タンパク質結晶の凍結方法及び凍結装置
【課題】窒素ガスの吹き付けをしなくても、液体窒素の表層の低温ガス層を効率良く除去できる、タンパク質結晶の凍結方法及びその装置を提供する。
【解決手段】タンパク質結晶を液体窒素ＬＮの中へ入れて凍結させるタンパク質結晶の凍結方法において、容器１３中に収容された液体窒素ＬＮの表層に存在する低温ガス層１８を形成するガスを、壁部材１２と容器１３壁とによって形成されたガス搬送路と、ファン１９とを用いた吸引によって表層１８から除去しながら、タンパク質結晶を液体窒素ＬＮの表層を通過させて液体窒素ＬＮの中へ入れる。タンパク質結晶を液体窒素ＬＮへ挿入するときには、低温ガス層１８が無くなっているので、タンパク質結晶を液体窒素ＬＮによって急速冷却できる。
【解決手段】タンパク質結晶を液体窒素ＬＮの中へ入れて凍結させるタンパク質結晶の凍結方法において、容器１３中に収容された液体窒素ＬＮの表層に存在する低温ガス層１８を形成するガスを、壁部材１２と容器１３壁とによって形成されたガス搬送路と、ファン１９とを用いた吸引によって表層１８から除去しながら、タンパク質結晶を液体窒素ＬＮの表層を通過させて液体窒素ＬＮの中へ入れる。タンパク質結晶を液体窒素ＬＮへ挿入するときには、低温ガス層１８が無くなっているので、タンパク質結晶を液体窒素ＬＮによって急速冷却できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質結晶を凍結させるための凍結方法及び凍結装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質（protein）とは、Ｌ−アミノ酸が多数連結（重合）してできた高分子化合物であり、生物の重要な構成成分のひとつである。タンパク質に代表される生体高分子の立体構造に関する知見が生命科学の分野において非常に重要で不可欠であることは知られている。近年、タンパク質の立体構造の知見を基にそのタンパク質が持つ機能を解明することを目的とした学問分野である構造生物学が注目されている。
【０００３】
タンパク質の立体構造を分子レベル、さらには原子レベルで決定できる有力な手段としてＸ線分析装置が知られている。被検物質であるタンパク質にＸ線を照射したときにそのタンパク質から出る２次Ｘ線、例えば回折線、散乱線等を検出して分析することにより、タンパク質の分子立体構造又は原子立体構造を知ることができ、その知見に基づいて分子生物学におけるタンパク質の解析を行うことができる。
【０００４】
タンパク質の構造解析は、一般に、図９に示す工程図のような手順で行われる。具体的には、まず、工程Ｐ１において、被検対象であるタンパク質を結晶化する。得られた結晶は、工程Ｐ２において、Ｘ線回折測定に適した試料となるように調整される。例えば、キャピラリチューブに封入されたり、凍結させられたりする。キャピラリチューブに封入するのは、タンパク質結晶には溶媒（例えば水）が含まれているが、空気中に放置すると溶媒分子が蒸発して結晶が壊れるおそれがあるからである。他方、タンパク質結晶を凍結させるのは、結晶に含まれる溶媒（例えば水）をガラス状態（非晶質状態）にすることにより、タンパク質結晶からの回折線の邪魔になる回折線を生じさせないようにするためである。
【０００５】
次に、工程Ｐ３においてタンパク質結晶を試料としてＸ線回折測定を行って、回折線強度Ｉ(hkl)を求める。次に、求められた回折線強度Ｉ(hkl)に基づいて、工程Ｐ４において結晶構造因子Ｆ(hkl)を計算し、さらに求められた結晶構造因子Ｆ(hkl)をフーリエ合成して単位格子内の電子密度ρ(xyz)を求める。
【０００６】
次に、求められた電子密度ρ(xyz)に基づいて、工程Ｐ５においてタンパク質の分子モデルを組み上げて行き（分子モデルの構築）、さらに構築された分子モデルと回折強度測定で得られた分子モデルが十分に一致するように分子モデルを修正する（分子モデルの精密化）。こうして、タンパク質の分子モデルが最終的に決定されて、構造解析の目的が達成される。
【０００７】
上記のタンパク質の構造解析処理に関して Warkentin 等は非特許文献１において、特に試料調整工程Ｐ２に関して次のことを開示している。すなわち、タンパク質結晶の凍結は、その結晶を液体窒素の中へ突っ込み冷却（plunge cool）することにより達成できるはずである。しかしながら、液体窒素の液面表層には低温ガス層（cold gas layer）が形成されており、結晶を液体窒素の中へ突っ込む際には、結晶がその低温ガス層を横切って液体窒素へ入れられることから、次のような問題が発生する。
【０００８】
結晶は本来、瞬間的に冷却（flash cooling）されて凍結され、内部の溶媒（例えば水）がガラス状（非晶質状）にされるべきであるが、上記の低温ガス層を横切るときにゆっくりと冷却されるため、溶媒が結晶化することがある。このような溶媒結晶が生成されると、この溶媒結晶から出る回折線が分析対象であるタンパク質結晶からの回折線と干渉し、タンパク質結晶についての正確な回折線強度が得られなくなり、正確なタンパク質の構造決定を行うことができなくなるおそれがある。
【０００９】
溶媒結晶の生成を抑制するために、凍結処理に供されるタンパク質結晶に凍結防止剤、すなわち抗凍結剤（cryoprotectant）を添加すること、具体的には、抗凍結剤に結晶を浸すことが考えられる。例えば、抗凍結剤を２５％含ませれば、１０２Ｋ（ケルビン）／秒以下の冷却速度で溶媒の結晶化を防止できる。抗凍結剤が６％であれば、１０４Ｋ／秒以下の冷却速度が必要である。抗凍結剤が０％であれば、１０６Ｋ／秒以下の冷却速度が必要である。しかしながら、抗凍結剤を使用すると、タンパク質結晶の内部に浸透圧が生じ、その結果、結晶の破損、分解、構造変化等が発生して、正確な分析ができなくなるおそれがある。
【００１０】
Warkentin 等は非特許文献１において、液体窒素の表層の低温ガス層を除去することにより、タンパク質結晶を凍結させるための冷却速度を高速にすることができ、タンパク質結晶の瞬間冷却を実現でき、その結果、抗凍結剤の含有量を小さくできることを教示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】"Hyperquenching for protein cryocrystallography", Matthew Warkentin, Vitacheslav Berejnov, Naji S. Husseini and Robert E. Thorne, Journal of Applied Crystallography (2006).39, 805-811
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
液体窒素の表層の低温ガス層を除去するために、Warkentin 等は非特許文献１において、液体窒素の表層の近傍にノズルを配置し、そのノズルを通して窒素ガスを液体窒素の表層に吹き付けることにより、低温ガス層を吹き飛ばすことを提案している。
【００１３】
しかしながら、この除去方法を実現するにあたっては、窒素ガスのガスタンクを含んだ大掛かりな設備を準備しなければならない。しかも、窒素ガスの消費量はかなり大きい。これらのため、広い設備空間及び大きな経費が必要となる。
【００１４】
さらに、窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなるという問題も生じる。
【００１５】
本発明は、上記の問題点を解消するために成されたものであって、窒素ガスの吹き付けをしなくても、液体窒素の表層の低温ガス層を効率良く除去できる、タンパク質結晶の凍結方法及びその装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係るタンパク質結晶の凍結方法は、タンパク質結晶を冷媒の中へ入れて凍結させるタンパク質結晶の凍結方法において、容器中に収容された前記冷媒の表層に存在する低温ガス層を形成するガスを、吸引によって当該表層から除去しながら、前記タンパク質結晶を前記冷媒の表層を通過させて当該冷媒の中へ入れることを特徴とする。
【００１７】
