タンパク質、核酸分子、および微生物の変性、修飾、分解、溶解、および除去のための除染液とその使用
本発明は、混入したタンパク質、核酸、および微生物を、例えば実験室のベンチ、床、機器、および器具などの表面から効率的に破壊し、除去するための界面活性物質、ビタミン、および金属イオンを含む三成分系に関する。タンパク質、核酸、および微生物を除去するためのこれら非腐食性かつ無毒性の溶液を、汚染された表面に噴霧、擦り込み、または浸漬によって塗布することで、タンパク質および核酸分子が破壊・溶解・不活化・除去される。同様に、微生物も高効率的かつ同時に死滅され、すべての遺伝情報が不活化される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくないタンパク質、核酸分子、または微生物により汚染された表面を処理するための除染液に関するものである。本発明はさらに除染液の使用および適する緩衝系に関するものである。
【０００２】
分子生物学の目覚しい発展により、ＤＮＡ分子やタンパク質の検出および増幅に関する新たな方法および技術の重要性が強調されている（非特許文献１）。最新の実施例は、医学的診断、法医学的分析、および生物医学的研究に関する。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明により、単一分子の検出も可能である。この極めて感度の高い、新しい検出法における新たな問題は、実験室、機器、または作業材料の表面が、好ましくない核酸分子、タンパク質、または微生物により汚染されることである。
【０００４】
さらに微生物汚染は、例えば食品加工技術、生産施設、病院、衛生施設、そして一般家庭においても深刻な問題および商業的損失を引き起こす。
【背景技術】
【０００５】
したがって、長い間にすでに多種多様な除染剤が存在し、例えば微生物に対してはホルムアルデヒド、アルコール類、フェノール類、アジ化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウムのような劇薬、あるいは例えば次亜塩素、漂白物質、または鉱酸のような強力な酸化剤を使用してタンパク質を変性させ、核酸を改変する。そうすることによって、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによるニックトランスレーション、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ‐ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、リガーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅、ローリングサークル型増幅、その他多数の増幅法に適合しなくなる。
【０００６】
除染に使用される劇薬および強力な酸化剤は、タンパク質に永続的な修飾および変性をもたらし、二本鎖ＤＮＡを不安定化させ、そうすることによって増幅反応を阻害する。一般的に修飾および酸化損傷は、標的分子のなかでも特に反応性の高い化学基に生じる。
【０００７】
したがって、現在このような劇薬の溶液は、機器、器具、および表面の水洗やすすぎに適用されている。
【０００８】
これらの溶液および方法の主な欠点は、タンパク質、ＤＮＡ、および微生物に対し選択作用しか示さないこと、全核酸を完全には除去しないこと、改変された分子が残存すること、機器、器具、表面、ならびに使用者の皮膚および粘膜に対して適用される化学物質が部分的にしか分解されず、腐食作用を示すことなどである。
【０００９】
これらの方法の効率は、溶液中の薬剤を洗剤のような界面活性化学物質と混合することによって限定的に改善された。劇薬物や、核酸、タンパク質、および微生物の不完全な破壊および除去の問題は依然として残っている。
【００１０】
記載したさまざまな商標のもとですでに利用され市販されている、ＤＮＡおよびタンパク質の混入に対する抗除染液および抗菌剤に関する製品よって、このような溶液に対する商業的関心が強調されるようになった。
【００１１】
現行の従来の除染液および除染方法の欠点は、タンパク質または核酸のような様々な生体分子に対する作用が限定されている、あるいは抗菌作用しか発揮しないことと、腐食性の高い劇薬である可能性および有害な特徴により深刻な健康問題が生じることである。特に微生物の除染については、現在のところ、微生物を死滅または不活化させるものの、そのゲノム、遺伝情報、および染色体外ＤＮＡ分子は不活化も分解もしない溶液しか手に入らない。
【００１２】
生理的濃度（マイクロモル）のビタミンおよび抗酸化剤に二価金属イオンを加えると、核酸分子の鎖に部分的損傷および部分的切断が生じることは周知である（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。これらは、特殊な１例にしか適用され得ない、選択的かつ単発的な結果でしかない。
【００１３】
現代の分子生物学および遺伝技術における最新の知見によれば、遺伝情報単独あるいは１個の遺伝子、その遺伝子断片、および特定のタンパク質であっても、疾患または望まれない、有害な遺伝情報の変化を引き起こすのに十分である。
【００１４】
したがって、表面および機器からタンパク質、核酸、および微生物を効率的かつ同時に、やさしく、害を及ぼさないように除染するための、新しい改善されたプロトコル、薬剤、方法、および溶液が必要である。
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他著（１９８９年）分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．
【非特許文献２】Ｐｏｄｉａｔｒｙ Ｓ．Ｊ．，Ｋａｔｚ Ａ．，Ｗａｎｇ Ｙ．，Ｅｃｋ Ｐ．，Ｋｗｏｎ Ｏ．，Ｌｅｅ Ｊ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｃｏｒｐｓｅ Ｃ，Ｄａｔａ Ａ，Ｄａｔａ ＳＫ および Ｌｅｖｉｎｅ Ｍ．（２００３年）抗酸化物質としてのビタミンＣ：病気の予防におけるその役割の評価。Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔ．１巻，p.１８‐３５
【非特許文献３】Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏ．，Ｖｉｒｏｌａｉｎｅｎ Ｅ．，Ｆａｇｅｒｓｔｅｄｔ Ｋ．Ｖ．（２００３年）抗酸化物質、酸化的損傷および酸素欠乏のストレス：ａ Ｒｅｖｉｅｗ ．Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔａｎｙ ９１巻：p.１７９‐１９４
【非特許文献４】Ｖｅａｌ Ｊ．Ｍ．，Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ｋ．＆Ｒｉｌｌ Ｒ．Ｌ．（１９９１年）フェナントロリン＋銅によるＤＮＡ分裂における還元剤と１，１０−フェナントロリン濃度の影響。Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９巻，Ｎｏ．１２，p.３３８３‐３３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、ここに記載する発明の目的は、先行技術の現時点での制限事項および欠点を克服し、劇薬や酸化を促進する腐食性の薬剤を使用せずに、混入した基質を完全に除染するための新しい方法および溶液を開発することである。
【００１６】
本発明によれば、この目的は、
ａ）少なくとも１種類のビタミンと、
ｂ）少なくとも１種類の金属イオンと、
ｃ）少なくとも１種類の界面活性化合物
による相乗作用を有する混合物を含む除染液によって達成されるものであり、このような混合物のｐＨ値は、ｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
天然の抗酸化物質と金属イオンおよび界面活性剤を適用することにより、予想外の、そして驚くべきことであるが、様々なビタミン、金属イオン、および洗剤を組み合わせると、核酸分子およびタンパク質に極めて迅速かつ大量の鎖切断および改変が起こることが分かった。この驚くべき効果から、これらの物質の遺伝情報およびタンパク質を不活化し、分解することで、微生物を効率的に死滅できるようになる。特に驚くべき、新しい知見は、本発明の三成分系によりｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲で不活化および分解が起こり、実質的に同等の効果が得られることである。比較的穏やかなｐＨの範囲で作業できるため、本発明による溶液は表面の損傷を防ぎ、また、使用者の皮膚に適合している。三成分系を液体で噴霧、擦り込み、または浸漬することによってタンパク質および核酸が変性・溶解・不活化・分解・除去され、それにより微生物も高効率的に死滅される。
【００１８】
