ジアミノフェノチアジン組成物およびこの使用
細胞老化は、細胞老化の遅延が必要であると具体的に決定された細胞をジアミノフェノチアジンの有効量と接触させることにより遅延される。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
メチレンブルーは、１８７６年に初めて合成されて以来、多様な医学的用途に用いられてきた。例えば、双極性躁うつ病患者をメチレンブルー３００ｍｇ／日で１年間治療したところプラセボ１５ｍｇ／日で治療した場合よりもうつが有意に軽減されたと報告されている（Ｎａｙｌｏｒ、１９８６年）。もう１つの例として、メチレンブルーを用量６５ｍｇで１日３回服用すると慢性腎結石症の管理において有益であると報告されている（Ｓｍｉｔｈ、１９７５年）。また、ラットにおいて、メチレンブルーを用量１ｍｇ／ｋｇで注射したところ、脳の酸化的代謝および記憶保持が改善したこと（Ｃａｌｌａｗａｙ、２００４年）、および老化により増強される酸化ストレスが、血管内皮細胞内のミトコンドリアチトクロームｃオキシダーゼの欠乏と関与していること（Ｘｉｎ、２００３年）も報告されている。
【発明の開示】
【０００２】
発明者らは、しばしばチアジンとも呼ばれるメチレンブルーおよび関連するジアミノフェノチアジンが、以前報告されたメチレンブルーの治療用量よりもより低いオーダーである有効濃度で、細胞を酸化ストレスより保護して細胞老化を遅延させることができることを見出した。
【０００３】
発明の要旨
本発明の１つの態様は、細胞老化を遅延させるための方法であり、該方法は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞をジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含み、該ジアミノフェノチアジンは、構造：
【０００４】
【化５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）、
およびこの互変異性型を有し、該細胞は、１から１００ｎＭのジアミノフェノチアジンを含む培地中でインビトロ有糸分裂活性な細胞であり、該接触させる段階は、該細胞を該培地中で少なくとも１週間培養することを含む。
【０００５】
１つの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。
【０００６】
もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【０００７】
１つの実施形態において、該培地は、１０から１００ｎＭメチレンブルーを含む。
【０００８】
１つの実施形態において、該接触させる段階は、該細胞を前記培地中で少なくとも４週間培養することを含む。
【０００９】
もう１つの実施形態において、該細胞は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤とさらに接触させられる。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、細胞老化を遅延させるための方法であり、該方法は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞をジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含み、該アミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造およびこの互変異性型を有し、該細胞は、個体において原位置にあり、該接触させる段階は、該個体に対して該ジアミノフェノチアジンの５から５００μｇ／日の用量を長期経口投与して有効量を提供することを含む。
【００１１】
１つの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素またはメチルである。
【００１２】
もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【００１３】
１つの実施形態において、該用量は、少なくとも３０日間毎日投与される。
【００１４】
１つの実施形態において、該個体は、４０歳を超える年齢である。
【００１５】
もう１つの実施形態において、該個体は、診断された急性疾患または急性症状を有していない。
【００１６】
１つの実施形態において、該接触させる段階は、該個体にＮ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤を長期経口投与することを更に含む。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、ジアミノフェノチアジン５から５００μｇの経口投与用単位用量および薬学的に許容できる賦形剤を含み、該ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造またはこの互変異性型を有する。
【００１８】
１つの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。
【００１９】
もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【００２０】
もう１つの実施形態において、該組成物は、ジアミノフェノチアジンを特定するおよびこの薬学的用途を規定するラベルと共に包装され、該用途は、細胞老化を遅延させることを含む。
【００２１】
もう１つの実施形態において、該組成物は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤を更に含む。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、細胞老化の遅延を必要とする細胞を有すると決定された個体において細胞老化を遅延させるために、有効量のジアミノフェノチアジンの使用を奨励することを含む、医薬組成物を販売するための方法である。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、ジアミノフェノチアジン１から１００ｎＭを含む細胞培地であり、前記ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造またはこの互変異性型を有する。
【００２４】
１つの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。
【００２５】
もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【００２６】
もう１つの実施形態において、該細胞培地は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたは２つまたは３つのミトコンドリア保護剤を更に含む。
【００２７】
（本発明の具体的態様の詳細な説明）
本発明は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞を、ジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含む、細胞老化を遅延させるための方法を提供する。
【００２８】
本発明のジアミノフェノチアジンは、構造：
【００２９】
【化６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素、メチルまたはエチルである。）、
およびこの互変異性型を有する。
【００３０】
ジアミノフェノチアジンは、電子の非局在化により正に帯電しており、その結果、部分的な正電荷が窒素原子および硫黄原子両方の上に生じる。模式図Ａは、最も単純なジアミノフェノチアジンであるチオニンの化学構造、および電子の非局在化により生成されるチオニンの３つの互変異性型を示す。
【００３１】
【化７】
【００３２】
本発明の１つの実施態様において、該ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。）の構造を有する。本発明のもう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【００３３】
該ジアミノフェノチアジンは、細胞老化を遅延させるのに十分な量、好ましくは最小有効用量で細胞に投与される。有糸分裂細胞の場合、細胞老化を遅延させることにより細胞が有糸分裂活性のままである期間が延長される結果、該ジアミノフェノチアジンで処理していない同年齢の対照細胞と比較して、個体数が倍増する。静止期細胞の場合、細胞老化を遅延させる結果、該ジアミノフェノチアジンで処理していない同年齢の対照細胞と比較して、酸化ストレスが低減され、または細胞の活力度もしくは生存率が増大する。細胞老化の遅延において有効であるジアミノフェノチアジンの最小用量は一般に、細胞の種類および状態、培養条件、および選択されるジアミノフェノチアジンにより約１から１００ｎＭの範囲内である。特定の細胞、組織または器官に対するジアミノフェノチアジンの最適量は、実施例１に記載するような日常的な実験を用いて経験的に決定することができる。
【００３４】
細胞老化の遅延が必要であると特に決定される細胞は、細胞老化に関係するいずれかの細胞であってよい。本明細書中において、単数形「１つの」および「該」は、文脈が明らかに別の様に示していない限り、単数並びに複数の両方を表す。例えば用語「細胞」は、単数または複数の細胞を含み、「少なくとも１つの細胞」という句と同等であると見なすことができる。好ましい実施形態において、該細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。
【００３５】
本発明の１つの実施形態において、該細胞は、培地中でインビトロ有糸分裂活性細胞である。培養された細胞の老化の遅延は、培養法の生産性を増加させ、その結果特定の用途のための細胞の数が非常に多数となるためにおよび／または細胞がその意図する用途に適した健康および活力度を有する期間を延長するために必要であり得る。該細胞は、未分化であっても、分化中であってもおよび／または分化されていてもよい。１つの実施形態において、該細胞は、人工皮膚、胚性のまたは成体の前駆細胞または幹細胞、神経細胞、造血細胞、骨髄細胞、筋細胞などのために用いられる、線維芽細胞および／またはケラチノサイトなどの異種細胞移植または自家細胞移植の療法に用いられる。特定の実施形態において、特に幹細胞についての培養条件は、０．１から２０％の、好ましくは１から２０％の、より好ましくは５から２０％の酸素、および／または１から２０ｍＭの、好ましくは５から２０ｍＭのグルコースを含む。
【００３６】
該細胞は、ジアミノフェノチアジン補充培地中で、細胞老化遅延の望ましい程度を達成するのに必要なできるだけ長い期間培養され得る。１つの実施形態において、該細胞は、少なくとも１週間ジアミノフェノチアジン補充培地中で連続的に培養され、必要であれば継代する。さらなる実施形態において、該細胞は、ジアミノフェノチアジン補充培地中で少なくとも２、４、または８週間培養される。１つの実施形態において、該細胞は、ジアミノフェノチアジン補充培地中で少なくとも１２週間連続的に培養される。もう１つの実施形態において、該培地は、１から１００ｎＭのジアミノフェノチアジンを含み、および接触させる段階は、細胞を培地中で少なくとも１週間培養することを含む。
【００３７】
本発明の方法は、細胞老化において得られる遅延を検出する段階をさらに含み得る。インビトロ細胞について、細胞老化における遅延は、実施例１に記載されるように、ジアミノフェノチアジン処理していない同年齢の対照細胞と比較して、ジアミノフェノチアジン処理した細胞の有糸分裂活性の持続時間および／または寿命の増加を測定することにより、直接検出することができる。細胞老化において得られる遅延は、例えば同年齢の対照細胞に対して細胞活力度における増加（例えば、市販の細胞活力度測定キット（例：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いることによる）、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン、グルタチオン（Ａｔａｍｎａ、２００１年を参照）もしくはニトロチロシン（例えば、ＯｘｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ、オレゴン州ポートランド）などの酸化的ストレスのマーカーを測定することにより、またはローダミン１２３の蓄積、チトクロームｃオキシダーゼ活性の低減およびミトコンドリアアコニターゼの減衰（Ａｔａｍｎａ、２０００年参照）などの、ミトコンドリアにおける年齢依存的変化の遅延の検出によって推測的に検出することもできる。
【００３８】
本発明の１つの実施形態において、該細胞は、ミトコンドリアを保護する用量、好ましくは最小用量の、１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤とさらに接触させられる。このような薬剤は、Ｎ−ヒドロキシルアミン（例えば、Ａｔａｍｎａ、２０００年；Ａｍｅｓ，２００２年；米国特許第６，４５５，５８９号）、アセチルカルニチン、およびリポ酸（例えば、Ｈａｇｅｎ，２０００年）を含み、有効である最小用量は、当分野で認められた文献（本明細書に引用した刊行物など）から容易に、および／または本明細書中に開示した分析法を用いて経験的に、決定される。例として、ヒトにおけるＮ−ヒドロキシルアミンのミトコンドリア保護用量は、一般に約１００ｕｇから１ｇ、好ましくは約１０ｕｇから１ｇ、より好ましくは少なくとも１００ｕｇ、より好ましくは少なくとも１ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、最も好ましくは少なくとも１００ｍｇである。１つの実施形態において、該細胞はさらにアセチルカルニチンおよびリポ酸と接触させられる（例：米国特許第５，９１６，９１２号）。例として、この組み合わせのミトコンドリア保護用量は、一般にリポ酸約１から５０ｍｇ／ｋｇ宿主／日と一緒のカルニチン約１から５０ｍｇ／ｋｇ宿主／日、好ましくはリポ酸約１０ｍｇ／ｋｇ宿主／日と一緒のカルニチン約１０ｍｇ／ｋｇ宿主／日である。
