サルモネラの検出および／またはモニタリングのための組成物、キットおよび関連方法
サルモネラの同定のための組成物、キット、および方法が提供される。特定の態様および実施形態において、これらの組成物、キット、および方法は、検出の特異性、感度、および速度に関する改良を提供し得る。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらの組成物は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
サルモネラ属は、ヒト、動物、食物、および環境において見い出されるグラム陰性細菌の大きなファミリーの一部である。サルモネラは、ヒトに感染し、腸チフス、パラチフス、および食物が原因となる健康被害を引き起こす桿状腸内細菌である。米国においては、これは、最も頻繁に報告されている、食物が原因となる病気である。全世界規模では、これは、世界で２番目にありふれた、食物が原因となる健康被害である。サルモネラ中毒は、人口１００，０００人あたり１００〜３００人に影響を与える。２００５年には、およそ３６，０００件の症例がＣＤＣに報告された。サルモネラ中毒は、感染動物に由来するか、または糞便（動物またはヒト）によって汚染された食物の消化によって伝染する。徴候には、突然の頭痛の発症、腹痛、下痢、吐き気および時折の嘔吐を伴う急性全腸炎が含まれる。潜伏期間は６〜７２時間の間（平均１２〜３６時間）である。腸内細菌は、しばしば属を横切って共有される、複雑な遺伝子型および表現型の特徴を有している。結果として、それらのゲノムは、多くの共通配列を共有している。目的のサンプル中でサルモネラを特異的かつ選択的に同定可能である迅速かつ堅固な検出系についての必要性が当該分野において依然として存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本発明は、サルモネラの検出において使用される組成物、キット、および方法に関する。本発明は、少なくとも部分的に、特定のサルモネラ配列がサルモネラの検出のために驚くべきほどに有効であるという発見に基づいている。特定の態様および実施形態において、サルモネラ２３Ｓ ｒＲＮＡの特定の領域が、核酸増幅反応のための好ましい標的であるとして同定されており、これは、検出の特異性、感度、または速度に関しての改善、ならびにその他の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
従って、１つの態様に従って、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物が提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらの組成物は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００４】
第２の態様において、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物が提供される。本明細書において提供される態様の特定の実施形態において、これらの組成物は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００５】
第３の態様において、本明細書で提供される組成物を含むキットが提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらのキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００６】
第４の態様において、本明細書で提供される組成物を含むキットが提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらのキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００７】
第５の態様において、本明細書で提供される組成物および／またはキットを使用してサンプル中のサルモネラの存在を検出するための方法が提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらの方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用し、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００８】
第６の態様において、本明細書で提供される組成物および／またはキットを使用してサンプル中のサルモネラの存在を検出するための方法が提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらの方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用し、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００９】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２６８〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。別の実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３１０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。さらに別の実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０９に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。特定の実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。特定の実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。
【００１０】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。別の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。さらに別の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。
【００１１】
本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、Ｔ７プロバイダーは配列番号１〜３４および相補物の配列から選択される。他の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、本明細書において規定されるように、配列番号３５〜５８および相補物の配列から選択される。ある好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーは配列番号１〜２６および相補物の配列から選択される。他の好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、本明細書において規定されるように、配列番号３５〜５１および相補物の配列から選択される。
【００１２】
本明細書で提供される態様の１つの特に好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーは配列番号１７または相補物の配列を有する。別の特に好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号５０または相補物の配列を有する。特に好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーは配列番号２６または相補物の配列を有する。別の特に好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号４９または相補物の配列を有する。
【００１３】
本明細書で提供される組成物、方法、およびキットの特定の実施形態において、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも７０％；または７５％；または８０％；または８５％；または９０％；または１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む。特定の好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含むが、その１５〜３５個の相補性ヌクレオチドの中の標的とされる核酸配列と比較して、１個のミスマッチ；または２個のミスマッチ；または３個のミスマッチ；または５個のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも７０％；または７５％；または８０％；または８５％；または９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である。１つの好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるが、その１５〜３５個の相補性ヌクレオチドの中の標的とされる核酸配列と比較して、１個のミスマッチ；または２個のミスマッチ；または３個のミスマッチ；または５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む。
【００１５】
本明細書で提供される態様のある実施形態において、転写媒介性増幅反応の１つ以上の態様を容易にするかまたは改善するように働く１つ以上のさらなるオリゴヌクレオチド型および／または他の増幅試薬が含まれてもよい。例えば、好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーおよび／またはプライマーオリゴヌクレオチドに加えて、さらなるオリゴヌクレオチドは、検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、標的捕捉オリゴヌクレオチドなどの１つ以上をさらに含んでもよい。
【００１６】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、上記の組成物、キット、および／または方法は、検出オリゴヌクレオチド、好ましくは、トーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンをさらに含むかまたは使用してもよい。特定の実施形態において、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号６６〜７０および相補物の配列から選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。特定の好ましい実施形態において、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号６６、配列番号６７、および相補物の配列から選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。特に好ましい実施形態において、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号６６または相補物の配列を有するトーチオリゴヌクレオチドである。
【００１７】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、上記の組成物、キット、および／または方法は、ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含むかまたは使用してもよい。特定の実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号５９〜６５および相補物の配列から選択される。特定の好ましい実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号５９、６１、６３、６４、および相補物の配列から選択される。特に好ましい実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号５９または相補物の配列を有する。
【００１８】
本明細書で提供される態様のある実施形態において、上記の組成物、キット、および／または方法は、標的捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含むかまたは使用してもよい。特定の実施形態において、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号７１〜７７および相補物の配列から選択される。好ましい実施形態において、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号７１、７４、および相補物の配列から選択される。特に好ましい実施形態において、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号７４または相補物の配列を有する。
【００１９】
ある態様において、サルモネラ転写媒介増幅アッセイ（以後本明細書中では「ＴＭＡ」）における使用のための組成物が提供される。ある態様において、サルモネラ転写媒介増幅アッセイを実施するためのキットが提供される。ある態様において、サルモネラ転写媒介増幅アッセイを実施するための方法が提供される。特定の実施形態において、これらの組成物、キット、および／または方法は、Ｔ７プロバイダー、プライマーオリゴヌクレオチド、検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、トーチオリゴヌクレオチドなどのような１種以上のオリゴヌクレオチドを含むかまたは使用してもよい。
【００２０】
本発明の用語および概念は、逆のことが明確に言及されない限り、および／または文脈が他のことを具体的に述べていない限り、本明細書に示されるような意味を有する。他に定義されない限り、本明細書で使用される科学的用語および技術的用語は、関連分野における当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。一般的定義は、分子生物学の分野に関連する専門書、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）またはＴｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ、１９９１，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）において見い出され得る。他に言及されない限り、本明細書で利用されるかまたは意図される技術は、当業者に周知である標準的な方法論である。本明細書に含まれる実施例はいくつかの好ましい実施形態を例証する。本明細書に引用される各々の参考文献は、その全体が参照により本明細書に具体的に援用される。
【００２１】
「１つの」または「１種の」実体という用語は、その実体の１つ以上をいうことが注目されるべきであり、例えば、「１種の核酸」は、１種以上の核酸を表すと理解される。このようなものとして、「１つの（または「１種の」）」、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書では交換可能に使用できる。
【００２２】
「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、単数形の「核酸」ならびに複数形の「核酸」を包含し、そして、一緒に共有結合された２つ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、または核酸塩基（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）の任意の鎖をいう。核酸には以下が含まれるがこれらに限定されない：ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかであるウイルスゲノムもしくはその部分、細菌ゲノムもしくはその部分、真菌、植物、もしくは動物のゲノムもしくはその部分、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ。核酸は、直鎖状（例えば、ｍＲＮＡ）、環状（例えば、プラスミド）、または分枝型、ならびに二本鎖または一本鎖型として提供されてもよい。核酸は、核酸の機能または挙動を変化させるために修飾塩基、例えば、さらなるヌクレオチドが核酸に付加されることをブロックするための３’末端ジデオキシヌクレオチドの付加を含んでもよい。本明細書で使用される場合、核酸の「配列」とは、核酸を作り上げる塩基の配列をいう。
【００２３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸鎖を意味する。本願を通して、核酸は５’末端から３’末端によって明示される。標準的な核酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは、典型的には、「３’から５’」で、すなわち、成長する核酸の５’末端へのヌクレオチドの付加によって合成される。
【００２４】
「ヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、リン酸基、５炭糖、および窒素含有塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡ中で見い出される５炭糖はリボースである。ＤＮＡ中では、５炭糖は２’デオキシリボースである。この用語は、リボースの２’位のメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）などのこのようなサブユニットのアナログもまた含む。本明細書で使用される場合、「Ｔ」残基を含むメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基を有し、ヌクレオチドの塩基の位置にウラシルを有する。
【００２５】
「非ヌクレオチド単位」は、本明細書で使用される場合、ポリマーのハイブリダイゼーションに有意に関与しない単位である。このような単位は、例えば、ヌクレオチドとのいかなる有意な水素結合にも関与しないはずであり、５種のヌクレオチド塩基またはそのアナログのうちの１種を成分として有する単位を除外する。
【００２６】
「標的核酸」は、本明細書で使用される場合、増幅される「標的配列」を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載されるようなＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。標的核酸は、標的配列に加えて、増幅されなくてもよい他の配列を含んでもよい。典型的な標的核酸には、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌、または真核生物細胞からのｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または染色体ＤＮＡが含まれる。
【００２７】
「単離された」によって、標的核酸を含むサンプルがその天然環境から取り出されていることが意味されるが、この用語は、いかなる程度の精製も暗示しない。
【００２８】
「標的配列」という用語は、本明細書で使用される場合、増幅される標的核酸の特定のヌクレオチド配列をいう。「標的配列」は、ＴＭＡのプロセスの間にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体形成する、複合体形成配列を含む。標的核酸がもともと一本鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸中に存在しているものとして、「標的配列」に対して相補的である配列もまたいう。標的核酸がもともと二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（−）鎖の両方をいう。標的配列を選択する際に、当業者は、関連性がない核酸と、密接に関連性がある標的核酸の間を区別するために、「独特な」配列が選択されるべきであることを理解する。
【００２９】
「配列を標的化する」という用語は、サルモネラ核酸の領域に関連して本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるような増幅および検出を可能にする様式でオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするプロセスをいう。１つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に相補的であり、ミスマッチを含まない。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列と相補的であるが、１個；または２個；または３個；または４個；または５個のミスマッチを含む。好ましくは、サルモネラ核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、標的配列に対して相補的である少なくとも１０〜５０個；または１２〜４５個；または１４〜４０個；または１５〜３５個のヌクレオチドを含む。
【００３０】
「フラグメント」または「領域」という用語は、サルモネラを標的とする核酸配列に関連して本明細書で使用される場合、連続する核酸の一片をいう。特定の実施形態において、フラグメントは、２５個；または５０個；または７５個；または１００個；または１２５個；または１５０個；または１７５個；または２００個；または２２５個；または２５０個；または３００個；または３５０個；または４００個；または４５０個；または５００個；または７５０個；または１０００個；または２０００個；または３０００個のヌクレオチドを含む。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」または「オリゴマー」という用語は、単数の「オリゴヌクレオチド」ならびに複数の「オリゴヌクレオチド」を包含することが意図され、２つ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基、または本明細書に開示される増幅方法ならびに引き続く検出方法において試薬として使用される関連化合物の任意のポリマーをいう。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはそれらのアナログであり得る。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対する任意の特定の機能を意味せず、むしろ、この用語は、本明細書に記載されるすべてのこのような試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは様々な異なる機能に役立つ可能性があり、例えば、これは相補鎖に特異的でありかつハイブリダイズ可能であり、さらに核酸ポリメラーゼの存在下で伸長できる場合にはプライマーとして機能する可能性があり、これがＲＮＡポリメラーゼによって認識されかつ転写を可能にする配列を含む場合にはプロモーターを提供する可能性があり（例えば、Ｔ７プロバイダー）、そして適切に配置および／または修飾される場合にはハイブリダイゼーションを妨害しまたはプライマー伸長を妨げるように機能する可能性がある。
【００３２】
本明細書で使用される場合、特定の配列の群から選択される配列を「含み」またはそれらの配列「からなり」またはそれらの配列「から本質的になる」核酸配列を有するオリゴヌクレオチドとは、基本的かつ新規な特徴としてのオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で列挙された核酸配列の群の１つの正確な相補体を有する核酸に安定にハイブリダイズする能力があることを意味する。正確な相補体は対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
【００３３】
本明細書で使用される場合、特定の核酸配列に「実質的に一致する」オリゴヌクレオチドとは、言及されるオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリダイズするという点で、そのオリゴヌクレオチドが参照核酸配列に対して類似したハイブリダイゼーション特性を有するように、参照核酸配列に十分に類似していることを意味する。当業者は、「実質的に一致するオリゴヌクレオチド」が、言及される配列とは異なり、なお同じ標的核酸配列にハイブリダイズすることが可能であることを理解する。この核酸からの変動は、プローブまたはプライマーとその標的配列の間の、配列中の同一の塩基のパーセンテージまたは完全に相補的な塩基のパーセンテージによって言及されてもよい。従って、塩基の同一性または相補性のこれらのパーセンテージが１００％〜約８０％である場合、オリゴヌクレオチドは参照核酸配列に「実質的に一致する」。好ましい実施形態において、このパーセンテージは１００％〜約８５％である。より好ましい実施形態において、このパーセンテージは１００％〜約９０％である；他の好ましい実施形態において、このパーセンテージは１００％〜約９５％である。当業者は、非特異的な受け入れがたいレベルのハイブリダイゼーションを発生させることなく、特定の標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために種々のパーセンテージの相補性において必要とされる可能性があるハイブリダイゼーション条件に対する種々の改変を理解している。
【００３４】
「ヘルパーオリゴヌクレオチド」または「ヘルパー」とは、例えば、その内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，０３０，５５７号に記載されるような、標的とされる核酸との検出プローブまたは他のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの速度および程度を増加させるために、標的核酸に結合し、かつ標的上の様々な二次構造および／または三次構造を強いるように設計されたオリゴヌクレオチドをいう。ヘルパーは、標的核酸配列へのハイブリダイゼーション、ならびにプライマー、標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび他のオリゴヌクレオチドの機能を補助するためにもまた使用されてもよい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ブロッキング部分」は、核酸ポリメラーゼによってオリゴヌクレオチドまたは他の核酸が効率的に伸長されることができないように、その３’末端を「ブロック」するために使用される実体である。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「プライミングオリゴヌクレオチド」または「プライマー」は、少なくともその３’末端が核酸鋳型に相補的であり、鋳型と複合体を形成して（水素結合またはハイブリダイゼーションによって）、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始のために適切であるプライマー：鋳型複合体を与えるオリゴヌクレオチドである。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、特定の部位において核酸に結合し、ＲＮＡの転写を開始するためのシグナルとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「トランスクリプターゼ」）によって認識される特定の核酸配列である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「プロモーター−プロバイダー」または「プロバイダー」とは、第１の領域および第２の領域を含み、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を妨害するように修飾されているオリゴヌクレオチドをいう。プロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする塩基配列を含み、ここで、このハイブリダイズする配列は３’に位置するが、プロモーター領域には必ずしも隣接していない。プロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズする部分は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはそれ以上のヌクレオチド長まで伸長されてもよい。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。プロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素によって伸長されることが不可能であるように操作され、好ましくは、上記のように、その３’末端にブロッキング部分を含む。本明細書で言及される場合、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供する、ブロックされたプロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドである。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「終結オリゴヌクレオチド」または「ブロッカーオリゴヌクレオチド」は、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結させ」、それによって、新生核酸鎖について規定された３’末端を提供するために、標的配列の５’末端の近傍における標的核酸の領域に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００４０】
「エクステンダーオリゴヌクレオチド」または「エクステンドオリゴ」とは、本明細書で使用される場合、Ｔ７プロバイダーと同じ意味であるオリゴヌクレオチドをいい、構造を広げ、または特異性を改善するヘルパーオリゴヌクレオチドとして働く可能性がある。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「検出オリゴヌクレオチド」とは、標的核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅された配列を含む標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴヌクレオチドをいう。「プローブ」または「検出プローブ」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれにハイブリダイズするように、検出されることが探求されている標的配列の領域に部分的または完全に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む分子を意味する。
【００４２】
「安定な」または「検出のために安定な」とは、反応混液の温度が核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも２℃下であることを意味する。
【００４３】
「増幅」または「核酸増幅」は、さらに本明細書に記載されるような、意図される特定の標的核酸配列の少なくとも一部を含む標的核酸の複数コピーの産生を意味する。複数コピーはアンプリコンまたは増幅産物と呼ばれてもよい。
【００４４】
「アンプリコン」という用語は、本明細書で使用される場合、標的配列の中に含まれる配列に相補的または相同である、増幅手順の間に生成された核酸分子をいう。
【００４５】
「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、同時に安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成が最小化されながら、プローブが、それらの標的配列またはそれらの複製にハイブリダイズして、安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成することを意味する。従って、プローブは、非標的配列よりも十分に大きな程度まで、標的配列またはその複製にハイブリダイズして、複製の間に形成された標的配列のＲＮＡ複製または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を当業者が正確に定量することを可能にする。
【００４６】
「相補性」は、２つの一本鎖核酸の類似の領域のヌクレオチド配列、または同じ一本鎖核酸の異なる領域に類似するヌクレオチド配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または増幅条件下で、安定な二本鎖水素結合領域中で一本鎖領域が一緒にハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド塩基組成物を有することを意味する。ＡがＵまたはＴと対合し、ＣがＧと対合するように、一本鎖領域のヌクレオチドの連続する配列は、他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似の配列と一連の「基準の」水素結合塩基対を形成することができる場合、ヌクレオチド配列は「完全に」相補的である。
【００４７】
「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」または「二重鎖」は、各鎖は互いに対して相補的であり、その領域は、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフィー、またはゲル電気泳動が含まれるがこれらに限定されない手段によって検出されるためにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で十分に安定である、二本鎖であり、水素結合している領域を含む核酸構造を意味する。このようなハイブリッドには、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子が含まれ得る。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「捕捉ヌクレオチド」または「捕捉プローブ」とは、標準的な塩基対形成によって標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、かつ支持体に標的核酸を捕捉するために固定化プローブ上の結合パートナーに結合する核酸オリゴマーをいう。捕捉オリゴマーの１つの例には、２つの結合領域：配列結合領域（すなわち、標的特異的部分）および通常は同じオリゴマー上である固定化プローブ結合領域を含むが、２つの領域は１つ以上のリンカーで一緒に結合された２つの異なるオリゴマー上に存在してもよい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「固定化オリゴヌクレオチド」、「固定化プローブ」、または「固定化核酸」とは、直接的または間接的に、捕捉オリゴマーを支持体に結合する、核酸結合パートナーをいう。支持体に結合された固定化プローブは、サンプル中の非結合物質からの捕捉プローブ結合標的の分離を容易にする。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「標識」とは、検出されるかまたは検出可能なシグナルに導くプローブに直接的または間接的に結合された部分または化合物をいう。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「分子トーチ」と呼ばれる構造は、結合領域によって連結され、かつあらかじめ決定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする自己相補性の別個の領域（新しく作り出された「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」）を含むように設計される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、またはバクテリオファージＴ４、Ｐｈｉ−２９、Ｍ２、もしくはＴ５由来のＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌もしくはバクテリオファージから単離されたか、または組換え的に発現された天然に存在する酵素であってもよく、あるいは特定の所望の特徴、例えば、熱安定性、または種々の修飾された鋳型からＤＮＡ鎖を認識または合成する能力を有するように操作された、修飾型または「進化した」型であってもよい。すべての公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが合成を開始するために相補性プライマーを必要とする。適切な条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成し得ることが知られている。典型的には、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼもまた、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「トランスクリプターゼ」は、通常は二本鎖であるプロモーター配列を有する、二本鎖または部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモーターのすぐ下流の特定の位置で開始して、５’から３’の方向で合成される。転写物の例は、Ｅ．ｃｏｌｉならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。すべての公知の逆転写酵素は、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを作る能力もまた有する；従って、これらは、ＲＮＡ依存性とＤＮＡ依存性の両方のＤＮＡポリメラーゼである。ＲＴはＲＮＡｓｅ Ｈ活性もまた有する可能性がある。プライマーは、ＲＮＡとＤＮＡの両方の鋳型で合成を開始するために必要とされる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「選択的ＲＮＡｓｅ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解するが、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、またはＤＮＡを分解しない酵素である。例示的な選択的なＲＮＡｓｅはＲＮＡｓｅ Ｈである。ＲＮＡｓｅ Ｈ以外の同じかまたは類似の活性を有する酵素もまた使用されてもよい。選択的ＲＮＡｓｅは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであってもよい。多くの逆転写酵素は、それらのポリメラーゼ活性に加えて、ＲＮＡｓｅ Ｈ活性を含む。しかし、他の供給源のＲＮＡｓｅ Ｈは、付随するポリメラーゼ活性を伴うことなく利用可能である。分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離を生じ得る。あるいは、選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡの一部が融解して除かれ、または酵素がＲＮＡの部分を巻き戻すことを可能にするように、様々な位置でＲＮＡを単純に切断し得る。ＲＮＡ標的配列または本明細書のＲＮＡ産物を選択的に分解する他の酵素は、当業者には容易に明白である。
【００５６】
増幅系の状況における「特異性」という用語は、配列およびアッセイ条件に依存して標的配列と非標的配列の間を区別する増幅系の能力を説明する、その増幅系の特徴をいうために本明細書で使用される。核酸増幅に関して、特異性とは、一般的に、生成した特異的アンプリコンの数の副産物の数に対する比率（すなわち、シグナル対ノイズ比）をいう。
【００５７】
「感度」という用語は、それによって核酸増幅反応が検出または定量できる精度をいうために本明細書で用いられる。増幅反応の精度は、一般的には、増幅系において信頼できるように検出可能である標的核酸の最小コピー数の尺度であり、例えば、利用される検出アッセイ、および増幅反応の特異性、すなわち、特異的アンプリコン対副産物の比率に依存する。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「コロニー形成単位」（「ＣＦＵ」）は、サンプル中の生存可能な微生物の尺度として使用される。ＣＦＵは、固形培地上で目に見えるコロニーを形成する能力がある個々の生存可能な細胞であり、それらのコロニーの個々の細胞は１個の親の細胞から細胞分裂によって誘導される。１ＣＦＵは約１０００コピーのｒＲＮＡに相当する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「Ｔ時間」は、アッセイデータのリアルタイムプロットにおけるシグナルの閾値時間または出現の時間である。Ｔ時間の値は、アンプリコン産生を示す特定の閾値がリアルタイム増幅反応において経過する時間を見積もる。Ｔ時間ならびにＴ時間値を計算および使用するためのアルゴリズムは、Ｌｉｇｈｔら、米国特許公開第２００６／０２７６９７２号、［０５１７］〜［０５３８］段落に記載されており、この開示はそれによって参照により本明細書に援用される。曲線フィッティング手順は、標準化されかつバックグラウンドを補正したデータに適用される。曲線フィットは、所定の低結合と高結合の間のデータの部分のみについて実施される。目的は、データにフィットする曲線を見い出した後で、曲線またはその突出部が所定の閾値と交差する点に対応する時間を見積もることである。１つの実施形態において、標準化されたデータの閾値は０．１１である。高結合および低結合は、様々な対照データセットにフィットする曲線が所定の閾値と関連付けられる時間の最小の変動性を示す範囲を超えたものとして、経験的に決定される。例えば、１つの実施形態において、低結合は０．０４であり、高結合は０．３６である。曲線は、高結合を過ぎた最初のデータ点を通して、低結合よりも下の最初のデータ点から伸長するデータにフィットされる。次に、フィットの傾きが統計学的に有意であるか否かの決定がなされる。例えば、一次係数のｐ値が０．０５未満である場合、フィットは有意であると見なされ、処理が継続する。そうでない場合、処理は停止する。あるいは、データの妥当性はＲ２値によって決定可能である。直線ｙ＝ｍｘ＋ｂの傾きｍおよび切片ｂはフィットした曲線について決定される。その情報がある場合、Ｔ時間は以下のように決定可能である：
Ｔ時間＝（閾値−ｂ）／ｍ
本明細書で使用される場合、「相対蛍光単位」（「ＲＦＵ」）という用語は、蛍光強度の尺度の任意単位である。ＲＦＵは測定のために使用される検出手段の特徴に伴って変化する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「リアルタイムＴＭＡ」という用語とは、リアルタイム検出手段によってモニタリングされる標的核酸の単一プライマー転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）をいう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、増幅オリゴヌクレオチドおよび検出オリゴヌクレオチドの様々な組み合わせの（Ａ）「乏しい」アッセイ性能および（Ｂ）「良好な」アッセイ性能を示す分析物のリアルタイム増幅チャートを図示する。使用した分析物は、精製Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｒＲＮＡであって、チャートは０、１Ｅ＋４、および１Ｅ＋５コピーにおける分析物の多数の複製を示す。
【図２】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ配列のヌクレオチド１５０〜４２５に対応するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｂｓｐ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０（ＡＴＣＣ１３０７６）「３５０領域」配列（配列番号１５０）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
発明の詳細な説明
特定の態様および実施形態において、本明細書は、サルモネラの同定、検出、および／または定量のための組成物、方法、およびキットに関する。このサルモネラは、試験のため、例えば、診断試験のため、血液製剤のスクリーニングのため、バイオプロセス、食物、水、工業サンプルまたは環境サンプルにおける微生物検出のため、および他の目的のために採取されたサンプル中で、単独で、または核酸の均一もしくは不均一な混合物の多いかもしくは少ない成分としてのいずれかで存在する可能性がある。本明細書に開示される特定の方法、組成物、およびキットは、増幅に基づくサルモネラの検出における検出の感度、特異性、または速度の改善を提供する。サルモネラリボソームＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、および他の潜在的な腸内細菌と非常に密接に関連している。従って、本明細書の特定の実施形態において、サルモネラアッセイは、サルモネラ属のほぼすべての種、亜種、および血清型に共通なｒＲＮＡ配列を同定し、他の腸内細菌からサルモネラを区別する。このような区別のために有用な領域は２３Ｓ ｒＲＮＡの３５０領域である。
【００６３】
サルモネラに特異的な増幅オリゴヌクレオチドの広範な分析の結果として、約１５０〜４２５ヌクレオチド塩基のＥ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ参照配列（アクセッション番号ＡＪ２７８７１０）の領域に対応するサルモネラの特定の領域（以後本明細書では「３５０領域」と称する）が、増幅に基づくサルモネラの検出のための好ましい標的として同定された。従って、本明細書は、関心対象のサンプル、増幅オリゴヌクレオチド、組成物、反応混液、キットなどの中のサルモネラの検出の方法に関する。
【００６４】
サルモネラ属アッセイは、既知のサルモネラ種に特異的なリボソームＲＮＡ配列を検出する。これは、リアルタイムＴＭＡ技術を利用し、ここでは、標的特異的配列が逆方向ＴＭＡを使用して増幅され、蛍光分子トーチが使用され、増幅産物が産生されるにつれてそれらを検出する。標的検出は、結果の信頼性を確認するために、内部対照の増幅および検出と同時に実施される。アッセイの結果は、サルモネラの存在または非存在について陽性または陰性であるサンプルの分類からなる。
【００６５】
