チモシーの品種識別用のＳＳＲマーカープライマー対及び当該プライマーセットを用いたチモシー品種の識別方法
【課題】簡便、迅速かつ正確にチモシーの品種識別を行うためのプライマー対、特定マーカー遺伝子及びその品種識別方法を提供する。
【解決手段】チモシーのゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対、該プライマー対を利用して対象となるチモシーをバルクすることで、個体間の遺伝子のばらつきを無くし、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させた特定マーカー遺伝子、及び増幅されたマーカー遺伝子断片の長さの違いを検出することで品種の識別を行う品種識別方法。
【効果】従来の形態形質及び出穂期などの品種区別法と比べて、必要とする工程数が少なく、複数個体のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用するチモシーの品種識別方法を提供することができる。
【解決手段】チモシーのゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対、該プライマー対を利用して対象となるチモシーをバルクすることで、個体間の遺伝子のばらつきを無くし、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させた特定マーカー遺伝子、及び増幅されたマーカー遺伝子断片の長さの違いを検出することで品種の識別を行う品種識別方法。
【効果】従来の形態形質及び出穂期などの品種区別法と比べて、必要とする工程数が少なく、複数個体のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用するチモシーの品種識別方法を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チモシー１１品種を識別するため、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対及びその利用に関するものであり、更に詳しくは、チモシー１１品種を識別することを可能とする、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用のＦプライマー及びＲプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカーの塩基配列、該マーカーを利用してチモシーの品種を識別する方法に関するものである。本発明は、チモシーの品種識別用のＳＳＲプライマー、該プライマーを利用してチモシーのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させ、その増幅断片のマーカーを比較することで品種を識別することを可能とするチモシー品種の識別方法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
チモシー（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ Ｌ．）は、主に飼料作物として利用される多年生の他殖性のイネ科植物である。先行技術として、主に飼料作物として利用される他殖性のイネ科牧草の品種識別法としては、イタリアンライグラスにおいて、１２品種を識別する方法が開発されている（特許文献１参照）。
【０００３】
この方法は、イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域をＰＣＲで増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出することで品種を識別するものである。しかし、チモシーにおいては、このような品種識別法が開発されていない。
【０００４】
このため、チモシーの品種識別は、これまで、圃場での特性調査により行われてきた。圃場での特性調査とは、例えば、一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日、草型、葉身長等の形質を調査し、共に栽培した６０個体の標準個体と比較して同品種かどうか判定を行う方法である。しかしながら、このような圃場での特性調査は、１）調査のための圃場が必要である、２）調査に多くの労力が必要である、３）調査結果が判明するまでに多くの時間が必要である、等の問題点がある。
【０００５】
チモシーにおいて、本発明者らは、ＳＳＲマーカーを、ゲノムのＳＳＲ濃縮ライブラリーから開発した（非特許文献１）。また、チモシー品種の遺伝的変異について、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ）及びＵＰ−ＰＣＲ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ ）マーカーによって解析した報告がある（非特許文献２）。ただし、この文献では、品種の識別法としては、説明がなされていない。
【０００６】
チモシーは、日本で、一番栽培面積の大きい寒地型牧草で、現在、日本国内で、１０数種類の品種が流通している。その中のほとんどは、国内育成品種である。これらの品種は、早晩生及びその他の農業形質をもって区別できるが、ＤＮＡレベルの識別では、いまだ報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２３７１８０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃａｉ ＨＷ， Ｙｕｙａｍａ Ｎ， Ｔａｍａｋｉ Ｈ， ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ａ （２００３） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｘａｐｌｏｉｄ ｆｏｒａｇｅ ｇｒａｓｓ ｔｉｍｏｔｈｙ （Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ Ｌ．）． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ １０７： １３３７−１３４９
【非特許文献２】Ｇｕｏ ＹＤ， Ｙｌｉ−ｍａｔｔｉｌａ Ｔ ａｎｄ Ｐｕｌｌｉ Ｓ． （２００３） Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｉｍｏｔｈｙ （Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ Ｌ．） ｕｓｉｎｇ ＲＡＰＤ ａｎｄ ＵＰ−ＰＣＲ． Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ １３８： １０１−１１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、短期間で、簡便且つ正確にチモシー１１品種を識別できる新しい手法を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅される特定マーカーを用いることにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、労力及び時間が必要な従来の圃場での特性調査に代わり、短期間で、簡便且つ正確にチモシーの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカー塩基配列、該マーカーを利用したチモシーの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
本発明は、従来の形質調査の方法より、栽培を要する時間及び季節を制限することなく、幼苗より抽出した複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、時間の短縮を行い、且つ正確なチモシーの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）チモシーの品種識別用のプライマーであって、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
