シクロオキシゲナーゼ−２の発現および／または活性の相乗的阻害を示すクルクミノイド組成物
【課題】ＣＯＸ−１に対してほとんど効果を有さないかまたは全く効果を有さずに、ＣＯＸ−２によるプロスタグランジン合成を、特異的に阻害または防止する化合物を含有する、組成物の提供。
【解決手段】第１の成分としてのクルクミノイド（ｃｕｒｃｕｍｉｎｏｉｄ）種およびクルクミノイドの抗炎症性効果を相乗作用的に増強し得る第２の化合物を含有する組成物。この組成物は、クルクミノイド種を含む有効量の第１の成分ならびにα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第２の成分を含有する。
【解決手段】第１の成分としてのクルクミノイド（ｃｕｒｃｕｍｉｎｏｉｄ）種およびクルクミノイドの抗炎症性効果を相乗作用的に増強し得る第２の化合物を含有する組成物。この組成物は、クルクミノイド種を含む有効量の第１の成分ならびにα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第２の成分を含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般的に、誘導性シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現および／または活性の相乗的阻害を示す組成物に関する。本組成物は、構成性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１）に対してほとんど有意な効果を有さないかまたは全く有意な効果を有さずに誘導性シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現および／または活性を相乗的に阻害するように機能し得る。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の記載）
炎症性疾患は、５千万人を超えるアメリカ人に影響を及ぼす。最近の１０年〜１５年の間の分子免疫学および細胞免疫学における基礎研究の結果として、これらの免疫学ベースの疾患の診断、治療および予防に対するアプローチが、劇的に変化した。この１つの例は、シクロオキシゲナーゼ酵素の誘導性形態の発見である。最初に、１９７６年に精製され、そして１９８８年にクローン化された構成性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）は、アラキドン酸（ＡＡ）由来のプロスタグランジン（ＰＧ）の合成において機能する。この精製から３年後、ＣＯＸ活性を有する誘導性酵素は、同定され、ＣＯＸ−２の名を与えられた一方、構成性ＣＯＸは、ＣＯＸ−１と称された。
【０００３】
ＣＯＸ−２遺伝子発現は、前炎症性サイトカインおよび成長因子の制御下にある。従って、この影響は、ＣＯＸ−２が細胞増殖の炎症および制御の両方において機能することである。ＣＯＸ−２が、多くの組織において誘導性である一方、疼痛および熱に対する神経伝達において機能し得る、脳および脊髄において構成的に存在する。ＣＯＸの２つのアイソフォームは、構造がほぼ同一であるが、基質およびインヒビターならびにこれらの細胞内位置において重要な差異を有する。胃壁の完全性を保護し、欠陥腎臓において正常な腎機能を維持する保護的ＰＧは、ＣＯＸ−１によって合成される。他方、免疫細胞においてＣＯＸ−２によって合成されるＰＧは、炎症プロセスに対して中枢である。
【０００４】
炎症処置のための理想的な処方物は、ＣＯＸ−１の活性に影響を与えずにＣＯＸ−２の誘導および活性を阻害する。しかし、従来の非ステロイド性薬物およびステロイド性抗炎症性薬物は、ＣＯＸ−１に影響せずにＣＯＸ−２を阻害する特異性を欠き、長期間使用される場合、胃腸管系に対して障害を生じる危険性がある。
【０００５】
多くの研究は、胃腸管（ＧＩ）副作用の相対的発生率が、薬剤の相対的ＣＯＸ−２特異性に関連し得ることを示した。ＣＯＸ−２に対する特異性がＣＯＸ−１より高ければ高いほど、ＧＩ不調の発生率がより低くなる。従って、わずか０．６のＣＯＸ−２特異性を有するアスピリンは、ほぼ３．０の報告されたＣＯＸ−２特異性を有するクルクミノイドよりも大きなＧＩ窮迫の発生率を生じる。しかし、ＧＩ不調の確立を有意に減少するために必要な一般的に受容されるＣＯＸ−２特異性は、５．０である。
【０００６】
従って、ＣＯＸ−２酵素活性の発現を特異的に阻害または防止するが、ＣＯＸ−１代謝に対してほとんど効果を有さないかまたは効果を全く有さない組成物を同定することは、有用であり、その結果、有害な副作用を有さない有意に低い用量または現在の臨床用量で使用し得る。
【０００７】
医師は、一般的に、変形性関節症の治療のための非ステロイド性抗炎症性薬物およびステロイド性抗炎症性薬物を使用する。しかし、これらの薬物は、長期療法にはそれほど適合しない。なぜなら、これらは、軟骨を補助（ｐｒｏｍｏｔｅ）し、そして保護する能力を欠くだけではなく；これらは、軟骨の変性またはその合成の低下を実際に導き得る。さらに、ほとんどの非ステロイド性抗炎症性薬物は、長期間使用される場合、胃腸管系を損傷する。従って、関節炎に対する新規処置は、緊急に必要とされる。
【０００８】
グルコサミンの関節保護特性によって、以下の２つの欠点を除いて、変形性関節症のための興味深い治療剤になる：（ｉ）グルコサミン処置に対する応答の速度が、抗炎症性薬物を用いた処置より遅い、そして（ｉｉ）グルコサミンは、変性の寛解の予想を満たさない可能性がある。非ステロイド性抗炎症性薬剤とグルコサミンとを比較する研究において、例えば、１日当たり１５００ｍｇのグルコサミン硫酸を１２００ｍｇのイブプロフェンと比較する二重盲式研究は、最初の２週間の間、グルコサミン処置患者においてよりも、イブプロフェン患者において、疼痛スコアをより早く減少したことを示した。しかし、疼痛スコアの減少は、グルコサミンを受容した患者において試行期間の間ずっと続き、２つの群の間の差異は、第８週までにグルコサミンの方に有意に傾いた。非特許文献１。従って、グルコサミンは、関節炎の疼痛および炎症を軽減し得るが、利用可能な抗炎症性薬物より速度がより遅い。
【０００９】
さらに、現在利用可能なグルコサミン処方物は、変形性関節症および慢性関節リウマチの根源的な原因を、最適に攻撃および緩和するようには処方されてこなかった。また、多くの市販されるハーブの補助物質および食事性補助物質とは違って、利用可能な処方物は、用法の歴史を有さず、これらの安全性および効力を保証し得る制御された臨床試験の歴史も有さない。
【００１０】
軟骨代謝の標準化または変形性関節症の処置のための理想的な処方物は、強力な抗炎症性活性を有する十分な軟骨保護を提供する。変形性関節症のための最適食事性補助物質は、グルコサミンによって提供される一般的な関節復元の質を強化し、任意の有害な副作用を誘導することなく、炎症応答を低減する。これは、安価に作製され、そして全ての政府の規制に従う。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｏｐｅｓ Ｖａｚ，Ａ．，（１９８２），「Ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｋｎｅｅ ｉｎ ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔｓ，８」，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｏｐｉｎ．１４５−１４９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
従って、ＣＯＸ−１に対してほとんど効果を有さないかまたは全く効果を有さずに、ＣＯＸ−２によるプロスタグランジン合成を、特異的に阻害または防止する化合物の天然の処方物を同定することは、有用である。関節組織の健康状態の保護、関節炎または他の炎症性状態の処置に有用である、このような処方物は、以前に発見されなかった。用語「特異的または選択的なＣＯＸ−２インヒビター」は、ＣＯＸ−１よりＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物または混合物を含む。好ましくは、化合物は、ＣＯＸ−１の阻害に関して中間有効濃度より少なくとも５倍大きい、ＣＯＸ−２阻害に関する中間有効濃度を有する。例えば、試験処方物のＣＯＸ−２に対する中間阻害濃度が０．２μｇ／ｍＬであった場合、処方物は、ＣＯＸ−１に対する中間阻害濃度が１μｇ／ｍＬ以上にならない限り、ＣＯＸ−２特異的であるとはみなされない。
【００１３】
好ましい実施形態は、第１の成分としてのクルクミノイド（ｃｕｒｃｕｍｉｎｏｉｄ）種およびクルクミノイドの抗炎症性効果を相乗作用的に増強し得る第２の化合物を含有する組成物を提供する。この組成物は、クルクミノイド種を含む有効量の第１の成分ならびにα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第２の成分を含有する。特定の実施形態において、α酸は、フムロン（ｈｕｍｕｌｏｎｅ）である。別の実施形態において、β酸は、ルプロン（ｌｕｐｕｌｏｎｅ）である。別の実施形態において、クルクミノイドは、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）である。
【００１４】
特定の実施形態において、この組成物は、グルコサミンおよびコンドロイチン硫酸からなる群から選択されるメンバーをさらに含有する。
【００１５】
好ましい実施形態はまた、動物における炎症または炎症ベースの疾患を処置する方法を提供し、この方法は、クルクミノイド種を含む有効量の第１の成分ならびにα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第２の成分を含有する組成物を、炎症の症状を罹患する動物に提供する工程を包含する。
【００１６】
好ましい実施形態はまた、動物における変形性関節症の症状を低減する方法を提供し、この方法は、クルクミノイド種を含む有効量の第１の成分ならびにα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第２の成分を含有する組成物を、炎症の症状を罹患する動物に提供する工程を包含する。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
有効量の第１の成分および第２の成分を含有する組成物であって、当該第１の成分が、クルクミノイド種を含有し、当該第２の成分が、α酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含有する、組成物。
・（項目２）
項目１に記載の組成物であって、上記α酸が、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン、アドフルポン、キサントフルポンＡおよびキサントフルポンＢからなる群から選択される、組成物。
・（項目３）
上記α酸が、フムロンである、項目２に記載の組成物。
・（項目４）
項目１に記載の組成物であって、上記β酸が、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン、ヘキサジドロコルプロン、およびジヒドロイソフムロンからなる群から選択される、組成物。
・（項目５）
上記β酸が、ルプロンである、項目４に記載の組成物。
・（項目６）
項目１に記載の組成物であって、上記α酸またはβ酸が、モノサッカリドまたはジサッカリド、アミノ酸、脂肪酸、スルフェート、スクシネート、アセテート、およびグルタチオンからなる群から選択される、組成物。
・（項目７）
上記第２の成分が、ホップから抽出される、項目１に記載の組成物。
・（項目８）
上記抽出が、超臨界ＣＯ２によって実施される、項目７に記載の組成物。
・（項目９）
項目１に記載の組成物であって、上記クルクミノイドが、クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、シス−トランス−クルクミン、およびシクロクルクミンからなる群から選択される、組成物。
・（項目１０）
上記クルクミノイドが、クルクミンである、項目９に記載の組成物。
・（項目１１）
項目１に記載の組成物であって、上記クルクミノイドが、モノサッカリドまたはジサッカリド、アミノ酸、脂肪酸、スルフェート、スクシネート、アセテート、およびグルタチオンからなる群から選択される化合物に結合体化される、組成物。
・（項目１２）
上記第１の成分が、合成化合物である、項目１に記載の組成物。
・（項目１３）
上記第２の成分が、合成化合物である、項目１に記載の組成物。
・（項目１４）
上記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアで処方される、項目１に記載の組成物。
・（項目１５）
グルコサミンおよびコンドロイチン硫酸からなる群から選択されるメンバーをさらに含有する、項目１に記載の組成物。
・（項目１６）
抗酸化剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質、炭水化物、およびアミノ糖からなる群から選択されるメンバーをさらに含有する、項目１に記載の組成物。
・（項目１７）
動物における炎症または炎症ベースの疾患の処置における使用のための、項目１に記載の組成物。
・（項目１８）
動物における変形性関節症の症状を低減する使用のための、項目１に記載の組成物。
・（項目１９）
動物における炎症または炎症ベースの疾患の処置のための医薬の調製のための項目１の組成物の使用。
・（項目２０）
項目１９に記載の使用であって、上記組成物が、投薬形態で処方され、当該投薬形態において、投与が、第１の成分および第２の成分を提供し、当該第１の成分が、１日当たり動物の体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約３０ｍｇであり、当該第２の成分が、１日当たり動物の体重１ｋｇ当たり約０．５〜約２０ｍｇである、使用。
・（項目２１）
項目１９に記載の使用であって、ここで、上記投与が、経口送達、非経口送達、局所的送達、経皮的送達、および経粘膜的送達からなる群から選択される手段による、使用。
・（項目２２）
項目２１に記載の使用であって、ここで、上記局所適用の処方箋が、約０．００１重量％〜約１重量％の第１の成分および約０．０２５重量％〜約１重量％の第２の成分を提供する、使用。
・（項目２３）
項目２２に記載の使用であって、ここで、上記局所適用の処方箋が、約０．０１重量％〜約１重量％の第１の成分および約０．０５重量％〜約１重量％の第２の成分を提供する、使用。
・（項目２４）
動物における変形性関節症の症状を低減するための医薬の調製のための項目１の組成物の使用。
・（項目２５）
項目２４に記載の使用であって、ここで、上記組成物が、グルコサミンおよびコンドロイチン硫酸からなる群から選択されるメンバーをさらに含有する、使用。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１［Ａ］〜１［Ｆ］は、［Ａ］クルクミノイド類の一般的な化学構造、ならびに［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］および［Ｆ］は、それぞれ、クルクミノイド類内の種として、クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、クルクミンのシス−トランス幾何異性体、およびシクロクルクミンの一般的な化学構造、を示す。
【図２】図２［Ａ］および［Ｂ］は、それぞれ、α酸類およびα酸類内の種として、フムロンの一般的な化学構造を示す。
【図３】図３［Ａ］および［Ｂ］は、それぞれ、β酸類およびルプロンの一般的な化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を含むことに留意しなければならない。
・好ましい実施形態は、ＣＯＸ−２の発現および／または活性に対して相乗的阻害効果を有する組成物を提供する。より詳細には、この組成物は、以下により詳細に記載されるように、第１の成分としてクルクミノイドを、そして第２の成分としてα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含有する。好ましい実施形態において提供される組成物は、食事性補助物質または治療組成物として処方され得る。組成物は、ＣＯＸ−１に対して有意な効果を有さずに、ＣＯＸ−２の誘導性および／または活性を相乗的に阻害するように機能し得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「食事性補助物質」とは、生理学の構造的変化または機能的変化に影響を及ぼすために消費される組成物をいう。用語「治療組成物」とは、疾患を処置または予防するために投与される任意の化合物をいう。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「クルクミノイド」および「活性クルクミノイド」とは、ＣＯＸ−２の誘導性および／または活性を阻害し得るが、ＣＯＸ−１に対してほとんど効果を有さないかまたは全く効果を有さないクルクミノイド類内の種、あるいは炎症性応答の重篤度を抑制し得るかまたは低減し得るクルクミノイド類内の種、をいう。クルクミノイドは、天然産物から抽出され得るかまたは化学合成され得る。
【００２１】
Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａの根茎から単離された黄色色素の画分は、ジシナモイルメタン基に属するクルクミノイドを含有する。クルクミノイドは、３〜５％の程度まで存在する。これらは、最も重要な活性成分であると考えられ、そしてＣｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａの生物学的活性を担うと考えられる。これらの主要な活性は抗炎症性であるが、クルクミノイドは、同様に、抗酸化性、抗アレルギー性、創傷治癒、抗痙攣性、抗菌性、抗真菌性および抗腫瘍活性を保有することが報告されている。クルクミン（図１Ｂ）は、１８１５年に単離され、１９１０年に構造的に規定された。Ｃｕｒｃｕｍ ｌｏｎｇａから単離された他のクルクミノイドとしては、デメトキシクルクミン（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）（図１Ｃ）、ビスデメトキシクルクミン（ｂｉｓｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）（図１Ｄ）、クルクミンのシス−トランス幾何異性体（図１Ｅ）、およびシクロクルクミン（ｃｙｃｌｏｃｕｒｃｕｍｉｎ）（図１Ｆ）が挙げられる。クルクミノイドは、Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａの他に他の植物種（例えば、Ｃｕｒｃｕｍａ ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚａおよびＣｕｒｃｕｍａ ｚｅｄｏａｒｉａ）において見出され得る。
【００２２】
クルクミノイドは、これらの抗炎症性活性について周知である。Ｔｕｍｅｒｉｃは、Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ医薬において使用される最も古い抗炎症性薬物の１つである。クルクミノイドの抗炎症性活性は、炎症反応モデル（例えば、カラゲニン、コットンペレット（ｃｏｔｔｏｎ ｐｅｌｌｅｔ）、ホルムアルデヒドおよび肉芽腫嚢のような化学的刺激原または物理的刺激原）において評価される。ヒトの二重盲式の臨床試行は、５〜６週間の間、１２００ｍｇのクルクミノイド／日の用量で、慢性関節リウマチにおける効力を示した。しかし、これらの用量で、胃腸管（ＧＩ）不快感および胃刺激の徴候が、しばしば報告される。高用量のクルクミノイドによって引き起こされるＧＩ不調および胃刺激は、クルクミノイドが、アスピリンおよびアスピリン様抗炎症性薬剤と類似する様式でプロスタグランジン産生に作用するという事実に起因し得る。
【００２３】
好ましくは、図１［Ａ］に示され、そして図１［Ｂ］中のクルクミンによって特に例示されるようなクルクミノイド類は、例えば、Ｓａｂｉｎｓａ（１２１ Ｅｔｈｅｌ Ｒｏａｄ Ｗｅｓｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から市販入手され得るような、薬学的等級の植物性抽出物である。使用され得る他のクルクミノイドとしては、デメトキシクルクミン（図１［Ｃ］）、ビスデメトキシクルクミン（図１［Ｄ］）、シス−トランスクルクミン（図１［Ｅ］）、およびシクロクルクミン（図１［Ｆ］）が挙げられる。使用されるクルクミノイドは、Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ Ｌ．から容易に得られ得る。薬学的等級のクルクミノイド抽出物は、約７０％を超えるクルクミノイド含量を有するように標準化される。薬学的な植物性等級の抽出物は、好ましくは、徹底的な安全性手順および効力手順を通過するべきである。好ましい実施形態において使用される場合、この抽出物は、約１〜９９重量％のクルクミノイド含量を有する。好ましくは、最小クルクミノイド含量は、約７０重量％である。あるいは、クルクミノイドは、化学合成において公知の標準的技術を使用して合成され得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ホップ（ｈｏｐ）抽出物」とは、（１）ホップ植物産物を溶媒に曝す工程、（２）ホップ植物産物を溶媒から分離する工程、および（３）溶媒を除去する工程から生じる固体物質をいう。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「溶媒」とは、ホップ植物産物から固体物質を抽出するために必要な特徴を保有する水性または有機性の液体をいう。溶媒の例としては、水、蒸気、過剰加熱水、メタノール、エタノール、ヘキサン、クロロホルム、液体ＣＯ２、液体Ｎ２、またはこれらの物質の任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＯ２抽出物」とは、ホップ植物産物を、液体または超臨界的ＣＯ２調製物に曝し、その後をＣＯ２除去する工程から得られる固体物質をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「α酸」とは、ホップ植物産物から単離される化合物をいい、これらとしては、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン（ｈｕｌｕｐｏｎｅ）、アドフムロン、キサントフモル（ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ）ＡおよびキサントフモルＢが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「β酸」とは、ホップ植物産物から単離される化合物をいい、これらとしては、ルプロンとして集合的に公知の化合物をいい、これらとしては、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン、およびヘキサヒドロコルプロンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「重要な油画分」とは、ミルセン（ｍｙｒｃｅｎｅ）、フムレン（ｈｕｍｕｌｅｎｅ）、β−カリオフィリーン（ｃａｒｙｏｐｈｙｌｅｅｎ）、ウンデカン−２−オン、および２−メチル−ブト−３−エン−オールを含む成分の複合混合物をいう。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「脂質」とは、脂肪酸のトリアシルグリセロールエステルをいう。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「ろう」は、トリアシルグリセロールエーテルまたは極端に長い鎖（＞２５炭素）の脂肪族アルコールもしくは脂肪酸のエステルをいう。