本発明の有利な実施形態では、この混合物のｐＨ値の範囲はｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６であることが示される。このようなｐＨの範囲では、本発明による溶液は長期に渡って安定しており、核酸を極めて十分に分解できるようになる。さらに、ｐＨ４〜ｐＨ６の範囲での皮膚適合性は最適である。
【００１９】
特に好適なのは、この混合物がさらに炭酸および琥珀酸誘導体を含む緩衝系を含み、それぞれが好ましくは１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度である有利な実施形態である。本発明によるこの緩衝系と本発明による除染液とを使用すれば、溶解成分、具体的には酸性ビタミンにより酸性の範囲となっているこの溶液のｐＨ値が、例えば中性または弱塩基性の範囲まで増加し得る。溶解金属イオンの沈殿は生じない。
【００２０】
本発明による除染液の好適な実施形態では、本発明による溶液に含まれるビタミンやそのビタミンの塩類または酸性誘導体は、それぞれ水溶性ビタミン群から選択された１つまたは複数の化合物および／またはこれと関連のある塩類であり、好ましくはビタミンＣ、リボフラビン、およびナイアシンのような抗酸化の特性を有する。これらは本溶液の総量と関連して、好ましくは１ ｍＭ〜１０００ ｍＭの濃度、特に１０ ｍＭ〜１００ ｍＭの濃度で使用する。
【００２１】
本発明による除染液のさらに好適な実施形態では、本発明により使用される金属イオンは、元素周期表の４族および／またはＩ族、ＩＩ族、およびＶＩＩＩ族の二価イオンおよび／または三価イオンの金属である。これらの金属は、塩類とその有機および／または無機の酸および塩基と組み合わせて使用される。本発明によれば、ＶＩＩＩ族、特に鉄、コバルト、ニッケル、銅、または亜鉛から選択された１つまたは複数の化合物が好適である。これらの化合物は本溶液の総量と関連して、好ましくは１ ｍＭ〜１００ ｍＭの濃度、特に５ ｍＭ〜１０ ｍＭの濃度で使用する。
【００２２】
本発明による溶液に含まれる界面活性物質は、例えば、陰イオン性、非イオン性、両性、または陽イオン性の不活性の界面活性剤またはその適切な混合物と考えられる。特に、硫酸アルキルエーテル、アルキルスルホン酸塩および／またはアリルスルホン酸塩、硫酸アルキル、両性界面活性剤、ベタイン、アルキルアミドアルキルアミン、アルキル置換アミノ酸、アルキル置換イミノ酸、アシル化アミノ酸、および両性界面活性剤混合物を使用することができる。基本的に、不活性の界面活性剤は、いずれも適している。不活性の意味は、これらの界面活性剤が、相乗作用を有する溶液とその効果を阻害あるいは低減しないことである。本発明によれば、陰イオン性および非イオン性の界面活性剤が好適である。これらは本溶液の総量と関連して、好ましくは０．１ ％〜１０ ％（重量）の濃度、特に０．２ ％〜０．５ ％（重量）の濃度で使用する。
【００２３】
本発明による除染液は、例えば特異的なｐＨ値を規定する、例えばＴｒｉｓ（Ｔｒｉｓ［ヒドロキシメチル］‐アミノメタン）、ＭＥＳ（２［モルフォリノ］エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（２‐［４‐（２‐ヒドロキシエチル）‐１‐ピペラジニル］‐エタンスルホン酸）、および／またはＭＯＰＳ（３‐［Ｎ‐モルフォリノ］プロパンスルホン酸）のような適切な緩衝物質など、一般的な不活性の補助物質および添加物をさらに含んでいると考えられる。この緩衝系は、本溶液の総量と関連して、１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度で使用される。
【００２４】
この新しい三成分系の有効作用は、様々な分離物質が単独では特殊な分解作用を呈さず、また、本発明の範囲外の成分の混合物も有効ではない、あるいは効果が限定されることが証明された通り、より驚くべきものでもある。ビタミン、金属イオン、および界面活性剤の併用、好ましくは適切な混合物の形態でのみ、相乗効果が発揮され、迅速かつ大量に生体分子が分解される。具体的には、妥当かつ好適な濃度を維持することにより、本発明による除染液の有効な活性を確保する。
【発明の効果】
【００２５】
これにより、タンパク質や核酸の混入および微生物を除去するため、基本的に、あらゆる種類の表面を非常にやさしく処理することができる。
【００２６】
一般的に、汚染された表面上に本発明関連溶液を噴霧または擦り込む、あるいは浸責することによって除染が達成される。表面上のタンパク質、核酸、および微生物を完全に変性、改変、分解、溶解、または除去するには、通常、室温または室温よりやや高めの温度時の滞留時間が０．５〜２分であれば十分である。しかし、適用される方法は様々なため異なる課題に適応させることができる。
【００２７】
本発明の別の目的は、表面上のタンパク質、核酸分子、および微生物を浸透、改変、分解、溶解、または除去するのに本発明関連除染液を使用することである。
【００２８】
炭酸および琥珀酸誘導体を含む新しい、有利な緩衝系は、特に本発明の除染液に適している。ｐＨ値がｐＨ２〜ｐＨ８．５の様々な混合物は明るい黄色〜明るいオレンジ色の透明な、長期に渡って安定している溶液であり、図５に示した通り、ｐＨ１．５の強力な鉱酸であるリン酸０．５ Ｍと比較して、ｐＨ４．５〜ｐＨ６の範囲で極めて効率よくＤＮＡ分子を分解する。
【００２９】
本発明による緩衝系の有利な実施形態では、炭酸および琥珀酸誘導体は、それぞれ１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度で提供される。
【００３０】
この緩衝系を含む溶液は、有利には、ｐＨがｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲、特にｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６に調整されると考えられる。これにより、本溶液にさらに溶解される成分が損傷を受けない上に、皮膚に適合する溶液を調製することができる。
【００３１】
したがって、本発明は、
ａ）少なくとも１種類のビタミンと、
ｂ）少なくとも１種類の金属イオンと、
ｃ）少なくとも１種類の界面活性物質
による混合物を含む溶液のｐＨ値を調整する方法にも関するものであり、この場合、本発明による緩衝系により、この混合物はｐＨ値がｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲、特にｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６に調整され得る。
【実施例】
【００３２】
（図１）〜（図５）新しい三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。同一量のＤＮＡプラスミド（ＹＥｐ３５１）を記載の溶液にて２分間処理した。次いで、そのＤＮＡ試料を変性させ、ゲル電気泳動により、アガロースゲル（１％）において一本鎖ＤＮＡ分子を分離した。臭化エチジウムで染色後、記載の写真を撮影した。対照は、減菌水にて処理した正常なプラスミドＤＮＡである。ＤＮＡ鎖に切れ目を導入すると、各ＤＮＡ分子のサイズおよび分子量が減少する。この効果は、対照および分子量マーカーとの比較により、ゲルにおいて確認できる。各試料には、減菌Ｔｒｉｓ緩衝液（１ ｍＭ、ｐＨ８．０）中にＤＮＡ ５ μｌが存在しており、記載の溶液５ μｌにて室温で２分間処理した。続いてその試料を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１２）５ μｌおよびブロモフェノールブルーと混和し、９５℃で５分間変性させた。この変性させた試料を速やかに４℃まで冷却し、同一量のＤＮＡ １ μｇを各レーンに流した。ＤＮＡ分子は、１％アガロースゲルにおいてゲル電気泳動したのち、臭化エチジウムで染色し、写真撮影した。
【００３３】
（図１）ビタミンおよび金属イオンのみと、ビタミン、金属イオン、および界面活性剤を含む三成分系による核酸分解の比較（Ｍ：ＤＮＡラダーマーカー１ ｋｂ、Ｃ：対照：ＤＮＡ＋減菌水５ μｌ、１：５ ｍＭ ＦｅＣｌ３，２：１ ｍＭ ＦＡＤ，３：１ ｍＭ ＦＡＤ＋１ｍＭ ＦｅＣｌ３，４：１００ ｍＭ ＮＡＤ，５：１００ ｍＭ ＮＡＤ＋５ｍＭ ＦｅＣｌ３，６：１００ ｍＭチアミン、７：１００ ｍＭチアミン＋５ ｍＭ ＦｅＣｌ３、８：１００ ｍＭビタミンＣ、９：１００ ｍＭビタミンＣ＋５ ｍＭ ＦｅＣｌ３、１０：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸、１１：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋５ ｍＭ ＦｅＣｌ３、１２：１００ ｍＭアスコルビン酸＋５ ｍＭ ＦｅＣｌ３）。いずれの試料も、０．２ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００および０．２ ％Ｔｗｅｅｎ ２０を含んでいた。
【００３４】
