チップ構造体
【課題】レンズを不要の構成とすることが可能となり、低コストにも係わらず、集光効率が落ちてＳ／Ｎの値が低下することがない、表面プラズモン増強蛍光装置に用いられるチップ構造体を提供する。
【解決手段】表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その周囲を囲み上方に伸びる空洞溝が設けられており、前記空洞溝と前記基体との境界面で前記蛍光を反射可能であるチップ構造体。
【解決手段】表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その周囲を囲み上方に伸びる空洞溝が設けられており、前記空洞溝と前記基体との境界面で前記蛍光を反射可能であるチップ構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出が行われている。表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザ光（励起光）が金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、光源より照射したレーザ光（励起光）が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光物質を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出する方法である。
【０００３】
近年、このような表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置の開発が進められており、例えば特許文献１や特許文献２などにその技術開示がなされている。
【０００４】
このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図８に示したように基本的な構造において、誘電体部材１０６の表面に金属薄膜１０２、更にその表面に反応部１０４が設けられたチップ構造体１０８を備えている。
【０００５】
そして、チップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２で全反射した金属薄膜全反射光ｂ２を受光する受光手段１１６が備えられている。
【０００６】
一方、チップ構造体１０８の反応部１０４側には、反応部１０４に捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光ｂ３を受光する光検出手段１２０が設けられている。
【０００７】
なお、反応部１０４と光検出手段１２０との間には、蛍光ｂ３を効率よく集光するための集光部材１２２と、蛍光ｂ３以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光のみを選択するフィルタ１２４が設けられている。
【０００８】
そして、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０の使用においては、あらかじめ金属薄膜１０２の表面上には検出対象のＤＮＡ等のアナライトに含まれる抗原に特異的に結合する１次抗体があらかじめ固定されている。金属薄膜１０２に接する反応部１０４に、アナライト及び当該アナライトに特異的に結合する２次抗体を順に送液して、２次抗体を反応部１０４で捕捉させる。アナライトとともに捕捉される２次抗体は蛍光物質で標識されている。
【０００９】
反応部１０４の蛍光標識に光源１１２より誘電体部材１０６内に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が特定の角度（共鳴角）θ１で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになっている。なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜全反射光ｂ２の光量減少という現象が生ずる。
【００１０】
受光手段１１６及び光源１１２とは対となって金属薄膜１０２の照射領域を中心として回動し、金属薄膜１０２への入射角度を変更することができる。入射角度を変化させ、その際の受光手段１１６で受光される金属薄膜全反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θ１を得ることができる。
【００１１】
そして、この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜１０２上の反応部１０４の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大することとなる。
【００１２】
この増大した蛍光ｂ３を、集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出手段１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。
【００１３】
このように、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察可能とする高感度計測センサである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００８−１０２１１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、上述したような従来の表面プラズモン増強蛍光装置１０では、集光部材１２２を用いて、増強された蛍光ｂ３を光検出手段１２０で検出するようになっている。このような集光部材１２２には通常レンズが用いられているが、レンズは非常に高価であり、焦点合わせが非常に大変なものあった。
【００１６】
また、反応部１０４の蛍光物質から発せられる蛍光を効率よく集光するためには、集光部材１２２を反応部１０４に近接することが望ましいが、チップ構造体１０８と集光部材１２２とは別部品で構成されているために、自ずと限界があり、離れた位置に配置された集光部材１２２では十分な集光効率が確保できず、やはりＳ／Ｎの値が低くなってしまう問題を有するものであった。
【００１７】
本発明はこのような問題に鑑み、レンズを不要の構成とすることが可能となり、低コストにも係わらず、集光効率が落ちてＳ／Ｎの値が低下することがない、表面プラズモン増強蛍光装置に用いられるチップ構造体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
【００１９】
１．表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その周囲を囲み上方に伸びる空洞溝が設けられており、前記空洞溝と前記基体との境界面で前記蛍光を反射可能であることを特徴とするチップ構造体。
【００２０】
２．前記空洞溝に囲まれた基体の形状は円柱状又は、上方に広がる円錐台形状であることを特徴とする前記１に記載のチップ構造体。
【００２１】
３．前記空洞溝は、前記流路に貫通していないことを特徴とする、前記１又は２に記載のチップ構造体。
【００２２】
４．前記空洞溝には、前記基材よりも低屈折率の他の基材からなる部材が挿入されていることを特徴とする前記１から３のいずれか一項に記載のチップ構造体。
【００２３】
５．前記基材は、透明樹脂であり、前記基体は成形により製造されていることを特徴とする前記１から４のいずれか一項に記載のチップ構造体。
【００２４】
６．表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その上方に空洞溝が設けられており、
前記空洞溝には、円柱状又は円錐台形状の集光ロッドが挿入されており、前記集光ロッドの側壁で前記蛍光を反射可能であることを特徴とするチップ構造体。
【００２５】
７．前記集光ロッドは、光ファイバであることを特徴とする前記６に記載のチップ構造体。
【００２６】
８．表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その上方に空洞溝が設けられており、
