セントロメア局在タンパク質
【課題】セントロメアに局在し、染色体の分裂、すなわち細胞分裂を制御しており、制がん剤のターゲット等として有用な新規タンパク質、その抗体及びそのタンパク質をコードする遺伝子を欠損させた細胞を提供する。
【解決手段】特定の配列で示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｔに結合性を有するタンパク質からなる。
【解決手段】特定の配列で示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｔに結合性を有するタンパク質からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セントロメアに局在し、細胞分裂に関与している新規なタンパク質、その用途、その抗体及びそのタンパク質をコードする遺伝子欠損細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物が生命を維持するためには、全ゲノム情報を包括する構造体である染色体は安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期で染色体の複製と分配が正確に行われる。染色体の複製・分配といった基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体分配機構の解明は、がん化の制御につながると考えられる。
【０００３】
細胞分裂時に両極から伸びた紡錘体が染色体の特殊構造を捕らえて、両極へ染色体を引っぱり、娘細胞へ分配することで染色体分配はおこる。その際、紡錘体が捕らえる染色体の特殊構造はセントロメア（動原体）と呼ばれている。従って、セントロメアは染色体分配に重要な働きを担っている。また、がん細胞のように過剰な分裂を行う細胞では、セントロメアを構成するあるタンパク質が過剰に発現していることが報告されている（非特許文献１）。我々は、がん細胞の増殖制御を目指してセントロメアを構成するタンパク質についての研究を行っており、特にＣＥＮＰ−ＨおよびＣＥＮＰ−Ｉと呼ばれるタンパク質に注目している。ＣＥＮＰ−ＨおよびＣＥＮＰ−Ｉは染色体分配に関わるセントロメア構成タンパク質であり、ＣＥＮＰ−ＨとＣＥＮＰ−Ｉが結合していることは報告されている（非特許文献２）。ただし、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉは、染色体分配において未同定のタンパク質と作用して巨大複合体として機能すると予想された（非特許文献３）。そこで、ＣＥＮＰ−ＨおよびＣＥＮＰ−Ｉと結合するタンパク質を精製して複合体に含まれるタンパク質を解析した結果、新しくＣＥＮＰ−Ｋ，−Ｌ，−Ｍ，−Ｎ，−Ｏ，−Ｐ，−Ｑ，−Ｒ，−Ｓ，−Ｔ，−Ｕと命名したセントロメアタンパク質群が同定された（特許文献１、非特許文献４、非特許文献５）。
【特許文献１】特願２００６−２８０２５５号公報
【非特許文献１】Tomonaga et al., Cancer Res., 63, 3511-3516, 2003
【非特許文献２】Nishihashi et al., Dev. Cell, 2, 463-476, 2002
【非特許文献３】Fukagawa Exp. Cell Res., 296, 21-27, 2004
【非特許文献４】Okada et al., Nature Cell Biol., 8, 446-457, 2006
【非特許文献５】Folts et al., Nature Cell Biol., 8, 458-469, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、セントロメアに局在し、染色体の分裂、すなわち細胞分裂を制御しており、制がん剤のターゲット等として有用な新規タンパク質、その抗体及びそのタンパク質をコードする遺伝子を欠損させた細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、従来のセントロメアタンパク質以外にも、セントロメアに存在し、細胞分裂の制御に関与しているタンパク質があるのではないかとの予測の下に、さらに新たなタンパク質の探索を試みた。その結果、細胞分裂に必須であるＣＥＮＰ−Ｓ及びＣＥＮＰ−Ｔとそれぞれ結合する新たなタンパク質を見出し、当該タンパク質が細胞周期を通じてセントロメアへ局在していることを見出した。また、当該タンパク質のノックアウト細胞を作製したところ、これらのタンパク質が細胞分裂に際し関与していることを見出し、さらにこのタンパク質に対する抗体も見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｔに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１を提供するものである。
また、本発明は、配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｓに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１を提供するものである。
また本発明は、上記タンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１を有効成分とする細胞分裂制御剤を提供するものである。
また本発明は、上記タンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１に対する抗体を提供するものである。
また本発明は、上記タンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１をコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１及びＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１はそれぞれＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓと結合し、細胞分裂に深く関与している。従って、これらのタンパク質は、細胞分裂を増強させる作用を有する。一方、セントロメアタンパク質はがん細胞で発現が強く亢進することが知られており、これらのタンパク質に対する抗体は抗がん剤として有用である。また本発明のタンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損した細胞は、染色体分裂の機能解明およびがん創薬に有用なモデル細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明タンパク質は、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓに結合性を有するタンパク質である。ここで、上記１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列との相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％以上である。
【０００９】
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列は、ニワトリ由来のタンパク質である。しかし、前記の如く１又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓに結合性を有する限り、ヒトを含む哺乳類由来のタンパク質も本発明に含まれることはいうまでもない。
【００１０】
セントロメアに局在するタンパク質の同定は、生化学的手法や遺伝学的手法を用いることで数多く試みられている。しかしながら、存在量の少なさや抽出技術の困難さから、新しくセントロメアタンパク質を同定したという成功例は数少ない。また、既存のセントロメアタンパク質にタグをつけたタンパク質を細胞内で大量発現させて、結合タンパク質を同定する試みが最近さかんに行われている。しかしながら、大量発現することで、そのタンパク質がセントロメア以外の場所に局在し、セントロメアに局在するセントロメアタンパク質同定がうまくいかないなど技術的な問題点が数多くあった。
