タンパク質抽出のためのイオン性液体の使用
【課題】
タンパク質をさらに解析できるように、生物学的サンプルからタンパク質を抽出するのに用いる方法を提供すること。
【解決手段】
生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための方法であって、使用される抽出剤が一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体である前記方法により、前記課題は解決される。
タンパク質をさらに解析できるように、生物学的サンプルからタンパク質を抽出するのに用いる方法を提供すること。
【解決手段】
生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための方法であって、使用される抽出剤が一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体である前記方法により、前記課題は解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための方法であって、使用される抽出剤が一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体である前記方法、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するためのキット、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の検出または解析は、医学における重要性が増加している。このことは、病気の徴候または病理学的変化の兆しを解明するための組織サンプルの解析に特に当てはまる。このため、細胞の完全なプロテオーム解析が研究されている。この目的のためには、その全体に関与する全タンパク質の解析によってのみ、疾患およびその発生について結論を出すことができるため、特定のサンプルの全タンパク質を定量的に抽出することが必要不可欠である。
【０００３】
イオン性液体または液体塩は、有機カチオンと一般的な無機アニオンからなるイオン種である。これらは、中性分子を含まず、通常は３７３Ｋより低い融点を有する。
潜在的な用途が多岐にわたることから、現在、イオン性液体の領域では集中的な研究が行われている。イオン性液体の総説は、例えば、非特許文献１〜５である。
【０００４】
【非特許文献１】R. Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399-2407
【非特許文献２】M.J. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future”, Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398
【非特許文献３】P. Wasserscheid, W. Keim "Ionische Fluessigkeiten - neue Loesungen fuer die Uebergangsmetallkatalyse" [Ionic Liquids - New Solutions for Transition-Metal Catalysis], Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945;
【非特許文献４】T. Welton "Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis”, Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083
【非特許文献５】R. Hagiwara, Ya. Ito "Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions”, J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
よって、タンパク質をさらに解析できるように、生物学的サンプルからタンパク質を抽出するのに用いる方法を提供することが課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって本発明は、生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための方法であって、使用される抽出剤が一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体である前記方法に関する。
【０００７】
驚くべきことに、一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体が、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを生物学的サンプルから抽出するために好適であることを見出した。これはまた、生物学的サンプルのサンプル調製における通常の場合のように、生物学的サンプルが固定されている場合にも適用することができる。驚くべきことに、本発明による抽出方法は固定サンプルにも用いることができ、このことは本方法の潜在的な用途を大きく拡大する。このようにして、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを生物学的サンプルから抽出するための本発明の方法により、生物学的サンプルを広く扱うことができる。
【０００８】
本発明による方法は、抽出される構成要素が分解されない、すなわちその化学構造が保持されている、という利点を有する。このことは、例えば、ＷＯ２００４／０８０５７９において記載されている、抽出されるタンパク質が、次の解析を可能にするためのタンパク質分解工程でペプチドに分解されなければならないような、既知の方法に対して有意義な利点である。したがって、全体として、本発明による方法は、従来技術に記載されている方法を用いては達成することが不可能であった、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドの単離のための生物学的サンプルの簡単な調製を可能にする。
【０００９】
本発明による方法においては、当業者に知られている全ての生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出することができる。生物学的サンプルは、好ましくは、例えばバイオプシーおよび組織学的調製物などの組織、細胞、細胞培養物および／または、例えば血液、血漿、血清、尿、分泌液もしくは唾液などの体液である。特に、組織および細胞培養物からのタンパク質の抽出は、特定のタンパク質の検出、例えば、疾患の存在を示すタンパク質の検出、を可能にする。したがって、本発明による方法はまた、病理学的に興味深い組織サンプルに特に有利である。
【００１０】
生物学的サンプルは、固定されていなくても固定されていてもよく、好ましくは固定されている。固定は、例えば、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ホルマリン代替物（formalin subsitute）、例えばエタノール、メタノールもしくはイソプロパノールなどのアルコール、または、例えばパラフィン、樹脂もしくはポリマーなどの不活性材料の使用などによる、当業者に既知の全ての方法により行うことができる。生物学的サンプルは、好ましくは、ホルマリンを使用して固定される。ホルマリンは、組織学的サンプルの調製において最も一般的な固定剤であり、その価格の安さと良好な固定作用のために広く使用され、１００年以上も使われてきている。
【００１１】
しかしながら、ホルマリンを使用した固定は、サンプルマトリックスとタンパク質との架橋を生じるという不都合を有する。その結果、一般的にタンパク質は不溶性になり、さらなる解析に使用することが不可能になる。しかしながら、本発明による方法においては、イオン性液体の使用により、タンパク質はその構造を保持したまま抽出することができ、そしてさらに解析することができる。このようにして、ホルマリンを使用する最も一般的な固定法は、次の解析の可能性を限定することなくその実効可能性が拡大される。したがって、ここでは、本発明による方法を使用して、ホルマリンを用いることにより極めて長い期間既に保存されているサンプルを、最新のタンパク質解析を使用して研究することができる、すなわち、解析するサンプルの可能性にタイムリミットがない。
【００１２】
一般的に、例えば、ヘキサフルオロホスフェート、テトラフルオロボレートまたはハロゲン化物アニオンなどの、当業者に知られている一般式Ｋ＋Ａ−で表される全てのイオン性液体は、本発明による方法に好適である。
好適なイオン性液体の例は、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムクロライドおよびトリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムテトラフルオロボレートである。
【００１３】
イオン性液体のアニオンＡ−は、好ましくは、イミドの群、特に一般式
［Ｎ（Ｒｆ）２］−
式中、Ｒｆは１〜８個のＣ原子を有する部分的にもしくは完全にフッ素置換されたアルキルまたはＲｆ２Ｘであり、ここで、Ｒｆ２は１〜８個のＣ原子を有する部分的にもしくは完全にフッ素置換されたアルキルであり、ＸはＳＯ２もしくはＣＯである、で表されるイミド群、
フルオロアルキルホスフェートの群、特に一般式
［ＰＦｘ（ＣｙＦ２ｙ＋１−ｚＨｚ）６−ｘ］−、ここで１≦ｘ＜６、１≦ｙ≦８および０≦ｚ≦２ｙ＋１、で表されるフルオロアルキルホスフェートの群、
またはこれらの混合物、
から選択される。
【００１４】
Ｒｆは、好ましくはトリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ノナフルオロブチルまたはＲｆ２ＳＯ２、特にトリフルオロメチルまたはＲｆ２ＳＯ２、ここでＲｆ２は特に好ましくはトリフルオロメチルである。フルオロアルキルホスフェートの場合は、好ましくは、ｘ＝３、ｚ＝０およびｙ＝２、３または４であり、ここでｙは特に好ましくは２である。特に好ましくは［（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ］−または［ＰＦ３（Ｃ２Ｆ５）３］−を含有するイオン性液体は、本発明の方法におけるタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドの抽出に特に好適である。
イオン性液体のカチオンＫ＋の選択に関しては、本質的に制限がない。しかしながら、好ましくは有機カチオン、特に好ましくはアンモニウム、ホスホニウム、ウロニウム、チオウロニウム、グアニジウムまたはび複素環カチオンが挙げられる。
【００１５】
アンモニウムカチオンは、例えば式（１）
［ＮＲ４］＋ （１）、
式中、
Ｒは、各場合において、互いに独立に、
Ｈ、ここで全ての置換基Ｒは同時にＨであることはできず、
ＯＲ’、ＮＲ’２、但し、式（１）の最大で１個の置換基ＲがＯＲ’またはＮＲ’２であり、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキルであり、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
【００１６】
ここで、１個または２個以上のＲは、部分的または完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、により、または部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよく、ならびに、α位にないＲの１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
により記載することができる。
【００１７】
ホスホニウムカチオンは、例えば式（２）
［ＰＲ２４］＋ （２）、
式中、
Ｒ２は、各場合において、互いに独立に、
Ｈ、ＯＲ’、ＮＲ’２、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキルであり、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
【００１８】
ここで、１個または２個以上のＲ２は、部分的または完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、により、または部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよく、ならびに、α位にないＲ２の１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
