セファロスポリンＣアシラーゼ変異体及び前記変異体を使用する７−ＡＣＡの製造方法
本発明のアシラーゼ変異体はＣＰＣに対する反応性と特異活性が改善されており、１段階酵素法によりＣＰＣから７−ＡＣＡを直接製造するために効率的に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＳＥ８３に由来するセファロスポリンＣ（ＣＰＣ）アシラーゼ変異体ポリペプチド；前記ポリペプチドをコードする遺伝子；前記遺伝子を含む発現ベクター；前記発現ベクターで形質転換された微生物；前記ＣＰＣアシラーゼ変異体の作製方法；及び前記ＣＰＣアシラーゼ変異体を使用する７−ＡＣＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セファロスポリンＣ（以下、「ＣＰＣ」と言う）はアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）等の糸状菌により生産されるβラクタムファミリー抗生物質の１種である。ＣＰＣは細胞壁合成を妨害することによりグラム陰性菌に対して抗生物質活性を示すが、グラム陰性菌の増殖に対して十分に活性ではない。従って、ＣＰＣは主に半合成セファロスポリン抗生物質の製造用中間体を製造するために使用されている。特に、ＣＰＣからＤ−α−アミノアジポイル側鎖を除去することにより製造される７−アミノセファロスポラン酸（以下、「７−ＡＣＡ」と言う）が抗生物質世界市場のシェアの４０％を越える大半の半合成セファロスポリン抗生物質の製造に使用されている。
【０００３】
ＣＰＣから７−ＡＣＡを製造する方法としては化学法と酵素法の２種類の方法が公知である。ＣＰＣから７−ＡＣＡを合成する化学法はアミン基とカルボキシル基の両者にシリル保護基を使用し、収率は９０％を上回る。しかし、この方法は複雑であり、非経済的で環境にやさしくない。従って、化学法に代わって環境上許容可能であると考えられている７−ＡＣＡの酵素的製造方法が使用されるようになっている。
【０００４】
現在商業的に広く使用されている２段階酵素法はＣＰＣをＤ−アミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＤＡＯ」と言う）によりグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（以下、「ＧＬ−７−ＡＣＡ」と言う）に変換する段階（第１段階）と、ＧＬ−７−ＡＣＡをＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼにより７−ＡＣＡに変換する段階（第２段階）の２段階からなる（図１参照）。しかし、この方法は第１段階で生成される過酸化水素とＤＡＯ基質又は反応生成物の反応により多量の副生物が生じるため、化学法よりも７−ＡＣＡの収率が低い。従って、ＣＰＣの７位のアミド結合を切断してアミノアジポイル側鎖を除去することが可能な改変ＣＰＣアシラーゼを使用してＣＰＣを７−ＡＣＡに直接変換するための効率的な１段階酵素法を開発することが必要とされている。
【０００５】
ＣＰＣに対して活性なＣＰＣアシラーゼ（ＣＰＣアミダーゼ又はＣＰＣアミドヒドロラーゼとも言う）がシュードモナスｓｐ．、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、エーロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．、アルスロバクター・ビスコウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｕｓ）等の数種の微生物で発見されており、シュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するａｃｙＩＩ遺伝子（Ｍａｔｓｕｄａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５８２１−５８２９，１９８７）；シュードモナスｓｐ．Ｎ１７６に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（米国特許第５，１９２，６７８号）；シュードモナスｓｐ．Ｖ２２に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（Ａｒａｍｏｒｉら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７２：２３２−２４３，１９９１）；シュードモナス・ベシクラリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｂ９６５に由来するＣＰＣアミドヒドロラーゼ遺伝子（米国特許第６，２９７，０３２号）；バチルス・メガテリウムに由来するＣＰＣアミダーゼ遺伝子（米国特許第５，２２９，２７４号）；及びシュードモナスｓｐ．１３０に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（Ｌｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６２：７１３−７１９，１９９９）等の数種のＣＰＣアシラーゼ遺伝子がクローニングされ、配列決定されている。しかし、これらのＣＰＣアシラーゼはＣＰＣの７位のアミド結合を切断するために十分な加水分解活性がないため、ＣＰＣから７−ＡＣＡを製造する１段階酵素法には適していない。
【０００６】
数件の遺伝子工学研究がＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼの酵素活性を高めようと試みている。例えば、藤沢薬品工業株式会社（日本）はＣＰＣに対して野生型の約２．５倍の特異活性を示すシュードモナスｓｐ．Ｎ１７６に由来するＣＰＣアシラーゼ変異体を開発した（米国特許第５，８０４，４２９号；米国特許第５，３３６，６１３号，日本特許公開１９９５−２２２５８７；日本特許公開１９９６−０９８６８６；及び日本特許公開１９９６−２０５８６４）。しかし、このような変異体はＣＰＣから７−ＡＣＡを直接製造するにはＣＰＣに対する特異活性がまだ不十分であり、７−ＡＣＡによる最終産物阻害を示す。従って、ＣＰＣから７−ＡＣＡに直接変換するために実地に使用することはできない。
【０００７】
７−ＡＣＡを製造するための１段階酵素法に適用可能なＣＰＣアシラーゼ変異体を開発する目的で本発明者らはＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼの三次構造を検討し、シュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（Ｋｉｍら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２３：１０６７−１０７１，２００１；以下、「ＣＡＤ」と言う）に関連するアポ酵素（Ｋｉｍら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８：１０５９−１０６８，２０００）とＣＡＤ−ＧＬ−７−ＡＣＡ複合体（Ｋｉｍら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１２５３−１２６４，２００１；Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４８３７６−４８３８１，２００１）の三次構造を初めて特定した（図２参照）。２種のＣＡＤ二元複合体の構造は、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼと基質の最も広範な相互作用がＧＬ−７−ＡＣＡのグルタリル部分で行われたことを示唆している。従って、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼにおいて基質を認識するのに主要な因子は基質の側鎖とその結合ポケットの親水性及び疎水性相互作用であると思われる。基質結合親和性が極端に低いＣＰＣとＧＬ−７−ＡＣＡの化学構造を比較すると、それらのβラクタム構造は同一でありながら、側鎖が多少相違している（図３参照）。即ち、ＧＬ−７−ＡＣＡの側鎖はグルタル酸から構成されるが、ＣＰＣの側鎖はＤ−α−アミノアジピン酸から構成される。従って、ＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の構造のモデリングによると、ＧＬ−７−ＡＣＡの側鎖とＣＡＤの結合関連主要残基はＤ−α−アミノアジピン酸側鎖の末端のカルボキシル基とＤ形アミノ基に対して立体的に混雑していると思われる（図４参照）。そこで、（ＧＬ−７−ＡＣＡ側鎖の炭素骨格よりも大きい炭素骨格とＤ−アミノ基を含む）ＣＰＣ側鎖を受容するために十分なスペースをＣＡＤの基質結合部位に確保することができるならば、ＣＰＣに対するＧＬ−７−ＡＣＡの特異活性を増加できると考えられる。従って、ＣＡＤの「酵素−基質」複合体に関する構造分析から、比較的低い基質結合親和性を示すシュードモナスｓｐ．に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼの活性部位に変異を導入することによりＣＰＣに対する特異活性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するために重要な情報が得られると思われる。
【０００８】
そこで、本発明者らはＣＰＣから７−ＡＣＡを製造するための１段階酵素法で使用することができるＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を開発しようと試みた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的はＣＰＣを７−ＡＣＡに変換するのに有利に使用することができるＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体とその機能的に等価な誘導体を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は前記ＣＰＣアシラーゼ変異体とその機能的に等価な誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、前記ヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、前記ヌクレオチド配列又は前記発現ベクターで形質転換された微生物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は前記形質転換微生物を使用してＣＰＣアシラーゼ変異体を作製するための方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は前記ＣＰＣアシラーゼ変異体を使用してＣＰＣから７−ＡＣＡ又はその塩を製造するための方法、前記ＣＰＣアシラーゼ変異体を含有する組成物、あるいはプロセシングされたＣＰＣアシラーゼ変異体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の１側面によると、配列番号４のＣＰＣアシラーゼαサブユニットのＶａｌ１２１α、Ｇｌｙ１３９α及びＰｈｅ１６９αならびに配列番号５のＣＰＣアシラーゼβサブユニットのＭｅｔ３１β、Ｐｈｅ５８β、Ｈｉｓ７０β、Ｉｌｅ７５β、Ｉｌｅ１７６β及びＳｅｒ４７１βから構成される群から選択される少なくとも１個のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されていることを特徴とするＣＰＣアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体が提供される。
【００１５】
本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体としては、
Ｖａｌ１２１αがアラニンで置換されているか；
Ｇｌｙ１３９αがセリンで置換されているか；
Ｐｈｅ１６９αがチロシンで置換されているか；
Ｍｅｔ３１βがロイシンで置換されているか；
Ｐｈｅ５８βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されているか；
Ｈｉｓ７０βがセリン又はロイシンで置換されているか；
Ｉｌｅ７５βがスレオニンで置換されているか；
Ｉｌｅ１７６βかバリンで置換されているか；または
Ｓｅｒ４７１βがシステインで置換されているものが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の上記及び他の目的は添付図面を参照して本発明の以下の記載から理解されよう。
【００１７】
本明細書で使用する「ＣＰＣに対する反応性の増加」なる用語はＣＰＣに対する特異活性の増加及び／又は７−ＡＣＡによる最終産物阻害の低下を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する「機能的に等価な誘導体」なる用語は本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体と同一の機能的特性を維持するＣＰＣアシラーゼ誘導体を意味する。即ち、機能的に等価な誘導体は、１又は数個のヌクレオチドの配列変異、欠失、挿入、置換、逆位及びその組合せにより変異していてもよいが、ＣＰＣアシラーゼ変異体として機能することが可能な天然、合成又は組換えポリペプチド等の可能な全変異体を含む。
【００１９】
本明細書で使用する「加工されたＣＰＣアシラーゼ変異体」なる用語は遊離状態ではなく、固定化状態のＣＰＣアシラーゼ変異体を意味する。ＣＰＣアシラーゼ変異体は共有結合、イオン結合、親水性結合、物理的結合、マイクロカプセル封入等の慣用方法により、当分野で一般に使用されている慣用の担体に固定化することができる。更に、それ以上精製せずに、ＣＰＣアシラーゼ変異体を生産する微生物をそのまま固定化する全細胞固定化法により、加工されたＣＰＣアシラーゼ変異体を作製することもできる。
【００２０】
本明細書で使用する「ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ」なる用語は一般にＧＬ−７−ＡＣＡを７−ＡＣＡに変換することが可能な酵素を意味する。本明細書で使用する「ＣＰＣアシラーゼ」なる用語はＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼのうちでＣＰＣに対する特異活性をもち、ＣＰＣの７位のアミド結合を切断してアミノアジポイル側鎖を除去することによりＣＰＣから７−ＡＣＡを直接生産する酵素を意味する。本明細書で使用する「ＣＡＤ」なる用語はシュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼを意味する。
【００２１】
本発明はＣＰＣに対する反応性の改善されたシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ変異体とその機能的に等価な誘導体のアミノ酸配列；前記ＣＰＣアシラーゼ変異体とその機能的に等価な誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００２２】
本発明ではＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するための出発遺伝子としてシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（「ａｃｙＩＩ遺伝子」）を使用し、ａｃｙＩＩ遺伝子はＭａｔｓｕｄａらにより同定されたＣＰＣアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５８２１−５８２６，１９８７；ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ１８２７８）のヌクレオチド配列に基づいてＤＮＡ合成器を使用して新規に合成される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して蛋白質合成効率を増加するためには、ＡｃｙＩＩの従来公知のアミノ酸配列を大腸菌媒介の蛋白質合成において使用されるのに好適なコドンに適合できるように改変する。例えば、ａｃｙＩＩ遺伝子によりコードされる従来公知のアミノ酸配列においては、フェニルアラニンの唯一のコドンはＴＴＣであり、アルギニンの唯一のコドンは主にＣＧＣ又はＣＧＧであるため、本発明で合成されるａｃｙＩＩ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列はＴＴＴコドンとＣＧＴコドンを夫々フェニルアラニンとアルギニンに使用する。本発明で合成されるａｃｙＩＩ遺伝子は配列番号１のヌクレオチド配列をもつ２，３２５塩基対から構成される。配列番号１では、塩基番号１から２，３２２（２，３２３〜２，３２５：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長蛋白質コーディング領域であり、この配列から誘導される７７４個のアミノ酸から構成される推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。本発明で合成されるａｃｙＩＩ遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列は従来周知のＣＰＣアシラーゼのアミノ酸配列と同一であるが、配列番号１のヌクレオチド配列中の塩基対の１８％は既存ＣＰＣアシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列と相違する。
【００２３】
大半のＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（又はＣＰＣアシラーゼ）遺伝子から推定されるアミノ酸配列は順にαサブユニットとスペーサーペプチドとβサブユニットから構成される。シュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来する野生型ＣＰＣアシラーゼは宿主細胞で転写翻訳後に約８４ｋＤａのサイズをもつ不活性単鎖ポリペプチドとして生成する。その後、配列番号２のアミノ酸配列の２３０位と２３１位のアミノ酸の間と２３９位と２４０位のアミノ酸の間に２回の自己消化が生じて、アミノ酸９個から構成されるスペーサーペプチドが除去され、２５ｋＤａαサブユニットと約５８ｋＤαβサブユニットに分離する。上記のように分離したαサブユニットの１個が疎水性相互作用によりβサブユニットの１個と結合し、アシラーゼ活性をもつ約８３ｋＤａ二量体を形成する。一般に公知の通り、原核生物で蛋白質合成中に翻訳開始に必要な最初のアミノ酸であるメチオニンコドンは翻訳後に除去される。従って、本発明で使用される野生型ＣＰＣアシラーゼの活性形はアミノ酸２２９個から構成されるαサブユニット（配列番号４）とアミノ酸５３５個から構成されるβサブユニット（配列番号５）から構成される。
【００２４】
対応する遺伝子の転写翻訳後に宿主細胞で適正な自己消化が生じない場合には、不活性ポリペプチド形態のＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（又はＣＰＣアシラーゼ）が生産される。従って、宿主細胞における自己消化効率は活性蛋白質の獲得に重要な役割を果たす。宿主細胞におけるアシラーゼの過剰生産やスペーサーペプチド又は成熟蛋白質における特定アミノ酸の変異等のいくつかの理由により自己消化効率が低下して不活性蛋白質が生産される可能性があることも報告されている（Ｌｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６２：７１３−７１９，１９９９；Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４８３７６−４８３８１，２００１）。従って、ＣＰＣアシラーゼの反応特性を改善しようとする場合には、酵素反応性を増加するために特定アミノ酸に導入する変異が自己消化効率に影響を与えないかという問題を的確に考慮する必要がある。即ち、ＣＰＣアシラーゼ遺伝子の転写／翻訳後に宿主細胞で生産される不活性ポリペプチドの自己消化効率の変化は不活性ＣＰＣアシラーゼの生産性に直接関係するので、精製された活性ＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性特徴を知らずにＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を選択することは困難である。このような問題を解決するために、本発明者らは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき、翻訳中にαサブユニットとβサブユニットを個々に合成することにより自己消化段階なしに活性ＣＰＣアシラーゼを生産することが可能な配列番号３のヌクレオチド配列をもつＣＰＣアシラーゼ遺伝子を設計した。配列番号３のＣＰＣアシラーゼ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は配列番号２の２３１〜２３９位の領域に対応するスペーサーペプチドをコードするヌクレオチド配列が変異している以外はＣＰＣアシラーゼ遺伝子ａｃｙＩＩによりコードされる配列番号２のアミノ酸配列と一致する。即ち、αサブユニットの最後のアミノ酸をコードするグリシンコドンの後に翻訳終止コドンが挿入され；制限酵素部位を含むランダムヌクレオチド配列と、−ＡＧＧＡ−として表されるリボソーム結合部位をコードするヌクレオチド配列と、別のランダムヌクレオチド部位と、翻訳開始コドン（メチオニン）を連続的に配置したヌクレオチド配列がβサブユニットの最初のアミノ酸をコードするセリンコドンの前に挿入されている。本発明者らはそれ自体の構造遺伝子を個々に維持するようにαサブユニットとβサブユニットをコードするヌクレオチド配列を各々作製することにより、１個のオペロン構造でＣＰＣアシラーゼ遺伝子を作製しようと試みた。配列番号３のヌクレオチド配列をもち、αサブユニットとβサブユニットを個々に発現するＣＰＣアシラーゼ遺伝子をｓｅｍと言う。従って、本発明のＣＰＣアシラーゼ遺伝子ｓｅｍを適切な発現ベクターに挿入し、宿主細胞に形質転換するならば、αサブユニットとβサブユニットは個々に合成され、宿主細胞内で相互に結合し、活性なＣＰＣアシラーゼの二量体形が得られるであろうと予想することができる。配列番号３のｓｅｍ遺伝子を含む大腸菌形質転換細胞から精製したＣＰＣアシラーゼと配列番号１のａｃｙＩＩ遺伝子を含む大腸菌形質転換細胞から精製したＣＰＣアシラーゼの特性を比較すると、ｓｅｍに由来するＣＰＣアシラーゼの特性（例えば分子量、特異活性、基質特異性、最適反応温度及びｐＨ）は実際にａｃｙＩＩに由来するＣＰＣアシラーゼに一致している。従って、αサブユニットとβサブユニットを別々に発現させると、不活性ポリペプチドの自己消化効率の原因を取り除くことができ、特定アミノ酸残基に導入された変異により誘導される特性の変化を検出することが容易になる。そこで、本発明では、ＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するための出発ＤＮＡとして配列番号３のａｃｙＩＩ遺伝子を使用する。
【００２５】
本発明で使用するシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ，配列番号２）のアミノ酸配列の文献命名法は最初のアミノ酸としてαサブユニットのＮ末端のメチオニンコドンから出発して最後のアミノ酸としてβサブユニットのＣ末端のアラニンコドンまで連続ナンバリングシステムを採用している。しかし、最初のアミノ酸であるメチオニンとスペーサーペプチドは宿主細胞でＣＰＣアシラーゼ遺伝子の転写翻訳後に除去されるので、成熟蛋白質のアミノ酸配列には存在しない。即ち、活性蛋白質のアミノ酸配列はαサブユニットのアミノ酸配列とβサブユニットのアミノ酸配列から構成される。従って、本発明で使用するナンバリングシステムは成熟ＣＰＣアシラーゼの活性形に存在するαサブユニットとβサブユニットを各々連続的にナンバリングする。ＣＰＣアシラーゼのアミノ酸配列の特定残基の呼称は慣用命名法に従い、配列番号４のアミノ酸配列のαサブユニットの最初の残基であるスレオニンをＴｈｒ１αとし、配列番号５のアミノ酸配列のβサブユニットの最初の残基であるセリンをＳｅｒ１βとする。従って、Ｔｈｒ１αとＳｅｒ１βは配列番号２のアミノ酸配列中の２番目の残基スレオニンと２４０番目の残基セリンを夫々意味する。
【００２６】
ＣＰＣアシラーゼのアミノ酸配列中に変異を導入した特定残基の呼称は慣用命名法に従い、αサブユニットの１６９番目の残基フェニルアラニンをチロシンで置換する変異残基をＦ１６９αＹとし、βサブユニットの１７６番目の残基イソロイシンをバリンで置換する変異残基はＩ１７６βＶとする。
【００２７】
本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体は配列番号３のＣＰＣアシラーゼ遺伝子ｓｅｍを出発ＤＮＡとし、慣用点変異法と遺伝子工学技術を使用して以下のように作製した（図５参照）。
【００２８】
まず、ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の特異活性を高めるために、コンピュータープログラムを使用したＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造モデリングにおける仮想変異誘発の結果に基づき、変異させるべきアミノ酸残基をＡｃｙＩＩのアミノ酸配列から選択した。上記のように選択した変異アミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を含む人工オリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにかけ、ＣＰＣアシラーゼ遺伝子に部位特異的変異誘発を誘導した。変異遺伝子を微生物に形質転換し、形質転換細胞を適切な条件下で培養し、ＣＰＣアシラーゼを生産した。次に、こうして生産されたＣＰＣアシラーゼの酵素活性を測定し、ＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を選択した。選択したＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を分析した。その結果、配列番号４及び５のＡｃｙＩＩアミノ酸配列におけるＰｈｅ１６９α、Ｍｅｔ３１β、Ｐｈｅ５８β、Ｈｉｓ７０β及びＩｌｅ１７６βから構成される群から選択されるアミノ酸残基の１個以上に導入された変異はＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ反応性を高めることが判明した。
【００２９】
ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性を更に高めるために、選択したＣＰＣアシラーゼ変異体をエラープローンＰＣＲにかけ、ランダム部位に点変異を誘導した。変異遺伝子を宿主細胞に形質転換して変異体ライブラリーを構築し、ＣＰＣに対する反応性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体を含む宿主細胞を変異体ライブラリーからスクリーニングした。こうして作製されたＣＰＣアシラーゼ変異体の酵素活性を測定し、改善されたＣＰＣアシラーゼ反応性をもつＣＰＣアシラーゼ変異体を選択し、上記の選択したＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を分析した。その結果、配列番号４及び５のＡｃｙＩＩアミノ酸配列におけるＶａｌ１２１α、Ｇｌｙ１３９α、Ｉｌｅ７５β及びＳｅｒ４７１βから構成される群から選択されるアミノ酸残基の１個以上に導入された変異はＣＰＣを７−ＡＣＡに変換するＣＰＣアシラーゼの効率を高めることが判明した。
【００３０】
従って、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体は配列番号４のＣＰＣアシラーゼαサブユニットのＶａｌ１２１α、Ｇｌｙ１３９α及びＰｈｅ１６９αならびに配列番号５のＣＰＣアシラーゼβサブユニットのＭｅｔ３１β、Ｐｈｅ５８β、Ｈｉｓ７０β、Ｉｌｅ７５β、Ｉｌｅ１７６β及びＳｅｒ４７１βから構成される群から選択される少なくとも１個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されていることを特徴とするアミノ酸配列をもつことが好ましい。
【００３１】
ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼの反応性を高めるための上記アミノ酸置換において、特定アミノ酸残基をグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、システイン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン及びアルギニンから構成される群から選択される別のアミノ酸で置換することが好ましい。Ｖａｌ１２１αをアラニン；Ｇｌｙ１３９αをセリン；Ｐｈｅ１６９αをチロシン；Ｍｅｔ３１βをロイシン；Ｐｈｅ５８βをアスパラギン、メチオニン、アラニン、ロイシン、バリン又はシステイン；Ｈｉｓ７０βをセリン又はロイシン；Ｉｌｅ７５βをスレオニン；Ｉｌｅ１７６βをバリン；Ｓｅｒ４７１βをシステインで置換することがより好ましい。
【００３２】
本発明の１好適態様では、Ｖａｌ１２１αをアラニン；Ｇｌｙ１３９αをセリン；Ｐｈｅ５８βをアスパラギン；Ｉｌｅ７５βをスレオニン；Ｉｌｅ１７６βをバリン；Ｓｅｒ４７１βをシステインで置換したＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子Ｓ１２を作製した。Ｓ１２変異体遺伝子はＣＰＣに対する特異活性が増加しているが、７−ＡＣＡによる最終産物阻害の低下を示す。Ｓ１２変異体遺伝子は配列番号６のヌクレオチド配列をもち、Ｓ１２変異体遺伝子によりコードされる活性なＣＰＣアシラーゼ変異体は配列番号７のαサブユニットと配列番号８のβサブユニットから構成される。
【００３３】
本発明は更に、ＣＰＣアシラーゼ変異体の機能的に等価な誘導体も含む。本発明において機能的に等価な誘導体とは本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体の一般特徴を維持するＣＰＣアシラーゼを意味する。即ち、機能的に等価な誘導体は、１又は数個のヌクレオチドの配列変異、欠失、挿入、置換、逆位及びその組合せにより変異しており、ＣＰＣアシラーゼ変異体として機能することが可能な天然、合成又は組換えポリペプチド等の可能なすべての変異体を含む。
【００３４】
更に、本発明はＣＰＣに対する反応性の改善された前記ＣＰＣアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。このポリヌクレオチドは配列番号６のヌクレオチド配列をもつことが好ましい。本発明において機能的に等価な誘導体とはＣＰＣアシラーゼ変異体のαサブユニット及び／又はβ−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの主要機能特性を維持するポリヌクレオチドとその誘導体を意味する。従って、本発明は特定スペーサーペプチドを介してβサブユニットと結合したαサブユニットを含むＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドのみならず、スペーサーペプチドを介さずにＣＰＣアシラーゼ変異体のαサブユニットとβサブユニットの両者をコードするポリヌクレオチドもその範囲に含む。更に、ＣＰＣアシラーゼ変異体のαサブユニットのみをコードするポリヌクレオチドとＣＰＣアシラーゼのβサブユニットのみをコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
本発明は本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子のヌクレオチド配列又はＣＰＣアシラーゼ変異体アミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列と、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子のヌクレオチド配列中の遺伝コードのコドン縮重により作製されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドもその範囲に含む。
【００３６】
更に、本発明は本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを含む。前記組換え発現ベクターは慣用方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に従ってＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子と適切な転写／翻訳調節配列を含むＤＮＡフラグメントを適切な発現ベクターに挿入することにより作製することができる。本発明においては、外来遺伝子を宿主で発現することが可能な任意発現ベクターを使用することができる。例えば、好ましい発現ベクターとしては限定されないが、プラスミド、ファージベクター及び組込みベクターが挙げられる。
【００３７】
上記のように作製した組換え発現ベクターを慣用形質転換法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）に従って適切な宿主細胞に導入することができる。組換えＤＮＡの発現に適した宿主細胞としては、細菌、放線菌、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞を使用することができる。これらの宿主細胞のうちでは大腸菌又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種等の細菌；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種等の放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種等の酵母；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種等の真菌；及びセファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種又はアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）種等のＣＰＣ産生微生物が好ましい。
【００３８】
本発明の１好適態様において、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子Ｓ１２（配列番号６）を含む組換え発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って２００３年７月３０日付けでＫｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）（所在地：Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ，３０５−３３３，大韓民国）にアクセション番号ＫＣＴＣ １０５０３ＢＰで寄託された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−Ｓ１２と呼ぶ大腸菌形質転換細胞を得る。
【００３９】
ＣＰＣアシラーゼ変異体はＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子又はその機能的に等価な誘導体を含む発現ベクターを導入した前記形質転換微生物を適切な培地で適正な条件下に培養することにより作製することができる。
【００４０】