【００１１】
本発明のタンパク質は、例えばニワトリＤＴ４０細胞を用いて、以下の如くして分離できる。すなわち、ニワトリＤＴ４０細胞内では、相同組み換えが高頻度でおこるために遺伝子改変を効率的に行うことができる。セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ又はＣＥＮＰ−Ｓの発現を１００％タグ付きの融合タンパク質に置き換えた細胞株を樹立した。この細胞株では、タグ付きのＣＥＮＰ−ＴやＣＥＮＰ−Ｓがセントロメア以外に局在してしまうという前記問題点が克服できていた。そこでこれらの細胞株を用いてクロマチン画分を調製し、抗タグ抗体を用いた免疫沈降法によりＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓと結合するタンパク質を同定した。得られたペプチド配列をもとにｃＤＮＡクローニングすることにより、本発明の配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなる２種類のタンパク質が得られる。
【００１２】
得られた本発明タンパク質は、これをＧＦＰ融合タンパク質等の標識タンパク質として細胞内で発現させれば、細胞周期を通じてセントロメアへ局在することが確認できる。
【００１３】
かくして得られた本発明のタンパク質は、アミノ酸配列及び塩基配列が判明したので、前記手段に限定されず、ペプチド合成等により製造することもでき、通常の遺伝子組み換え手段により製造できることは言うまでもない。
【００１４】
本発明タンパク質は、ＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓに結合し、かつセントロメアへ局在する。従って、染色体の分配に必須のタンパク質である。本発明タンパク質が過剰に発現する細胞は、がん化している可能性が高く、本発明タンパク質を検出すればがんの診断が可能である。また、本発明タンパク質又の過剰発現を指標にして、制がん剤の開発が可能である。すなわち、本発明タンパク質又はその遺伝子の過剰発現を抑制する薬剤を探索すれば制がん剤がスクリーニングできる。また、本発明のタンパク質に細胞分裂制御剤としても使用できる。
【００１５】
本発明のタンパク質に対する抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれる。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１６】
本発明の抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明の抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【００１７】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、本発明タンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００１８】
本発明の抗体は、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１に特異的に結合するので、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の免疫学的検出法に使用することができる。当該免疫学的検出手段としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫核酸法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（enzyme-ilnded immunosorbent assay:ELISA）（例えば、sandwich ELISA）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００１９】
また、本発明の抗体はＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１を特異的に結合するので、これらのタンパク質の作用を中和し、細胞分裂抑制剤として有用である。当該細胞分裂抑制剤は、抗がん薬として使用できる。
【００２０】
本発明のノックアウト細胞は、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子の機能を欠損させたものである。本発明において、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１をコードする遺伝子の機能を欠損させたとは、該遺伝子の遺伝子産物であるＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１が正常に産生されないようにしたことをいい、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１自体が産生しない場合、及び一部を欠損するなどして機能を発現し得ないタンパク質を産生する場合が含まれる。
【００２１】
本発明のノックアウト細胞は、例えばＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子領域の一部又は全部を相同組み換え方法によって、染色体上の当該遺伝子を破壊することにより行なわれる。相同組み換えは、他の遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子との間に相同組み換えを行うことにより、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子の領域を細胞から欠失させることにより行うのが好ましい。
【００２２】
本発明のノックアウト細胞の樹立は、具体的には次の如くして行われる。ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１を例にして説明する。
宿主としては例えば、ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を用いることができる。ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１が２ローカス存在する。そこで、２つのノックアウトコンストラクトを作成して順次遺伝子破壊を行う。はじめに、薬剤耐性遺伝子、例えばヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入する。このノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のエキソン１からエキソン２がｈｉｓＤ遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の一つの遺伝子領域が破壊される。１遺伝子座が破壊された細胞へもう一つの薬剤耐性遺伝子、例えばピユーロマイシン耐性遺伝子を含む２つ目のノックアウトコンストラクトを導入して２遺伝子座も完全に破壊する。ノックアウト株の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素で消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写する。検出プローブをラベルしたのちフィルターとハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択する。
【００２３】
かくして得られるノックアウト細胞は、異常な細胞分裂像を示す。従って、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１及びＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１はいずれも細胞分裂に必須であることが判明した。従って、本発明のノックアウト細胞は、がん治療薬のスクリーニングモデル細胞として、また細胞分裂の機構解明に有用である。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