タンパク質結晶は多量の溶媒（例えば水）を含んで結晶化するので、溶媒が蒸発等するとその蒸発等の際に結晶が壊れるおそれがある。タンパク質結晶を凍結すれば、溶媒を凍結してその動きを規制でき、タンパク質結晶が壊れることを回避できる。その際、凍結した溶媒、例えば氷が結晶状態をとっていると、Ｘ線回折測定を行ったときに、被検試料であるタンパク質結晶から出る回折線以外に、氷の結晶からの不要な回折線が出てしまい、タンパク質結晶からの回折線を正確に測定できないおそれがある。
【００１８】
溶媒である水が凍結するときに、結晶状態の氷が生成されることなく、ガラス状（非晶質状）の氷が生成されれば、上記のような氷の結晶からの回折線が無くなり、タンパク質結晶からの回折線を正確に捕らえることができるようになる。このように氷の結晶が生成されないようにするためには、溶媒としての水を含んだタンパク質結晶を急速に冷却することが有効である。
【００１９】
タンパク質結晶を凍結させるために用いられる冷媒（例えば液体窒素、液体プロパン等）は、通常、タンパク質結晶を十分に急速に冷却できる特性を有している。例えば、液体窒素の温度は８１Ｋ（ケルビン、−１９２℃）であるので、この液体窒素にタンパク質結晶を入れれば、タンパク質結晶を急速冷却することができ、氷の結晶の生成を回避できるはずである。
【００２０】
しかしながら、液体窒素等といった冷媒はその温度が非常に低温であるが故に、その液面表層に必然的に低温ガス層が形成される。従って、タンパク質結晶を液体窒素へ突っ込み投入するさいには、タンパク質結晶は必ずこの低温ガス層を通過する。この低温ガス層は緩やかな温度勾配をもって温度変化する層であるので、この低温ガス層を通過するタンパク質結晶は液体窒素で急冷される前に低温ガス層によって比較的ゆっくりと冷却されてしまう。このようなゆっくりとした冷却では、溶媒である水をガラス状に凍結させることは難しく、結晶化してしまう。この氷の結晶はＸ線回折測定の妨げとなる。
【００２１】
本発明によれば、低温ガス層を吸引によって液体窒素等といった冷媒の表層から除去した上で、タンパク質結晶をその液体窒素へ挿入することにしたので、タンパク質結晶は意図通りに急速に冷却され、その結果、溶媒を結晶化させることなくガラス状に凍結できる。このため、タンパク質結晶についての回折線を正確に検出できる。
【００２２】
しかも、本発明では、低温ガス層の除去のために窒素ガスの噴き付けを行うことが無いので、窒素ガス設備を準備する必要が無く、それ故、設備のためのコストが安く、窒素ガスを準備するためのコストも不要であり、非常に経済的である。
【００２３】
さらに、窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなるのであるが、本発明によれば、そのような霧の発生が無いので、作業が非常にやり易くなる。
【００２４】
本発明方法においては、前記低温ガス層を形成するガスを前記容器の周縁の一部又は全域において吸引することが望ましい。ガスを吸引する場所は種々考えられるが、容器の周縁から吸引することが、低温ガス層を除去する上で効果的である。
【００２５】
本発明方法において、前記冷媒は液体窒素であることが望ましい。冷媒は液体プロパン等とすることもできるが、安全性、経済性等の観点から液体窒素であることが望ましい。
【００２６】
次に、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置は、タンパク質結晶を凍結させる冷媒を収容しタンパク質結晶を出し入れできる開口を有した容器と、前記開口の周縁領域の一部又は全部において当該開口上のガスを吸引して当該開口上から除去するガス除去手段とを有することを特徴とする。
【００２７】
本発明装置によれば、冷媒の表面に形成された低温ガス層をガス除去手段によって除去した上で、タンパク質結晶をその冷媒中へ入れることができるので、タンパク質結晶内の溶媒（例えば水）を結晶化でなくガラス状に凍結させることができる程度に、タンパク質結晶を急速冷却できる。このため、タンパク質結晶のＸ線回折測定を正確に行なうことができる。
【００２８】
しかも、窒素ガスの吹き付けによる低温ガス層の除去ではないので、非常に経済的である。さらに、窒素ガスの吹き付けによる霧の発生の心配も無いので、作業が非常に楽である。
【００２９】
次に、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置において、前記ガス除去手段は、前記容器の開口の周縁領域の一部又は全部にガス吸引用の開口を有したガス搬送路と、該ガス搬送路内のガスを吸引する吸ガス器とを有することが望ましい。ガスを容器開口の周縁から吸い出すようにすれば、低温ガス層の除去を確実に行うことができる。
【００３０】
この構成において、前記ガス搬送路は、前記容器の周壁を間隔をおいて覆う壁部材と、前記容器の開口の周縁領域を間隔をおいて覆う庇部とを有することができる。そして、前記庇部は前記壁部材に連続して形成することができる。この構成の場合、ガス搬送路は、壁部材と容器壁とによって形成された空間によって形成される。壁部材によってガス搬送路を形成すれば、特別なガス管が不要であり、装置全体の構造が簡単で取り扱い易い構造となる。
【００３１】
本発明装置においては、前記壁部材が前記容器の全体を覆い、前記壁部材に囲まれた領域内であって前記容器の外側の部分に前記吸ガス器が設けられることが望ましい。そして、前記吸ガス器は、前記容器と反対側へガスを吸引するファンとすることが望ましい。この構成により、本発明のタンパク質結晶の凍結装置の全体的な構造を非常に簡単にすることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明方法及び装置によれば、低温ガス層を吸引によって液体窒素等といった冷媒の表層から除去した上で、タンパク質結晶をその液体窒素へ挿入することができるので、タンパク質結晶は意図通りに急速に冷却され、その結果、溶媒を結晶化させることなくガラス状に凍結できる。このため、タンパク質結晶についての回折線を正確に検出できる。
【００３３】
しかも、本発明では、低温ガス層の除去のために窒素ガスの噴き付けを行うことが無いので、窒素ガス設備を準備する必要が無く、それ故、設備のためのコストが安く、窒素ガスを準備するためのコストも不要であり、非常に経済的である。
【００３４】
さらに、窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなるのであるが、本発明によれば、そのような霧の発生が無いので、作業が非常にやり易くなる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置の一実施形態を示す斜視図である。
【図２】図１の凍結装置の側面断面図である。
【図３】低温ガス層の温度特性を示すグラフである。
【図４】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置の他の実施形態を示す断面図である。
【図５】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示す断面図である。
【図６】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示す断面図である。
【図７】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示す断面図である。
【図８】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示す断面図である。
【図９】タンパク質のＸ線構造解析方法の一般的な工程図である。
【図１０】結晶化処理の一例を示す模式図である。
【図１１】結晶化されたタンパク質を模式的に示す図である。
【図１２】Ｘ線回折測定系の一例を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（タンパク質結晶の凍結方法及び凍結装置の第１実施形態）
本発明に係るタンパク質結晶の凍結方法及び凍結装置を説明する前に、まず、Ｘ線分析を用いたタンパク質の構造解析方法について図９に示された工程図に基づいて簡単に説明する。
【００３７】
まず、工程Ｐ１でタンパク質の結晶化が行われる。結晶化する理由は、第１に、タンパク質が気体や溶液の状態であると分子が激しく動いて立体構造が確定しないからである。第２に、結晶化して分子を規則正しく配列させると高強度の回折線を得ることができるからである。