１つの実施形態において、サンプルは、生物薬剤学プロセス（バイオプロセス）の流れであり、ここでは、サルモネラは既知のまたは疑いのある夾雑物である。「バイオプロセス」は、本明細書で使用される場合、生きている細胞もしくは生物またはその成分が、意図されてまたは意図されずのいずれかで存在している、一般的に任意のプロセスをいう。例えば、その少なくとも１つが生きている細胞、生物、もしくはその成分を含み、または意図されない汚染の結果としてそのような細胞、生物、もしくは成分を含む、本質的に任意の製造プロセスまたは１つ以上のサンプルもしくはサンプルの流れを利用する他のプロセスは、バイオプロセスと見なされる。多くのこのようなプロセスにおいて、プロセスの中で生きている細胞、生物、またはその成分の存在および／または供給源を検出、同定、および／または制御する能力を有することが所望される。本明細書に開示される方法を使用して、例えば、１つ以上のバイオプロセスサンプルおよび／または流れにおけるサルモネラの存在および／または供給源は、迅速かつ高感度の様式でモニタリングされてもよい。
【００６６】
標的核酸／標的配列
標的核酸は、実行される増幅アッセイの目的に基づいて任意の数の供給源から単離されてもよい。標的核酸の供給源には、臨床試料、例えば、血液、尿、唾液、糞便、精液、または髄液、犯罪の証拠からの試料、環境サンプル、例えば、水もしくは土壌サンプルからの試料、食物からの試料、工業サンプルからの試料、ｃＤＮＡライブラリーからの試料、または全細胞ＲＮＡからの試料が含まれるがこれらに限定されない。必要な場合、標的核酸は、種々のオリゴヌクレオチドとの相互作用のために利用可能にされる。これは、例えば、細胞から標的核酸を放出させるための細胞溶解または細胞透過を含んでもよく、これに、次いで、一連の単離工程および洗浄工程などの１つ以上の精製工程が続いてもよい。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｃｌａｒｋら「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ａ Ｗｉｄｅ Ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」米国特許第５，７８６，２０８号を参照のこと。これは、例えば、血液サンプルに存在するヘムなど、増幅反応と干渉する可能性がある成分をサンプルが含む可能性がある場合に特に重要である。その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｒｙｄｅｒら「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｒｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｇｅｎｔｓ」米国特許第５，６３９，５９９号を参照のこと。増幅のための種々の供給源から標的核酸を調製するための方法は当業者に周知である。標的核酸は、本明細書に記載される増幅反応の前にある程度まで精製されてもよいが、他の場合において、サンプルは、いかなるさらなる操作も伴うことなく、増幅反応に加えられる。
【００６７】
当業者によって理解されるように、「独特な」配列は試験環境から判断される。少なくとも検出プローブによって認識される配列は、試験される環境において独特であるべきであるが、しかし、すべての可能な配列の領域の中で独特である必要はない。さらに、たとえ標的配列が検出プローブによる認識のために「独特な」配列を含むはずであっても、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチドが「独特な」配列を常に認識しているわけではない。ある実施形態において、関連する生物のファミリーに対して一般的である標的配列を選択することが望ましくあり得る。他の状況において、非常に高度に特異的な標的配列、または検出プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドによって認識される少なくとも高度に特異的な領域を有する標的配列が、密接に関連する生物、例えば、病原性Ｅ．ｃｏｌｉと非病原性Ｅ．ｃｏｌｉの間を区別するように選択される。標的配列は、任意の実用的な長さであってもよい。最小限の標的配列は、プライミングオリゴヌクレオチド（またはその相補物）にハイブリダイズする領域、プロモーターオリゴヌクレオチド（またはその相補物）のハイブリダイズする領域にハイブリダイズする領域、および検出のために使用される領域、例えば、検出プローブにハイブリダイズする領域を含む。検出プローブにハイブリダイズする領域は、プライミングヌクレオチド（またはその相補物）にハイブリダイズする領域またはプロモーターオリゴヌクレオチド（またはその相補物）のハイブリダイズ領域と重複するか、またはその中に含まれてもよい。最小限の要件に加えて、標的配列の最適長は、多くの考慮すべき点、例えば、二次構造の量または配列中の自己ハイブリダイズ領域に依存する。典型的には、標的配列は、約３０ヌクレオチド長から約３００ヌクレオチド長までの範囲である。最適なまたは好ましい長さは、本明細書に記載される方法に従って決定可能である様々な条件下で変化する可能性がある。
【００６８】
核酸「同一性」
特定の実施形態において、核酸は、参照核酸の連続する塩基領域に対して少なくとも７０％；または７５％；または８０％、または８５％または９０％、または９５％；または１００％同一である連続する塩基領域を含む。短い核酸については、「問い合わせ」核酸の塩基領域と参照核酸の塩基領域の間の同一性の程度は、手動のアラインメントによって決定可能である。「同一性」は、比較される核酸の糖領域およびバックボーン領域とは関係なく、窒素性塩基の配列のみを比較することによって決定される。従って、問い合わせ：参照塩基配列アラインメントは、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはその任意の組み合わせまたはアナログであってもよい。等価なＲＮＡおよびＤＮＡの塩基配列は、Ｕ（ＲＮＡ中）をＴ（ＤＮＡ中）に変換することによって比較可能である。
【００６９】
オリゴヌクレオチドおよびプライマー
オリゴヌクレオチドは、実質的に任意の長さであり得、増幅反応におけるまたは増幅反応の増幅産物を検出する際のその特異的機能によってのみ限定される。しかし、特定の実施形態において、好ましいオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域に対して相補的である、少なくとも約１０個；または１２個；または１４個；または１６個；または１８個；または２０個；または２２個；または２４個；または２６個；または２８個；または３０個；または３２個；または３４個；または３６個；または３８個；または４０個；または４２個；または４４個；または４６個；または４８個；または５０個；または５２個；または５４個；または５６個の連続する塩基を含む。これらの連続する塩基は、そのオリゴヌクレオチドが結合する標的配列に対して、好ましくは、少なくとも約８０％相補的であり、より好ましくは、少なくとも約９０％相補的であり、そして最も好ましくは、完全に相補的である。特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、一般的には、約１０〜１００の間；または１２〜７５の間；または１４〜５０の間；または１５〜４０の間の塩基長であり、任意に修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【００７０】
規定された配列および化学構造のオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の技術によって、例えば、化学的または生化学的な合成、および組換え核酸分子、例えば、細菌ベクターまたはウイルスベクターからのインビトロまたはインビボ発現によって産生されてもよい。本開示によって意図されるように、オリゴヌクレオチドは、単に野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からなるのではない。
【００７１】
オリゴヌクレオチドは、所定の修飾が所定のオリゴヌクレオチドの所望の機能と適合性である限り、どんなやり方で修飾されてもよい。当業者は、所定の修飾が、任意の所定のオリゴヌクレオチドのために適切であるか、または所望されるかを容易に決定することができる。修飾には、塩基修飾、糖修飾、またはバックボーン修飾が含まれる。塩基修飾には、アデニン、シチジン、グアノシン、チミン、およびウラシルに加えて、以下の塩基の使用が含まれるがこれらに限定されない：Ｃ−５プロピン、２−アミノアデニン、５−メチルシチジン、イノシン、ならびにｄＰおよびｄＫ塩基。ヌクレオシドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース、および、例えば、リボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む、リボース、デオキシリボースのアナログであり得る。Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第６，１３０，０３８号を参照のこと。他の糖修飾には、２’−アミノ、２’−フルオロ、（Ｌ）−α−スレオフラノシル、およびペントピラノシル修飾が含まれるがこれらに限定されない。ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合などの結合、修飾された結合、またはオリゴヌクレオチドのその相補的標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを妨害しない非ヌクレオチド部分によって連結されてもよい。修飾された結合には、標準的なホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合などの様々な結合で置き換えられている結合が含まれる。核酸塩基サブユニットは、例えば、中心二級アミンへのカルボキシメチルリンカーによって核酸塩基サブユニットを連結する２−アミノエチルグリシンバックボーンなどの擬似ペプチドバックボーンで、ＤＮＡの天然のデオキシリボースリン酸バックボーンを置き換えることによって連結されてもよい。擬似ペプチドバックボーンを有するＤＮＡアナログは、一般的には、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」と呼ばれ、Ｎｉｅｌｓｅｎら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」米国特許第５，５３９，０８２号によって開示されている。他の結合の修飾には、モルホリノ結合が含まれるがこれに限定されない。
【００７２】
本明細書で意図されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴの非限定的な例には、二環式および三環式のヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログを含む核酸アナログ（ＬＮＡ）が含まれる。Ｉｍａｎｉｓｈｉら、米国特許第６，２６８，４９０号；およびＷｅｎｇｅｌら、米国特許第６，６７０，４６１号を参照のこと。修飾オリゴヌクレオチドがその意図される機能を、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件もしくは増幅条件下で標的核酸にハイブリダイズし、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼと相互作用し、それによって伸長または転写を開始することが実施できるならば、任意の核酸アナログが本明細書によって意図される。検出プローブの場合においては、修飾オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸に優先的にハイブリダイズ可能であることもまた必須である。
【００７３】
オリゴヌクレオチドの設計および配列は、以下に記載されるように、それらの機能に依存する。考慮されるべきいくつかの変数には、長さ、融解温度（Ｔｍ）、特異性、系の中での他のオリゴヌクレオチドとの相補性、Ｇ／Ｃ含量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）またはポリプリン（Ａ、Ｇ）ストレッチ、および３’末端配列が含まれる。これらおよび他の変数を制御することは、オリゴヌクレオチド設計の標準的かつ周知の態様であり、多数の潜在的なオリゴヌクレオチドを最初にスクリーニングするために、種々のコンピュータプログラムが容易に利用可能である。
【００７４】
オリゴヌクレオチド（または他の核酸）の３’末端は、以下に記載されるように、ブロッキング部分を使用して、様々な方法でブロックすることが可能である。「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ−またはＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによる、その３’末端へのオリゴヌクレオチドの付加によって、ＤＮＡの相補鎖を生成するために効率的に伸長されない。このように、「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは「プライマー」にはなり得ない。
【００７５】
ブロッキング部分
ブロッキング部分は、小さな分子、例えば、リン酸またはアンモニウム基であってもよく、あるいはこれは、修飾ヌクレオチド、例えば、３’２’ジデオキシヌクレオチドもしくは３’デオキシアデノシン５’三リン酸（コルジセピン）または他の修飾ヌクレオチドであってもよい。さらなるブロッキング部分には、例えば、３’末端に遊離のヒドロキシル基が存在しないように、３’から５’の方向を有するヌクレオチドもしくは短いヌクレオチド配列の使用、３’アルキル基、３’非ヌクレオチド部分（例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら、「Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」米国特許第６，０３１，０９１号を参照のこと）、ホスホロチオエート、アルカン−ジオール残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、３’末端に３’ヒドロキシル基を欠くヌクレオチド残基、または核酸結合タンパク質の使用が含まれる。好ましくは、３’ブロッキング部分は、３’から５’の方向または３’非ヌクレオチド部分を有するヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含み、３’２’ジデオキシヌクレオチドまたは遊離のヒドロキシル基を有する３’末端を含まない。３’ブロッキングオリゴヌクレオチドを調製するためのさらなる方法は当業者には周知である。
【００７６】
プライミングオリゴヌクレオチドまたはプライマー
プライミングオリゴヌクレオチドは、その３’末端に共有結合されたヌクレオチド塩基の付加によって伸長され、その塩基は鋳型に対して相補的である。結果はプライマー伸長産物である。適切かつ好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは本明細書に記載されている。知られている実質的にすべてのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、ＤＮＡ合成を開始するために一本鎖鋳型（「プライミング」）へのオリゴヌクレオチドの複合体形成を必要とするのに対して、ＲＮＡの複製および転写は（ＤＮＡからのＲＮＡのコピー作製）、一般的に、プライマーを必要としない。ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるまさしくその性質により、プライミングオリゴヌクレオチドは３’ブロッキング部分を含まない。
【００７７】
プロモーターオリゴヌクレオチド／プロモーター配列
結合するために、このようなトランスクリプターゼは、伸長反応を経由してプロモーター配列を含む領域中で二本鎖にされたＤＮＡを必要としたと一般的に考えられていた。しかし、ＲＮＡの効率的な転写は、二本鎖プロモーターが鋳型核酸との伸長反応を通して形成されない条件下でさえも起こり得ることが決定された。鋳型核酸（転写される配列）は二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、種々の異なるプロモーター配列を認識し、これらは、転写を促進する際のそれらの効率が顕著に変化し得る。ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するためにプロモーター配列に結合するとき、そのプロモーター配列は転写される配列の一部ではない。従って、それによって産生されるＲＮＡ転写物は、その配列を含まない。
【００７８】
終結オリゴヌクレオチド
終結オリゴヌクレオチドまたは「ブロッカー」は、新生核酸鎖についての所望の３’末端を達成するために十分な位置において、標的核酸にハイブリダイズするように設計される。終結オリゴヌクレオチドの位置決めは、その設計に依存して柔軟性がある。終結オリゴヌクレオチドは、修飾されているかまたは非修飾であり得る。特定の実施形態において、終結オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いて合成される。これらの修飾ヌクレオチドは、相補的二重鎖のより高い熱安定性を実証した。２’−Ｏ−メチルリボヌクレアーゼはまた、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を増加させるように機能し、それによって、修飾オリゴヌクレオチドの半減期を増加させる。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｍａｊｌｅｓｓｉら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，２２２４−９を参照のこと。本明細書の他の箇所に記載されているような他の修飾は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに加えて、またはその代わりに利用されてもよい。例えば、終結オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡまたはＬＮＡを含んでもよい。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，４４−５３を参照のこと。終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、伸長を妨害するために、その３’末端においてブロッキング部分を含む。終結オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる新生核酸鎖の伸長をさらに終結させるように、オリゴヌクレオチドに連結されたタンパク質またはペプチドもまた含んでもよい。適切かつ好ましい終結オリゴヌクレオチドは本明細書に記載される。終結オリゴヌクレオチドは、典型的にはまたは必然的に３’ブロッキング部分を含むのに対し、「３’ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、必ずしも終結オリゴヌクレオチドである必要はないことが注目される。本明細書に開示されるような他のオリゴヌクレオチド、例えば、プロモーターオリゴヌクレオチドおよびキャッピングオリゴヌクレオチドは、同様に、典型的にはまたは必然的に３’ブロックされている。
【００７９】
エクステンダーオリゴヌクレオチド
エクステンダーオリゴヌクレオチドは、プロモーターオリゴヌクレオチドの最初の領域の３’末端に隣接するかまたはその近傍のＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする。エクステンダーオリゴヌクレオチドは、好ましくは、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基がプロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端塩基の３塩基、２塩基、または１塩基以内にあるように、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする。最も好ましくは、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基は、エクステンダーオリゴヌクレオチドおよびプロモーターオリゴヌクレオチドがＤＮＡ鋳型にハイブリダイズされるときに、プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に隣接している。エクステンダーオリゴヌクレオチドの伸長を妨害するために、３’末端ブロッキング部分が典型的には含まれる。
【００８０】
プローブ
当業者によって理解されるように、プローブは、ヒトの介入なしで天然には見い出されない型である（例えば、外因性核酸で組換えされ、単離され、またはある程度まで精製されている）、単離された核酸分子またはそのアナログを含む。プローブは、ヌクレオシドまたは核酸塩基がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションに実質的に影響を与えない限り、検出プローブの場合には、標的核酸への優先的なハイブリダイゼーションを妨害しない限り、標的とされる領域の外側のさらなるヌクレオシドまたは核酸塩基を有してもよい。標的捕捉配列（一般的には、ホモポリマートラクト、例えば、ポリＡ、ポリＴ、またはポリＵテール）、プロモーター配列、ＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位などの非相補的配列もまた含められてもよく、または、プローブ上または標的核酸上またはその両方での触媒活性部位またはヘアピン構造などの所望の二次構造または三次構造を付与する配列を含んでもよい。
【００８１】
プローブは、好ましくは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。この標識は、以下を含むがこれらに限定されない、任意の適切な標識物質であり得る：放射性同位元素、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、燐光分子、電気化学発光分子、発色団、言及した条件下で標的核酸に安定にハイブリダイズできない塩基配列領域、およびこれらの混合物。１つの特定の好ましい実施形態において、標識はアクリジニウムエステルである。本明細書に開示されているような特定のプローブは標識を含まない。例えば、非標識「捕捉」プローブは、標的配列またはその複製で富化されるために使用されてもよく、次いで、これは、第２の「検出」プローブによって検出されてもよい。例えば、それによって参照により本明細書に援用される、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら「Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」米国特許第６，５３４，２７３号を参照のこと。検出プローブは典型的には標識されているが、特定の検出技術はプローブが標識されることを必要としない。例えば、Ｎｙｇｒｅｎら「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」米国特許第６，０６０，２３７号を参照のこと。
【００８２】
規定された配列のプローブは、当業者に公知である技術によって、例えば、化学合成によって、および組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現によって、製造されてもよい。好ましくは、プローブは、１０〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは１２〜５０塩基長、およびさらにより好ましくは１８〜３５塩基長である。
【００８３】
ハイブリダイズ／ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションは、それによって、安定な二本鎖ハイブリッドを形成するための所定の反応条件下で、完全にまたは部分的に相補的なヌクレオチド配列を有する２つの核酸鎖が一緒になるプロセスである。核酸鎖は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）またはそのアナログのいずれかであり得る。従って、ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはそのアナログを含むことができる。時折ハイブリッドと呼ばれる、この二本鎖構造の構成要素である２つの鎖は、水素結合によってまとめられている。これらの水素結合は、単一の核酸鎖上で塩基アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で最も一般的には形成しているが、塩基対形成は、これらの「基準の」対合のメンバーではない塩基間でもまた形成し得る。基準ではない塩基対形成は当該分野において周知である（例えば、Ｒｏｇｅｒ Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓら「Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」（第１１版、１９９２））を参照のこと）。
【００８４】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特定の検出プローブが、試験サンプル中に存在する他の核酸ではなく、標的核酸とハイブリダイズすることが可能である条件をいう。これらの条件は、プローブのＧＣ含量および長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、および探求されるハイブリダイゼーションの特異性の程度を含む要因に依存して変化してもよいことが理解される。特定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の開示において提供される。
【００８５】
核酸増幅
核酸増幅の多くの周知の方法は、二本鎖核酸を変性させ、そしてプライマーをハイブリダイズすることを交互に行う熱サイクルを必要とする；しかし、核酸増幅の他の周知の方法は等温である。一般的にはＰＣＲと呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号）は、変性、プライマー対の逆ストランドへのアニーリング、および標的配列のコピー数を指数関数的に増加させるためのプライマー伸長の複数のサイクルを使用する。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれるバリエーションでは、逆転写酵素（ＲＴ）が、ｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製するために使用され、次いで、ｃＤＮＡがＰＣＲによって増幅されて、ＤＮＡの複数のコピーを生成する。ＬＣＲと一般的に呼ばれるリガーゼ連鎖反応（Ｗｅｉｓｓ、Ｒ．１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４ １２９２）は、標的核酸の隣接する領域にハイブリダイズする相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの２つのセットを使用する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーション、およびライゲーションの反復サイクルにおいてＤＮＡリガーゼによって共有結合され、検出可能な二本鎖のライゲーションされたオリゴヌクレオチド産物を生成する。別の方法は、ＳＤＡと一般的に呼ばれる鎖置換増幅であり（Ｗａｌｋｅｒ、Ｇ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６、米国特許第５，２７０，１８４号および同第５，４５５，１６６号）、これは、標的配列の逆ストランドへのプライマー配列の対のアニーリング、ｄＮＴＰαＳの存在下での二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を生成するためのプライマー伸長、ヘミ修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介ニック形成、ならびに既存の鎖を置き換え、かつ次のラウンドのプライマーアニーリング、ニック形成、および鎖置き換えのための鎖を生成する、ニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介プライマー伸長のサイクルを使用して、産物の幾何学的な増幅を生じる。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、本質的に同じ方法において、より高い温度で好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用する（ヨーロッパ特許第０ ６８４ ３１５号）。他の増幅方法には以下が含まれる：一般的にはＮＡＳＢＡと呼ばれる、核酸配列に基づく増幅（米国特許第５，１３０，２３８号）；一般的にはＱ−βレプリカーゼと呼ばれる、プローブ分子それ自体を増幅するためにＲＮＡレプリカーゼを使用するもの（Ｌｉｚａｒｄｉ、Ｐ．ら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６ １１９７−１２０２）；転写に基づく増幅方法（Ｋｗｏｈ、Ｄ．ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）；自律的な配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．ら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）；および一般的にはＴＭＡと呼ばれる転写媒介増幅（米国特許第５，４８０，７８４号および同第５，３９９，４９１号）。公知の増幅方法のさらなる議論については、Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．、１９９３、「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら編）所収、５１−８７頁（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ）を参照のこと。
【００８６】
好ましい実施形態において、サルモネラは、転写に基づく増幅技術によって検出される。１つの好ましい転写に基づく増幅系は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）であり、これは、ＲＮＡポリメラーゼを利用して、標的領域の複数のＲＮＡ転写物を生成する。例示的なＴＭＡ増幅方法は、米国特許第５，４８０，７８４号、同第５，３９９，４９１号、同第７，３７４，８８５号、およびそこに引用されている参考文献に記載されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。ＴＭＡは、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で標的核酸にハイブリダイズする「プロモーター−プライマー」を使用して、そこからＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ転写物を生成する二本鎖プロモーターを形成する。これらの転写物は、ＲＮＡ転写物にハイブリダイズする能力がある第２のプライマーの存在下で、ＴＭＡのさらなるラウンドのための鋳型となることができる。熱変性を必要とするＰＣＲ、ＬＣＲ、または他の方法とは異なり、ＴＭＡは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化するためにＲＮａｓｅ Ｈ活性を使用する等温方法であり、それによって、ＤＮＡ鎖を、プライマーまたはプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションのために利用可能にする。一般的に、増幅のために提供される逆転写酵素に付随するＲＮａｓｅ Ｈ活性が使用される。
【００８７】
ＴＭＡ法の１つのバージョンにおいて、１つの増幅プライマーは、二本鎖になり、標的配列の５’に配置されたときに機能的になるプロモーター配列を含む、オリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーであり、これは、増幅される配列に対して３’の位置において標的ＲＮＡの結合部位にハイブリダイズする能力がある。プロモーター−プライマーは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識について特異的である場合に、「Ｔ７プライマー」と呼ばれてもよい。特定の状況下で、プロモーター−プライマーの３’末端、またはこのようなプロモーター−プライマーの亜集団は、プロモーター−プライマー伸長をブロックまたは減少するために修飾されてもよい。非修飾プロモーター−プライマーから、逆転写酵素は、標的ＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製するが、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、標的ＲＮＡを分解する。次いで、第２の増幅プライマーがｃＤＮＡに結合する。このプライマーは、「Ｔ７プライマー」からそれを区別するために「非Ｔ７プライマー」と呼ばれてもよい。この第２の増幅プライマーから、逆転写酵素は別のＤＮＡ鎖を作製し、一方の末端に機能的プロモーターを有する二本鎖ＤＮＡを生じる。二本鎖となったときに、プロモーター配列は、プロモーター−プライマーがハイブリダイズされる標的配列の転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼを結合する能力がある。ＲＮＡポリメラーゼは、このプロモーター配列を使用して、複数のＲＮＡ転写物（すなわち、アンプリコン）、一般的には、約１００〜１，０００コピーを生成する。各々の新たに合成されたアンプリコンは、第２の増幅プライマーとアニーリングすることができる。次いで、逆転写酵素がＤＮＡコピーを作製できるのに対して、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、このＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡを分解する。次いで、プロモーター−プライマーは、新たに合成されたＤＮＡに結合でき、逆転写酵素が二本鎖ＤＮＡを作製することを可能にし、そこからＲＮＡポリメラーゼは複数のアンプリコンを生成する。従って、数１０億倍の等温増幅が、２つの増幅プライマーを使用して達成することができる。
【００８８】
ＴＭＡの別のバージョンは、核酸をインビトロで増幅するために１種のプライマーおよび１種以上のさらなる増幅オリゴマーを使用し、サンプル中の標的配列の存在を示す転写物（アンプリコン）をもたらす（Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第７，３７４，８８５号に記載されており、その詳細は、それによって参照により本明細書に援用される）。手短に述べると、単一プライマーＴＭＡ法は、プライマー（または「プライミングオリゴマー」）、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を妨害するように修飾されている（例えば、３’ブロッキング部分を含めることによる）修飾プロモーターオリゴマー（または「プロモーター−プロバイダー」）、および選択的に、標的鎖からのｃＤＮＡの伸長を終結させるための結合分子（例えば、３’ブロックされたエクステンダーオリゴマー）を使用する。本明細書で言及される場合、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供する、ブロックされたプロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドである。この方法は、標的配列の複数のコピーを合成し、そしてプライミングオリゴマーおよび結合分子を用いて、標的配列を含む標的ＲＮＡを処理する工程を含み、ここで、プライマーは、標的鎖の３’末端にハイブリダイズする。ＲＴは、プライマーの３’末端からのプライマー伸長を開始して、標的鎖との二重鎖の中にあるｃＤＮＡ（例えば、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ）を生成する。３’ブロックされたエクステンダーオリゴマーなどの結合分子が反応において使用される場合、これは、標的配列の５’末端に隣接するか近傍にある標的核酸に結合する。すなわち、結合分子は、増幅される標的配列の５’末端の次の標的鎖に結合する。プライマーがＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されてｃＤＮＡを生成する場合、そのｃＤＮＡの３’末端は結合分子の位置によって決定される。なぜなら、プライマー伸長産物が標的鎖に結合した結合分子に到達したときに重合が停止するからである。従って、ｃＤＮＡの３’末端は、標的配列の５’末端に対して相補的である。ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈ）がＲＮＡ鎖を分解するときに分離されるが、当業者は、任意の型の鎖分離が使用されてもよいことを認識している。次いで、プロモーター−プロバイダーオリゴマーが、ｃＤＮＡ鎖の３’末端近傍のｃＤＮＡにハイブリダイズする。このプロモーター−プロバイダーオリゴマーは、ＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列およびｃＤＮＡの３’領域における配列に対して相補的である３’領域を含む。プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、プロモーター−プロバイダーオリゴマーの３’末端からのＤＮＡ合成の開始を妨害するブロッキング部分を含む修飾３’末端もまた有する。プロモーター−プロバイダー：ｃＤＮＡ二重鎖において、ｃＤＮＡの３’末端は、鋳型としてプロモーターオリゴマーを使用して、ＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されて、ｃＤＮＡにプロモーター配列を加え、そして機能的な二本鎖プロモーターを作製する。次いで、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼは機能的プロモーターに結合し、そしてｃＤＮＡに相補的であり、最初の標的鎖から増幅された標的領域配列と実質的に同一である複数のＲＮＡ転写物を転写する。次いで、得られた増幅ＲＮＡは、プライマーを結合すること、およびさらなるｃＤＮＡ産生のための鋳型として働くことによって、再度このプロセスを通してサイクルを回すことができ、最終的には、サンプル中に存在する最初の標的核酸から多くのアンプリコンを生成する。単一プライマー転写関連増幅法のある実施形態は、結合分子を含まず、それゆえに、プライマーから作られたｃＤＮＡ産物は確定できない３’末端を有するが、増幅工程は、すべての他の工程について上記に記載されたように実質的に進行する。
【００８９】
適切な増幅条件は、本開示を考慮して、当業者によって容易に決定されることが可能である。「増幅条件」は、本明細書に開示される場合、核酸増幅を可能にする条件をいう。増幅条件は、ある実施形態において、本明細書に記載されるような「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」よりもストリンジェントではなくてもよい。本明細書において開示されるような、増幅反応において使用されるオリゴヌクレオチドは、増幅条件下でそれらの意図される標的に特異的でありかつハイブリダイズしてもよいが、特定の実施形態において、よりストリンジェントな条件下でハイブリダイズしてもよいし、ハイブリダイズしなくてもよい。一方、検出プローブは、一般的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。下記の実施例の節は標的核酸配列を増幅するための好ましい増幅条件を提供するが、核酸増幅を実行するための他の受容可能な条件は、利用される増幅の特定の方法に依存して、当業者によって容易に確認可能である。
【００９０】
本明細書に開示されるような増幅方法は、特定の実施形態において、増幅反応の感度、選択性、効率などの改善のために有効であるオリゴヌクレオチドの１つ以上の他の型の使用もまた、好ましく用いる。これらには、例えば、終結オリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドなどが含まれてもよい。
【００９１】
標的捕捉
特定の実施形態において、例えば、標的捕捉アプローチを使用して、増幅の前にサンプルからの標的核酸を精製または富化することが好ましくあり得る。「標的捕捉」（ＴＣ）とは、一般的に、磁気的に引きつけることが可能な粒子などの固体支持体に標的ポリヌクレオチドを捕捉することをいい、ここでは、固体支持体が、標的ポリヌクレオチドの精製手順の１回以上の洗浄工程の間に標的ポリヌクレオチドを保持している。このやり方で、標的ポリヌクレオチドは、次の核酸増幅工程の前に実質的に精製される。多数の標的捕捉方法が公知であり、本明細書に記載される方法と併せての使用のために適切である。
【００９２】
任意の支持体、例えば、溶液中で遊離しているマトリックスまたは粒子が使用されてもよく、これは、種々の材料のいずれか、例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、または金属製であってもよい。説明的な例は、磁気的に引きつけることが可能な粒子、例えば、単分散常磁性ビーズ（均一サイズ、＋−．５％）である支持体を使用し、これに固定化プローブが直接的に（例えば、共有結合、キレート化、またはイオン的相互作用を介して）または間接的に（例えば、リンカーを介して）結合し、この結合は核酸ハイブリダイゼーション条件の間に安定である。
【００９３】
例えば、米国特許出願第２００６００６８４１７号に記載されるような１つの例証的なアプローチは、標的相補的な領域を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴヌクレオチド、および捕捉支持体上の固定化プローブに標的核酸を結合する特異的な結合対のメンバーを使用し、従って、標的核酸が捕捉支持体から遊離される前に、他のサンプル成分から分離されている捕捉ハイブリッドを形成する。
【００９４】
別の例証的な方法において、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら、米国特許第６，１１０，６７８号は、捕捉プローブ、および好ましくは温度のみが異なる２つの異なるハイブリダイゼーション条件を使用することによって、結合した固定化プローブを用いて、磁気的に引きつけることが可能な粒子などの固体支持体上にサンプル中の標的ポリヌクレオチドを捕捉するための方法を記載している。２つのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの次数を制御し、ここでは、第１のハイブリダイゼーション条件は、標的ポリヌクレオチドへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、第２のハイブリダイゼーション条件は、固定化プローブへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にする。この方法は、捕捉された標的ポリヌクレオチドまたは増幅された標的ポリヌクレオチドを検出することによって、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出するために使用されてもよい。
【００９５】
別の例証的な標的捕捉技術（米国特許第４，４８６，５３９号）は、標的ポリヌクレオチドを捕捉するため、およびその存在を検出するための、ハイブリダイゼーションサンドイッチ技術を含む。この技術は、固体支持体に結合したプローブによる標的ポリヌクレオチドの捕捉、および捕捉された標的ポリヌクレオチドへの検出プローブのハイブリダイゼーションを包含する。標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない検出プローブは、固体支持体から容易に洗浄除去される。従って、残っている標識は、最初にサンプル中に存在している標的ポリヌクレオチドに付随している。
【００９６】
別の例証的な標的捕捉技術（米国特許第４，７５１，１７７号）は、標的ポリヌクレオチドと、固体支持体上に固定されたポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズするメディエーターポリヌクレオチドを使用する方法を包含する。このメディエーターポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドを固体支持体に結合して、結合した標的を生成する。標識プローブは結合した標的にハイブリダイズ可能であり、非結合標識プローブは固体支持体から洗浄除去できる。
【００９７】
さらに別の例証的な標的捕捉技術は、標的ポリヌクレオチドを検出するための方法を記載している、米国特許第４，８９４，３２４号および同第５，２８８，６０９号に記載されている。この方法は、標的の同じ鎖または逆ストランドに相補的な２つの一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを利用し、標的ポリヌクレオチドとの二重ハイブリッドの形成を生じる。１つの実施形態において、ハイブリッドは支持体に捕捉される。
【００９８】
別の例証的な標的捕捉技術、ＥＰ特許公開第０ ３７０ ６９４号において、核酸を検出するための方法およびキットは、プライマーおよびプライマー伸長産物を固定化するために特異的結合パートナーを用いて標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。この標識は、固体支持体に結合されているその受容体と特異的に複合体を形成する。
【００９９】
上記の捕捉技術は例示のみであって、限定ではない。確かに、増幅の前に目的の標的核酸配列を精製するために有効であるならば、当業者に利用可能である本質的に任意の技術が使用されてもよい。
【０１００】
核酸検出
特異的核酸ハイブリダイゼーションをモニタリングするために使用できる本質的に任意の標識および／または検出系が、サルモネラアンプリコンを検出することに連動して使用できる。このような多くの系が公知でありかつ当業者に利用可能であり、その説明的な例は以下で手短に議論される。
【０１０１】
