サルモネラの検出のためのオリゴヌクレオチド
【課題】サルモネラ エンテリカまたはサルモネラ ボンゴリのＤＮＡまたはｃＤＮＡの、特に増幅後における検出のための、ヌクレオチド配列を具備する新規な手段を提供する。
【解決手段】サルモネラ エンテリカまたはサルモネラ ボンゴリ由来のＩａｇＡ配列またはＩａｇＢ配列。少なくとも９ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列。該オリゴヌクレオチド配列は、グループＩからＶＩの他のグループ、またはこれらのグループの一部に属するサルモネラ属のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅後に検出するためのプライマーとして用いる。
【解決手段】サルモネラ エンテリカまたはサルモネラ ボンゴリ由来のＩａｇＡ配列またはＩａｇＢ配列。少なくとも９ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列。該オリゴヌクレオチド配列は、グループＩからＶＩの他のグループ、またはこれらのグループの一部に属するサルモネラ属のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅後に検出するためのプライマーとして用いる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
サルモネラ属は、種であるサルモネラ・エンテリカ( Salmonella enterica )、並びにサルモネラ・ボンゴリ( Salmonella bongori ) の２種を含み、これらは生化学的特徴およびＤＮＡレベルでの相同性に基づいて６亜種に分割される。この属は、菌体抗原および鞭毛抗原によって定義される、２０００を超える血清変種(serovarieties) に細分される。一般的にサルモネラ属の細菌は、動物およびヒトに対して病原性を有する。そのような訳で、サルモネラ菌は、発展途上国における食中毒の最も一般的な事例の原因となる病原体の一つであることが知られているため、サルモネラ菌の亜種の高速かつ信頼性の高い検出方法は重要である。
【０００２】
食物の毒性感染(toxi-infections) の原因となるサルモネラ属菌は、主に、Ｓ．エンテリカの亜種Ｉ（グループＩとも称される）に属する。しかしながら、毒性感染は、サルモネラ感染が原因となる病状だけではない。
【０００３】
例えば、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィ(typhi) （以後、タイフィ(Typhi) と称する）は、ヒト腸チフスの病原体である。
【０００４】
サルモネラ属菌により引き起こされる感染の性質と、特に、患者または食物から採られた生物学的試料中におけるそれらの存在を調査する必要性とを考慮すれば、該試料中におけるこれら菌の存在を検出するための高速かつ高感度の利用可能な手段を得ることが、恐らく不可欠であろう。サルモネラ属菌を検出するために現在まで広範に用いられている標準的な培養方法は、相当な長さの時間を必要とし、例えば、食品の汚染をモニターするためには適切ではない。これらの方法の欠点を克服するために、ハイブリダイゼーションテストおよびポリメラーゼ連鎖反応に基づく試験のような、分子生物学的技術に基礎を有する幾つかの方法がすでに提案されている。飲食物中のサルモネラ亜種を検出するために、幾つかのハイブリダイゼーションおよびＰＣＲの手順において様々なＤＮＡプローブが用いられてきた。しかしながら、それらの技術はいずれも完全に満足し得るものではない。何故なら、使用される配列が完全には知られていないか、またはサルモネラ属にのみ存在するものではないために、該プローブと他の腸内細菌からのＤＮＡ配列との間の交差反応を導き、または多数の陰性誤認もしくは陽性誤認を導き得るからである。
【０００５】
本発明者は、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの種に属するすべてのサルモネラ属菌を特異的かつ高感度で検出できる手段を探索した。この目的のために、我々発明者は、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィ（Ｓ．タイフィ）株およびＳ．タイフィによる細胞の侵入に関連する遺伝子に注目した。
【０００６】
さらに、我々発明者は、限定されたグループのサルモネラ属菌（例えばグループＩの細菌）の特異的検出を許容する特定の条件を定義した。
【０００７】
タイフィ株が単層のヒーラ（ＨｅＬａ）細胞に付着し、それらの細胞に侵入し得ることは、従来の技術水準においてすでに示されていた（Ｙａｂｕｕｃｈｉｅｔ ａｌ， １９８６）。しかしながら現在に至るまで、細胞に付着して侵入するこのプロセスに関与する遺伝子としての決定基(determinants)は、明確には同定されていなかった。エルジングホルスト(Elsinghorst) ら（１９８９）は、大腸菌型の細菌に対してヘンル（Ｈｅｎｌｅ）４０７細胞を貫通する能力を与える、タイフィ染色体断片をクローン化した。最近、タイフィのＴｙ２株によるヒーラ細胞への侵入に関与する別の染色体領域が同定され、クローン化された（Ｐｏｐｏｆｆ ａｎｄ Ｄｉｏｎ，１９９０）。
【０００８】
本出願の発明者は、ポポフとディオン（１９９０）により記載された７．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ配列に含まれる２．４ｋｂのＳ．タイフィのＤＮＡ断片上に、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィが細胞に侵入する活性に関与し得る領域を同定した。これらの領域は特にヒーラ・タイプの培養細胞においては、更にＳ．エンテリカ種及び／またはＳ．ボンゴリ種のすべての検体(the representatives) についての一般化された診断または任意の特別な検出条件下であれば、Ｓ．エンテリカのグループＩの特異的な診断のための反応に用いることが可能である。
【０００９】
本発明者は、ＩａｇＡと称する配列およびＩａｇＢと称する配列を同定し、これを、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィによる感染の間に出現する、細胞侵入に関与するものとして特徴付けした。Ｓ．タイフィ中のそれら配列の特異性に導かれて、発明者は、Ｓ．タイフィによる感染を診断するための手段、またはさらにＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの種のサルモネラ属による感染を診断するための手段、または場合によっては特定のグループのＳ．エンテリカを検出するための手段を定義するためのそれらの使用を提案して来た。
【００１０】
サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリによる感染を診断するために用いることができるこれらの手段は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応のようなヌクレオチド配列を増幅させるための反応において用いることが可能なオリゴヌクレオチドを包含するものである。本発明は、Ｓ．エンテリカの、またはＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの特定の亜種の核酸を検出するためのプローブにも関するものであり、これらの核酸は、適切であれば増幅された断片であり得る。生物学的試料中において、並びに例えば食品中もしくは臨床的診断の対象となるいずれかの試料中において、サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリの存在を検出するためのキットおよび方法もまた、本発明の課題である。それらの検出キットおよび検出方法は、本発明の特定の態様によれば、Ｓ．エンテリカのグループＩ株に特異的である。
【００１１】
本発明の別の態様に従えば、一方では、それらの方法によりサルモネラ属の細菌であるＳ．エンテリカまたはＳ．ボンゴリの存在を調査することが可能となる。かように、サルモネラ属は６亜種、即ちグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩを含む。亜種Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶＩは、Ｓ．エンテリカ種に属し、亜種Ｖは、Ｓ．ボンゴリ種に属する。本発明は、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィによる細胞への侵入に関与するヌクレオチド配列であって、それぞれ、図１および図２に示されている配列のヌクレオチド９７とヌクレオチド１７５５との間（ＩａｇＡ）、並びに図２に示されている配列のヌクレオチド１７７６とヌクレオチド２２５５との間（ＩａｇＢ）である、配列ｉａｇＡまたは配列ｉａｇＢのひとつであることを特徴とするものにも関する。
【００１２】
本発明は、ｉａｇＡまたはｉａｇＢについて改変されているが、それにもかかわらず細胞への侵入に関して同じ特性を示すか、または厳格な条件の下では上記配列の一つとハイブリッドを形成するようなヌクレオチド配列にも関する。図１および図２において示される配列に一致するＩａｇＡタンパク質およびＩａｇＢタンパク質、または得られた配列が上記のＩａｇＡ配列またはＩａｇＢ配列の一つに対する抗体により認識されるかぎり、アミノ酸の突然変異、欠失もしくは付加により得られるそれらの配列の変異体もまた、本出願の課題である。
【００１３】
一般的に、本発明の課題は、図１および図２において示されるｉａｇＡ遺伝子およびｉａｇＢ遺伝子によりコードされる、いずれかのアミノ酸配列である。
さらに、本発明は何れかの断片、とりわけ細胞（特に培養ヒーラ細胞）に付着し感染するという特性をＳ．タイフィに保持させるのに十分な配列の一つであるいずれかの精製断片に関する。培養中のヒーラ細胞に感染させるための方法は、特にＷＯ９２／０１０５６の番号で公開された国際特許出願に記載された標準的方法である。
【００１４】
別の側面によれば、本発明は、生物学的試料中のＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの存在を検出し、適切であれば、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリを定量するための手段に関する。生物学的試料とは、動物もしくはヒトにおいてインビトロ分析を実施するために採集されたか、またはその性質に関わりなく食品から採集されたか、または所望の病原体を含む可能性が高い液体、固体もしくは気体の媒質から採集されたいずれかの試料を意味するものと理解される。
【００１５】
これに関連する本発明の課題は、上記のＩａｇＡ配列またはＩａｇＢ配列の１つとハイブリッド化することを特徴とする、少なくとも９ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列である。上記のハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションにおける所望の特異性にしたがって定義され、本出願の実施例には指針として適切な条件が与えられている。
【００１６】
好ましくは、本発明は、図１から図２において表されるＩａｇＡ配列のＣ末端部分に由来するオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチド型の配列は、グループＩからＶＩの他のグループ、またはこれらのグループの一部に属するサルモネラ属（Ｓ．エンテリカ種および／またはＳ．ボンゴリ種）のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅後に検出するため、あるいは別の条件下においてＳ．エンテリカのグループＩの特異的な検出のためのプライマーとして用いるために選択することができる。これは特に、当業者公知の方法にしたがって化学合成により得られたヌクレオチド配列でもよい。
【００１７】
サルモネラ属のグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの１つに属する細菌に特有な核酸、特にＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅に用いることができる好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば以下の通りである（図１から図２に示したＩａｇＡ配列内におけるそれらの位置をも示す）：
Ｉａｇ１：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡＧ ＧＴＴＡＴＧ−３´（位置）１４２４−１４４３
Ｉａｇ２：５´−ＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡ ＡＧＴＧＡＡ−３´（位置）１５８５−１６０５
Ｉａｇ３：５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡ ＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´（位置）１４９５−１５２１
Ｉａｇ４：５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧ ＡＣＧＡＴＡ−３´（位置）１５６４−１５８４
Ｉａｇ５：５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧ ＣＴＧＴＧ−３´（位置）１３１８−１３３７
Ｉａｇ６：５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡ ＣＴＡＡＣＧ−３´（位置）１６３７−１６５７
ｓｌｍ１：５´−ＣＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴ ＣＡＣＣＴ−３´（位置）７０９−７２８
ｓｌｍ２：５´−ＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴ ＧＧＧ−３´（位置）１０１４−１０３１
ｓｌｍ３：５´−ＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴ ＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＡＣＡ Ｃ−３´（位置）７３２−７６２
ｓｌｍ４：５´−ＣＴＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡ ＡＡＧＣＡ−３´（位置）８２３−８４２
ＳＳ２８：５´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴ ＧＣ−３´。
【００１８】
Ｓ．エンテリカ種および／またはＳ．ボンゴリ種の全サルモネラ菌株のｉａｇＢ遺伝子からＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅するためのプライマーとして用いることができるその他のオリゴヌクレオチドは、図２に示されるｉａｇＢ配列から定義された。
それゆえに、以下のヌクレオチド鎖に一致するオリゴヌクレオチドは、本発明の主題である：
Ｉａｇ７：５´−ＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＡＴＴＧＣＴ−３´
Ｉａｇ８：５´−ＴＴＡＣＧＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡ−３´
Ｉａｇ９：５´−ＴＧＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＣＧＡＴＣ−３´
Ｉａｇ１０：５´−ＡＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴ−３´。
【００１９】
これらのオリゴヌクレオチドはまた、例えば、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡの増幅産生物の検出のためのプローブとしても用いることができる。
【００２０】
細菌が属するグループに関係なく、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの核酸の増幅を実施する上で好ましいプライマー対は、例えば、プライマーのＩａｇ５（センス）およびＩａｇ６（アンチセンス）からなっている。
このプライマー対は、３４０ｂｐの核酸断片の増幅を指示する。
【００２１】
もう一つの好ましいプライマー対は、プライマーのＳｌｍ１（センス）およびＳｌｍ２（アンチセンス）からなっている。これらのプライマーは、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの１つであるＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの細菌のＤＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリッド形成が可能である。
【００２２】
別の好ましい態様によれば、本発明は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅後の検出条件が実施例Ｉに記載されているものであるときに、サルモネラ・エンテリカ・グループＩの特異的検出のためのプライマーとして用い得るオリゴヌクレオチドに関する。
【００２３】
そのようなプライマーは、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩを代表するＳ．エンテリカまたはＳ．ボンゴリの株由来の核酸配列を増殖する能力を特徴とする。但し、その検出条件は、グループＩの細菌単独の検出を許容する実施例Ｉに記載した条件である。
【００２４】
Ｓ．エンテリカ・グループＩ由来のＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列の検出について特異的なプライマーとして、これらの目的のために用い得る１対のオリゴヌクレオチドは、例えば、次の配列からなる：
ＳＳ２ ５´−ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣ−３´および
ＳＳ２８ ´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´。
【００２５】
本発明者が定義するオリゴヌクレオチドにより、感度、速度、簡便性および特異性において十分な条件の下で、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの診断を考察することが可能となる。
【００２６】
Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡの増幅による、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの検出のためのキットもまた本発明の主題であり、該キットは、
−厳格な条件の下で、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡとハイブリッド化することができる、上記のオリゴヌクレオチドと、
−前出のページにおいて与えられた定義の１つに一致する、増幅された断片の検出のためのプローブと、
−増幅反応を実施するために必要な試薬と
を具備することを特徴とする。
【００２７】