【００３８】
結晶化の方法としては、静置バッチ法、自由界面拡散法、微量透析法、蒸気拡散法、等といった種々の方法があるが、例えば蒸気拡散法に従って結晶化を行うものとすれば、図１０に示すように、容器１内に沈殿剤を含んだ緩衝液２を収容し、容器１の開口をガラスの蓋３で密封する。そして、沈殿剤を含んだタンパク質溶液４を蓋３に吊り下げる。
【００３９】
タンパク質溶液４に含まれる沈殿剤の濃度は、緩衝液２に含まれる沈殿剤の濃度の１／２である。緩衝液２とタンパク質溶液４とが蒸気平衡に近づくにつれてタンパク質溶液４から溶媒である水が蒸発し、タンパク質溶液中の沈殿剤濃度が上昇し、タンパク質が結晶化する。得られた結晶は、図１１に符号５で示すように、ループと呼ばれる捕集具６によって溶液と共に捕集される。
【００４０】
捕集具６に捕集されたタンパク質結晶５は、工程Ｐ３で行われるＸ線回折測定に適した状態の試料となるように、工程Ｐ２において調整処理を受ける。本実施形態では、その調整のために、タンパク質結晶５を抗凍結剤を含んだ溶液に浸した後、そのタンパク質結晶５を凍結する。
【００４１】
タンパク質結晶を凍結させるのは、水が蒸発することを防止したり、結晶に含まれる溶媒である水をガラス状態（非晶質状態）にすることにより、タンパク質結晶からの回折線の邪魔になる回折線を生じさせないようにするためである。また、タンパク質結晶５に抗凍結剤を加えるのは、結晶に含まれる又は結晶の周囲にある水が結晶状態に氷結することを防ぐためである。
結晶の凍結処理については後で詳しく説明する。
【００４２】
凍結されたタンパク質結晶５は、図９のＸ線回折測定工程Ｐ３において、図１２に示すように、Ｘ線源７及び２次元Ｘ線検出器８を含んだＸ線回折測定装置のＸ線光軸Ｘ０上に置かれる。Ｘ線源７は測定の種類に応じて白色Ｘ線又は特性Ｘ線を出射する。２次元Ｘ線検出器８は試料であるタンパク質結晶５から出た回折Ｘ線を検出するための検出器であり、平面形あるいは湾曲形のものが用いられる。例えば、２次元Ｘ線検出器８は蓄積性蛍光体によって形成された平板状のＸ線検出器であり、試料であるタンパク質結晶５から出た回折線を平面内で受光する検出器である場合で説明する。なお、Ｘ線回折測定装置はＸ線源７及びＸ線検出器８以外に、スリット、モノクロメータ等といった各種Ｘ線光学要素を含むものであるが、それらの図示は省略している。
【００４３】
Ｘ線源７から放出されたＸ線が試料であるタンパク質結晶５に入射すると、結晶５の原子立体構造に応じてＸ線光軸Ｘ０に対して所定の回折角度位置に回折線が生じ、その回折線がＸ線検出器８によって受光される。図では符号Ｐで受光点を模式的に示している。Ｘ線受光点Ｐが形成されるとき、回折線の強度の大きさに応じてＸ線検出器８によるＸ線受光量が変化し、受光部分Ｐに蓄積される蓄像量が変化する。Ｘ線検出器８に蓄積された蓄像量は、引き続いて行われる次の工程でレーザ光等といった輝尽励起光を受けて読み取られる。読み取られた結果は、回折線強度Ｉ（hkl）として電気信号によって特定される。
【００４４】
回折線強度Ｉ（hkl）が得られると、工程Ｐ４において、電子密度ρ（xyz）を求めるための計算を行う。具体的には、Ｉ（hkl）に基づいて結晶構造因子Ｆ（hkl）を計算によって求め、さらに求められた結晶構造因子Ｆ（hkl）をフーリエ合成して電子密度ρ（xyz）を求める。
【００４５】
その後、求められた電子密度ρ（xyz）に対して、工程Ｐ５においてアミノ基を当てはめてタンパク質の分子モデルを組み上げて行く作業を行う（分子モデルの構築）。さらに、構築された分子モデルと回折線強度測定で得られた分子モデルとを比較しながら分子モデルを修正する（分子モデルの精密化）。以上により、目標とするタンパク質結晶の分子モデルが求められる。
【００４６】
以下、工程Ｐ２において行われるタンパク質結晶の凍結工程を詳しく説明する。
この工程では、例えば図１に示す凍結装置１１を使用する。この凍結装置１１は内部が中空である円筒形状の壁部材１２を有し、その壁部材１２の内部に容器１３及び吸ガス器としてのファン１９が設けられている。
【００４７】
容器１３は、図２に示すように、上端に開口１４を有する有底の容器である。容器１３の内部に冷媒である液体窒素ＬＮが収容されている。冷媒としては、液体プロパンを用いることもできる。ファン１９は、軸１５を中心として回転する複数の羽部材１６を有している。羽根部材１６が回転すると、ファン１９と容器１３との間にある空気又はガスがファン１９の下方へ吸引される。吸引された空気又はガスは壁部材１２の下部に設けた開口を通して外部へ排出される。また、容器１３の底部は、下端が緩やかに湾曲する底部となっていても良い。
【００４８】
壁部材１２の上端は容器１３の開口１４よりも上方へ張り出しており、その上端部に庇部１７が設けられている。庇部１７は、容器１３の上端縁を越えて水平方向へ延び、開口１４の周縁領域まで延在している。つまり、開口１４の周縁領域は庇部１７によって覆われている。庇部１７のうち開口１４の周縁領域の上方に位置する部分は容器１３の内部方向へ向かって下がる傾斜部となっている。本実施形態では、庇部１７が開口１４の周縁領域の全域に設けられているが、周縁領域の一部には庇部１７が無い部分があっても良い。
【００４９】
本実施形態では、壁部材１２と容器１３との間の空間がガス搬送路を形成している。そして、その空間内に吸ガス器としてのファン１９が設けられている。ファン１９が作動すると、ガス搬送路内の空気が吸引されて外部へ排出される。ガス搬送路とファン１９とによって、後述する低温ガス層を除去するためのガス除去手段が構成されている。
【００５０】
容器１３内に収容された液体窒素ＬＮの温度は８１Ｋ（ケルビン）（−１９２℃）である。ファン１９が停止状態（通電ＯＦＦ状態）のとき、低温度である液体窒素ＬＮに起因して、液体窒素ＬＮの表層に低温ガス層（cold gas layer）１８が形成される。この低温ガス層１８は図３に曲線Ｌ１で示すような温度特性を有している。具体的には、液体窒素ＬＮの液面からの距離が大きくなるに従って徐々に温度が上がる特性を有している。曲線Ｌ１において、液体窒素ＬＮの液面から距離Ｄ１の所の温度がＴｈ＝２３５Ｋとなっている。液体窒素ＬＮの液面から距離Ｄ１の所までが低温ガス層１８であると考えられる。
【００５１】
図１１のタンパク質結晶５を凍結させる際には、タンパク質結晶５が捕集具６ごと図２の低温ガス層１８を通過して液体窒素ＬＮの中へ挿入される。挿入されたタンパク質結晶５は低温度の液体窒素ＬＮによって凍結状態とされる。しかしながら、タンパク質結晶５が低温ガス層１８を通過する際には、液体窒素ＬＮへ入って本格的に冷却される前に、タンパク質結晶５が低温ガス層１８の作用によって冷却され始める。このときの冷却速度は比較的遅いものであり、例えば８×１０３Ｋ／Ｓ程度である。
【００５２】
本実施形態ではタンパク質結晶５に抗凍結剤が添加されるので、タンパク質結晶５に含まれる水及びタンパク質結晶５の周囲の水がタンパク質結晶５の冷却の最中に氷の結晶となることはある程度抑えられる。しかしながら、抗凍結剤の添加が多量であると、浸透圧が高くなりすぎてタンパク質結晶５が破損するおそれがあるので、抗凍結剤の添加量はタンパク質結晶５の破損が生じない程度の少量に抑えられている。
【００５３】
このように抗凍結剤が少量に抑えられている場合に、低温ガス層１８の作用によってタンパク質結晶５に対する冷却速度が低く抑えられてしまうと、タンパク質結晶５に含まれる水及びタンパク質結晶５の周囲の水は、ガラス状態（非晶質状態）ではなく、結晶状態で氷結する。こうして氷の結晶が生成されると、図１２において、タンパク質結晶５からの回折線Ｐに加えて氷の結晶からの回折線が発生してそれがＸ線検出器８に受光されてしまうので、タンパク質結晶５の回折線を正確に捉えることができなくなる。
【００５４】
そこで、本実施形態では、タンパク質結晶５の凍結処理を行う際には、ファン１９がＯＮ状態とされる。すると、壁部材１２と容器１３との間に形成されるガス搬送路内の空気が吸引され、その結果、当該ガス搬送路の先端開口部、すなわち容器１３の開口１４の周縁領域に向かい合っているガス搬送路の開口部から、低温ガス層１８を形成しているガスが吸引されて開口１４から除去される。
【００５５】
