ジペプチドの製造法
本発明によれば、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ以外のジペプチド合成活性を有する蛋白質および該ジペプチド合成用蛋白質、該ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、該ジペプチド合成活性を有する蛋白質または該ジペプチド合成用蛋白質を用いた該ジペプチドの製造法、および該ジペプチド合成活性を有する蛋白質または該ジペプチド合成用蛋白質を生産する微生物の培養物等を酵素源に用いた該ジペプチドの製造法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質およびジペプチド合成用蛋白質、ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産する微生物または形質転換体、および該微生物または形質転換体を用いたジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
ペプチドの大量合成法については、化学合成法（液相法、固相法）、酵素的合成法およびＤＮＡ組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、５０残基以上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が用いられ、ジペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）参照］、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法［特開昭５８−１４６５３９号公報、特開昭５８−２０９９９１号公報、特開昭５８−２０９９９２号公報および特開昭５９−１０６２９８号公報参照］、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法［Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１）、米国特許第５７９５７３８号および米国特許第５６５２１１６号参照］が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある。ＮＲＰＳを利用する方法に関しては、酵素分子が巨大なためにＤＮＡ組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である４’−ホスフォパンテテイン（４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）の供給が必要であり、効率的な製造法とはいえない。
一方、酵素分子量がＮＲＰＳより小さく、補酵素である４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅを必要としないγ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、グルタチオンシンセターゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）リガーゼ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ｌｉｇａｓｅ）、ポリ−γ−グルタミン酸シンセターゼ（ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等の一群のペプチドシンセターゼも知られている。これらの酵素の殆どはＤ−アミノ酸を基質に用いる、またはγ位のカルボキシル基でのペプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でペプチド結合するジペプチドの合成に用いることはできない。
Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質であるバシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン（Ｌ−アラニル−Ｌ−アンチカプシン、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ａｎｔｉｃａｐｓｉｎ）及びＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）を合成する活性を有することは知られているが、その他のジペプチドの合成活性については知られていない［Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，２０１−２０８（１９８７）およびＥｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２９，４００−４０６（２００１）参照］。
一方、全ゲノム情報の解明されたバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］におけるバシリシン生合成酵素遺伝子群に関しては、ｙｗｆＡ〜ＦのＯＲＦを含むバシリシンオペロンを増幅するとバシリシンの生産性が増加することが知られている［国際公開特許第００−０３００９号パンフレット参照］。しかしこれらのＯＲＦの中に２種以上のアミノ酸をペプチド結合で連結する活性を有する蛋白質をコードするＯＲＦが含まれているか、含まれているとすれば、どのＯＲＦが該蛋白質をコードするかについては知られていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、ペプチドシンセターゼ等による酵素的合成法が知られていなかったＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）以外のジペプチドの合成活性を有する蛋白質および該ジペプチド合成用蛋白質、該ジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の製造法、該ジペプチドの合成活性を有する蛋白質または該ジペプチド合成用蛋白質を用いた該ジペプチドの酵素的合成法、該ジペプチドの合成活性を有する蛋白質または該ジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（２１）に関する。
（１） 以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
［１］配列番号２〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
（２） 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成用蛋白質。
（３） 以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡ（ただし、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡを除く）。
［１］上記（１）の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１０〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１８で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（４） 上記（３）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
（５） 上記（４）の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
（６） 形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である上記（５）の形質転換体。
（７） 微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である上記（６）の形質転換体。
（８） 上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（１）の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（１）の蛋白質の製造法。
（９） 上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（１）の蛋白質の製造法。
（１０） 微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物である上記（９）の製造法。
（１１） バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物である上記（１０）の製造法。
（１２） バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）からなる群より選ばれる種に属する微生物である上記（１１）の製造法。
（１３） 上記（１）の蛋白質または上記（２）のジペプチドの合成用蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
（１４） 以下の［１］〜［３］から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
［１］上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物［２］上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物［３］上記（２）のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
（１５） 上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物がバチルス属に属する微生物である上記（１４）の製造法。
（１６） バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物である上記（１５）の製造法。
（１７） バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウムおよびバチルス・プミルスからなる群より選ばれる種に属する微生物である上記（１６）の製造法。
（１８） 上記（２）のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する微生物、またはバチルス・サチリスに属する微生物である上記（１４）の製造法。
（１９） 配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である上記（１８）の製造法。
（２０） 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、上記（１４）〜（１９）の製造法。
（２１） ジペプチドが式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４ （ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ダルタミン酸、グリシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、β−アラニン、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシンから選ばれるアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドである上記（１３）〜（２０）の製造法。
本発明の蛋白質としては、
［１］配列番号２〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
また、本発明の式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成用蛋白質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
以下、上記本発明の蛋白質および式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成用蛋白質を合わせて本発明の蛋白質と称する場合もある。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
アミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、例えば配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列を公知のアライメントソフトウェアを用いて比較したときに、すべてのアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸をあげることができる。公知のアライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルト値を用いることができる。
また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質が式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有するためには、配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有していることが望ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。アミノ酸配列の相同性は、上記したようにＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列は、配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の間で保存されている領域であり、かつ各種微生物のＡｌａ−Ａｌａリガーゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質が、式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が、少なくとも８０％以上、通常は９０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、上記したようにＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。
本発明の蛋白質が、上記式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質、１種以上のＬ−アミノ酸（ただし、Ｌ−アラニンは他のＬ−アミノ酸とともに用いる）、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に上記式（Ｉ）で表されるジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
本発明のＤＮＡとしては、
［５］上記［１］〜［４］記載の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［６］配列番号１０〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［７］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（ただし、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡを除き、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを除く）、
［８］配列番号１８で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（ただし、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡを除き、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを除く）、
をあげることができる。
また、本発明の式（Ｉ）で表されるジペプチドの製造法に用いることができるＤＮＡとしては、上記［５］〜［８］記載のＤＮＡおよび配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等を用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号９〜１６のいずれかで表される塩基配列と少なくとも７５％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、例えば上記したように、組換えＤＮＡ法を用いて該ＤＮＡにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
（ｉ）本発明のＤＮＡ、および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法に用いられるＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡ、および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法（以下、単に本発明の製造法ともいう）に用いられるＤＮＡは、例えば、配列番号９〜１６および３６で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号９〜１６および３６で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１〜８および１７のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明のＤＮＡ、または本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号９〜１６および３６で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡおよび本発明の製造法に用いられるＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ１２４３５、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＭＥ８４１５等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられるＤＮＡを保有する微生物としては、例えば配列番号１で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３をあげることができる。