（図２）ビタミンＣ、金属イオン、および界面活性剤を含む混合物による核酸分解に関する試験（Ｌ：ラダー１ Ｋｂ、Ｍ：ＤＮＡマーカーＬａｍｂｄａ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、１：１０ ｍＭビタミンＣ、２：１００ ｍＭビタミンＣ、３：１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、４：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、５：１０ ｍＭ ＺｎＣｌ２、６：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭ ＺｎＣｌ２、７：ＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭ、Ｃ：対照：減菌水５ μｌ）。いずれの試料も、０．２ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００および０．２ ％Ｔｗｅｅｎ ２０を含んでいた。
【００３５】
（図３）アスコルビン酸またはＮａ‐アスコルビン酸含有混合物による核酸分解の比較（Ｍ：ＤＮＡマーカーＬａｍｂｄａ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｃ：対照：減菌水 ５ μｌ、１：ＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭ、２：１００ ｍＭ ＨＡｃ＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３＋０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、３：１００ ｍＭアスコルビン酸＋０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、４：１００ ｍＭアスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＳＯ４＋０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、５：１００ ｍＭアスコルビン酸＋ＺｎＣｌ２＋０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、６：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００，７：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３＋０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐ １００，８：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋ＺｎＣｌ２＋ ０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐ １００）
【００３６】
（図４）鉱酸、アスコルビン酸、またはＮａ‐アスコルビン酸（ｐＨ６〜ｐＨ８．５）含有混合物による核酸分解の比較（Ｍ：ＤＮＡマーカーＬａｍｂｄａ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｃ：対照：ＤＮＡ＋減菌水 ５ μｌ、１：ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦＴＭ（試料１）、２：ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦＴＭ（試料２）、３：ＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭ（試料１）、４：ＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭ（試料２）、５：０．５ Ｍ Ｈ３ＰＯ４、６：０．５ Ｍ ＨＮＯ３、７：１００ ｍＭアスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、８：１０ ｍＭアスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、９：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、１０：９のみにあるようなｐＨ６の混合物。１１：９のみにあるようなｐＨ７．１の混合物１２：９のみにあるようなｐＨ８の混合物１３：９のみにあるようなｐＨ８．５の混合物。試料５〜試料１３は０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００および０．２ ％ Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいた。
【００３７】
（図５）Ｎａ‐アスコルビン酸および琥珀酸を含有する新たな緩衝系の例と鉱酸との比較。基礎混合物は、５０ ｍＭアスコルビン酸、５ ｍＭ ＦｅＣｌ３、０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、およびＴｗｅｅｎ ２０を含む（Ｍ：ＤＮＡマーカーラダー１ｋｂ）、Ｃ：対照：ＤＮＡ＋無菌水５ μｌ、１：ｐＨ１０の混合物、２：ｐＨ９の混合物、３：ｐＨ７の混合物、４：ｐＨ６の混合物、５：ｐＨ４の混合物、６：０．５ Ｍ Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ１．５）、０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、および０．２ ％Ｔｗｅｅｎ２０。（図６）新しい三成分系による処理後に阻止されたＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅（混合物Ａ：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３＋０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、および０．２ ％ Ｔｗｅｅｎ ２０）。本ＤＮＡ試料の様々な量（０．１〜１ ｎｇ）をＰＣＲチューブにおいて凍結乾燥させた。その凍結乾燥させたＤＮＡを含むＰＣＲチューブを記載の溶液にて２０秒間処理した。続いてそのチューブを減菌蒸留水１００ μｌで２回洗浄した。最後に、そのチューブをＰＣＲ反応混合物５０ μｌで充填し、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応混合物には、対照ＤＮＡ（酵母菌ｓｃＩＭＰ２遺伝子）および試験ＤＮＡ（酵母菌ｓｃＰＣＰ１遺伝子）の増幅用プライマー対が含まれていた。対照ＤＮＡ（１ｎｇ）はＰＣＲ反応成功を示す。試験ＤＮＡのバンドは、この遺伝子の正常なＤＮＡ分子が依然として存在していたことを示す。試験ＤＮＡが完全に除去または阻止されている場合は、増幅されたＤＮＡバンドはゲルに存在していないはずである。１％アガロースゲルにおいてゲル電気泳動したのち、ＤＮＡを臭化エチジウムで染色し、写真撮影した。陽性対照として、従来のＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭを使用した。無菌水（Ｈ２Ｏ）を陰性対照とした。
【００３８】
（図７）ＲＮａｓｅＡ酵素の不活化に関して先行技術と新しい三成分系とを比較した試験。同一量のＲＮａｓｅＡ １０ μｇをエッペンドルフチューブで凍結乾燥させた。次いで、各チューブを記載の溶液１ ｍｌで処理し、２０秒間ボルテックスし、最後に室温で５分間インキュベートした。続いて各チューブを減菌水１ ｍｌで２回洗浄した。次いで大腸菌由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡ５ μｇをチューブに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。続いてｔｏｔａｌ ＲＮＡ試料とホルムアミド／ブロムフェノールブルー緩衝液とを混和し、９５℃で５分間変性させた。次いで完全なｔｏｔａｌ ＲＮＡ試料５ μｇをアガロースゲル（１．２％）電気泳動にかけ、分離した。臭化エチジウムで染色後、記載の写真を撮影した。未処理の対照は、正常なｔｏｔａｌ ＲＮＡを示す。活性ＲＮａｓｅＡ存在下では、これらのＲＮＡ分子は分解される。ＲＮａｓｅＡの完全な不活化が成功した場合、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ分子も正常なままである（Ｃ：ｔｏｔａｌ ＲＮＡの対照、１：ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦ（Ａ）、２：ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦ（Ｂ）、３：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３＋０．５ ％ ＳＤＳを有するアスコルビン酸混合物、４：空のレーン、５：水、６：ＲＮａｓｅ Ａ １０ μｇ、７：空のレーン、Ｃ：ｔｏｔａｌ ＲＮＡの対照）。
【００３９】