（２）チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１３のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１４〜２６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）又は（２）に記載のプライマー対。
（４）前記（２）又は（３）に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするチモシーの品種識別用プライマーセット。
（５）チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する前記（１）、（２）又は（３）に記載のプライマー対から増幅されるＰＣＲ増幅産物からなることを特徴とする特定マーカー遺伝子。
（６）配列表の配列番号２７〜３９のいずれかの塩基配列を有する、前記（５）に記載の特定マーカー遺伝子。
（７）前記（５）又は（６）に記載の特定マーカー遺伝子を使用し、識別対象のチモシーＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするチモシーの品種識別方法。
（８）前記（５）又は（６）に記載の特定マーカー遺伝子を使用し、識別対象の遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするチモシーの品種識別方法。
（９）対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したチモシー遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、前記（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）アッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラの１１品種からなるチモシー品種を識別する、前記（７）から（９）のいずれかに記載の品種識別方法。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、チモシーの品種識別用のプライマーであって、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対の点に特徴を有するものである。また、本発明は、チモシーの品種識別方法であって、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する上記のプライマーから増幅される特定マーカーを使用し、識別対象のチモシーＤＮＡのＰＣＲによる増幅産物の多型を確認することで、品種の識別を行うことを特徴とするものである。
【００１４】
本発明では、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマー対から、識別対象のチモシー遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーのサイズ、及びバンドパターン（複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせ）を確認することで、品種の識別を行う。
【００１５】
本発明では、個体単位での解析が不要となるため、対象品種のバルクＤＮＡを使用したチモシー遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に数品種の識別を行う。他殖性であるチモシーは、個体間で遺伝的に異なるが、バルクＤＮＡをテンプレートとして用いることによって、この品種の非特異的な個体間の差異を無くし、且つ効率よく品種の識別が可能となる。
【００１６】
本発明により、チモシーの品種を識別するチモシーのＳＳＲマーカーが提供され、単数又は複数のプライマー対を使用した、ＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、チモシーのアッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラからなる１１品種での品種識別を行うことができる。
【００１７】
本発明では、２〜３塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計した遺伝子増幅用プライマーの１３対のプライマー（表１参照）で、単数又は複数のプライマー対を使用し、対象となるチモシー１１品種について、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで、品種を識別する。
【００１８】
本発明では、実際の使用時に、バルクＤＮＡをテンプレートとすることを想定し、品種特異的なＳＳＲマーカーを選抜するため対象品種のゲノムＤＮＡを複数個体混合するバルクしたＤＮＡをテンプレートとすることにより、識別を行う。そのため、本発明では、例えば、濃度を一定にしたチモシーのＤＮＡを１０個体合わせて、バルクＤＮＡテンプレートとして使用する。
【００１９】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、プライマー設計ソフトウエア「Ｐｒｉｍｅｒ０．５， ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用して作成した。本発明で、チモシーの品種識別に有用なプライマー対の配列を、次の表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
上記表１の配列のプライマー対の１１品種内での増幅型の詳細について説明する。
【００２２】
プライマー「ｂ１６８」は、アッケシ、シリウス及びホクセイを識別するプライマー対で、１０５ｂｐ付近〜１７５ｂｐの間で、他品種とは異なる増幅パターンを示す（図１参照）。
【００２３】
プライマー「ｂ６７」は、シリウスを識別するプライマー対で、２０４ｂｐ〜２３０ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅パターンを示す（図２）。
【００２４】
プライマー「ｄ５６」は、シリウス及びホクシュウを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ〜２００ｂｐの間で、他品種とは異なる増幅パターンを示す（図３）。
【００２５】
プライマー「ｂ２２７」は、ホクシュウを識別するプライマー対で、１７５ｂｐの付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図４）。
【００２６】
プライマー「ｂ１９５」は、クンプウを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ〜２００ｂｐの間に、他品種とは異なる増幅を示す（図５）。
【００２７】
プライマー「ｂ１３１」は、ホライズンを識別するプライマー対で、２０４ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図６）。
【００２８】
プライマー「ｄ６」は、キリタップを識別するプライマー対で、１４５〜１７５ｂｐの間で、他品種とは異なる増幅を示す（図７）。
【００２９】
プライマー「ｂ１８９」は、ホクエイを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図８）。
【００３０】
プライマー「ｂ１８１」は、ホクエイ及びなつさかりを識別するプライマー対で、ホクエイは、１４５ｂｐ付近で、なつさかりは２０４ｂｐ〜２３０ｂｐの間で、他品種とは異なる増幅を示す（図９）。
【００３１】
プライマー「ｄ５９」は、ノッサプを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す、なお、ホクエイ及びなつさかり両品種では、やや下のところに増幅がある（図１０）。
【００３２】
プライマー「ｂ３１７」は、オーロラを識別するプライマー対で、１２０ｂｐ〜１４５ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図１１）。
【００３３】