（ｉｉ）本発明の蛋白質の製造法
本発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記（ｉ）の方法により取得した本発明のＤＮＡおよび本発明の製造法に用いられるＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばｐＰＥ４３をあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、バチルス・サチリスＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３０、バチルス・アミロリケファスエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｄ−０１１０、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１ プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、キャンディダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはナマルバＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、イーグル（Ｅａｇｌｅ）のＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを発現ベクターに連結した組換え体ＤＮＡを保有する微生物、昆虫細胞、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（ｉｉｉ）本発明のジペプチドの製造法
（１）酵素的製造法
ジペプチドの酵素的製造法としては、本発明の蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する方法をあげることができる。
上記製造法において、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、好ましくは１または２種のアミノ酸としては、１種のアミノ酸としてＬ−アラニンを用いる場合を除き、アミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸、グリシン（Ｇｌｙ）およびβ−アラニン（βＡｌａ）からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばＬ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリン（Ｌ−Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ｌ−α−ＡＢ）、Ｌ−アザセリン（Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、Ｌ−テアニン（Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ）、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン（Ｌ−４−ＨＹＰ）、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン（Ｌ−３−ＨＹＰ）、Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）、Ｌ−シトルリン（Ｌ−Ｃｉｔ）およびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン（Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）などをあげることができる。
上記製造法に用いられる、より好ましいアミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ（ただし、Ｌ−Ａｌａ同士の組み合わせを除く）、Ｌ−ＧｌｎとＬ−Ｐｈｅの組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢの組み合わせ、さらに好ましくはＬ−ＡｌａとＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−ｔｈｅａｎｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、ＧｌｙとＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−ＡＢおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＭｅｔとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＳｅｒとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＴｈｒとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−ＴｈｒおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＧｌｎとＬ−Ｐｈｅの組み合わせ、β−ＡｌａとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢの組み合わせをあげることができる。
上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ添加する。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源として用いるＡＴＰは、０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いる。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で２〜１５０時間、好ましくは６〜１２０時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、式（Ｉ）で表されるジペプチドをあげることができ、好ましくは、式（Ｉ）においてＲ１およびＲ２が同時にまたは異なって、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅから選ばれるアミノ酸であるジペプチド（ただし、Ｒ１およびＲ２は、同時にＬ−Ａｌａである場合を除く）をあげることができ、より好ましくはＲ１がＬ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒまたはβ−Ａｌａの場合は、Ｒ２がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔまたはＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅであるジペプチドをあげることができ、さらに好ましくは、Ｒ１がＬ−Ａｌａの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅまたはＬ−Ｃｉｔであるジペプチド、Ｒ１がＧｌｙの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−ＡＢまたはＬ−Ｃｉｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｍｅｔの場合は、Ｒ２はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓまたはＬ−Ｈｉｓであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｓｅｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｈｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＴｈｒまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｇｌｎの場合は、Ｒ２はＬ−ＰｈｅまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｐｈｅの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｒｐの場合は、Ｒ２はＧｌｙであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｃｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、またはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｌｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がβ−Ａｌａの場合は、Ｒ２はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−ＭｅｔまたはＬ−Ｈｉｓであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ａｒｇの場合は、Ｒ２はＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｈｉｓである場合は、Ｒ２はＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、およびＲ１がＬ−α−ＡＢの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチドをあげることができる。
（２）形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる製造法
形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドの製造法としては、本発明の蛋白質を生産する能力を有する形質転換体、または本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、および１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法をあげることができる。
上記製造法に用いられる形質転換体としては、上記（ｉｉ）の方法により製造することができる、本発明の蛋白質を生産する形質転換体をあげることができる。該形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等をあげることができ、好ましく細菌、より好ましくはエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としては、好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物等をあげることができ、バチルス属に属する微生物としては好ましくはバチルス・サチリスまたはバチルス・メガテリウム等に属する微生物をあげることができ、コリネバクテリウム属に属する微生物としては好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス等に属する微生物をあげることができる。
上記製造法に用いられる微生物は、本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよく、好ましくはバチルス属に属する微生物、より好ましくはバシリシン合成活性を有するバチルス属に属する微生物、さらに好ましくはバチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウムおよびバチルス・プミルスからなる群より選ばれる種に属する微生物、最も好ましくは、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、バチルス・サチリスＡＴＣＣ６６３３、バチルス・サチリスＩＡＭ１２１３、バチルス・サチリスＩＡＭ１１０７、バチルス・サチリスＩＡＭ１２１４、バチルス・サチリスＡＴＣＣ９４６６、バチルス・サチリスＩＡＭ１０３３、バチルス・サチリスＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５からなる群より選ばれる株である微生物をあげることができる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸の種類、使用濃度および添加時期、並びに生産されるジペプチドは、上記（ｉｉｉ）の（１）の酵素的製造法のものと同様である。
また、微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源とした製造法において用いられる水性媒体としては、上記（ｉｉｉ）の（１）の酵素的製造法に用いられる水性媒体に加え、酵素源として用いた形質転換体または微生物の培養液も水性媒体として用いることができる。
また上記製造法においては、必要に応じて、ＡＴＰの供給源として、ＡＴＰまたは形質転換体もしくは微生物が代謝してＡＴＰを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができる。
さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ジペプチドの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり湿菌体重量として５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜６５℃、好ましくは２５〜５５℃、より好ましくは３０〜４５℃の条件で通常１分間〜１５０時間、好ましくは３分間〜１２０時間、より好ましくは３０分間〜１００時間行う。
上記（ｉｉｉ）の（１）または（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐＰＥ４３の構築過程を示す図である。
第２図はプラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥの構築過程を示す図である。
また、図中のｙｗｆＥは、バチルス・サチリス１６８株由来のｙｗｆＥ遺伝子、Ｐｔｒｐはトリプトファンプロモーター遺伝子、ＰＴ５はＴ５プロモーター遺伝子を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１ データベースを利用したジペプチド合成活性を有する蛋白質の検索
バチルス・サチリス１６８株由来のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ遺伝子のアミノ酸配列［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］をクエリーとして、バチルス・サチリス１６８株のゲノムＤＮＡのデータベースであるＳｕｂｔｉｌｉｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／）のホモロジー検索機能を用いて、バチルス・サチリス１６８株のゲノムＤＮＡ配列中に存在する相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子を検索した。
その結果抽出された配列のうち、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼモチーフ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１６７３（１９９１）］である配列番号３３、３４または３５で表されるアミノ酸配列をコードし、かつ既にその機能が同定されている蛋白質をコードする遺伝子を排除したもののうち、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼモチーフと最も高い相同性（２９．１％）を示すものとして機能未知遺伝子ｙｗｆＥを選択した。
ｙｗｆＥの塩基配列を配列番号９、該塩基配列にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
実施例２ｙｗｆＥ遺伝子発現株の造成
実施例１で得られた塩基配列情報に従い、バチルス・サチリスのｙｗｆＥ遺伝子断片を以下のようにして取得した。
まず、バチルス・サチリス１６８株（ＡＴＣＣ２３８５７）をＬＢ培地［１０ｇ／ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム］に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１９〜２２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣおよびプライマーＤと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、バチルス・サチリスの染色体ＤＮＡのｙｗｆＥの開始コドンを含む領域の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＢは、ｙｗｆＥの終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の５’末端にＢａｍＨＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。またプライマーＣは、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］のｔｒｐプロモーター領域の塩基配列の５’末端にＥｃｏＲＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＤは、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列と相補的な配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