こうして液体窒素ＬＮの表層の低温ガス層１８が除去されると、その表層部分の温度勾配は、図２の曲線Ｌ２で示すように、液面からの距離が小さい間に急速に高温領域へ立ち上がる状態となる。この状態において図１１のタンパク質結晶５を捕集具６ごと容器１３内の液体窒素ＬＮ内へ突っ込み投入すると、タンパク質結晶５は十分な冷却速度で急速に冷却されて凍結状態となる。このときの冷却速度は、例えば、８×１０４Ｋ／Ｓ程度の高い値である。
【００５６】
このようにタンパク質結晶５が急速冷却されて凍結されると、タンパク質結晶５に含まれる水及びタンパク質結晶５の周囲の水は、ガラス状態（非晶質状態）で氷結する。従って、これにＸ線が照射されても高強度の回折ピークは生じない。このため、Ｘ線検出器８に捕らえられるのはタンパク質結晶５からの回折線だけとなり、正確なＸ線回折測定が行われる。
【００５７】
非特許文献１（Warkentin等）は、液体窒素の液面近傍にノズルを配置して、このノズルから窒素ガスを放出して、液体窒素の表層の低温ガス層を吹き飛ばして除去する技術を開示している。しかしながら、この技術の場合には、窒素ガスのガスタンクを含んだ大掛かりな設備を準備しなければならない。しかも、窒素ガスの消費量はかなり大きい。これらのため、広い設備空間及び大きな経費が必要となる。
【００５８】
さらに、窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなる。
【００５９】
本実施形態では、窒素ガスの吹き付けによって低温ガス層を除去するのではなく、ガス吸引によって低温ガス層を除去することにしたので、大掛かりな窒素ガス噴射系を設置する必要がなくなり、窒素ガスを消費するという事態も発生せず、さらに、窒素ガスの噴射により液体窒素の液面に霧が発生してオペレータによる凍結処理作業をやり難くするということも無い。
【００６０】
（タンパク質結晶の凍結装置の第２実施形態）
図４は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置の他の実施形態を示している。上記の第１実施形態では、図２に示したように、壁部材１２を容器１３よりも長い円筒形状に形成し、容器１３の下方領域の壁部材１２の内部領域内に吸ガス器であるファン１９を設けた。
【００６１】
本実施形態では、壁部材１２の長さを容器１３を覆う程度に短縮し、その壁部材１２にガス管２１を接続し、そのガス管２１の途中に吸ガス器であるファン１９を設けている。この実施形態では、壁部材１２と容器１３との間の空間と、ガス管２１とによってガス搬送路が形成されている。液体窒素ＬＮの液面表層の低温ガス層１８を形成しているガスを、このガス搬送路を通して吸引して除去できる。
【００６２】
（タンパク質結晶の凍結装置の第３実施形態）
図５は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示している。この実施形態では、壁部材１２の長さを図４の実施形態よりもさらに短縮し、容器１３の底部が壁部材１２の下方へ突出している。壁部材１２の底面は、容器１３の壁面に気密に接触している。この状態でも、壁部材１２と容器１３との間の空間と、ガス管２１とによってガス搬送路が形成されている。
【００６３】
（タンパク質結晶の凍結装置の第４実施形態）
図６は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示している。図２、図４、図５で示した各実施形態では、円筒形状の壁部材１２と容器１３との間の空間と、ガス管２１とによってガス搬送路を形成した。これに対し、本実施形態では、ガス管２２によってガス搬送路を形成している。
【００６４】
本実施形態では、液体窒素ＬＮの液面表層の低温ガス層１８を形成しているガスを、ガス管２２を通してファン１９によって吸引して液面表層から除去する。ガス管２２のガス吸引用開口は、ガス管２２の先端の開口２３である。図では２本のガス管２２が示されているが、ガス管２２の数は、１本でも良いし、２本以上でも良い。
【００６５】
（タンパク質結晶の凍結装置の第５実施形態）
図７は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示している。この実施形態が１本又は複数本のガス管２４を用いてガス搬送路を形成していることは、図６に示した実施形態と同じである。
【００６６】
この実施形態では、ガス管２４の先端部分が液体窒素ＬＮの中に挿入されており、ガス吸引用開口２５は、ガス管２４の先端よりも少し上方位置の側面に形成されている。もちろん、開口２５の位置は、液体窒素ＬＮの液面よりも上方の位置である。
【００６７】
（タンパク質結晶の凍結装置の第６実施形態）
図８は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示している。この実施形態は図２に示した実施形態に改変を加えたものである。図２の実施形態と同じ部材は同じ符号で示すことにしてその説明は省略することにする。
【００６８】
本実施形態が図２に示した実施形態と異なる点は、壁部材１２の上端開口の上にノズルではない広口の吐出管２６を設け、この吐出管２６を窒素ガス源２７に接続したことである。窒素ガス源２７から放出された窒素ガスは、低温ガス層１８を吹き飛ばすことなく、液体窒素ＬＮの表層を覆う。
【００６９】
窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなるおそれがあった。これに対し、本実施形態では、水分を含んでいない窒素ガスによって液体窒素の表層を覆うことにしたので、表層に霧が発生することがない。
【符号の説明】
【００７０】
１．容器、 ２．緩衝液、 ３．蓋、 ４．タンパク質溶液、 ５．結晶、 ６．捕集具、 ７．Ｘ線源、 ８．２次元Ｘ線検出器、 １１．凍結装置、 １２．壁部材（ガス搬送路、ガス除去手段）、 １３．容器（ガス搬送路、ガス除去手段）、 １４．開口、 １５．軸、 １６．羽根部材、 １７．庇部、 １８．低温ガス層、 １９．ファン（吸ガス器、ガス除去手段）、２１，２２，２４．ガス管（ガス搬送路、ガス除去手段）、
２３，２５．ガス管の開口、 ２６．吐出管、 ２７．窒素ガス源、 Ｄ１．液面からの距離、 ＬＮ．液体窒素、 Ｐ．受光点、 Ｘ０．Ｘ線光軸、 Ｌ１，Ｌ２．液体窒素の液面上の温度特性曲線
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質結晶を凍結させるための凍結方法及び凍結装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質（protein）とは、Ｌ−アミノ酸が多数連結（重合）してできた高分子化合物であり、生物の重要な構成成分のひとつである。タンパク質に代表される生体高分子の立体構造に関する知見が生命科学の分野において非常に重要で不可欠であることは知られている。近年、タンパク質の立体構造の知見を基にそのタンパク質が持つ機能を解明することを目的とした学問分野である構造生物学が注目されている。
【０００３】
タンパク質の立体構造を分子レベル、さらには原子レベルで決定できる有力な手段としてＸ線分析装置が知られている。被検物質であるタンパク質にＸ線を照射したときにそのタンパク質から出る２次Ｘ線、例えば回折線、散乱線等を検出して分析することにより、タンパク質の分子立体構造又は原子立体構造を知ることができ、その知見に基づいて分子生物学におけるタンパク質の解析を行うことができる。
【０００４】
タンパク質の構造解析は、一般に、図９に示す工程図のような手順で行われる。具体的には、まず、工程Ｐ１において、被検対象であるタンパク質を結晶化する。得られた結晶は、工程Ｐ２において、Ｘ線回折測定に適した試料となるように調整される。例えば、キャピラリチューブに封入されたり、凍結させられたりする。キャピラリチューブに封入するのは、タンパク質結晶には溶媒（例えば水）が含まれているが、空気中に放置すると溶媒分子が蒸発して結晶が壊れるおそれがあるからである。他方、タンパク質結晶を凍結させるのは、結晶に含まれる溶媒（例えば水）をガラス状態（非晶質状態）にすることにより、タンパク質結晶からの回折線の邪魔になる回折線を生じさせないようにするためである。
【０００５】
