タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤
本発明は、タンパク質チロシンホスファターゼを阻害するホスホペプチド、及びこれらの医学的使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファターゼ阻害剤の分野に属する。より詳細には、本発明は、タンパク質チロシンホスファターゼを阻害するホスホペプチド及びホスホペプチド誘導体、並びにこれらの医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどすべての細胞内シグナリングが、タンパク質リン酸化ステップ及び脱リン酸化ステップに支配されている。リン酸化酵素、即ちキナーゼの役割は極めて早くから理解されていたが、それらの対応物であるホスファターゼの積極的役割は、現在、急速に認知度を高めている。
【０００３】
リン酸化／脱リン酸化事象のダイナミックな性質は、細胞をバナジン酸塩などの汎用ホスファターゼ阻害剤で処理した際に、これにより、多数の細胞内標的が大規模かつ急速にリン酸化され、また、これに多面的な生理作用があることで、最も良く理解される。
【０００４】
現在までに、１００に満たない数のＰＴＰが記載されており（１、２）、ヒトゲノム第１ドラフトのスクリーニング（３、４）で、このファミリーのタンパク質をコードする新遺伝子の発見がなかった（Ｉｂｂｅｒｓｏｎら、投稿済み）ので、この数が大幅に増えることもなさそうである。
【０００５】
受容体キナーゼ及びＰＴＰによるシグナリングは複雑である。サイトカイン及び成長因子受容体がリガンド誘発二量体化を通して活性化され、これが受容体キナーゼを活性化するのである。或いは、受容体がＪＡＫなどの細胞内キナーゼを動員し、ＪＡＫが受容体（及び、ＪＡＫ自ら）をリン酸化する。両事象とも、リン酸化カスケードを引き起こす。しかし、受容体ホスホチロシンに結合しこれを遮蔽するＳＯＣＳ（サイトカインシグナル抑制因子）、ＰＩＡＳ（活性型ＳＴＡＴタンパク質阻害因子）、受容体の内部移行及び分解、並びにＰＴＰによる脱リン酸化を含めた、この系路を変調する複数のネガティブフィードバック機構の存在がますます明らかなものになりつつある。ＰＴＰは、可溶性タンパク質として、膜結合型「受容体」ＰＴＰとして、又は小胞体に付随して存在するため、脱リン酸化は、受容体が膜に固着している間でも、又は受容体が再循環過程にある間でも起こりうる。
【０００６】
現在までに、生理的基質と関連付けされていることの知られているＰＴＰはごく少数のみである。しかし、ＰＴＰ１Ｂがインシュリンシグナリング及びレプチンシグナリングの負の変調因子であることが発見されたことによって、薬物標的（５〜７）として、ＰＴＰに対するかなりの関心がかき立てられた。ＰＴＰ１Ｂは、リン酸化されたインシュリン受容体に対して特有の基質特異性を有することが示された（８）。さらに、ＰＴＰ１Ｂは、インシュリン受容体チロシンキナーゼの主要な負の調節因子であることも示されている（９、１０）。
【０００７】
ＰＴＰ１Ｂは、ｃ−ｓｒｃを脱リン酸化及び活性化することができ（６５）、また、卵巣（６６）及び胸部（６５）における癌腫で過剰発現されるので、抗腫瘍標的として想定されている。
【０００８】
別の研究は、ＰＴＰ１Ｂ欠失細胞中で、ＩＧＦ−１（インシュリン様成長因子−１）シグナリングが促進されていることを示した（６８）。インシュリン及びＩＧＦ−１受容体の自己リン酸化ドメインは、ほぼ同一であり、しかも、おそらく両方ともＰＴＰ１Ｂの良い基質であるので、この結果はそれほど驚くべきことではない。ＩＧＦ−１超感受性による影響として観測されたものの１つに、アポトーシスからの防御があったが、これは、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤に、顕著なアポトーシス要素を伴う神経変性疾患における利用価値がありうることを示すものである。
【０００９】
ＰＴＰ１Ｂ、即ちタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（遺伝子名はＰＴＰＮ１又はＰＴＰ１Ｂ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号Ｐ１８０３１）は、４３５アミノ酸及び分子量５０ｋＤを有する細胞内タンパク質であり、複数の組織で発現される。そのＣ末端配列は、ＰＴＰ１Ｂが小胞体膜に結合していることを予測し、これは実験的に確かめられた。
【００１０】
ＰＴＰ１Ｂにインシュリンシグナリングにおける抑制性の役割があることに加えて、Ｊａｋ２がＰＴＰ１Ｂの基質であることも示されている。この基質選択性は、ＰＴＰ１Ｂの遮断によってレプチン受容体を介したシグナリングが増強されることを説明するものであるかもしれない。
【００１１】
ホスファターゼは免疫系においても見いだされている。最も初期に発見されたＰＴＰの１つであるＣＤ４５は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球における抗原受容体シグナリングに不可欠である。従って、このＰＴＰは免疫抑制薬の良い標的と考えられるだろう。Ｓｒｃホモロジードメインを含むＰＴＰであるＳＨＰ１もまた、ＴＣＲシグナリング及びＢ細胞シグナリングに関与するが、ＳＨＰ２ノックアウト表現型（８２〜８４）は、それがはるかに広い役割をもつことを示す。
【００１２】
ＳＨＰ−１（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ２９３５０、遺伝子名はＰＴＰＮ６、ＰＴＰ１Ｃ又はＨＣＰ）は、５９５アミノ酸を有する６７．６ｋＤの細胞質ゾルタンパク質であり、主として造血系由来の細胞で発現される。ＳＨＰ−１は、２つのＮ端ＳＨ２（Ｓｒｃホモロジー２）ドメインと、触媒ドメインと、２つのＣ末端自己調節性チロシンリン酸化部位を含有している。ＳＨＰ−１は、ＢＣＲ、ＴＣＲ、ＥｐｏＲ、ＣＳＦ−１、ｌｙｎ、ｓｙｋ、及びｃ−Ｋｉｔが関与する系路において、通常、負の調節因子であり、その抑制又は遺伝的除去により、免疫応答の増強がもたらされる。
【００１３】
ホスファターゼはさらに、感染症の進展にも関与している。病原菌がそれらの生存率を増大させるためにＰＴＰを利用するという一連の興味深い発見がある。これら細胞内ＰＴＰとＰＴＰ導入性微生物のＰＴＰとが同じ系路を標的にしているかどうかは、全く明らかではないが、これらのＰＴＰは、アプリオリに良い薬物標的と考えられるだろう。最も初期の例は、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）細菌であるが、この細菌は、生体内における病原性に不可欠なＹｏｐＨと呼ばれるＰＴＰをコードする（３５〜３６）。胃潰瘍の原因となる通常の感染性細菌であるヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）は、ＣａｇＡと呼ばれるタンパク質を胃の皮層細胞中に導入し、その細胞上で繁殖する（３７）が、最近、ＣａｇＡがリン酸化に際してＳＨＰ２を活性化することが判明した（３８）。別の例はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）であるが、この細菌は、ＳｐｔＰと呼ばれるＰＴＰをその宿主細胞内に導入することが知られている（３９）。他の細菌（ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））も、ＰＴＰによってそれらの宿主を操作すると考えられている（３５）。
【００１４】
病原菌がＰＴＰを用いることのより間接的な証跡は、リーシュマニア症の治療用に確立された薬剤であるスチボグルコン酸ナトリウムがＳＨＰ１を強く阻害し、また、それに劣る程度においてＳＨＰ２も阻害するという観測から得られる（４０）。従って、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、及び微生物ＰＴＰは、感染症における有効な標的であると考えられる。ＳＨＰ−２（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｑ０６１２４；異名はＰＴＰ−２Ｃ、ＰＴＰ−１Ｄ、ＳＨ−ＰＴＰ３、ＳＨ−ＰＴＰ２；遺伝子名はＰＴＰＮ１１、ＰＴＰ２Ｃ、又はＳＨＰＴＰ２）は、５９３アミノ酸を有する６８ｋＤの細胞質ゾルタンパク質であり、広く発現される。主としてＳＨＰ−２は、ＧＨＲ、レプチンＲ（Ｏｂ）、ＥＧＦＲ、ＩｎｓＲ、ＰＤＧＦＲ、及び、ＮＦ−κＢなどの細胞内活性化因子を含めたサイトカイン受容体のアゴニストである。
【００１５】
血管内皮単層は炎症における重要な役割を果たしている。局所炎症では、Ｌ−セレクチン及びＥ−セレクチンなどのサイトカイン誘発接着性分子がアップレギュレーションされ、また、密着結合の透過性が増強されて（４１）、好中球血管外遊走がこれに続く。アンジオポエチン−１、及びその内皮受容体Ｔｉｅ−２がこの過程にアンタゴナイズすることが最近示された（４２）。また、内皮特異的なＰＴＰ−β（又は、マウスオーソログであるＶＥ−ＰＴＰ）が、Ｔｉｅ−２受容体キナーゼを特異的に脱リン酸化することも示された（４３）。これは、ＰＴＰ−βが好中球及びマクロファージによる血管外遊走の抑制因子として、炎症における薬物標的であることを示唆するだろう。ＰＴＰ−β（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ２３４６７）は、１，９９７アミノ酸を有する２２４ｋＤのＩ型膜タンパク質であり、主として内皮細胞で発現される。
【００１６】
最後に、ＳＡＰ−１（胃癌関連タンパク質チロシンホスファターゼ−１）と呼ばれるチロシンホスファターゼは癌に関与すると言われている（４４）。Ｓａｐ−１（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｑ１５４２６）は、１，１１８アミノ酸を有する１２３ｋＤのＩ型膜タンパク質であり、脳、心臓、及び胃で非常に弱く発現される。
【００１７】
ＳＡＰ−１は、１９９４年に、Ｉ型膜貫通ＰＴＰファミリーの新メンバーとしてクローニングされた（４５）。大きな細胞外ドメインは、８つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ様ドメインからなる。他の多くの受容体ＰＴＰとは異なり、Ｓａｐ−１は、触媒活性を有する単独のチロシンホスファターゼドメインを有し、ＧＬＥＰＰ−１、ＰＴＰ−β、及びＤＥＰ−１に近縁である（４６、４７）。ＳＡＰ−１ ｍＲＮＡは、膵臓でも、又は結腸でも検出できなかったが、膵臓癌及び結腸直腸癌細胞中では、ｍＲＮＡ及びタンパク質が強く発現されていた。Ｓａｐ−１の発現は、生検において免疫組織学的に検査され、その過剰発現が軽度の形成異常を伴うアデノーマから腺癌への進行と相関していることが判明した（４８）。過剰発現による研究は、ｐ１３０ｃａｓがＳＡＰ−１の基質であることを示唆している（４４）。
【００１８】
従って、ホスファターゼは、「ドラッガブルな（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」標的として現れ、これに対する阻害剤が探索されている。そのような阻害剤は、例えば、低分子量化合物阻害剤でもよい。
【００１９】
ホスファターゼに対する多くの低分子量阻害剤が公知である。現在開発中のものの大部分は、（４９）の総説にあるものなど、ＰＴＰ１Ｂに特異的なものである。
【００２０】
ホスファターゼ阻害剤は、ペプチド阻害剤、又はそのようなペプチド阻害剤のミメティックであってもよい。ＰＴＰ１Ｂを阻害するペプチドミメティックの例は、（５０）に記載のホスホチロシルミメティック、例えば、（ジフルオロホスホノメチル）フェニルアラニン（Ｆ２Ｐｍｐ）など、公知である。ホスホチロシンミメティックの別の例は、例えば、（５１）に記載されているものなどの（ジフルオロナフチルメチル）ホスホン酸である。
【００２１】
ホスファターゼに対するペプチド阻害剤を同定するためのアプローチは、Ｆｌｉｎｔら（１２）によって開発された。彼らのストラテジーは、基質とまだ相互作用はできるが、解離することができない触媒不活性変異体を使用するものである。これらの変異体は「捕捉変異体」と呼ばれた。捕捉変異体及びバナジン酸塩で処理された細胞からの基質を用いて、細胞が分析された（１３、１４）。ホスファターゼＹｏｐＨ及びＰＴＰαに関する生化学的アプローチを用いて、２つのグループが、これらのＰＴＰによる異なったペプチドに対する選択性を明らかにし（１５、１６）、再度、触媒ドメインの特異性を明らかにした。
【００２２】
薬理学的標的であるＰＴＰ１Ｂの認識部位を模擬したランダムペプチドライブラリー（１７）又は化学物質（１８）のアッセイは、リン酸化チロシンからの位置−２及び−３における酸性残基、並びに位置−１における芳香族基を好む選択性を実証した。さらに最近では、１つのグループが、異なった短ペプチド配列に対するＰＴＰ１Ｂの親和性をテストするために、リバースアラニンスキャンを行い（１９）、Ａｓａｎｔｅ−Ａｐｐｉａｈら（２０）は、システイン以外のすべてのアミノ酸で位置をひとつずつ変えた合成ペプチドライブラリーでＴＣ−ＰＴＰをテストした。
【００２３】
Ｗａｎｇ Ｐｅｎｇら（６８）は、コンビナトリアルライブラリーを質量分析でスクリーニングし、タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ−１の最適な基質を同定した。このアプローチは、ＳＨＰ−１が−２の位置で酸性残基を好み、そのうちアスパラギン酸の方がわずかにグルタミン酸より好まれることを明らかにした。−１の位置において、ＳＨＰ−１は酸性残基も好むが、他の様々なアミノ酸も許容される。Ｗａｎｇ Ｐｅｎｇらが生成したＳＨＰ−１阻害剤の１つに、配列ＲＮＮＥＦｐＹＡ−ＮＨ２があったが、このペプチドは「クラス３」として、即ち、ＳＨＰ−１の最も好ましくない基質として分類された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、５つの異なったタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、即ち、Ｓａｐ−１、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−β、ＳＨＰ１、及びＳＨＰ２の「理想的な」基質として機能する合成ホスホペプチドの同定に基づいている。これらのホスホペプチドは、例えば、前述のＰＴＰに対して特異的であり、それらの阻害剤として有用である。
【００２５】
これらのＰＴＰは様々な病理学的状態の発達に関与するので、本発明のペプチド阻害剤は、これらの疾患を治療又は予防するための新規アプローチを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ＰＴＰ捕捉変異体、ファージディスプレイ、及びＳＰＯＴなどの公知の技術を用いて、５つの異なったタンパク質チロシンホスファターゼ、即ち、Ｓａｐ１、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−β、ＳＨＰ１、及びＳＨＰ２の「理想的な」基質を同定した。
【００２７】
従って本発明は、これらのタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の特異的阻害剤として用いることのできる新規合成ホスホペプチドに関する。
【００２８】
本明細書において、「ホスホペプチド」という用語は、ホスホペプチドだけではなく、ホスホペプチドの誘導体、塩、及び、ペプチドミメティックにせよ非ペプチド性ミメティックにせよ、ミメティックを包含するものである。
【００２９】
第１の態様では、本発明は、ホスホペプチドであって、
−２：Ｅ、Ｌ、又はＶ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＩ又はＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ｇ、
＋２：Ａ、Ｔ、又はＳ、
＋３：疎水性アミノ酸、又はフェノールアミノ酸、特にＦ又はＹ、
＋４：Ａ又はＧ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基である、ホスホペプチドに関する。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、Ｓａｐ−１特異的阻害剤として用いることができる。
【００３０】
チロシン残基は、通常、「Ｙ」又はＴｙｒとして短縮表記されるが、本出願を通して、リン酸化されたチロシン残基は、このチロシン残基がリン酸化されていることを明らかにするために、「Ｚ」として標識される場合があることに留意するべきである。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドは、
ＥＬＹＧＳＹＹＡ（配列番号１）、
ＥＦＹＧＡＦＡ（配列番号２）、
ＥＦＹＧＡＦＧ（配列番号３）、及び
ＡＥＧＥＬＹＧＳＬＹＡ（配列番号４）
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。
【００３２】
いかなる疑問も避けるために述べると、本明細書に示されるすべてのペプチド配列に関して、左側がペプチドのＮ端側に対応し、また、右側がペプチドの最もＣ末端側に対応している。同様に、所与のペプチドの最初に言及されるアミノ酸はそのペプチドのＮ末端アミノ酸に対応し、ペプチドの最後に言及されるアミノ酸はそのペプチドのＣ末端アミノ酸に対応している。本発明のペプチドは、本明細書に示された配列を含むものであり、従って、本明細書に示されたペプチド配列のＮ末端アミノ酸は、このペプチド自体のＮ末端である必要はなく、また、本明細書に示された配列のＣ末端アミノ酸も、このペプチド自体のＣ末端である必要はないことを理解するべきである。
【００３３】
本発明の別の態様は、ホスホペプチドであって、
−２：Ｅ又はＰ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＦ、
０：Ｙ、
＋１：Ｇ又はＡ、
＋２：Ｔ、
＋３：疎水性アミノ酸、特にＹ、Ｆ、Ｉ、又はＬ、
＋４：Ｇ又はＡ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基である、ホスホペプチドに関する。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤として用いることができる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドは、
ＥＦＹＡＴＹＧ（配列番号５）、
ＥＦＹＧＴＹＧ（配列番号６）、
ＥＦＹＡＴＹＡ（配列番号７）、及び
ＥＦＹＧＴＹＡ（配列番号８）
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明のさらに別の態様では、このホスホペプチドは、
−３：酸性アミノ酸、特にＥ又はＤ、
−２：Ｌ又はＥ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ａ又はＧ、
＋２：Ｓ、
＋３：Ｙ、Ｌ、又は酸性アミノ酸、
＋４：フェノールアミノ酸、特にＹ又はＦ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、数字はペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹはリン酸化されたチロシン残基である。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、ＰＴＰ−β阻害剤として用いることができる。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドはアミノ酸配列ＥＬＬＹＧＳＹＹ（配列番号９）を含む。
【００３７】
本発明のさらに別の態様では、このホスホペプチドは、
−２：Ｅ又はＰ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＦ、Ｙ、又はＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ａ、
＋２：Ｅ、Ｑ、又はＨ、
＋３：疎水性アミノ酸、特にＶ、又はＩ、
＋４：Ｇ、
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、数字はペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹはリン酸化されたチロシン残基である。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、ＳＨＰ１阻害剤として用いることができる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドは、アミノ酸配列ＥＦＹＡＥＶＧ（配列番号１０）を含む。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、ホスホペプチドであって、
−２：Ｅ又はＦ、
−１：疎水性アミノ酸、特にフェノールアミノ酸、特にＦ、
０：Ｙ、
＋１：Ａ、
＋２：Ｅ、
＋３：Ｖ又はＩ、
＋４：Ｇ、
＋５：Ｒ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基である、ホスホペプチドに関する。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、ＳＨＰ−２阻害剤として用いることができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドは、アミノ酸配列ＥＦＹＡＥＶＧＲ（配列番号１１）を含む。
【００４１】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明のホスホペプチドは、５０個若しくは約５０個未満のアミノ酸、又は３０個若しくは約３０個未満のアミノ酸、又は２０個若しくは約２０個未満のアミノ酸、又は１５個若しくは約１５個未満のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、又は約９個のアミノ酸、又は約８個のアミノ酸、又は約７個のアミノ酸を含む。
【００４２】
本発明は、
ａ） １つ又は複数のアミノ酸残基が添加、除去、又は置換されている、本発明のどのペプチドの活性変異体も、
ｂ） （ａ）の活性画分、前駆体、塩、又は誘導体も、
ｃ） 本発明のペプチドの配列又は構造に基づいて設計されたペプチド性若しくは非ペプチド性ミメティック、又はそのフラグメントも含む。
【００４３】
本発明で定義されたポリペプチド若しくはペプチドの活性変異体、又はこれらをコードする核酸には、置換ペプチド又は置換ポリペプチドとして実質上対応する配列の有限集合が含まれ、これらは、当業者であるならば、過度の実験をせずに、実施例で提示された教示と機能的特徴に基づいて日常的に入手できるものである。
【００４４】
本発明によると、これらの活性変異体における好ましい変異は、「保存的」又は「安全な」置換として周知のものである。保存的アミノ酸置換は、分子の構造及び生物学的機能を保存するために、十分に類似した化学的特性を有するアミノ酸による置換である。ホスホペプチド又はその誘導体における「共通配列」の外側では、特に挿入又は欠失がいくつかのアミノ酸、例えば、３０個未満、そして好ましくは１０個未満のアミノ酸のみに関与し、かつ、例えばシステイン残基など、（ポリ）ペプチドの機能的立体配座に極めて重要なアミノ酸を削除又は置換除去しない場合、それらの機能を変化させることなく、残りの配列中にアミノ酸の挿入及び欠失を生成することができる。
【００４５】
文献は、自然なポリペプチドの配列及び／又は構造に関する統計的研究及び物理化学研究を基礎にした多くのモデルを提供しており、これらに基づいて、保存的アミノ酸置換の選択を行うことができる（５２、５３）。プロテインデザイン実験は、特定のアミノ酸サブセットの使用により、折り畳み可能な活性タンパク質を生成できることを示しており、タンパク質構造中により容易に収容でき、かつ機能的ホモローグ及び構造的ホモローグ、並びにパラローグを検出するのに使用できるアミノ酸置換を分類するのに役立っている（５４）。これらの同義アミノ酸グループ、及びより好ましい同義アミノ酸グループは表１に定義するものが好ましい。
【表１】
これらの教示に基づいて行われた置換によって生成した活性変異体も、１つ又は複数のアミノ酸が除去又は付加された活性変異体も同様に、本発明の対象、即ち、本発明のペプチドと同じ生物活性か、又はもし可能なら改善さえされている生物活性を有する新規ペプチドのうちに数えられる。
【００４６】