更に、ＣＰＣアシラーゼ変異体はＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするαサブユニット遺伝子又はその機能的に等価な誘導体のみを含む発現ベクターで形質転換された微生物と、ＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするβサブユニット遺伝子又はその機能的に等価な誘導体のみを含む発現ベクターで形質転換された微生物を適切な培地で適正な条件下に培養し、夫々の形質転換微生物でαサブユニット蛋白質とβサブユニット蛋白質を別々に生産し、精製した２種のサブユニット蛋白質をインビトロ混合することにより作製することもできる。
【００４１】
こうして作製したＣＰＣアシラーゼ変異体をそのまま使用するか又は精製形で使用し、１段階酵素法で所望生成物７−ＡＣＡを生産することができる。ＣＰＣアシラーゼ変異体はＣＰＣアシラーゼの特徴に基づく各種カラムクロマトグラフィー技術を特定目的に従って多少改変するか又は改変せずに使用し、慣用蛋白質精製法により精製することができる。更に、ニッケルカラムに対するヒスチジンペプチドの結合親和性又はセルロースに対するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）の結合親和性等の結合親和性を利用してアフィニティークロマトグラフィーによりＣＰＣアシラーゼ変異体を精製することもできる。
【００４２】
本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体は固定化形態で使用することもできる。ＣＰＣアシラーゼ変異体の固定化は担体（例えばセルロース、澱粉、デキストラン及びアガロース等の天然ポリマー；ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート及びＥｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ等の合成ポリマー；又はシリカ、ベントナイト及び金属等の鉱物）を使用する慣用方法により実施することができる。ＣＰＣアシラーゼ変異体は共有結合、イオン結合、親水性結合、物理的結合又はマイクロカプセル封入等の慣用の固定化方法により前記担体に結合させることができる。更に、グルタルアルデヒド又は臭化シアンの作用により担体と酵素の間に共有結合を形成することによりＣＰＣアシラーゼ変異体を固定化することも可能である。ＣＰＣアシラーゼ変異体を精製せずに、ＣＰＣアシラーゼ変異体を生産する微生物細胞を全細胞固定化法によりそのまま固定化することが好ましい。微生物により産生されるＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性を高めるためには、細胞壁に穴を開けるか又は細胞表面発現技術を適用することも可能である。
【００４３】
更に、本発明は前記ＣＰＣアシラーゼ変異体を使用して式ＩのＣＰＣから式ＩＩの７−ＡＣＡ又はその塩を製造するための方法を提供する。
【００４４】
下式中、Ｒはアセトキシ（−ＯＣＯＣＨ３）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、水素（−Ｈ）又はその塩である。Ｒはアセトキシ（−ＯＣＯＣＨ３）が好ましく、塩はナトリウム、カリウム又はリチウム塩等のアルカリ金属塩が好ましい。
【００４５】
【化２】
【００４６】
７−ＡＣＡ（ＩＩ）はＣＰＣ（Ｉ）を本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体と接触させることにより製造することができ、ここで、このＣＰＣアシラーゼはＣＰＣアシラーゼ変異体産生株の培養液として使用してもよいし、ＣＰＣアシラーゼ変異体、精製遊離酵素自体又は前記酵素の固定化形態を含む組成物として使用してもよい。ＣＰＣアシラーゼ変異体とＣＰＣ（Ｉ）の接触反応は水溶液中で実施することが好ましい。ＣＰＣ（Ｉ）の好適濃度は１〜５００ｍＭであり；ＣＰＣアシラーゼ変異体の添加量は０．１〜１００Ｕ／ｍｌであり；反応混合物のｐＨは７〜１０であり；反応時間は０．１〜２４時間であり；反応温度は４〜４０℃である。上記酵素反応により生成された７−ＡＣＡ（ＩＩ）を慣用方法により反応混合物から単離精製することができる。
【００４７】
更に、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体をＣＰＣ（Ｉ）とインビボで接触させることにより７−ＡＣＡ（ＩＩ）を製造することもできる。特に、７−ＡＣＡ（ＩＩ）はアクレモニウム・クリソゼナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｒｙｓｏｚｅｎｕｍ）等のＣＰＣ生合成活性をもつ微生物にＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子又はその機能的に等価な誘導体を導入する段階と；形質転換細胞を適切な培地で適正な条件下に培養する段階と；ＣＰＣアシラーゼ変異体を前記形質転換細胞中で生合成されたＣＰＣ（Ｉ）と自然接触させる段階により製造することができる。
【００４８】
以下、実施例により本発明を更に例証する。当然のことながら、以下の実施例は本発明の好適態様に関するものであるが、例証に過ぎない。上記記載と以下の実施例から当業者は本発明の本質的特徴を認識し、発明の精神と範囲から逸脱することなく、各種用途と条件に合わせて本発明の種々の変更及び変形を実施することができる。
【実施例１】
【００４９】
ＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体の作製
＜１−１＞構造情報に基づくＣＰＣアシラーゼ変異体の作製
＜１−１−１＞構造情報に基づく変異対象ＡｃｙＩＩアミノ酸残基の選択
ＣＡＤ−ＧＬ−７−ＡＣＡ複合体の三次構造が最近決定された（Ｋｉｍら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１２５３−１２６４，２００１；Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４８３７６−４８３８１、２００１）。図３に示すように、ＣＡＤの基質結合部位に存在するＡｒｇ５７β、Ｔｙｒ３３β、Ｔｙｒ１４９α及びＡｒｇ１５５αはＧＬ−７−ＡＣＡと直接水素結合を形成し、Ｐｈｅ１７７β、Ｌｅｕ２４β及びＶａｌ７０βは疎水性相互作用によりＧＬ−７−ＡＣＡと結合する。更に、Ｇｌｎ５０βはＧＬ−７−ＡＣＡと直接相互作用しないが、Ａｒｇ５７β及びＴｙｒ１４９αと水素結合を形成し、これらの残基を触媒反応に適した位置に配置する。一方、ＣＡＤとＧＬ−７−ＡＣＡの結合において、アセトキシ基と６員環と４員βラクタム環を含むＧＬ−７−ＡＣＡのβラクタムコアは活性部位残基との結合に有意な影響を与えない。逆に、ＧＬ−７−ＡＣＡ側鎖としてのグルタル酸領域はＡｒｇ５７β、Ｔｙｒ３３β、Ｔｙｒ１４９α及びＰｈｅ１７７βと正確に結合することにより基質結合に最大影響を及ぼす（図２及び３）。更に、Ｌｅｕ２４βとＶａｌ７０βは基質を適切な位置まで占有させることによりＳｅｒ１βの触媒反応の刺激に役割を果たすと推定されている。
【００５０】
一方、ＣＡＤ−ＧＬ−７−ＡＣＡ複合体の三次構造とＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造のオーバーラップの結果、ＧＬ−７−ＡＣＡのグルタル酸側鎖との結合に関与するＡｒｇ５７β、Ｔｙｒ３３β、Ｐｈｅ１７７β及びＴｙｒ１４９α等のＣＡＤの主要残基はＣＰＣのＤ−α−アミノアジピン酸側鎖の末端領域のカルボキシル基及びＤ形アミノ基とぶつかる（図４）。これらのモデリング結果から、ＣＰＣ側鎖（即ち、ＧＬ−７−ＡＣＡ側鎖に比較してＣＰＣ側鎖に付加的に存在する炭素骨格とＤ−アミノ基）を受容するために十分なスペースをＣＡＤの基質結合部位の内側に確保できるならば、ＣＰＣに対するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼの特異活性を増加できると予想される。
【００５１】
また、ＣＡＤ、ペニシリンＧアシラーゼ及びシュードモナスｓｐ．に由来するＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼの構造を比較した結果、シュードモナスｓｐ．に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼは他の酵素と同様の基質結合及び反応パターンを示すことが推定された（Ｋｉｍら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１２５３−１２６４，２００１；Ｆｒｉｔｚ−Ｗｏｌｆら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１：９２−１０３，２００２）。更に、ＣＡＤはＣＰＣに対する活性をもたないが、シュードモナスｓｐ．に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ）はＧＬ−７−ＡＣＡに比較して約５％のレベルのＣＰＣに対するアシラーゼ活性をもつことが報告されている（Ｍａｔｓｕｄａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５８１５−５８２０，１９８７）。従って、ＣＰＣに対する酵素活性をもたないＣＡＤよりも、ＣＰＣに対して安定したレベルの酵素活性をもつＡｃｙＩＩに基づいてＣＰＣアシラーゼ変異体を開発することが有利である。そこで、本発明はＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するための基本遺伝子としてシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（ａｃｙＩＩ）を使用した。
【００５２】
本発明はＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造と仮想変異誘発情報に基づいてＡｃｙＩＩの活性部位を選択した後に、選択した活性部位のうちでＣＰＣ結合の妨害に関与するＡｃｙＩＩ残基に部位特異的変異誘発を実施することにより、野生型ＡｃｙＩＩよりもＣＰＣに対して良好な特異活性をもつＣＰＣアシラーゼ変異体を作製しようと試みた。表１は部位特異的変異誘発の対象としたＣＡＤの活性部位残基に対応するＡｃｙＩＩ残基を示す。
【００５３】
【表１】
【００５４】
ＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造モデリングの結果に基づき、ＣＰＣ側鎖の結合を著しく阻害すると推定されるＣＡＤのＰｈｅ５８β、Ｔｙｒ３３β、Ｐｈｅ１７７β及びＴｙｒ１４９α残基に対応するＡｃｙＩＩのＰｈｅ５８β、Ｍｅｔ３１β、Ｉｌｅ１７６β及びＰｈｅ１６９α残基と、Ｓｅｒ１β活性部位の触媒反応を刺激するＣＡＤのＶａｌ７０β残基に対応するＡｃｙＩＩのＨｉｓ７０β残基に部位特異的変異誘発を実施した（図５）。
【００５５】
＜１−１−２＞ｐＢＣＰＣ及びｐＢＳＥＭプラスミドの作製
以下のように配列番号１のａｃｙＩＩ構造遺伝子ＤＮＡフラグメントをｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）のＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位に挿入することによりｐＢＣＰＣプラスミドを構築した。まず、ＤＮＡ合成器を使用することにより、シュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（ａｃｙＩＩ）のＤＮＡヌクレオチド配列と前記配列によりコードされる蛋白質ＡｃｙＩＩのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ１８２７８）に基づいてａｃｙＩＩ構造遺伝子を合成した。この場合、ａｃｙＩＩ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は文献に公開されている配列と同一としたが、そのヌクレオチド配列はａｃｙＩＩ遺伝子が大腸菌に１個以上の好ましいコドンを含むように多少改変して合成した。
【００５６】
制限酵素認識部位とリボソーム結合部位をａｃｙＩＩ構造遺伝子に導入するようにＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応溶液（１００μｌ）は合成ａｃｙＩＩ遺伝子ＤＮＡ１０ｎｇ、ＣＰＣ−Ｆプライマー（配列番号１３）及びＣＰＣ−Ｒプライマー（配列番号１４）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物０．２ｍＭ、Ｔａｑ緩衝液（５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、及びＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ，日本）２．５単位を含有するものとした。プログラマブルサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国）を用い９５℃にて５分間予備変性させることにより反応を開始した。ＰＣＲ条件は、１分９５℃（変性）、３０秒５８℃（アニール）、及び１分３０秒７２℃（重合）を２５サイクルからなり、１０分７２℃（後重合）の最終伸長とした。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物約２．５ｋｂをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡを、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用して１６℃で１２〜１６時間、インサートＤＮＡをベクターＤＮＡに連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析した。その結果、配列番号１のａｃｙＩＩ構造遺伝子を含むｐＢＣＰＣプラスミドが作製され、ｐＢＣＰＣプラスミドを含む大腸菌形質転換細胞を大腸菌ＭＣ１０６１（ｐＢＣＰＣ）と命名した。
【００５７】
配列番号３のｓｅｍ構造遺伝子ＤＮＡフラグメントをｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）のＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位に挿入することによりｐＢＳＥＭプラスミドを構築した。次のように一連のＰＣＲ増幅を実施した。ｐＢＣＰＣプラスミドを鋳型とし、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）とαＯＲＦ−Ｒプライマー（配列番号１５）を使用して０．８ｋｂのＰＣＲ産物を得、ｐＢＣＰＣプラスミドを鋳型とし、βＯＲＦ−Ｆプライマー（配列番号１６）とＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒプライマー（配列番号１８）を使用して約０．９６ｋｂのＰＣＲ産物を得、ｐＢＣＰＣプラスミドを鋳型とし、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆプライマー（配列番号１７）とＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）を使用して０．７５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。上記のように得られた０．８ｋｂ、０．９６ｋｂ及び０．７５ｋｂのＰＣＲ産物を混合し、プライマーを添加しなかった以外は上記と同一のＰＣＲ条件下でＰＣＲを実施し、３個のＰＣＲ産物を１個に融合した約２．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。その後、Ｔ３プライマー（配列番号９）とＴ７プライマー（配列番号１０）を使用して約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＰＣＲにかけ、サイズ約２．５ｋｂのｓｅｍ遺伝子ＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲ増幅後、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡとベクターＤＮＡを１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析した。その結果、配列番号３のｓｅｍ構造遺伝子を含むｐＢＳＥＭプラスミドが作製され、ｐＢＳＥＭプラスミドを含む大腸菌形質転換細胞を大腸菌ＭＣ１０６１（ｐＢＳＥＭ）と命名した。
【００５８】
ｐＢＣＰＣプラスミドに由来する大腸菌形質転換細胞によるＣＰＣアシラーゼ生産性をｐＢＳＥＭプラスミドに由来する大腸菌形質転換細胞による生産性と比較するために、各大腸菌形質転換細胞から得られたＣＰＣアシラーゼ粗酵素溶液を次のように調製した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地（１％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，０．５％ＮａＣｌ）３ｍｌに各大腸菌形質転換細胞を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで１６時間激しく振盪しながら培養した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えた新鮮なＬＢ培地５０ｍｌに培養液５０μｌを移し、更に２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養した。培養液を４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を分離し、この沈殿を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。この沈殿を同一緩衝液５ｍｌに懸濁し、４℃で１０分間超音波処理した。その後、懸濁液を４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、ＣＰＣアシラーゼ粗酵素溶液として使用可能な上清を分離した。
【００５９】
Ｐａｒｋら（Ｐａｒｋら，Ｋｏｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５５９−５６４，１９９５）により記載されている方法を以下のように多少変更してＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の酵素活性を測定した。ＣＰＣ（純度７４．２％；ＣＪ Ｃｏｒｐ．，韓国）を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に濃度２０ｍｇ／ｍｌで溶かし、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを８に調整することにより基質溶液を調製した。上記のように調製した粗酵素溶液２０μｌとＣＰＣ溶液２０μｌを混合し、反応混合物を３７℃で５分間インキュベートした。反応後、５０ｍＭ ＮａＯＨと２０％氷酢酸（１：２）の混合物（２００μｌ）を加えて反応を停止した。メタノールに溶かした０．５％（ｗ／ｖ）ＰＤＡＢ（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド；Ｓｉｇｍａ，米国）４０μｌと遠心により反応混合物から回収した上清２００μｌを混合し、反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。反応後、反応混合物の吸光度を４１５ｎｍで測定し、標準材料の校正曲線と比較することにより定量した。この場合、１分間にＣＰＣから７−ＡＣＡ１モルを生産することができる酵素の量として１単位を定義した。一方、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４，１９７６）により記載されている方法に従って酵素溶液中に残存している蛋白質の量を測定し、蛋白質１ｍｇに対応する活性単位として表すことにより、ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の特異活性を測定した。ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性は、同一量の蛋白質を反応混合物に加える段階と、酵素反応を規定時間実施する段階と、反応混合物中で生産された７−ＡＣＡの量を測定する段階と、前記量を相対値として表す段階とにより測定した。同一活性単位に対応する蛋白質を反応混合物に加え、酵素反応を規定時間実施し、反応混合物中で生産された７−ＡＣＡの量を測定し、前記量を相対値として表すことにより、７−ＡＣＡによる最終産物阻害を測定した。
【００６０】
ＣＰＣに対する酵素活性の測定の結果、大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＣＰＣ）により生産されたＣＰＣアシラーゼの生産性は約９７単位／リットルであったが、大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＳＥＭ）による生産性は約１１単位／リットルに過ぎなかった。
【００６１】
＜１−１−３＞Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β二重変異体の作製
ＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するために、以下のようにＭｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β二重変異体を作製した。ＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造モデリングに示すように、ＣＰＣ側鎖はＧＬ−７−ＡＣＡ側鎖に比較して付加的に炭素骨格とＤ−アミノ基を含むので、ＣＡＤはＣＰＣと結合するためにＧＬ−７−ＡＣＡよりも大きなスペースを必要とする。ＣＰＣとの結合に十分なスペースを確保するために、ＡｃｙＩＩの基質結合部位の内側の２個の残基を同時に変異させた。ＣＰＣ側鎖の結合に最も重要な残基としてＣＡＤのＡｒｇ５７βに対応するＡｃｙＩＩのＨｉｓ５７βを保存し、ＣＰＣ側鎖の末端のカルボキシル基とＤ−アミノ基にぶつかると考えられるＡｃｙＩＩのとＭｅｔ３１βをロイシンで置換した。同時に、ＡｃｙＩＩのＨｉｓ５７β側鎖にねじれ角の変化を誘導することによりＣＰＣ側鎖の結合スペースを更に確保するために、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、システイン又はアスパラギン等の比較的小さい側鎖をもつ別のアミノ酸残基でＡｃｙＩＩのＰｈｅ５８βを置換した。その結果、オーバーラップＰＣＲによりＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＬ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＡ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＶ及びＭ３１βＬ／Ｆ５８βＮ二重変異体が作製された（Ｈｏら，Ｇｅｎｅ １５：５１−５９，１９８９）。これらの二重変異体の作製方法を以下に詳述する。
【００６２】
部位特異的変異誘発に使用したＰＣＲ反応溶液（１００μｌ）は鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、フォワード及びリバースプライマー各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物０．２ｍＭ、Ｔａｑ緩衝液（５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、及びＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ，日本）２．５単位を含有するものとした。プログラマブルサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国）で９５℃にて５分間変性させることにより反応を開始した。ＰＣＲ条件は１分９５℃、３０秒５８℃及び６０〜９０秒７２℃を２５サイクルからなり、１０分７２℃の最終伸長とした。
【００６３】
特に、以下の鋳型とプライマーを使用してＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体を作製するための一連のＰＣＲ増幅を実施した。即ちｐＢＳＥＭプラスミドを鋳型とし、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）とＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）を使用して１．０ｋｂのＰＣＲ産物を得、ｐＢＳＥＭプラスミドを鋳型とし、Ｆ５８βＭ−Ｆプライマー（配列番号２０）とＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）を使用して１．６ｋｂのＰＣＲ産物を得た。
【００６４】
上記のように得られた１．０ｋｂと１．６ｋｂのＰＣＲ産物を混合し、プライマーを添加しなかった以外は上記と同一の条件下でＰＣＲを実施し、２個のＰＣＲ産物を相互に結合することにより１個に融合した約２．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。その後、Ｔ３プライマー（配列番号９）とＴ７プライマー（配列番号１０）を使用して約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＰＣＲにかけ、サイズ約２．５ｋｂの二重変異体ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅後、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡをベクターＤＮＡに１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、二重変異体遺伝子を含む形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析し、変異残基を確認した。
【００６５】
上記と同一方法により、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＬ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＡ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＶ及びＭ３１βＬ／Ｆ５８βＮ二重変異体を作製した。この場合、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＣ−Ｆプライマー（配列番号２１）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＬには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＬ−Ｆプライマー（配列番号２４）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＡには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＡ−Ｆプライマー（配列番号２２）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＶには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＶ−Ｆプライマー（配列番号２３）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＮ−Ｆプライマー（配列番号２５）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）をオーバーラップＰＣＲ増幅に使用した。
【００６６】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各ＣＰＣアシラーゼ変異体の粗酵素溶液を使用することにより、上記のように得られた二重変異体のＣＰＣに対する特異活性を測定した。その結果、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＬ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＡ及びＭ３１βＬ／Ｆ５８βＶ二重変異体の特異活性は野生型ＡｃｙＩＩの夫々２．４倍、２．３倍、２．０倍、１．８倍、１．６倍及び１．６倍であることが確認された。
【００６７】
＜１−１−４＞Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｈｉｓ７０β三重変異体の作製
６種の二重変異体のうちで最高の特異活性増加を示すＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭの特異活性を更に高めるために、活性部位Ｓ１βの触媒反応を刺激するＣＡＤのＶａｌ７０βに対応するＡｃｙＩＩのＨｉｓ７０βをセリン又はロイシンで置換し、三重変異体を作製した。
【００６８】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）を製造業者の指示に従って使用することにより、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体を作製した。ＰＣＲ反応溶液（５０μｌ）はＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体ＤＮＡ４０ｎｇ、Ｈ７０βＳ−Ｆプライマー（配列番号２６）及びＨ７０βＳ−Ｒプライマー（配列番号２７）各１００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物１μｌ、緩衝液（１００ｍＭ ＫＣ１，１００ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．８），２０ｍＭ ＭｇＳＯ４，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）５μｌ、及びｐｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，米国）２．５単位を含有するものとした。プログラマブルサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国）で９５℃にて３０秒間変性させることにより反応を開始した。ＰＣＲ条件は３０秒９５℃、１分５５℃、及び１２分６８℃を１６サイクルとした。ＰＣＲ増幅後、ＤｐｎＩ制限酵素１０単位をＰＣＲ反応溶液に加え、３７℃で１時間インキュベートし、変異が生じない鋳型ＤＮＡを除去した。変異体ＤＮＡを精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析し、変異残基を確認した。
【００６９】
Ｈ７０βＬ−Ｆプライマー（配列番号２８）とＨ７０βＬ−Ｒプライマー（配列番号２９）を使用した以外は上記と同一方法に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）を使用することによりＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＬ三重変異体を作製した。
【００７０】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各ＣＰＣアシラーゼ変異体の粗酵素溶液を使用することにより、ＣＰＣに対する三重変異体の特異活性を測定した。その結果、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ及びＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＬ三重変異体の特異活性はＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体の夫々３．２倍と２．４倍を示した。
【００７１】
＜１−１−５＞Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｈｉｓ７０β四重変異体の作製
２種の三重変異体のうちで最高の特異活性増加を示すＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳの特異活性を更に高めるために、活性部位Ｓ１βの効率的触媒反応に適した位置にＣＰＣを配置するのを助長するＣＡＤのＴｙｒ１４９αに対応するＡｃｙＩＩのＰｈｅ１６９αをチロシンで置換し、四重変異体Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳを作製した。チロシン側鎖はフェニルアラニン側鎖に比較して付加的にヒドロキシル（−ＯＨ）基をもつので、ＣＰＣ側鎖及び／又はその隣接残基と水素結合を形成することによりＳ１βの触媒反応を刺激することができる。
【００７２】
Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体を鋳型とし、Ｆ１６９αＹ−Ｆプライマー（配列番号３０）とＦ１６９αＹ−Ｒプライマー（配列番号３１）を使用した以外は実施例＜１−１−４＞に記載したと同一方法に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）を使用することにより、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体を作製した。
【００７３】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、四重変異体の粗酵素溶液を使用することにより、ＣＰＣに対するＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体の特異活性を測定した。その結果、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体の特異活性はＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体の２．１倍に増加した。
【００７４】
＜１−１−６＞Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｈｉｓ７０β／Ｉｌｅ１７６β五重変異体の作製
ＣＰＣに対するＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体特異活性の特異活性を更に高めるために、ＣＰＣ側鎖の結合の妨害に関与していると思われるＣＡＤのＰｈｅ１７７βに対応するＡｃｙＩＩのＩｌｅ１７６βをバリンで置換し、五重変異体Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉｌｅ１７６βＶを作製した。実施例＜１−１−３＞では、ＡｃｙＩＩのＰｈｅ５８βをメチオニンで置換した。一方、ＡｃｙＩＩのＩｌｅ１７６βはＡｃｙＩＩのＰｈｅ５８βに非常に近接して位置しており、ＣＰＣ結合を妨害すると予想される。そこで、ＣＰＣ基質側鎖の結合をより効率的にするために、イソロイシンと同様の構造でサイズが小さい側鎖をもつバリンでＩｌｅ１７６βを置換した。
【００７５】
Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体を鋳型とし、Ｉｌｅ１７６βＶ−Ｆプライマー（配列番号３２）とＩｌｅ１７６βＶ−Ｒプライマー（配列番号３３）を使用した以外は実施例＜１−１−４＞に記載したと同一方法に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）を使用することにより、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体を作製した。