前記基体の前記空洞溝に面する表面に鏡面加工が施されていることを特徴とするチップ構造体。
【発明の効果】
【００２７】
レンズを不要の構成とすることが可能となり、低コストにも係わらず、集光効率が落ちてＳ／Ｎの値が低下することがない、表面プラズモン増強蛍光装置に用いられるチップ構造体を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】マイクロチップ送液システムを用いた表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【図２】図２（ａ）はマイクロチップ１４周辺の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図である。
【図３】チップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図４】第２の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図５】第３の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図６】第４の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図７】第５の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図８】従来の表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
【００３０】
図１、図２は、実施形態に係るマイクロチップ送液システムを用いた表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【００３１】
表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光を金属薄膜に照射して粗密波（表面プラズモン）を生じさせて励起された蛍光物質が生ずる蛍光を正確に検出し、検出感度を上げても超高精度に蛍光検出を行うことを可能とするものである。
【００３２】
［表面プラズモン増強蛍光測定装置１０、及び検体検出方法］
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図１に示したように、金属薄膜１０２と、金属薄膜１０２の表面に形成された反応部１０４と、基体１４２とを有するチップ構造体１０８を備えている。金属薄膜１０２の一方の面側には誘電体部材１０６が形成されており、反応部１０４は金属薄膜１０２の他方の面側に形成されている。
【００３３】
基体に用いる基材としては、樹脂が用いられる。その樹脂としては、成形性（転写性、離型性）が良いこと、透明性が高いこと、紫外線や可視光に対する自家蛍光性が低いことなどが条件として挙げられるが、特に限定されるものではない。例えば、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン６、ナイロン６６、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリプロピレン、ポリイソプレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン、環状ポリオレフィンなどが用いられる。
【００３４】
また、高屈折率の観点からは、更にポリカーボネートが好ましい。
【００３５】
基体１４２の一方の面には流路溝が形成されており、流路溝が形成された面を金属薄膜１０２の面に接着剤塗布あるいは加熱及び加圧を所定時間行うこと等により接合することにより反応部１０４を底面として液体を送液する流路１４３が形成される。また基体１４２には反応部１０４を中心として、その周囲を囲み上方に伸びる空洞溝ｈ１が設けられている。空洞溝ｈ１についての詳細は後述の図３の説明で行う。また、基体１４２の形成方法としては、コストの観点から金型を用いた射出成形が好ましい。
【００３６】
またチップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２に全反射した金属薄膜全反射光ｂ２を受光する受光手段１１６を備えている。
【００３７】
ここで光源１１２から照射される励起光ｂ１としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜１０００ｎｍのガスレーザまたは固体レーザ、波長３８５〜８００ｎｍの半導体レーザが好適である。
【００３８】
一方、チップ構造体１０８の反応部１０４側には、反応部１０４で生じた蛍光ｂ３を受光する光検出手段１２０が設けられている。
【００３９】
光検出手段１２０としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
【００４０】
そしてチップ構造体１０８の反応部１０４と光検出手段１２０との間には、光を効率よく集光するための集光部材１２２と、光の内で蛍光ｂ３とは異なる波長の光の透過を低減して蛍光ｂ３を選択的に透過するように形成されたフィルタ１２４が設けられている。
【００４１】
なお、集光部材１２２は、本実施形態においては空洞溝ｈ１を設けた基体１４２にその機能の一部を担わせることで省略することが可能である。そのことにより表面プラズモン増強蛍光測定装置全体としてコストダウンが図れる。また集光部材１２２が設けた構成においても、集光効率が良くなりＳ／Ｎの値が低下することがない、
集光部材１２２としては、光検出手段１２０に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００４２】
一方、フィルタ１２４としては、光学フィルタ、カットフィルタなどを用いることができる。光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【００４３】
そして、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０を用いたアナライト検出方法では、反応部１０４に接する側の金属薄膜１０２表面上には１次抗体を結合させたＳＡＭ膜（Self-Assembled Monolayer：「自己組織化単分子膜」ともいう）あるいは高分子材料膜が設けられている。１次抗体はＳＡＭ膜あるいは高分子材料膜の一方の面に結合されており、ＳＡＭ膜あるいは高分子材料膜の他方の面は、直接若しくは間接に金属薄膜１０２表面に固定されている。ＳＡＭ膜としては例えばＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜、高分子材料としては例えばポリエチレングリコール（polyethylene glycol、以下「ＰＥＧ」と記す。）やＭＰＣポリマー等が挙げられる。これは使用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。また、１次抗体に対する反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を備えたポリマーを直接基板上に固定化し、その上に１次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。
【００４４】
このようにして構成した反応部１０４に標的物質としてのアナライトの抗原を含む溶液（以下、検体液ともいう）と、二次抗体を含む試薬液の送液を行う。固定化した一次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対しさらに蛍光物質で標識した二次抗体を含む試薬液を作用させることで捕捉された抗原を標識している。なお予め抗原と二次抗体とを反応させておいてから一次抗体を作用させてもよい。
【００４５】
蛍光物質で標識されたアナライトの検出を行うには、アナライトが捕捉された反応部１０４に光源１１２より誘電体部材１０６に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が金属薄膜１０２に対して特定の入射角度（共鳴角θ１）で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになる。