（タンパク質の同定）
ＣＥＮＰ−Ｓ遺伝子ＣＥＮＰ−Ｔ遺伝子のゲノム領域を薬剤耐性遺伝子と置換したニワトリＤＴ４０細胞株（ＣＥＮＰ−ＳおよびＣＥＮＰ−Ｔノックアウト株）へＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＳあるいはＣＥＮＰ−Ｔタンパク質発現遺伝子を導入した。これらの細胞株では、細胞内のＣＥＮＰ−ＳあるいはＣＥＮＰ−Ｔタンパク質の全てがＦＬＡＧタグ融合タンパク質に置き換わっている。
【００２６】
これらの細胞を大量培養して１×１０9個の細胞を集めた。これらの細胞を５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Na phosphate [pH8.0], 0.3M NaCl, 0.1％ NP-40, 5 mM β-mercaptoethanol, complete protease inhibitor [Roche], 20 units/ml DNase I [TAKARA］）中でよく溶かし、超音波破砕後２０，０００×ｇ，４℃の条件で１０分間、遠心分離を行い、上清を得た。その上清に抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジン（Anti-FLAG M2-beads [SIGMA]）を添加して４℃で２時間撹拌した。その後レジンを遠心分離によって回収し、溶解緩衝液を用いて洗浄した。さらに、溶解緩衝液に３ｘＦＬＡＧ ペプチド（ＳＩＧＭＡ）を添加してタンパク質の溶出を行った。溶出されたタンパク質に終濃度２０％（Ｗ／Ｖ）トリクロロ酢酸を添加し、４℃で２時間静置し、遠心分離によって蛋白質を回収した。回収された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、銀染色で検出した。その際、ＣＥＮＰ−Ｓ−ＦＬＡＧおよびＣＥＮＰ−Ｔ−ＦＬＡＧを発現させていない細胞からも上記と同様の実験を行い、コントロールとした。
【００２７】
その結果を図１に示す。コントロールになく、ＦＬＡＧ特異的に検出されるバンド（図１中の*）を切り出して質量分析処理を行うことで各タンパク質の部分アミノ酸配列を決定した。ＣＥＮＰ−Ｓ−ＦＬＡＧ発現細胞より１種類（ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１と命名：配列番号２）およびＣＥＮＰ−Ｔ−ＦＬＡＧ発現細胞より１種類（ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１と命名：配列番号１）のタンパク質が同定された。それぞれのタンパク質情報をＮＣＢＩのタンパク質データベースで検索したところ、いずれも機能未同定のタンパク質として登録されてはいるが、セントロメアへ局在するという報告は全くない。
【００２８】
そこで、得られた部分アミノ酸配列をもとにプローブを調製し、ニワトリ胚由来のｃＤＮＡライブラリーを用いて完全長のｃＤＮＡをクローニングした。
【００２９】
このｃＤＮＡをもとに、ＧＦＰ融合タンパク質としてそれぞれのタンパク質を発現させ、細胞内局在を蛍光顕微鏡にて観察した（図２及び３）。いずれのタンパク質も細胞周期を通じてセントロメアへ局在することが知られているＣＥＮＰ−Ｃとの共局在が観察され、新規のセントロメア局在タンパク質であることが証明された。
【００３０】
実施例２
（ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のノックアウト細胞の作成）
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の遺伝子領域の一部を相同組み換え法によって、薬剤耐性遺伝子と置換して遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
【００３１】
ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１は、細胞増殖に必須である遺伝子のために、この遺伝子を破壊すると細胞が死滅して、細胞を得ることができない。ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１は２アリル存在する。そこで、はじめに１アリルのＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１遺伝子座（図４，１stアリル）のＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１エキソン１からエキソン２をヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）と置き換えることにより破壊した。２遺伝子座の遺伝子破壊に先立ち、テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流にＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のｃＤＮＡをつないだプラスミドをＤＴ４０細胞内に導入してテトラサイクリン非存在下では、本プロモーターからＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１が安定に発現する細胞を構築した。すなわち、この細胞では、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１は、まだ遺伝子破壊されていない１遺伝子座のＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１遺伝子領域からとテトラサイクリンに応答するプロモーターの２カ所から発現している。この細胞へピユーロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入した。このピユーロマイシン耐性遺伝子を含むノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の２アリル目の遺伝子領域（図４、２ndアリル）と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のエキソン１からエキソン２がピユーロマイシン耐性遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のすべての遺伝子領域が破壊される。作成したノックアウト細胞の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＳｐｅＩ＋ＸｈｏＩで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図４で示すｐｒｏｂｅを放射能ラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約８ｋｂにバンドがでる（図５のwild-type）が、１遺伝子座のＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の遺伝子領域が破壊されると、８ｋｂに加えて６ｋｂ（図５の１st）のバンドをしめす。また、１遺伝子座にｃＤＮＡを導入した細胞でも同様のパターンを示す（図５の１st＋ｃＤＮＡ）。２遺伝子座とも破壊されている細胞では、８ｋｂのバンドはでずに、６ｋｂのバンドを示す（図５の２nd＋ｃＤＮＡ）。これが目的のノックアウトクローンの遺伝子座のパターンである。この細胞を＃２−１と呼んでいる。
【００３２】
得られたＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のコンディショナルノックアウト細胞は、テトラサイクリンに応答するプロモーターからのみＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１を発現している。この細胞へテトラサイクリンを終濃度で２マイクログラム／ｍｌ加えることで、このプロモーター活性が失われ、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の遺伝子発現が抑制されることが期待される。そこで、テトラサイクリンの添加後の細胞分裂を観察したところ、異常な細胞分裂像（図６）が多く観察された。また、このノックアウト細胞では、細胞分裂に必須なＣＥＮＰ−Ｈの局在性が著しく失われることも明らかになった（図７）。以上のことから、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１は、細胞分裂に必須なセントロメアタンパク質であることが証明された。
【００３３】
実施例３
（ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１のノックアウト細胞の作成）
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子領域の一部を相同組み換え法によって、薬剤耐性遺伝子と置換して遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
【００３４】
ＤＴ４０細胞は２倍体細胞のため、ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１は２アリル存在する。そこで、はじめに１アリル目のＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１遺伝子座 （図８，１stアリル）のＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１エキソン１からエキソン５をヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）と置き換えることにより破壊した。さらに、ピユーロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏr遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入し２アリル目の遺伝子破壊を試みた。ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１は生存には、必須でなかったため、ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１のすべての遺伝子領域が破壊されたノックアウト細胞を得ることができた。作成したノックアウト細胞の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＥｃｏＲＩで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図８で示すｐｒｏｂｅを放射能ラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約９．４ｋｂにバンドがでる（図９のwild-type）が、１遺伝子座のＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子領域が破壊されると、９．４ｋｂに加えて５．０ｋｂ（図９の１st）のバンドを示す。２遺伝子座とも破壊されている細胞では、９．４ｋｂのバンドはでずに、５．０ｋｂのみのバンドを示す（図９の２nd）。これが目的のノックアウトクローンの遺伝子座のパターンである。この細胞をＤ９−２２−３０と呼んでいる。
【００３５】
得られたＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１のノックアウト細胞は、細胞生育が可能であるが、セントロメア構成タンパク質であるＣＥＮＰ−Ｓの局在が失われていた（図１０）。このことから、ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１がセントロメアで何らかの機能を担っていることが示唆される。
【００３６】
実施例４
（抗ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１抗体および抗ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１抗体の評価）
大腸菌内でＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１およびＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１タンパク質を発現させ、精製したものを抗原とした。常法に従い、ウサギに抗原を注射してポリクローナル抗体を作成した。この抗体は、野生型細胞では、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１およびＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１をそれぞれ特異的に認識するが、それぞれのノックアウト細胞では、その特異性が失われる（図１０）。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１及びＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の銀染色像を示す図である。
【図２】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１−ＧＦＰの細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図３】ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１−ＧＦＰの細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図４】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のノックアウト細胞作成のターゲティングを示す図である。
【図５】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１ノックアウト細胞における遺伝子の発現を示す図である。
【図６】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１ノックアウト細胞の細胞分裂像を示す図である。
【図７】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１ノックアウト細胞の細胞分裂像を示す図である。
【図８】ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１ノックアウト細胞作成のターゲティングを示す図である。
【図９】ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１ノックアウト細胞における遺伝子の発現を示す図である。
【図１０】ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１ノックアウト細胞の細胞分裂像を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セントロメアに局在し、細胞分裂に関与している新規なタンパク質、その用途、その抗体及びそのタンパク質をコードする遺伝子欠損細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物が生命を維持するためには、全ゲノム情報を包括する構造体である染色体は安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期で染色体の複製と分配が正確に行われる。染色体の複製・分配といった基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体分配機構の解明は、がん化の制御につながると考えられる。