次に、工程Ｐ３においてタンパク質結晶を試料としてＸ線回折測定を行って、回折線強度Ｉ(hkl)を求める。次に、求められた回折線強度Ｉ(hkl)に基づいて、工程Ｐ４において結晶構造因子Ｆ(hkl)を計算し、さらに求められた結晶構造因子Ｆ(hkl)をフーリエ合成して単位格子内の電子密度ρ(xyz)を求める。
【０００６】
次に、求められた電子密度ρ(xyz)に基づいて、工程Ｐ５においてタンパク質の分子モデルを組み上げて行き（分子モデルの構築）、さらに構築された分子モデルと回折強度測定で得られた分子モデルが十分に一致するように分子モデルを修正する（分子モデルの精密化）。こうして、タンパク質の分子モデルが最終的に決定されて、構造解析の目的が達成される。
【０００７】
上記のタンパク質の構造解析処理に関して Warkentin 等は非特許文献１において、特に試料調整工程Ｐ２に関して次のことを開示している。すなわち、タンパク質結晶の凍結は、その結晶を液体窒素の中へ突っ込み冷却（plunge cool）することにより達成できるはずである。しかしながら、液体窒素の液面表層には低温ガス層（cold gas layer）が形成されており、結晶を液体窒素の中へ突っ込む際には、結晶がその低温ガス層を横切って液体窒素へ入れられることから、次のような問題が発生する。
【０００８】
結晶は本来、瞬間的に冷却（flash cooling）されて凍結され、内部の溶媒（例えば水）がガラス状（非晶質状）にされるべきであるが、上記の低温ガス層を横切るときにゆっくりと冷却されるため、溶媒が結晶化することがある。このような溶媒結晶が生成されると、この溶媒結晶から出る回折線が分析対象であるタンパク質結晶からの回折線と干渉し、タンパク質結晶についての正確な回折線強度が得られなくなり、正確なタンパク質の構造決定を行うことができなくなるおそれがある。
【０００９】
溶媒結晶の生成を抑制するために、凍結処理に供されるタンパク質結晶に凍結防止剤、すなわち抗凍結剤（cryoprotectant）を添加すること、具体的には、抗凍結剤に結晶を浸すことが考えられる。例えば、抗凍結剤を２５％含ませれば、１０２Ｋ（ケルビン）／秒以下の冷却速度で溶媒の結晶化を防止できる。抗凍結剤が６％であれば、１０４Ｋ／秒以下の冷却速度が必要である。抗凍結剤が０％であれば、１０６Ｋ／秒以下の冷却速度が必要である。しかしながら、抗凍結剤を使用すると、タンパク質結晶の内部に浸透圧が生じ、その結果、結晶の破損、分解、構造変化等が発生して、正確な分析ができなくなるおそれがある。
【００１０】
Warkentin 等は非特許文献１において、液体窒素の表層の低温ガス層を除去することにより、タンパク質結晶を凍結させるための冷却速度を高速にすることができ、タンパク質結晶の瞬間冷却を実現でき、その結果、抗凍結剤の含有量を小さくできることを教示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】"Hyperquenching for protein cryocrystallography", Matthew Warkentin, Vitacheslav Berejnov, Naji S. Husseini and Robert E. Thorne, Journal of Applied Crystallography (2006).39, 805-811
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
液体窒素の表層の低温ガス層を除去するために、Warkentin 等は非特許文献１において、液体窒素の表層の近傍にノズルを配置し、そのノズルを通して窒素ガスを液体窒素の表層に吹き付けることにより、低温ガス層を吹き飛ばすことを提案している。
【００１３】
しかしながら、この除去方法を実現するにあたっては、窒素ガスのガスタンクを含んだ大掛かりな設備を準備しなければならない。しかも、窒素ガスの消費量はかなり大きい。これらのため、広い設備空間及び大きな経費が必要となる。
【００１４】
さらに、窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなるという問題も生じる。
【００１５】
本発明は、上記の問題点を解消するために成されたものであって、窒素ガスの吹き付けをしなくても、液体窒素の表層の低温ガス層を効率良く除去できる、タンパク質結晶の凍結方法及びその装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係るタンパク質結晶の凍結方法は、タンパク質結晶を冷媒の中へ入れて凍結させるタンパク質結晶の凍結方法において、容器中に収容された前記冷媒の表層に存在する低温ガス層を形成するガスを、吸引によって当該表層から除去しながら、前記タンパク質結晶を前記冷媒の表層を通過させて当該冷媒の中へ入れることを特徴とする。
【００１７】
タンパク質結晶は多量の溶媒（例えば水）を含んで結晶化するので、溶媒が蒸発等するとその蒸発等の際に結晶が壊れるおそれがある。タンパク質結晶を凍結すれば、溶媒を凍結してその動きを規制でき、タンパク質結晶が壊れることを回避できる。その際、凍結した溶媒、例えば氷が結晶状態をとっていると、Ｘ線回折測定を行ったときに、被検試料であるタンパク質結晶から出る回折線以外に、氷の結晶からの不要な回折線が出てしまい、タンパク質結晶からの回折線を正確に測定できないおそれがある。
【００１８】
溶媒である水が凍結するときに、結晶状態の氷が生成されることなく、ガラス状（非晶質状）の氷が生成されれば、上記のような氷の結晶からの回折線が無くなり、タンパク質結晶からの回折線を正確に捕らえることができるようになる。このように氷の結晶が生成されないようにするためには、溶媒としての水を含んだタンパク質結晶を急速に冷却することが有効である。
【００１９】
タンパク質結晶を凍結させるために用いられる冷媒（例えば液体窒素、液体プロパン等）は、通常、タンパク質結晶を十分に急速に冷却できる特性を有している。例えば、液体窒素の温度は８１Ｋ（ケルビン、−１９２℃）であるので、この液体窒素にタンパク質結晶を入れれば、タンパク質結晶を急速冷却することができ、氷の結晶の生成を回避できるはずである。
【００２０】
しかしながら、液体窒素等といった冷媒はその温度が非常に低温であるが故に、その液面表層に必然的に低温ガス層が形成される。従って、タンパク質結晶を液体窒素へ突っ込み投入するさいには、タンパク質結晶は必ずこの低温ガス層を通過する。この低温ガス層は緩やかな温度勾配をもって温度変化する層であるので、この低温ガス層を通過するタンパク質結晶は液体窒素で急冷される前に低温ガス層によって比較的ゆっくりと冷却されてしまう。このようなゆっくりとした冷却では、溶媒である水をガラス状に凍結させることは難しく、結晶化してしまう。この氷の結晶はＸ線回折測定の妨げとなる。
【００２１】
本発明によれば、低温ガス層を吸引によって液体窒素等といった冷媒の表層から除去した上で、タンパク質結晶をその液体窒素へ挿入することにしたので、タンパク質結晶は意図通りに急速に冷却され、その結果、溶媒を結晶化させることなくガラス状に凍結できる。このため、タンパク質結晶についての回折線を正確に検出できる。
【００２２】
しかも、本発明では、低温ガス層の除去のために窒素ガスの噴き付けを行うことが無いので、窒素ガス設備を準備する必要が無く、それ故、設備のためのコストが安く、窒素ガスを準備するためのコストも不要であり、非常に経済的である。
【００２３】
さらに、窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなるのであるが、本発明によれば、そのような霧の発生が無いので、作業が非常にやり易くなる。
【００２４】
本発明方法においては、前記低温ガス層を形成するガスを前記容器の周縁の一部又は全域において吸引することが望ましい。ガスを吸引する場所は種々考えられるが、容器の周縁から吸引することが、低温ガス層を除去する上で効果的である。
【００２５】
本発明方法において、前記冷媒は液体窒素であることが望ましい。冷媒は液体プロパン等とすることもできるが、安全性、経済性等の観点から液体窒素であることが望ましい。
【００２６】