【００３９】
本発明のもう１つの態様は、ジアミノフェノチアジンの約１から１００ｎＭを含む細胞培地であり、該ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造またはその互変異性型を有する。１つの好ましい実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンはアズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。いずれかの細胞培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＰＲＭＩ−１６４０、ハムのＦ−１０およびＦ−１２培地など）は、該ジアミノフェノチアジンを補充されてよい。該細胞培地は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤を更に含むことができる。１つの実施形態において、該細胞培地はさらにアセチルカルニチンおよびリポ酸を含む。
【００４０】
本発明のもう１つの実施形態において、該細胞は個体において原位置にあり、接触させる段階は、個体に対してジアミノフェノチアジンの５から５００μｇ／日の用量を長期経口投与して有効用量を提供することを含む。原位置にある細胞の老化の遅延は、正常または早期老化に伴う効果を遅延させるために所望され得る。例えば、ヒト皮膚における線維芽細胞の老化は、コラーゲン生成の低下によって引き起こされるしわ形成および弾力性の損失などの老化の徴候を伴っている。さらに、ミトコンドリアにおける加齢による変化は移動活性の低減を伴っている（例えば、Ａｔａｍｎａ、２００１年）。ある実施形態において、該個体は４０歳を超える年齢である。さらなる実施形態において、該個体は５０、６５または７０歳を超える年齢である。もう１つの実施形態において、該個体は、ミトコンドリア関連疾患、特に、ＭＥＬＡＳ、ＭＥＲＲＦ、ＮＡＲＰ、筋神経性胃腸障害および脳症（ＭＮＧＩＥ）、ピアソン・マーロー症候群、カーンズ・セイヤー−ＣＰＥＯ、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アミノグリコシド関連聴覚消失、難聴を伴う糖尿病などのミトコンドリア関連疾患である神経障害、心筋症または脳症を有すると診断される。もう１つの実施形態において、該個体は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病などの慢性神経変性疾患または、脳卒中などの急性神経変性疾患を有すると診断される。もう１つの実施形態において、該個体は、インスリン抵抗性または糖尿病、特にＩＩ型糖尿病を有するかまたは有すると診断される。もう１つの好ましい実施形態において、該個体は、急性疾患または急性症状、特に、ジアミノフェノチアジン療法が特定的に指示されるかまたは禁忌となる疾患および症状を有していない。このような疾患または症状の例としては、イホスファミドとメチレンブルーとの併用療法（Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ、１９９８年）で治療される癌、慢性腎結石症（Ｓｍｉｔｈ、１９７５年）、躁うつ精神病（Ｎａｙｌｏｒ、１９８６年）およびマラリア（Ｖｅｎｎｅｒｓｔｒｏｍ、１９９５年）が挙げられる。
【００４１】
１つの実施形態において、該用量は、０．１から１０．０μｇ／ｋｇ体重／日である。１つの好ましい実施形態において、該用量によってジアミノフェノチアジン血中濃度約１．０から１００ｎＭを達成する。他の実施形態において、該用量によってジアミノフェノチアジン脳内濃度約１．０から１００ｎＭを達成する。体重約１６０ポンド（ｌｂｓ）で血液約５リットルを有するヒトに対して、この濃度を達成するために必要なメチレンブルー（分子量３１９）の１日用量は約１．６から１６０μｇである。該経口用量は、一般に、長期間、通常は少なくとも３０日間、毎日１から３回投与される。いくつかの場合において、該経口用量は長期間、すなわち少なくとも３ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、より好ましくは少なくとも１２ヶ月間にわたって定期的に投与され、ここで、定期的とは、週に、少なくとも１回、好ましくは少なくとも２から３回、より好ましくは少なくとも７回（毎日）である。特定の実施形態において、該組成物は１日１回、２回、３回または４回投与される。さらなる実施形態において、該個体は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンまたはリポ酸などのミトコンドリア保護剤をさらに長期間経口投与される。もう１つの実施形態において、該個体は、アセチルカルニチンおよびリポ酸をさらに長期間経口投与される。
【００４２】
ある実施形態において、該方法は、個体における得られた細胞老化の遅延を検出する段階を更に含む。原位置にある細胞に対して、細胞老化の遅延は一般に、例えば処置前と比較して向上した弾力性または増加した皮膚の厚みなどの細胞活力度における上昇；酸化ストレスのマーカーの濃度における低下；チトクロームｃオキシダーゼの活性度または濃度の上昇などのミトコンドリアにおける年齢依存的変化の遅延；および／または個体における移動活性の増大；を検出することにより、推測的に検出される。
【００４３】
本発明のもう１つの態様は、ジアミノフェノチアジン５から５００μｇの経口投与用単位用量および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物であり、該ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造またはこの互変異性型を有する。１つの実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。１つの好ましい実施形態において、該ジアミノフェノチアジンはメチレンブルーである。更なる実施形態において、該ジアミノフェノチアジンはメチレンブルーであり、単位用量は、２００μｇ、１５０μｇ、１００μｇ、５０μｇ、４０μｇ、２５μｇおよび１０μｇから選択される。経口用量は、経口投与に適したいずれかの形態において調製されてよく、その形態は、錠剤、カプセル剤、口中錠、トローチ剤、ハードキャンディ剤、散剤、定量スプレー剤、クリーム、座剤などを含む。該組成物は、ゼラチン、油などの薬学的に許容できる賦形剤と組み合わされ、また更なる有効成分を含むことができる。１つの実施形態において、該医薬組成物は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択されるミトコンドリア保護剤を更に含む。もう１つの実施形態において、該組成物は、アセチルカルニチンおよびリポ酸を更に含む。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ジアミノフェノチアジンを識別し、酸化による損害および／または細胞老化の軽減のためのその使用を指示するラベルと共に包装される。
【００４５】
本発明のもう１つの態様は、上述のジアミノフェノチアジンまたは上述の医薬組成物のいずれかを販売するための方法であり、該方法は、細胞老化の遅延を必要とする細胞を有すると決定された個体における細胞老化を遅延させるためのジアミノフェノチアジンの有効量の使用を促進することを含む。１つの実施形態において、該個体は、４０歳を超える年齢である。１つのさらなる実施形態において、該個体は、皮膚弾力性の改善および／またはしわの減少および／またはエネルギーレベルの上昇により皮膚老化の徴候を軽減するためにサプリメントを摂取することを望み、ジアミノフェノチアジンはこうした使用のために販促される。製品ラベル、包装宣伝物、インターネット販売、テレビコマーシャル、新聞および雑誌記事などの従来のいずれかの媒体を、販売のために用いることができる。販売は一般に、細胞老化を遅延させるためのジアミノフェノチアジンの使用およびこのような使用による有望な健康上の利点（改善された皮膚の弾力性、しわの減少および／または上昇したエネルギーレベルなど）の記述を含む。
【実施例１】
【００４６】
ジアミノフェノチアジンは、組織培養中のヒト肺の線維芽細胞（ＩＭＲ９０）の老化を遅延させる。
【００４７】
正常なヒト上皮の線維芽細胞（ＩＭＲ９０）を、細胞集団倍化数（ＰＤＬ）１０．８５にてＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。ＰＤＬを、ｌｏｇ２（Ｄ／Ｄ０）（ＤおよびＤ０は、各々採取時および播種時の細胞の密度として定義される。）として算出した。保存培養を、１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地１０ｍＬ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有する１００ｍｍコーニング組織培養皿で増殖させた。保存培養を、週に１回集密化に近づいたときに分割した。細胞を、３７℃、５分間のトリプシン処理により採取し、速やかに完全ダルベッコ変法イーグル培地５ｍＬに収集し、完全ダルベッコ変法イーグル培地５ｍＬで１回洗浄し、３７℃で１０から１５分間温置して細胞を回収可能にした。
【００４８】
複製寿命に対するジアミノフェノチアジンの効果を試験するために、ＩＭＲ９０細胞を空気中、０．５×１０６／１００ｍｍ皿に播種した。ジアミノフェノチアジン（メチレンブルーまたはチオニン）を１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１０００ｎＭの濃度で培地に加えた。培養物を、７日ごとに収穫し、計数し、ＰＤＬを算出した。細胞の一部を用いて新たな皿の新鮮な培地（対照）または上述の新鮮なジアミノフェノチアジン補充培地に接種した。細胞を５％酸素で培養した以外は、培養条件および方法を、同濃度のメチレンブルー（および対照条件）を用いて繰り返した。
【００４９】
メチレンブルーは、空気中で少なくとも２５から３０の細胞集団倍化数で播種したＩＭＲ９０細胞の老化を遅延させた。最適濃度は、１０から１００ｎＭの間である。チオニンも１００ｎＭで有効である。メチレンブルーは、５％酸素で播種したＩＭＲ９０細胞の老化をも遅延させた。５％酸素中でのＰＤＬにおける増加は１０から１５の間の範囲であった。空気中の酸素濃度が約２０％である一方、酸素５％はほぼ生理学的濃度であり、その結果、通常は培養中のヒト細胞に対するＰＤＬが著しく、より多くなる。
【００５０】
ＩＭＲ９０細胞中のミトコンドリア複合体ＩＶの濃度は、サブユニットＩＩ（複合体全体を組み立てるために不可欠な中核サブユニット）に対する特異的抗体、ウエスタンブロット法、およびＮＩＨ画像を用いるタンパク質密度測定を用いて測定した。メチレンブルーにより、複合体ＩＶの濃度は、同年齢の対照に比べ約３０％増加した。メチレンブルーの効果は釣り鐘型であり、１０００ｎＭの濃度においてメチレンブルーは、ミトコンドリアからの複合体ＩＶの除去を引き起こした。チオニンによる処置後にも複合体ＩＶの増加が見られた。
【００５１】
もう１つの実験において、メチレンブルー処理した細胞の老化に対する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を試験した。ＩＭＲ９０細胞を、Ｈ２Ｏ２処理の前に初期密度０．５×１０６／皿で播種し、メチレンブルー存在下で２週間増殖させた。その後、細胞を１週間毎に採取し、計数し、メチレンブルーおよび／またはＨ２Ｏ２１０μＭを添加して、または添加せずに播種した。メチレンブルー処理せずに過酸化水素処理した細胞は、老化が加速した。これらの細胞を１００ｎＭのメチレンブルーで連続的に処理した場合、Ｈ２Ｏ２により誘発された老化は、防止された。
【実施例２】
【００５２】
ジアミノフェノチアジンは増殖された臍帯血造血幹細胞の老化を遅延させる。
【００５３】
ヒト臍帯血（ＵＣＢ）細胞は、先天性異常または悪性疾患を患う小児において、同種間幹細胞移植のための造血前駆体の魅力的な源となってきた。末梢血幹細胞または骨髄（ＢＭ）と比較してのＵＣＢ細胞の１つの主要な長所は、臍帯血移植片が引き起こす急性移植片対宿主病の発生率を低減することである。ＵＣＢ細胞は収集し貯蔵するのが容易であるけれども、成人向け移植プロトコール中への使用は、１件の臍帯血収穫に含まれる前駆細胞の個数を限定することによって制限されてきた。移植までの時間が長いこと、並びに非常に初期段階の造血前駆細胞が存在することにより、血液病専門医は、臨床使用のためのＵＣＢ幹細胞用の生体外増殖プロトコールを開発することとなった。
【００５４】
幹細胞研究における主な課題の１つは、原始的区画の細胞および前駆細胞を増殖させるために、造血幹細胞のエクスビボ自己複製分裂を刺激することにより、移植可能な造血幹細胞（ＨＳＣ）の数を増加させることである。ＵＣＢ細胞は、高い増殖能力を示し、これにより数週間以内に、造血成長因子の種々の組み合わせに応じて細胞の大規模な増殖をもたらす。異なる培地並びに異なる成長因子の最適組み合わせの混合物により、前駆細胞が効率よく増殖する結果となったが、長期間培養を開始する細胞の増幅は、より困難であった。