により記載することができる。
【００１９】
しかしながら、全ての４個または３個の置換基ＲおよびＲ２が完全にハロゲンにより置換されている、式（１）および（２）のカチオン、例えば、トリス（トリフルオロメチル）メチルアンモニウムカチオン、テトラ（トリフルオロメチル）アンモニウムカチオンまたはテトラ（ノナフルオロブチル）アンモニウムカチオン、は除外される。
【００２０】
ウロニウムカチオンは、例えば式（３）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＯＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋ （３）、
およびチオウロニウムカチオンは、式（４）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋ （４）、
式中、
Ｒ３〜Ｒ７は、それぞれ互いに独立して、
水素、ここで水素はＲ５については除外され、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキルであり、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
【００２１】
ここで、１個または２個以上の置換基Ｒ３〜Ｒ７は、部分的または完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、により、または部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよく、ならびに、α位にないＲ３〜Ｒ７の１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
により記載することができる。
【００２２】
グアニジウムカチオンは、式（５）
［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋ （５）、
式中、
Ｒ８〜Ｒ１３は、それぞれ互いに独立して、
水素、−ＣＮ、ＮＲ’２、−ＯＲ’、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキルであり、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
【００２３】
ここで、１個または２個以上の置換基Ｒ８〜Ｒ１３は、部分的または完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、により、または部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよく、ならびに、α位にないＲ８〜Ｒ１３の１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
により記載することができる。
【００２４】
さらに、一般式（６）
［ＨｅｔＮ］＋ （６）、
式中、
ＨｅｔＮ＋は、群
【化１】
【００２５】
【化２】
【００２６】
ここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、それぞれ互いに独立して、
水素、−ＣＮ、−ＯＲ’、ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキル、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、またはアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルであり、
ここで、置換基Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’は一緒に環を形成していてもよく、
【００２７】
ここで、１個または２個以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、部分的または完全に、ハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよいが、Ｒ１’およびＲ４’は同時にハロゲンにより完全に置換されていてはならず、ならびに、ヘテロ原子に結合していないＲ１’〜Ｒ４’の１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
で表されるカチオンを用いることができる。
【００２８】
本発明の目的のためには、完全不飽和置換基は芳香族置換基をも意味するように用いられる。
本発明によれば、式（１）〜（５）で表される化合物の好適な置換基ＲおよびＲ２〜Ｒ１３は好適な置換基は、水素以外には、好ましくはＣ１〜Ｃ２０アルキル基、特にＣ１〜Ｃ１４アルキル基、および、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、特にフェニル、により置換されていてもよい飽和または不飽和Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル基（すなわち、芳香族をも含む）である。
式（１）または（２）で表される化合物中の置換基ＲおよびＲ２は、同一であってもよく、異なっていてもよい。置換基ＲおよびＲ２は、好ましくは異なっている。
置換基ＲおよびＲ２は、特に好ましくは、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシルまたはテトラデシルである。
【００２９】
グアニジウムカチオン［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋の４個までの置換基はまた、単環式、二環式もしくは多環式カチオンを形成するようにペアを組んで結合していてもよい。
一般的な限定なしに、かかるグアニジウムカチオンの例は、
【化３】
【化４】
【００３０】
ここで、置換基Ｒ８〜Ｒ１０およびＲ１３は、上記の意味を有することができ、または上記の特に好ましい意味を有することができる、
である。
必要に応じて、上記グアニジウムカチオンの炭素環または複素環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２ＸまたはＳＯ３Ｈ、ここでＸおよびＲ’は上記の意味を有する、置換もしくは非置換フェニル、あるいは、非置換もしくは置換複素環であってもよい。
【００３１】
ウロニウムカチオン［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＯＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋またはチオウロニウムカチオン［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋の４個までの置換基はまた、単環式、二環式もしくは多環式カチオンを形成するようにペアを組んで結合していてもよい。
一般的な限定なしに、かかるカチオンの例は、下記
式中、Ｙ＝ＯもしくはＳである：
【化５】
【化６】
【００３２】
ここで、置換基Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、上記の意味を有することができる、または上記の特に好ましい意味を有することができる、
で示される。
必要に応じて、前記カチオンの炭素環または複素環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２ＸまたはＳＯ３Ｈ、あるいは置換もしくは非置換フェニルまたは非置換もしくは置換複素環、ここでＸおよびＲ’は上記の意味を有する、であってもよい。
【００３３】
置換基Ｒ３〜Ｒ１３は、それぞれ互いに独立して、好ましくは１〜１０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル基である。式（３）〜（５）の化合物中の置換基Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ８およびＲ９、Ｒ１０およびＲ１１、ならびに、Ｒ１２およびＲ１３は、同一であってもよく、異なっていてもよい。置換基Ｒ３〜Ｒ１３は、特に好ましくは、それぞれ互いに独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フェニルまたはシクロヘキシルであり、極めて特に好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはｎ−ブチルである。
【００３４】
本発明によれば、式（６）で表される好適な置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、水素以外には、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、特にＣ１〜Ｃ１２アルキル基、および、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、特にフェニル、により置換されていてもよい飽和または不飽和Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル基（すなわち、芳香族をも含む）である。
【００３５】
置換基Ｒ１’およびＲ４’は、それぞれ互いに独立して、特に好ましくはメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。これらは特に極めて好ましくは、メチル、エチル、ｎ−ブチルまたはヘキシルである。ピロリジニウム、ピペリジニウムまたはインドリニウム化合物においては、２個の置換基Ｒ１’およびＲ４’は、好ましくは異なっている。
置換基Ｒ２’またはＲ３’は、各場合において互いに独立して、特に水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。Ｒ２’は、特に好ましくは水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチルまたはｓｅｃ−ブチルである。Ｒ２’およびＲ３’は、極めて特に好ましくは水素である。
【００３６】
Ｃ１〜Ｃ１2アルキル基は、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、さらにまたペンチル、１−、２−もしくは３−メチルブチル、１，１−、１，２−もしくは２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシル、任意にジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピルまたはノナフルオロブチルである。
【００３７】
二重結合が複数個存在してもよい、Ｃ原子２〜２０個を有する直鎖または分枝アルケニルは、例えば、アリル、２−もしくは３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに４−ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、−Ｃ９Ｈ１７、−Ｃ１０Ｈ１９〜−Ｃ２０Ｈ３９、好ましくはアリル、２−もしくは３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに好ましくは４−ペンテニル、イソペンテニルまたはヘキセニルである。
【００３８】
三重結合が複数個存在してもよい、Ｃ原子２〜２０個を有する直鎖または分枝アルキニルは、例えば、エチニル、１−もしくは２−プロピニル、２−もしくは３−ブチニル、さらに４−ペンチニル、３−ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、−Ｃ９Ｈ１５、−Ｃ１０Ｈ１７〜−Ｃ２０Ｈ３７、好ましくはエチニル、１−もしくは２−プロピニル、２−もしくは３−ブチニル、４−ペンチニル、３−ペンチニルまたはヘキシニルである。
【００３９】
アリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルは、例えば、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチルまたはフェニルヘキシル、ここでフェニル環およびアルキレン鎖の両方は、部分的または完全に、上記の通り、ハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよい。
【００４０】
