの系を用いた予防免疫の実現可能性が実証されている。したがって、好ましい実施形態は、療法又は予防法が、例えばヒト被験体に対するワクチン接種である本発明による使用である。アデノウイルスをワクチン接種に対して使用及び作製する方法の詳細な指示は、当該技術分野に含まれ、当業者に既知の十分な文献に提示されている。
【０１５１】
使用がワクチン接種である場合、本発明の組換えアデノウイルスは、好ましくは１×１０８個〜１×１０１１個のウイルス粒子（すなわち１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、２．５×１０１０個又は５×１０１０個の粒子）という免疫学的及び／又は予防的に効果的な用量で投与することができる。さらに、ブーストを必要とするワクチン接種については、上記で定義される「異種プライム−ブースト」方法を適用することが好ましい。さらに、本発明による単離ポリヌクレオチド、本発明による単離タンパク質、本発明によるベクター、本発明による組換えアデノウイルス及び／又は本発明による医薬組成物をワクチン中で用いる場合、ワクチンがアジュバントを含むことが好ましい。好ましい免疫学的アジュバントは本明細書中で言及されており、かかるワクチン中で使用することができる。
【０１５２】
本発明によるポリヌクレオチド又は組換えアデノウイルスタンパク質又はそれらの断片を用いて作製される組換えアデノウイルスは、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡを宿主細胞に形質導入するために使用することができる。したがって、好ましくは感染性、すなわち宿主細胞に侵入することが可能ではあるが複製欠損のアデノウイルスを、任意の特別なタンパク質又はポリペプチドを宿主細胞において発現させるために作製することができる。したがって、好ましい実施形態では、本発明による使用において挙げられる療法は遺伝子療法である。本発明による単離ポリヌクレオチド、単離タンパク質、ベクター、組換えアデノウイルス及び／又は医薬組成物を遺伝子療法に使用し、治療を受ける被験体に投与する場合、治療によって患者の１つ又は複数の細胞がトランスフェクトされる、すなわち形質導入されるように十分に大きな用量で投与することが好ましい。本発明による組換えアデノウイルス及び／又は医薬組成物は、本明細書中で開示される好ましい投与手段のいずれかによって投与される場合、好ましくは１×１０８個〜５×１０１１個のウイルス粒子（すなわち１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、２．５×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個、又は最も好ましくは５×１０１１個の粒子）という効果的な用量で投与することが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の組換えアデノウイルス中に含まれる好ましくは異種のポリヌクレオチドは、被験体の宿主細胞においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることが可能であり、この場合、タンパク質又はポリペプチドが、上記宿主細胞からのタンパク質又はポリペプチドの分泌をもたらすシグナルペプチドを含む。例えば、或る特定のタンパク質を必要とする患者は、分泌可能な形態のそのタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む本発明のアデノウイルスを用いて治療することができる。
【０１５３】
本発明の使用のさらなる実施形態では、本発明による単離ポリヌクレオチド、単離タンパク質、ベクター、アデノウイルス及び／又は医薬組成物（以下で本発明による医薬品と称される）は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤；担体；増量剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤及び吸着剤を含む賦形剤；及び／又は防腐剤をさらに含むように配合される。
【０１５４】
本発明による医薬品は、経口投与、直腸投与、胃内（intragastrical）投与、及び非経口投与、例えば静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮内投与、皮下投与、及び同様の投与経路を含む既知の様々な経路によって投与することができる。非経口投与、筋肉内投与及び静脈内投与が好ましい。好ましくは、本発明による医薬品はシロップ剤、注入液又は注射液、錠剤、カプセル、キャプレット、舐剤、リポソーム、坐薬、硬膏、バンドエイド、徐放性カプセル、粉末剤又は徐放製剤として調剤される。好ましくは、希釈剤は水、緩衝液、緩衝塩溶液又は塩溶液であり、担体は好ましくはカカオバター及びビテベソールからなる群から選択される。
【０１５５】
本発明の使用における本発明による医薬品の投与に特に好ましい医薬品形態は、注射用途（injectable use）に好適な形態であり、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。典型的には、かかる溶液又は分散液は、例えば水緩衝水溶液、例えば生体適合性緩衝液、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリオール、それらの好適な混合物、界面活性剤又は植物油を含有する溶媒又は分散媒を含む。
【０１５６】
注入液又は注射液の調製は、抗菌剤又は抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸又はチメロサールのような防腐剤の添加が挙げられるが、これに限定されない、当該技術分野において承認されている様々な技法によって達成することができる。さらに、糖又は塩、特に塩化ナトリウム等の等張剤を注入液又は注射液に加えてもよい。
【０１５７】
本発明の好ましい希釈剤は、水、生理学的に（physiological）許容可能な緩衝液、生理学的に許容可能な緩衝塩溶液又は塩溶液である。好ましい担体はカカオバター及びビテベソールである。様々な医薬品形態の本発明による医薬品と共に使用することのできる賦形剤は、以下の非限定的なリストから選択することができる：
ａ）ラクトース、マンニトール、結晶性ソルビトール、リン酸水素二カリウム（dibasic phosphates）、リン酸カルシウム、糖類、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；
ｂ）ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、硬化植物油、ロイシン、グリセリド及びフマル酸ステアリルナトリウム等の滑剤；
ｃ）デンプン、クロスカルメロースナトリウム、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の崩壊剤。
【０１５８】
他の好適な賦形剤は、米国薬剤師会により出版された医薬品添加物ハンドブック（Handbook of Pharmaceutical Excipients）（参照により本明細書中に援用される）に見ることができる。
【０１５９】