【０００３】
細胞分裂時に両極から伸びた紡錘体が染色体の特殊構造を捕らえて、両極へ染色体を引っぱり、娘細胞へ分配することで染色体分配はおこる。その際、紡錘体が捕らえる染色体の特殊構造はセントロメア（動原体）と呼ばれている。従って、セントロメアは染色体分配に重要な働きを担っている。また、がん細胞のように過剰な分裂を行う細胞では、セントロメアを構成するあるタンパク質が過剰に発現していることが報告されている（非特許文献１）。我々は、がん細胞の増殖制御を目指してセントロメアを構成するタンパク質についての研究を行っており、特にＣＥＮＰ−ＨおよびＣＥＮＰ−Ｉと呼ばれるタンパク質に注目している。ＣＥＮＰ−ＨおよびＣＥＮＰ−Ｉは染色体分配に関わるセントロメア構成タンパク質であり、ＣＥＮＰ−ＨとＣＥＮＰ−Ｉが結合していることは報告されている（非特許文献２）。ただし、ＣＥＮＰ−ＨやＣＥＮＰ−Ｉは、染色体分配において未同定のタンパク質と作用して巨大複合体として機能すると予想された（非特許文献３）。そこで、ＣＥＮＰ−ＨおよびＣＥＮＰ−Ｉと結合するタンパク質を精製して複合体に含まれるタンパク質を解析した結果、新しくＣＥＮＰ−Ｋ，−Ｌ，−Ｍ，−Ｎ，−Ｏ，−Ｐ，−Ｑ，−Ｒ，−Ｓ，−Ｔ，−Ｕと命名したセントロメアタンパク質群が同定された（特許文献１、非特許文献４、非特許文献５）。
【特許文献１】特願２００６−２８０２５５号公報
【非特許文献１】Tomonaga et al., Cancer Res., 63, 3511-3516, 2003
【非特許文献２】Nishihashi et al., Dev. Cell, 2, 463-476, 2002
【非特許文献３】Fukagawa Exp. Cell Res., 296, 21-27, 2004
【非特許文献４】Okada et al., Nature Cell Biol., 8, 446-457, 2006
【非特許文献５】Folts et al., Nature Cell Biol., 8, 458-469, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、セントロメアに局在し、染色体の分裂、すなわち細胞分裂を制御しており、制がん剤のターゲット等として有用な新規タンパク質、その抗体及びそのタンパク質をコードする遺伝子を欠損させた細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、従来のセントロメアタンパク質以外にも、セントロメアに存在し、細胞分裂の制御に関与しているタンパク質があるのではないかとの予測の下に、さらに新たなタンパク質の探索を試みた。その結果、細胞分裂に必須であるＣＥＮＰ−Ｓ及びＣＥＮＰ−Ｔとそれぞれ結合する新たなタンパク質を見出し、当該タンパク質が細胞周期を通じてセントロメアへ局在していることを見出した。また、当該タンパク質のノックアウト細胞を作製したところ、これらのタンパク質が細胞分裂に際し関与していることを見出し、さらにこのタンパク質に対する抗体も見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｔに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１を提供するものである。
また、本発明は、配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｓに結合性を有するタンパク質ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１を提供するものである。
また本発明は、上記タンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１を有効成分とする細胞分裂制御剤を提供するものである。
また本発明は、上記タンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１に対する抗体を提供するものである。
また本発明は、上記タンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１をコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１及びＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１はそれぞれＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓと結合し、細胞分裂に深く関与している。従って、これらのタンパク質は、細胞分裂を増強させる作用を有する。一方、セントロメアタンパク質はがん細胞で発現が強く亢進することが知られており、これらのタンパク質に対する抗体は抗がん剤として有用である。また本発明のタンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損した細胞は、染色体分裂の機能解明およびがん創薬に有用なモデル細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明タンパク質は、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓに結合性を有するタンパク質である。ここで、上記１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列との相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％以上である。
【０００９】
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列は、ニワトリ由来のタンパク質である。しかし、前記の如く１又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓに結合性を有する限り、ヒトを含む哺乳類由来のタンパク質も本発明に含まれることはいうまでもない。
【００１０】
セントロメアに局在するタンパク質の同定は、生化学的手法や遺伝学的手法を用いることで数多く試みられている。しかしながら、存在量の少なさや抽出技術の困難さから、新しくセントロメアタンパク質を同定したという成功例は数少ない。また、既存のセントロメアタンパク質にタグをつけたタンパク質を細胞内で大量発現させて、結合タンパク質を同定する試みが最近さかんに行われている。しかしながら、大量発現することで、そのタンパク質がセントロメア以外の場所に局在し、セントロメアに局在するセントロメアタンパク質同定がうまくいかないなど技術的な問題点が数多くあった。
【００１１】
本発明のタンパク質は、例えばニワトリＤＴ４０細胞を用いて、以下の如くして分離できる。すなわち、ニワトリＤＴ４０細胞内では、相同組み換えが高頻度でおこるために遺伝子改変を効率的に行うことができる。セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ−Ｔ又はＣＥＮＰ−Ｓの発現を１００％タグ付きの融合タンパク質に置き換えた細胞株を樹立した。この細胞株では、タグ付きのＣＥＮＰ−ＴやＣＥＮＰ−Ｓがセントロメア以外に局在してしまうという前記問題点が克服できていた。そこでこれらの細胞株を用いてクロマチン画分を調製し、抗タグ抗体を用いた免疫沈降法によりＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓと結合するタンパク質を同定した。得られたペプチド配列をもとにｃＤＮＡクローニングすることにより、本発明の配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなる２種類のタンパク質が得られる。
【００１２】
得られた本発明タンパク質は、これをＧＦＰ融合タンパク質等の標識タンパク質として細胞内で発現させれば、細胞周期を通じてセントロメアへ局在することが確認できる。
【００１３】