【００３２】
１つの形態または別の形態中のホップ抽出は、水およびエタノール中への抽出がまず試行された１９世紀初期まで１５０年以上遡る。今日でさえも、エタノール抽出は、ヨーロッパで利用可能であるが、はるかに広く行われている抽出は、有機溶媒（ヘキサン）抽出およびＣＯ２抽出（超臨界的かつ液体）である。ＣＯ２（代表的には、６０バールの圧力かつ５〜１０℃で）は、液体状態で存在し、そしてホップ軟質樹脂および油に対して高度に特異的な、比較的穏やかな非極性溶媒である。臨界点を超えると、代表的には、３００バールの圧力および６０℃で、ＣＯ２は、気体および液体の両方の特徴を有し、さらにより強い溶媒である。種々の抽出物の適切な成分が、表１において比較される。
【００３３】
（表１．ホップ抽出物（パーセント Ｗ／Ｗ）
【００３４】
【表１】
最も単純な場合、ホップ抽出は、ホップを粉砕する工程、ペレット化する工程、そして再粉砕し、ホップ腺を広げる工程、溶媒を充填されたカラムを通過させ、樹脂成分を回収する工程、最後に、溶媒を除去し、全樹脂抽出物または「純粋」樹脂抽出物を得る工程を包含する。
【００３５】
主要な有機抽出物は、強い溶媒であり、実質的に全てのホップ腺成分に加えて、これらは、植物色素、クチクラろう、水および水溶性物質を抽出する。
【００３６】
超臨界ＣＯ２は、有機溶媒より選択的であり、少量のタンニンおよびろうならびにより少量の水、従って水溶性成分を抽出する。これは、クロロフィルのようないくらかの植物色素を抽出するが、有機溶媒が抽出するよりは少ない。液体ＣＯ２は、ホップに使用するために商業的に使用される最も選択的な溶媒であり、従って、最も純粋な全樹脂および油抽出物を生成する。これは、硬質樹脂もタンニンも抽出せず、かなりより少量の植物ろうを抽出し、植物色素は抽出せず、そしてより少量の水および水溶性物質を抽出する。
【００３７】
この選択性およびより穏やかな溶媒特性の結果として、ホップ単位重量当たりの液体ＣＯ２抽出物の絶対収量は、他の記載された溶媒を使用する場合よりも少ない。さらに、液体ＣＯ２でのα酸の収量（約８９〜９３％）は、超臨界ＣＯ２（約９１〜９４％）または有機溶媒（約９３〜９６％）よりも少ない。抽出の後、溶媒除去のプロセスを行い、有機溶媒に対する溶媒除去は、加熱し揮発させる工程を包含する。このことにも関わらず、微量の溶媒が、抽出物に残る。しかし、ＣＯ２の除去は、圧力を緩め、ＣＯ２を揮発させる工程を単に包含する。
【００３８】
好ましい実施形態において、α酸、β酸、またはこれらの誘導体は、ホップから抽出され得るか、または化学合成され得る。好ましくは、α酸、β酸、またはこれらの誘導体は、ホップから抽出され、より好ましくは、超臨界ＣＯ２によって抽出される。
【００３９】
好ましくは、図２［Ａ］によって示され、特に図２［Ｂ］におけるフムロンによって例示されるようなα酸類、および図３［Ａ］によって示され、特にルプロン（図３［Ｂ］）によって例示されるようなβ酸類は、薬学的等級調製物であり、例えば、Ｈｏｐｕｎｉｏｎ（Ｙａｋｉｍａ，ＷＡ）から市販入手され得る。
【００４０】
骨吸収インヒビターとしてのホップ抽出物由来のフムロンの同定は、Ｔｏｂｅ，Ｈら１９９７に報告される［Ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｏｐ ｅｘｔｒａｃｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ６１（１）１５８−１５９］。同じグループの後の研究によって、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＴＮＦα刺激後の、ＣＯＸ−２遺伝子転写の阻害として、フムロンの作用の機構が特徴付けられた［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．２０００．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍｕｌｏｎ ｏｆ ｂｅｅ ｈｏｐ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４６５：１０３−１０６］。しかし、これらの参考文献は、骨粗鬆症およびＣＯＸ−２遺伝子転写の適用のためのみのフムロンの使用を開示する。
【００４１】
好ましい実施形態は、クルクミノイド分子を改変し、より高い効力およびより低い毒性を達成する工程ならびに相乗的な様式で作用する第２の成分を添加する工程を提供する。従って、好ましい実施形態は、クルクミノイドを、α酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択される第２の分子と組み合わせる場合、この組合せが、標的細胞において相乗効果を生じるという発見に関する。１つのこのような相乗的応答は、誘導性ＣＯＸ−２の特異的阻害である。
【００４２】
各類内の代表的な種は、表２に列挙される。表２における各類の項目下で列挙される種の中で、少なくとも１つのアステリスク（＊）を含む種は、好ましく、２つのアステリスク（＊）を含む種は、特に好ましい。
【００４３】
（表２．組成物の成分）
【００４４】
【表２】
好ましくは、好ましい実施形態は、活性クルクミノイドおよびホップ抽出物の成分またはこれらの誘導体を使用する。本明細書中で使用される場合、用語「活性クルクミノイド」、「ホップ抽出物の活性成分」またはこれらの誘導体は、ＣＯＸ−２の誘導性および／または活性を阻害し得るが、ＣＯＸ−１に対してほとんど効果を有さないかまたは全く効果を有さないか、あるいは炎症性応答の重篤度を防止し得るかまたは低減し得る、それぞれの類の範囲内の天然に存在する種または合成誘導体をいう。
【００４５】
好ましい実施形態はまた、クルクミノイド、α酸およびβ酸またはこれらの誘導体の結合体を使用し得る。クルクミノイド、α酸およびβ酸またはこれらの誘導体の「結合体」は、モノサッカリドまたはジサッカリド、アミノ酸、スルフェート、スクシネート、アセテートおよびグルタチオンからなる群から選択されるメンバーを共有結合するかまたはこれらと結合体化される、クルクミノイド、α酸、およびβ酸を意味する。好ましくは、モノサッカリドまたはジサッカリドは、グルコース、マンノース、リボース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、マルトース、およびフルクトースからなる群から選択されるメンバーである。
【００４６】
特定の実施形態は、有効量のクルクミンならびにフムロンおよびルプロンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含有する組成物である。
【００４７】
α酸またはβ酸によるＣＯＸ−２酵素活性の阻害は、クルクミノイドとの二重の相乗効果を提供し得る。従って、α酸およびβ酸からなる群から選択される第２の化合物は、クルクミノイドの抗炎症性活性を増大し得る。好ましい実施形態の組成物の結果は、通常必要とされるよりも低い用量のクルクミノイドでのＣＯＸ−２の活性に対するより選択的な効果である。所望のＣＯＸ−２阻害を達成するようにクルクミノイドの用量を減少することによって、この化合物からの副作用の可能性は、ほとんど指数関数的に減少する。α酸およびβ酸からなる群から選択される第２の化合物は、利益を提供し得、この利益としては、例えば、肝臓保護、抗腫瘍促進、抗高脂質血症、抗高血糖症（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｒｍｉａ）およびクルクミノイドによるＣＯＸ−１阻害由来の潰瘍形成に対する保護であるがこれらに限定されない。
【００４８】
好ましくは、好ましい食事性補助物質の一日用量（ｍｇ／ｋｇ−日）は、動物の体重の１ｋｇ当たり、約０．００１〜約３０ｍｇクルクミノイド、および約０．５〜約２０．０ｍｇのα酸またはβ酸を送達するように処方される。
【００４９】
局所適用のための好ましい実施形態の組成物は、以下の１つを含有する：約０．００１〜約１重量％、好ましくは約０．０１〜約１重量％のクルクミノイド、および約０．０２５〜約１重量％、好ましくは約０．０５〜約１重量％のα酸またはβ酸。
【００５０】
好ましい実施形態の組成物は、以下の範囲の血清濃度を生じる：約０．０００１〜約１０μＭのクルクミノイド、および約０．００１〜約１０μＭのα酸またはβ酸。
【００５１】
好ましい実施形態において、組成物は、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸をさらに含有し得る。グルコサミンは、一般的に、変形性関節症の処置に対して有効であり、そして安全であるとして受け入れられる。従って、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸をさらに含有する組成物は、関節機能の正常化または変形性関節症の症状を低減するのを補助し得る。
【００５２】
クルクミノイドとα酸、β酸または誘導体との組み合わせに加えて、食事性適用のための本組成物は、種々の添加物（例えば、他の天然の中間代謝物の成分、抗酸化剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質、炭水化物、およびアミノ糖であるがこれらに限定されない）および不活性成分（例えば、タルクおよびステアリン酸マグネシウム（これらは、錠剤およびカプセル剤の製造において標準的な賦形剤である））を含有し得る。
【００５３】
好ましい実施形態の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。本明細書中で使用されるように、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤および吸収遅延剤、甘味剤などを含む。これらの薬学的に受容可能なキャリアは、広範な材料から調製され得、このような材料としては、希釈剤、結合剤および接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、バルキング剤、嬌味嬌臭剤、甘味剤および特定の治療組成物を調製するために必要とされ得る雑材（例えば、緩衝剤および吸収剤）が挙げられるが、それらに限定されない。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。いかなる従来の媒体または薬剤も活性成分と不適合性でない限り、好ましい実施形態におけるその使用が企図される。１つの実施形態では、タルク剤およびステアリン酸マグネシウムが、処方物中に含まれる。好ましい成分は、Ａｓｔａｃ Ｂｒａｎｄ ４００ ＵＳＰタルク粉末および実際等級（ｖｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｒａｄｅ）のステアリン酸マグネシウムである。食用バーまたは機能的食品としてのこの組成物の製造に影響することが公知の他の成分としては、フレーバリング、糖、アミノ糖、タンパク質、および／または化工澱粉、ならびに脂肪および油が挙げられ得る。
【００５４】
好ましい実施形態の食事性補助物質、ローション、または治療組成物は、当業者によって公知である任意の様式で処方され得る。１つの実施形態では、組成物は、当業者に利用可能な技術を用いてカプセルまたは錠剤に処方され得る。カプセルまたは錠剤の形態では、成人または成体動物にとって推奨された一日用量が、好ましくは、１〜６のカプセルまたは錠剤に含有される。しかし、本発明の組成物はまた、他の便宜的な形態で処方され得る。このような形態としては、例えば、注射溶液または懸濁液、スプレー溶液または懸濁液、ローション、ガム、ロゼンジ、食品または軽食品目が挙げられる。食品、軽食、ガムまたはロゼンジ品目は、任意の摂取可能な成分を含み得、このような成分としては、甘味剤、フレーバリング、油、澱粉、タンパク質、果実もしくは果実抽出物、野菜もしくは野菜抽出物、穀物、動物脂、またはタンパク質が挙げられる。従って、本組成物は、シリアル、軽食品目（例えば、チップス、バー、ガムドロップ、チューイングキャンデー、または緩慢に溶解するロゼンジ）に処方され得る。好ましい実施形態は、炎症ベースの疾患（急性および慢性の両方）の全ての型の処置を企図する。本発明は、炎症応答を減少させ、そしてそれにより罹患組織の治癒を促進するか、または罹患組織へのさらなる損傷を防ぐ。薬学的に受容可能なキャリアはまた、本発明の組成物および処方物において使用され得る。
【００５５】
好ましい実施形態によれば、動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、トリ、ウマ、反芻動物、または他の温血動物からなる群から選択されるメンバーであり得る。好ましい実施形態は、主としてヒトの処置に関する。投与は、当業者に利用可能な任意の方法によって、例えば、経口経路、局所経路、経皮経路、経粘膜経路、または非経口経路によって、であり得る。
【００５６】
以下の表３は、ＣＯＸ−２酵素発現および活性が役割を果たし得、従って、好ましい実施形態の組成物による正常化または処置の適切な標的である疾患のリストを提供する。
（表３：ＣＯＸ−２関連疾患）
【００５７】
【表３】
ＣＯＸ−２の発見は、ＣＯＸ−１により作製された胃および腎臓における防御性ＰＧを除去することなく炎症を減少させる薬物の設計を可能にした。好ましい実施形態の組成物は、被験体における炎症の処置、および他の炎症関連障害の処置（例えば、疼痛および頭痛の処置における鎮痛薬として、または熱の処置のための解熱薬として）に有用であるが、これらに限定されない。好ましい実施形態の組成物は、血管疾患、片頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｍａ）、リウマチ熱、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、多発性硬化症、サルコイドーシス（ｓａｃｏｉｄｏｓｉｓ）、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、傷害後に生じる腫脹、心筋虚血などのような疾患において炎症を処置する際に有用である。好ましい実施形態の組成物は、有害な副作用が顕著に少ないというさらなる利点を有する抗炎症剤として有用である。
【００５８】
好ましい実施形態はまた、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸が、関節運動を正常化するか、または変形性関節炎の症状を減少させるように機能する割合を増加させる組成物を提供し得る。例えば、好ましい実施形態の組成物は、関節炎を処置するために有用である。このような関節炎としては、慢性関節リウマチ、脊椎アソパシー（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｔｈｏｐａｔｈｉｅｓ）、痛風性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス、および若年性関節炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
好ましい実施形態のこのような組成物はまた、喘息、気管支炎、月経性痙攣（ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｒａｍｐｓ）、腱炎、滑液包炎および皮膚関連状態（例えば、乾癬、湿疹、熱傷、および皮膚炎）の処置において有用である。好ましい実施形態の組成物はまた、胃腸状態（例えば、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群、および潰瘍性大腸炎）を処置するため、および癌（例えば、結腸直腸癌）の予防または処置に有用である。
【００６０】
好ましい実施形態の組成物はまた、眼疾患（例えば、網膜症、結膜炎、ブドウ膜炎、眼光恐怖（ｏｃｕｌａｒ ｐｈｏｔｏｐｈｏｂｉａ））の処置、および眼組織への急性傷害の処置において有用である。化合物はまた、肺炎症（例えば、ウイルス感染および嚢胞性線維症に関連した肺炎症）の処置において有用である。化合物はまた、特定の神経系障害（例えば、皮質性痴呆（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ）（アルツハイマー病を含む）の処置に有用である。ＰＧＥ２のＣＯＸ−２媒介生合成のインヒビターとして、これらの組成物はまた、アレルギー性鼻炎、呼吸窮迫症候群、エンドトキシンショック症候群、アテローム性動脈硬化症、および発作、虚血、および外傷から生じる中枢神経系損傷の処置において有用である。
【００６１】
以下の実施例は、好ましい実施形態の例示であって、いずれの様式においても制限しないことを意図する。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
クルクミノイドおよびホップの抽出物によるマウスＢ細胞におけるプロスタグランジンＥ２産生の相乗的阻害
本実施例は、好ましい実施形態のクルクミノイドおよびホップ抽出物の組み合わせの、クルクミノイド単独に比較して優れたＣＯＸ−２阻害効力および選択性を示す。
（ＲＡＷ ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２のＣＯＸ−２媒介産生の阻害）
装置−バランサー（分析用）、Ｏｈａｕｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｏｈａｕｓ Ｍｏｄｅｌ ＃ＥＯ１１４０，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、バイオセイフティーキャビネット（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ１２１４，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、ピペッター（１００〜１０００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ），細胞ハンド計数カウンター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２３６０９−１０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ），ＣＯ２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ３２１０，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ），ヘマサイトメーター（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｍｏｄｅｌ＃１４９２，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｏｄｅｌ ＃ＤＭ ＩＬ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、マルチチャンネルピペッター（１２チャンネル）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３５０１−６６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットエイド（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３４９８−１０３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（０．５〜１０μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（１００〜１０００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（２〜２０μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（２０〜２００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＰＵＲＥＬＡＢ Ｐｌｕｓ Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕ．Ｓ．Ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）、冷蔵装置（４℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ３７７５，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、ボルテックスミキサー（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃３３９９４−３０６，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、温水バス（Ｓｈｅｌ Ｌａｂ Ｍｏｄｅｌ＃１２０３，Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ，ＯＲ）。
【００６３】
細胞、化学物質、試薬、および緩衝液−細胞スクレーパー（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ＃３００８，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５５０７，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ），ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ＃１０−０１３−ＣＶ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、ウシ胎仔血清（熱不活性化）（ＦＢＳ−ＨＩ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ＃３５−０１１−ＣＶ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｌ−２６５４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、遠心管（１．７ｍＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２０１７２−６９８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ＃３０−００１−ＣＩ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、ピペットチップ（０．５〜１０μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５０９−１３８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットチップ（１００〜１０００μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５１２−２９４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットチップ（２〜２０μＬピペッターおよび２０〜２００μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ ＃５３５１２−２６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペット（１０ｍＬ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃７５５１，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、ピペット（２ｍＬ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃７５０７，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、ピペット（５ｍＬ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃７５４３，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、ＲＡＷ ２６４．７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＴＩＢ−７１，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、試験化合物（液体ＣＯ２ホップ抽出物（Ｈｏｐｕｎｉｏｎ，Ｙａｋｉｍａ，ＷＡ製））、（クルクミン（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃ １３８６）、６５〜７０％Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ粉末）、組織培養プレート（９６ウェル）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃３０７５，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｎｅｓ，ＮＪ）、超純水（Ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）（抵抗（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）＝１８ＭΩ−ｃｍ脱イオン水）。