ｙｗｆＥ遺伝子断片の増幅には上記のプライマーＡおよびプライマーＢ、鋳型としてバチルス・サチリスの染色体ＤＮＡを用い、ｔｒｐプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＣおよびプライマーＤ、鋳型としてｐＴｒＳ３０を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型として０．１μｇの染色体ＤＮＡまたは１０ｎｇのｐＴｒＳ３０、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＡおよびプライマーＢを用いたＰＣＲではｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂ、プライマーＣおよびプライマーＤを用いた反応ではｔｒｐプロモーター領域のＤＮＡ断片に相当する約０．３ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液それぞれ５μＬを用い、プライマーＡおよびプライマーＢで増幅したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＣおよびプライマーＤで増幅したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ ｋｉｔ、ＢＩＯ １０１社製）を用いて、ｙｗｆＥを含む１．４ｋｂおよびｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥを含む１．４ｋｂ断片、ｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片および４．５ｋｂの断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株（ストラタジーン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｔｒｐプロモーター下流にｙｗｆＥが連結された発現ベクターであるｐＰＥ４３が取得されていることを確認した（図１）。
実施例３ ジペプチドの生産
実施例２で得られたｐＰＥ４３を保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３株）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
終濃度６０ｍｇ／ｍｌの該湿菌体、１２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎ、０．４％のナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で３分間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をジニトロフェノール化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムに関東化学社製のＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ−ＲＰ−１８カラムを用い、溶離液として１％（ｖ／ｖ）リン酸、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、０．７ｍｌ／分の流動速度で行った。その結果反応液中に１２０ｍｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ）が生成蓄積していることを確認した。
対照菌株であるベクターのみを含むエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＴｒＳ３１株の菌体ではＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの生成は認められなかった。
実施例４ Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
上記ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２３および２４で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＥ、プライマーＦと呼ぶ）を合成した。プライマーＥは、ｙｗｆＥの開始コドン（ａｔｇ）をＮｃｏＩ認識配列（ｃｃａｔｇｇ）に置換した領域を含む塩基配列である。プライマーＦは、ｙｗｆＥの終止コドンをＢａｍＨＩ認識配列（ｇｇａｔｃｃ）に置換した領域を含む塩基配列である。
バチルス・サチリス１６８株（ＡＴＣＣ２３８５７）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＥおよびプライマーＦをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０（キアゲン社製）０．２ｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片と３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型ｙｗｆＥ発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥが取得されていることを確認した（図２）。
ｐＱＥ６０ｙｗｆＥを保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株）を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐ（Ｈｉｓタグ付加タンパク精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｓｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、説明書に従いＨｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実施例５ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（１）
（ｉ）実施例４で取得した精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、上記実施例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中に３．７ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎと０．３ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）が生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌを含有する以外は、上記（ｉ）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（ｉ）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記実施例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ）のみ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｍｅｔ）および０．０３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、５．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ）および０．２ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、または１．６ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−バリン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌ）および０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ａｌａの代わりにＧｌｙ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−ＰｈｅまたはＬ−Ｍｅｔを含有する以外は、上記（１）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（１）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記実施例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ５．２ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ）または１．１ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−メチオニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔ）が生成蓄積していることを確認した。
上記反応液組成からＡＴＰを除くとジペプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、ｙｗｆＥ遺伝子産物は、ＡＴＰ存在下において、Ｌ−ＡｌａとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌとから、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＭｅｔおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、またはＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＶａｌおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性、ＧｌｙとＬ−ＰｈｅまたはＬ−ＭｅｔとからＧｌｙ−Ｌ−ＰｈｅまたはＧｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔを生成する活性を有することが明らかになった。
実施例６ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（２）
実施例４で得られた精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、表１の第１行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種Ｌ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａをそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌずつになるように反応液に添加し、３７℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣ分析したところ、第１表に示すジペプチドが生成していることが確認された。
第１表の第１行目と最左列に記載の２種類（もしくは１種類）のＬ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａを基質として反応した場合に生成したジペプチドを枠内に記載した。○は配列は未確定だがジペプチドが生成したこと、×はジペプチドの生成が確認されなかったこと、および空欄は未実施を示す。
実施例７ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジペプチドの生産
実施例４で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。
２００ｇ／Ｌの湿菌体、５０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのフィチン酸（３３％の濃水酸化ナトリウム溶液を用いて中性になるよう希釈）、１５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・７水和物、４ｇ／ＬのナイミーンＳ−２１５、１０ｍｌ／Ｌのキシレン、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる２０ｍｌの反応液（ｐＨ７．２）を５０ｍｌ容量のビーカーに入れ、３２℃、９００ｒｐｍの条件下で２時間反応を行った。反応中は２ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウムを用いて反応液のｐＨを７．２に保った。
反応生成物を実施例３記載の方法と同様の方法で分析したところ、２５ｍｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの蓄積が確認された。
実施例８ バチルス属に属する各種微生物からのｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子のクローニングとその解析
配列番号９で表される塩基配列に基づき、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルス ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５に存在するｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
まず、バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５をそれぞれＬＢ培地に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡをそれぞれ単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２５および２６で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＧ、プライマーＨと呼ぶ）を合成した。プライマーＧは、バチルス・サチリス１６８株の染色体ＤＮＡのｙｗｆＥの開始コドンより上流を含む領域の配列である。プライマーＨは、ｙｗｆＥの終始コドンより下流を含む配列と相補的な配列である。
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＧおよびプライマーＨをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．６ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の１．４ｋｂ断片とｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれぞれの構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５株由来、配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ２（ＡＴＣＣ６６３３株由来、配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ３（ＩＡＭ１２１３株由来、配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ４（ＩＡＭ１１０７株由来、配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ５（ＩＡＭ１２１４株由来、配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ６（ＡＴＣＣ９４６６株由来、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ７（ＩＡＭ１０３３株由来、配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５株由来、配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ９（ＩＦＯ３０２２株由来、配列番号１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が取得されていることを確認した。
一方、バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来のｙｗｆＥに相当する遺伝子（配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）は以下のように取得した。
上記で調製したＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号２７および２８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＺ−ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）、５μＬのＺ−ｔａｑポリメラーゼ用×１０緩衝液（宝酒造社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約０．８ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の０．８ｋｂ断片とｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ（プロメガ社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