プライマー「ｄ１２０」は、ホクセイを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図１２）。
【００３４】
プライマー「ｂ１９７」は、なつさかりを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図１３）。
【００３５】
表２にＳＳＲマーカーバルク法によるチモシー品種識別早見表（１００個体中に品種特異的なマーカーアレルの個体数）を示す。表中、＋は、品種特異的な増幅があることを示し、−は、品種に特定領域に特異的な増幅が見られないことを示す。
【００３６】
【表２】
【発明の効果】
【００３７】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、チモシーの品種を識別するチモシーのＳＳＲマーカーが提供される。
（２）単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、チモシーの品種識別を行うことができる。
（３）本発明により、アッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラからなる１１品種相互での品種識別を行うことができる。
（４）個体単位の解析ではなく、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、解析時間の短縮及び正確な品種識別が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例におけるｂ１６８を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。Ｍは、サイズマーカー（単位はｂｐ）を示し、左から各４レーンは、一組１品種で、それぞれ「アッケシ」「シリウス」「ホクシュウ」「クンプウ」「ホライズン」「キリタップ」「ホクエイ」「ノサップ」「オーロラ」「ホクセイ」「クライマックス」（本発明の識別品種に含まれていない）及び「なつさかり」を、それぞれ電気泳動した結果を示す。図２−１３も同様である。
【図２】実施例におけるｂ６７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例におけるｄ５６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例におけるｂ２２７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例におけるｂ１９５を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例におけるｂ１３１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例におけるｄ６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例におけるｂ１８９を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図９】実施例におけるｄ１８１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１０】実施例におけるｄ５９を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１１】実施例におけるｂ３１７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１２】実施例におけるｂ１２０を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１３】実施例におけるｂ１９７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１４】本発明の特定のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１５】本発明の特定のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１６】本発明の特定のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１７】本発明の特定のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４０】
本発明で使用した機器は、以下の通りである。
すなわち、本実施例では、Ｔ ＧＲＡＤＩＥＮＴ Ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、及び、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＡＢＩ）、ＤＮＡシーケンシングシステムＬＩＣ−４２００Ｌ（ｓ）（ＬＩＣＯＲ社）、を用いた。
【００４１】
本発明で使用した試薬は、以下の通りである。
〈５０％アクリルアミドゲル〉
アクリルナニドゲルとして、尿素（和光純薬工業株式会社）、Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ Ｇｅｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用（タカラバイオ株式会社）、１０ｘＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光純薬工業株式会社）を用いた。
【００４２】
〈ＰＣＲ反応液〉
ＰＣＲ反応液として、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ（和光純薬工業株式会社）、１ｐｍｏｌ／μｌ Ｍ１３ Ｆｏｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（ＬＩＣＯＲ社）、色素マーカーとして、５０−３５０ｂｐ ＳＩＺＩＮＧ ＳＴＡＮＤＡＲＤ−ＢＵＬＫ（ＬＩＣＯＲ社）を用いた。本発明では、ＬＩＣＯＲ社のプロトコールに基づいて、ゲルの作製を行った。
【００４３】
国内で育成されたチモシーのアッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラの１１品種から、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４４】
抽出したＤＮＡ溶液は、滅菌水でＤＮＡ濃度を５０ｎｇ／μｌに調整し、１０個体を混合し、バルクにしたものを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。
【００４５】
〈ＰＣＲ反応液：計１０μｌ〉
ＰＣＲ反応液の調製は、以下の通りとした。
チモシー対象品種から抽出したバルクＤＮＡ：１μｌ
１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．８μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：６．５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｒｄ（２０ｐｍｏｌ／ｕｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ（５ ｕｎｉｔ／μｌ）：０．１μｌ
【００４６】
〈ＰＣＲ条件〉
ＰＣＲ条件は、以下の通りとした。
９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）９５℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）で反応させた。ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー５μｌを加え、９０℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で１時間以上静置させることで、安定させた後、アクリルアミドゲルを使用して、電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認した。
【００４７】
チモシーのアッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラの１１品種を使用し、「ｂ１６８」プライマー対を使用し、ＰＣＲを行った。
【００４８】
アッケシ及びシリウスを増幅パターンで、ある位置では、ほかの品種がそれぞれすべてバンドのでる部分に、バンドの欠如が見られた。それに対して、ホクセイは、ほかの品種と異なる増幅を示した。「ｂ１６８」プライマー対を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を、図１に示す。プライマーである、「ｂ６７」、「ｄ５６」、「ｂ２２７」、「ｂ１９５」、「ｂ１３１」、「ｄ６」、「ｂ１８９」、「ｄ１８１」、「ｄ５９」、「ｂ３１７」、「ｂ１２０」、「ｂ１９７」を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を、それぞれ図２〜１３に示す。
【００４９】
本発明の特定のプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子を、図１４〜１７に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上詳述したように、本発明は、チモシーの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用に係るものであり、本発明により、チモシー１１品種を特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対を提供することができる。また、本発明により、単数又は複数のプライマー対を使用した、ＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させた特定マーカー遺伝子を提供することができる。本発明は、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、チモシーの品種識別を行うことを可能とするものである。本発明により、アッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラからなる１１品種相互での品種識別を行うことができる。本発明は、短い時間で、正確なチモシーの品種識別を可能にする、新しい品種識別方法を提供するものとして有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チモシー１１品種を識別するため、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対及びその利用に関するものであり、更に詳しくは、チモシー１１品種を識別することを可能とする、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用のＦプライマー及びＲプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカーの塩基配列、該マーカーを利用してチモシーの品種を識別する方法に関するものである。本発明は、チモシーの品種識別用のＳＳＲプライマー、該プライマーを利用してチモシーのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させ、その増幅断片のマーカーを比較することで品種を識別することを可能とするチモシー品種の識別方法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
チモシー（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ Ｌ．）は、主に飼料作物として利用される多年生の他殖性のイネ科植物である。先行技術として、主に飼料作物として利用される他殖性のイネ科牧草の品種識別法としては、イタリアンライグラスにおいて、１２品種を識別する方法が開発されている（特許文献１参照）。
【０００３】
この方法は、イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域をＰＣＲで増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出することで品種を識別するものである。しかし、チモシーにおいては、このような品種識別法が開発されていない。
【０００４】
このため、チモシーの品種識別は、これまで、圃場での特性調査により行われてきた。圃場での特性調査とは、例えば、一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日、草型、葉身長等の形質を調査し、共に栽培した６０個体の標準個体と比較して同品種かどうか判定を行う方法である。しかしながら、このような圃場での特性調査は、１）調査のための圃場が必要である、２）調査に多くの労力が必要である、３）調査結果が判明するまでに多くの時間が必要である、等の問題点がある。
【０００５】
チモシーにおいて、本発明者らは、ＳＳＲマーカーを、ゲノムのＳＳＲ濃縮ライブラリーから開発した（非特許文献１）。また、チモシー品種の遺伝的変異について、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ）及びＵＰ−ＰＣＲ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ ）マーカーによって解析した報告がある（非特許文献２）。ただし、この文献では、品種の識別法としては、説明がなされていない。
【０００６】
チモシーは、日本で、一番栽培面積の大きい寒地型牧草で、現在、日本国内で、１０数種類の品種が流通している。その中のほとんどは、国内育成品種である。これらの品種は、早晩生及びその他の農業形質をもって区別できるが、ＤＮＡレベルの識別では、いまだ報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２３７１８０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃａｉ ＨＷ， Ｙｕｙａｍａ Ｎ， Ｔａｍａｋｉ Ｈ， ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ａ （２００３） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｘａｐｌｏｉｄ ｆｏｒａｇｅ ｇｒａｓｓ ｔｉｍｏｔｈｙ （Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ Ｌ．）． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ １０７： １３３７−１３４９
【非特許文献２】Ｇｕｏ ＹＤ， Ｙｌｉ−ｍａｔｔｉｌａ Ｔ ａｎｄ Ｐｕｌｌｉ Ｓ． （２００３） Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｉｍｏｔｈｙ （Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ Ｌ．） ｕｓｉｎｇ ＲＡＰＤ ａｎｄ ＵＰ−ＰＣＲ． Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ １３８： １０１−１１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、短期間で、簡便且つ正確にチモシー１１品種を識別できる新しい手法を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅される特定マーカーを用いることにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、労力及び時間が必要な従来の圃場での特性調査に代わり、短期間で、簡便且つ正確にチモシーの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカー塩基配列、該マーカーを利用したチモシーの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