次に、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置は、タンパク質結晶を凍結させる冷媒を収容しタンパク質結晶を出し入れできる開口を有した容器と、前記開口の周縁領域の一部又は全部において当該開口上のガスを吸引して当該開口上から除去するガス除去手段とを有することを特徴とする。
【００２７】
本発明装置によれば、冷媒の表面に形成された低温ガス層をガス除去手段によって除去した上で、タンパク質結晶をその冷媒中へ入れることができるので、タンパク質結晶内の溶媒（例えば水）を結晶化でなくガラス状に凍結させることができる程度に、タンパク質結晶を急速冷却できる。このため、タンパク質結晶のＸ線回折測定を正確に行なうことができる。
【００２８】
しかも、窒素ガスの吹き付けによる低温ガス層の除去ではないので、非常に経済的である。さらに、窒素ガスの吹き付けによる霧の発生の心配も無いので、作業が非常に楽である。
【００２９】
次に、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置において、前記ガス除去手段は、前記容器の開口の周縁領域の一部又は全部にガス吸引用の開口を有したガス搬送路と、該ガス搬送路内のガスを吸引する吸ガス器とを有することが望ましい。ガスを容器開口の周縁から吸い出すようにすれば、低温ガス層の除去を確実に行うことができる。
【００３０】
この構成において、前記ガス搬送路は、前記容器の周壁を間隔をおいて覆う壁部材と、前記容器の開口の周縁領域を間隔をおいて覆う庇部とを有することができる。そして、前記庇部は前記壁部材に連続して形成することができる。この構成の場合、ガス搬送路は、壁部材と容器壁とによって形成された空間によって形成される。壁部材によってガス搬送路を形成すれば、特別なガス管が不要であり、装置全体の構造が簡単で取り扱い易い構造となる。
【００３１】
本発明装置においては、前記壁部材が前記容器の全体を覆い、前記壁部材に囲まれた領域内であって前記容器の外側の部分に前記吸ガス器が設けられることが望ましい。そして、前記吸ガス器は、前記容器と反対側へガスを吸引するファンとすることが望ましい。この構成により、本発明のタンパク質結晶の凍結装置の全体的な構造を非常に簡単にすることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明方法及び装置によれば、低温ガス層を吸引によって液体窒素等といった冷媒の表層から除去した上で、タンパク質結晶をその液体窒素へ挿入することができるので、タンパク質結晶は意図通りに急速に冷却され、その結果、溶媒を結晶化させることなくガラス状に凍結できる。このため、タンパク質結晶についての回折線を正確に検出できる。
【００３３】
しかも、本発明では、低温ガス層の除去のために窒素ガスの噴き付けを行うことが無いので、窒素ガス設備を準備する必要が無く、それ故、設備のためのコストが安く、窒素ガスを準備するためのコストも不要であり、非常に経済的である。
【００３４】
さらに、窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなるのであるが、本発明によれば、そのような霧の発生が無いので、作業が非常にやり易くなる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置の一実施形態を示す斜視図である。
【図２】図１の凍結装置の側面断面図である。
【図３】低温ガス層の温度特性を示すグラフである。
【図４】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置の他の実施形態を示す断面図である。
【図５】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示す断面図である。
【図６】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示す断面図である。
【図７】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示す断面図である。
【図８】本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示す断面図である。
【図９】タンパク質のＸ線構造解析方法の一般的な工程図である。
【図１０】結晶化処理の一例を示す模式図である。
【図１１】結晶化されたタンパク質を模式的に示す図である。
【図１２】Ｘ線回折測定系の一例を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（タンパク質結晶の凍結方法及び凍結装置の第１実施形態）
本発明に係るタンパク質結晶の凍結方法及び凍結装置を説明する前に、まず、Ｘ線分析を用いたタンパク質の構造解析方法について図９に示された工程図に基づいて簡単に説明する。
【００３７】
まず、工程Ｐ１でタンパク質の結晶化が行われる。結晶化する理由は、第１に、タンパク質が気体や溶液の状態であると分子が激しく動いて立体構造が確定しないからである。第２に、結晶化して分子を規則正しく配列させると高強度の回折線を得ることができるからである。
【００３８】
結晶化の方法としては、静置バッチ法、自由界面拡散法、微量透析法、蒸気拡散法、等といった種々の方法があるが、例えば蒸気拡散法に従って結晶化を行うものとすれば、図１０に示すように、容器１内に沈殿剤を含んだ緩衝液２を収容し、容器１の開口をガラスの蓋３で密封する。そして、沈殿剤を含んだタンパク質溶液４を蓋３に吊り下げる。
【００３９】
タンパク質溶液４に含まれる沈殿剤の濃度は、緩衝液２に含まれる沈殿剤の濃度の１／２である。緩衝液２とタンパク質溶液４とが蒸気平衡に近づくにつれてタンパク質溶液４から溶媒である水が蒸発し、タンパク質溶液中の沈殿剤濃度が上昇し、タンパク質が結晶化する。得られた結晶は、図１１に符号５で示すように、ループと呼ばれる捕集具６によって溶液と共に捕集される。
【００４０】
捕集具６に捕集されたタンパク質結晶５は、工程Ｐ３で行われるＸ線回折測定に適した状態の試料となるように、工程Ｐ２において調整処理を受ける。本実施形態では、その調整のために、タンパク質結晶５を抗凍結剤を含んだ溶液に浸した後、そのタンパク質結晶５を凍結する。
【００４１】
タンパク質結晶を凍結させるのは、水が蒸発することを防止したり、結晶に含まれる溶媒である水をガラス状態（非晶質状態）にすることにより、タンパク質結晶からの回折線の邪魔になる回折線を生じさせないようにするためである。また、タンパク質結晶５に抗凍結剤を加えるのは、結晶に含まれる又は結晶の周囲にある水が結晶状態に氷結することを防ぐためである。
結晶の凍結処理については後で詳しく説明する。
【００４２】
凍結されたタンパク質結晶５は、図９のＸ線回折測定工程Ｐ３において、図１２に示すように、Ｘ線源７及び２次元Ｘ線検出器８を含んだＸ線回折測定装置のＸ線光軸Ｘ０上に置かれる。Ｘ線源７は測定の種類に応じて白色Ｘ線又は特性Ｘ線を出射する。２次元Ｘ線検出器８は試料であるタンパク質結晶５から出た回折Ｘ線を検出するための検出器であり、平面形あるいは湾曲形のものが用いられる。例えば、２次元Ｘ線検出器８は蓄積性蛍光体によって形成された平板状のＸ線検出器であり、試料であるタンパク質結晶５から出た回折線を平面内で受光する検出器である場合で説明する。なお、Ｘ線回折測定装置はＸ線源７及びＸ線検出器８以外に、スリット、モノクロメータ等といった各種Ｘ線光学要素を含むものであるが、それらの図示は省略している。
【００４３】
Ｘ線源７から放出されたＸ線が試料であるタンパク質結晶５に入射すると、結晶５の原子立体構造に応じてＸ線光軸Ｘ０に対して所定の回折角度位置に回折線が生じ、その回折線がＸ線検出器８によって受光される。図では符号Ｐで受光点を模式的に示している。Ｘ線受光点Ｐが形成されるとき、回折線の強度の大きさに応じてＸ線検出器８によるＸ線受光量が変化し、受光部分Ｐに蓄積される蓄像量が変化する。Ｘ線検出器８に蓄積された蓄像量は、引き続いて行われる次の工程でレーザ光等といった輝尽励起光を受けて読み取られる。読み取られた結果は、回折線強度Ｉ（hkl）として電気信号によって特定される。
【００４４】
回折線強度Ｉ（hkl）が得られると、工程Ｐ４において、電子密度ρ（xyz）を求めるための計算を行う。具体的には、Ｉ（hkl）に基づいて結晶構造因子Ｆ（hkl）を計算によって求め、さらに求められた結晶構造因子Ｆ（hkl）をフーリエ合成して電子密度ρ（xyz）を求める。