検出系は、典型的には、目的の標的核酸の検出を容易にするために１つの型または別の型の検出オリゴヌクレオチドを利用する。検出は、直接的（すなわち、プローブは標的に直接的にハイブリダイズされる）または間接的（すなわち、プローブは、標的にプローブを連結する中間体構造にハイブリダイズされる）のいずれかであってもよい。プローブの標的配列は、一般的には、プローブが特異的にハイブリダイズするより大きな配列の中の特異的配列をいう。検出プローブは、標的配列が存在するか否かに依存して、プローブの三次元構造に寄与する標的特異的配列および他の配列または構造を含んでもよい（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８３５，５４２号、および同第６，８４９，４１２号）。
【０１０２】
多数の周知の標識系のいずれかが、検出を容易にするために使用されてもよい。直接的結合が共有結合または非共有結合的相互作用（例えば、水素結合、疎水性相互作用またはイオン性相互作用、ならびにキレートまたは配位錯体形成）を使用してもよいのに対して、間接的結合は、検出可能なシグナルを増幅する架橋部分またはリンカー（例えば、抗体またはさらなるオリゴヌクレオチドを介する）を使用してもよい。任意の検出可能な部分、例えば、放射性核種、ビオチンまたはアビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応基、色素または検出可能な色を付与する粒子（例えば、ラテックスまたは金属ビーズ）などの発色団、発光化合物（例えば、生物発光、燐光、または化学発光化合物）、および蛍光化合物が使用されてもよい。好ましい実施形態は、均質系で検出可能である「均質な検出可能な標識」を含み、ここでは、混液中の結合された標識プローブが、非結合標識プローブと比較して検出可能な変化を示し、これは、ハイブリダイズしていない標識プローブからハイブリダイズした標識プローブを物理的に取り出すことなく、標識が検出されることを可能にする（例えば、米国特許第６，００４，７４５号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。好ましい均質な検出可能な標識には化学発光化合物が含まれ、より好ましくは、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、周知である標準ＡＥまたはＡＥ誘導体が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，９４８，８９９号）。標識を合成する方法、核酸に標識を結合させる方法、および標識からのシグナルを検出する方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第１０章、ならびに米国特許第６，４１４，１５２号、同第５，１８５，４３９号、同第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，６３９，６０４号、同第４，５８１，３３３号、および同第５，７３１，１４８号）。核酸にＡＥ化合物を連結する好ましい方法は公知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，６３９，６０４号、カラム１０、第６行〜カラム１１、第３行、および実施例８）。好ましいＡＥ標識位置は、プローブの中心領域およびプローブの３’末端もしくは５’末端における、または公知の配列とのミスマッチ部位上もしくは近傍における、Ａ／Ｔ塩基対の領域の近傍であり、すなわち、このプローブは、所望の標的配列と比較して検出されないはずである。
【０１０３】
好ましい実施形態において、少なくともある程度の自己相補性を示すオリゴヌクレオチドは、検出の前にハイブリダイズしていないプローブの除去を最初に必要とすることなく、試験サンプル中のプローブ：標的二重鎖の検出を容易にするために望ましい。例として、変性条件に曝露されたときに、完全にまたは部分的に相補的である分子トーチの２つの相補的な領域は融解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件に戻されたときに、標的配列に対するハイブリダイゼーションのために利用可能な標的結合ドメインを残す。分子トーチは、標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインよりも、標的配列へのハイブリダイゼーションへ優勢であるように設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズされる場合とは反対に、分子トーチが自己ハイブリダイズされる場合に異なるシグナルが生成されるように配置された相互作用標識（例えば、蛍光／クエンチャー対）を含み、それによって、プローブに付随する実行可能な標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で、試験サンプル中のプローブ：標的二重鎖の検出を可能にする。分子トーチは米国特許第６，３６１，９４５号に完全に記載されており、その開示はそれによって参照により本明細書に援用される。
【０１０４】
使用されてもよい自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、一般的に「分子ビーコン」と呼ばれる構造である。分子ビーコンは、標的相補的配列、標的核酸配列の非存在下で閉じたコンホメーションでプローブを保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが開いたコンホメーションにあるときに相互作用する標識対を有する核酸分子である。標的核酸への分子ビーコン標的相補的配列のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、それによって、プローブを開いたコンホメーションにシフトさせる。この開いたコンホメーションへのシフトは、例えば、蛍光団およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であり得る、標識対の相互作用の減少に起因して検出可能である。分子ビーコンは米国特許第５，９２５，５１７号に十分に記載されており、その開示はそれによって参照により本明細書に援用される。特定の核酸配列を検出するために有用な分子ビーコンは、本明細書に開示されているプローブ配列の１つのいずれかの末端に、蛍光団を含む第１の核酸アーム、およびクエンチャー部分を含む第２の核酸アームを付加することによって作製されてもよい。この配置において、サルモネラ特異的プローブ配列は、得られた分子ビーコンの標的相補的「ループ」部分として働いてもよい。
【０１０５】
分子ビーコンは、好ましくは、検出可能な標識の相互作用的な対で標識される。好ましい検出可能な標識は、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴエネルギー移動メカニズムによって互いと相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、発色団の間の共鳴相互作用による、原子間距離よりも顕著に大きな距離にわたる、熱エネルギーへの転換を伴わず、かつドナーとアクセプターが動力学的衝突の状態になることがない、分子または分子の系における吸収の部位からその利用の部位までのエネルギー量子の無放射伝播を含む。「ドナー」は最初にエネルギーを吸収する部分であり、「アクセプター」はエネルギーが次に移動される部分である。ＦＲＥＴに加えて、少なくとも３つの他の「非ＦＲＥＴ」エネルギー移動プロセスが存在し、それによって、励起エネルギーはドナーからアクセプター分子へ移動可能である。
【０１０６】
１つの標識から放射されたエネルギーが第２の標識によって受容または吸収されることが可能であるように、２つの標識が十分に密接して保持される場合、ＦＲＥＴメカニズムによるかまたは非ＦＲＥＴメカニズムでよるかに関わらず、その２つの標識は「エネルギー移動関係」にあるといわれる。この場合、例えば、分子ビーコンがステム二重鎖の形成によって密接な状態に維持され、分子ビーコンの１つのアームに結合された蛍光団からの蛍光放射は、他のアーム上にクエンチャー部分によってクエンチされる場合である。
【０１０７】
分子ビーコンについての例証的な標識部分は、蛍光団、および蛍光クエンチング特性を有する第２の部分（すなわち、クエンチャー）を含む。この実施形態において、特徴的なシグナルは、おそらく特定の波長の蛍光であるが、代替的には、可視光シグナルであり得る。蛍光が含まれる場合、発光の変化は好ましくはＦＲＥＴに起因し、または放射的なエネルギー移動もしくは非ＦＲＥＴモードに起因する。密接した状態で相互作用的な標識の対を有する分子ビーコンが適切な波長の光によって刺激される場合、蛍光シグナルは最初のレベルで生成され、これは非常に低い可能性がある。この同じ分子ビーコンが開いた状態でありかつ適切な波長の光によって刺激される場合、蛍光団およびクエンチャー部分は、それらの間のエネルギー移動が実質的に除外されるように、互いから十分に離れている。この条件下では、クエンチャー部分は、蛍光団部分からの蛍光をクエンチすることは不可能である。蛍光団が適切な波長の光エネルギーによって刺激される場合、第１のレベルよりも高い、第２のレベルの蛍光シグナルが生成される。２つのレベルの蛍光の間の違いは検出可能でありかつ測定可能である。この様式で蛍光団部分およびクエンチャー部分を使用すると、分子ビーコンは「開いた」コンホメーションにおいてのみ「オン」であり、容易に検出可能なシグナルを発することによって、プローブが標的に結合していることを示す。プローブのコンホメーションの状態は、標識部分の間の相互作用を調節することによって、プローブから生成するシグナルを変化させる。
【０１０８】
非ＦＲＥＴからＦＲＥＴを区別するための試みを行わずに使用される可能性があるドナー／アクセプター標識対の例には、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン（ｅｏｓｉｎｅ）／ＤＡＢＣＹＬ、エリトロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が含まれる。当業者は、ドナーおよびアクセプター色素が異なる場合には、エネルギー移動は、アクセプターの感作された蛍光の出現によって、またはドナー蛍光のクエンチングによって検出可能であることを理解している。ドナーおよびアクセプター種が同じ場合、エネルギーは、得られる蛍光偏光解消によって検出可能である。ＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹ ７色素などの非蛍光アクセプターは、直接的な（すなわち、感作されていない）アクセプター励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題を有利に排除する。ドナー−アクセプター対の１つのメンバーとして使用できる好ましい蛍光団部分には、フルオレセイン、ＲＯＸ、およびＣＹ色素（ＣＹ５など）が含まれる。ドナー−アクセプター対の別のメンバーとして使用できる高度に好ましいクエンチャー部分には、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能であるＤＡＢＣＹＬおよびブラックホールクエンチャー（ｔｈｅ Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）部分が含まれる。
【０１０９】
合成技術ならびに核酸に標識を結合させる方法および標識を検出する方法は当該分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、第１０章、Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、同第５，６５６，２０７号、Ｈｏｇａｎら、同第５，５４７，８４２号、Ａｒｎｏｌｄら、同第５，１８５，４３９号および同第６，００４，７４５号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、同第４，５８１，３３３号、ならびにＢｅｃｋｅｒら、同第５，７３１，１４８号を参照のこと）。
【０１１０】
好ましいサルモネラオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセット
本明細書で使用される場合、本明細書に開示されるようなサルモネラ核酸を増幅および検出するための好ましい部位は、サルモネラ２３Ｓ ｒＲＮＡの３５０領域に存在することが見い出されている。さらに、この領域中の特に好ましいオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットは、感度、選択性、および特異性の改善を伴ってサルモネラ２３Ｓを増幅するために同定された。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、高度な特異性でサルモネラ標的配列にハイブリダイズ可能であり、結果として、サンプル中のサルモネラの存在および／またはレベルを検出し、かつ他の腸内細菌の存在からサルモネラを区別するために使用できる核酸増幅反応に加えることが可能であることが理解される。
【０１１１】
例えば、１つの実施形態において、増幅オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、高度な特異性で、サルモネラ２３ｓ ｒＲＮＡの３５０領域を標的とする。当然、本明細書に開示される増幅オリゴヌクレオチドを議論する際には、増幅反応において使用される第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、増幅される標的核酸配列の逆ストランドに対して特異性を有することが理解される。
【０１１２】
本明細書に開示される増幅オリゴヌクレオチドは、転写に基づく増幅反応、好ましくは、リアルタイム転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応においてサルモネラの標的核酸配列を増幅するために特に有効である。
【０１１３】
増幅反応において使用される特定のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドに加えて、さらなるオリゴヌクレオチドもまた、一般的には、増幅反応と連動して利用されることが理解される。例えば、特定の実施形態において、増幅反応は、検出オリゴヌクレオチド（例えば、トーチオリゴヌクレオチド）およびブロッカーオリゴヌクレオチドの１つ以上の使用もまた利用する。
【０１１４】
表１は、本発明によって同定された、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチド、およびその他の付属的なオリゴヌクレオチド（例えば、ブロッカー、トーチ、および標的捕捉オリゴヌクレオチド）の特定の例を提示する。
【０１１５】
【表１−１】
【０１１６】
【表１−２】
【０１１７】
【表１−３】
【０１１８】
【表１−４】
加えて、表２は、本明細書に開示されるような組成物、キット、および方法における使用のための２つの特に好ましいオリゴヌクレオチドセットを同定する。
【０１１９】
【表２】
優れたアッセイ性能を生じる、３５０領域から誘導された特に好ましい増幅オリゴヌクレオチドが同定されたが、同じかまたは類似の性能の対象が達成されるならば、３５０領域から誘導され、かつ本明細書に具体的に記載されたものからの実体的ではない修飾を有する他のオリゴヌクレオチドもまた使用されてもよいことが認識される。例えば、３５０領域から誘導され、かつ本明細書に開示されるような増幅反応において有用であるオリゴヌクレオチドは、それが増幅および／または検出の手順に実質的に影響を与えないならば、本明細書に同定されたものとは異なる長さを有することが可能である。好ましいオリゴヌクレオチドに対するこれらのおよび他の日常的かつ実質的ではない修飾は、従来的な技術を使用して実行することが可能であり、そしてこのような修飾が本明細書に提供された１つ以上の利点を維持する程度まで、これらは本発明の技術思想および範囲の中にあると見なされる。
【０１２０】
本明細書に開示されるような一般的原理は、以下の非限定的な実施例の参照によって、より完全に理解され得る。
【実施例】
【０１２１】
特定の態様および実施形態を例証する実施例が以下に提供される。以下の実施例は、実際に実施された実験の詳細を正確に反映していると考えられるが、しかし、実際に行われた研究と以下に示された実験の詳細の間に、何らかのわずかな不一致が存在する可能性があるが、このことは、これらの実験の結論またはこれらの実験を実施する実務者の能力に影響を与えるものではないことが可能である。実務者は、これらの実験が本発明をそこに記載されている特定の実施形態に限定することを意図しないことを理解している。加えて、当業者は、本明細書に記載される技術、材料、および方法を使用して、本発明の技術思想および範囲の中に留まりながら、これらおよび関連する方法を実行するために代替的な増幅系を容易に工夫および最適化できる。
【０１２２】
他に言及されない限り、以下の実施例におけるオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは、標準的なホスホルアミダイト化学を使用して合成され、その種々の方法は当該分野において周知である。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、１５４ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８７（１９８７）を参照のこと。本明細書において他に言及されない限り、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであって、これは、ホスホルアミダイトアナログとして合成において使用された。単一プライマー増幅において使用されるブロックされたオリゴヌクレオチドについては（Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第７，３７４，８８５号、それによって参照により本明細書に援用される）、３’末端ブロッキング部分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号２０−０１０２−０１）を使用して調製された「逆向きＣ」３’から３’連結からなった。分子トーチ（それによって参照により本明細書に援用される、Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第６，８４９，４１２号を参照のこと）は、標準的な方法によってオリゴヌクレオチドに結合された、Ｃ９非ヌクレオチド（トリエチレングリコール）リンカー結合領域（Ｓｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ９、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１０−１９０９−ｘｘ）、５’−フルオレセイン（「Ｆ」）蛍光団、および３’−ｄａｂｓｙｌ（「Ｄ」）クエンチャー部分を使用して調製された。
【０１２３】
以下の実施例において示されるように、広範な種々の増幅試薬および条件の分析物が、サルモネラの検出のために高感度かつ選択的な増幅プロセスの開発に導いてきた。様々な標的濃度の複数の分析物の複製の生のリアルタイム増幅アッセイチャート（例えば、図１を参照のこと）は、オリゴヌクレオチドセットの品質を評価するために利用した。リアルタイムアッセイからのデータは、以下の本明細書のデータの提示のためにＴ時間値およびＲＦＵ範囲を計算するために収集および分析した。
【０１２４】
実施例１
例証的なアッセイ試薬およびプロトコールの説明
以下の実施例は、本明細書に記載されるリアルタイムＴＭＡ実験において使用される典型的なアッセイ試薬、プロトコール、条件などを説明する。反対のことが特定されない限り、試薬調製、設備の準備、およびアッセイプロトコールは、本質的に以下に示されるように実施した。
【０１２５】
Ａ．試薬およびサンプル
１．増幅試薬。「増幅試薬」または「Ａｍｐ試薬」は、以下の成分のおよその濃度を含んだ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．７中、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、１０ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１２．７ｍＭ ＵＴＰ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および３３ｍＭ ＫＣｌ。プライマーおよび他のオリゴヌクレオチドは、Ａｍｐ試薬に加えた。
【０１２６】
２．酵素試薬。「酵素試薬」は、以下の成分のおよその濃度を含んだ：１２０ｍＭ ＫＣｌ、１０％ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１６０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ ７．０中、１１８０ ＲＴＵ／μＬ モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素（「ＲＴ」）および２６０ ＰＵ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ここで、１ＲＴＵのＲＴ活性は３７℃で２０分間に基質に１ｎｍｏｌのｄＴを取り込み、１ＰＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ活性は３７℃で２０分間で５ｆｍｏｌのＲＮＡ転写物を産生する。
【０１２７】
３．洗浄溶液。「洗浄溶液」は、ｐＨ ７．５までの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ。
【０１２８】
４．標的捕捉試薬。「標的捕捉試薬」（ＴＣＲ）は、以下の成分のおよその濃度を含んだ：ｄＴ３ｄＡ３０テールを有する捕捉プローブおよび任意に捕捉ヘルパープローブの１種以上、各６０ｐｍｏｌ／ｍＬ、２５０〜３００μｇ／ｍＬ常磁性オリゴ（ｄＴ）１４微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）、２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＥＤＴＡおよび１．８８Ｍ ＬｉＣｌ、ｐＨ ６．５。
【０１２９】
５．溶解試薬。「溶解緩衝液」は、１００ｍＭ ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ コハク酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および５００ｍＭ ＬｉＣｌ、ｐＨ ６．５を含む緩衝液中の１％ラウリル硫酸リチウムを含んだ。
【０１３０】
６．標的ｒＲＮＡサンプル。ｒＲＮＡサンプルは、本明細書に記載される実験における使用の前に、水、０．１％ ＬｉＬＳ、または溶解試薬の中で保存した。
【０１３１】
Ｂ．設備および材料
・キングフィッシャー（ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ）（登録商標）９６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）
・ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
・エッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）（登録商標）サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）Ｒ ０２２６７０５６５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）
・ハードシェルシンウォール９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート（Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｓｋｉｒｔｅｄ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅｓ）、着色シェル／白色ウェル、カタログ番号：ＨＳＰ−９６１５、ＨＳＰ−９６２５、ＨＳＰ−９６３５）（ＢｉｏＲａｄ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）
・キングフィッシャー（ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ）（登録商標）９６チップコーム、ＤＷマグネット用（カタログ番号：９７００２５３４）Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）
・ＤＷ ９６プレート、Ｖ底、ポリプロピレン、滅菌２５ｐｃｓ／ケース（Ａｘｙｇｅｎ カタログ番号：Ｐ−２ＭＬ−ＳＱ−Ｃ−Ｓ；ＶＷＲカタログ番号４７７４９−８７４）
・キングフィッシャー（ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ）（登録商標）９６ＫＦプレート（２００マイクロリットル）（カタログ番号：９７００２５４０）
・ＰＴＩ（登録商標）プレートリーダー
・Ｃｈｒｏｍｏ４（商標）プレートリーダー
Ｃ．標的捕捉
サンプルは、標的を遊離させ、ｒＲＮＡを安定化するために溶解試薬と混合した。標的捕捉試薬を加えた。キングフィッシャー９６精製システムを使用して、リボソームＲＮＡ試薬を捕捉し、磁気粒子上で精製した。粒子は、分析物用にＦＡＭ標識されたトーチを、内部対照用にＴＡＭＲＡ標識されたトーチを含む増幅試薬中に再懸濁した。引き続く増幅のために核酸サンプルを精製および調製するための典型的な標的捕捉手順は、本質的に以下に記載されるように実施した。１００μＬの試験サンプル、標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む５０μＬのＴＣＲ、および１ｍＬ 溶解試薬を合わせ、６０℃で１５分間インキュベートした。洗浄溶液ならびに適切な磁気粒子洗浄および分離デバイス（例えば、磁気分離ラック、ＧＥＮ−ＰＲＯＢＥ（登録商標）Ｔａｒｇｅｔ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅカタログ番号５２０７、またはＴｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓから利用可能であるキングフィッシャー（登録商標）磁気粒子プロセッサーシステム）を使用して、処理された反応混液からのＴＣＲ磁気粒子を捕捉および洗浄した。洗浄後、磁気粒子は１００μＬの増幅試薬に再懸濁した。
【０１３２】
Ｄ．標的の増幅および検出
リアルタイムＴＭＡ増幅反応は、本質的に以下のように実施した。Ａｍｐ試薬中の３０μＬのサンプル、増幅および検出オリゴヌクレオチド、または標的捕捉手順からのＡｍｐ試薬中３０μＬの再懸濁粒子を、６０℃で１０分間インキュベートした。次いで、エッペンドルフサーモミキサーインキュベーター上で温度を低下させ、反応混液を４２℃まで１５分間平衡化させた。１０μＬの酵素試薬を加えた。分析物および内部対照の同時の増幅および検出のために、反応混液を混合し、リアルタイム検出システム（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから利用可能であるＯｐｔｉｃｏｎ（商標）もしくはＣｈｒｏｍｏ４（商標）検出システム、またはＰＴＩ ＦｌｕｏＤｉａ（登録商標）Ｔ７０機器）の中で、４２℃にて７５分間、インキュベートした。
【０１３３】
実施例２
サルモネラオリゴヌクレオチドセットの設計および初期試験
Ｅ．ｃｏｌｉ ｒＲＮＡ配列の３５０領域に対応する領域を使用して、いくつかのＴ７プロバイダー、ブロッカー、プライマー、およびトーチを設計した。この領域は他の非サルモネラ腸内細菌に対して独特であるミスマッチを含むので、この領域を選択した。
【０１３４】
Ｔ７、ブロッカー、プライマー、およびトーチオリゴヌクレオチドの総計４２６セットを、プレートスクリーニングプロトコールを使用してスクリーニングした。好ましいオリゴヌクレオチドの配列番号を表３に示す。オリゴヌクレオチドの番号および使用した濃度は；８種の異なるＴ７（５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）；７種の異なるブロッカー（０．５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）；１２種の異なるプライマー（５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）、および５種の異なるトーチ（８ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）であった。使用した標的はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ １３０７６／ＧＰ６０）ｒＲＮＡ、反応あたり１Ｅ＋４コピーであった。収集した生のデータを分析して、Ｔ時間値およびＲＦＵ範囲を計算した。導き出されたデータは、３０分未満のＴ時間を与えたセット、３０〜３５分の間のＴ時間を与えたセット、および３５〜３９分であったものに分類した（表４）。
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
【表４−１】
【０１３７】
【表４−２】
二次スクリーニングは、最初のスクリーニングに基づいて４２の潜在的オリゴヌクレオチドセット上で実施した。使用したオリゴヌクレオチドを表５に示す。
【０１３８】
【表５】
Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＧＰ６０）ｒＲＮＡに対する反応性を繰り返したのに加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＧＰ８８／ＡＴＣＣ１０７９８）ｒＲＮＡに対する予備的な交差反応性試験もまた実施した。これらの結果から、Ｅ．ｃｏｌｉと交差反応しないか、またはＥ．ｃｏｌｉと交差反応するが出現時間に遅れがあるかのいずれかであった４セットを同定した。これらの４つのオリゴヌクレオチドセットを表６に示す。
【０１３９】
【表６】
他の腸内細菌（すなわち、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）に対する初期の特異性試験は、４つのオリゴヌクレオチドセットすべてについて実施した。これらの４つのオリゴヌクレオチドセットから、最良のオリゴヌクレオチドセットをセット番号３として同定した。なぜなら、これはＥ．ｃｏｌｉ（ＧＰ８８）、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、およびＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉと交差反応しなかったからである。これはまた、サルモネラ属の下の他の種であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉも検出した。サルモネラ２３Ｓオリゴヌクレオチドセット番号３の反復試験は、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅのより多くの複製、ならびに３種のＥ．ｃｏｌｉ株（ＧＰ３／ＡＴＣＣ２５９２２、ＧＰ８８／ＡＴＣＣ１０７９８、およびＧＰ８３１／ＡＴＣＣ２９２１４）を用いて行った。Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ．ｂｏｎｇｏｒｉ ｒＲＮＡは、以前に得られたのと同様のレベルまで再度検出した。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＧＰ８３１）もまた、このオリゴヌクレオチドのセットによって検出した。
【０１４０】
代替的な領域
サルモネラ属研究課題のための設計は、１６Ｓ ｒＲＮＡの４５０領域において開始した（表７）。配列は、上記に議論した２３Ｓ ｒＲＮＡにおけるものと同じ様式でスクリーニングした。アッセイのための設計は、塩基４５０から４９０の間に示されるミスマッチに焦点を当てた。Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ株およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ株は、この領域においてサルモネラと同一ではないとしても、非常に近いことが示された。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉおよびＳ．ａｒｉｚｏｎａｅは、他のサルモネラよりもＥ．ｃｏｌｉに類似しており、偽陰性生成のリスクをもたらすこともまた決定された。初期のスクリーニング結果は、試験したＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ株およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ株を区別することが１６Ｓオリゴヌクレオチド系では不可能であることを示した。このデータは、この系に固有であった非常に高い偽陽性の割合を示した。初期のスクリーニング結果に基づいて、代替的な設計（２３Ｓ−３５０領域）を用いて先に進めることを決定した。ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒが区別できなかったからである。
【０１４１】
【表７−１】
【０１４２】
【表７−２】
【０１４３】
【表７−３】
従って、２３Ｓ ｒＲＮＡの３５０領域は、この領域についてのＴ７プロバイダーおよびプライマーオリゴヌクレオチドが、試験した多くの他のオリゴヌクレオチドセットと比較して、単一プライマーＴＭＡアッセイにおいて最高シグナルおよび最低バックグラウンドを示したという知見に基づいて、さらなる最適化のために好ましい領域として選択した。ＴＭＡアッセイにおけるオリゴヌクレオチドのスクリーニングを実施し、様々なトーチおよびブロッカーもまた分析した。最良のオリゴヌクレオチドセットを選択するための判断基準には、１Ｅ＋５コピーのサルモネラｒＲＮＡにおいて最低のバックグラウンドおよび最高のシグナルを有することを含めた。
【０１４４】
実施例３
サルモネラオリゴヌクレオチドセットのさらなる同定
バックグラウンドシグナルをさらに減少させ、特異性および感度を改善するために、多数のさらなるオリゴヌクレオチドセットを設計し、試験した。
【０１４５】
オリゴヌクレオチドセット番号３に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて見い出されるミスマッチを利用していくつかの再設計したＴ７プロバイダーおよびプライマーオリゴヌクレオチドを同定した。リアルタイムＴＭＡは、再設計した２３Ｓ Ｔ７プロバイダーおよびプライマーオリゴヌクレオチドに対して実行した。使用したオリゴヌクレオチドの数および濃度は以下の通りであった：１０種の異なるＴ７プロバイダー（５ｐｍｏｌ／反応）；１種のブロッカー（０．５ｐｍｏｌ／反応）；６種のプライマーオリゴヌクレオチド（５ｐｍｏｌ／反応）および１種のトーチオリゴヌクレオチド（８ｐｍｏｌ／反応）。オリゴヌクレオチドの同定は表８に示す。
【０１４６】
【表８】
使用した標的は、反応あたり１Ｅ＋４コピーのＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０ ｒＲＮＡ、反応あたり１Ｅ＋４コピーのＳ．ｂｏｎｇｏｒｉ、１Ｅ＋６コピー／ｒｘｎのＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８８ ｒＲＮＡ、および１Ｅ＋６コピー／ｒｘｎのＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８３１ ｒＲＮＡであった。総計６０セットを試験し、この再設計したセットからの１０個の潜在的なオリゴヌクレオチドセットを、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓについて相当のＴ時間およびＲＦＵ範囲を与えるとして同定したが、いくつかはＳ．ｂｏｎｇｏｒｉと反応しなかったか、またはＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８８および／またはＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８３１と交差反応した（表９）。
【０１４７】
【表９】
＊０個の標的はより低いＴ時間および同じＲＦＵを有した；＊＊０個の標的はより高いＴ時間およびより低いＲＦＵを有した。より低いＴ時間およびより高いＴ時間とは、それぞれ、シグナルのより初期およびより後期の出現をいう。
【０１４８】
リアルタイムＴＭＡは、以下の濃度を使用して上記の１０セットのサブセットをスクリーニングするために使用した：５ｐｍｏｌ／反応のＴ７プロバイダー；０．５ｐｍｏｌ／ｒｘｎのブロッカーオリゴヌクレオチド；５ｐｍｏｌ／反応のプライマーオリゴヌクレオチド；および８ｐｍｏｌ／ｒｘｎのトーチオリゴヌクレオチド。使用した標的は１Ｅ＋４ｃｐｓ／ｒｘｎのＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ｒＲＮＡ、１Ｅ＋４ｃｐｓ／ｒｘｎのＳ．ｂｏｎｇｏｒｉ；１Ｅ＋７ｃｐｓ／ｒｘｎの１３種のＥ．ｃｏｌｉ株；１Ｅ＋６ｃｐｓ／ｒｘｎのＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ；１Ｅ＋６ｃｐｓ／ｒｘｎのＥ．ｃｌｏａｃａｅ；１Ｅ＋６ｃｐｓ／ｒｘｎの２種のＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ株、および１Ｅ＋６ｃｐｓ／ｒｘｎのＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉであった。
【０１４９】
Ｔ７プロバイダーおよびプライマーオリゴヌクレオチドは、混合およびマッチして、表１０に示される試験に４つの可能なセットを提供した。
【０１５０】
【表１０】
これらのセットは、１３種すべてのＥ．ｃｏｌｉ株（ＡＴＣＣ番号２５９２２、１１７７５、１０７９８、３５１５０、３３７８０、２３７２２、２５４０４、２９２１４、２９１９４、３５３５９、２３４９９、１２７９２、および２３５０３）に対して試験し、次いで、他の腸内細菌に対して試験した。Ｔ時間およびＲＦＵの結果を互いに比較した。Ｅ．ｃｏｌｉの結果から得られた最良の３種のオリゴヌクレオチドセットを使用して、いくつかの他の腸内細菌に対して、セット番号３、７、および９を使用してリアルタイムＴＭＡを実行した。３種すべてのオリゴヌクレオチドセットは、それぞれ２８分、２５分、および２３分のＴ時間でＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａを拾い上げた。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉもまた、これらの３種のオリゴヌクレオチドセットによって、それぞれ３２分、３０分、および２６分のＴ時間で拾い上げた。いくつかの他の腸内細菌は、ある程度の交差反応性を示したが、非常に遅い出現時間および低いＲＦＵレベルを有した。
【０１５１】
得られた結果に基づいて、さらなるアッセイ試験および最適化は２種のオリゴヌクレオチドセット：番号７および９に焦点を合わせた（表１０）。オリゴヌクレオチドセット番号７および９を使用して、純粋系（標的捕捉工程がない）におけるＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０ ｒＲＮＡの様々なコピーレベルを検出する感度を試験した。１Ｅ＋５コピーにおいて、Ｔ時間は両方のセットのオリゴヌクレオチドについて、低い２０分範囲であった。オリゴヌクレオチドセット番号７は１００コピーレベルで複製の８３％を検出した。オリゴヌクレオチドセット番号９は、５０コピーレベルで複製の１００％を検出した。
【０１５２】
実施例４
サルモネラオリゴヌクレオチドセットのさらなる特徴付けおよび最適化
セット番号９よりも良好な特異性を示すセット番号７の結果、およびセット番号７よりもより良好な感度を示すセット番号９の結果に基づいて、Ｔ７プロバイダーとプライマーの両方のオリゴヌクレオチドの新たなオリゴヌクレオチド再設計を準備した。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドセット番号７
新たに再設計されたＴ７オリゴヌクレオチドプロバイダーは、配列番号５９のブロッカー配列、配列番号４９のプライマー配列、および配列番号６６のトーチ配列と組み合わせて、試験し、もともとの配列番号１のＴ７プロバイダー配列と比較し、Ｅ．ｃｏｌｉに対して最小限の交差反応性を提供した。増幅性能は、セット番号７と比較した、各セットのオリゴヌクレオチドについて評価した。標的はすべて、配列番号７４の配列を使用して、標的捕捉工程を経由した。これらのデータおよび曲線の形状から、配列番号２４および２６のＴ７プロバイダー配列をさらに評価するために選択した。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドセット番号９
Ｅ．ｃｏｌｉへの他の可能なミスマッチを利用するように、およびＥ．ｃｏｌｉへの配列番号４９の配列の交差反応性を減少させるために、配列番号５０および５１のプライマーオリゴヌクレオチドを配列番号４９の配列から再設計した。試験は、ベースライン性能測定を確立するために、標的捕捉なしで行った。
【０１５５】
表１１は再設計されたオリゴヌクレオチドを提示する。再設計されたオリゴヌクレオチドは、ゼロｒＲＮＡコピーレベルにおいて、最低の相対蛍光単位（ＲＦＵ）および最長のＴ時間を有した。ゼロｒＲＮＡコピーレベルにおける高いＲＦＵは、試薬中の汚染の可能性を示した。
【０１５６】
【表１１】
得られた結果に基づいて、オリゴヌクレオチドセット番号１がセット番号９よりも良好な特異性を有することが決定された。このオリゴヌクレオチドセットは、Ｅ．ｃｏｌｉに対してより少ない交差反応性を有し、さらなる研究のためのオリゴヌクレオチド系の１つとして使用した。
【０１５７】
さらなる研究のために使用した他のオリゴヌクレオチドセットはセット番号２であった。これらの２つのオリゴヌクレオチドセットを選択するための構造的な根拠は、他の腸内細菌からサルモネラを区別するための十分なミスマッチ、およびすべてのサルモネラ亜種を検出するための十分なマッチの組み合わせに基づいた。これは、増幅系が必要とされる特異性および感度を達成することを可能にする。これらの２つの好ましいオリゴヌクレオチドは表２に示す。
【０１５８】
確認試験を両方のオリゴヌクレオチドセットに対して実施した。セット番号１については、分析物用のＴ７（１５ｐｍｏｌ）、プライマー（１５ｐｍｏｌ）、およびブロッカー（５ｐｍｏｌ）、ならびにＩＣ用のＴ７（２ｐｍｏｌ）およびプライマー（２ｐｍｏｌ）を新たな濃度で使用して、Ｔ時間（１Ｅ＋５−１Ｅ＋４ Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ標的コピーにおいて少なくとも１０〜１５分早い）と曲線形状（直立形状および急な曲線）の両方に有意な改善が存在した。セット番号２については、分析物用のＴ７（１５ｐｍｏｌ）およびプライマー（１５ｐｍｏｌ）、ならびにＩＣ用のＴ７（２ｐｍｏｌ）およびプライマー（２ｐｍｏｌ）を使用して、Ｔ時間（１Ｅ＋５−１Ｅ＋４ Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ標的コピーにおいて少なくとも１０〜１７分早い）と曲線形状（直立形状および急な曲線）の両方に有意な改善が存在した。
【０１５９】
実施例５
標的捕捉組み込みおよび内部対照（ＩＣ）組み込みの評価
７種のサルモネラ２３Ｓ標的捕捉オリゴヌクレオチド（配列番号７１〜７７）を、２つのセットの増幅オリゴヌクレオチド：セット番号７およびセット番号９を使用して試験した。標的捕捉手順は、様々な量のＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０ ｒＲＮＡで、１Ｅ＋７コピーのＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８８ ｒＲＮＡに対して実施した。２種の潜在的に有用な標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）配列を同定した（配列番号７１および７４）。全体として、観察されたＴ時間は、純粋な系よりも約８〜１０分遅かった。配列番号７４の標的捕捉オリゴヌクレオチドは、すべての引き続く実験における使用のために選択した。
【０１６０】
キングフィッシャー９６を用いる標的捕捉の方法は表１２に要約する。増幅および酵素試薬は再構成した。洗浄プレートは、２００μＬ／ウェルの洗浄溶液でＫＦ２００プレートを満たすことによって調製した。ａｍｐプレートは、１００μＬ／ウェルの増幅試薬で別のＫＦ２００プレートを満たすことによって調製した。ａｍｐプレートと洗浄プレートの両方は使用するまでカバーをかけた。サンプルプレートは、２ｍＬの深いウェルの９６ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ）に５０μＬ ＴＣＲ／ウェルを加えることによって調製した。標的は、１０μＬ溶解溶液中で必要とされる濃度まで希釈した。１ｍｌの溶解溶液をサンプルプレートの各ウェルに加えた。反復ピペッターを用いて、１０μＬの標的溶液を適切な深いウェルに加えた。深いウェルチップコームをサンプルプレート中に配置した。洗浄プレートおよびａｍｐプレートのカバーを取り外した。ＫＦ９６プロトコールを開始し、３つすべてのプレートをＫＦ９６機器に配置した。ａｍｐプレートを位置４まで配置し、洗浄プレートを位置３に、そしてサンプルプレート（深いウェルプレート）を位置１に配置した。ＫＦ９６機器の位置２は空のままであった。一旦プレートがロードされると、ＫＦ９６機器は標的捕捉工程を開始した。ＫＦ９６の実行が完了したとき、プレートは取り外した。ａｍｐプレートから、マルチチャンネルピペッターを使用して各ウェルより３０μＬを取り出し、ＭＪ９６ウェルＰＣＲプレートに移した。
【０１６１】
【表１２】
内部対照（ＩＣ）は、標的捕捉を用いてサルモネラプロトタイプアッセイに組み込んだ。このＩＣオリゴヌクレオチドのセットは、１９〜２０分間の範囲にある平均Ｔ時間を用いてサルモネラ系のために十分な性能を発揮し、そして曲線は急な、鋭い、そして直立状であった。ＩＣ組み込みを用いると、サルモネラアッセイの感度は約１０倍低下したが、これは他の腸内細菌に対する特異性に影響を与えないように見えた。
【０１６２】
【表１３】
実施例６
感度、特異性、干渉、検出限界、交差反応性、および結果までの時間
ステージＩ
感度