したがって、３〜７個のＣ原子を有する、非置換飽和または部分飽和もしくは完全不飽和シクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロペンタ−１，３−ジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサ−１，３−ジエニル、シクロヘキサ−１，４−ジエニル、フェニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタ−１，３−ジエニル、シクロヘプタ−１，４−ジエニルまたはシクロヘプタ−１，５−ジエニルであり、これらの各々は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されていてもよく、ここでシクロアルキル基またはＣ１〜Ｃ６アルキル基により置換されているシクロアルキル基はまた同様に、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ、特にＦもしくはＣｌなどのハロゲン原子、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により置換されていてもよい。
【００４１】
置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３またはＲ１’〜Ｒ４’においては、ヘテロ原子に対してα位にない１個または２個以上の炭素原子はまた、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルから選択される原子および／または原子団により置換されていてもよい。
【００４２】
一般的な限定なく、このように修飾された置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３またはＲ１’〜Ｒ４’の例は：
−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ２Ｈ４ＳＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３、−ＳＯ２Ｃ６Ｈ５、−ＳＯ２Ｃ３Ｈ７、−ＳＯ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−Ｏ−Ｃ４Ｈ９、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−Ｃ４Ｆ９、−Ｃ（ＣＦ３）３、−ＣＦ２ＳＯ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ４Ｎ（Ｃ２Ｆ５）Ｃ２Ｆ５、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ２Ｈ３、−Ｃ３ＦＨ６、−ＣＨ２Ｃ３Ｆ７、−Ｃ（ＣＦＨ２）３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５またはＰ（Ｏ）（Ｃ２Ｈ５）２である。
Ｒ’において、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルは、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチルである。
【００４３】
Ｒ’における置換フェニルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’’２またはＳＯ３Ｈにより置換されているフェニルであり、ここでＸ’はＦ、ＣｌもしくはＢｒであり、Ｒ’’はＲ’について定義されている通り、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり、例えば、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−メチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−エチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−プロピルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−イソプロピルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ニトロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ヒドロキシフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−メトキシフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−エトキシフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−（トリフルオロメチル）フェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−（トリフルオロメトキシ）フェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−（トリフルオロメチルスルホニル)フェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−フルオロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−クロロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ブロモフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ヨードフェニル、さらに好ましくは、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメチルフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジヒドロキシフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジフルオロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジクロロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジブロモフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメトキシフェニル、５−フルオロ−２−メチルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニルまたは２，４，５−トリメチルフェニルである。
【００４４】
Ｒ１’〜Ｒ４’におけるヘテロアリールは、５〜１３員環を有する、飽和または不飽和単環式もしくは二環式複素環基であり、式中、１、２もしくは３個のＮ原子および／または１個もしくは２個のＳ原子またはＯ原子が存在してもよく、複素環基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’’２またはＳＯ３Ｈであり、ここでＸ’およびＲ’’は上記の意味を有する。
複素環基は、好ましくは、置換または非置換２−もしくは３−フリル、２−もしくは３−チエニル、１−、２−もしくは３−ピロリル、１−、２−、４−もしくは５−イミダゾリル、３−、４−もしくは５−ピラゾリル、２−、４−もしくは５−オキサゾリル、３−、４−もしくは５−イソオキサゾリル、２−、４−もしくは５−チアゾリル、３−、４−もしくは５−イソチアゾリル、２−、３−もしくは４−ピリジル、２−、４−、５−もしくは６−ピリミジニル、さらに好ましくは１，２，３−トリアゾル−１−、−４−もしくは−５−イル、１，２，４−トリアゾル−１−、−４−もしくは−５−イル、１−もしくは５−テトラゾリル、１，２，３−オキサジアゾル−４−もしくは−５−イル、１，２，４−オキサジアゾル−３−もしくは−５−イル、１，３，４−チアジアゾル−２−もしくは−５−イル、１，２，４−チアジアゾル−３−もしくは−５−イル、１，２，３−チアジアゾル−４−もしくは−５−イル、２−、３−、４−、５−もしくは６−２Ｈ−チオピラニル、２−、３−もしくは４−４Ｈ−チオピラニル、３−もしくは４−ピリダジニル、ピラジニル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾフリル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチエニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−１Ｈ−インドリル、１−、２−、４−もしくは５−ベンズイミダゾリル、１−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾピラゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾキサゾリル、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンズイソキサゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチアゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンズイソチアゾリル、４−、５−、６−もしくは７−ベンズ−２，１，３−オキサジアゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キノリニル、１−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−イソキノリニル、１−、２−、３−、４−もしくは９−カルバゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−もしくは９−アクリジニル、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−シノリニル、２−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キナゾリニルまたは１−、２−もしくは３−ピロリジニルである。
【００４５】
ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルは、アリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルと同様に、例えば、ピリジニルメチル、ピリジニルエチル、ピリジニルプロピル、ピリジニルブチル、ピリジニルペンチルまたはピリジニルヘキシルを意味するように用いられ、ここで上記の複素環はさらにこのようにアルキレン鎖と結合していてもよい。
【００４６】
ＨｅｔＮ＋は好ましくは、
【化７】
であり、ここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’はそれぞれ、互いに独立して上記の意味を有する。
本発明によるイオン性液体のカチオンは、好ましくはアンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウム、ピリジニウムまたはピロリジニウムカチオンである。
【００４７】