【００７６】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、五重変異体の粗酵素溶液を使用することにより、ＣＰＣに対するＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体の特異活性を測定した。その結果、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体の特異活性はＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体の２．４倍に増加した。
【００７７】
＜１−２＞ＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体の作製
＜１−２−１＞Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β四重変異体の作製
７−ＡＣＡの大規模１段階酵素的製造方法に既存ＣＰＣアシラーゼを適用することは困難であるが、これは、７−ＡＣＡによる最終産物阻害とＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼの特異活性が低いことからＣＰＣから７−ＡＣＡへの変換効率が非常に低いためである。一方、実施例＜１−１＞においてＣＰＣアシラーゼ変異体の特異活性を増加させる一連の部位特異的変異誘発から明らかなように、Ｈｉｓ７０βの変異はＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の特異活性を有意に増加するが、７−ＡＣＡによる最終産物阻害レベルも著しく増加する。そこで、実施例＜１−１−６＞のＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体をＨ７０βＳの復帰変異誘発により野生型残基ヒスチジンに変異させ、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体を作製した（図５）。Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体を鋳型とし、Ｈ７０β−Ｆプライマー（配列番号３４）とＨ７０β−Ｒプライマー（配列番号３５）を使用した以外は実施例＜１−１−４＞に記載したと同一方法に従い、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体を作製した。
【００７８】
野生型、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体及びＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体の各粗酵素溶液の調製後に同一活性単位に対応する酵素溶液を使用することにより、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一の方法により、最終産物阻害を測定した。その結果、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体のＨ７０βＳを野生型残基ヒスチジンに復帰変異させると、７−ＡＣＡによる最終産物阻害は野生型酵素と同等レベルまで低下することが確認された（図６）。
【００７９】
＜１−２−２＞Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β及びＶａｌ１２１α／Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β五重変異体の作製
ＣＰＣに対するＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体の反応性を更に高めるために、四重変異体ＤＮＡにエラープローンＰＣＲを実施し、ランダム部位に点変異をもつ変異体ライブラリーを構築した。この場合、平均して四重変異体遺伝子１個当たりアミノ酸残基１個に置換が生じるように前記エラープローンＰＣＲのエラー率を調節した。変異体ライブラリーの具体的な構築手順は以下の通りとした。
【００８０】
エラープローンＰＣＲに使用したＰＣＲ反応溶液（１００μｌ）はＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体ＤＮＡ５ｎｇ、Ｔ３プライマー（配列番号９）及びＴ７プライマー（配列番号１０）各５０ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ各１．０ｍＭ、５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．３），３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０２５ｍＭ ＭｎＣｌ２及びｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラ，日本）５単位を含有するものとした。プログラマブルサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国）で９５℃にて３分間変性させることにより反応を開始した。ＰＣＲ条件は１分９５℃、３０秒５８℃、及び９０秒７２℃を２０サイクルと、１０分７２℃の最終伸長とした。エラープローンＰＣＲ増幅後、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＳＥＭプラスミドＤＮＡをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ベクターＤＮＡとして使用する３．４ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡとベクターＤＮＡを１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、変異体ライブラリーを構築した。
【００８１】
上記のように得られた変異体ライブラリーからＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を以下のようにスクリーニングした。
【００８２】
クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地２００μｌを充填した９６ウェルプレートにエラープローンＰＣＲによりランダム部位に点変異を導入したＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を含む大腸菌ＭＣ１０６１形質転換細胞を接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで６０〜７０時間激しく振盪しながら培養した。ウェルプレートから取り出した各培養液１００μｌを別の９６ウェルプレートに移した。細胞溶解液（２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０））１００μｌを加え、３０℃で２時間放置した。その後、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かした２．５％（ｗ／ｖ）ＣＰＣ溶液と５ｍＭ ７−ＡＣＡの混合物５０μｌを各ウェルに加え、ウェルプレートを２８℃に１４〜１６時間維持し、ＣＰＣの加水分解反応を誘導した。この場合、７−ＡＣＡをＣＰＣ溶液に添加したが、これはＣＰＣに対する特異活性の改善及び／又は７−ＡＣＡによる最終産物阻害の低下を示すＣＰＣアシラーゼ変異体のスクリーニングを容易にするためである。ＣＰＣの加水分解反応後、反応混合物を４，２００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を分離し、上清５０μｌを別の９６ウェルプレートに移した。停止溶液（酢酸：２５０ｍＭ ＮａＯＨ，２：１）１６０μｌを各ウェルに加えて酵素反応を停止した後、発色剤（メタノールに溶かした０．５％（ｗ／ｖ）ＰＤＡＢ溶液）４０μｌを加え、ウェルプレートを室温で１０分間放置した。次にウェルプレートをマイクロプレートリーダーに載せ、４１５ｎｍの吸光度を測定し、測定した吸光度値を比較することによりＣＰＣに対する特異活性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を選択した。
【００８３】
前記ランダム変異体ライブラリーから約２５，０００個のコロニーをランダムにスクリーニングした結果、ランダム変異誘発の鋳型として使用したＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体よりも高い吸光度値を示す２個の変異体（＃１２０及び＃２１３）を選択した。＃１２０変異体はＧｌｙ１３９αがセリンで置換されており（Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重変異体）、＃２１３変異体はＶａｌ１２１αがアラニンで置換されている（Ｖ１２１αＡ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重変異体）ことが配列分析により確認された（図５）。
【００８４】
更に、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各変異体の粗酵素溶液を使用することにより、＃１２０及び＃２１３変異体のＣＰＣに対する反応性を測定した。その結果、＃１２０及び＃２１３変異体はＣＰＣに対する反応性が実施例＜１−２−１＞のＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体よりも更に増加していることが確認された（図７）。
【００８５】
＜１−２−３＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β六重変異体の作製
Ｖ１２１αＡ又はＧ１３９αＳ変異をＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体に組込むと、ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性が増加することが実施例＜１−２−２＞の結果から確認された。そこで、ＣＰＣに対する反応性を更に高めるために、＃１２０変異体のＧ１３９αＳ変異を＃２１３変異体に組込むことにより、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体を作製した（図５）。本発明の六重変異体は＃２１３変異体ＤＮＡを鋳型とし、Ｇ１３９αＳ−Ｆプライマー（配列番号３６）とＧ１３９αＳ−Ｒプライマー（配列番号３７）をＰＣＲに使用した以外は、実施例＜１−１−４＞に記載したと同一方法に従って作製した。本発明では、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子をＴｎＳ５と命名した。
【００８６】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、六重変異体の粗酵素溶液を使用することにより、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体のＣＰＣに対する反応性を測定した。その結果、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体（ＴｎＳ５）のＣＰＣに対する反応性は＃２１３及び＃１２０変異体よりも増加することが確認された（図７）。
【００８７】
＜１−３＞ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβプラスミドの作製
Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＴｎＳ５遺伝子は、宿主細胞でαサブユニットとβサブユニットを別々に発現し、これらの２個のサブユニットの自然接触によりＣＰＣアシラーゼの活性形を生成するように設計されたＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子（例えばｓｅｍ遺伝子）である。
【００８８】
野生型アシラーゼ遺伝子（ａｃｙＩＩ）等のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を宿主細胞で転写翻訳後に自己消化プロセスにより得られるα及びβサブユニット各１個から構成されるＴｎＳ５遺伝子から活性なＣＰＣアシラーゼ変異体の形成を誘導するために、本発明はＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体のαサブユニットとβサブユニットの間に野生型ＣＰＣアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ）のスペーサーペプチドを挿入した六重ＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするＴｎＳ５αβ遺伝子を作製した（図５）。ＴｎＳ５αβ遺伝子の作製方法を以下に詳細に記載する。
【００８９】
ＴｎＳ５遺伝子をｐＢＣ−ＫＳ（＋）ベクターのＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位に挿入し、ｐＢＣ−ＴｎＳ５プラスミドを作製した。ＰＣＲ増幅を２回実施し、ｐＢＣ−ＴｎＳ５プラスミドを鋳型とし、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）とαＣＰＣ−Ｒプライマー（配列番号３８）を使用することにより０．８ｋｂのＰＣＲ産物を得、ｐＢＣ−ＴｎＳ５プラスミドを鋳型とし、βＣＰＣ−Ｆプライマー（配列番号３９）とＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）を使用して１．７ｋｂのＰＣＲ産物を得た。上記のように得られた０．８ｋｂと１．７ｋｂのＰＣＲ産物を混合し、プライマーを添加しなかった以外は同一条件下でＰＣＲを実施し、２個のＰＣＲ産物を相互に結合することにより１個に融合した約２．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。その後、Ｔ３プライマー（配列番号９）とＴ７プライマー（配列番号１０）を使用して２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＰＣＲにかけ、ＴｎＳ５αβ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲ増幅後、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡをベクターＤＮＡに１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析した。その結果、ＴｎＳ５αβ遺伝子を含むｐＢＣ−ＴｎＳ５αβプラスミドが作製された。
【００９０】
ＴｎＳ５αβ遺伝子によるＣＰＣアシラーゼ変異体の生産性を検討するために、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＴｎＳ５及びＴｎＳ５αβ遺伝子の各々をｐＢＣ−ＫＳ（＋）ベクターに挿入し、夫々ｐＢＣ−ＴｎＳ５及びｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ組換えプラスミドを作製し、各組換えプラスミドを大腸菌ＭＣ１０６１に形質転換し、大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５）及びＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ）を得た。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢブロス５０ｍｌ中で大腸菌形質転換細胞を２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養し、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、形質転換細胞培養液から調製した粗酵素溶液を使用することによりＣＰＣに対する酵素活性を測定した。その結果、各大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５）及びＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ）により生産されたＣＰＣアシラーゼの生産性は夫々約７８単位／リットルと１６２単位／リットルであった。これらの結果から、ＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を宿主細胞で転写翻訳後に自己消化プロセスにより形成される六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（例えばＴｎＳ５αβ）は宿主細胞で別々に発現させたαサブユニットとβサブユニットの自然接触により形成される六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（例えばＴｎＳ５）の生産性の約２倍であることが確認された。
【００９１】
更に、大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ）の培養液から調製した粗酵素溶液を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、蛋白質発現パターンを検討した。その結果、サイズ約８３ｋＤａの不活性前駆体バンドは出現せず、不活性前駆体形の大半は本発明の培養条件下でＴｎＳ５αβ遺伝子の転写翻訳後に効率的自己消化によりＣＰＣアシラーゼ変異体の活性形に変換することが分かった（図７）。従って、以下ではＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するための鋳型ＤＮＡとしてＴｎＳ５αβ遺伝子を使用した。
【００９２】
＜１−４＞ＣＰＣに対する反応性が更に増加したＣＰＣアシラーゼ変異体の作製
＜１−４−１＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ１６９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β五重変異体の作製
本発明では、実施例＜１−１＞〜＜１−３＞で一連の部位特異的変異誘発とランダム変異誘発により、ＣＰＣに対する反応性の改善されたＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子ＴｎＳ５及びＴｎＳ５αβを作製した。ＴｎＳ５αβ六重変異体を作製するためのこれらの変異誘発操作では、ＣＰＣ側鎖の末端のカルボキシル基とＤ−アミノ基にぶつかると予想されるＭｅｔ３１βをロイシンで置換し、Ｐｈｅ５８βをメチオニン、システイン又はアスパラギンで同時に置換し、Ｈｉｓ５７β側鎖のねじれ角を変化させることによりＣＰＣ側鎖の効率的結合に十分なスペースを確保した。即ち、本発明はＣＰＣに対する反応性を更に高めるために、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体のＭｅｔ３１β及びＰｈｅ５８β残基を次のように最適化した。
【００９３】
本発明は、ＴｎＳ５αβ六重変異体ＤＮＡを鋳型としてＭ３１βＬを野生型残基メチオニンに復帰変異誘発すると共にＦ５８βＭをアスパラギン又はシステインに置換し、 ４個の変異体（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ，Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶ，Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ，Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶ）を作製した。これらの変異体は実施例＜１−１−３＞にＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体について記載したと同一の作製方法に従って作製した。この場合、以下のプライマー、即ちＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶにはＭ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）ならびにＦ５８βＣ−Ｆプライマー（配列番号２１）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶにはＭ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）ならびにＦ５８βＮ−Ｆプライマー（配列番号２５）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶにはＭ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１β−Ｒプライマー（配列番号４２）ならびにＦ５８βＣ−Ｆプライマー（配列番号２１）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶにはＭ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１β−Ｒプライマー（配列番号４２）ならびにＦ５８βＮ−Ｆプライマー（配列番号２５）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）を使用してオーバーラップＰＣＲを実施した。
【００９４】
ＣＰＣに対する酵素反応性は、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各変異体の粗酵素溶液を使用することにより測定した。その結果、ＴｎＳ５αβ六重変異体のＦ５８βＭをアスパラギンで置換した変異体は、ＣＰＣに対する反応性が著しく増加し、ＴｎＳ５αβ六重変異体のＭ３１βＬをメチオニンに復帰変異させた変異体はＣＰＣから７−ＡＣＡをより効率的に生産するが、その特異活性は多少低下することが確認された（図８）。これらの結果から、本発明はＴｎＳ５αβ六重変異体よりもＣＰＣに対する反応性が更に増加したＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重変異体（ｍＦ５８）を選択した（図５）。
【００９５】
＜１−４−２＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β四重変異体の作製
本発明では実施例＜１−１−５＞でＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の特異反応性を更に高めるためにＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体のＰｈｅ１６９αをチロシンで置換した。一方、実施例＜１−２−１＞では７−ＡＣＡによる最終産物阻害を低減するためにＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体のＨ７０βＳ残基をヒスチジンに復帰変異誘発し、実施例＜１−４−１＞ではＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体のＭ３１βＬ残基を野生型残基メチオニンに復帰変異誘発した。更に、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重変異体のＦ５８βＭ変異残基及びＩ１７６β残基を夫々アスパラギンとバリンで置換した。こうして、Ｆ１６９αＹ変異残基を野生型残基フェニルアラニンに復帰変異誘発することによりＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体（Ｆ１６９）を作製した（図５）。
【００９６】
Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重変異体ＤＮＡを鋳型とし、Ｆ１６９α−Ｆプライマー（配列番号４５）とＦ１６９α−Ｒプライマー（配列番号４６）をＰＣＲに使用した以外は実施例＜１−１−４＞にＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体ＤＮＡについて記載したと同一の作製方法によりＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体を作製した。
【００９７】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、変異体酵素の粗酵素溶液を使用することによりＣＰＣに対するＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体の反応性を測定した。その結果、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重変異体のＦ１６９αＹを野生型残基フェニルアラニンに復帰変異させると、ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性が更に増加することが確認された（図９）。
【００９８】
＜１−４−３＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ７５β／Ｉｌｅ１７６β及びＶａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β／Ｓｅｒ４７１β五重変異体の作製
ＣＰＣに対するＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体の反応性を更に高めるために、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体をエラープローンＰＣＲにかけ、ランダム変異体ライブラリーを構築した。上記のように構築したランダム変異体ライブラリーからＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体よりもＣＰＣに対する反応性が更に増加した変異体をスクリーニングした。この場合の、エラープローンＰＣＲの反応条件、前記変異体ライブラリーの作製方法及び変異体のスクリーニング方法は、ＣＰＣに対する反応性が更に増加した変異体を変異体ライブラリーからスクリーニングする際に５ｍＭ ７−ＡＣＡ（終濃度）を反応混合物に添加した以外は実施例＜１−２−２＞に記載したものと同一とした。
【００９９】
前記ランダム変異体ライブラリーから約１５，０００個のコロニーをスクリーニングした結果、ランダム変異誘発の鋳型として使用したＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体よりも高い吸光度値を示す２個の変異体（＃５９及び＃７６）を選択した。配列分析の結果、＃５９変異体はＩｌｅ７５βがスレオニンで置換されており（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ五重変異体）、＃７６変異体はＳｅｒ４７１βがシステインで置換されている（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ五重変異体）ことが確認された（図５）。
【０１００】
更に、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各変異体の粗酵素溶液を使用することによりＣＰＣに対する＃５９及び＃７６変異体の反応性を測定した。その結果、ＣＰＣに対する＃５９及び＃７６変異体の反応性はＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体（Ｆ１６９）よりも高いことが確認された（図９）。
【０１０１】
＜１−４−４＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ７５β／Ｉｌｅ１７６β／Ｓｅｒ４７１β六重変異体の作製
ＣＰＣに対する反応性はＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体にＩｌｅ７５βＴ又はＳ４７１βＣ変異を導入することにより増加することが上記から確認された。そこで、ＣＰＣに対する反応性を更に高めるために、本発明では＃５９変異体のＩｌｅ７５βＴ変異を＃７６変異体に導入することによりＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体を作製した（図５）。本発明の六重変異体は、＃７６変異体ＤＮＡを鋳型とし、Ｉ７５βＴ−Ｆプライマー（配列番号４３）とＩ７５βＴ−Ｒプライマー（配列番号４４）をＰＣＲ増幅に使用した以外は、実施例＜１−１−４＞に記載したと同一の方法により作製した。本発明ではＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子をＳ１２と命名した。
【０１０２】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、六重変異体の粗酵素溶液を使用することにより、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体のＣＰＣに対する反応性を測定した。その結果、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体（Ｓ１２）のＣＰＣに対する反応性は＃７６変異体（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／ＳβＣ五重変異体）よりも高いことが確認された（図１０）。
【実施例２】
【０１０３】
ＣＰＣアシラーゼ変異体の精製とその反応特性の分析
＜２−１＞ＣＰＣに対する特異活性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体の精製
クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたテリフィックブロス（１．２％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ，２．４％Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，０．４％グリセロール，０．１７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４，０．７２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４）１リットル中で野生型又は本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を導入した組換えプラスミドを含む大腸菌ＭＣ１０６１形質転換細胞を３０℃で１６時間培養し、前培養液を得た。前培養液１０ｍｌを同一培地に接種した後、２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養した。培養液を４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を分離し、沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。沈殿を同一緩衝液１００ｍｌに懸濁した。この懸濁液を４℃で２０分間超音波処理し、細胞壁を破壊し、４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して不溶性材料と細胞破片を除去し、以下に粗酵素溶液として使用する上清を得た。
【０１０４】
硫酸アンモニウムを粗酵素溶液に加え、その最終飽和率を３０％に調整し、反応混合物を４℃で１時間飽和まで撹拌した。その後、反応混合物を４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を除去し、硫酸アンモニウムを上清に加えて最終飽和率を６０％に調整した。反応混合物を４℃で１時間飽和まで撹拌し、４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を回収した。沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、５０ｍＭ ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で一晩透析した。
【０１０５】
５０ｍＭ ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でＤＥＡＥ−セファロースアニオン交換カラム（５×１８．５ｃｍ）を平衡化し、透析により得られた蛋白質溶液をクロマトグラフィーにかけ、カラムを同一緩衝液３容量で洗浄し、吸着しない蛋白質分子を除去した。ＮａＣｌ濃度を５０ｍＭから２００ｍＭまで漸増させることにより吸着した蛋白質を溶出させた。ＣＰＣアシラーゼ活性を示すフラクションを集め、透析バッグでポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．２０，０００）により濃縮した。２５％硫酸アンモニウムを加えた２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で濃縮蛋白質を透析した。
【０１０６】
２５％硫酸アンモニウムを加えた２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅｒｌカラム（２．５×６ｃｍ）を平衡化し、上記により得られた透析物をクロマトグラフィーにかけ、蛋白質をカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度を２５％から０％まで漸減させることにより吸着した蛋白質を溶出させた。各フラクションのＣＰＣアシラーゼ活性を確認した後に、酵素活性をもつフラクションを回収し、ポリエチレングリコールで濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、野生型及び本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体を精製した。
【０１０７】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法により酵素活性を測定した。
【０１０８】
＜２−２＞野生型ＣＰＣアシラーゼの物性と反応特徴の分析
実施例＜２−１＞に記載したと同一方法に従い、実施例＜１−１−２＞で作製したｐＢＣＰＣ又はｐＢＳＥＭプラスミドを含む大腸菌形質転換細胞から野生型ＣＰＣアシラーゼを精製した。ｐＢＣＰＣプラスミドに由来する野生型ＣＰＣアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ）とｐＢＳＥＭプラスミドに由来する野生型ＣＰＣアシラーゼ（Ｓｅｍ）の物性と反応特徴を分析した結果、同一の物性（例えば分子量）と反応特徴（例えば特異活性、最適温度、最適ｐＨ）を示した。
【０１０９】
更に、実施例＜２−１＞で得られた野生型ＣＰＣアシラーゼの活性フラクションに非変性ＰＡＧＥとクーマシーブルー染色を実施した。その結果、約８３ｋＤａの分子量に対応する位置に単一バンドが検出され、野生型ＣＰＣアシラーゼが純粋に精製されたことを示した（図１１ａ〜１１ｃ）。非変性ＰＡＧＥの結果に加え、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により精製酵素（即ち活性ＣＰＣアシラーゼ）の分子量は約８３ｋＤａであることが確認された。更に、αサブユニットに対応する約２５ｋＤａのバンドとβサブユニットに対応する約５８ｋＤａのバンドが変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出された。これらの結果から、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体は約２５ｋＤａのαサブユニットと約５８ｋＤａのβサブユニット１個ずつから構成される二量体であることが確認された。