【００４５】
その後、求められた電子密度ρ（xyz）に対して、工程Ｐ５においてアミノ基を当てはめてタンパク質の分子モデルを組み上げて行く作業を行う（分子モデルの構築）。さらに、構築された分子モデルと回折線強度測定で得られた分子モデルとを比較しながら分子モデルを修正する（分子モデルの精密化）。以上により、目標とするタンパク質結晶の分子モデルが求められる。
【００４６】
以下、工程Ｐ２において行われるタンパク質結晶の凍結工程を詳しく説明する。
この工程では、例えば図１に示す凍結装置１１を使用する。この凍結装置１１は内部が中空である円筒形状の壁部材１２を有し、その壁部材１２の内部に容器１３及び吸ガス器としてのファン１９が設けられている。
【００４７】
容器１３は、図２に示すように、上端に開口１４を有する有底の容器である。容器１３の内部に冷媒である液体窒素ＬＮが収容されている。冷媒としては、液体プロパンを用いることもできる。ファン１９は、軸１５を中心として回転する複数の羽部材１６を有している。羽根部材１６が回転すると、ファン１９と容器１３との間にある空気又はガスがファン１９の下方へ吸引される。吸引された空気又はガスは壁部材１２の下部に設けた開口を通して外部へ排出される。また、容器１３の底部は、下端が緩やかに湾曲する底部となっていても良い。
【００４８】
壁部材１２の上端は容器１３の開口１４よりも上方へ張り出しており、その上端部に庇部１７が設けられている。庇部１７は、容器１３の上端縁を越えて水平方向へ延び、開口１４の周縁領域まで延在している。つまり、開口１４の周縁領域は庇部１７によって覆われている。庇部１７のうち開口１４の周縁領域の上方に位置する部分は容器１３の内部方向へ向かって下がる傾斜部となっている。本実施形態では、庇部１７が開口１４の周縁領域の全域に設けられているが、周縁領域の一部には庇部１７が無い部分があっても良い。
【００４９】
本実施形態では、壁部材１２と容器１３との間の空間がガス搬送路を形成している。そして、その空間内に吸ガス器としてのファン１９が設けられている。ファン１９が作動すると、ガス搬送路内の空気が吸引されて外部へ排出される。ガス搬送路とファン１９とによって、後述する低温ガス層を除去するためのガス除去手段が構成されている。
【００５０】
容器１３内に収容された液体窒素ＬＮの温度は８１Ｋ（ケルビン）（−１９２℃）である。ファン１９が停止状態（通電ＯＦＦ状態）のとき、低温度である液体窒素ＬＮに起因して、液体窒素ＬＮの表層に低温ガス層（cold gas layer）１８が形成される。この低温ガス層１８は図３に曲線Ｌ１で示すような温度特性を有している。具体的には、液体窒素ＬＮの液面からの距離が大きくなるに従って徐々に温度が上がる特性を有している。曲線Ｌ１において、液体窒素ＬＮの液面から距離Ｄ１の所の温度がＴｈ＝２３５Ｋとなっている。液体窒素ＬＮの液面から距離Ｄ１の所までが低温ガス層１８であると考えられる。
【００５１】
図１１のタンパク質結晶５を凍結させる際には、タンパク質結晶５が捕集具６ごと図２の低温ガス層１８を通過して液体窒素ＬＮの中へ挿入される。挿入されたタンパク質結晶５は低温度の液体窒素ＬＮによって凍結状態とされる。しかしながら、タンパク質結晶５が低温ガス層１８を通過する際には、液体窒素ＬＮへ入って本格的に冷却される前に、タンパク質結晶５が低温ガス層１８の作用によって冷却され始める。このときの冷却速度は比較的遅いものであり、例えば８×１０３Ｋ／Ｓ程度である。
【００５２】
本実施形態ではタンパク質結晶５に抗凍結剤が添加されるので、タンパク質結晶５に含まれる水及びタンパク質結晶５の周囲の水がタンパク質結晶５の冷却の最中に氷の結晶となることはある程度抑えられる。しかしながら、抗凍結剤の添加が多量であると、浸透圧が高くなりすぎてタンパク質結晶５が破損するおそれがあるので、抗凍結剤の添加量はタンパク質結晶５の破損が生じない程度の少量に抑えられている。
【００５３】
このように抗凍結剤が少量に抑えられている場合に、低温ガス層１８の作用によってタンパク質結晶５に対する冷却速度が低く抑えられてしまうと、タンパク質結晶５に含まれる水及びタンパク質結晶５の周囲の水は、ガラス状態（非晶質状態）ではなく、結晶状態で氷結する。こうして氷の結晶が生成されると、図１２において、タンパク質結晶５からの回折線Ｐに加えて氷の結晶からの回折線が発生してそれがＸ線検出器８に受光されてしまうので、タンパク質結晶５の回折線を正確に捉えることができなくなる。
【００５４】
そこで、本実施形態では、タンパク質結晶５の凍結処理を行う際には、ファン１９がＯＮ状態とされる。すると、壁部材１２と容器１３との間に形成されるガス搬送路内の空気が吸引され、その結果、当該ガス搬送路の先端開口部、すなわち容器１３の開口１４の周縁領域に向かい合っているガス搬送路の開口部から、低温ガス層１８を形成しているガスが吸引されて開口１４から除去される。
【００５５】
こうして液体窒素ＬＮの表層の低温ガス層１８が除去されると、その表層部分の温度勾配は、図２の曲線Ｌ２で示すように、液面からの距離が小さい間に急速に高温領域へ立ち上がる状態となる。この状態において図１１のタンパク質結晶５を捕集具６ごと容器１３内の液体窒素ＬＮ内へ突っ込み投入すると、タンパク質結晶５は十分な冷却速度で急速に冷却されて凍結状態となる。このときの冷却速度は、例えば、８×１０４Ｋ／Ｓ程度の高い値である。
【００５６】
このようにタンパク質結晶５が急速冷却されて凍結されると、タンパク質結晶５に含まれる水及びタンパク質結晶５の周囲の水は、ガラス状態（非晶質状態）で氷結する。従って、これにＸ線が照射されても高強度の回折ピークは生じない。このため、Ｘ線検出器８に捕らえられるのはタンパク質結晶５からの回折線だけとなり、正確なＸ線回折測定が行われる。
【００５７】
非特許文献１（Warkentin等）は、液体窒素の液面近傍にノズルを配置して、このノズルから窒素ガスを放出して、液体窒素の表層の低温ガス層を吹き飛ばして除去する技術を開示している。しかしながら、この技術の場合には、窒素ガスのガスタンクを含んだ大掛かりな設備を準備しなければならない。しかも、窒素ガスの消費量はかなり大きい。これらのため、広い設備空間及び大きな経費が必要となる。
【００５８】
さらに、窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなる。
【００５９】
本実施形態では、窒素ガスの吹き付けによって低温ガス層を除去するのではなく、ガス吸引によって低温ガス層を除去することにしたので、大掛かりな窒素ガス噴射系を設置する必要がなくなり、窒素ガスを消費するという事態も発生せず、さらに、窒素ガスの噴射により液体窒素の液面に霧が発生してオペレータによる凍結処理作業をやり難くするということも無い。
【００６０】
（タンパク質結晶の凍結装置の第２実施形態）
図４は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置の他の実施形態を示している。上記の第１実施形態では、図２に示したように、壁部材１２を容器１３よりも長い円筒形状に形成し、容器１３の下方領域の壁部材１２の内部領域内に吸ガス器であるファン１９を設けた。
【００６１】
本実施形態では、壁部材１２の長さを容器１３を覆う程度に短縮し、その壁部材１２にガス管２１を接続し、そのガス管２１の途中に吸ガス器であるファン１９を設けている。この実施形態では、壁部材１２と容器１３との間の空間と、ガス管２１とによってガス搬送路が形成されている。液体窒素ＬＮの液面表層の低温ガス層１８を形成しているガスを、このガス搬送路を通して吸引して除去できる。
【００６２】
（タンパク質結晶の凍結装置の第３実施形態）
図５は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示している。この実施形態では、壁部材１２の長さを図４の実施形態よりもさらに短縮し、容器１３の底部が壁部材１２の下方へ突出している。壁部材１２の底面は、容器１３の壁面に気密に接触している。この状態でも、壁部材１２と容器１３との間の空間と、ガス管２１とによってガス搬送路が形成されている。
【００６３】
（タンパク質結晶の凍結装置の第４実施形態）