極めて特に好ましくは、本発明の方法における抽出のための使用には、アンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウム、ピリジニウムもしくはピロリジニウムトリフルオロメチルスルホニルイミド、または、アンモニウムもしくはホスホニウムトリス(ペンタフルオロエチル)トリフルオロホスフェートが極めて特に好ましく、ここで、トリヘキシル(テトラデシル)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、トリヘキシル(テトラデシル)ホスホニウムクロライド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムテトラフルオロボレート、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−（エトキシメチル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−（２−メトキシエチル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−（２−メトキシエチル）ピリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム）ピリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−ブチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム）ピリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−ヘキシル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム）ピリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−（３−ヒドロキシプロピル）−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−（エトキシメチル）−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−（２−メトキシエチル）−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−（２−エトキシエチル）−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、テトラ−ブチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、テトラエチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、トリヘキシル（テトラデシル）アンモニウムトリフルオロメチルスルホニルイミド、メチルトリオクチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、（エトキシメチル）エチルジメチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、（２−エトキシメチル）エチルジメチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、（２−エトキシエチル）エチルジエチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、エチルジメチルプロピルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、テトラブチルホスホニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、テトラメチルアンモニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、テトラエチルアンモニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェートまたはテトラブチルアンモニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、
【００４８】
および特に好ましくはＮ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−（エトキシメチル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、トリヘキシル（テトラデシル）アンモニウムトリフルオロメチルスルホニルイミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリフルオロメチルスルホニルイミドまたはテトラブチルアンモニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェートが、本発明による方法において特に良好な結果をもたらす。
【００４９】
本発明による方法は、０〜９５℃、好ましくは５５〜６５℃、および極めて特に好ましくは６０℃の温度で行うことができる。好ましい温度においては、比較的短時間に改善された抽出が観察される。一般的な抽出、特に比較的繊細なタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドの抽出については、上記温度範囲内のより低温で、この目的に必要となるであろうより長い抽出時間を考慮に入れて、本発明の方法を行うことが望ましい。
【００５０】
本発明による方法は、生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを、そのサンプルの細胞の基本構造を保持したままで抽出するのに好適である。しかしながら、さらに、対応した前処置がなされたサンプル、例えば細胞の基本構造が本発明の方法の使用前に破壊されてしまっているサンプル、に本発明の方法を使用することもまた考え得ることである。この前処置は当業者に既知の全ての方法で、例えば手によるホモジナイズもしくはボルテックスにより、行うことができる。
【００５１】
本発明による方法を用いて得られた抽出物は、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを含む。これらは、例えば電気泳動（例えば２次元電気泳動）、免疫化学検出法（例えばウェスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ）、タンパク質アレイ（例えば平面およびビーズベースシステム）、質量分析（例えばＭａｌｄｉ、ＥｓｉおよびＳｅｌｄｉ）および全てのバイオクロマトグラフィー分離法（ＩＥＸ、ＳＥＣ、ＨＩＣおよびアフィニティクロマトグラフィー）等の当業者に既知の全てのタンパク質解析に適している。
【００５２】
本発明は同様に、少なくとも１種のイオン性液体を含む、上記本発明の方法の１つによるタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドの抽出のためのキットに関する。本発明によるキットは、１種または２種以上のイオン性液体を含むことができる。キットが２種以上のイオン性液体を含む場合には、これらは別々の形態であってもよく、混合物の形態で一緒になっていてもよい。好ましくは、上記の特に好ましいイオン性液体がキット中に含まれる。
【００５３】
さらに、キットはさらなる態様において、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを沈殿させるために好適な少なくとも１種の試薬をさらに含み、ここで前記試薬は、例えばトリクロロ酢酸などの当業者に既知の全ての沈殿試薬から選択することができる。
本発明によるキットは、使用者が簡単な方法で生物学的サンプルからタンパク質を抽出することができるようにするとともに、必要に応じて、さらなる解析における使用のためにタンパク質を沈殿することができるようにする。
【００５４】
同様に、本発明は、本発明のキットの、生物学的サンプルからタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための使用にも関する。
さらなる解説なしに、当業者は最も広い範囲で上記記載を用いることができるとみなされる。したがって、好ましい態様および例は、どのような方法によっても全く限定することのない記載的開示としてのみみなされるべきである。
【実施例】
【００５５】
例１
１ｇのホルマリン固定組織サンプル（例えば肺、心臓、腎臓、肝臓、脾臓）を何回も１０ｍｌの等張リン酸緩衝生理食塩水溶液で洗浄し、メスを用いて小片に切断する。０．１ｇの切断サンプルを６０μｌのトリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリフルオロメチルスルホニルイミドと混合し、回転ミキサー中で２時間にわたり６０℃でインキュベートする。上清溶液を分離し、その中に含まれているタンパク質のさらなる解析に用いることができる。
【００５６】
タンパク質解析
例１で得られた抽出物を用いて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を以下のように行う：３μｌのタンパク質抽出物を１６μｌのＳＤＳサンプルアプリケーションバッファー（３Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．５、グリセロール２４％（ｖ／ｖ）、ドデシル硫酸ナトリウム８％（ｗ／ｖ）、２−メルカプトエタノール２％、ブロモフェノールブルー０．１％（ｗ／ｖ））と混合し、混合物を９５℃で５分間インキュベートする。１０，０００×ｇで遠心した後、サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし、１２０ボルトで９０分間分離する。
抽出されたタンパク質を同定するためには、例えば膜タンパク質であるカルネキシン（９０ｋＤａ、抗カルネキシン、Ｃ末端、１：２０００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ．Ｎｏ．：２０８８８０）などに対する抗体を用いて、ゲルのウェスタンブロットを行う。ウェスタンブロット解析においては、カルネキシンはその野生型の分子サイズで同定される。
全体として、本発明による方法は、生物学的サンプルからのタンパク質の抽出に有利に適していることが見出されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための方法であって、使用される抽出剤が一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体である前記方法、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するためのキット、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の検出または解析は、医学における重要性が増加している。このことは、病気の徴候または病理学的変化の兆しを解明するための組織サンプルの解析に特に当てはまる。このため、細胞の完全なプロテオーム解析が研究されている。この目的のためには、その全体に関与する全タンパク質の解析によってのみ、疾患およびその発生について結論を出すことができるため、特定のサンプルの全タンパク質を定量的に抽出することが必要不可欠である。
【０００３】
イオン性液体または液体塩は、有機カチオンと一般的な無機アニオンからなるイオン種である。これらは、中性分子を含まず、通常は３７３Ｋより低い融点を有する。
潜在的な用途が多岐にわたることから、現在、イオン性液体の領域では集中的な研究が行われている。イオン性液体の総説は、例えば、非特許文献１〜５である。
【０００４】
【非特許文献１】R. Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399-2407
【非特許文献２】M.J. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future”, Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398
【非特許文献３】P. Wasserscheid, W. Keim "Ionische Fluessigkeiten - neue Loesungen fuer die Uebergangsmetallkatalyse" [Ionic Liquids - New Solutions for Transition-Metal Catalysis], Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945;
【非特許文献４】T. Welton "Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis”, Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083
【非特許文献５】R. Hagiwara, Ya. Ito "Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions”, J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
よって、タンパク質をさらに解析できるように、生物学的サンプルからタンパク質を抽出するのに用いる方法を提供することが課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって本発明は、生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための方法であって、使用される抽出剤が一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体である前記方法に関する。