【００５５】
Ｃｈｉｖｕら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００４ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；８（２）：２２３−３１）の報告を応用した一連の実験において、発明者らは、臍帯血幹細胞のインビトロ維持のための数種類の培養プロトコールにおけるジアミノフェノチアジンの有益な使用を実証する。その実証の結果は、ジアミノフェノチアジンを補充したＰＣＭおよびＢＭ一次培養が、インビトロ造血細胞の増殖のための改善されたサポートおよび培養開始細胞を単核細胞（ＭＮＣ）分画として接種されるように長期間維持することを提供することを示す。
【００５６】
細胞
血液を、機関のガイドラインに従い、通常のおよび日常の満期産時に抗凝固剤としてクエン酸リン酸デキストロースアデニンを用いて収集する。単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）（密度勾配＝１．００７ｇ／ｍｌ）上で分離し、Ｉｓｃｏｖｅのダルベッコ変法培地（ＩＭＤＭ）中に再懸濁して計数する。
【００５７】
増殖培養
低密度ＭＮＣを、血清を含まない以下の組成の培地に最終濃度２×１０６細胞数／ｍｌとなるように再懸濁する。該組成は、１％ウシ血清アルブミン（Ｍｅｒｃｋ）、５×１０−４Ｍ ２−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび溶解したての１０−６Ｍ ヒドロコルチゾンを補充したダルベッコ培地である。細胞懸濁液を２４ウェルプレート（１ｍｌ／ウェル）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で温置する。ヒト成長因子を、滴定試験において最高の細胞増殖を提供する濃度で用いる。滴定試験では、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン６（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、２０ｎｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）および２Ｕ／ｍｌエリスロポエチン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）を用いる。第２の増殖混合物は２０％胎盤条件培地（ＰＣＭ）（前述の方法で入手−Ｃｈｉｖｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６：６０９−６２０，２００２）および２％自己血清を基礎としている。８種類のジアミノフェノチアジン（アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルー）の各々を、別々に、３つの一連の濃度：１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭで試験する。３日後、有核細胞および生存細胞の総数を、トリパンブルー排除試験を用いて測定する。
【００５８】
フィーダー層の確立
事前に形作る間質を生成するために、長期的骨髄培養をマウス骨髄細胞を用いて確立する。骨髄を、同体積のＰＢＳおよび密度勾配遠心分離により分離される単核細胞と混合する。洗浄した細胞を、間質性培地（１０％ウシ胎仔血清、４００ＵＩ／ｍｌペニシリン、２００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１．０μｍｏｌ／ｌヒドロコルチゾンを補充したＦ１２培地（Ｓｉｇｍａ））に再懸濁する。細胞を、培地の半量を週２回交換しながら、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で維持する。２週間後、集密接着層由来の細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いる消化により回収し、更なる実験のために６ウェルプレートに移す。培養物を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベートする。集密間質層が形成される場合、培養物を２０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で４時間処理し、次いで、徹底的に洗浄して薬物を除去する。最終的に細胞は生存可能で代謝的に活性であるが、細胞周期が遮断される。成長因子およびＰＣＭを補充した更なる培養物も同様に確立される。
【００５９】
フローサイトメトリー分析
標識細胞を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて得る。対照細胞および誘導細胞を収集し、４℃でＰＢＳ、ＢＳＡ０．１％、アジ化ナトリウム０．１％中で２回洗浄し、最終的に１％パラホルムアルデヒド中に固定する。全てのサンプルの分析を、増殖の前後にＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行い、前駆細胞サブセットを分類する。１万のイベントが得られ、データをＷｉｍＭＤＩで分析する。ＣＤ３４＋細胞を、リンパ球ゲートの百分率として測定する（ＣＤ４５＋細胞の低波長側に分布する細胞に照準を合わせ、分析を通してこれを維持する。ＣＤ１４＋細胞を、除外する）。
【００６０】
半固形クローン分析
１×１０５個のＵＣＢ細胞を、３０％ウシ胎児血清を補充したＩＭＤＭ、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌＧ−ＣＳＦ、２Ｕ／ｍｌエリスロポエチン，１０−４Ｍ／Ｌ２−メルカプトエタノールおよび１％ウシ血清アルブミンを含む０．３％寒天培地中に平板接種する。培養皿を３７℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気中で温置する。培養物を、１４日後に、赤血球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）および混合コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の存在について評価する。
【００６１】
統計解析
大部分のパラメータに対して、中央値および範囲を求める。異なる条件を評価する実験を、対応のあるサンプルに対するｔ−検定を用いて比較する。両側ｐ値が０．０５を下回った場合、統計学的に有意であると推定される。
【００６２】
ＣＤ３４＋細胞の増殖効率
臍帯血由来のＭＮＣの培養は、フィーダー細胞層、外因性サイトカイン混合物（ＩＬ−６，Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン）の補充、またはＰＣＭなどの種々の増殖条件の存在下で開始する。増殖効率は、種々の細胞サブセットの増殖倍率として表され、増殖倍率は対照未処理細胞に対する細胞の増加である。
【００６３】
ＣＤ３４＋集団のフローサイトメトリー分析により、標準サイトカインに基づくインビトロＵＣＢ増殖条件において、ＰＣＭ中の定量されたナノモル濃度の各々の濃度のジアミノフェノチアジンをフィーダー層との組み合わせで用いることの明らかな利点が実証される。結果は、ＣＤ３４＋細胞個体数および長期培養開始細胞数の対照細胞を上回る増加を示した。ジアミノフェノチアジン処理した培養物は、ジアミノフェノチアジン処理していない同年齢の対照細胞と比較して、一貫して細胞集団倍化数の増加を実証する。
【実施例３】
【００６４】
ジアミノフェノチアジンは、増殖ヒト胚性幹細胞の老化を遅延させる。
【００６５】
平行した一連の実験において、発明者らは、ヒト胚性幹細胞のインビトロ維持のための培養プロトコールにおける同じジアミノフェノチアジンの有利な使用を実証する。Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒら（２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，１１３０７−１１３１２）の報告を応用したプロトコールにおいて、ヒトＥＳ細胞（Ｈ９クローン（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２、１１４５−１１４７））は、８０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ（ＥＳ細胞用に最適化したダルベッコ変法イーグル培地（／ＢＲＬ））、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ ＳＲ（血清を含まない調合物（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ））、１ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸原液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ））および１０３単位／ｍｌ ＬＩＦ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ））中のマウス胚線維芽細胞上で成長させる。
【００６６】
上述のように、８種類のジアミノフェノチアジン（アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルー）を、各々別々に一連の４つの濃度：１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭで試験する。ジアミノフェノチアジン処理した培養物は、ジアミノフェノチアジン処理していない同年齢の対照細胞と比較して、細胞集団倍化数の増加を一貫して実証する。
【実施例４】
【００６７】
高齢ラットにおける飼料消費および移動活性、ならびにこれらの肝臓中の加齢による酸化的変化に及ぼす、ジアミノフェノチアジンの効果。
【００６８】
方法論は、Ａｔａｍｎａら（２００１年）の報告を応用する。若年（月齢３ヶ月、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、カリフォルニア州ギルロイ）および高齢（月齢２４ヶ月、国立加齢研究所動物コロニー）の雄性Ｆｉｓｈｅｒ３４４ラットを、対照群およびジアミノフェノチアジン処理群に均等に分割する。試験開始時において、各処理群は、４から５匹のラットから構成され、制御された温度（２５℃）および明期／暗期１２時間周期（６：００時から１８：００時）条件下で、ストレスを最小限にするために大型ケージ内で一緒に飼育する。ラットには標準Ｐｕｒｉｎａげっ歯類固形飼料を自由に摂取させる。メチレンブルーを、２回蒸留した水に加えて最終濃度１００ｎＭで２５日間ラットに投与するが、これはラットの典型的水消費量に基づいてメチレンブルー約１から２μｇ／ｋｇ／日を提供しなければならない。全群とも飲用水の塩分濃度を、１μｍｏｌＮａＣｌ／ｍｌに調節し、水酸化ナトリウムを用いて水のｐＨを６に調節する。メチレンブルーを含むまたは含まない新鮮な水を、毎日供給する。体重を毎週測定し、飼料および水の摂取量を、毎日測定する。飼料または水摂取量を、２４時間周期毎の開始および終了時に測定し、その差をケージ内の動物数で割る。実験終了時に、ラットにエーテル麻酔して心穿刺により屠殺する。肝臓を摘出し、２１０ｍＭマンニトール、７０ｍＭショ糖、５ｍＭＨＥＰＥＳおよび１ｍＭＥＤＴＡを含むｐＨ７の氷冷ミトコンドリア単離緩衝液（ＭＳＨ／ＥＤＴＡ）中に入れる。肝臓を直ちに均質化し、ミトコンドリア分画を分画遠心法により単離する。コハク酸塩５ｍＭ、リン酸塩（４ｍＭ）およびＡＤＰ（０．１５ｍＭ）で維持したミトコンドリア呼吸を、１２５ｍＭＫＣｌおよび５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）中でクラーク酸素電極（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オハイオ州イエロースプリングス）を用い、４μＭロテノンの存在下で測定する。
【００６９】
この実験プロトコールを、未処理のまたはメチレンブルーを２５日間投与した高齢ラット群（ｎ＝１０）中で繰り返す。２回の実験結果を貯蔵し、データ分析する。
【００７０】
移動活性を測定するために試験２１日目にラットを、移動活性の測定のために個別ケージ（長さ４８ｃｍ×幅２５ｃｍ×高さ２０ｃｍ）に移す。ラットを、モニタリング前にその新しい環境に少なくとも４時間気候順応させる。ラットには飼料および水を自由摂取させる。飼育室を、１２時間明期／暗期周期とする（点灯は６：００から１８：００）。２０：００時にラットを、非常に強度の低い光線で照らしてビデオ追跡する。移動活性のモニタリングを、２１：００時に開始して４時間続ける。１時間後に低強度光線を消し、標準明暗周期を続ける。各ラットの移動活性を、４連続夜間、記録する。各ケージの真上に吊したカメラからのビデオ信号を、多目的多地帯（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｏｂｊｅｃｔｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｚｏｎｅｓ）ソフトウェア上で動くＶｉｄｅｏｍｅｘ−Ｖ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オハイオ州コロンバス）コンピュータシステムに接続する。システムは、移動活性パラメータを定量し、校正して移動距離をセンチメートル単位で報告する。