一定量の本発明による医薬品が疾患の療法又は予防法に好ましい。しかしながら、疾患の重症度、疾患の種類、及び治療を受けるそれぞれの患者（例えば患者の全身健康状態等）に応じて、異なる用量の本発明による医薬品が治療効果又は予防効果を引き起こすのに必要とされることが理解される。適切な用量の決定は主治医の裁量による。
【０１６０】
本発明による医薬品が予防的に使用される場合、ワクチンとして調剤することができる。この場合、本発明による医薬品は、上記で概説される好ましい用量及び特に好ましい用量で投与するのが好ましい。好ましくは、ワクチンの投与は、ワクチン接種した被験体が、十分な抗体を本発明による医薬品に対して生成するまで、規定の期間にわたって少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回又は少なくとも１０回繰り返し、それぞれの疾患を発症するリスクを減少させる。この場合の期間は通常、ワクチンの抗原性に応じて変化する。この期間は４週間、３ヶ月、６ヶ月又は３年間を超えないのが好ましい。一実施形態では、本発明によるアデノウイルスがワクチン接種を目的として使用される場合、ヘキソンタンパク質の超可変ドメインの少なくとも１つを、ワクチン接種が対象とするそれぞれの病因物質の免疫原性エピトープによって置き換えることができる。ワクチンは典型的には、上記に概説される１つ又は複数のアジュバントを含有する。ワクチン接種及びそれに関する方法の使用についての詳細な概要は、Bangari DS and Mittal SK (2006) Vaccine, 24(7), p. 849-862（Zhou D, et al., Expert Opin Biol Ther. 2006 Jan;6(1):63-72も参照されたい）、及びFolgori A, et al.,Nat Med. 2006 Feb;12(2):190-7（Draper SJ, et al., NatMed. 2008 Aug;14(8):819-21. Epub 2008 Jul 27も参照されたい）に提示されている。
【０１６１】
本発明の様々な変更形態及び変形形態が、本発明の範囲を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、クレームされる本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されるものではないことが理解されよう。実際に、関連分野の当業者に明らかな本発明を実施する記載の形態の様々な変更形態は、本発明に包含されることが意図される。
【実施例】
【０１６２】
実施例１：アデノウイルスの単離及び特性化
ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７は、欧州及び米国の様々な施設に収容された健常な動物から得られたチンパンジーアデノウイルスの群である。ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７には、ヒト血清との検出可能な反応性を有しないという性質がある。ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３は、欧州及び米国の様々な施設に収容された健常なボノボ（Pan Paniscus）から単離した新たなアデノウイルスである。ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３には、ヒト血清との検出可能な反応性を有しないという性質がある。
【０１６３】
ナミチンパンジー及びボノボのアデノウイルスストックを、最初の継代増幅の後に、９６ウェルプレートに播種した２９３細胞に感染させることによってクローニングした。このウイルスクローニングは、最初の継代ウイルス増幅の後に得られる細胞溶解物の限界希釈によって行った。５つの単離したクローンを取り、連続的に増殖させた。３回〜４回の連続継代増幅の後、アデノウイルスの大規模調製を、５つの二層セルファクトリー（cell-facties）（NUNC）上に播種した（planted）細胞（１つのセルファクトリーにつき２億個の細胞）について行った。２回の塩化セシウム密度勾配超遠心分離工程によって、細胞溶解物から精製ウイルス粒子を得た。
【０１６４】
ゲノムＤＮＡを、３×１０１２ｐｐの精製ウイルス調製物から、１％ＳＤＳ−ＴＥＮ中でのプロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いた消化（５５℃で２時間）によって単離した。フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿の後、ゲノムＤＮＡを水中に再懸濁し、ゲノムシークエンシングを行った。
【０１６５】
この新たな分離株の初期分類は、ヘキソン遺伝子の超可変領域７（ＨＶＲ７）の配列分析によって得られた。この目的で、ＨＶＲ７に隣接する高度に保存された領域について２つのプライマーを設計した：TGTCCTACCARCTCTTGCTTGA（配列番号３）及びGTGGAARGGCACGTAGCG（配列番号４）。ＨＶＲ７を精製ウイルスＤＮＡ又は粗２９３溶解物を鋳型として用いたＰＣＲによって増幅した後、シークエンシングした。分離株に関するより詳細な情報は、超可変領域１〜６をシークエンシングすることによって得た。ＨＶＲ１〜ＨＶＲ６を含有するＤＮＡ領域を、オリゴヌクレオチドＨＶＲ１−６ｆｄ、CAYGATGTGACCACCGACCG（配列番号５）及びＨＶＲ１-６ｒｅｖ、GTGTTYCTGTCYTGCAAGTC（配列番号６）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＨＶＲの配列分析に基づくと、新たな単離ウイルスは、ヒトＡｄウイルス分類（Horowitz, MS (1990), Adenoviridae and theirreplication. In Virology B.N. Fields and D.M. Knipe, eds (raven Press, New York) pp.1679-1740）の亜群Ｅ（ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７）と、亜群Ｃ（ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３）とに分類された。
【０１６６】
ヒト及びチンパンジーのアデノウイルスヘキソンアミノ酸配列のアラインメントによって系統樹を得た。この結果は、Ａｌｉｇｎ Ｘプログラム（Informax, Inc）を用いることによる、ヘキソンＨＶＲ１〜ＨＶＲ６及びＨＶＲ７に限局したヌクレオチド配列アラインメントに基づく初期分類と一致しており、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７分離株と、ヒトＡｄ４（亜群Ｅ）との緊密な系統発生的関係が実証され、ボノボアデノウイルス分離株ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３はヒトＡｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６（亜群Ｃ）に関連している。
【０１６７】
実施例２：ベクター構築
ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３、並びにＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７ウイルスゲノムを、下記に詳述する戦略に従ってプラスミドベクターにクローニングした。ベクターゲノムの全ての操作は、標準的な技法に従って大腸菌において行った。ベクター系は、ＣｈＡｄ及びＰａｎＡｄの骨格からＥ１領域及びＥ３領域を欠失させることによって開発した。Ｅ１領域を、動物モデルにおける免疫学的効力の評価のために、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター及びＢＧＨｐＡシグナル含有ＨＣＶ非構造領域（ＨＣＶ ＮＳ）及びＨＩＶ ｇａｇ（配列番号１）遺伝子に基づく発現カセットに置換した。加えて、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）を発現するＣｈＡｄベクター及びＰａｎＡｄベクターを、中和アッセイのために構築した。ベクターを２９３細胞中で増殖させて、標準的なプロトコルに従ったＣｓＣｌ勾配によって精製した。
【０１６８】
ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ ΔＥ１ベクターの構築は、下記に示す工程によって行った。
【０１６９】
Ｉ．ＰａｎＡｄシャトルベクターの構築
ＰａｎＡｄ１ゲノムを使用して、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３の全ゲノムの相同組換えによるクローニングのためのシャトルベクターを構築した。簡潔に述べると、ボノボアデノウイルス１のクローニングに使用されるシャトルベクター（本明細書中でｐＢＡｄ１ＲＬＤ＿ＥＧＦＰと称される）を以下のように構築した：
ＰａｎＡｄ１左端（ｎｔ １〜ｎｔ ４５０）を、ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化したオリゴヌクレオチド５’−ATCTGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATTTTG−３’（配列番号７）及び５’−TCAGGAACTAGTTCCGTATACCTATAATAATAAAACGGAGACTTTG−３’（配列番号８）を用いたＰＣＲによって増幅した後、ｐＢＡｄ１−Ｌを生成することによってＨＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｂｇｈ ｐｏｌｙＡカセットを既に含有するプラスミドベクターにライゲーションした。次いで、ＰａｎＡｄ１右端（ｎｔ ３７３６２〜ｎｔ ３７７７２）を、オリゴヌクレオチド５’−TCCAGCGGCGCGCCAGACCCGAGTCTTACCAGGA−３’（配列番号９）及び５’−ATTCAGGATCCGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATTTTG−３’（配列番号１０）を用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＢＡｄ１−Ｌにクローニングすることにより、プラスミドｐＢＡｄ１−ＲＬを作製した。
【０１７０】
続いて、ｐＩＸコード領域を含有するＰａｎＡｄ１ ＤＮＡ断片（ｎｔ ３４９８〜ｎｔ ４０３９）を、オリゴヌクレオチド５’−TATTCTGCGATCGCTGAGGTGGGTGAGTGGGCG−３’（配列番号１１）及び５’−TTACTGGCGCGCCTGCCTCGAGTAAACGGCATTTGCAGGAGAAG−３’（配列番号１２）を用いたＰＣＲによって増幅した後、ｐＢＡｄ１−ＲＬにクローニングして、プラスミドｐＢＡｄ１ＲＬＤ ＥＧＦＰシャトルを得た。分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）に対する発現カセット、ＨＩＶ ｇａｇ、ＨＣＶ非構造領域（ＮＳ）遺伝子を含有するシャトルプラスミドも、ｐＢＡｄ１ＲＬＤ ＥＧＦＰシャトル中のＥＧＦＰ遺伝子を置換することによって構築した。
【０１７１】
ＨＩＶ ｇａｇ ＨＣＶ ＮＳ領域、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ｐｏｌｙＡ）をベースとするＳＥＡＰ及びＥＧＦＰ発現カセットを、Emini et al.の国際公開第０３／０３１５８８号に記載されるように構築した。ウイルスＤＮＡカセットは、両方のＩＴＲの末端のみに存在する制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含有し、プラスミドＤＮＡからのウイルスＤＮＡの放出が可能となるように設計した。
【０１７２】
ＩＩ．ΔＥ１ ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ベクターの構築
ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ベクターを、大腸菌株ＢＪ５１８３における相同組換えによって構築した。ＢＪ５１８３細胞を、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３の精製ウイルスＤＮＡ及びｐＢＡｄ１ＲＬＤ−ＥＧＦＰ又はｐＢＡｄ１ＲＬＤ−Ｇａｇによって同時形質転換させた。ｐＩＸ遺伝子、線状化ｐＢＡｄ１ＲＬＤ−ＥＧＦＰ又はｐＢＡｄ１ＲＬＤ−Ｇａｇの末端に存在する右側のＩＴＲ ＤＮＡ配列、及びウイルスゲノムＤＮＡの間の相同組換えでは、発現カセットにより置換されたＥ１領域を同時に欠失させることによってプラスミドベクターへのその挿入が可能となった。この戦略によって、ＥＧＦＰ又はＨＩＶ ｇａｇ形質導入遺伝子を発現するプレアデノプラスミドｐＰａｎＡｄ１、ｐＰａｎＡｄ２及びｐＰａｎＡｄ３の構築が可能となった。次いで、ＳＥＡＰ又はＨＣＶ−ＮＳ発現カセットを、ＥＧＦＰ又はＧａｇ発現カセットを置き換えることによってｐＰａｎＡｄ１、ｐＰａｎＡｄ２及びｐＰａｎＡｄ３ベクターにクローニングした。
【０１７３】
ＩＩＩ．Ｅ３領域の欠失
Ｅ３領域の欠失を、大腸菌におけるクローニング及び相同組換えの幾つかの工程を含む戦略を用いることによって、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ベクター骨格に導入した。ＰａｎＡｄ１ Ｅ３欠失は、ゲノムＰａｎＡｄ１配列のヌクレオチド２８６３６からヌクレオチド３２５９６までにわたり（配列番号１３）、ＰａｎＡｄ２ Ｅ３欠失は、ゲノムＰａｎＡｄ２配列のヌクレオチド２８６５３からヌクレオチド３２５９９までにわたり（配列番号６２）、ＰａｎＡｄ３ Ｅ３欠失は、ゲノムＰａｎＡｄ３配列のヌクレオチド２８６８４からヌクレオチド３２６４０までにわたる（配列番号６３）。
【０１７４】
ＩＶ．Ｅ４領域の欠失
ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３の固有のＥ４領域を欠失させ、Ａｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６コード配列（配列番号６４）と置き換えた。ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３骨格中に導入されたＥ４欠失の座標は以下である：