【００４６】
なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜全反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段１１６で受光される金属薄膜全反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ良い。
【００４７】
そして、この粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１０２上の反応部１０４で生じた蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大し、この蛍光ｂ３を集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出手段１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。
【００４８】
なお、金属薄膜１０２の材質としては、好ましくは金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。
【００４９】
このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１０２に好適である。
【００５０】
また、金属薄膜１０２の形成方法としては、例えばスパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法、蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
【００５１】
さらに金属薄膜１０２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００５２】
電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
【００５３】
金属薄膜１０２の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１０２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。
【００５４】
また、誘電体部材１０６としては、例えば高屈折率の６０度プリズムを用いることができる。材料としては光学的に透明な各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）または二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことが好ましい。
【００５５】
さらに、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、光源１１２から金属薄膜１０２に照射される励起光ｂ１による表面プラズモン共鳴の最適角（共鳴角θ１）を調整するため、角度可変部（図示せず）を有している。
【００５６】
ここで、角度可変部（図示せず）は制御部１３により制御され、「共鳴角スキャン工程」においては角度可変部のサーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段１１６と光源１１２とを同期して、照射領域を中心として回動し、４５〜８５°の範囲で角度変更を可能としている。また分解能は０．０１°以上であることが好ましい。
【００５７】
図２（ａ）は、マイクロチップ１４周辺の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図である。流路１４３の経路中には、反応部１０４が設けられている。流路１４３の一方の端部には開口１４４ａが、他方の端部には開口１４４ｂがそれぞれ設けられている。また開口１４４ａ側には接続部１４５が設けられている。
【００５８】
接続部１４５へは、ピペット１５０が接続可能である。接続部１４５は弾性体材料で構成されており、ピペット１５０を装填する際にはシール部材として機能する。他方の端部側の開口１４４ｂの先には、液溜部１５１が設けられている。なお液溜部１５１の上部には不図示の微細な空気孔が設けられている。
【００５９】
基体１４２の空洞溝ｈ１が設けられている付近の厚み（Ｚ方向長さ）は好ましくは２〜５ｍｍであるがこれよりも厚くてもよい。流路１４３の幅（Ｙ方向長さ）は１ｍｍ〜３ｍｍ、高さ（Ｚ方向）は５０μｍ〜５００μｍ、反応部１０４の幅は流路１４３の幅と同等であり、長さ（Ｘ方向）は１ｍｍ〜３ｍｍであるが、必ずしも限定されるものではなくそれよりも長く流路１４３の全域に渡っていても良い。また流路１４３の両端の開口１４４ａ、１４４ｂの大きさは流路１４３の幅と同等のφ１ｍｍ〜φ３ｍｍである。ピペット１５０の先端は開口１４４ａとほぼ同等の形状であり、根元部分はこれよりも太い軸径の円柱形状である。液溜部１５１は流路方向で開口１４４ｂよりも大きな断面形状であり、例えば断面が２〜４ｍｍ角の角柱形状としている。
【００６０】
図２（ａ）においては、ピペット１５０を装填した状態を示している。なお、液溜部１５１はマイクロチップ１４に固定した例を示しているが、ピペット１５０と同様に取り外し可能な構成としてもよい。なおピペット１５０はポンプ１３０の駆動による内圧の変化に対して変形せずに容積の変化がほとんど生じない程度の剛性を備えていればよい。本実施形態では、材料としてはポリプロピレンを用いている。また接続部１４５を介して容易に脱着が可能であり、供給した検体液とともにピペット１５０の廃棄を容易に行うことができる。
【００６１】
ポンプ１３０は例えばシリンジポンプであり、所定量の液体を吐出あるいは吸引することが可能である。ポンプ１３０により、ピペット１５０の内部に貯留した検体液等の液体をマイクロチップ１４の内部に送液する。このようにして流路１４３には蛍光物質が標識された二次抗体等が含まれる試薬液や、アナライトが含まれる検体液がポンプ１３０により送液される。
【００６２】
検体としては、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００６３】
さらに蛍光物質としては、所定の励起光ｂ１を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光ｂ３を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光ｂ３とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
【００６４】
図３は、チップ構造体１０８の構成を示す模式図であり、図２を一部拡大したものである。図３（ａ）は上面図、図３（ｂ）はＡ−Ａ断面図である。これらの図に示すように空洞溝ｈ１は反応部１０４を中心としてその周囲を囲むように設けられおり、上方に伸びている。より詳しくは、空洞溝ｈ１は反応部１０４の蛍光物質からの蛍光ｂ３が発光する領域の周囲を囲むように設けられている。蛍光ｂ３が発光する領域とは、蛍光物質が標識された二次抗体が捕捉されている反応部１０４であって、かつ、励起光ｂ１の照射により電場が増強されている領域である。図３（図４〜図７でも同様）に示す例では、反応部１０４の領域は、電場が増強される領域よりも狭いので、反応部１０４の領域と蛍光ｂ３が発光する領域とは一致している。
【００６５】
基体１４２は、中央部１４２ａと外周部１４２ｃ、及びこれらを接続する架橋部１４２ｂからなる。中央部１４２ａの外周壁ａ２（空洞溝と基体との境界面）はほぼ垂直になっており、空洞溝ｈ１に囲まれた中央部１４２ａの形状は円柱状である。
【００６６】
中央部１４２ａを含む基体１４２の基材は、高屈折率の材料を用いている。空洞溝ｈ１は空間（空気）なのでその屈折率の低い（ほぼ１．０）。反応部１０４から発光して上方の中央部１４２ａの内部に入射した蛍光ｂ３は、外周壁ａ２に対して臨界角以上の角度で入射した場合には、全反射することになる。蛍光ｂ３は全反射を繰り返して上面ａ４から抜けてゆく。このように、基体１４２の中央部１４２ａは集光部材として機能することが可能であり、これにより反応部１０４から発光した蛍光ｂ３を効率よく集光することが可能となる。