従って、本発明の主題は特に、前出のページにおいて記載されたｉａｇＡ配列もしくはｉａｇＢ配列の１つに含まれているか、またはその様な配列に対して相補的である、サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリからのＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列の増幅のためのプライマーとしての上記のオリゴヌクレオチドの使用であり、或いは増幅されたヌクレオチド配列の検出のためのプローブとしてのこれらのオリゴヌクレオチドの使用である。
【００２８】
例えば、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの検出のために、それぞれをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして、オリゴヌクレオチドｉａｇ５およびｉａｇ６を用いることができる。
【００２９】
同様に、生物学的試料中において、これらのグループの１つに由来するＳ．エンテリカ種および／またはＳ．ボンゴリ種の細菌を検出するために、Ｓｌｍ１とＳｌｍ２とのプライマー対を用いることができる。
【００３０】
本発明はまた、生物学的試料中において、Ｓ．エンテリカ・グループＩのインビトロでの特異的検出のために、オリゴヌクレオチドＳＳ２およびＳＳ２８を使用することに関する。
【００３１】
所望のヌクレオチド配列の増幅のために用いられるプライマーが、他のグループＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの１つに属するＳ．エンテリカ菌および／またはＳ．ボンゴリ菌についての該増幅を許容するけれども、採用される実験条件が、検体である生物学的試料中に存在し得る同じグループの細菌または異なる生物の検出を許容しないとすれば、上記の検出は特異的である。
【００３２】
したがって本発明は、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡの増幅後に、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの細菌の検出のために用い得るオリゴヌクレオチドのセットに関するものであって、該セットは、
−Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとの間で、厳格な条件の下に、ハイブリッド化することが可能な上記で与えられた定義に一致する１対のオリゴヌクレオチドと、
−上記で与えられた特徴に一致するプローブと
を具備することを特徴とする。
【００３３】
生物学的試料中において、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの１つに属するサルモネラ・エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの株のインビトロ検出のために用い得る第１のオリゴヌクレオチドセットは、
−増幅のためのプライマーとして用い得る、配列Ｉａｇ５（５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＴＧＴＧ−３´）および配列Ｉａｇ６（５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＣＧ−３´）と、
−表示プローブ(revealing probe) として用い得る配列Ｉａｇ３（５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´）および捕獲プローブ(capture probe) として用い得る配列Ｉａｇ４（５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３´）と
を含むことを特徴とする。
【００３４】
生物学的試料中において、Ｓ．エンテリカ・グループＩのインビトロでの特異的検出のために用い得るもう一つのオリゴヌクレオチドセットは、
ＳＳ２ （５´−ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣ−３´）と、
ＳＳ２８ （‘−ＴＡＡＴＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´）と
を含むことを特徴とする。
【００３５】
さらに、図１から図２に示されるヌクレオチド配列ｉａｇＡによりコードされたｉａｇＡタンパク質、並びに図２において示されるヌクレオチド配列ｉａｇＢによりコードされたｉａｇＢタンパク質も本出願の主題である。
【００３６】
ｉａｇＡタンパク質およびｉａｇＢタンパク質のそれぞれは、図１および図２に示されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３７】
また、例えば、ＰＣＲにより前もって増幅された、生物学的試料中のサルモネラ・エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのヌクレオチド配列をインビトロで検出するための方法も本発明の範囲内に入るものであり、この方法は、
−増幅されたＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの配列を変性させる工程と、
−このＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリからの増幅され変性されたヌクレオチド配列と、上記に定義されたヌクレオチドから得られる捕獲プローブおよび表示プローブとを、前記の捕獲プローブおよび表示プローブがＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリ由来の上記の増幅されたヌクレオチド配列とハイブリッド化することを許容する条件下で接触させる（なお捕獲プローブはマイクロタイタープレートのウェル表面に付着させ、表示プローブはラベルして、適切なハイブリダイゼーション用緩衝液中に遊離させておく）工程と；
−ハイブリダイゼーション反応をさせるために十分な時間、反応混合物をインキュベートする工程と；
−未反応のオリゴヌクレオチドを除去するために洗浄する工程と、
−増幅されたヌクレオチド配列にハイブリッド化した表示プローブを顕在化させる工程と
を具備することを特徴とする。
【００３８】
上記の検出方法は、有利には、
−等容量の(volume for volume) ２００ｍＭ ＮａＯＨ，４０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を添加することにより、１０μｌ容量の増幅配列を変性させる工程と、
−適切なハイブリダイゼーション用緩衝液中において、ウェル表面が捕獲プローブにより被覆されたマイクロプレートのプレハイブリダイゼーションを行う工程と、
−マイクロプレートを空にして、変性された増幅断片及び１０ｎｇ／μｌの濃度のペルオキシダーゼでラベル化された表示プローブを含む２００μｌのハイブリダイゼーション用緩衝液を、それぞれのウェルに充填する工程と、
−この混合物を、攪拌しながら３７℃での１時間のインキュベーションを行う工程と、
−１０Ｘ洗浄溶液（１００ｍＭのトリス，３ＭのＮａＣｌ，１％のトゥイーン２０，ｐＨ７．４）を用いて、反応した混合物を洗浄する工程と、−発色基質の存在下での比色定量によって、プローブに結合したペルオキシダーゼの活性を検出する工程と
にしたがって検出が行われることを特徴とする。
【００３９】
表示プローブに存在するペルオキシダーゼの活性は、次の工程、即ち、
−反応混合物を含むそれぞれのウェルに、２００μｌの、４０ｍＭのクエン酸三ナトリウム溶液，０．０３％ Ｈ2 Ｏ ３０％，７．５ｍｇ／ｍｌのオルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を入れる工程と、
−暗室内において３７℃で３０分間、マイクロプレートのインキュベーションを行う工程と、
−４ＮのＨ2 ＳＯ4 溶液を５０μｌ／ウェル添加することにより、反応のブロッキングを行う工程と、
−４９２ｎｍの波長での光学密度を定量（レファレンスの波長は６２０ｎｍ）する工程と
によって行うことができる。
【００４０】
使用する捕獲プローブはオリゴヌクレオチドＩａｇ４であり、表示プローブはオリゴヌクレオチドＩａｇ３であるのが有利である。
こうして、本発明の範囲において定義された手段は、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのひとつにおける非特異的検出であっても、Ｓ．エンテリカ型および／またはＳ．ボンゴリ型の細菌の存在の定性的または定量的な検出を可能にする。
他方、実施例Ｉに記載したような検出工程を実施するための特定の条件下では、プライマーＳＳ２、ＳＳ２８およびプローブＳＳ４０は、Ｓ．エンテリカ・グループＩの細菌の特異的な検出を可能にする。
本発明の他の特徴および長所を、以下の実施例および図において示す。
【実施例】
【００４１】
実施例１：２．４ｋｂのＤＮＡ断片のクローン化および配列決定
ポポフおよびディオン（１９９０）による刊行物中に記載された７．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ配列から、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素を用いて切断することにより得られた制限断片を用いることにより、このＤＮＡ断片をベクターｍ１３の誘導体（メッシングおよびビエイラ(Messing and Vieira)、１９８２）にサブクローン化した。
このクローニングの実施後に、改変Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ(Sequenase) 、ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．）とプライマーとしての万能型合成オリゴヌクレオチドとを用いて、読み終わり式(chain termination) ジデオキシ法を実施した。使用した制限断片の末端は、すべて互いに重複し合う。ＤＮＡの配列決定を、それぞれの鎖ごとに少なくとも２回実施した。リパンおよびピアソン(Lipan and Pearson) によるプログラム（１９８５）を用いて、ヌクレオチド配列を解析した。
【００４２】
図１から図３に掲載された配列が示すように、配列決定された断片中には２つのオープン・リーディング・フレームが含まれる；それらを、ｉａｇＡ（侵入関連遺伝子(invasion associate gene) の略語）およびｉａｇＢの術語で称する。その２つのオープン・リーディング・フレームを、同じ配向(orientation) で転写する。配列５´−ＡＧＡＧＡ−３´に続くｉａｇＡのオープン・リーディング・フレームの最初のＡＴＧコドン（ｂｐ９７）が、ｉａｇＡ遺伝子の翻訳開始部位に一致すると考えられる。このｉａｇＡ遺伝子は、５５３アミノ酸残基を含む算出分子量６３０２６Ｄａのポリペプチドをコードする。ＩａｇＡタンパク質のＮ末端側ドメインと、転写制御のためのタンパク質ＰｈｏＢに対応するドメイン（１０８アミノ酸の重複について、２４％の同一性と５２％の類似性）および大腸菌のタンパク質ＰｈｏＰに対応するドメイン（１００のアミノ酸の配列について、２５％の同一性と６９％の類似性）との間に、有意な相同性が検出された。ｉａｇＢ遺伝子の開始のためのＡＴＧコドン（ｂｐ１７７６）にもまた、潜在的なリボゾーム結合部位（５´−ＡＧＧＡＡＧ−３´）が先行する。ｉａｇＢ遺伝子は、１６０アミノ酸残基を含み且つ１８３６９Ｄａの算定分子量を有するポリペプチドをコードする。ＩａｇＢタンパク質の配列をジェンバンク(Genbank) のデータバンクに含まれる翻訳配列と比較したところ、ＩｐｇＦタンパク質との有意な相同性（１５１のアミノ酸の配列について、４３％の同一性と６６％の類似性）を示した。
【００４３】
シゲラ・フレクスネリ( Shigella flexneri) の病原性に関連したプラスミド上のｍｘｉ−ｓｐｉ遺伝子座の５´末端に位置するｉｐｇＦ遺伝子が、ＩｐｇＦタンパク質をコードする（アラウイ(Allaoui) ら、１９９３）。それゆえに、検出されたサルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィのタンパク質は、これらの細菌による感染、特に細胞への付着および貫通において働くと考えられる。
【００４４】
実施例２：Ｓ．エンテリカ・グループＩの特異的検出
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるサルモネラ属の亜種を検出するための手順を開発した。プライマーとして用いる一組のオリゴヌクレオチドを定義して、Ｓ．タイフィのＴｙ２株によるヒーラ（ＨｅＬａ）細胞の侵入に必要な遺伝子の９３ｂｐ断片を増幅した。シュブリエ(Chevrier)らにより１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ７，１８７−１９７に記載された手順にしたがい、２つの異なるオリゴヌクレヌクレオチドを用いて、マイクロタイタープレート上での非放射性サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションにより増幅産生物を分析した。捕獲用オリゴヌクレヌクレオチドをその５´末端でリン酸化し、マイクロタイタープレートの、アミノ含有基を有するウェルに共有結合させた。検出用オリゴヌクレヌクレオチドをその５´末端でアミノ化し、次いでビオチニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルでラベル化した。ハイブリダイゼーションの後、アルカリホスファターゼおよび色素原基質と複合体を形成したアビジンにより、そのハイブリッド分子を検出した。この方法は、周期的加熱器(a thermal cycler)および従来型のマイクロタイター読取り機（a conventional microtitrereader）だけの使用を必要とし、大きな規模で実施できる。
【００４５】
〔材料および方法〕
「細菌の菌株」
この研究において、Ｓ．ボンゴリ［サムブルックら、１９８９、モレキュラークローニングの実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Sambrook et al,1989,Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)］、Ｓ．エンテリカの亜種Ｉ（１１６）、ＩＩ（５６）、ＩＩＩａ（１１）ＩＩＩｂ（３０）ＩＶ（５）およびＶＩ（５）を含む２２８の臨床単離株（表１および表２）、並びに９の異なる属を代表する１６の非サルモネラ腸内細菌株（表３）を用いた。ＰＣＲテストにおいては、Ｓ．血清変種タイフィムリウム( Typhimurium ) Ｃ５３株を陽性対照として用い、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ＨＢ１０１株を陰性対照として用いた。
【００４６】
「ＤＮＡの抽出」
ＬＢ培地中において、３７℃で菌株を培養した。ＤＮＡの高速抽出を実施するために、一夜保存した２ｍｌの培養物を遠心分離し、１ｍｌのＴＥ（１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ８の１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液）で再懸濁した。その細胞を遠心分離し、遠心分離して得たペレットを５００μｌの滅菌蒸留水で再懸濁し、１００℃で１０分間加熱した。最終的に、溶液を遠心分離し、上清をＰＣＲ実験のために貯蔵した。
【００４７】
「オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブ」
ホスホラミダイト技術を用いて、サイクロンＤＮＡシンセサイザー（ミリポア−ウォーターズ社(Millipore-Waters)）でオリゴヌクレオチドを合成した。
オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、
ＳＳ２： ５´−ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣ−３´および
ＳＳ２８： ５´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´
であった。
【００４８】
オリゴヌクレオチド捕獲プローブとしての、
ＳＳ４０： ５´−ＣＣＣＧＡＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＴ−３´
を、サムブルックら、１９８９、（モレキュラークローニングの実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）によりなされた記載にしたがって、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー(Boehringer)）により、その５´末端でリン酸化した。オクタデカヌクレオチド検出プローブのＳＳ４１（５´−ＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＡＣＣＴＴＴＡＡ−３´）を、その５´末端のアミノ官能基を利用して、アプライド・バイオシステム(Applied Biosystem) の３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーにおいて固相ホスホラミダイト法を用いることにより合成し、次いで、タム(Tham)ら、１９９０、（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．６９， １０９−１１６）によりなされた記載にしたがってＤ−ビオチニル−Σ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ベーリンガー）でラベルした。捕獲用オリゴヌクレオチドおよび検出用オリゴヌクレオチドの両方を、ＦＰＬＣシステム（ファーマシア(Pharmacia) ）により高速ＨＲ １０／１０脱塩カラム上で精製した。
【００４９】
「ＰＣＲ実験」
ウェルごとに、９５μｌの蒸留水、５μｌのＰＣＲ試料、４０μｌの検出プローブおよび１４μｌの１Ｎ ＮａＯＨを順次連続して加えることにより、ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡ断片をウェルの中で直接変性させた。１０分後、１％サルコシル(sarkosyl)を含有する１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 を２１μｌ添加することにより中和を行った。試料はすべて２重に調製した。中和後、金属表面上でバンドを沈殿させ、４０℃で一夜オーブン中に保存した。ビオチニル化された検出プローブＳＳ４１の最終濃度は、０．５ｎＭであった。オーブン内でのインキュベーションの間、使われていないウェルを空のままにして置かず、水で満たして均質な熱交換が得られるようにすることが好ましい。室温でＴＢＳ−Ｔｗ（０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、１％のトゥイーン２０）ーにより、マイクロウェルを５回洗浄した。ウェル当り、１％のウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳ−Ｔｗ中において１μｇ／ｍｌとなるように希釈されたアルカリホスファターゼ−エクストラビジン(extravidine) 複合体（シグマ(Sigma) ）を、１００μｌ加えた。次いで、バンドを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔｗで５回洗浄し、最終的に、１ｍＭのＭｇＣｌ2 および１ｍＭのパラニトロフェニルリン酸塩を含有するｐＨ９．８の１Ｍ ジエタノールアミンを２００μｌ加えた。３０分間から２時間、酵素反応を実施した。マイクロプレート読取り機（ダイナテック(Dynatech)）を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。Ｓ．血清変種タイフィムリウム( S. ser. Typhimurium ) Ｃ５３株の増幅ＤＮＡ断片（８００ｆｍ／ウェル）の標準溶液で得られたシグナルを、１００％を表すものと考え、それぞれのハイブリダイゼーションテストにとっての参照値として用いた。ブランク値は、０．５ｎＭのビオチニル化されたオリゴヌクレオチドプローブＳＳ４１のみをインキュベートした、オリゴヌクレオチドＳＳ４０で被覆されたウェルにおいて測定された平均吸光度に対応する。