ＰａｎＡｄ１ Ｅ４欠失は、ヌクレオチド３４６９０から３７３６９までにわたり（配列番号１３）；
ＰａｎＡｄ２ Ｅ４欠失は、ヌクレオチド３４６９６から３７４００までにわたり（配列番号６２）；
ＰａｎＡｄ３ Ｅ４欠失は、ヌクレオチド３４６９０から３７３６９までにわたる（配列番号６３）。
【０１７５】
欠失領域は全てのＰａｎＡｄ Ｅ４ ｏｒｆを含有する一方で、Ｅ４固有のプロモーター及びポリアデニル化シグナルは欠失していなかった。
【０１７６】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ｐｏｌｙＡ）をベースとするＨＩＶ ｇａｇ及びＨＣＶ ＮＳ領域発現カセットを、Emini et al.の国際公開第０３／０３１５８８号に記載されるように構築し、ＨＣＭＶ及びＢｇｈ ｐｏｌｙＡのＤＮＡ配列間の相同性を利用した大腸菌株ＢＪ５１８３における相同組換えによってＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ ΔＥ１ ＥＧＦＰベクターに挿入した。
【０１７７】
Ｖ．ＣｈＡｄ５５ ＤＥ１発現ベクターの構築及びレスキュー
ＣｈＡｄ５５のクローニングのためのシャトルベクターの構築
ＣｈＡｄ５５シャトルを、ＰａｎＡｄベクターについて上記で記載したものと同じ戦略に従うことによって構築した後、ＣｈＡｄ５５ウイルスゲノムのクローニングに使用した。この目的で、ウイルスゲノムの右端及び左端を含有するシャトルベクターｐＡＲＳ ＣｈＡｄ５５（ＩＴＲ遺伝子からｐＩＸ遺伝子までの左端からＥ１領域を欠失させ、発現カセットで置換した）を、ＡｓｃＩ制限酵素で線状化し、ＣｈＡｄ５５精製ウイルスＤＮＡと共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。ｐＩＸ遺伝子から、線状化ｐＡＲＳ ＣｈＡｄ５５及びＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７精製ウイルスゲノムＤＮＡの末端に存在する右側のＩＴＲまでのＤＮＡ配列間の相同組換えによって、Ｅ１領域を同時に欠失させることによるプラスミドベクターへのそれらの挿入が可能となった。チンパンジーアデノウイルス５５（ＣｈＡｄ５５）ゲノムのクローニング戦略の図を図４に提示する。
【０１７８】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ｐｏｌｙＡ）をベースとする発現カセットを、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子、ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子、ＨＣＶ ＮＳ遺伝子を発現するように構築した。全ての発現カセットを、相同組換えによってΔＥ１アデノウイルスプレプラスミドに移動するようにｐＡＲＳ ＣｈＡｄ５５ベクターの単一のＳｎａＢＩ部位に挿入した。
【０１７９】
実施例３：免疫化実験
ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３ベクターの潜在的組換えワクチンとしての有効性を、マウスにおいてＨＩＶ ｇａｇ形質導入遺伝子を発現するベクターを用いて評価した。ＣｈＡｄ５５ ｇａｇのベクター効力を、並行して行った免疫化実験においてヒトＡｄ５ ｇａｇと比較した。１０匹の動物の群について、大腿四頭筋に１０８ｖｐ／マウスのベクター用量でＡｄ５ ｇａｇ又はＣｈＡｄ５５ ｇａｇを注射した（図５Ａ）。別個の実験においては、５匹の動物の群に、１０８ｖｐ／マウスのベクター用量でＡｄ５ ｇａｇ又はＰａｎＡｄ１ ｇａｇ、ＰａｎＡｄ２ ｇａｇ及びＰａｎＡｄ３ ｇａｇを注射した（図５Ｂ）。ＣｈＡｄ７３ ｇａｇ、ＣｈＡｄ８３ ｇａｇ、ＣｈＡｄ１４６ ｇａｇ及びＣｈａｄ１４７ ｇａｇの効力を、ＣｈＡｄ５５ ｇａｇと並行して、５匹のマウスの群を１０８ｖｐ／マウスのベクター用量で免疫化することによって同様に決定した（図５Ｃ）。ＨＩＶ ｇａｇに対して引き起こされる免疫応答を、脾細胞に対するインターフェロン−γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定した。ヒトＡｄ５ ｇａｇベクターと比較した、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、並びにＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３を用いた免疫化実験の結果から、本発明の新規のアデノウイルスが、特異的免疫応答を引き起こす上で、従来技術の組換えアデノウイルスＡｄ５と少なくとも同程度効果的であることが示される。
【０１８０】
実施例４：中和研究
ヒト血清におけるナミチンパンジーアデノウイルス５５、７３、８３、１４６、１４７並びにボノボアデノウイルス１型、２型及び３型に対する中和抗体の陽性率を評価するために中和アッセイを行った。このアッセイによって、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を運搬して、ヒト２９３細胞に形質導入するＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３の能力に対する血清プレインキュベーションの影響を評価した。中和力価は、血清の非存在下でウイルスを有する陽性対照において観察される、ＳＥＡＰ活性の５０％の低減をもたらす血清の希釈率として定義される。各々の血清試料を様々な希釈率（１８倍希釈から始め、４倍ずつ増加させて４６０８倍までの５つ）で試験した。試料を３７℃で１時間プレインキュベートした後、９６ウェルプレートに播種した２９３細胞（３×１０４細胞／ウェル）に添加した。ヒト血清パネルを中和活性について試験した。並行して、同じパネルをＡｄ５、並びにチンパンジー及びボノボＡｄ ＳＥＡＰベクターについて試験した。結果を図６に提示する。この結果から、チンパンジーアデノウイルスに対する血清陽性率が、ヒトアデノウイルスＡｄ５よりも低いことが示される。しかしながら、概して、既に記載されたＣｈＡｄ（ＣＶ−６８）に対する中和抗体の存在を、被験体のサブセットにおいて検出することができる。対照的に、これまでに試験された全てのヒト血清は、ＣｈＡｄ５５、並びにＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３を非常に低い力価であっても中和することができなかった。同じことがＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６及びＣｈＡｄ１４７についても観察された。したがって、新規のアデノウイルス分離株ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、並びにＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３は、一般的なヒトＡｄ血清型（Ａｄ５等）ベースのウイルスベクターの投与を制限する、既存の抗ヒトＡｄ免疫の問題に対する理想的な解決策を示す。
【０１８１】
実施例５：Ａｄ５ベクターと比較したＰａｎＡｄ１ベクター及びＰａｎＡｄ３ベクターの免疫化効率