【００７１】
ラット肝臓中の遊離ＧＳＨおよびタンパク質混合ジスルフィドの濃度を測定するために、肝ホモジネートを２００μＬ分取し、直ちに１Ｍメタンスルホン酸（ＭＳＡ）およびＤＴＰＡ２．５ｍＭの５０μＬ中に移し、分析時まで−８０℃で保存する。ＭＳＡホモジネート由来タンパク質を高速遠心分離により沈殿させる。遊離ＧＳＨの定量のために、上澄みを用いる。ペレットを、氷冷ＰＢＳ中に再懸濁することにより３回洗浄する。最終的に、ペレットを、氷冷０．１ＭＴｒｉｓおよび５０ｍＭＤＴＴ（ｐＨ８．３）１００μＬ中に再懸濁し、氷上で温置する。１時間温置したのち、１ＭＭＳＡおよび２．５ｍＭＤＴＰＡ ２０μＬを加えてタンパク質を沈殿させ、ＧＳＨを安定させる。ペレットをタンパク質定量（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に用いるが、この定量は、上澄みを濾過し、タンパク質中の混合ジスルフィドから遊離するＧＳＨの定量のために用いる。いずれの上澄みとも、ＨＰＬＣカラムに注入する前に３０，０００カットオフフィルターで濾過される。注入するタンパク質の量は、ＧＳ−ＳＲおよび遊離ＧＳＨについて各々、５から１０μｇまたは１から３μｇである。遊離ＧＳＨおよびＤＴＴによる還元後にタンパク質混合ジスルフィドから遊離するＧＳＨを、ＨＰＬＣ−ＥＣ検出により定量する。グルタミン酸脱水素酵素およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素の活性を分析する。
【００７２】
上述の実験を、０．１ｎＭから１００ｎＭの血中濃度を達成するように濃度を変化させた更なるジアミノフェノチアジン（ニューメチレンブルー、１−９−ジメチルメチレンブルー、およびアズールＢ）を用いて繰り返す。肝臓におけるＧＳＨレベルの低下で示される高齢ラットにおける飼料消費および移動活性の増加および／または酸化的ストレスにおける軽減をもたらすジアミノフェノチアジン処理は、ヒト臨床治験に適した試薬を提供する。
【実施例５】
【００７３】
ジアミノフェノチアジンの長期投与により、５０歳以上の患者における皮膚の弾力性および活性レベルが改善する。
【００７４】
二重盲検無作為化担体対照試験を、年齢５０から６５歳の範囲の１６０名の被験者を対象に実施する。処置群は、２５μｇジアミノフェノチアジン（アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーまたは１−９−ジメチルメチレンブルー）錠剤が１日３回の食事とともに経口摂取で処方される。臨床モニタリング、主観的自己評価、皮膚弾力性、表皮水和量および皮膚表面脂質の客観的測定法を用いて、２４週間中４回の来診時に各処置の効果を測定する。臨床モニタリングにはしわの本数、右目周囲のしわの深さの測定、および鼻唇溝の深さを含む。結果から、皮膚における各加齢徴候に対する対抗作用および全般的エネルギーレベルの改善における、プラセボを上回るジアミノフェノチアジン処置の一貫した効果が実証される。
【００７５】
前記の実施例および詳細な記述は、例示のために提供されるのであって、制限のためにではない。本明細書中に引用する全ての刊行物および特許出願書は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的および個別的に表示されるかのように、本明細書中に参照により組み込まれる。本発明は前記に、理解を明確にする目的のための例示および例のためにある程度詳細に記述してきたが、本発明を教示する観点より一定の変更および改変が本発明に対して添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなくなされ得ることが、当業者に容易に明らかになるであろう。
【００７６】
参照文献
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【背景技術】
【０００１】
メチレンブルーは、１８７６年に初めて合成されて以来、多様な医学的用途に用いられてきた。例えば、双極性躁うつ病患者をメチレンブルー３００ｍｇ／日で１年間治療したところプラセボ１５ｍｇ／日で治療した場合よりもうつが有意に軽減されたと報告されている（Ｎａｙｌｏｒ、１９８６年）。もう１つの例として、メチレンブルーを用量６５ｍｇで１日３回服用すると慢性腎結石症の管理において有益であると報告されている（Ｓｍｉｔｈ、１９７５年）。また、ラットにおいて、メチレンブルーを用量１ｍｇ／ｋｇで注射したところ、脳の酸化的代謝および記憶保持が改善したこと（Ｃａｌｌａｗａｙ、２００４年）、および老化により増強される酸化ストレスが、血管内皮細胞内のミトコンドリアチトクロームｃオキシダーゼの欠乏と関与していること（Ｘｉｎ、２００３年）も報告されている。
【発明の開示】
【０００２】
発明者らは、しばしばチアジンとも呼ばれるメチレンブルーおよび関連するジアミノフェノチアジンが、以前報告されたメチレンブルーの治療用量よりもより低いオーダーである有効濃度で、細胞を酸化ストレスより保護して細胞老化を遅延させることができることを見出した。
【０００３】
発明の要旨
本発明の１つの態様は、細胞老化を遅延させるための方法であり、該方法は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞をジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含み、該ジアミノフェノチアジンは、構造：
【０００４】
【化５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）、
およびこの互変異性型を有し、該細胞は、１から１００ｎＭのジアミノフェノチアジンを含む培地中でインビトロ有糸分裂活性な細胞であり、該接触させる段階は、該細胞を該培地中で少なくとも１週間培養することを含む。
【０００５】
１つの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。
【０００６】
もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【０００７】
１つの実施形態において、該培地は、１０から１００ｎＭメチレンブルーを含む。
【０００８】
１つの実施形態において、該接触させる段階は、該細胞を前記培地中で少なくとも４週間培養することを含む。
【０００９】
もう１つの実施形態において、該細胞は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤とさらに接触させられる。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、細胞老化を遅延させるための方法であり、該方法は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞をジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含み、該アミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造およびこの互変異性型を有し、該細胞は、個体において原位置にあり、該接触させる段階は、該個体に対して該ジアミノフェノチアジンの５から５００μｇ／日の用量を長期経口投与して有効量を提供することを含む。
【００１１】
１つの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素またはメチルである。
【００１２】
もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【００１３】
１つの実施形態において、該用量は、少なくとも３０日間毎日投与される。
【００１４】
１つの実施形態において、該個体は、４０歳を超える年齢である。
【００１５】
もう１つの実施形態において、該個体は、診断された急性疾患または急性症状を有していない。
【００１６】
１つの実施形態において、該接触させる段階は、該個体にＮ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤を長期経口投与することを更に含む。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、ジアミノフェノチアジン５から５００μｇの経口投与用単位用量および薬学的に許容できる賦形剤を含み、該ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造またはこの互変異性型を有する。
【００１８】
１つの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。
【００１９】
もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【００２０】
もう１つの実施形態において、該組成物は、ジアミノフェノチアジンを特定するおよびこの薬学的用途を規定するラベルと共に包装され、該用途は、細胞老化を遅延させることを含む。
【００２１】
もう１つの実施形態において、該組成物は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤を更に含む。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、細胞老化の遅延を必要とする細胞を有すると決定された個体において細胞老化を遅延させるために、有効量のジアミノフェノチアジンの使用を奨励することを含む、医薬組成物を販売するための方法である。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、ジアミノフェノチアジン１から１００ｎＭを含む細胞培地であり、前記ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造またはこの互変異性型を有する。
【００２４】
１つの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。
【００２５】
もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【００２６】
もう１つの実施形態において、該細胞培地は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたは２つまたは３つのミトコンドリア保護剤を更に含む。
【００２７】
（本発明の具体的態様の詳細な説明）
本発明は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞を、ジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含む、細胞老化を遅延させるための方法を提供する。
【００２８】
本発明のジアミノフェノチアジンは、構造：
【００２９】
【化６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素、メチルまたはエチルである。）、
およびこの互変異性型を有する。
【００３０】
ジアミノフェノチアジンは、電子の非局在化により正に帯電しており、その結果、部分的な正電荷が窒素原子および硫黄原子両方の上に生じる。模式図Ａは、最も単純なジアミノフェノチアジンであるチオニンの化学構造、および電子の非局在化により生成されるチオニンの３つの互変異性型を示す。
【００３１】
【化７】
【００３２】
本発明の１つの実施態様において、該ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。）の構造を有する。本発明のもう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。
【００３３】
該ジアミノフェノチアジンは、細胞老化を遅延させるのに十分な量、好ましくは最小有効用量で細胞に投与される。有糸分裂細胞の場合、細胞老化を遅延させることにより細胞が有糸分裂活性のままである期間が延長される結果、該ジアミノフェノチアジンで処理していない同年齢の対照細胞と比較して、個体数が倍増する。静止期細胞の場合、細胞老化を遅延させる結果、該ジアミノフェノチアジンで処理していない同年齢の対照細胞と比較して、酸化ストレスが低減され、または細胞の活力度もしくは生存率が増大する。細胞老化の遅延において有効であるジアミノフェノチアジンの最小用量は一般に、細胞の種類および状態、培養条件、および選択されるジアミノフェノチアジンにより約１から１００ｎＭの範囲内である。特定の細胞、組織または器官に対するジアミノフェノチアジンの最適量は、実施例１に記載するような日常的な実験を用いて経験的に決定することができる。
【００３４】
細胞老化の遅延が必要であると特に決定される細胞は、細胞老化に関係するいずれかの細胞であってよい。本明細書中において、単数形「１つの」および「該」は、文脈が明らかに別の様に示していない限り、単数並びに複数の両方を表す。例えば用語「細胞」は、単数または複数の細胞を含み、「少なくとも１つの細胞」という句と同等であると見なすことができる。好ましい実施形態において、該細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。
【００３５】