【００６７】
また、空洞溝ｈ１の下端部ａ１は流路１４３へは貫通しておらず、流路１４３を構成する上壁面ａ３はフラットである。このことにより流路１４３を流れる液体の送液にスムーズに行え、悪影響を及ぼさない。また基体１４２の外周部１４２ｃと中央部１４２ａとは、空洞溝ｈ１に下方にある架橋部１４２ｂにより接続されているが、架橋部１４２ｂの厚み（Ｚ方向）は強度を許す限り、なるべく薄くして空洞溝ｈ１の下端部ａ１が反応部１０４に近い方が効率良く蛍光ｂ３を集光できるので好ましい。また図３に示す構成では空洞溝ｈ１は環状で架橋部１４２ｂは下端にのみ設けられていたが、これに限られず空洞溝ｈ１の中に架橋部１４２ｂを設け、環状の一部が寸断された構成であってもよい。更に中央部１４２ａは断面が真円の円柱形状であったが、断面が楕円の円柱形状であってもよい。
【００６８】
更に、励起光ｂ１や可視光による誘電体部材１０６からの自家蛍光ｂ３０１がノイズとなりＳ／Ｎ値に影響するが、本実施形態においては、このような自家蛍光ｂ３０１は外周部１４２ｃの内周壁ａ５（空洞溝外側と基体との境界面）で全反射できるので、その影響を少なくすることができる。また空洞溝ｈ１の外側と内側の壁面（内周壁ａ５及び外周壁ａ２）は平行にする必要はなく、外側の内周壁ａ５で自家蛍光ｂ３０１をより効率よく全反射するためには、自家蛍光ｂ３０１の内周壁ａ５への入射角が臨界角以上となりやすいように角度を決定してもよい。さらに、射出成形により基体１４２する場合に転写性を高めるために空洞溝ｈ１の外側と内側の壁面に２〜５°の抜きテーパを形成してもよい。
【００６９】
［他の実施形態］
図４〜図７は、それぞれ第２〜第５の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。図３に対応するものであり、図３と共通する構成に関しては同符号を付すことにより説明に換える。また図４に示す構成以外は図１〜図２と共通であり説明は省略する。
【００７０】
図４に示す第２の実施形態に係るチップ構造体１０８では、空洞溝ｈ１に囲まれた中央部１４２ａの形状は、上方に広がる円錐台形状である。このような構成とすることにより中央部１４２ａの外周壁ａ２は反応部１０４が形成されている面に対してラッパ状に広がった傾斜を持つので、外周壁ａ２により蛍光ｂ３は、より平行光（反応部１０４の面に対する法線方向）に近い角度で全反射されるので集光効率が向上する。
【００７１】
図５に示す第３の実施形態におけるチップ構造体１０８では、図３に示した基体１４２に対して空洞溝ｈ１の部分に部材１４７を挿入している。部材１４７は、基体１４２の基材よりも低屈折率の基材から構成されているので、図３に示した構成と同様に、基体１４２の中央部１４２ａ内部へ照射された蛍光ｂ３は、部材１４７と中央部１４２ａとの境界で全反射させることができる。そして、部材１４７を挿入することにより、基体１４２全体の剛性強度を増すことが可能となる。低屈折率な基材としてはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）が好ましい。
【００７２】
図６に示す第４の実施形態に係るチップ構造体１０８では、空洞溝ｈ２に集光ロッド１４８を挿入し、集光ロッド１４８を集光部材として用いるものである。集光ロッド１４８とはガラスあるいは樹脂でできた一体構造物であって、その一方の片面から光を取り込み内部で導光し、他の片面から光を放出する構造物のことである。
【００７３】
図６（ａ）は基体１４２を示す図であり円柱状の空洞溝ｈ２は、反応部１０４を覆うように上方に設けられている。図６（ｂ）は、図６（ａ）に示す基体１４２を用いて構成されたチップ構造体１０８を示す図であり、同図においては集光ロッド１４８を挿入している。同図に示す集光ロッドは円柱状であり高屈折率の基材から構成されているので、図３に示した構成と同様に、反応部１０４から基体１４２の中央部１４２ｄを透過して集光ロッド１４８の内部へ照射された蛍光ｂ３は、集光ロッド１４８とその外側の空間（空洞溝ｈ２）との境界で全反射させることができる。蛍光ｂ３は全反射を繰り返して上面ａ４から抜けてゆく。このように、集光ロッド１４８は集光部材として機能することが可能であり、これにより反応部１０４から発光した蛍光ｂ３を効率よく集光することが可能となる。
【００７４】
なお集光ロッド１４８は、円柱状のみならず上方に広がる円錐台形状としてもよい。また集光ロッド１４８の代わりに、光ファイバを空洞溝ｈ２に挿入してもよい。光ファイバは、ガラスファイバ、若しくは中空光ファイバであり集光ロッドにくらべてフレキシブルに屈曲できる点で好ましい。例えば複雑に込み入った所に配置されたセンサ面まで光ファイバにより検出光を導光することができるので、設計の自由度が向上する。
【００７５】
図７に示す第５の実施形態に係るチップ構造体１０８では、空洞溝ｈ２に面する基体１４２の表面は鏡面加工が施されている鏡面ａ６である。鏡面加工とは光が反射するように、表面に対して研磨処理あるいはスパッタリング法や蒸着法により金属薄膜の形成処理をしてその表面を平滑にすることである。
【００７６】
図３に示した構成と同様に、反応部１０４から基体１４２の中央部１４２ｄを透過して上方の空洞溝ｈ２に抜けた蛍光ｂ３は鏡面ａ６で全反射させることができる。蛍光ｂ３は全反射を繰り返して上方に抜けてゆく。このように、鏡面ａ６を備えた基体１４２を集光部材として機能することが可能であり、これにより反応部１０４から発光した蛍光ｂ３を効率よく集光することが可能となる。
【符号の説明】
【００７７】
１０ 表面プラズモン増強蛍光測定装置
１０２ 金属薄膜
１０４ 反応部
１０６ 誘電体部材
１０８ チップ構造体
１１２ 光源
１１６ 受光手段
１２０ 光検出手段
１２２ 集光部材
１２４ フィルタ
１４２ 基体
１４２ａ 中央部
１４２ｂ 架橋部
１４２ｃ 外周部
１４２ｄ 中央部
ｈ１、ｈ２ 空洞溝
ａ１ 下端部
ａ２ 外周壁
ａ３ 上壁面
ａ４ 上面
ａ５ 内周壁
ａ６ 鏡面
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出が行われている。表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザ光（励起光）が金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、光源より照射したレーザ光（励起光）が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光物質を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出する方法である。
【０００３】
近年、このような表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置の開発が進められており、例えば特許文献１や特許文献２などにその技術開示がなされている。
【０００４】
このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図８に示したように基本的な構造において、誘電体部材１０６の表面に金属薄膜１０２、更にその表面に反応部１０４が設けられたチップ構造体１０８を備えている。
【０００５】
そして、チップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２で全反射した金属薄膜全反射光ｂ２を受光する受光手段１１６が備えられている。
【０００６】
一方、チップ構造体１０８の反応部１０４側には、反応部１０４に捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光ｂ３を受光する光検出手段１２０が設けられている。
【０００７】
なお、反応部１０４と光検出手段１２０との間には、蛍光ｂ３を効率よく集光するための集光部材１２２と、蛍光ｂ３以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光のみを選択するフィルタ１２４が設けられている。