【００６４】
一般手順−ＲＡＷ ２６４．７細胞（ＡＴＣＣより入手）を、ＤＭＥＭ培地において増殖させ、そして対数期増殖に維持した。ＤＭＥＭ増殖培地を以下のようにして作製した：５０ｍＬの熱不活性化ＦＢＳおよび５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを、５００ｍＬボトルのＤＭＥＭに添加し、そして４℃で保存した。これを使用前に温水バス中で３７℃に温め、そして最良の結果のために、３ヶ月以内に使用すべきである。
【００６５】
実験の第一日目において、対数期２６４．７細胞を、９６ウェル組織培養プレートにおいて１ウェル当たり０．２ｍＬ増殖培地中に、８×１０４細胞／ウェルで播種した。播種後６〜８時間で、各ウェルから１００μＬの増殖培地を除去し、１００μＬの新鮮な培地と交換した。１．０ｍｇ／ｍＬ ＬＰＳ溶液（これを、ＲＡＷ ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２の発現を誘導するために使用した）を、１ｍＬ ＤＭＳＯ中の１．０ｍｇのＬＰＳ中に溶解することによって調製した。それを、溶解するまで混合し、そして４℃で貯蔵した。使用する直前に、室温で、または３７℃温浴バス中でそれを解凍させた。
【００６６】
実験の第二日目において、試験材料を、ＤＭＳＯ中で１０００×ストックとして調製した。例えば、試験材料の最終濃度が１０μｇ／ｍＬであった場合、１ｍＬのＤＭＳＯ中に１０ｍｇの試験材料を溶解することにより、１０ｍｇ／ｍＬストックを調製した。実験の２日目に、新鮮な試験材料を調製した。１．７ｍＬ遠心分離管において、１ｍＬ ＤＭＥＭ（ＦＢＳ含まず）を添加し、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、および１．０μｇ／ｍＬの試験濃度を得た。２μＬの１０００×ＤＭＳＯストックの試験材料を１ｍＬ培地（ＦＢＳ含まず）に添加した。最終濃度の試験材料を含んだ管を２倍濃縮した。この管を、１０分間インキュベーター中に配置して、平衡化させた。
【００６７】
１００ｍＬの培地を、１日目に調製した細胞プレートの各ウェルから除去した。１００ｍＬの平衡化した２×最終濃度の試験化合物を細胞に添加し、そして９０分間インキュベートした。４４μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯストックを１０ｍＬの培地に添加することにより、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ含まず）中ＬＰＳを調製した。刺激される細胞の各ウェルにつき、２０μＬのＬＰＳ（ＬＰＳの最終濃度は、０．４μｇ／ｍＬのＬＰＳである）を添加した。ＬＰＳ刺激を２４時間続け、その後各ウェルからの上清培地を、培地中のＰＧＥ２
含有量の決定のために、きれいな遠心管に移した。
（クルクミノイドおよびホップ抽出物によるＣＯＸ−１酵素阻害の決定）
ＰＧＥ２のＣＯＸ−１合成を阻害する試験材料の能力を、本質的に、Ｎｏｒｅｅｎ，Ｙ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６１，２−７，１９９８）によって記載されるように決定した。
【００６８】
装置−バランサー（２４００ｇ，Ａｃｃｕｌａｂ ＶＩ−２４００，ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃１１２３７−３００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、バランサー（分析用）、Ｏｈａｕｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｏｈａｕｓ Ｍｏｄｅｌ＃ＥＯ１１４０，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、バイオセイフティーキャビネット（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ１２１４，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、冷凍装置（−３０℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ３７９７）、冷凍装置（−８０℃）Ｕｌｔｒａｌｏｗ（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ８５１６，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、加熱攪拌プレート（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃３３９１８−２６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、製氷機（Ｓｃｏｔｓｍａｎ Ｍｏｄｅｌ＃ＡＦＥ４００Ａ−１Ａ，Ｆａｉｒｆａｘ，ＳＣ）、マルチチャンネルピペッター（１２チャンネル）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３５０１−６６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、マルチチャンネルピペッター（８チャンネル）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３５０１−６６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、旋回振盪器プラットフォーム（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ＃Ｆ３７０４１−００００，Ｐｅｑｕａｎｎｏｃｋ，ＮＪ）、ｐＨメーター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃３３２２１−０１０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットエイド（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３４９８−１０３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（０．５〜１０μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（１００〜１０００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（２〜２０μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（２０〜２００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＰＵＲＥＬＡＢ Ｐｌｕｓ Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕ．Ｓ．Ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）、冷蔵装置（４℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ３７７５，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、真空チャンバー（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｚ３５，４０７−４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ボルテックスミキサー（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃３３９９４−３０６，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。
【００６９】
供給品および試薬−９６ウェル丸底プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ＃２６７２４５，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、アラキドン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ａ−３９２５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、遠心分離管（１５ｍＬ）（円錐形、滅菌済）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２０１７１−００８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＣＯＸ−１酵素（ヒツジ）、４０，０００単位／ｍｇ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔａｌｏｇ＃６０１００，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５５０７，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、エタノール１００％（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＭＫ７０１９０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、エピネフリン（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｅ−４２５０，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、グルタチオン（還元）（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｇ−６５２９，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、メモリ付きシリンダー（１０００ｍＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２４７１１−３６４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ヘマチン（ブタ）（Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｈ−３２８１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、塩酸（ＨＣｌ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＶＷ３１１０−３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＫｉｍＷｉｐｅｓ（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ ＣｌａｒｋＣａｔａｌｏｇ＃３４２５６，Ｒｏｓｗｅｌｌ，ＧＡ）、遠心管（１．７ｍＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２０１７２−６９８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｓ−５８８１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ピペットチップ（０．５〜１０μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５０９−１３８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットチップ（１００〜１０００μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５１２−２９４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットチップ（２〜２０μＬピペッターおよび２０〜２００μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５１２−２６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、プロスタグランジンＥ２（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｐ−５６４０，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、プロスタグランジンＦ２α（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｐ−０４２４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、攪拌棒（磁気）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５８９４８−１９３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、貯蔵ビン（１０００ｍＬ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ＃１３９５−１Ｌ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、貯蔵ビン（１００ｍＬ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ＃１３９５−１００，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ホップのＣＯ２抽出物（Ｈｏｐｕｎｉｏｎ，Ｙａｋｉｍａ，ＷＡ）、クルクミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃ １３８６）、６５〜７０％ Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ粉末）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｔ−５９４１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、超純水（抵抗＝１８ＭΩ−ｃｍ脱イオン水）。
【００７０】
一般手順−酸素を含まない１．０ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を、以下のようにして調製した。１０００ｍＬのビーカーで、１２．１１ｇのＴｒｉｚｍａ ＨＣｌを、９００ｍＬの超純水に溶解した。このビーカーにスターラーバーを入れて、スターラープレートにのせた。ＮａＯＨを、ｐＨが８．０に達するまで添加した。その容量を、１０００ｍＬの最終容量まで調整し、そして１０００ｍＬの保存瓶中で貯蔵した。
【００７１】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を、上を開けたまま、真空チャンバーに入れ、そしてこの緩衝液の気体発生が止まるまで、空気ポンプをオンにした。次いで、真空チャンバーを切り、そして貯蔵瓶に密閉して覆った。酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用するたびに、この工程を繰り返した。
【００７２】
１ｍＬの補因子溶液を、１．３ｍｇの（−）エピネフリン、０．３ｍｇの還元グルタチオンおよび１．３ｇｍのヘマチンを、１ｍＬの酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に添加することによって調製した。この試験物質の溶液を、必要に応じて調製した（すなわち、１０ｍｇのアスピリンを計量し、そして１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した）。
【００７３】
酵素、すなわち、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＦ２αを、以下のようにして、酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解した。すなわち、氷上で、４０，０００単位／ｍＬの酵素（６．５μＬ）をとり、そして酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（６４３．５μＬ）に添加した。この酵素溶液は、６０回の反応に十分である。ＣＯＸ−１酵素溶液を、以下のようにして調製した：１５ｍＬの遠心分離管中で、４０，０００単位／ｍＬのＣＯＸ−１酵素（１０μＬ）を、一回の反応あたり、５０μＬの補因子溶液を含有する酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌに添加した。この混合物を、氷上で、５分間インキュベートした。６０回の反応について、６５０μＬの酵素を、３．２５ｍＬの補因子溶液を含有する酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に添加した。
【００７４】
９６ウェルプレートの各ウェル中で、６０μＬの酵素溶液を２０μＬの試験溶液と合わせた。試験溶液の最終濃度は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２μｇ／ｍＬであった。これらのプレートを、氷上で１０分間、プレインキュベートした。２０μＬのアラキドン酸（３０μＭ）を添加し、そして３７℃で１５分間インキュベートした。
【００７５】
１２．１ＮのＨＣｌを１００ｍＬの貯蔵瓶中で希釈することによって、２ＭのＨＣｌを調製した。８３．５ｍＬの超純水を添加し、次いで、１２．１ＮのＨＣｌ（１６．５ｍＬ）を添加した。これを、１００ｍＬの貯蔵瓶中で貯蔵し、そしてＢｉｏｓａｆｔｙキャビネット中に置いた。この反応を、２ＭのＨＣｌ（１０μＬ）を添加することによって停止させた。最終溶液を、ＰＧＥ２アッセイのための上清として使用した。
【００７６】
（培地中のＰＧＥ２濃度の決定）
以下の手順は、本質的にＨａｍｂｅｒｇ，Ｍ．およびＳａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｂ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７１．２４６，６７１３−６７２１）により記載される手順であった；しかし、商業的な非放射性の手順を用いた。
【００７７】
装置−冷凍庫、−３０℃（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ３７９７）、加熱撹拌プレート（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃３３９１８−２６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、マルチチャネルピペッター、１２チャネル（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３５０１−６６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、回転式振盪プラットフォーム（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ ＃Ｆ３７０４１−００００，Ｐｅｑｕａｎｎｏｃｋ，ＮＪ）、ピペットエイド（Ｐｉｐｅｔ Ａｉｄ）（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３４９８−１０３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、０．５〜１０μＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、１００〜１０００μＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、２〜２０μＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、２０〜２００μＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、プレートリーダー（Ｂｉｏ−ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｍｏｄｅｌ＃Ｅｌｘ８００，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）、ＰＵＲＥＬＡＢ Ｐｌｕｓ水研磨システム（Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｕ．Ｓ．Ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）、冷却装置、４℃（Ｆｏｒｍａ ｍｏｄｅｌ＃Ｆ３７７５，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）。
【００７８】