【００５０】
〔結果〕
「方法の最適化」
プライマーとプローブとをｉａｇＡ配列中において選択した。様々なプライマーの組を試験することにより、コバリンク(CovaLink)マイクロプレート上でのサンドウィッチ・ハイブリダイゼーション技術を最適化させた。選ばれたプライマーの組（ＳＳ２およびＳＳ２８）により、サルモネラ属菌のゲノムＤＮＡの９３ｂｐ領域の特異的増幅がなされる。このプライマーの組を用いることにより、標準的なＭｇＣｌ2 濃度（１．５−２ｍＭ）では、相対的に不利な増幅結果が導かれ、効率の良い増幅を得るためには、４ｍＭのＭｇＣｌ2 濃度を必要としたことが示された。非放射性ハイブリダイゼーション・テストにおいて、それぞれを捕獲プローブおよび検出プローブとして、内部(Internal)オリゴヌクレオチドのＳＳ４０およびＳＳ４１を用いた。
【００５１】
「当該技術の特異性」
サルモネラ属の２２８株（表１および表２）並びに相異する細菌の１６株（表３）について、サルモネラ属菌の検出のための方法の特異性を評価した。結果を表４において要約する。エドワルドシエラ・タルダ( Edwardsiella tarda) 、クレブシエラ・プネウモニアック( Klebsiella pneumoniac ) 、エンテロバクター( Enterobacter) およびアシネトバクター( Acinetobacter ) の種、パストゥーレラ( Pasteurella ) 、ビブリオ・ハルベイイ( Vibrio harveyi) 、セラチア・マルケセンス( Serratia marcescens ) およびシトロバクター( Citrobacter )のより多くの種、並びにすべての大腸菌は、２０％未満のハイブリダイゼーション・シグナルを示した。この値に基づいて、この方法により亜種Ｉに属するすべてのサルモネラ属の菌株を検出し得たと結論を下した。さらにその上、亜種ＩＩの５６株中の１株（３９７５−８３株）のみおよび亜種ＩＩＩａの１１株中の３株は、陽性のシグナルを示した。サルモネラ・ボンゴリならびに亜種ＩＩＩｂ、亜種ＩＶおよび亜種ＶＩに属する株は、検出されなかった。
【００５２】
「細菌全体についての当該技術の検出レベル」
Ｓ．血清変種タイフィムリウムＣ５３株の懸濁液の１０分の１希釈系列（１０9 細胞／ｍｌから１０-2細胞／ｍｌまで）を調製することにより、ＰＣＲとそれに続く非放射性ハイブリダイゼーション技術により検出することが可能な細菌の最小数を推定した。煮沸による高速抽出技術を用いて、それぞれの校正された懸濁液からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応の前に単に懸濁液を煮沸することによるＤＮＡの高速抽出技術が効率の良い技術であることを、得られた結果は明らかに示している。実際に、それはたった１ｃｆｕ単位の検出を許容する。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００５３】
「精製されたゲノムＤＮＡでの定量的ハイブリダイゼーション」ここで報告される試験において用いられる非放射性ハイブリダイゼーションの手順は、定量的な研究において容易に実施し得る。様々なサルモネラ属の菌株について得られたハイブリダイゼーション・シグナルを比較するために、サルモネラ・エンテリカの６亜種とサルモネラ・ボンゴリ種とを代表する１０株からＤＮＡを抽出し、次いで、校正された量のＤＮＡを、ＰＣＲ反応とそれに続くサンドウィッチ・ハイブリダイゼーションに用いた。その結果を図２において報告する
（ａ：Ｓ．エンテリカ亜種エンテリカ（Ｉ）、参照：Ｃ５３
ｂ：Ｓ．エンテリカ亜種サラマエ(salamae) （ＩＩ）、参照：９７５−７１
ｃ：Ｓ．エンテリカ亜種サラマエ（ＩＩ）、参照：３９７５−８３
ｄ：Ｓ．エンテリカ亜種アリゾナエ(arizonae)（ＩＩＩａ）、参照：１６００Ｋ
ｅ：Ｓ．エンテリカ亜種アリゾナエ（ＩＩＩａ）、参照：Ｓｏ２０−２０
ｆ：Ｓ．エンテリカ亜種ジアリゾナエ(diarizonae)（ＩＩ）、（参照：５２５０−８５
ｇ：Ｓ．エンテリカ亜種ジアリゾナエ（ＩＩＩｂ）、参照：８０１３−９３
ｈ：Ｓ．エンテリカ亜種ホウテナエ(houtenae)（ＩＶ）、参照：１３５７−７３
ｉ：Ｓ．ボンゴリ、参照：２７９０−７９
ｋ：Ｓ．エンテリカ亜種インディカ(indica)（ＶＩ）、参照：４３５５−８４−７、６、５、４および３：ＤＮＡ分子の量の対数）。サルモネラ・ボンゴリまたはサルモネラ・エンテリカの亜種ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶおよびＶＩについて１０7 分子のＤＮＡで得られるハイブリダイゼーション・シグナルは、亜種Ｉの株について１０3 分子のＤＮＡで観察されるハイブリダイゼーション・シグナルよりも低いことが例証された。しかしながら、３９７５−８３単離体（亜種ＩＩ）は、亜種Ｉに属する菌株と同等のハイブリダイゼーション・シグナルを示すことに留意することが必要である。
【００５４】
〔考察〕
ＰＣＲ増幅は、特定のＤＮＡ配列についての極めて高感度の検出を可能とする。増幅の感度は、基本的に、標的ＤＮＡの複製の数、分析される試料の純度、ＤＮＡの抽出方法、およびＰＣＲ生成物を検出するために用いられる方法の感度に依存する。電気泳動ゲル中で染色するエチジウムブロマイドによるＰＣＲ生成物の可視化は、この技術での日常的な使用には向かないものであり、また、感度が十分ではない。ダブルＰＣＲの使用、またはドットブロット・ハイブリダイゼーションもしくはサザンブロット・ハイブリダイゼーションでのＤＮＡプローブの使用により、感度を増強し得る。しかしながら、ダブルＰＣＲはＤＮＡによる汚染に対して極めて高感度であり、ドットブロット・ハイブリダイゼーションもしくはサザンブロット・ハイブリダイゼーションの技術は、自動化に不適である。それゆえに、マイクロプレート・ハイブリダイゼーションは、ＰＣＲにより増幅された断片の検出および定量について適切な技術を提供する。マイクロウェルへの核酸の単純な共有結合による付着は、受動的な吸着の有益な変形であり、且つマイクロウェル上でＰＣＲにより増幅された断片の検出にとっての重要な改善である。
【００５５】
ヒトにおける感染の原因となるサルモネラ属の菌株は、基本的に亜種Ｉに属することが知られている。実際に、ヒトの臨床的単離株の９５％より多くがこの亜種に属する（ロウ(Rowe)，Ｂ．、１９８７、サルモネラ属の監視。ＷＨＯプログラムに参加するセンターから受け取った報告。世界保健機構、ロンドン）。さらにその上、１９９１年には、パリ（フランス）の「獣医学および栄養学についての国立研究センター("Centre National d'Etudes Veterinaires et Alimentaires") 」が、以前の年においては、１９８８年および１９８９年に飼育動物(animals in the diet) または野生の(in the environment)動物において単離された菌株のほとんど（すなわち１８８３２株）が亜種Ｉに属する（９９．２％）と報告した［コルビオン(Corbion) ，Ｂ．ら、１９９１年、サルモネラ菌の調査(Inventory of Salmonella) ］。
【００５６】
ここに報告された結果から、サルモネラ属の病原性株の検出のためのＰＣＲ増幅に基づく方法を定義することが可能となった。一組のプライマーのＳＳ２およびＳＳ２８ならびに一組のプローブのＳＳ４０およびＳＳ４１を、サルモネラ血清変種タイフィＴｙ２株によるヒーラ細胞の侵入に必要な遺伝子から選択した。ＰＣＲ技術とマイクロプレート非放射性サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションを組み合わせて用いることにより、亜種Ｉのサルモネラ属菌すべてを検出した。他の同様なＰＣＲ技術により得られた結果に従うものである、ＰＣＲ試験管当り１０細胞として表されたしきい値(a threshold) よりも、検出限界は低かった。腸内細菌の成員間の核酸の類似を考慮したとき、「陽性誤認」型反応("false-positive" type reactions) に導く可能性が極めて高い属の腸内細菌についての、これら新規のプライマーおよびプローブの特異性を検査することは重要であった。得られた結果からは、上記のＰＣＲおよびハイブリダイゼーションの条件を遵守するときには、陽性誤認反応は起こり得ないと結論し得る。
【００５７】
亜種Ｉに属する単離株で得られたものと同一のハイブリダイゼーション・シグナルを、サルモネラ属菌株３９７５−８３（亜種ＩＩ）が有していたことに留意することは有益である。イギリスにおいてヒト患者の便から１９８３年にこの株を単離した。生化学的特徴に基づいて、この新規な血清変種を亜種ＩＩに分類したが、しかし、ゼラチナーゼ中ではその存在が検出されなかったことから、非典型的な菌株と考えられた（Ｌｅ Ｍｉｎｏｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ，１９８４，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｎｏ．ＸＸＶＩＩ，１９８３，ｔｏ Ｋａｕｆｆｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｅ Ｓｃｈｅｍｅ， Ａｎｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）１３５ Ｂ，４５−５１）。今回報告された結果の観点から、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション技術を用いて、３９７５−８３株の分類学上の位置を再検討すべきである。
【００５８】
ここに示すデータは、サルモネラ血清変種タイフィＴｙ２株によるヒーラ細胞の侵入に必要な遺伝子の使用に基づくハイブリダイゼーション方法により、大腸菌も含めてその他の腸の細菌から亜種Ｉのサルモネラ属の菌株を区別しうることを示唆する。コバリンクのＮＨマイクロプレート上での非放射性ハイブリダイゼーションは高感度であり、多数の試料の分析に適切である。
【００５９】
実施例３：サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションにより増幅されたサルモネラ菌ＤＮＡの検出
「オリゴヌクレオチドの配列」
選択されたＤＮＡ断片は以下の通りである（図１の配列上の位置を参照）：
Ｃ末端部 位置
Ｉａｇ１：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡＧ ＧＴＴＡＴＧ−３´ １４２４−１４４３
Ｉａｇ２：５´−ＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡ ＡＧＴＧＡＡ−３´ １５８５−１６０５
Ｉａｇ３：５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡ ＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´ １４９５−１５２１
Ｉａｇ４：５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧ ＡＣＧＡＴＡ−３´ １５６４−１５８４
Ｉａｇ５：５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧ ＣＴＧＴＧ−３´ １３１８−１３３７
Ｉａｇ６：５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡ ＣＴＡＡＣＧ−３´ １６３７−１６５７
ｓｌｍ１：５´−ＣＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴ ＣＡＣＣＴ−３´ ７０９−７２８
ｓｌｍ２：５´−ＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴ ＧＧＧ−３´ １０１４−１０３１
ｓｌｍ３：５´−ＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴ ＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＡＣＡ Ｃ−３´ ７３２−７６２
ｓｌｍ４：５´−ＣＴＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡ ＡＡＧＣＡ−３´ ８２３−８４２。
【００６０】
Ｉａｇ５（センス）とＩａｇ６（アンチセンス）とのプライマーの組を３４０ｂｐ断片の増幅に用い、ｓｌｍ１（センス）とｓｌｍ２（アンチセンス）との組を３２３ｂｐ断片の増幅に用いることが好ましい（図５）。サルモネラ属菌のそれぞれのグループの２つの代表株についての、Ｉａｇ５とＩａｇ６とのプライマーの組での増幅の効率を、図６に示す。
【００６１】
「検出方法」
サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションによる検出のためのフォーマットを採用した。
２つのオリゴヌクレオチドは、変性されて増幅された断片と、同時にハイブリッド化する。捕獲プローブと称するそのうちの１つは、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルの表面に受動的に付着する（しかし、共有結合的にも付着し得る）。表示プローブと称する他方は、検出することが容易な成分でラベルされる。表示プローブは、ハイブリダイゼーション用緩衝液中に遊離している。
【００６２】
捕獲プローブおよび表示プローブは、増幅された断片の内部に位置する２つの異なる領域に対して相補的である。ここに記載される事例における検出プローブは、特にペルオキシダーゼである酵素マーカーに連結されており、表示プローブとして有用であろう。これは、オリゴヌクレオチドＩａｇ３およびｓｌｍ３について好ましい事例である。他のオリゴヌクレオチドはマイクロプレート型の固相支持体、微粒子または膜支持体に接着可能であり、且つ捕獲プローブとして働き、これは特にオリゴヌクレオチドＩａｇ４およびｓｌｍ４について言えることである。
【００６３】
実験条件：
１）サルモネラ属菌のＤＮＡの調製
シェレックス(Chelex)（６％のシェレックス，０．１％のＳＤＳ，１％のＮＰ４０，１％のトゥイーン２０）の存在下で煮沸する方法を用いることにより、ＤＮＡ配列を得る。この試薬はバイオラッドより市販され、製造者の教示する手順に従って用いる（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．１９９１．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：５０６−５１３を参照）。
【００６４】
２）増幅
サイキ(Saiki) により最初に記載された方法に従い、例えば欧州特許ＥＰ ０，２０１，１８４において為されたようにする。
次に示す反応混合液を使用してＰＣＲを実施する：
５０ｍＭのＫＣｌ１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
１．５ｍＭのＭｇＣｌ2
１２５μＭのデオキシリボヌクレオチド（ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ）
２５０μＭのＵＴＰ
２５ｐｍｏｌのそれぞれのプライマー
１０ｎｇのＤＮＡ
１単位のウラシルＮグリコシラーゼ(Uracyl N Glycosylase)
１単位のＴａｑポリメラーゼ。
【００６５】
１００μｌ容量中に増幅がなされるＤＮＡを１０μｌ含有する溶液を用いて、反応混合液を調製した。ｄＵＴＰおよびＵＮＧを、汚染除去系で用いる（ブレベ・ライフ・テクノロジーズ(Brevet Life Technologies)欧州特許出願第０４０１０３７号）。用いられる周期的加熱器(The thermocycler)は、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)９６００である。
ＵＮＧを作用させ、９５℃で５分間変性させるために、５０℃で２分間のインキュベーション後に採用された温度周期は以下の通りである：−５サイクル（９５℃で１５秒、５０℃で１５秒、７２℃で１５秒）
−３５サイクル（９５℃で１５秒、５７℃で１５秒、７２℃で１５秒）。
【００６６】
３）増幅反応の可視化
３−１）表示プローブのラベリング
プローブをセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼでラベル化し（ＰＣＲプロトコール：方法及び応用についての手引き(a guide to methodes and application)；アカデミック・プレス(Academic press)（１９９０）、１５、ｐ４５１３−４５３４を参照）、その酵素活性を比色定量により明らかにする。
【００６７】
３−２）ＢＥＴにより染色されたアガロースゲルおよびメンブレン・ハイブリダイゼーション
増幅後、１０μｌの増幅生成物をアガロースゲルで集積し、従来の技術（マニアティス(Maniatis)）に従って膜上に該ＤＮＡを移し取る。ハイブリダイゼーション用緩衝液（１０× デンハート(Denhart) 、６× ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）中において６８℃で３０分、膜をプレハイブリッド化し、次いで、ｍｌのハイブリダイゼーション用緩衝液当り６０ｎｇのプローブにより、４２℃で３時間ハイブリッド化する。
【００６８】
次いで、次の工程にしたがって洗浄を実施する：
−室温で、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中において、１０分間を２回、
−４２℃で、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中において、３０分間を１回、
−室温で、２×ＳＳＣ中において、１０分間を２回。
表示(Revealing) ：２枚の吸水紙（ホワットマン(Whatman) ３ＭＭペーパー）の間で膜（メンブレン）は移写（ブロット）され、清浄で乾燥した貯蔵器中に配置された。
【００６９】
試料と等量で(volume for volume) 用いる直前に、アマーシャム(Amershan)検出試薬（ＥＣＬ ＲＰＮ ２１０５検出試薬）を調製する；５×８ｃｍの膜に対して、全量は３０ｍｌである。底部で、１枚の吸水紙（ホワットマン３ＭＭペーパー）を固定することにより、オートラジオグラフィーのためのカセットを得る。これらの工程すべては光の下で実施し得るものであり、次いで暗室内に置く。
膜を１分間検出試薬中に浸し、ＤＮＡ側を上にし、速やかに膜の水を除き、それをカセット内に置き、ＤＮＡ側を上にし、その上に透明なプラスチックのシートを重ね（さもなければ、その膜がフィルムに貼り付く）、その上にＸ線フィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ ＫＯＤＡＫフィルム）を重ねる。室温で３０分間露光を行い、次いで、従来の現像技術（現像液、水、固着剤）によりそのフィルムを現像する。
【００７０】
３−３）マイクロプレート
３−３−１）捕獲オリゴヌクレオチドでの被覆