【０００８】
そして、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０の使用においては、あらかじめ金属薄膜１０２の表面上には検出対象のＤＮＡ等のアナライトに含まれる抗原に特異的に結合する１次抗体があらかじめ固定されている。金属薄膜１０２に接する反応部１０４に、アナライト及び当該アナライトに特異的に結合する２次抗体を順に送液して、２次抗体を反応部１０４で捕捉させる。アナライトとともに捕捉される２次抗体は蛍光物質で標識されている。
【０００９】
反応部１０４の蛍光標識に光源１１２より誘電体部材１０６内に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が特定の角度（共鳴角）θ１で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになっている。なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜全反射光ｂ２の光量減少という現象が生ずる。
【００１０】
受光手段１１６及び光源１１２とは対となって金属薄膜１０２の照射領域を中心として回動し、金属薄膜１０２への入射角度を変更することができる。入射角度を変化させ、その際の受光手段１１６で受光される金属薄膜全反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θ１を得ることができる。
【００１１】
そして、この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜１０２上の反応部１０４の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大することとなる。
【００１２】
この増大した蛍光ｂ３を、集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出手段１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。
【００１３】
このように、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察可能とする高感度計測センサである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００８−１０２１１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、上述したような従来の表面プラズモン増強蛍光装置１０では、集光部材１２２を用いて、増強された蛍光ｂ３を光検出手段１２０で検出するようになっている。このような集光部材１２２には通常レンズが用いられているが、レンズは非常に高価であり、焦点合わせが非常に大変なものあった。
【００１６】
また、反応部１０４の蛍光物質から発せられる蛍光を効率よく集光するためには、集光部材１２２を反応部１０４に近接することが望ましいが、チップ構造体１０８と集光部材１２２とは別部品で構成されているために、自ずと限界があり、離れた位置に配置された集光部材１２２では十分な集光効率が確保できず、やはりＳ／Ｎの値が低くなってしまう問題を有するものであった。
【００１７】
本発明はこのような問題に鑑み、レンズを不要の構成とすることが可能となり、低コストにも係わらず、集光効率が落ちてＳ／Ｎの値が低下することがない、表面プラズモン増強蛍光装置に用いられるチップ構造体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
【００１９】
１．表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その周囲を囲み上方に伸びる空洞溝が設けられており、前記空洞溝と前記基体との境界面で前記蛍光を反射可能であることを特徴とするチップ構造体。
【００２０】
２．前記空洞溝に囲まれた基体の形状は円柱状又は、上方に広がる円錐台形状であることを特徴とする前記１に記載のチップ構造体。
【００２１】
３．前記空洞溝は、前記流路に貫通していないことを特徴とする、前記１又は２に記載のチップ構造体。
【００２２】
４．前記空洞溝には、前記基材よりも低屈折率の他の基材からなる部材が挿入されていることを特徴とする前記１から３のいずれか一項に記載のチップ構造体。
【００２３】
５．前記基材は、透明樹脂であり、前記基体は成形により製造されていることを特徴とする前記１から４のいずれか一項に記載のチップ構造体。
【００２４】
６．表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その上方に空洞溝が設けられており、
前記空洞溝には、円柱状又は円錐台形状の集光ロッドが挿入されており、前記集光ロッドの側壁で前記蛍光を反射可能であることを特徴とするチップ構造体。
【００２５】
７．前記集光ロッドは、光ファイバであることを特徴とする前記６に記載のチップ構造体。
【００２６】
８．表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その上方に空洞溝が設けられており、
前記基体の前記空洞溝に面する表面に鏡面加工が施されていることを特徴とするチップ構造体。
【発明の効果】
【００２７】
レンズを不要の構成とすることが可能となり、低コストにも係わらず、集光効率が落ちてＳ／Ｎの値が低下することがない、表面プラズモン増強蛍光装置に用いられるチップ構造体を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】マイクロチップ送液システムを用いた表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【図２】図２（ａ）はマイクロチップ１４周辺の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図である。
【図３】チップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図４】第２の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図５】第３の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図６】第４の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図７】第５の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。
【図８】従来の表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
【００３０】
図１、図２は、実施形態に係るマイクロチップ送液システムを用いた表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【００３１】
表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光を金属薄膜に照射して粗密波（表面プラズモン）を生じさせて励起された蛍光物質が生ずる蛍光を正確に検出し、検出感度を上げても超高精度に蛍光検出を行うことを可能とするものである。
【００３２】
［表面プラズモン増強蛍光測定装置１０、及び検体検出方法］
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図１に示したように、金属薄膜１０２と、金属薄膜１０２の表面に形成された反応部１０４と、基体１４２とを有するチップ構造体１０８を備えている。金属薄膜１０２の一方の面側には誘電体部材１０６が形成されており、反応部１０４は金属薄膜１０２の他方の面側に形成されている。
【００３３】