化学物質、試薬および緩衝液−プロスタタグランジンＥ２ ＥＩＡキットモノクローナル４８０ウェル（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔａｌｏｇ ＃５１４０１０，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、遠心分離管、５０ｍＬ、コニカル、滅菌（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃２０１７１−１７８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ ｃａｔａｌｏｇ ＃１０−０１３−ＣＶ、Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、メスシリンダー、１００ｍＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃２４７１１−３１０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、キムワイプ（ＫｉｍＷｉｐｅｓ）（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ｃｌａｒｋ ｃａｔａｌｏｇ ＃３４２５６、Ｒｏｓｗｅｌｌ，ＧＡ）、微量遠心管、１．７ｍＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃２０１７２−６９８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ ｃａｔａｌｏｇ ＃３０−００１−ＣＩ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、０．５〜１０μＬのピペッターのピペットチップ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３５０９−１３８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、１００〜１０００μＬのピペッター用のピペットチップ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３５１２−２９４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、２〜２０μＬおよび２０〜２００μＬのピペッター用のピペットチップ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３５１２−２６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペット、２５ｍＬ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｃａｔａｌｏｇ ＃７５５１，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、貯蔵瓶、１００ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃａｔａｌｏｇ ＃１３９５−１００，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、貯蔵瓶、１０００ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃａｔａｌｏｇ ＃１３９５−１Ｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、超純水（抵抗＝１８メガオーム−ｃｍ脱イオン水）。
【００７９】
一般手順−ＥＩＡ緩衝液を、ＥＩＡ緩衝液濃縮物（バイアル＃４）の内容物を９０ｍｌの超純水で希釈することによって調製した。バイアル＃４を、数回リンスして、全ての結晶を確実に除去し、次いで、１００ｍＬの貯蔵瓶に入れ、そして４℃で貯蔵した。
【００８０】
洗浄緩衝液濃縮物（バイアル＃５）を、超純水で１：４００に希釈することによって、洗浄緩衝液を調製した。次いで、０．５ｍｌ／ｌのＴｗｅｅｎ ２０（バイアル＃５ａ）を（正確な測定のためのシリンジを使用して）添加した。２．５ｍｌの洗浄緩衝液濃縮物、０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０および９９７ｍｌの超純水を添加して、１リットルの洗浄緩衝液を調製した。この溶液を、１リットルの貯蔵瓶中、４℃で貯蔵した。
【００８１】
プロスタグランジンＥ２標準物質を、以下のようにして再構成した。２００μＬのピペットチップを、このチップにエタノールを繰返し数回出し入れすることによって平衡化した。このチップを使用して、１００μＬのＰＧＥ２標準物質（バイアル＃３）を１．７ｍＬの微量遠心管に移した。９００μｌの超純水を、この管に添加し、そして４℃で貯蔵した。これは、約６週間安定であった。プロスタグランジンＥ２アセチルコリンエステラーゼトレーサーを、以下のようにして再構成した。５０ｍＬの遠心分離管中で、１００μＬのＰＥＧ２トレーサー（バイアル＃２）を３０ｍＬのＥＩＡ緩衝液と混合し、そして４℃で貯蔵した。
【００８２】
プロスタグランジンＥ２モノクローナル抗体を、以下のようにして再構成した。５０ｍＬの遠心分離管中で、１００μＬのＰＧＥ２抗体（バイアル＃１）を３０ｍＬのＥＩＡ緩衝液と混合し、そして４℃で貯蔵した。
【００８３】
５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを５００ｍＬのＤＭＥＭに添加することによって、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭを調製し、そして４℃で貯蔵した。
【００８４】
プレートを以下のようにして構成した：各プレートは、最低２つのブランク（Ｂ）、２つの非特異的結合ウェル（ＮＳＢ）、２つの最大結合ウェル（Ｂ０）および二重に実行される８点標準曲線（Ｓ１〜Ｓ８）を含んだ。各サンプルを、最低２つの希釈物でアッセイし、そして各希釈物を二重に実行した。
【００８５】
標準物質を以下のようにして調製した：１．７ｍＬの微量遠心管（８個）を、管１〜８とラベルを付けた。９００μＬのＤＭＥＭを、管１に添加し、そして５００μＬのＤＭＥＭを管２〜８に添加した。１００μＬのＰＧＥ２標準物質を、管１に添加し、そして混合した。５００ｍＬの溶液を、管１から取り、そして管２に入れ、このプロセスを、管８まで繰り返した。
【００８６】
５０ｍＬのＥＩＡ緩衝液および５０μｌのＤＭＥＭを、ＮＳＢウェルに添加した。５０μｌのＤＭＥＭを、Ｂ０ウェルに添加した。５０ｍＬの溶液を、管＃８から取り、そして最低の標準物質ウェル（Ｓ８）の両方に添加した。５０ｍＬを、管＃７から取り、そして次の２つのウェルの各々に添加した。これを、管＃１まで続けた。（８個全ての標準物質について、同じピペットチップを使用して、新たな標準物質の各々をピペットで吸い上げそして出すことによって、この新たな標準物質の各々におけるチップの平衡化を確実にした）。Ｐ２００を使用して、各希釈率の各サンプル（５０μｌ）を、サンプルウェルに添加した。
【００８７】
１２チャネルピペッターを使用して、５０μｌのプロスタグランジンＥ２アセチルコリンエステラーゼトレーサーを、全活性（ＴＡ）ウェルおよびブランク（Ｂ）ウェル以外の各ウェルに添加した。１２チャネルピペッターを使用して、５０μｌのプロスタグランジンＥ２モノクローナル抗体を、全活性（ＴＡ）ウェル、（ＮＳＢ）ウェルおよびブランク（Ｂ）ウェル以外の各ウェルに添加した。このプレートを、プラスチックフィルム（項目＃７）で覆い、そして４℃で１８時間インキュベートした。
【００８８】
このプレートを以下のようにして発色させた：Ｅｌｌｍａｎ試薬の１個の１００μＬバイアル（バイアル＃８）を、５０ｍＬの遠心分離管中で、５０ｍｌの超純水を用いて再構成した。このバイアルを光から保護し、そして同じ日に使用した。ウェルを、１２チャネルピペッターを使用して、洗浄緩衝液で５回洗浄およびリンスした。２００ｍＬのＥｌｌｍａｎ試薬を、１２チャネルピペッターを使用して、各ウェルに添加し、そして５μｌのトレーサーを全活性（ＴＡ）ウェルに添加し、次いで、Ｐ１０ピペットを使用して各ウェルに添加した。このプレートを、プラスチックフィルムで覆い、そして暗室で、６０〜９０分間回転式振盪機に置いた。
【００８９】
このプレートを、４０５ｎｍと４２０ｎｍとの間の単一の波長で、Ｂｉｏ−ｔｅｋプレートリーダーで読みとった。各プレートを読みとる前に、底をキムワイプで拭いた。このプレートは、ウェルの吸光度が０．３から０．８Ａ．Ｕ．の範囲にある時に読みとるべきである。ウェルの吸光度が１．５を越えた場合、これらを洗浄し、そして新たなＥｌｌｍａｎ試薬を添加し、そして再び発色させた。
【００９０】
（相乗効果および組合せ指数の計算）
クルクミノイドとアンドログラホリド（ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）との間の相乗効果を、ＣａｌｃｕＳｙｎ（ＢＩＯＳＯＦＴ、ｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ）を使用して評価した。この統計学パッケージは、Ｔ−Ｃ ＣｈｏｕおよびＰ．Ｔａｌａｌｙ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．４：４５０−４５４）（本明細書中で参考として援用される）により記載される５０パーセント有効法（Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、複数の薬物用量−効果計算を行う。
【００９１】
簡単に述べると、これは、最も簡単な予測様式：ｆａ／ｆｕ＝（Ｃ／Ｃｍ）ｍで、「用量」および「効果」を相関させる。ここで、Ｃは、化合物の濃度または用量であり、そしてＣｍは、可能性を示す５０パーセント有効用量である。Ｃｍは、５０パーセント有効プロットのｘ切片から決定される。試験物質の濃度により影響を受ける因数は、Ｆａであり、そして濃度により影響を受けない部分は、ｆｕ（ｆｕ＝１−ｆａ）である。指数ｍは、用量−効果曲線のＳ字形（ｓｉｇｍｏｉｄｉｃｉｔｙ）または形状を示すパラメーターである。これは、５０パーセント有効プロットの傾きによって推定される。
【００９２】
５０パーセント有効プロットは、ｘ＝ｌｏｇ（Ｃ） 対 ｙ＝ｌｏｇ（ｆａ／ｆｕ）のプロットであり、そしてＣｈｏｕの５０パーセント有効式の対数形態に基づく。この５０パーセント有効式に対するデータの適合度は、５０パーセント有効プロットの線形相関係数ｒによって表される。通常、酵素またはレセプター系からの実験データは、ｒ＞０．９６を有し、組織培養物からの実験データは、ｒ＞０．９０を有し、そして動物系からの実験データは、ｒ＞０．８５を有する。
【００９３】
試験成分の相乗効果は、組合せ指数（ＣＩ）パラメーターを使用して数量化される。Ｃｈｏｕ−ＴａｌａｌｙのＣＩは、多剤効果に基づき、そして酵素動力学モデルから導かれる（Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．およびＴａｌａｌａｙ，Ｐ．（１９７７）Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６４３８−６４４２）。この式は、相乗効果または拮抗作用ではなく、付加的な効果のみを決定する。しかし、本発明者らは、１９８３年にＣｈｏおよびＴａｌａｌａｙ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．（１９８３）４：４５０−４５４）により提案されるように、相乗効果を予測される付加的な効果よりも大きいと規定し、そして拮抗作用を、予測される付加的な効果よりも小さいと規定する。付加的な効果としてのＣＩ＝１の指定を使用して、本発明者らは、同じ作用様式を有する相互排除的な化合物について、または全体的に独立した作用様式を有する相互非排除的な薬物について、以下の関係：ＣＩ＜１，＝１および＞１（これは、それぞれ、相乗作用、相加性および拮抗作用を示す）を得る。
【００９４】
２成分組合せの推定５０パーセント阻害濃度を、以下の関係を使用して推定した：
［１／推定ＩＣ５０］＝［Ａ／ＩＣ５０Ａ］＋［Ｂ／ＩＣ５０Ｂ］
ここで、Ａ＝組合せ中の成分Ａのモル画分であり、そしてＢ＝組合せ中の成分Ｂのモル画分である。
【００９５】
表４は、ＲＡＷ ２６４．７細胞アッセイにおける、ＣＯＸ−２によるＰＧＥ２産生についての、クルクミン抽出物およびホップ抽出物の、観察された５０パーセント阻害濃度および推定５０パーセント阻害濃度を示す。クルクミン抽出物およびホップ抽出物の１０：１の組合せの推定ＩＣ５０は、１．６μｌ／ｍＬであったが、観察された値は、０．７７μｇ／ｍＬ、または２倍以上大きかった。このレベルの差異は、予想外であり、クルクミン抽出物およびホップ抽出物の１：１０の組合せの合わせたＣＯＸ−２阻害活性についての新規な所見を構成する。
【００９６】
（表４．クルクミンおよびホップ抽出物の処方物（１０：１）についての観察および予期された中間阻害濃度）
【００９７】
【表４】
クルクミンとホップ抽出物の１：１０の組み合わせに対するＲＡＷ２６４．７細胞モデル中のＰＥＧ２のＣＯＸ−２産生の阻害の統計的分析を表５に提示する。この組み合わせに対するＣＩは、ＩＣ５０、ＩＣ７５およびＩＣ９０について、それぞれ、０．４９０、０．４７２および０．４５４であった。これらのＣＩ値は、完全用量応答曲線に亘り、クルクミンとホップ抽出物との間の強い相乗効果を示す。
【００９８】
（表５．クルクミンおよびホップ抽出物１：１０の処方物についての組み合わせ指数）
【００９９】
【表５】
クルクミン単独によるＲＡＷ２６４．７細胞モデル中のＣＯＸ−２の中間阻害濃度は、４．０１μｇ／ｍＬであった（表６）。クルクミンによるＣＯＸ−１酵素活性の阻害は、１０．０μｇ／ｍＬのＩＣ５０で幾分より高かった。ホップ抽出物は、０．２１μｇ／ｍＬのＣＯＸ−２によるＰＧＥ２阻害のＩＣ５０、および６．２５μｇ／ｍＬで推定されたＣＯＸ−１酵素阻害のＩＣ５０を示し；クルクミン単独のＣＯＸ−２特異性は２．５であり、そしてホップ抽出物については、それは２９．５であった。クルクミンとホップ抽出物との１１の処方物は、１７．４の中間ＣＯＸ−２特異性で、４８．６〜１１．２の範囲のＣＯＸ−２特異性を示した。クルクミンとホップ抽出物との組み合わせのすべては、予期せぬことに、ＣＯＸ−２の阻害によりＰＧＥ産生を特異的に制限するように設計された薬学的産物に対する最小値として示唆されたわずかな５．０より大きいＣＯＸ−２特異性を示した。この発見は、クルクミンとホップ抽出物との組み合わせが、ＣＯＸ−１阻害で観察されるＧＩ副作用なしに強力な抗炎症性処方物として機能し得ることを示す。
【０１００】
（６．クルクミン、ホップ抽出物ならびに１１のクルクミンおよびホップ抽出物処方物
に対するＣＯＸ−２特異性）
【０１０１】
【表６】
（実施例２）
（外傷後の関節機能の正常化）
食事性補助物質としての本発明の代表的な組成物は、経口処方物、すなわち、以下の組み合わせの１つを供給する錠剤中に存在する：（ａ）１５ｍｇクルクミノイド／ｋｇ・日および６．０ｍｇフムロン／ｋｇ・日；（ｂ）１５ｍｇクルクミノイド／ｋｇ・日および６．０ｍｇウプロン（ｕｐｌｏｎｓ）／ｋｇ・日；（ｃ）１５ｍｇクルクミノイド／ｋｇ・日および６．０ｍｇジヒドロイソフムロン／ｋｇ・日。運動または繰り返し運動ストレスに起因する身体外傷後の関節運動の正常化が、２〜１０用量の後に生ずることが期待される。この結果は、すべての動物において期待される。
【０１０２】
（実施例３）
（しゅさ性挫瘡の処置におけるローション処方物の臨床有効性）
以下：（ａ）０．１重量％クルクミノイドおよび０．５％のフムロン；または（ｂ）０．１重量％クルクミノイドおよび０．５％のルムロンの１つを含むよう設計されたローションを、患者の担当医により診断され、そして独立の広く認定された（ｂｏａｒｄ−ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ）皮膚学者により確認されるように、しゅさ性挫瘡を示す患者の罹患領域に付与する。罹患した表面領域および赤みを定量する研究の１週間前に、自己評価試験が施与される。さらに、類似の変数が、患者の処置状態を知らない専門の臨床スタッフによりスコアされる。これらの評価を、０、７、１４および２１日に繰り返す。
【０１０３】
患者を、試験の開始時に、試験処方物また偽薬にランダムに割り当てる。この試験処方物および偽薬は、１日あたり罹患領域に１または２回付与される。糖尿病、高血圧などの健康状態の処置は、この研究の間許可される。スコアは、４つの観察期間の各々について、試験処方物と偽薬との間で統計的に比較される。ローション処方物中の本発明の組成物で処理された患者は、患者のスコアが、評価される各カテゴリー内で、予備試験されたスコアから２０％より大きく改善されるとき、改善されると考えられる。改善を示す人の％を、組み合わせ処方物と偽薬コントロールとの間で比較する。２つの群間の差異は、真実であるときのゼロ仮説を拒絶する確率が５％未満である場合、統計的に有意であると考えられる。
【０１０４】
（実施例４）
（乾癬の処置におけるローション処方物の臨床的有効性）
組成物が、患者の担当医により診断され、そして独立の広く認定された皮膚学者によりされ確認されるように、乾癬を示す患者の罹患領域に付与することを除いて、実施例３に記載のと同じよう様式でこの実施例を実施する。罹患した表面領域および皮膚状態を定量する研究の１週間前に、自己評価試験が施与される。さらに、類似の変数が、患者の処置状態を知らない専門の臨床スタッフによりスコアされる。これらの評価を、０、７、３０および６０日に繰り返す。
【０１０５】
患者を、試験の開始時に、試験処方物また偽薬にランダムに割り当てる。この試験処方物および偽薬は、１日あたり罹患領域に１または２回付与される。糖尿病、高血圧のような健康状態の処置は、この研究の間許可される。スコアは、４つの観察期間の各々について、試験処方物と偽薬との間で統計的に比較される。試験ローション処方物としての本発明の組成物で処理された患者は、患者のスコアが、評価される各カテゴリー内で、予備試験されたスコアから２０％より大きく改善されるとき、改善されると考えられる。改善を示す人の％を、試験処方物と偽薬コントロールとの間で比較する。２つの群間の差異は、真実であるときのゼロ仮説を拒絶する確率が５％未満である場合、統計的に有意であると考えられる。
【０１０６】
（実施例５）
（アルツハイマー病の処置における処方物の臨床的有効性）
実施例２に記載のような経口処方物が、患者の担当医により診断され、そして独立の広く認定された神経学者により確認されるように、アルツハイマー病（ＡＤ）の初期段階を示した患者に投与される。臨床試験の２週間前に、患者は、ミニメンタル状態試験（ＭＭＳＥ）、アルツハイマー病評価スケール（ＡＤＡＳ）、ボストンネーミング試験（ＢＮＴ）、およびトーケン試験（ＴＴ）のような適切な精神神経学的試験を受ける。精神神経学的試験は、臨床試験の０日、６週および３ヶ月で繰り返される。これらの試験は、患者の処置状態を知らない精神神経学者により実施される。
【０１０７】
患者を、試験の開始時に、試験処方物また偽薬にランダムに割り当てる。この試験処方物および偽薬は、１日あたり１または２回経口摂取される。糖尿病、高血圧などのような状態の処置は、この研究の間許可される。スコアは、３つの観察期間の各々について、試験処方物と偽薬との間で統計的に比較される。処置なしでは、ＡＤの自然の経過は、臨床試験の経過の間は、試験スコアで有意な悪化がある。試験処方物として本発明の組成物で処理された患者は、臨床試験の経過の間に同じままか、または改善する場合、改善されると考えられる。
【０１０８】
（実施例６）
（結腸癌の処置および予防における経口処方物）
実施例２に記載のような経口処方物が、患者自身の担当医により診断され、そして独立の広く認定された癌学者により確認されるように、結腸癌の初期段階を示した患者に投与される。
【０１０９】
患者を、試験の開始時に、試験処方物また偽薬にランダムに割り当てる。この試験処方物および偽薬は、１日あたり１または２回経口摂取される。糖尿病、高血圧などのような状態の処置は、この研究の間許可される。内視鏡評価を、１、２、６および１２ヶ月で行う。４つのフォローアップ臨床訪問のいずれか１つの間で腫瘍の再出現の証拠は、処置失敗と考えられる。処置失敗の％は、試験処方物と偽薬コントロールとの間で比較される。記載される実験条件の下では、試験物質は、コントロール群に対し腫瘍発生率を低減することが予期される。２つの群間の差異は、真実であるときのゼロ仮説を拒絶する確率が５％未満である場合、統計的に有意であると考えられる。
【０１１０】
（実施例７）
（過敏性大腸症候群の処置のための経口処方物）
実施例２に記載のような経口処方物が、患者の担当医により診断されるように、過敏性大腸症候群を示した患者に投与される。正常な大腸機能が２４時間以内に回復される。
【０１１１】
（実施例８）
（変形性関節症における関節機能の正常化）
実施例２に記載の組成物を用い、変形性関節症に起因する関節剛直性の正常化が、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸の存在下または不在下で、５〜１２用量の後生じる。さらに、この組成物は、伝統的な非ステロイド系抗炎症剤とは異なり、これら２つのプロテオグリカン成分の正常な関節再構築効果を妨害しない。
【０１１２】
要するに、特定の実施形態は、誘導性ＣＯＸ−２活性の阻害のための組成物であって、ＣＯＸ−１活性に対しては最小の影響を有し、この組成物は、第１の成分として有効量のクルクミノイド種、ならびにα酸種およびβ酸種またはそれら誘導体からなる群から選択される有効量の第２の成分を含む。好ましくは、このクルクミノイド種は、クルクミン、デメトキシクルクミン、またはビスデメトキシクルクミンである。好ましくは、α酸種は、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン、アドフムロン、キサントフモルＡ、またはキサントフモルＢである。好ましくは、β酸種は、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロコルプロンまたはジヒドロイソフムロンである。本組成物の第１または第２の成分は、薬学的等級であり得るか、かつまたは植物（単数または複数）または植物抽出物（単数または複数）に由来し得る。この第１または第２の成分はまた、モノサッカリドまたはジサッカリド、アミノ酸、スルフェート、スクシネート、アセテートまたはグルタチオンのような化合物との結合体に由来し得る。好ましい実施形態の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に処方され得、そして抗酸化剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質、炭水化物、グルコサミン、コンドロイチン硫酸またはアミノ糖のような添加物を含む。
【０１１３】
その他の実施形態は、好ましい実施形態の組成物の栄養補助の方法を含み、炎症の症状を患う動物中の症状を低減する。この組成物は、上記投与が、約０．００１〜約３０．０ｍｇ／ｋｇ体重／日の各クルクミノイド種、および約０．５〜約２０．０ｍｇ／ｋｇ体重／日のα酸種またはβ酸種を提供するような投薬形態で処方される。この組成物は、約０．１〜約５０μＭの各クルクミノイド種、および約０．００１〜約５０μＭの各α酸種またはβ酸種の血清濃度を維持するに十分な量で投与される。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、トリ、爬虫類、両生類、ウマまたは反芻動物であり得る。投与は、経口送達系、非経口送達系、局所送達系、経皮系または経粘膜送達系であり得る。
【０１１４】