【０１１０】
α及びβサブユニットを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから精製し、各サブユニットフラグメントの分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定した。その結果、ｐＢＣＰＣプラスミドに由来する野生型ＣＰＣアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ）は配列番号２のアミノ酸配列の２３０位と２３１位のアミノ酸の間と２３９位と２４０位のアミノ酸の間の２つの位置に生じる自己消化により９個のアミノ酸から構成されるスペーサーペプチドを除去することにより、約２５ｋＤａのαサブユニットと約５８ｋＤａのβサブユニットに分離されると予想された。
【０１１１】
野生型ＣＰＣアシラーゼの特異活性を検討した結果、野生型ＣＰＣアシラーゼは約２３．１単位／ｍｇ蛋白質のＧＬ−７−ＡＣＡに対する特異活性と約０．３３単位／ｍｇ蛋白質のＣＰＣに対する特異活性を示した。従って、シュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＡｃｙＩＩのＣＰＣに対する特異活性はＧＬ−７−ＡＣＡに対する特異活性の約１．４％に過ぎないことが分かった。
【０１１２】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従って酵素反応を実施した後に、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット法により精製酵素の速度論的パラメーターを測定した。その結果、野生型ＣＰＣアシラーゼＡｃｙＩＩのＫｍ、Ｋｃａｔ及び触媒効率（即ちＫｃａｔ／Ｋｍ）は夫々５０ｍＭ、０．９／ｓｅｃ及び０．０２／ｓｅｃ／ｍＭであった。
【０１１３】
更に、野生型ＣＰＣアシラーゼＡｃｙＩＩの最適反応温度及びｐＨを検討した結果、ＣＰＣの最適反応温度及びｐＨは夫々４０℃と９．０であった。
【０１１４】
＜２−３＞特異活性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体の反応特徴の分析
実施例＜２−１＞に記載したと同一方法に従い、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体及びＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体をコードする各ＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を含むプラスミドで形質転換した組換え大腸菌から各ＣＰＣアシラーゼ変異体を精製した。
【０１１５】
各変異体酵素の反応特徴を分析した結果、その反応特徴（例えば最適温度及びｐＨ）と物性（例えば分子量）は野生型ＣＰＣアシラーゼと同一であった。他方、各変異体酵素の特異活性を検討した結果、ＣＰＣに対する各変異体の特異活性は変異誘発が定常的に進行するにつれて漸増した（表２）。これらの順次変異誘発から、ＣＰＣに対する特異活性が野生型ＣＰＣアシラーゼの約１１．２倍に増加したＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体が得られた。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従って酵素反応を実施した後に、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット法によりＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体酵素の速度論的パラメーターを測定した。その結果、Ｋｍ、Ｋｃａｔ及びＫｃａｔ／Ｋｍは夫々８ｍＭ、２．４／ｓｅｃ及び０．３０／ｓｅｃ／ｍＭであった。Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体は野生型酵素に比較してＫｍ値が約６．３分の１に減少し、ＣＰＣ反応効率が約１５倍に増加した。これらの結果から、ＣＡＤの三次構造に基づく一連の部位特異的変異誘発により得られた本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体はＣＰＣに対する結合親和性と特異活性が増加していることが確認された。
【０１１８】
＜２−４＞ＣＰＣに対する反応性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体の精製とその反応特徴の分析
実施例＜２−１＞に記載したと同一方法に従い、実施例＜１−３＞のＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子（ＴｎＳ５αβ）又は実施例＜１−４−４＞のＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子（Ｓ１２）を含むプラスミドで形質転換した組換え大腸菌から各六重ＣＰＣアシラーゼ変異体を精製した。
【０１１９】
各精製変異体酵素ＴｎＳ５αβ及びＳ１２の反応特徴を分析した結果、その反応特徴（例えば最適温度及びｐＨ）と物性（例えば分子量）は野生型ＣＰＣアシラーゼと同一であった。
【０１２０】
各ＣＰＣアシラーゼ変異体ＣＰＣに対する特異活性と７−ＡＣＡによる最終産物阻害を検討するために、反応混合物のｐＨを８．５に調整した以外は実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従って酵素反応を実施した。その結果、ＴｎＳ５αβ及びＳ１２変異体酵素のＣＰＣに対する特異活性は野生型ＣＰＣアシラーゼの２．３倍と８．５倍に対応する夫々１．５単位／ｍｇ蛋白質と５．８単位／ｍｇ蛋白質であった。更に、Ｓ１２変異体酵素の７−ＡＣＡによる阻害定数（Ｋｉ）を測定した結果、野生型酵素のＫｉ値は０．４ｍＭであったが、Ｓ１２変異体酵素のＫｉ値は１．９ｍＭであり、Ｓ１２変異体酵素の７−ＡＣＡによる最終産物阻害が野生型酵素に比較して有意に低下したことが判明した。これらの結果から、本発明のＳ１２変異体酵素（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体）はＣＰＣに対する特異活性が増加すると同時に７−ＡＣＡによる最終産物阻害が低下することが確認された。
【実施例３】
【０１２１】
大腸菌におけるＣＰＣアシラーゼ変異体の生産
＜３−１＞ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターを使用したＣＰＣアシラーゼ変異体の生産
Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子ＴｎＳ及びＴｎＳ５αβと、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子Ｓ１２をｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターに挿入し、夫々ｐＢＣ−ＴｎＳ５、ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ及びｐＢＣ−Ｓ１２組換えプラスミドを得、得られた各組換えプラスミドで大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換した。
【０１２２】
クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢブロス５０ｍｌ中で各大腸菌形質転換細胞を２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養し、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、培養液から調製した粗酵素溶液を使用することによりＣＰＣアシラーゼの生産性を測定した。この場合、野生型アシラーゼをコードする遺伝子ａｃｙＩＩ及びｓｅｍを夫々含む組換えプラスミドｐＢＳＥＭ及びｐＢＣＰＣを対照として使用した。その結果、ｐＢＣ−Ｓ１２プラスミドを含む大腸菌形質転換細胞は７１２単位／リットルのレベルの最高のＣＰＣアシラーゼ生産性を示した。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
＜３−２＞ｐＥＴ２９−ａ（＋）ベクターを使用したＣＰＣアシラーゼ変異体の生産
＜３−２−１＞ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドの作製
ｐＥＴ２９−Ｆプライマー（配列番号４０）とｐＥＴ２９−Ｒプライマー（配列番号４１）を夫々使用して組換えプラスミドｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ及びｐＢＣ−Ｓ１２をＰＣＲ増幅し、各々２．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＥＴ２９−ａ（＋）ベクターＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国）をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡをベクターＤＮＡに１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。カナマイシン２０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、変異体遺伝子を含む形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析し、ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドを得た。
【０１２５】
＜３−２−２＞ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ又はｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドを含む大腸菌形質転換細胞によるＣＰＣアシラーゼ変異体の生産
ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドの各々をエレクトロポレーションにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、夫々ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドを含む組換え大腸菌を作製し、各組換え大腸菌における六重ＣＰＣアシラーゼ変異体の生産性を測定した。これらの組換えプラスミドにおけるＴｎＳ５αβ及びＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子はｐＥＴ２９−ａ（＋）ベクター上に存在するＬａｃＩオペレーターの制御下のＴ７プロモーターの作用により転写された。
【０１２６】
カナマイシン２０μｇ／ｍｌを加えたＬＢブロス３ｍｌにｐＥＴ−ＴｎＳ５αβプラスミドを含む組換え大腸菌を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで１６時間激しく振盪しながら培養した。カナマイシン２０μｇ／ｍｌとラクトース各０、０．０２、０．２及び２％を加えた新鮮なＬＢブロス５０ｍｌに培養液５０μｌを移し、２５℃、２００ｒｐｍで８０時間激しく振盪しながら培養した。この場合、培養時間の経過に従ってＣＰＣアシラーゼ変異体の生産性を測定するために、培養中の２４、３６、４８、７２及び８０時間に培養フラスコから培養ブロス５μｌを採取した。各培養液を４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を分離し、沈殿を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。沈殿を同一緩衝液５００μｌに懸濁し、４℃で１分間超音波処理し、４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、六重ＣＰＣアシラーゼ変異体の粗酵素溶液として使用可能な上清を分離した。前記粗酵素溶液を使用して実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、六重ＣＰＣアシラーゼ変異体のＣＰＣに対する活性を測定した。
【０１２７】
ｐＥＴ２９ベクターと大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の発現系で外来遺伝子の高度発現用インデューサーとして一般に使用されているＩＰＴＧは非常に高価であるので、ＩＰＴＧを工業規模の培養に適用するのは難しい。そこで、本発明ではＣＰＣアシラーゼ変異体の大量生産用にＩＰＴＧの代わりに廉価なインデューサーであるラクトース（ＤＩＦＣＯ，米国）を使用した。更に、ｐＥＴ２９ベクターと大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の発現系は初期培養段階でインデューサーを添加せずに規定時間形質転換細胞を培養して増殖させ、規定時点でインデューサーを添加して更に培養することにより外来遺伝子を短時間で高度に発現することが一般に知られている。しかし、ＣＰＣアシラーゼを生産させるための上記誘導発現法では大量の不活性ポリペプチドが副生物として生成したので、本発明では構成的発現を誘導するために初期培養段階にラクトースを添加して大腸菌形質転換細胞を培養した。その結果、２％ラクトースの存在下に培養した場合には、ＣＰＣアシラーゼの生産性は培養時間の経過に従ってインデューサーとしてのラクトースの作用により増加した（表４）。
【０１２８】
更に、培養後４８時間に採取した各種濃度のラクトース（０．０２、０．２及び２％）を含有する３種の培養ブロスから各粗酵素溶液を調製し、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル）により蛋白質の発現パターンを検討した。その結果、２％ラクトースの存在下に培養した場合には大量のＣＰＣアシラーゼ変異体が生産された（図１２）。更に、約８３ｋＤａの分子量に対応する不活性前駆体バンドは出現せず、不活性前駆体形の大半は効率的自己消化により活性形のＣＰＣアシラーゼに変換されることが確認された。
【０１２９】
【表４】
【０１３０】
更に、カナマイシン２０μｇ／ｍｌとラクトース２％を加えたＬＢブロス５０ｍｌを主培養に使用し、大腸菌形質転換細胞を２５℃、２００ｒｐｍで７２時間激しく振盪しながら培養した以外は上記と同一方法に従い、ｐＥＴ２９−Ｓ１２組換えプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換細胞中のＳ１２変異体酵素によるＣＰＣアシラーゼの生産性を測定した。その結果、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（Ｓ１２）の生産性は１．２０７単位／リットルであった。
【０１３１】
本発明のＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｆ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子Ｓ１２を含むｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−Ｓ１２と命名し、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って２００３年７月３０日付けでＫｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）（所在地：Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ，３０５−３３３，大韓民国）に受託番号ＫＣＴＣ １０５０３ＢＰで寄託した。
【実施例４】
【０１３２】
ＣＰＣアシラーゼ変異体を使用したＣＰＣから７−ＡＣＡへの１段階変換
カナマイシン２０μｇ／ｍｌとラクトース２％を加えたＬＢブロス５ｍｌ中で実施例＜３−２＞のｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミド各１個を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換細胞を２５℃、２００ｒｐｍで７２時間激しく振盪しながら培養した。更に、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢブロス１０リットル中で野生型ＣＰＣアシラーゼ遺伝子を含む大腸菌ＭＣ１０６１（ｐＢＣＰＣ）も２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養した。その後、野生型ＣＰＣアシラーゼ、ＴｎＳ５αβ及びＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体を夫々実施例＜２−１＞に記載したと同一方法に従って各培養ブロスから精製した。上記のようにして得られた精製蛋白質を５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）で透析し、透析により得られた透析物をＣＰＣ変換反応に使用した。
【０１３３】
ＣＰＣを終濃度５０ｍＭで５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶かした後、同一緩衝液に溶かした精製酵素溶液を上記のように得られたＣＰＣ溶液に終濃度５単位／ｍｌで添加し、反応混合物５０ｍｌを調製した。反応混合物を２５℃で１時間撹拌し、ＣＰＣ変換反応を誘導した。この場合、反応混合物のｐＨが変換反応中に低下しないようにするために、反応混合物のｐＨが８．４に達したら０．２Ｎ ＮａＯＨ溶液をｐＨ調節器により反応混合物に自動注入し、反応混合物のｐＨを常に８．５に維持した。変換反応中の規定時点から反応混合物１００μｌを採取し、すぐにＨＰＬＣ分析し、反応混合物中のＣＰＣと７−ＡＣＡの量を定量した。ＨＰＬＣ分析では、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ，米国）と、移動相として２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）とアセトニトリルの混合物（９０：１０）を使用した。更に、移動相の流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎとし、注入するサンプル（２０μｌ）は反応混合物を５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）で適宜希釈することにより調製し、その吸光度はＵＶ２５０ｎｍで検出した。
【０１３４】
その結果、野生型ＣＰＣアシラーゼは上記反応条件下で６０％のレベルのＣＰＣ変換率を示したが、本発明のＴｎＳ５αβ及びＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体は夫々８６％と９８％のレベルのＣＰＣ変換率を示した（図１３）。特に、本発明のＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体は高レベルの７−ＡＣＡ収率（９０％以上）でＣＰＣを７−ＡＣＡに効率的に変換した（図１３及び１４）。
【０１３５】
以上、本発明の態様を記載及び例証したが、当然のことながら、本発明の精神から逸脱せずに種々の変更や変形を加えることができ、本発明は特許請求の範囲のみにより制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＣＰＣから７−ＡＣＡを製造するための１段階及び２段階酵素法の反応スキームを示す。
【図２】シュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＣＡＤ−ＧＬ−７−ＡＣＡ複合体の三次構造（Ａ）とその活性部位に隣接する結合残基の一般スキーム（Ｂ）を示す。
【図３】シュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＣＡＤとＧＬ−７−ＡＣＡの結合パターンを示す。
【図４】シュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＣＡＤ−ＣＰＣ複合体のモデリングを示す
【図５】本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体の作製方法の模式図を示す。
【図６】野生型ＣＰＣアシラーゼ（−●−，Ｓｅｍ）、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重ＣＰＣアシラーゼ変異体（Ｈ７０）及びＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，ｍＩ１７６）で観察された７−ＡＣＡによる最終産物阻害の比較を示す。
【図７】Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−◇−，Ｈ７０）、Ｖ１２１αＡ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，＃２１３）、Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−■−，＃１２０）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５）のＣＰＣに対する反応性の比較を示す。
【図８】Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▽−，ｍＦ５８）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−■−）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，ＴｎＳ５αβ）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▼−）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５）のＣＰＣに対する反応性の比較を示す。
【図９】Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▼−，Ｆ１６９）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▽−，＃５９）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−■−，＃７６）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，ｍＦ５８）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５αβ）のＣＰＣに対する反応性の比較を示す。
【図１０ａ】図１０ａ及び１０ｂはＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▼−，Ｓ１２）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５αβ）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，＃７６）で観察されたＣＰＣに対する反応性（Ａ）と７−ＡＣＡによる最終産物阻害（Ｂ）の比較を示す。
【図１０ｂ】図１０ａ及び１０ｂはＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▼−，Ｓ１２）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５αβ）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，＃７６）で観察されたＣＰＣに対する反応性（Ａ）と７−ＡＣＡによる最終産物阻害（Ｂ）の比較を示す。
【図１１ａ】図１１ａ〜１１ｃはシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来する野生型ＣＰＣアシラーゼの分子量を示す。１１ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：無細胞抽出物；２：精製酵素）。１１ｂ：非変性ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：精製酵素）。１１ｃ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。
【図１１ｂ】図１１ａ〜１１ｃはシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来する野生型ＣＰＣアシラーゼの分子量を示す。１１ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：無細胞抽出物；２：精製酵素）。１１ｂ：非変性ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：精製酵素）。１１ｃ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。
【図１１ｃ】図１１ａ〜１１ｃはシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来する野生型ＣＰＣアシラーゼの分子量を示す。１１ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：無細胞抽出物；２：精製酵素）。１１ｂ：非変性ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：精製酵素）。１１ｃ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。
【図１２】ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）培養液から単離した粗酵素のゲル電気泳動とクーマシーブルー染色の結果を示す。Ｍ：標準サイズマーカー；１：０％ラクトース，４８時間培養；２：０．０２％ラクトース，４８時間培養；３：０．２％ラクトース，４８時間培養；４：２％ラクトース，４８時間培養；５：２％ラクトース，７２時間培養。
【図１３】野生型ＣＰＣアシラーゼ、ＴｎＳ５及びＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体で観察されたＣＰＣから７−ＡＣＡへの変換率の比較を示す。
【図１４】本発明のＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体の作用によりＣＰＣから生産された７−ＡＣＡを測定するためのＨＰＬＣ分析結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＳＥ８３に由来するセファロスポリンＣ（ＣＰＣ）アシラーゼ変異体ポリペプチド；前記ポリペプチドをコードする遺伝子；前記遺伝子を含む発現ベクター；前記発現ベクターで形質転換された微生物；前記ＣＰＣアシラーゼ変異体の作製方法；及び前記ＣＰＣアシラーゼ変異体を使用する７−ＡＣＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セファロスポリンＣ（以下、「ＣＰＣ」と言う）はアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）等の糸状菌により生産されるβラクタムファミリー抗生物質の１種である。ＣＰＣは細胞壁合成を妨害することによりグラム陰性菌に対して抗生物質活性を示すが、グラム陰性菌の増殖に対して十分に活性ではない。従って、ＣＰＣは主に半合成セファロスポリン抗生物質の製造用中間体を製造するために使用されている。特に、ＣＰＣからＤ−α−アミノアジポイル側鎖を除去することにより製造される７−アミノセファロスポラン酸（以下、「７−ＡＣＡ」と言う）が抗生物質世界市場のシェアの４０％を越える大半の半合成セファロスポリン抗生物質の製造に使用されている。
【０００３】
ＣＰＣから７−ＡＣＡを製造する方法としては化学法と酵素法の２種類の方法が公知である。ＣＰＣから７−ＡＣＡを合成する化学法はアミン基とカルボキシル基の両者にシリル保護基を使用し、収率は９０％を上回る。しかし、この方法は複雑であり、非経済的で環境にやさしくない。従って、化学法に代わって環境上許容可能であると考えられている７−ＡＣＡの酵素的製造方法が使用されるようになっている。
【０００４】
現在商業的に広く使用されている２段階酵素法はＣＰＣをＤ−アミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＤＡＯ」と言う）によりグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（以下、「ＧＬ−７−ＡＣＡ」と言う）に変換する段階（第１段階）と、ＧＬ−７−ＡＣＡをＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼにより７−ＡＣＡに変換する段階（第２段階）の２段階からなる（図１参照）。しかし、この方法は第１段階で生成される過酸化水素とＤＡＯ基質又は反応生成物の反応により多量の副生物が生じるため、化学法よりも７−ＡＣＡの収率が低い。従って、ＣＰＣの７位のアミド結合を切断してアミノアジポイル側鎖を除去することが可能な改変ＣＰＣアシラーゼを使用してＣＰＣを７−ＡＣＡに直接変換するための効率的な１段階酵素法を開発することが必要とされている。
【０００５】
ＣＰＣに対して活性なＣＰＣアシラーゼ（ＣＰＣアミダーゼ又はＣＰＣアミドヒドロラーゼとも言う）がシュードモナスｓｐ．、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、エーロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．、アルスロバクター・ビスコウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｕｓ）等の数種の微生物で発見されており、シュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するａｃｙＩＩ遺伝子（Ｍａｔｓｕｄａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５８２１−５８２９，１９８７）；シュードモナスｓｐ．Ｎ１７６に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（米国特許第５，１９２，６７８号）；シュードモナスｓｐ．Ｖ２２に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（Ａｒａｍｏｒｉら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７２：２３２−２４３，１９９１）；シュードモナス・ベシクラリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｂ９６５に由来するＣＰＣアミドヒドロラーゼ遺伝子（米国特許第６，２９７，０３２号）；バチルス・メガテリウムに由来するＣＰＣアミダーゼ遺伝子（米国特許第５，２２９，２７４号）；及びシュードモナスｓｐ．１３０に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（Ｌｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６２：７１３−７１９，１９９９）等の数種のＣＰＣアシラーゼ遺伝子がクローニングされ、配列決定されている。しかし、これらのＣＰＣアシラーゼはＣＰＣの７位のアミド結合を切断するために十分な加水分解活性がないため、ＣＰＣから７−ＡＣＡを製造する１段階酵素法には適していない。
【０００６】
数件の遺伝子工学研究がＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼの酵素活性を高めようと試みている。例えば、藤沢薬品工業株式会社（日本）はＣＰＣに対して野生型の約２．５倍の特異活性を示すシュードモナスｓｐ．Ｎ１７６に由来するＣＰＣアシラーゼ変異体を開発した（米国特許第５，８０４，４２９号；米国特許第５，３３６，６１３号，日本特許公開１９９５−２２２５８７；日本特許公開１９９６−０９８６８６；及び日本特許公開１９９６−２０５８６４）。しかし、このような変異体はＣＰＣから７−ＡＣＡを直接製造するにはＣＰＣに対する特異活性がまだ不十分であり、７−ＡＣＡによる最終産物阻害を示す。従って、ＣＰＣから７−ＡＣＡに直接変換するために実地に使用することはできない。
【０００７】
７−ＡＣＡを製造するための１段階酵素法に適用可能なＣＰＣアシラーゼ変異体を開発する目的で本発明者らはＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼの三次構造を検討し、シュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（Ｋｉｍら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２３：１０６７−１０７１，２００１；以下、「ＣＡＤ」と言う）に関連するアポ酵素（Ｋｉｍら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８：１０５９−１０６８，２０００）とＣＡＤ−ＧＬ−７−ＡＣＡ複合体（Ｋｉｍら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１２５３−１２６４，２００１；Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４８３７６−４８３８１，２００１）の三次構造を初めて特定した（図２参照）。２種のＣＡＤ二元複合体の構造は、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼと基質の最も広範な相互作用がＧＬ−７−ＡＣＡのグルタリル部分で行われたことを示唆している。従って、ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼにおいて基質を認識するのに主要な因子は基質の側鎖とその結合ポケットの親水性及び疎水性相互作用であると思われる。基質結合親和性が極端に低いＣＰＣとＧＬ−７−ＡＣＡの化学構造を比較すると、それらのβラクタム構造は同一でありながら、側鎖が多少相違している（図３参照）。即ち、ＧＬ−７−ＡＣＡの側鎖はグルタル酸から構成されるが、ＣＰＣの側鎖はＤ−α−アミノアジピン酸から構成される。従って、ＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の構造のモデリングによると、ＧＬ−７−ＡＣＡの側鎖とＣＡＤの結合関連主要残基はＤ−α−アミノアジピン酸側鎖の末端のカルボキシル基とＤ形アミノ基に対して立体的に混雑していると思われる（図４参照）。そこで、（ＧＬ−７−ＡＣＡ側鎖の炭素骨格よりも大きい炭素骨格とＤ−アミノ基を含む）ＣＰＣ側鎖を受容するために十分なスペースをＣＡＤの基質結合部位に確保することができるならば、ＣＰＣに対するＧＬ−７−ＡＣＡの特異活性を増加できると考えられる。従って、ＣＡＤの「酵素−基質」複合体に関する構造分析から、比較的低い基質結合親和性を示すシュードモナスｓｐ．に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼの活性部位に変異を導入することによりＣＰＣに対する特異活性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するために重要な情報が得られると思われる。