【０００７】
驚くべきことに、一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体が、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを生物学的サンプルから抽出するために好適であることを見出した。これはまた、生物学的サンプルのサンプル調製における通常の場合のように、生物学的サンプルが固定されている場合にも適用することができる。驚くべきことに、本発明による抽出方法は固定サンプルにも用いることができ、このことは本方法の潜在的な用途を大きく拡大する。このようにして、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを生物学的サンプルから抽出するための本発明の方法により、生物学的サンプルを広く扱うことができる。
【０００８】
本発明による方法は、抽出される構成要素が分解されない、すなわちその化学構造が保持されている、という利点を有する。このことは、例えば、ＷＯ２００４／０８０５７９において記載されている、抽出されるタンパク質が、次の解析を可能にするためのタンパク質分解工程でペプチドに分解されなければならないような、既知の方法に対して有意義な利点である。したがって、全体として、本発明による方法は、従来技術に記載されている方法を用いては達成することが不可能であった、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドの単離のための生物学的サンプルの簡単な調製を可能にする。
【０００９】
本発明による方法においては、当業者に知られている全ての生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出することができる。生物学的サンプルは、好ましくは、例えばバイオプシーおよび組織学的調製物などの組織、細胞、細胞培養物および／または、例えば血液、血漿、血清、尿、分泌液もしくは唾液などの体液である。特に、組織および細胞培養物からのタンパク質の抽出は、特定のタンパク質の検出、例えば、疾患の存在を示すタンパク質の検出、を可能にする。したがって、本発明による方法はまた、病理学的に興味深い組織サンプルに特に有利である。
【００１０】
生物学的サンプルは、固定されていなくても固定されていてもよく、好ましくは固定されている。固定は、例えば、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ホルマリン代替物（formalin subsitute）、例えばエタノール、メタノールもしくはイソプロパノールなどのアルコール、または、例えばパラフィン、樹脂もしくはポリマーなどの不活性材料の使用などによる、当業者に既知の全ての方法により行うことができる。生物学的サンプルは、好ましくは、ホルマリンを使用して固定される。ホルマリンは、組織学的サンプルの調製において最も一般的な固定剤であり、その価格の安さと良好な固定作用のために広く使用され、１００年以上も使われてきている。
【００１１】
しかしながら、ホルマリンを使用した固定は、サンプルマトリックスとタンパク質との架橋を生じるという不都合を有する。その結果、一般的にタンパク質は不溶性になり、さらなる解析に使用することが不可能になる。しかしながら、本発明による方法においては、イオン性液体の使用により、タンパク質はその構造を保持したまま抽出することができ、そしてさらに解析することができる。このようにして、ホルマリンを使用する最も一般的な固定法は、次の解析の可能性を限定することなくその実効可能性が拡大される。したがって、ここでは、本発明による方法を使用して、ホルマリンを用いることにより極めて長い期間既に保存されているサンプルを、最新のタンパク質解析を使用して研究することができる、すなわち、解析するサンプルの可能性にタイムリミットがない。
【００１２】
一般的に、例えば、ヘキサフルオロホスフェート、テトラフルオロボレートまたはハロゲン化物アニオンなどの、当業者に知られている一般式Ｋ＋Ａ−で表される全てのイオン性液体は、本発明による方法に好適である。
好適なイオン性液体の例は、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムクロライドおよびトリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムテトラフルオロボレートである。
【００１３】
イオン性液体のアニオンＡ−は、好ましくは、イミドの群、特に一般式
［Ｎ（Ｒｆ）２］−
式中、Ｒｆは１〜８個のＣ原子を有する部分的にもしくは完全にフッ素置換されたアルキルまたはＲｆ２Ｘであり、ここで、Ｒｆ２は１〜８個のＣ原子を有する部分的にもしくは完全にフッ素置換されたアルキルであり、ＸはＳＯ２もしくはＣＯである、で表されるイミド群、
フルオロアルキルホスフェートの群、特に一般式
［ＰＦｘ（ＣｙＦ２ｙ＋１−ｚＨｚ）６−ｘ］−、ここで１≦ｘ＜６、１≦ｙ≦８および０≦ｚ≦２ｙ＋１、で表されるフルオロアルキルホスフェートの群、
またはこれらの混合物、
から選択される。
【００１４】
Ｒｆは、好ましくはトリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ノナフルオロブチルまたはＲｆ２ＳＯ２、特にトリフルオロメチルまたはＲｆ２ＳＯ２、ここでＲｆ２は特に好ましくはトリフルオロメチルである。フルオロアルキルホスフェートの場合は、好ましくは、ｘ＝３、ｚ＝０およびｙ＝２、３または４であり、ここでｙは特に好ましくは２である。特に好ましくは［（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ］−または［ＰＦ３（Ｃ２Ｆ５）３］−を含有するイオン性液体は、本発明の方法におけるタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドの抽出に特に好適である。
イオン性液体のカチオンＫ＋の選択に関しては、本質的に制限がない。しかしながら、好ましくは有機カチオン、特に好ましくはアンモニウム、ホスホニウム、ウロニウム、チオウロニウム、グアニジウムまたはび複素環カチオンが挙げられる。
【００１５】
アンモニウムカチオンは、例えば式（１）
［ＮＲ４］＋ （１）、
式中、
Ｒは、各場合において、互いに独立に、
Ｈ、ここで全ての置換基Ｒは同時にＨであることはできず、
ＯＲ’、ＮＲ’２、但し、式（１）の最大で１個の置換基ＲがＯＲ’またはＮＲ’２であり、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキルであり、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
【００１６】
ここで、１個または２個以上のＲは、部分的または完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、により、または部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよく、ならびに、α位にないＲの１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
により記載することができる。
【００１７】
ホスホニウムカチオンは、例えば式（２）
［ＰＲ２４］＋ （２）、
式中、
Ｒ２は、各場合において、互いに独立に、
Ｈ、ＯＲ’、ＮＲ’２、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキルであり、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
【００１８】
ここで、１個または２個以上のＲ２は、部分的または完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、により、または部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよく、ならびに、α位にないＲ２の１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
により記載することができる。
【００１９】
しかしながら、全ての４個または３個の置換基ＲおよびＲ２が完全にハロゲンにより置換されている、式（１）および（２）のカチオン、例えば、トリス（トリフルオロメチル）メチルアンモニウムカチオン、テトラ（トリフルオロメチル）アンモニウムカチオンまたはテトラ（ノナフルオロブチル）アンモニウムカチオン、は除外される。
【００２０】
ウロニウムカチオンは、例えば式（３）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＯＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋ （３）、
およびチオウロニウムカチオンは、式（４）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋ （４）、
式中、
Ｒ３〜Ｒ７は、それぞれ互いに独立して、
水素、ここで水素はＲ５については除外され、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキルであり、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
【００２１】
ここで、１個または２個以上の置換基Ｒ３〜Ｒ７は、部分的または完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、により、または部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよく、ならびに、α位にないＲ３〜Ｒ７の１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
により記載することができる。
【００２２】
グアニジウムカチオンは、式（５）
［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋ （５）、
式中、
Ｒ８〜Ｒ１３は、それぞれ互いに独立して、
水素、−ＣＮ、ＮＲ’２、−ＯＲ’、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキルであり、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
【００２３】
ここで、１個または２個以上の置換基Ｒ８〜Ｒ１３は、部分的または完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、により、または部分的に−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよく、ならびに、α位にないＲ８〜Ｒ１３の１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
により記載することができる。
【００２４】
さらに、一般式（６）
［ＨｅｔＮ］＋ （６）、
式中、
ＨｅｔＮ＋は、群
【化１】
【００２５】
【化２】
【００２６】
ここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、それぞれ互いに独立して、
水素、−ＣＮ、−ＯＲ’、ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、
１〜２０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝アルケニル、
２〜２０個のＣ原子および１個または２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝アルキニル、
３〜７個のＣ原子を有する、飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和シクロアルキル、ここでこれは１〜６個のＣ原子を有するアルキル基により置換されていてもよく、
飽和、部分不飽和、もしくは完全不飽和ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、またはアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルであり、