上記で得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、約０．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号１６で表される塩基配列中の塩基番号３５８〜１１６０番からなる塩基配列が確認された。
次に該プラスミドをＥｃｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。該ＤＮＡ断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製した。約０．５μｇの該精製ＤＮＡ断片を、ＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて、ＤＩＧラベル化した。ＤＩＧラベル化は、該キット添付の説明書に従って行った。
上記で得られたＤＩＧラベル化ＤＮＡを用いて、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡのサザン解析を行った。
ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）に転移させた。
ＵＶを照射することにより、該ナイロン膜にＤＮＡ断片を固定した後、上記プローブＤＮＡおよび該ナイロン膜を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、該プローブＤＮＡと該ナイロン膜を６５℃で１６時間接触させ、その後該ナイロン膜を、０．１％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣからなる溶液を用い、室温で５分間、２回洗浄し、さらに０．１％ＳＤＳおよび０．５×ＳＳＣからなる溶液を用い、６５℃で１５分間、２回洗浄することで行い、その他の操作、条件およびハイブリダイズしたＤＮＡの検出は、上記したＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩに添付されている説明書に準じて行った。
その結果、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの完全消化断片の３．５ｋｂｐ付近に発色が見られた。
次に、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。それぞれの制限酵素消化ＤＮＡから３−４ｋｂｐの断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製し、ライゲーションキットを用いて自己環化させた。
上記で決定した０．８ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列番号２９および３０で表される塩基配列を設計、合成し、上記で取得した環化ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇの環化ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（宝酒造社製）、５μＬのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ用×１０緩衝液（宝酒造社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分３０秒間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約３．０ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）とをライゲーションキットを用いて連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株由来、配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が得られていることを確認した。
上記で得られたｐＹＷＦＥ１〜ｐＹＷＦＥ１０に含まれるｙｗｆＥに相当する各遺伝子の塩基配列を塩基配列分析装置３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。
ｐＹＷＦＥ１、ｐＹＷＦＥ６およびｐＹＷＦＥ７に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と同一であったが、ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９およびｐＹＷＦＥ１０に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と異なっていた。
ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９、ｐＹＷＦＥ１０およびｐＹＷＦＥ１とｐＹＷＦＥ７に含まれるｙｗｆＥに相当する遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２〜８および１に、該遺伝子の塩基配列を配列番号１０〜１６および３６にそれぞれ示した。
実施例９ Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、実施例２記載のプライマーＡおよびプライマーＢをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５の染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号３１および３２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液のそれぞれ５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥに相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次にＣ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０ ０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたバチルス・サチルス１６８株のｙｗｆＥに相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片、および３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行いそれぞれ連結した。
該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれらの構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ２（ＡＴＣＣ６６３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ３（ＩＡＭ１２１３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ４（ＩＡＭ１１０７由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ５（ＩＡＭ１２１４由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ６（ＡＴＣＣ９４６６由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ７（ＩＡＭ１０３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ９（ＩＦＯ３０２２由来の遺伝子を含有するベクター）、およびｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来の遺伝子を含有するベクター）が取得されていることを確認した。
上記で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１〜ＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容の三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して得られた湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐをその使用説明書に従って用いて、Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実施例１０ 精製酵素を用いたジペプチドの生産
実施例９で得られた組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａおよび３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、実施例３記載の方法により反応液を分析した結果、それぞれ、３．０〜３．５ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎおよび０．２５〜０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることが確認された。
また、上記反応液組成からＡＴＰを除くとＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａは全く生成されなかった。
以上の結果から、実施例８で得られた遺伝子の産物は、いずれもＡＴＰ存在下でＬ−ＡｌａとＬ−ＧｌｎとからＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性を有することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
本発明により、酵素的合成法が知られていなかったＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ以外のジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体もしくは微生物を用いてＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ以外のジペプチドを製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号３４−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号３５−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
【配列表】
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質およびジペプチド合成用蛋白質、ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産する微生物または形質転換体、および該微生物または形質転換体を用いたジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
ペプチドの大量合成法については、化学合成法（液相法、固相法）、酵素的合成法およびＤＮＡ組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、５０残基以上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が用いられ、ジペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）参照］、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法［特開昭５８−１４６５３９号公報、特開昭５８−２０９９９１号公報、特開昭５８−２０９９９２号公報および特開昭５９−１０６２９８号公報参照］、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法［Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１）、米国特許第５７９５７３８号および米国特許第５６５２１１６号参照］が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある。ＮＲＰＳを利用する方法に関しては、酵素分子が巨大なためにＤＮＡ組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である４’−ホスフォパンテテイン（４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）の供給が必要であり、効率的な製造法とはいえない。
一方、酵素分子量がＮＲＰＳより小さく、補酵素である４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅを必要としないγ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、グルタチオンシンセターゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）リガーゼ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ｌｉｇａｓｅ）、ポリ−γ−グルタミン酸シンセターゼ（ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等の一群のペプチドシンセターゼも知られている。これらの酵素の殆どはＤ−アミノ酸を基質に用いる、またはγ位のカルボキシル基でのペプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でペプチド結合するジペプチドの合成に用いることはできない。
Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質であるバシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン（Ｌ−アラニル−Ｌ−アンチカプシン、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ａｎｔｉｃａｐｓｉｎ）及びＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）を合成する活性を有することは知られているが、その他のジペプチドの合成活性については知られていない［Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，２０１−２０８（１９８７）およびＥｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２９，４００−４０６（２００１）参照］。
一方、全ゲノム情報の解明されたバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］におけるバシリシン生合成酵素遺伝子群に関しては、ｙｗｆＡ〜ＦのＯＲＦを含むバシリシンオペロンを増幅するとバシリシンの生産性が増加することが知られている［国際公開特許第００−０３００９号パンフレット参照］。しかしこれらのＯＲＦの中に２種以上のアミノ酸をペプチド結合で連結する活性を有する蛋白質をコードするＯＲＦが含まれているか、含まれているとすれば、どのＯＲＦが該蛋白質をコードするかについては知られていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、ペプチドシンセターゼ等による酵素的合成法が知られていなかったＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）以外のジペプチドの合成活性を有する蛋白質および該ジペプチド合成用蛋白質、該ジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の製造法、該ジペプチドの合成活性を有する蛋白質または該ジペプチド合成用蛋白質を用いた該ジペプチドの酵素的合成法、該ジペプチドの合成活性を有する蛋白質または該ジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（２１）に関する。
（１） 以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
［１］配列番号２〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
（２） 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成用蛋白質。
（３） 以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡ（ただし、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡを除く）。
［１］上記（１）の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１０〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１８で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（４） 上記（３）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
（５） 上記（４）の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