吸着により（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ，ＮＡＲ，１６：４０７７−４０９５（１９８８））、または共有結合により（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｓ．Ｒ． ｅｔ ａｌ，１９９１．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８，１３８−１４２）実施し得る。
【００７１】
３−３−２）マイクロプレート・ハイブリダイゼーションおよび読取り
等容量の２００ｍＭ ＮａＯＨ，４０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えることにより、１０μｌの増幅生成物を変性した。ウェルの表面を捕獲プローブで被覆したマイクロプレートを、１０×デンハート，６×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含有するハイブリダイゼーション用緩衝液でハイブリダイゼーションの前処理（プレハイブリッド化）をした。
【００７２】
次いで、そのマイクロプレートを空にして、それぞれのウェルに変性された増幅断片と１０ｎｇ／μｌ濃度の表示プローブとを含むハイブリダイゼーション用緩衝液を２００μｌ供給した。攪拌しながら、３７℃で１時間のインキュベーションを行った。
洗浄（１０×洗浄溶液：１００ｍＭのトリス、３ＭのＮａＣｌ、１％のトゥイーン２０、ｐＨ７．４）の後、発色基質の存在下での比色定量により、プローブに連結したペルオキシダーゼの活性を検出した。
【００７３】
これを行うために、２００μｌの、４０ｍＭのクエン酸三ナトリウム溶液，０．０３％ Ｈ2 Ｏ ３０％，７．５ｍｇ／ｍｌのオルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）をそれぞれのウェル中に分布させた。そのマイクロプレートを、暗室中に３７℃で３０分間インキュベートした。反応を止めるために、４ＮのＨ2 ＳＯ4溶液を５０μｌ／ウェル添加した。
４９２ｎｍの波長で光学密度を定量した（レファレンスの波長は６２０ｎｍ）。
【００７４】
４）ＰＣＲ生成物の配列決定およびその配列の手動によるアラインメント従来の技術に従って、例えばアプライド・バイオシステム(Applied Biosystem) 社の“３７３ ＤＮＡシーケンサー”自動装置および同じくアプライド社の“ダイ・ターミネター(dye terminator)”キットを用いることによる。
【００７５】
「結果」
例示されるモデルは、以下のオリゴヌクレオチド系が好ましい：
Ｉａｇ５センスプライマー−Ｉａｇ６アンチセンスプライマー
Ｉａｇ３表示プローブおよびＩａｇ４捕獲プローブ。
（Ｉａｇ４は、同様に良好にラベル化でき、表示プローブとして使用し得ることに注意すべきである）。
【００７６】
「特異性の研究」
表５および表６において一覧されたすべての細菌株について行われた。
４５のサルモネラ菌株検体より抽出されたＤＮＡを増幅することにより、予測されたサイズの断片を産生した（図７を参照。）。すべての増幅生成物のサザンブロットを、ペルオキシダーゼによりラベル化した内部(internal)オリゴヌクレオチド・プローブＩａｇ３とハイブリッド化する。上記の手順にしたがって膜上において得られる、ペルオキシダーゼ・プローブとのハイブリダイゼーションは、非サルモネラ属菌株においては起こらなかった。
同じ増幅生成物を、マイクロプレート方式で試験した。
カットオフ値を、任意に、０．０５０に設定した。それぞれのサルモネラ属グループの代表菌株は、すべて０．０５０よりも大きい光学密度値を与えた（表７）。
【００７７】
「感度」
検出可能なサルモネラ属菌の染色体ＤＮＡの最小分子数を定量するために、精製された染色体ＤＮＡの一定範囲の希釈系列を増幅させた。５分子は、サザンブロットオートラジオグラフィー上で可視的であり、マイクロプレート・ハイブリダイゼーションにより検出される：比色定量により得られた値は、上記のカットオフ値よりも大きい（図８）。
この実施例を行うために選択されたオリゴヌクレオチドは、ＩａｇＡ遺伝子の配列上に位置する（図９）。
【表５】
【表６】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、サルモネラ血清変種タイフィの侵入領域(tie invasion region)の2.4 kbのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。リボソームへの結合についてのポテンシャル部位に下線を付す。
【図２】図２は、サルモネラ血清変種タイフィの侵入領域の2.4 kbのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。リボソームへの結合についてのポテンシャル部位に下線を付す。
【図３】図３は、サルモネラ血清変種タイフィの侵入領域の2.4 kbのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
【図４】図４は、サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションにより様々な血清変種に属する様々な株のサルモネラ属菌で得られた活性のパーセンテージを示す。様々なサルモネラ属菌の血清変種の単離株が試験された。
【図５】図５は、サルモネラ属菌の６グループの増幅された断片（１３４５から１６４４までのヌクレオチド）の配列の図を示す。
【図６】図６は、サルモネラ属菌のそれぞれのグループの２つの代表株における、Ｉａｇ５およびＩａｇ６のプライマーによる増幅を示す。
【図７】図７は、サルモネラ属菌での増幅産生物のサザン・ブロットのオートラジオグラフィーを示す。
【図８】図８は、検出し得る染色体ＤＮＡ分子の最小数の定量結果を示す。サザンブロットおよびマイクロプレート・ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーである。
【図９】図９は、ＩａｇＡ遺伝子の範囲内において選択されたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図１０】図１０は、本発明によるオリゴヌクレオチドを示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
サルモネラ属は、種であるサルモネラ・エンテリカ( Salmonella enterica )、並びにサルモネラ・ボンゴリ( Salmonella bongori ) の２種を含み、これらは生化学的特徴およびＤＮＡレベルでの相同性に基づいて６亜種に分割される。この属は、菌体抗原および鞭毛抗原によって定義される、２０００を超える血清変種(serovarieties) に細分される。一般的にサルモネラ属の細菌は、動物およびヒトに対して病原性を有する。そのような訳で、サルモネラ菌は、発展途上国における食中毒の最も一般的な事例の原因となる病原体の一つであることが知られているため、サルモネラ菌の亜種の高速かつ信頼性の高い検出方法は重要である。
【０００２】
食物の毒性感染(toxi-infections) の原因となるサルモネラ属菌は、主に、Ｓ．エンテリカの亜種Ｉ（グループＩとも称される）に属する。しかしながら、毒性感染は、サルモネラ感染が原因となる病状だけではない。
【０００３】
例えば、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィ(typhi) （以後、タイフィ(Typhi) と称する）は、ヒト腸チフスの病原体である。
【０００４】
サルモネラ属菌により引き起こされる感染の性質と、特に、患者または食物から採られた生物学的試料中におけるそれらの存在を調査する必要性とを考慮すれば、該試料中におけるこれら菌の存在を検出するための高速かつ高感度の利用可能な手段を得ることが、恐らく不可欠であろう。サルモネラ属菌を検出するために現在まで広範に用いられている標準的な培養方法は、相当な長さの時間を必要とし、例えば、食品の汚染をモニターするためには適切ではない。これらの方法の欠点を克服するために、ハイブリダイゼーションテストおよびポリメラーゼ連鎖反応に基づく試験のような、分子生物学的技術に基礎を有する幾つかの方法がすでに提案されている。飲食物中のサルモネラ亜種を検出するために、幾つかのハイブリダイゼーションおよびＰＣＲの手順において様々なＤＮＡプローブが用いられてきた。しかしながら、それらの技術はいずれも完全に満足し得るものではない。何故なら、使用される配列が完全には知られていないか、またはサルモネラ属にのみ存在するものではないために、該プローブと他の腸内細菌からのＤＮＡ配列との間の交差反応を導き、または多数の陰性誤認もしくは陽性誤認を導き得るからである。
【０００５】
本発明者は、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの種に属するすべてのサルモネラ属菌を特異的かつ高感度で検出できる手段を探索した。この目的のために、我々発明者は、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィ（Ｓ．タイフィ）株およびＳ．タイフィによる細胞の侵入に関連する遺伝子に注目した。
【０００６】
さらに、我々発明者は、限定されたグループのサルモネラ属菌（例えばグループＩの細菌）の特異的検出を許容する特定の条件を定義した。
【０００７】
タイフィ株が単層のヒーラ（ＨｅＬａ）細胞に付着し、それらの細胞に侵入し得ることは、従来の技術水準においてすでに示されていた（Ｙａｂｕｕｃｈｉｅｔ ａｌ， １９８６）。しかしながら現在に至るまで、細胞に付着して侵入するこのプロセスに関与する遺伝子としての決定基(determinants)は、明確には同定されていなかった。エルジングホルスト(Elsinghorst) ら（１９８９）は、大腸菌型の細菌に対してヘンル（Ｈｅｎｌｅ）４０７細胞を貫通する能力を与える、タイフィ染色体断片をクローン化した。最近、タイフィのＴｙ２株によるヒーラ細胞への侵入に関与する別の染色体領域が同定され、クローン化された（Ｐｏｐｏｆｆ ａｎｄ Ｄｉｏｎ，１９９０）。
【０００８】
本出願の発明者は、ポポフとディオン（１９９０）により記載された７．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ配列に含まれる２．４ｋｂのＳ．タイフィのＤＮＡ断片上に、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィが細胞に侵入する活性に関与し得る領域を同定した。これらの領域は特にヒーラ・タイプの培養細胞においては、更にＳ．エンテリカ種及び／またはＳ．ボンゴリ種のすべての検体(the representatives) についての一般化された診断または任意の特別な検出条件下であれば、Ｓ．エンテリカのグループＩの特異的な診断のための反応に用いることが可能である。
【０００９】
本発明者は、ＩａｇＡと称する配列およびＩａｇＢと称する配列を同定し、これを、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィによる感染の間に出現する、細胞侵入に関与するものとして特徴付けした。Ｓ．タイフィ中のそれら配列の特異性に導かれて、発明者は、Ｓ．タイフィによる感染を診断するための手段、またはさらにＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの種のサルモネラ属による感染を診断するための手段、または場合によっては特定のグループのＳ．エンテリカを検出するための手段を定義するためのそれらの使用を提案して来た。
【００１０】
サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリによる感染を診断するために用いることができるこれらの手段は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応のようなヌクレオチド配列を増幅させるための反応において用いることが可能なオリゴヌクレオチドを包含するものである。本発明は、Ｓ．エンテリカの、またはＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの特定の亜種の核酸を検出するためのプローブにも関するものであり、これらの核酸は、適切であれば増幅された断片であり得る。生物学的試料中において、並びに例えば食品中もしくは臨床的診断の対象となるいずれかの試料中において、サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリの存在を検出するためのキットおよび方法もまた、本発明の課題である。それらの検出キットおよび検出方法は、本発明の特定の態様によれば、Ｓ．エンテリカのグループＩ株に特異的である。
【００１１】
本発明の別の態様に従えば、一方では、それらの方法によりサルモネラ属の細菌であるＳ．エンテリカまたはＳ．ボンゴリの存在を調査することが可能となる。かように、サルモネラ属は６亜種、即ちグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩを含む。亜種Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶＩは、Ｓ．エンテリカ種に属し、亜種Ｖは、Ｓ．ボンゴリ種に属する。本発明は、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィによる細胞への侵入に関与するヌクレオチド配列であって、それぞれ、図１および図２に示されている配列のヌクレオチド９７とヌクレオチド１７５５との間（ＩａｇＡ）、並びに図２に示されている配列のヌクレオチド１７７６とヌクレオチド２２５５との間（ＩａｇＢ）である、配列ｉａｇＡまたは配列ｉａｇＢのひとつであることを特徴とするものにも関する。
【００１２】
本発明は、ｉａｇＡまたはｉａｇＢについて改変されているが、それにもかかわらず細胞への侵入に関して同じ特性を示すか、または厳格な条件の下では上記配列の一つとハイブリッドを形成するようなヌクレオチド配列にも関する。図１および図２において示される配列に一致するＩａｇＡタンパク質およびＩａｇＢタンパク質、または得られた配列が上記のＩａｇＡ配列またはＩａｇＢ配列の一つに対する抗体により認識されるかぎり、アミノ酸の突然変異、欠失もしくは付加により得られるそれらの配列の変異体もまた、本出願の課題である。
【００１３】
一般的に、本発明の課題は、図１および図２において示されるｉａｇＡ遺伝子およびｉａｇＢ遺伝子によりコードされる、いずれかのアミノ酸配列である。
さらに、本発明は何れかの断片、とりわけ細胞（特に培養ヒーラ細胞）に付着し感染するという特性をＳ．タイフィに保持させるのに十分な配列の一つであるいずれかの精製断片に関する。培養中のヒーラ細胞に感染させるための方法は、特にＷＯ９２／０１０５６の番号で公開された国際特許出願に記載された標準的方法である。
【００１４】
別の側面によれば、本発明は、生物学的試料中のＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの存在を検出し、適切であれば、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリを定量するための手段に関する。生物学的試料とは、動物もしくはヒトにおいてインビトロ分析を実施するために採集されたか、またはその性質に関わりなく食品から採集されたか、または所望の病原体を含む可能性が高い液体、固体もしくは気体の媒質から採集されたいずれかの試料を意味するものと理解される。
【００１５】
これに関連する本発明の課題は、上記のＩａｇＡ配列またはＩａｇＢ配列の１つとハイブリッド化することを特徴とする、少なくとも９ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列である。上記のハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションにおける所望の特異性にしたがって定義され、本出願の実施例には指針として適切な条件が与えられている。
【００１６】
好ましくは、本発明は、図１から図２において表されるＩａｇＡ配列のＣ末端部分に由来するオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチド型の配列は、グループＩからＶＩの他のグループ、またはこれらのグループの一部に属するサルモネラ属（Ｓ．エンテリカ種および／またはＳ．ボンゴリ種）のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅後に検出するため、あるいは別の条件下においてＳ．エンテリカのグループＩの特異的な検出のためのプライマーとして用いるために選択することができる。これは特に、当業者公知の方法にしたがって化学合成により得られたヌクレオチド配列でもよい。
【００１７】
サルモネラ属のグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの１つに属する細菌に特有な核酸、特にＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅に用いることができる好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば以下の通りである（図１から図２に示したＩａｇＡ配列内におけるそれらの位置をも示す）：
Ｉａｇ１：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡＧ ＧＴＴＡＴＧ−３´（位置）１４２４−１４４３
Ｉａｇ２：５´−ＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡ ＡＧＴＧＡＡ−３´（位置）１５８５−１６０５
Ｉａｇ３：５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡ ＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´（位置）１４９５−１５２１
Ｉａｇ４：５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧ ＡＣＧＡＴＡ−３´（位置）１５６４−１５８４
Ｉａｇ５：５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧ ＣＴＧＴＧ−３´（位置）１３１８−１３３７
Ｉａｇ６：５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡ ＣＴＡＡＣＧ−３´（位置）１６３７−１６５７
ｓｌｍ１：５´−ＣＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴ ＣＡＣＣＴ−３´（位置）７０９−７２８
ｓｌｍ２：５´−ＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴ ＧＧＧ−３´（位置）１０１４−１０３１
ｓｌｍ３：５´−ＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴ ＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＡＣＡ Ｃ−３´（位置）７３２−７６２
ｓｌｍ４：５´−ＣＴＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡ ＡＡＧＣＡ−３´（位置）８２３−８４２
ＳＳ２８：５´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴ ＧＣ−３´。