【０００８】
そこで、本発明者らはＣＰＣから７−ＡＣＡを製造するための１段階酵素法で使用することができるＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を開発しようと試みた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的はＣＰＣを７−ＡＣＡに変換するのに有利に使用することができるＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体とその機能的に等価な誘導体を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は前記ＣＰＣアシラーゼ変異体とその機能的に等価な誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、前記ヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、前記ヌクレオチド配列又は前記発現ベクターで形質転換された微生物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は前記形質転換微生物を使用してＣＰＣアシラーゼ変異体を作製するための方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は前記ＣＰＣアシラーゼ変異体を使用してＣＰＣから７−ＡＣＡ又はその塩を製造するための方法、前記ＣＰＣアシラーゼ変異体を含有する組成物、あるいはプロセシングされたＣＰＣアシラーゼ変異体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の１側面によると、配列番号４のＣＰＣアシラーゼαサブユニットのＶａｌ１２１α、Ｇｌｙ１３９α及びＰｈｅ１６９αならびに配列番号５のＣＰＣアシラーゼβサブユニットのＭｅｔ３１β、Ｐｈｅ５８β、Ｈｉｓ７０β、Ｉｌｅ７５β、Ｉｌｅ１７６β及びＳｅｒ４７１βから構成される群から選択される少なくとも１個のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されていることを特徴とするＣＰＣアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体が提供される。
【００１５】
本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体としては、
Ｖａｌ１２１αがアラニンで置換されているか；
Ｇｌｙ１３９αがセリンで置換されているか；
Ｐｈｅ１６９αがチロシンで置換されているか；
Ｍｅｔ３１βがロイシンで置換されているか；
Ｐｈｅ５８βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されているか；
Ｈｉｓ７０βがセリン又はロイシンで置換されているか；
Ｉｌｅ７５βがスレオニンで置換されているか；
Ｉｌｅ１７６βかバリンで置換されているか；または
Ｓｅｒ４７１βがシステインで置換されているものが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の上記及び他の目的は添付図面を参照して本発明の以下の記載から理解されよう。
【００１７】
本明細書で使用する「ＣＰＣに対する反応性の増加」なる用語はＣＰＣに対する特異活性の増加及び／又は７−ＡＣＡによる最終産物阻害の低下を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する「機能的に等価な誘導体」なる用語は本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体と同一の機能的特性を維持するＣＰＣアシラーゼ誘導体を意味する。即ち、機能的に等価な誘導体は、１又は数個のヌクレオチドの配列変異、欠失、挿入、置換、逆位及びその組合せにより変異していてもよいが、ＣＰＣアシラーゼ変異体として機能することが可能な天然、合成又は組換えポリペプチド等の可能な全変異体を含む。
【００１９】
本明細書で使用する「加工されたＣＰＣアシラーゼ変異体」なる用語は遊離状態ではなく、固定化状態のＣＰＣアシラーゼ変異体を意味する。ＣＰＣアシラーゼ変異体は共有結合、イオン結合、親水性結合、物理的結合、マイクロカプセル封入等の慣用方法により、当分野で一般に使用されている慣用の担体に固定化することができる。更に、それ以上精製せずに、ＣＰＣアシラーゼ変異体を生産する微生物をそのまま固定化する全細胞固定化法により、加工されたＣＰＣアシラーゼ変異体を作製することもできる。
【００２０】
本明細書で使用する「ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ」なる用語は一般にＧＬ−７−ＡＣＡを７−ＡＣＡに変換することが可能な酵素を意味する。本明細書で使用する「ＣＰＣアシラーゼ」なる用語はＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼのうちでＣＰＣに対する特異活性をもち、ＣＰＣの７位のアミド結合を切断してアミノアジポイル側鎖を除去することによりＣＰＣから７−ＡＣＡを直接生産する酵素を意味する。本明細書で使用する「ＣＡＤ」なる用語はシュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼを意味する。
【００２１】
本発明はＣＰＣに対する反応性の改善されたシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ変異体とその機能的に等価な誘導体のアミノ酸配列；前記ＣＰＣアシラーゼ変異体とその機能的に等価な誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００２２】
本発明ではＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するための出発遺伝子としてシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（「ａｃｙＩＩ遺伝子」）を使用し、ａｃｙＩＩ遺伝子はＭａｔｓｕｄａらにより同定されたＣＰＣアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５８２１−５８２６，１９８７；ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ１８２７８）のヌクレオチド配列に基づいてＤＮＡ合成器を使用して新規に合成される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して蛋白質合成効率を増加するためには、ＡｃｙＩＩの従来公知のアミノ酸配列を大腸菌媒介の蛋白質合成において使用されるのに好適なコドンに適合できるように改変する。例えば、ａｃｙＩＩ遺伝子によりコードされる従来公知のアミノ酸配列においては、フェニルアラニンの唯一のコドンはＴＴＣであり、アルギニンの唯一のコドンは主にＣＧＣ又はＣＧＧであるため、本発明で合成されるａｃｙＩＩ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列はＴＴＴコドンとＣＧＴコドンを夫々フェニルアラニンとアルギニンに使用する。本発明で合成されるａｃｙＩＩ遺伝子は配列番号１のヌクレオチド配列をもつ２，３２５塩基対から構成される。配列番号１では、塩基番号１から２，３２２（２，３２３〜２，３２５：終止コドン）に対応するオープンリーディングフレームは全長蛋白質コーディング領域であり、この配列から誘導される７７４個のアミノ酸から構成される推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。本発明で合成されるａｃｙＩＩ遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列は従来周知のＣＰＣアシラーゼのアミノ酸配列と同一であるが、配列番号１のヌクレオチド配列中の塩基対の１８％は既存ＣＰＣアシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列と相違する。
【００２３】
大半のＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（又はＣＰＣアシラーゼ）遺伝子から推定されるアミノ酸配列は順にαサブユニットとスペーサーペプチドとβサブユニットから構成される。シュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来する野生型ＣＰＣアシラーゼは宿主細胞で転写翻訳後に約８４ｋＤａのサイズをもつ不活性単鎖ポリペプチドとして生成する。その後、配列番号２のアミノ酸配列の２３０位と２３１位のアミノ酸の間と２３９位と２４０位のアミノ酸の間に２回の自己消化が生じて、アミノ酸９個から構成されるスペーサーペプチドが除去され、２５ｋＤａαサブユニットと約５８ｋＤαβサブユニットに分離する。上記のように分離したαサブユニットの１個が疎水性相互作用によりβサブユニットの１個と結合し、アシラーゼ活性をもつ約８３ｋＤａ二量体を形成する。一般に公知の通り、原核生物で蛋白質合成中に翻訳開始に必要な最初のアミノ酸であるメチオニンコドンは翻訳後に除去される。従って、本発明で使用される野生型ＣＰＣアシラーゼの活性形はアミノ酸２２９個から構成されるαサブユニット（配列番号４）とアミノ酸５３５個から構成されるβサブユニット（配列番号５）から構成される。
【００２４】
対応する遺伝子の転写翻訳後に宿主細胞で適正な自己消化が生じない場合には、不活性ポリペプチド形態のＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（又はＣＰＣアシラーゼ）が生産される。従って、宿主細胞における自己消化効率は活性蛋白質の獲得に重要な役割を果たす。宿主細胞におけるアシラーゼの過剰生産やスペーサーペプチド又は成熟蛋白質における特定アミノ酸の変異等のいくつかの理由により自己消化効率が低下して不活性蛋白質が生産される可能性があることも報告されている（Ｌｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６２：７１３−７１９，１９９９；Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４８３７６−４８３８１，２００１）。従って、ＣＰＣアシラーゼの反応特性を改善しようとする場合には、酵素反応性を増加するために特定アミノ酸に導入する変異が自己消化効率に影響を与えないかという問題を的確に考慮する必要がある。即ち、ＣＰＣアシラーゼ遺伝子の転写／翻訳後に宿主細胞で生産される不活性ポリペプチドの自己消化効率の変化は不活性ＣＰＣアシラーゼの生産性に直接関係するので、精製された活性ＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性特徴を知らずにＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を選択することは困難である。このような問題を解決するために、本発明者らは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき、翻訳中にαサブユニットとβサブユニットを個々に合成することにより自己消化段階なしに活性ＣＰＣアシラーゼを生産することが可能な配列番号３のヌクレオチド配列をもつＣＰＣアシラーゼ遺伝子を設計した。配列番号３のＣＰＣアシラーゼ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は配列番号２の２３１〜２３９位の領域に対応するスペーサーペプチドをコードするヌクレオチド配列が変異している以外はＣＰＣアシラーゼ遺伝子ａｃｙＩＩによりコードされる配列番号２のアミノ酸配列と一致する。即ち、αサブユニットの最後のアミノ酸をコードするグリシンコドンの後に翻訳終止コドンが挿入され；制限酵素部位を含むランダムヌクレオチド配列と、−ＡＧＧＡ−として表されるリボソーム結合部位をコードするヌクレオチド配列と、別のランダムヌクレオチド部位と、翻訳開始コドン（メチオニン）を連続的に配置したヌクレオチド配列がβサブユニットの最初のアミノ酸をコードするセリンコドンの前に挿入されている。本発明者らはそれ自体の構造遺伝子を個々に維持するようにαサブユニットとβサブユニットをコードするヌクレオチド配列を各々作製することにより、１個のオペロン構造でＣＰＣアシラーゼ遺伝子を作製しようと試みた。配列番号３のヌクレオチド配列をもち、αサブユニットとβサブユニットを個々に発現するＣＰＣアシラーゼ遺伝子をｓｅｍと言う。従って、本発明のＣＰＣアシラーゼ遺伝子ｓｅｍを適切な発現ベクターに挿入し、宿主細胞に形質転換するならば、αサブユニットとβサブユニットは個々に合成され、宿主細胞内で相互に結合し、活性なＣＰＣアシラーゼの二量体形が得られるであろうと予想することができる。配列番号３のｓｅｍ遺伝子を含む大腸菌形質転換細胞から精製したＣＰＣアシラーゼと配列番号１のａｃｙＩＩ遺伝子を含む大腸菌形質転換細胞から精製したＣＰＣアシラーゼの特性を比較すると、ｓｅｍに由来するＣＰＣアシラーゼの特性（例えば分子量、特異活性、基質特異性、最適反応温度及びｐＨ）は実際にａｃｙＩＩに由来するＣＰＣアシラーゼに一致している。従って、αサブユニットとβサブユニットを別々に発現させると、不活性ポリペプチドの自己消化効率の原因を取り除くことができ、特定アミノ酸残基に導入された変異により誘導される特性の変化を検出することが容易になる。そこで、本発明では、ＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するための出発ＤＮＡとして配列番号３のａｃｙＩＩ遺伝子を使用する。
【００２５】
本発明で使用するシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ，配列番号２）のアミノ酸配列の文献命名法は最初のアミノ酸としてαサブユニットのＮ末端のメチオニンコドンから出発して最後のアミノ酸としてβサブユニットのＣ末端のアラニンコドンまで連続ナンバリングシステムを採用している。しかし、最初のアミノ酸であるメチオニンとスペーサーペプチドは宿主細胞でＣＰＣアシラーゼ遺伝子の転写翻訳後に除去されるので、成熟蛋白質のアミノ酸配列には存在しない。即ち、活性蛋白質のアミノ酸配列はαサブユニットのアミノ酸配列とβサブユニットのアミノ酸配列から構成される。従って、本発明で使用するナンバリングシステムは成熟ＣＰＣアシラーゼの活性形に存在するαサブユニットとβサブユニットを各々連続的にナンバリングする。ＣＰＣアシラーゼのアミノ酸配列の特定残基の呼称は慣用命名法に従い、配列番号４のアミノ酸配列のαサブユニットの最初の残基であるスレオニンをＴｈｒ１αとし、配列番号５のアミノ酸配列のβサブユニットの最初の残基であるセリンをＳｅｒ１βとする。従って、Ｔｈｒ１αとＳｅｒ１βは配列番号２のアミノ酸配列中の２番目の残基スレオニンと２４０番目の残基セリンを夫々意味する。
【００２６】
ＣＰＣアシラーゼのアミノ酸配列中に変異を導入した特定残基の呼称は慣用命名法に従い、αサブユニットの１６９番目の残基フェニルアラニンをチロシンで置換する変異残基をＦ１６９αＹとし、βサブユニットの１７６番目の残基イソロイシンをバリンで置換する変異残基はＩ１７６βＶとする。
【００２７】
本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体は配列番号３のＣＰＣアシラーゼ遺伝子ｓｅｍを出発ＤＮＡとし、慣用点変異法と遺伝子工学技術を使用して以下のように作製した（図５参照）。
【００２８】
まず、ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の特異活性を高めるために、コンピュータープログラムを使用したＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造モデリングにおける仮想変異誘発の結果に基づき、変異させるべきアミノ酸残基をＡｃｙＩＩのアミノ酸配列から選択した。上記のように選択した変異アミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を含む人工オリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにかけ、ＣＰＣアシラーゼ遺伝子に部位特異的変異誘発を誘導した。変異遺伝子を微生物に形質転換し、形質転換細胞を適切な条件下で培養し、ＣＰＣアシラーゼを生産した。次に、こうして生産されたＣＰＣアシラーゼの酵素活性を測定し、ＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を選択した。選択したＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を分析した。その結果、配列番号４及び５のＡｃｙＩＩアミノ酸配列におけるＰｈｅ１６９α、Ｍｅｔ３１β、Ｐｈｅ５８β、Ｈｉｓ７０β及びＩｌｅ１７６βから構成される群から選択されるアミノ酸残基の１個以上に導入された変異はＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ反応性を高めることが判明した。
【００２９】
ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性を更に高めるために、選択したＣＰＣアシラーゼ変異体をエラープローンＰＣＲにかけ、ランダム部位に点変異を誘導した。変異遺伝子を宿主細胞に形質転換して変異体ライブラリーを構築し、ＣＰＣに対する反応性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体を含む宿主細胞を変異体ライブラリーからスクリーニングした。こうして作製されたＣＰＣアシラーゼ変異体の酵素活性を測定し、改善されたＣＰＣアシラーゼ反応性をもつＣＰＣアシラーゼ変異体を選択し、上記の選択したＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を分析した。その結果、配列番号４及び５のＡｃｙＩＩアミノ酸配列におけるＶａｌ１２１α、Ｇｌｙ１３９α、Ｉｌｅ７５β及びＳｅｒ４７１βから構成される群から選択されるアミノ酸残基の１個以上に導入された変異はＣＰＣを７−ＡＣＡに変換するＣＰＣアシラーゼの効率を高めることが判明した。
【００３０】
従って、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体は配列番号４のＣＰＣアシラーゼαサブユニットのＶａｌ１２１α、Ｇｌｙ１３９α及びＰｈｅ１６９αならびに配列番号５のＣＰＣアシラーゼβサブユニットのＭｅｔ３１β、Ｐｈｅ５８β、Ｈｉｓ７０β、Ｉｌｅ７５β、Ｉｌｅ１７６β及びＳｅｒ４７１βから構成される群から選択される少なくとも１個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されていることを特徴とするアミノ酸配列をもつことが好ましい。
【００３１】
ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼの反応性を高めるための上記アミノ酸置換において、特定アミノ酸残基をグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、システイン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン及びアルギニンから構成される群から選択される別のアミノ酸で置換することが好ましい。Ｖａｌ１２１αをアラニン；Ｇｌｙ１３９αをセリン；Ｐｈｅ１６９αをチロシン；Ｍｅｔ３１βをロイシン；Ｐｈｅ５８βをアスパラギン、メチオニン、アラニン、ロイシン、バリン又はシステイン；Ｈｉｓ７０βをセリン又はロイシン；Ｉｌｅ７５βをスレオニン；Ｉｌｅ１７６βをバリン；Ｓｅｒ４７１βをシステインで置換することがより好ましい。
【００３２】
本発明の１好適態様では、Ｖａｌ１２１αをアラニン；Ｇｌｙ１３９αをセリン；Ｐｈｅ５８βをアスパラギン；Ｉｌｅ７５βをスレオニン；Ｉｌｅ１７６βをバリン；Ｓｅｒ４７１βをシステインで置換したＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子Ｓ１２を作製した。Ｓ１２変異体遺伝子はＣＰＣに対する特異活性が増加しているが、７−ＡＣＡによる最終産物阻害の低下を示す。Ｓ１２変異体遺伝子は配列番号６のヌクレオチド配列をもち、Ｓ１２変異体遺伝子によりコードされる活性なＣＰＣアシラーゼ変異体は配列番号７のαサブユニットと配列番号８のβサブユニットから構成される。
【００３３】
本発明は更に、ＣＰＣアシラーゼ変異体の機能的に等価な誘導体も含む。本発明において機能的に等価な誘導体とは本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体の一般特徴を維持するＣＰＣアシラーゼを意味する。即ち、機能的に等価な誘導体は、１又は数個のヌクレオチドの配列変異、欠失、挿入、置換、逆位及びその組合せにより変異しており、ＣＰＣアシラーゼ変異体として機能することが可能な天然、合成又は組換えポリペプチド等の可能なすべての変異体を含む。
【００３４】
更に、本発明はＣＰＣに対する反応性の改善された前記ＣＰＣアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。このポリヌクレオチドは配列番号６のヌクレオチド配列をもつことが好ましい。本発明において機能的に等価な誘導体とはＣＰＣアシラーゼ変異体のαサブユニット及び／又はβ−サブユニットをコードするポリヌクレオチドの主要機能特性を維持するポリヌクレオチドとその誘導体を意味する。従って、本発明は特定スペーサーペプチドを介してβサブユニットと結合したαサブユニットを含むＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドのみならず、スペーサーペプチドを介さずにＣＰＣアシラーゼ変異体のαサブユニットとβサブユニットの両者をコードするポリヌクレオチドもその範囲に含む。更に、ＣＰＣアシラーゼ変異体のαサブユニットのみをコードするポリヌクレオチドとＣＰＣアシラーゼのβサブユニットのみをコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
本発明は本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子のヌクレオチド配列又はＣＰＣアシラーゼ変異体アミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列と、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子のヌクレオチド配列中の遺伝コードのコドン縮重により作製されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドもその範囲に含む。
【００３６】
更に、本発明は本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを含む。前記組換え発現ベクターは慣用方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に従ってＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子と適切な転写／翻訳調節配列を含むＤＮＡフラグメントを適切な発現ベクターに挿入することにより作製することができる。本発明においては、外来遺伝子を宿主で発現することが可能な任意発現ベクターを使用することができる。例えば、好ましい発現ベクターとしては限定されないが、プラスミド、ファージベクター及び組込みベクターが挙げられる。
【００３７】
上記のように作製した組換え発現ベクターを慣用形質転換法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）に従って適切な宿主細胞に導入することができる。組換えＤＮＡの発現に適した宿主細胞としては、細菌、放線菌、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞を使用することができる。これらの宿主細胞のうちでは大腸菌又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種等の細菌；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種等の放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種等の酵母；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種等の真菌；及びセファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種又はアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）種等のＣＰＣ産生微生物が好ましい。
【００３８】
本発明の１好適態様において、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子Ｓ１２（配列番号６）を含む組換え発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って２００３年７月３０日付けでＫｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）（所在地：Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ，３０５−３３３，大韓民国）にアクセション番号ＫＣＴＣ １０５０３ＢＰで寄託された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−Ｓ１２と呼ぶ大腸菌形質転換細胞を得る。
【００３９】
ＣＰＣアシラーゼ変異体はＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子又はその機能的に等価な誘導体を含む発現ベクターを導入した前記形質転換微生物を適切な培地で適正な条件下に培養することにより作製することができる。
【００４０】
更に、ＣＰＣアシラーゼ変異体はＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするαサブユニット遺伝子又はその機能的に等価な誘導体のみを含む発現ベクターで形質転換された微生物と、ＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするβサブユニット遺伝子又はその機能的に等価な誘導体のみを含む発現ベクターで形質転換された微生物を適切な培地で適正な条件下に培養し、夫々の形質転換微生物でαサブユニット蛋白質とβサブユニット蛋白質を別々に生産し、精製した２種のサブユニット蛋白質をインビトロ混合することにより作製することもできる。
【００４１】
こうして作製したＣＰＣアシラーゼ変異体をそのまま使用するか又は精製形で使用し、１段階酵素法で所望生成物７−ＡＣＡを生産することができる。ＣＰＣアシラーゼ変異体はＣＰＣアシラーゼの特徴に基づく各種カラムクロマトグラフィー技術を特定目的に従って多少改変するか又は改変せずに使用し、慣用蛋白質精製法により精製することができる。更に、ニッケルカラムに対するヒスチジンペプチドの結合親和性又はセルロースに対するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）の結合親和性等の結合親和性を利用してアフィニティークロマトグラフィーによりＣＰＣアシラーゼ変異体を精製することもできる。
【００４２】
本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体は固定化形態で使用することもできる。ＣＰＣアシラーゼ変異体の固定化は担体（例えばセルロース、澱粉、デキストラン及びアガロース等の天然ポリマー；ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート及びＥｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ等の合成ポリマー；又はシリカ、ベントナイト及び金属等の鉱物）を使用する慣用方法により実施することができる。ＣＰＣアシラーゼ変異体は共有結合、イオン結合、親水性結合、物理的結合又はマイクロカプセル封入等の慣用の固定化方法により前記担体に結合させることができる。更に、グルタルアルデヒド又は臭化シアンの作用により担体と酵素の間に共有結合を形成することによりＣＰＣアシラーゼ変異体を固定化することも可能である。ＣＰＣアシラーゼ変異体を精製せずに、ＣＰＣアシラーゼ変異体を生産する微生物細胞を全細胞固定化法によりそのまま固定化することが好ましい。微生物により産生されるＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性を高めるためには、細胞壁に穴を開けるか又は細胞表面発現技術を適用することも可能である。
【００４３】
更に、本発明は前記ＣＰＣアシラーゼ変異体を使用して式ＩのＣＰＣから式ＩＩの７−ＡＣＡ又はその塩を製造するための方法を提供する。
【００４４】
下式中、Ｒはアセトキシ（−ＯＣＯＣＨ３）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、水素（−Ｈ）又はその塩である。Ｒはアセトキシ（−ＯＣＯＣＨ３）が好ましく、塩はナトリウム、カリウム又はリチウム塩等のアルカリ金属塩が好ましい。
【００４５】
【化２】
【００４６】
７−ＡＣＡ（ＩＩ）はＣＰＣ（Ｉ）を本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体と接触させることにより製造することができ、ここで、このＣＰＣアシラーゼはＣＰＣアシラーゼ変異体産生株の培養液として使用してもよいし、ＣＰＣアシラーゼ変異体、精製遊離酵素自体又は前記酵素の固定化形態を含む組成物として使用してもよい。ＣＰＣアシラーゼ変異体とＣＰＣ（Ｉ）の接触反応は水溶液中で実施することが好ましい。ＣＰＣ（Ｉ）の好適濃度は１〜５００ｍＭであり；ＣＰＣアシラーゼ変異体の添加量は０．１〜１００Ｕ／ｍｌであり；反応混合物のｐＨは７〜１０であり；反応時間は０．１〜２４時間であり；反応温度は４〜４０℃である。上記酵素反応により生成された７−ＡＣＡ（ＩＩ）を慣用方法により反応混合物から単離精製することができる。
【００４７】
更に、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体をＣＰＣ（Ｉ）とインビボで接触させることにより７−ＡＣＡ（ＩＩ）を製造することもできる。特に、７−ＡＣＡ（ＩＩ）はアクレモニウム・クリソゼナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｒｙｓｏｚｅｎｕｍ）等のＣＰＣ生合成活性をもつ微生物にＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子又はその機能的に等価な誘導体を導入する段階と；形質転換細胞を適切な培地で適正な条件下に培養する段階と；ＣＰＣアシラーゼ変異体を前記形質転換細胞中で生合成されたＣＰＣ（Ｉ）と自然接触させる段階により製造することができる。
【００４８】
以下、実施例により本発明を更に例証する。当然のことながら、以下の実施例は本発明の好適態様に関するものであるが、例証に過ぎない。上記記載と以下の実施例から当業者は本発明の本質的特徴を認識し、発明の精神と範囲から逸脱することなく、各種用途と条件に合わせて本発明の種々の変更及び変形を実施することができる。
【実施例１】
【００４９】
ＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体の作製
＜１−１＞構造情報に基づくＣＰＣアシラーゼ変異体の作製
＜１−１−１＞構造情報に基づく変異対象ＡｃｙＩＩアミノ酸残基の選択
ＣＡＤ−ＧＬ−７−ＡＣＡ複合体の三次構造が最近決定された（Ｋｉｍら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１２５３−１２６４，２００１；Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４８３７６−４８３８１、２００１）。図３に示すように、ＣＡＤの基質結合部位に存在するＡｒｇ５７β、Ｔｙｒ３３β、Ｔｙｒ１４９α及びＡｒｇ１５５αはＧＬ−７−ＡＣＡと直接水素結合を形成し、Ｐｈｅ１７７β、Ｌｅｕ２４β及びＶａｌ７０βは疎水性相互作用によりＧＬ−７−ＡＣＡと結合する。更に、Ｇｌｎ５０βはＧＬ−７−ＡＣＡと直接相互作用しないが、Ａｒｇ５７β及びＴｙｒ１４９αと水素結合を形成し、これらの残基を触媒反応に適した位置に配置する。一方、ＣＡＤとＧＬ−７−ＡＣＡの結合において、アセトキシ基と６員環と４員βラクタム環を含むＧＬ−７−ＡＣＡのβラクタムコアは活性部位残基との結合に有意な影響を与えない。逆に、ＧＬ−７−ＡＣＡ側鎖としてのグルタル酸領域はＡｒｇ５７β、Ｔｙｒ３３β、Ｔｙｒ１４９α及びＰｈｅ１７７βと正確に結合することにより基質結合に最大影響を及ぼす（図２及び３）。更に、Ｌｅｕ２４βとＶａｌ７０βは基質を適切な位置まで占有させることによりＳｅｒ１βの触媒反応の刺激に役割を果たすと推定されている。
【００５０】
一方、ＣＡＤ−ＧＬ−７−ＡＣＡ複合体の三次構造とＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造のオーバーラップの結果、ＧＬ−７−ＡＣＡのグルタル酸側鎖との結合に関与するＡｒｇ５７β、Ｔｙｒ３３β、Ｐｈｅ１７７β及びＴｙｒ１４９α等のＣＡＤの主要残基はＣＰＣのＤ−α−アミノアジピン酸側鎖の末端領域のカルボキシル基及びＤ形アミノ基とぶつかる（図４）。これらのモデリング結果から、ＣＰＣ側鎖（即ち、ＧＬ−７−ＡＣＡ側鎖に比較してＣＰＣ側鎖に付加的に存在する炭素骨格とＤ−アミノ基）を受容するために十分なスペースをＣＡＤの基質結合部位の内側に確保できるならば、ＣＰＣに対するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼの特異活性を増加できると予想される。
【００５１】
また、ＣＡＤ、ペニシリンＧアシラーゼ及びシュードモナスｓｐ．に由来するＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼの構造を比較した結果、シュードモナスｓｐ．に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼは他の酵素と同様の基質結合及び反応パターンを示すことが推定された（Ｋｉｍら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１２５３−１２６４，２００１；Ｆｒｉｔｚ−Ｗｏｌｆら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１：９２−１０３，２００２）。更に、ＣＡＤはＣＰＣに対する活性をもたないが、シュードモナスｓｐ．に由来するＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ）はＧＬ−７−ＡＣＡに比較して約５％のレベルのＣＰＣに対するアシラーゼ活性をもつことが報告されている（Ｍａｔｓｕｄａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５８１５−５８２０，１９８７）。従って、ＣＰＣに対する酵素活性をもたないＣＡＤよりも、ＣＰＣに対して安定したレベルの酵素活性をもつＡｃｙＩＩに基づいてＣＰＣアシラーゼ変異体を開発することが有利である。そこで、本発明はＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するための基本遺伝子としてシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（ａｃｙＩＩ）を使用した。