本発明の１つの実施形態において、該細胞は、培地中でインビトロ有糸分裂活性細胞である。培養された細胞の老化の遅延は、培養法の生産性を増加させ、その結果特定の用途のための細胞の数が非常に多数となるためにおよび／または細胞がその意図する用途に適した健康および活力度を有する期間を延長するために必要であり得る。該細胞は、未分化であっても、分化中であってもおよび／または分化されていてもよい。１つの実施形態において、該細胞は、人工皮膚、胚性のまたは成体の前駆細胞または幹細胞、神経細胞、造血細胞、骨髄細胞、筋細胞などのために用いられる、線維芽細胞および／またはケラチノサイトなどの異種細胞移植または自家細胞移植の療法に用いられる。特定の実施形態において、特に幹細胞についての培養条件は、０．１から２０％の、好ましくは１から２０％の、より好ましくは５から２０％の酸素、および／または１から２０ｍＭの、好ましくは５から２０ｍＭのグルコースを含む。
【００３６】
該細胞は、ジアミノフェノチアジン補充培地中で、細胞老化遅延の望ましい程度を達成するのに必要なできるだけ長い期間培養され得る。１つの実施形態において、該細胞は、少なくとも１週間ジアミノフェノチアジン補充培地中で連続的に培養され、必要であれば継代する。さらなる実施形態において、該細胞は、ジアミノフェノチアジン補充培地中で少なくとも２、４、または８週間培養される。１つの実施形態において、該細胞は、ジアミノフェノチアジン補充培地中で少なくとも１２週間連続的に培養される。もう１つの実施形態において、該培地は、１から１００ｎＭのジアミノフェノチアジンを含み、および接触させる段階は、細胞を培地中で少なくとも１週間培養することを含む。
【００３７】
本発明の方法は、細胞老化において得られる遅延を検出する段階をさらに含み得る。インビトロ細胞について、細胞老化における遅延は、実施例１に記載されるように、ジアミノフェノチアジン処理していない同年齢の対照細胞と比較して、ジアミノフェノチアジン処理した細胞の有糸分裂活性の持続時間および／または寿命の増加を測定することにより、直接検出することができる。細胞老化において得られる遅延は、例えば同年齢の対照細胞に対して細胞活力度における増加（例えば、市販の細胞活力度測定キット（例：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いることによる）、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン、グルタチオン（Ａｔａｍｎａ、２００１年を参照）もしくはニトロチロシン（例えば、ＯｘｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ、オレゴン州ポートランド）などの酸化的ストレスのマーカーを測定することにより、またはローダミン１２３の蓄積、チトクロームｃオキシダーゼ活性の低減およびミトコンドリアアコニターゼの減衰（Ａｔａｍｎａ、２０００年参照）などの、ミトコンドリアにおける年齢依存的変化の遅延の検出によって推測的に検出することもできる。
【００３８】
本発明の１つの実施形態において、該細胞は、ミトコンドリアを保護する用量、好ましくは最小用量の、１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤とさらに接触させられる。このような薬剤は、Ｎ−ヒドロキシルアミン（例えば、Ａｔａｍｎａ、２０００年；Ａｍｅｓ，２００２年；米国特許第６，４５５，５８９号）、アセチルカルニチン、およびリポ酸（例えば、Ｈａｇｅｎ，２０００年）を含み、有効である最小用量は、当分野で認められた文献（本明細書に引用した刊行物など）から容易に、および／または本明細書中に開示した分析法を用いて経験的に、決定される。例として、ヒトにおけるＮ−ヒドロキシルアミンのミトコンドリア保護用量は、一般に約１００ｕｇから１ｇ、好ましくは約１０ｕｇから１ｇ、より好ましくは少なくとも１００ｕｇ、より好ましくは少なくとも１ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、最も好ましくは少なくとも１００ｍｇである。１つの実施形態において、該細胞はさらにアセチルカルニチンおよびリポ酸と接触させられる（例：米国特許第５，９１６，９１２号）。例として、この組み合わせのミトコンドリア保護用量は、一般にリポ酸約１から５０ｍｇ／ｋｇ宿主／日と一緒のカルニチン約１から５０ｍｇ／ｋｇ宿主／日、好ましくはリポ酸約１０ｍｇ／ｋｇ宿主／日と一緒のカルニチン約１０ｍｇ／ｋｇ宿主／日である。
【００３９】
本発明のもう１つの態様は、ジアミノフェノチアジンの約１から１００ｎＭを含む細胞培地であり、該ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造またはその互変異性型を有する。１つの好ましい実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンはアズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。いずれかの細胞培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＰＲＭＩ−１６４０、ハムのＦ−１０およびＦ−１２培地など）は、該ジアミノフェノチアジンを補充されてよい。該細胞培地は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つまたはそれ以上のミトコンドリア保護剤を更に含むことができる。１つの実施形態において、該細胞培地はさらにアセチルカルニチンおよびリポ酸を含む。
【００４０】
本発明のもう１つの実施形態において、該細胞は個体において原位置にあり、接触させる段階は、個体に対してジアミノフェノチアジンの５から５００μｇ／日の用量を長期経口投与して有効用量を提供することを含む。原位置にある細胞の老化の遅延は、正常または早期老化に伴う効果を遅延させるために所望され得る。例えば、ヒト皮膚における線維芽細胞の老化は、コラーゲン生成の低下によって引き起こされるしわ形成および弾力性の損失などの老化の徴候を伴っている。さらに、ミトコンドリアにおける加齢による変化は移動活性の低減を伴っている（例えば、Ａｔａｍｎａ、２００１年）。ある実施形態において、該個体は４０歳を超える年齢である。さらなる実施形態において、該個体は５０、６５または７０歳を超える年齢である。もう１つの実施形態において、該個体は、ミトコンドリア関連疾患、特に、ＭＥＬＡＳ、ＭＥＲＲＦ、ＮＡＲＰ、筋神経性胃腸障害および脳症（ＭＮＧＩＥ）、ピアソン・マーロー症候群、カーンズ・セイヤー−ＣＰＥＯ、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アミノグリコシド関連聴覚消失、難聴を伴う糖尿病などのミトコンドリア関連疾患である神経障害、心筋症または脳症を有すると診断される。もう１つの実施形態において、該個体は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病などの慢性神経変性疾患または、脳卒中などの急性神経変性疾患を有すると診断される。もう１つの実施形態において、該個体は、インスリン抵抗性または糖尿病、特にＩＩ型糖尿病を有するかまたは有すると診断される。もう１つの好ましい実施形態において、該個体は、急性疾患または急性症状、特に、ジアミノフェノチアジン療法が特定的に指示されるかまたは禁忌となる疾患および症状を有していない。このような疾患または症状の例としては、イホスファミドとメチレンブルーとの併用療法（Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ、１９９８年）で治療される癌、慢性腎結石症（Ｓｍｉｔｈ、１９７５年）、躁うつ精神病（Ｎａｙｌｏｒ、１９８６年）およびマラリア（Ｖｅｎｎｅｒｓｔｒｏｍ、１９９５年）が挙げられる。
【００４１】
１つの実施形態において、該用量は、０．１から１０．０μｇ／ｋｇ体重／日である。１つの好ましい実施形態において、該用量によってジアミノフェノチアジン血中濃度約１．０から１００ｎＭを達成する。他の実施形態において、該用量によってジアミノフェノチアジン脳内濃度約１．０から１００ｎＭを達成する。体重約１６０ポンド（ｌｂｓ）で血液約５リットルを有するヒトに対して、この濃度を達成するために必要なメチレンブルー（分子量３１９）の１日用量は約１．６から１６０μｇである。該経口用量は、一般に、長期間、通常は少なくとも３０日間、毎日１から３回投与される。いくつかの場合において、該経口用量は長期間、すなわち少なくとも３ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、より好ましくは少なくとも１２ヶ月間にわたって定期的に投与され、ここで、定期的とは、週に、少なくとも１回、好ましくは少なくとも２から３回、より好ましくは少なくとも７回（毎日）である。特定の実施形態において、該組成物は１日１回、２回、３回または４回投与される。さらなる実施形態において、該個体は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンまたはリポ酸などのミトコンドリア保護剤をさらに長期間経口投与される。もう１つの実施形態において、該個体は、アセチルカルニチンおよびリポ酸をさらに長期間経口投与される。
【００４２】
ある実施形態において、該方法は、個体における得られた細胞老化の遅延を検出する段階を更に含む。原位置にある細胞に対して、細胞老化の遅延は一般に、例えば処置前と比較して向上した弾力性または増加した皮膚の厚みなどの細胞活力度における上昇；酸化ストレスのマーカーの濃度における低下；チトクロームｃオキシダーゼの活性度または濃度の上昇などのミトコンドリアにおける年齢依存的変化の遅延；および／または個体における移動活性の増大；を検出することにより、推測的に検出される。
【００４３】
本発明のもう１つの態様は、ジアミノフェノチアジン５から５００μｇの経口投与用単位用量および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物であり、該ジアミノフェノチアジンは、式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）の構造またはこの互変異性型を有する。１つの実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素またはメチルである。もう１つの実施形態において、該ジアミノフェノチアジンは、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される。１つの好ましい実施形態において、該ジアミノフェノチアジンはメチレンブルーである。更なる実施形態において、該ジアミノフェノチアジンはメチレンブルーであり、単位用量は、２００μｇ、１５０μｇ、１００μｇ、５０μｇ、４０μｇ、２５μｇおよび１０μｇから選択される。経口用量は、経口投与に適したいずれかの形態において調製されてよく、その形態は、錠剤、カプセル剤、口中錠、トローチ剤、ハードキャンディ剤、散剤、定量スプレー剤、クリーム、座剤などを含む。該組成物は、ゼラチン、油などの薬学的に許容できる賦形剤と組み合わされ、また更なる有効成分を含むことができる。１つの実施形態において、該医薬組成物は、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択されるミトコンドリア保護剤を更に含む。もう１つの実施形態において、該組成物は、アセチルカルニチンおよびリポ酸を更に含む。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ジアミノフェノチアジンを識別し、酸化による損害および／または細胞老化の軽減のためのその使用を指示するラベルと共に包装される。
【００４５】
本発明のもう１つの態様は、上述のジアミノフェノチアジンまたは上述の医薬組成物のいずれかを販売するための方法であり、該方法は、細胞老化の遅延を必要とする細胞を有すると決定された個体における細胞老化を遅延させるためのジアミノフェノチアジンの有効量の使用を促進することを含む。１つの実施形態において、該個体は、４０歳を超える年齢である。１つのさらなる実施形態において、該個体は、皮膚弾力性の改善および／またはしわの減少および／またはエネルギーレベルの上昇により皮膚老化の徴候を軽減するためにサプリメントを摂取することを望み、ジアミノフェノチアジンはこうした使用のために販促される。製品ラベル、包装宣伝物、インターネット販売、テレビコマーシャル、新聞および雑誌記事などの従来のいずれかの媒体を、販売のために用いることができる。販売は一般に、細胞老化を遅延させるためのジアミノフェノチアジンの使用およびこのような使用による有望な健康上の利点（改善された皮膚の弾力性、しわの減少および／または上昇したエネルギーレベルなど）の記述を含む。
【実施例１】
【００４６】
ジアミノフェノチアジンは、組織培養中のヒト肺の線維芽細胞（ＩＭＲ９０）の老化を遅延させる。
【００４７】
正常なヒト上皮の線維芽細胞（ＩＭＲ９０）を、細胞集団倍化数（ＰＤＬ）１０．８５にてＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。ＰＤＬを、ｌｏｇ２（Ｄ／Ｄ０）（ＤおよびＤ０は、各々採取時および播種時の細胞の密度として定義される。）として算出した。保存培養を、１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地１０ｍＬ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有する１００ｍｍコーニング組織培養皿で増殖させた。保存培養を、週に１回集密化に近づいたときに分割した。細胞を、３７℃、５分間のトリプシン処理により採取し、速やかに完全ダルベッコ変法イーグル培地５ｍＬに収集し、完全ダルベッコ変法イーグル培地５ｍＬで１回洗浄し、３７℃で１０から１５分間温置して細胞を回収可能にした。