【００１８】
Ｓ．エンテリカ種および／またはＳ．ボンゴリ種の全サルモネラ菌株のｉａｇＢ遺伝子からＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅するためのプライマーとして用いることができるその他のオリゴヌクレオチドは、図２に示されるｉａｇＢ配列から定義された。
それゆえに、以下のヌクレオチド鎖に一致するオリゴヌクレオチドは、本発明の主題である：
Ｉａｇ７：５´−ＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＡＴＴＧＣＴ−３´
Ｉａｇ８：５´−ＴＴＡＣＧＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡ−３´
Ｉａｇ９：５´−ＴＧＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＣＧＡＴＣ−３´
Ｉａｇ１０：５´−ＡＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴ−３´。
【００１９】
これらのオリゴヌクレオチドはまた、例えば、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡの増幅産生物の検出のためのプローブとしても用いることができる。
【００２０】
細菌が属するグループに関係なく、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの核酸の増幅を実施する上で好ましいプライマー対は、例えば、プライマーのＩａｇ５（センス）およびＩａｇ６（アンチセンス）からなっている。
このプライマー対は、３４０ｂｐの核酸断片の増幅を指示する。
【００２１】
もう一つの好ましいプライマー対は、プライマーのＳｌｍ１（センス）およびＳｌｍ２（アンチセンス）からなっている。これらのプライマーは、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの１つであるＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの細菌のＤＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリッド形成が可能である。
【００２２】
別の好ましい態様によれば、本発明は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅後の検出条件が実施例Ｉに記載されているものであるときに、サルモネラ・エンテリカ・グループＩの特異的検出のためのプライマーとして用い得るオリゴヌクレオチドに関する。
【００２３】
そのようなプライマーは、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩを代表するＳ．エンテリカまたはＳ．ボンゴリの株由来の核酸配列を増殖する能力を特徴とする。但し、その検出条件は、グループＩの細菌単独の検出を許容する実施例Ｉに記載した条件である。
【００２４】
Ｓ．エンテリカ・グループＩ由来のＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列の検出について特異的なプライマーとして、これらの目的のために用い得る１対のオリゴヌクレオチドは、例えば、次の配列からなる：
ＳＳ２ ５´−ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣ−３´および
ＳＳ２８ ´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´。
【００２５】
本発明者が定義するオリゴヌクレオチドにより、感度、速度、簡便性および特異性において十分な条件の下で、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの診断を考察することが可能となる。
【００２６】
Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡの増幅による、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの検出のためのキットもまた本発明の主題であり、該キットは、
−厳格な条件の下で、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡとハイブリッド化することができる、上記のオリゴヌクレオチドと、
−前出のページにおいて与えられた定義の１つに一致する、増幅された断片の検出のためのプローブと、
−増幅反応を実施するために必要な試薬と
を具備することを特徴とする。
【００２７】
従って、本発明の主題は特に、前出のページにおいて記載されたｉａｇＡ配列もしくはｉａｇＢ配列の１つに含まれているか、またはその様な配列に対して相補的である、サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリからのＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列の増幅のためのプライマーとしての上記のオリゴヌクレオチドの使用であり、或いは増幅されたヌクレオチド配列の検出のためのプローブとしてのこれらのオリゴヌクレオチドの使用である。
【００２８】
例えば、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの検出のために、それぞれをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして、オリゴヌクレオチドｉａｇ５およびｉａｇ６を用いることができる。
【００２９】
同様に、生物学的試料中において、これらのグループの１つに由来するＳ．エンテリカ種および／またはＳ．ボンゴリ種の細菌を検出するために、Ｓｌｍ１とＳｌｍ２とのプライマー対を用いることができる。
【００３０】
本発明はまた、生物学的試料中において、Ｓ．エンテリカ・グループＩのインビトロでの特異的検出のために、オリゴヌクレオチドＳＳ２およびＳＳ２８を使用することに関する。
【００３１】
所望のヌクレオチド配列の増幅のために用いられるプライマーが、他のグループＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの１つに属するＳ．エンテリカ菌および／またはＳ．ボンゴリ菌についての該増幅を許容するけれども、採用される実験条件が、検体である生物学的試料中に存在し得る同じグループの細菌または異なる生物の検出を許容しないとすれば、上記の検出は特異的である。
【００３２】
したがって本発明は、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡの増幅後に、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの細菌の検出のために用い得るオリゴヌクレオチドのセットに関するものであって、該セットは、
−Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとの間で、厳格な条件の下に、ハイブリッド化することが可能な上記で与えられた定義に一致する１対のオリゴヌクレオチドと、
−上記で与えられた特徴に一致するプローブと
を具備することを特徴とする。
【００３３】
生物学的試料中において、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの１つに属するサルモネラ・エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの株のインビトロ検出のために用い得る第１のオリゴヌクレオチドセットは、
−増幅のためのプライマーとして用い得る、配列Ｉａｇ５（５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＴＧＴＧ−３´）および配列Ｉａｇ６（５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＣＧ−３´）と、
−表示プローブ(revealing probe) として用い得る配列Ｉａｇ３（５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´）および捕獲プローブ(capture probe) として用い得る配列Ｉａｇ４（５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３´）と
を含むことを特徴とする。
【００３４】
生物学的試料中において、Ｓ．エンテリカ・グループＩのインビトロでの特異的検出のために用い得るもう一つのオリゴヌクレオチドセットは、
ＳＳ２ （５´−ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣ−３´）と、
ＳＳ２８ （‘−ＴＡＡＴＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´）と
を含むことを特徴とする。
【００３５】
さらに、図１から図２に示されるヌクレオチド配列ｉａｇＡによりコードされたｉａｇＡタンパク質、並びに図２において示されるヌクレオチド配列ｉａｇＢによりコードされたｉａｇＢタンパク質も本出願の主題である。
【００３６】
ｉａｇＡタンパク質およびｉａｇＢタンパク質のそれぞれは、図１および図２に示されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３７】
また、例えば、ＰＣＲにより前もって増幅された、生物学的試料中のサルモネラ・エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのヌクレオチド配列をインビトロで検出するための方法も本発明の範囲内に入るものであり、この方法は、
−増幅されたＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの配列を変性させる工程と、
−このＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリからの増幅され変性されたヌクレオチド配列と、上記に定義されたヌクレオチドから得られる捕獲プローブおよび表示プローブとを、前記の捕獲プローブおよび表示プローブがＳ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリ由来の上記の増幅されたヌクレオチド配列とハイブリッド化することを許容する条件下で接触させる（なお捕獲プローブはマイクロタイタープレートのウェル表面に付着させ、表示プローブはラベルして、適切なハイブリダイゼーション用緩衝液中に遊離させておく）工程と；
−ハイブリダイゼーション反応をさせるために十分な時間、反応混合物をインキュベートする工程と；
−未反応のオリゴヌクレオチドを除去するために洗浄する工程と、
−増幅されたヌクレオチド配列にハイブリッド化した表示プローブを顕在化させる工程と
を具備することを特徴とする。
【００３８】
上記の検出方法は、有利には、
−等容量の(volume for volume) ２００ｍＭ ＮａＯＨ，４０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を添加することにより、１０μｌ容量の増幅配列を変性させる工程と、
−適切なハイブリダイゼーション用緩衝液中において、ウェル表面が捕獲プローブにより被覆されたマイクロプレートのプレハイブリダイゼーションを行う工程と、
−マイクロプレートを空にして、変性された増幅断片及び１０ｎｇ／μｌの濃度のペルオキシダーゼでラベル化された表示プローブを含む２００μｌのハイブリダイゼーション用緩衝液を、それぞれのウェルに充填する工程と、
−この混合物を、攪拌しながら３７℃での１時間のインキュベーションを行う工程と、
−１０Ｘ洗浄溶液（１００ｍＭのトリス，３ＭのＮａＣｌ，１％のトゥイーン２０，ｐＨ７．４）を用いて、反応した混合物を洗浄する工程と、−発色基質の存在下での比色定量によって、プローブに結合したペルオキシダーゼの活性を検出する工程と
にしたがって検出が行われることを特徴とする。
【００３９】
表示プローブに存在するペルオキシダーゼの活性は、次の工程、即ち、
−反応混合物を含むそれぞれのウェルに、２００μｌの、４０ｍＭのクエン酸三ナトリウム溶液，０．０３％ Ｈ2 Ｏ ３０％，７．５ｍｇ／ｍｌのオルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を入れる工程と、
−暗室内において３７℃で３０分間、マイクロプレートのインキュベーションを行う工程と、
−４ＮのＨ2 ＳＯ4 溶液を５０μｌ／ウェル添加することにより、反応のブロッキングを行う工程と、
−４９２ｎｍの波長での光学密度を定量（レファレンスの波長は６２０ｎｍ）する工程と
によって行うことができる。
【００４０】
使用する捕獲プローブはオリゴヌクレオチドＩａｇ４であり、表示プローブはオリゴヌクレオチドＩａｇ３であるのが有利である。
こうして、本発明の範囲において定義された手段は、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのひとつにおける非特異的検出であっても、Ｓ．エンテリカ型および／またはＳ．ボンゴリ型の細菌の存在の定性的または定量的な検出を可能にする。
他方、実施例Ｉに記載したような検出工程を実施するための特定の条件下では、プライマーＳＳ２、ＳＳ２８およびプローブＳＳ４０は、Ｓ．エンテリカ・グループＩの細菌の特異的な検出を可能にする。
本発明の他の特徴および長所を、以下の実施例および図において示す。
【実施例】
【００４１】
実施例１：２．４ｋｂのＤＮＡ断片のクローン化および配列決定
ポポフおよびディオン（１９９０）による刊行物中に記載された７．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ配列から、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素を用いて切断することにより得られた制限断片を用いることにより、このＤＮＡ断片をベクターｍ１３の誘導体（メッシングおよびビエイラ(Messing and Vieira)、１９８２）にサブクローン化した。
このクローニングの実施後に、改変Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ(Sequenase) 、ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．）とプライマーとしての万能型合成オリゴヌクレオチドとを用いて、読み終わり式(chain termination) ジデオキシ法を実施した。使用した制限断片の末端は、すべて互いに重複し合う。ＤＮＡの配列決定を、それぞれの鎖ごとに少なくとも２回実施した。リパンおよびピアソン(Lipan and Pearson) によるプログラム（１９８５）を用いて、ヌクレオチド配列を解析した。
【００４２】
図１から図３に掲載された配列が示すように、配列決定された断片中には２つのオープン・リーディング・フレームが含まれる；それらを、ｉａｇＡ（侵入関連遺伝子(invasion associate gene) の略語）およびｉａｇＢの術語で称する。その２つのオープン・リーディング・フレームを、同じ配向(orientation) で転写する。配列５´−ＡＧＡＧＡ−３´に続くｉａｇＡのオープン・リーディング・フレームの最初のＡＴＧコドン（ｂｐ９７）が、ｉａｇＡ遺伝子の翻訳開始部位に一致すると考えられる。このｉａｇＡ遺伝子は、５５３アミノ酸残基を含む算出分子量６３０２６Ｄａのポリペプチドをコードする。ＩａｇＡタンパク質のＮ末端側ドメインと、転写制御のためのタンパク質ＰｈｏＢに対応するドメイン（１０８アミノ酸の重複について、２４％の同一性と５２％の類似性）および大腸菌のタンパク質ＰｈｏＰに対応するドメイン（１００のアミノ酸の配列について、２５％の同一性と６９％の類似性）との間に、有意な相同性が検出された。ｉａｇＢ遺伝子の開始のためのＡＴＧコドン（ｂｐ１７７６）にもまた、潜在的なリボゾーム結合部位（５´−ＡＧＧＡＡＧ−３´）が先行する。ｉａｇＢ遺伝子は、１６０アミノ酸残基を含み且つ１８３６９Ｄａの算定分子量を有するポリペプチドをコードする。ＩａｇＢタンパク質の配列をジェンバンク(Genbank) のデータバンクに含まれる翻訳配列と比較したところ、ＩｐｇＦタンパク質との有意な相同性（１５１のアミノ酸の配列について、４３％の同一性と６６％の類似性）を示した。
【００４３】
シゲラ・フレクスネリ( Shigella flexneri) の病原性に関連したプラスミド上のｍｘｉ−ｓｐｉ遺伝子座の５´末端に位置するｉｐｇＦ遺伝子が、ＩｐｇＦタンパク質をコードする（アラウイ(Allaoui) ら、１９９３）。それゆえに、検出されたサルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清変種タイフィのタンパク質は、これらの細菌による感染、特に細胞への付着および貫通において働くと考えられる。
【００４４】
実施例２：Ｓ．エンテリカ・グループＩの特異的検出
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるサルモネラ属の亜種を検出するための手順を開発した。プライマーとして用いる一組のオリゴヌクレオチドを定義して、Ｓ．タイフィのＴｙ２株によるヒーラ（ＨｅＬａ）細胞の侵入に必要な遺伝子の９３ｂｐ断片を増幅した。シュブリエ(Chevrier)らにより１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ７，１８７−１９７に記載された手順にしたがい、２つの異なるオリゴヌクレヌクレオチドを用いて、マイクロタイタープレート上での非放射性サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションにより増幅産生物を分析した。捕獲用オリゴヌクレヌクレオチドをその５´末端でリン酸化し、マイクロタイタープレートの、アミノ含有基を有するウェルに共有結合させた。検出用オリゴヌクレヌクレオチドをその５´末端でアミノ化し、次いでビオチニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルでラベル化した。ハイブリダイゼーションの後、アルカリホスファターゼおよび色素原基質と複合体を形成したアビジンにより、そのハイブリッド分子を検出した。この方法は、周期的加熱器(a thermal cycler)および従来型のマイクロタイター読取り機（a conventional microtitrereader）だけの使用を必要とし、大きな規模で実施できる。
【００４５】
〔材料および方法〕
「細菌の菌株」
この研究において、Ｓ．ボンゴリ［サムブルックら、１９８９、モレキュラークローニングの実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Sambrook et al,1989,Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)］、Ｓ．エンテリカの亜種Ｉ（１１６）、ＩＩ（５６）、ＩＩＩａ（１１）ＩＩＩｂ（３０）ＩＶ（５）およびＶＩ（５）を含む２２８の臨床単離株（表１および表２）、並びに９の異なる属を代表する１６の非サルモネラ腸内細菌株（表３）を用いた。ＰＣＲテストにおいては、Ｓ．血清変種タイフィムリウム( Typhimurium ) Ｃ５３株を陽性対照として用い、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ＨＢ１０１株を陰性対照として用いた。