本明細書において、塩とは、ＰＴＰ阻害性ペプチド又はそのアナローグにおけるカルボキシル基塩、及びアミノ基の酸添加塩の両方をいう。カルボキシル基塩は当技術分野で公知の方法で形成できるが、これらには、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩、又は亜鉛塩などの無機塩と、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン若しくはリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンによって形成された塩など、有機塩基による塩とが含まれる。酸添加塩には、例えば、無機酸、例えば、塩酸又は硫酸などによる塩と、有機酸、例えば、酢酸又は蓚酸などによる塩とが含まれる。当然ながら、そのような塩のどれも、本発明のＰＴＰ結合活性又は阻害活性の生物活性を保持していなければならない。
【００４７】
ほとんどのホスファターゼは、細胞内でそれらの活性を作用させるので、本発明のホスホペプチドは、細胞膜を通して細胞質に送達するのが望ましい。これは、選択された送達の経路及び方法によって、例えば、リポソームを用いることによって実現できる。細胞内送達を実現するためには、他に、脂質二重層を通した移行、又は、チャンネルタンパク質、受容体などの膜タンパク質を通した移行を媒介する特有の部分を、ペプチドに結合させることもできる。
【００４８】
従って、さらに別の好ましい実施形態では、本発明のホスホペプチドは、細胞貫通ペプチドに連結される。
【００４９】
細胞貫通ペプチドは当技術分野で公知である。それらは、例えば、ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、ホメオドメイン由来若しくはＨＩＶ ｔａｔタンパク質由来のもの、又は膜移行配列を含むシグナル配列ベースのものなど、タンパク質由来のものでもよい。細胞貫通ペプチドはさらに、トランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）のように、合成及び／又はキメラであってもよい。細胞貫通ペプチドの例、及び細胞貫通の可能な機構については、例えば、（５５）又は（５６）に総説がある。
【００５０】
本発明の化合物の細胞貫通を増進又は促進するためには、他に、親油性特性を導入することもできる。さらに、自然に細胞膜を横切って輸送される分子であって、これらの化合物が細胞膜を横切って細胞質中に進入するのを容易にするか、又はこれらの化合物の浸透性を促進する分子で、これらの化合物を化学的に修飾、誘導体化、結合、又は複合体化することもできる。これらの膜ブレンド剤の例には、融合誘導ポリペプチド、イオンチャンネル形成ポリペプチド、他の膜ポリペプチド、及び、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸などの長鎖脂肪酸がある（米国特許第５，１４９，７８２号）。これらの膜ブレンド剤は、分子結合体を細胞膜の脂質二重層に挿入して、それらの細胞質への進入を容易にする。分子を膜貫通送達するための他の有益な方法では、受容体介在性のエンドサイトーシス活性の機構を利用する。これらの受容体システムには、ガラクトース、マンノース、マンノース６−リン酸、トランスフェリン、アシアログリコプロテイン、トランスコバラミン（ビタミンＢ１２）、インシュリン、及び他のペプチド成長因子、例えば、表皮成長因子（ＥＧＦ）などを認識するものが含まれる。ビオチン受容体及び葉酸受容体などの栄養物受容体も、細胞膜を横切った輸送を促進するのに有利に用いることができるが、これは、ほとんどの細胞の細胞膜表面におけるビオチン受容体及び葉酸受容体の位置及び多重性、並びに付随する受容体介在性の膜貫通輸送過程によるものである（米国特許第５１０８９２１号）。従って、細胞質中に送達するべき化合物と、ビオチン又は葉酸などのリガンドとの間で形成された複合体は、ビオチン受容体又は葉酸受容体を有する細胞膜と接触させることによって、受容体介在性膜貫通輸送機構を開始させることができ、それによって所望の化合物の細胞内への進入が可能となる。
【００５１】
本発明の化合物を改変して、脳血液関門における透過性を改善することも有用であろう。ペプチドを改変して、脂溶性を高めるか（例えば、コレステリルなどの大きな親油性部分とエステル化することによって）、又は、関門の脳側での保持を促進する、切断可能な「ターゲッティング」部分を供給することができる（５７）。或いは、ペプチドをトランスフェリン受容体に特異的な抗体に連結して、この受容体がもつ、血液脳関門を通して鉄を輸送する役割を利用することもできる（５８）。血行性薬物送達分野におけるバイオミメテック輸送及び合理的薬物送達の他の方法は、当技術分野で公知である（５９）。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のホスホペプチドの配列及び／又は構造に基づいて設計されたペプチド性ミメティック（ペプチドミメティックとも呼ばれる）、又は非ペプチド性ミメティックを提供する。そのようなペプチドミメティックは、Ｙをリン酸化されたチロシン残基とするところの、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではないことが好ましい。
【００５３】
このミメティックでは、ペプチド又はポリペプチドの性質が、アミノ酸側鎖、アミノ酸キラリティー、及び／又はペプチドバックボーンのレベルで化学的に改変されている。これらの改変は、同程度か、又は改善された治療特性、診断特性及び／又は薬物動態特性を有するＰＴＰ結合性化合物及びＰＴＰ阻害性化合物を提供することを意図したものである。
【００５４】
例えば、対象への注射後に、ペプチドがペプチダーゼで切断されやすいことが問題であるとき、特に感受性が高いペプチド結合を切断可能でないペプチドミメティックで置換することにより、ペプチドをより安定にし、従って治療薬としてさらに有用にすることができる。同様に、Ｌ−アミノ酸残基の置換は、プロテアーゼ分解に対するペプチドの感受性を弱める標準的な方法であり、最終的には、ペプチド以外の有機化合物に一層類似させるものである。ｔ−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、テイル（ｔｈｅｙｌ）基、スクシニル基、メトキシスクシニル基、スベリル（ｓｕｂｅｒｙｌ）基、アジピル基、アゼライル（ａｚｅｌａｙｌ）基、ダンシル基、ベンジルオキシカルボニル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、メトキシアゼライル（ｍｅｔｈｏｘｙａｚｅｌａｙｌ）基、メトキシアジピル基、メトキシスベリル（ｍｅｔｈｏｘｙｓｕｂｅｒｙｌ）基、及び２，４，−ジニトロフェニル基などのアミノ末端ブロック基も有用である。ペプチドにおける電荷をもったＮ末端及びＣ末端をブロックすることには、ペプチドが疎水性の細胞膜を通過して細胞内に入るのを促進する別の効果もあるだろう。ペプチドミメティックに含まれる好ましいアミノ酸の代替基は、表２に規定するものである。
【表２】
【００５５】
ペプチドミメティック及び他の非ペプチド性ミメティックを合成及び開発するための技法は、当技術分野で周知である（６０〜６２）。例えば、タンパク質間相互作用を破壊し、さらにタンパク質複合体形成を阻害できるミニプロテイン及び合成模倣体について記載されている（６３）。タンパク質の構造及び機能を調査及び／又は改善するために、生体外及び生体内両方の翻訳システムを用いて、自然でないアミノ酸をタンパク質に組み入れるための様々な方法も、文献に開示されている（６４）。
【００５６】
本発明はさらに、本発明のホスホペプチドの機能的誘導体に関する。このホスホペプチドは、Ｙをリン酸化されたチロシン残基とするころの、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではないことが好ましい。
【００５７】
本明細書において、「誘導体」という用語は、アミノ酸部分の側鎖に存在する官能基、又は末端Ｎ基若しくはＣ基から、公知の方法によって調製できる誘導体のことをいう。そのような誘導体には、例えば、カルボキシル基のエステル又は脂肪族アミド、及び遊離アミノ基のＮアシル誘導体又は遊離水酸基のＯアシル誘導体が含まれ、アシル基、例えば、アルカノイル基又はアロイル基で形成される。
【００５８】
本発明のホスホペプチドの機能的誘導体は、安定性、半減期、生体利用性、人体による許容度、又は免疫原性などのペプチドの特性を改善するために、ポリマーに結合することができる。この目標を実現するために、アミノ酸残基上の１つ又は複数の側鎖として存在する１つ又は複数の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含む、ペプチドの機能的誘導体が生成される。そのような官能基は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でもよい。ＰＥＧ化は、公知の方法で行うことができ、例えば、国際公開第ＷＯ９２／１３０９５号に記載されている。ＰＥＧ化処理過程の他の例は、例えば、国際公開第ＷＯ０２／２８４３７号、第ＷＯ９９／５５３７７号、第ＷＯ９９／５５３７６号、又は第ＷＯ９９／２７８９７号に開示されている。
【００５９】
従って、本発明の好ましい実施形態では、本発明のホスホペプチドはＰＥＧ化されている。
【００６０】
本発明のペプチドの生成方法
本発明のペプチドは、当技術分野で公知のいかなる適当な方法で、例えば、分子生物学的方法で、また、好ましくは化学的方法で用いてもよい。
【００６１】
化学合成技術の例には、固相合成法及び液相合成法がある。固相合成法としては、例えば、合成するべきペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を有機溶媒に不溶の支持体に結合し、アミノ基及び側鎖官能基が適切な保護基で保護されているアミノ酸をＣ末端からＮ末端への順序でひとつずつ縮合する反応と、ペプチドのアミノ基の保護基又は樹脂に結合したアミノ酸を遊離させる反応との交互反復によって、ペプチド鎖を伸長する。固相合成法は、用いられる保護基のタイプによって、主として、ｔＢｏｃ法と、Ｆｍｏｃ法とに分類される。通常使用される保護基には、アミノ基用に、ｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４，メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、及びＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）；グアニジノ基用に、ＮＯ２（ニトロ）及びＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル）；水酸基用にｔＢｕ（ｔ−ブチル）が含まれる。
【００６２】
ホスホチロシンは、合成中、例えば、下記の実施例で記載されるように、Ｆ−ｍｏｃホスホチロシンに組み入れることによって合成される。
【００６３】
所望のペプチドを合成した後、それに脱保護基反応を施し、固形担体から切り取る。そのようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法ではフッ化水素又はフルオロホルムスルホン酸で、またＦｍｏｃ法ではＴＦＡで行うことができる。
【００６４】
このようにして得られた化合物は、その後、１つ又は複数の精製ステップにかけられる。精製は、これを目的とする公知の方法のいずれの１つによっても、即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳働、又は同様のものを用いる従来のいかなる操作手順によっても行うことができる。例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いることができる。溶出は、タンパク質精製で通常使用される水−アセトニトリルベースの溶剤を用いて行うことができる。
【００６５】
本発明には、本発明の化合物の精製試料も含まれる。本明細書において、精製試料とは、乾燥重量で、本発明の化合物が少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％である試料のことをいう。
【００６６】
医学上の有用性
本発明はさらに、本発明のホスホペプチドの医学的利用に関する。
【００６７】
１．本発明のホスホペプチドによって阻害されるホスファターゼは、いくつかの病態の進行に関与することが記載されている。従って、ＰＴＰの特異的な阻害剤である、本発明のホスホペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体は、本発明に従って薬物として用いられる。このホスホペプチド、ミメティック或いは機能的誘導体は、Ｙをリン酸化されたチロシン残基とするところの、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではないことが好ましい。
【００６８】
好ましい実施形態では、Ｓａｐ１を阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体は、癌、特に胃又は腸の癌の治療及び／又は予防用薬物を製造するために使用される。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、ＰＴＰ１Ｂを阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体は、糖尿病及び／又は肥満症の治療及び／又は予防用薬物を製造するために使用される。
【００７０】
ＰＴＰ１Ｂはさらに、例えば、卵巣癌又は乳癌などの腫瘍疾患における関与が示されているか、又は示唆されている。ＰＴＰ１Ｂ欠失細胞において、促進されたＩＧＦ−１シグナリングが示されたので、ＰＴＰ１Ｂの阻害剤には、ＩＧＦ−１様の効果もあるかもしれず、従って、うっ血性心不全、神経変性疾患、脳の虚血症イベント、又は脱髄疾患などのＩＧＦ−１介在性疾患の予防用又は治療用に用いることができる。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、ＰＴＰ１Ｂを阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体は、食欲抑制剤として使用される。
【００７２】
本発明はさらに、ＰＴＰ−βを阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用であって、炎症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための使用に関する。多発性硬化症を治療及び／又は予防するための、そのようなペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体の使用は、本発明に従い特に好ましい。
【００７３】
本発明はさらに、ＰＴＰ−βを阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用であって、固形癌又は転移癌などの血管新生依存性疾患の治療及び／又は予防用薬物を製造するための使用に関する。
【００７４】
本発明はさらに、ホスファターゼＳＨＰ１及びＳＨＰ２を阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用であって、感染症、特にリーシュマニア症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための使用に関する。
【００７５】
本発明のホスホペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体をそれを必要とする患者に薬学的有効量投与することを含む、ＰＴＰ介在性疾患を治療する方法も、本発明の範囲内にある。
【００７６】
医薬組成物
本発明は、これらのホスホペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体の１つ又は複数を含む医薬組成物にも関する。
【００７７】
この医薬組成物はさらに、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、又は希釈剤をさらに含むことが好ましい。
【００７８】
本発明による有効成分は、様々な方法で個体に投与することができる。投与経路には、皮内経路、経皮経路（例えば、遅延放出製剤中で）、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、経口経路、硬膜外経路、局所経路、及び鼻腔内経路が含まれる。他のいかなる治療法上有効な投与経路も用いることができ、例えば、上皮組織又は内皮組織を通した吸収、又は、活性薬をコードするＤＮＡ分子が患者に投与され（例えばベクターを介して）、活性薬の生体内での発現及び分泌を引き起こす遺伝子療法よって投与できる。さらに、本発明によるペプチドは、薬学的に許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤、及び媒体など、生物学的に活性な薬剤の他のコンポーネントと共に投与することもできる。
【００７９】
「薬学的に許容される」ものの定義は、有効成分のもつ生物活性の有効性を妨げず、かつそれが投与される宿主に有害でない、いかなる担体も包含されるものである。例えば非経口投与において活性ペプチドは、注射用に食塩水、ブドウ糖溶液、血清アルブミン、及びリンゲル液などの媒体中に単位用量形態で処方することができる。
【００８０】
非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与）用には、活性ペプチドは、溶液、懸濁液、乳剤、又は凍結乾燥粉末薬として、薬学的に許容される非経口媒体（例えば、水、食塩水、ブドウ糖溶液）、及び、等張性（例えば、マンニトール）又は化学安定性（例えば、保存剤及び緩衝液）を維持する添加物と共に処方することができる。この製剤は、一般的に使用される技法で殺菌される。
【００８１】
ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９２／１３０９５号に記載されているように、人体中での分子の半減期を増強する結合操作を行うことによって、例えば、ポリエチレングリコールに分子を連結することによって、本発明による活性ペプチドの生体利用性を改善することができる。
【００８２】
活性ペプチドの治療有効量は、受容体タイプ、本発明による物質の受容体に対する親和性、ペプチドが示すなんらかの残留細胞毒活性、投与経路、及び患者の臨床症状を含めた、多くの変数の関数になるだろう。
【００８３】
「治療有効量」とは、投与した際、本発明による物質によって、生体内におけるタンパク質チロシンホスファターゼの阻害が引き起こされる量である。１回用量又は複数回用量として個体に投与される用量は、薬物動態特性、投与経路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康、大きさ）、症候の程度、併用治療、治療の頻度、及び所望の効果を含めた様々な要因によって異なるだろう。確立された用量範囲の調節及び操作は、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【００８４】
本発明によるポリペプチドの必要とされる用量は、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇまで、約０．０１から１０ｍｇ／ｋｇまで、約０．１から５ｍｇ／ｋｇまで、又は約１から３ｍｇ／ｋｇまでの範囲で変動するだろうが、これは上述のように、多くの治療上の裁量を必要とするものである。
【００８５】
１日の用量は、通常、所望の結果を得るために有効である、分割用量又は持続放出形状で与えられる。第２投与又は後続投与は、個体に投与した初回用量又は先行用量より多いか、少ないか、又は同じ用量で行うことができる。第２投与又は後続投与は、疾患期間中又は疾患開始以前に投与することができる。
【００８６】
本発明はさらに、本発明のペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体の有効量を、薬学的に許容される担体と混合することを含む、医薬組成物を調製する方法にも関する。
【００８７】
雑誌記事若しくは要約、公開若しくは未公開の米国特許出願若しくは外国特許出願、米国特許若しくは外国特許、又他のいかなる引用文献も含めた、本明細書に引用されたすべての文献を、参照により、引用された文献に示されたすべてのデータ、表、図、及びテキストを含めた全体として、本明細書に組み込む。さらに、本明細書に引用された文献中の引用文献の全内容も、参照により全体として組み込む。
【００８８】
公知の方法のステップ、従来の方法のステップ、公知の方法、又は従来の方法の参照は、いかなる意味においても、本発明のいかなる態様、記載、又は実施形態も、関連技術において開示、教示、又は示唆されていることを認めるものではない。
【００８９】
特定の実施形態についての以上の記載は、本発明の一般的な本質を完全に明らかにするものであり、他の者も、当該技術の範囲内における知識（本明細書に引用された文献の内容も含む）を応用することによって、過度の実験をすることなく容易に、本発明の一般概念から逸脱せずに、特定の実施形態を改変し、かつ／又は、様々な適用のために適応させることができる。従って、そのような適応及び改変は、本明細書に示された教示及び教導に基づいて、開示された実施形態の均等物の範囲内にあるものである。本明細書における術語又は用語は、限定ではなく、説明を目的とするものであり、本明細書における用語又は術語は、当業者の知識と併せて、本明細書に示された教示及び教導の観点から、当業者によって解釈されるべきであることを理解するべきである。
【００９０】
これまで、本発明の説明を行ったが、本発明を限定するものではなく実例として提供する以下の実施例を参照することにより、本発明はより容易に理解されるだろう。
【実施例】
【００９１】
ホスホチロシンを含むランダムファージライブラリーを用いて、タンパク質チロシンホスファターゼの基質特異性を調べた。
【００９２】
実験の概要
操作手順は、ホスホチロシンを含むランダムペプチド配列を保持するファージライブラリーの作製が可能となるように設定した。ファージは、固定された基質捕捉性のＧＳＴ−ＰＴＰ融合タンパク質で選択した。複数ラウンドの選択の後、個々のクローンをＥＬＩＳＡ及びＳＰＯＴ分析で確認した。ディスプレイされたペプチドの重要なものをコードする配列は、サブクローニングして、Ｅｌｋキナーゼを発現する細菌中で同時発現させた。この結果得られたタンパク質は、その後、ＰＴＰの野生型バージョンの基質として用いた。この操作手順を用いて、いくつかのＰＴＰの共通配列を同定した。最後に、基質認識に重要であると記載されている触媒ドメイン中の特定の残基に変異を有するＰＴＰを用いて、同一のプロトコールを実施した。
【００９３】
各ファージが特有の（ホスホ）ペプチドを提示するＭ１３バクテリオファージライブラリーに、５つのＰＴＰを曝露した。提示されたペプチドは、自然なファージのタンパク質に隣接された硬直した構造中に埋め込まれた。この同じファージディスプレイ法がキナーゼの選択性の研究において効率的であることが既に示されている（２１〜２３）。このファージの主要キャプシドタンパク質であるタンパク質ＶＩＩＩ上にディスプレイされたペプチドレパートリーを用いたので、これにより、提示される配列のコピー数が増加した（２４）。同じライブラリーは、以前、ｆｙｎキナーゼのリン酸化部位をマッピングするのに用いられている（２２）。リン酸化されたランダムライブラリーの使用によって、ＳｈｃにおけるＰＴＢドメインの共通配列も同定された（２２）。さらに最近では、ファージ上に発現されたｃＤＮＡライブラリーが、ＳＨＰ−２におけるＳＨ２ドメインと相互作用するリガンドの同定に効率的であることも示されている（２５）。
【００９４】
この実施例では、事前にリン酸化されたＭ１３ファージライブラリーを利用した操作手順（２６）を用い、それに続いて、異なるＰＴＰによる「捕捉」を行った。ＰＴＰ１Ｂの共通配列を同定したが、これは、既に記載されているものとは異なっていた（１９）。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＯＴ技法を用いることによって得られた配列の正当性を確認した。後者の方法は、同定された配列中の、発見された個々のアミノ酸をテストするために、そして、認識されるのに必要な最小のアミノ酸をマッピングするために用いた。さらに、この技法によって、ＤＮＡシーケンシングより得られたデータから、直接、陽性クローンを広範囲にスクリーングすることが可能となった。これに従って、近縁のＰＴＰ（ＰＴＰ−Ｓａｐ１、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、及びＰＴＰ−β）を用いた新ラウンドのパニングを行った。これらのホスファターゼは、異なったファージに対する選択性を示した。
【００９５】
材料及び方法
クローニング及び精製