ＰａｎＡｄ１ベクター及びＰａｎＡｄ３ベクターの潜在的な組換えワクチンとしての有効性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原を発現するベクター及び癌抗原を発現するベクターを用いて評価した。ＨＳＶ Ａｇ及び癌Ａｇを発現するＰａｎＡｄ１及びＰａｎＡｄ３のベクター効力を、ヒトＡｄ５ベースの対応するベクターと比較した。
【０１８２】
抗ウイルス効力を評価するために、９つのＢＡＬＢ／ｃマウス群について、漸増用量（１０７ｖｐ／マウスから始めて１０９ｖｐ／マウスまで）のベクターを、ＰａｎＡｄ１−ＨＳＶ、ＰａｎＡｄ３−ＨＳＶ及びＡｄ５−ＨＳＶと並行して大腿四頭筋に注射した（図７Ａを参照されたい）。ＨＳＶ抗原に対して引き起こされる免疫応答を、抗原の全アミノ酸配列を含むペプチドプールと共にインキュベートしたマウス脾細胞に対するインターフェロン−γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定した。ヒトＡｄ５ベクターと比較した、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２及びＰａｎＡｄ３を用いた免疫化実験の結果を図７に報告するが、本発明の新規のアデノウイルスが試験した各々の濃度で、特異的免疫応答を引き起こす上で従来技術の組換えアデノウイルスＡｄ５よりも効果的であることが示された。このことは、ＰａｎＡｄ１ベクター及びＰａｎＡｄ３ベクターで免疫化したマウスにおいて観察される抗原特異的Ｔ細胞が、より高頻度であることによって明らかに実証される。
【０１８３】
ＰａｎＡｄベクターが抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き起こす効率を、漸増用量（１０７ｖｐ／マウスから始めて１０９ｖｐ／マウスまで）のベクターを大腿四頭筋に注射することによってＢＡＬＢ／ｃマウスの群を免疫化することで評価した。２つのＢＡＬＢ／Ｃマウス群に、１０７ｖｐ／マウス及び１０９ｖｐ／マウスで腫瘍抗原を発現するＡｄ５ベクターを注射した。並行して、３つのＢＡＬＢ／ｃマウス群を、同じ腫瘍抗原を運搬する１０７ｖｐ、１０８ｖｐ、１０９ｖｐのＰａｎＡｄ１ベクター又はＰａｎＡｄ３ベクターで免疫化した。Ｔ細胞応答を、マッピングされたＣＤ８エピトープを示す単一のペプチドを用いて、脾細胞に対するインターフェロン−γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定した。図７Ｂに示される結果から、ＰａｎＡｄベクターで免疫化した動物群において、Ａｄ５ベクターで免疫化した動物群と比較して、最も低いワクチン用量で応答する動物の頻度がより高く、抗原特異的Ｔ細胞の頻度がより高いことが実証される。
【０１８４】
実施例６：ＰａｎＡｄベクターでのカニクイザルの免疫化
３匹のカニクイザルの２つの群を、異種プライム／ブースト計画でＣｓＣｌ精製ＰａｎＡｄ１及びＰａｎＡｄ３を筋肉内注射することによって免疫化した。群１の各々の動物には１０８ｖｐの用量、群２の動物には１０１０ｖｐの用量のＰａｎＡｄ３ Ｇａｇベクターを、０週目に三角筋に注射した。次いで、１３週目に両群の全ての動物を、１０１０ｖｐのＰａｎＡｄ１ Ｇａｇの単回投与によってブーストした。
【０１８５】
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって種々の時点でＣＭＩを測定した。このアッセイによって、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球応答が測定される。ＨＩＶ Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列に基づくペプチドを、これらのアッセイに使用するために調製し、アデノウイルスベクターをワクチン接種したサルにおける免疫応答を測定した。個々のペプチドは、１０個のアミノ酸によって相殺される重複する２０ｍｅｒである。
【０１８６】
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、抗原特異的Ｔリンパ球応答の定量的決定がもたらされる。ＰＢＭＣを段階希釈し、抗アカゲザルＩＦＮ−γ抗体（ＭＤ−１，U-Cytech）をコーティングしたマイクロプレートのウェルに入れた。これをＨＩＶ Ｇａｇペプチドプールと共に２０時間培養すると、前駆細胞の再刺激及びＩＦＮ−γの分泌が得られる。細胞を洗い流して、細胞が位置する集中領域において抗体コーティングウェルに結合した分泌ＩＦＮを残した。捕捉されたＩＦＮは、ビオチン化抗アカゲザルＩＦＮ抗体（検出Ａｂ、U-Cytech）、続いてアルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（Pharmingen，１３０４３Ｅ）を用いて検出される。不溶性アルカリフォスファターゼ基質の添加によって、細胞が位置していた部位のウェルに暗いスポットが生じ、ＩＦＮ−γを分泌したＴ細胞と同じ数のスポットが残る。
【０１８７】
ウェル当たりのスポットの数は、抗原特異的Ｔ細胞の前駆体頻度と直接関係する。γインターフェロンは最も一般的であり、活性化Ｔリンパ球によって合成及び分泌される最も豊富なサイトカインの１つであるため、このアッセイにおいて（特異的抗γインターフェロンモノクローナル抗体を用いて）可視化するサイトカインとして選択した。このアッセイについては、ＰＢＭＣ１００万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を、ペプチド抗原の存在下及び非存在下（媒体対照）で試料について決定する。１回目の投与後及び２回目の投与後の種々の時点で得られる、ＰＢＭＣに対するカニクイザルによるデータを図８に示す。両方の投与の時点でＰａｎＡｄ３によってプライミングした全ての動物が、ＨＩＶ Ｇａｇに対するＴ細胞応答を示し、２回目のＰａｎＡｄ１の注射によって効率的にブーストされ、ヘキソン、ペントン及びファイバーの配列アラインメントによって既に示唆されているように、ＰａｎＡｄ１及びＰａｎＡｄ３が、異種プライム−ブースト免疫化計画において組み合わせることのできる異なる血清型であることが実証される。したがって、本発明の別の態様では、異種プライム−ブースト免疫化への本発明の２つの組換えアデノウイルスの使用が提供され、この場合、本発明の２つの組換えアデノウイルスは異なるアデノウイルス血清型、最も好ましくは本明細書中で記載されるＰａｎＡｄ１及びＰａｎＡｄ３である。
【０１８８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスファイバータンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１４〜１９、５０及び５３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４〜１９、５０及び５３のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号１４〜１９、５０及び５３のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
アデノウイルスヘキソンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２０〜２５、５１及び５４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２０〜２５、５１及び５４のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２０〜２５、５１及び５４のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
アデノウイルスペントンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２６〜３１、５２及び５５のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２６〜３１、５２及び５５のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２６〜３１、５２及び５５のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むポリヌクレオチド。
【請求項５】
以下のものを少なくとも１つ含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド：
（ａ）アデノウイルス５’末端、好ましくはアデノウイルス５’逆方向末端反復；
（ｂ）アデノウイルスＥ１ａ領域、又は１３Ｓ領域、１２Ｓ領域及び９Ｓ領域の中から選択されるその断片；
（ｃ）アデノウイルスＥ１ｂ領域、又はスモールＴ領域、ラージＴ領域及びＩＸ領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｄ）アデノウイルスＥ２ｂ領域、又はスモールｐＴＰ領域、ポリメラーゼ領域及びＩＶａ２領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｅ）アデノウイルスＬ１領域、又は２８．１ｋＤタンパク質、ポリメラーゼ、アグノタンパク質、５２／５５ｋＤａタンパク質及びＩＩＩａタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｆ）アデノウイルスＬ２領域、又は請求項３に記載のペントンタンパク質、ＶＩＩタンパク質、Ｖタンパク質及びＭｕタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｇ）アデノウイルスＬ３領域、又はＶＩタンパク質、請求項２に記載のヘキソンタンパク質及びエンドプロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｈ）アデノウイルスＥ２ａ領域；
（ｉ）アデノウイルスＬ４領域、又は１００ｋＤタンパク質、３３ｋＤホモログ及びＶＩＩＩタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｊ）アデノウイルスＥ３領域、又はＥ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８及びＥ３ ＯＲＦ９からなる群から選択されるその断片；
（ｋ）アデノウイルスＬ５領域、又は請求項１に記載のファイバータンパク質をコードするその断片；
（ｌ）アデノウイルスＥ４領域、又はＥ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及びＥ４ ＯＲＦ１からなる群から選択されるその断片；及び／又は
（ｍ）アデノウイルス３’末端、好ましくはアデノウイルス３’逆方向末端反復。
【請求項６】
基本的に配列番号１３、６２、６３若しくは６５のいずれか１つからなる配列と、又は配列番号１３、６２、６３若しくは６５のいずれか１つからなるが、配列番号１３、６２、６３若しくは６５のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む、請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、又はその機能的誘導体によってコードされる単離アデノウイルスカプシドポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
ベクターがＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４からなるゲノム領域の群から選択されるゲノム領域に遺伝子を含まないか、及び／又はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４の群から選択されるゲノム領域の少なくとも１つの遺伝子を含み、前記少なくとも１つの遺伝子が、該少なくとも１つの遺伝子を非機能的にする欠失及び／又は突然変異を含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、及び／又は少なくとも１つの請求項７に記載の単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを含む組換えアデノウイルス、好ましくは複製不全アデノウイルス。
【請求項１１】
標的細胞への送達のための分子を含む、請求項１０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
ヒト被験体における血清陽性率が５％未満であり、好ましくはヒト被験体において血清陽性率を有しない、請求項１０又は１１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
哺乳動物細胞に感染することが可能である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
標的細胞への送達のための分子が、抗原タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１５】
寄託されており、０８１１０６０１（ＣｈＡｄ８３）、０８１１０６０２（ＣｈＡｄ７３）、０８１１０６０３（ＣｈＡｄ５５）、０８１１０６０４（ＣｈＡｄ１４７）及び０８１１０６０５（ＣｈＡｄ１４６）からなる群から選択される受託番号を有するアデノウイルスである、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１６】
アジュバント及び以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つを含む組成物：
（ｉ）１つ又は複数の請求項７に記載の単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；
（ｉｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）請求項８又は９に記載のベクター；
（ｉｖ）請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス；及び、
任意で、薬学的に許容可能な賦形剤。
【請求項１７】