【００４８】
複製寿命に対するジアミノフェノチアジンの効果を試験するために、ＩＭＲ９０細胞を空気中、０．５×１０６／１００ｍｍ皿に播種した。ジアミノフェノチアジン（メチレンブルーまたはチオニン）を１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１０００ｎＭの濃度で培地に加えた。培養物を、７日ごとに収穫し、計数し、ＰＤＬを算出した。細胞の一部を用いて新たな皿の新鮮な培地（対照）または上述の新鮮なジアミノフェノチアジン補充培地に接種した。細胞を５％酸素で培養した以外は、培養条件および方法を、同濃度のメチレンブルー（および対照条件）を用いて繰り返した。
【００４９】
メチレンブルーは、空気中で少なくとも２５から３０の細胞集団倍化数で播種したＩＭＲ９０細胞の老化を遅延させた。最適濃度は、１０から１００ｎＭの間である。チオニンも１００ｎＭで有効である。メチレンブルーは、５％酸素で播種したＩＭＲ９０細胞の老化をも遅延させた。５％酸素中でのＰＤＬにおける増加は１０から１５の間の範囲であった。空気中の酸素濃度が約２０％である一方、酸素５％はほぼ生理学的濃度であり、その結果、通常は培養中のヒト細胞に対するＰＤＬが著しく、より多くなる。
【００５０】
ＩＭＲ９０細胞中のミトコンドリア複合体ＩＶの濃度は、サブユニットＩＩ（複合体全体を組み立てるために不可欠な中核サブユニット）に対する特異的抗体、ウエスタンブロット法、およびＮＩＨ画像を用いるタンパク質密度測定を用いて測定した。メチレンブルーにより、複合体ＩＶの濃度は、同年齢の対照に比べ約３０％増加した。メチレンブルーの効果は釣り鐘型であり、１０００ｎＭの濃度においてメチレンブルーは、ミトコンドリアからの複合体ＩＶの除去を引き起こした。チオニンによる処置後にも複合体ＩＶの増加が見られた。
【００５１】
もう１つの実験において、メチレンブルー処理した細胞の老化に対する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果を試験した。ＩＭＲ９０細胞を、Ｈ２Ｏ２処理の前に初期密度０．５×１０６／皿で播種し、メチレンブルー存在下で２週間増殖させた。その後、細胞を１週間毎に採取し、計数し、メチレンブルーおよび／またはＨ２Ｏ２１０μＭを添加して、または添加せずに播種した。メチレンブルー処理せずに過酸化水素処理した細胞は、老化が加速した。これらの細胞を１００ｎＭのメチレンブルーで連続的に処理した場合、Ｈ２Ｏ２により誘発された老化は、防止された。
【実施例２】
【００５２】
ジアミノフェノチアジンは増殖された臍帯血造血幹細胞の老化を遅延させる。
【００５３】
ヒト臍帯血（ＵＣＢ）細胞は、先天性異常または悪性疾患を患う小児において、同種間幹細胞移植のための造血前駆体の魅力的な源となってきた。末梢血幹細胞または骨髄（ＢＭ）と比較してのＵＣＢ細胞の１つの主要な長所は、臍帯血移植片が引き起こす急性移植片対宿主病の発生率を低減することである。ＵＣＢ細胞は収集し貯蔵するのが容易であるけれども、成人向け移植プロトコール中への使用は、１件の臍帯血収穫に含まれる前駆細胞の個数を限定することによって制限されてきた。移植までの時間が長いこと、並びに非常に初期段階の造血前駆細胞が存在することにより、血液病専門医は、臨床使用のためのＵＣＢ幹細胞用の生体外増殖プロトコールを開発することとなった。
【００５４】
幹細胞研究における主な課題の１つは、原始的区画の細胞および前駆細胞を増殖させるために、造血幹細胞のエクスビボ自己複製分裂を刺激することにより、移植可能な造血幹細胞（ＨＳＣ）の数を増加させることである。ＵＣＢ細胞は、高い増殖能力を示し、これにより数週間以内に、造血成長因子の種々の組み合わせに応じて細胞の大規模な増殖をもたらす。異なる培地並びに異なる成長因子の最適組み合わせの混合物により、前駆細胞が効率よく増殖する結果となったが、長期間培養を開始する細胞の増幅は、より困難であった。
【００５５】
Ｃｈｉｖｕら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００４ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；８（２）：２２３−３１）の報告を応用した一連の実験において、発明者らは、臍帯血幹細胞のインビトロ維持のための数種類の培養プロトコールにおけるジアミノフェノチアジンの有益な使用を実証する。その実証の結果は、ジアミノフェノチアジンを補充したＰＣＭおよびＢＭ一次培養が、インビトロ造血細胞の増殖のための改善されたサポートおよび培養開始細胞を単核細胞（ＭＮＣ）分画として接種されるように長期間維持することを提供することを示す。
【００５６】
細胞
血液を、機関のガイドラインに従い、通常のおよび日常の満期産時に抗凝固剤としてクエン酸リン酸デキストロースアデニンを用いて収集する。単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）（密度勾配＝１．００７ｇ／ｍｌ）上で分離し、Ｉｓｃｏｖｅのダルベッコ変法培地（ＩＭＤＭ）中に再懸濁して計数する。
【００５７】
増殖培養
低密度ＭＮＣを、血清を含まない以下の組成の培地に最終濃度２×１０６細胞数／ｍｌとなるように再懸濁する。該組成は、１％ウシ血清アルブミン（Ｍｅｒｃｋ）、５×１０−４Ｍ ２−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび溶解したての１０−６Ｍ ヒドロコルチゾンを補充したダルベッコ培地である。細胞懸濁液を２４ウェルプレート（１ｍｌ／ウェル）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で温置する。ヒト成長因子を、滴定試験において最高の細胞増殖を提供する濃度で用いる。滴定試験では、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン６（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、２０ｎｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）および２Ｕ／ｍｌエリスロポエチン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）を用いる。第２の増殖混合物は２０％胎盤条件培地（ＰＣＭ）（前述の方法で入手−Ｃｈｉｖｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６：６０９−６２０，２００２）および２％自己血清を基礎としている。８種類のジアミノフェノチアジン（アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルー）の各々を、別々に、３つの一連の濃度：１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭで試験する。３日後、有核細胞および生存細胞の総数を、トリパンブルー排除試験を用いて測定する。
【００５８】
フィーダー層の確立
事前に形作る間質を生成するために、長期的骨髄培養をマウス骨髄細胞を用いて確立する。骨髄を、同体積のＰＢＳおよび密度勾配遠心分離により分離される単核細胞と混合する。洗浄した細胞を、間質性培地（１０％ウシ胎仔血清、４００ＵＩ／ｍｌペニシリン、２００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１．０μｍｏｌ／ｌヒドロコルチゾンを補充したＦ１２培地（Ｓｉｇｍａ））に再懸濁する。細胞を、培地の半量を週２回交換しながら、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で維持する。２週間後、集密接着層由来の細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いる消化により回収し、更なる実験のために６ウェルプレートに移す。培養物を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベートする。集密間質層が形成される場合、培養物を２０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で４時間処理し、次いで、徹底的に洗浄して薬物を除去する。最終的に細胞は生存可能で代謝的に活性であるが、細胞周期が遮断される。成長因子およびＰＣＭを補充した更なる培養物も同様に確立される。
【００５９】
フローサイトメトリー分析
標識細胞を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて得る。対照細胞および誘導細胞を収集し、４℃でＰＢＳ、ＢＳＡ０．１％、アジ化ナトリウム０．１％中で２回洗浄し、最終的に１％パラホルムアルデヒド中に固定する。全てのサンプルの分析を、増殖の前後にＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行い、前駆細胞サブセットを分類する。１万のイベントが得られ、データをＷｉｍＭＤＩで分析する。ＣＤ３４＋細胞を、リンパ球ゲートの百分率として測定する（ＣＤ４５＋細胞の低波長側に分布する細胞に照準を合わせ、分析を通してこれを維持する。ＣＤ１４＋細胞を、除外する）。
【００６０】
半固形クローン分析
１×１０５個のＵＣＢ細胞を、３０％ウシ胎児血清を補充したＩＭＤＭ、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌＧ−ＣＳＦ、２Ｕ／ｍｌエリスロポエチン，１０−４Ｍ／Ｌ２−メルカプトエタノールおよび１％ウシ血清アルブミンを含む０．３％寒天培地中に平板接種する。培養皿を３７℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気中で温置する。培養物を、１４日後に、赤血球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）および混合コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の存在について評価する。
【００６１】
統計解析
大部分のパラメータに対して、中央値および範囲を求める。異なる条件を評価する実験を、対応のあるサンプルに対するｔ−検定を用いて比較する。両側ｐ値が０．０５を下回った場合、統計学的に有意であると推定される。
【００６２】
ＣＤ３４＋細胞の増殖効率
臍帯血由来のＭＮＣの培養は、フィーダー細胞層、外因性サイトカイン混合物（ＩＬ−６，Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン）の補充、またはＰＣＭなどの種々の増殖条件の存在下で開始する。増殖効率は、種々の細胞サブセットの増殖倍率として表され、増殖倍率は対照未処理細胞に対する細胞の増加である。
【００６３】
ＣＤ３４＋集団のフローサイトメトリー分析により、標準サイトカインに基づくインビトロＵＣＢ増殖条件において、ＰＣＭ中の定量されたナノモル濃度の各々の濃度のジアミノフェノチアジンをフィーダー層との組み合わせで用いることの明らかな利点が実証される。結果は、ＣＤ３４＋細胞個体数および長期培養開始細胞数の対照細胞を上回る増加を示した。ジアミノフェノチアジン処理した培養物は、ジアミノフェノチアジン処理していない同年齢の対照細胞と比較して、一貫して細胞集団倍化数の増加を実証する。
【実施例３】
【００６４】
ジアミノフェノチアジンは、増殖ヒト胚性幹細胞の老化を遅延させる。
【００６５】
平行した一連の実験において、発明者らは、ヒト胚性幹細胞のインビトロ維持のための培養プロトコールにおける同じジアミノフェノチアジンの有利な使用を実証する。Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒら（２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，１１３０７−１１３１２）の報告を応用したプロトコールにおいて、ヒトＥＳ細胞（Ｈ９クローン（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２、１１４５−１１４７））は、８０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ（ＥＳ細胞用に最適化したダルベッコ変法イーグル培地（／ＢＲＬ））、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ ＳＲ（血清を含まない調合物（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ））、１ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸原液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ））および１０３単位／ｍｌ ＬＩＦ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ））中のマウス胚線維芽細胞上で成長させる。
【００６６】
上述のように、８種類のジアミノフェノチアジン（アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルー）を、各々別々に一連の４つの濃度：１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭで試験する。ジアミノフェノチアジン処理した培養物は、ジアミノフェノチアジン処理していない同年齢の対照細胞と比較して、細胞集団倍化数の増加を一貫して実証する。