（図８）新しい三成分系による微生物内のゲノムＤＮＡおよび染色体外遺伝物質の効率的な分解。染色体外プラスミドを有する組換え大腸菌株（ＹＥｐ３５１）をＬＢ ａｍｐ ｍｅｄｉｕｍにおいて一晩増殖させた。大腸菌懸濁液から５ ｕｌ量をリゾチーム溶液５ μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）にて５分間処理し、続いて記載の溶液（１〜５）５ μｌにてさらに５分間インキュベートした。ブロモフェノールブルー試料をゲルのスロットに添加し、ＤＮＡ分子を電気泳動により分離した。三成分系を含む試料５に関してのみ、ＤＮＡ分子が大量に分解されている。減菌水（Ｃ）を有する対照および試料３ならびに試料４では細胞溶解が認められ、そのため染色体外プラスミドＤＮＡが放出され、ゲルへ移動している。試料１および試料２では、可溶化物およびＤＮＡが沈殿しているため、結果的に全ＤＮＡ分子がゲルのスロット底に残っている。（Ｍ：マーカーラダー１ Ｋｂ、Ｃ：Ｈ２Ｏを有する対照、１：７０ ％エタノール、２：０．５ ％ＢａｃｉｌｌｏｚｉｄＴＭ、３：０．５ ％ＳＤＳ、４：０．５ ％Ｎａ‐アジ化物＋０．５ ％ＳＤＳ、５：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭＦｅＣｌ３＋０．５％ＳＤＳ、Ｃ：対照：無菌水５ μｌ
【００４０】
（表１）新しい三成分系の抗菌作用に関する試験。記載の微生物について新たに増殖させた培地を５０ μｌ量中細胞数１０６に調製し、１：１の比率で水、７０ ％エタノール、または三成分系の混合物（１００ ｍＭアスコルビン酸、１０ｍＭＦｅＣｌ３、および０．５ ％ＳＤＳ）５０ μｌと混和した。２分間のインキュベート後、微生物を含む本試料１００ ｕｌを各培地上で平板培養した。２８℃（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）または３７℃（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で１〜３日間のインキュベート後、増殖したコロニー数を測定した。減菌水を有する試験試料では、全ての微生物が生存していた。７０ ％エタノールまたは三成分系を有する試験試料では生きている細胞群体は認められず、このような条件下では全ての微生物が死滅することが示された。
【００４１】
（表２）表面および機器からＤＮＡ分子を除去するための、界面活性物質、ビタミン、および金属イオンを有する溶液の好適な組成を要約する。
【００４２】
図中の略語の説明一覧
ａｍｐ：アンピシリン
ＢａｃｉｌｌｏｚｉｄＴＭ：市販の抗菌溶液
Ｃ：対照
ＤＮａｓｅ‐ＯＦＦＴＭ：市販のＤＮＡ不活化用溶液
ＥｔＢｒ：臭化エチジウム
ＦＡＤ：フラビンアデニンジヌクレオチド
ＨＡｃ：酢酸
Ｍ：分子量マーカー
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦＴＭ：市販のＲＮａｓｅ不活化用溶液
ＲＮａｓｅＡ：リボヌクレアーゼＡ（ウシ膵臓由来）
ＲＴ：室温
ｓｃ：酵母
ｓｃＩＭＰ２：内膜のプロテアーゼ２用の酵母遺伝子
ｓｃＰＣＰ１：チトクロームｃペルオキシターゼ処理用の酵母遺伝子
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＸ：ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（非イオン性界面活性剤）
ＹＥｐ３５１：酵母エピソーム様プラスミド
（表１）新しい三成分系の抗菌作用に関する試験。
【表１】
（表２）表面および機器からＤＮＡ分子を除去するための、界面活性物質、ビタミン、および金属イオンからなる三成分系を含む溶液の好適な組成。
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明は、以下のパートにおいて非制限的な図、例、および表により示される。
【図１】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図２】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図３】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図４】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図５】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図６】新しい三成分系による処理後に阻止されたＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅
【図７】ＲＮａｓｅＡ酵素の不活化に関して先行技術と新たな三成分系とを比較した試験
【図８】新しい三成分系による微生物内のゲノムＤＮＡおよび染色体外遺伝物質の効率的な分解
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくないタンパク質、核酸分子、または微生物により汚染された表面を処理するための除染液に関するものである。本発明はさらに除染液の使用および適する緩衝系に関するものである。
【０００２】
分子生物学の目覚しい発展により、ＤＮＡ分子やタンパク質の検出および増幅に関する新たな方法および技術の重要性が強調されている（非特許文献１）。最新の実施例は、医学的診断、法医学的分析、および生物医学的研究に関する。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明により、単一分子の検出も可能である。この極めて感度の高い、新しい検出法における新たな問題は、実験室、機器、または作業材料の表面が、好ましくない核酸分子、タンパク質、または微生物により汚染されることである。
【０００４】
さらに微生物汚染は、例えば食品加工技術、生産施設、病院、衛生施設、そして一般家庭においても深刻な問題および商業的損失を引き起こす。
【背景技術】
【０００５】
したがって、長い間にすでに多種多様な除染剤が存在し、例えば微生物に対してはホルムアルデヒド、アルコール類、フェノール類、アジ化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウムのような劇薬、あるいは例えば次亜塩素、漂白物質、または鉱酸のような強力な酸化剤を使用してタンパク質を変性させ、核酸を改変する。そうすることによって、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによるニックトランスレーション、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ‐ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、リガーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅、ローリングサークル型増幅、その他多数の増幅法に適合しなくなる。
【０００６】
除染に使用される劇薬および強力な酸化剤は、タンパク質に永続的な修飾および変性をもたらし、二本鎖ＤＮＡを不安定化させ、そうすることによって増幅反応を阻害する。一般的に修飾および酸化損傷は、標的分子のなかでも特に反応性の高い化学基に生じる。
【０００７】
したがって、現在このような劇薬の溶液は、機器、器具、および表面の水洗やすすぎに適用されている。
【０００８】
これらの溶液および方法の主な欠点は、タンパク質、ＤＮＡ、および微生物に対し選択作用しか示さないこと、全核酸を完全には除去しないこと、改変された分子が残存すること、機器、器具、表面、ならびに使用者の皮膚および粘膜に対して適用される化学物質が部分的にしか分解されず、腐食作用を示すことなどである。
【０００９】
これらの方法の効率は、溶液中の薬剤を洗剤のような界面活性化学物質と混合することによって限定的に改善された。劇薬物や、核酸、タンパク質、および微生物の不完全な破壊および除去の問題は依然として残っている。
【００１０】
記載したさまざまな商標のもとですでに利用され市販されている、ＤＮＡおよびタンパク質の混入に対する抗除染液および抗菌剤に関する製品よって、このような溶液に対する商業的関心が強調されるようになった。
【００１１】
現行の従来の除染液および除染方法の欠点は、タンパク質または核酸のような様々な生体分子に対する作用が限定されている、あるいは抗菌作用しか発揮しないことと、腐食性の高い劇薬である可能性および有害な特徴により深刻な健康問題が生じることである。特に微生物の除染については、現在のところ、微生物を死滅または不活化させるものの、そのゲノム、遺伝情報、および染色体外ＤＮＡ分子は不活化も分解もしない溶液しか手に入らない。
【００１２】
生理的濃度（マイクロモル）のビタミンおよび抗酸化剤に二価金属イオンを加えると、核酸分子の鎖に部分的損傷および部分的切断が生じることは周知である（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。これらは、特殊な１例にしか適用され得ない、選択的かつ単発的な結果でしかない。