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １３０７６を１Ｅ＋５コピー／反応でアッセイした。溶解緩衝液を陰性対照として使用した。標的捕捉のためにキングフィッシャー９６機器を、検出のためにＰＴＩリーダーを使用して、２０の陽性（１０５コピーのｒＲＮＡ／アッセイ）を試験した。２０の陰性（溶解緩衝液）を対照として使用した。標的捕捉のためのインプットは１ｍＬであり、標的捕捉のためのアウトプットは１００μＬであり、そのうちの３０μＬを増幅において使用した。陽性判断基準は１，０００ＲＦＵであった。２０の複製のうち１９は、＞９５％陽性比率で検出されるべきものであった。初期のラウンドの試験後に、１９未満の複製が陽性であった場合、４０のさらなる複製が試験されるべきであった。ステージＩ−感度の試験は、１Ｅ＋５コピー／反応でＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓについての１００％比率の陽性を生じ、０コピーで０％偽陽性を生じた。
【０１６３】
特異性
標的生物に密接に関連しているが、ｒＲＮＡ分析によって遺伝子型が区別される生物を陰性として選択した。標的捕捉のためにキングフィッシャー９６機器を、プライマーのアニーリングおよび酵素添加のためにエッペンドルフサーモミキサーを、および検出のためにＰＴＩリーダーを使用して、８例のチャレンジ生物を１Ｅ＋７コピー／ｒｘｎで試験した。すべてのチャレンジ生物（８）の２０回の反応を、増幅した各反応の１つの複製とともに試験した（１０５コピーのｒＲＮＡ、約１００ＣＦＵ／アッセイ）。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １３０７６を、１Ｅ＋５コピー／ｒｘｎで陽性対照として使用し、溶解溶液を陰性対照として使用した。陽性判断基準は１，０００ＲＦＵであった。１６０反応のうちの８反応以下は、≦５％の合わせた偽陽性比率の目的に合致するべきものであった（１０５コピーの非標的ｒＲＮＡを区別し、検出しない）。８例の生物にわたるいかなる偽陽性の分散も考慮されるべきものであった。集団化した偽陽性を有する生物≧４は、再試験され、さらに調べられるべきものであった。ステージＩ特異性試験は、試験したチャレンジ生物のいずれに対しても０％陽性を示し、陽性対照では１００％陽性であった。
【０１６４】
干渉
目的は、サンプル濃縮デバイスから得られることが予想される、一定量の溶解緩衝液に混入された１０〜１００ＣＦＵ ｒＲＮＡにほぼ等価であるｒＲＮＡの反復可能な検出であった。試験は、低コピー数の所望のｒＲＮＡおよび１０７コピーｒＲＮＡ（約１０，０００ＣＦＵ）の最も近い近隣生物を含めることであった。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １３０７６は、ベースライン標的として使用し、１Ｅ＋５コピーｒＲＮＡ／反応で試験した（約１００ＣＦＵ）。８例のチャレンジ生物は、０（溶解溶液のみ）または１Ｅ＋７コピー（約１０，０００ＣＦＵ）の濃度でサンプルに混入した。キングフィッシャー９６およびＰＴＩリーダーを使用してアッセイを実施した。すべての条件は、１２の複製で、１，０００ＲＦＵの陽性判断基準で試験した。結果は、最も近い近隣生物の存在下での陽性の再現性を報告するものであった。試験した生物にわたる干渉の分散は考慮されるべきものであった。干渉を示す生物は、再試験され、さらに調査されるべきものであった。ステージＩ干渉試験は、すべてのチャレンジサンプルおよび陽性対照において１００％陽性を示した。
【０１６５】
微生物フローラ決定
２０例の家禽洗浄液をＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅで分析して、家禽洗浄液に関連する通常フローラの見積もりを提供した。２０例の洗浄液のうちの１８例が、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅの外部の供給源から受容した１バッチの一部であった。その他の２例のサンプルが、２箇所の地方の食料品店で購入したニワトリからＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅで導き出された。ＴＳＡプレート上での総好気性菌数のための希釈プレーティングを行った。各家禽洗浄液サンプルの１Ｅ＋１〜１Ｅ＋４の希釈は、１×リン酸緩衝化生理食塩水中で調製した。１００μＬの非希釈、１Ｅ＋１〜１Ｅ＋４の洗浄液希釈液を、トリプシン処理ダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート上でプレーティングした。
【０１６６】
コロニー形成は、プレートを３０℃および３５〜３７℃で、２４〜４８時間の間、インキュベーションした後で実施した。異なる形態を表すコロニーは、ＲｉｂｏＰｒｉｎｔｅｒ（登録商標）微生物特徴付けシステムによる同定のために、ＰＡＣＥ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に送った。ＴＳＡ計数およびリボプリンティングに加えて、サンプルは、緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）で富化され、続いて、ＴＴブロスまたはｍＲＳＶブロス（半固形）のいずれかで選択的富化を行った。選択的富化を行った。選択的富化からのサンプルは、さらなる選択性のために、ＢＧＳとＸＬＴ４寒天プレートの両方でプレートした。ＢＩＯＬＯＧ同定およびグラム染色／オキシダーゼ試験を、代表的なコロニーに対して実施した。結果は、家禽洗浄液における通常のフローラを示した。
【０１６７】
サルモネラ選択のために、９０ｍｌ緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）は、１０ｍｌの家禽洗浄液を接種し、３５℃で２４時間、富化した。１０ｍｌのｍＲＳＶ（改変Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ−Ｂｏｕｉｌｌｉｏｎ）ブロスに１００μＬの富化サンプルを接種し、振盪しながら、４２℃で２４時間インキュベートした。１０ｍｌのＴＴブロス（Ｈａｊｎａ）に５００μＬの富化サンプルを接種し、振盪しながら、４２℃で２４時間インキュベートした。両方の選択培地（ｍＲＳＶおよびＴＴ）からの１０μＬサンプルを、ＸＬＴ４（キシロースリジンテトラチオネート）とＢＧＳ（ブリリアントグリーンセレナイト）の両方の寒天プレート上にプレートした。接種したプレートは３５℃でインキュベートし、２４時間および４８時間に調べた。ＸＬＴ４プレートおよびＢＧＳプレートからの選択したコロニーは、反対の培地にプレートした。例えば、コロニーをＸＬＴ４プレートから選択する場合、これはＢＧＳ培地上でプレートし、逆もまた同様であった（ｖｉｓａ ｖｅｒｓａ）。選択したコロニーはＴＳＡ上にプレートし、そこからＢＩＯＬＯＧ同定およびグラム染色／オキシダーゼ試験を実施して、微生物の同定を確認した。
【０１６８】
選択したコロニーのグリセロールストックを作り、微生物の同定の確認のためのリボプリンティングのためにＰＡＣＥ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌに送付した。
【０１６９】
ステージＩＩ
ステージＩＩ性能試験は、緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）中での予備増幅アッセイを評価した。この評価は純粋な培養溶解物を使用した。サンプル調製装置は含まれなかった。すべての陽性対照（１Ｅ＋５コピー／アッセイ）は、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＡＴＣＣ １３０７６から単離した精製ＲＮＡを使用し、陰性対照は溶解溶液：ＢＰＷ（７：３）であった。３００μＬ ＢＰＷおよび７００μＬ 溶解緩衝液（サンプルありまたはサンプルなし）を使用して、標的捕捉のための１ｍＬ インプットを作製した。標的捕捉のためのインプットは１ｍＬであり、標的捕捉のためのアウトプットは１００μＬであり、その３０μＬを増幅のために使用した。
【０１７０】
感度
Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ （ＡＴＣＣ １０７０８）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｔｙｐｈｉ（ＡＴＣＣ １９４３０）、およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ １３３１１）を、１Ｅ４−５Ｅ４コピーＲＮＡ／アッセイ（約１０〜５０ ＣＦＵ）のレベルで試験した。３つすべての種および陰性対照（混入していないＢＰＷ）は２０の複製で試験した。標的捕捉はキングフィッシャー９６機器上で実施し、エッペンドルフサーモサイクラー上での酵素添加を用い、続いてＰＴＩリーダー上での検出を行った。感度についての陽性判断基準パラメーターは１，０００ＲＦＵであった。２０の複製のうちの１９が陽性であるべきであった。２０のうちの１９未満が陽性であるならば、４０の複製のさらなる試験が必要であった。感度について試験したすべての生物はステージＩＩの要件を通過した。
【０１７１】
検出限界
目的は、アッセイインプット量あたり１０３〜１０４の等価なコピーｒＲＮＡ（約１〜１０ＣＦＵ）の反復可能な検出であった。反復可能な検出は≧９５％陽性として定義した。Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（ＡＴＣＣ １０７０８）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｔｙｐｈｉ（ＡＴＣＣ １９４３０）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ １３３１１）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ １３０７６）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ９１８４）、およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ａｒｉｚｏｎａｅ（ＡＴＣＣ ２９９３３）は、１Ｅ３−１Ｅ４コピーＲＮＡ／アッセイのレベルで試験した（約１〜１０ ＣＦＵ）。標的捕捉はキングフィッシャー９６機器上で実施し、エッペンドルフサーモミキサー上での酵素添加を用い、そしてＰＴＩリーダー上での検出を行った。各種について、２０の複製物で試験した。溶解物は、ＣＦＵ中で定量した純粋な培養標的生物から調製し、溶解して約１〜１０ＣＦＵに等価なレベルの核酸標的を提供した。陽性判断基準は１，０００ＲＦＵであった。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １３０７６は、陽性対照ならびに試験のために必要とされる株の両方で考慮した。ＬＯＤ試験のために、陽性対照ＲＮＡは１Ｅ＋４コピー／アッセイで使用した。判断基準は、試験した種のすべてについて≧９５％陽性であった。２０のうちの１９未満が陽性である場合、さらなる４０の複製のさらなる試験が必要であった。すべての生物がステージＩＩ要件を通過した。
【０１７２】
包括的種および排他的種の分析試験
２２例の包括的生物および２２例の排他的生物を、１Ｅ＋５コピー／アッセイ（約１００ＣＦＵ）で試験した。試験は、標的捕捉のためにキングフィッシャー９６機器上で実施し、エッペンドルフサーモミキサー上で酵素添加を行い、そして検出のためにＰＴＩリーダーを用いた。包括的種については４つの複製、排他的種については８つの複製ですべてを試験した。
【０１７３】
包括的種については４のうちの３の複製が陽性であるべきであり、排他的種については８のうちの１以下が陽性であるべきであった。これらの判断基準がいずれの生物にも合致しない場合、その種／株についての試験は１２の複製で反復され、ここで包括的種の１２のうちの１１の複製は反応性であるべきものであった。再試験後に包括性判断基準に失敗した生物の同一性はさらに調べられるべきであった。再試験判断基準に合致しない排他的種については［＜３／１２陽性］、交差反応する生物をさらに調べた。
【０１７４】
【表１４−１】
【０１７５】
【表１４−２】
【０１７６】
【表１５】
包括種（表１４）および排他種（表１５）のステージＩＩ分析試験についての試験を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉの包括性という単一のわずかな例外以外は、完全に考慮した。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉは４の複製の初期の試験（０陽性／４表示）および１２の複製の再試験（０陽性／１２表示）に際して検出しなかった（表１４）。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉについては、Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅのＭＴＣ−ＮＩ（カタログ番号４５７３）を使用するＲＮＡ濃度の決定後に、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ ＡＴＣＣ ４３９７５の現在のロットからの新たな溶解物チューブ上で再試験を行った。試験はＳ．ｂｏｎｇｏｒｉの他の株に対して行ったが、現在のサルモネラアッセイによっては何も増幅されなかった。この生物のまれな単離に起因して、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉの検出では、アッセイのための要件を考慮しなかった。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉは、３６，１８４個の単離物から２回単離されたのみであり、ｔｈｅ ＣＤＣ ２００５ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ａｎｎｕａｌ Ｓｕｍｍａｒｙによると上位３０種の単離物には入っていないからである。Ｓ．Ｃｕｂａｎａ再試験のために、初期試験において使用したのと同じロットから新たな溶解物チューブを使用した。再試験に際して、Ｓ．Ｃｕｂａｎａ（１２陽性／１２表示）は、再試験のためのステージ２受容可能判断基準を通過した。
【０１７７】
結果までの時間
ステージＩＩのための各アッセイ実行の時間は、サンプルを深いウェルプレートに加えた時点からＰＴＩリーダープロトコールの最後まで追跡した。サンプルローディングからＰＴＩリーダーの開始までの平均時間は、９６サンプルについて２時間１８分であった。ＰＴＩリーダー時間は７５分で不変であった。従って、開始から終了までの全体のアッセイは、９６サンプルについて平均で３時間３３分であった。
【０１７８】
これらの結果は、サルモネラの種特異的な検出が、リアルタイムＴＭＡデータの特徴に基づいて（例えば、ＲＦＵ曲線のサイズおよび形状はリアルタイムＴＭＡ反応から生成した）、密接に関連する生物の存在下においてさえ、これらの組成物および方法によって達成できることを示す。
【０１７９】
実施例７
混入した牛ひき肉およびアイスクリームの食品試験
日常生活サンプルを用いるプロトタイプサルモネラアッセイの機能性を試験するために、牛ひき肉およびアイスクリームを地方のスーパーマーケットから購入し、既知量のＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０を混入させ、そしてＳｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）サンプリングバッグ中の緩衝化ペプトン水中で増殖させた。様々な時点で、サンプルを取り出し、ＸＬＤ寒天選択培地を使用するコロニー係数のために、およびプロトタイプサルモネラアッセイを使用するリアルタイムＴＭＡのために処理した。本研究において続く種々の工程は以下に記載される。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０のＭｃＦａｒｌａｎｄ １を作製した。ＴＳＡプレート（無菌ＰＢＳ中で１Ｅ＋６まで希釈した）中のＣＦＵ計数の確認を実施した。２５ｇの食品を秤量し、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒバッグ中に無菌的に配置した。２０ＣＦＵを２２５ｍＬの緩衝化ペプトン水に直接接種した。混入させた培地は、食品を含有するＳｔｏｍａｃｈｅｒバッグに注ぎ、２分間、２００ｒｐｍで処理した。サンプルは３５℃でインキュベートした。１ｍＬアリコート（プレート計数における使用のために１アリコート）を０、４、６、８、および２４時間の時点で取り出した。サンプルは、ＣＦＵ計数のために、選択的寒天、ＸＬＤプレート上、３希釈、１プレート／希釈でプレートし、３５℃でインキュベートした。２４時間の時間内にサンプリングした残りの５アリコートは、１２，０００×ｇで３０秒間遠心分離した。上清を除去し、５００μＬの５０ｍＭ コハク酸緩衝液（０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％ ＬｉＬＳ、ｐＨ ４．８）をペレットに加え、次いで、２０秒間激しくボルテックスした。サンプルを少なくとも１５分間、＞９５℃に加熱した。次いで、これを、１２，０００×ｇで１分間遠心分離した。上清を新しい標識したチューブに移した。サンプルを−７０℃で凍結させた。食物対照は以下を含んだ：牛ひき肉については２つの陽性および２つの陰性、プレーンバニラアイスクリームについては２つの陽性および２つの陰性、ならびに培地のみの純粋系については２つの陽性および１つの陰性。
【０１８０】
サルモネラＣＦＵタイミングおよびプレート計数
２２５ｍｌの培地あたり１２ＣＦＵ周辺の接種材料を使用して、牛ひき肉に混入させたサルモネラは、緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）中での４時間のインキュベーション後に約２８０ＣＦＵ／ｍｌまで増殖した。混入させたアイスクリーム中では、ＢＰＷ中での６時間のインキュベーション後に２０ＣＦＵ／ｍｌを観察した。牛ひき肉は、アイスクリームよりも他の腸内細菌で実質的に多く汚染されており、４時間のインキュベーション後に１，０００ＣＦＵ／ｍｌを超えた。いかなる食品サンプルも有さない混入させた培地は、４時間のインキュベーション後に約２０ＣＦＵ／ｍｌであった。２４時間までに、ＢＰＷ中のすべての混入させた食品サンプルおよび混入させていない食品サンプルは＞１．５Ｅ＋７ ＣＦＵ／ｍｌを有した。すべての陰性の混入させていない培地対照はいかなる増殖も示さなかった。これらの結果は、ＣＦＵタイミングに関するリアルタイムＴＭＡから得られたデータおよびリアルタイムＴＭＡを使用する陽性検出可能シグナルの初期の出現を裏付ける。
【０１８１】
２２５ｍｌ ＢＰＷあたり１２ＣＦＵのサルモネラで混入させた食品サンプルについて、サルモネラについての陽性ＲＦＵシグナルは、牛ひき肉またはアイスクリームのいずれかにおいて４時間のインキュベーション後に観察された。混入させていない牛ひき肉対照の実行は８時間のインキュベーション後に陽性シグナルを生じ（生来の微生物汚染による）、混入させていないアイスクリーム対照の実行は２４時間のインキュベーション後に陽性シグナルを示した。両方の混入させていない食品サンプルにおいて、陽性シグナルは非常に遅く出現した（＞４０分）。混入させていない牛ひき肉サンプルにおいて、これらの偽陽性シグナルは、非常に高い核酸負荷で（例えば、このサンプル中では＞６Ｅ＋８コピーｒＲＮＡ／反応）、交差反応生物（最も可能性が高いのは他の腸内細菌）によって引き起こされたかもしれない。混入させていないアイスクリームサンプルにおいて、見かけの陽性シグナルは、ＸＬＤ選択培地中で増殖しなかったが、ＢＰＷ中で増殖した、生来のまたは汚染性の生物から誘導された。陽性対照（陽性の混入させた培地）は４時間〜２４時間の時点で陽性であった。陰性対照（陰性の混入させていない培地）は全体の実行を通して陰性のままであった。これらのデータは、リアルタイムＴＭＡが、ＢＰＷ中の最低限４時間の事前の富化に伴って、非常に低いレベルのサルモネラ汚染を検出するために使用できること、および全体のプロセスが、２つの短い（＜１分間）遠心分離工程を除いて、複雑なサンプル処理工程を必要としたことを示す。
【０１８２】
アッセイの要約
サルモネラ核酸の２つの領域、Ｅ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの約３８０〜約６３０ヌクレオチド塩基位置に対応する「４５０領域」およびＥ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの約１５０〜約４２５ヌクレオチド塩基位置に対応する「３５０領域」を標的とする増幅オリゴヌクレオチドおよび検出オリゴヌクレオチドを設計し、評価のために合成した。１６Ｓ−４５０領域における設計は、サルモネラ属アッセイのための良好なオリゴヌクレオチド候補を生じなかった。これらのオリゴヌクレオチドは、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒと交差反応した。
【０１８３】
アッセイの特異性および感度は、溶解した細菌ペレットを使用して評価した。細菌ペレットのＣＦＵおよびｒＲＮＡ標的レベルは、プレーティングによって、および直接ＤＮＡプローブアッセイによって見積もった。
【０１８４】
サルモネラアッセイは、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．の６つの異なる亜種および１６の血清型を含む２２種のサルモネラの株に対して１００％感受性であった。１つの例外はＳ．ｂｏｎｇｏｒｉであり、これは、標的領域において、他のサルモネラ種よりも、Ｅ．ｃｏｌｉに遺伝子型的に類似している。サルモネラアッセイは、１Ｅ＋５コピー／アッセイの２２種の非サルモネラ生物に対して１００％特異的であった。
【０１８５】
２種の食物基質（ｆｏｏｄ ｍａｔｒｉｃｅｓ）、アイスクリームおよび牛ひき肉（２５ｇ）にＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（約２０ＣＦＵ）を接種し、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ装置を通してブロス中で処理した。プレーティングおよびリアルタイムＴＭＡは、２４時間の時間経過にわたってモニタリングした。リアルタイムＴＭＡシステムは、１つは分析物に特異的であり、１つは内部対照に特異的である２つの蛍光プローブを利用した。結果は蛍光出現曲線に基づいて分析した。リアルタイムＴＭＡアッセイは４時間未満で実行し、食品施設において試験のために必要な数日間から数時間の時間を減少した。結果は、低レベルのサルモネラ汚染が８時間以内に検出できることを示し、これは、非選択培地中の４時間の事前の富化、続いてサンプル処理およびリアルタイムＴＭＡを含んだ。食品の存在下では、感度は約８０００コピー（約８ＣＦＵ／グラム食品）であった。高い核酸負荷からの干渉は、８時間の増殖後に１．８Ｅ＋１０コピー（約１．８Ｅ＋７ ＣＦＵ）／グラム食品で開始した。
【０１８６】
要約すると、リアルタイムＴＭＡ技術は、食品由来の病原体の迅速、高感度な検出のために適切であった。このアッセイは、所望の種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ． ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０／ＡＴＣＣ １３０７６について、１Ｅ＋４ ｒＲＮＡコピー／アッセイ（約１０ＣＦＵ）の感度を有し、一方、種々の最も近い近縁種および１Ｅ＋７ ｒＲＮＡコピー／アッセイ（約１０，０００ＣＦＵ）の潜在的に同時汚染フローラを除外した。磁気粒子標的捕捉技術を利用して、牛ひき肉サンプルおよびアイスクリームサンプルからの干渉は観察しなかった。データは、改善された富化プロトコールを伴う、サルモネラの単一の８時間ワークシフトの中で食品サンプルのスクリーニングを可能にした、迅速な試験形式を実証した。
【０１８７】
本明細書で言及されるか、または引用される、記事、特許、および特許出願、ならびにすべての他の文書および電子的に利用可能な情報の内容は、あたかも各々の個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により援用されるために示されるのと同じ程度まで、それによってそれらの全体が参照により援用される。出願人は、任意のこのような記事、特許、特許出願、または他の物理的および電子的な文書からのいかなるおよびすべての物質および情報を本願に物理的に援用する権利を留保した。
【０１８８】
本明細書に例証的に記載された方法は、本明細書には具体的には開示されていなかった、任意のエレメント、制限の非存在下で適切に実施されてもよい。従って、例えば、「含む」、「含有する」、「包含する」などの用語は、広範にかつ非限定的に読むべきである。さらに、本明細書で利用される用語および表現は、説明の用語として使用されており、限定の用語ではなく、そしてこのような用語および表現の使用において、示されるかもしくは記載される特徴の任意の等価物またはその一部を除外する意図は存在しない。種々の修飾が、特許請求された本発明の範囲の中で可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書に開示されそこで具体化された本発明の改変およびバリエーションが当業者によって再構築され得ること、ならびにこのような改変およびバリエーションは、本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。
【０１８９】
本発明は、本明細書において広範にかつ一般的に記載されてきた。この一般的開示の範囲内にあるより狭い種および亜属の分類の各々もまた、本発明の方法の一部を形成する。これには、除外された物質が具体的に本明細書に列挙されているか否かに関わらず、属からの任意の対象を除外する否定的な限定という条件付きで、方法の一般的記載が含まれる。
【０１９０】
他の実施形態は以下に続く特許請求の範囲の中にある。加えて、本発明の方法の特徴または態様がマーカッシュグループによって記載される場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによってもまた、それによって記載されることを認識する。
【背景技術】
【０００１】
サルモネラ属は、ヒト、動物、食物、および環境において見い出されるグラム陰性細菌の大きなファミリーの一部である。サルモネラは、ヒトに感染し、腸チフス、パラチフス、および食物が原因となる健康被害を引き起こす桿状腸内細菌である。米国においては、これは、最も頻繁に報告されている、食物が原因となる病気である。全世界規模では、これは、世界で２番目にありふれた、食物が原因となる健康被害である。サルモネラ中毒は、人口１００，０００人あたり１００〜３００人に影響を与える。２００５年には、およそ３６，０００件の症例がＣＤＣに報告された。サルモネラ中毒は、感染動物に由来するか、または糞便（動物またはヒト）によって汚染された食物の消化によって伝染する。徴候には、突然の頭痛の発症、腹痛、下痢、吐き気および時折の嘔吐を伴う急性全腸炎が含まれる。潜伏期間は６〜７２時間の間（平均１２〜３６時間）である。腸内細菌は、しばしば属を横切って共有される、複雑な遺伝子型および表現型の特徴を有している。結果として、それらのゲノムは、多くの共通配列を共有している。目的のサンプル中でサルモネラを特異的かつ選択的に同定可能である迅速かつ堅固な検出系についての必要性が当該分野において依然として存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本発明は、サルモネラの検出において使用される組成物、キット、および方法に関する。本発明は、少なくとも部分的に、特定のサルモネラ配列がサルモネラの検出のために驚くべきほどに有効であるという発見に基づいている。特定の態様および実施形態において、サルモネラ２３Ｓ ｒＲＮＡの特定の領域が、核酸増幅反応のための好ましい標的であるとして同定されており、これは、検出の特異性、感度、または速度に関しての改善、ならびにその他の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
従って、１つの態様に従って、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物が提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらの組成物は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００４】
第２の態様において、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物が提供される。本明細書において提供される態様の特定の実施形態において、これらの組成物は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００５】
第３の態様において、本明細書で提供される組成物を含むキットが提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらのキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００６】
第４の態様において、本明細書で提供される組成物を含むキットが提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらのキットは、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００７】
第５の態様において、本明細書で提供される組成物および／またはキットを使用してサンプル中のサルモネラの存在を検出するための方法が提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらの方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用し、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００８】
第６の態様において、本明細書で提供される組成物および／またはキットを使用してサンプル中のサルモネラの存在を検出するための方法が提供される。本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、これらの方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用し、ここで、上記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして上記プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、ここで、上記増幅アッセイにおいて使用される上記Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび上記プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅されるサルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする。
【０００９】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２６８〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。別の実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３１０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。さらに別の実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０９に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。特定の実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。特定の実施形態において、上記Ｔ７プロバイダーはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。
【００１０】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。別の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。さらに別の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする。
【００１１】
本明細書で提供される態様の特定の実施形態において、Ｔ７プロバイダーは配列番号１〜３４および相補物の配列から選択される。他の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、本明細書において規定されるように、配列番号３５〜５８および相補物の配列から選択される。ある好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーは配列番号１〜２６および相補物の配列から選択される。他の好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、本明細書において規定されるように、配列番号３５〜５１および相補物の配列から選択される。
【００１２】
本明細書で提供される態様の１つの特に好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーは配列番号１７または相補物の配列を有する。別の特に好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号５０または相補物の配列を有する。特に好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーは配列番号２６または相補物の配列を有する。別の特に好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号４９または相補物の配列を有する。
【００１３】
本明細書で提供される組成物、方法、およびキットの特定の実施形態において、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも７０％；または７５％；または８０％；または８５％；または９０％；または１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む。特定の好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含むが、その１５〜３５個の相補性ヌクレオチドの中の標的とされる核酸配列と比較して、１個のミスマッチ；または２個のミスマッチ；または３個のミスマッチ；または５個のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも７０％；または７５％；または８０％；または８５％；または９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である。１つの好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるが、その１５〜３５個の相補性ヌクレオチドの中の標的とされる核酸配列と比較して、１個のミスマッチ；または２個のミスマッチ；または３個のミスマッチ；または５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む。
【００１５】
本明細書で提供される態様のある実施形態において、転写媒介性増幅反応の１つ以上の態様を容易にするかまたは改善するように働く１つ以上のさらなるオリゴヌクレオチド型および／または他の増幅試薬が含まれてもよい。例えば、好ましい実施形態において、Ｔ７プロバイダーおよび／またはプライマーオリゴヌクレオチドに加えて、さらなるオリゴヌクレオチドは、検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、標的捕捉オリゴヌクレオチドなどの１つ以上をさらに含んでもよい。
【００１６】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、上記の組成物、キット、および／または方法は、検出オリゴヌクレオチド、好ましくは、トーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンをさらに含むかまたは使用してもよい。特定の実施形態において、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号６６〜７０および相補物の配列から選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。特定の好ましい実施形態において、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号６６、配列番号６７、および相補物の配列から選択されるトーチオリゴヌクレオチドである。特に好ましい実施形態において、検出オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号６６または相補物の配列を有するトーチオリゴヌクレオチドである。
【００１７】
本明細書で提供される態様の１つの実施形態において、上記の組成物、キット、および／または方法は、ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含むかまたは使用してもよい。特定の実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号５９〜６５および相補物の配列から選択される。特定の好ましい実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号５９、６１、６３、６４、および相補物の配列から選択される。特に好ましい実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号５９または相補物の配列を有する。
【００１８】
本明細書で提供される態様のある実施形態において、上記の組成物、キット、および／または方法は、標的捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含むかまたは使用してもよい。特定の実施形態において、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号７１〜７７および相補物の配列から選択される。好ましい実施形態において、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号７１、７４、および相補物の配列から選択される。特に好ましい実施形態において、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、本明細書に規定されるような、配列番号７４または相補物の配列を有する。
【００１９】
ある態様において、サルモネラ転写媒介増幅アッセイ（以後本明細書中では「ＴＭＡ」）における使用のための組成物が提供される。ある態様において、サルモネラ転写媒介増幅アッセイを実施するためのキットが提供される。ある態様において、サルモネラ転写媒介増幅アッセイを実施するための方法が提供される。特定の実施形態において、これらの組成物、キット、および／または方法は、Ｔ７プロバイダー、プライマーオリゴヌクレオチド、検出オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド、トーチオリゴヌクレオチドなどのような１種以上のオリゴヌクレオチドを含むかまたは使用してもよい。
【００２０】
本発明の用語および概念は、逆のことが明確に言及されない限り、および／または文脈が他のことを具体的に述べていない限り、本明細書に示されるような意味を有する。他に定義されない限り、本明細書で使用される科学的用語および技術的用語は、関連分野における当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。一般的定義は、分子生物学の分野に関連する専門書、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）またはＴｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ、１９９１，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）において見い出され得る。他に言及されない限り、本明細書で利用されるかまたは意図される技術は、当業者に周知である標準的な方法論である。本明細書に含まれる実施例はいくつかの好ましい実施形態を例証する。本明細書に引用される各々の参考文献は、その全体が参照により本明細書に具体的に援用される。
【００２１】
「１つの」または「１種の」実体という用語は、その実体の１つ以上をいうことが注目されるべきであり、例えば、「１種の核酸」は、１種以上の核酸を表すと理解される。このようなものとして、「１つの（または「１種の」）」、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書では交換可能に使用できる。
【００２２】
「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、単数形の「核酸」ならびに複数形の「核酸」を包含し、そして、一緒に共有結合された２つ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、または核酸塩基（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）の任意の鎖をいう。核酸には以下が含まれるがこれらに限定されない：ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかであるウイルスゲノムもしくはその部分、細菌ゲノムもしくはその部分、真菌、植物、もしくは動物のゲノムもしくはその部分、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ。核酸は、直鎖状（例えば、ｍＲＮＡ）、環状（例えば、プラスミド）、または分枝型、ならびに二本鎖または一本鎖型として提供されてもよい。核酸は、核酸の機能または挙動を変化させるために修飾塩基、例えば、さらなるヌクレオチドが核酸に付加されることをブロックするための３’末端ジデオキシヌクレオチドの付加を含んでもよい。本明細書で使用される場合、核酸の「配列」とは、核酸を作り上げる塩基の配列をいう。
【００２３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸鎖を意味する。本願を通して、核酸は５’末端から３’末端によって明示される。標準的な核酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは、典型的には、「３’から５’」で、すなわち、成長する核酸の５’末端へのヌクレオチドの付加によって合成される。
【００２４】
「ヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、リン酸基、５炭糖、および窒素含有塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡ中で見い出される５炭糖はリボースである。ＤＮＡ中では、５炭糖は２’デオキシリボースである。この用語は、リボースの２’位のメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）などのこのようなサブユニットのアナログもまた含む。本明細書で使用される場合、「Ｔ」残基を含むメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基を有し、ヌクレオチドの塩基の位置にウラシルを有する。
【００２５】
「非ヌクレオチド単位」は、本明細書で使用される場合、ポリマーのハイブリダイゼーションに有意に関与しない単位である。このような単位は、例えば、ヌクレオチドとのいかなる有意な水素結合にも関与しないはずであり、５種のヌクレオチド塩基またはそのアナログのうちの１種を成分として有する単位を除外する。
【００２６】
「標的核酸」は、本明細書で使用される場合、増幅される「標的配列」を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載されるようなＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。標的核酸は、標的配列に加えて、増幅されなくてもよい他の配列を含んでもよい。典型的な標的核酸には、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌、または真核生物細胞からのｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または染色体ＤＮＡが含まれる。
【００２７】
「単離された」によって、標的核酸を含むサンプルがその天然環境から取り出されていることが意味されるが、この用語は、いかなる程度の精製も暗示しない。
【００２８】
「標的配列」という用語は、本明細書で使用される場合、増幅される標的核酸の特定のヌクレオチド配列をいう。「標的配列」は、ＴＭＡのプロセスの間にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体形成する、複合体形成配列を含む。標的核酸がもともと一本鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸中に存在しているものとして、「標的配列」に対して相補的である配列もまたいう。標的核酸がもともと二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（−）鎖の両方をいう。標的配列を選択する際に、当業者は、関連性がない核酸と、密接に関連性がある標的核酸の間を区別するために、「独特な」配列が選択されるべきであることを理解する。
【００２９】
「配列を標的化する」という用語は、サルモネラ核酸の領域に関連して本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるような増幅および検出を可能にする様式でオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするプロセスをいう。１つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列に相補的であり、ミスマッチを含まない。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的とされるサルモネラ核酸配列と相補的であるが、１個；または２個；または３個；または４個；または５個のミスマッチを含む。好ましくは、サルモネラ核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、標的配列に対して相補的である少なくとも１０〜５０個；または１２〜４５個；または１４〜４０個；または１５〜３５個のヌクレオチドを含む。