【実施例４】
【００６７】
高齢ラットにおける飼料消費および移動活性、ならびにこれらの肝臓中の加齢による酸化的変化に及ぼす、ジアミノフェノチアジンの効果。
【００６８】
方法論は、Ａｔａｍｎａら（２００１年）の報告を応用する。若年（月齢３ヶ月、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、カリフォルニア州ギルロイ）および高齢（月齢２４ヶ月、国立加齢研究所動物コロニー）の雄性Ｆｉｓｈｅｒ３４４ラットを、対照群およびジアミノフェノチアジン処理群に均等に分割する。試験開始時において、各処理群は、４から５匹のラットから構成され、制御された温度（２５℃）および明期／暗期１２時間周期（６：００時から１８：００時）条件下で、ストレスを最小限にするために大型ケージ内で一緒に飼育する。ラットには標準Ｐｕｒｉｎａげっ歯類固形飼料を自由に摂取させる。メチレンブルーを、２回蒸留した水に加えて最終濃度１００ｎＭで２５日間ラットに投与するが、これはラットの典型的水消費量に基づいてメチレンブルー約１から２μｇ／ｋｇ／日を提供しなければならない。全群とも飲用水の塩分濃度を、１μｍｏｌＮａＣｌ／ｍｌに調節し、水酸化ナトリウムを用いて水のｐＨを６に調節する。メチレンブルーを含むまたは含まない新鮮な水を、毎日供給する。体重を毎週測定し、飼料および水の摂取量を、毎日測定する。飼料または水摂取量を、２４時間周期毎の開始および終了時に測定し、その差をケージ内の動物数で割る。実験終了時に、ラットにエーテル麻酔して心穿刺により屠殺する。肝臓を摘出し、２１０ｍＭマンニトール、７０ｍＭショ糖、５ｍＭＨＥＰＥＳおよび１ｍＭＥＤＴＡを含むｐＨ７の氷冷ミトコンドリア単離緩衝液（ＭＳＨ／ＥＤＴＡ）中に入れる。肝臓を直ちに均質化し、ミトコンドリア分画を分画遠心法により単離する。コハク酸塩５ｍＭ、リン酸塩（４ｍＭ）およびＡＤＰ（０．１５ｍＭ）で維持したミトコンドリア呼吸を、１２５ｍＭＫＣｌおよび５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）中でクラーク酸素電極（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オハイオ州イエロースプリングス）を用い、４μＭロテノンの存在下で測定する。
【００６９】
この実験プロトコールを、未処理のまたはメチレンブルーを２５日間投与した高齢ラット群（ｎ＝１０）中で繰り返す。２回の実験結果を貯蔵し、データ分析する。
【００７０】
移動活性を測定するために試験２１日目にラットを、移動活性の測定のために個別ケージ（長さ４８ｃｍ×幅２５ｃｍ×高さ２０ｃｍ）に移す。ラットを、モニタリング前にその新しい環境に少なくとも４時間気候順応させる。ラットには飼料および水を自由摂取させる。飼育室を、１２時間明期／暗期周期とする（点灯は６：００から１８：００）。２０：００時にラットを、非常に強度の低い光線で照らしてビデオ追跡する。移動活性のモニタリングを、２１：００時に開始して４時間続ける。１時間後に低強度光線を消し、標準明暗周期を続ける。各ラットの移動活性を、４連続夜間、記録する。各ケージの真上に吊したカメラからのビデオ信号を、多目的多地帯（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｏｂｊｅｃｔｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｚｏｎｅｓ）ソフトウェア上で動くＶｉｄｅｏｍｅｘ−Ｖ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オハイオ州コロンバス）コンピュータシステムに接続する。システムは、移動活性パラメータを定量し、校正して移動距離をセンチメートル単位で報告する。
【００７１】
ラット肝臓中の遊離ＧＳＨおよびタンパク質混合ジスルフィドの濃度を測定するために、肝ホモジネートを２００μＬ分取し、直ちに１Ｍメタンスルホン酸（ＭＳＡ）およびＤＴＰＡ２．５ｍＭの５０μＬ中に移し、分析時まで−８０℃で保存する。ＭＳＡホモジネート由来タンパク質を高速遠心分離により沈殿させる。遊離ＧＳＨの定量のために、上澄みを用いる。ペレットを、氷冷ＰＢＳ中に再懸濁することにより３回洗浄する。最終的に、ペレットを、氷冷０．１ＭＴｒｉｓおよび５０ｍＭＤＴＴ（ｐＨ８．３）１００μＬ中に再懸濁し、氷上で温置する。１時間温置したのち、１ＭＭＳＡおよび２．５ｍＭＤＴＰＡ ２０μＬを加えてタンパク質を沈殿させ、ＧＳＨを安定させる。ペレットをタンパク質定量（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に用いるが、この定量は、上澄みを濾過し、タンパク質中の混合ジスルフィドから遊離するＧＳＨの定量のために用いる。いずれの上澄みとも、ＨＰＬＣカラムに注入する前に３０，０００カットオフフィルターで濾過される。注入するタンパク質の量は、ＧＳ−ＳＲおよび遊離ＧＳＨについて各々、５から１０μｇまたは１から３μｇである。遊離ＧＳＨおよびＤＴＴによる還元後にタンパク質混合ジスルフィドから遊離するＧＳＨを、ＨＰＬＣ−ＥＣ検出により定量する。グルタミン酸脱水素酵素およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素の活性を分析する。
【００７２】
上述の実験を、０．１ｎＭから１００ｎＭの血中濃度を達成するように濃度を変化させた更なるジアミノフェノチアジン（ニューメチレンブルー、１−９−ジメチルメチレンブルー、およびアズールＢ）を用いて繰り返す。肝臓におけるＧＳＨレベルの低下で示される高齢ラットにおける飼料消費および移動活性の増加および／または酸化的ストレスにおける軽減をもたらすジアミノフェノチアジン処理は、ヒト臨床治験に適した試薬を提供する。
【実施例５】
【００７３】
ジアミノフェノチアジンの長期投与により、５０歳以上の患者における皮膚の弾力性および活性レベルが改善する。
【００７４】
二重盲検無作為化担体対照試験を、年齢５０から６５歳の範囲の１６０名の被験者を対象に実施する。処置群は、２５μｇジアミノフェノチアジン（アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーまたは１−９−ジメチルメチレンブルー）錠剤が１日３回の食事とともに経口摂取で処方される。臨床モニタリング、主観的自己評価、皮膚弾力性、表皮水和量および皮膚表面脂質の客観的測定法を用いて、２４週間中４回の来診時に各処置の効果を測定する。臨床モニタリングにはしわの本数、右目周囲のしわの深さの測定、および鼻唇溝の深さを含む。結果から、皮膚における各加齢徴候に対する対抗作用および全般的エネルギーレベルの改善における、プラセボを上回るジアミノフェノチアジン処置の一貫した効果が実証される。
【００７５】
前記の実施例および詳細な記述は、例示のために提供されるのであって、制限のためにではない。本明細書中に引用する全ての刊行物および特許出願書は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的および個別的に表示されるかのように、本明細書中に参照により組み込まれる。本発明は前記に、理解を明確にする目的のための例示および例のためにある程度詳細に記述してきたが、本発明を教示する観点より一定の変更および改変が本発明に対して添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなくなされ得ることが、当業者に容易に明らかになるであろう。
【００７６】
参照文献
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Ａｔａｍｎａら、“Ｎ−ｔ−Ｂｕｔｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｒｎｉｎｅ ｉｓ ａｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｔｈａｔ ｒｅｖｅｒｓｅｓ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．”ＦＡＳＥＢ Ｊ．（２００１）Ｏｃｔ；１５（１２）：２１９６−２０４．
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞老化を遅延させるための方法であり、
前記方法は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞を、ジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含み、前記ジアミノフェノチアジンは、構造：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素、メチルまたはエチルである。）、
およびこの互変異性型を有し、
前記細胞は、１から１００ｎＭジアミノフェノチアジンを含む培地中でインビトロ有糸分裂活性な細胞であり、前記接触させる段階は、前記細胞を前記培地中で少なくとも１週間培養することを含む、前記方法。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’が独立して水素またはメチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ジアミノフェノチアジンが、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ジアミノフェノチアジンがメチレンブルーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
培地が、１０から１００ｎＭのメチレンブルーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
接触させる段階が、前記細胞を前記培地中で少なくとも４週間培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培地が、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択されるミトコンドリア保護剤の有効量を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
培地が、アセチルカルニチンおよびリポ酸の有効量を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
培地が、Ｎ−ヒドロキシルアミンの有効量を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞老化を遅延させる方法であり、
前記方法は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞をジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含み、前記ジアミノフェノチアジンは、構造：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素、メチルまたはエチルである。）およびこの互変異性型を有し、
前記細胞は、個体において原位置にあり、前記接触させる段階は、前記個体に対して前記ジアミノフェノチアジンの５から５００μｇ／日の用量を長期経口投与して前記有効量を提供することを含む、前記方法。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’が独立して水素またはメチルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ジアミノフェノチアジンが、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ジアミノフェノチアジンがメチレンブルーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
用量が少なくとも３０日間毎日投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
個体が４０歳を超える年齢である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
個体が、診断された急性疾患または急性症状を有していない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
接触させる段階が、個体にＮ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つのミトコンドリア保護剤を長期経口投与することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
接触させる段階が、個体にアセチルカルニチンおよびリポ酸を長期経口投与することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
接触させる段階が、個体にＮ−ヒドロキシルアミンを長期経口投与することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
接触させる段階が、個体にアセチルカルニチン、リポ酸およびＮ−ヒドロキシルアミンを長期経口投与することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