【００１３】
現代の分子生物学および遺伝技術における最新の知見によれば、遺伝情報単独あるいは１個の遺伝子、その遺伝子断片、および特定のタンパク質であっても、疾患または望まれない、有害な遺伝情報の変化を引き起こすのに十分である。
【００１４】
したがって、表面および機器からタンパク質、核酸、および微生物を効率的かつ同時に、やさしく、害を及ぼさないように除染するための、新しい改善されたプロトコル、薬剤、方法、および溶液が必要である。
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他著（１９８９年）分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．
【非特許文献２】Ｐｏｄｉａｔｒｙ Ｓ．Ｊ．，Ｋａｔｚ Ａ．，Ｗａｎｇ Ｙ．，Ｅｃｋ Ｐ．，Ｋｗｏｎ Ｏ．，Ｌｅｅ Ｊ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｃｏｒｐｓｅ Ｃ，Ｄａｔａ Ａ，Ｄａｔａ ＳＫ および Ｌｅｖｉｎｅ Ｍ．（２００３年）抗酸化物質としてのビタミンＣ：病気の予防におけるその役割の評価。Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔ．１巻，p.１８‐３５
【非特許文献３】Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏ．，Ｖｉｒｏｌａｉｎｅｎ Ｅ．，Ｆａｇｅｒｓｔｅｄｔ Ｋ．Ｖ．（２００３年）抗酸化物質、酸化的損傷および酸素欠乏のストレス：ａ Ｒｅｖｉｅｗ ．Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔａｎｙ ９１巻：p.１７９‐１９４
【非特許文献４】Ｖｅａｌ Ｊ．Ｍ．，Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ｋ．＆Ｒｉｌｌ Ｒ．Ｌ．（１９９１年）フェナントロリン＋銅によるＤＮＡ分裂における還元剤と１，１０−フェナントロリン濃度の影響。Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９巻，Ｎｏ．１２，p.３３８３‐３３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、ここに記載する発明の目的は、先行技術の現時点での制限事項および欠点を克服し、劇薬や酸化を促進する腐食性の薬剤を使用せずに、混入した基質を完全に除染するための新しい方法および溶液を開発することである。
【００１６】
本発明によれば、この目的は、
ａ）少なくとも１種類のビタミンと、
ｂ）少なくとも１種類の金属イオンと、
ｃ）少なくとも１種類の界面活性化合物
による相乗作用を有する混合物を含む除染液によって達成されるものであり、このような混合物のｐＨ値は、ｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
天然の抗酸化物質と金属イオンおよび界面活性剤を適用することにより、予想外の、そして驚くべきことであるが、様々なビタミン、金属イオン、および洗剤を組み合わせると、核酸分子およびタンパク質に極めて迅速かつ大量の鎖切断および改変が起こることが分かった。この驚くべき効果から、これらの物質の遺伝情報およびタンパク質を不活化し、分解することで、微生物を効率的に死滅できるようになる。特に驚くべき、新しい知見は、本発明の三成分系によりｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲で不活化および分解が起こり、実質的に同等の効果が得られることである。比較的穏やかなｐＨの範囲で作業できるため、本発明による溶液は表面の損傷を防ぎ、また、使用者の皮膚に適合している。三成分系を液体で噴霧、擦り込み、または浸漬することによってタンパク質および核酸が変性・溶解・不活化・分解・除去され、それにより微生物も高効率的に死滅される。
【００１８】
本発明の有利な実施形態では、この混合物のｐＨ値の範囲はｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６であることが示される。このようなｐＨの範囲では、本発明による溶液は長期に渡って安定しており、核酸を極めて十分に分解できるようになる。さらに、ｐＨ４〜ｐＨ６の範囲での皮膚適合性は最適である。
【００１９】
特に好適なのは、この混合物がさらに炭酸および琥珀酸誘導体を含む緩衝系を含み、それぞれが好ましくは１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度である有利な実施形態である。本発明によるこの緩衝系と本発明による除染液とを使用すれば、溶解成分、具体的には酸性ビタミンにより酸性の範囲となっているこの溶液のｐＨ値が、例えば中性または弱塩基性の範囲まで増加し得る。溶解金属イオンの沈殿は生じない。
【００２０】
本発明による除染液の好適な実施形態では、本発明による溶液に含まれるビタミンやそのビタミンの塩類または酸性誘導体は、それぞれ水溶性ビタミン群から選択された１つまたは複数の化合物および／またはこれと関連のある塩類であり、好ましくはビタミンＣ、リボフラビン、およびナイアシンのような抗酸化の特性を有する。これらは本溶液の総量と関連して、好ましくは１ ｍＭ〜１０００ ｍＭの濃度、特に１０ ｍＭ〜１００ ｍＭの濃度で使用する。
【００２１】
本発明による除染液のさらに好適な実施形態では、本発明により使用される金属イオンは、元素周期表の４族および／またはＩ族、ＩＩ族、およびＶＩＩＩ族の二価イオンおよび／または三価イオンの金属である。これらの金属は、塩類とその有機および／または無機の酸および塩基と組み合わせて使用される。本発明によれば、ＶＩＩＩ族、特に鉄、コバルト、ニッケル、銅、または亜鉛から選択された１つまたは複数の化合物が好適である。これらの化合物は本溶液の総量と関連して、好ましくは１ ｍＭ〜１００ ｍＭの濃度、特に５ ｍＭ〜１０ ｍＭの濃度で使用する。
【００２２】
本発明による溶液に含まれる界面活性物質は、例えば、陰イオン性、非イオン性、両性、または陽イオン性の不活性の界面活性剤またはその適切な混合物と考えられる。特に、硫酸アルキルエーテル、アルキルスルホン酸塩および／またはアリルスルホン酸塩、硫酸アルキル、両性界面活性剤、ベタイン、アルキルアミドアルキルアミン、アルキル置換アミノ酸、アルキル置換イミノ酸、アシル化アミノ酸、および両性界面活性剤混合物を使用することができる。基本的に、不活性の界面活性剤は、いずれも適している。不活性の意味は、これらの界面活性剤が、相乗作用を有する溶液とその効果を阻害あるいは低減しないことである。本発明によれば、陰イオン性および非イオン性の界面活性剤が好適である。これらは本溶液の総量と関連して、好ましくは０．１ ％〜１０ ％（重量）の濃度、特に０．２ ％〜０．５ ％（重量）の濃度で使用する。
【００２３】
本発明による除染液は、例えば特異的なｐＨ値を規定する、例えばＴｒｉｓ（Ｔｒｉｓ［ヒドロキシメチル］‐アミノメタン）、ＭＥＳ（２［モルフォリノ］エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（２‐［４‐（２‐ヒドロキシエチル）‐１‐ピペラジニル］‐エタンスルホン酸）、および／またはＭＯＰＳ（３‐［Ｎ‐モルフォリノ］プロパンスルホン酸）のような適切な緩衝物質など、一般的な不活性の補助物質および添加物をさらに含んでいると考えられる。この緩衝系は、本溶液の総量と関連して、１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度で使用される。
【００２４】
この新しい三成分系の有効作用は、様々な分離物質が単独では特殊な分解作用を呈さず、また、本発明の範囲外の成分の混合物も有効ではない、あるいは効果が限定されることが証明された通り、より驚くべきものでもある。ビタミン、金属イオン、および界面活性剤の併用、好ましくは適切な混合物の形態でのみ、相乗効果が発揮され、迅速かつ大量に生体分子が分解される。具体的には、妥当かつ好適な濃度を維持することにより、本発明による除染液の有効な活性を確保する。
【発明の効果】
【００２５】
これにより、タンパク質や核酸の混入および微生物を除去するため、基本的に、あらゆる種類の表面を非常にやさしく処理することができる。
【００２６】
一般的に、汚染された表面上に本発明関連溶液を噴霧または擦り込む、あるいは浸責することによって除染が達成される。表面上のタンパク質、核酸、および微生物を完全に変性、改変、分解、溶解、または除去するには、通常、室温または室温よりやや高めの温度時の滞留時間が０．５〜２分であれば十分である。しかし、適用される方法は様々なため異なる課題に適応させることができる。
【００２７】
本発明の別の目的は、表面上のタンパク質、核酸分子、および微生物を浸透、改変、分解、溶解、または除去するのに本発明関連除染液を使用することである。
【００２８】