本発明は、従来の形質調査の方法より、栽培を要する時間及び季節を制限することなく、幼苗より抽出した複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、時間の短縮を行い、且つ正確なチモシーの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）チモシーの品種識別用のプライマーであって、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
（２）チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１３のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１４〜２６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）又は（２）に記載のプライマー対。
（４）前記（２）又は（３）に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするチモシーの品種識別用プライマーセット。
（５）チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する前記（１）、（２）又は（３）に記載のプライマー対から増幅されるＰＣＲ増幅産物からなることを特徴とする特定マーカー遺伝子。
（６）配列表の配列番号２７〜３９のいずれかの塩基配列を有する、前記（５）に記載の特定マーカー遺伝子。
（７）前記（５）又は（６）に記載の特定マーカー遺伝子を使用し、識別対象のチモシーＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするチモシーの品種識別方法。
（８）前記（５）又は（６）に記載の特定マーカー遺伝子を使用し、識別対象の遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするチモシーの品種識別方法。
（９）対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したチモシー遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、前記（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）アッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラの１１品種からなるチモシー品種を識別する、前記（７）から（９）のいずれかに記載の品種識別方法。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、チモシーの品種識別用のプライマーであって、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対の点に特徴を有するものである。また、本発明は、チモシーの品種識別方法であって、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する上記のプライマーから増幅される特定マーカーを使用し、識別対象のチモシーＤＮＡのＰＣＲによる増幅産物の多型を確認することで、品種の識別を行うことを特徴とするものである。
【００１４】
本発明では、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマー対から、識別対象のチモシー遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーのサイズ、及びバンドパターン（複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせ）を確認することで、品種の識別を行う。
【００１５】
本発明では、個体単位での解析が不要となるため、対象品種のバルクＤＮＡを使用したチモシー遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に数品種の識別を行う。他殖性であるチモシーは、個体間で遺伝的に異なるが、バルクＤＮＡをテンプレートとして用いることによって、この品種の非特異的な個体間の差異を無くし、且つ効率よく品種の識別が可能となる。
【００１６】
本発明により、チモシーの品種を識別するチモシーのＳＳＲマーカーが提供され、単数又は複数のプライマー対を使用した、ＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、チモシーのアッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラからなる１１品種での品種識別を行うことができる。
【００１７】
本発明では、２〜３塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計した遺伝子増幅用プライマーの１３対のプライマー（表１参照）で、単数又は複数のプライマー対を使用し、対象となるチモシー１１品種について、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで、品種を識別する。
【００１８】
本発明では、実際の使用時に、バルクＤＮＡをテンプレートとすることを想定し、品種特異的なＳＳＲマーカーを選抜するため対象品種のゲノムＤＮＡを複数個体混合するバルクしたＤＮＡをテンプレートとすることにより、識別を行う。そのため、本発明では、例えば、濃度を一定にしたチモシーのＤＮＡを１０個体合わせて、バルクＤＮＡテンプレートとして使用する。
【００１９】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、プライマー設計ソフトウエア「Ｐｒｉｍｅｒ０．５， ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用して作成した。本発明で、チモシーの品種識別に有用なプライマー対の配列を、次の表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
上記表１の配列のプライマー対の１１品種内での増幅型の詳細について説明する。
【００２２】
プライマー「ｂ１６８」は、アッケシ、シリウス及びホクセイを識別するプライマー対で、１０５ｂｐ付近〜１７５ｂｐの間で、他品種とは異なる増幅パターンを示す（図１参照）。
【００２３】
プライマー「ｂ６７」は、シリウスを識別するプライマー対で、２０４ｂｐ〜２３０ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅パターンを示す（図２）。
【００２４】
プライマー「ｄ５６」は、シリウス及びホクシュウを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ〜２００ｂｐの間で、他品種とは異なる増幅パターンを示す（図３）。
【００２５】
プライマー「ｂ２２７」は、ホクシュウを識別するプライマー対で、１７５ｂｐの付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図４）。
【００２６】
プライマー「ｂ１９５」は、クンプウを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ〜２００ｂｐの間に、他品種とは異なる増幅を示す（図５）。
【００２７】
プライマー「ｂ１３１」は、ホライズンを識別するプライマー対で、２０４ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図６）。
【００２８】
プライマー「ｄ６」は、キリタップを識別するプライマー対で、１４５〜１７５ｂｐの間で、他品種とは異なる増幅を示す（図７）。
【００２９】
プライマー「ｂ１８９」は、ホクエイを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図８）。
【００３０】
プライマー「ｂ１８１」は、ホクエイ及びなつさかりを識別するプライマー対で、ホクエイは、１４５ｂｐ付近で、なつさかりは２０４ｂｐ〜２３０ｂｐの間で、他品種とは異なる増幅を示す（図９）。
【００３１】