（６） 形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である上記（５）の形質転換体。
（７） 微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である上記（６）の形質転換体。
（８） 上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（１）の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（１）の蛋白質の製造法。
（９） 上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（１）の蛋白質の製造法。
（１０） 微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物である上記（９）の製造法。
（１１） バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物である上記（１０）の製造法。
（１２） バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）からなる群より選ばれる種に属する微生物である上記（１１）の製造法。
（１３） 上記（１）の蛋白質または上記（２）のジペプチドの合成用蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
（１４） 以下の［１］〜［３］から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
［１］上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物［２］上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物［３］上記（２）のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
（１５） 上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物がバチルス属に属する微生物である上記（１４）の製造法。
（１６） バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物である上記（１５）の製造法。
（１７） バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウムおよびバチルス・プミルスからなる群より選ばれる種に属する微生物である上記（１６）の製造法。
（１８） 上記（２）のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する微生物、またはバチルス・サチリスに属する微生物である上記（１４）の製造法。
（１９） 配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である上記（１８）の製造法。
（２０） 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、上記（１４）〜（１９）の製造法。
（２１） ジペプチドが式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４ （ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ダルタミン酸、グリシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、β−アラニン、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシンから選ばれるアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドである上記（１３）〜（２０）の製造法。
本発明の蛋白質としては、
［１］配列番号２〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
また、本発明の式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成用蛋白質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
以下、上記本発明の蛋白質および式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成用蛋白質を合わせて本発明の蛋白質と称する場合もある。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
アミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、例えば配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列を公知のアライメントソフトウェアを用いて比較したときに、すべてのアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸をあげることができる。公知のアライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルト値を用いることができる。
また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質が式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有するためには、配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有していることが望ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。アミノ酸配列の相同性は、上記したようにＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列は、配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の間で保存されている領域であり、かつ各種微生物のＡｌａ−Ａｌａリガーゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質が、式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が、少なくとも８０％以上、通常は９０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、上記したようにＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。
本発明の蛋白質が、上記式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質、１種以上のＬ−アミノ酸（ただし、Ｌ−アラニンは他のＬ−アミノ酸とともに用いる）、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に上記式（Ｉ）で表されるジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
本発明のＤＮＡとしては、
［５］上記［１］〜［４］記載の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［６］配列番号１０〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［７］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（ただし、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡを除き、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを除く）、
［８］配列番号１８で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（ただし、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡを除き、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを除く）、
をあげることができる。
また、本発明の式（Ｉ）で表されるジペプチドの製造法に用いることができるＤＮＡとしては、上記［５］〜［８］記載のＤＮＡおよび配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等を用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号９〜１６のいずれかで表される塩基配列と少なくとも７５％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、例えば上記したように、組換えＤＮＡ法を用いて該ＤＮＡにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
（ｉ）本発明のＤＮＡ、および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法に用いられるＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡ、および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法（以下、単に本発明の製造法ともいう）に用いられるＤＮＡは、例えば、配列番号９〜１６および３６で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号９〜１６および３６で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１〜８および１７のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明のＤＮＡ、または本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号９〜１６および３６で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡおよび本発明の製造法に用いられるＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ１２４３５、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＭＥ８４１５等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられるＤＮＡを保有する微生物としては、例えば配列番号１で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３をあげることができる。
（ｉｉ）本発明の蛋白質の製造法
本発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記（ｉ）の方法により取得した本発明のＤＮＡおよび本発明の製造法に用いられるＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばｐＰＥ４３をあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、バチルス・サチリスＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３０、バチルス・アミロリケファスエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｄ−０１１０、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１ プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、キャンディダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはナマルバＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、イーグル（Ｅａｇｌｅ）のＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを発現ベクターに連結した組換え体ＤＮＡを保有する微生物、昆虫細胞、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（ｉｉｉ）本発明のジペプチドの製造法
（１）酵素的製造法
ジペプチドの酵素的製造法としては、本発明の蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する方法をあげることができる。
上記製造法において、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、好ましくは１または２種のアミノ酸としては、１種のアミノ酸としてＬ−アラニンを用いる場合を除き、アミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸、グリシン（Ｇｌｙ）およびβ−アラニン（βＡｌａ）からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばＬ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）、Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリン（Ｌ−Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ｌ−α−ＡＢ）、Ｌ−アザセリン（Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、Ｌ−テアニン（Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ）、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン（Ｌ−４−ＨＹＰ）、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン（Ｌ−３−ＨＹＰ）、Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）、Ｌ−シトルリン（Ｌ−Ｃｉｔ）およびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン（Ｌ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）などをあげることができる。
上記製造法に用いられる、より好ましいアミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒおよびβ−Ａｌａから選ばれる１種のアミノ酸とＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ（ただし、Ｌ−Ａｌａ同士の組み合わせを除く）、Ｌ−ＧｌｎとＬ−Ｐｈｅの組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢの組み合わせ、さらに好ましくはＬ−ＡｌａとＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−ｔｈｅａｎｉｎｅから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、ＧｌｙとＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−ＡＢおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＭｅｔとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓおよびＬ−Ｈｉｓから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＳｅｒとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＴｈｒとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−ＴｈｒおよびＬ−α−ＡＢから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、Ｌ−ＧｌｎとＬ−Ｐｈｅの組み合わせ、β−ＡｌａとＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＨｉｓおよびＬ−Ｃｉｔから選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、およびＬ−α−ＡＢとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢの組み合わせをあげることができる。