従って、教示される種々の処方物の中で、第１の成分としてのクルクミノイド、およびα酸およびβ酸からなる群から選択される第２の成分を含む処方物が開示されている。これらの組み合わせは、生物学的因子または未知の病因に起因する、物理的または化学的損傷あるいは異常免疫刺激に応答する相乗的抗炎症性効果を提供し得る。自明な性質の種々の変更および改変が、本発明の意図から逸脱することなくなされ得、そしてすべてのこのような変更および改変が、添付の請求項により規定されるような本発明の範囲内に入ると考えられることは当業者に容易に明らかである。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般的に、誘導性シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現および／または活性の相乗的阻害を示す組成物に関する。本組成物は、構成性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１）に対してほとんど有意な効果を有さないかまたは全く有意な効果を有さずに誘導性シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現および／または活性を相乗的に阻害するように機能し得る。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の記載）
炎症性疾患は、５千万人を超えるアメリカ人に影響を及ぼす。最近の１０年〜１５年の間の分子免疫学および細胞免疫学における基礎研究の結果として、これらの免疫学ベースの疾患の診断、治療および予防に対するアプローチが、劇的に変化した。この１つの例は、シクロオキシゲナーゼ酵素の誘導性形態の発見である。最初に、１９７６年に精製され、そして１９８８年にクローン化された構成性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）は、アラキドン酸（ＡＡ）由来のプロスタグランジン（ＰＧ）の合成において機能する。この精製から３年後、ＣＯＸ活性を有する誘導性酵素は、同定され、ＣＯＸ−２の名を与えられた一方、構成性ＣＯＸは、ＣＯＸ−１と称された。
【０００３】
ＣＯＸ−２遺伝子発現は、前炎症性サイトカインおよび成長因子の制御下にある。従って、この影響は、ＣＯＸ−２が細胞増殖の炎症および制御の両方において機能することである。ＣＯＸ−２が、多くの組織において誘導性である一方、疼痛および熱に対する神経伝達において機能し得る、脳および脊髄において構成的に存在する。ＣＯＸの２つのアイソフォームは、構造がほぼ同一であるが、基質およびインヒビターならびにこれらの細胞内位置において重要な差異を有する。胃壁の完全性を保護し、欠陥腎臓において正常な腎機能を維持する保護的ＰＧは、ＣＯＸ−１によって合成される。他方、免疫細胞においてＣＯＸ−２によって合成されるＰＧは、炎症プロセスに対して中枢である。
【０００４】
炎症処置のための理想的な処方物は、ＣＯＸ−１の活性に影響を与えずにＣＯＸ−２の誘導および活性を阻害する。しかし、従来の非ステロイド性薬物およびステロイド性抗炎症性薬物は、ＣＯＸ−１に影響せずにＣＯＸ−２を阻害する特異性を欠き、長期間使用される場合、胃腸管系に対して障害を生じる危険性がある。
【０００５】
多くの研究は、胃腸管（ＧＩ）副作用の相対的発生率が、薬剤の相対的ＣＯＸ−２特異性に関連し得ることを示した。ＣＯＸ−２に対する特異性がＣＯＸ−１より高ければ高いほど、ＧＩ不調の発生率がより低くなる。従って、わずか０．６のＣＯＸ−２特異性を有するアスピリンは、ほぼ３．０の報告されたＣＯＸ−２特異性を有するクルクミノイドよりも大きなＧＩ窮迫の発生率を生じる。しかし、ＧＩ不調の確立を有意に減少するために必要な一般的に受容されるＣＯＸ−２特異性は、５．０である。
【０００６】
従って、ＣＯＸ−２酵素活性の発現を特異的に阻害または防止するが、ＣＯＸ−１代謝に対してほとんど効果を有さないかまたは効果を全く有さない組成物を同定することは、有用であり、その結果、有害な副作用を有さない有意に低い用量または現在の臨床用量で使用し得る。
【０００７】
医師は、一般的に、変形性関節症の治療のための非ステロイド性抗炎症性薬物およびステロイド性抗炎症性薬物を使用する。しかし、これらの薬物は、長期療法にはそれほど適合しない。なぜなら、これらは、軟骨を補助（ｐｒｏｍｏｔｅ）し、そして保護する能力を欠くだけではなく；これらは、軟骨の変性またはその合成の低下を実際に導き得る。さらに、ほとんどの非ステロイド性抗炎症性薬物は、長期間使用される場合、胃腸管系を損傷する。従って、関節炎に対する新規処置は、緊急に必要とされる。
【０００８】
グルコサミンの関節保護特性によって、以下の２つの欠点を除いて、変形性関節症のための興味深い治療剤になる：（ｉ）グルコサミン処置に対する応答の速度が、抗炎症性薬物を用いた処置より遅い、そして（ｉｉ）グルコサミンは、変性の寛解の予想を満たさない可能性がある。非ステロイド性抗炎症性薬剤とグルコサミンとを比較する研究において、例えば、１日当たり１５００ｍｇのグルコサミン硫酸を１２００ｍｇのイブプロフェンと比較する二重盲式研究は、最初の２週間の間、グルコサミン処置患者においてよりも、イブプロフェン患者において、疼痛スコアをより早く減少したことを示した。しかし、疼痛スコアの減少は、グルコサミンを受容した患者において試行期間の間ずっと続き、２つの群の間の差異は、第８週までにグルコサミンの方に有意に傾いた。非特許文献１。従って、グルコサミンは、関節炎の疼痛および炎症を軽減し得るが、利用可能な抗炎症性薬物より速度がより遅い。
【０００９】
さらに、現在利用可能なグルコサミン処方物は、変形性関節症および慢性関節リウマチの根源的な原因を、最適に攻撃および緩和するようには処方されてこなかった。また、多くの市販されるハーブの補助物質および食事性補助物質とは違って、利用可能な処方物は、用法の歴史を有さず、これらの安全性および効力を保証し得る制御された臨床試験の歴史も有さない。
【００１０】
軟骨代謝の標準化または変形性関節症の処置のための理想的な処方物は、強力な抗炎症性活性を有する十分な軟骨保護を提供する。変形性関節症のための最適食事性補助物質は、グルコサミンによって提供される一般的な関節復元の質を強化し、任意の有害な副作用を誘導することなく、炎症応答を低減する。これは、安価に作製され、そして全ての政府の規制に従う。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｏｐｅｓ Ｖａｚ，Ａ．，（１９８２），「Ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｋｎｅｅ ｉｎ ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔｓ，８」，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｏｐｉｎ．１４５−１４９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
従って、ＣＯＸ−１に対してほとんど効果を有さないかまたは全く効果を有さずに、ＣＯＸ−２によるプロスタグランジン合成を、特異的に阻害または防止する化合物の天然の処方物を同定することは、有用である。関節組織の健康状態の保護、関節炎または他の炎症性状態の処置に有用である、このような処方物は、以前に発見されなかった。用語「特異的または選択的なＣＯＸ−２インヒビター」は、ＣＯＸ−１よりＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物または混合物を含む。好ましくは、化合物は、ＣＯＸ−１の阻害に関して中間有効濃度より少なくとも５倍大きい、ＣＯＸ−２阻害に関する中間有効濃度を有する。例えば、試験処方物のＣＯＸ−２に対する中間阻害濃度が０．２μｇ／ｍＬであった場合、処方物は、ＣＯＸ−１に対する中間阻害濃度が１μｇ／ｍＬ以上にならない限り、ＣＯＸ−２特異的であるとはみなされない。
【００１３】
好ましい実施形態は、第１の成分としてのクルクミノイド（ｃｕｒｃｕｍｉｎｏｉｄ）種およびクルクミノイドの抗炎症性効果を相乗作用的に増強し得る第２の化合物を含有する組成物を提供する。この組成物は、クルクミノイド種を含む有効量の第１の成分ならびにα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第２の成分を含有する。特定の実施形態において、α酸は、フムロン（ｈｕｍｕｌｏｎｅ）である。別の実施形態において、β酸は、ルプロン（ｌｕｐｕｌｏｎｅ）である。別の実施形態において、クルクミノイドは、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）である。
【００１４】
特定の実施形態において、この組成物は、グルコサミンおよびコンドロイチン硫酸からなる群から選択されるメンバーをさらに含有する。
【００１５】
好ましい実施形態はまた、動物における炎症または炎症ベースの疾患を処置する方法を提供し、この方法は、クルクミノイド種を含む有効量の第１の成分ならびにα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第２の成分を含有する組成物を、炎症の症状を罹患する動物に提供する工程を包含する。
【００１６】
好ましい実施形態はまた、動物における変形性関節症の症状を低減する方法を提供し、この方法は、クルクミノイド種を含む有効量の第１の成分ならびにα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含む第２の成分を含有する組成物を、炎症の症状を罹患する動物に提供する工程を包含する。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
有効量の第１の成分および第２の成分を含有する組成物であって、当該第１の成分が、クルクミノイド種を含有し、当該第２の成分が、α酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含有する、組成物。
・（項目２）
項目１に記載の組成物であって、上記α酸が、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン、アドフルポン、キサントフルポンＡおよびキサントフルポンＢからなる群から選択される、組成物。
・（項目３）
上記α酸が、フムロンである、項目２に記載の組成物。
・（項目４）
項目１に記載の組成物であって、上記β酸が、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン、ヘキサジドロコルプロン、およびジヒドロイソフムロンからなる群から選択される、組成物。
・（項目５）
上記β酸が、ルプロンである、項目４に記載の組成物。
・（項目６）
項目１に記載の組成物であって、上記α酸またはβ酸が、モノサッカリドまたはジサッカリド、アミノ酸、脂肪酸、スルフェート、スクシネート、アセテート、およびグルタチオンからなる群から選択される、組成物。
・（項目７）
上記第２の成分が、ホップから抽出される、項目１に記載の組成物。
・（項目８）
上記抽出が、超臨界ＣＯ２によって実施される、項目７に記載の組成物。
・（項目９）
項目１に記載の組成物であって、上記クルクミノイドが、クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、シス−トランス−クルクミン、およびシクロクルクミンからなる群から選択される、組成物。
・（項目１０）
上記クルクミノイドが、クルクミンである、項目９に記載の組成物。
・（項目１１）
項目１に記載の組成物であって、上記クルクミノイドが、モノサッカリドまたはジサッカリド、アミノ酸、脂肪酸、スルフェート、スクシネート、アセテート、およびグルタチオンからなる群から選択される化合物に結合体化される、組成物。
・（項目１２）
上記第１の成分が、合成化合物である、項目１に記載の組成物。
・（項目１３）
上記第２の成分が、合成化合物である、項目１に記載の組成物。
・（項目１４）
上記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアで処方される、項目１に記載の組成物。
・（項目１５）
グルコサミンおよびコンドロイチン硫酸からなる群から選択されるメンバーをさらに含有する、項目１に記載の組成物。
・（項目１６）
抗酸化剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質、炭水化物、およびアミノ糖からなる群から選択されるメンバーをさらに含有する、項目１に記載の組成物。
・（項目１７）
動物における炎症または炎症ベースの疾患の処置における使用のための、項目１に記載の組成物。
・（項目１８）
動物における変形性関節症の症状を低減する使用のための、項目１に記載の組成物。
・（項目１９）
動物における炎症または炎症ベースの疾患の処置のための医薬の調製のための項目１の組成物の使用。
・（項目２０）
項目１９に記載の使用であって、上記組成物が、投薬形態で処方され、当該投薬形態において、投与が、第１の成分および第２の成分を提供し、当該第１の成分が、１日当たり動物の体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約３０ｍｇであり、当該第２の成分が、１日当たり動物の体重１ｋｇ当たり約０．５〜約２０ｍｇである、使用。
・（項目２１）
項目１９に記載の使用であって、ここで、上記投与が、経口送達、非経口送達、局所的送達、経皮的送達、および経粘膜的送達からなる群から選択される手段による、使用。
・（項目２２）
項目２１に記載の使用であって、ここで、上記局所適用の処方箋が、約０．００１重量％〜約１重量％の第１の成分および約０．０２５重量％〜約１重量％の第２の成分を提供する、使用。
・（項目２３）
項目２２に記載の使用であって、ここで、上記局所適用の処方箋が、約０．０１重量％〜約１重量％の第１の成分および約０．０５重量％〜約１重量％の第２の成分を提供する、使用。
・（項目２４）
動物における変形性関節症の症状を低減するための医薬の調製のための項目１の組成物の使用。
・（項目２５）
項目２４に記載の使用であって、ここで、上記組成物が、グルコサミンおよびコンドロイチン硫酸からなる群から選択されるメンバーをさらに含有する、使用。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１［Ａ］〜１［Ｆ］は、［Ａ］クルクミノイド類の一般的な化学構造、ならびに［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］および［Ｆ］は、それぞれ、クルクミノイド類内の種として、クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、クルクミンのシス−トランス幾何異性体、およびシクロクルクミンの一般的な化学構造、を示す。
【図２】図２［Ａ］および［Ｂ］は、それぞれ、α酸類およびα酸類内の種として、フムロンの一般的な化学構造を示す。
【図３】図３［Ａ］および［Ｂ］は、それぞれ、β酸類およびルプロンの一般的な化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を含むことに留意しなければならない。
・好ましい実施形態は、ＣＯＸ−２の発現および／または活性に対して相乗的阻害効果を有する組成物を提供する。より詳細には、この組成物は、以下により詳細に記載されるように、第１の成分としてクルクミノイドを、そして第２の成分としてα酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるメンバーを含有する。好ましい実施形態において提供される組成物は、食事性補助物質または治療組成物として処方され得る。組成物は、ＣＯＸ−１に対して有意な効果を有さずに、ＣＯＸ−２の誘導性および／または活性を相乗的に阻害するように機能し得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「食事性補助物質」とは、生理学の構造的変化または機能的変化に影響を及ぼすために消費される組成物をいう。用語「治療組成物」とは、疾患を処置または予防するために投与される任意の化合物をいう。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「クルクミノイド」および「活性クルクミノイド」とは、ＣＯＸ−２の誘導性および／または活性を阻害し得るが、ＣＯＸ−１に対してほとんど効果を有さないかまたは全く効果を有さないクルクミノイド類内の種、あるいは炎症性応答の重篤度を抑制し得るかまたは低減し得るクルクミノイド類内の種、をいう。クルクミノイドは、天然産物から抽出され得るかまたは化学合成され得る。
【００２１】
Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａの根茎から単離された黄色色素の画分は、ジシナモイルメタン基に属するクルクミノイドを含有する。クルクミノイドは、３〜５％の程度まで存在する。これらは、最も重要な活性成分であると考えられ、そしてＣｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａの生物学的活性を担うと考えられる。これらの主要な活性は抗炎症性であるが、クルクミノイドは、同様に、抗酸化性、抗アレルギー性、創傷治癒、抗痙攣性、抗菌性、抗真菌性および抗腫瘍活性を保有することが報告されている。クルクミン（図１Ｂ）は、１８１５年に単離され、１９１０年に構造的に規定された。Ｃｕｒｃｕｍ ｌｏｎｇａから単離された他のクルクミノイドとしては、デメトキシクルクミン（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）（図１Ｃ）、ビスデメトキシクルクミン（ｂｉｓｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）（図１Ｄ）、クルクミンのシス−トランス幾何異性体（図１Ｅ）、およびシクロクルクミン（ｃｙｃｌｏｃｕｒｃｕｍｉｎ）（図１Ｆ）が挙げられる。クルクミノイドは、Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａの他に他の植物種（例えば、Ｃｕｒｃｕｍａ ｘａｎｔｈｏｒｒｈｉｚａおよびＣｕｒｃｕｍａ ｚｅｄｏａｒｉａ）において見出され得る。
【００２２】
クルクミノイドは、これらの抗炎症性活性について周知である。Ｔｕｍｅｒｉｃは、Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ医薬において使用される最も古い抗炎症性薬物の１つである。クルクミノイドの抗炎症性活性は、炎症反応モデル（例えば、カラゲニン、コットンペレット（ｃｏｔｔｏｎ ｐｅｌｌｅｔ）、ホルムアルデヒドおよび肉芽腫嚢のような化学的刺激原または物理的刺激原）において評価される。ヒトの二重盲式の臨床試行は、５〜６週間の間、１２００ｍｇのクルクミノイド／日の用量で、慢性関節リウマチにおける効力を示した。しかし、これらの用量で、胃腸管（ＧＩ）不快感および胃刺激の徴候が、しばしば報告される。高用量のクルクミノイドによって引き起こされるＧＩ不調および胃刺激は、クルクミノイドが、アスピリンおよびアスピリン様抗炎症性薬剤と類似する様式でプロスタグランジン産生に作用するという事実に起因し得る。
【００２３】
好ましくは、図１［Ａ］に示され、そして図１［Ｂ］中のクルクミンによって特に例示されるようなクルクミノイド類は、例えば、Ｓａｂｉｎｓａ（１２１ Ｅｔｈｅｌ Ｒｏａｄ Ｗｅｓｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から市販入手され得るような、薬学的等級の植物性抽出物である。使用され得る他のクルクミノイドとしては、デメトキシクルクミン（図１［Ｃ］）、ビスデメトキシクルクミン（図１［Ｄ］）、シス−トランスクルクミン（図１［Ｅ］）、およびシクロクルクミン（図１［Ｆ］）が挙げられる。使用されるクルクミノイドは、Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ Ｌ．から容易に得られ得る。薬学的等級のクルクミノイド抽出物は、約７０％を超えるクルクミノイド含量を有するように標準化される。薬学的な植物性等級の抽出物は、好ましくは、徹底的な安全性手順および効力手順を通過するべきである。好ましい実施形態において使用される場合、この抽出物は、約１〜９９重量％のクルクミノイド含量を有する。好ましくは、最小クルクミノイド含量は、約７０重量％である。あるいは、クルクミノイドは、化学合成において公知の標準的技術を使用して合成され得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ホップ（ｈｏｐ）抽出物」とは、（１）ホップ植物産物を溶媒に曝す工程、（２）ホップ植物産物を溶媒から分離する工程、および（３）溶媒を除去する工程から生じる固体物質をいう。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「溶媒」とは、ホップ植物産物から固体物質を抽出するために必要な特徴を保有する水性または有機性の液体をいう。溶媒の例としては、水、蒸気、過剰加熱水、メタノール、エタノール、ヘキサン、クロロホルム、液体ＣＯ２、液体Ｎ２、またはこれらの物質の任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＯ２抽出物」とは、ホップ植物産物を、液体または超臨界的ＣＯ２調製物に曝し、その後をＣＯ２除去する工程から得られる固体物質をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「α酸」とは、ホップ植物産物から単離される化合物をいい、これらとしては、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン（ｈｕｌｕｐｏｎｅ）、アドフムロン、キサントフモル（ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ）ＡおよびキサントフモルＢが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「β酸」とは、ホップ植物産物から単離される化合物をいい、これらとしては、ルプロンとして集合的に公知の化合物をいい、これらとしては、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン、およびヘキサヒドロコルプロンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「重要な油画分」とは、ミルセン（ｍｙｒｃｅｎｅ）、フムレン（ｈｕｍｕｌｅｎｅ）、β−カリオフィリーン（ｃａｒｙｏｐｈｙｌｅｅｎ）、ウンデカン−２−オン、および２−メチル−ブト−３−エン−オールを含む成分の複合混合物をいう。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「脂質」とは、脂肪酸のトリアシルグリセロールエステルをいう。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「ろう」は、トリアシルグリセロールエーテルまたは極端に長い鎖（＞２５炭素）の脂肪族アルコールもしくは脂肪酸のエステルをいう。
【００３２】
１つの形態または別の形態中のホップ抽出は、水およびエタノール中への抽出がまず試行された１９世紀初期まで１５０年以上遡る。今日でさえも、エタノール抽出は、ヨーロッパで利用可能であるが、はるかに広く行われている抽出は、有機溶媒（ヘキサン）抽出およびＣＯ２抽出（超臨界的かつ液体）である。ＣＯ２（代表的には、６０バールの圧力かつ５〜１０℃で）は、液体状態で存在し、そしてホップ軟質樹脂および油に対して高度に特異的な、比較的穏やかな非極性溶媒である。臨界点を超えると、代表的には、３００バールの圧力および６０℃で、ＣＯ２は、気体および液体の両方の特徴を有し、さらにより強い溶媒である。種々の抽出物の適切な成分が、表１において比較される。
【００３３】
（表１．ホップ抽出物（パーセント Ｗ／Ｗ）
【００３４】
【表１】