プライマー「ｄ５９」は、ノッサプを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す、なお、ホクエイ及びなつさかり両品種では、やや下のところに増幅がある（図１０）。
【００３２】
プライマー「ｂ３１７」は、オーロラを識別するプライマー対で、１２０ｂｐ〜１４５ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図１１）。
【００３３】
プライマー「ｄ１２０」は、ホクセイを識別するプライマー対で、１７５ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図１２）。
【００３４】
プライマー「ｂ１９７」は、なつさかりを識別するプライマー対で、２５５ｂｐ付近で、他品種とは異なる増幅を示す（図１３）。
【００３５】
表２にＳＳＲマーカーバルク法によるチモシー品種識別早見表（１００個体中に品種特異的なマーカーアレルの個体数）を示す。表中、＋は、品種特異的な増幅があることを示し、−は、品種に特定領域に特異的な増幅が見られないことを示す。
【００３６】
【表２】
【発明の効果】
【００３７】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、チモシーの品種を識別するチモシーのＳＳＲマーカーが提供される。
（２）単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、チモシーの品種識別を行うことができる。
（３）本発明により、アッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラからなる１１品種相互での品種識別を行うことができる。
（４）個体単位の解析ではなく、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、解析時間の短縮及び正確な品種識別が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例におけるｂ１６８を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。Ｍは、サイズマーカー（単位はｂｐ）を示し、左から各４レーンは、一組１品種で、それぞれ「アッケシ」「シリウス」「ホクシュウ」「クンプウ」「ホライズン」「キリタップ」「ホクエイ」「ノサップ」「オーロラ」「ホクセイ」「クライマックス」（本発明の識別品種に含まれていない）及び「なつさかり」を、それぞれ電気泳動した結果を示す。図２−１３も同様である。
【図２】実施例におけるｂ６７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例におけるｄ５６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例におけるｂ２２７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例におけるｂ１９５を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例におけるｂ１３１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例におけるｄ６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例におけるｂ１８９を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図９】実施例におけるｄ１８１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１０】実施例におけるｄ５９を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１１】実施例におけるｂ３１７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１２】実施例におけるｂ１２０を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１３】実施例におけるｂ１９７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１４】本発明の特定のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１５】本発明の特定のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１６】本発明の特定のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１７】本発明の特定のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４０】
本発明で使用した機器は、以下の通りである。
すなわち、本実施例では、Ｔ ＧＲＡＤＩＥＮＴ Ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、及び、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＡＢＩ）、ＤＮＡシーケンシングシステムＬＩＣ−４２００Ｌ（ｓ）（ＬＩＣＯＲ社）、を用いた。
【００４１】
本発明で使用した試薬は、以下の通りである。
〈５０％アクリルアミドゲル〉
アクリルナニドゲルとして、尿素（和光純薬工業株式会社）、Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ Ｇｅｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用（タカラバイオ株式会社）、１０ｘＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光純薬工業株式会社）を用いた。
【００４２】
〈ＰＣＲ反応液〉
ＰＣＲ反応液として、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ（和光純薬工業株式会社）、１ｐｍｏｌ／μｌ Ｍ１３ Ｆｏｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（ＬＩＣＯＲ社）、色素マーカーとして、５０−３５０ｂｐ ＳＩＺＩＮＧ ＳＴＡＮＤＡＲＤ−ＢＵＬＫ（ＬＩＣＯＲ社）を用いた。本発明では、ＬＩＣＯＲ社のプロトコールに基づいて、ゲルの作製を行った。
【００４３】
国内で育成されたチモシーのアッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラの１１品種から、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４４】
抽出したＤＮＡ溶液は、滅菌水でＤＮＡ濃度を５０ｎｇ／μｌに調整し、１０個体を混合し、バルクにしたものを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。
【００４５】
〈ＰＣＲ反応液：計１０μｌ〉
ＰＣＲ反応液の調製は、以下の通りとした。
チモシー対象品種から抽出したバルクＤＮＡ：１μｌ
１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．８μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：６．５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｒｄ（２０ｐｍｏｌ／ｕｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ（５ ｕｎｉｔ／μｌ）：０．１μｌ
【００４６】
〈ＰＣＲ条件〉
ＰＣＲ条件は、以下の通りとした。
９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）９５℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）で反応させた。ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー５μｌを加え、９０℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で１時間以上静置させることで、安定させた後、アクリルアミドゲルを使用して、電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認した。