上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ添加する。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源として用いるＡＴＰは、０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いる。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で２〜１５０時間、好ましくは６〜１２０時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、式（Ｉ）で表されるジペプチドをあげることができ、好ましくは、式（Ｉ）においてＲ１およびＲ２が同時にまたは異なって、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅから選ばれるアミノ酸であるジペプチド（ただし、Ｒ１およびＲ２は、同時にＬ−Ａｌａである場合を除く）をあげることができ、より好ましくはＲ１がＬ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒまたはβ−Ａｌａの場合は、Ｒ２がＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、β−Ａｌａ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔまたはＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅであるジペプチドをあげることができ、さらに好ましくは、Ｒ１がＬ−Ａｌａの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅまたはＬ−Ｃｉｔであるジペプチド、Ｒ１がＧｌｙの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−α−ＡＢまたはＬ−Ｃｉｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｍｅｔの場合は、Ｒ２はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＬｙｓまたはＬ−Ｈｉｓであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｓｅｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−ＨｉｓまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｈｒの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−ＴｈｒまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｇｌｎの場合は、Ｒ２はＬ−ＰｈｅまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｐｈｅの場合は、Ｒ２はＬ−Ｇｌｎであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｔｒｐの場合は、Ｒ２はＧｌｙであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｃｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、またはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｌｙｓの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、Ｒ１がβ−Ａｌａの場合は、Ｒ２はＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−ＭｅｔまたはＬ−Ｈｉｓであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ａｒｇの場合は、Ｒ２はＬ−α−ＡＢであるジペプチド、Ｒ１がＬ−Ｈｉｓである場合は、Ｒ２はＬ−Ｍｅｔであるジペプチド、およびＲ１がＬ−α−ＡＢの場合は、Ｒ２はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−α−ＡＢであるジペプチドをあげることができる。
（２）形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる製造法
形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドの製造法としては、本発明の蛋白質を生産する能力を有する形質転換体、または本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、および１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法をあげることができる。
上記製造法に用いられる形質転換体としては、上記（ｉｉ）の方法により製造することができる、本発明の蛋白質を生産する形質転換体をあげることができる。該形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等をあげることができ、好ましく細菌、より好ましくはエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としては、好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物等をあげることができ、バチルス属に属する微生物としては好ましくはバチルス・サチリスまたはバチルス・メガテリウム等に属する微生物をあげることができ、コリネバクテリウム属に属する微生物としては好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス等に属する微生物をあげることができる。
上記製造法に用いられる微生物は、本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよく、好ましくはバチルス属に属する微生物、より好ましくはバシリシン合成活性を有するバチルス属に属する微生物、さらに好ましくはバチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウムおよびバチルス・プミルスからなる群より選ばれる種に属する微生物、最も好ましくは、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、バチルス・サチリスＡＴＣＣ６６３３、バチルス・サチリスＩＡＭ１２１３、バチルス・サチリスＩＡＭ１１０７、バチルス・サチリスＩＡＭ１２１４、バチルス・サチリスＡＴＣＣ９４６６、バチルス・サチリスＩＡＭ１０３３、バチルス・サチリスＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミロリケファシエンスＩＦＯ３０２２およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５からなる群より選ばれる株である微生物をあげることができる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸の種類、使用濃度および添加時期、並びに生産されるジペプチドは、上記（ｉｉｉ）の（１）の酵素的製造法のものと同様である。
また、微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源とした製造法において用いられる水性媒体としては、上記（ｉｉｉ）の（１）の酵素的製造法に用いられる水性媒体に加え、酵素源として用いた形質転換体または微生物の培養液も水性媒体として用いることができる。
また上記製造法においては、必要に応じて、ＡＴＰの供給源として、ＡＴＰまたは形質転換体もしくは微生物が代謝してＡＴＰを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができる。
さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ジペプチドの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり湿菌体重量として５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜６５℃、好ましくは２５〜５５℃、より好ましくは３０〜４５℃の条件で通常１分間〜１５０時間、好ましくは３分間〜１２０時間、より好ましくは３０分間〜１００時間行う。
上記（ｉｉｉ）の（１）または（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐＰＥ４３の構築過程を示す図である。
第２図はプラスミドｐＱＥ６０ｙｗｆＥの構築過程を示す図である。
また、図中のｙｗｆＥは、バチルス・サチリス１６８株由来のｙｗｆＥ遺伝子、Ｐｔｒｐはトリプトファンプロモーター遺伝子、ＰＴ５はＴ５プロモーター遺伝子を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１ データベースを利用したジペプチド合成活性を有する蛋白質の検索
バチルス・サチリス１６８株由来のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ遺伝子のアミノ酸配列［Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）］をクエリーとして、バチルス・サチリス１６８株のゲノムＤＮＡのデータベースであるＳｕｂｔｉｌｉｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／）のホモロジー検索機能を用いて、バチルス・サチリス１６８株のゲノムＤＮＡ配列中に存在する相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子を検索した。
その結果抽出された配列のうち、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼモチーフ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１６７３（１９９１）］である配列番号３３、３４または３５で表されるアミノ酸配列をコードし、かつ既にその機能が同定されている蛋白質をコードする遺伝子を排除したもののうち、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼモチーフと最も高い相同性（２９．１％）を示すものとして機能未知遺伝子ｙｗｆＥを選択した。
ｙｗｆＥの塩基配列を配列番号９、該塩基配列にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
実施例２ｙｗｆＥ遺伝子発現株の造成
実施例１で得られた塩基配列情報に従い、バチルス・サチリスのｙｗｆＥ遺伝子断片を以下のようにして取得した。
まず、バチルス・サチリス１６８株（ＡＴＣＣ２３８５７）をＬＢ培地［１０ｇ／ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム］に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号１９〜２２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢ、プライマーＣおよびプライマーＤと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、バチルス・サチリスの染色体ＤＮＡのｙｗｆＥの開始コドンを含む領域の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＢは、ｙｗｆＥの終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の５’末端にＢａｍＨＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。またプライマーＣは、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］のｔｒｐプロモーター領域の塩基配列の５’末端にＥｃｏＲＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＤは、ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０のｔｒｐプロモーター領域の配列と相補的な配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
ｙｗｆＥ遺伝子断片の増幅には上記のプライマーＡおよびプライマーＢ、鋳型としてバチルス・サチリスの染色体ＤＮＡを用い、ｔｒｐプロモーター領域の断片の増幅にはプライマーＣおよびプライマーＤ、鋳型としてｐＴｒＳ３０を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型として０．１μｇの染色体ＤＮＡまたは１０ｎｇのｐＴｒＳ３０、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、プライマーＡおよびプライマーＢを用いたＰＣＲではｙｗｆＥ遺伝子断片に相当する約１．４ｋｂ、プライマーＣおよびプライマーＤを用いた反応ではｔｒｐプロモーター領域のＤＮＡ断片に相当する約０．３ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液それぞれ５μＬを用い、プライマーＡおよびプライマーＢで増幅したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで、またプライマーＣおよびプライマーＤで増幅したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ ｋｉｔ、ＢＩＯ １０１社製）を用いて、ｙｗｆＥを含む１．４ｋｂおよびｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
ｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥを含む１．４ｋｂ断片、ｔｒｐプロモーター領域を含む０．３ｋｂ断片および４．５ｋｂの断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株（ストラタジーン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｔｒｐプロモーター下流にｙｗｆＥが連結された発現ベクターであるｐＰＥ４３が取得されていることを確認した（図１）。
実施例３ ジペプチドの生産
実施例２で得られたｐＰＥ４３を保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＰＥ４３株）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地が入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
終濃度６０ｍｇ／ｍｌの該湿菌体、１２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎ、０．４％のナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で３分間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をジニトロフェノール化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ法により分析した。ＨＰＬＣ法による分析は、分離カラムに関東化学社製のＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ−ＲＰ−１８カラムを用い、溶離液として１％（ｖ／ｖ）リン酸、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、０．７ｍｌ／分の流動速度で行った。その結果反応液中に１２０ｍｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎ）が生成蓄積していることを確認した。
対照菌株であるベクターのみを含むエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＴｒＳ３１株の菌体ではＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの生成は認められなかった。
実施例４ Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
上記ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２３および２４で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＥ、プライマーＦと呼ぶ）を合成した。プライマーＥは、ｙｗｆＥの開始コドン（ａｔｇ）をＮｃｏＩ認識配列（ｃｃａｔｇｇ）に置換した領域を含む塩基配列である。プライマーＦは、ｙｗｆＥの終止コドンをＢａｍＨＩ認識配列（ｇｇａｔｃｃ）に置換した領域を含む塩基配列である。
バチルス・サチリス１６８株（ＡＴＣＣ２３８５７）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＥおよびプライマーＦをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０（キアゲン社製）０．２ｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｙｗｆＥを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片と３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型ｙｗｆＥ発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥが取得されていることを確認した（図２）。