基体に用いる基材としては、樹脂が用いられる。その樹脂としては、成形性（転写性、離型性）が良いこと、透明性が高いこと、紫外線や可視光に対する自家蛍光性が低いことなどが条件として挙げられるが、特に限定されるものではない。例えば、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン６、ナイロン６６、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリプロピレン、ポリイソプレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン、環状ポリオレフィンなどが用いられる。
【００３４】
また、高屈折率の観点からは、更にポリカーボネートが好ましい。
【００３５】
基体１４２の一方の面には流路溝が形成されており、流路溝が形成された面を金属薄膜１０２の面に接着剤塗布あるいは加熱及び加圧を所定時間行うこと等により接合することにより反応部１０４を底面として液体を送液する流路１４３が形成される。また基体１４２には反応部１０４を中心として、その周囲を囲み上方に伸びる空洞溝ｈ１が設けられている。空洞溝ｈ１についての詳細は後述の図３の説明で行う。また、基体１４２の形成方法としては、コストの観点から金型を用いた射出成形が好ましい。
【００３６】
またチップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２に全反射した金属薄膜全反射光ｂ２を受光する受光手段１１６を備えている。
【００３７】
ここで光源１１２から照射される励起光ｂ１としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜１０００ｎｍのガスレーザまたは固体レーザ、波長３８５〜８００ｎｍの半導体レーザが好適である。
【００３８】
一方、チップ構造体１０８の反応部１０４側には、反応部１０４で生じた蛍光ｂ３を受光する光検出手段１２０が設けられている。
【００３９】
光検出手段１２０としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
【００４０】
そしてチップ構造体１０８の反応部１０４と光検出手段１２０との間には、光を効率よく集光するための集光部材１２２と、光の内で蛍光ｂ３とは異なる波長の光の透過を低減して蛍光ｂ３を選択的に透過するように形成されたフィルタ１２４が設けられている。
【００４１】
なお、集光部材１２２は、本実施形態においては空洞溝ｈ１を設けた基体１４２にその機能の一部を担わせることで省略することが可能である。そのことにより表面プラズモン増強蛍光測定装置全体としてコストダウンが図れる。また集光部材１２２が設けた構成においても、集光効率が良くなりＳ／Ｎの値が低下することがない、
集光部材１２２としては、光検出手段１２０に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００４２】
一方、フィルタ１２４としては、光学フィルタ、カットフィルタなどを用いることができる。光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【００４３】
そして、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０を用いたアナライト検出方法では、反応部１０４に接する側の金属薄膜１０２表面上には１次抗体を結合させたＳＡＭ膜（Self-Assembled Monolayer：「自己組織化単分子膜」ともいう）あるいは高分子材料膜が設けられている。１次抗体はＳＡＭ膜あるいは高分子材料膜の一方の面に結合されており、ＳＡＭ膜あるいは高分子材料膜の他方の面は、直接若しくは間接に金属薄膜１０２表面に固定されている。ＳＡＭ膜としては例えばＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜、高分子材料としては例えばポリエチレングリコール（polyethylene glycol、以下「ＰＥＧ」と記す。）やＭＰＣポリマー等が挙げられる。これは使用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。また、１次抗体に対する反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を備えたポリマーを直接基板上に固定化し、その上に１次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。
【００４４】
このようにして構成した反応部１０４に標的物質としてのアナライトの抗原を含む溶液（以下、検体液ともいう）と、二次抗体を含む試薬液の送液を行う。固定化した一次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対しさらに蛍光物質で標識した二次抗体を含む試薬液を作用させることで捕捉された抗原を標識している。なお予め抗原と二次抗体とを反応させておいてから一次抗体を作用させてもよい。
【００４５】
蛍光物質で標識されたアナライトの検出を行うには、アナライトが捕捉された反応部１０４に光源１１２より誘電体部材１０６に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が金属薄膜１０２に対して特定の入射角度（共鳴角θ１）で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになる。
【００４６】
なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜全反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段１１６で受光される金属薄膜全反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ良い。
【００４７】
そして、この粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１０２上の反応部１０４で生じた蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大し、この蛍光ｂ３を集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出手段１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。
【００４８】
なお、金属薄膜１０２の材質としては、好ましくは金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。
【００４９】
このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１０２に好適である。
【００５０】
また、金属薄膜１０２の形成方法としては、例えばスパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法、蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
【００５１】
さらに金属薄膜１０２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００５２】
電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
【００５３】
金属薄膜１０２の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１０２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。
【００５４】
また、誘電体部材１０６としては、例えば高屈折率の６０度プリズムを用いることができる。材料としては光学的に透明な各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）または二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことが好ましい。