ＰＴＰは、以前に記載されている（２７）ように、クローニングし、精製した。簡潔には、すべてのＰＴＰにおける触媒ドメインの始め及び終わりに対応する特異的プライマーを用いて、注目の領域を含有するＥＳＴをＰＣＲによって増幅した。これらのプライマーは、５′端にＥｃｏＲＩ部位を、そして３’末端にＮｏｔＩ部位をもつように設計した。これらの２つの制限部位は、触媒ドメインをｐＧＥＸ４ＴＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にインフレームでクローニングするのに用いた。捕捉を行う変異体を構築するために、発明者らは、記載されている（２７）ような、ＤからＡへの突然変異を生成する内部プライマーを設計した。ＰＴＰ−Ｓａｐ１中のＲ８８位の変異は、次の内部プライマーを用いて行った。即ち、５’ＡＴＴ ＧＴＡ ＧＣＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＧＣ ＧＴ３’及び５’ＡＣＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＣＴ ＡＣＡ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＧＣ ＴＧＣ ＣＣＴ ＡＴＧ ＡＣＴ Ｇ３’である。ＳＰＯＴ分析に用いられたクローンは、ＧＳＴとインフレームなＰＫＡリン酸化部位をコードする改変されたｐＧＥＸ２ＴＫにサブクローニングした。コンストラクトはシーケンシングによってチェックした。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（コドン＋；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を形質転換して、シングルコロニーを、３７℃、２５ｍＬのＬＢ＋ａｍｐ＋Ｃｍ中で、ＯＤが０．５に達するまで増殖させた。タンパク質生成は、最終濃度２５０μＭのＩＰＴＧを添加した後、３時間、３０℃で行った。細菌を沈殿させ、溶菌緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ トリトンＸ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ＋プロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリート（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社））に再懸濁し、さらに、氷上で１時間のリゾチーム（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）処理と、それに続く３ラウンドの超音波処理によって溶菌した。溶菌液の上清を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の５０％溶液１００μｌと、４℃、２時間以上インキュベートした。最後に、ビーズを十分に洗浄し、１０ｍＭ グルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で、ＰＴＰを溶出した。グリセロールを最終濃度２０％まで添加し、生成されたタンパク質の量をＢｉｏ Ｒａｄ社のタンパク質アッセイで測定し、そして使用するまでアリコートを−２０℃で保存した。
【００９６】
ＰＥＰ−ＧＳＴコンストラクトは、以下の通りに調製した。用いられたプライマーは、Ｍ１３のｐＶＩＩＩキャプシド配列＋２か所の制限部位（ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ）に対応しており、センス配列が、５’ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＴＴＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＡ３’であり、アンチセンス配列が、５’ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＣＣ Ｇ３’であった。ファージＤＮＡは、ＰＣＲミックスに１０９のファージを添加することにより、直接増幅した。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いたＰＣＲの後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＰＣＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてＤＮＡ断片（１００ｂｐ）を精製し、さらにＵｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＤＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でゲル抽出した。最後に、クローニング及びタンパク質精製を、ＰＴＰに関するものと同じプロトコールに従って、ただし、ＴＫＢ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）細菌を形質転換し、シングルコロニーを増殖して、メーカーによる記載に忠実に従ってタンパク質生成及びリン酸化を誘導したことを唯一の相違点として、実行した。この場合も、すべてのコンストラクトは、タンパク質生成の前にＤＮＡシーケンシングでチェックした。
【００９７】
ＳＰＯＴ分析のためのＧＳＴ−ＰＴＰの標識化は、以下の通りに行った。２〜５μｇのＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に４℃で結合した。洗浄後、ＧＳＴ融合タンパク質は、ウシ心臓から得たプロテインキナーゼ（Ｓｉｇｍａ社）によって、ＰＫＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）中で、３５μＣｉの（γ−３２Ｐ）ＡＴＰの存在下に、氷上で３０分間、放射性同位元素標識した。洗浄後、融合タンパク質は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中の１０ｍＭ 遊離グルタチオンでビーズから溶出した（２８）。
【００９８】
ライブラリーのリン酸化
ファージ（１０９〜１０１０）は、全容積２０μｌのキナーゼ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、２．５ｍＭ ＤＴＴ、及び１ｍＭ ＡＴＰ）中、３０℃で、３時間、インキュベートした。まず、未精製ライブラリーをＰＴＰ捕捉変異体上でアッセイしたが、バックグランドが高く、リン酸化されたものも、リン酸化されていないものも、結合したクローンの数のいかなる増幅も観測できなかった（データは示されていない）。従って、全ライブラリーをリン酸化して、抗ＰＴｙｒカラム（Ｕｐｓｔａｔｅ社）中を通した。結合したファージをフェニルリン酸で溶出し、クローンは再び、カラム中を二度通した。増幅されたチロシン含有ファージは、その後、４℃でＴＥ中に保存し、捕捉実験に用いた（下記参照）。得られたファージの配列分析では、チロシン周辺のアミノ酸組成にいかなる偏向も示されず、配列決定された３０クローンのうち２クローンのみがチロシンを全く持たなかった（結果は示していない）。さらに、どの配列も二度は見いだされなかった。発明者らは、野生型ファージはリン酸化されず、それに対してライブラリーは高度にリン酸化されるという以前に得られた結果（（２２、２５、２９）データは示されていない）を確認した。これは、発明者らのリン酸化プロトコールに従い、（γ−３２Ｐ）ＡＴＰをトレーサーとして用いて検査した。
【００９９】
選択されたファージのパニング、増幅、及びシーケンシング
ファージ（１０８〜１０９）は、キナーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、そして、３ユニットのｓｒｃキナーゼを含む場合と、含まない場合とがある）中、３０℃で、３時間、インキュベートした。バクロウイルスから精製されたｐ６０ｓｒｃは、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。グルタチオンセファロースビーズは、捕捉緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）に最終濃度１％のＢＳＡを含む溶液中で、４℃、４時間、３μｇのＧＳＴ又はＰＴＰ−ＧＳＴでプレコーティングした。ファージは、４℃で、３０分間、ＧＳＴ−ビーズを用いてプレクリアーし、遠心して、上清を、４℃で、１．５時間、コーティングされたＰＴＰ−ＧＳＴと定常的に振盪しながらインキュベートした。最後に、ビーズをスピンダウンして、何度か（第１パニングでは５回、その後は１０回）、最終濃度０．２５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。ファージは、定常的に振盪しながら、室温で１０分間、酸処理（グリシン緩衝液、ｐＨ２．７）することによってＰＴＰ−ＧＳＴから溶出し、ビーズをスピンダウンして、ファージを上清中に回収した。ｐＨを回復するために、１／１０容積の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）溶液を添加した。最後に、両方の分画（結合及び非結合）で、ファージのタイターを測定し、結合分画の残りは、記載された操作手順（２４）に従い、ＸＬ１ ＭＲＦ’細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を感染させるのに用いた。翌日、細胞をこすり取り、メーカーの操作手順に従って、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてファージを増幅した。
【０１００】
捕捉されたクローンの数に増加が観測された場合、ファージをシングルクローンとして精製し、フォワードプライマー：５’ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＴＣＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＣＴＣ３’及びリバースプライマー：５’ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＧＡＴ ＡＧＴ ＴＧＣ３’をファージプライマーとして用いて、コロニーＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、次に、同じプライマーを用いて精製し、配列決定した。配列は、ＳｅｑｍａｎＩＩソフトウェアを用いて、両方向に読んだ。
【０１０１】
ＧＳＴ−ＰＥＰコンストラクト及びｐＮＰＰの脱リン酸化アッセイ
１００ｎｇのＰＥＰ−ＧＳＴコンストラクトを、ＰＴＰ緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、０．０５％ ノニデット Ｎｐ−４０、及び１ｍＭ ＤＴＴ）中で、１０ｎｇのＰＴＰ野生型とインキュベートした。反応は、異なったタイムラップに等容積のアリコートを、５０ｍＭ バナジン酸塩溶液と混合して停止させた。最後に、９６ウェルドットブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、全混合液をニトロセルロース膜上にスポッティングし、基質のリン酸化状態を抗ホスホチロシン抗体（クローンＧ４１０、Ｕｐｓｔａｔｅ社）を用いて可視化した。
【０１０２】
ｐＮＰＰ加水分解では、２００ｎｇのＰＴＰを、全容積５０μｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、及び２ｍＭ ＤＴＴ）中、室温で、異なった量の汎用基質（０〜６０ｍＭ）とインキュベートした。プレートを４０５ｎｍで計測し、動態パラメータは、非線形回帰法プログラム（Ｇｒａｐｈｐａｄ社、Ｐｒｉｓｍ（登録商標））を用いて決定した。
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ
シングルクローンは、以前に記載されているように増幅した。コーティングは、ＧＳＴ−ＰＴＰ又はＧＳＴ単独で、ＰＢＳ中で行った（９６ウェルプレート形式ではウェルあたり２μｇ）。ファージのリン酸化は、記載されたプロトコールに従って（ホスホ−Ｔｙｒ認識の特異性を検査し、それによって、陽性クローンが触媒ドメインに特異的であることを確認するために、（３０）に示されるように、３Ｕのｓｒｃキナーゼの存在下、及び非存在下に）行い、この処理過程中に、各ウェルを、５％無脂肪粉ミルクのＰＢＳ溶液中でブロッキングした。ウェルをＰＢＳ−０．５％ Ｔｗｅｅｎ（商標）で５回洗浄し、ファージを、１００μｌの捕捉緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中のＰＴＰ−ＧＳＴ又はＧＳＴと、４℃で２時間、インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−５％ミルクで十分に洗浄し、１時間ブロッキングした。ファージの存在は、一次抗体として抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて検出し、シグナルは、ヤギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社）で増幅し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のプロトコールの記載に従って、ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、ペルオキシダーゼ活性によって明らかにした。
【０１０４】
ＳＰＯＴ合成及びプロービング
ペプチドは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社によって提供された誘導体化したセルロース膜上で、手動で合成した。２０種のＦｍｏｃ−アミノ酸活性エステルも、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社によって提供された。Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社からのＦｍｏｃ−ホスホチロシン（＃０４−１２−１１５６）を、カップリング試薬であるＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ；Ｓｉｇｍａ社）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ；Ｆｌｕｋａ社；Ｅｓｐａｎｅｌら、投稿済み）の存在下で取り込ませた。
【０１０５】
膜は、ウエスタン洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１％ トリトンＸ−１００、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）＋ＳＰＯＴブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）でブロッキングし（少なくとも２時間）、４℃でプロービングした。２時間後に、膜をウエスタン洗浄緩衝液で何度か洗浄し、そのオートラジオグラフィーを行った。
【０１０６】
Ｔｙｒ偏向ライブラリーの構築
発明者らは、ｐＶＩＩＩタンパク質のＣ末端部分で９アミノ酸のインサートをディスプレイする、（１）に記載されているファージミドを用いた。発明者らは、（ｉ）インサートの５’末端にあるＥｃｏＲＩ部位に対応するＥＦモチーフを除去すること、及び（ｉｉ）ディスプレイされる配列の中央に固定されたチロシンを添加することを望んだ。ＤＮＡインサートは、５’末端にＭｕｎＩを、そして３’末端にＢａｍＨ１を有するように設計した（下線部）。プライマーは、ポリメラーゼによる充填のために、ｐＧＸｂ（太字）プライマーのリバース配列も有するように延長されている。従って、ＥＬＸＸＸＸＹＸＸＸＸＤＰ（Ｘはどんなアミノ酸も意味する）をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＡＴＡ ＣＡＡ ＴＴＧ （ＮＮＫ）４ ＴＡＴ （ＮＮＫ）３ ＮＮＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＣＡＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＣＣ ＧＧＡ Ｇであり、ただし、ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ、かつＫ＝Ｇ又はＴである。ライブラリーを構築するのに用いられた方法は、（２、３）に記載されている通りに実施した。簡潔には、４００ｐｍｏｌｅのライブラリープライマー及びｐＧＸｂ、（５’−ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＴＧ−３’）をアニールし、相補鎖を、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡ ＰｏｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて充填した。次に、ＤＮＡをフェノールクロロホルム沈殿によって抽出し、産物をＭｕｎＩ及びＢａｍＨＩで消化した。その後、混合物をコントロールと共に１５％ポリアクリルアミドゲルにロードし、正しい大きさとして移動するバンドを切り、回収した（４）。インサートは、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで事前に開環されたｐＣ８９ベクターにクローニングした（１）。ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ’エレクトロポレーション用コンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を、このライゲーション反応液で形質転換し、２０枚の大きなプレート（アンピシリン及びテトラサイクリンを含む１００ｍｌのＬＢアガー）に広げた。細胞を採取し、２ｍＬアリコートを凍結させた。
【０１０７】
ファージは以下の通り増幅した。Ｔｅｔ（１２．５μｇ／ｍｌ）及びＡｍｐ（５０μｇ／ｍｌ）を補充された５リットルのＬＢに、２ｍｌのライブラリー細菌を希釈し、ＯＤ６００が０．２〜０．３に達するまで振盪した。このとき、発明者らは、最終濃度２．４μｇ／ｍｌのＩＰＴＧと、タイター１０１２のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）とを添加し、再び５時間、３７℃で、振盪した。ファージをポリエチレングリコールで二度沈殿し、ＣｓＣｌの平衡遠心で精製した（２）。ライブラリーの品質を力価測定によってテストし、最終形質導入ユニットタイターは１０１０ファージ／ｍｌであった。
【０１０８】
結果
この実施例中では、リン酸化されたチロシン残基を「ｐＹ」と表す場合がある。添付の配列リストでは、このアミノ酸残基は、通常のチロシン残基として、即ち「Ｔｙｒ」又は「Ｙ」として現れる。図においては、ホスホチロシンを「Ｚ」として示す。
【０１０９】
ＰＴＰ１Ｂに関するファージディスプレイ
ＰＴＰ１Ｂ捕捉変異体（（１２）並びに、材料及び方法）をポジティブコントロールとして用いて、基質認識を研究するためにファージディスプレイライブラリーを用いることの有効性を検証した。ＰＴＰ１Ｂには、いくつかの利点がある。即ち、（ｉ）現在、ＰＴＰ１Ｂの主要な細胞基質について詳しく記載されていること（９、１０）、（ｉｉ）リバースアラニンスキャンが行われ（１９）、「最適」の基質共通配列の決定が行われたこと、及び（ｉｉｉ）ＰＴＰ１Ｂとペプチドとの相互作用に関する結晶学的記述の正確なマッピングが行われたことである（３１、３２）。
【０１１０】
チロシン偏向ライブラリー（材料及び方法を参照）を３回パンニングした後に、結合したファージの濃縮が観測された。捕捉されたファージは、保存モチーフ（表３）を見出すために直接配列決定した。その後、適合させたＥＬＩＳＡアッセイ（材料及び方法を参照）を行ったが、このＥＬＩＳＡはすべての捕捉されたクローンを検出するのに十分な感受性を持たなかった。その上、このアッセイの成功率は、テストされるＰＴＰに依存するように見えた（下記参照）。
【０１１１】
これらの実験では、ファージのキャプシドが２つの選択可能なアミノ酸（リン酸化チロシンの−２及び−１の位置にそれぞれＥ及びＦ）をディスプレイするのが観測された。この偏向から、何故、ランダムにディスプレイされた配列の第１ポジションにチロシンを有する陽性ファージが、多数得られたのか説明できる。それにもかかわらず、キャプシドのアミノ酸がチロシンに先行しないところで、１ｂ−４（図１及び表３）のようないくつかのファージが、独立した保存モチーフを表した。実際、基質チロシンの−１におけるフェノール基が相互作用を安定させ、さらに、触媒ポケットにリン酸を配置するであろうことが実証されている（３１）。
表III
PTP1Bによって選択されたクローン
クローン ディスプレイされた配列 プール中のコピー数 ELISA
1b-1 EFpYATYGSAATDPAK (配列番号12) 4X +
1b-2 EFIpYQNLADPLDPAK (配列番号13)
1b-3 EFpYDIILAGMADPAK (配列番号14)
1b-4 EFQpYZGEYTRGDPAK (配列番号15)
1b-5 EFPEpYAMLSNSDPAK (配列番号16)
1b-6 EFEPIpYNAYQVDPAK (配列番号17)
1b-7 EFpYGTYRGQDSDPAK (配列番号18) +
1b-9 EFpYNLYEGVMSDPAK (配列番号19)
1b-11 EFQSPVpYGNFADPAK (配列番号20)
1b-12 EFATpYEEYALMDPAK (配列番号21)
1b-13 EFpYGTFAPKPLDPAK (配列番号22)
1b-14 EFpYGTYRGQDSDPAK (配列番号23) 2X
コンセンサス： φｐＹＧＸＹ
【０１１２】
次に、捕捉変異体によって選択されたコンセンサスペプチドが、ＷＴ ＰＴＰ１Ｂによって脱リン酸化されるであろうか否かをテストした。ディスプレイされた配列をＧＳＴ発現性ベクターにサブクローニングすることにより、最も頻繁な配列であると判明した配列を、ＰＴＰ１Ｂが脱リン酸化できるかどうかテストした（１ｂ−１）。ＷＴ型のＰＴＰ１Ｂがディスプレイされたペプチドを脱リン酸化できることが判明した（示されていない）。他のものによって既に観測されているように、ＧＳＴタグがＴＫＢ１細胞中でＥｌｋキナーゼによってリン酸化されなかったことが留意された。これは、ディスプレイされたペプチドに特異的な脱リン酸化が検出されたことを意味する。
【０１１３】
最後に、ファージから単離された共通配列の結合を確認するために、ＳＰＯＴ分析を行った（Ｅｓｐａｎｅｌら、印刷中）。この技法により、１０個の配列（表３）をテストして、ＥＬＩＳＡと同様の結果が得られうるかどうか検査することが可能となった。ＳＰＯＴプロトコールを用いて、ホスホ−Ｔｙｒ（ｐＹ）を有するペプチド、又はホスホ−Ｔｙｒ（ｐＹ）を持たないペプチドを膜上で（材料及び方法を参照）合成した。
【０１１４】
さらに、複数のＴｙｒに関して、すべての可能なホスホペプチドの組合せを検査した。２つの配列（１ｂ−６及び１ｂ１１）を除外したすべてが、ＰＴＰ１Ｂ捕捉変異体によって認識された。興味深いことに、これらの２つの配列は、ＰηｐＹＸＸφコンセンサス（Ｘはどんなアミノ酸も表し、ηはＴｙｒ又はＰｈｅ、そしてφはどんな疎水性アミノ酸も表す）を共有する。ＰＴＰ１Ｂが好むコンセンサスを有するいくつかの配列は、ＥＬＩＳＡでは見いだされなかったが、ＳＰＯＴでは確認された（例えば、１ｂ−９、１ｂ−４）。二重リン酸化ペプチドは、単独リン酸化ペプチド（例えば、１ｂ−１スポット４又は１ｂ−１２スポット３６）ほどよく反応するようには見えなかった。興味深い例外はＳＰＯＴ１５であって（クローン１ｂ−４）、２つのリン酸化されたＴｙｒが相互に伴っている場合、２つのリン酸化チロシンが他のアミノ酸によって切り離された場合より、結合が効率的になったように見えた。
【０１１５】
配列１ｂ−４がこのアッセイで最も良い基質であったので、これをバリンスキャン用に選んだ（図１Ｃ）。このアッセイでは、各位置をバリンと交換し、結合をテストする。このペプチド上の結合に、３つの位置、即ち、−１、＋１、及び＋３が決定的であった。
【０１１６】
ホスホ−Ｔｙｒ（ｐＹ）周辺における、最小の好ましい配列は、
ＥＦｐＹＧ／ＡＴＹＧ／Ａ（配列番号４〜８）
と定義できるかもしれない。また、＋２において求核性アミノ酸（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）が、そして＋３において、Ｐｈｅ（例えば、１ｂ−１３では、それ以外のコンセンサスが保存されていてもシグナルがより弱い）ではなくＴｙｒが好まれている可能性もある。
【０１１７】
ＰＴＰ Ｓａｐ１及びＰＴＰ−βに関するファージディスプレイ
ＰＴＰ−Ｓａｐ１及びＰＴＰ−βは、ＰＴＰの同じサブファミリーに属する（１、２）。
【０１１８】