炭酸および琥珀酸誘導体を含む新しい、有利な緩衝系は、特に本発明の除染液に適している。ｐＨ値がｐＨ２〜ｐＨ８．５の様々な混合物は明るい黄色〜明るいオレンジ色の透明な、長期に渡って安定している溶液であり、図５に示した通り、ｐＨ１．５の強力な鉱酸であるリン酸０．５ Ｍと比較して、ｐＨ４．５〜ｐＨ６の範囲で極めて効率よくＤＮＡ分子を分解する。
【００２９】
本発明による緩衝系の有利な実施形態では、炭酸および琥珀酸誘導体は、それぞれ１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度で提供される。
【００３０】
この緩衝系を含む溶液は、有利には、ｐＨがｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲、特にｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６に調整されると考えられる。これにより、本溶液にさらに溶解される成分が損傷を受けない上に、皮膚に適合する溶液を調製することができる。
【００３１】
したがって、本発明は、
ａ）少なくとも１種類のビタミンと、
ｂ）少なくとも１種類の金属イオンと、
ｃ）少なくとも１種類の界面活性物質
による混合物を含む溶液のｐＨ値を調整する方法にも関するものであり、この場合、本発明による緩衝系により、この混合物はｐＨ値がｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲、特にｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６に調整され得る。
【実施例】
【００３２】
（図１）〜（図５）新しい三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。同一量のＤＮＡプラスミド（ＹＥｐ３５１）を記載の溶液にて２分間処理した。次いで、そのＤＮＡ試料を変性させ、ゲル電気泳動により、アガロースゲル（１％）において一本鎖ＤＮＡ分子を分離した。臭化エチジウムで染色後、記載の写真を撮影した。対照は、減菌水にて処理した正常なプラスミドＤＮＡである。ＤＮＡ鎖に切れ目を導入すると、各ＤＮＡ分子のサイズおよび分子量が減少する。この効果は、対照および分子量マーカーとの比較により、ゲルにおいて確認できる。各試料には、減菌Ｔｒｉｓ緩衝液（１ ｍＭ、ｐＨ８．０）中にＤＮＡ ５ μｌが存在しており、記載の溶液５ μｌにて室温で２分間処理した。続いてその試料を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１２）５ μｌおよびブロモフェノールブルーと混和し、９５℃で５分間変性させた。この変性させた試料を速やかに４℃まで冷却し、同一量のＤＮＡ １ μｇを各レーンに流した。ＤＮＡ分子は、１％アガロースゲルにおいてゲル電気泳動したのち、臭化エチジウムで染色し、写真撮影した。
【００３３】
（図１）ビタミンおよび金属イオンのみと、ビタミン、金属イオン、および界面活性剤を含む三成分系による核酸分解の比較（Ｍ：ＤＮＡラダーマーカー１ ｋｂ、Ｃ：対照：ＤＮＡ＋減菌水５ μｌ、１：５ ｍＭ ＦｅＣｌ３，２：１ ｍＭ ＦＡＤ，３：１ ｍＭ ＦＡＤ＋１ｍＭ ＦｅＣｌ３，４：１００ ｍＭ ＮＡＤ，５：１００ ｍＭ ＮＡＤ＋５ｍＭ ＦｅＣｌ３，６：１００ ｍＭチアミン、７：１００ ｍＭチアミン＋５ ｍＭ ＦｅＣｌ３、８：１００ ｍＭビタミンＣ、９：１００ ｍＭビタミンＣ＋５ ｍＭ ＦｅＣｌ３、１０：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸、１１：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋５ ｍＭ ＦｅＣｌ３、１２：１００ ｍＭアスコルビン酸＋５ ｍＭ ＦｅＣｌ３）。いずれの試料も、０．２ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００および０．２ ％Ｔｗｅｅｎ ２０を含んでいた。
【００３４】
（図２）ビタミンＣ、金属イオン、および界面活性剤を含む混合物による核酸分解に関する試験（Ｌ：ラダー１ Ｋｂ、Ｍ：ＤＮＡマーカーＬａｍｂｄａ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、１：１０ ｍＭビタミンＣ、２：１００ ｍＭビタミンＣ、３：１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、４：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、５：１０ ｍＭ ＺｎＣｌ２、６：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭ ＺｎＣｌ２、７：ＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭ、Ｃ：対照：減菌水５ μｌ）。いずれの試料も、０．２ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００および０．２ ％Ｔｗｅｅｎ ２０を含んでいた。
【００３５】
（図３）アスコルビン酸またはＮａ‐アスコルビン酸含有混合物による核酸分解の比較（Ｍ：ＤＮＡマーカーＬａｍｂｄａ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｃ：対照：減菌水 ５ μｌ、１：ＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭ、２：１００ ｍＭ ＨＡｃ＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３＋０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、３：１００ ｍＭアスコルビン酸＋０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、４：１００ ｍＭアスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＳＯ４＋０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、５：１００ ｍＭアスコルビン酸＋ＺｎＣｌ２＋０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、６：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００，７：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３＋０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐ １００，８：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋ＺｎＣｌ２＋ ０．２ ％ ＴｒｉｔｏｎＸ‐ １００）
【００３６】
（図４）鉱酸、アスコルビン酸、またはＮａ‐アスコルビン酸（ｐＨ６〜ｐＨ８．５）含有混合物による核酸分解の比較（Ｍ：ＤＮＡマーカーＬａｍｂｄａ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｃ：対照：ＤＮＡ＋減菌水 ５ μｌ、１：ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦＴＭ（試料１）、２：ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦＴＭ（試料２）、３：ＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭ（試料１）、４：ＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭ（試料２）、５：０．５ Ｍ Ｈ３ＰＯ４、６：０．５ Ｍ ＨＮＯ３、７：１００ ｍＭアスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、８：１０ ｍＭアスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、９：１００ ｍＭ Ｎａ‐アスコルビン酸＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３、１０：９のみにあるようなｐＨ６の混合物。１１：９のみにあるようなｐＨ７．１の混合物１２：９のみにあるようなｐＨ８の混合物１３：９のみにあるようなｐＨ８．５の混合物。試料５〜試料１３は０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００および０．２ ％ Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいた。
【００３７】