【００５５】
さらに、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、光源１１２から金属薄膜１０２に照射される励起光ｂ１による表面プラズモン共鳴の最適角（共鳴角θ１）を調整するため、角度可変部（図示せず）を有している。
【００５６】
ここで、角度可変部（図示せず）は制御部１３により制御され、「共鳴角スキャン工程」においては角度可変部のサーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段１１６と光源１１２とを同期して、照射領域を中心として回動し、４５〜８５°の範囲で角度変更を可能としている。また分解能は０．０１°以上であることが好ましい。
【００５７】
図２（ａ）は、マイクロチップ１４周辺の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図である。流路１４３の経路中には、反応部１０４が設けられている。流路１４３の一方の端部には開口１４４ａが、他方の端部には開口１４４ｂがそれぞれ設けられている。また開口１４４ａ側には接続部１４５が設けられている。
【００５８】
接続部１４５へは、ピペット１５０が接続可能である。接続部１４５は弾性体材料で構成されており、ピペット１５０を装填する際にはシール部材として機能する。他方の端部側の開口１４４ｂの先には、液溜部１５１が設けられている。なお液溜部１５１の上部には不図示の微細な空気孔が設けられている。
【００５９】
基体１４２の空洞溝ｈ１が設けられている付近の厚み（Ｚ方向長さ）は好ましくは２〜５ｍｍであるがこれよりも厚くてもよい。流路１４３の幅（Ｙ方向長さ）は１ｍｍ〜３ｍｍ、高さ（Ｚ方向）は５０μｍ〜５００μｍ、反応部１０４の幅は流路１４３の幅と同等であり、長さ（Ｘ方向）は１ｍｍ〜３ｍｍであるが、必ずしも限定されるものではなくそれよりも長く流路１４３の全域に渡っていても良い。また流路１４３の両端の開口１４４ａ、１４４ｂの大きさは流路１４３の幅と同等のφ１ｍｍ〜φ３ｍｍである。ピペット１５０の先端は開口１４４ａとほぼ同等の形状であり、根元部分はこれよりも太い軸径の円柱形状である。液溜部１５１は流路方向で開口１４４ｂよりも大きな断面形状であり、例えば断面が２〜４ｍｍ角の角柱形状としている。
【００６０】
図２（ａ）においては、ピペット１５０を装填した状態を示している。なお、液溜部１５１はマイクロチップ１４に固定した例を示しているが、ピペット１５０と同様に取り外し可能な構成としてもよい。なおピペット１５０はポンプ１３０の駆動による内圧の変化に対して変形せずに容積の変化がほとんど生じない程度の剛性を備えていればよい。本実施形態では、材料としてはポリプロピレンを用いている。また接続部１４５を介して容易に脱着が可能であり、供給した検体液とともにピペット１５０の廃棄を容易に行うことができる。
【００６１】
ポンプ１３０は例えばシリンジポンプであり、所定量の液体を吐出あるいは吸引することが可能である。ポンプ１３０により、ピペット１５０の内部に貯留した検体液等の液体をマイクロチップ１４の内部に送液する。このようにして流路１４３には蛍光物質が標識された二次抗体等が含まれる試薬液や、アナライトが含まれる検体液がポンプ１３０により送液される。
【００６２】
検体としては、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００６３】
さらに蛍光物質としては、所定の励起光ｂ１を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光ｂ３を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光ｂ３とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
【００６４】
図３は、チップ構造体１０８の構成を示す模式図であり、図２を一部拡大したものである。図３（ａ）は上面図、図３（ｂ）はＡ−Ａ断面図である。これらの図に示すように空洞溝ｈ１は反応部１０４を中心としてその周囲を囲むように設けられおり、上方に伸びている。より詳しくは、空洞溝ｈ１は反応部１０４の蛍光物質からの蛍光ｂ３が発光する領域の周囲を囲むように設けられている。蛍光ｂ３が発光する領域とは、蛍光物質が標識された二次抗体が捕捉されている反応部１０４であって、かつ、励起光ｂ１の照射により電場が増強されている領域である。図３（図４〜図７でも同様）に示す例では、反応部１０４の領域は、電場が増強される領域よりも狭いので、反応部１０４の領域と蛍光ｂ３が発光する領域とは一致している。
【００６５】
基体１４２は、中央部１４２ａと外周部１４２ｃ、及びこれらを接続する架橋部１４２ｂからなる。中央部１４２ａの外周壁ａ２（空洞溝と基体との境界面）はほぼ垂直になっており、空洞溝ｈ１に囲まれた中央部１４２ａの形状は円柱状である。
【００６６】
中央部１４２ａを含む基体１４２の基材は、高屈折率の材料を用いている。空洞溝ｈ１は空間（空気）なのでその屈折率の低い（ほぼ１．０）。反応部１０４から発光して上方の中央部１４２ａの内部に入射した蛍光ｂ３は、外周壁ａ２に対して臨界角以上の角度で入射した場合には、全反射することになる。蛍光ｂ３は全反射を繰り返して上面ａ４から抜けてゆく。このように、基体１４２の中央部１４２ａは集光部材として機能することが可能であり、これにより反応部１０４から発光した蛍光ｂ３を効率よく集光することが可能となる。
【００６７】
また、空洞溝ｈ１の下端部ａ１は流路１４３へは貫通しておらず、流路１４３を構成する上壁面ａ３はフラットである。このことにより流路１４３を流れる液体の送液にスムーズに行え、悪影響を及ぼさない。また基体１４２の外周部１４２ｃと中央部１４２ａとは、空洞溝ｈ１に下方にある架橋部１４２ｂにより接続されているが、架橋部１４２ｂの厚み（Ｚ方向）は強度を許す限り、なるべく薄くして空洞溝ｈ１の下端部ａ１が反応部１０４に近い方が効率良く蛍光ｂ３を集光できるので好ましい。また図３に示す構成では空洞溝ｈ１は環状で架橋部１４２ｂは下端にのみ設けられていたが、これに限られず空洞溝ｈ１の中に架橋部１４２ｂを設け、環状の一部が寸断された構成であってもよい。更に中央部１４２ａは断面が真円の円柱形状であったが、断面が楕円の円柱形状であってもよい。
【００６８】
更に、励起光ｂ１や可視光による誘電体部材１０６からの自家蛍光ｂ３０１がノイズとなりＳ／Ｎ値に影響するが、本実施形態においては、このような自家蛍光ｂ３０１は外周部１４２ｃの内周壁ａ５（空洞溝外側と基体との境界面）で全反射できるので、その影響を少なくすることができる。また空洞溝ｈ１の外側と内側の壁面（内周壁ａ５及び外周壁ａ２）は平行にする必要はなく、外側の内周壁ａ５で自家蛍光ｂ３０１をより効率よく全反射するためには、自家蛍光ｂ３０１の内周壁ａ５への入射角が臨界角以上となりやすいように角度を決定してもよい。さらに、射出成形により基体１４２する場合に転写性を高めるために空洞溝ｈ１の外側と内側の壁面に２〜５°の抜きテーパを形成してもよい。
【００６９】
［他の実施形態］
図４〜図７は、それぞれ第２〜第５の実施形態におけるチップ構造体１０８の構成を示す模式図である。図３に対応するものであり、図３と共通する構成に関しては同符号を付すことにより説明に換える。また図４に示す構成以外は図１〜図２と共通であり説明は省略する。
【００７０】
図４に示す第２の実施形態に係るチップ構造体１０８では、空洞溝ｈ１に囲まれた中央部１４２ａの形状は、上方に広がる円錐台形状である。このような構成とすることにより中央部１４２ａの外周壁ａ２は反応部１０４が形成されている面に対してラッパ状に広がった傾斜を持つので、外周壁ａ２により蛍光ｂ３は、より平行光（反応部１０４の面に対する法線方向）に近い角度で全反射されるので集光効率が向上する。
【００７１】