ＰＴＰ１Ｂで行われたように、Ｔｙｒ偏向ライブラリーのパニングを行ったところ、両方のＰＴＰに関して、３ラウンド後にファージ濃縮を観測することができた（図２）。シングルクローンをＥＬＩＳＡでテストした。ＰＴＰ−Ｓａｐ１は、捕捉が非常に効率的であり、陽性クローンを容易に検出することができた（表４）が、ＰＴＰ−βは、この方法を用いてテストされた３０ファージのうち、３ファージしか捕捉することができなかった（表５）。Ｓａｐ−１クローンの配列は、ＰＴＰ１Ｂ（表２）の配列を想起させるものであった。位置−１及び＋３におけるフェニル基（Ｐｈｅが好まれる）と、＋１における不変のグリシンとが、認識される最小の共通配列であるように思われる。脱リン酸化アッセイは、テストされたすべてのクローンで保存された酵素活性を示した（データは示されていない）。ＰＴＰ−βによって選択されたクローンは、濃縮が観測されたにもかかわらず、より可変的であり、ＥＬＩＳＡ（表４）で陽性であったものは、−１にＬｙｓ又はＴｈｒ（疎水性アミノ酸）を有した。陽性クローンの配列は、この位置におけるこれら２つのアミノ酸のうち１つを好む選択性を示した。その上、このホスファターゼは、触媒アッセイであまり効率的でないように見え、実際、ＰＴＰ−Ｓａｐ１の同じ実験と比較したところ、ＧＳＴペプチドの脱リン酸化が弱かった（データは示されていない）。
表IV: PTP-Sap1によって選択されたクローン
クローン ディスプレイされた配列 プール中のコピー数 ELISA
x2 EFpYGQFpYGPPQDPAK (配列番号24) +
x3 EFpYGAYTSTTADPAK (配列番号25) +
x5 EFpYGAYSNADLDPAK (配列番号26) 2X +
x9 EFpYGTFAQSAEDPAK (配列番号27) 3X +
x10 EFpYGAFGDFTKDPAK (配列番号28) +
x41 EFpYGELGHISQDPAK (配列番号29) +
x42 EFDVpYGSATSMDPAK (配列番号30) +
x50 EFpYGSFFPISQDPAK (配列番号31) -
x51 EFpYGAFGAP. (配列番号32) +
x58 EFpYGPVASDASDPAK (配列番号33) +
コンセンサス： ＦｐＹＧＡφ
表V: PTP-bによって選択されたクローン
クローン ディスプレイされた配列 ELISA
B1 EFLpYQSFSGNVDPAK (配列番号34) ++
B27 EFLpYGSFFRPPDPAK (配列番号35) +
B32 EFTpYQTYSPAADPAK (配列番号36) +
コンセンサス： ＬｐＹＱ／ＧＳＦ
表VI
Km (mM)
Sap-1WT 2.665 +/-0.463
Sap-1R88N 2.67 +/-0.2295
【０１１９】
ＰＴＰ−Ｓａｐ１における陽性クローンのＳＰＯＴ分析
ＰＴＰ−１Ｂにおいてと同様、ＰＴＰ−Ｓａｐ１における陽性クローンをＳＰＯＴでテストした。Ｓａｐに特異的な配列のほとんどすべてがＥＬＩＳＡテストにおいて陽性であった。最良のファージは、ＥＦｐＹＧＡφという共通配列を共有していた。ＳＰＯＴ分析（図３Ａ）では、すべての配列が陽性であり、再度、二重リン酸化されたファージは、より弱いシグナル（例えば、Ｘ−５）を示した。さらに、第２のＴｙｒの配列前後関係も相互作用に影響を及ぼした。例えば、Ｘ−２は、両方のリン酸化されたチロシンで同様のＳＰＯＴ結果を示したが、これはおそらく、第２のＴｙｒも好まれる環境（ＦｐＹＧ）の中にあるという事実によるものである。この実施例は、第２のＴｙｒについてのポジティブセレクションも可能であるという仮説を支持する。
【０１２０】
好まれる配列中の必要なアミノ酸を記述するために、バリンスキャンを次に行うことにした（図３Ｂ）。Ｘ−５は、それが二度現れ、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合が最も強かったため選択された。このアッセイでは、スポット９〜１２が極めて重要であるように見えた。これらのアミノ酸の１つがバリンに変わった際、それにより結合が劇的に反転した。また、＋１位におけるＧｌｙも、選択的な位置であった。このＧｌｙは、ランダム配列から発して、配列決定されたすべてのクローンで選択されていた。加えて、＋２におけるＡｌａはそれほど必須ではないが、小さいアミノ酸がファージディスプレイのこの位置で選択されているように見えた。従ってこれは、Ｖａｌでの置換によって結合が抑制されるものではない。最後に、＋３におけるフェニル基は、選択されたクローンのほとんどすべてに存在するが、Ｖａｌで置換された場合、結合を解除しなかった。ファージの配列を注意深く見ると、Ｘ−５８は＋３にＶａｌを有し、かつＥＬＩＳＡで認識されており、即ち、この位置でのバリンスキャンは、好まれるアミノ酸（Ｐｈｅ）をそれほど好まれない（Ｖａｌ）ものに交換するだけであることを意味する。実際、バリンはこの位置でＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２の２つＰＴＰに必須であることが判明した（データは示されていない）。
【０１２１】
この分析から、Ｖａｌによって置換できず、その位置の構造グループに限定されていると思われる選択性の位置が３か所（−２、−１、＋１）あると結論することができた。置換された際に、よりフレキシブルな他の位置（＋２及び＋３）もおそらくある。従って、ＰＴＰ−Ｓａｐ１に関する共通配列は、ＥＦｐＹＧＡＦＡ／Ｇである。
【０１２２】
ＰＴＰ−Ｓａｐ１における触媒ドメイン内の主要残基を変異させることによる基質共通配列の改変
ＰＴＰ−βと、ＰＴＰ ＳＡＰ１との触媒ドメイン間の配列同一性は非常に高い（５０％以上）。それにもかかわらず、選択されたクローンはいくつかのアミノ酸において異なっていた。即ち、位置−１は、ＰＴＰ−Ｓａｐ１用のキャプシド配列では、厳密にＰｈｅでなければならないが、ＰＴＰ−βでは、Ｌｅｕ又はＴｈｒであることが判明した。基質ペプチドを伴ったＰＴＰ１Ｂの共結晶化産物が以前にマッピングされている（３１、３２）。Ａｒｇ４７（触媒ドメインにおける付番（１９、２０、３１−３３））における相互作用の正確な記述が示されている。このアミノ酸は、「理想的な」ペプチド基質中のＰｈｅ−１と相互作用すると考えられている。この領域の単純なアライメントは、ＰＴＰ−Ｓａｐ１におけるこの位置に対応するアミノ酸がＡｒｇ即ちＡｒｇ８８であり、ＰＴＰ−βにおいてはＡｓｎ即ちＡｓｎ１０１であることを示す（図４）。この位置は実際に、Ｔｙｒリン酸化ペプチドにおける、位置−１に対する親和性の主要な変調因子であるかもしれず、これは、ＰＴＰ−Ｓａｐ１クローンとＰＴＰ１Ｂクローンとの間の類似性を説明するものである。
【０１２３】
この仮説をテストするために、ｗｔバックグランド及び捕捉変異体バックグランドでＰＴＰ−Ｓａｐ１Ｒ８８Ｎ変異体を生成した。まず、この変異が基質の非特異的な認識を改変しないことを確認するために、汎用ホスファターゼ基質（ｐＮＰＰ）に対する、変異体の触媒能をテストした（表６）。
【０１２４】
次に、この捕捉変異体をＴｙｒ偏向ライブラリーに曝露した。３ラウンドの後、結合したファージの濃縮が観測されたが、クローン数のこの増加は、ホスホ−Ｔｙｒに依存していた（係数１０３〜１０４の間）。ＤＮＡシーケンシングの後、発明者らは、ＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎ捕捉変異体が、ファージの保存されたファミリーと相互作用でき、これらの配列がＰＴＰ−Ｓａｐ１によって捕捉されたクローンの配列と異なることを観測した（表７）。
【表３】
【０１２５】
位置−１に疎水性アミノ酸があることは、ＰＴＰ−βプール中で観測されたクローンと同様である。従って、ＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎは、基質選択性においてＰＴＰ−βに類似している。実際に−１位が改変されたので、これは、認識過程中に、この位置が触媒ドメインのアルギニン又はリジン（例えば、ＰＴＰ ＳＨＰ−１／２）と強く相互作用するという考えを援護するものである。ＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎ変異体は−１でＬｅｕを選択したが、この選択は厳密なものではなく、これは、おそらく他のアミノ酸もこの位置の選択性に関与することを示すものである。それにもかかわらず、選択されたクローンの大部分は−１で疎水性アミノ酸（η）を有する。
【０１２６】
表６は、８個の異なったＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎクローンの配列を示す。
表VIII: PTP-Sap1 R88Nクローン
Sm-1 EFAHLpYGTFREDPAK (配列番号67)
Sm-2 EFGATpYGVYTSDPAK (配列番号68)
Sm-7 EFLpYGEIQGTQDPAK (配列番号69)
Sm-8 EFLpYANVERSSDPAK (配列番号70)
Sm-10 EFIpYGQILPRSDPAK (配列番号71)
Sm-11 EFpYGQIGDHLVDPAK (配列番号72)
Sm-12 EFpYGEYRPRAQDPAK (配列番号73)
Sm-15 EFIpYGSFHQTADPAK (配列番号74)
コンセンサス： ηｐＹＧＸφ．
【０１２７】
クローンプールのＥＬＩＳＡシグナルは、あらゆる選択ラウンドの後に増強されたが、これは、陽性クローンの数がラウンド中に増大し続けていたことを確認するものである（データは示されていない）。従って、これらの変異体に捕捉された配列を直接ＳＰＯＴ膜に曝露して、最小コンセンサスがどのように影響されたかテストすることにした。図５に示すように、ＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎの親和性が変化していた。位置−１において、Ｐｈｅはまだ受容されたが、基質認識がよりフレキシブルになっており、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＴｈｒもＳＰＯＴアッセイで認識されうる。１クローン（ｓｍ−８）のみがここで認識されていない。触媒ドメインＲ８８Ｎ変異体によって、好まれたモチーフは、
ηｐＹＧＸφ
である。
【０１２８】
まとめると、これらのデータは、クローンを選択するための、ファージディスプレイと組み合わせたＰＴＰ点変異体研究と、触媒ドメインから基質に相互作用するアミノ酸を発見するためのＳＰＯＴ分析とを提供する。
表ＩＸ 上記に提示された研究フレームで得られた結果をまとめる。すべての配列が位置０にホスホチロシン（ｐＹ）を有する。
Ｓａｐ１：
−２：５０％Ｅ又は５０％Ｌ／Ｖ（疎水性）
−１：１００％疎水性（７７％Ｉ／Ｌ）
＋１：１００％Ｇ
＋２：３６％Ａ、２９％Ｔ、１４％Ｓ、及び２１％その他
＋３：疎水性、８５％フェノール基（２０％Ｙ及び６５％Ｆ）
＋４：５８％Ａ又はＧ
→コンセンサス：ＥＬｐＹＧＳＹＹＡ（配列番号１）
→例：ＥＦｐＹＧＡＦＡ／Ｇ（Ｋｍ＝７．０ｕＭ）（配列番号２、３）
→例：ＡＥＧＥＬｐＹＧＳＬＹＡ（Ｋｍ＝７．６ｕＭ）（配列番号４）
ＰＴＰ１Ｂ：
−２：６０％Ｅ及び２０％Ｐ
−１：１００％疎水性（そのうち６０％Ｆ）
＋１：６６％Ｇ／Ａ
＋２：４７％Ｔ
＋３：１００％疎水性、そのうち８０％フェノール基（６７％Ｙと１３％Ｆ）；２０％Ｉ／Ｌ
＋４：５３％Ｇ／Ａ
→コンセンサス：ＥＦｐＹＡ／ＧＴＹＧ／Ａ（配列番号５〜８）
ＰＴＰ−β
−３：５０％酸性（Ｅ又はＤ）
−２：６２％Ｌ、１３％Ｅ
−１：１００％疎水性（６２％Ｌ）
＋１：１００％Ａ（２３％）又はＧ（７７％）
＋２：３８％Ｓ
＋３：６２％Ｙ、２３％Ｌ、及び１５％酸性
＋４：３１％フェノール基（Ｙ又はＦ）
→コンセンサス：ＥＬＬｐＹＧＳＹＹ（配列番号９）
ＳＨＰ１：
−２：５６％Ｅ、２２％Ｐ
−１：８９％疎水性（５６％Ｆ、それ以外はＹ又はＬ）
＋１：１００％Ａ
＋２：３３％Ｅ、２２％Ｑ、又はＨ
＋３：８９％疎水性（６７％Ｖ、２２％Ｉ）
＋４：４４％Ｇ
→コンセンサス：ＥＦｐＹＡＥＶＧ（配列番号１０）
ＳＨＰ２：
−２：７７％Ｅ及び２７％Ｆ
−１：１００％疎水性、そのうち９０％フェノール基（７７％Ｆ）
＋１：７７％Ａ
＋２：４４％Ｅ
＋３：７７％Ｖ、２３％Ｉ
＋４：６６％Ｇ
＋５：６６％Ｒ
→コンセンサス：ＥＦｐＹＡＥＶＧＲ（配列番号１１）
【０１２９】
概要及び考察
ファージキャプシド上に発現されたランダムペプチドライブラリーを、３つのＰＴＰにおける触媒ドメインの特異性を研究するのに用いた。パニングの各ラウンド後に、捕捉されたファージプールの濃縮が観測され、また、ＰＴＰ捕捉変異体はシングルファージを捕捉することができた。同じ配列をＧＳＴ融合タンパク質としてディスプレイした際、野生型ＰＴＰはそれを脱リン酸化することができた。
【０１３０】
ファージディスプレイとＳＰＯＴ技術との組合せによって、このように、これらのＰＴＰによる基質認識に必要な主要アミノ酸の定義が得られた。
【０１３１】
最後に、基質認識に直接関与すると予測されたアミノ酸は、変異された際にそれらが好む基質配列を変えるため、実際に確認できることが示された。
【０１３２】
ＳＨＰ１及びＳＨＰ２
上記に概説された操作手順を用いて、ＳＨＰ１及びＳＨＰ２の最適な基質配列（表８）を得ることができた。２つのＰＴＰは、近縁の触媒ドメインを有し、これらの最適配列であるＥＦＺＡＥＶＧ（配列番号１０）及びＥＦＺＡＥＶＧＲ（配列番号１１）も同様に強い近縁性を示し、ただし他のＰＴＰ認識モチーフとは明確に異なっていた。
【０１３３】
不遍向ライブラリーでのＰＴＰ−βの再スクリーニング
先に述べたように、多くのモチーフがキャプシドによってコードされている２つのアミノ酸を合体していることが判明した。従って、ライブラリー中のランダム配列が異なった前後関係で提示されている第２のライブラリー（「ライブラリー６」、実験手順を参照）を生成した。ランダム配列の中央にチロシンをコードするコドンが含まれている。この追加研究を用いたことによって、モチーフがＥＬＬＺＧＳＹＹ（配列番号９）に伸長された。この独立した実験は、この操作手順が、最適のＰＴＰ認識配列を同定するのに再現可能であることをさらに示した。
【０１３４】
この技法を用いて、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰ１Ｂ、Ｓａｐ１、ＰＴＰ−β、ＳＨＰ１、及びＳＨＰ２の理想的な基質を定義した。これらのペプチドは、それぞれのホスファターゼの基質に対する高度に特異的な阻害剤としての機能を果たすことができ、従って、それぞれのホスファターゼの阻害を必要とする疾患において有用である。
（参考文献）
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】ＹＺＧＸＹモチーフを含むＰＴＰ−１Ｂ結合性ペプチドのＳＰＯＴ分析を示す。Ａ：ファージディスプレイスクリーニングから得られたペプチドに対するＰＴＰ−１Ｂの結合。チロシン又はホスホチロシン（Ｚ）を含有する１５量体ペプチドをＳＰＯＴ膜上で合成した。ブロットは、放射性同位元素標識されたＰＴＰ−１Ｂ ＤＡ（ＷＰＤモチーフ内のアスパラギン酸がアラニンに変異されている捕捉変異体）でプローブした。Ｂ：（Ａ）における膜上でテストされたペプチドの配列。Ｃ：（Ｂ）における配列１ｂ−４のバリンスキャン。
【図２】ＰＴＰ−βによって捕捉されたファージの濃縮を示す。パニングの各ラウンド後にファージの力価測定をし、結合分画と非結合分画との間の比率を計算した。
【図３】ＥＦＺＧモチーフを含むペプチドに対するＰＴＰ−Ｓａｐ１の結合のＳＰＯＴ分析を示す。Ａ：ファージディスプレイから得られたペプチドに対するＰＴＰ−Ｓａｐ１の結合。ホスホチロシン（Ｚ）を有する１５量体ペプチドと、ホスホチロシン（Ｚ）をもたない１５量体ペプチドとを膜上で合成した。放射性同位元素標識されたＰＴＰ−Ｓａｐ１ＤＡの結合をオートラジオグラフィーで明らかにした。Ｂ：ＳＰＯＴにおける、バリン（下線部）スキャンによるクローンＸ５の結合部位マッピング。第１のチロシンのみがリン酸化されたが、これはそれがパネルＡで最も強い結合を示したものであったからである。膜は、放射性同位元素標識されたＰＴＰ−Ｓａｐ１ＤＡでプローブし、オートラジオグラフィーで明らかにした。
【図４】ＰＴＰ１ＢにおけるＲ４７の周辺領域での配列アラインメントを示す。このアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ配列アライメントソフトウェアを用いて行った。数字は触媒ドメインにおける付番に対応している。
【図５】（Ｂ）に示される配列を有するペプチドに対するＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８ＮのＳＰＯＴ上での結合を示す。ホスホチロシン（Ｚ）を有する１５量体ペプチドと、ホスホチロシン（Ｚ）をもたない１５量体ペプチドとを膜上で合成した。放射性同位元素標識されたＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎの結合をオートラジオグラフィーで明らかにした。１クローンのみが結合しなかった（Ｓｍ−８）。位置−１にＴ、Ｆ又はＩを有するクローン（それぞれ、クローンＳｍ−２、Ｓｍ−１１、及びＳｍ−１５）で最も強いシグナルが得られている。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファターゼ阻害剤の分野に属する。より詳細には、本発明は、タンパク質チロシンホスファターゼを阻害するホスホペプチド及びホスホペプチド誘導体、並びにこれらの医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどすべての細胞内シグナリングが、タンパク質リン酸化ステップ及び脱リン酸化ステップに支配されている。リン酸化酵素、即ちキナーゼの役割は極めて早くから理解されていたが、それらの対応物であるホスファターゼの積極的役割は、現在、急速に認知度を高めている。
【０００３】
リン酸化／脱リン酸化事象のダイナミックな性質は、細胞をバナジン酸塩などの汎用ホスファターゼ阻害剤で処理した際に、これにより、多数の細胞内標的が大規模かつ急速にリン酸化され、また、これに多面的な生理作用があることで、最も良く理解される。
【０００４】
現在までに、１００に満たない数のＰＴＰが記載されており（１、２）、ヒトゲノム第１ドラフトのスクリーニング（３、４）で、このファミリーのタンパク質をコードする新遺伝子の発見がなかった（Ｉｂｂｅｒｓｏｎら、投稿済み）ので、この数が大幅に増えることもなさそうである。
【０００５】
受容体キナーゼ及びＰＴＰによるシグナリングは複雑である。サイトカイン及び成長因子受容体がリガンド誘発二量体化を通して活性化され、これが受容体キナーゼを活性化するのである。或いは、受容体がＪＡＫなどの細胞内キナーゼを動員し、ＪＡＫが受容体（及び、ＪＡＫ自ら）をリン酸化する。両事象とも、リン酸化カスケードを引き起こす。しかし、受容体ホスホチロシンに結合しこれを遮蔽するＳＯＣＳ（サイトカインシグナル抑制因子）、ＰＩＡＳ（活性型ＳＴＡＴタンパク質阻害因子）、受容体の内部移行及び分解、並びにＰＴＰによる脱リン酸化を含めた、この系路を変調する複数のネガティブフィードバック機構の存在がますます明らかなものになりつつある。ＰＴＰは、可溶性タンパク質として、膜結合型「受容体」ＰＴＰとして、又は小胞体に付随して存在するため、脱リン酸化は、受容体が膜に固着している間でも、又は受容体が再循環過程にある間でも起こりうる。
【０００６】
現在までに、生理的基質と関連付けされていることの知られているＰＴＰはごく少数のみである。しかし、ＰＴＰ１Ｂがインシュリンシグナリング及びレプチンシグナリングの負の変調因子であることが発見されたことによって、薬物標的（５〜７）として、ＰＴＰに対するかなりの関心がかき立てられた。ＰＴＰ１Ｂは、リン酸化されたインシュリン受容体に対して特有の基質特異性を有することが示された（８）。さらに、ＰＴＰ１Ｂは、インシュリン受容体チロシンキナーゼの主要な負の調節因子であることも示されている（９、１０）。
【０００７】
ＰＴＰ１Ｂは、ｃ−ｓｒｃを脱リン酸化及び活性化することができ（６５）、また、卵巣（６６）及び胸部（６５）における癌腫で過剰発現されるので、抗腫瘍標的として想定されている。
【０００８】
別の研究は、ＰＴＰ１Ｂ欠失細胞中で、ＩＧＦ−１（インシュリン様成長因子−１）シグナリングが促進されていることを示した（６８）。インシュリン及びＩＧＦ−１受容体の自己リン酸化ドメインは、ほぼ同一であり、しかも、おそらく両方ともＰＴＰ１Ｂの良い基質であるので、この結果はそれほど驚くべきことではない。ＩＧＦ−１超感受性による影響として観測されたものの１つに、アポトーシスからの防御があったが、これは、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤に、顕著なアポトーシス要素を伴う神経変性疾患における利用価値がありうることを示すものである。
【０００９】
ＰＴＰ１Ｂ、即ちタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（遺伝子名はＰＴＰＮ１又はＰＴＰ１Ｂ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号Ｐ１８０３１）は、４３５アミノ酸及び分子量５０ｋＤを有する細胞内タンパク質であり、複数の組織で発現される。そのＣ末端配列は、ＰＴＰ１Ｂが小胞体膜に結合していることを予測し、これは実験的に確かめられた。
【００１０】
ＰＴＰ１Ｂにインシュリンシグナリングにおける抑制性の役割があることに加えて、Ｊａｋ２がＰＴＰ１Ｂの基質であることも示されている。この基質選択性は、ＰＴＰ１Ｂの遮断によってレプチン受容体を介したシグナリングが増強されることを説明するものであるかもしれない。
【００１１】
ホスファターゼは免疫系においても見いだされている。最も初期に発見されたＰＴＰの１つであるＣＤ４５は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球における抗原受容体シグナリングに不可欠である。従って、このＰＴＰは免疫抑制薬の良い標的と考えられるだろう。Ｓｒｃホモロジードメインを含むＰＴＰであるＳＨＰ１もまた、ＴＣＲシグナリング及びＢ細胞シグナリングに関与するが、ＳＨＰ２ノックアウト表現型（８２〜８４）は、それがはるかに広い役割をもつことを示す。
【００１２】
ＳＨＰ−１（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ２９３５０、遺伝子名はＰＴＰＮ６、ＰＴＰ１Ｃ又はＨＣＰ）は、５９５アミノ酸を有する６７．６ｋＤの細胞質ゾルタンパク質であり、主として造血系由来の細胞で発現される。ＳＨＰ−１は、２つのＮ端ＳＨ２（Ｓｒｃホモロジー２）ドメインと、触媒ドメインと、２つのＣ末端自己調節性チロシンリン酸化部位を含有している。ＳＨＰ−１は、ＢＣＲ、ＴＣＲ、ＥｐｏＲ、ＣＳＦ−１、ｌｙｎ、ｓｙｋ、及びｃ−Ｋｉｔが関与する系路において、通常、負の調節因子であり、その抑制又は遺伝的除去により、免疫応答の増強がもたらされる。
【００１３】
ホスファターゼはさらに、感染症の進展にも関与している。病原菌がそれらの生存率を増大させるためにＰＴＰを利用するという一連の興味深い発見がある。これら細胞内ＰＴＰとＰＴＰ導入性微生物のＰＴＰとが同じ系路を標的にしているかどうかは、全く明らかではないが、これらのＰＴＰは、アプリオリに良い薬物標的と考えられるだろう。最も初期の例は、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）細菌であるが、この細菌は、生体内における病原性に不可欠なＹｏｐＨと呼ばれるＰＴＰをコードする（３５〜３６）。胃潰瘍の原因となる通常の感染性細菌であるヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）は、ＣａｇＡと呼ばれるタンパク質を胃の皮層細胞中に導入し、その細胞上で繁殖する（３７）が、最近、ＣａｇＡがリン酸化に際してＳＨＰ２を活性化することが判明した（３８）。別の例はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）であるが、この細菌は、ＳｐｔＰと呼ばれるＰＴＰをその宿主細胞内に導入することが知られている（３９）。他の細菌（ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））も、ＰＴＰによってそれらの宿主を操作すると考えられている（３５）。
【００１４】
病原菌がＰＴＰを用いることのより間接的な証跡は、リーシュマニア症の治療用に確立された薬剤であるスチボグルコン酸ナトリウムがＳＨＰ１を強く阻害し、また、それに劣る程度においてＳＨＰ２も阻害するという観測から得られる（４０）。従って、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、及び微生物ＰＴＰは、感染症における有効な標的であると考えられる。ＳＨＰ−２（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｑ０６１２４；異名はＰＴＰ−２Ｃ、ＰＴＰ−１Ｄ、ＳＨ−ＰＴＰ３、ＳＨ−ＰＴＰ２；遺伝子名はＰＴＰＮ１１、ＰＴＰ２Ｃ、又はＳＨＰＴＰ２）は、５９３アミノ酸を有する６８ｋＤの細胞質ゾルタンパク質であり、広く発現される。主としてＳＨＰ−２は、ＧＨＲ、レプチンＲ（Ｏｂ）、ＥＧＦＲ、ＩｎｓＲ、ＰＤＧＦＲ、及び、ＮＦ−κＢなどの細胞内活性化因子を含めたサイトカイン受容体のアゴニストである。