アジュバントが、Ｉ型サイトカイン受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体、ＴＮＦ受容体、転写因子として作用するビタミンＤ受容体、並びにＴｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９からなる群から選択される受容体の作動薬である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
アジュバントがＴｏｌｌ様受容体４又は９の作動薬である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
以下のものの少なくとも１つを含む細胞：
（ｉ）１つ又は複数の請求項７に記載の単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；
（ｉｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）請求項８又は９に記載のベクター；
（ｉｖ）請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２０】
Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群から選択されるアデノウイルス遺伝子を少なくとも１つ発現する宿主細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
疾患の療法又は予防法への、請求項７に記載の単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド；請求項８又は９に記載のベクター；請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス；及び／又は請求項１８に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
療法又は予防法がワクチン接種である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
療法が遺伝子療法である、請求項２１に記載の使用。
【請求項１】
アデノウイルスファイバータンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１４〜１９、５０及び５３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４〜１９、５０及び５３のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号１４〜１９、５０及び５３のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
アデノウイルスヘキソンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２０〜２５、５１及び５４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２０〜２５、５１及び５４のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２０〜２５、５１及び５４のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
アデノウイルスペントンタンパク質又はその機能的誘導体をコードし、かつ以下のものからなる群から選択される単離ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２６〜３１、５２及び５５のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２６〜３１、５２及び５５のいずれかに記載のポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、前記機能的誘導体が１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む、ポリヌクレオチド；並びに
（ｃ）配列番号２６〜３１、５２及び５５のいずれかのアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有する機能的誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むポリヌクレオチド。
【請求項５】
以下のものを少なくとも１つ含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド：
（ａ）アデノウイルス５’末端、好ましくはアデノウイルス５’逆方向末端反復；
（ｂ）アデノウイルスＥ１ａ領域、又は１３Ｓ領域、１２Ｓ領域及び９Ｓ領域の中から選択されるその断片；
（ｃ）アデノウイルスＥ１ｂ領域、又はスモールＴ領域、ラージＴ領域及びＩＸ領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｄ）アデノウイルスＥ２ｂ領域、又はスモールｐＴＰ領域、ポリメラーゼ領域及びＩＶａ２領域からなる群の中から選択されるその断片；
（ｅ）アデノウイルスＬ１領域、又は２８．１ｋＤタンパク質、ポリメラーゼ、アグノタンパク質、５２／５５ｋＤａタンパク質及びＩＩＩａタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｆ）アデノウイルスＬ２領域、又は請求項３に記載のペントンタンパク質、ＶＩＩタンパク質、Ｖタンパク質及びＭｕタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｇ）アデノウイルスＬ３領域、又はＶＩタンパク質、請求項２に記載のヘキソンタンパク質及びエンドプロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｈ）アデノウイルスＥ２ａ領域；
（ｉ）アデノウイルスＬ４領域、又は１００ｋＤタンパク質、３３ｋＤホモログ及びＶＩＩＩタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
（ｊ）アデノウイルスＥ３領域、又はＥ３ ＯＲＦ１、Ｅ３ ＯＲＦ２、Ｅ３ ＯＲＦ３、Ｅ３ ＯＲＦ４、Ｅ３ ＯＲＦ５、Ｅ３ ＯＲＦ６、Ｅ３ ＯＲＦ７、Ｅ３ ＯＲＦ８及びＥ３ ＯＲＦ９からなる群から選択されるその断片；
（ｋ）アデノウイルスＬ５領域、又は請求項１に記載のファイバータンパク質をコードするその断片；
（ｌ）アデノウイルスＥ４領域、又はＥ４ ＯＲＦ７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ５、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２及びＥ４ ＯＲＦ１からなる群から選択されるその断片；及び／又は
（ｍ）アデノウイルス３’末端、好ましくはアデノウイルス３’逆方向末端反復。
【請求項６】
基本的に配列番号１３、６２、６３若しくは６５のいずれか１つからなる配列と、又は配列番号１３、６２、６３若しくは６５のいずれか１つからなるが、配列番号１３、６２、６３若しくは６５のゲノム領域Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及び／又はＥ４を欠いている配列と、その全長にわたって少なくとも９０％同一なポリヌクレオチドからなるか、又はそれらを含む、請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、又はその機能的誘導体によってコードされる単離アデノウイルスカプシドポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
ベクターがＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４からなるゲノム領域の群から選択されるゲノム領域に遺伝子を含まないか、及び／又はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４の群から選択されるゲノム領域の少なくとも１つの遺伝子を含み、前記少なくとも１つの遺伝子が、該少なくとも１つの遺伝子を非機能的にする欠失及び／又は突然変異を含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、及び／又は少なくとも１つの請求項７に記載の単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを含む組換えアデノウイルス、好ましくは複製不全アデノウイルス。
【請求項１１】
標的細胞への送達のための分子を含む、請求項１０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
ヒト被験体における血清陽性率が５％未満であり、好ましくはヒト被験体において血清陽性率を有しない、請求項１０又は１１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
哺乳動物細胞に感染することが可能である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
標的細胞への送達のための分子が、抗原タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１５】
寄託されており、０８１１０６０１（ＣｈＡｄ８３）、０８１１０６０２（ＣｈＡｄ７３）、０８１１０６０３（ＣｈＡｄ５５）、０８１１０６０４（ＣｈＡｄ１４７）及び０８１１０６０５（ＣｈＡｄ１４６）からなる群から選択される受託番号を有するアデノウイルスである、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１６】
アジュバント及び以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つを含む組成物：
（ｉ）１つ又は複数の請求項７に記載の単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；
（ｉｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）請求項８又は９に記載のベクター；
（ｉｖ）請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス；及び、
任意で、薬学的に許容可能な賦形剤。
【請求項１７】
アジュバントが、Ｉ型サイトカイン受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体、ＴＮＦ受容体、転写因子として作用するビタミンＤ受容体、並びにＴｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９からなる群から選択される受容体の作動薬である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
アジュバントがＴｏｌｌ様受容体４又は９の作動薬である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
以下のものの少なくとも１つを含む細胞：
（ｉ）１つ又は複数の請求項７に記載の単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；
（ｉｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）請求項８又は９に記載のベクター；
（ｉｖ）請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２０】
Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群から選択されるアデノウイルス遺伝子を少なくとも１つ発現する宿主細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
疾患の療法又は予防法への、請求項７に記載の単離アデノウイルスカプシドポリペプチド；請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド；請求項８又は９に記載のベクター；請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス；及び／又は請求項１８に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
療法又は予防法がワクチン接種である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
療法が遺伝子療法である、請求項２１に記載の使用。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図４】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図４】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【公表番号】特表２０１２−５１６６７９（Ｐ２０１２−５１６６７９Ａ）
【公表日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４６７１９（Ｐ２０１１−５４６７１９）
【出願日】平成２２年２月２日（２０１０．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０００６１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８６１８９
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５０９２８０４５３）オカイロス アーゲー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２日（２０１０．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０００６１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８６１８９
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５０９２８０４５３）オカイロス アーゲー (3)
【Ｆターム（参考）】
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