ここで、置換基Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’は一緒に環を形成していてもよく、
【００２７】
ここで、１個または２個以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、部分的または完全に、ハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよいが、Ｒ１’およびＲ４’は同時にハロゲンにより完全に置換されていてはならず、ならびに、ヘテロ原子に結合していないＲ１’〜Ｒ４’の１個または２個以上の隣接しない炭素原子は、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝Ｈ、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または、非置換もしくは置換フェニルであってもよく、およびＸ＝ハロゲンであってもよい、から選択される、原子および／または原子団により置換されていてもよい、
で表されるカチオンを用いることができる。
【００２８】
本発明の目的のためには、完全不飽和置換基は芳香族置換基をも意味するように用いられる。
本発明によれば、式（１）〜（５）で表される化合物の好適な置換基ＲおよびＲ２〜Ｒ１３は好適な置換基は、水素以外には、好ましくはＣ１〜Ｃ２０アルキル基、特にＣ１〜Ｃ１４アルキル基、および、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、特にフェニル、により置換されていてもよい飽和または不飽和Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル基（すなわち、芳香族をも含む）である。
式（１）または（２）で表される化合物中の置換基ＲおよびＲ２は、同一であってもよく、異なっていてもよい。置換基ＲおよびＲ２は、好ましくは異なっている。
置換基ＲおよびＲ２は、特に好ましくは、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシルまたはテトラデシルである。
【００２９】
グアニジウムカチオン［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋の４個までの置換基はまた、単環式、二環式もしくは多環式カチオンを形成するようにペアを組んで結合していてもよい。
一般的な限定なしに、かかるグアニジウムカチオンの例は、
【化３】
【化４】
【００３０】
ここで、置換基Ｒ８〜Ｒ１０およびＲ１３は、上記の意味を有することができ、または上記の特に好ましい意味を有することができる、
である。
必要に応じて、上記グアニジウムカチオンの炭素環または複素環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２ＸまたはＳＯ３Ｈ、ここでＸおよびＲ’は上記の意味を有する、置換もしくは非置換フェニル、あるいは、非置換もしくは置換複素環であってもよい。
【００３１】
ウロニウムカチオン［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＯＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋またはチオウロニウムカチオン［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋の４個までの置換基はまた、単環式、二環式もしくは多環式カチオンを形成するようにペアを組んで結合していてもよい。
一般的な限定なしに、かかるカチオンの例は、下記
式中、Ｙ＝ＯもしくはＳである：
【化５】
【化６】
【００３２】
ここで、置換基Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、上記の意味を有することができる、または上記の特に好ましい意味を有することができる、
で示される。
必要に応じて、前記カチオンの炭素環または複素環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２ＸまたはＳＯ３Ｈ、あるいは置換もしくは非置換フェニルまたは非置換もしくは置換複素環、ここでＸおよびＲ’は上記の意味を有する、であってもよい。
【００３３】
置換基Ｒ３〜Ｒ１３は、それぞれ互いに独立して、好ましくは１〜１０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル基である。式（３）〜（５）の化合物中の置換基Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ８およびＲ９、Ｒ１０およびＲ１１、ならびに、Ｒ１２およびＲ１３は、同一であってもよく、異なっていてもよい。置換基Ｒ３〜Ｒ１３は、特に好ましくは、それぞれ互いに独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フェニルまたはシクロヘキシルであり、極めて特に好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはｎ−ブチルである。
【００３４】
本発明によれば、式（６）で表される好適な置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、水素以外には、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、特にＣ１〜Ｃ１２アルキル基、および、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、特にフェニル、により置換されていてもよい飽和または不飽和Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル基（すなわち、芳香族をも含む）である。
【００３５】
置換基Ｒ１’およびＲ４’は、それぞれ互いに独立して、特に好ましくはメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。これらは特に極めて好ましくは、メチル、エチル、ｎ−ブチルまたはヘキシルである。ピロリジニウム、ピペリジニウムまたはインドリニウム化合物においては、２個の置換基Ｒ１’およびＲ４’は、好ましくは異なっている。
置換基Ｒ２’またはＲ３’は、各場合において互いに独立して、特に水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。Ｒ２’は、特に好ましくは水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチルまたはｓｅｃ−ブチルである。Ｒ２’およびＲ３’は、極めて特に好ましくは水素である。
【００３６】
Ｃ１〜Ｃ１2アルキル基は、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、さらにまたペンチル、１−、２−もしくは３−メチルブチル、１，１−、１，２−もしくは２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシル、任意にジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピルまたはノナフルオロブチルである。
【００３７】
二重結合が複数個存在してもよい、Ｃ原子２〜２０個を有する直鎖または分枝アルケニルは、例えば、アリル、２−もしくは３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに４−ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、−Ｃ９Ｈ１７、−Ｃ１０Ｈ１９〜−Ｃ２０Ｈ３９、好ましくはアリル、２−もしくは３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに好ましくは４−ペンテニル、イソペンテニルまたはヘキセニルである。
【００３８】
三重結合が複数個存在してもよい、Ｃ原子２〜２０個を有する直鎖または分枝アルキニルは、例えば、エチニル、１−もしくは２−プロピニル、２−もしくは３−ブチニル、さらに４−ペンチニル、３−ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、−Ｃ９Ｈ１５、−Ｃ１０Ｈ１７〜−Ｃ２０Ｈ３７、好ましくはエチニル、１−もしくは２−プロピニル、２−もしくは３−ブチニル、４−ペンチニル、３−ペンチニルまたはヘキシニルである。
【００３９】
アリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルは、例えば、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチルまたはフェニルヘキシル、ここでフェニル環およびアルキレン鎖の両方は、部分的または完全に、上記の通り、ハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘもしくは−ＮＯ２により置換されていてもよい。
【００４０】
したがって、３〜７個のＣ原子を有する、非置換飽和または部分飽和もしくは完全不飽和シクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロペンタ−１，３−ジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサ−１，３−ジエニル、シクロヘキサ−１，４−ジエニル、フェニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタ−１，３−ジエニル、シクロヘプタ−１，４−ジエニルまたはシクロヘプタ−１，５−ジエニルであり、これらの各々は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されていてもよく、ここでシクロアルキル基またはＣ１〜Ｃ６アルキル基により置換されているシクロアルキル基はまた同様に、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ、特にＦもしくはＣｌなどのハロゲン原子、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により置換されていてもよい。
【００４１】
置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３またはＲ１’〜Ｒ４’においては、ヘテロ原子に対してα位にない１個または２個以上の炭素原子はまた、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルから選択される原子および／または原子団により置換されていてもよい。
【００４２】
一般的な限定なく、このように修飾された置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３またはＲ１’〜Ｒ４’の例は：
−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ２Ｈ４ＳＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３、−ＳＯ２Ｃ６Ｈ５、−ＳＯ２Ｃ３Ｈ７、−ＳＯ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−Ｏ−Ｃ４Ｈ９、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−Ｃ４Ｆ９、−Ｃ（ＣＦ３）３、−ＣＦ２ＳＯ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ４Ｎ（Ｃ２Ｆ５）Ｃ２Ｆ５、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ２Ｈ３、−Ｃ３ＦＨ６、−ＣＨ２Ｃ３Ｆ７、−Ｃ（ＣＦＨ２）３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５またはＰ（Ｏ）（Ｃ２Ｈ５）２である。
Ｒ’において、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルは、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチルである。
【００４３】