【００１５】
血管内皮単層は炎症における重要な役割を果たしている。局所炎症では、Ｌ−セレクチン及びＥ−セレクチンなどのサイトカイン誘発接着性分子がアップレギュレーションされ、また、密着結合の透過性が増強されて（４１）、好中球血管外遊走がこれに続く。アンジオポエチン−１、及びその内皮受容体Ｔｉｅ−２がこの過程にアンタゴナイズすることが最近示された（４２）。また、内皮特異的なＰＴＰ−β（又は、マウスオーソログであるＶＥ−ＰＴＰ）が、Ｔｉｅ−２受容体キナーゼを特異的に脱リン酸化することも示された（４３）。これは、ＰＴＰ−βが好中球及びマクロファージによる血管外遊走の抑制因子として、炎症における薬物標的であることを示唆するだろう。ＰＴＰ−β（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ２３４６７）は、１，９９７アミノ酸を有する２２４ｋＤのＩ型膜タンパク質であり、主として内皮細胞で発現される。
【００１６】
最後に、ＳＡＰ−１（胃癌関連タンパク質チロシンホスファターゼ−１）と呼ばれるチロシンホスファターゼは癌に関与すると言われている（４４）。Ｓａｐ−１（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｑ１５４２６）は、１，１１８アミノ酸を有する１２３ｋＤのＩ型膜タンパク質であり、脳、心臓、及び胃で非常に弱く発現される。
【００１７】
ＳＡＰ−１は、１９９４年に、Ｉ型膜貫通ＰＴＰファミリーの新メンバーとしてクローニングされた（４５）。大きな細胞外ドメインは、８つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ様ドメインからなる。他の多くの受容体ＰＴＰとは異なり、Ｓａｐ−１は、触媒活性を有する単独のチロシンホスファターゼドメインを有し、ＧＬＥＰＰ−１、ＰＴＰ−β、及びＤＥＰ−１に近縁である（４６、４７）。ＳＡＰ−１ ｍＲＮＡは、膵臓でも、又は結腸でも検出できなかったが、膵臓癌及び結腸直腸癌細胞中では、ｍＲＮＡ及びタンパク質が強く発現されていた。Ｓａｐ−１の発現は、生検において免疫組織学的に検査され、その過剰発現が軽度の形成異常を伴うアデノーマから腺癌への進行と相関していることが判明した（４８）。過剰発現による研究は、ｐ１３０ｃａｓがＳＡＰ−１の基質であることを示唆している（４４）。
【００１８】
従って、ホスファターゼは、「ドラッガブルな（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」標的として現れ、これに対する阻害剤が探索されている。そのような阻害剤は、例えば、低分子量化合物阻害剤でもよい。
【００１９】
ホスファターゼに対する多くの低分子量阻害剤が公知である。現在開発中のものの大部分は、（４９）の総説にあるものなど、ＰＴＰ１Ｂに特異的なものである。
【００２０】
ホスファターゼ阻害剤は、ペプチド阻害剤、又はそのようなペプチド阻害剤のミメティックであってもよい。ＰＴＰ１Ｂを阻害するペプチドミメティックの例は、（５０）に記載のホスホチロシルミメティック、例えば、（ジフルオロホスホノメチル）フェニルアラニン（Ｆ２Ｐｍｐ）など、公知である。ホスホチロシンミメティックの別の例は、例えば、（５１）に記載されているものなどの（ジフルオロナフチルメチル）ホスホン酸である。
【００２１】
ホスファターゼに対するペプチド阻害剤を同定するためのアプローチは、Ｆｌｉｎｔら（１２）によって開発された。彼らのストラテジーは、基質とまだ相互作用はできるが、解離することができない触媒不活性変異体を使用するものである。これらの変異体は「捕捉変異体」と呼ばれた。捕捉変異体及びバナジン酸塩で処理された細胞からの基質を用いて、細胞が分析された（１３、１４）。ホスファターゼＹｏｐＨ及びＰＴＰαに関する生化学的アプローチを用いて、２つのグループが、これらのＰＴＰによる異なったペプチドに対する選択性を明らかにし（１５、１６）、再度、触媒ドメインの特異性を明らかにした。
【００２２】
薬理学的標的であるＰＴＰ１Ｂの認識部位を模擬したランダムペプチドライブラリー（１７）又は化学物質（１８）のアッセイは、リン酸化チロシンからの位置−２及び−３における酸性残基、並びに位置−１における芳香族基を好む選択性を実証した。さらに最近では、１つのグループが、異なった短ペプチド配列に対するＰＴＰ１Ｂの親和性をテストするために、リバースアラニンスキャンを行い（１９）、Ａｓａｎｔｅ−Ａｐｐｉａｈら（２０）は、システイン以外のすべてのアミノ酸で位置をひとつずつ変えた合成ペプチドライブラリーでＴＣ−ＰＴＰをテストした。
【００２３】
Ｗａｎｇ Ｐｅｎｇら（６８）は、コンビナトリアルライブラリーを質量分析でスクリーニングし、タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ−１の最適な基質を同定した。このアプローチは、ＳＨＰ−１が−２の位置で酸性残基を好み、そのうちアスパラギン酸の方がわずかにグルタミン酸より好まれることを明らかにした。−１の位置において、ＳＨＰ−１は酸性残基も好むが、他の様々なアミノ酸も許容される。Ｗａｎｇ Ｐｅｎｇらが生成したＳＨＰ−１阻害剤の１つに、配列ＲＮＮＥＦｐＹＡ−ＮＨ２があったが、このペプチドは「クラス３」として、即ち、ＳＨＰ−１の最も好ましくない基質として分類された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、５つの異なったタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、即ち、Ｓａｐ−１、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−β、ＳＨＰ１、及びＳＨＰ２の「理想的な」基質として機能する合成ホスホペプチドの同定に基づいている。これらのホスホペプチドは、例えば、前述のＰＴＰに対して特異的であり、それらの阻害剤として有用である。
【００２５】
これらのＰＴＰは様々な病理学的状態の発達に関与するので、本発明のペプチド阻害剤は、これらの疾患を治療又は予防するための新規アプローチを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ＰＴＰ捕捉変異体、ファージディスプレイ、及びＳＰＯＴなどの公知の技術を用いて、５つの異なったタンパク質チロシンホスファターゼ、即ち、Ｓａｐ１、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−β、ＳＨＰ１、及びＳＨＰ２の「理想的な」基質を同定した。
【００２７】
従って本発明は、これらのタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の特異的阻害剤として用いることのできる新規合成ホスホペプチドに関する。
【００２８】
本明細書において、「ホスホペプチド」という用語は、ホスホペプチドだけではなく、ホスホペプチドの誘導体、塩、及び、ペプチドミメティックにせよ非ペプチド性ミメティックにせよ、ミメティックを包含するものである。
【００２９】
第１の態様では、本発明は、ホスホペプチドであって、
−２：Ｅ、Ｌ、又はＶ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＩ又はＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ｇ、
＋２：Ａ、Ｔ、又はＳ、
＋３：疎水性アミノ酸、又はフェノールアミノ酸、特にＦ又はＹ、
＋４：Ａ又はＧ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基である、ホスホペプチドに関する。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、Ｓａｐ−１特異的阻害剤として用いることができる。
【００３０】
チロシン残基は、通常、「Ｙ」又はＴｙｒとして短縮表記されるが、本出願を通して、リン酸化されたチロシン残基は、このチロシン残基がリン酸化されていることを明らかにするために、「Ｚ」として標識される場合があることに留意するべきである。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドは、
ＥＬＹＧＳＹＹＡ（配列番号１）、
ＥＦＹＧＡＦＡ（配列番号２）、
ＥＦＹＧＡＦＧ（配列番号３）、及び
ＡＥＧＥＬＹＧＳＬＹＡ（配列番号４）
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。
【００３２】
いかなる疑問も避けるために述べると、本明細書に示されるすべてのペプチド配列に関して、左側がペプチドのＮ端側に対応し、また、右側がペプチドの最もＣ末端側に対応している。同様に、所与のペプチドの最初に言及されるアミノ酸はそのペプチドのＮ末端アミノ酸に対応し、ペプチドの最後に言及されるアミノ酸はそのペプチドのＣ末端アミノ酸に対応している。本発明のペプチドは、本明細書に示された配列を含むものであり、従って、本明細書に示されたペプチド配列のＮ末端アミノ酸は、このペプチド自体のＮ末端である必要はなく、また、本明細書に示された配列のＣ末端アミノ酸も、このペプチド自体のＣ末端である必要はないことを理解するべきである。
【００３３】
本発明の別の態様は、ホスホペプチドであって、
−２：Ｅ又はＰ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＦ、
０：Ｙ、
＋１：Ｇ又はＡ、
＋２：Ｔ、
＋３：疎水性アミノ酸、特にＹ、Ｆ、Ｉ、又はＬ、
＋４：Ｇ又はＡ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基である、ホスホペプチドに関する。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤として用いることができる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドは、
ＥＦＹＡＴＹＧ（配列番号５）、
ＥＦＹＧＴＹＧ（配列番号６）、
ＥＦＹＡＴＹＡ（配列番号７）、及び
ＥＦＹＧＴＹＡ（配列番号８）
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明のさらに別の態様では、このホスホペプチドは、
−３：酸性アミノ酸、特にＥ又はＤ、
−２：Ｌ又はＥ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ａ又はＧ、
＋２：Ｓ、
＋３：Ｙ、Ｌ、又は酸性アミノ酸、
＋４：フェノールアミノ酸、特にＹ又はＦ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、数字はペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹはリン酸化されたチロシン残基である。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、ＰＴＰ−β阻害剤として用いることができる。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドはアミノ酸配列ＥＬＬＹＧＳＹＹ（配列番号９）を含む。
【００３７】
本発明のさらに別の態様では、このホスホペプチドは、
−２：Ｅ又はＰ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＦ、Ｙ、又はＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ａ、
＋２：Ｅ、Ｑ、又はＨ、
＋３：疎水性アミノ酸、特にＶ、又はＩ、
＋４：Ｇ、
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、数字はペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹはリン酸化されたチロシン残基である。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、ＳＨＰ１阻害剤として用いることができる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドは、アミノ酸配列ＥＦＹＡＥＶＧ（配列番号１０）を含む。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、ホスホペプチドであって、
−２：Ｅ又はＦ、
−１：疎水性アミノ酸、特にフェノールアミノ酸、特にＦ、
０：Ｙ、
＋１：Ａ、
＋２：Ｅ、
＋３：Ｖ又はＩ、
＋４：Ｇ、
＋５：Ｒ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基である、ホスホペプチドに関する。これらの配列特性を有するいかなるペプチドも、ＳＨＰ−２阻害剤として用いることができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、このホスホペプチドは、アミノ酸配列ＥＦＹＡＥＶＧＲ（配列番号１１）を含む。
【００４１】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明のホスホペプチドは、５０個若しくは約５０個未満のアミノ酸、又は３０個若しくは約３０個未満のアミノ酸、又は２０個若しくは約２０個未満のアミノ酸、又は１５個若しくは約１５個未満のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、又は約９個のアミノ酸、又は約８個のアミノ酸、又は約７個のアミノ酸を含む。
【００４２】
本発明は、
ａ） １つ又は複数のアミノ酸残基が添加、除去、又は置換されている、本発明のどのペプチドの活性変異体も、
ｂ） （ａ）の活性画分、前駆体、塩、又は誘導体も、
ｃ） 本発明のペプチドの配列又は構造に基づいて設計されたペプチド性若しくは非ペプチド性ミメティック、又はそのフラグメントも含む。
【００４３】
本発明で定義されたポリペプチド若しくはペプチドの活性変異体、又はこれらをコードする核酸には、置換ペプチド又は置換ポリペプチドとして実質上対応する配列の有限集合が含まれ、これらは、当業者であるならば、過度の実験をせずに、実施例で提示された教示と機能的特徴に基づいて日常的に入手できるものである。
【００４４】
本発明によると、これらの活性変異体における好ましい変異は、「保存的」又は「安全な」置換として周知のものである。保存的アミノ酸置換は、分子の構造及び生物学的機能を保存するために、十分に類似した化学的特性を有するアミノ酸による置換である。ホスホペプチド又はその誘導体における「共通配列」の外側では、特に挿入又は欠失がいくつかのアミノ酸、例えば、３０個未満、そして好ましくは１０個未満のアミノ酸のみに関与し、かつ、例えばシステイン残基など、（ポリ）ペプチドの機能的立体配座に極めて重要なアミノ酸を削除又は置換除去しない場合、それらの機能を変化させることなく、残りの配列中にアミノ酸の挿入及び欠失を生成することができる。
【００４５】
文献は、自然なポリペプチドの配列及び／又は構造に関する統計的研究及び物理化学研究を基礎にした多くのモデルを提供しており、これらに基づいて、保存的アミノ酸置換の選択を行うことができる（５２、５３）。プロテインデザイン実験は、特定のアミノ酸サブセットの使用により、折り畳み可能な活性タンパク質を生成できることを示しており、タンパク質構造中により容易に収容でき、かつ機能的ホモローグ及び構造的ホモローグ、並びにパラローグを検出するのに使用できるアミノ酸置換を分類するのに役立っている（５４）。これらの同義アミノ酸グループ、及びより好ましい同義アミノ酸グループは表１に定義するものが好ましい。
【表１】
これらの教示に基づいて行われた置換によって生成した活性変異体も、１つ又は複数のアミノ酸が除去又は付加された活性変異体も同様に、本発明の対象、即ち、本発明のペプチドと同じ生物活性か、又はもし可能なら改善さえされている生物活性を有する新規ペプチドのうちに数えられる。
【００４６】
本明細書において、塩とは、ＰＴＰ阻害性ペプチド又はそのアナローグにおけるカルボキシル基塩、及びアミノ基の酸添加塩の両方をいう。カルボキシル基塩は当技術分野で公知の方法で形成できるが、これらには、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩、又は亜鉛塩などの無機塩と、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン若しくはリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンによって形成された塩など、有機塩基による塩とが含まれる。酸添加塩には、例えば、無機酸、例えば、塩酸又は硫酸などによる塩と、有機酸、例えば、酢酸又は蓚酸などによる塩とが含まれる。当然ながら、そのような塩のどれも、本発明のＰＴＰ結合活性又は阻害活性の生物活性を保持していなければならない。
【００４７】
ほとんどのホスファターゼは、細胞内でそれらの活性を作用させるので、本発明のホスホペプチドは、細胞膜を通して細胞質に送達するのが望ましい。これは、選択された送達の経路及び方法によって、例えば、リポソームを用いることによって実現できる。細胞内送達を実現するためには、他に、脂質二重層を通した移行、又は、チャンネルタンパク質、受容体などの膜タンパク質を通した移行を媒介する特有の部分を、ペプチドに結合させることもできる。
【００４８】
従って、さらに別の好ましい実施形態では、本発明のホスホペプチドは、細胞貫通ペプチドに連結される。
【００４９】
細胞貫通ペプチドは当技術分野で公知である。それらは、例えば、ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、ホメオドメイン由来若しくはＨＩＶ ｔａｔタンパク質由来のもの、又は膜移行配列を含むシグナル配列ベースのものなど、タンパク質由来のものでもよい。細胞貫通ペプチドはさらに、トランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）のように、合成及び／又はキメラであってもよい。細胞貫通ペプチドの例、及び細胞貫通の可能な機構については、例えば、（５５）又は（５６）に総説がある。
【００５０】
本発明の化合物の細胞貫通を増進又は促進するためには、他に、親油性特性を導入することもできる。さらに、自然に細胞膜を横切って輸送される分子であって、これらの化合物が細胞膜を横切って細胞質中に進入するのを容易にするか、又はこれらの化合物の浸透性を促進する分子で、これらの化合物を化学的に修飾、誘導体化、結合、又は複合体化することもできる。これらの膜ブレンド剤の例には、融合誘導ポリペプチド、イオンチャンネル形成ポリペプチド、他の膜ポリペプチド、及び、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸などの長鎖脂肪酸がある（米国特許第５，１４９，７８２号）。これらの膜ブレンド剤は、分子結合体を細胞膜の脂質二重層に挿入して、それらの細胞質への進入を容易にする。分子を膜貫通送達するための他の有益な方法では、受容体介在性のエンドサイトーシス活性の機構を利用する。これらの受容体システムには、ガラクトース、マンノース、マンノース６−リン酸、トランスフェリン、アシアログリコプロテイン、トランスコバラミン（ビタミンＢ１２）、インシュリン、及び他のペプチド成長因子、例えば、表皮成長因子（ＥＧＦ）などを認識するものが含まれる。ビオチン受容体及び葉酸受容体などの栄養物受容体も、細胞膜を横切った輸送を促進するのに有利に用いることができるが、これは、ほとんどの細胞の細胞膜表面におけるビオチン受容体及び葉酸受容体の位置及び多重性、並びに付随する受容体介在性の膜貫通輸送過程によるものである（米国特許第５１０８９２１号）。従って、細胞質中に送達するべき化合物と、ビオチン又は葉酸などのリガンドとの間で形成された複合体は、ビオチン受容体又は葉酸受容体を有する細胞膜と接触させることによって、受容体介在性膜貫通輸送機構を開始させることができ、それによって所望の化合物の細胞内への進入が可能となる。
【００５１】
本発明の化合物を改変して、脳血液関門における透過性を改善することも有用であろう。ペプチドを改変して、脂溶性を高めるか（例えば、コレステリルなどの大きな親油性部分とエステル化することによって）、又は、関門の脳側での保持を促進する、切断可能な「ターゲッティング」部分を供給することができる（５７）。或いは、ペプチドをトランスフェリン受容体に特異的な抗体に連結して、この受容体がもつ、血液脳関門を通して鉄を輸送する役割を利用することもできる（５８）。血行性薬物送達分野におけるバイオミメテック輸送及び合理的薬物送達の他の方法は、当技術分野で公知である（５９）。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のホスホペプチドの配列及び／又は構造に基づいて設計されたペプチド性ミメティック（ペプチドミメティックとも呼ばれる）、又は非ペプチド性ミメティックを提供する。そのようなペプチドミメティックは、Ｙをリン酸化されたチロシン残基とするところの、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではないことが好ましい。
【００５３】
このミメティックでは、ペプチド又はポリペプチドの性質が、アミノ酸側鎖、アミノ酸キラリティー、及び／又はペプチドバックボーンのレベルで化学的に改変されている。これらの改変は、同程度か、又は改善された治療特性、診断特性及び／又は薬物動態特性を有するＰＴＰ結合性化合物及びＰＴＰ阻害性化合物を提供することを意図したものである。
【００５４】
例えば、対象への注射後に、ペプチドがペプチダーゼで切断されやすいことが問題であるとき、特に感受性が高いペプチド結合を切断可能でないペプチドミメティックで置換することにより、ペプチドをより安定にし、従って治療薬としてさらに有用にすることができる。同様に、Ｌ−アミノ酸残基の置換は、プロテアーゼ分解に対するペプチドの感受性を弱める標準的な方法であり、最終的には、ペプチド以外の有機化合物に一層類似させるものである。ｔ−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、テイル（ｔｈｅｙｌ）基、スクシニル基、メトキシスクシニル基、スベリル（ｓｕｂｅｒｙｌ）基、アジピル基、アゼライル（ａｚｅｌａｙｌ）基、ダンシル基、ベンジルオキシカルボニル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、メトキシアゼライル（ｍｅｔｈｏｘｙａｚｅｌａｙｌ）基、メトキシアジピル基、メトキシスベリル（ｍｅｔｈｏｘｙｓｕｂｅｒｙｌ）基、及び２，４，−ジニトロフェニル基などのアミノ末端ブロック基も有用である。ペプチドにおける電荷をもったＮ末端及びＣ末端をブロックすることには、ペプチドが疎水性の細胞膜を通過して細胞内に入るのを促進する別の効果もあるだろう。ペプチドミメティックに含まれる好ましいアミノ酸の代替基は、表２に規定するものである。
【表２】
【００５５】
ペプチドミメティック及び他の非ペプチド性ミメティックを合成及び開発するための技法は、当技術分野で周知である（６０〜６２）。例えば、タンパク質間相互作用を破壊し、さらにタンパク質複合体形成を阻害できるミニプロテイン及び合成模倣体について記載されている（６３）。タンパク質の構造及び機能を調査及び／又は改善するために、生体外及び生体内両方の翻訳システムを用いて、自然でないアミノ酸をタンパク質に組み入れるための様々な方法も、文献に開示されている（６４）。
【００５６】
本発明はさらに、本発明のホスホペプチドの機能的誘導体に関する。このホスホペプチドは、Ｙをリン酸化されたチロシン残基とするころの、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではないことが好ましい。
【００５７】
本明細書において、「誘導体」という用語は、アミノ酸部分の側鎖に存在する官能基、又は末端Ｎ基若しくはＣ基から、公知の方法によって調製できる誘導体のことをいう。そのような誘導体には、例えば、カルボキシル基のエステル又は脂肪族アミド、及び遊離アミノ基のＮアシル誘導体又は遊離水酸基のＯアシル誘導体が含まれ、アシル基、例えば、アルカノイル基又はアロイル基で形成される。
【００５８】
本発明のホスホペプチドの機能的誘導体は、安定性、半減期、生体利用性、人体による許容度、又は免疫原性などのペプチドの特性を改善するために、ポリマーに結合することができる。この目標を実現するために、アミノ酸残基上の１つ又は複数の側鎖として存在する１つ又は複数の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含む、ペプチドの機能的誘導体が生成される。そのような官能基は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でもよい。ＰＥＧ化は、公知の方法で行うことができ、例えば、国際公開第ＷＯ９２／１３０９５号に記載されている。ＰＥＧ化処理過程の他の例は、例えば、国際公開第ＷＯ０２／２８４３７号、第ＷＯ９９／５５３７７号、第ＷＯ９９／５５３７６号、又は第ＷＯ９９／２７８９７号に開示されている。