【００３０】
「フラグメント」または「領域」という用語は、サルモネラを標的とする核酸配列に関連して本明細書で使用される場合、連続する核酸の一片をいう。特定の実施形態において、フラグメントは、２５個；または５０個；または７５個；または１００個；または１２５個；または１５０個；または１７５個；または２００個；または２２５個；または２５０個；または３００個；または３５０個；または４００個；または４５０個；または５００個；または７５０個；または１０００個；または２０００個；または３０００個のヌクレオチドを含む。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」または「オリゴマー」という用語は、単数の「オリゴヌクレオチド」ならびに複数の「オリゴヌクレオチド」を包含することが意図され、２つ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基、または本明細書に開示される増幅方法ならびに引き続く検出方法において試薬として使用される関連化合物の任意のポリマーをいう。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはそれらのアナログであり得る。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対する任意の特定の機能を意味せず、むしろ、この用語は、本明細書に記載されるすべてのこのような試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは様々な異なる機能に役立つ可能性があり、例えば、これは相補鎖に特異的でありかつハイブリダイズ可能であり、さらに核酸ポリメラーゼの存在下で伸長できる場合にはプライマーとして機能する可能性があり、これがＲＮＡポリメラーゼによって認識されかつ転写を可能にする配列を含む場合にはプロモーターを提供する可能性があり（例えば、Ｔ７プロバイダー）、そして適切に配置および／または修飾される場合にはハイブリダイゼーションを妨害しまたはプライマー伸長を妨げるように機能する可能性がある。
【００３２】
本明細書で使用される場合、特定の配列の群から選択される配列を「含み」またはそれらの配列「からなり」またはそれらの配列「から本質的になる」核酸配列を有するオリゴヌクレオチドとは、基本的かつ新規な特徴としてのオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で列挙された核酸配列の群の１つの正確な相補体を有する核酸に安定にハイブリダイズする能力があることを意味する。正確な相補体は対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
【００３３】
本明細書で使用される場合、特定の核酸配列に「実質的に一致する」オリゴヌクレオチドとは、言及されるオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリダイズするという点で、そのオリゴヌクレオチドが参照核酸配列に対して類似したハイブリダイゼーション特性を有するように、参照核酸配列に十分に類似していることを意味する。当業者は、「実質的に一致するオリゴヌクレオチド」が、言及される配列とは異なり、なお同じ標的核酸配列にハイブリダイズすることが可能であることを理解する。この核酸からの変動は、プローブまたはプライマーとその標的配列の間の、配列中の同一の塩基のパーセンテージまたは完全に相補的な塩基のパーセンテージによって言及されてもよい。従って、塩基の同一性または相補性のこれらのパーセンテージが１００％〜約８０％である場合、オリゴヌクレオチドは参照核酸配列に「実質的に一致する」。好ましい実施形態において、このパーセンテージは１００％〜約８５％である。より好ましい実施形態において、このパーセンテージは１００％〜約９０％である；他の好ましい実施形態において、このパーセンテージは１００％〜約９５％である。当業者は、非特異的な受け入れがたいレベルのハイブリダイゼーションを発生させることなく、特定の標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために種々のパーセンテージの相補性において必要とされる可能性があるハイブリダイゼーション条件に対する種々の改変を理解している。
【００３４】
「ヘルパーオリゴヌクレオチド」または「ヘルパー」とは、例えば、その内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，０３０，５５７号に記載されるような、標的とされる核酸との検出プローブまたは他のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの速度および程度を増加させるために、標的核酸に結合し、かつ標的上の様々な二次構造および／または三次構造を強いるように設計されたオリゴヌクレオチドをいう。ヘルパーは、標的核酸配列へのハイブリダイゼーション、ならびにプライマー、標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび他のオリゴヌクレオチドの機能を補助するためにもまた使用されてもよい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ブロッキング部分」は、核酸ポリメラーゼによってオリゴヌクレオチドまたは他の核酸が効率的に伸長されることができないように、その３’末端を「ブロック」するために使用される実体である。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「プライミングオリゴヌクレオチド」または「プライマー」は、少なくともその３’末端が核酸鋳型に相補的であり、鋳型と複合体を形成して（水素結合またはハイブリダイゼーションによって）、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始のために適切であるプライマー：鋳型複合体を与えるオリゴヌクレオチドである。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、特定の部位において核酸に結合し、ＲＮＡの転写を開始するためのシグナルとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「トランスクリプターゼ」）によって認識される特定の核酸配列である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「プロモーター−プロバイダー」または「プロバイダー」とは、第１の領域および第２の領域を含み、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を妨害するように修飾されているオリゴヌクレオチドをいう。プロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする塩基配列を含み、ここで、このハイブリダイズする配列は３’に位置するが、プロモーター領域には必ずしも隣接していない。プロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズする部分は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはそれ以上のヌクレオチド長まで伸長されてもよい。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。プロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素によって伸長されることが不可能であるように操作され、好ましくは、上記のように、その３’末端にブロッキング部分を含む。本明細書で言及される場合、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供する、ブロックされたプロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドである。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「終結オリゴヌクレオチド」または「ブロッカーオリゴヌクレオチド」は、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結させ」、それによって、新生核酸鎖について規定された３’末端を提供するために、標的配列の５’末端の近傍における標的核酸の領域に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００４０】
「エクステンダーオリゴヌクレオチド」または「エクステンドオリゴ」とは、本明細書で使用される場合、Ｔ７プロバイダーと同じ意味であるオリゴヌクレオチドをいい、構造を広げ、または特異性を改善するヘルパーオリゴヌクレオチドとして働く可能性がある。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「検出オリゴヌクレオチド」とは、標的核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅された配列を含む標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴヌクレオチドをいう。「プローブ」または「検出プローブ」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれにハイブリダイズするように、検出されることが探求されている標的配列の領域に部分的または完全に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む分子を意味する。
【００４２】
「安定な」または「検出のために安定な」とは、反応混液の温度が核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも２℃下であることを意味する。
【００４３】
「増幅」または「核酸増幅」は、さらに本明細書に記載されるような、意図される特定の標的核酸配列の少なくとも一部を含む標的核酸の複数コピーの産生を意味する。複数コピーはアンプリコンまたは増幅産物と呼ばれてもよい。
【００４４】
「アンプリコン」という用語は、本明細書で使用される場合、標的配列の中に含まれる配列に相補的または相同である、増幅手順の間に生成された核酸分子をいう。
【００４５】
「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、同時に安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成が最小化されながら、プローブが、それらの標的配列またはそれらの複製にハイブリダイズして、安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成することを意味する。従って、プローブは、非標的配列よりも十分に大きな程度まで、標的配列またはその複製にハイブリダイズして、複製の間に形成された標的配列のＲＮＡ複製または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を当業者が正確に定量することを可能にする。
【００４６】
「相補性」は、２つの一本鎖核酸の類似の領域のヌクレオチド配列、または同じ一本鎖核酸の異なる領域に類似するヌクレオチド配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または増幅条件下で、安定な二本鎖水素結合領域中で一本鎖領域が一緒にハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド塩基組成物を有することを意味する。ＡがＵまたはＴと対合し、ＣがＧと対合するように、一本鎖領域のヌクレオチドの連続する配列は、他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似の配列と一連の「基準の」水素結合塩基対を形成することができる場合、ヌクレオチド配列は「完全に」相補的である。
【００４７】
「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」または「二重鎖」は、各鎖は互いに対して相補的であり、その領域は、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフィー、またはゲル電気泳動が含まれるがこれらに限定されない手段によって検出されるためにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で十分に安定である、二本鎖であり、水素結合している領域を含む核酸構造を意味する。このようなハイブリッドには、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子が含まれ得る。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「捕捉ヌクレオチド」または「捕捉プローブ」とは、標準的な塩基対形成によって標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、かつ支持体に標的核酸を捕捉するために固定化プローブ上の結合パートナーに結合する核酸オリゴマーをいう。捕捉オリゴマーの１つの例には、２つの結合領域：配列結合領域（すなわち、標的特異的部分）および通常は同じオリゴマー上である固定化プローブ結合領域を含むが、２つの領域は１つ以上のリンカーで一緒に結合された２つの異なるオリゴマー上に存在してもよい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「固定化オリゴヌクレオチド」、「固定化プローブ」、または「固定化核酸」とは、直接的または間接的に、捕捉オリゴマーを支持体に結合する、核酸結合パートナーをいう。支持体に結合された固定化プローブは、サンプル中の非結合物質からの捕捉プローブ結合標的の分離を容易にする。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「標識」とは、検出されるかまたは検出可能なシグナルに導くプローブに直接的または間接的に結合された部分または化合物をいう。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「分子トーチ」と呼ばれる構造は、結合領域によって連結され、かつあらかじめ決定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする自己相補性の別個の領域（新しく作り出された「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」）を含むように設計される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、またはバクテリオファージＴ４、Ｐｈｉ−２９、Ｍ２、もしくはＴ５由来のＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌もしくはバクテリオファージから単離されたか、または組換え的に発現された天然に存在する酵素であってもよく、あるいは特定の所望の特徴、例えば、熱安定性、または種々の修飾された鋳型からＤＮＡ鎖を認識または合成する能力を有するように操作された、修飾型または「進化した」型であってもよい。すべての公知のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが合成を開始するために相補性プライマーを必要とする。適切な条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成し得ることが知られている。典型的には、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼもまた、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「トランスクリプターゼ」は、通常は二本鎖であるプロモーター配列を有する、二本鎖または部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。ＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモーターのすぐ下流の特定の位置で開始して、５’から３’の方向で合成される。転写物の例は、Ｅ．ｃｏｌｉならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを合成する酵素である。すべての公知の逆転写酵素は、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡコピーを作る能力もまた有する；従って、これらは、ＲＮＡ依存性とＤＮＡ依存性の両方のＤＮＡポリメラーゼである。ＲＴはＲＮＡｓｅ Ｈ活性もまた有する可能性がある。プライマーは、ＲＮＡとＤＮＡの両方の鋳型で合成を開始するために必要とされる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「選択的ＲＮＡｓｅ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解するが、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、またはＤＮＡを分解しない酵素である。例示的な選択的なＲＮＡｓｅはＲＮＡｓｅ Ｈである。ＲＮＡｓｅ Ｈ以外の同じかまたは類似の活性を有する酵素もまた使用されてもよい。選択的ＲＮＡｓｅは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであってもよい。多くの逆転写酵素は、それらのポリメラーゼ活性に加えて、ＲＮＡｓｅ Ｈ活性を含む。しかし、他の供給源のＲＮＡｓｅ Ｈは、付随するポリメラーゼ活性を伴うことなく利用可能である。分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からのＲＮＡの分離を生じ得る。あるいは、選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡの一部が融解して除かれ、または酵素がＲＮＡの部分を巻き戻すことを可能にするように、様々な位置でＲＮＡを単純に切断し得る。ＲＮＡ標的配列または本明細書のＲＮＡ産物を選択的に分解する他の酵素は、当業者には容易に明白である。
【００５６】
増幅系の状況における「特異性」という用語は、配列およびアッセイ条件に依存して標的配列と非標的配列の間を区別する増幅系の能力を説明する、その増幅系の特徴をいうために本明細書で使用される。核酸増幅に関して、特異性とは、一般的に、生成した特異的アンプリコンの数の副産物の数に対する比率（すなわち、シグナル対ノイズ比）をいう。
【００５７】
「感度」という用語は、それによって核酸増幅反応が検出または定量できる精度をいうために本明細書で用いられる。増幅反応の精度は、一般的には、増幅系において信頼できるように検出可能である標的核酸の最小コピー数の尺度であり、例えば、利用される検出アッセイ、および増幅反応の特異性、すなわち、特異的アンプリコン対副産物の比率に依存する。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「コロニー形成単位」（「ＣＦＵ」）は、サンプル中の生存可能な微生物の尺度として使用される。ＣＦＵは、固形培地上で目に見えるコロニーを形成する能力がある個々の生存可能な細胞であり、それらのコロニーの個々の細胞は１個の親の細胞から細胞分裂によって誘導される。１ＣＦＵは約１０００コピーのｒＲＮＡに相当する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「Ｔ時間」は、アッセイデータのリアルタイムプロットにおけるシグナルの閾値時間または出現の時間である。Ｔ時間の値は、アンプリコン産生を示す特定の閾値がリアルタイム増幅反応において経過する時間を見積もる。Ｔ時間ならびにＴ時間値を計算および使用するためのアルゴリズムは、Ｌｉｇｈｔら、米国特許公開第２００６／０２７６９７２号、［０５１７］〜［０５３８］段落に記載されており、この開示はそれによって参照により本明細書に援用される。曲線フィッティング手順は、標準化されかつバックグラウンドを補正したデータに適用される。曲線フィットは、所定の低結合と高結合の間のデータの部分のみについて実施される。目的は、データにフィットする曲線を見い出した後で、曲線またはその突出部が所定の閾値と交差する点に対応する時間を見積もることである。１つの実施形態において、標準化されたデータの閾値は０．１１である。高結合および低結合は、様々な対照データセットにフィットする曲線が所定の閾値と関連付けられる時間の最小の変動性を示す範囲を超えたものとして、経験的に決定される。例えば、１つの実施形態において、低結合は０．０４であり、高結合は０．３６である。曲線は、高結合を過ぎた最初のデータ点を通して、低結合よりも下の最初のデータ点から伸長するデータにフィットされる。次に、フィットの傾きが統計学的に有意であるか否かの決定がなされる。例えば、一次係数のｐ値が０．０５未満である場合、フィットは有意であると見なされ、処理が継続する。そうでない場合、処理は停止する。あるいは、データの妥当性はＲ２値によって決定可能である。直線ｙ＝ｍｘ＋ｂの傾きｍおよび切片ｂはフィットした曲線について決定される。その情報がある場合、Ｔ時間は以下のように決定可能である：
Ｔ時間＝（閾値−ｂ）／ｍ
本明細書で使用される場合、「相対蛍光単位」（「ＲＦＵ」）という用語は、蛍光強度の尺度の任意単位である。ＲＦＵは測定のために使用される検出手段の特徴に伴って変化する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「リアルタイムＴＭＡ」という用語とは、リアルタイム検出手段によってモニタリングされる標的核酸の単一プライマー転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）をいう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、増幅オリゴヌクレオチドおよび検出オリゴヌクレオチドの様々な組み合わせの（Ａ）「乏しい」アッセイ性能および（Ｂ）「良好な」アッセイ性能を示す分析物のリアルタイム増幅チャートを図示する。使用した分析物は、精製Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｒＲＮＡであって、チャートは０、１Ｅ＋４、および１Ｅ＋５コピーにおける分析物の多数の複製を示す。
【図２】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ配列のヌクレオチド１５０〜４２５に対応するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｂｓｐ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０（ＡＴＣＣ１３０７６）「３５０領域」配列（配列番号１５０）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
発明の詳細な説明
特定の態様および実施形態において、本明細書は、サルモネラの同定、検出、および／または定量のための組成物、方法、およびキットに関する。このサルモネラは、試験のため、例えば、診断試験のため、血液製剤のスクリーニングのため、バイオプロセス、食物、水、工業サンプルまたは環境サンプルにおける微生物検出のため、および他の目的のために採取されたサンプル中で、単独で、または核酸の均一もしくは不均一な混合物の多いかもしくは少ない成分としてのいずれかで存在する可能性がある。本明細書に開示される特定の方法、組成物、およびキットは、増幅に基づくサルモネラの検出における検出の感度、特異性、または速度の改善を提供する。サルモネラリボソームＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、および他の潜在的な腸内細菌と非常に密接に関連している。従って、本明細書の特定の実施形態において、サルモネラアッセイは、サルモネラ属のほぼすべての種、亜種、および血清型に共通なｒＲＮＡ配列を同定し、他の腸内細菌からサルモネラを区別する。このような区別のために有用な領域は２３Ｓ ｒＲＮＡの３５０領域である。
【００６３】
サルモネラに特異的な増幅オリゴヌクレオチドの広範な分析の結果として、約１５０〜４２５ヌクレオチド塩基のＥ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡ参照配列（アクセッション番号ＡＪ２７８７１０）の領域に対応するサルモネラの特定の領域（以後本明細書では「３５０領域」と称する）が、増幅に基づくサルモネラの検出のための好ましい標的として同定された。従って、本明細書は、関心対象のサンプル、増幅オリゴヌクレオチド、組成物、反応混液、キットなどの中のサルモネラの検出の方法に関する。
【００６４】
サルモネラ属アッセイは、既知のサルモネラ種に特異的なリボソームＲＮＡ配列を検出する。これは、リアルタイムＴＭＡ技術を利用し、ここでは、標的特異的配列が逆方向ＴＭＡを使用して増幅され、蛍光分子トーチが使用され、増幅産物が産生されるにつれてそれらを検出する。標的検出は、結果の信頼性を確認するために、内部対照の増幅および検出と同時に実施される。アッセイの結果は、サルモネラの存在または非存在について陽性または陰性であるサンプルの分類からなる。
【００６５】
１つの実施形態において、サンプルは、生物薬剤学プロセス（バイオプロセス）の流れであり、ここでは、サルモネラは既知のまたは疑いのある夾雑物である。「バイオプロセス」は、本明細書で使用される場合、生きている細胞もしくは生物またはその成分が、意図されてまたは意図されずのいずれかで存在している、一般的に任意のプロセスをいう。例えば、その少なくとも１つが生きている細胞、生物、もしくはその成分を含み、または意図されない汚染の結果としてそのような細胞、生物、もしくは成分を含む、本質的に任意の製造プロセスまたは１つ以上のサンプルもしくはサンプルの流れを利用する他のプロセスは、バイオプロセスと見なされる。多くのこのようなプロセスにおいて、プロセスの中で生きている細胞、生物、またはその成分の存在および／または供給源を検出、同定、および／または制御する能力を有することが所望される。本明細書に開示される方法を使用して、例えば、１つ以上のバイオプロセスサンプルおよび／または流れにおけるサルモネラの存在および／または供給源は、迅速かつ高感度の様式でモニタリングされてもよい。
【００６６】
標的核酸／標的配列
標的核酸は、実行される増幅アッセイの目的に基づいて任意の数の供給源から単離されてもよい。標的核酸の供給源には、臨床試料、例えば、血液、尿、唾液、糞便、精液、または髄液、犯罪の証拠からの試料、環境サンプル、例えば、水もしくは土壌サンプルからの試料、食物からの試料、工業サンプルからの試料、ｃＤＮＡライブラリーからの試料、または全細胞ＲＮＡからの試料が含まれるがこれらに限定されない。必要な場合、標的核酸は、種々のオリゴヌクレオチドとの相互作用のために利用可能にされる。これは、例えば、細胞から標的核酸を放出させるための細胞溶解または細胞透過を含んでもよく、これに、次いで、一連の単離工程および洗浄工程などの１つ以上の精製工程が続いてもよい。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｃｌａｒｋら「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ａ Ｗｉｄｅ Ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」米国特許第５，７８６，２０８号を参照のこと。これは、例えば、血液サンプルに存在するヘムなど、増幅反応と干渉する可能性がある成分をサンプルが含む可能性がある場合に特に重要である。その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｒｙｄｅｒら「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｉｒｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｇｅｎｔｓ」米国特許第５，６３９，５９９号を参照のこと。増幅のための種々の供給源から標的核酸を調製するための方法は当業者に周知である。標的核酸は、本明細書に記載される増幅反応の前にある程度まで精製されてもよいが、他の場合において、サンプルは、いかなるさらなる操作も伴うことなく、増幅反応に加えられる。
【００６７】
当業者によって理解されるように、「独特な」配列は試験環境から判断される。少なくとも検出プローブによって認識される配列は、試験される環境において独特であるべきであるが、しかし、すべての可能な配列の領域の中で独特である必要はない。さらに、たとえ標的配列が検出プローブによる認識のために「独特な」配列を含むはずであっても、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチドが「独特な」配列を常に認識しているわけではない。ある実施形態において、関連する生物のファミリーに対して一般的である標的配列を選択することが望ましくあり得る。他の状況において、非常に高度に特異的な標的配列、または検出プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドによって認識される少なくとも高度に特異的な領域を有する標的配列が、密接に関連する生物、例えば、病原性Ｅ．ｃｏｌｉと非病原性Ｅ．ｃｏｌｉの間を区別するように選択される。標的配列は、任意の実用的な長さであってもよい。最小限の標的配列は、プライミングオリゴヌクレオチド（またはその相補物）にハイブリダイズする領域、プロモーターオリゴヌクレオチド（またはその相補物）のハイブリダイズする領域にハイブリダイズする領域、および検出のために使用される領域、例えば、検出プローブにハイブリダイズする領域を含む。検出プローブにハイブリダイズする領域は、プライミングヌクレオチド（またはその相補物）にハイブリダイズする領域またはプロモーターオリゴヌクレオチド（またはその相補物）のハイブリダイズ領域と重複するか、またはその中に含まれてもよい。最小限の要件に加えて、標的配列の最適長は、多くの考慮すべき点、例えば、二次構造の量または配列中の自己ハイブリダイズ領域に依存する。典型的には、標的配列は、約３０ヌクレオチド長から約３００ヌクレオチド長までの範囲である。最適なまたは好ましい長さは、本明細書に記載される方法に従って決定可能である様々な条件下で変化する可能性がある。
【００６８】
核酸「同一性」
特定の実施形態において、核酸は、参照核酸の連続する塩基領域に対して少なくとも７０％；または７５％；または８０％、または８５％または９０％、または９５％；または１００％同一である連続する塩基領域を含む。短い核酸については、「問い合わせ」核酸の塩基領域と参照核酸の塩基領域の間の同一性の程度は、手動のアラインメントによって決定可能である。「同一性」は、比較される核酸の糖領域およびバックボーン領域とは関係なく、窒素性塩基の配列のみを比較することによって決定される。従って、問い合わせ：参照塩基配列アラインメントは、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはその任意の組み合わせまたはアナログであってもよい。等価なＲＮＡおよびＤＮＡの塩基配列は、Ｕ（ＲＮＡ中）をＴ（ＤＮＡ中）に変換することによって比較可能である。
【００６９】
オリゴヌクレオチドおよびプライマー
オリゴヌクレオチドは、実質的に任意の長さであり得、増幅反応におけるまたは増幅反応の増幅産物を検出する際のその特異的機能によってのみ限定される。しかし、特定の実施形態において、好ましいオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域に対して相補的である、少なくとも約１０個；または１２個；または１４個；または１６個；または１８個；または２０個；または２２個；または２４個；または２６個；または２８個；または３０個；または３２個；または３４個；または３６個；または３８個；または４０個；または４２個；または４４個；または４６個；または４８個；または５０個；または５２個；または５４個；または５６個の連続する塩基を含む。これらの連続する塩基は、そのオリゴヌクレオチドが結合する標的配列に対して、好ましくは、少なくとも約８０％相補的であり、より好ましくは、少なくとも約９０％相補的であり、そして最も好ましくは、完全に相補的である。特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、一般的には、約１０〜１００の間；または１２〜７５の間；または１４〜５０の間；または１５〜４０の間の塩基長であり、任意に修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【００７０】
規定された配列および化学構造のオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の技術によって、例えば、化学的または生化学的な合成、および組換え核酸分子、例えば、細菌ベクターまたはウイルスベクターからのインビトロまたはインビボ発現によって産生されてもよい。本開示によって意図されるように、オリゴヌクレオチドは、単に野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からなるのではない。
【００７１】
オリゴヌクレオチドは、所定の修飾が所定のオリゴヌクレオチドの所望の機能と適合性である限り、どんなやり方で修飾されてもよい。当業者は、所定の修飾が、任意の所定のオリゴヌクレオチドのために適切であるか、または所望されるかを容易に決定することができる。修飾には、塩基修飾、糖修飾、またはバックボーン修飾が含まれる。塩基修飾には、アデニン、シチジン、グアノシン、チミン、およびウラシルに加えて、以下の塩基の使用が含まれるがこれらに限定されない：Ｃ−５プロピン、２−アミノアデニン、５−メチルシチジン、イノシン、ならびにｄＰおよびｄＫ塩基。ヌクレオシドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース、および、例えば、リボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む、リボース、デオキシリボースのアナログであり得る。Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第６，１３０，０３８号を参照のこと。他の糖修飾には、２’−アミノ、２’−フルオロ、（Ｌ）−α−スレオフラノシル、およびペントピラノシル修飾が含まれるがこれらに限定されない。ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合などの結合、修飾された結合、またはオリゴヌクレオチドのその相補的標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを妨害しない非ヌクレオチド部分によって連結されてもよい。修飾された結合には、標準的なホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合などの様々な結合で置き換えられている結合が含まれる。核酸塩基サブユニットは、例えば、中心二級アミンへのカルボキシメチルリンカーによって核酸塩基サブユニットを連結する２−アミノエチルグリシンバックボーンなどの擬似ペプチドバックボーンで、ＤＮＡの天然のデオキシリボースリン酸バックボーンを置き換えることによって連結されてもよい。擬似ペプチドバックボーンを有するＤＮＡアナログは、一般的には、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」と呼ばれ、Ｎｉｅｌｓｅｎら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」米国特許第５，５３９，０８２号によって開示されている。他の結合の修飾には、モルホリノ結合が含まれるがこれに限定されない。
【００７２】
本明細書で意図されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴの非限定的な例には、二環式および三環式のヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログを含む核酸アナログ（ＬＮＡ）が含まれる。Ｉｍａｎｉｓｈｉら、米国特許第６，２６８，４９０号；およびＷｅｎｇｅｌら、米国特許第６，６７０，４６１号を参照のこと。修飾オリゴヌクレオチドがその意図される機能を、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件もしくは増幅条件下で標的核酸にハイブリダイズし、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼと相互作用し、それによって伸長または転写を開始することが実施できるならば、任意の核酸アナログが本明細書によって意図される。検出プローブの場合においては、修飾オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸に優先的にハイブリダイズ可能であることもまた必須である。
【００７３】
オリゴヌクレオチドの設計および配列は、以下に記載されるように、それらの機能に依存する。考慮されるべきいくつかの変数には、長さ、融解温度（Ｔｍ）、特異性、系の中での他のオリゴヌクレオチドとの相補性、Ｇ／Ｃ含量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）またはポリプリン（Ａ、Ｇ）ストレッチ、および３’末端配列が含まれる。これらおよび他の変数を制御することは、オリゴヌクレオチド設計の標準的かつ周知の態様であり、多数の潜在的なオリゴヌクレオチドを最初にスクリーニングするために、種々のコンピュータプログラムが容易に利用可能である。
【００７４】
オリゴヌクレオチド（または他の核酸）の３’末端は、以下に記載されるように、ブロッキング部分を使用して、様々な方法でブロックすることが可能である。「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ−またはＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによる、その３’末端へのオリゴヌクレオチドの付加によって、ＤＮＡの相補鎖を生成するために効率的に伸長されない。このように、「ブロックされた」オリゴヌクレオチドは「プライマー」にはなり得ない。
【００７５】
ブロッキング部分
ブロッキング部分は、小さな分子、例えば、リン酸またはアンモニウム基であってもよく、あるいはこれは、修飾ヌクレオチド、例えば、３’２’ジデオキシヌクレオチドもしくは３’デオキシアデノシン５’三リン酸（コルジセピン）または他の修飾ヌクレオチドであってもよい。さらなるブロッキング部分には、例えば、３’末端に遊離のヒドロキシル基が存在しないように、３’から５’の方向を有するヌクレオチドもしくは短いヌクレオチド配列の使用、３’アルキル基、３’非ヌクレオチド部分（例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら、「Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」米国特許第６，０３１，０９１号を参照のこと）、ホスホロチオエート、アルカン−ジオール残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、３’末端に３’ヒドロキシル基を欠くヌクレオチド残基、または核酸結合タンパク質の使用が含まれる。好ましくは、３’ブロッキング部分は、３’から５’の方向または３’非ヌクレオチド部分を有するヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含み、３’２’ジデオキシヌクレオチドまたは遊離のヒドロキシル基を有する３’末端を含まない。３’ブロッキングオリゴヌクレオチドを調製するためのさらなる方法は当業者には周知である。
【００７６】
プライミングオリゴヌクレオチドまたはプライマー
プライミングオリゴヌクレオチドは、その３’末端に共有結合されたヌクレオチド塩基の付加によって伸長され、その塩基は鋳型に対して相補的である。結果はプライマー伸長産物である。適切かつ好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは本明細書に記載されている。知られている実質的にすべてのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、ＤＮＡ合成を開始するために一本鎖鋳型（「プライミング」）へのオリゴヌクレオチドの複合体形成を必要とするのに対して、ＲＮＡの複製および転写は（ＤＮＡからのＲＮＡのコピー作製）、一般的に、プライマーを必要としない。ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるまさしくその性質により、プライミングオリゴヌクレオチドは３’ブロッキング部分を含まない。
【００７７】
プロモーターオリゴヌクレオチド／プロモーター配列
結合するために、このようなトランスクリプターゼは、伸長反応を経由してプロモーター配列を含む領域中で二本鎖にされたＤＮＡを必要としたと一般的に考えられていた。しかし、ＲＮＡの効率的な転写は、二本鎖プロモーターが鋳型核酸との伸長反応を通して形成されない条件下でさえも起こり得ることが決定された。鋳型核酸（転写される配列）は二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、種々の異なるプロモーター配列を認識し、これらは、転写を促進する際のそれらの効率が顕著に変化し得る。ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するためにプロモーター配列に結合するとき、そのプロモーター配列は転写される配列の一部ではない。従って、それによって産生されるＲＮＡ転写物は、その配列を含まない。
【００７８】
終結オリゴヌクレオチド
終結オリゴヌクレオチドまたは「ブロッカー」は、新生核酸鎖についての所望の３’末端を達成するために十分な位置において、標的核酸にハイブリダイズするように設計される。終結オリゴヌクレオチドの位置決めは、その設計に依存して柔軟性がある。終結オリゴヌクレオチドは、修飾されているかまたは非修飾であり得る。特定の実施形態において、終結オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いて合成される。これらの修飾ヌクレオチドは、相補的二重鎖のより高い熱安定性を実証した。２’−Ｏ−メチルリボヌクレアーゼはまた、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を増加させるように機能し、それによって、修飾オリゴヌクレオチドの半減期を増加させる。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｍａｊｌｅｓｓｉら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，２２２４−９を参照のこと。本明細書の他の箇所に記載されているような他の修飾は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに加えて、またはその代わりに利用されてもよい。例えば、終結オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡまたはＬＮＡを含んでもよい。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，４４−５３を参照のこと。終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、伸長を妨害するために、その３’末端においてブロッキング部分を含む。終結オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる新生核酸鎖の伸長をさらに終結させるように、オリゴヌクレオチドに連結されたタンパク質またはペプチドもまた含んでもよい。適切かつ好ましい終結オリゴヌクレオチドは本明細書に記載される。終結オリゴヌクレオチドは、典型的にはまたは必然的に３’ブロッキング部分を含むのに対し、「３’ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、必ずしも終結オリゴヌクレオチドである必要はないことが注目される。本明細書に開示されるような他のオリゴヌクレオチド、例えば、プロモーターオリゴヌクレオチドおよびキャッピングオリゴヌクレオチドは、同様に、典型的にはまたは必然的に３’ブロックされている。
【００７９】
エクステンダーオリゴヌクレオチド
エクステンダーオリゴヌクレオチドは、プロモーターオリゴヌクレオチドの最初の領域の３’末端に隣接するかまたはその近傍のＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする。エクステンダーオリゴヌクレオチドは、好ましくは、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基がプロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端塩基の３塩基、２塩基、または１塩基以内にあるように、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする。最も好ましくは、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基は、エクステンダーオリゴヌクレオチドおよびプロモーターオリゴヌクレオチドがＤＮＡ鋳型にハイブリダイズされるときに、プロモーターオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に隣接している。エクステンダーオリゴヌクレオチドの伸長を妨害するために、３’末端ブロッキング部分が典型的には含まれる。
【００８０】
プローブ