【００４７】
チモシーのアッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラの１１品種を使用し、「ｂ１６８」プライマー対を使用し、ＰＣＲを行った。
【００４８】
アッケシ及びシリウスを増幅パターンで、ある位置では、ほかの品種がそれぞれすべてバンドのでる部分に、バンドの欠如が見られた。それに対して、ホクセイは、ほかの品種と異なる増幅を示した。「ｂ１６８」プライマー対を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を、図１に示す。プライマーである、「ｂ６７」、「ｄ５６」、「ｂ２２７」、「ｂ１９５」、「ｂ１３１」、「ｄ６」、「ｂ１８９」、「ｄ１８１」、「ｄ５９」、「ｂ３１７」、「ｂ１２０」、「ｂ１９７」を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を、それぞれ図２〜１３に示す。
【００４９】
本発明の特定のプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の増幅産物である特定マーカー遺伝子を、図１４〜１７に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上詳述したように、本発明は、チモシーの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用に係るものであり、本発明により、チモシー１１品種を特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対を提供することができる。また、本発明により、単数又は複数のプライマー対を使用した、ＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させた特定マーカー遺伝子を提供することができる。本発明は、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、チモシーの品種識別を行うことを可能とするものである。本発明により、アッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラからなる１１品種相互での品種識別を行うことができる。本発明は、短い時間で、正確なチモシーの品種識別を可能にする、新しい品種識別方法を提供するものとして有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チモシーの品種識別用のプライマーであって、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
【請求項２】
チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１３のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１４〜２６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１又は２に記載のプライマー対。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするチモシーの品種識別用プライマーセット。
【請求項５】
チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する請求項１、２又は３に記載のプライマー対から増幅されるＰＣＲ増幅産物からなることを特徴とする特定マーカー遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号２７〜３９のいずれかの塩基配列を有する、請求項５に記載の特定マーカー遺伝子。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の特定マーカー遺伝子を使用し、識別対象のチモシーＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするチモシーの品種識別方法。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の特定マーカー遺伝子を使用し、識別対象の遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするチモシーの品種識別方法。
【請求項９】
対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したチモシー遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
アッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラの１１品種からなるチモシー品種を識別する、請求項７から９のいずれかに記載の品種識別方法。
【請求項１】
チモシーの品種識別用のプライマーであって、チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
【請求項２】
チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１３のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１４〜２６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１又は２に記載のプライマー対。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするチモシーの品種識別用プライマーセット。
【請求項５】
チモシーのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する請求項１、２又は３に記載のプライマー対から増幅されるＰＣＲ増幅産物からなることを特徴とする特定マーカー遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号２７〜３９のいずれかの塩基配列を有する、請求項５に記載の特定マーカー遺伝子。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の特定マーカー遺伝子を使用し、識別対象のチモシーＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするチモシーの品種識別方法。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の特定マーカー遺伝子を使用し、識別対象の遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするチモシーの品種識別方法。
【請求項９】
対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したチモシー遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
アッケシ、キリタップ、クンプウ、なつさかり、ノサップ、ホクシュウ、シリウス、ホクエイ、ホクセイ、ホライズン、オーロラの１１品種からなるチモシー品種を識別する、請求項７から９のいずれかに記載の品種識別方法。
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１１−２１１９４４（Ｐ２０１１−２１１９４４Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８２１３３（Ｐ２０１０−８２１３３）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
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