Ｒ’における置換フェニルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’’２またはＳＯ３Ｈにより置換されているフェニルであり、ここでＸ’はＦ、ＣｌもしくはＢｒであり、Ｒ’’はＲ’について定義されている通り、フッ素化されていない、部分的にフッ素化されている、もしくは過フッ素化されているＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり、例えば、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−メチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−エチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−プロピルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−イソプロピルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ニトロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ヒドロキシフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−メトキシフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−エトキシフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−（トリフルオロメチル）フェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−（トリフルオロメトキシ）フェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−（トリフルオロメチルスルホニル)フェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−フルオロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−クロロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ブロモフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ヨードフェニル、さらに好ましくは、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメチルフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジヒドロキシフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジフルオロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジクロロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジブロモフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメトキシフェニル、５−フルオロ−２−メチルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニルまたは２，４，５−トリメチルフェニルである。
【００４４】
Ｒ１’〜Ｒ４’におけるヘテロアリールは、５〜１３員環を有する、飽和または不飽和単環式もしくは二環式複素環基であり、式中、１、２もしくは３個のＮ原子および／または１個もしくは２個のＳ原子またはＯ原子が存在してもよく、複素環基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’’２またはＳＯ３Ｈであり、ここでＸ’およびＲ’’は上記の意味を有する。
複素環基は、好ましくは、置換または非置換２−もしくは３−フリル、２−もしくは３−チエニル、１−、２−もしくは３−ピロリル、１−、２−、４−もしくは５−イミダゾリル、３−、４−もしくは５−ピラゾリル、２−、４−もしくは５−オキサゾリル、３−、４−もしくは５−イソオキサゾリル、２−、４−もしくは５−チアゾリル、３−、４−もしくは５−イソチアゾリル、２−、３−もしくは４−ピリジル、２−、４−、５−もしくは６−ピリミジニル、さらに好ましくは１，２，３−トリアゾル−１−、−４−もしくは−５−イル、１，２，４−トリアゾル−１−、−４−もしくは−５−イル、１−もしくは５−テトラゾリル、１，２，３−オキサジアゾル−４−もしくは−５−イル、１，２，４−オキサジアゾル−３−もしくは−５−イル、１，３，４−チアジアゾル−２−もしくは−５−イル、１，２，４−チアジアゾル−３−もしくは−５−イル、１，２，３−チアジアゾル−４−もしくは−５−イル、２−、３−、４−、５−もしくは６−２Ｈ−チオピラニル、２−、３−もしくは４−４Ｈ−チオピラニル、３−もしくは４−ピリダジニル、ピラジニル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾフリル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチエニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−１Ｈ−インドリル、１−、２−、４−もしくは５−ベンズイミダゾリル、１−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾピラゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾキサゾリル、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンズイソキサゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチアゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンズイソチアゾリル、４−、５−、６−もしくは７−ベンズ−２，１，３−オキサジアゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キノリニル、１−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−イソキノリニル、１−、２−、３−、４−もしくは９−カルバゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−もしくは９−アクリジニル、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−シノリニル、２−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キナゾリニルまたは１−、２−もしくは３−ピロリジニルである。
【００４５】
ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルは、アリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルと同様に、例えば、ピリジニルメチル、ピリジニルエチル、ピリジニルプロピル、ピリジニルブチル、ピリジニルペンチルまたはピリジニルヘキシルを意味するように用いられ、ここで上記の複素環はさらにこのようにアルキレン鎖と結合していてもよい。
【００４６】
ＨｅｔＮ＋は好ましくは、
【化７】
であり、ここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’はそれぞれ、互いに独立して上記の意味を有する。
本発明によるイオン性液体のカチオンは、好ましくはアンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウム、ピリジニウムまたはピロリジニウムカチオンである。
【００４７】
極めて特に好ましくは、本発明の方法における抽出のための使用には、アンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウム、ピリジニウムもしくはピロリジニウムトリフルオロメチルスルホニルイミド、または、アンモニウムもしくはホスホニウムトリス(ペンタフルオロエチル)トリフルオロホスフェートが極めて特に好ましく、ここで、トリヘキシル(テトラデシル)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、トリヘキシル(テトラデシル)ホスホニウムクロライド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムテトラフルオロボレート、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−（エトキシメチル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−（２−メトキシエチル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−（２−メトキシエチル）ピリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム）ピリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−ブチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム）ピリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−ヘキシル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム）ピリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−（３−ヒドロキシプロピル）−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−（エトキシメチル）−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−（２−メトキシエチル）−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−（２−エトキシエチル）−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、テトラ−ブチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、テトラエチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、トリヘキシル（テトラデシル）アンモニウムトリフルオロメチルスルホニルイミド、メチルトリオクチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、（エトキシメチル）エチルジメチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、（２−エトキシメチル）エチルジメチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、（２−エトキシエチル）エチルジエチルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、エチルジメチルプロピルアンモニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、テトラブチルホスホニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、テトラメチルアンモニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、テトラエチルアンモニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェートまたはテトラブチルアンモニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、
【００４８】