当業者によって理解されるように、プローブは、ヒトの介入なしで天然には見い出されない型である（例えば、外因性核酸で組換えされ、単離され、またはある程度まで精製されている）、単離された核酸分子またはそのアナログを含む。プローブは、ヌクレオシドまたは核酸塩基がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションに実質的に影響を与えない限り、検出プローブの場合には、標的核酸への優先的なハイブリダイゼーションを妨害しない限り、標的とされる領域の外側のさらなるヌクレオシドまたは核酸塩基を有してもよい。標的捕捉配列（一般的には、ホモポリマートラクト、例えば、ポリＡ、ポリＴ、またはポリＵテール）、プロモーター配列、ＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位などの非相補的配列もまた含められてもよく、または、プローブ上または標的核酸上またはその両方での触媒活性部位またはヘアピン構造などの所望の二次構造または三次構造を付与する配列を含んでもよい。
【００８１】
プローブは、好ましくは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。この標識は、以下を含むがこれらに限定されない、任意の適切な標識物質であり得る：放射性同位元素、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、燐光分子、電気化学発光分子、発色団、言及した条件下で標的核酸に安定にハイブリダイズできない塩基配列領域、およびこれらの混合物。１つの特定の好ましい実施形態において、標識はアクリジニウムエステルである。本明細書に開示されているような特定のプローブは標識を含まない。例えば、非標識「捕捉」プローブは、標的配列またはその複製で富化されるために使用されてもよく、次いで、これは、第２の「検出」プローブによって検出されてもよい。例えば、それによって参照により本明細書に援用される、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら「Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」米国特許第６，５３４，２７３号を参照のこと。検出プローブは典型的には標識されているが、特定の検出技術はプローブが標識されることを必要としない。例えば、Ｎｙｇｒｅｎら「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」米国特許第６，０６０，２３７号を参照のこと。
【００８２】
規定された配列のプローブは、当業者に公知である技術によって、例えば、化学合成によって、および組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現によって、製造されてもよい。好ましくは、プローブは、１０〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは１２〜５０塩基長、およびさらにより好ましくは１８〜３５塩基長である。
【００８３】
ハイブリダイズ／ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションは、それによって、安定な二本鎖ハイブリッドを形成するための所定の反応条件下で、完全にまたは部分的に相補的なヌクレオチド配列を有する２つの核酸鎖が一緒になるプロセスである。核酸鎖は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）またはそのアナログのいずれかであり得る。従って、ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはそのアナログを含むことができる。時折ハイブリッドと呼ばれる、この二本鎖構造の構成要素である２つの鎖は、水素結合によってまとめられている。これらの水素結合は、単一の核酸鎖上で塩基アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で最も一般的には形成しているが、塩基対形成は、これらの「基準の」対合のメンバーではない塩基間でもまた形成し得る。基準ではない塩基対形成は当該分野において周知である（例えば、Ｒｏｇｅｒ Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓら「Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」（第１１版、１９９２））を参照のこと）。
【００８４】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特定の検出プローブが、試験サンプル中に存在する他の核酸ではなく、標的核酸とハイブリダイズすることが可能である条件をいう。これらの条件は、プローブのＧＣ含量および長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、および探求されるハイブリダイゼーションの特異性の程度を含む要因に依存して変化してもよいことが理解される。特定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の開示において提供される。
【００８５】
核酸増幅
核酸増幅の多くの周知の方法は、二本鎖核酸を変性させ、そしてプライマーをハイブリダイズすることを交互に行う熱サイクルを必要とする；しかし、核酸増幅の他の周知の方法は等温である。一般的にはＰＣＲと呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号）は、変性、プライマー対の逆ストランドへのアニーリング、および標的配列のコピー数を指数関数的に増加させるためのプライマー伸長の複数のサイクルを使用する。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれるバリエーションでは、逆転写酵素（ＲＴ）が、ｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製するために使用され、次いで、ｃＤＮＡがＰＣＲによって増幅されて、ＤＮＡの複数のコピーを生成する。ＬＣＲと一般的に呼ばれるリガーゼ連鎖反応（Ｗｅｉｓｓ、Ｒ．１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４ １２９２）は、標的核酸の隣接する領域にハイブリダイズする相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの２つのセットを使用する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーション、およびライゲーションの反復サイクルにおいてＤＮＡリガーゼによって共有結合され、検出可能な二本鎖のライゲーションされたオリゴヌクレオチド産物を生成する。別の方法は、ＳＤＡと一般的に呼ばれる鎖置換増幅であり（Ｗａｌｋｅｒ、Ｇ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６、米国特許第５，２７０，１８４号および同第５，４５５，１６６号）、これは、標的配列の逆ストランドへのプライマー配列の対のアニーリング、ｄＮＴＰαＳの存在下での二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を生成するためのプライマー伸長、ヘミ修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介ニック形成、ならびに既存の鎖を置き換え、かつ次のラウンドのプライマーアニーリング、ニック形成、および鎖置き換えのための鎖を生成する、ニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介プライマー伸長のサイクルを使用して、産物の幾何学的な増幅を生じる。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、本質的に同じ方法において、より高い温度で好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用する（ヨーロッパ特許第０ ６８４ ３１５号）。他の増幅方法には以下が含まれる：一般的にはＮＡＳＢＡと呼ばれる、核酸配列に基づく増幅（米国特許第５，１３０，２３８号）；一般的にはＱ−βレプリカーゼと呼ばれる、プローブ分子それ自体を増幅するためにＲＮＡレプリカーゼを使用するもの（Ｌｉｚａｒｄｉ、Ｐ．ら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６ １１９７−１２０２）；転写に基づく増幅方法（Ｋｗｏｈ、Ｄ．ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）；自律的な配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．ら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）；および一般的にはＴＭＡと呼ばれる転写媒介増幅（米国特許第５，４８０，７８４号および同第５，３９９，４９１号）。公知の増幅方法のさらなる議論については、Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．、１９９３、「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら編）所収、５１−８７頁（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ）を参照のこと。
【００８６】
好ましい実施形態において、サルモネラは、転写に基づく増幅技術によって検出される。１つの好ましい転写に基づく増幅系は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）であり、これは、ＲＮＡポリメラーゼを利用して、標的領域の複数のＲＮＡ転写物を生成する。例示的なＴＭＡ増幅方法は、米国特許第５，４８０，７８４号、同第５，３９９，４９１号、同第７，３７４，８８５号、およびそこに引用されている参考文献に記載されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。ＴＭＡは、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で標的核酸にハイブリダイズする「プロモーター−プライマー」を使用して、そこからＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ転写物を生成する二本鎖プロモーターを形成する。これらの転写物は、ＲＮＡ転写物にハイブリダイズする能力がある第２のプライマーの存在下で、ＴＭＡのさらなるラウンドのための鋳型となることができる。熱変性を必要とするＰＣＲ、ＬＣＲ、または他の方法とは異なり、ＴＭＡは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化するためにＲＮａｓｅ Ｈ活性を使用する等温方法であり、それによって、ＤＮＡ鎖を、プライマーまたはプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションのために利用可能にする。一般的に、増幅のために提供される逆転写酵素に付随するＲＮａｓｅ Ｈ活性が使用される。
【００８７】
ＴＭＡ法の１つのバージョンにおいて、１つの増幅プライマーは、二本鎖になり、標的配列の５’に配置されたときに機能的になるプロモーター配列を含む、オリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーであり、これは、増幅される配列に対して３’の位置において標的ＲＮＡの結合部位にハイブリダイズする能力がある。プロモーター−プライマーは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識について特異的である場合に、「Ｔ７プライマー」と呼ばれてもよい。特定の状況下で、プロモーター−プライマーの３’末端、またはこのようなプロモーター−プライマーの亜集団は、プロモーター−プライマー伸長をブロックまたは減少するために修飾されてもよい。非修飾プロモーター−プライマーから、逆転写酵素は、標的ＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製するが、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、標的ＲＮＡを分解する。次いで、第２の増幅プライマーがｃＤＮＡに結合する。このプライマーは、「Ｔ７プライマー」からそれを区別するために「非Ｔ７プライマー」と呼ばれてもよい。この第２の増幅プライマーから、逆転写酵素は別のＤＮＡ鎖を作製し、一方の末端に機能的プロモーターを有する二本鎖ＤＮＡを生じる。二本鎖となったときに、プロモーター配列は、プロモーター−プライマーがハイブリダイズされる標的配列の転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼを結合する能力がある。ＲＮＡポリメラーゼは、このプロモーター配列を使用して、複数のＲＮＡ転写物（すなわち、アンプリコン）、一般的には、約１００〜１，０００コピーを生成する。各々の新たに合成されたアンプリコンは、第２の増幅プライマーとアニーリングすることができる。次いで、逆転写酵素がＤＮＡコピーを作製できるのに対して、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、このＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡを分解する。次いで、プロモーター−プライマーは、新たに合成されたＤＮＡに結合でき、逆転写酵素が二本鎖ＤＮＡを作製することを可能にし、そこからＲＮＡポリメラーゼは複数のアンプリコンを生成する。従って、数１０億倍の等温増幅が、２つの増幅プライマーを使用して達成することができる。
【００８８】
ＴＭＡの別のバージョンは、核酸をインビトロで増幅するために１種のプライマーおよび１種以上のさらなる増幅オリゴマーを使用し、サンプル中の標的配列の存在を示す転写物（アンプリコン）をもたらす（Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第７，３７４，８８５号に記載されており、その詳細は、それによって参照により本明細書に援用される）。手短に述べると、単一プライマーＴＭＡ法は、プライマー（または「プライミングオリゴマー」）、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を妨害するように修飾されている（例えば、３’ブロッキング部分を含めることによる）修飾プロモーターオリゴマー（または「プロモーター−プロバイダー」）、および選択的に、標的鎖からのｃＤＮＡの伸長を終結させるための結合分子（例えば、３’ブロックされたエクステンダーオリゴマー）を使用する。本明細書で言及される場合、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供する、ブロックされたプロモーター−プロバイダーオリゴヌクレオチドである。この方法は、標的配列の複数のコピーを合成し、そしてプライミングオリゴマーおよび結合分子を用いて、標的配列を含む標的ＲＮＡを処理する工程を含み、ここで、プライマーは、標的鎖の３’末端にハイブリダイズする。ＲＴは、プライマーの３’末端からのプライマー伸長を開始して、標的鎖との二重鎖の中にあるｃＤＮＡ（例えば、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ）を生成する。３’ブロックされたエクステンダーオリゴマーなどの結合分子が反応において使用される場合、これは、標的配列の５’末端に隣接するか近傍にある標的核酸に結合する。すなわち、結合分子は、増幅される標的配列の５’末端の次の標的鎖に結合する。プライマーがＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されてｃＤＮＡを生成する場合、そのｃＤＮＡの３’末端は結合分子の位置によって決定される。なぜなら、プライマー伸長産物が標的鎖に結合した結合分子に到達したときに重合が停止するからである。従って、ｃＤＮＡの３’末端は、標的配列の５’末端に対して相補的である。ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＴのＲＮａｓｅ Ｈ）がＲＮＡ鎖を分解するときに分離されるが、当業者は、任意の型の鎖分離が使用されてもよいことを認識している。次いで、プロモーター−プロバイダーオリゴマーが、ｃＤＮＡ鎖の３’末端近傍のｃＤＮＡにハイブリダイズする。このプロモーター−プロバイダーオリゴマーは、ＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列およびｃＤＮＡの３’領域における配列に対して相補的である３’領域を含む。プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、プロモーター−プロバイダーオリゴマーの３’末端からのＤＮＡ合成の開始を妨害するブロッキング部分を含む修飾３’末端もまた有する。プロモーター−プロバイダー：ｃＤＮＡ二重鎖において、ｃＤＮＡの３’末端は、鋳型としてプロモーターオリゴマーを使用して、ＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されて、ｃＤＮＡにプロモーター配列を加え、そして機能的な二本鎖プロモーターを作製する。次いで、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼは機能的プロモーターに結合し、そしてｃＤＮＡに相補的であり、最初の標的鎖から増幅された標的領域配列と実質的に同一である複数のＲＮＡ転写物を転写する。次いで、得られた増幅ＲＮＡは、プライマーを結合すること、およびさらなるｃＤＮＡ産生のための鋳型として働くことによって、再度このプロセスを通してサイクルを回すことができ、最終的には、サンプル中に存在する最初の標的核酸から多くのアンプリコンを生成する。単一プライマー転写関連増幅法のある実施形態は、結合分子を含まず、それゆえに、プライマーから作られたｃＤＮＡ産物は確定できない３’末端を有するが、増幅工程は、すべての他の工程について上記に記載されたように実質的に進行する。
【００８９】
適切な増幅条件は、本開示を考慮して、当業者によって容易に決定されることが可能である。「増幅条件」は、本明細書に開示される場合、核酸増幅を可能にする条件をいう。増幅条件は、ある実施形態において、本明細書に記載されるような「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」よりもストリンジェントではなくてもよい。本明細書において開示されるような、増幅反応において使用されるオリゴヌクレオチドは、増幅条件下でそれらの意図される標的に特異的でありかつハイブリダイズしてもよいが、特定の実施形態において、よりストリンジェントな条件下でハイブリダイズしてもよいし、ハイブリダイズしなくてもよい。一方、検出プローブは、一般的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。下記の実施例の節は標的核酸配列を増幅するための好ましい増幅条件を提供するが、核酸増幅を実行するための他の受容可能な条件は、利用される増幅の特定の方法に依存して、当業者によって容易に確認可能である。
【００９０】
本明細書に開示されるような増幅方法は、特定の実施形態において、増幅反応の感度、選択性、効率などの改善のために有効であるオリゴヌクレオチドの１つ以上の他の型の使用もまた、好ましく用いる。これらには、例えば、終結オリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドなどが含まれてもよい。
【００９１】
標的捕捉
特定の実施形態において、例えば、標的捕捉アプローチを使用して、増幅の前にサンプルからの標的核酸を精製または富化することが好ましくあり得る。「標的捕捉」（ＴＣ）とは、一般的に、磁気的に引きつけることが可能な粒子などの固体支持体に標的ポリヌクレオチドを捕捉することをいい、ここでは、固体支持体が、標的ポリヌクレオチドの精製手順の１回以上の洗浄工程の間に標的ポリヌクレオチドを保持している。このやり方で、標的ポリヌクレオチドは、次の核酸増幅工程の前に実質的に精製される。多数の標的捕捉方法が公知であり、本明細書に記載される方法と併せての使用のために適切である。
【００９２】
任意の支持体、例えば、溶液中で遊離しているマトリックスまたは粒子が使用されてもよく、これは、種々の材料のいずれか、例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、または金属製であってもよい。説明的な例は、磁気的に引きつけることが可能な粒子、例えば、単分散常磁性ビーズ（均一サイズ、＋−．５％）である支持体を使用し、これに固定化プローブが直接的に（例えば、共有結合、キレート化、またはイオン的相互作用を介して）または間接的に（例えば、リンカーを介して）結合し、この結合は核酸ハイブリダイゼーション条件の間に安定である。
【００９３】
例えば、米国特許出願第２００６００６８４１７号に記載されるような１つの例証的なアプローチは、標的相補的な領域を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴヌクレオチド、および捕捉支持体上の固定化プローブに標的核酸を結合する特異的な結合対のメンバーを使用し、従って、標的核酸が捕捉支持体から遊離される前に、他のサンプル成分から分離されている捕捉ハイブリッドを形成する。
【００９４】
別の例証的な方法において、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら、米国特許第６，１１０，６７８号は、捕捉プローブ、および好ましくは温度のみが異なる２つの異なるハイブリダイゼーション条件を使用することによって、結合した固定化プローブを用いて、磁気的に引きつけることが可能な粒子などの固体支持体上にサンプル中の標的ポリヌクレオチドを捕捉するための方法を記載している。２つのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの次数を制御し、ここでは、第１のハイブリダイゼーション条件は、標的ポリヌクレオチドへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、第２のハイブリダイゼーション条件は、固定化プローブへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にする。この方法は、捕捉された標的ポリヌクレオチドまたは増幅された標的ポリヌクレオチドを検出することによって、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出するために使用されてもよい。
【００９５】
別の例証的な標的捕捉技術（米国特許第４，４８６，５３９号）は、標的ポリヌクレオチドを捕捉するため、およびその存在を検出するための、ハイブリダイゼーションサンドイッチ技術を含む。この技術は、固体支持体に結合したプローブによる標的ポリヌクレオチドの捕捉、および捕捉された標的ポリヌクレオチドへの検出プローブのハイブリダイゼーションを包含する。標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない検出プローブは、固体支持体から容易に洗浄除去される。従って、残っている標識は、最初にサンプル中に存在している標的ポリヌクレオチドに付随している。
【００９６】
別の例証的な標的捕捉技術（米国特許第４，７５１，１７７号）は、標的ポリヌクレオチドと、固体支持体上に固定されたポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズするメディエーターポリヌクレオチドを使用する方法を包含する。このメディエーターポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドを固体支持体に結合して、結合した標的を生成する。標識プローブは結合した標的にハイブリダイズ可能であり、非結合標識プローブは固体支持体から洗浄除去できる。
【００９７】
さらに別の例証的な標的捕捉技術は、標的ポリヌクレオチドを検出するための方法を記載している、米国特許第４，８９４，３２４号および同第５，２８８，６０９号に記載されている。この方法は、標的の同じ鎖または逆ストランドに相補的な２つの一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを利用し、標的ポリヌクレオチドとの二重ハイブリッドの形成を生じる。１つの実施形態において、ハイブリッドは支持体に捕捉される。
【００９８】
別の例証的な標的捕捉技術、ＥＰ特許公開第０ ３７０ ６９４号において、核酸を検出するための方法およびキットは、プライマーおよびプライマー伸長産物を固定化するために特異的結合パートナーを用いて標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。この標識は、固体支持体に結合されているその受容体と特異的に複合体を形成する。
【００９９】
上記の捕捉技術は例示のみであって、限定ではない。確かに、増幅の前に目的の標的核酸配列を精製するために有効であるならば、当業者に利用可能である本質的に任意の技術が使用されてもよい。
【０１００】
核酸検出
特異的核酸ハイブリダイゼーションをモニタリングするために使用できる本質的に任意の標識および／または検出系が、サルモネラアンプリコンを検出することに連動して使用できる。このような多くの系が公知でありかつ当業者に利用可能であり、その説明的な例は以下で手短に議論される。
【０１０１】
検出系は、典型的には、目的の標的核酸の検出を容易にするために１つの型または別の型の検出オリゴヌクレオチドを利用する。検出は、直接的（すなわち、プローブは標的に直接的にハイブリダイズされる）または間接的（すなわち、プローブは、標的にプローブを連結する中間体構造にハイブリダイズされる）のいずれかであってもよい。プローブの標的配列は、一般的には、プローブが特異的にハイブリダイズするより大きな配列の中の特異的配列をいう。検出プローブは、標的配列が存在するか否かに依存して、プローブの三次元構造に寄与する標的特異的配列および他の配列または構造を含んでもよい（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８３５，５４２号、および同第６，８４９，４１２号）。
【０１０２】
多数の周知の標識系のいずれかが、検出を容易にするために使用されてもよい。直接的結合が共有結合または非共有結合的相互作用（例えば、水素結合、疎水性相互作用またはイオン性相互作用、ならびにキレートまたは配位錯体形成）を使用してもよいのに対して、間接的結合は、検出可能なシグナルを増幅する架橋部分またはリンカー（例えば、抗体またはさらなるオリゴヌクレオチドを介する）を使用してもよい。任意の検出可能な部分、例えば、放射性核種、ビオチンまたはアビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応基、色素または検出可能な色を付与する粒子（例えば、ラテックスまたは金属ビーズ）などの発色団、発光化合物（例えば、生物発光、燐光、または化学発光化合物）、および蛍光化合物が使用されてもよい。好ましい実施形態は、均質系で検出可能である「均質な検出可能な標識」を含み、ここでは、混液中の結合された標識プローブが、非結合標識プローブと比較して検出可能な変化を示し、これは、ハイブリダイズしていない標識プローブからハイブリダイズした標識プローブを物理的に取り出すことなく、標識が検出されることを可能にする（例えば、米国特許第６，００４，７４５号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。好ましい均質な検出可能な標識には化学発光化合物が含まれ、より好ましくは、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、周知である標準ＡＥまたはＡＥ誘導体が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，９４８，８９９号）。標識を合成する方法、核酸に標識を結合させる方法、および標識からのシグナルを検出する方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第１０章、ならびに米国特許第６，４１４，１５２号、同第５，１８５，４３９号、同第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，６３９，６０４号、同第４，５８１，３３３号、および同第５，７３１，１４８号）。核酸にＡＥ化合物を連結する好ましい方法は公知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，６３９，６０４号、カラム１０、第６行〜カラム１１、第３行、および実施例８）。好ましいＡＥ標識位置は、プローブの中心領域およびプローブの３’末端もしくは５’末端における、または公知の配列とのミスマッチ部位上もしくは近傍における、Ａ／Ｔ塩基対の領域の近傍であり、すなわち、このプローブは、所望の標的配列と比較して検出されないはずである。
【０１０３】
好ましい実施形態において、少なくともある程度の自己相補性を示すオリゴヌクレオチドは、検出の前にハイブリダイズしていないプローブの除去を最初に必要とすることなく、試験サンプル中のプローブ：標的二重鎖の検出を容易にするために望ましい。例として、変性条件に曝露されたときに、完全にまたは部分的に相補的である分子トーチの２つの相補的な領域は融解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件に戻されたときに、標的配列に対するハイブリダイゼーションのために利用可能な標的結合ドメインを残す。分子トーチは、標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインよりも、標的配列へのハイブリダイゼーションへ優勢であるように設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズされる場合とは反対に、分子トーチが自己ハイブリダイズされる場合に異なるシグナルが生成されるように配置された相互作用標識（例えば、蛍光／クエンチャー対）を含み、それによって、プローブに付随する実行可能な標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で、試験サンプル中のプローブ：標的二重鎖の検出を可能にする。分子トーチは米国特許第６，３６１，９４５号に完全に記載されており、その開示はそれによって参照により本明細書に援用される。
【０１０４】
使用されてもよい自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、一般的に「分子ビーコン」と呼ばれる構造である。分子ビーコンは、標的相補的配列、標的核酸配列の非存在下で閉じたコンホメーションでプローブを保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが開いたコンホメーションにあるときに相互作用する標識対を有する核酸分子である。標的核酸への分子ビーコン標的相補的配列のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、それによって、プローブを開いたコンホメーションにシフトさせる。この開いたコンホメーションへのシフトは、例えば、蛍光団およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であり得る、標識対の相互作用の減少に起因して検出可能である。分子ビーコンは米国特許第５，９２５，５１７号に十分に記載されており、その開示はそれによって参照により本明細書に援用される。特定の核酸配列を検出するために有用な分子ビーコンは、本明細書に開示されているプローブ配列の１つのいずれかの末端に、蛍光団を含む第１の核酸アーム、およびクエンチャー部分を含む第２の核酸アームを付加することによって作製されてもよい。この配置において、サルモネラ特異的プローブ配列は、得られた分子ビーコンの標的相補的「ループ」部分として働いてもよい。
【０１０５】
分子ビーコンは、好ましくは、検出可能な標識の相互作用的な対で標識される。好ましい検出可能な標識は、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴエネルギー移動メカニズムによって互いと相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、発色団の間の共鳴相互作用による、原子間距離よりも顕著に大きな距離にわたる、熱エネルギーへの転換を伴わず、かつドナーとアクセプターが動力学的衝突の状態になることがない、分子または分子の系における吸収の部位からその利用の部位までのエネルギー量子の無放射伝播を含む。「ドナー」は最初にエネルギーを吸収する部分であり、「アクセプター」はエネルギーが次に移動される部分である。ＦＲＥＴに加えて、少なくとも３つの他の「非ＦＲＥＴ」エネルギー移動プロセスが存在し、それによって、励起エネルギーはドナーからアクセプター分子へ移動可能である。
【０１０６】
１つの標識から放射されたエネルギーが第２の標識によって受容または吸収されることが可能であるように、２つの標識が十分に密接して保持される場合、ＦＲＥＴメカニズムによるかまたは非ＦＲＥＴメカニズムでよるかに関わらず、その２つの標識は「エネルギー移動関係」にあるといわれる。この場合、例えば、分子ビーコンがステム二重鎖の形成によって密接な状態に維持され、分子ビーコンの１つのアームに結合された蛍光団からの蛍光放射は、他のアーム上にクエンチャー部分によってクエンチされる場合である。
【０１０７】
分子ビーコンについての例証的な標識部分は、蛍光団、および蛍光クエンチング特性を有する第２の部分（すなわち、クエンチャー）を含む。この実施形態において、特徴的なシグナルは、おそらく特定の波長の蛍光であるが、代替的には、可視光シグナルであり得る。蛍光が含まれる場合、発光の変化は好ましくはＦＲＥＴに起因し、または放射的なエネルギー移動もしくは非ＦＲＥＴモードに起因する。密接した状態で相互作用的な標識の対を有する分子ビーコンが適切な波長の光によって刺激される場合、蛍光シグナルは最初のレベルで生成され、これは非常に低い可能性がある。この同じ分子ビーコンが開いた状態でありかつ適切な波長の光によって刺激される場合、蛍光団およびクエンチャー部分は、それらの間のエネルギー移動が実質的に除外されるように、互いから十分に離れている。この条件下では、クエンチャー部分は、蛍光団部分からの蛍光をクエンチすることは不可能である。蛍光団が適切な波長の光エネルギーによって刺激される場合、第１のレベルよりも高い、第２のレベルの蛍光シグナルが生成される。２つのレベルの蛍光の間の違いは検出可能でありかつ測定可能である。この様式で蛍光団部分およびクエンチャー部分を使用すると、分子ビーコンは「開いた」コンホメーションにおいてのみ「オン」であり、容易に検出可能なシグナルを発することによって、プローブが標的に結合していることを示す。プローブのコンホメーションの状態は、標識部分の間の相互作用を調節することによって、プローブから生成するシグナルを変化させる。
【０１０８】
非ＦＲＥＴからＦＲＥＴを区別するための試みを行わずに使用される可能性があるドナー／アクセプター標識対の例には、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン（ｅｏｓｉｎｅ）／ＤＡＢＣＹＬ、エリトロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が含まれる。当業者は、ドナーおよびアクセプター色素が異なる場合には、エネルギー移動は、アクセプターの感作された蛍光の出現によって、またはドナー蛍光のクエンチングによって検出可能であることを理解している。ドナーおよびアクセプター種が同じ場合、エネルギーは、得られる蛍光偏光解消によって検出可能である。ＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹ ７色素などの非蛍光アクセプターは、直接的な（すなわち、感作されていない）アクセプター励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題を有利に排除する。ドナー−アクセプター対の１つのメンバーとして使用できる好ましい蛍光団部分には、フルオレセイン、ＲＯＸ、およびＣＹ色素（ＣＹ５など）が含まれる。ドナー−アクセプター対の別のメンバーとして使用できる高度に好ましいクエンチャー部分には、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能であるＤＡＢＣＹＬおよびブラックホールクエンチャー（ｔｈｅ Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）部分が含まれる。
【０１０９】
合成技術ならびに核酸に標識を結合させる方法および標識を検出する方法は当該分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、第１０章、Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、同第５，６５６，２０７号、Ｈｏｇａｎら、同第５，５４７，８４２号、Ａｒｎｏｌｄら、同第５，１８５，４３９号および同第６，００４，７４５号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、同第４，５８１，３３３号、ならびにＢｅｃｋｅｒら、同第５，７３１，１４８号を参照のこと）。
【０１１０】
好ましいサルモネラオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセット
本明細書で使用される場合、本明細書に開示されるようなサルモネラ核酸を増幅および検出するための好ましい部位は、サルモネラ２３Ｓ ｒＲＮＡの３５０領域に存在することが見い出されている。さらに、この領域中の特に好ましいオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットは、感度、選択性、および特異性の改善を伴ってサルモネラ２３Ｓを増幅するために同定された。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、高度な特異性でサルモネラ標的配列にハイブリダイズ可能であり、結果として、サンプル中のサルモネラの存在および／またはレベルを検出し、かつ他の腸内細菌の存在からサルモネラを区別するために使用できる核酸増幅反応に加えることが可能であることが理解される。
【０１１１】
例えば、１つの実施形態において、増幅オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、高度な特異性で、サルモネラ２３ｓ ｒＲＮＡの３５０領域を標的とする。当然、本明細書に開示される増幅オリゴヌクレオチドを議論する際には、増幅反応において使用される第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、増幅される標的核酸配列の逆ストランドに対して特異性を有することが理解される。
【０１１２】
本明細書に開示される増幅オリゴヌクレオチドは、転写に基づく増幅反応、好ましくは、リアルタイム転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応においてサルモネラの標的核酸配列を増幅するために特に有効である。
【０１１３】
増幅反応において使用される特定のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドに加えて、さらなるオリゴヌクレオチドもまた、一般的には、増幅反応と連動して利用されることが理解される。例えば、特定の実施形態において、増幅反応は、検出オリゴヌクレオチド（例えば、トーチオリゴヌクレオチド）およびブロッカーオリゴヌクレオチドの１つ以上の使用もまた利用する。
【０１１４】
表１は、本発明によって同定された、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチド、およびその他の付属的なオリゴヌクレオチド（例えば、ブロッカー、トーチ、および標的捕捉オリゴヌクレオチド）の特定の例を提示する。
【０１１５】
【表１−１】
【０１１６】
【表１−２】
【０１１７】
【表１−３】
【０１１８】
【表１−４】
加えて、表２は、本明細書に開示されるような組成物、キット、および方法における使用のための２つの特に好ましいオリゴヌクレオチドセットを同定する。
【０１１９】
【表２】
優れたアッセイ性能を生じる、３５０領域から誘導された特に好ましい増幅オリゴヌクレオチドが同定されたが、同じかまたは類似の性能の対象が達成されるならば、３５０領域から誘導され、かつ本明細書に具体的に記載されたものからの実体的ではない修飾を有する他のオリゴヌクレオチドもまた使用されてもよいことが認識される。例えば、３５０領域から誘導され、かつ本明細書に開示されるような増幅反応において有用であるオリゴヌクレオチドは、それが増幅および／または検出の手順に実質的に影響を与えないならば、本明細書に同定されたものとは異なる長さを有することが可能である。好ましいオリゴヌクレオチドに対するこれらのおよび他の日常的かつ実質的ではない修飾は、従来的な技術を使用して実行することが可能であり、そしてこのような修飾が本明細書に提供された１つ以上の利点を維持する程度まで、これらは本発明の技術思想および範囲の中にあると見なされる。
【０１２０】
本明細書に開示されるような一般的原理は、以下の非限定的な実施例の参照によって、より完全に理解され得る。
【実施例】
【０１２１】
特定の態様および実施形態を例証する実施例が以下に提供される。以下の実施例は、実際に実施された実験の詳細を正確に反映していると考えられるが、しかし、実際に行われた研究と以下に示された実験の詳細の間に、何らかのわずかな不一致が存在する可能性があるが、このことは、これらの実験の結論またはこれらの実験を実施する実務者の能力に影響を与えるものではないことが可能である。実務者は、これらの実験が本発明をそこに記載されている特定の実施形態に限定することを意図しないことを理解している。加えて、当業者は、本明細書に記載される技術、材料、および方法を使用して、本発明の技術思想および範囲の中に留まりながら、これらおよび関連する方法を実行するために代替的な増幅系を容易に工夫および最適化できる。
【０１２２】
他に言及されない限り、以下の実施例におけるオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは、標準的なホスホルアミダイト化学を使用して合成され、その種々の方法は当該分野において周知である。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、１５４ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８７（１９８７）を参照のこと。本明細書において他に言及されない限り、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであって、これは、ホスホルアミダイトアナログとして合成において使用された。単一プライマー増幅において使用されるブロックされたオリゴヌクレオチドについては（Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第７，３７４，８８５号、それによって参照により本明細書に援用される）、３’末端ブロッキング部分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号２０−０１０２−０１）を使用して調製された「逆向きＣ」３’から３’連結からなった。分子トーチ（それによって参照により本明細書に援用される、Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第６，８４９，４１２号を参照のこと）は、標準的な方法によってオリゴヌクレオチドに結合された、Ｃ９非ヌクレオチド（トリエチレングリコール）リンカー結合領域（Ｓｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ９、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号１０−１９０９−ｘｘ）、５’−フルオレセイン（「Ｆ」）蛍光団、および３’−ｄａｂｓｙｌ（「Ｄ」）クエンチャー部分を使用して調製された。
【０１２３】
以下の実施例において示されるように、広範な種々の増幅試薬および条件の分析物が、サルモネラの検出のために高感度かつ選択的な増幅プロセスの開発に導いてきた。様々な標的濃度の複数の分析物の複製の生のリアルタイム増幅アッセイチャート（例えば、図１を参照のこと）は、オリゴヌクレオチドセットの品質を評価するために利用した。リアルタイムアッセイからのデータは、以下の本明細書のデータの提示のためにＴ時間値およびＲＦＵ範囲を計算するために収集および分析した。
【０１２４】
実施例１
例証的なアッセイ試薬およびプロトコールの説明
以下の実施例は、本明細書に記載されるリアルタイムＴＭＡ実験において使用される典型的なアッセイ試薬、プロトコール、条件などを説明する。反対のことが特定されない限り、試薬調製、設備の準備、およびアッセイプロトコールは、本質的に以下に示されるように実施した。
【０１２５】
Ａ．試薬およびサンプル
１．増幅試薬。「増幅試薬」または「Ａｍｐ試薬」は、以下の成分のおよその濃度を含んだ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．７中、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ ｄＴＴＰ、１０ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１２．７ｍＭ ＵＴＰ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および３３ｍＭ ＫＣｌ。プライマーおよび他のオリゴヌクレオチドは、Ａｍｐ試薬に加えた。
【０１２６】