かくして得られた本発明のタンパク質は、アミノ酸配列及び塩基配列が判明したので、前記手段に限定されず、ペプチド合成等により製造することもでき、通常の遺伝子組み換え手段により製造できることは言うまでもない。
【００１４】
本発明タンパク質は、ＣＥＮＰ−Ｔ及びＣＥＮＰ−Ｓに結合し、かつセントロメアへ局在する。従って、染色体の分配に必須のタンパク質である。本発明タンパク質が過剰に発現する細胞は、がん化している可能性が高く、本発明タンパク質を検出すればがんの診断が可能である。また、本発明タンパク質又の過剰発現を指標にして、制がん剤の開発が可能である。すなわち、本発明タンパク質又はその遺伝子の過剰発現を抑制する薬剤を探索すれば制がん剤がスクリーニングできる。また、本発明のタンパク質に細胞分裂制御剤としても使用できる。
【００１５】
本発明のタンパク質に対する抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれる。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１６】
本発明の抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明の抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【００１７】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、本発明タンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００１８】
本発明の抗体は、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１に特異的に結合するので、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の免疫学的検出法に使用することができる。当該免疫学的検出手段としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫核酸法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（enzyme-ilnded immunosorbent assay:ELISA）（例えば、sandwich ELISA）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００１９】
また、本発明の抗体はＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１を特異的に結合するので、これらのタンパク質の作用を中和し、細胞分裂抑制剤として有用である。当該細胞分裂抑制剤は、抗がん薬として使用できる。
【００２０】
本発明のノックアウト細胞は、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子の機能を欠損させたものである。本発明において、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１をコードする遺伝子の機能を欠損させたとは、該遺伝子の遺伝子産物であるＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１が正常に産生されないようにしたことをいい、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１自体が産生しない場合、及び一部を欠損するなどして機能を発現し得ないタンパク質を産生する場合が含まれる。
【００２１】
本発明のノックアウト細胞は、例えばＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子領域の一部又は全部を相同組み換え方法によって、染色体上の当該遺伝子を破壊することにより行なわれる。相同組み換えは、他の遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子との間に相同組み換えを行うことにより、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１又はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子の領域を細胞から欠失させることにより行うのが好ましい。
【００２２】
本発明のノックアウト細胞の樹立は、具体的には次の如くして行われる。ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１を例にして説明する。
宿主としては例えば、ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を用いることができる。ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１が２ローカス存在する。そこで、２つのノックアウトコンストラクトを作成して順次遺伝子破壊を行う。はじめに、薬剤耐性遺伝子、例えばヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入する。このノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の遺伝子領域と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のエキソン１からエキソン２がｈｉｓＤ遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の一つの遺伝子領域が破壊される。１遺伝子座が破壊された細胞へもう一つの薬剤耐性遺伝子、例えばピユーロマイシン耐性遺伝子を含む２つ目のノックアウトコンストラクトを導入して２遺伝子座も完全に破壊する。ノックアウト株の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素で消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写する。検出プローブをラベルしたのちフィルターとハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択する。
【００２３】
かくして得られるノックアウト細胞は、異常な細胞分裂像を示す。従って、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１及びＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１はいずれも細胞分裂に必須であることが判明した。従って、本発明のノックアウト細胞は、がん治療薬のスクリーニングモデル細胞として、また細胞分裂の機構解明に有用である。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
（タンパク質の同定）
ＣＥＮＰ−Ｓ遺伝子ＣＥＮＰ−Ｔ遺伝子のゲノム領域を薬剤耐性遺伝子と置換したニワトリＤＴ４０細胞株（ＣＥＮＰ−ＳおよびＣＥＮＰ−Ｔノックアウト株）へＦＬＡＧタグ融合ＣＥＮＰ−ＳあるいはＣＥＮＰ−Ｔタンパク質発現遺伝子を導入した。これらの細胞株では、細胞内のＣＥＮＰ−ＳあるいはＣＥＮＰ−Ｔタンパク質の全てがＦＬＡＧタグ融合タンパク質に置き換わっている。
【００２６】