（図５）Ｎａ‐アスコルビン酸および琥珀酸を含有する新たな緩衝系の例と鉱酸との比較。基礎混合物は、５０ ｍＭアスコルビン酸、５ ｍＭ ＦｅＣｌ３、０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、およびＴｗｅｅｎ ２０を含む（Ｍ：ＤＮＡマーカーラダー１ｋｂ）、Ｃ：対照：ＤＮＡ＋無菌水５ μｌ、１：ｐＨ１０の混合物、２：ｐＨ９の混合物、３：ｐＨ７の混合物、４：ｐＨ６の混合物、５：ｐＨ４の混合物、６：０．５ Ｍ Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ１．５）、０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、および０．２ ％Ｔｗｅｅｎ２０。（図６）新しい三成分系による処理後に阻止されたＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅（混合物Ａ：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３＋０．２ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、および０．２ ％ Ｔｗｅｅｎ ２０）。本ＤＮＡ試料の様々な量（０．１〜１ ｎｇ）をＰＣＲチューブにおいて凍結乾燥させた。その凍結乾燥させたＤＮＡを含むＰＣＲチューブを記載の溶液にて２０秒間処理した。続いてそのチューブを減菌蒸留水１００ μｌで２回洗浄した。最後に、そのチューブをＰＣＲ反応混合物５０ μｌで充填し、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応混合物には、対照ＤＮＡ（酵母菌ｓｃＩＭＰ２遺伝子）および試験ＤＮＡ（酵母菌ｓｃＰＣＰ１遺伝子）の増幅用プライマー対が含まれていた。対照ＤＮＡ（１ｎｇ）はＰＣＲ反応成功を示す。試験ＤＮＡのバンドは、この遺伝子の正常なＤＮＡ分子が依然として存在していたことを示す。試験ＤＮＡが完全に除去または阻止されている場合は、増幅されたＤＮＡバンドはゲルに存在していないはずである。１％アガロースゲルにおいてゲル電気泳動したのち、ＤＮＡを臭化エチジウムで染色し、写真撮影した。陽性対照として、従来のＤＮＡ‐ＯＦＦＴＭを使用した。無菌水（Ｈ２Ｏ）を陰性対照とした。
【００３８】
（図７）ＲＮａｓｅＡ酵素の不活化に関して先行技術と新しい三成分系とを比較した試験。同一量のＲＮａｓｅＡ １０ μｇをエッペンドルフチューブで凍結乾燥させた。次いで、各チューブを記載の溶液１ ｍｌで処理し、２０秒間ボルテックスし、最後に室温で５分間インキュベートした。続いて各チューブを減菌水１ ｍｌで２回洗浄した。次いで大腸菌由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡ５ μｇをチューブに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。続いてｔｏｔａｌ ＲＮＡ試料とホルムアミド／ブロムフェノールブルー緩衝液とを混和し、９５℃で５分間変性させた。次いで完全なｔｏｔａｌ ＲＮＡ試料５ μｇをアガロースゲル（１．２％）電気泳動にかけ、分離した。臭化エチジウムで染色後、記載の写真を撮影した。未処理の対照は、正常なｔｏｔａｌ ＲＮＡを示す。活性ＲＮａｓｅＡ存在下では、これらのＲＮＡ分子は分解される。ＲＮａｓｅＡの完全な不活化が成功した場合、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ分子も正常なままである（Ｃ：ｔｏｔａｌ ＲＮＡの対照、１：ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦ（Ａ）、２：ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦ（Ｂ）、３：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭ ＦｅＣｌ３＋０．５ ％ ＳＤＳを有するアスコルビン酸混合物、４：空のレーン、５：水、６：ＲＮａｓｅ Ａ １０ μｇ、７：空のレーン、Ｃ：ｔｏｔａｌ ＲＮＡの対照）。
【００３９】
（図８）新しい三成分系による微生物内のゲノムＤＮＡおよび染色体外遺伝物質の効率的な分解。染色体外プラスミドを有する組換え大腸菌株（ＹＥｐ３５１）をＬＢ ａｍｐ ｍｅｄｉｕｍにおいて一晩増殖させた。大腸菌懸濁液から５ ｕｌ量をリゾチーム溶液５ μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）にて５分間処理し、続いて記載の溶液（１〜５）５ μｌにてさらに５分間インキュベートした。ブロモフェノールブルー試料をゲルのスロットに添加し、ＤＮＡ分子を電気泳動により分離した。三成分系を含む試料５に関してのみ、ＤＮＡ分子が大量に分解されている。減菌水（Ｃ）を有する対照および試料３ならびに試料４では細胞溶解が認められ、そのため染色体外プラスミドＤＮＡが放出され、ゲルへ移動している。試料１および試料２では、可溶化物およびＤＮＡが沈殿しているため、結果的に全ＤＮＡ分子がゲルのスロット底に残っている。（Ｍ：マーカーラダー１ Ｋｂ、Ｃ：Ｈ２Ｏを有する対照、１：７０ ％エタノール、２：０．５ ％ＢａｃｉｌｌｏｚｉｄＴＭ、３：０．５ ％ＳＤＳ、４：０．５ ％Ｎａ‐アジ化物＋０．５ ％ＳＤＳ、５：１００ ｍＭビタミンＣ＋１０ ｍＭＦｅＣｌ３＋０．５％ＳＤＳ、Ｃ：対照：無菌水５ μｌ
【００４０】
（表１）新しい三成分系の抗菌作用に関する試験。記載の微生物について新たに増殖させた培地を５０ μｌ量中細胞数１０６に調製し、１：１の比率で水、７０ ％エタノール、または三成分系の混合物（１００ ｍＭアスコルビン酸、１０ｍＭＦｅＣｌ３、および０．５ ％ＳＤＳ）５０ μｌと混和した。２分間のインキュベート後、微生物を含む本試料１００ ｕｌを各培地上で平板培養した。２８℃（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）または３７℃（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で１〜３日間のインキュベート後、増殖したコロニー数を測定した。減菌水を有する試験試料では、全ての微生物が生存していた。７０ ％エタノールまたは三成分系を有する試験試料では生きている細胞群体は認められず、このような条件下では全ての微生物が死滅することが示された。
【００４１】
（表２）表面および機器からＤＮＡ分子を除去するための、界面活性物質、ビタミン、および金属イオンを有する溶液の好適な組成を要約する。
【００４２】
図中の略語の説明一覧
ａｍｐ：アンピシリン
ＢａｃｉｌｌｏｚｉｄＴＭ：市販の抗菌溶液
Ｃ：対照
ＤＮａｓｅ‐ＯＦＦＴＭ：市販のＤＮＡ不活化用溶液
ＥｔＢｒ：臭化エチジウム
ＦＡＤ：フラビンアデニンジヌクレオチド
ＨＡｃ：酢酸
Ｍ：分子量マーカー
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮａｓｅ‐ＯＦＦＴＭ：市販のＲＮａｓｅ不活化用溶液
ＲＮａｓｅＡ：リボヌクレアーゼＡ（ウシ膵臓由来）
ＲＴ：室温
ｓｃ：酵母
ｓｃＩＭＰ２：内膜のプロテアーゼ２用の酵母遺伝子
ｓｃＰＣＰ１：チトクロームｃペルオキシターゼ処理用の酵母遺伝子
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＸ：ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（非イオン性界面活性剤）
ＹＥｐ３５１：酵母エピソーム様プラスミド
（表１）新しい三成分系の抗菌作用に関する試験。
【表１】
（表２）表面および機器からＤＮＡ分子を除去するための、界面活性物質、ビタミン、および金属イオンからなる三成分系を含む溶液の好適な組成。
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明は、以下のパートにおいて非制限的な図、例、および表により示される。
【図１】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図２】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図３】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図４】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図５】三成分系と先行技術による従来の他の溶液によるＤＮＡ分子の効率的な分解の比較。
【図６】新しい三成分系による処理後に阻止されたＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅
【図７】ＲＮａｓｅＡ酵素の不活化に関して先行技術と新たな三成分系とを比較した試験
【図８】新しい三成分系による微生物内のゲノムＤＮＡおよび染色体外遺伝物質の効率的な分解
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１種類のビタミンと、
ｂ）少なくとも１種類の金属イオンと、
ｃ）少なくとも１種類の界面活性物質