２．酵素試薬。「酵素試薬」は、以下の成分のおよその濃度を含んだ：１２０ｍＭ ＫＣｌ、１０％ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１６０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ ７．０中、１１８０ ＲＴＵ／μＬ モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素（「ＲＴ」）および２６０ ＰＵ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ここで、１ＲＴＵのＲＴ活性は３７℃で２０分間に基質に１ｎｍｏｌのｄＴを取り込み、１ＰＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ活性は３７℃で２０分間で５ｆｍｏｌのＲＮＡ転写物を産生する。
【０１２７】
３．洗浄溶液。「洗浄溶液」は、ｐＨ ７．５までの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ。
【０１２８】
４．標的捕捉試薬。「標的捕捉試薬」（ＴＣＲ）は、以下の成分のおよその濃度を含んだ：ｄＴ３ｄＡ３０テールを有する捕捉プローブおよび任意に捕捉ヘルパープローブの１種以上、各６０ｐｍｏｌ／ｍＬ、２５０〜３００μｇ／ｍＬ常磁性オリゴ（ｄＴ）１４微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）、２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＥＤＴＡおよび１．８８Ｍ ＬｉＣｌ、ｐＨ ６．５。
【０１２９】
５．溶解試薬。「溶解緩衝液」は、１００ｍＭ ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ コハク酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および５００ｍＭ ＬｉＣｌ、ｐＨ ６．５を含む緩衝液中の１％ラウリル硫酸リチウムを含んだ。
【０１３０】
６．標的ｒＲＮＡサンプル。ｒＲＮＡサンプルは、本明細書に記載される実験における使用の前に、水、０．１％ ＬｉＬＳ、または溶解試薬の中で保存した。
【０１３１】
Ｂ．設備および材料
・キングフィッシャー（ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ）（登録商標）９６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）
・ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
・エッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）（登録商標）サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）Ｒ ０２２６７０５６５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）
・ハードシェルシンウォール９６ウェルスカート付きＰＣＲプレート（Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｓｋｉｒｔｅｄ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅｓ）、着色シェル／白色ウェル、カタログ番号：ＨＳＰ−９６１５、ＨＳＰ−９６２５、ＨＳＰ−９６３５）（ＢｉｏＲａｄ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）
・キングフィッシャー（ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ）（登録商標）９６チップコーム、ＤＷマグネット用（カタログ番号：９７００２５３４）Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）
・ＤＷ ９６プレート、Ｖ底、ポリプロピレン、滅菌２５ｐｃｓ／ケース（Ａｘｙｇｅｎ カタログ番号：Ｐ−２ＭＬ−ＳＱ−Ｃ−Ｓ；ＶＷＲカタログ番号４７７４９−８７４）
・キングフィッシャー（ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ）（登録商標）９６ＫＦプレート（２００マイクロリットル）（カタログ番号：９７００２５４０）
・ＰＴＩ（登録商標）プレートリーダー
・Ｃｈｒｏｍｏ４（商標）プレートリーダー
Ｃ．標的捕捉
サンプルは、標的を遊離させ、ｒＲＮＡを安定化するために溶解試薬と混合した。標的捕捉試薬を加えた。キングフィッシャー９６精製システムを使用して、リボソームＲＮＡ試薬を捕捉し、磁気粒子上で精製した。粒子は、分析物用にＦＡＭ標識されたトーチを、内部対照用にＴＡＭＲＡ標識されたトーチを含む増幅試薬中に再懸濁した。引き続く増幅のために核酸サンプルを精製および調製するための典型的な標的捕捉手順は、本質的に以下に記載されるように実施した。１００μＬの試験サンプル、標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む５０μＬのＴＣＲ、および１ｍＬ 溶解試薬を合わせ、６０℃で１５分間インキュベートした。洗浄溶液ならびに適切な磁気粒子洗浄および分離デバイス（例えば、磁気分離ラック、ＧＥＮ−ＰＲＯＢＥ（登録商標）Ｔａｒｇｅｔ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅカタログ番号５２０７、またはＴｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓから利用可能であるキングフィッシャー（登録商標）磁気粒子プロセッサーシステム）を使用して、処理された反応混液からのＴＣＲ磁気粒子を捕捉および洗浄した。洗浄後、磁気粒子は１００μＬの増幅試薬に再懸濁した。
【０１３２】
Ｄ．標的の増幅および検出
リアルタイムＴＭＡ増幅反応は、本質的に以下のように実施した。Ａｍｐ試薬中の３０μＬのサンプル、増幅および検出オリゴヌクレオチド、または標的捕捉手順からのＡｍｐ試薬中３０μＬの再懸濁粒子を、６０℃で１０分間インキュベートした。次いで、エッペンドルフサーモミキサーインキュベーター上で温度を低下させ、反応混液を４２℃まで１５分間平衡化させた。１０μＬの酵素試薬を加えた。分析物および内部対照の同時の増幅および検出のために、反応混液を混合し、リアルタイム検出システム（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから利用可能であるＯｐｔｉｃｏｎ（商標）もしくはＣｈｒｏｍｏ４（商標）検出システム、またはＰＴＩ ＦｌｕｏＤｉａ（登録商標）Ｔ７０機器）の中で、４２℃にて７５分間、インキュベートした。
【０１３３】
実施例２
サルモネラオリゴヌクレオチドセットの設計および初期試験
Ｅ．ｃｏｌｉ ｒＲＮＡ配列の３５０領域に対応する領域を使用して、いくつかのＴ７プロバイダー、ブロッカー、プライマー、およびトーチを設計した。この領域は他の非サルモネラ腸内細菌に対して独特であるミスマッチを含むので、この領域を選択した。
【０１３４】
Ｔ７、ブロッカー、プライマー、およびトーチオリゴヌクレオチドの総計４２６セットを、プレートスクリーニングプロトコールを使用してスクリーニングした。好ましいオリゴヌクレオチドの配列番号を表３に示す。オリゴヌクレオチドの番号および使用した濃度は；８種の異なるＴ７（５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）；７種の異なるブロッカー（０．５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）；１２種の異なるプライマー（５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）、および５種の異なるトーチ（８ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）であった。使用した標的はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ １３０７６／ＧＰ６０）ｒＲＮＡ、反応あたり１Ｅ＋４コピーであった。収集した生のデータを分析して、Ｔ時間値およびＲＦＵ範囲を計算した。導き出されたデータは、３０分未満のＴ時間を与えたセット、３０〜３５分の間のＴ時間を与えたセット、および３５〜３９分であったものに分類した（表４）。
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
【表４−１】
【０１３７】
【表４−２】
二次スクリーニングは、最初のスクリーニングに基づいて４２の潜在的オリゴヌクレオチドセット上で実施した。使用したオリゴヌクレオチドを表５に示す。
【０１３８】
【表５】
Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＧＰ６０）ｒＲＮＡに対する反応性を繰り返したのに加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＧＰ８８／ＡＴＣＣ１０７９８）ｒＲＮＡに対する予備的な交差反応性試験もまた実施した。これらの結果から、Ｅ．ｃｏｌｉと交差反応しないか、またはＥ．ｃｏｌｉと交差反応するが出現時間に遅れがあるかのいずれかであった４セットを同定した。これらの４つのオリゴヌクレオチドセットを表６に示す。
【０１３９】
【表６】
他の腸内細菌（すなわち、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）に対する初期の特異性試験は、４つのオリゴヌクレオチドセットすべてについて実施した。これらの４つのオリゴヌクレオチドセットから、最良のオリゴヌクレオチドセットをセット番号３として同定した。なぜなら、これはＥ．ｃｏｌｉ（ＧＰ８８）、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、およびＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉと交差反応しなかったからである。これはまた、サルモネラ属の下の他の種であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉも検出した。サルモネラ２３Ｓオリゴヌクレオチドセット番号３の反復試験は、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅのより多くの複製、ならびに３種のＥ．ｃｏｌｉ株（ＧＰ３／ＡＴＣＣ２５９２２、ＧＰ８８／ＡＴＣＣ１０７９８、およびＧＰ８３１／ＡＴＣＣ２９２１４）を用いて行った。Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ．ｂｏｎｇｏｒｉ ｒＲＮＡは、以前に得られたのと同様のレベルまで再度検出した。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＧＰ８３１）もまた、このオリゴヌクレオチドのセットによって検出した。
【０１４０】
代替的な領域
サルモネラ属研究課題のための設計は、１６Ｓ ｒＲＮＡの４５０領域において開始した（表７）。配列は、上記に議論した２３Ｓ ｒＲＮＡにおけるものと同じ様式でスクリーニングした。アッセイのための設計は、塩基４５０から４９０の間に示されるミスマッチに焦点を当てた。Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ株およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ株は、この領域においてサルモネラと同一ではないとしても、非常に近いことが示された。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉおよびＳ．ａｒｉｚｏｎａｅは、他のサルモネラよりもＥ．ｃｏｌｉに類似しており、偽陰性生成のリスクをもたらすこともまた決定された。初期のスクリーニング結果は、試験したＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ株およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ株を区別することが１６Ｓオリゴヌクレオチド系では不可能であることを示した。このデータは、この系に固有であった非常に高い偽陽性の割合を示した。初期のスクリーニング結果に基づいて、代替的な設計（２３Ｓ−３５０領域）を用いて先に進めることを決定した。ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒが区別できなかったからである。
【０１４１】
【表７−１】
【０１４２】
【表７−２】
【０１４３】
【表７−３】
従って、２３Ｓ ｒＲＮＡの３５０領域は、この領域についてのＴ７プロバイダーおよびプライマーオリゴヌクレオチドが、試験した多くの他のオリゴヌクレオチドセットと比較して、単一プライマーＴＭＡアッセイにおいて最高シグナルおよび最低バックグラウンドを示したという知見に基づいて、さらなる最適化のために好ましい領域として選択した。ＴＭＡアッセイにおけるオリゴヌクレオチドのスクリーニングを実施し、様々なトーチおよびブロッカーもまた分析した。最良のオリゴヌクレオチドセットを選択するための判断基準には、１Ｅ＋５コピーのサルモネラｒＲＮＡにおいて最低のバックグラウンドおよび最高のシグナルを有することを含めた。
【０１４４】
実施例３
サルモネラオリゴヌクレオチドセットのさらなる同定
バックグラウンドシグナルをさらに減少させ、特異性および感度を改善するために、多数のさらなるオリゴヌクレオチドセットを設計し、試験した。
【０１４５】
オリゴヌクレオチドセット番号３に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて見い出されるミスマッチを利用していくつかの再設計したＴ７プロバイダーおよびプライマーオリゴヌクレオチドを同定した。リアルタイムＴＭＡは、再設計した２３Ｓ Ｔ７プロバイダーおよびプライマーオリゴヌクレオチドに対して実行した。使用したオリゴヌクレオチドの数および濃度は以下の通りであった：１０種の異なるＴ７プロバイダー（５ｐｍｏｌ／反応）；１種のブロッカー（０．５ｐｍｏｌ／反応）；６種のプライマーオリゴヌクレオチド（５ｐｍｏｌ／反応）および１種のトーチオリゴヌクレオチド（８ｐｍｏｌ／反応）。オリゴヌクレオチドの同定は表８に示す。
【０１４６】
【表８】
使用した標的は、反応あたり１Ｅ＋４コピーのＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０ ｒＲＮＡ、反応あたり１Ｅ＋４コピーのＳ．ｂｏｎｇｏｒｉ、１Ｅ＋６コピー／ｒｘｎのＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８８ ｒＲＮＡ、および１Ｅ＋６コピー／ｒｘｎのＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８３１ ｒＲＮＡであった。総計６０セットを試験し、この再設計したセットからの１０個の潜在的なオリゴヌクレオチドセットを、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓについて相当のＴ時間およびＲＦＵ範囲を与えるとして同定したが、いくつかはＳ．ｂｏｎｇｏｒｉと反応しなかったか、またはＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８８および／またはＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８３１と交差反応した（表９）。
【０１４７】
【表９】
＊０個の標的はより低いＴ時間および同じＲＦＵを有した；＊＊０個の標的はより高いＴ時間およびより低いＲＦＵを有した。より低いＴ時間およびより高いＴ時間とは、それぞれ、シグナルのより初期およびより後期の出現をいう。
【０１４８】
リアルタイムＴＭＡは、以下の濃度を使用して上記の１０セットのサブセットをスクリーニングするために使用した：５ｐｍｏｌ／反応のＴ７プロバイダー；０．５ｐｍｏｌ／ｒｘｎのブロッカーオリゴヌクレオチド；５ｐｍｏｌ／反応のプライマーオリゴヌクレオチド；および８ｐｍｏｌ／ｒｘｎのトーチオリゴヌクレオチド。使用した標的は１Ｅ＋４ｃｐｓ／ｒｘｎのＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ｒＲＮＡ、１Ｅ＋４ｃｐｓ／ｒｘｎのＳ．ｂｏｎｇｏｒｉ；１Ｅ＋７ｃｐｓ／ｒｘｎの１３種のＥ．ｃｏｌｉ株；１Ｅ＋６ｃｐｓ／ｒｘｎのＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ；１Ｅ＋６ｃｐｓ／ｒｘｎのＥ．ｃｌｏａｃａｅ；１Ｅ＋６ｃｐｓ／ｒｘｎの２種のＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ株、および１Ｅ＋６ｃｐｓ／ｒｘｎのＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉであった。
【０１４９】
Ｔ７プロバイダーおよびプライマーオリゴヌクレオチドは、混合およびマッチして、表１０に示される試験に４つの可能なセットを提供した。
【０１５０】
【表１０】
これらのセットは、１３種すべてのＥ．ｃｏｌｉ株（ＡＴＣＣ番号２５９２２、１１７７５、１０７９８、３５１５０、３３７８０、２３７２２、２５４０４、２９２１４、２９１９４、３５３５９、２３４９９、１２７９２、および２３５０３）に対して試験し、次いで、他の腸内細菌に対して試験した。Ｔ時間およびＲＦＵの結果を互いに比較した。Ｅ．ｃｏｌｉの結果から得られた最良の３種のオリゴヌクレオチドセットを使用して、いくつかの他の腸内細菌に対して、セット番号３、７、および９を使用してリアルタイムＴＭＡを実行した。３種すべてのオリゴヌクレオチドセットは、それぞれ２８分、２５分、および２３分のＴ時間でＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａを拾い上げた。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉもまた、これらの３種のオリゴヌクレオチドセットによって、それぞれ３２分、３０分、および２６分のＴ時間で拾い上げた。いくつかの他の腸内細菌は、ある程度の交差反応性を示したが、非常に遅い出現時間および低いＲＦＵレベルを有した。
【０１５１】
得られた結果に基づいて、さらなるアッセイ試験および最適化は２種のオリゴヌクレオチドセット：番号７および９に焦点を合わせた（表１０）。オリゴヌクレオチドセット番号７および９を使用して、純粋系（標的捕捉工程がない）におけるＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０ ｒＲＮＡの様々なコピーレベルを検出する感度を試験した。１Ｅ＋５コピーにおいて、Ｔ時間は両方のセットのオリゴヌクレオチドについて、低い２０分範囲であった。オリゴヌクレオチドセット番号７は１００コピーレベルで複製の８３％を検出した。オリゴヌクレオチドセット番号９は、５０コピーレベルで複製の１００％を検出した。
【０１５２】
実施例４
サルモネラオリゴヌクレオチドセットのさらなる特徴付けおよび最適化
セット番号９よりも良好な特異性を示すセット番号７の結果、およびセット番号７よりもより良好な感度を示すセット番号９の結果に基づいて、Ｔ７プロバイダーとプライマーの両方のオリゴヌクレオチドの新たなオリゴヌクレオチド再設計を準備した。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドセット番号７
新たに再設計されたＴ７オリゴヌクレオチドプロバイダーは、配列番号５９のブロッカー配列、配列番号４９のプライマー配列、および配列番号６６のトーチ配列と組み合わせて、試験し、もともとの配列番号１のＴ７プロバイダー配列と比較し、Ｅ．ｃｏｌｉに対して最小限の交差反応性を提供した。増幅性能は、セット番号７と比較した、各セットのオリゴヌクレオチドについて評価した。標的はすべて、配列番号７４の配列を使用して、標的捕捉工程を経由した。これらのデータおよび曲線の形状から、配列番号２４および２６のＴ７プロバイダー配列をさらに評価するために選択した。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドセット番号９
Ｅ．ｃｏｌｉへの他の可能なミスマッチを利用するように、およびＥ．ｃｏｌｉへの配列番号４９の配列の交差反応性を減少させるために、配列番号５０および５１のプライマーオリゴヌクレオチドを配列番号４９の配列から再設計した。試験は、ベースライン性能測定を確立するために、標的捕捉なしで行った。
【０１５５】
表１１は再設計されたオリゴヌクレオチドを提示する。再設計されたオリゴヌクレオチドは、ゼロｒＲＮＡコピーレベルにおいて、最低の相対蛍光単位（ＲＦＵ）および最長のＴ時間を有した。ゼロｒＲＮＡコピーレベルにおける高いＲＦＵは、試薬中の汚染の可能性を示した。
【０１５６】
【表１１】
得られた結果に基づいて、オリゴヌクレオチドセット番号１がセット番号９よりも良好な特異性を有することが決定された。このオリゴヌクレオチドセットは、Ｅ．ｃｏｌｉに対してより少ない交差反応性を有し、さらなる研究のためのオリゴヌクレオチド系の１つとして使用した。
【０１５７】
さらなる研究のために使用した他のオリゴヌクレオチドセットはセット番号２であった。これらの２つのオリゴヌクレオチドセットを選択するための構造的な根拠は、他の腸内細菌からサルモネラを区別するための十分なミスマッチ、およびすべてのサルモネラ亜種を検出するための十分なマッチの組み合わせに基づいた。これは、増幅系が必要とされる特異性および感度を達成することを可能にする。これらの２つの好ましいオリゴヌクレオチドは表２に示す。
【０１５８】
確認試験を両方のオリゴヌクレオチドセットに対して実施した。セット番号１については、分析物用のＴ７（１５ｐｍｏｌ）、プライマー（１５ｐｍｏｌ）、およびブロッカー（５ｐｍｏｌ）、ならびにＩＣ用のＴ７（２ｐｍｏｌ）およびプライマー（２ｐｍｏｌ）を新たな濃度で使用して、Ｔ時間（１Ｅ＋５−１Ｅ＋４ Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ標的コピーにおいて少なくとも１０〜１５分早い）と曲線形状（直立形状および急な曲線）の両方に有意な改善が存在した。セット番号２については、分析物用のＴ７（１５ｐｍｏｌ）およびプライマー（１５ｐｍｏｌ）、ならびにＩＣ用のＴ７（２ｐｍｏｌ）およびプライマー（２ｐｍｏｌ）を使用して、Ｔ時間（１Ｅ＋５−１Ｅ＋４ Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ標的コピーにおいて少なくとも１０〜１７分早い）と曲線形状（直立形状および急な曲線）の両方に有意な改善が存在した。
【０１５９】
実施例５
標的捕捉組み込みおよび内部対照（ＩＣ）組み込みの評価
７種のサルモネラ２３Ｓ標的捕捉オリゴヌクレオチド（配列番号７１〜７７）を、２つのセットの増幅オリゴヌクレオチド：セット番号７およびセット番号９を使用して試験した。標的捕捉手順は、様々な量のＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０ ｒＲＮＡで、１Ｅ＋７コピーのＥ．ｃｏｌｉ ＧＰ８８ ｒＲＮＡに対して実施した。２種の潜在的に有用な標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）配列を同定した（配列番号７１および７４）。全体として、観察されたＴ時間は、純粋な系よりも約８〜１０分遅かった。配列番号７４の標的捕捉オリゴヌクレオチドは、すべての引き続く実験における使用のために選択した。
【０１６０】
キングフィッシャー９６を用いる標的捕捉の方法は表１２に要約する。増幅および酵素試薬は再構成した。洗浄プレートは、２００μＬ／ウェルの洗浄溶液でＫＦ２００プレートを満たすことによって調製した。ａｍｐプレートは、１００μＬ／ウェルの増幅試薬で別のＫＦ２００プレートを満たすことによって調製した。ａｍｐプレートと洗浄プレートの両方は使用するまでカバーをかけた。サンプルプレートは、２ｍＬの深いウェルの９６ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ）に５０μＬ ＴＣＲ／ウェルを加えることによって調製した。標的は、１０μＬ溶解溶液中で必要とされる濃度まで希釈した。１ｍｌの溶解溶液をサンプルプレートの各ウェルに加えた。反復ピペッターを用いて、１０μＬの標的溶液を適切な深いウェルに加えた。深いウェルチップコームをサンプルプレート中に配置した。洗浄プレートおよびａｍｐプレートのカバーを取り外した。ＫＦ９６プロトコールを開始し、３つすべてのプレートをＫＦ９６機器に配置した。ａｍｐプレートを位置４まで配置し、洗浄プレートを位置３に、そしてサンプルプレート（深いウェルプレート）を位置１に配置した。ＫＦ９６機器の位置２は空のままであった。一旦プレートがロードされると、ＫＦ９６機器は標的捕捉工程を開始した。ＫＦ９６の実行が完了したとき、プレートは取り外した。ａｍｐプレートから、マルチチャンネルピペッターを使用して各ウェルより３０μＬを取り出し、ＭＪ９６ウェルＰＣＲプレートに移した。
【０１６１】
【表１２】
内部対照（ＩＣ）は、標的捕捉を用いてサルモネラプロトタイプアッセイに組み込んだ。このＩＣオリゴヌクレオチドのセットは、１９〜２０分間の範囲にある平均Ｔ時間を用いてサルモネラ系のために十分な性能を発揮し、そして曲線は急な、鋭い、そして直立状であった。ＩＣ組み込みを用いると、サルモネラアッセイの感度は約１０倍低下したが、これは他の腸内細菌に対する特異性に影響を与えないように見えた。
【０１６２】
【表１３】
実施例６
感度、特異性、干渉、検出限界、交差反応性、および結果までの時間
ステージＩ
感度
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １３０７６を１Ｅ＋５コピー／反応でアッセイした。溶解緩衝液を陰性対照として使用した。標的捕捉のためにキングフィッシャー９６機器を、検出のためにＰＴＩリーダーを使用して、２０の陽性（１０５コピーのｒＲＮＡ／アッセイ）を試験した。２０の陰性（溶解緩衝液）を対照として使用した。標的捕捉のためのインプットは１ｍＬであり、標的捕捉のためのアウトプットは１００μＬであり、そのうちの３０μＬを増幅において使用した。陽性判断基準は１，０００ＲＦＵであった。２０の複製のうち１９は、＞９５％陽性比率で検出されるべきものであった。初期のラウンドの試験後に、１９未満の複製が陽性であった場合、４０のさらなる複製が試験されるべきであった。ステージＩ−感度の試験は、１Ｅ＋５コピー／反応でＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓについての１００％比率の陽性を生じ、０コピーで０％偽陽性を生じた。
【０１６３】
特異性
標的生物に密接に関連しているが、ｒＲＮＡ分析によって遺伝子型が区別される生物を陰性として選択した。標的捕捉のためにキングフィッシャー９６機器を、プライマーのアニーリングおよび酵素添加のためにエッペンドルフサーモミキサーを、および検出のためにＰＴＩリーダーを使用して、８例のチャレンジ生物を１Ｅ＋７コピー／ｒｘｎで試験した。すべてのチャレンジ生物（８）の２０回の反応を、増幅した各反応の１つの複製とともに試験した（１０５コピーのｒＲＮＡ、約１００ＣＦＵ／アッセイ）。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １３０７６を、１Ｅ＋５コピー／ｒｘｎで陽性対照として使用し、溶解溶液を陰性対照として使用した。陽性判断基準は１，０００ＲＦＵであった。１６０反応のうちの８反応以下は、≦５％の合わせた偽陽性比率の目的に合致するべきものであった（１０５コピーの非標的ｒＲＮＡを区別し、検出しない）。８例の生物にわたるいかなる偽陽性の分散も考慮されるべきものであった。集団化した偽陽性を有する生物≧４は、再試験され、さらに調べられるべきものであった。ステージＩ特異性試験は、試験したチャレンジ生物のいずれに対しても０％陽性を示し、陽性対照では１００％陽性であった。
【０１６４】
干渉
目的は、サンプル濃縮デバイスから得られることが予想される、一定量の溶解緩衝液に混入された１０〜１００ＣＦＵ ｒＲＮＡにほぼ等価であるｒＲＮＡの反復可能な検出であった。試験は、低コピー数の所望のｒＲＮＡおよび１０７コピーｒＲＮＡ（約１０，０００ＣＦＵ）の最も近い近隣生物を含めることであった。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １３０７６は、ベースライン標的として使用し、１Ｅ＋５コピーｒＲＮＡ／反応で試験した（約１００ＣＦＵ）。８例のチャレンジ生物は、０（溶解溶液のみ）または１Ｅ＋７コピー（約１０，０００ＣＦＵ）の濃度でサンプルに混入した。キングフィッシャー９６およびＰＴＩリーダーを使用してアッセイを実施した。すべての条件は、１２の複製で、１，０００ＲＦＵの陽性判断基準で試験した。結果は、最も近い近隣生物の存在下での陽性の再現性を報告するものであった。試験した生物にわたる干渉の分散は考慮されるべきものであった。干渉を示す生物は、再試験され、さらに調査されるべきものであった。ステージＩ干渉試験は、すべてのチャレンジサンプルおよび陽性対照において１００％陽性を示した。
【０１６５】
微生物フローラ決定
２０例の家禽洗浄液をＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅで分析して、家禽洗浄液に関連する通常フローラの見積もりを提供した。２０例の洗浄液のうちの１８例が、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅの外部の供給源から受容した１バッチの一部であった。その他の２例のサンプルが、２箇所の地方の食料品店で購入したニワトリからＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅで導き出された。ＴＳＡプレート上での総好気性菌数のための希釈プレーティングを行った。各家禽洗浄液サンプルの１Ｅ＋１〜１Ｅ＋４の希釈は、１×リン酸緩衝化生理食塩水中で調製した。１００μＬの非希釈、１Ｅ＋１〜１Ｅ＋４の洗浄液希釈液を、トリプシン処理ダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート上でプレーティングした。
【０１６６】
コロニー形成は、プレートを３０℃および３５〜３７℃で、２４〜４８時間の間、インキュベーションした後で実施した。異なる形態を表すコロニーは、ＲｉｂｏＰｒｉｎｔｅｒ（登録商標）微生物特徴付けシステムによる同定のために、ＰＡＣＥ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に送った。ＴＳＡ計数およびリボプリンティングに加えて、サンプルは、緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）で富化され、続いて、ＴＴブロスまたはｍＲＳＶブロス（半固形）のいずれかで選択的富化を行った。選択的富化を行った。選択的富化からのサンプルは、さらなる選択性のために、ＢＧＳとＸＬＴ４寒天プレートの両方でプレートした。ＢＩＯＬＯＧ同定およびグラム染色／オキシダーゼ試験を、代表的なコロニーに対して実施した。結果は、家禽洗浄液における通常のフローラを示した。
【０１６７】
サルモネラ選択のために、９０ｍｌ緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）は、１０ｍｌの家禽洗浄液を接種し、３５℃で２４時間、富化した。１０ｍｌのｍＲＳＶ（改変Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ−Ｂｏｕｉｌｌｉｏｎ）ブロスに１００μＬの富化サンプルを接種し、振盪しながら、４２℃で２４時間インキュベートした。１０ｍｌのＴＴブロス（Ｈａｊｎａ）に５００μＬの富化サンプルを接種し、振盪しながら、４２℃で２４時間インキュベートした。両方の選択培地（ｍＲＳＶおよびＴＴ）からの１０μＬサンプルを、ＸＬＴ４（キシロースリジンテトラチオネート）とＢＧＳ（ブリリアントグリーンセレナイト）の両方の寒天プレート上にプレートした。接種したプレートは３５℃でインキュベートし、２４時間および４８時間に調べた。ＸＬＴ４プレートおよびＢＧＳプレートからの選択したコロニーは、反対の培地にプレートした。例えば、コロニーをＸＬＴ４プレートから選択する場合、これはＢＧＳ培地上でプレートし、逆もまた同様であった（ｖｉｓａ ｖｅｒｓａ）。選択したコロニーはＴＳＡ上にプレートし、そこからＢＩＯＬＯＧ同定およびグラム染色／オキシダーゼ試験を実施して、微生物の同定を確認した。
【０１６８】
選択したコロニーのグリセロールストックを作り、微生物の同定の確認のためのリボプリンティングのためにＰＡＣＥ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌに送付した。
【０１６９】
ステージＩＩ
ステージＩＩ性能試験は、緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）中での予備増幅アッセイを評価した。この評価は純粋な培養溶解物を使用した。サンプル調製装置は含まれなかった。すべての陽性対照（１Ｅ＋５コピー／アッセイ）は、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＡＴＣＣ １３０７６から単離した精製ＲＮＡを使用し、陰性対照は溶解溶液：ＢＰＷ（７：３）であった。３００μＬ ＢＰＷおよび７００μＬ 溶解緩衝液（サンプルありまたはサンプルなし）を使用して、標的捕捉のための１ｍＬ インプットを作製した。標的捕捉のためのインプットは１ｍＬであり、標的捕捉のためのアウトプットは１００μＬであり、その３０μＬを増幅のために使用した。
【０１７０】
感度
Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ （ＡＴＣＣ １０７０８）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｔｙｐｈｉ（ＡＴＣＣ １９４３０）、およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ １３３１１）を、１Ｅ４−５Ｅ４コピーＲＮＡ／アッセイ（約１０〜５０ ＣＦＵ）のレベルで試験した。３つすべての種および陰性対照（混入していないＢＰＷ）は２０の複製で試験した。標的捕捉はキングフィッシャー９６機器上で実施し、エッペンドルフサーモサイクラー上での酵素添加を用い、続いてＰＴＩリーダー上での検出を行った。感度についての陽性判断基準パラメーターは１，０００ＲＦＵであった。２０の複製のうちの１９が陽性であるべきであった。２０のうちの１９未満が陽性であるならば、４０の複製のさらなる試験が必要であった。感度について試験したすべての生物はステージＩＩの要件を通過した。
【０１７１】
検出限界
目的は、アッセイインプット量あたり１０３〜１０４の等価なコピーｒＲＮＡ（約１〜１０ＣＦＵ）の反復可能な検出であった。反復可能な検出は≧９５％陽性として定義した。Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（ＡＴＣＣ １０７０８）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｔｙｐｈｉ（ＡＴＣＣ １９４３０）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ １３３１１）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ １３０７６）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ９１８４）、およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．ａｒｉｚｏｎａｅ（ＡＴＣＣ ２９９３３）は、１Ｅ３−１Ｅ４コピーＲＮＡ／アッセイのレベルで試験した（約１〜１０ ＣＦＵ）。標的捕捉はキングフィッシャー９６機器上で実施し、エッペンドルフサーモミキサー上での酵素添加を用い、そしてＰＴＩリーダー上での検出を行った。各種について、２０の複製物で試験した。溶解物は、ＣＦＵ中で定量した純粋な培養標的生物から調製し、溶解して約１〜１０ＣＦＵに等価なレベルの核酸標的を提供した。陽性判断基準は１，０００ＲＦＵであった。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １３０７６は、陽性対照ならびに試験のために必要とされる株の両方で考慮した。ＬＯＤ試験のために、陽性対照ＲＮＡは１Ｅ＋４コピー／アッセイで使用した。判断基準は、試験した種のすべてについて≧９５％陽性であった。２０のうちの１９未満が陽性である場合、さらなる４０の複製のさらなる試験が必要であった。すべての生物がステージＩＩ要件を通過した。
【０１７２】
包括的種および排他的種の分析試験
２２例の包括的生物および２２例の排他的生物を、１Ｅ＋５コピー／アッセイ（約１００ＣＦＵ）で試験した。試験は、標的捕捉のためにキングフィッシャー９６機器上で実施し、エッペンドルフサーモミキサー上で酵素添加を行い、そして検出のためにＰＴＩリーダーを用いた。包括的種については４つの複製、排他的種については８つの複製ですべてを試験した。
【０１７３】
包括的種については４のうちの３の複製が陽性であるべきであり、排他的種については８のうちの１以下が陽性であるべきであった。これらの判断基準がいずれの生物にも合致しない場合、その種／株についての試験は１２の複製で反復され、ここで包括的種の１２のうちの１１の複製は反応性であるべきものであった。再試験後に包括性判断基準に失敗した生物の同一性はさらに調べられるべきであった。再試験判断基準に合致しない排他的種については［＜３／１２陽性］、交差反応する生物をさらに調べた。
【０１７４】
【表１４−１】
【０１７５】
【表１４−２】
【０１７６】
【表１５】
包括種（表１４）および排他種（表１５）のステージＩＩ分析試験についての試験を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉの包括性という単一のわずかな例外以外は、完全に考慮した。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉは４の複製の初期の試験（０陽性／４表示）および１２の複製の再試験（０陽性／１２表示）に際して検出しなかった（表１４）。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉについては、Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅのＭＴＣ−ＮＩ（カタログ番号４５７３）を使用するＲＮＡ濃度の決定後に、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ ＡＴＣＣ ４３９７５の現在のロットからの新たな溶解物チューブ上で再試験を行った。試験はＳ．ｂｏｎｇｏｒｉの他の株に対して行ったが、現在のサルモネラアッセイによっては何も増幅されなかった。この生物のまれな単離に起因して、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉの検出では、アッセイのための要件を考慮しなかった。Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉは、３６，１８４個の単離物から２回単離されたのみであり、ｔｈｅ ＣＤＣ ２００５ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ａｎｎｕａｌ Ｓｕｍｍａｒｙによると上位３０種の単離物には入っていないからである。Ｓ．Ｃｕｂａｎａ再試験のために、初期試験において使用したのと同じロットから新たな溶解物チューブを使用した。再試験に際して、Ｓ．Ｃｕｂａｎａ（１２陽性／１２表示）は、再試験のためのステージ２受容可能判断基準を通過した。
【０１７７】
結果までの時間
ステージＩＩのための各アッセイ実行の時間は、サンプルを深いウェルプレートに加えた時点からＰＴＩリーダープロトコールの最後まで追跡した。サンプルローディングからＰＴＩリーダーの開始までの平均時間は、９６サンプルについて２時間１８分であった。ＰＴＩリーダー時間は７５分で不変であった。従って、開始から終了までの全体のアッセイは、９６サンプルについて平均で３時間３３分であった。
【０１７８】
これらの結果は、サルモネラの種特異的な検出が、リアルタイムＴＭＡデータの特徴に基づいて（例えば、ＲＦＵ曲線のサイズおよび形状はリアルタイムＴＭＡ反応から生成した）、密接に関連する生物の存在下においてさえ、これらの組成物および方法によって達成できることを示す。
【０１７９】
実施例７
混入した牛ひき肉およびアイスクリームの食品試験
日常生活サンプルを用いるプロトタイプサルモネラアッセイの機能性を試験するために、牛ひき肉およびアイスクリームを地方のスーパーマーケットから購入し、既知量のＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０を混入させ、そしてＳｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）サンプリングバッグ中の緩衝化ペプトン水中で増殖させた。様々な時点で、サンプルを取り出し、ＸＬＤ寒天選択培地を使用するコロニー係数のために、およびプロトタイプサルモネラアッセイを使用するリアルタイムＴＭＡのために処理した。本研究において続く種々の工程は以下に記載される。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０のＭｃＦａｒｌａｎｄ １を作製した。ＴＳＡプレート（無菌ＰＢＳ中で１Ｅ＋６まで希釈した）中のＣＦＵ計数の確認を実施した。２５ｇの食品を秤量し、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒバッグ中に無菌的に配置した。２０ＣＦＵを２２５ｍＬの緩衝化ペプトン水に直接接種した。混入させた培地は、食品を含有するＳｔｏｍａｃｈｅｒバッグに注ぎ、２分間、２００ｒｐｍで処理した。サンプルは３５℃でインキュベートした。１ｍＬアリコート（プレート計数における使用のために１アリコート）を０、４、６、８、および２４時間の時点で取り出した。サンプルは、ＣＦＵ計数のために、選択的寒天、ＸＬＤプレート上、３希釈、１プレート／希釈でプレートし、３５℃でインキュベートした。２４時間の時間内にサンプリングした残りの５アリコートは、１２，０００×ｇで３０秒間遠心分離した。上清を除去し、５００μＬの５０ｍＭ コハク酸緩衝液（０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％ ＬｉＬＳ、ｐＨ ４．８）をペレットに加え、次いで、２０秒間激しくボルテックスした。サンプルを少なくとも１５分間、＞９５℃に加熱した。次いで、これを、１２，０００×ｇで１分間遠心分離した。上清を新しい標識したチューブに移した。サンプルを−７０℃で凍結させた。食物対照は以下を含んだ：牛ひき肉については２つの陽性および２つの陰性、プレーンバニラアイスクリームについては２つの陽性および２つの陰性、ならびに培地のみの純粋系については２つの陽性および１つの陰性。
【０１８０】
サルモネラＣＦＵタイミングおよびプレート計数
２２５ｍｌの培地あたり１２ＣＦＵ周辺の接種材料を使用して、牛ひき肉に混入させたサルモネラは、緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）中での４時間のインキュベーション後に約２８０ＣＦＵ／ｍｌまで増殖した。混入させたアイスクリーム中では、ＢＰＷ中での６時間のインキュベーション後に２０ＣＦＵ／ｍｌを観察した。牛ひき肉は、アイスクリームよりも他の腸内細菌で実質的に多く汚染されており、４時間のインキュベーション後に１，０００ＣＦＵ／ｍｌを超えた。いかなる食品サンプルも有さない混入させた培地は、４時間のインキュベーション後に約２０ＣＦＵ／ｍｌであった。２４時間までに、ＢＰＷ中のすべての混入させた食品サンプルおよび混入させていない食品サンプルは＞１．５Ｅ＋７ ＣＦＵ／ｍｌを有した。すべての陰性の混入させていない培地対照はいかなる増殖も示さなかった。これらの結果は、ＣＦＵタイミングに関するリアルタイムＴＭＡから得られたデータおよびリアルタイムＴＭＡを使用する陽性検出可能シグナルの初期の出現を裏付ける。
【０１８１】
２２５ｍｌ ＢＰＷあたり１２ＣＦＵのサルモネラで混入させた食品サンプルについて、サルモネラについての陽性ＲＦＵシグナルは、牛ひき肉またはアイスクリームのいずれかにおいて４時間のインキュベーション後に観察された。混入させていない牛ひき肉対照の実行は８時間のインキュベーション後に陽性シグナルを生じ（生来の微生物汚染による）、混入させていないアイスクリーム対照の実行は２４時間のインキュベーション後に陽性シグナルを示した。両方の混入させていない食品サンプルにおいて、陽性シグナルは非常に遅く出現した（＞４０分）。混入させていない牛ひき肉サンプルにおいて、これらの偽陽性シグナルは、非常に高い核酸負荷で（例えば、このサンプル中では＞６Ｅ＋８コピーｒＲＮＡ／反応）、交差反応生物（最も可能性が高いのは他の腸内細菌）によって引き起こされたかもしれない。混入させていないアイスクリームサンプルにおいて、見かけの陽性シグナルは、ＸＬＤ選択培地中で増殖しなかったが、ＢＰＷ中で増殖した、生来のまたは汚染性の生物から誘導された。陽性対照（陽性の混入させた培地）は４時間〜２４時間の時点で陽性であった。陰性対照（陰性の混入させていない培地）は全体の実行を通して陰性のままであった。これらのデータは、リアルタイムＴＭＡが、ＢＰＷ中の最低限４時間の事前の富化に伴って、非常に低いレベルのサルモネラ汚染を検出するために使用できること、および全体のプロセスが、２つの短い（＜１分間）遠心分離工程を除いて、複雑なサンプル処理工程を必要としたことを示す。
【０１８２】
アッセイの要約
サルモネラ核酸の２つの領域、Ｅ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの約３８０〜約６３０ヌクレオチド塩基位置に対応する「４５０領域」およびＥ．ｃｏｌｉ ２３ｓ ｒＲＮＡの約１５０〜約４２５ヌクレオチド塩基位置に対応する「３５０領域」を標的とする増幅オリゴヌクレオチドおよび検出オリゴヌクレオチドを設計し、評価のために合成した。１６Ｓ−４５０領域における設計は、サルモネラ属アッセイのための良好なオリゴヌクレオチド候補を生じなかった。これらのオリゴヌクレオチドは、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒと交差反応した。
【０１８３】
アッセイの特異性および感度は、溶解した細菌ペレットを使用して評価した。細菌ペレットのＣＦＵおよびｒＲＮＡ標的レベルは、プレーティングによって、および直接ＤＮＡプローブアッセイによって見積もった。