最も単純な場合、ホップ抽出は、ホップを粉砕する工程、ペレット化する工程、そして再粉砕し、ホップ腺を広げる工程、溶媒を充填されたカラムを通過させ、樹脂成分を回収する工程、最後に、溶媒を除去し、全樹脂抽出物または「純粋」樹脂抽出物を得る工程を包含する。
【００３５】
主要な有機抽出物は、強い溶媒であり、実質的に全てのホップ腺成分に加えて、これらは、植物色素、クチクラろう、水および水溶性物質を抽出する。
【００３６】
超臨界ＣＯ２は、有機溶媒より選択的であり、少量のタンニンおよびろうならびにより少量の水、従って水溶性成分を抽出する。これは、クロロフィルのようないくらかの植物色素を抽出するが、有機溶媒が抽出するよりは少ない。液体ＣＯ２は、ホップに使用するために商業的に使用される最も選択的な溶媒であり、従って、最も純粋な全樹脂および油抽出物を生成する。これは、硬質樹脂もタンニンも抽出せず、かなりより少量の植物ろうを抽出し、植物色素は抽出せず、そしてより少量の水および水溶性物質を抽出する。
【００３７】
この選択性およびより穏やかな溶媒特性の結果として、ホップ単位重量当たりの液体ＣＯ２抽出物の絶対収量は、他の記載された溶媒を使用する場合よりも少ない。さらに、液体ＣＯ２でのα酸の収量（約８９〜９３％）は、超臨界ＣＯ２（約９１〜９４％）または有機溶媒（約９３〜９６％）よりも少ない。抽出の後、溶媒除去のプロセスを行い、有機溶媒に対する溶媒除去は、加熱し揮発させる工程を包含する。このことにも関わらず、微量の溶媒が、抽出物に残る。しかし、ＣＯ２の除去は、圧力を緩め、ＣＯ２を揮発させる工程を単に包含する。
【００３８】
好ましい実施形態において、α酸、β酸、またはこれらの誘導体は、ホップから抽出され得るか、または化学合成され得る。好ましくは、α酸、β酸、またはこれらの誘導体は、ホップから抽出され、より好ましくは、超臨界ＣＯ２によって抽出される。
【００３９】
好ましくは、図２［Ａ］によって示され、特に図２［Ｂ］におけるフムロンによって例示されるようなα酸類、および図３［Ａ］によって示され、特にルプロン（図３［Ｂ］）によって例示されるようなβ酸類は、薬学的等級調製物であり、例えば、Ｈｏｐｕｎｉｏｎ（Ｙａｋｉｍａ，ＷＡ）から市販入手され得る。
【００４０】
骨吸収インヒビターとしてのホップ抽出物由来のフムロンの同定は、Ｔｏｂｅ，Ｈら１９９７に報告される［Ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｏｐ ｅｘｔｒａｃｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ６１（１）１５８−１５９］。同じグループの後の研究によって、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＴＮＦα刺激後の、ＣＯＸ−２遺伝子転写の阻害として、フムロンの作用の機構が特徴付けられた［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．２０００．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍｕｌｏｎ ｏｆ ｂｅｅ ｈｏｐ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４６５：１０３−１０６］。しかし、これらの参考文献は、骨粗鬆症およびＣＯＸ−２遺伝子転写の適用のためのみのフムロンの使用を開示する。
【００４１】
好ましい実施形態は、クルクミノイド分子を改変し、より高い効力およびより低い毒性を達成する工程ならびに相乗的な様式で作用する第２の成分を添加する工程を提供する。従って、好ましい実施形態は、クルクミノイドを、α酸、β酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択される第２の分子と組み合わせる場合、この組合せが、標的細胞において相乗効果を生じるという発見に関する。１つのこのような相乗的応答は、誘導性ＣＯＸ−２の特異的阻害である。
【００４２】
各類内の代表的な種は、表２に列挙される。表２における各類の項目下で列挙される種の中で、少なくとも１つのアステリスク（＊）を含む種は、好ましく、２つのアステリスク（＊）を含む種は、特に好ましい。
【００４３】
（表２．組成物の成分）
【００４４】
【表２】
好ましくは、好ましい実施形態は、活性クルクミノイドおよびホップ抽出物の成分またはこれらの誘導体を使用する。本明細書中で使用される場合、用語「活性クルクミノイド」、「ホップ抽出物の活性成分」またはこれらの誘導体は、ＣＯＸ−２の誘導性および／または活性を阻害し得るが、ＣＯＸ−１に対してほとんど効果を有さないかまたは全く効果を有さないか、あるいは炎症性応答の重篤度を防止し得るかまたは低減し得る、それぞれの類の範囲内の天然に存在する種または合成誘導体をいう。
【００４５】
好ましい実施形態はまた、クルクミノイド、α酸およびβ酸またはこれらの誘導体の結合体を使用し得る。クルクミノイド、α酸およびβ酸またはこれらの誘導体の「結合体」は、モノサッカリドまたはジサッカリド、アミノ酸、スルフェート、スクシネート、アセテートおよびグルタチオンからなる群から選択されるメンバーを共有結合するかまたはこれらと結合体化される、クルクミノイド、α酸、およびβ酸を意味する。好ましくは、モノサッカリドまたはジサッカリドは、グルコース、マンノース、リボース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、マルトース、およびフルクトースからなる群から選択されるメンバーである。
【００４６】
特定の実施形態は、有効量のクルクミンならびにフムロンおよびルプロンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含有する組成物である。
【００４７】
α酸またはβ酸によるＣＯＸ−２酵素活性の阻害は、クルクミノイドとの二重の相乗効果を提供し得る。従って、α酸およびβ酸からなる群から選択される第２の化合物は、クルクミノイドの抗炎症性活性を増大し得る。好ましい実施形態の組成物の結果は、通常必要とされるよりも低い用量のクルクミノイドでのＣＯＸ−２の活性に対するより選択的な効果である。所望のＣＯＸ−２阻害を達成するようにクルクミノイドの用量を減少することによって、この化合物からの副作用の可能性は、ほとんど指数関数的に減少する。α酸およびβ酸からなる群から選択される第２の化合物は、利益を提供し得、この利益としては、例えば、肝臓保護、抗腫瘍促進、抗高脂質血症、抗高血糖症（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｒｍｉａ）およびクルクミノイドによるＣＯＸ−１阻害由来の潰瘍形成に対する保護であるがこれらに限定されない。
【００４８】
好ましくは、好ましい食事性補助物質の一日用量（ｍｇ／ｋｇ−日）は、動物の体重の１ｋｇ当たり、約０．００１〜約３０ｍｇクルクミノイド、および約０．５〜約２０．０ｍｇのα酸またはβ酸を送達するように処方される。
【００４９】
局所適用のための好ましい実施形態の組成物は、以下の１つを含有する：約０．００１〜約１重量％、好ましくは約０．０１〜約１重量％のクルクミノイド、および約０．０２５〜約１重量％、好ましくは約０．０５〜約１重量％のα酸またはβ酸。
【００５０】
好ましい実施形態の組成物は、以下の範囲の血清濃度を生じる：約０．０００１〜約１０μＭのクルクミノイド、および約０．００１〜約１０μＭのα酸またはβ酸。
【００５１】
好ましい実施形態において、組成物は、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸をさらに含有し得る。グルコサミンは、一般的に、変形性関節症の処置に対して有効であり、そして安全であるとして受け入れられる。従って、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸をさらに含有する組成物は、関節機能の正常化または変形性関節症の症状を低減するのを補助し得る。
【００５２】
クルクミノイドとα酸、β酸または誘導体との組み合わせに加えて、食事性適用のための本組成物は、種々の添加物（例えば、他の天然の中間代謝物の成分、抗酸化剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質、炭水化物、およびアミノ糖であるがこれらに限定されない）および不活性成分（例えば、タルクおよびステアリン酸マグネシウム（これらは、錠剤およびカプセル剤の製造において標準的な賦形剤である））を含有し得る。
【００５３】
好ましい実施形態の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。本明細書中で使用されるように、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤および吸収遅延剤、甘味剤などを含む。これらの薬学的に受容可能なキャリアは、広範な材料から調製され得、このような材料としては、希釈剤、結合剤および接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、バルキング剤、嬌味嬌臭剤、甘味剤および特定の治療組成物を調製するために必要とされ得る雑材（例えば、緩衝剤および吸収剤）が挙げられるが、それらに限定されない。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。いかなる従来の媒体または薬剤も活性成分と不適合性でない限り、好ましい実施形態におけるその使用が企図される。１つの実施形態では、タルク剤およびステアリン酸マグネシウムが、処方物中に含まれる。好ましい成分は、Ａｓｔａｃ Ｂｒａｎｄ ４００ ＵＳＰタルク粉末および実際等級（ｖｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｒａｄｅ）のステアリン酸マグネシウムである。食用バーまたは機能的食品としてのこの組成物の製造に影響することが公知の他の成分としては、フレーバリング、糖、アミノ糖、タンパク質、および／または化工澱粉、ならびに脂肪および油が挙げられ得る。
【００５４】
好ましい実施形態の食事性補助物質、ローション、または治療組成物は、当業者によって公知である任意の様式で処方され得る。１つの実施形態では、組成物は、当業者に利用可能な技術を用いてカプセルまたは錠剤に処方され得る。カプセルまたは錠剤の形態では、成人または成体動物にとって推奨された一日用量が、好ましくは、１〜６のカプセルまたは錠剤に含有される。しかし、本発明の組成物はまた、他の便宜的な形態で処方され得る。このような形態としては、例えば、注射溶液または懸濁液、スプレー溶液または懸濁液、ローション、ガム、ロゼンジ、食品または軽食品目が挙げられる。食品、軽食、ガムまたはロゼンジ品目は、任意の摂取可能な成分を含み得、このような成分としては、甘味剤、フレーバリング、油、澱粉、タンパク質、果実もしくは果実抽出物、野菜もしくは野菜抽出物、穀物、動物脂、またはタンパク質が挙げられる。従って、本組成物は、シリアル、軽食品目（例えば、チップス、バー、ガムドロップ、チューイングキャンデー、または緩慢に溶解するロゼンジ）に処方され得る。好ましい実施形態は、炎症ベースの疾患（急性および慢性の両方）の全ての型の処置を企図する。本発明は、炎症応答を減少させ、そしてそれにより罹患組織の治癒を促進するか、または罹患組織へのさらなる損傷を防ぐ。薬学的に受容可能なキャリアはまた、本発明の組成物および処方物において使用され得る。
【００５５】
好ましい実施形態によれば、動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、トリ、ウマ、反芻動物、または他の温血動物からなる群から選択されるメンバーであり得る。好ましい実施形態は、主としてヒトの処置に関する。投与は、当業者に利用可能な任意の方法によって、例えば、経口経路、局所経路、経皮経路、経粘膜経路、または非経口経路によって、であり得る。
【００５６】
以下の表３は、ＣＯＸ−２酵素発現および活性が役割を果たし得、従って、好ましい実施形態の組成物による正常化または処置の適切な標的である疾患のリストを提供する。
（表３：ＣＯＸ−２関連疾患）
【００５７】
【表３】
ＣＯＸ−２の発見は、ＣＯＸ−１により作製された胃および腎臓における防御性ＰＧを除去することなく炎症を減少させる薬物の設計を可能にした。好ましい実施形態の組成物は、被験体における炎症の処置、および他の炎症関連障害の処置（例えば、疼痛および頭痛の処置における鎮痛薬として、または熱の処置のための解熱薬として）に有用であるが、これらに限定されない。好ましい実施形態の組成物は、血管疾患、片頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｍａ）、リウマチ熱、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、多発性硬化症、サルコイドーシス（ｓａｃｏｉｄｏｓｉｓ）、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、傷害後に生じる腫脹、心筋虚血などのような疾患において炎症を処置する際に有用である。好ましい実施形態の組成物は、有害な副作用が顕著に少ないというさらなる利点を有する抗炎症剤として有用である。
【００５８】
好ましい実施形態はまた、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸が、関節運動を正常化するか、または変形性関節炎の症状を減少させるように機能する割合を増加させる組成物を提供し得る。例えば、好ましい実施形態の組成物は、関節炎を処置するために有用である。このような関節炎としては、慢性関節リウマチ、脊椎アソパシー（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｔｈｏｐａｔｈｉｅｓ）、痛風性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス、および若年性関節炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
好ましい実施形態のこのような組成物はまた、喘息、気管支炎、月経性痙攣（ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｒａｍｐｓ）、腱炎、滑液包炎および皮膚関連状態（例えば、乾癬、湿疹、熱傷、および皮膚炎）の処置において有用である。好ましい実施形態の組成物はまた、胃腸状態（例えば、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群、および潰瘍性大腸炎）を処置するため、および癌（例えば、結腸直腸癌）の予防または処置に有用である。
【００６０】
好ましい実施形態の組成物はまた、眼疾患（例えば、網膜症、結膜炎、ブドウ膜炎、眼光恐怖（ｏｃｕｌａｒ ｐｈｏｔｏｐｈｏｂｉａ））の処置、および眼組織への急性傷害の処置において有用である。化合物はまた、肺炎症（例えば、ウイルス感染および嚢胞性線維症に関連した肺炎症）の処置において有用である。化合物はまた、特定の神経系障害（例えば、皮質性痴呆（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ）（アルツハイマー病を含む）の処置に有用である。ＰＧＥ２のＣＯＸ−２媒介生合成のインヒビターとして、これらの組成物はまた、アレルギー性鼻炎、呼吸窮迫症候群、エンドトキシンショック症候群、アテローム性動脈硬化症、および発作、虚血、および外傷から生じる中枢神経系損傷の処置において有用である。
【００６１】
以下の実施例は、好ましい実施形態の例示であって、いずれの様式においても制限しないことを意図する。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
クルクミノイドおよびホップの抽出物によるマウスＢ細胞におけるプロスタグランジンＥ２産生の相乗的阻害
本実施例は、好ましい実施形態のクルクミノイドおよびホップ抽出物の組み合わせの、クルクミノイド単独に比較して優れたＣＯＸ−２阻害効力および選択性を示す。
（ＲＡＷ ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２のＣＯＸ−２媒介産生の阻害）
装置−バランサー（分析用）、Ｏｈａｕｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｏｈａｕｓ Ｍｏｄｅｌ ＃ＥＯ１１４０，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、バイオセイフティーキャビネット（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ１２１４，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、ピペッター（１００〜１０００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ），細胞ハンド計数カウンター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２３６０９−１０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ），ＣＯ２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ３２１０，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ），ヘマサイトメーター（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｍｏｄｅｌ＃１４９２，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｏｄｅｌ ＃ＤＭ ＩＬ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、マルチチャンネルピペッター（１２チャンネル）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３５０１−６６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットエイド（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３４９８−１０３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（０．５〜１０μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（１００〜１０００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（２〜２０μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（２０〜２００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＰＵＲＥＬＡＢ Ｐｌｕｓ Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕ．Ｓ．Ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）、冷蔵装置（４℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ３７７５，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、ボルテックスミキサー（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃３３９９４−３０６，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、温水バス（Ｓｈｅｌ Ｌａｂ Ｍｏｄｅｌ＃１２０３，Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ，ＯＲ）。
【００６３】
細胞、化学物質、試薬、および緩衝液−細胞スクレーパー（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ＃３００８，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５５０７，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ），ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ＃１０−０１３−ＣＶ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、ウシ胎仔血清（熱不活性化）（ＦＢＳ−ＨＩ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ＃３５−０１１−ＣＶ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｌ−２６５４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、遠心管（１．７ｍＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２０１７２−６９８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ＃３０−００１−ＣＩ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、ピペットチップ（０．５〜１０μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５０９−１３８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットチップ（１００〜１０００μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５１２−２９４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットチップ（２〜２０μＬピペッターおよび２０〜２００μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ ＃５３５１２−２６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペット（１０ｍＬ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃７５５１，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、ピペット（２ｍＬ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃７５０７，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、ピペット（５ｍＬ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃７５４３，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、ＲＡＷ ２６４．７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＴＩＢ−７１，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、試験化合物（液体ＣＯ２ホップ抽出物（Ｈｏｐｕｎｉｏｎ，Ｙａｋｉｍａ，ＷＡ製））、（クルクミン（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃ １３８６）、６５〜７０％Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ粉末）、組織培養プレート（９６ウェル）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃３０７５，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｎｅｓ，ＮＪ）、超純水（Ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）（抵抗（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）＝１８ＭΩ−ｃｍ脱イオン水）。