による相乗作用を有する混合物を含んでいて、前記混合物がｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲であることを特徴とする、除染液。
【請求項２】
前記混合物のｐＨ値の範囲がｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６であることを特徴とする、請求項１に記載の除染液。
【請求項３】
前記混合物が炭酸および琥珀酸誘導体を含む緩衝系をさらに含み、それぞれが好ましくは１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の除染液。
【請求項４】
前記ビタミン、このビタミンの塩類、または酸性誘導体が、抗酸化剤の特徴を有する水溶性ビタミン群から選択される少なくとも１種類の化合物であることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項５】
使用される金属イオンが、元素周期表の４族およびＩ族、ＩＩ族、またはＶＩＩＩ族から選択されることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項６】
使用される金属イオンが、それぞれ酸または塩基由来の塩類であることを特徴とする、請求項５に記載の除染液。
【請求項７】
前記界面活性物質が、陰イオン性、非イオン性、両性、または陽イオン性の界面活性剤またはその適切な混合物の群の少なくとも１種類の化合物であることを特徴とする、請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項８】
ａ）による前記ビタミンが、１ ｍＭ〜１０００ ｍＭの濃度で使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項９】
ｂ）による前記金属イオンが、１ ｍＭ〜１００ ｍＭの濃度で使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項１０】
ｃ）による前記界面活性物質が、本溶液の総量と関連して、０．１ ％〜１０ ％（重量）の濃度で使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項１１】
表面上のタンパク質、核酸分子、および微生物を浸透、改変、分解、溶解、または除去するための、請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載の除染液の使用。
【請求項１２】
炭酸および琥珀酸誘導体を含む溶液の前記ｐＨ値を調整するための、緩衝系。
【請求項１３】
前記炭酸および琥珀酸誘導体が、それぞれ１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度で提供されることを特徴とする請求項１２に記載の緩衝系。
【請求項１４】
前記緩衝系により、前記溶液のｐＨ値の範囲がｐＨ２〜ｐＨ８．５、特にｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６に調整されることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の緩衝系。
【請求項１５】
ａ）少なくとも１種類のビタミンと、
ｂ）少なくとも１種類の金属イオンと、
ｃ）少なくとも１種類の界面活性物質
の混合物を含む溶液で、請求項１２または請求項１３に記載の前記緩衝系により、前記混合物のｐＨ値の範囲がｐＨ２〜ｐＨ８．５、特にｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６に調整されることを特徴とする、前記ｐＨ値を調整する方法。
【請求項１】
ａ）少なくとも１種類のビタミンと、
ｂ）少なくとも１種類の金属イオンと、
ｃ）少なくとも１種類の界面活性物質
による相乗作用を有する混合物を含んでいて、前記混合物がｐＨ２〜ｐＨ８．５の範囲であることを特徴とする、除染液。
【請求項２】
前記混合物のｐＨ値の範囲がｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６であることを特徴とする、請求項１に記載の除染液。
【請求項３】
前記混合物が炭酸および琥珀酸誘導体を含む緩衝系をさらに含み、それぞれが好ましくは１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の除染液。
【請求項４】
前記ビタミン、このビタミンの塩類、または酸性誘導体が、抗酸化剤の特徴を有する水溶性ビタミン群から選択される少なくとも１種類の化合物であることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項５】
使用される金属イオンが、元素周期表の４族およびＩ族、ＩＩ族、またはＶＩＩＩ族から選択されることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項６】
使用される金属イオンが、それぞれ酸または塩基由来の塩類であることを特徴とする、請求項５に記載の除染液。
【請求項７】
前記界面活性物質が、陰イオン性、非イオン性、両性、または陽イオン性の界面活性剤またはその適切な混合物の群の少なくとも１種類の化合物であることを特徴とする、請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項８】
ａ）による前記ビタミンが、１ ｍＭ〜１０００ ｍＭの濃度で使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項９】
ｂ）による前記金属イオンが、１ ｍＭ〜１００ ｍＭの濃度で使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項１０】
ｃ）による前記界面活性物質が、本溶液の総量と関連して、０．１ ％〜１０ ％（重量）の濃度で使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の除染液。
【請求項１１】
表面上のタンパク質、核酸分子、および微生物を浸透、改変、分解、溶解、または除去するための、請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載の除染液の使用。
【請求項１２】
炭酸および琥珀酸誘導体を含む溶液の前記ｐＨ値を調整するための、緩衝系。
【請求項１３】
前記炭酸および琥珀酸誘導体が、それぞれ１ ｍＭ〜５００ ｍＭの濃度で提供されることを特徴とする請求項１２に記載の緩衝系。
【請求項１４】
前記緩衝系により、前記溶液のｐＨ値の範囲がｐＨ２〜ｐＨ８．５、特にｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６に調整されることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の緩衝系。
【請求項１５】
ａ）少なくとも１種類のビタミンと、
ｂ）少なくとも１種類の金属イオンと、
ｃ）少なくとも１種類の界面活性物質
の混合物を含む溶液で、請求項１２または請求項１３に記載の前記緩衝系により、前記混合物のｐＨ値の範囲がｐＨ２〜ｐＨ８．５、特にｐＨ３〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６に調整されることを特徴とする、前記ｐＨ値を調整する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５４０３３２（Ｐ２００８−５４０３３２Ａ）
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０８０７５（Ｐ２００８−５０８０７５）
【出願日】平成１８年５月２日（２００６．５．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００６／０００７５８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１６９８３
【国際公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願人】（５０７３３５３９９）マルチバインド バイオテク ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２日（２００６．５．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００６／０００７５８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１６９８３
【国際公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願人】（５０７３３５３９９）マルチバインド バイオテク ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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