【００５２】
本発明はＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造と仮想変異誘発情報に基づいてＡｃｙＩＩの活性部位を選択した後に、選択した活性部位のうちでＣＰＣ結合の妨害に関与するＡｃｙＩＩ残基に部位特異的変異誘発を実施することにより、野生型ＡｃｙＩＩよりもＣＰＣに対して良好な特異活性をもつＣＰＣアシラーゼ変異体を作製しようと試みた。表１は部位特異的変異誘発の対象としたＣＡＤの活性部位残基に対応するＡｃｙＩＩ残基を示す。
【００５３】
【表１】
【００５４】
ＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造モデリングの結果に基づき、ＣＰＣ側鎖の結合を著しく阻害すると推定されるＣＡＤのＰｈｅ５８β、Ｔｙｒ３３β、Ｐｈｅ１７７β及びＴｙｒ１４９α残基に対応するＡｃｙＩＩのＰｈｅ５８β、Ｍｅｔ３１β、Ｉｌｅ１７６β及びＰｈｅ１６９α残基と、Ｓｅｒ１β活性部位の触媒反応を刺激するＣＡＤのＶａｌ７０β残基に対応するＡｃｙＩＩのＨｉｓ７０β残基に部位特異的変異誘発を実施した（図５）。
【００５５】
＜１−１−２＞ｐＢＣＰＣ及びｐＢＳＥＭプラスミドの作製
以下のように配列番号１のａｃｙＩＩ構造遺伝子ＤＮＡフラグメントをｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）のＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位に挿入することによりｐＢＣＰＣプラスミドを構築した。まず、ＤＮＡ合成器を使用することにより、シュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＣＰＣアシラーゼ遺伝子（ａｃｙＩＩ）のＤＮＡヌクレオチド配列と前記配列によりコードされる蛋白質ＡｃｙＩＩのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ１８２７８）に基づいてａｃｙＩＩ構造遺伝子を合成した。この場合、ａｃｙＩＩ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は文献に公開されている配列と同一としたが、そのヌクレオチド配列はａｃｙＩＩ遺伝子が大腸菌に１個以上の好ましいコドンを含むように多少改変して合成した。
【００５６】
制限酵素認識部位とリボソーム結合部位をａｃｙＩＩ構造遺伝子に導入するようにＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応溶液（１００μｌ）は合成ａｃｙＩＩ遺伝子ＤＮＡ１０ｎｇ、ＣＰＣ−Ｆプライマー（配列番号１３）及びＣＰＣ−Ｒプライマー（配列番号１４）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物０．２ｍＭ、Ｔａｑ緩衝液（５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、及びＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ，日本）２．５単位を含有するものとした。プログラマブルサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国）を用い９５℃にて５分間予備変性させることにより反応を開始した。ＰＣＲ条件は、１分９５℃（変性）、３０秒５８℃（アニール）、及び１分３０秒７２℃（重合）を２５サイクルからなり、１０分７２℃（後重合）の最終伸長とした。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物約２．５ｋｂをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡを、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用して１６℃で１２〜１６時間、インサートＤＮＡをベクターＤＮＡに連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析した。その結果、配列番号１のａｃｙＩＩ構造遺伝子を含むｐＢＣＰＣプラスミドが作製され、ｐＢＣＰＣプラスミドを含む大腸菌形質転換細胞を大腸菌ＭＣ１０６１（ｐＢＣＰＣ）と命名した。
【００５７】
配列番号３のｓｅｍ構造遺伝子ＤＮＡフラグメントをｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）のＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位に挿入することによりｐＢＳＥＭプラスミドを構築した。次のように一連のＰＣＲ増幅を実施した。ｐＢＣＰＣプラスミドを鋳型とし、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）とαＯＲＦ−Ｒプライマー（配列番号１５）を使用して０．８ｋｂのＰＣＲ産物を得、ｐＢＣＰＣプラスミドを鋳型とし、βＯＲＦ−Ｆプライマー（配列番号１６）とＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒプライマー（配列番号１８）を使用して約０．９６ｋｂのＰＣＲ産物を得、ｐＢＣＰＣプラスミドを鋳型とし、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆプライマー（配列番号１７）とＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）を使用して０．７５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。上記のように得られた０．８ｋｂ、０．９６ｋｂ及び０．７５ｋｂのＰＣＲ産物を混合し、プライマーを添加しなかった以外は上記と同一のＰＣＲ条件下でＰＣＲを実施し、３個のＰＣＲ産物を１個に融合した約２．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。その後、Ｔ３プライマー（配列番号９）とＴ７プライマー（配列番号１０）を使用して約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＰＣＲにかけ、サイズ約２．５ｋｂのｓｅｍ遺伝子ＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲ増幅後、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡとベクターＤＮＡを１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析した。その結果、配列番号３のｓｅｍ構造遺伝子を含むｐＢＳＥＭプラスミドが作製され、ｐＢＳＥＭプラスミドを含む大腸菌形質転換細胞を大腸菌ＭＣ１０６１（ｐＢＳＥＭ）と命名した。
【００５８】
ｐＢＣＰＣプラスミドに由来する大腸菌形質転換細胞によるＣＰＣアシラーゼ生産性をｐＢＳＥＭプラスミドに由来する大腸菌形質転換細胞による生産性と比較するために、各大腸菌形質転換細胞から得られたＣＰＣアシラーゼ粗酵素溶液を次のように調製した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地（１％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，０．５％ＮａＣｌ）３ｍｌに各大腸菌形質転換細胞を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで１６時間激しく振盪しながら培養した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えた新鮮なＬＢ培地５０ｍｌに培養液５０μｌを移し、更に２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養した。培養液を４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を分離し、この沈殿を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。この沈殿を同一緩衝液５ｍｌに懸濁し、４℃で１０分間超音波処理した。その後、懸濁液を４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、ＣＰＣアシラーゼ粗酵素溶液として使用可能な上清を分離した。
【００５９】
Ｐａｒｋら（Ｐａｒｋら，Ｋｏｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５５９−５６４，１９９５）により記載されている方法を以下のように多少変更してＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の酵素活性を測定した。ＣＰＣ（純度７４．２％；ＣＪ Ｃｏｒｐ．，韓国）を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に濃度２０ｍｇ／ｍｌで溶かし、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを８に調整することにより基質溶液を調製した。上記のように調製した粗酵素溶液２０μｌとＣＰＣ溶液２０μｌを混合し、反応混合物を３７℃で５分間インキュベートした。反応後、５０ｍＭ ＮａＯＨと２０％氷酢酸（１：２）の混合物（２００μｌ）を加えて反応を停止した。メタノールに溶かした０．５％（ｗ／ｖ）ＰＤＡＢ（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド；Ｓｉｇｍａ，米国）４０μｌと遠心により反応混合物から回収した上清２００μｌを混合し、反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。反応後、反応混合物の吸光度を４１５ｎｍで測定し、標準材料の校正曲線と比較することにより定量した。この場合、１分間にＣＰＣから７−ＡＣＡ１モルを生産することができる酵素の量として１単位を定義した。一方、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４，１９７６）により記載されている方法に従って酵素溶液中に残存している蛋白質の量を測定し、蛋白質１ｍｇに対応する活性単位として表すことにより、ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の特異活性を測定した。ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性は、同一量の蛋白質を反応混合物に加える段階と、酵素反応を規定時間実施する段階と、反応混合物中で生産された７−ＡＣＡの量を測定する段階と、前記量を相対値として表す段階とにより測定した。同一活性単位に対応する蛋白質を反応混合物に加え、酵素反応を規定時間実施し、反応混合物中で生産された７−ＡＣＡの量を測定し、前記量を相対値として表すことにより、７−ＡＣＡによる最終産物阻害を測定した。
【００６０】
ＣＰＣに対する酵素活性の測定の結果、大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＣＰＣ）により生産されたＣＰＣアシラーゼの生産性は約９７単位／リットルであったが、大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＳＥＭ）による生産性は約１１単位／リットルに過ぎなかった。
【００６１】
＜１−１−３＞Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β二重変異体の作製
ＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するために、以下のようにＭｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β二重変異体を作製した。ＣＡＤ−ＣＰＣ複合体の三次構造モデリングに示すように、ＣＰＣ側鎖はＧＬ−７−ＡＣＡ側鎖に比較して付加的に炭素骨格とＤ−アミノ基を含むので、ＣＡＤはＣＰＣと結合するためにＧＬ−７−ＡＣＡよりも大きなスペースを必要とする。ＣＰＣとの結合に十分なスペースを確保するために、ＡｃｙＩＩの基質結合部位の内側の２個の残基を同時に変異させた。ＣＰＣ側鎖の結合に最も重要な残基としてＣＡＤのＡｒｇ５７βに対応するＡｃｙＩＩのＨｉｓ５７βを保存し、ＣＰＣ側鎖の末端のカルボキシル基とＤ−アミノ基にぶつかると考えられるＡｃｙＩＩのとＭｅｔ３１βをロイシンで置換した。同時に、ＡｃｙＩＩのＨｉｓ５７β側鎖にねじれ角の変化を誘導することによりＣＰＣ側鎖の結合スペースを更に確保するために、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、システイン又はアスパラギン等の比較的小さい側鎖をもつ別のアミノ酸残基でＡｃｙＩＩのＰｈｅ５８βを置換した。その結果、オーバーラップＰＣＲによりＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＬ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＡ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＶ及びＭ３１βＬ／Ｆ５８βＮ二重変異体が作製された（Ｈｏら，Ｇｅｎｅ １５：５１−５９，１９８９）。これらの二重変異体の作製方法を以下に詳述する。
【００６２】
部位特異的変異誘発に使用したＰＣＲ反応溶液（１００μｌ）は鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、フォワード及びリバースプライマー各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物０．２ｍＭ、Ｔａｑ緩衝液（５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、及びＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ，日本）２．５単位を含有するものとした。プログラマブルサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国）で９５℃にて５分間変性させることにより反応を開始した。ＰＣＲ条件は１分９５℃、３０秒５８℃及び６０〜９０秒７２℃を２５サイクルからなり、１０分７２℃の最終伸長とした。
【００６３】
特に、以下の鋳型とプライマーを使用してＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体を作製するための一連のＰＣＲ増幅を実施した。即ちｐＢＳＥＭプラスミドを鋳型とし、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）とＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）を使用して１．０ｋｂのＰＣＲ産物を得、ｐＢＳＥＭプラスミドを鋳型とし、Ｆ５８βＭ−Ｆプライマー（配列番号２０）とＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）を使用して１．６ｋｂのＰＣＲ産物を得た。
【００６４】
上記のように得られた１．０ｋｂと１．６ｋｂのＰＣＲ産物を混合し、プライマーを添加しなかった以外は上記と同一の条件下でＰＣＲを実施し、２個のＰＣＲ産物を相互に結合することにより１個に融合した約２．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。その後、Ｔ３プライマー（配列番号９）とＴ７プライマー（配列番号１０）を使用して約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＰＣＲにかけ、サイズ約２．５ｋｂの二重変異体ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅後、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡをベクターＤＮＡに１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、二重変異体遺伝子を含む形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析し、変異残基を確認した。
【００６５】
上記と同一方法により、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＬ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＡ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＶ及びＭ３１βＬ／Ｆ５８βＮ二重変異体を作製した。この場合、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＣ−Ｆプライマー（配列番号２１）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＬには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＬ−Ｆプライマー（配列番号２４）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＡには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＡ−Ｆプライマー（配列番号２２）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＶには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＶ−Ｆプライマー（配列番号２３）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮには、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）とＦ５８βＮ−Ｆプライマー（配列番号２５）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）をオーバーラップＰＣＲ増幅に使用した。
【００６６】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各ＣＰＣアシラーゼ変異体の粗酵素溶液を使用することにより、上記のように得られた二重変異体のＣＰＣに対する特異活性を測定した。その結果、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＬ、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＡ及びＭ３１βＬ／Ｆ５８βＶ二重変異体の特異活性は野生型ＡｃｙＩＩの夫々２．４倍、２．３倍、２．０倍、１．８倍、１．６倍及び１．６倍であることが確認された。
【００６７】
＜１−１−４＞Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｈｉｓ７０β三重変異体の作製
６種の二重変異体のうちで最高の特異活性増加を示すＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭの特異活性を更に高めるために、活性部位Ｓ１βの触媒反応を刺激するＣＡＤのＶａｌ７０βに対応するＡｃｙＩＩのＨｉｓ７０βをセリン又はロイシンで置換し、三重変異体を作製した。
【００６８】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）を製造業者の指示に従って使用することにより、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体を作製した。ＰＣＲ反応溶液（５０μｌ）はＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体ＤＮＡ４０ｎｇ、Ｈ７０βＳ−Ｆプライマー（配列番号２６）及びＨ７０βＳ−Ｒプライマー（配列番号２７）各１００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物１μｌ、緩衝液（１００ｍＭ ＫＣ１，１００ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．８），２０ｍＭ ＭｇＳＯ４，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）５μｌ、及びｐｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，米国）２．５単位を含有するものとした。プログラマブルサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国）で９５℃にて３０秒間変性させることにより反応を開始した。ＰＣＲ条件は３０秒９５℃、１分５５℃、及び１２分６８℃を１６サイクルとした。ＰＣＲ増幅後、ＤｐｎＩ制限酵素１０単位をＰＣＲ反応溶液に加え、３７℃で１時間インキュベートし、変異が生じない鋳型ＤＮＡを除去した。変異体ＤＮＡを精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析し、変異残基を確認した。
【００６９】
Ｈ７０βＬ−Ｆプライマー（配列番号２８）とＨ７０βＬ−Ｒプライマー（配列番号２９）を使用した以外は上記と同一方法に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）を使用することによりＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＬ三重変異体を作製した。
【００７０】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各ＣＰＣアシラーゼ変異体の粗酵素溶液を使用することにより、ＣＰＣに対する三重変異体の特異活性を測定した。その結果、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ及びＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＬ三重変異体の特異活性はＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体の夫々３．２倍と２．４倍を示した。
【００７１】
＜１−１−５＞Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｈｉｓ７０β四重変異体の作製
２種の三重変異体のうちで最高の特異活性増加を示すＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳの特異活性を更に高めるために、活性部位Ｓ１βの効率的触媒反応に適した位置にＣＰＣを配置するのを助長するＣＡＤのＴｙｒ１４９αに対応するＡｃｙＩＩのＰｈｅ１６９αをチロシンで置換し、四重変異体Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳを作製した。チロシン側鎖はフェニルアラニン側鎖に比較して付加的にヒドロキシル（−ＯＨ）基をもつので、ＣＰＣ側鎖及び／又はその隣接残基と水素結合を形成することによりＳ１βの触媒反応を刺激することができる。
【００７２】
Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体を鋳型とし、Ｆ１６９αＹ−Ｆプライマー（配列番号３０）とＦ１６９αＹ−Ｒプライマー（配列番号３１）を使用した以外は実施例＜１−１−４＞に記載したと同一方法に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）を使用することにより、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体を作製した。
【００７３】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、四重変異体の粗酵素溶液を使用することにより、ＣＰＣに対するＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体の特異活性を測定した。その結果、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体の特異活性はＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体の２．１倍に増加した。
【００７４】
＜１−１−６＞Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｈｉｓ７０β／Ｉｌｅ１７６β五重変異体の作製
ＣＰＣに対するＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体特異活性の特異活性を更に高めるために、ＣＰＣ側鎖の結合の妨害に関与していると思われるＣＡＤのＰｈｅ１７７βに対応するＡｃｙＩＩのＩｌｅ１７６βをバリンで置換し、五重変異体Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉｌｅ１７６βＶを作製した。実施例＜１−１−３＞では、ＡｃｙＩＩのＰｈｅ５８βをメチオニンで置換した。一方、ＡｃｙＩＩのＩｌｅ１７６βはＡｃｙＩＩのＰｈｅ５８βに非常に近接して位置しており、ＣＰＣ結合を妨害すると予想される。そこで、ＣＰＣ基質側鎖の結合をより効率的にするために、イソロイシンと同様の構造でサイズが小さい側鎖をもつバリンでＩｌｅ１７６βを置換した。
【００７５】
Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体を鋳型とし、Ｉｌｅ１７６βＶ−Ｆプライマー（配列番号３２）とＩｌｅ１７６βＶ−Ｒプライマー（配列番号３３）を使用した以外は実施例＜１−１−４＞に記載したと同一方法に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）を使用することにより、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体を作製した。
【００７６】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、五重変異体の粗酵素溶液を使用することにより、ＣＰＣに対するＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体の特異活性を測定した。その結果、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体の特異活性はＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体の２．４倍に増加した。
【００７７】
＜１−２＞ＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体の作製
＜１−２−１＞Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β四重変異体の作製
７−ＡＣＡの大規模１段階酵素的製造方法に既存ＣＰＣアシラーゼを適用することは困難であるが、これは、７−ＡＣＡによる最終産物阻害とＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼの特異活性が低いことからＣＰＣから７−ＡＣＡへの変換効率が非常に低いためである。一方、実施例＜１−１＞においてＣＰＣアシラーゼ変異体の特異活性を増加させる一連の部位特異的変異誘発から明らかなように、Ｈｉｓ７０βの変異はＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の特異活性を有意に増加するが、７−ＡＣＡによる最終産物阻害レベルも著しく増加する。そこで、実施例＜１−１−６＞のＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体をＨ７０βＳの復帰変異誘発により野生型残基ヒスチジンに変異させ、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体を作製した（図５）。Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体を鋳型とし、Ｈ７０β−Ｆプライマー（配列番号３４）とＨ７０β−Ｒプライマー（配列番号３５）を使用した以外は実施例＜１−１−４＞に記載したと同一方法に従い、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体を作製した。
【００７８】
野生型、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体及びＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体の各粗酵素溶液の調製後に同一活性単位に対応する酵素溶液を使用することにより、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一の方法により、最終産物阻害を測定した。その結果、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体のＨ７０βＳを野生型残基ヒスチジンに復帰変異させると、７−ＡＣＡによる最終産物阻害は野生型酵素と同等レベルまで低下することが確認された（図６）。
【００７９】
＜１−２−２＞Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β及びＶａｌ１２１α／Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β五重変異体の作製
ＣＰＣに対するＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体の反応性を更に高めるために、四重変異体ＤＮＡにエラープローンＰＣＲを実施し、ランダム部位に点変異をもつ変異体ライブラリーを構築した。この場合、平均して四重変異体遺伝子１個当たりアミノ酸残基１個に置換が生じるように前記エラープローンＰＣＲのエラー率を調節した。変異体ライブラリーの具体的な構築手順は以下の通りとした。
【００８０】
エラープローンＰＣＲに使用したＰＣＲ反応溶液（１００μｌ）はＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体ＤＮＡ５ｎｇ、Ｔ３プライマー（配列番号９）及びＴ７プライマー（配列番号１０）各５０ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ各１．０ｍＭ、５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．３），３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０２５ｍＭ ＭｎＣｌ２及びｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラ，日本）５単位を含有するものとした。プログラマブルサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国）で９５℃にて３分間変性させることにより反応を開始した。ＰＣＲ条件は１分９５℃、３０秒５８℃、及び９０秒７２℃を２０サイクルと、１０分７２℃の最終伸長とした。エラープローンＰＣＲ増幅後、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＳＥＭプラスミドＤＮＡをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ベクターＤＮＡとして使用する３．４ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡとベクターＤＮＡを１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、変異体ライブラリーを構築した。
【００８１】
上記のように得られた変異体ライブラリーからＣＰＣに対する反応性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を以下のようにスクリーニングした。
【００８２】
クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地２００μｌを充填した９６ウェルプレートにエラープローンＰＣＲによりランダム部位に点変異を導入したＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を含む大腸菌ＭＣ１０６１形質転換細胞を接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで６０〜７０時間激しく振盪しながら培養した。ウェルプレートから取り出した各培養液１００μｌを別の９６ウェルプレートに移した。細胞溶解液（２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０））１００μｌを加え、３０℃で２時間放置した。その後、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かした２．５％（ｗ／ｖ）ＣＰＣ溶液と５ｍＭ ７−ＡＣＡの混合物５０μｌを各ウェルに加え、ウェルプレートを２８℃に１４〜１６時間維持し、ＣＰＣの加水分解反応を誘導した。この場合、７−ＡＣＡをＣＰＣ溶液に添加したが、これはＣＰＣに対する特異活性の改善及び／又は７−ＡＣＡによる最終産物阻害の低下を示すＣＰＣアシラーゼ変異体のスクリーニングを容易にするためである。ＣＰＣの加水分解反応後、反応混合物を４，２００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を分離し、上清５０μｌを別の９６ウェルプレートに移した。停止溶液（酢酸：２５０ｍＭ ＮａＯＨ，２：１）１６０μｌを各ウェルに加えて酵素反応を停止した後、発色剤（メタノールに溶かした０．５％（ｗ／ｖ）ＰＤＡＢ溶液）４０μｌを加え、ウェルプレートを室温で１０分間放置した。次にウェルプレートをマイクロプレートリーダーに載せ、４１５ｎｍの吸光度を測定し、測定した吸光度値を比較することによりＣＰＣに対する特異活性の改善されたＣＰＣアシラーゼ変異体を選択した。
【００８３】
前記ランダム変異体ライブラリーから約２５，０００個のコロニーをランダムにスクリーニングした結果、ランダム変異誘発の鋳型として使用したＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体よりも高い吸光度値を示す２個の変異体（＃１２０及び＃２１３）を選択した。＃１２０変異体はＧｌｙ１３９αがセリンで置換されており（Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重変異体）、＃２１３変異体はＶａｌ１２１αがアラニンで置換されている（Ｖ１２１αＡ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重変異体）ことが配列分析により確認された（図５）。