【０１８４】
サルモネラアッセイは、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ．の６つの異なる亜種および１６の血清型を含む２２種のサルモネラの株に対して１００％感受性であった。１つの例外はＳ．ｂｏｎｇｏｒｉであり、これは、標的領域において、他のサルモネラ種よりも、Ｅ．ｃｏｌｉに遺伝子型的に類似している。サルモネラアッセイは、１Ｅ＋５コピー／アッセイの２２種の非サルモネラ生物に対して１００％特異的であった。
【０１８５】
２種の食物基質（ｆｏｏｄ ｍａｔｒｉｃｅｓ）、アイスクリームおよび牛ひき肉（２５ｇ）にＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（約２０ＣＦＵ）を接種し、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ装置を通してブロス中で処理した。プレーティングおよびリアルタイムＴＭＡは、２４時間の時間経過にわたってモニタリングした。リアルタイムＴＭＡシステムは、１つは分析物に特異的であり、１つは内部対照に特異的である２つの蛍光プローブを利用した。結果は蛍光出現曲線に基づいて分析した。リアルタイムＴＭＡアッセイは４時間未満で実行し、食品施設において試験のために必要な数日間から数時間の時間を減少した。結果は、低レベルのサルモネラ汚染が８時間以内に検出できることを示し、これは、非選択培地中の４時間の事前の富化、続いてサンプル処理およびリアルタイムＴＭＡを含んだ。食品の存在下では、感度は約８０００コピー（約８ＣＦＵ／グラム食品）であった。高い核酸負荷からの干渉は、８時間の増殖後に１．８Ｅ＋１０コピー（約１．８Ｅ＋７ ＣＦＵ）／グラム食品で開始した。
【０１８６】
要約すると、リアルタイムＴＭＡ技術は、食品由来の病原体の迅速、高感度な検出のために適切であった。このアッセイは、所望の種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｓｐ． ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｖ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＧＰ６０／ＡＴＣＣ １３０７６について、１Ｅ＋４ ｒＲＮＡコピー／アッセイ（約１０ＣＦＵ）の感度を有し、一方、種々の最も近い近縁種および１Ｅ＋７ ｒＲＮＡコピー／アッセイ（約１０，０００ＣＦＵ）の潜在的に同時汚染フローラを除外した。磁気粒子標的捕捉技術を利用して、牛ひき肉サンプルおよびアイスクリームサンプルからの干渉は観察しなかった。データは、改善された富化プロトコールを伴う、サルモネラの単一の８時間ワークシフトの中で食品サンプルのスクリーニングを可能にした、迅速な試験形式を実証した。
【０１８７】
本明細書で言及されるか、または引用される、記事、特許、および特許出願、ならびにすべての他の文書および電子的に利用可能な情報の内容は、あたかも各々の個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により援用されるために示されるのと同じ程度まで、それによってそれらの全体が参照により援用される。出願人は、任意のこのような記事、特許、特許出願、または他の物理的および電子的な文書からのいかなるおよびすべての物質および情報を本願に物理的に援用する権利を留保した。
【０１８８】
本明細書に例証的に記載された方法は、本明細書には具体的には開示されていなかった、任意のエレメント、制限の非存在下で適切に実施されてもよい。従って、例えば、「含む」、「含有する」、「包含する」などの用語は、広範にかつ非限定的に読むべきである。さらに、本明細書で利用される用語および表現は、説明の用語として使用されており、限定の用語ではなく、そしてこのような用語および表現の使用において、示されるかもしくは記載される特徴の任意の等価物またはその一部を除外する意図は存在しない。種々の修飾が、特許請求された本発明の範囲の中で可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書に開示されそこで具体化された本発明の改変およびバリエーションが当業者によって再構築され得ること、ならびにこのような改変およびバリエーションは、本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。
【０１８９】
本発明は、本明細書において広範にかつ一般的に記載されてきた。この一般的開示の範囲内にあるより狭い種および亜属の分類の各々もまた、本発明の方法の一部を形成する。これには、除外された物質が具体的に本明細書に列挙されているか否かに関わらず、属からの任意の対象を除外する否定的な限定という条件付きで、方法の一般的記載が含まれる。
【０１９０】
他の実施形態は以下に続く特許請求の範囲の中にある。加えて、本発明の方法の特徴または態様がマーカッシュグループによって記載される場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによってもまた、それによって記載されることを認識する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物であって、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドがＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドがサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、組成物。
【請求項２】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２６８〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３１０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０９に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物であって、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、組成物。
【請求項１２】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、３、４、５、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、３、４、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、３、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、２、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１〜８、１１、または１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号１７またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号５０またはその相補物の配列である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２６またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号４９またはその相補物の配列である、請求項１、３、４、５、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記トーチオリゴヌクレオチドが配列番号６６、６７、６８、６９、７０、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
配列番号１７またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号５０またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物。
【請求項３２】
配列番号２６またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号４９またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物。
【請求項３３】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマープロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキットであって、ここで、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、キット。
【請求項４８】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２６８〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３１０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０９に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項５３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５４】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５５】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７〜５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５６】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５７】
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキットであって、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、キット。
【請求項５８】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項５７に記載のキット。
【請求項６０】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項５７に記載のキット。
【請求項６１】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７〜６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４９、５０、５１、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６３】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４９、５０、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６４】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４９、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６５】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４８、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６６】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６７】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７〜６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６８】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７〜５９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６９】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５７、または５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７０】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号１７またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号５０またはその相補物の配列である、請求項４７〜６９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７１】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２６またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号４９またはその相補物の配列である、請求項４７、４９、５０、５１、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７２】
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４７〜７１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７３】
前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンである、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
前記トーチオリゴヌクレオチドが配列番号６６、６７、６８、６９、７０、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４７〜７１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７６】
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
配列番号１７またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号５０またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキット。
【請求項７８】
配列番号２６またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号４９またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキット。
【請求項７９】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８０】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８１】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８２】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８３】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８４】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８５】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８６】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８７】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８８】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８９】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９０】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９１】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９２】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマープロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９３】
サンプル中のサルモネラを検出するための方法であって、該方法はＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを実行する工程を包含し、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、方法。
【請求項９４】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２６８〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３１０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０９に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
サンプル中のサルモネラを検出するための方法であって、該方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを実施する工程を包含し、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、方法。
【請求項１０４】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９５、９６、９７、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９５、９６、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９５、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９４、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４、または１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０３、または１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号１７またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号５０またはその相補物の配列である、請求項９３〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２６またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号４９またはその相補物の配列である、請求項９３、９５、９６、９７、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
検出オリゴヌクレオチドを用いて増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、請求項９３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記トーチオリゴヌクレオチドが配列番号６６、６７、６８、６９、７０、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項９３〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
配列番号１７またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号５０またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための方法。
【請求項１２４】
配列番号２６またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号４９またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための方法。
【請求項１２５】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマープロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記増幅された核酸を検出する工程がリアルタイムで行われる、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１４０】
密接に関連する腸内細菌の存在下でサルモネラ核酸が特異的に検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
サルモネラ核酸が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａのうちの少なくとも１種の存在下で特異的に検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
サルモネラ核酸が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ、Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅ．ｈｏｓｈｉｎａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｃ．ｂｒａｋｉｉ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｃ．ｋｏｓｅｒｉ／ｄｉｖｅｒｓｕｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのうちの少なくとも１種の存在下で特異的に検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４３】
サルモネラ２３Ｓリボソーム核酸の３５０領域のフラグメントを増幅するように設計された２つ以上の増幅オリゴヌクレオチドを含む、サンプル中のサルモネラを検出するための組成物。
【請求項１４４】
サルモネラ２３Ｓリボソーム核酸を検出するための１種以上のプローブをさらに含む、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
請求項１４３に記載の増幅オリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを実施する工程、および増幅された核酸を請求項１４４に記載の１種以上のプローブを用いて検出する工程を包含する、サンプル中のサルモネラの存在を検出するための方法。
【請求項１】
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物であって、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドがＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドがサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、組成物。
【請求項２】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２６８〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３１０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０９に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物であって、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、組成物。
【請求項１２】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、３、４、５、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、３、４、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、３、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、２、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１、１１、１２、１３、または１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１〜８、１１、または１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号１７またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号５０またはその相補物の配列である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２６またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号４９またはその相補物の配列である、請求項１、３、４、５、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記トーチオリゴヌクレオチドが配列番号６６、６７、６８、６９、７０、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
配列番号１７またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号５０またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物。
【請求項３２】
配列番号２６またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号４９またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物。
【請求項３３】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマープロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項１、１１、３１、または３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキットであって、ここで、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、キット。
【請求項４８】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２６８〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３１０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０９に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７に記載のキット。
【請求項５３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５４】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５５】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７〜５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５６】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５７】
Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキットであって、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、キット。
【請求項５８】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項５７に記載のキット。
【請求項６０】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項５７に記載のキット。
【請求項６１】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７〜６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４９、５０、５１、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６３】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４９、５０、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６４】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４９、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６５】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４８、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６６】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、５７、５８、５９、または６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６７】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７〜６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６８】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７〜５９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６９】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５７、または５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７０】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号１７またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号５０またはその相補物の配列である、請求項４７〜６９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７１】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２６またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号４９またはその相補物の配列である、請求項４７、４９、５０、５１、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７２】
検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４７〜７１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７３】
前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンである、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
前記トーチオリゴヌクレオチドが配列番号６６、６７、６８、６９、７０、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４７〜７１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７６】
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
配列番号１７またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号５０またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキット。
【請求項７８】
配列番号２６またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号４９またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキット。
【請求項７９】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８０】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８１】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８２】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８３】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８４】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８５】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８６】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８７】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８８】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８９】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９０】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９１】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９２】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマープロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項４７、５７、７７、または７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９３】
サンプル中のサルモネラを検出するための方法であって、該方法はＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを実行する工程を包含し、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約２６８〜３２０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、方法。
【請求項９４】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２６８〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３１０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０９に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基２７９〜３０２に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
サンプル中のサルモネラを検出するための方法であって、該方法は、Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを実施する工程を包含し、該Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはＥ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基約３３８〜３９５に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該Ｔ７オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、方法。
【請求項１０４】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７４に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３７０に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの塩基３４９〜３６６に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９５、９６、９７、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９５、９６、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９５、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９４、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記Ｔ７プロバイダーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、１０３、１０４、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４、または１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０３、または１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号１７またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号５０またはその相補物の配列である、請求項９３〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記Ｔ７プロバイダーが配列番号２６またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号４９またはその相補物の配列である、請求項９３、９５、９６、９７、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
検出オリゴヌクレオチドを用いて増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、請求項９３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記トーチオリゴヌクレオチドが配列番号６６、６７、６８、６９、７０、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項９３〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
配列番号１７またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号５０またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための方法。
【請求項１２４】
配列番号２６またはその相補物の配列のＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号４９またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号６６またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号５９またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号７４またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための方法。
【請求項１２５】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記Ｔ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるＴ７プロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して１００％相補的である１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、１個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、２個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、３個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、４個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマープロバイダーオリゴヌクレオチドが、５個のミスマッチを有する１５〜３５ヌクレオチドを含む、請求項９３、１０３、１２３、または１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記増幅された核酸を検出する工程がリアルタイムで行われる、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１４０】
密接に関連する腸内細菌の存在下でサルモネラ核酸が特異的に検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
サルモネラ核酸が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａのうちの少なくとも１種の存在下で特異的に検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
サルモネラ核酸が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ、Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅ．ｈｏｓｈｉｎａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｃ．ｂｒａｋｉｉ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｃ．ｋｏｓｅｒｉ／ｄｉｖｅｒｓｕｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのうちの少なくとも１種の存在下で特異的に検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４３】
サルモネラ２３Ｓリボソーム核酸の３５０領域のフラグメントを増幅するように設計された２つ以上の増幅オリゴヌクレオチドを含む、サンプル中のサルモネラを検出するための組成物。
【請求項１４４】
サルモネラ２３Ｓリボソーム核酸を検出するための１種以上のプローブをさらに含む、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
請求項１４３に記載の増幅オリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを実施する工程、および増幅された核酸を請求項１４４に記載の１種以上のプローブを用いて検出する工程を包含する、サンプル中のサルモネラの存在を検出するための方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１１−５２１６５１（Ｐ２０１１−５２１６５１Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１１８７５（Ｐ２０１１−５１１８７５）
【出願日】平成２１年５月２９日（２００９．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５７３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５８１１９
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５００５０６５３０）ジェン−プロウブ インコーポレイテッド (58)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２９日（２００９．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５７３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５８１１９
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５００５０６５３０）ジェン−プロウブ インコーポレイテッド (58)
【Ｆターム（参考）】
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