これらの細胞を大量培養して１×１０9個の細胞を集めた。これらの細胞を５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Na phosphate [pH8.0], 0.3M NaCl, 0.1％ NP-40, 5 mM β-mercaptoethanol, complete protease inhibitor [Roche], 20 units/ml DNase I [TAKARA］）中でよく溶かし、超音波破砕後２０，０００×ｇ，４℃の条件で１０分間、遠心分離を行い、上清を得た。その上清に抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したレジン（Anti-FLAG M2-beads [SIGMA]）を添加して４℃で２時間撹拌した。その後レジンを遠心分離によって回収し、溶解緩衝液を用いて洗浄した。さらに、溶解緩衝液に３ｘＦＬＡＧ ペプチド（ＳＩＧＭＡ）を添加してタンパク質の溶出を行った。溶出されたタンパク質に終濃度２０％（Ｗ／Ｖ）トリクロロ酢酸を添加し、４℃で２時間静置し、遠心分離によって蛋白質を回収した。回収された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、銀染色で検出した。その際、ＣＥＮＰ−Ｓ−ＦＬＡＧおよびＣＥＮＰ−Ｔ−ＦＬＡＧを発現させていない細胞からも上記と同様の実験を行い、コントロールとした。
【００２７】
その結果を図１に示す。コントロールになく、ＦＬＡＧ特異的に検出されるバンド（図１中の*）を切り出して質量分析処理を行うことで各タンパク質の部分アミノ酸配列を決定した。ＣＥＮＰ−Ｓ−ＦＬＡＧ発現細胞より１種類（ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１と命名：配列番号２）およびＣＥＮＰ−Ｔ−ＦＬＡＧ発現細胞より１種類（ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１と命名：配列番号１）のタンパク質が同定された。それぞれのタンパク質情報をＮＣＢＩのタンパク質データベースで検索したところ、いずれも機能未同定のタンパク質として登録されてはいるが、セントロメアへ局在するという報告は全くない。
【００２８】
そこで、得られた部分アミノ酸配列をもとにプローブを調製し、ニワトリ胚由来のｃＤＮＡライブラリーを用いて完全長のｃＤＮＡをクローニングした。
【００２９】
このｃＤＮＡをもとに、ＧＦＰ融合タンパク質としてそれぞれのタンパク質を発現させ、細胞内局在を蛍光顕微鏡にて観察した（図２及び３）。いずれのタンパク質も細胞周期を通じてセントロメアへ局在することが知られているＣＥＮＰ−Ｃとの共局在が観察され、新規のセントロメア局在タンパク質であることが証明された。
【００３０】
実施例２
（ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のノックアウト細胞の作成）
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の遺伝子領域の一部を相同組み換え法によって、薬剤耐性遺伝子と置換して遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
【００３１】
ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１は、細胞増殖に必須である遺伝子のために、この遺伝子を破壊すると細胞が死滅して、細胞を得ることができない。ＤＴ４０細胞は２倍体であるため、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１は２アリル存在する。そこで、はじめに１アリルのＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１遺伝子座（図４，１stアリル）のＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１エキソン１からエキソン２をヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）と置き換えることにより破壊した。２遺伝子座の遺伝子破壊に先立ち、テトラサイクリンに応答するプロモーターの下流にＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のｃＤＮＡをつないだプラスミドをＤＴ４０細胞内に導入してテトラサイクリン非存在下では、本プロモーターからＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１が安定に発現する細胞を構築した。すなわち、この細胞では、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１は、まだ遺伝子破壊されていない１遺伝子座のＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１遺伝子領域からとテトラサイクリンに応答するプロモーターの２カ所から発現している。この細胞へピユーロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入した。このピユーロマイシン耐性遺伝子を含むノックアウトコンストラクトがＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の２アリル目の遺伝子領域（図４、２ndアリル）と相同組み換えを起こすと、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のエキソン１からエキソン２がピユーロマイシン耐性遺伝子と置き換わり、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のすべての遺伝子領域が破壊される。作成したノックアウト細胞の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＳｐｅＩ＋ＸｈｏＩで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図４で示すｐｒｏｂｅを放射能ラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約８ｋｂにバンドがでる（図５のwild-type）が、１遺伝子座のＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の遺伝子領域が破壊されると、８ｋｂに加えて６ｋｂ（図５の１st）のバンドをしめす。また、１遺伝子座にｃＤＮＡを導入した細胞でも同様のパターンを示す（図５の１st＋ｃＤＮＡ）。２遺伝子座とも破壊されている細胞では、８ｋｂのバンドはでずに、６ｋｂのバンドを示す（図５の２nd＋ｃＤＮＡ）。これが目的のノックアウトクローンの遺伝子座のパターンである。この細胞を＃２−１と呼んでいる。
【００３２】
得られたＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のコンディショナルノックアウト細胞は、テトラサイクリンに応答するプロモーターからのみＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１を発現している。この細胞へテトラサイクリンを終濃度で２マイクログラム／ｍｌ加えることで、このプロモーター活性が失われ、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１の遺伝子発現が抑制されることが期待される。そこで、テトラサイクリンの添加後の細胞分裂を観察したところ、異常な細胞分裂像（図６）が多く観察された。また、このノックアウト細胞では、細胞分裂に必須なＣＥＮＰ−Ｈの局在性が著しく失われることも明らかになった（図７）。以上のことから、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１は、細胞分裂に必須なセントロメアタンパク質であることが証明された。
【００３３】
実施例３
（ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１のノックアウト細胞の作成）
ニワトリのＢ細胞由来のＤＴ４０細胞を宿主に用いた。遺伝子破壊はＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子領域の一部を相同組み換え法によって、薬剤耐性遺伝子と置換して遺伝子領域の一部を細胞から欠失させることで行った。
【００３４】