【００８４】
更に、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各変異体の粗酵素溶液を使用することにより、＃１２０及び＃２１３変異体のＣＰＣに対する反応性を測定した。その結果、＃１２０及び＃２１３変異体はＣＰＣに対する反応性が実施例＜１−２−１＞のＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体よりも更に増加していることが確認された（図７）。
【００８５】
＜１−２−３＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ１６９α／Ｍｅｔ３１β／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β六重変異体の作製
Ｖ１２１αＡ又はＧ１３９αＳ変異をＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重変異体に組込むと、ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性が増加することが実施例＜１−２−２＞の結果から確認された。そこで、ＣＰＣに対する反応性を更に高めるために、＃１２０変異体のＧ１３９αＳ変異を＃２１３変異体に組込むことにより、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体を作製した（図５）。本発明の六重変異体は＃２１３変異体ＤＮＡを鋳型とし、Ｇ１３９αＳ−Ｆプライマー（配列番号３６）とＧ１３９αＳ−Ｒプライマー（配列番号３７）をＰＣＲに使用した以外は、実施例＜１−１−４＞に記載したと同一方法に従って作製した。本発明では、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子をＴｎＳ５と命名した。
【００８６】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、六重変異体の粗酵素溶液を使用することにより、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体のＣＰＣに対する反応性を測定した。その結果、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体（ＴｎＳ５）のＣＰＣに対する反応性は＃２１３及び＃１２０変異体よりも増加することが確認された（図７）。
【００８７】
＜１−３＞ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβプラスミドの作製
Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＴｎＳ５遺伝子は、宿主細胞でαサブユニットとβサブユニットを別々に発現し、これらの２個のサブユニットの自然接触によりＣＰＣアシラーゼの活性形を生成するように設計されたＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子（例えばｓｅｍ遺伝子）である。
【００８８】
野生型アシラーゼ遺伝子（ａｃｙＩＩ）等のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を宿主細胞で転写翻訳後に自己消化プロセスにより得られるα及びβサブユニット各１個から構成されるＴｎＳ５遺伝子から活性なＣＰＣアシラーゼ変異体の形成を誘導するために、本発明はＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体のαサブユニットとβサブユニットの間に野生型ＣＰＣアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ）のスペーサーペプチドを挿入した六重ＣＰＣアシラーゼ変異体をコードするＴｎＳ５αβ遺伝子を作製した（図５）。ＴｎＳ５αβ遺伝子の作製方法を以下に詳細に記載する。
【００８９】
ＴｎＳ５遺伝子をｐＢＣ−ＫＳ（＋）ベクターのＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位に挿入し、ｐＢＣ−ＴｎＳ５プラスミドを作製した。ＰＣＲ増幅を２回実施し、ｐＢＣ−ＴｎＳ５プラスミドを鋳型とし、Ｍ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）とαＣＰＣ−Ｒプライマー（配列番号３８）を使用することにより０．８ｋｂのＰＣＲ産物を得、ｐＢＣ−ＴｎＳ５プラスミドを鋳型とし、βＣＰＣ−Ｆプライマー（配列番号３９）とＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）を使用して１．７ｋｂのＰＣＲ産物を得た。上記のように得られた０．８ｋｂと１．７ｋｂのＰＣＲ産物を混合し、プライマーを添加しなかった以外は同一条件下でＰＣＲを実施し、２個のＰＣＲ産物を相互に結合することにより１個に融合した約２．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。その後、Ｔ３プライマー（配列番号９）とＴ７プライマー（配列番号１０）を使用して２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＰＣＲにかけ、ＴｎＳ５αβ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲ増幅後、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡをベクターＤＮＡに１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析した。その結果、ＴｎＳ５αβ遺伝子を含むｐＢＣ−ＴｎＳ５αβプラスミドが作製された。
【００９０】
ＴｎＳ５αβ遺伝子によるＣＰＣアシラーゼ変異体の生産性を検討するために、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＴｎＳ５及びＴｎＳ５αβ遺伝子の各々をｐＢＣ−ＫＳ（＋）ベクターに挿入し、夫々ｐＢＣ−ＴｎＳ５及びｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ組換えプラスミドを作製し、各組換えプラスミドを大腸菌ＭＣ１０６１に形質転換し、大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５）及びＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ）を得た。クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢブロス５０ｍｌ中で大腸菌形質転換細胞を２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養し、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、形質転換細胞培養液から調製した粗酵素溶液を使用することによりＣＰＣに対する酵素活性を測定した。その結果、各大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５）及びＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ）により生産されたＣＰＣアシラーゼの生産性は夫々約７８単位／リットルと１６２単位／リットルであった。これらの結果から、ＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を宿主細胞で転写翻訳後に自己消化プロセスにより形成される六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（例えばＴｎＳ５αβ）は宿主細胞で別々に発現させたαサブユニットとβサブユニットの自然接触により形成される六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（例えばＴｎＳ５）の生産性の約２倍であることが確認された。
【００９１】
更に、大腸菌形質転換細胞ＭＣ１０６１（ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ）の培養液から調製した粗酵素溶液を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、蛋白質発現パターンを検討した。その結果、サイズ約８３ｋＤａの不活性前駆体バンドは出現せず、不活性前駆体形の大半は本発明の培養条件下でＴｎＳ５αβ遺伝子の転写翻訳後に効率的自己消化によりＣＰＣアシラーゼ変異体の活性形に変換することが分かった（図７）。従って、以下ではＣＰＣアシラーゼ変異体を開発するための鋳型ＤＮＡとしてＴｎＳ５αβ遺伝子を使用した。
【００９２】
＜１−４＞ＣＰＣに対する反応性が更に増加したＣＰＣアシラーゼ変異体の作製
＜１−４−１＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ１６９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β五重変異体の作製
本発明では、実施例＜１−１＞〜＜１−３＞で一連の部位特異的変異誘発とランダム変異誘発により、ＣＰＣに対する反応性の改善されたＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子ＴｎＳ５及びＴｎＳ５αβを作製した。ＴｎＳ５αβ六重変異体を作製するためのこれらの変異誘発操作では、ＣＰＣ側鎖の末端のカルボキシル基とＤ−アミノ基にぶつかると予想されるＭｅｔ３１βをロイシンで置換し、Ｐｈｅ５８βをメチオニン、システイン又はアスパラギンで同時に置換し、Ｈｉｓ５７β側鎖のねじれ角を変化させることによりＣＰＣ側鎖の効率的結合に十分なスペースを確保した。即ち、本発明はＣＰＣに対する反応性を更に高めるために、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体のＭｅｔ３１β及びＰｈｅ５８β残基を次のように最適化した。
【００９３】
本発明は、ＴｎＳ５αβ六重変異体ＤＮＡを鋳型としてＭ３１βＬを野生型残基メチオニンに復帰変異誘発すると共にＦ５８βＭをアスパラギン又はシステインに置換し、 ４個の変異体（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ，Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶ，Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ，Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶ）を作製した。これらの変異体は実施例＜１−１−３＞にＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体について記載したと同一の作製方法に従って作製した。この場合、以下のプライマー、即ちＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶにはＭ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）ならびにＦ５８βＣ−Ｆプライマー（配列番号２１）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶにはＭ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１βＬ−Ｒプライマー（配列番号１９）ならびにＦ５８βＮ−Ｆプライマー（配列番号２５）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶにはＭ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１β−Ｒプライマー（配列番号４２）ならびにＦ５８βＣ−Ｆプライマー（配列番号２１）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）；Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶにはＭ１３−Ｒプライマー（配列番号１１）及びＭ３１β−Ｒプライマー（配列番号４２）ならびにＦ５８βＮ−Ｆプライマー（配列番号２５）及びＭ１３−Ｆプライマー（配列番号１２）を使用してオーバーラップＰＣＲを実施した。
【００９４】
ＣＰＣに対する酵素反応性は、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各変異体の粗酵素溶液を使用することにより測定した。その結果、ＴｎＳ５αβ六重変異体のＦ５８βＭをアスパラギンで置換した変異体は、ＣＰＣに対する反応性が著しく増加し、ＴｎＳ５αβ六重変異体のＭ３１βＬをメチオニンに復帰変異させた変異体はＣＰＣから７−ＡＣＡをより効率的に生産するが、その特異活性は多少低下することが確認された（図８）。これらの結果から、本発明はＴｎＳ５αβ六重変異体よりもＣＰＣに対する反応性が更に増加したＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重変異体（ｍＦ５８）を選択した（図５）。
【００９５】
＜１−４−２＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β四重変異体の作製
本発明では実施例＜１−１−５＞でＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の特異反応性を更に高めるためにＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体のＰｈｅ１６９αをチロシンで置換した。一方、実施例＜１−２−１＞では７−ＡＣＡによる最終産物阻害を低減するためにＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体のＨ７０βＳ残基をヒスチジンに復帰変異誘発し、実施例＜１−４−１＞ではＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体のＭ３１βＬ残基を野生型残基メチオニンに復帰変異誘発した。更に、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重変異体のＦ５８βＭ変異残基及びＩ１７６β残基を夫々アスパラギンとバリンで置換した。こうして、Ｆ１６９αＹ変異残基を野生型残基フェニルアラニンに復帰変異誘発することによりＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体（Ｆ１６９）を作製した（図５）。
【００９６】
Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重変異体ＤＮＡを鋳型とし、Ｆ１６９α−Ｆプライマー（配列番号４５）とＦ１６９α−Ｒプライマー（配列番号４６）をＰＣＲに使用した以外は実施例＜１−１−４＞にＭ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体ＤＮＡについて記載したと同一の作製方法によりＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体を作製した。
【００９７】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、変異体酵素の粗酵素溶液を使用することによりＣＰＣに対するＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体の反応性を測定した。その結果、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重変異体のＦ１６９αＹを野生型残基フェニルアラニンに復帰変異させると、ＣＰＣに対するＣＰＣアシラーゼ変異体の反応性が更に増加することが確認された（図９）。
【００９８】
＜１−４−３＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ７５β／Ｉｌｅ１７６β及びＶａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ１７６β／Ｓｅｒ４７１β五重変異体の作製
ＣＰＣに対するＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体の反応性を更に高めるために、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体をエラープローンＰＣＲにかけ、ランダム変異体ライブラリーを構築した。上記のように構築したランダム変異体ライブラリーからＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体よりもＣＰＣに対する反応性が更に増加した変異体をスクリーニングした。この場合の、エラープローンＰＣＲの反応条件、前記変異体ライブラリーの作製方法及び変異体のスクリーニング方法は、ＣＰＣに対する反応性が更に増加した変異体を変異体ライブラリーからスクリーニングする際に５ｍＭ ７−ＡＣＡ（終濃度）を反応混合物に添加した以外は実施例＜１−２−２＞に記載したものと同一とした。
【００９９】
前記ランダム変異体ライブラリーから約１５，０００個のコロニーをスクリーニングした結果、ランダム変異誘発の鋳型として使用したＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体よりも高い吸光度値を示す２個の変異体（＃５９及び＃７６）を選択した。配列分析の結果、＃５９変異体はＩｌｅ７５βがスレオニンで置換されており（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ五重変異体）、＃７６変異体はＳｅｒ４７１βがシステインで置換されている（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ五重変異体）ことが確認された（図５）。
【０１００】
更に、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、各変異体の粗酵素溶液を使用することによりＣＰＣに対する＃５９及び＃７６変異体の反応性を測定した。その結果、ＣＰＣに対する＃５９及び＃７６変異体の反応性はＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体（Ｆ１６９）よりも高いことが確認された（図９）。
【０１０１】
＜１−４−４＞Ｖａｌ１２１α／Ｇｌｙ１３９α／Ｐｈｅ５８β／Ｉｌｅ７５β／Ｉｌｅ１７６β／Ｓｅｒ４７１β六重変異体の作製
ＣＰＣに対する反応性はＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重変異体にＩｌｅ７５βＴ又はＳ４７１βＣ変異を導入することにより増加することが上記から確認された。そこで、ＣＰＣに対する反応性を更に高めるために、本発明では＃５９変異体のＩｌｅ７５βＴ変異を＃７６変異体に導入することによりＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体を作製した（図５）。本発明の六重変異体は、＃７６変異体ＤＮＡを鋳型とし、Ｉ７５βＴ−Ｆプライマー（配列番号４３）とＩ７５βＴ−Ｒプライマー（配列番号４４）をＰＣＲ増幅に使用した以外は、実施例＜１−１−４＞に記載したと同一の方法により作製した。本発明ではＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子をＳ１２と命名した。
【０１０２】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、六重変異体の粗酵素溶液を使用することにより、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体のＣＰＣに対する反応性を測定した。その結果、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体（Ｓ１２）のＣＰＣに対する反応性は＃７６変異体（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／ＳβＣ五重変異体）よりも高いことが確認された（図１０）。
【実施例２】
【０１０３】
ＣＰＣアシラーゼ変異体の精製とその反応特性の分析
＜２−１＞ＣＰＣに対する特異活性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体の精製
クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたテリフィックブロス（１．２％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ，２．４％Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，０．４％グリセロール，０．１７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４，０．７２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４）１リットル中で野生型又は本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を導入した組換えプラスミドを含む大腸菌ＭＣ１０６１形質転換細胞を３０℃で１６時間培養し、前培養液を得た。前培養液１０ｍｌを同一培地に接種した後、２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養した。培養液を４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を分離し、沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。沈殿を同一緩衝液１００ｍｌに懸濁した。この懸濁液を４℃で２０分間超音波処理し、細胞壁を破壊し、４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して不溶性材料と細胞破片を除去し、以下に粗酵素溶液として使用する上清を得た。
【０１０４】
硫酸アンモニウムを粗酵素溶液に加え、その最終飽和率を３０％に調整し、反応混合物を４℃で１時間飽和まで撹拌した。その後、反応混合物を４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を除去し、硫酸アンモニウムを上清に加えて最終飽和率を６０％に調整した。反応混合物を４℃で１時間飽和まで撹拌し、４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を回収した。沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、５０ｍＭ ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で一晩透析した。
【０１０５】
５０ｍＭ ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でＤＥＡＥ−セファロースアニオン交換カラム（５×１８．５ｃｍ）を平衡化し、透析により得られた蛋白質溶液をクロマトグラフィーにかけ、カラムを同一緩衝液３容量で洗浄し、吸着しない蛋白質分子を除去した。ＮａＣｌ濃度を５０ｍＭから２００ｍＭまで漸増させることにより吸着した蛋白質を溶出させた。ＣＰＣアシラーゼ活性を示すフラクションを集め、透析バッグでポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．２０，０００）により濃縮した。２５％硫酸アンモニウムを加えた２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で濃縮蛋白質を透析した。
【０１０６】
２５％硫酸アンモニウムを加えた２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅｒｌカラム（２．５×６ｃｍ）を平衡化し、上記により得られた透析物をクロマトグラフィーにかけ、蛋白質をカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度を２５％から０％まで漸減させることにより吸着した蛋白質を溶出させた。各フラクションのＣＰＣアシラーゼ活性を確認した後に、酵素活性をもつフラクションを回収し、ポリエチレングリコールで濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、野生型及び本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体を精製した。
【０１０７】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法により酵素活性を測定した。
【０１０８】
＜２−２＞野生型ＣＰＣアシラーゼの物性と反応特徴の分析
実施例＜２−１＞に記載したと同一方法に従い、実施例＜１−１−２＞で作製したｐＢＣＰＣ又はｐＢＳＥＭプラスミドを含む大腸菌形質転換細胞から野生型ＣＰＣアシラーゼを精製した。ｐＢＣＰＣプラスミドに由来する野生型ＣＰＣアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ）とｐＢＳＥＭプラスミドに由来する野生型ＣＰＣアシラーゼ（Ｓｅｍ）の物性と反応特徴を分析した結果、同一の物性（例えば分子量）と反応特徴（例えば特異活性、最適温度、最適ｐＨ）を示した。
【０１０９】
更に、実施例＜２−１＞で得られた野生型ＣＰＣアシラーゼの活性フラクションに非変性ＰＡＧＥとクーマシーブルー染色を実施した。その結果、約８３ｋＤａの分子量に対応する位置に単一バンドが検出され、野生型ＣＰＣアシラーゼが純粋に精製されたことを示した（図１１ａ〜１１ｃ）。非変性ＰＡＧＥの結果に加え、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により精製酵素（即ち活性ＣＰＣアシラーゼ）の分子量は約８３ｋＤａであることが確認された。更に、αサブユニットに対応する約２５ｋＤａのバンドとβサブユニットに対応する約５８ｋＤａのバンドが変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出された。これらの結果から、本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体は約２５ｋＤａのαサブユニットと約５８ｋＤａのβサブユニット１個ずつから構成される二量体であることが確認された。
【０１１０】
α及びβサブユニットを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから精製し、各サブユニットフラグメントの分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定した。その結果、ｐＢＣＰＣプラスミドに由来する野生型ＣＰＣアシラーゼ（ＡｃｙＩＩ）は配列番号２のアミノ酸配列の２３０位と２３１位のアミノ酸の間と２３９位と２４０位のアミノ酸の間の２つの位置に生じる自己消化により９個のアミノ酸から構成されるスペーサーペプチドを除去することにより、約２５ｋＤａのαサブユニットと約５８ｋＤａのβサブユニットに分離されると予想された。
【０１１１】
野生型ＣＰＣアシラーゼの特異活性を検討した結果、野生型ＣＰＣアシラーゼは約２３．１単位／ｍｇ蛋白質のＧＬ−７−ＡＣＡに対する特異活性と約０．３３単位／ｍｇ蛋白質のＣＰＣに対する特異活性を示した。従って、シュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来するＡｃｙＩＩのＣＰＣに対する特異活性はＧＬ−７−ＡＣＡに対する特異活性の約１．４％に過ぎないことが分かった。
【０１１２】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従って酵素反応を実施した後に、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット法により精製酵素の速度論的パラメーターを測定した。その結果、野生型ＣＰＣアシラーゼＡｃｙＩＩのＫｍ、Ｋｃａｔ及び触媒効率（即ちＫｃａｔ／Ｋｍ）は夫々５０ｍＭ、０．９／ｓｅｃ及び０．０２／ｓｅｃ／ｍＭであった。
【０１１３】
更に、野生型ＣＰＣアシラーゼＡｃｙＩＩの最適反応温度及びｐＨを検討した結果、ＣＰＣの最適反応温度及びｐＨは夫々４０℃と９．０であった。
【０１１４】
＜２−３＞特異活性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体の反応特徴の分析
実施例＜２−１＞に記載したと同一方法に従い、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ二重変異体、Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ三重変異体、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ四重変異体及びＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体をコードする各ＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子を含むプラスミドで形質転換した組換え大腸菌から各ＣＰＣアシラーゼ変異体を精製した。
【０１１５】
各変異体酵素の反応特徴を分析した結果、その反応特徴（例えば最適温度及びｐＨ）と物性（例えば分子量）は野生型ＣＰＣアシラーゼと同一であった。他方、各変異体酵素の特異活性を検討した結果、ＣＰＣに対する各変異体の特異活性は変異誘発が定常的に進行するにつれて漸増した（表２）。これらの順次変異誘発から、ＣＰＣに対する特異活性が野生型ＣＰＣアシラーゼの約１１．２倍に増加したＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体が得られた。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従って酵素反応を実施した後に、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット法によりＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体酵素の速度論的パラメーターを測定した。その結果、Ｋｍ、Ｋｃａｔ及びＫｃａｔ／Ｋｍは夫々８ｍＭ、２．４／ｓｅｃ及び０．３０／ｓｅｃ／ｍＭであった。Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重変異体は野生型酵素に比較してＫｍ値が約６．３分の１に減少し、ＣＰＣ反応効率が約１５倍に増加した。これらの結果から、ＣＡＤの三次構造に基づく一連の部位特異的変異誘発により得られた本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体はＣＰＣに対する結合親和性と特異活性が増加していることが確認された。
【０１１８】
＜２−４＞ＣＰＣに対する反応性の増加したＣＰＣアシラーゼ変異体の精製とその反応特徴の分析
実施例＜２−１＞に記載したと同一方法に従い、実施例＜１−３＞のＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子（ＴｎＳ５αβ）又は実施例＜１−４−４＞のＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体をコードするＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子（Ｓ１２）を含むプラスミドで形質転換した組換え大腸菌から各六重ＣＰＣアシラーゼ変異体を精製した。
【０１１９】
各精製変異体酵素ＴｎＳ５αβ及びＳ１２の反応特徴を分析した結果、その反応特徴（例えば最適温度及びｐＨ）と物性（例えば分子量）は野生型ＣＰＣアシラーゼと同一であった。
【０１２０】
各ＣＰＣアシラーゼ変異体ＣＰＣに対する特異活性と７−ＡＣＡによる最終産物阻害を検討するために、反応混合物のｐＨを８．５に調整した以外は実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従って酵素反応を実施した。その結果、ＴｎＳ５αβ及びＳ１２変異体酵素のＣＰＣに対する特異活性は野生型ＣＰＣアシラーゼの２．３倍と８．５倍に対応する夫々１．５単位／ｍｇ蛋白質と５．８単位／ｍｇ蛋白質であった。更に、Ｓ１２変異体酵素の７−ＡＣＡによる阻害定数（Ｋｉ）を測定した結果、野生型酵素のＫｉ値は０．４ｍＭであったが、Ｓ１２変異体酵素のＫｉ値は１．９ｍＭであり、Ｓ１２変異体酵素の７−ＡＣＡによる最終産物阻害が野生型酵素に比較して有意に低下したことが判明した。これらの結果から、本発明のＳ１２変異体酵素（Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重変異体）はＣＰＣに対する特異活性が増加すると同時に７−ＡＣＡによる最終産物阻害が低下することが確認された。
【実施例３】
【０１２１】
大腸菌におけるＣＰＣアシラーゼ変異体の生産
＜３−１＞ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターを使用したＣＰＣアシラーゼ変異体の生産
Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子ＴｎＳ及びＴｎＳ５αβと、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体をコードする遺伝子Ｓ１２をｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターに挿入し、夫々ｐＢＣ−ＴｎＳ５、ｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ及びｐＢＣ−Ｓ１２組換えプラスミドを得、得られた各組換えプラスミドで大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換した。
【０１２２】
クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢブロス５０ｍｌ中で各大腸菌形質転換細胞を２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養し、実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、培養液から調製した粗酵素溶液を使用することによりＣＰＣアシラーゼの生産性を測定した。この場合、野生型アシラーゼをコードする遺伝子ａｃｙＩＩ及びｓｅｍを夫々含む組換えプラスミドｐＢＳＥＭ及びｐＢＣＰＣを対照として使用した。その結果、ｐＢＣ−Ｓ１２プラスミドを含む大腸菌形質転換細胞は７１２単位／リットルのレベルの最高のＣＰＣアシラーゼ生産性を示した。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
＜３−２＞ｐＥＴ２９−ａ（＋）ベクターを使用したＣＰＣアシラーゼ変異体の生産
＜３−２−１＞ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドの作製