【００４６】
「ＤＮＡの抽出」
ＬＢ培地中において、３７℃で菌株を培養した。ＤＮＡの高速抽出を実施するために、一夜保存した２ｍｌの培養物を遠心分離し、１ｍｌのＴＥ（１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ８の１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液）で再懸濁した。その細胞を遠心分離し、遠心分離して得たペレットを５００μｌの滅菌蒸留水で再懸濁し、１００℃で１０分間加熱した。最終的に、溶液を遠心分離し、上清をＰＣＲ実験のために貯蔵した。
【００４７】
「オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブ」
ホスホラミダイト技術を用いて、サイクロンＤＮＡシンセサイザー（ミリポア−ウォーターズ社(Millipore-Waters)）でオリゴヌクレオチドを合成した。
オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、
ＳＳ２： ５´−ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣ−３´および
ＳＳ２８： ５´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´
であった。
【００４８】
オリゴヌクレオチド捕獲プローブとしての、
ＳＳ４０： ５´−ＣＣＣＧＡＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＴ−３´
を、サムブルックら、１９８９、（モレキュラークローニングの実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）によりなされた記載にしたがって、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー(Boehringer)）により、その５´末端でリン酸化した。オクタデカヌクレオチド検出プローブのＳＳ４１（５´−ＧＣＡＧＧＴＧＡＴＡＡＣＣＴＴＴＡＡ−３´）を、その５´末端のアミノ官能基を利用して、アプライド・バイオシステム(Applied Biosystem) の３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーにおいて固相ホスホラミダイト法を用いることにより合成し、次いで、タム(Tham)ら、１９９０、（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．６９， １０９−１１６）によりなされた記載にしたがってＤ−ビオチニル−Σ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ベーリンガー）でラベルした。捕獲用オリゴヌクレオチドおよび検出用オリゴヌクレオチドの両方を、ＦＰＬＣシステム（ファーマシア(Pharmacia) ）により高速ＨＲ １０／１０脱塩カラム上で精製した。
【００４９】
「ＰＣＲ実験」
ウェルごとに、９５μｌの蒸留水、５μｌのＰＣＲ試料、４０μｌの検出プローブおよび１４μｌの１Ｎ ＮａＯＨを順次連続して加えることにより、ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡ断片をウェルの中で直接変性させた。１０分後、１％サルコシル(sarkosyl)を含有する１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 を２１μｌ添加することにより中和を行った。試料はすべて２重に調製した。中和後、金属表面上でバンドを沈殿させ、４０℃で一夜オーブン中に保存した。ビオチニル化された検出プローブＳＳ４１の最終濃度は、０．５ｎＭであった。オーブン内でのインキュベーションの間、使われていないウェルを空のままにして置かず、水で満たして均質な熱交換が得られるようにすることが好ましい。室温でＴＢＳ−Ｔｗ（０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、１％のトゥイーン２０）ーにより、マイクロウェルを５回洗浄した。ウェル当り、１％のウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳ−Ｔｗ中において１μｇ／ｍｌとなるように希釈されたアルカリホスファターゼ−エクストラビジン(extravidine) 複合体（シグマ(Sigma) ）を、１００μｌ加えた。次いで、バンドを室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔｗで５回洗浄し、最終的に、１ｍＭのＭｇＣｌ2 および１ｍＭのパラニトロフェニルリン酸塩を含有するｐＨ９．８の１Ｍ ジエタノールアミンを２００μｌ加えた。３０分間から２時間、酵素反応を実施した。マイクロプレート読取り機（ダイナテック(Dynatech)）を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。Ｓ．血清変種タイフィムリウム( S. ser. Typhimurium ) Ｃ５３株の増幅ＤＮＡ断片（８００ｆｍ／ウェル）の標準溶液で得られたシグナルを、１００％を表すものと考え、それぞれのハイブリダイゼーションテストにとっての参照値として用いた。ブランク値は、０．５ｎＭのビオチニル化されたオリゴヌクレオチドプローブＳＳ４１のみをインキュベートした、オリゴヌクレオチドＳＳ４０で被覆されたウェルにおいて測定された平均吸光度に対応する。
【００５０】
〔結果〕
「方法の最適化」
プライマーとプローブとをｉａｇＡ配列中において選択した。様々なプライマーの組を試験することにより、コバリンク(CovaLink)マイクロプレート上でのサンドウィッチ・ハイブリダイゼーション技術を最適化させた。選ばれたプライマーの組（ＳＳ２およびＳＳ２８）により、サルモネラ属菌のゲノムＤＮＡの９３ｂｐ領域の特異的増幅がなされる。このプライマーの組を用いることにより、標準的なＭｇＣｌ2 濃度（１．５−２ｍＭ）では、相対的に不利な増幅結果が導かれ、効率の良い増幅を得るためには、４ｍＭのＭｇＣｌ2 濃度を必要としたことが示された。非放射性ハイブリダイゼーション・テストにおいて、それぞれを捕獲プローブおよび検出プローブとして、内部(Internal)オリゴヌクレオチドのＳＳ４０およびＳＳ４１を用いた。
【００５１】
「当該技術の特異性」
サルモネラ属の２２８株（表１および表２）並びに相異する細菌の１６株（表３）について、サルモネラ属菌の検出のための方法の特異性を評価した。結果を表４において要約する。エドワルドシエラ・タルダ( Edwardsiella tarda) 、クレブシエラ・プネウモニアック( Klebsiella pneumoniac ) 、エンテロバクター( Enterobacter) およびアシネトバクター( Acinetobacter ) の種、パストゥーレラ( Pasteurella ) 、ビブリオ・ハルベイイ( Vibrio harveyi) 、セラチア・マルケセンス( Serratia marcescens ) およびシトロバクター( Citrobacter )のより多くの種、並びにすべての大腸菌は、２０％未満のハイブリダイゼーション・シグナルを示した。この値に基づいて、この方法により亜種Ｉに属するすべてのサルモネラ属の菌株を検出し得たと結論を下した。さらにその上、亜種ＩＩの５６株中の１株（３９７５−８３株）のみおよび亜種ＩＩＩａの１１株中の３株は、陽性のシグナルを示した。サルモネラ・ボンゴリならびに亜種ＩＩＩｂ、亜種ＩＶおよび亜種ＶＩに属する株は、検出されなかった。
【００５２】
「細菌全体についての当該技術の検出レベル」
Ｓ．血清変種タイフィムリウムＣ５３株の懸濁液の１０分の１希釈系列（１０9 細胞／ｍｌから１０-2細胞／ｍｌまで）を調製することにより、ＰＣＲとそれに続く非放射性ハイブリダイゼーション技術により検出することが可能な細菌の最小数を推定した。煮沸による高速抽出技術を用いて、それぞれの校正された懸濁液からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応の前に単に懸濁液を煮沸することによるＤＮＡの高速抽出技術が効率の良い技術であることを、得られた結果は明らかに示している。実際に、それはたった１ｃｆｕ単位の検出を許容する。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００５３】
「精製されたゲノムＤＮＡでの定量的ハイブリダイゼーション」ここで報告される試験において用いられる非放射性ハイブリダイゼーションの手順は、定量的な研究において容易に実施し得る。様々なサルモネラ属の菌株について得られたハイブリダイゼーション・シグナルを比較するために、サルモネラ・エンテリカの６亜種とサルモネラ・ボンゴリ種とを代表する１０株からＤＮＡを抽出し、次いで、校正された量のＤＮＡを、ＰＣＲ反応とそれに続くサンドウィッチ・ハイブリダイゼーションに用いた。その結果を図２において報告する
（ａ：Ｓ．エンテリカ亜種エンテリカ（Ｉ）、参照：Ｃ５３
ｂ：Ｓ．エンテリカ亜種サラマエ(salamae) （ＩＩ）、参照：９７５−７１
ｃ：Ｓ．エンテリカ亜種サラマエ（ＩＩ）、参照：３９７５−８３
ｄ：Ｓ．エンテリカ亜種アリゾナエ(arizonae)（ＩＩＩａ）、参照：１６００Ｋ
ｅ：Ｓ．エンテリカ亜種アリゾナエ（ＩＩＩａ）、参照：Ｓｏ２０−２０
ｆ：Ｓ．エンテリカ亜種ジアリゾナエ(diarizonae)（ＩＩ）、（参照：５２５０−８５
ｇ：Ｓ．エンテリカ亜種ジアリゾナエ（ＩＩＩｂ）、参照：８０１３−９３
ｈ：Ｓ．エンテリカ亜種ホウテナエ(houtenae)（ＩＶ）、参照：１３５７−７３
ｉ：Ｓ．ボンゴリ、参照：２７９０−７９
ｋ：Ｓ．エンテリカ亜種インディカ(indica)（ＶＩ）、参照：４３５５−８４−７、６、５、４および３：ＤＮＡ分子の量の対数）。サルモネラ・ボンゴリまたはサルモネラ・エンテリカの亜種ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶおよびＶＩについて１０7 分子のＤＮＡで得られるハイブリダイゼーション・シグナルは、亜種Ｉの株について１０3 分子のＤＮＡで観察されるハイブリダイゼーション・シグナルよりも低いことが例証された。しかしながら、３９７５−８３単離体（亜種ＩＩ）は、亜種Ｉに属する菌株と同等のハイブリダイゼーション・シグナルを示すことに留意することが必要である。
【００５４】
〔考察〕
ＰＣＲ増幅は、特定のＤＮＡ配列についての極めて高感度の検出を可能とする。増幅の感度は、基本的に、標的ＤＮＡの複製の数、分析される試料の純度、ＤＮＡの抽出方法、およびＰＣＲ生成物を検出するために用いられる方法の感度に依存する。電気泳動ゲル中で染色するエチジウムブロマイドによるＰＣＲ生成物の可視化は、この技術での日常的な使用には向かないものであり、また、感度が十分ではない。ダブルＰＣＲの使用、またはドットブロット・ハイブリダイゼーションもしくはサザンブロット・ハイブリダイゼーションでのＤＮＡプローブの使用により、感度を増強し得る。しかしながら、ダブルＰＣＲはＤＮＡによる汚染に対して極めて高感度であり、ドットブロット・ハイブリダイゼーションもしくはサザンブロット・ハイブリダイゼーションの技術は、自動化に不適である。それゆえに、マイクロプレート・ハイブリダイゼーションは、ＰＣＲにより増幅された断片の検出および定量について適切な技術を提供する。マイクロウェルへの核酸の単純な共有結合による付着は、受動的な吸着の有益な変形であり、且つマイクロウェル上でＰＣＲにより増幅された断片の検出にとっての重要な改善である。
【００５５】
ヒトにおける感染の原因となるサルモネラ属の菌株は、基本的に亜種Ｉに属することが知られている。実際に、ヒトの臨床的単離株の９５％より多くがこの亜種に属する（ロウ(Rowe)，Ｂ．、１９８７、サルモネラ属の監視。ＷＨＯプログラムに参加するセンターから受け取った報告。世界保健機構、ロンドン）。さらにその上、１９９１年には、パリ（フランス）の「獣医学および栄養学についての国立研究センター("Centre National d'Etudes Veterinaires et Alimentaires") 」が、以前の年においては、１９８８年および１９８９年に飼育動物(animals in the diet) または野生の(in the environment)動物において単離された菌株のほとんど（すなわち１８８３２株）が亜種Ｉに属する（９９．２％）と報告した［コルビオン(Corbion) ，Ｂ．ら、１９９１年、サルモネラ菌の調査(Inventory of Salmonella) ］。
【００５６】
ここに報告された結果から、サルモネラ属の病原性株の検出のためのＰＣＲ増幅に基づく方法を定義することが可能となった。一組のプライマーのＳＳ２およびＳＳ２８ならびに一組のプローブのＳＳ４０およびＳＳ４１を、サルモネラ血清変種タイフィＴｙ２株によるヒーラ細胞の侵入に必要な遺伝子から選択した。ＰＣＲ技術とマイクロプレート非放射性サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションを組み合わせて用いることにより、亜種Ｉのサルモネラ属菌すべてを検出した。他の同様なＰＣＲ技術により得られた結果に従うものである、ＰＣＲ試験管当り１０細胞として表されたしきい値(a threshold) よりも、検出限界は低かった。腸内細菌の成員間の核酸の類似を考慮したとき、「陽性誤認」型反応("false-positive" type reactions) に導く可能性が極めて高い属の腸内細菌についての、これら新規のプライマーおよびプローブの特異性を検査することは重要であった。得られた結果からは、上記のＰＣＲおよびハイブリダイゼーションの条件を遵守するときには、陽性誤認反応は起こり得ないと結論し得る。
【００５７】
亜種Ｉに属する単離株で得られたものと同一のハイブリダイゼーション・シグナルを、サルモネラ属菌株３９７５−８３（亜種ＩＩ）が有していたことに留意することは有益である。イギリスにおいてヒト患者の便から１９８３年にこの株を単離した。生化学的特徴に基づいて、この新規な血清変種を亜種ＩＩに分類したが、しかし、ゼラチナーゼ中ではその存在が検出されなかったことから、非典型的な菌株と考えられた（Ｌｅ Ｍｉｎｏｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ，１９８４，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｎｏ．ＸＸＶＩＩ，１９８３，ｔｏ Ｋａｕｆｆｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｅ Ｓｃｈｅｍｅ， Ａｎｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）１３５ Ｂ，４５−５１）。今回報告された結果の観点から、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション技術を用いて、３９７５−８３株の分類学上の位置を再検討すべきである。
【００５８】
ここに示すデータは、サルモネラ血清変種タイフィＴｙ２株によるヒーラ細胞の侵入に必要な遺伝子の使用に基づくハイブリダイゼーション方法により、大腸菌も含めてその他の腸の細菌から亜種Ｉのサルモネラ属の菌株を区別しうることを示唆する。コバリンクのＮＨマイクロプレート上での非放射性ハイブリダイゼーションは高感度であり、多数の試料の分析に適切である。
【００５９】
実施例３：サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションにより増幅されたサルモネラ菌ＤＮＡの検出
「オリゴヌクレオチドの配列」
選択されたＤＮＡ断片は以下の通りである（図１の配列上の位置を参照）：
Ｃ末端部 位置
Ｉａｇ１：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡＧ ＧＴＴＡＴＧ−３´ １４２４−１４４３
Ｉａｇ２：５´−ＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡ ＡＧＴＧＡＡ−３´ １５８５−１６０５
Ｉａｇ３：５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡ ＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´ １４９５−１５２１
Ｉａｇ４：５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧ ＡＣＧＡＴＡ−３´ １５６４−１５８４
Ｉａｇ５：５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧ ＣＴＧＴＧ−３´ １３１８−１３３７
Ｉａｇ６：５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡ ＣＴＡＡＣＧ−３´ １６３７−１６５７
ｓｌｍ１：５´−ＣＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴ ＣＡＣＣＴ−３´ ７０９−７２８
ｓｌｍ２：５´−ＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴ ＧＧＧ−３´ １０１４−１０３１
ｓｌｍ３：５´−ＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴ ＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＡＣＡ Ｃ−３´ ７３２−７６２
ｓｌｍ４：５´−ＣＴＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡ ＡＡＧＣＡ−３´ ８２３−８４２。
【００６０】
Ｉａｇ５（センス）とＩａｇ６（アンチセンス）とのプライマーの組を３４０ｂｐ断片の増幅に用い、ｓｌｍ１（センス）とｓｌｍ２（アンチセンス）との組を３２３ｂｐ断片の増幅に用いることが好ましい（図５）。サルモネラ属菌のそれぞれのグループの２つの代表株についての、Ｉａｇ５とＩａｇ６とのプライマーの組での増幅の効率を、図６に示す。
【００６１】
「検出方法」
サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションによる検出のためのフォーマットを採用した。
２つのオリゴヌクレオチドは、変性されて増幅された断片と、同時にハイブリッド化する。捕獲プローブと称するそのうちの１つは、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルの表面に受動的に付着する（しかし、共有結合的にも付着し得る）。表示プローブと称する他方は、検出することが容易な成分でラベルされる。表示プローブは、ハイブリダイゼーション用緩衝液中に遊離している。
【００６２】
捕獲プローブおよび表示プローブは、増幅された断片の内部に位置する２つの異なる領域に対して相補的である。ここに記載される事例における検出プローブは、特にペルオキシダーゼである酵素マーカーに連結されており、表示プローブとして有用であろう。これは、オリゴヌクレオチドＩａｇ３およびｓｌｍ３について好ましい事例である。他のオリゴヌクレオチドはマイクロプレート型の固相支持体、微粒子または膜支持体に接着可能であり、且つ捕獲プローブとして働き、これは特にオリゴヌクレオチドＩａｇ４およびｓｌｍ４について言えることである。
【００６３】
実験条件：
１）サルモネラ属菌のＤＮＡの調製