ＤＴ４０細胞は２倍体細胞のため、ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１は２アリル存在する。そこで、はじめに１アリル目のＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１遺伝子座 （図８，１stアリル）のＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１エキソン１からエキソン５をヒスティディノール耐性遺伝子（ｈｉｓＤ遺伝子）と置き換えることにより破壊した。さらに、ピユーロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏr遺伝子）を含むノックアウトコンストラクトを導入し２アリル目の遺伝子破壊を試みた。ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１は生存には、必須でなかったため、ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１のすべての遺伝子領域が破壊されたノックアウト細胞を得ることができた。作成したノックアウト細胞の全ゲノムＤＮＡを抽出して制限酵素ＥｃｏＲＩで消化してゲル電気泳動後、ＤＮＡをフィルターに転写した。フィルターを図８で示すｐｒｏｂｅを放射能ラベルしたのちハイブリダイズして、遺伝子置換を起こしている細胞を選択した。ＤＮＡ置換が起きていないと約９．４ｋｂにバンドがでる（図９のwild-type）が、１遺伝子座のＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の遺伝子領域が破壊されると、９．４ｋｂに加えて５．０ｋｂ（図９の１st）のバンドを示す。２遺伝子座とも破壊されている細胞では、９．４ｋｂのバンドはでずに、５．０ｋｂのみのバンドを示す（図９の２nd）。これが目的のノックアウトクローンの遺伝子座のパターンである。この細胞をＤ９−２２−３０と呼んでいる。
【００３５】
得られたＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１のノックアウト細胞は、細胞生育が可能であるが、セントロメア構成タンパク質であるＣＥＮＰ−Ｓの局在が失われていた（図１０）。このことから、ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１がセントロメアで何らかの機能を担っていることが示唆される。
【００３６】
実施例４
（抗ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１抗体および抗ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１抗体の評価）
大腸菌内でＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１およびＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１タンパク質を発現させ、精製したものを抗原とした。常法に従い、ウサギに抗原を注射してポリクローナル抗体を作成した。この抗体は、野生型細胞では、ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１およびＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１をそれぞれ特異的に認識するが、それぞれのノックアウト細胞では、その特異性が失われる（図１０）。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１及びＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１の銀染色像を示す図である。
【図２】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１−ＧＦＰの細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図３】ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１−ＧＦＰの細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図４】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１のノックアウト細胞作成のターゲティングを示す図である。
【図５】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１ノックアウト細胞における遺伝子の発現を示す図である。
【図６】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１ノックアウト細胞の細胞分裂像を示す図である。
【図７】ＣＥＮＰ−Ｔ−ＩＰ１ノックアウト細胞の細胞分裂像を示す図である。
【図８】ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１ノックアウト細胞作成のターゲティングを示す図である。
【図９】ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１ノックアウト細胞における遺伝子の発現を示す図である。
【図１０】ＣＥＮＰ−Ｓ−ＩＰ１ノックアウト細胞の細胞分裂像を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｔに結合性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｓに結合性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２記載のタンパク質を有効成分とする細胞分裂制御剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項５】
請求項１又は２記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞。
【請求項１】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｔに結合性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるか、あるいは当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セントロメアに局在し、かつＣＥＮＰ−Ｓに結合性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２記載のタンパク質を有効成分とする細胞分裂制御剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項５】
請求項１又は２記載のタンパク質をコードする遺伝子の機能を欠損させた細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−１９６９２３（Ｐ２００９−１９６９２３Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３９５２６（Ｐ２００８−３９５２６）
【出願日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０４２０２４７２）大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 (119)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０４２０２４７２）大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 (119)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]