図６は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示している。図２、図４、図５で示した各実施形態では、円筒形状の壁部材１２と容器１３との間の空間と、ガス管２１とによってガス搬送路を形成した。これに対し、本実施形態では、ガス管２２によってガス搬送路を形成している。
【００６４】
本実施形態では、液体窒素ＬＮの液面表層の低温ガス層１８を形成しているガスを、ガス管２２を通してファン１９によって吸引して液面表層から除去する。ガス管２２のガス吸引用開口は、ガス管２２の先端の開口２３である。図では２本のガス管２２が示されているが、ガス管２２の数は、１本でも良いし、２本以上でも良い。
【００６５】
（タンパク質結晶の凍結装置の第５実施形態）
図７は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示している。この実施形態が１本又は複数本のガス管２４を用いてガス搬送路を形成していることは、図６に示した実施形態と同じである。
【００６６】
この実施形態では、ガス管２４の先端部分が液体窒素ＬＮの中に挿入されており、ガス吸引用開口２５は、ガス管２４の先端よりも少し上方位置の側面に形成されている。もちろん、開口２５の位置は、液体窒素ＬＮの液面よりも上方の位置である。
【００６７】
（タンパク質結晶の凍結装置の第６実施形態）
図８は、本発明に係るタンパク質結晶の凍結装置のさらに他の実施形態を示している。この実施形態は図２に示した実施形態に改変を加えたものである。図２の実施形態と同じ部材は同じ符号で示すことにしてその説明は省略することにする。
【００６８】
本実施形態が図２に示した実施形態と異なる点は、壁部材１２の上端開口の上にノズルではない広口の吐出管２６を設け、この吐出管２６を窒素ガス源２７に接続したことである。窒素ガス源２７から放出された窒素ガスは、低温ガス層１８を吹き飛ばすことなく、液体窒素ＬＮの表層を覆う。
【００６９】
窒素ガスをノズルによって液体窒素の表層に吹き付ける場合には、空気中の水分が凍って水滴化して霧が発生し、その霧が液体窒素の表層を覆い、オペレータの視界が遮られ、オペレータがタンパク質結晶を液体窒素の中に入れる作業が非常にやり難くなるおそれがあった。これに対し、本実施形態では、水分を含んでいない窒素ガスによって液体窒素の表層を覆うことにしたので、表層に霧が発生することがない。
【符号の説明】
【００７０】
１．容器、 ２．緩衝液、 ３．蓋、 ４．タンパク質溶液、 ５．結晶、 ６．捕集具、 ７．Ｘ線源、 ８．２次元Ｘ線検出器、 １１．凍結装置、 １２．壁部材（ガス搬送路、ガス除去手段）、 １３．容器（ガス搬送路、ガス除去手段）、 １４．開口、 １５．軸、 １６．羽根部材、 １７．庇部、 １８．低温ガス層、 １９．ファン（吸ガス器、ガス除去手段）、２１，２２，２４．ガス管（ガス搬送路、ガス除去手段）、
２３，２５．ガス管の開口、 ２６．吐出管、 ２７．窒素ガス源、 Ｄ１．液面からの距離、 ＬＮ．液体窒素、 Ｐ．受光点、 Ｘ０．Ｘ線光軸、 Ｌ１，Ｌ２．液体窒素の液面上の温度特性曲線
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質結晶を冷媒の中へ入れて凍結させるタンパク質結晶の凍結方法において、
容器中に収容された前記冷媒の表層に存在する低温ガス層を形成するガスを、吸引によって当該表層から除去しながら、前記タンパク質結晶を前記冷媒の表層を通過させて当該冷媒の中へ入れる
ことを特徴とするタンパク質結晶の凍結方法。
【請求項２】
前記低温ガス層を形成するガスを前記容器の周縁の一部又は全域において吸引する
ことを特徴とする請求項１記載のタンパク質結晶の凍結方法。
【請求項３】
前記冷媒は液体窒素であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載のタンパク質結晶の凍結方法。
【請求項４】
タンパク質結晶を凍結させる冷媒を収容しタンパク質結晶を出し入れできる開口を有した容器と、
前記開口の周縁領域の一部又は全部において当該開口上のガスを吸引して当該開口上から除去するガス除去手段と、
を有することを特徴とするタンパク質結晶の凍結装置。
【請求項５】
前記ガス除去手段は、
前記容器の開口の周縁領域の一部又は全部にガス吸引用の開口を有したガス搬送路と、
該ガス搬送路内のガスを吸引する吸ガス器と、
を有することを特徴とする請求項４記載のタンパク質結晶の凍結装置。
【請求項６】
前記ガス搬送路は、
前記容器の周壁を間隔をおいて覆う壁部材と、前記容器の開口の周縁領域を間隔をおいて覆う庇部と、を有し、
前記庇部は前記壁部材に連続している
ことを特徴とする請求項５記載のタンパク質結晶の凍結装置。
【請求項７】
前記壁部材は前記容器の全体を覆い、
前記壁部材に囲まれた領域内であって前記容器の外側の部分に前記吸ガス器が設けられている
ことを特徴とする請求項６記載のタンパク質結晶の凍結装置。
【請求項８】
前記吸ガス器は前記容器と反対側へガスを吸引するファンであることを特徴とする請求項７記載のタンパク質結晶の凍結装置。
【請求項１】
タンパク質結晶を冷媒の中へ入れて凍結させるタンパク質結晶の凍結方法において、
容器中に収容された前記冷媒の表層に存在する低温ガス層を形成するガスを、吸引によって当該表層から除去しながら、前記タンパク質結晶を前記冷媒の表層を通過させて当該冷媒の中へ入れる
ことを特徴とするタンパク質結晶の凍結方法。
【請求項２】
前記低温ガス層を形成するガスを前記容器の周縁の一部又は全域において吸引する
ことを特徴とする請求項１記載のタンパク質結晶の凍結方法。
【請求項３】
前記冷媒は液体窒素であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載のタンパク質結晶の凍結方法。
【請求項４】
タンパク質結晶を凍結させる冷媒を収容しタンパク質結晶を出し入れできる開口を有した容器と、
前記開口の周縁領域の一部又は全部において当該開口上のガスを吸引して当該開口上から除去するガス除去手段と、
を有することを特徴とするタンパク質結晶の凍結装置。
【請求項５】
前記ガス除去手段は、
前記容器の開口の周縁領域の一部又は全部にガス吸引用の開口を有したガス搬送路と、
該ガス搬送路内のガスを吸引する吸ガス器と、
を有することを特徴とする請求項４記載のタンパク質結晶の凍結装置。
【請求項６】
前記ガス搬送路は、
前記容器の周壁を間隔をおいて覆う壁部材と、前記容器の開口の周縁領域を間隔をおいて覆う庇部と、を有し、
前記庇部は前記壁部材に連続している
ことを特徴とする請求項５記載のタンパク質結晶の凍結装置。
【請求項７】
前記壁部材は前記容器の全体を覆い、
前記壁部材に囲まれた領域内であって前記容器の外側の部分に前記吸ガス器が設けられている
ことを特徴とする請求項６記載のタンパク質結晶の凍結装置。
【請求項８】
前記吸ガス器は前記容器と反対側へガスを吸引するファンであることを特徴とする請求項７記載のタンパク質結晶の凍結装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−１９０４５７（Ｐ２０１０−１９０４５７Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３３５２６（Ｐ２００９−３３５２６）
【出願日】平成２１年２月１７日（２００９．２．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名： 第２１回国際結晶学連合会議 主催者名 ： 日本結晶学会及び日本学術会議の共催 開催日 ： 平成２０（２００８）年８月２３日〜３１日
【出願人】（０００２５０３３９）株式会社リガク (206)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１７日（２００９．２．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名： 第２１回国際結晶学連合会議 主催者名 ： 日本結晶学会及び日本学術会議の共催 開催日 ： 平成２０（２００８）年８月２３日〜３１日
【出願人】（０００２５０３３９）株式会社リガク (206)
【Ｆターム（参考）】
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