【００５９】
従って、本発明の好ましい実施形態では、本発明のホスホペプチドはＰＥＧ化されている。
【００６０】
本発明のペプチドの生成方法
本発明のペプチドは、当技術分野で公知のいかなる適当な方法で、例えば、分子生物学的方法で、また、好ましくは化学的方法で用いてもよい。
【００６１】
化学合成技術の例には、固相合成法及び液相合成法がある。固相合成法としては、例えば、合成するべきペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を有機溶媒に不溶の支持体に結合し、アミノ基及び側鎖官能基が適切な保護基で保護されているアミノ酸をＣ末端からＮ末端への順序でひとつずつ縮合する反応と、ペプチドのアミノ基の保護基又は樹脂に結合したアミノ酸を遊離させる反応との交互反復によって、ペプチド鎖を伸長する。固相合成法は、用いられる保護基のタイプによって、主として、ｔＢｏｃ法と、Ｆｍｏｃ法とに分類される。通常使用される保護基には、アミノ基用に、ｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４，メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、及びＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）；グアニジノ基用に、ＮＯ２（ニトロ）及びＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル）；水酸基用にｔＢｕ（ｔ−ブチル）が含まれる。
【００６２】
ホスホチロシンは、合成中、例えば、下記の実施例で記載されるように、Ｆ−ｍｏｃホスホチロシンに組み入れることによって合成される。
【００６３】
所望のペプチドを合成した後、それに脱保護基反応を施し、固形担体から切り取る。そのようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法ではフッ化水素又はフルオロホルムスルホン酸で、またＦｍｏｃ法ではＴＦＡで行うことができる。
【００６４】
このようにして得られた化合物は、その後、１つ又は複数の精製ステップにかけられる。精製は、これを目的とする公知の方法のいずれの１つによっても、即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳働、又は同様のものを用いる従来のいかなる操作手順によっても行うことができる。例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いることができる。溶出は、タンパク質精製で通常使用される水−アセトニトリルベースの溶剤を用いて行うことができる。
【００６５】
本発明には、本発明の化合物の精製試料も含まれる。本明細書において、精製試料とは、乾燥重量で、本発明の化合物が少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％である試料のことをいう。
【００６６】
医学上の有用性
本発明はさらに、本発明のホスホペプチドの医学的利用に関する。
【００６７】
１．本発明のホスホペプチドによって阻害されるホスファターゼは、いくつかの病態の進行に関与することが記載されている。従って、ＰＴＰの特異的な阻害剤である、本発明のホスホペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体は、本発明に従って薬物として用いられる。このホスホペプチド、ミメティック或いは機能的誘導体は、Ｙをリン酸化されたチロシン残基とするところの、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではないことが好ましい。
【００６８】
好ましい実施形態では、Ｓａｐ１を阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体は、癌、特に胃又は腸の癌の治療及び／又は予防用薬物を製造するために使用される。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、ＰＴＰ１Ｂを阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体は、糖尿病及び／又は肥満症の治療及び／又は予防用薬物を製造するために使用される。
【００７０】
ＰＴＰ１Ｂはさらに、例えば、卵巣癌又は乳癌などの腫瘍疾患における関与が示されているか、又は示唆されている。ＰＴＰ１Ｂ欠失細胞において、促進されたＩＧＦ−１シグナリングが示されたので、ＰＴＰ１Ｂの阻害剤には、ＩＧＦ−１様の効果もあるかもしれず、従って、うっ血性心不全、神経変性疾患、脳の虚血症イベント、又は脱髄疾患などのＩＧＦ−１介在性疾患の予防用又は治療用に用いることができる。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、ＰＴＰ１Ｂを阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体は、食欲抑制剤として使用される。
【００７２】
本発明はさらに、ＰＴＰ−βを阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用であって、炎症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための使用に関する。多発性硬化症を治療及び／又は予防するための、そのようなペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体の使用は、本発明に従い特に好ましい。
【００７３】
本発明はさらに、ＰＴＰ−βを阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用であって、固形癌又は転移癌などの血管新生依存性疾患の治療及び／又は予防用薬物を製造するための使用に関する。
【００７４】
本発明はさらに、ホスファターゼＳＨＰ１及びＳＨＰ２を阻害するホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用であって、感染症、特にリーシュマニア症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための使用に関する。
【００７５】
本発明のホスホペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体をそれを必要とする患者に薬学的有効量投与することを含む、ＰＴＰ介在性疾患を治療する方法も、本発明の範囲内にある。
【００７６】
医薬組成物
本発明は、これらのホスホペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体の１つ又は複数を含む医薬組成物にも関する。
【００７７】
この医薬組成物はさらに、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、又は希釈剤をさらに含むことが好ましい。
【００７８】
本発明による有効成分は、様々な方法で個体に投与することができる。投与経路には、皮内経路、経皮経路（例えば、遅延放出製剤中で）、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、経口経路、硬膜外経路、局所経路、及び鼻腔内経路が含まれる。他のいかなる治療法上有効な投与経路も用いることができ、例えば、上皮組織又は内皮組織を通した吸収、又は、活性薬をコードするＤＮＡ分子が患者に投与され（例えばベクターを介して）、活性薬の生体内での発現及び分泌を引き起こす遺伝子療法よって投与できる。さらに、本発明によるペプチドは、薬学的に許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤、及び媒体など、生物学的に活性な薬剤の他のコンポーネントと共に投与することもできる。
【００７９】
「薬学的に許容される」ものの定義は、有効成分のもつ生物活性の有効性を妨げず、かつそれが投与される宿主に有害でない、いかなる担体も包含されるものである。例えば非経口投与において活性ペプチドは、注射用に食塩水、ブドウ糖溶液、血清アルブミン、及びリンゲル液などの媒体中に単位用量形態で処方することができる。
【００８０】
非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与）用には、活性ペプチドは、溶液、懸濁液、乳剤、又は凍結乾燥粉末薬として、薬学的に許容される非経口媒体（例えば、水、食塩水、ブドウ糖溶液）、及び、等張性（例えば、マンニトール）又は化学安定性（例えば、保存剤及び緩衝液）を維持する添加物と共に処方することができる。この製剤は、一般的に使用される技法で殺菌される。
【００８１】
ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９２／１３０９５号に記載されているように、人体中での分子の半減期を増強する結合操作を行うことによって、例えば、ポリエチレングリコールに分子を連結することによって、本発明による活性ペプチドの生体利用性を改善することができる。
【００８２】
活性ペプチドの治療有効量は、受容体タイプ、本発明による物質の受容体に対する親和性、ペプチドが示すなんらかの残留細胞毒活性、投与経路、及び患者の臨床症状を含めた、多くの変数の関数になるだろう。
【００８３】
「治療有効量」とは、投与した際、本発明による物質によって、生体内におけるタンパク質チロシンホスファターゼの阻害が引き起こされる量である。１回用量又は複数回用量として個体に投与される用量は、薬物動態特性、投与経路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康、大きさ）、症候の程度、併用治療、治療の頻度、及び所望の効果を含めた様々な要因によって異なるだろう。確立された用量範囲の調節及び操作は、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【００８４】
本発明によるポリペプチドの必要とされる用量は、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇまで、約０．０１から１０ｍｇ／ｋｇまで、約０．１から５ｍｇ／ｋｇまで、又は約１から３ｍｇ／ｋｇまでの範囲で変動するだろうが、これは上述のように、多くの治療上の裁量を必要とするものである。
【００８５】
１日の用量は、通常、所望の結果を得るために有効である、分割用量又は持続放出形状で与えられる。第２投与又は後続投与は、個体に投与した初回用量又は先行用量より多いか、少ないか、又は同じ用量で行うことができる。第２投与又は後続投与は、疾患期間中又は疾患開始以前に投与することができる。
【００８６】
本発明はさらに、本発明のペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体の有効量を、薬学的に許容される担体と混合することを含む、医薬組成物を調製する方法にも関する。
【００８７】
雑誌記事若しくは要約、公開若しくは未公開の米国特許出願若しくは外国特許出願、米国特許若しくは外国特許、又他のいかなる引用文献も含めた、本明細書に引用されたすべての文献を、参照により、引用された文献に示されたすべてのデータ、表、図、及びテキストを含めた全体として、本明細書に組み込む。さらに、本明細書に引用された文献中の引用文献の全内容も、参照により全体として組み込む。
【００８８】
公知の方法のステップ、従来の方法のステップ、公知の方法、又は従来の方法の参照は、いかなる意味においても、本発明のいかなる態様、記載、又は実施形態も、関連技術において開示、教示、又は示唆されていることを認めるものではない。
【００８９】
特定の実施形態についての以上の記載は、本発明の一般的な本質を完全に明らかにするものであり、他の者も、当該技術の範囲内における知識（本明細書に引用された文献の内容も含む）を応用することによって、過度の実験をすることなく容易に、本発明の一般概念から逸脱せずに、特定の実施形態を改変し、かつ／又は、様々な適用のために適応させることができる。従って、そのような適応及び改変は、本明細書に示された教示及び教導に基づいて、開示された実施形態の均等物の範囲内にあるものである。本明細書における術語又は用語は、限定ではなく、説明を目的とするものであり、本明細書における用語又は術語は、当業者の知識と併せて、本明細書に示された教示及び教導の観点から、当業者によって解釈されるべきであることを理解するべきである。
【００９０】
これまで、本発明の説明を行ったが、本発明を限定するものではなく実例として提供する以下の実施例を参照することにより、本発明はより容易に理解されるだろう。
【実施例】
【００９１】
ホスホチロシンを含むランダムファージライブラリーを用いて、タンパク質チロシンホスファターゼの基質特異性を調べた。
【００９２】
実験の概要
操作手順は、ホスホチロシンを含むランダムペプチド配列を保持するファージライブラリーの作製が可能となるように設定した。ファージは、固定された基質捕捉性のＧＳＴ−ＰＴＰ融合タンパク質で選択した。複数ラウンドの選択の後、個々のクローンをＥＬＩＳＡ及びＳＰＯＴ分析で確認した。ディスプレイされたペプチドの重要なものをコードする配列は、サブクローニングして、Ｅｌｋキナーゼを発現する細菌中で同時発現させた。この結果得られたタンパク質は、その後、ＰＴＰの野生型バージョンの基質として用いた。この操作手順を用いて、いくつかのＰＴＰの共通配列を同定した。最後に、基質認識に重要であると記載されている触媒ドメイン中の特定の残基に変異を有するＰＴＰを用いて、同一のプロトコールを実施した。
【００９３】
各ファージが特有の（ホスホ）ペプチドを提示するＭ１３バクテリオファージライブラリーに、５つのＰＴＰを曝露した。提示されたペプチドは、自然なファージのタンパク質に隣接された硬直した構造中に埋め込まれた。この同じファージディスプレイ法がキナーゼの選択性の研究において効率的であることが既に示されている（２１〜２３）。このファージの主要キャプシドタンパク質であるタンパク質ＶＩＩＩ上にディスプレイされたペプチドレパートリーを用いたので、これにより、提示される配列のコピー数が増加した（２４）。同じライブラリーは、以前、ｆｙｎキナーゼのリン酸化部位をマッピングするのに用いられている（２２）。リン酸化されたランダムライブラリーの使用によって、ＳｈｃにおけるＰＴＢドメインの共通配列も同定された（２２）。さらに最近では、ファージ上に発現されたｃＤＮＡライブラリーが、ＳＨＰ−２におけるＳＨ２ドメインと相互作用するリガンドの同定に効率的であることも示されている（２５）。
【００９４】
この実施例では、事前にリン酸化されたＭ１３ファージライブラリーを利用した操作手順（２６）を用い、それに続いて、異なるＰＴＰによる「捕捉」を行った。ＰＴＰ１Ｂの共通配列を同定したが、これは、既に記載されているものとは異なっていた（１９）。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＯＴ技法を用いることによって得られた配列の正当性を確認した。後者の方法は、同定された配列中の、発見された個々のアミノ酸をテストするために、そして、認識されるのに必要な最小のアミノ酸をマッピングするために用いた。さらに、この技法によって、ＤＮＡシーケンシングより得られたデータから、直接、陽性クローンを広範囲にスクリーングすることが可能となった。これに従って、近縁のＰＴＰ（ＰＴＰ−Ｓａｐ１、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、及びＰＴＰ−β）を用いた新ラウンドのパニングを行った。これらのホスファターゼは、異なったファージに対する選択性を示した。
【００９５】
材料及び方法
クローニング及び精製
ＰＴＰは、以前に記載されている（２７）ように、クローニングし、精製した。簡潔には、すべてのＰＴＰにおける触媒ドメインの始め及び終わりに対応する特異的プライマーを用いて、注目の領域を含有するＥＳＴをＰＣＲによって増幅した。これらのプライマーは、５′端にＥｃｏＲＩ部位を、そして３’末端にＮｏｔＩ部位をもつように設計した。これらの２つの制限部位は、触媒ドメインをｐＧＥＸ４ＴＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にインフレームでクローニングするのに用いた。捕捉を行う変異体を構築するために、発明者らは、記載されている（２７）ような、ＤからＡへの突然変異を生成する内部プライマーを設計した。ＰＴＰ−Ｓａｐ１中のＲ８８位の変異は、次の内部プライマーを用いて行った。即ち、５’ＡＴＴ ＧＴＡ ＧＣＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＧＣ ＧＴ３’及び５’ＡＣＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＣＴ ＡＣＡ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＧＣ ＴＧＣ ＣＣＴ ＡＴＧ ＡＣＴ Ｇ３’である。ＳＰＯＴ分析に用いられたクローンは、ＧＳＴとインフレームなＰＫＡリン酸化部位をコードする改変されたｐＧＥＸ２ＴＫにサブクローニングした。コンストラクトはシーケンシングによってチェックした。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（コドン＋；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を形質転換して、シングルコロニーを、３７℃、２５ｍＬのＬＢ＋ａｍｐ＋Ｃｍ中で、ＯＤが０．５に達するまで増殖させた。タンパク質生成は、最終濃度２５０μＭのＩＰＴＧを添加した後、３時間、３０℃で行った。細菌を沈殿させ、溶菌緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ トリトンＸ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ＋プロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリート（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社））に再懸濁し、さらに、氷上で１時間のリゾチーム（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）処理と、それに続く３ラウンドの超音波処理によって溶菌した。溶菌液の上清を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の５０％溶液１００μｌと、４℃、２時間以上インキュベートした。最後に、ビーズを十分に洗浄し、１０ｍＭ グルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で、ＰＴＰを溶出した。グリセロールを最終濃度２０％まで添加し、生成されたタンパク質の量をＢｉｏ Ｒａｄ社のタンパク質アッセイで測定し、そして使用するまでアリコートを−２０℃で保存した。
【００９６】
ＰＥＰ−ＧＳＴコンストラクトは、以下の通りに調製した。用いられたプライマーは、Ｍ１３のｐＶＩＩＩキャプシド配列＋２か所の制限部位（ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ）に対応しており、センス配列が、５’ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＴＴＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＡ３’であり、アンチセンス配列が、５’ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＣＣ Ｇ３’であった。ファージＤＮＡは、ＰＣＲミックスに１０９のファージを添加することにより、直接増幅した。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いたＰＣＲの後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ＰＣＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてＤＮＡ断片（１００ｂｐ）を精製し、さらにＵｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＤＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でゲル抽出した。最後に、クローニング及びタンパク質精製を、ＰＴＰに関するものと同じプロトコールに従って、ただし、ＴＫＢ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）細菌を形質転換し、シングルコロニーを増殖して、メーカーによる記載に忠実に従ってタンパク質生成及びリン酸化を誘導したことを唯一の相違点として、実行した。この場合も、すべてのコンストラクトは、タンパク質生成の前にＤＮＡシーケンシングでチェックした。
【００９７】
ＳＰＯＴ分析のためのＧＳＴ−ＰＴＰの標識化は、以下の通りに行った。２〜５μｇのＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に４℃で結合した。洗浄後、ＧＳＴ融合タンパク質は、ウシ心臓から得たプロテインキナーゼ（Ｓｉｇｍａ社）によって、ＰＫＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）中で、３５μＣｉの（γ−３２Ｐ）ＡＴＰの存在下に、氷上で３０分間、放射性同位元素標識した。洗浄後、融合タンパク質は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中の１０ｍＭ 遊離グルタチオンでビーズから溶出した（２８）。
【００９８】
ライブラリーのリン酸化
ファージ（１０９〜１０１０）は、全容積２０μｌのキナーゼ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、２．５ｍＭ ＤＴＴ、及び１ｍＭ ＡＴＰ）中、３０℃で、３時間、インキュベートした。まず、未精製ライブラリーをＰＴＰ捕捉変異体上でアッセイしたが、バックグランドが高く、リン酸化されたものも、リン酸化されていないものも、結合したクローンの数のいかなる増幅も観測できなかった（データは示されていない）。従って、全ライブラリーをリン酸化して、抗ＰＴｙｒカラム（Ｕｐｓｔａｔｅ社）中を通した。結合したファージをフェニルリン酸で溶出し、クローンは再び、カラム中を二度通した。増幅されたチロシン含有ファージは、その後、４℃でＴＥ中に保存し、捕捉実験に用いた（下記参照）。得られたファージの配列分析では、チロシン周辺のアミノ酸組成にいかなる偏向も示されず、配列決定された３０クローンのうち２クローンのみがチロシンを全く持たなかった（結果は示していない）。さらに、どの配列も二度は見いだされなかった。発明者らは、野生型ファージはリン酸化されず、それに対してライブラリーは高度にリン酸化されるという以前に得られた結果（（２２、２５、２９）データは示されていない）を確認した。これは、発明者らのリン酸化プロトコールに従い、（γ−３２Ｐ）ＡＴＰをトレーサーとして用いて検査した。
【００９９】
選択されたファージのパニング、増幅、及びシーケンシング
ファージ（１０８〜１０９）は、キナーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、そして、３ユニットのｓｒｃキナーゼを含む場合と、含まない場合とがある）中、３０℃で、３時間、インキュベートした。バクロウイルスから精製されたｐ６０ｓｒｃは、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。グルタチオンセファロースビーズは、捕捉緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）に最終濃度１％のＢＳＡを含む溶液中で、４℃、４時間、３μｇのＧＳＴ又はＰＴＰ−ＧＳＴでプレコーティングした。ファージは、４℃で、３０分間、ＧＳＴ−ビーズを用いてプレクリアーし、遠心して、上清を、４℃で、１．５時間、コーティングされたＰＴＰ−ＧＳＴと定常的に振盪しながらインキュベートした。最後に、ビーズをスピンダウンして、何度か（第１パニングでは５回、その後は１０回）、最終濃度０．２５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。ファージは、定常的に振盪しながら、室温で１０分間、酸処理（グリシン緩衝液、ｐＨ２．７）することによってＰＴＰ−ＧＳＴから溶出し、ビーズをスピンダウンして、ファージを上清中に回収した。ｐＨを回復するために、１／１０容積の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）溶液を添加した。最後に、両方の分画（結合及び非結合）で、ファージのタイターを測定し、結合分画の残りは、記載された操作手順（２４）に従い、ＸＬ１ ＭＲＦ’細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を感染させるのに用いた。翌日、細胞をこすり取り、メーカーの操作手順に従って、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてファージを増幅した。