ｐＥＴ２９−Ｆプライマー（配列番号４０）とｐＥＴ２９−Ｒプライマー（配列番号４１）を夫々使用して組換えプラスミドｐＢＣ−ＴｎＳ５αβ及びｐＢＣ−Ｓ１２をＰＣＲ増幅し、各々２．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、精製キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）で精製し、インサートＤＮＡを得た。更に、ｐＥＴ２９−ａ（＋）ベクターＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国）をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化し、ベクターＤＮＡを得た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を使用してインサートＤＮＡをベクターＤＮＡに１６℃で１６時間連結し、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換した。カナマイシン２０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ寒天プレートにこの大腸菌株を播種し、３０℃インキュベーターで一晩培養し、変異体遺伝子を含む形質転換細胞を選択した。選択した形質転換細胞からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡのヌクレオチド配列を分析し、ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドを得た。
【０１２５】
＜３−２−２＞ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ又はｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドを含む大腸菌形質転換細胞によるＣＰＣアシラーゼ変異体の生産
ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドの各々をエレクトロポレーションにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、夫々ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドを含む組換え大腸菌を作製し、各組換え大腸菌における六重ＣＰＣアシラーゼ変異体の生産性を測定した。これらの組換えプラスミドにおけるＴｎＳ５αβ及びＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子はｐＥＴ２９−ａ（＋）ベクター上に存在するＬａｃＩオペレーターの制御下のＴ７プロモーターの作用により転写された。
【０１２６】
カナマイシン２０μｇ／ｍｌを加えたＬＢブロス３ｍｌにｐＥＴ−ＴｎＳ５αβプラスミドを含む組換え大腸菌を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで１６時間激しく振盪しながら培養した。カナマイシン２０μｇ／ｍｌとラクトース各０、０．０２、０．２及び２％を加えた新鮮なＬＢブロス５０ｍｌに培養液５０μｌを移し、２５℃、２００ｒｐｍで８０時間激しく振盪しながら培養した。この場合、培養時間の経過に従ってＣＰＣアシラーゼ変異体の生産性を測定するために、培養中の２４、３６、４８、７２及び８０時間に培養フラスコから培養ブロス５μｌを採取した。各培養液を４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿を分離し、沈殿を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。沈殿を同一緩衝液５００μｌに懸濁し、４℃で１分間超音波処理し、４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、六重ＣＰＣアシラーゼ変異体の粗酵素溶液として使用可能な上清を分離した。前記粗酵素溶液を使用して実施例＜１−１−２＞に記載したと同一方法に従い、六重ＣＰＣアシラーゼ変異体のＣＰＣに対する活性を測定した。
【０１２７】
ｐＥＴ２９ベクターと大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の発現系で外来遺伝子の高度発現用インデューサーとして一般に使用されているＩＰＴＧは非常に高価であるので、ＩＰＴＧを工業規模の培養に適用するのは難しい。そこで、本発明ではＣＰＣアシラーゼ変異体の大量生産用にＩＰＴＧの代わりに廉価なインデューサーであるラクトース（ＤＩＦＣＯ，米国）を使用した。更に、ｐＥＴ２９ベクターと大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の発現系は初期培養段階でインデューサーを添加せずに規定時間形質転換細胞を培養して増殖させ、規定時点でインデューサーを添加して更に培養することにより外来遺伝子を短時間で高度に発現することが一般に知られている。しかし、ＣＰＣアシラーゼを生産させるための上記誘導発現法では大量の不活性ポリペプチドが副生物として生成したので、本発明では構成的発現を誘導するために初期培養段階にラクトースを添加して大腸菌形質転換細胞を培養した。その結果、２％ラクトースの存在下に培養した場合には、ＣＰＣアシラーゼの生産性は培養時間の経過に従ってインデューサーとしてのラクトースの作用により増加した（表４）。
【０１２８】
更に、培養後４８時間に採取した各種濃度のラクトース（０．０２、０．２及び２％）を含有する３種の培養ブロスから各粗酵素溶液を調製し、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル）により蛋白質の発現パターンを検討した。その結果、２％ラクトースの存在下に培養した場合には大量のＣＰＣアシラーゼ変異体が生産された（図１２）。更に、約８３ｋＤａの分子量に対応する不活性前駆体バンドは出現せず、不活性前駆体形の大半は効率的自己消化により活性形のＣＰＣアシラーゼに変換されることが確認された。
【０１２９】
【表４】
【０１３０】
更に、カナマイシン２０μｇ／ｍｌとラクトース２％を加えたＬＢブロス５０ｍｌを主培養に使用し、大腸菌形質転換細胞を２５℃、２００ｒｐｍで７２時間激しく振盪しながら培養した以外は上記と同一方法に従い、ｐＥＴ２９−Ｓ１２組換えプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換細胞中のＳ１２変異体酵素によるＣＰＣアシラーゼの生産性を測定した。その結果、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（Ｓ１２）の生産性は１．２０７単位／リットルであった。
【０１３１】
本発明のＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｆ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体遺伝子Ｓ１２を含むｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−Ｓ１２と命名し、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って２００３年７月３０日付けでＫｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）（所在地：Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ，３０５−３３３，大韓民国）に受託番号ＫＣＴＣ １０５０３ＢＰで寄託した。
【実施例４】
【０１３２】
ＣＰＣアシラーゼ変異体を使用したＣＰＣから７−ＡＣＡへの１段階変換
カナマイシン２０μｇ／ｍｌとラクトース２％を加えたＬＢブロス５ｍｌ中で実施例＜３−２＞のｐＥＴ２９−ＴｎＳ５αβ及びｐＥＴ２９−Ｓ１２プラスミド各１個を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換細胞を２５℃、２００ｒｐｍで７２時間激しく振盪しながら培養した。更に、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを加えたＬＢブロス１０リットル中で野生型ＣＰＣアシラーゼ遺伝子を含む大腸菌ＭＣ１０６１（ｐＢＣＰＣ）も２５℃、２００ｒｐｍで４８時間激しく振盪しながら培養した。その後、野生型ＣＰＣアシラーゼ、ＴｎＳ５αβ及びＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体を夫々実施例＜２−１＞に記載したと同一方法に従って各培養ブロスから精製した。上記のようにして得られた精製蛋白質を５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）で透析し、透析により得られた透析物をＣＰＣ変換反応に使用した。
【０１３３】
ＣＰＣを終濃度５０ｍＭで５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶かした後、同一緩衝液に溶かした精製酵素溶液を上記のように得られたＣＰＣ溶液に終濃度５単位／ｍｌで添加し、反応混合物５０ｍｌを調製した。反応混合物を２５℃で１時間撹拌し、ＣＰＣ変換反応を誘導した。この場合、反応混合物のｐＨが変換反応中に低下しないようにするために、反応混合物のｐＨが８．４に達したら０．２Ｎ ＮａＯＨ溶液をｐＨ調節器により反応混合物に自動注入し、反応混合物のｐＨを常に８．５に維持した。変換反応中の規定時点から反応混合物１００μｌを採取し、すぐにＨＰＬＣ分析し、反応混合物中のＣＰＣと７−ＡＣＡの量を定量した。ＨＰＬＣ分析では、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ，米国）と、移動相として２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）とアセトニトリルの混合物（９０：１０）を使用した。更に、移動相の流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎとし、注入するサンプル（２０μｌ）は反応混合物を５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）で適宜希釈することにより調製し、その吸光度はＵＶ２５０ｎｍで検出した。
【０１３４】
その結果、野生型ＣＰＣアシラーゼは上記反応条件下で６０％のレベルのＣＰＣ変換率を示したが、本発明のＴｎＳ５αβ及びＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体は夫々８６％と９８％のレベルのＣＰＣ変換率を示した（図１３）。特に、本発明のＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体は高レベルの７−ＡＣＡ収率（９０％以上）でＣＰＣを７−ＡＣＡに効率的に変換した（図１３及び１４）。
【０１３５】
以上、本発明の態様を記載及び例証したが、当然のことながら、本発明の精神から逸脱せずに種々の変更や変形を加えることができ、本発明は特許請求の範囲のみにより制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＣＰＣから７−ＡＣＡを製造するための１段階及び２段階酵素法の反応スキームを示す。
【図２】シュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＣＡＤ−ＧＬ−７−ＡＣＡ複合体の三次構造（Ａ）とその活性部位に隣接する結合残基の一般スキーム（Ｂ）を示す。
【図３】シュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＣＡＤとＧＬ−７−ＡＣＡの結合パターンを示す。
【図４】シュードモナスｓｐ．ＫＡＣ−１に由来するＣＡＤ−ＣＰＣ複合体のモデリングを示す
【図５】本発明のＣＰＣアシラーゼ変異体の作製方法の模式図を示す。
【図６】野生型ＣＰＣアシラーゼ（−●−，Ｓｅｍ）、Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重ＣＰＣアシラーゼ変異体（Ｈ７０）及びＦ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｈ７０βＳ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，ｍＩ１７６）で観察された７−ＡＣＡによる最終産物阻害の比較を示す。
【図７】Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ四重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−◇−，Ｈ７０）、Ｖ１２１αＡ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，＃２１３）、Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−■−，＃１２０）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５）のＣＰＣに対する反応性の比較を示す。
【図８】Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▽−，ｍＦ５８）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−■−）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，ＴｎＳ５αβ）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＣ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▼−）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＭ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５）のＣＰＣに対する反応性の比較を示す。
【図９】Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ四重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▼−，Ｆ１６９）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▽−，＃５９）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−■−，＃７６）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ五重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，ｍＦ５８）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５αβ）のＣＰＣに対する反応性の比較を示す。
【図１０ａ】図１０ａ及び１０ｂはＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▼−，Ｓ１２）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５αβ）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，＃７６）で観察されたＣＰＣに対する反応性（Ａ）と７−ＡＣＡによる最終産物阻害（Ｂ）の比較を示す。
【図１０ｂ】図１０ａ及び１０ｂはＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ７５βＴ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−▼−，Ｓ１２）、Ｖ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ１６９αＹ／Ｍ３１βＬ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−●−，ＴｎＳ５αβ）及びＶ１２１αＡ／Ｇ１３９αＳ／Ｆ５８βＮ／Ｉ１７６βＶ／Ｓ４７１βＣ六重ＣＰＣアシラーゼ変異体（−○−，＃７６）で観察されたＣＰＣに対する反応性（Ａ）と７−ＡＣＡによる最終産物阻害（Ｂ）の比較を示す。
【図１１ａ】図１１ａ〜１１ｃはシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来する野生型ＣＰＣアシラーゼの分子量を示す。１１ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：無細胞抽出物；２：精製酵素）。１１ｂ：非変性ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：精製酵素）。１１ｃ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。
【図１１ｂ】図１１ａ〜１１ｃはシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来する野生型ＣＰＣアシラーゼの分子量を示す。１１ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：無細胞抽出物；２：精製酵素）。１１ｂ：非変性ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：精製酵素）。１１ｃ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。
【図１１ｃ】図１１ａ〜１１ｃはシュードモナスｓｐ．ＳＥ８３に由来する野生型ＣＰＣアシラーゼの分子量を示す。１１ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：無細胞抽出物；２：精製酵素）。１１ｂ：非変性ＰＡＧＥ（Ｍ：サイズマーカー；１：精製酵素）。１１ｃ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。
【図１２】ｐＥＴ２９−ＴｎＳ５プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）培養液から単離した粗酵素のゲル電気泳動とクーマシーブルー染色の結果を示す。Ｍ：標準サイズマーカー；１：０％ラクトース，４８時間培養；２：０．０２％ラクトース，４８時間培養；３：０．２％ラクトース，４８時間培養；４：２％ラクトース，４８時間培養；５：２％ラクトース，７２時間培養。
【図１３】野生型ＣＰＣアシラーゼ、ＴｎＳ５及びＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体で観察されたＣＰＣから７−ＡＣＡへの変換率の比較を示す。
【図１４】本発明のＳ１２ＣＰＣアシラーゼ変異体の作用によりＣＰＣから生産された７−ＡＣＡを測定するためのＨＰＬＣ分析結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のＣＰＣアシラーゼαサブユニットのＶａｌ１２１α、Ｇｌｙ１３９α及びＰｈｅ１６９αならびに配列番号５のＣＰＣアシラーゼβサブユニットのＭｅｔ３１β、Ｐｈｅ５８β、Ｈｉｓ７０β、Ｉｌｅ７５β、Ｉｌｅ１７６β及びＳｅｒ４７１βから構成される群から選択される少なくとも１個のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されていることを特徴とするＣＰＣアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体。
【請求項２】
Ｖａｌ１２１αがアラニンで置換されているか；
Ｇｌｙ１３９αがセリンで置換されているか；
Ｐｈｅ１６９αがチロシンで置換されているか；
Ｍｅｔ３１βがロイシンで置換されているか；
Ｐｈｅ５８βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されているか；
Ｈｉｓ７０βがセリン又はロイシンで置換されているか；
Ｉｌｅ７５βがスレオニンで置換されているか；
Ｉｌｅ１７６βかバリンで置換されているか；または
Ｓｅｒ４７１βがシステインで置換されている、請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項３】
Ｍｅｔ３１βがロイシンで置換されており、Ｐｈｅ５８βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されている、請求項２に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項４】
Ｈｉｓ７０βが更にセリン又はロイシンで置換されている、請求項３に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項５】
Ｐｈｅ１６９αが更にチロシンで置換されている、請求項４に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項６】
Ｉｌｅ１７６βが更にバリンで置換されている、請求項５に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項７】
Ｐｈｅ１６９αが更にチロシンで置換されており、Ｉｌｅ１７６βが更にバリンで置換されている、請求項３に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項８】
Ｖａｌ１２１αが更にアラニンで置換されている、請求項７に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項９】
Ｇｌｙ１３９αが更にセリンで置換されている、請求項７に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１０】
Ｖａｌ１２１αが更にアラニンで置換されており、Ｇｌｙ１３９αが更にセリンで置換されている、請求項７に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１１】
Ｖａｌ１２１αがアラニンで置換されており；Ｇｌｙ１３９αがセリンで置換されており；Ｐｈｅ５８βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されており；Ｉｌｅ１７６βがバリンで置換されている、請求項２に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１２】
Ｐｈｅ１６９αが更にチロシンで置換されている、請求項１１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１３】
Ｉｌｅ７５βが更にスレオニンで置換されている、請求項１１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１４】
Ｓｅｒ４７１βが更にシステインで置換されている、請求項１１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１５】
Ｉｌｅ７５βが更にスレオニンで置換されており、Ｓｅｒ４７１βが更にシステインで置換されている、請求項１１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１６】
配列番号７のＣＰＣアシラーゼαサブユニットと配列番号８のＣＰＣアシラーゼβサブユニットを含むアミノ酸配列をもつ、請求項１５に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１７】
請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体をコードする遺伝子。
【請求項１８】
配列番号６に記載のヌクレオチド配列をもつ、請求項１７に記載の遺伝子。
【請求項１９】
請求項１７に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２０】
ｐＥＴ２９−Ｓ１２である請求項１９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の組換え発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項２２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２９−Ｓ１２）（受託番号：ＫＣＴＣ １０５０３ＢＰ）である、請求項２１に記載の微生物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の微生物を適切な条件下で培養する段階と、培養ブロスからＣＰＣアシラーゼ変異体を回収する段階を含む請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体の作製方法。
【請求項２４】
初期培養段階にインデューサーとしてラクトースを培養ブロスに添加する段階を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１段階酵素法により７−ＡＣＡを製造するための請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体を含有する組成物。
【請求項２６】
式Ｉの化合物を請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体と接触させる段階を含む式ＩＩの化合物：
【化１】
［式中、Ｒはアセトキシ（−ＯＣＯＣＨ３）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、水素（−Ｈ）又はその塩である］の製造方法。
【請求項２７】
ＣＰＣアシラーゼ変異体が請求項２１に記載の微生物の培養ブロスの形態で、請求項２５に記載の組成物で、培養液から精製されたＣＰＣアシラーゼ変異体の遊離形態で、又はＣＰＣアシラーゼ変異体の固定化形態で使用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
式Ｉの化合物とＣＰＣアシラーゼ変異体の接触反応を水溶液中で実施する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
式Ｉの化合物の濃度が１〜５００ｍＭであり、ＣＰＣアシラーゼ変異体の添加量が０．１〜１００Ｕ／ｍｌである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
式Ｉの化合物とＣＰＣアシラーゼ変異体の接触反応をｐＨ７から１０、４から４０℃で０．１から２４時間実施する、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
配列番号４のＣＰＣアシラーゼαサブユニットのＶａｌ１２１α、Ｇｌｙ１３９α及びＰｈｅ１６９αならびに配列番号５のＣＰＣアシラーゼβサブユニットのＭｅｔ３１β、Ｐｈｅ５８β、Ｈｉｓ７０β、Ｉｌｅ７５β、Ｉｌｅ１７６β及びＳｅｒ４７１βから構成される群から選択される少なくとも１個のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されていることを特徴とするＣＰＣアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体。
【請求項２】
Ｖａｌ１２１αがアラニンで置換されているか；
Ｇｌｙ１３９αがセリンで置換されているか；
Ｐｈｅ１６９αがチロシンで置換されているか；
Ｍｅｔ３１βがロイシンで置換されているか；
Ｐｈｅ５８βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されているか；
Ｈｉｓ７０βがセリン又はロイシンで置換されているか；
Ｉｌｅ７５βがスレオニンで置換されているか；
Ｉｌｅ１７６βかバリンで置換されているか；または
Ｓｅｒ４７１βがシステインで置換されている、請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項３】
Ｍｅｔ３１βがロイシンで置換されており、Ｐｈｅ５８βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されている、請求項２に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項４】
Ｈｉｓ７０βが更にセリン又はロイシンで置換されている、請求項３に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項５】
Ｐｈｅ１６９αが更にチロシンで置換されている、請求項４に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項６】
Ｉｌｅ１７６βが更にバリンで置換されている、請求項５に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項７】
Ｐｈｅ１６９αが更にチロシンで置換されており、Ｉｌｅ１７６βが更にバリンで置換されている、請求項３に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項８】
Ｖａｌ１２１αが更にアラニンで置換されている、請求項７に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項９】
Ｇｌｙ１３９αが更にセリンで置換されている、請求項７に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１０】
Ｖａｌ１２１αが更にアラニンで置換されており、Ｇｌｙ１３９αが更にセリンで置換されている、請求項７に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１１】
Ｖａｌ１２１αがアラニンで置換されており；Ｇｌｙ１３９αがセリンで置換されており；Ｐｈｅ５８βがアラニン、メチオニン、ロイシン、バリン、システイン又はアスパラギンで置換されており；Ｉｌｅ１７６βがバリンで置換されている、請求項２に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１２】
Ｐｈｅ１６９αが更にチロシンで置換されている、請求項１１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１３】
Ｉｌｅ７５βが更にスレオニンで置換されている、請求項１１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１４】
Ｓｅｒ４７１βが更にシステインで置換されている、請求項１１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１５】
Ｉｌｅ７５βが更にスレオニンで置換されており、Ｓｅｒ４７１βが更にシステインで置換されている、請求項１１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１６】
配列番号７のＣＰＣアシラーゼαサブユニットと配列番号８のＣＰＣアシラーゼβサブユニットを含むアミノ酸配列をもつ、請求項１５に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体。
【請求項１７】
請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体又はその機能的に等価な誘導体をコードする遺伝子。
【請求項１８】
配列番号６に記載のヌクレオチド配列をもつ、請求項１７に記載の遺伝子。
【請求項１９】
請求項１７に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２０】
ｐＥＴ２９−Ｓ１２である請求項１９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の組換え発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項２２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２９−Ｓ１２）（受託番号：ＫＣＴＣ １０５０３ＢＰ）である、請求項２１に記載の微生物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の微生物を適切な条件下で培養する段階と、培養ブロスからＣＰＣアシラーゼ変異体を回収する段階を含む請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体の作製方法。
【請求項２４】
初期培養段階にインデューサーとしてラクトースを培養ブロスに添加する段階を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１段階酵素法により７−ＡＣＡを製造するための請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体を含有する組成物。
【請求項２６】
式Ｉの化合物を請求項１に記載のＣＰＣアシラーゼ変異体と接触させる段階を含む式ＩＩの化合物：
【化１】
［式中、Ｒはアセトキシ（−ＯＣＯＣＨ３）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、水素（−Ｈ）又はその塩である］の製造方法。
【請求項２７】
ＣＰＣアシラーゼ変異体が請求項２１に記載の微生物の培養ブロスの形態で、請求項２５に記載の組成物で、培養液から精製されたＣＰＣアシラーゼ変異体の遊離形態で、又はＣＰＣアシラーゼ変異体の固定化形態で使用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
式Ｉの化合物とＣＰＣアシラーゼ変異体の接触反応を水溶液中で実施する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
式Ｉの化合物の濃度が１〜５００ｍＭであり、ＣＰＣアシラーゼ変異体の添加量が０．１〜１００Ｕ／ｍｌである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
式Ｉの化合物とＣＰＣアシラーゼ変異体の接触反応をｐＨ７から１０、４から４０℃で０．１から２４時間実施する、請求項２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００７−５０２１０８（Ｐ２００７−５０２１０８Ａ）
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３１２７（Ｐ２００６−５２３１２７）
【出願日】平成１６年８月１０日（２００４．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２００５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４８２１
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（３０５００８０４２）サンド・アクチエンゲゼルシヤフト (54)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１０日（２００４．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２００５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４８２１
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（３０５００８０４２）サンド・アクチエンゲゼルシヤフト (54)
【Ｆターム（参考）】
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