ｐＱＥ６０ｙｗｆＥを保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株）を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐ（Ｈｉｓタグ付加タンパク精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｓｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、説明書に従いＨｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実施例５ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（１）
（ｉ）実施例４で取得した精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、上記実施例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中に３．７ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎと０．３ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）が生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌを含有する以外は、上記（ｉ）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（ｉ）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記実施例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ）のみ、７．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｍｅｔ）および０．０３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、５．０ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ）および０．２ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、または１．６ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−バリン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｖａｌ）および０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることを確認した。
（ｉｉｉ）酵素を０．０１ｍｇ、Ｌ−Ａｌａの代わりにＧｌｙ、Ｌ−Ｇｌｎの代わりにＬ−ＰｈｅまたはＬ−Ｍｅｔを含有する以外は、上記（１）の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（１）の反応条件で反応させた。
反応終了後、上記実施例３と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそれぞれ５．２ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ）または１．１ｇ／Ｌのグリシル−Ｌ−メチオニン（Ｇｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔ）が生成蓄積していることを確認した。
上記反応液組成からＡＴＰを除くとジペプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、ｙｗｆＥ遺伝子産物は、ＡＴＰ存在下において、Ｌ−ＡｌａとＬ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｖａｌとから、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＭｅｔおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、またはＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＶａｌおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性、ＧｌｙとＬ−ＰｈｅまたはＬ−ＭｅｔとからＧｌｙ−Ｌ−ＰｈｅまたはＧｌｙ−Ｌ−Ｍｅｔを生成する活性を有することが明らかになった。
実施例６ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産（２）
実施例４で得られた精製したＨｉｓタグ付加組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、表１の第１行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種Ｌ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａをそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌずつになるように反応液に添加し、３７℃で１６時間反応を行った。反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣ分析したところ、第１表に示すジペプチドが生成していることが確認された。
第１表の第１行目と最左列に記載の２種類（もしくは１種類）のＬ−アミノ酸、Ｇｌｙまたはβ−Ａｌａを基質として反応した場合に生成したジペプチドを枠内に記載した。○は配列は未確定だがジペプチドが生成したこと、×はジペプチドの生成が確認されなかったこと、および空欄は未実施を示す。
実施例７ Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジペプチドの生産
実施例４で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。
２００ｇ／Ｌの湿菌体、５０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのフィチン酸（３３％の濃水酸化ナトリウム溶液を用いて中性になるよう希釈）、１５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・７水和物、４ｇ／ＬのナイミーンＳ−２１５、１０ｍｌ／Ｌのキシレン、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａ、２００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる２０ｍｌの反応液（ｐＨ７．２）を５０ｍｌ容量のビーカーに入れ、３２℃、９００ｒｐｍの条件下で２時間反応を行った。反応中は２ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウムを用いて反応液のｐＨを７．２に保った。
反応生成物を実施例３記載の方法と同様の方法で分析したところ、２５ｍｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎの蓄積が確認された。
実施例８ バチルス属に属する各種微生物からのｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子のクローニングとその解析
配列番号９で表される塩基配列に基づき、バチルス・サチリスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルス ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５に存在するｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
まず、バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、バチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２、およびバチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５をそれぞれＬＢ培地に植菌し３０℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡをそれぞれ単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２５および２６で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＧ、プライマーＨと呼ぶ）を合成した。プライマーＧは、バチルス・サチリス１６８株の染色体ＤＮＡのｙｗｆＥの開始コドンより上流を含む領域の配列である。プライマーＨは、ｙｗｆＥの終始コドンより下流を含む配列と相補的な配列である。
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーＧおよびプライマーＨをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．６ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の１．４ｋｂ断片とｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれぞれの構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５株由来、配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ２（ＡＴＣＣ６６３３株由来、配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ３（ＩＡＭ１２１３株由来、配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ４（ＩＡＭ１１０７株由来、配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ５（ＩＡＭ１２１４株由来、配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ６（ＡＴＣＣ９４６６株由来、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ７（ＩＡＭ１０３３株由来、配列番号３６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５株由来、配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐＹＷＦＥ９（ＩＦＯ３０２２株由来、配列番号１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が取得されていることを確認した。
一方、バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来のｙｗｆＥに相当する遺伝子（配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）は以下のように取得した。
上記で調製したＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号２７および２８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＺ−ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）、５μＬのＺ−ｔａｑポリメラーゼ用×１０緩衝液（宝酒造社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約０．８ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体ＤＮＡ由来の０．８ｋｂ断片とｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ（プロメガ社製）を、ライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
上記で得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、約０．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号１６で表される塩基配列中の塩基番号３５８〜１１６０番からなる塩基配列が確認された。
次に該プラスミドをＥｃｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。該ＤＮＡ断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製した。約０．５μｇの該精製ＤＮＡ断片を、ＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて、ＤＩＧラベル化した。ＤＩＧラベル化は、該キット添付の説明書に従って行った。
上記で得られたＤＩＧラベル化ＤＮＡを用いて、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡのサザン解析を行った。
ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）に転移させた。
ＵＶを照射することにより、該ナイロン膜にＤＮＡ断片を固定した後、上記プローブＤＮＡおよび該ナイロン膜を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、該プローブＤＮＡと該ナイロン膜を６５℃で１６時間接触させ、その後該ナイロン膜を、０．１％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣからなる溶液を用い、室温で５分間、２回洗浄し、さらに０．１％ＳＤＳおよび０．５×ＳＳＣからなる溶液を用い、６５℃で１５分間、２回洗浄することで行い、その他の操作、条件およびハイブリダイズしたＤＮＡの検出は、上記したＤＩＧ−ハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクション スターターキットＩに添付されている説明書に準じて行った。
その結果、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの完全消化断片の３．５ｋｂｐ付近に発色が見られた。
次に、ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩを用いてそれぞれ完全消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した。それぞれの制限酵素消化ＤＮＡから３−４ｋｂｐの断片をジーンクリーンＩＩキットを用いて精製し、ライゲーションキットを用いて自己環化させた。
上記で決定した０．８ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列番号２９および３０で表される塩基配列を設計、合成し、上記で取得した環化ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｎｇの環化ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（宝酒造社製）、５μＬのｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ用×１０緩衝液（宝酒造社製）、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液５０μＬを調製し、９８℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分３０秒間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約３．０ｋｂの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
上記で得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）とをライゲーションキットを用いて連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｙｗｆＥ遺伝子に相当する遺伝子を含むプラスミドであるｐＹＷＦＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５株由来、配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）が得られていることを確認した。
上記で得られたｐＹＷＦＥ１〜ｐＹＷＦＥ１０に含まれるｙｗｆＥに相当する各遺伝子の塩基配列を塩基配列分析装置３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。
ｐＹＷＦＥ１、ｐＹＷＦＥ６およびｐＹＷＦＥ７に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と同一であったが、ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９およびｐＹＷＦＥ１０に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ｙｗｆＥ遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と異なっていた。
ｐＹＷＦＥ２、ｐＹＷＦＥ３、ｐＹＷＦＥ４、ｐＹＷＦＥ５、ｐＹＷＦＥ８、ｐＹＷＦＥ９、ｐＹＷＦＥ１０およびｐＹＷＦＥ１とｐＹＷＦＥ７に含まれるｙｗｆＥに相当する遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２〜８および１に、該遺伝子の塩基配列を配列番号１０〜１６および３６にそれぞれ示した。