ジアミノフェノチアジン５から５００μｇの経口投与用単位用量および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物であり、前記ジアミノフェノチアジンが、構造：
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素、メチルまたはエチルである。）
またはこの互変異性型を有する、前記医薬組成物。
【請求項２２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’が独立して水素またはメチルである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ジアミノフェノチアジンが、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
ジアミノフェノチアジンがメチレンブルーである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
ジアミノフェノチアジンを識別するおよびこの薬学的用途を指示するラベルと共に包装され、前記用途が細胞老化を遅延させることを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つのミトコンドリア保護剤を更に含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
ジアミノフェノチアジン１から１００ｎＭを含む細胞培地を含む組成物であり、前記ジアミノフェノチアジンが、構造：
【化４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）、
またはこの互変異性型を有する、前記組成物。
【請求項２８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’が独立して水素またはメチルである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ジアミノフェノチアジンが、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
ジアミノフェノチアジンがメチレンブルーである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つのミトコンドリア保護剤を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３２】
アセチルカルニチンおよびリポ酸を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｎ−ヒドロキシルアミンを更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３５】
組成物中で少なくとも１週間成長させた有糸分裂活性な細胞の群を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３６】
細胞老化の遅延を必要とする細胞を有すると決定された個体において細胞老化を遅延させるためにジアミノフェノチアジンの有効量の使用を奨励することを含む、請求項２７に記載の医薬組成物を販売するための方法。
【請求項１】
細胞老化を遅延させるための方法であり、
前記方法は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞を、ジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含み、前記ジアミノフェノチアジンは、構造：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素、メチルまたはエチルである。）、
およびこの互変異性型を有し、
前記細胞は、１から１００ｎＭジアミノフェノチアジンを含む培地中でインビトロ有糸分裂活性な細胞であり、前記接触させる段階は、前記細胞を前記培地中で少なくとも１週間培養することを含む、前記方法。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’が独立して水素またはメチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ジアミノフェノチアジンが、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ジアミノフェノチアジンがメチレンブルーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
培地が、１０から１００ｎＭのメチレンブルーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
接触させる段階が、前記細胞を前記培地中で少なくとも４週間培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培地が、Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択されるミトコンドリア保護剤の有効量を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
培地が、アセチルカルニチンおよびリポ酸の有効量を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
培地が、Ｎ−ヒドロキシルアミンの有効量を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞老化を遅延させる方法であり、
前記方法は、細胞老化を遅延させる必要があると具体的に決定された細胞をジアミノフェノチアジンの有効量と接触させる段階を含み、前記ジアミノフェノチアジンは、構造：
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素、メチルまたはエチルである。）およびこの互変異性型を有し、
前記細胞は、個体において原位置にあり、前記接触させる段階は、前記個体に対して前記ジアミノフェノチアジンの５から５００μｇ／日の用量を長期経口投与して前記有効量を提供することを含む、前記方法。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’が独立して水素またはメチルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ジアミノフェノチアジンが、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ジアミノフェノチアジンがメチレンブルーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
用量が少なくとも３０日間毎日投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
個体が４０歳を超える年齢である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
個体が、診断された急性疾患または急性症状を有していない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
接触させる段階が、個体にＮ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つのミトコンドリア保護剤を長期経口投与することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
接触させる段階が、個体にアセチルカルニチンおよびリポ酸を長期経口投与することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
接触させる段階が、個体にＮ−ヒドロキシルアミンを長期経口投与することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
接触させる段階が、個体にアセチルカルニチン、リポ酸およびＮ−ヒドロキシルアミンを長期経口投与することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
ジアミノフェノチアジン５から５００μｇの経口投与用単位用量および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物であり、前記ジアミノフェノチアジンが、構造：
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は、独立して水素、メチルまたはエチルである。）
またはこの互変異性型を有する、前記医薬組成物。
【請求項２２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’が独立して水素またはメチルである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ジアミノフェノチアジンが、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
ジアミノフェノチアジンがメチレンブルーである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
ジアミノフェノチアジンを識別するおよびこの薬学的用途を指示するラベルと共に包装され、前記用途が細胞老化を遅延させることを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つのミトコンドリア保護剤を更に含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
ジアミノフェノチアジン１から１００ｎＭを含む細胞培地を含む組成物であり、前記ジアミノフェノチアジンが、構造：
【化４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’は独立して水素、メチルまたはエチルである。）、
またはこの互変異性型を有する、前記組成物。
【請求項２８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’およびＲ４’が独立して水素またはメチルである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ジアミノフェノチアジンが、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、トルイジンブルー、メチレンブルー、ニューメチレンブルーおよび１−９−ジメチルメチレンブルーからなる群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
ジアミノフェノチアジンがメチレンブルーである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸からなる群より選択される１つのミトコンドリア保護剤を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３２】
アセチルカルニチンおよびリポ酸を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｎ−ヒドロキシルアミンを更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｎ−ヒドロキシルアミン、アセチルカルニチンおよびリポ酸を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３５】
組成物中で少なくとも１週間成長させた有糸分裂活性な細胞の群を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３６】
細胞老化の遅延を必要とする細胞を有すると決定された個体において細胞老化を遅延させるためにジアミノフェノチアジンの有効量の使用を奨励することを含む、請求項２７に記載の医薬組成物を販売するための方法。
【公表番号】特表２００８−５３０２４９（Ｐ２００８−５３０２４９Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５６４２１（Ｐ２００７−５５６４２１）
【出願日】平成１８年２月１８日（２００６．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６３２０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８９３０１
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０３０３７９２９）チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１８日（２００６．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６３２０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８９３０１
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０３０３７９２９）チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド (6)
【Ｆターム（参考）】
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