および特に好ましくはＮ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、Ｎ−（エトキシメチル）−Ｎ−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、トリヘキシル（テトラデシル）アンモニウムトリフルオロメチルスルホニルイミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリフルオロメチルスルホニルイミドまたはテトラブチルアンモニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェートが、本発明による方法において特に良好な結果をもたらす。
【００４９】
本発明による方法は、０〜９５℃、好ましくは５５〜６５℃、および極めて特に好ましくは６０℃の温度で行うことができる。好ましい温度においては、比較的短時間に改善された抽出が観察される。一般的な抽出、特に比較的繊細なタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドの抽出については、上記温度範囲内のより低温で、この目的に必要となるであろうより長い抽出時間を考慮に入れて、本発明の方法を行うことが望ましい。
【００５０】
本発明による方法は、生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを、そのサンプルの細胞の基本構造を保持したままで抽出するのに好適である。しかしながら、さらに、対応した前処置がなされたサンプル、例えば細胞の基本構造が本発明の方法の使用前に破壊されてしまっているサンプル、に本発明の方法を使用することもまた考え得ることである。この前処置は当業者に既知の全ての方法で、例えば手によるホモジナイズもしくはボルテックスにより、行うことができる。
【００５１】
本発明による方法を用いて得られた抽出物は、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを含む。これらは、例えば電気泳動（例えば２次元電気泳動）、免疫化学検出法（例えばウェスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ）、タンパク質アレイ（例えば平面およびビーズベースシステム）、質量分析（例えばＭａｌｄｉ、ＥｓｉおよびＳｅｌｄｉ）および全てのバイオクロマトグラフィー分離法（ＩＥＸ、ＳＥＣ、ＨＩＣおよびアフィニティクロマトグラフィー）等の当業者に既知の全てのタンパク質解析に適している。
【００５２】
本発明は同様に、少なくとも１種のイオン性液体を含む、上記本発明の方法の１つによるタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドの抽出のためのキットに関する。本発明によるキットは、１種または２種以上のイオン性液体を含むことができる。キットが２種以上のイオン性液体を含む場合には、これらは別々の形態であってもよく、混合物の形態で一緒になっていてもよい。好ましくは、上記の特に好ましいイオン性液体がキット中に含まれる。
【００５３】
さらに、キットはさらなる態様において、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを沈殿させるために好適な少なくとも１種の試薬をさらに含み、ここで前記試薬は、例えばトリクロロ酢酸などの当業者に既知の全ての沈殿試薬から選択することができる。
本発明によるキットは、使用者が簡単な方法で生物学的サンプルからタンパク質を抽出することができるようにするとともに、必要に応じて、さらなる解析における使用のためにタンパク質を沈殿することができるようにする。
【００５４】
同様に、本発明は、本発明のキットの、生物学的サンプルからタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための使用にも関する。
さらなる解説なしに、当業者は最も広い範囲で上記記載を用いることができるとみなされる。したがって、好ましい態様および例は、どのような方法によっても全く限定することのない記載的開示としてのみみなされるべきである。
【実施例】
【００５５】
例１
１ｇのホルマリン固定組織サンプル（例えば肺、心臓、腎臓、肝臓、脾臓）を何回も１０ｍｌの等張リン酸緩衝生理食塩水溶液で洗浄し、メスを用いて小片に切断する。０．１ｇの切断サンプルを６０μｌのトリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリフルオロメチルスルホニルイミドと混合し、回転ミキサー中で２時間にわたり６０℃でインキュベートする。上清溶液を分離し、その中に含まれているタンパク質のさらなる解析に用いることができる。
【００５６】
タンパク質解析
例１で得られた抽出物を用いて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を以下のように行う：３μｌのタンパク質抽出物を１６μｌのＳＤＳサンプルアプリケーションバッファー（３Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．５、グリセロール２４％（ｖ／ｖ）、ドデシル硫酸ナトリウム８％（ｗ／ｖ）、２−メルカプトエタノール２％、ブロモフェノールブルー０．１％（ｗ／ｖ））と混合し、混合物を９５℃で５分間インキュベートする。１０，０００×ｇで遠心した後、サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし、１２０ボルトで９０分間分離する。
抽出されたタンパク質を同定するためには、例えば膜タンパク質であるカルネキシン（９０ｋＤａ、抗カルネキシン、Ｃ末端、１：２０００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ．Ｎｏ．：２０８８８０）などに対する抗体を用いて、ゲルのウェスタンブロットを行う。ウェスタンブロット解析においては、カルネキシンはその野生型の分子サイズで同定される。
全体として、本発明による方法は、生物学的サンプルからのタンパク質の抽出に有利に適していることが見出されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための方法であって、使用される抽出剤が一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体であることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
生物学的サンプルが、組織、細胞、細胞培養物および／または体液であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的サンプルが、固定されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
生物学的サンプルが、ホルマリンを使用して固定されていることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
イオン性液体のアニオンＡ−が、
一般式［Ｎ（Ｒｆ）２］−、式中、Ｒｆは１〜８個のＣ原子を有する部分的にもしくは完全にフッ素置換されたアルキルまたはＲｆ２Ｘであり、ここで、Ｒｆ２は１〜８個のＣ原子を有する部分的にもしくは完全にフッ素置換されたアルキルであり、ＸはＳＯ２もしくはＣＯである、で表されるイミドの群、
一般式［ＰＦｘ（ＣｙＦ２ｙ＋１−ｚＨｚ）６−ｘ］−、ここで１≦ｘ≦６、１≦ｙ≦８および０≦ｚ≦２ｙ＋１、で表されるフルオロアルキルホスフェートの群、
またはこれらの混合物、
から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
イオン性液体のカチオンＫ＋が、アンモニウム、ホスホニウム、ウロニウム、チオウロニウム、グアニジウムおよび複素環カチオンの群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
抽出が０〜９５℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法によりタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための、少なくとも１種のイオン性液体を含むキット。
【請求項９】
タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを沈殿させるために好適な少なくとも１種の試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを沈殿させるために好適な少なくとも１種の試薬が、トリクロロ酢酸であることを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
請求項８〜１０に記載のキットの、生物学的サンプルからタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための使用。
【請求項１】
生物学的サンプルから、タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための方法であって、使用される抽出剤が一般式Ｋ＋Ａ−で表されるイオン性液体であることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
生物学的サンプルが、組織、細胞、細胞培養物および／または体液であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的サンプルが、固定されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
生物学的サンプルが、ホルマリンを使用して固定されていることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
イオン性液体のアニオンＡ−が、
一般式［Ｎ（Ｒｆ）２］−、式中、Ｒｆは１〜８個のＣ原子を有する部分的にもしくは完全にフッ素置換されたアルキルまたはＲｆ２Ｘであり、ここで、Ｒｆ２は１〜８個のＣ原子を有する部分的にもしくは完全にフッ素置換されたアルキルであり、ＸはＳＯ２もしくはＣＯである、で表されるイミドの群、
一般式［ＰＦｘ（ＣｙＦ２ｙ＋１−ｚＨｚ）６−ｘ］−、ここで１≦ｘ≦６、１≦ｙ≦８および０≦ｚ≦２ｙ＋１、で表されるフルオロアルキルホスフェートの群、
またはこれらの混合物、
から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
イオン性液体のカチオンＫ＋が、アンモニウム、ホスホニウム、ウロニウム、チオウロニウム、グアニジウムおよび複素環カチオンの群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
抽出が０〜９５℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法によりタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための、少なくとも１種のイオン性液体を含むキット。
【請求項９】
タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを沈殿させるために好適な少なくとも１種の試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
タンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを沈殿させるために好適な少なくとも１種の試薬が、トリクロロ酢酸であることを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
請求項８〜１０に記載のキットの、生物学的サンプルからタンパク質、タンパク質断片および／またはペプチドを抽出するための使用。
【公開番号】特開２００６−３４８０３１（Ｐ２００６−３４８０３１Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６１７５７（Ｐ２００６−１６１７５７）
【出願日】平成１８年６月１２日（２００６．６．１２）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１２日（２００６．６．１２）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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