実施例９ Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチルス・サチルスＡＴＣＣ１５２４５、ＡＴＣＣ６６３３、ＩＡＭ１２１３、ＩＡＭ１１０７、ＩＡＭ１２１４、ＡＴＣＣ９４６６、ＩＡＭ１０３３、ＡＴＣＣ２１５５５、またはバチルス・アミノリケファシエンスＩＦＯ３０２２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、実施例２記載のプライマーＡおよびプライマーＢをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰを含む反応液４０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
バチルス・プミルスＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５の染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号３１および３２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、ｙｗｆＥ断片に相当する約１．４ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を２０μＬのＴＥに溶解した。
該溶解液のそれぞれ５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットを用いて、ｙｗｆＥに相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次にＣ末端Ｈｉｓタグ付加型組換え体発現ベクターｐＱＥ６０ ０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたバチルス・サチルス１６８株のｙｗｆＥに相当する遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片、および３．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間反応を行いそれぞれ連結した。
該反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてそれらの構造を解析することにより、Ｃ末Ｈｉｓタグ付加型遺伝子発現ベクターであるｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１（ＡＴＣＣ１５２４５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ２（ＡＴＣＣ６６３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ３（ＩＡＭ１２１３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ４（ＩＡＭ１１０７由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ５（ＩＡＭ１２１４由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ６（ＡＴＣＣ９４６６由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ７（ＩＡＭ１０３３由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ８（ＡＴＣＣ２１５５５由来の遺伝子を含有するベクター）、ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ９（ＩＦＯ３０２２由来の遺伝子を含有するベクター）、およびｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２０２５由来の遺伝子を含有するベクター）が取得されていることを確認した。
上記で得られたエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１〜ＮＭ５２２／ｐＱＥ６０ｙｗｆＥ１０株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍｌのＬＢ培地の入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地の入った２５０ｍｌ容の三角フラスコに接種し３０℃で３時間培養した後、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに３０℃で４時間培養した。該培養液を遠心分離して得られた湿菌体から、ＨｉｓＴｒａｐをその使用説明書に従って用いて、Ｈｉｓタグ付加組換え型酵素を精製した。
実施例１０ 精製酵素を用いたジペプチドの生産
実施例９で得られた組換え型酵素０．０４ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、６０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ａｌａおよび３０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−Ｇｌｎからなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、実施例３記載の方法により反応液を分析した結果、それぞれ、３．０〜３．５ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｎおよび０．２５〜０．３ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａが生成蓄積していることが確認された。
また、上記反応液組成からＡＴＰを除くとＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａは全く生成されなかった。
以上の結果から、実施例８で得られた遺伝子の産物は、いずれもＡＴＰ存在下でＬ−ＡｌａとＬ−ＧｌｎとからＬ−Ａｌａ−Ｌ−ＧｌｎおよびＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａを生成する活性を有することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
本発明により、酵素的合成法が知られていなかったＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ以外のジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体もしくは微生物を用いてＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ以外のジペプチドを製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号３４−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
配列番号３５−人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列
【配列表】
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
［１］配列番号２〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成用蛋白質。
【請求項３】
以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡ（ただし、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡを除く）。
［１］請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１０〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１８で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項６】
形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１記載の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項９】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項１０】
微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物である請求項９記載の製造法。
【請求項１１】
バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物である請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）からなる群より選ばれる種に属する微生物である請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
請求項１記載の蛋白質または請求項２記載のジペプチドの合成用蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
【請求項１４】
以下の［１］〜［３］から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
［１］請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物
［２］請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
［３］請求項２記載のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
【請求項１５】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物がバチルス属に属する微生物である請求項１４記載の製造法。
【請求項１６】
バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物である請求項１５記載の製造法。
【請求項１７】
バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウムおよびバチルス・プミルスからなる群より選ばれる種に属する微生物である請求項１６記載の製造法。
【請求項１８】
請求項２記載のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する微生物、またはバチルス・サチリスに属する微生物である請求項１４記載の製造法。
【請求項１９】
配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である請求項１８記載の製造法。
【請求項２０】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１４〜１９記載の製造法。
【請求項２１】
ジペプチドが式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４ （ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、β−アラニン、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシンから選ばれるアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドである請求項１３〜２０記載の製造法。
【請求項１】
以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
［１］配列番号２〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜８のいずれかで表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［４］配列番号１７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドの合成用蛋白質。
【請求項３】
以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡ（ただし、配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡを除く）。
［１］請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１０〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号９〜１６および３６のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１８で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項６】
形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１記載の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項９】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項１０】
微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物である請求項９記載の製造法。
【請求項１１】
バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物である請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）からなる群より選ばれる種に属する微生物である請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
請求項１記載の蛋白質または請求項２記載のジペプチドの合成用蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
【請求項１４】
以下の［１］〜［３］から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
［１］請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物
［２］請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
［３］請求項２記載のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
【請求項１５】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物がバチルス属に属する微生物である請求項１４記載の製造法。
【請求項１６】
バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物である請求項１５記載の製造法。
【請求項１７】
バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウムおよびバチルス・プミルスからなる群より選ばれる種に属する微生物である請求項１６記載の製造法。
【請求項１８】
請求項２記載のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する微生物、またはバチルス・サチリスに属する微生物である請求項１４記載の製造法。
【請求項１９】
配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である請求項１８記載の製造法。
【請求項２０】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１４〜１９記載の製造法。
【請求項２１】
ジペプチドが式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４ （ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−α−アミノ酪酸、β−アラニン、Ｌ−アザセリン、Ｌ−テアニン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンおよびＬ−６−ジアゾ−５−オキソノルロイシンから選ばれるアミノ酸を表すが、同時にＬ−アラニンを表すことはない）で表されるジペプチドである請求項１３〜２０記載の製造法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９６０
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【発行日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６２９５６（Ｐ２００４−５６２９５６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６９３６
【国際出願日】平成１５年１２月２６日（２００３．１２．２６）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【発行日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６９３６
【国際出願日】平成１５年１２月２６日（２００３．１２．２６）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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