【００６４】
一般手順−ＲＡＷ ２６４．７細胞（ＡＴＣＣより入手）を、ＤＭＥＭ培地において増殖させ、そして対数期増殖に維持した。ＤＭＥＭ増殖培地を以下のようにして作製した：５０ｍＬの熱不活性化ＦＢＳおよび５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを、５００ｍＬボトルのＤＭＥＭに添加し、そして４℃で保存した。これを使用前に温水バス中で３７℃に温め、そして最良の結果のために、３ヶ月以内に使用すべきである。
【００６５】
実験の第一日目において、対数期２６４．７細胞を、９６ウェル組織培養プレートにおいて１ウェル当たり０．２ｍＬ増殖培地中に、８×１０４細胞／ウェルで播種した。播種後６〜８時間で、各ウェルから１００μＬの増殖培地を除去し、１００μＬの新鮮な培地と交換した。１．０ｍｇ／ｍＬ ＬＰＳ溶液（これを、ＲＡＷ ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２の発現を誘導するために使用した）を、１ｍＬ ＤＭＳＯ中の１．０ｍｇのＬＰＳ中に溶解することによって調製した。それを、溶解するまで混合し、そして４℃で貯蔵した。使用する直前に、室温で、または３７℃温浴バス中でそれを解凍させた。
【００６６】
実験の第二日目において、試験材料を、ＤＭＳＯ中で１０００×ストックとして調製した。例えば、試験材料の最終濃度が１０μｇ／ｍＬであった場合、１ｍＬのＤＭＳＯ中に１０ｍｇの試験材料を溶解することにより、１０ｍｇ／ｍＬストックを調製した。実験の２日目に、新鮮な試験材料を調製した。１．７ｍＬ遠心分離管において、１ｍＬ ＤＭＥＭ（ＦＢＳ含まず）を添加し、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、および１．０μｇ／ｍＬの試験濃度を得た。２μＬの１０００×ＤＭＳＯストックの試験材料を１ｍＬ培地（ＦＢＳ含まず）に添加した。最終濃度の試験材料を含んだ管を２倍濃縮した。この管を、１０分間インキュベーター中に配置して、平衡化させた。
【００６７】
１００ｍＬの培地を、１日目に調製した細胞プレートの各ウェルから除去した。１００ｍＬの平衡化した２×最終濃度の試験化合物を細胞に添加し、そして９０分間インキュベートした。４４μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯストックを１０ｍＬの培地に添加することにより、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ含まず）中ＬＰＳを調製した。刺激される細胞の各ウェルにつき、２０μＬのＬＰＳ（ＬＰＳの最終濃度は、０．４μｇ／ｍＬのＬＰＳである）を添加した。ＬＰＳ刺激を２４時間続け、その後各ウェルからの上清培地を、培地中のＰＧＥ２
含有量の決定のために、きれいな遠心管に移した。
（クルクミノイドおよびホップ抽出物によるＣＯＸ−１酵素阻害の決定）
ＰＧＥ２のＣＯＸ−１合成を阻害する試験材料の能力を、本質的に、Ｎｏｒｅｅｎ，Ｙ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６１，２−７，１９９８）によって記載されるように決定した。
【００６８】
装置−バランサー（２４００ｇ，Ａｃｃｕｌａｂ ＶＩ−２４００，ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃１１２３７−３００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、バランサー（分析用）、Ｏｈａｕｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｏｈａｕｓ Ｍｏｄｅｌ＃ＥＯ１１４０，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、バイオセイフティーキャビネット（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ１２１４，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、冷凍装置（−３０℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ３７９７）、冷凍装置（−８０℃）Ｕｌｔｒａｌｏｗ（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ＃Ｆ８５１６，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、加熱攪拌プレート（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃３３９１８−２６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、製氷機（Ｓｃｏｔｓｍａｎ Ｍｏｄｅｌ＃ＡＦＥ４００Ａ−１Ａ，Ｆａｉｒｆａｘ，ＳＣ）、マルチチャンネルピペッター（１２チャンネル）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３５０１−６６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、マルチチャンネルピペッター（８チャンネル）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３５０１−６６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、旋回振盪器プラットフォーム（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ＃Ｆ３７０４１−００００，Ｐｅｑｕａｎｎｏｃｋ，ＮＪ）、ｐＨメーター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃３３２２１−０１０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットエイド（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５３４９８−１０３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（０．５〜１０μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（１００〜１０００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（２〜２０μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター（２０〜２００μＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃４０００−２０４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＰＵＲＥＬＡＢ Ｐｌｕｓ Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕ．Ｓ．Ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）、冷蔵装置（４℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ３７７５，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、真空チャンバー（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｚ３５，４０７−４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ボルテックスミキサー（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃３３９９４−３０６，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。
【００６９】
供給品および試薬−９６ウェル丸底プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ＃２６７２４５，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、アラキドン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ａ−３９２５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、遠心分離管（１５ｍＬ）（円錐形、滅菌済）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２０１７１−００８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＣＯＸ−１酵素（ヒツジ）、４０，０００単位／ｍｇ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔａｌｏｇ＃６０１００，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５５０７，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、エタノール１００％（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＭＫ７０１９０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、エピネフリン（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｅ−４２５０，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、グルタチオン（還元）（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｇ−６５２９，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、メモリ付きシリンダー（１０００ｍＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２４７１１−３６４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ヘマチン（ブタ）（Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｈ−３２８１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、塩酸（ＨＣｌ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＶＷ３１１０−３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＫｉｍＷｉｐｅｓ（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ ＣｌａｒｋＣａｔａｌｏｇ＃３４２５６，Ｒｏｓｗｅｌｌ，ＧＡ）、遠心管（１．７ｍＬ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃２０１７２−６９８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｓ−５８８１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ピペットチップ（０．５〜１０μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５０９−１３８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットチップ（１００〜１０００μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５１２−２９４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットチップ（２〜２０μＬピペッターおよび２０〜２００μＬピペッター用）（ＶＷＲ Ｃａｔｏｌｏｇ＃５３５１２−２６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、プロスタグランジンＥ２（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｐ−５６４０，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、プロスタグランジンＦ２α（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｐ−０４２４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、攪拌棒（磁気）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ＃５８９４８−１９３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、貯蔵ビン（１０００ｍＬ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ＃１３９５−１Ｌ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、貯蔵ビン（１００ｍＬ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ＃１３９５−１００，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ホップのＣＯ２抽出物（Ｈｏｐｕｎｉｏｎ，Ｙａｋｉｍａ，ＷＡ）、クルクミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃ １３８６）、６５〜７０％ Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ粉末）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｔ−５９４１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、超純水（抵抗＝１８ＭΩ−ｃｍ脱イオン水）。
【００７０】
一般手順−酸素を含まない１．０ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を、以下のようにして調製した。１０００ｍＬのビーカーで、１２．１１ｇのＴｒｉｚｍａ ＨＣｌを、９００ｍＬの超純水に溶解した。このビーカーにスターラーバーを入れて、スターラープレートにのせた。ＮａＯＨを、ｐＨが８．０に達するまで添加した。その容量を、１０００ｍＬの最終容量まで調整し、そして１０００ｍＬの保存瓶中で貯蔵した。
【００７１】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を、上を開けたまま、真空チャンバーに入れ、そしてこの緩衝液の気体発生が止まるまで、空気ポンプをオンにした。次いで、真空チャンバーを切り、そして貯蔵瓶に密閉して覆った。酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用するたびに、この工程を繰り返した。
【００７２】
１ｍＬの補因子溶液を、１．３ｍｇの（−）エピネフリン、０．３ｍｇの還元グルタチオンおよび１．３ｇｍのヘマチンを、１ｍＬの酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に添加することによって調製した。この試験物質の溶液を、必要に応じて調製した（すなわち、１０ｍｇのアスピリンを計量し、そして１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した）。
【００７３】
酵素、すなわち、プロスタグランジンＥ２またはプロスタグランジンＦ２αを、以下のようにして、酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解した。すなわち、氷上で、４０，０００単位／ｍＬの酵素（６．５μＬ）をとり、そして酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（６４３．５μＬ）に添加した。この酵素溶液は、６０回の反応に十分である。ＣＯＸ−１酵素溶液を、以下のようにして調製した：１５ｍＬの遠心分離管中で、４０，０００単位／ｍＬのＣＯＸ−１酵素（１０μＬ）を、一回の反応あたり、５０μＬの補因子溶液を含有する酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌに添加した。この混合物を、氷上で、５分間インキュベートした。６０回の反応について、６５０μＬの酵素を、３．２５ｍＬの補因子溶液を含有する酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に添加した。
【００７４】
９６ウェルプレートの各ウェル中で、６０μＬの酵素溶液を２０μＬの試験溶液と合わせた。試験溶液の最終濃度は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２μｇ／ｍＬであった。これらのプレートを、氷上で１０分間、プレインキュベートした。２０μＬのアラキドン酸（３０μＭ）を添加し、そして３７℃で１５分間インキュベートした。
【００７５】
１２．１ＮのＨＣｌを１００ｍＬの貯蔵瓶中で希釈することによって、２ＭのＨＣｌを調製した。８３．５ｍＬの超純水を添加し、次いで、１２．１ＮのＨＣｌ（１６．５ｍＬ）を添加した。これを、１００ｍＬの貯蔵瓶中で貯蔵し、そしてＢｉｏｓａｆｔｙキャビネット中に置いた。この反応を、２ＭのＨＣｌ（１０μＬ）を添加することによって停止させた。最終溶液を、ＰＧＥ２アッセイのための上清として使用した。
【００７６】
（培地中のＰＧＥ２濃度の決定）
以下の手順は、本質的にＨａｍｂｅｒｇ，Ｍ．およびＳａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｂ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７１．２４６，６７１３−６７２１）により記載される手順であった；しかし、商業的な非放射性の手順を用いた。
【００７７】
装置−冷凍庫、−３０℃（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ３７９７）、加熱撹拌プレート（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃３３９１８−２６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、マルチチャネルピペッター、１２チャネル（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３５０１−６６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、回転式振盪プラットフォーム（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ ＃Ｆ３７０４１−００００，Ｐｅｑｕａｎｎｏｃｋ，ＮＪ）、ピペットエイド（Ｐｉｐｅｔ Ａｉｄ）（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３４９８−１０３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、０．５〜１０μＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、１００〜１０００μＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、２〜２０μＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、２０〜２００μＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、プレートリーダー（Ｂｉｏ−ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｍｏｄｅｌ＃Ｅｌｘ８００，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）、ＰＵＲＥＬＡＢ Ｐｌｕｓ水研磨システム（Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｕ．Ｓ．Ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）、冷却装置、４℃（Ｆｏｒｍａ ｍｏｄｅｌ＃Ｆ３７７５，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）。
【００７８】