シェレックス(Chelex)（６％のシェレックス，０．１％のＳＤＳ，１％のＮＰ４０，１％のトゥイーン２０）の存在下で煮沸する方法を用いることにより、ＤＮＡ配列を得る。この試薬はバイオラッドより市販され、製造者の教示する手順に従って用いる（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．１９９１．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：５０６−５１３を参照）。
【００６４】
２）増幅
サイキ(Saiki) により最初に記載された方法に従い、例えば欧州特許ＥＰ ０，２０１，１８４において為されたようにする。
次に示す反応混合液を使用してＰＣＲを実施する：
５０ｍＭのＫＣｌ１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
１．５ｍＭのＭｇＣｌ2
１２５μＭのデオキシリボヌクレオチド（ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ）
２５０μＭのＵＴＰ
２５ｐｍｏｌのそれぞれのプライマー
１０ｎｇのＤＮＡ
１単位のウラシルＮグリコシラーゼ(Uracyl N Glycosylase)
１単位のＴａｑポリメラーゼ。
【００６５】
１００μｌ容量中に増幅がなされるＤＮＡを１０μｌ含有する溶液を用いて、反応混合液を調製した。ｄＵＴＰおよびＵＮＧを、汚染除去系で用いる（ブレベ・ライフ・テクノロジーズ(Brevet Life Technologies)欧州特許出願第０４０１０３７号）。用いられる周期的加熱器(The thermocycler)は、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)９６００である。
ＵＮＧを作用させ、９５℃で５分間変性させるために、５０℃で２分間のインキュベーション後に採用された温度周期は以下の通りである：−５サイクル（９５℃で１５秒、５０℃で１５秒、７２℃で１５秒）
−３５サイクル（９５℃で１５秒、５７℃で１５秒、７２℃で１５秒）。
【００６６】
３）増幅反応の可視化
３−１）表示プローブのラベリング
プローブをセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼでラベル化し（ＰＣＲプロトコール：方法及び応用についての手引き(a guide to methodes and application)；アカデミック・プレス(Academic press)（１９９０）、１５、ｐ４５１３−４５３４を参照）、その酵素活性を比色定量により明らかにする。
【００６７】
３−２）ＢＥＴにより染色されたアガロースゲルおよびメンブレン・ハイブリダイゼーション
増幅後、１０μｌの増幅生成物をアガロースゲルで集積し、従来の技術（マニアティス(Maniatis)）に従って膜上に該ＤＮＡを移し取る。ハイブリダイゼーション用緩衝液（１０× デンハート(Denhart) 、６× ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）中において６８℃で３０分、膜をプレハイブリッド化し、次いで、ｍｌのハイブリダイゼーション用緩衝液当り６０ｎｇのプローブにより、４２℃で３時間ハイブリッド化する。
【００６８】
次いで、次の工程にしたがって洗浄を実施する：
−室温で、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中において、１０分間を２回、
−４２℃で、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中において、３０分間を１回、
−室温で、２×ＳＳＣ中において、１０分間を２回。
表示(Revealing) ：２枚の吸水紙（ホワットマン(Whatman) ３ＭＭペーパー）の間で膜（メンブレン）は移写（ブロット）され、清浄で乾燥した貯蔵器中に配置された。
【００６９】
試料と等量で(volume for volume) 用いる直前に、アマーシャム(Amershan)検出試薬（ＥＣＬ ＲＰＮ ２１０５検出試薬）を調製する；５×８ｃｍの膜に対して、全量は３０ｍｌである。底部で、１枚の吸水紙（ホワットマン３ＭＭペーパー）を固定することにより、オートラジオグラフィーのためのカセットを得る。これらの工程すべては光の下で実施し得るものであり、次いで暗室内に置く。
膜を１分間検出試薬中に浸し、ＤＮＡ側を上にし、速やかに膜の水を除き、それをカセット内に置き、ＤＮＡ側を上にし、その上に透明なプラスチックのシートを重ね（さもなければ、その膜がフィルムに貼り付く）、その上にＸ線フィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ ＫＯＤＡＫフィルム）を重ねる。室温で３０分間露光を行い、次いで、従来の現像技術（現像液、水、固着剤）によりそのフィルムを現像する。
【００７０】
３−３）マイクロプレート
３−３−１）捕獲オリゴヌクレオチドでの被覆
吸着により（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ，ＮＡＲ，１６：４０７７−４０９５（１９８８））、または共有結合により（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｓ．Ｒ． ｅｔ ａｌ，１９９１．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８，１３８−１４２）実施し得る。
【００７１】
３−３−２）マイクロプレート・ハイブリダイゼーションおよび読取り
等容量の２００ｍＭ ＮａＯＨ，４０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えることにより、１０μｌの増幅生成物を変性した。ウェルの表面を捕獲プローブで被覆したマイクロプレートを、１０×デンハート，６×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含有するハイブリダイゼーション用緩衝液でハイブリダイゼーションの前処理（プレハイブリッド化）をした。
【００７２】
次いで、そのマイクロプレートを空にして、それぞれのウェルに変性された増幅断片と１０ｎｇ／μｌ濃度の表示プローブとを含むハイブリダイゼーション用緩衝液を２００μｌ供給した。攪拌しながら、３７℃で１時間のインキュベーションを行った。
洗浄（１０×洗浄溶液：１００ｍＭのトリス、３ＭのＮａＣｌ、１％のトゥイーン２０、ｐＨ７．４）の後、発色基質の存在下での比色定量により、プローブに連結したペルオキシダーゼの活性を検出した。
【００７３】
これを行うために、２００μｌの、４０ｍＭのクエン酸三ナトリウム溶液，０．０３％ Ｈ2 Ｏ ３０％，７．５ｍｇ／ｍｌのオルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）をそれぞれのウェル中に分布させた。そのマイクロプレートを、暗室中に３７℃で３０分間インキュベートした。反応を止めるために、４ＮのＨ2 ＳＯ4溶液を５０μｌ／ウェル添加した。
４９２ｎｍの波長で光学密度を定量した（レファレンスの波長は６２０ｎｍ）。
【００７４】
４）ＰＣＲ生成物の配列決定およびその配列の手動によるアラインメント従来の技術に従って、例えばアプライド・バイオシステム(Applied Biosystem) 社の“３７３ ＤＮＡシーケンサー”自動装置および同じくアプライド社の“ダイ・ターミネター(dye terminator)”キットを用いることによる。
【００７５】
「結果」
例示されるモデルは、以下のオリゴヌクレオチド系が好ましい：
Ｉａｇ５センスプライマー−Ｉａｇ６アンチセンスプライマー
Ｉａｇ３表示プローブおよびＩａｇ４捕獲プローブ。
（Ｉａｇ４は、同様に良好にラベル化でき、表示プローブとして使用し得ることに注意すべきである）。
【００７６】
「特異性の研究」
表５および表６において一覧されたすべての細菌株について行われた。
４５のサルモネラ菌株検体より抽出されたＤＮＡを増幅することにより、予測されたサイズの断片を産生した（図７を参照。）。すべての増幅生成物のサザンブロットを、ペルオキシダーゼによりラベル化した内部(internal)オリゴヌクレオチド・プローブＩａｇ３とハイブリッド化する。上記の手順にしたがって膜上において得られる、ペルオキシダーゼ・プローブとのハイブリダイゼーションは、非サルモネラ属菌株においては起こらなかった。
同じ増幅生成物を、マイクロプレート方式で試験した。
カットオフ値を、任意に、０．０５０に設定した。それぞれのサルモネラ属グループの代表菌株は、すべて０．０５０よりも大きい光学密度値を与えた（表７）。
【００７７】
「感度」
検出可能なサルモネラ属菌の染色体ＤＮＡの最小分子数を定量するために、精製された染色体ＤＮＡの一定範囲の希釈系列を増幅させた。５分子は、サザンブロットオートラジオグラフィー上で可視的であり、マイクロプレート・ハイブリダイゼーションにより検出される：比色定量により得られた値は、上記のカットオフ値よりも大きい（図８）。
この実施例を行うために選択されたオリゴヌクレオチドは、ＩａｇＡ遺伝子の配列上に位置する（図９）。
【表５】
【表６】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、サルモネラ血清変種タイフィの侵入領域(tie invasion region)の2.4 kbのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。リボソームへの結合についてのポテンシャル部位に下線を付す。
【図２】図２は、サルモネラ血清変種タイフィの侵入領域の2.4 kbのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。リボソームへの結合についてのポテンシャル部位に下線を付す。
【図３】図３は、サルモネラ血清変種タイフィの侵入領域の2.4 kbのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
【図４】図４は、サンドウィッチ・ハイブリダイゼーションにより様々な血清変種に属する様々な株のサルモネラ属菌で得られた活性のパーセンテージを示す。様々なサルモネラ属菌の血清変種の単離株が試験された。
【図５】図５は、サルモネラ属菌の６グループの増幅された断片（１３４５から１６４４までのヌクレオチド）の配列の図を示す。
【図６】図６は、サルモネラ属菌のそれぞれのグループの２つの代表株における、Ｉａｇ５およびＩａｇ６のプライマーによる増幅を示す。
【図７】図７は、サルモネラ属菌での増幅産生物のサザン・ブロットのオートラジオグラフィーを示す。
【図８】図８は、検出し得る染色体ＤＮＡ分子の最小数の定量結果を示す。サザンブロットおよびマイクロプレート・ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーである。
【図９】図９は、ＩａｇＡ遺伝子の範囲内において選択されたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図１０】図１０は、本発明によるオリゴヌクレオチドを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ・エンテリカ( Salmonella enterica ) 種の亜種エンテリカ血清変種タイフィ（Ｓ．タイフィと称する）によるヒーラ（ＨｅＬａ）培養細胞への侵入に関与するヌクレオチド配列であって、図１および図２において示されている配列のヌクレオチド９７とヌクレオチド１７５５との間のｉａｇＡ配列または図２において示されている配列のヌクレオチド１７７６とヌクレオチド２２５５との間のｉａｇＢ配列であることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項２】
請求項１の記載にしたがった配列に由来するオリゴヌクレオチドであって、以下の配列、
Ｉａｇ１：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＧ−３´
Ｉａｇ２：５´−ＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡ−３´
Ｉａｇ３：５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´
Ｉａｇ４：５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３´
Ｉａｇ５：５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＴＧＴＧ−３´
Ｉａｇ６：５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＣＧ−３´
ｓｌｍ１：５´−ＣＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＴ−３´
ｓｌｍ２：５´−ＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧ−３´
ｓｌｍ３：５´−ＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＡＣＡＣ−３´
ｓｌｍ４：５´−ＣＴＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡ−３´
ＳＳ２８：５´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´
Ｉａｇ７：５´−ＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＡＴＴＧＣＴ−３´
Ｉａｇ８：５´−ＴＴＡＣＧＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡ−３´
Ｉａｇ９：５´−ＴＧＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＣＧＡＴＣ−３´
Ｉａｇ１０：５´−ＡＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴ−３´
の１つに対応することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１の記載にしたがったヌクレオチド配列ＩａｇＡに由来し、且つサルモネラ・エンテリカ・グループＩの特異的検出、またはこうして増幅されたヌクレオチド配列の検出のためのプライマーとして用い得る配列より選択されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３の記載にしたがったオリゴヌクレオチドであって、次の配列、即ち、ＳＳ２８：５´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´に対応することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２の記載にしたがったオリゴヌクレオチド対であって、
Ｉａｇ５（センス）：５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＴＧＴＣ−３´と
Ｉａｇ６（アンチセンス）：５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＣＧ−３´との対、または
ｓｌｍ１（センス）：５´−ＣＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＴ−３´と
ｓｌｍ２（アンチセンス）：５´−ＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧ−３´との対
のうちの１つであることを特徴とするオリゴヌクレオチド対。
【請求項６】
サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリ( Salmonella bongori) とのハイブリッド化が可能なヌクレオチド配列であって、以下の配列、
Ｉａｇ３：５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´もしくは
Ｉａｇ４：５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３´、または
ｓｌｍ３：５´−ＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＡＣＡＣ−３´もしくは
ｓｌｍ４：５´−ＣＴＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡ−３´
の１つに対応し、且つラベル化されていることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項６の記載にしたがったヌクレオチド配列（またはプローブ）であって、プローブＩａｇ３もしくはプローブｓｌｍ３は増幅されたヌクレオチド配列の存在を表示するためのプローブであり、且つプローブＩａｇ４およびプローブｓｌｍ４は増幅されたヌクレオチド配列を捕獲するためのプローブであることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項８】
請求項２のオリゴヌクレオチドの使用であって、サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリ由来のＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列（請求項１のヌクレオチド配列に含まれるか、またはそのような配列に対して相補的である）を増幅するためのプライマーとして、または増幅されたヌクレオチド配列を検出するためのプローブとしての使用。
【請求項９】
請求項５のオリゴヌクレオチド対の使用であって、Ｓ．エンテリカ種および／またはＳ．ボンゴリ種のグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶもしくはＶＩの細菌由来のヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーとしての使用。
【請求項１０】
Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡの増幅後に、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの細菌を検出するために用い得るオリゴヌクレオチドのセットであって、
厳格な条件の下で、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとハイブリッド化することが可能な、請求項４または５のいずれか１項のオリゴヌクレオチド対と、
請求項６のプローブと
を具備することを特徴とするオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項１１】
生物学的試料中において、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶもしくはＶＩの１つに属するサルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリの菌株のインビトロ検出のために用い得るオリゴヌクレオチドのセットであって、次のオリゴヌクレオチド、即ち、
増幅のためのプライマーとして用い得る配列Ｉａｇ５（５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＴＧＴＧ−３´）および配列Ｉａｇ６（５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＣＧ−３´）と、