図５に示す第３の実施形態におけるチップ構造体１０８では、図３に示した基体１４２に対して空洞溝ｈ１の部分に部材１４７を挿入している。部材１４７は、基体１４２の基材よりも低屈折率の基材から構成されているので、図３に示した構成と同様に、基体１４２の中央部１４２ａ内部へ照射された蛍光ｂ３は、部材１４７と中央部１４２ａとの境界で全反射させることができる。そして、部材１４７を挿入することにより、基体１４２全体の剛性強度を増すことが可能となる。低屈折率な基材としてはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）が好ましい。
【００７２】
図６に示す第４の実施形態に係るチップ構造体１０８では、空洞溝ｈ２に集光ロッド１４８を挿入し、集光ロッド１４８を集光部材として用いるものである。集光ロッド１４８とはガラスあるいは樹脂でできた一体構造物であって、その一方の片面から光を取り込み内部で導光し、他の片面から光を放出する構造物のことである。
【００７３】
図６（ａ）は基体１４２を示す図であり円柱状の空洞溝ｈ２は、反応部１０４を覆うように上方に設けられている。図６（ｂ）は、図６（ａ）に示す基体１４２を用いて構成されたチップ構造体１０８を示す図であり、同図においては集光ロッド１４８を挿入している。同図に示す集光ロッドは円柱状であり高屈折率の基材から構成されているので、図３に示した構成と同様に、反応部１０４から基体１４２の中央部１４２ｄを透過して集光ロッド１４８の内部へ照射された蛍光ｂ３は、集光ロッド１４８とその外側の空間（空洞溝ｈ２）との境界で全反射させることができる。蛍光ｂ３は全反射を繰り返して上面ａ４から抜けてゆく。このように、集光ロッド１４８は集光部材として機能することが可能であり、これにより反応部１０４から発光した蛍光ｂ３を効率よく集光することが可能となる。
【００７４】
なお集光ロッド１４８は、円柱状のみならず上方に広がる円錐台形状としてもよい。また集光ロッド１４８の代わりに、光ファイバを空洞溝ｈ２に挿入してもよい。光ファイバは、ガラスファイバ、若しくは中空光ファイバであり集光ロッドにくらべてフレキシブルに屈曲できる点で好ましい。例えば複雑に込み入った所に配置されたセンサ面まで光ファイバにより検出光を導光することができるので、設計の自由度が向上する。
【００７５】
図７に示す第５の実施形態に係るチップ構造体１０８では、空洞溝ｈ２に面する基体１４２の表面は鏡面加工が施されている鏡面ａ６である。鏡面加工とは光が反射するように、表面に対して研磨処理あるいはスパッタリング法や蒸着法により金属薄膜の形成処理をしてその表面を平滑にすることである。
【００７６】
図３に示した構成と同様に、反応部１０４から基体１４２の中央部１４２ｄを透過して上方の空洞溝ｈ２に抜けた蛍光ｂ３は鏡面ａ６で全反射させることができる。蛍光ｂ３は全反射を繰り返して上方に抜けてゆく。このように、鏡面ａ６を備えた基体１４２を集光部材として機能することが可能であり、これにより反応部１０４から発光した蛍光ｂ３を効率よく集光することが可能となる。
【符号の説明】
【００７７】
１０ 表面プラズモン増強蛍光測定装置
１０２ 金属薄膜
１０４ 反応部
１０６ 誘電体部材
１０８ チップ構造体
１１２ 光源
１１６ 受光手段
１２０ 光検出手段
１２２ 集光部材
１２４ フィルタ
１４２ 基体
１４２ａ 中央部
１４２ｂ 架橋部
１４２ｃ 外周部
１４２ｄ 中央部
ｈ１、ｈ２ 空洞溝
ａ１ 下端部
ａ２ 外周壁
ａ３ 上壁面
ａ４ 上面
ａ５ 内周壁
ａ６ 鏡面
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その周囲を囲み上方に伸びる空洞溝が設けられており、前記空洞溝と前記基体との境界面で前記蛍光を反射可能であることを特徴とするチップ構造体。
【請求項２】
前記空洞溝に囲まれた基体の形状は円柱状又は、上方に広がる円錐台形状であることを特徴とする請求項１に記載のチップ構造体。
【請求項３】
前記空洞溝は、前記流路に貫通していないことを特徴とする、請求項１又は２に記載のチップ構造体。
【請求項４】
前記空洞溝には、前記基材よりも低屈折率の他の基材からなる部材が挿入されていることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のチップ構造体。
【請求項５】
前記基材は、透明樹脂であり、前記基体は成形により製造されていることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のチップ構造体。
【請求項６】
表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その上方に空洞溝が設けられており、
前記空洞溝には、円柱状又は円錐台形状の集光ロッドが挿入されており、前記集光ロッドの側壁で前記蛍光を反射可能であることを特徴とするチップ構造体。
【請求項７】
前記集光ロッドは、光ファイバであることを特徴とする請求項６に記載のチップ構造体。
【請求項８】
表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その上方に空洞溝が設けられており、
前記基体の前記空洞溝に面する表面に鏡面加工が施されていることを特徴とするチップ構造体。
【請求項１】
表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その周囲を囲み上方に伸びる空洞溝が設けられており、前記空洞溝と前記基体との境界面で前記蛍光を反射可能であることを特徴とするチップ構造体。
【請求項２】
前記空洞溝に囲まれた基体の形状は円柱状又は、上方に広がる円錐台形状であることを特徴とする請求項１に記載のチップ構造体。
【請求項３】
前記空洞溝は、前記流路に貫通していないことを特徴とする、請求項１又は２に記載のチップ構造体。
【請求項４】
前記空洞溝には、前記基材よりも低屈折率の他の基材からなる部材が挿入されていることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のチップ構造体。
【請求項５】
前記基材は、透明樹脂であり、前記基体は成形により製造されていることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のチップ構造体。
【請求項６】
表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その上方に空洞溝が設けられており、
前記空洞溝には、円柱状又は円錐台形状の集光ロッドが挿入されており、前記集光ロッドの側壁で前記蛍光を反射可能であることを特徴とするチップ構造体。
【請求項７】
前記集光ロッドは、光ファイバであることを特徴とする請求項６に記載のチップ構造体。
【請求項８】
表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
一方の面に励起光が照射されることにより電場が増強される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方の面側に形成された反応部であって、増強された前記電場により蛍光物質を励起させる反応部と、
蛍光を透過する基材からなり、流路溝が形成された面を前記金属薄膜の面に接合することにより前記反応部を底面として液体を送液する流路を形成した基体と、を有し、
前記基体には、前記反応部を中心として、その上方に空洞溝が設けられており、
前記基体の前記空洞溝に面する表面に鏡面加工が施されていることを特徴とするチップ構造体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１８５６９８（Ｐ２０１１−１８５６９８Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０３３０（Ｐ２０１０−５０３３０）
【出願日】平成２２年３月８日（２０１０．３．８）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月８日（２０１０．３．８）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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