【０１００】
捕捉されたクローンの数に増加が観測された場合、ファージをシングルクローンとして精製し、フォワードプライマー：５’ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＴＣＴ ＴＴＡ ＧＴＣ ＣＴＣ３’及びリバースプライマー：５’ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＧＡＴ ＡＧＴ ＴＧＣ３’をファージプライマーとして用いて、コロニーＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、次に、同じプライマーを用いて精製し、配列決定した。配列は、ＳｅｑｍａｎＩＩソフトウェアを用いて、両方向に読んだ。
【０１０１】
ＧＳＴ−ＰＥＰコンストラクト及びｐＮＰＰの脱リン酸化アッセイ
１００ｎｇのＰＥＰ−ＧＳＴコンストラクトを、ＰＴＰ緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、０．０５％ ノニデット Ｎｐ−４０、及び１ｍＭ ＤＴＴ）中で、１０ｎｇのＰＴＰ野生型とインキュベートした。反応は、異なったタイムラップに等容積のアリコートを、５０ｍＭ バナジン酸塩溶液と混合して停止させた。最後に、９６ウェルドットブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、全混合液をニトロセルロース膜上にスポッティングし、基質のリン酸化状態を抗ホスホチロシン抗体（クローンＧ４１０、Ｕｐｓｔａｔｅ社）を用いて可視化した。
【０１０２】
ｐＮＰＰ加水分解では、２００ｎｇのＰＴＰを、全容積５０μｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、及び２ｍＭ ＤＴＴ）中、室温で、異なった量の汎用基質（０〜６０ｍＭ）とインキュベートした。プレートを４０５ｎｍで計測し、動態パラメータは、非線形回帰法プログラム（Ｇｒａｐｈｐａｄ社、Ｐｒｉｓｍ（登録商標））を用いて決定した。
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ
シングルクローンは、以前に記載されているように増幅した。コーティングは、ＧＳＴ−ＰＴＰ又はＧＳＴ単独で、ＰＢＳ中で行った（９６ウェルプレート形式ではウェルあたり２μｇ）。ファージのリン酸化は、記載されたプロトコールに従って（ホスホ−Ｔｙｒ認識の特異性を検査し、それによって、陽性クローンが触媒ドメインに特異的であることを確認するために、（３０）に示されるように、３Ｕのｓｒｃキナーゼの存在下、及び非存在下に）行い、この処理過程中に、各ウェルを、５％無脂肪粉ミルクのＰＢＳ溶液中でブロッキングした。ウェルをＰＢＳ−０．５％ Ｔｗｅｅｎ（商標）で５回洗浄し、ファージを、１００μｌの捕捉緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中のＰＴＰ−ＧＳＴ又はＧＳＴと、４℃で２時間、インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−５％ミルクで十分に洗浄し、１時間ブロッキングした。ファージの存在は、一次抗体として抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて検出し、シグナルは、ヤギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社）で増幅し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のプロトコールの記載に従って、ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、ペルオキシダーゼ活性によって明らかにした。
【０１０４】
ＳＰＯＴ合成及びプロービング
ペプチドは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社によって提供された誘導体化したセルロース膜上で、手動で合成した。２０種のＦｍｏｃ−アミノ酸活性エステルも、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社によって提供された。Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社からのＦｍｏｃ−ホスホチロシン（＃０４−１２−１１５６）を、カップリング試薬であるＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ；Ｓｉｇｍａ社）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ；Ｆｌｕｋａ社；Ｅｓｐａｎｅｌら、投稿済み）の存在下で取り込ませた。
【０１０５】
膜は、ウエスタン洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１％ トリトンＸ−１００、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）＋ＳＰＯＴブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）でブロッキングし（少なくとも２時間）、４℃でプロービングした。２時間後に、膜をウエスタン洗浄緩衝液で何度か洗浄し、そのオートラジオグラフィーを行った。
【０１０６】
Ｔｙｒ偏向ライブラリーの構築
発明者らは、ｐＶＩＩＩタンパク質のＣ末端部分で９アミノ酸のインサートをディスプレイする、（１）に記載されているファージミドを用いた。発明者らは、（ｉ）インサートの５’末端にあるＥｃｏＲＩ部位に対応するＥＦモチーフを除去すること、及び（ｉｉ）ディスプレイされる配列の中央に固定されたチロシンを添加することを望んだ。ＤＮＡインサートは、５’末端にＭｕｎＩを、そして３’末端にＢａｍＨ１を有するように設計した（下線部）。プライマーは、ポリメラーゼによる充填のために、ｐＧＸｂ（太字）プライマーのリバース配列も有するように延長されている。従って、ＥＬＸＸＸＸＹＸＸＸＸＤＰ（Ｘはどんなアミノ酸も意味する）をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＡＴＡ ＣＡＡ ＴＴＧ （ＮＮＫ）４ ＴＡＴ （ＮＮＫ）３ ＮＮＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＣＡＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＣＣ ＧＧＡ Ｇであり、ただし、ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ、かつＫ＝Ｇ又はＴである。ライブラリーを構築するのに用いられた方法は、（２、３）に記載されている通りに実施した。簡潔には、４００ｐｍｏｌｅのライブラリープライマー及びｐＧＸｂ、（５’−ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＴＧ−３’）をアニールし、相補鎖を、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡ ＰｏｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて充填した。次に、ＤＮＡをフェノールクロロホルム沈殿によって抽出し、産物をＭｕｎＩ及びＢａｍＨＩで消化した。その後、混合物をコントロールと共に１５％ポリアクリルアミドゲルにロードし、正しい大きさとして移動するバンドを切り、回収した（４）。インサートは、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで事前に開環されたｐＣ８９ベクターにクローニングした（１）。ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ’エレクトロポレーション用コンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を、このライゲーション反応液で形質転換し、２０枚の大きなプレート（アンピシリン及びテトラサイクリンを含む１００ｍｌのＬＢアガー）に広げた。細胞を採取し、２ｍＬアリコートを凍結させた。
【０１０７】
ファージは以下の通り増幅した。Ｔｅｔ（１２．５μｇ／ｍｌ）及びＡｍｐ（５０μｇ／ｍｌ）を補充された５リットルのＬＢに、２ｍｌのライブラリー細菌を希釈し、ＯＤ６００が０．２〜０．３に達するまで振盪した。このとき、発明者らは、最終濃度２．４μｇ／ｍｌのＩＰＴＧと、タイター１０１２のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）とを添加し、再び５時間、３７℃で、振盪した。ファージをポリエチレングリコールで二度沈殿し、ＣｓＣｌの平衡遠心で精製した（２）。ライブラリーの品質を力価測定によってテストし、最終形質導入ユニットタイターは１０１０ファージ／ｍｌであった。
【０１０８】
結果
この実施例中では、リン酸化されたチロシン残基を「ｐＹ」と表す場合がある。添付の配列リストでは、このアミノ酸残基は、通常のチロシン残基として、即ち「Ｔｙｒ」又は「Ｙ」として現れる。図においては、ホスホチロシンを「Ｚ」として示す。
【０１０９】
ＰＴＰ１Ｂに関するファージディスプレイ
ＰＴＰ１Ｂ捕捉変異体（（１２）並びに、材料及び方法）をポジティブコントロールとして用いて、基質認識を研究するためにファージディスプレイライブラリーを用いることの有効性を検証した。ＰＴＰ１Ｂには、いくつかの利点がある。即ち、（ｉ）現在、ＰＴＰ１Ｂの主要な細胞基質について詳しく記載されていること（９、１０）、（ｉｉ）リバースアラニンスキャンが行われ（１９）、「最適」の基質共通配列の決定が行われたこと、及び（ｉｉｉ）ＰＴＰ１Ｂとペプチドとの相互作用に関する結晶学的記述の正確なマッピングが行われたことである（３１、３２）。
【０１１０】
チロシン偏向ライブラリー（材料及び方法を参照）を３回パンニングした後に、結合したファージの濃縮が観測された。捕捉されたファージは、保存モチーフ（表３）を見出すために直接配列決定した。その後、適合させたＥＬＩＳＡアッセイ（材料及び方法を参照）を行ったが、このＥＬＩＳＡはすべての捕捉されたクローンを検出するのに十分な感受性を持たなかった。その上、このアッセイの成功率は、テストされるＰＴＰに依存するように見えた（下記参照）。
【０１１１】
これらの実験では、ファージのキャプシドが２つの選択可能なアミノ酸（リン酸化チロシンの−２及び−１の位置にそれぞれＥ及びＦ）をディスプレイするのが観測された。この偏向から、何故、ランダムにディスプレイされた配列の第１ポジションにチロシンを有する陽性ファージが、多数得られたのか説明できる。それにもかかわらず、キャプシドのアミノ酸がチロシンに先行しないところで、１ｂ−４（図１及び表３）のようないくつかのファージが、独立した保存モチーフを表した。実際、基質チロシンの−１におけるフェノール基が相互作用を安定させ、さらに、触媒ポケットにリン酸を配置するであろうことが実証されている（３１）。
表III
PTP1Bによって選択されたクローン
クローン ディスプレイされた配列 プール中のコピー数 ELISA
1b-1 EFpYATYGSAATDPAK (配列番号12) 4X +
1b-2 EFIpYQNLADPLDPAK (配列番号13)
1b-3 EFpYDIILAGMADPAK (配列番号14)
1b-4 EFQpYZGEYTRGDPAK (配列番号15)
1b-5 EFPEpYAMLSNSDPAK (配列番号16)
1b-6 EFEPIpYNAYQVDPAK (配列番号17)
1b-7 EFpYGTYRGQDSDPAK (配列番号18) +
1b-9 EFpYNLYEGVMSDPAK (配列番号19)
1b-11 EFQSPVpYGNFADPAK (配列番号20)
1b-12 EFATpYEEYALMDPAK (配列番号21)
1b-13 EFpYGTFAPKPLDPAK (配列番号22)
1b-14 EFpYGTYRGQDSDPAK (配列番号23) 2X
コンセンサス： φｐＹＧＸＹ
【０１１２】
次に、捕捉変異体によって選択されたコンセンサスペプチドが、ＷＴ ＰＴＰ１Ｂによって脱リン酸化されるであろうか否かをテストした。ディスプレイされた配列をＧＳＴ発現性ベクターにサブクローニングすることにより、最も頻繁な配列であると判明した配列を、ＰＴＰ１Ｂが脱リン酸化できるかどうかテストした（１ｂ−１）。ＷＴ型のＰＴＰ１Ｂがディスプレイされたペプチドを脱リン酸化できることが判明した（示されていない）。他のものによって既に観測されているように、ＧＳＴタグがＴＫＢ１細胞中でＥｌｋキナーゼによってリン酸化されなかったことが留意された。これは、ディスプレイされたペプチドに特異的な脱リン酸化が検出されたことを意味する。
【０１１３】
最後に、ファージから単離された共通配列の結合を確認するために、ＳＰＯＴ分析を行った（Ｅｓｐａｎｅｌら、印刷中）。この技法により、１０個の配列（表３）をテストして、ＥＬＩＳＡと同様の結果が得られうるかどうか検査することが可能となった。ＳＰＯＴプロトコールを用いて、ホスホ−Ｔｙｒ（ｐＹ）を有するペプチド、又はホスホ−Ｔｙｒ（ｐＹ）を持たないペプチドを膜上で（材料及び方法を参照）合成した。
【０１１４】
さらに、複数のＴｙｒに関して、すべての可能なホスホペプチドの組合せを検査した。２つの配列（１ｂ−６及び１ｂ１１）を除外したすべてが、ＰＴＰ１Ｂ捕捉変異体によって認識された。興味深いことに、これらの２つの配列は、ＰηｐＹＸＸφコンセンサス（Ｘはどんなアミノ酸も表し、ηはＴｙｒ又はＰｈｅ、そしてφはどんな疎水性アミノ酸も表す）を共有する。ＰＴＰ１Ｂが好むコンセンサスを有するいくつかの配列は、ＥＬＩＳＡでは見いだされなかったが、ＳＰＯＴでは確認された（例えば、１ｂ−９、１ｂ−４）。二重リン酸化ペプチドは、単独リン酸化ペプチド（例えば、１ｂ−１スポット４又は１ｂ−１２スポット３６）ほどよく反応するようには見えなかった。興味深い例外はＳＰＯＴ１５であって（クローン１ｂ−４）、２つのリン酸化されたＴｙｒが相互に伴っている場合、２つのリン酸化チロシンが他のアミノ酸によって切り離された場合より、結合が効率的になったように見えた。
【０１１５】
配列１ｂ−４がこのアッセイで最も良い基質であったので、これをバリンスキャン用に選んだ（図１Ｃ）。このアッセイでは、各位置をバリンと交換し、結合をテストする。このペプチド上の結合に、３つの位置、即ち、−１、＋１、及び＋３が決定的であった。
【０１１６】
ホスホ−Ｔｙｒ（ｐＹ）周辺における、最小の好ましい配列は、
ＥＦｐＹＧ／ＡＴＹＧ／Ａ（配列番号４〜８）
と定義できるかもしれない。また、＋２において求核性アミノ酸（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）が、そして＋３において、Ｐｈｅ（例えば、１ｂ−１３では、それ以外のコンセンサスが保存されていてもシグナルがより弱い）ではなくＴｙｒが好まれている可能性もある。
【０１１７】
ＰＴＰ Ｓａｐ１及びＰＴＰ−βに関するファージディスプレイ
ＰＴＰ−Ｓａｐ１及びＰＴＰ−βは、ＰＴＰの同じサブファミリーに属する（１、２）。
【０１１８】
ＰＴＰ１Ｂで行われたように、Ｔｙｒ偏向ライブラリーのパニングを行ったところ、両方のＰＴＰに関して、３ラウンド後にファージ濃縮を観測することができた（図２）。シングルクローンをＥＬＩＳＡでテストした。ＰＴＰ−Ｓａｐ１は、捕捉が非常に効率的であり、陽性クローンを容易に検出することができた（表４）が、ＰＴＰ−βは、この方法を用いてテストされた３０ファージのうち、３ファージしか捕捉することができなかった（表５）。Ｓａｐ−１クローンの配列は、ＰＴＰ１Ｂ（表２）の配列を想起させるものであった。位置−１及び＋３におけるフェニル基（Ｐｈｅが好まれる）と、＋１における不変のグリシンとが、認識される最小の共通配列であるように思われる。脱リン酸化アッセイは、テストされたすべてのクローンで保存された酵素活性を示した（データは示されていない）。ＰＴＰ−βによって選択されたクローンは、濃縮が観測されたにもかかわらず、より可変的であり、ＥＬＩＳＡ（表４）で陽性であったものは、−１にＬｙｓ又はＴｈｒ（疎水性アミノ酸）を有した。陽性クローンの配列は、この位置におけるこれら２つのアミノ酸のうち１つを好む選択性を示した。その上、このホスファターゼは、触媒アッセイであまり効率的でないように見え、実際、ＰＴＰ−Ｓａｐ１の同じ実験と比較したところ、ＧＳＴペプチドの脱リン酸化が弱かった（データは示されていない）。
表IV: PTP-Sap1によって選択されたクローン
クローン ディスプレイされた配列 プール中のコピー数 ELISA
x2 EFpYGQFpYGPPQDPAK (配列番号24) +
x3 EFpYGAYTSTTADPAK (配列番号25) +
x5 EFpYGAYSNADLDPAK (配列番号26) 2X +
x9 EFpYGTFAQSAEDPAK (配列番号27) 3X +
x10 EFpYGAFGDFTKDPAK (配列番号28) +
x41 EFpYGELGHISQDPAK (配列番号29) +
x42 EFDVpYGSATSMDPAK (配列番号30) +
x50 EFpYGSFFPISQDPAK (配列番号31) -
x51 EFpYGAFGAP. (配列番号32) +
x58 EFpYGPVASDASDPAK (配列番号33) +
コンセンサス： ＦｐＹＧＡφ
表V: PTP-bによって選択されたクローン
クローン ディスプレイされた配列 ELISA
B1 EFLpYQSFSGNVDPAK (配列番号34) ++
B27 EFLpYGSFFRPPDPAK (配列番号35) +
B32 EFTpYQTYSPAADPAK (配列番号36) +
コンセンサス： ＬｐＹＱ／ＧＳＦ
表VI
Km (mM)
Sap-1WT 2.665 +/-0.463
Sap-1R88N 2.67 +/-0.2295
【０１１９】
ＰＴＰ−Ｓａｐ１における陽性クローンのＳＰＯＴ分析
ＰＴＰ−１Ｂにおいてと同様、ＰＴＰ−Ｓａｐ１における陽性クローンをＳＰＯＴでテストした。Ｓａｐに特異的な配列のほとんどすべてがＥＬＩＳＡテストにおいて陽性であった。最良のファージは、ＥＦｐＹＧＡφという共通配列を共有していた。ＳＰＯＴ分析（図３Ａ）では、すべての配列が陽性であり、再度、二重リン酸化されたファージは、より弱いシグナル（例えば、Ｘ−５）を示した。さらに、第２のＴｙｒの配列前後関係も相互作用に影響を及ぼした。例えば、Ｘ−２は、両方のリン酸化されたチロシンで同様のＳＰＯＴ結果を示したが、これはおそらく、第２のＴｙｒも好まれる環境（ＦｐＹＧ）の中にあるという事実によるものである。この実施例は、第２のＴｙｒについてのポジティブセレクションも可能であるという仮説を支持する。
【０１２０】
好まれる配列中の必要なアミノ酸を記述するために、バリンスキャンを次に行うことにした（図３Ｂ）。Ｘ−５は、それが二度現れ、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合が最も強かったため選択された。このアッセイでは、スポット９〜１２が極めて重要であるように見えた。これらのアミノ酸の１つがバリンに変わった際、それにより結合が劇的に反転した。また、＋１位におけるＧｌｙも、選択的な位置であった。このＧｌｙは、ランダム配列から発して、配列決定されたすべてのクローンで選択されていた。加えて、＋２におけるＡｌａはそれほど必須ではないが、小さいアミノ酸がファージディスプレイのこの位置で選択されているように見えた。従ってこれは、Ｖａｌでの置換によって結合が抑制されるものではない。最後に、＋３におけるフェニル基は、選択されたクローンのほとんどすべてに存在するが、Ｖａｌで置換された場合、結合を解除しなかった。ファージの配列を注意深く見ると、Ｘ−５８は＋３にＶａｌを有し、かつＥＬＩＳＡで認識されており、即ち、この位置でのバリンスキャンは、好まれるアミノ酸（Ｐｈｅ）をそれほど好まれない（Ｖａｌ）ものに交換するだけであることを意味する。実際、バリンはこの位置でＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２の２つＰＴＰに必須であることが判明した（データは示されていない）。
【０１２１】
この分析から、Ｖａｌによって置換できず、その位置の構造グループに限定されていると思われる選択性の位置が３か所（−２、−１、＋１）あると結論することができた。置換された際に、よりフレキシブルな他の位置（＋２及び＋３）もおそらくある。従って、ＰＴＰ−Ｓａｐ１に関する共通配列は、ＥＦｐＹＧＡＦＡ／Ｇである。
【０１２２】
ＰＴＰ−Ｓａｐ１における触媒ドメイン内の主要残基を変異させることによる基質共通配列の改変
ＰＴＰ−βと、ＰＴＰ ＳＡＰ１との触媒ドメイン間の配列同一性は非常に高い（５０％以上）。それにもかかわらず、選択されたクローンはいくつかのアミノ酸において異なっていた。即ち、位置−１は、ＰＴＰ−Ｓａｐ１用のキャプシド配列では、厳密にＰｈｅでなければならないが、ＰＴＰ−βでは、Ｌｅｕ又はＴｈｒであることが判明した。基質ペプチドを伴ったＰＴＰ１Ｂの共結晶化産物が以前にマッピングされている（３１、３２）。Ａｒｇ４７（触媒ドメインにおける付番（１９、２０、３１−３３））における相互作用の正確な記述が示されている。このアミノ酸は、「理想的な」ペプチド基質中のＰｈｅ−１と相互作用すると考えられている。この領域の単純なアライメントは、ＰＴＰ−Ｓａｐ１におけるこの位置に対応するアミノ酸がＡｒｇ即ちＡｒｇ８８であり、ＰＴＰ−βにおいてはＡｓｎ即ちＡｓｎ１０１であることを示す（図４）。この位置は実際に、Ｔｙｒリン酸化ペプチドにおける、位置−１に対する親和性の主要な変調因子であるかもしれず、これは、ＰＴＰ−Ｓａｐ１クローンとＰＴＰ１Ｂクローンとの間の類似性を説明するものである。
【０１２３】
この仮説をテストするために、ｗｔバックグランド及び捕捉変異体バックグランドでＰＴＰ−Ｓａｐ１Ｒ８８Ｎ変異体を生成した。まず、この変異が基質の非特異的な認識を改変しないことを確認するために、汎用ホスファターゼ基質（ｐＮＰＰ）に対する、変異体の触媒能をテストした（表６）。
【０１２４】
次に、この捕捉変異体をＴｙｒ偏向ライブラリーに曝露した。３ラウンドの後、結合したファージの濃縮が観測されたが、クローン数のこの増加は、ホスホ−Ｔｙｒに依存していた（係数１０３〜１０４の間）。ＤＮＡシーケンシングの後、発明者らは、ＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎ捕捉変異体が、ファージの保存されたファミリーと相互作用でき、これらの配列がＰＴＰ−Ｓａｐ１によって捕捉されたクローンの配列と異なることを観測した（表７）。
【表３】
【０１２５】
位置−１に疎水性アミノ酸があることは、ＰＴＰ−βプール中で観測されたクローンと同様である。従って、ＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎは、基質選択性においてＰＴＰ−βに類似している。実際に−１位が改変されたので、これは、認識過程中に、この位置が触媒ドメインのアルギニン又はリジン（例えば、ＰＴＰ ＳＨＰ−１／２）と強く相互作用するという考えを援護するものである。ＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎ変異体は−１でＬｅｕを選択したが、この選択は厳密なものではなく、これは、おそらく他のアミノ酸もこの位置の選択性に関与することを示すものである。それにもかかわらず、選択されたクローンの大部分は−１で疎水性アミノ酸（η）を有する。
【０１２６】
表６は、８個の異なったＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎクローンの配列を示す。
表VIII: PTP-Sap1 R88Nクローン
Sm-1 EFAHLpYGTFREDPAK (配列番号67)
Sm-2 EFGATpYGVYTSDPAK (配列番号68)