表示プローブとして用い得る配列Ｉａｇ３（５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´）および捕獲プローブとして用い得る配列Ｉａｇ４（５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３´）とを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項１２】
生物学的試料中において、Ｓ．エンテリカのグループＩのインビトロでの特異的検出のために用い得るオリゴヌクレオチドのセットであって、次のオリゴヌクレオチド、即ち、
ＳＳ２ （５´−ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣ−３´と、
ＳＳ２８ （‘−ＴＡＡＴＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´）と
を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項１３】
請求項１のヌクレオチド配列ｉａｇＡによりコードされることを特徴とするＩａｇＡタンパク質。
【請求項１４】
図１および図２におけるアミノ酸１からアミノ酸５５３までのアミノ酸鎖に対応することを特徴とする、請求項１３に記載のＩａｇＡタンパク質。
【請求項１５】
請求項１のヌクレオチド配列ｉａｇＢによりコードされることを特徴とするＩａｇＢタンパク質。
【請求項１６】
図２におけるアミノ酸５５４からアミノ酸７１３までのアミノ酸鎖に対応することを特徴とする、請求項１５に記載のＩａｇＢタンパク質。
【請求項１７】
前もって、例えばＰＣＲにより増幅され且つ変性されたサルモネラ・エンテリカのヌクレオチド配列を、生物学的試料中においてインビトロ検出するための方法であって、
増幅されたＳ．エンテリカの配列を変性させる工程と、
このＳ．エンテリカ由来の増幅され変性されたヌクレオチド配列と、請求項２、６または７のいずれか１項のオリゴヌクレオチドから得られる捕獲プローブおよび表示プローブとを、前記の捕獲プローブおよび表示プローブがＳ．エンテリカ由来の上記の増幅されたヌクレオチド配列とハイブリッド化することを許容する条件下で接触させる（なお捕獲プローブはマイクロタイタープレートのウェル表面に付着させ、表示プローブはラベルして、ハイブリダイゼーション用緩衝液中に遊離させておく）工程と、
ハイブリダイゼーション反応をさせるために十分な時間、反応混合物をインキュベートする工程と、
未反応のオリゴヌクレオチドを除去するために洗浄する工程と、
増幅されたヌクレオチド配列にハイブリッド化した表示プローブを顕在化させる工程と、
を具備することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の検出方法であって、
捕獲プローブがオリゴヌクレオチドＩａｇ４であり、表示プローブがオリゴヌクレオチドＩａｇ３であることと、前記検出が
等容量の(volume for volume) ２００ｍＭ ＮａＯＨ，４０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を添加することにより、１０μｌ容量の増幅配列を変性させる工程と、
適切なハイブリダイゼーション用緩衝液中において、ウェル表面が捕獲プローブにより被覆されたマイクロプレートのプレハイブリダイゼーションを行う工程と、
マイクロプレートを空にして、変性された増幅断片及び１０ｎｇ／μｌの濃度のペルオキシダーゼでラベル化された表示プローブを含む２００μｌのハイブリダイゼーション用緩衝液を、それぞれのウェルに充填する工程と、
この混合物を、攪拌しながら３７℃での１時間のインキュベーションを行う工程と、
１０Ｘ洗浄溶液（１００ｍＭのトリス，３ＭのＮａＣｌ，１％のトゥイーン２０，ｐＨ７．４）を用いて、反応した混合物を洗浄する工程と、
発色基質の存在下での比色定量によって、プローブに結合したペルオキシダーゼの活性を検出する工程と、
にしたがって行われることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の検出方法であって、前記ペルオキシダーゼの活性が下記の工程、即ち、
反応混合物を含むそれぞれのウェルに、２００μｌの、４０ｍＭのクエン酸三ナトリウム溶液，０．０３％ Ｈ2 Ｏ ３０％，７．５ｍｇ／ｍｌのオルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を入れる工程と、
暗室内において３７℃で３０分間、マイクロプレートのインキュベーションを行う工程と、
４ＮのＨ2 ＳＯ4 溶液を５０μｌ／ウェル添加することにより、反応のブロッキングを行う工程と、
４９２ｎｍの波長での光学密度を定量（レファレンスの波長は６２０ｎｍ）する工程と
により行われることを特徴とする方法。
【請求項１】
サルモネラ・エンテリカ( Salmonella enterica ) 種の亜種エンテリカ血清変種タイフィ（Ｓ．タイフィと称する）によるヒーラ（ＨｅＬａ）培養細胞への侵入に関与するヌクレオチド配列であって、図１および図２において示されている配列のヌクレオチド９７とヌクレオチド１７５５との間のｉａｇＡ配列または図２において示されている配列のヌクレオチド１７７６とヌクレオチド２２５５との間のｉａｇＢ配列であることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項２】
請求項１の記載にしたがった配列に由来するオリゴヌクレオチドであって、以下の配列、
Ｉａｇ１：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＧ−３´
Ｉａｇ２：５´−ＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡ−３´
Ｉａｇ３：５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´
Ｉａｇ４：５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３´
Ｉａｇ５：５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＴＧＴＧ−３´
Ｉａｇ６：５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＣＧ−３´
ｓｌｍ１：５´−ＣＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＴ−３´
ｓｌｍ２：５´−ＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧ−３´
ｓｌｍ３：５´−ＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＡＣＡＣ−３´
ｓｌｍ４：５´−ＣＴＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡ−３´
ＳＳ２８：５´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´
Ｉａｇ７：５´−ＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＡＴＴＧＣＴ−３´
Ｉａｇ８：５´−ＴＴＡＣＧＣＴＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡ−３´
Ｉａｇ９：５´−ＴＧＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＣＧＡＴＣ−３´
Ｉａｇ１０：５´−ＡＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴ−３´
の１つに対応することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１の記載にしたがったヌクレオチド配列ＩａｇＡに由来し、且つサルモネラ・エンテリカ・グループＩの特異的検出、またはこうして増幅されたヌクレオチド配列の検出のためのプライマーとして用い得る配列より選択されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３の記載にしたがったオリゴヌクレオチドであって、次の配列、即ち、ＳＳ２８：５´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´に対応することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２の記載にしたがったオリゴヌクレオチド対であって、
Ｉａｇ５（センス）：５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＴＧＴＣ−３´と
Ｉａｇ６（アンチセンス）：５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＣＧ−３´との対、または
ｓｌｍ１（センス）：５´−ＣＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＴ−３´と
ｓｌｍ２（アンチセンス）：５´−ＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧ−３´との対
のうちの１つであることを特徴とするオリゴヌクレオチド対。
【請求項６】
サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリ( Salmonella bongori) とのハイブリッド化が可能なヌクレオチド配列であって、以下の配列、
Ｉａｇ３：５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´もしくは
Ｉａｇ４：５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３´、または
ｓｌｍ３：５´−ＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＧＡＡＣＡＣ−３´もしくは
ｓｌｍ４：５´−ＣＴＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡ−３´
の１つに対応し、且つラベル化されていることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項６の記載にしたがったヌクレオチド配列（またはプローブ）であって、プローブＩａｇ３もしくはプローブｓｌｍ３は増幅されたヌクレオチド配列の存在を表示するためのプローブであり、且つプローブＩａｇ４およびプローブｓｌｍ４は増幅されたヌクレオチド配列を捕獲するためのプローブであることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項８】
請求項２のオリゴヌクレオチドの使用であって、サルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリ由来のＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列（請求項１のヌクレオチド配列に含まれるか、またはそのような配列に対して相補的である）を増幅するためのプライマーとして、または増幅されたヌクレオチド配列を検出するためのプローブとしての使用。
【請求項９】
請求項５のオリゴヌクレオチド対の使用であって、Ｓ．エンテリカ種および／またはＳ．ボンゴリ種のグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶもしくはＶＩの細菌由来のヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーとしての使用。
【請求項１０】
Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡの増幅後に、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリの細菌を検出するために用い得るオリゴヌクレオチドのセットであって、
厳格な条件の下で、Ｓ．エンテリカおよび／またはＳ．ボンゴリのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとハイブリッド化することが可能な、請求項４または５のいずれか１項のオリゴヌクレオチド対と、
請求項６のプローブと
を具備することを特徴とするオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項１１】
生物学的試料中において、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶもしくはＶＩの１つに属するサルモネラ・エンテリカおよび／またはサルモネラ・ボンゴリの菌株のインビトロ検出のために用い得るオリゴヌクレオチドのセットであって、次のオリゴヌクレオチド、即ち、
増幅のためのプライマーとして用い得る配列Ｉａｇ５（５´−ＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＴＧＴＧ−３´）および配列Ｉａｇ６（５´−ＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＡＣＧ−３´）と、
表示プローブとして用い得る配列Ｉａｇ３（５´−ＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴ−３´）および捕獲プローブとして用い得る配列Ｉａｇ４（５´−ＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３´）とを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項１２】
生物学的試料中において、Ｓ．エンテリカのグループＩのインビトロでの特異的検出のために用い得るオリゴヌクレオチドのセットであって、次のオリゴヌクレオチド、即ち、
ＳＳ２ （５´−ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣ−３´と、
ＳＳ２８ （‘−ＴＡＡＴＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３´）と
を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項１３】
請求項１のヌクレオチド配列ｉａｇＡによりコードされることを特徴とするＩａｇＡタンパク質。
【請求項１４】
図１および図２におけるアミノ酸１からアミノ酸５５３までのアミノ酸鎖に対応することを特徴とする、請求項１３に記載のＩａｇＡタンパク質。
【請求項１５】
請求項１のヌクレオチド配列ｉａｇＢによりコードされることを特徴とするＩａｇＢタンパク質。
【請求項１６】
図２におけるアミノ酸５５４からアミノ酸７１３までのアミノ酸鎖に対応することを特徴とする、請求項１５に記載のＩａｇＢタンパク質。
【請求項１７】
前もって、例えばＰＣＲにより増幅され且つ変性されたサルモネラ・エンテリカのヌクレオチド配列を、生物学的試料中においてインビトロ検出するための方法であって、
増幅されたＳ．エンテリカの配列を変性させる工程と、
このＳ．エンテリカ由来の増幅され変性されたヌクレオチド配列と、請求項２、６または７のいずれか１項のオリゴヌクレオチドから得られる捕獲プローブおよび表示プローブとを、前記の捕獲プローブおよび表示プローブがＳ．エンテリカ由来の上記の増幅されたヌクレオチド配列とハイブリッド化することを許容する条件下で接触させる（なお捕獲プローブはマイクロタイタープレートのウェル表面に付着させ、表示プローブはラベルして、ハイブリダイゼーション用緩衝液中に遊離させておく）工程と、
ハイブリダイゼーション反応をさせるために十分な時間、反応混合物をインキュベートする工程と、
未反応のオリゴヌクレオチドを除去するために洗浄する工程と、
増幅されたヌクレオチド配列にハイブリッド化した表示プローブを顕在化させる工程と、
を具備することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の検出方法であって、
捕獲プローブがオリゴヌクレオチドＩａｇ４であり、表示プローブがオリゴヌクレオチドＩａｇ３であることと、前記検出が
等容量の(volume for volume) ２００ｍＭ ＮａＯＨ，４０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を添加することにより、１０μｌ容量の増幅配列を変性させる工程と、
適切なハイブリダイゼーション用緩衝液中において、ウェル表面が捕獲プローブにより被覆されたマイクロプレートのプレハイブリダイゼーションを行う工程と、
マイクロプレートを空にして、変性された増幅断片及び１０ｎｇ／μｌの濃度のペルオキシダーゼでラベル化された表示プローブを含む２００μｌのハイブリダイゼーション用緩衝液を、それぞれのウェルに充填する工程と、
この混合物を、攪拌しながら３７℃での１時間のインキュベーションを行う工程と、
１０Ｘ洗浄溶液（１００ｍＭのトリス，３ＭのＮａＣｌ，１％のトゥイーン２０，ｐＨ７．４）を用いて、反応した混合物を洗浄する工程と、
発色基質の存在下での比色定量によって、プローブに結合したペルオキシダーゼの活性を検出する工程と、
にしたがって行われることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の検出方法であって、前記ペルオキシダーゼの活性が下記の工程、即ち、
反応混合物を含むそれぞれのウェルに、２００μｌの、４０ｍＭのクエン酸三ナトリウム溶液，０．０３％ Ｈ2 Ｏ ３０％，７．５ｍｇ／ｍｌのオルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を入れる工程と、
暗室内において３７℃で３０分間、マイクロプレートのインキュベーションを行う工程と、
４ＮのＨ2 ＳＯ4 溶液を５０μｌ／ウェル添加することにより、反応のブロッキングを行う工程と、
４９２ｎｍの波長での光学密度を定量（レファレンスの波長は６２０ｎｍ）する工程と
により行われることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−６７７０６（Ｐ２００８−６７７０６Ａ）
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００７−２３７２０６（Ｐ２００７−２３７２０６）
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【分割の表示】特願平８−４６２２の分割
【原出願日】平成８年１月１６日（１９９６．１．１６）
【出願人】（５９６００９６７４）アンスティテュ・パストゥール (23)
【出願人】（５９６００５８７２）アンスティテュ・ナシオナル・デゥ・ラ・サンテ・エ・デゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３７２０６（Ｐ２００７−２３７２０６）
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【分割の表示】特願平８−４６２２の分割
【原出願日】平成８年１月１６日（１９９６．１．１６）
【出願人】（５９６００９６７４）アンスティテュ・パストゥール (23)
【出願人】（５９６００５８７２）アンスティテュ・ナシオナル・デゥ・ラ・サンテ・エ・デゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル (8)
【Ｆターム（参考）】
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