化学物質、試薬および緩衝液−プロスタタグランジンＥ２ ＥＩＡキットモノクローナル４８０ウェル（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔａｌｏｇ ＃５１４０１０，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、遠心分離管、５０ｍＬ、コニカル、滅菌（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃２０１７１−１７８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ ｃａｔａｌｏｇ ＃１０−０１３−ＣＶ、Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、メスシリンダー、１００ｍＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃２４７１１−３１０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、キムワイプ（ＫｉｍＷｉｐｅｓ）（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ｃｌａｒｋ ｃａｔａｌｏｇ ＃３４２５６、Ｒｏｓｗｅｌｌ，ＧＡ）、微量遠心管、１．７ｍＬ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃２０１７２−６９８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ ｃａｔａｌｏｇ ＃３０−００１−ＣＩ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、０．５〜１０μＬのピペッターのピペットチップ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３５０９−１３８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、１００〜１０００μＬのピペッター用のピペットチップ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３５１２−２９４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、２〜２０μＬおよび２０〜２００μＬのピペッター用のピペットチップ（ＶＷＲｃａｔａｌｏｇ ＃５３５１２−２６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペット、２５ｍＬ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｃａｔａｌｏｇ ＃７５５１，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、貯蔵瓶、１００ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃａｔａｌｏｇ ＃１３９５−１００，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、貯蔵瓶、１０００ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃａｔａｌｏｇ ＃１３９５−１Ｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、超純水（抵抗＝１８メガオーム−ｃｍ脱イオン水）。
【００７９】
一般手順−ＥＩＡ緩衝液を、ＥＩＡ緩衝液濃縮物（バイアル＃４）の内容物を９０ｍｌの超純水で希釈することによって調製した。バイアル＃４を、数回リンスして、全ての結晶を確実に除去し、次いで、１００ｍＬの貯蔵瓶に入れ、そして４℃で貯蔵した。
【００８０】
洗浄緩衝液濃縮物（バイアル＃５）を、超純水で１：４００に希釈することによって、洗浄緩衝液を調製した。次いで、０．５ｍｌ／ｌのＴｗｅｅｎ ２０（バイアル＃５ａ）を（正確な測定のためのシリンジを使用して）添加した。２．５ｍｌの洗浄緩衝液濃縮物、０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０および９９７ｍｌの超純水を添加して、１リットルの洗浄緩衝液を調製した。この溶液を、１リットルの貯蔵瓶中、４℃で貯蔵した。
【００８１】
プロスタグランジンＥ２標準物質を、以下のようにして再構成した。２００μＬのピペットチップを、このチップにエタノールを繰返し数回出し入れすることによって平衡化した。このチップを使用して、１００μＬのＰＧＥ２標準物質（バイアル＃３）を１．７ｍＬの微量遠心管に移した。９００μｌの超純水を、この管に添加し、そして４℃で貯蔵した。これは、約６週間安定であった。プロスタグランジンＥ２アセチルコリンエステラーゼトレーサーを、以下のようにして再構成した。５０ｍＬの遠心分離管中で、１００μＬのＰＥＧ２トレーサー（バイアル＃２）を３０ｍＬのＥＩＡ緩衝液と混合し、そして４℃で貯蔵した。
【００８２】
プロスタグランジンＥ２モノクローナル抗体を、以下のようにして再構成した。５０ｍＬの遠心分離管中で、１００μＬのＰＧＥ２抗体（バイアル＃１）を３０ｍＬのＥＩＡ緩衝液と混合し、そして４℃で貯蔵した。
【００８３】
５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを５００ｍＬのＤＭＥＭに添加することによって、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭを調製し、そして４℃で貯蔵した。
【００８４】
プレートを以下のようにして構成した：各プレートは、最低２つのブランク（Ｂ）、２つの非特異的結合ウェル（ＮＳＢ）、２つの最大結合ウェル（Ｂ０）および二重に実行される８点標準曲線（Ｓ１〜Ｓ８）を含んだ。各サンプルを、最低２つの希釈物でアッセイし、そして各希釈物を二重に実行した。
【００８５】
標準物質を以下のようにして調製した：１．７ｍＬの微量遠心管（８個）を、管１〜８とラベルを付けた。９００μＬのＤＭＥＭを、管１に添加し、そして５００μＬのＤＭＥＭを管２〜８に添加した。１００μＬのＰＧＥ２標準物質を、管１に添加し、そして混合した。５００ｍＬの溶液を、管１から取り、そして管２に入れ、このプロセスを、管８まで繰り返した。
【００８６】
５０ｍＬのＥＩＡ緩衝液および５０μｌのＤＭＥＭを、ＮＳＢウェルに添加した。５０μｌのＤＭＥＭを、Ｂ０ウェルに添加した。５０ｍＬの溶液を、管＃８から取り、そして最低の標準物質ウェル（Ｓ８）の両方に添加した。５０ｍＬを、管＃７から取り、そして次の２つのウェルの各々に添加した。これを、管＃１まで続けた。（８個全ての標準物質について、同じピペットチップを使用して、新たな標準物質の各々をピペットで吸い上げそして出すことによって、この新たな標準物質の各々におけるチップの平衡化を確実にした）。Ｐ２００を使用して、各希釈率の各サンプル（５０μｌ）を、サンプルウェルに添加した。
【００８７】
１２チャネルピペッターを使用して、５０μｌのプロスタグランジンＥ２アセチルコリンエステラーゼトレーサーを、全活性（ＴＡ）ウェルおよびブランク（Ｂ）ウェル以外の各ウェルに添加した。１２チャネルピペッターを使用して、５０μｌのプロスタグランジンＥ２モノクローナル抗体を、全活性（ＴＡ）ウェル、（ＮＳＢ）ウェルおよびブランク（Ｂ）ウェル以外の各ウェルに添加した。このプレートを、プラスチックフィルム（項目＃７）で覆い、そして４℃で１８時間インキュベートした。
【００８８】
このプレートを以下のようにして発色させた：Ｅｌｌｍａｎ試薬の１個の１００μＬバイアル（バイアル＃８）を、５０ｍＬの遠心分離管中で、５０ｍｌの超純水を用いて再構成した。このバイアルを光から保護し、そして同じ日に使用した。ウェルを、１２チャネルピペッターを使用して、洗浄緩衝液で５回洗浄およびリンスした。２００ｍＬのＥｌｌｍａｎ試薬を、１２チャネルピペッターを使用して、各ウェルに添加し、そして５μｌのトレーサーを全活性（ＴＡ）ウェルに添加し、次いで、Ｐ１０ピペットを使用して各ウェルに添加した。このプレートを、プラスチックフィルムで覆い、そして暗室で、６０〜９０分間回転式振盪機に置いた。
【００８９】
このプレートを、４０５ｎｍと４２０ｎｍとの間の単一の波長で、Ｂｉｏ−ｔｅｋプレートリーダーで読みとった。各プレートを読みとる前に、底をキムワイプで拭いた。このプレートは、ウェルの吸光度が０．３から０．８Ａ．Ｕ．の範囲にある時に読みとるべきである。ウェルの吸光度が１．５を越えた場合、これらを洗浄し、そして新たなＥｌｌｍａｎ試薬を添加し、そして再び発色させた。
【００９０】
（相乗効果および組合せ指数の計算）
クルクミノイドとアンドログラホリド（ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）との間の相乗効果を、ＣａｌｃｕＳｙｎ（ＢＩＯＳＯＦＴ、ｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ）を使用して評価した。この統計学パッケージは、Ｔ−Ｃ ＣｈｏｕおよびＰ．Ｔａｌａｌｙ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．４：４５０−４５４）（本明細書中で参考として援用される）により記載される５０パーセント有効法（Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、複数の薬物用量−効果計算を行う。
【００９１】
簡単に述べると、これは、最も簡単な予測様式：ｆａ／ｆｕ＝（Ｃ／Ｃｍ）ｍで、「用量」および「効果」を相関させる。ここで、Ｃは、化合物の濃度または用量であり、そしてＣｍは、可能性を示す５０パーセント有効用量である。Ｃｍは、５０パーセント有効プロットのｘ切片から決定される。試験物質の濃度により影響を受ける因数は、Ｆａであり、そして濃度により影響を受けない部分は、ｆｕ（ｆｕ＝１−ｆａ）である。指数ｍは、用量−効果曲線のＳ字形（ｓｉｇｍｏｉｄｉｃｉｔｙ）または形状を示すパラメーターである。これは、５０パーセント有効プロットの傾きによって推定される。
【００９２】
５０パーセント有効プロットは、ｘ＝ｌｏｇ（Ｃ） 対 ｙ＝ｌｏｇ（ｆａ／ｆｕ）のプロットであり、そしてＣｈｏｕの５０パーセント有効式の対数形態に基づく。この５０パーセント有効式に対するデータの適合度は、５０パーセント有効プロットの線形相関係数ｒによって表される。通常、酵素またはレセプター系からの実験データは、ｒ＞０．９６を有し、組織培養物からの実験データは、ｒ＞０．９０を有し、そして動物系からの実験データは、ｒ＞０．８５を有する。
【００９３】
試験成分の相乗効果は、組合せ指数（ＣＩ）パラメーターを使用して数量化される。Ｃｈｏｕ−ＴａｌａｌｙのＣＩは、多剤効果に基づき、そして酵素動力学モデルから導かれる（Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．およびＴａｌａｌａｙ，Ｐ．（１９７７）Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６４３８−６４４２）。この式は、相乗効果または拮抗作用ではなく、付加的な効果のみを決定する。しかし、本発明者らは、１９８３年にＣｈｏおよびＴａｌａｌａｙ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．（１９８３）４：４５０−４５４）により提案されるように、相乗効果を予測される付加的な効果よりも大きいと規定し、そして拮抗作用を、予測される付加的な効果よりも小さいと規定する。付加的な効果としてのＣＩ＝１の指定を使用して、本発明者らは、同じ作用様式を有する相互排除的な化合物について、または全体的に独立した作用様式を有する相互非排除的な薬物について、以下の関係：ＣＩ＜１，＝１および＞１（これは、それぞれ、相乗作用、相加性および拮抗作用を示す）を得る。
【００９４】
２成分組合せの推定５０パーセント阻害濃度を、以下の関係を使用して推定した：
［１／推定ＩＣ５０］＝［Ａ／ＩＣ５０Ａ］＋［Ｂ／ＩＣ５０Ｂ］
ここで、Ａ＝組合せ中の成分Ａのモル画分であり、そしてＢ＝組合せ中の成分Ｂのモル画分である。
【００９５】
表４は、ＲＡＷ ２６４．７細胞アッセイにおける、ＣＯＸ−２によるＰＧＥ２産生についての、クルクミン抽出物およびホップ抽出物の、観察された５０パーセント阻害濃度および推定５０パーセント阻害濃度を示す。クルクミン抽出物およびホップ抽出物の１０：１の組合せの推定ＩＣ５０は、１．６μｌ／ｍＬであったが、観察された値は、０．７７μｇ／ｍＬ、または２倍以上大きかった。このレベルの差異は、予想外であり、クルクミン抽出物およびホップ抽出物の１：１０の組合せの合わせたＣＯＸ−２阻害活性についての新規な所見を構成する。
【００９６】
（表４．クルクミンおよびホップ抽出物の処方物（１０：１）についての観察および予期された中間阻害濃度）
【００９７】
【表４】
クルクミンとホップ抽出物の１：１０の組み合わせに対するＲＡＷ２６４．７細胞モデル中のＰＥＧ２のＣＯＸ−２産生の阻害の統計的分析を表５に提示する。この組み合わせに対するＣＩは、ＩＣ５０、ＩＣ７５およびＩＣ９０について、それぞれ、０．４９０、０．４７２および０．４５４であった。これらのＣＩ値は、完全用量応答曲線に亘り、クルクミンとホップ抽出物との間の強い相乗効果を示す。
【００９８】
（表５．クルクミンおよびホップ抽出物１：１０の処方物についての組み合わせ指数）
【００９９】
【表５】
クルクミン単独によるＲＡＷ２６４．７細胞モデル中のＣＯＸ−２の中間阻害濃度は、４．０１μｇ／ｍＬであった（表６）。クルクミンによるＣＯＸ−１酵素活性の阻害は、１０．０μｇ／ｍＬのＩＣ５０で幾分より高かった。ホップ抽出物は、０．２１μｇ／ｍＬのＣＯＸ−２によるＰＧＥ２阻害のＩＣ５０、および６．２５μｇ／ｍＬで推定されたＣＯＸ−１酵素阻害のＩＣ５０を示し；クルクミン単独のＣＯＸ−２特異性は２．５であり、そしてホップ抽出物については、それは２９．５であった。クルクミンとホップ抽出物との１１の処方物は、１７．４の中間ＣＯＸ−２特異性で、４８．６〜１１．２の範囲のＣＯＸ−２特異性を示した。クルクミンとホップ抽出物との組み合わせのすべては、予期せぬことに、ＣＯＸ−２の阻害によりＰＧＥ産生を特異的に制限するように設計された薬学的産物に対する最小値として示唆されたわずかな５．０より大きいＣＯＸ−２特異性を示した。この発見は、クルクミンとホップ抽出物との組み合わせが、ＣＯＸ−１阻害で観察されるＧＩ副作用なしに強力な抗炎症性処方物として機能し得ることを示す。
【０１００】
（６．クルクミン、ホップ抽出物ならびに１１のクルクミンおよびホップ抽出物処方物
に対するＣＯＸ−２特異性）
【０１０１】
【表６】
（実施例２）
（外傷後の関節機能の正常化）
食事性補助物質としての本発明の代表的な組成物は、経口処方物、すなわち、以下の組み合わせの１つを供給する錠剤中に存在する：（ａ）１５ｍｇクルクミノイド／ｋｇ・日および６．０ｍｇフムロン／ｋｇ・日；（ｂ）１５ｍｇクルクミノイド／ｋｇ・日および６．０ｍｇウプロン（ｕｐｌｏｎｓ）／ｋｇ・日；（ｃ）１５ｍｇクルクミノイド／ｋｇ・日および６．０ｍｇジヒドロイソフムロン／ｋｇ・日。運動または繰り返し運動ストレスに起因する身体外傷後の関節運動の正常化が、２〜１０用量の後に生ずることが期待される。この結果は、すべての動物において期待される。
【０１０２】
（実施例３）
（しゅさ性挫瘡の処置におけるローション処方物の臨床有効性）
以下：（ａ）０．１重量％クルクミノイドおよび０．５％のフムロン；または（ｂ）０．１重量％クルクミノイドおよび０．５％のルムロンの１つを含むよう設計されたローションを、患者の担当医により診断され、そして独立の広く認定された（ｂｏａｒｄ−ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ）皮膚学者により確認されるように、しゅさ性挫瘡を示す患者の罹患領域に付与する。罹患した表面領域および赤みを定量する研究の１週間前に、自己評価試験が施与される。さらに、類似の変数が、患者の処置状態を知らない専門の臨床スタッフによりスコアされる。これらの評価を、０、７、１４および２１日に繰り返す。
【０１０３】
患者を、試験の開始時に、試験処方物また偽薬にランダムに割り当てる。この試験処方物および偽薬は、１日あたり罹患領域に１または２回付与される。糖尿病、高血圧などの健康状態の処置は、この研究の間許可される。スコアは、４つの観察期間の各々について、試験処方物と偽薬との間で統計的に比較される。ローション処方物中の本発明の組成物で処理された患者は、患者のスコアが、評価される各カテゴリー内で、予備試験されたスコアから２０％より大きく改善されるとき、改善されると考えられる。改善を示す人の％を、組み合わせ処方物と偽薬コントロールとの間で比較する。２つの群間の差異は、真実であるときのゼロ仮説を拒絶する確率が５％未満である場合、統計的に有意であると考えられる。
【０１０４】
（実施例４）
（乾癬の処置におけるローション処方物の臨床的有効性）
組成物が、患者の担当医により診断され、そして独立の広く認定された皮膚学者によりされ確認されるように、乾癬を示す患者の罹患領域に付与することを除いて、実施例３に記載のと同じよう様式でこの実施例を実施する。罹患した表面領域および皮膚状態を定量する研究の１週間前に、自己評価試験が施与される。さらに、類似の変数が、患者の処置状態を知らない専門の臨床スタッフによりスコアされる。これらの評価を、０、７、３０および６０日に繰り返す。
【０１０５】
患者を、試験の開始時に、試験処方物また偽薬にランダムに割り当てる。この試験処方物および偽薬は、１日あたり罹患領域に１または２回付与される。糖尿病、高血圧のような健康状態の処置は、この研究の間許可される。スコアは、４つの観察期間の各々について、試験処方物と偽薬との間で統計的に比較される。試験ローション処方物としての本発明の組成物で処理された患者は、患者のスコアが、評価される各カテゴリー内で、予備試験されたスコアから２０％より大きく改善されるとき、改善されると考えられる。改善を示す人の％を、試験処方物と偽薬コントロールとの間で比較する。２つの群間の差異は、真実であるときのゼロ仮説を拒絶する確率が５％未満である場合、統計的に有意であると考えられる。
【０１０６】
（実施例５）
（アルツハイマー病の処置における処方物の臨床的有効性）
実施例２に記載のような経口処方物が、患者の担当医により診断され、そして独立の広く認定された神経学者により確認されるように、アルツハイマー病（ＡＤ）の初期段階を示した患者に投与される。臨床試験の２週間前に、患者は、ミニメンタル状態試験（ＭＭＳＥ）、アルツハイマー病評価スケール（ＡＤＡＳ）、ボストンネーミング試験（ＢＮＴ）、およびトーケン試験（ＴＴ）のような適切な精神神経学的試験を受ける。精神神経学的試験は、臨床試験の０日、６週および３ヶ月で繰り返される。これらの試験は、患者の処置状態を知らない精神神経学者により実施される。
【０１０７】
患者を、試験の開始時に、試験処方物また偽薬にランダムに割り当てる。この試験処方物および偽薬は、１日あたり１または２回経口摂取される。糖尿病、高血圧などのような状態の処置は、この研究の間許可される。スコアは、３つの観察期間の各々について、試験処方物と偽薬との間で統計的に比較される。処置なしでは、ＡＤの自然の経過は、臨床試験の経過の間は、試験スコアで有意な悪化がある。試験処方物として本発明の組成物で処理された患者は、臨床試験の経過の間に同じままか、または改善する場合、改善されると考えられる。
【０１０８】
（実施例６）
（結腸癌の処置および予防における経口処方物）
実施例２に記載のような経口処方物が、患者自身の担当医により診断され、そして独立の広く認定された癌学者により確認されるように、結腸癌の初期段階を示した患者に投与される。
【０１０９】
患者を、試験の開始時に、試験処方物また偽薬にランダムに割り当てる。この試験処方物および偽薬は、１日あたり１または２回経口摂取される。糖尿病、高血圧などのような状態の処置は、この研究の間許可される。内視鏡評価を、１、２、６および１２ヶ月で行う。４つのフォローアップ臨床訪問のいずれか１つの間で腫瘍の再出現の証拠は、処置失敗と考えられる。処置失敗の％は、試験処方物と偽薬コントロールとの間で比較される。記載される実験条件の下では、試験物質は、コントロール群に対し腫瘍発生率を低減することが予期される。２つの群間の差異は、真実であるときのゼロ仮説を拒絶する確率が５％未満である場合、統計的に有意であると考えられる。
【０１１０】
（実施例７）
（過敏性大腸症候群の処置のための経口処方物）
実施例２に記載のような経口処方物が、患者の担当医により診断されるように、過敏性大腸症候群を示した患者に投与される。正常な大腸機能が２４時間以内に回復される。
【０１１１】
（実施例８）
（変形性関節症における関節機能の正常化）
実施例２に記載の組成物を用い、変形性関節症に起因する関節剛直性の正常化が、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸の存在下または不在下で、５〜１２用量の後生じる。さらに、この組成物は、伝統的な非ステロイド系抗炎症剤とは異なり、これら２つのプロテオグリカン成分の正常な関節再構築効果を妨害しない。
【０１１２】
要するに、特定の実施形態は、誘導性ＣＯＸ−２活性の阻害のための組成物であって、ＣＯＸ−１活性に対しては最小の影響を有し、この組成物は、第１の成分として有効量のクルクミノイド種、ならびにα酸種およびβ酸種またはそれら誘導体からなる群から選択される有効量の第２の成分を含む。好ましくは、このクルクミノイド種は、クルクミン、デメトキシクルクミン、またはビスデメトキシクルクミンである。好ましくは、α酸種は、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン、アドフムロン、キサントフモルＡ、またはキサントフモルＢである。好ましくは、β酸種は、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロン、ヘキサヒドロコルプロンまたはジヒドロイソフムロンである。本組成物の第１または第２の成分は、薬学的等級であり得るか、かつまたは植物（単数または複数）または植物抽出物（単数または複数）に由来し得る。この第１または第２の成分はまた、モノサッカリドまたはジサッカリド、アミノ酸、スルフェート、スクシネート、アセテートまたはグルタチオンのような化合物との結合体に由来し得る。好ましい実施形態の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に処方され得、そして抗酸化剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質、炭水化物、グルコサミン、コンドロイチン硫酸またはアミノ糖のような添加物を含む。
【０１１３】
その他の実施形態は、好ましい実施形態の組成物の栄養補助の方法を含み、炎症の症状を患う動物中の症状を低減する。この組成物は、上記投与が、約０．００１〜約３０．０ｍｇ／ｋｇ体重／日の各クルクミノイド種、および約０．５〜約２０．０ｍｇ／ｋｇ体重／日のα酸種またはβ酸種を提供するような投薬形態で処方される。この組成物は、約０．１〜約５０μＭの各クルクミノイド種、および約０．００１〜約５０μＭの各α酸種またはβ酸種の血清濃度を維持するに十分な量で投与される。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、トリ、爬虫類、両生類、ウマまたは反芻動物であり得る。投与は、経口送達系、非経口送達系、局所送達系、経皮系または経粘膜送達系であり得る。
【０１１４】
従って、教示される種々の処方物の中で、第１の成分としてのクルクミノイド、およびα酸およびβ酸からなる群から選択される第２の成分を含む処方物が開示されている。これらの組み合わせは、生物学的因子または未知の病因に起因する、物理的または化学的損傷あるいは異常免疫刺激に応答する相乗的抗炎症性効果を提供し得る。自明な性質の種々の変更および改変が、本発明の意図から逸脱することなくなされ得、そしてすべてのこのような変更および改変が、添付の請求項により規定されるような本発明の範囲内に入ると考えられることは当業者に容易に明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−９３９１８（Ｐ２０１１−９３９１８Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２９１３３３（Ｐ２０１０−２９１３３３）
【出願日】平成２２年１２月２７日（２０１０．１２．２７）
【分割の表示】特願２００３−５３７５７６（Ｐ２００３−５３７５７６）の分割
【原出願日】平成１４年１０月２５日（２００２．１０．２５）
【出願人】（５０３４６５９３７）メタプロテオミクス， エルエルシー (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２７日（２０１０．１２．２７）
【分割の表示】特願２００３−５３７５７６（Ｐ２００３−５３７５７６）の分割
【原出願日】平成１４年１０月２５日（２００２．１０．２５）
【出願人】（５０３４６５９３７）メタプロテオミクス， エルエルシー (19)
【Ｆターム（参考）】
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