Sm-7 EFLpYGEIQGTQDPAK (配列番号69)
Sm-8 EFLpYANVERSSDPAK (配列番号70)
Sm-10 EFIpYGQILPRSDPAK (配列番号71)
Sm-11 EFpYGQIGDHLVDPAK (配列番号72)
Sm-12 EFpYGEYRPRAQDPAK (配列番号73)
Sm-15 EFIpYGSFHQTADPAK (配列番号74)
コンセンサス： ηｐＹＧＸφ．
【０１２７】
クローンプールのＥＬＩＳＡシグナルは、あらゆる選択ラウンドの後に増強されたが、これは、陽性クローンの数がラウンド中に増大し続けていたことを確認するものである（データは示されていない）。従って、これらの変異体に捕捉された配列を直接ＳＰＯＴ膜に曝露して、最小コンセンサスがどのように影響されたかテストすることにした。図５に示すように、ＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎの親和性が変化していた。位置−１において、Ｐｈｅはまだ受容されたが、基質認識がよりフレキシブルになっており、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＴｈｒもＳＰＯＴアッセイで認識されうる。１クローン（ｓｍ−８）のみがここで認識されていない。触媒ドメインＲ８８Ｎ変異体によって、好まれたモチーフは、
ηｐＹＧＸφ
である。
【０１２８】
まとめると、これらのデータは、クローンを選択するための、ファージディスプレイと組み合わせたＰＴＰ点変異体研究と、触媒ドメインから基質に相互作用するアミノ酸を発見するためのＳＰＯＴ分析とを提供する。
表ＩＸ 上記に提示された研究フレームで得られた結果をまとめる。すべての配列が位置０にホスホチロシン（ｐＹ）を有する。
Ｓａｐ１：
−２：５０％Ｅ又は５０％Ｌ／Ｖ（疎水性）
−１：１００％疎水性（７７％Ｉ／Ｌ）
＋１：１００％Ｇ
＋２：３６％Ａ、２９％Ｔ、１４％Ｓ、及び２１％その他
＋３：疎水性、８５％フェノール基（２０％Ｙ及び６５％Ｆ）
＋４：５８％Ａ又はＧ
→コンセンサス：ＥＬｐＹＧＳＹＹＡ（配列番号１）
→例：ＥＦｐＹＧＡＦＡ／Ｇ（Ｋｍ＝７．０ｕＭ）（配列番号２、３）
→例：ＡＥＧＥＬｐＹＧＳＬＹＡ（Ｋｍ＝７．６ｕＭ）（配列番号４）
ＰＴＰ１Ｂ：
−２：６０％Ｅ及び２０％Ｐ
−１：１００％疎水性（そのうち６０％Ｆ）
＋１：６６％Ｇ／Ａ
＋２：４７％Ｔ
＋３：１００％疎水性、そのうち８０％フェノール基（６７％Ｙと１３％Ｆ）；２０％Ｉ／Ｌ
＋４：５３％Ｇ／Ａ
→コンセンサス：ＥＦｐＹＡ／ＧＴＹＧ／Ａ（配列番号５〜８）
ＰＴＰ−β
−３：５０％酸性（Ｅ又はＤ）
−２：６２％Ｌ、１３％Ｅ
−１：１００％疎水性（６２％Ｌ）
＋１：１００％Ａ（２３％）又はＧ（７７％）
＋２：３８％Ｓ
＋３：６２％Ｙ、２３％Ｌ、及び１５％酸性
＋４：３１％フェノール基（Ｙ又はＦ）
→コンセンサス：ＥＬＬｐＹＧＳＹＹ（配列番号９）
ＳＨＰ１：
−２：５６％Ｅ、２２％Ｐ
−１：８９％疎水性（５６％Ｆ、それ以外はＹ又はＬ）
＋１：１００％Ａ
＋２：３３％Ｅ、２２％Ｑ、又はＨ
＋３：８９％疎水性（６７％Ｖ、２２％Ｉ）
＋４：４４％Ｇ
→コンセンサス：ＥＦｐＹＡＥＶＧ（配列番号１０）
ＳＨＰ２：
−２：７７％Ｅ及び２７％Ｆ
−１：１００％疎水性、そのうち９０％フェノール基（７７％Ｆ）
＋１：７７％Ａ
＋２：４４％Ｅ
＋３：７７％Ｖ、２３％Ｉ
＋４：６６％Ｇ
＋５：６６％Ｒ
→コンセンサス：ＥＦｐＹＡＥＶＧＲ（配列番号１１）
【０１２９】
概要及び考察
ファージキャプシド上に発現されたランダムペプチドライブラリーを、３つのＰＴＰにおける触媒ドメインの特異性を研究するのに用いた。パニングの各ラウンド後に、捕捉されたファージプールの濃縮が観測され、また、ＰＴＰ捕捉変異体はシングルファージを捕捉することができた。同じ配列をＧＳＴ融合タンパク質としてディスプレイした際、野生型ＰＴＰはそれを脱リン酸化することができた。
【０１３０】
ファージディスプレイとＳＰＯＴ技術との組合せによって、このように、これらのＰＴＰによる基質認識に必要な主要アミノ酸の定義が得られた。
【０１３１】
最後に、基質認識に直接関与すると予測されたアミノ酸は、変異された際にそれらが好む基質配列を変えるため、実際に確認できることが示された。
【０１３２】
ＳＨＰ１及びＳＨＰ２
上記に概説された操作手順を用いて、ＳＨＰ１及びＳＨＰ２の最適な基質配列（表８）を得ることができた。２つのＰＴＰは、近縁の触媒ドメインを有し、これらの最適配列であるＥＦＺＡＥＶＧ（配列番号１０）及びＥＦＺＡＥＶＧＲ（配列番号１１）も同様に強い近縁性を示し、ただし他のＰＴＰ認識モチーフとは明確に異なっていた。
【０１３３】
不遍向ライブラリーでのＰＴＰ−βの再スクリーニング
先に述べたように、多くのモチーフがキャプシドによってコードされている２つのアミノ酸を合体していることが判明した。従って、ライブラリー中のランダム配列が異なった前後関係で提示されている第２のライブラリー（「ライブラリー６」、実験手順を参照）を生成した。ランダム配列の中央にチロシンをコードするコドンが含まれている。この追加研究を用いたことによって、モチーフがＥＬＬＺＧＳＹＹ（配列番号９）に伸長された。この独立した実験は、この操作手順が、最適のＰＴＰ認識配列を同定するのに再現可能であることをさらに示した。
【０１３４】
この技法を用いて、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰ１Ｂ、Ｓａｐ１、ＰＴＰ−β、ＳＨＰ１、及びＳＨＰ２の理想的な基質を定義した。これらのペプチドは、それぞれのホスファターゼの基質に対する高度に特異的な阻害剤としての機能を果たすことができ、従って、それぞれのホスファターゼの阻害を必要とする疾患において有用である。
（参考文献）
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】ＹＺＧＸＹモチーフを含むＰＴＰ−１Ｂ結合性ペプチドのＳＰＯＴ分析を示す。Ａ：ファージディスプレイスクリーニングから得られたペプチドに対するＰＴＰ−１Ｂの結合。チロシン又はホスホチロシン（Ｚ）を含有する１５量体ペプチドをＳＰＯＴ膜上で合成した。ブロットは、放射性同位元素標識されたＰＴＰ−１Ｂ ＤＡ（ＷＰＤモチーフ内のアスパラギン酸がアラニンに変異されている捕捉変異体）でプローブした。Ｂ：（Ａ）における膜上でテストされたペプチドの配列。Ｃ：（Ｂ）における配列１ｂ−４のバリンスキャン。
【図２】ＰＴＰ−βによって捕捉されたファージの濃縮を示す。パニングの各ラウンド後にファージの力価測定をし、結合分画と非結合分画との間の比率を計算した。
【図３】ＥＦＺＧモチーフを含むペプチドに対するＰＴＰ−Ｓａｐ１の結合のＳＰＯＴ分析を示す。Ａ：ファージディスプレイから得られたペプチドに対するＰＴＰ−Ｓａｐ１の結合。ホスホチロシン（Ｚ）を有する１５量体ペプチドと、ホスホチロシン（Ｚ）をもたない１５量体ペプチドとを膜上で合成した。放射性同位元素標識されたＰＴＰ−Ｓａｐ１ＤＡの結合をオートラジオグラフィーで明らかにした。Ｂ：ＳＰＯＴにおける、バリン（下線部）スキャンによるクローンＸ５の結合部位マッピング。第１のチロシンのみがリン酸化されたが、これはそれがパネルＡで最も強い結合を示したものであったからである。膜は、放射性同位元素標識されたＰＴＰ−Ｓａｐ１ＤＡでプローブし、オートラジオグラフィーで明らかにした。
【図４】ＰＴＰ１ＢにおけるＲ４７の周辺領域での配列アラインメントを示す。このアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ配列アライメントソフトウェアを用いて行った。数字は触媒ドメインにおける付番に対応している。
【図５】（Ｂ）に示される配列を有するペプチドに対するＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８ＮのＳＰＯＴ上での結合を示す。ホスホチロシン（Ｚ）を有する１５量体ペプチドと、ホスホチロシン（Ｚ）をもたない１５量体ペプチドとを膜上で合成した。放射性同位元素標識されたＰＴＰ−Ｓａｐ１ Ｒ８８Ｎの結合をオートラジオグラフィーで明らかにした。１クローンのみが結合しなかった（Ｓｍ−８）。位置−１にＴ、Ｆ又はＩを有するクローン（それぞれ、クローンＳｍ−２、Ｓｍ−１１、及びＳｍ−１５）で最も強いシグナルが得られている。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−２：Ｅ、Ｌ、又はＶ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＩ又はＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ｇ、
＋２：Ａ、Ｔ、又はＳ、
＋３：疎水性アミノ酸、又はフェノールアミノ酸、特にＦ又はＹ、
＋４：Ａ又はＧ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項２】
ＥＬＹＧＳＹＹＡ（配列番号１）、
ＥＦＹＧＡＦＡ（配列番号２）、
ＥＦＹＧＡＦＧ（配列番号３）、及び
ＡＥＧＥＬＹＧＳＬＹＡ（配列番号４）
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１記載のホスホペプチド。
【請求項３】
−２：Ｅ又はＰ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＦ、
０：Ｙ、
＋１：Ｇ又はＡ、
＋２：Ｔ、
＋３：疎水性アミノ酸、特にＹ、Ｆ、Ｉ、又はＬ、
＋４：Ｇ又はＡ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項４】
ＥＦＹＡＴＹＧ（配列番号５）、
ＥＦＹＧＴＹＧ（配列番号６）、
ＥＦＹＡＴＹＡ（配列番号７）、及び
ＥＦＹＧＴＹＡ（配列番号８）
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項３記載のホスホペプチド。
【請求項５】
−３：酸性アミノ酸、特にＥ又はＤ、
−２：Ｌ又はＥ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ａ又はＧ、
＋２：Ｓ、
＋３：Ｙ、Ｌ、又は酸性アミノ酸、
＋４：フェノールアミノ酸、特にＹ、又はＦ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列ＥＬＬＹＧＳＹＹ（配列番号９）を含む、請求項５記載のホスホペプチド。
【請求項７】
−２：Ｅ又はＰ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＦ、Ｙ、又はＬ、
０：Ｙ
＋１：Ａ、
＋２：Ｅ、Ｑ、又はＨ、
＋３：疎水性アミノ酸、特にＶ又はＩ、
＋４：Ｇ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列ＥＦＹＡＥＶＧ（配列番号１０）を含む、請求項７記載のホスホペプチド。
【請求項９】
−２：Ｅ及びＦ、
−１：疎水性、特にフェノールアミノ酸、
０：Ｙ、
＋１：Ａ、
＋２：Ｅ、
＋３：Ｖ又はＩ、
＋４：Ｇ、
＋５：Ｒ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項１０】
位置−１のアミノ酸がＦである、請求項９記載のホスホペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸配列ＥＦＹＡＥＶＧＲ（配列番号１１）を含む、請求項９又は１０に記載のホスホペプチド。
【請求項１２】
５０個若しくは約５０個未満のアミノ酸、又は３０個若しくは約３０個未満のアミノ酸、又は２０個若しくは約２０個未満のアミノ酸、又は１５個若しくは約１５個未満のアミノ酸、又は約１０個のアミノ酸、又は約９個のアミノ酸、又は約８個のアミノ酸、又は約７個のアミノ酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のホスホペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のホスホペプチドの配列及び／又は構造に基づいて設計されたペプチドミメティック又は非ペプチド性ミメティックであって、前記ペプチドミメティックが、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではなく、Ｙはリン酸化されたチロシン残基である、ペプチドミメティック又は非ペプチド性ミメティック。
【請求項１４】
アミノ酸残基上の１つ又は複数の側鎖として存在する１つ又は複数の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含み、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではなく、Ｙはリン酸化されたチロシン残基である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のホスホペプチドの機能的誘導体。
【請求項１５】
前記部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、請求項１４記載の機能的誘導体。
【請求項１６】
前記ペプチドが細胞貫通性部分に連結されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のホスホペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のホスホペプチド、ペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、又は機能的誘導体の薬物としての使用。
【請求項１８】
癌、特に胃又は腸の癌の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項１又は２に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項１９】
糖尿病及び／又は肥満症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項３又は４に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２０】
請求項３又は４に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の食欲抑制剤としての使用。
【請求項２１】
炎症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項５又は６に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２２】
多発性硬化症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項５又は６に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２３】
固形癌又は転移癌などの血管新生依存性疾患の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項５又は６に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２４】
感染症、特にリーシュマニア症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項７〜９のいずれか一項に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ又は複数のホスホペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体を含み、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、又は希釈剤をさらに含んでいてもよい医薬組成物。
【請求項１】
−２：Ｅ、Ｌ、又はＶ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＩ又はＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ｇ、
＋２：Ａ、Ｔ、又はＳ、
＋３：疎水性アミノ酸、又はフェノールアミノ酸、特にＦ又はＹ、
＋４：Ａ又はＧ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項２】
ＥＬＹＧＳＹＹＡ（配列番号１）、
ＥＦＹＧＡＦＡ（配列番号２）、
ＥＦＹＧＡＦＧ（配列番号３）、及び
ＡＥＧＥＬＹＧＳＬＹＡ（配列番号４）
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１記載のホスホペプチド。
【請求項３】
−２：Ｅ又はＰ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＦ、
０：Ｙ、
＋１：Ｇ又はＡ、
＋２：Ｔ、
＋３：疎水性アミノ酸、特にＹ、Ｆ、Ｉ、又はＬ、
＋４：Ｇ又はＡ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項４】
ＥＦＹＡＴＹＧ（配列番号５）、
ＥＦＹＧＴＹＧ（配列番号６）、
ＥＦＹＡＴＹＡ（配列番号７）、及び
ＥＦＹＧＴＹＡ（配列番号８）
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項３記載のホスホペプチド。
【請求項５】
−３：酸性アミノ酸、特にＥ又はＤ、
−２：Ｌ又はＥ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＬ、
０：Ｙ、
＋１：Ａ又はＧ、
＋２：Ｓ、
＋３：Ｙ、Ｌ、又は酸性アミノ酸、
＋４：フェノールアミノ酸、特にＹ、又はＦ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列ＥＬＬＹＧＳＹＹ（配列番号９）を含む、請求項５記載のホスホペプチド。
【請求項７】
−２：Ｅ又はＰ、
−１：疎水性アミノ酸、特にＦ、Ｙ、又はＬ、
０：Ｙ
＋１：Ａ、
＋２：Ｅ、Ｑ、又はＨ、
＋３：疎水性アミノ酸、特にＶ又はＩ、
＋４：Ｇ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列ＥＦＹＡＥＶＧ（配列番号１０）を含む、請求項７記載のホスホペプチド。
【請求項９】
−２：Ｅ及びＦ、
−１：疎水性、特にフェノールアミノ酸、
０：Ｙ、
＋１：Ａ、
＋２：Ｅ、
＋３：Ｖ又はＩ、
＋４：Ｇ、
＋５：Ｒ
という特徴を有するアミノ酸配列を含み、数字がペプチドのアミノ酸位置を表し、かつ位置０のＹがリン酸化されたチロシン残基であるホスホペプチド。
【請求項１０】
位置−１のアミノ酸がＦである、請求項９記載のホスホペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸配列ＥＦＹＡＥＶＧＲ（配列番号１１）を含む、請求項９又は１０に記載のホスホペプチド。
【請求項１２】
５０個若しくは約５０個未満のアミノ酸、又は３０個若しくは約３０個未満のアミノ酸、又は２０個若しくは約２０個未満のアミノ酸、又は１５個若しくは約１５個未満のアミノ酸、又は約１０個のアミノ酸、又は約９個のアミノ酸、又は約８個のアミノ酸、又は約７個のアミノ酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のホスホペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のホスホペプチドの配列及び／又は構造に基づいて設計されたペプチドミメティック又は非ペプチド性ミメティックであって、前記ペプチドミメティックが、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではなく、Ｙはリン酸化されたチロシン残基である、ペプチドミメティック又は非ペプチド性ミメティック。
【請求項１４】
アミノ酸残基上の１つ又は複数の側鎖として存在する１つ又は複数の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含み、ペプチドＲＮＮＥＦＹＡ−ＮＨ２ではなく、Ｙはリン酸化されたチロシン残基である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のホスホペプチドの機能的誘導体。
【請求項１５】
前記部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、請求項１４記載の機能的誘導体。
【請求項１６】
前記ペプチドが細胞貫通性部分に連結されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のホスホペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のホスホペプチド、ペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、又は機能的誘導体の薬物としての使用。
【請求項１８】
癌、特に胃又は腸の癌の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項１又は２に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項１９】
糖尿病及び／又は肥満症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項３又は４に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２０】
請求項３又は４に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の食欲抑制剤としての使用。
【請求項２１】
炎症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項５又は６に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２２】
多発性硬化症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項５又は６に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２３】
固形癌又は転移癌などの血管新生依存性疾患の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項５又は６に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２４】
感染症、特にリーシュマニア症の治療及び／又は予防用薬物を製造するための請求項７〜９のいずれか一項に記載のホスホペプチド、又はそのペプチドミメティック、非ペプチド性ミメティック、若しくは機能的誘導体の使用。
【請求項２５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ又は複数のホスホペプチド、ミメティック、又は機能的誘導体を含み、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、又は希釈剤をさらに含んでいてもよい医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００６−５１３１４３（Ｐ２００６−５１３１４３Ａ）
【公表日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３２１８１（Ｐ２００４−５３２１８１）
【出願日】平成１５年８月２０日（２００３．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０５０３８５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２０４６６
【国際公開日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【出願人】（５０４４４４４８５）アプライド リサーチ システムズ アルス ホールディング ナムローゼ フエンノートシャップ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月２０日（２００３．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０５０３８５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２０４６６
【国際公開日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【出願人】（５０４４４４４８５）アプライド リサーチ システムズ アルス ホールディング ナムローゼ フエンノートシャップ (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]