テイコプラニンの産生のための微生物およびプロセス
【課題】 Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ．（ＡＴＣＣ−３１１２１）株に比べてより高い生産性を有する変異株。このような変異株を用いて好気条件下でテイコプラニンを調製するための醗酵プロセス。
【解決手段】 韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託された変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を用いる、テイコプラニンの最大産生のための醗酵方法。韓国微生物保存センターに、受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託されている、単離されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５。
【解決手段】 韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託された変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を用いる、テイコプラニンの最大産生のための醗酵方法。韓国微生物保存センターに、受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託されている、単離されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テイコプラニン（ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）を産生する微生物、およびＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ種に属する単離変異株を用いて好気条件下で、同化可能な炭素源、窒素源および鉱物塩を含む培養培地上でテイコプラニンを調製するための醗酵プロセスに関する。
【０００２】
特に、本発明は、単離された変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）に関する。この微生物は、先行技術（特許文献１）に記載された微生物よりも約６倍を超えて高い生産性で、テイコプラニンを産生する。本発明はまた、この変異株を用いて好気条件下でテイコプラニンを調製するための醗酵プロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
テイコプラニンは、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓによって産生される抗生物質の１つであり、バンコマイシン−リストセチンファミリーの糖ペプチド抗生物質に分類されている。その機構は、細胞壁生合成を阻害することであり、そしてメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＣｌｏｓｔｒｄｉｕｍおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓなどのグラム陽性抗生物質耐性病原体に対して投与されている。
【０００４】
多すぎる抗生物質の投与によって生じている種々の種類の抗生物質に対して耐性の微生物（特に、メチシリン耐性微生物）の出現は、重篤な健康問題を引き起こし得る。さらに、メチシリン耐性微生物はまた、他のあらゆる抗生物質（例えば、アミノグリコシド類、テトラサイクリン類、セファロスポリン類、セファマイシン類、ペネム類、カルバペネム類、およびマクロライド類）に対して耐性であり、このことは、重篤な疾患を生じる。
【０００５】
メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓからの保護という世界規模の問題は、バンコマイシンおよびテイコプラニンの使用の増大を生じた。これらの抗生物質は、これらの病原体の有効な処置のための唯一の薬剤である。
【０００６】
テイコプラニンは、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ．（ＡＴＣＣ−３１１２１）株を炭素源、窒素源および無機塩を含む培養培地中で培養することによって産生される抗生物質である（非特許文献１，特許文献１）。しかし、特許文献１に記載された株は、市販規模では所望されるものではない。なぜなら、これは、５０ｍｇ／Ｌ未満の生産性でテイコプラニンを高コストで産生するからである。
【特許文献１】米国特許第４，２３９，７５１号
【非特許文献１】Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２７６−２８３，１９７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
テイコプラニンを産生する上記株に比べてより高い生産性を有する変異株の単離が必要とされている。また、このような変異株を用いて好気条件下でテイコプラニンを調製するための醗酵プロセスの開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅａｅ科のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓのテイコプラニン産生株に対する本研究者らのスクリーニング研究過程において、本発明者らは、大韓民国の雪嶽山（Ｓｏｒａｋ Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ｋｏｒｅａ）において収集された土壌サンプルから新規株を単離した。この単離株は、先行技術文献（米国特許第４，２３９，７５１号）に記載された株の約２０倍の生産性でテイコプラニンを産生する。
【０００９】
この株は、反復的な変異誘発処理に供された。ついで、テイコプラニン耐性変異株が単離された。この変異株は、先行技術文献（米国特許第４，２３９，７５１号）に記載された株の約６０倍の生産性でテイコプラニンを産生する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の目的は、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託された変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｐｌａｎｅｓ ＢＮＧ２３１５を用いて、テイコプラニンを最大限産生するための醗酵方法を提供することである。この方法は、以下の工程を包含する： ｉ）グルコース１５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、デキストリン４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ、ペプトン４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌ、ナタネ粗引き粉（ｍｅａｌ）１６ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、ダイズ粉１６ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ〜０．６ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３ ４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌ、およびＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ〜１．４ｇ／Ｌを含む産生培地上で、該培地の曝気速度が１分間当たり、１培地容量につき、空気０．５〜２．０容量である条件で変異株細胞を醗酵させる工程；ｉｉ）該変異株細胞および他の残渣を、該醗酵培地から取り除く工程；およびｉｉｉ）工程ｉｉ）の該醗酵培地からテイコプラニンを単離および回収する工程。
【００１１】
さらに、醗酵のために使用されるこの変異株細胞は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）を、グルコース２５ｇ／Ｌ〜３５ｇ／Ｌ、酵母抽出物２．０ｇ／Ｌ〜３．０ｇ／Ｌ、ダイズ粉７．０ｇ／Ｌ〜１１．０ｇ／Ｌ、ナタネ粗引き粉７．０ｇ／Ｌ〜１１．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ〜１．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．０８ｇ／Ｌ〜０．１２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ〜０．６ｇ／ＬおよびＣａＣＯ３ ４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌを含む培地において培養することによって調製される。
【００１２】
他方、本発明はまた、韓国微生物保存センターに、受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託されている、単離されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を提供する。
【００１３】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１４】
Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ．（ＡＴＣＣ−３１１２１）株に比べてより高い生産性を有する変異株が、単離された。また、このような変異株を用いて好気条件下でテイコプラニンを調製するための醗酵プロセスが、開発された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
上記変異株は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓに属することが、細胞の脂肪酸分析および１６ｓ ｒＤＮＡ配列分析などの分類学的調査を通じて決定された。
【００１６】
しかし、この変異株は、いくつかの培養上および生理学上の特性、ならびにテイコプラニンを産生する能力という点で、米国特許第４，２３９，７５１号に記載されたオリジナル株とは明らかに区別される。従って、新たに単離された培養物を、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３と命名し、この培養物に対して紫外線照射処理によって得られたその変異株を、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５と命名した。
【００１７】
ついで、この変異株は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５として、ブダペスト条約下で、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；住所：大韓民国ソウル，ソデムン−ク，ホンジェ１−ドン、ユリムビルディング、３６１−２２１）に、２００４年７月２８日に、受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１として寄託された。
【００１８】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００１９】
（実施例１）
（テイコプラニン産生微生物の単離）
変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３を、大韓民国雪嶽山から収集した土壌サンプルから、キャピラリーチューブ法により単離した。上記の土壌サンプルからの微生物を、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓのメンバーの同定のための選択培地上に接種した。ついで、分類学的な特性によってＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓのメンバーとして選択された候補培養物を、グルコース、デキストリン、ダイズ粉、ジャガイモタンパク質、および鉱物塩を含む水性栄養培地中で増殖させた。この培養ブロスを濾過し、そして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、テイコプラニンのアッセイについて標準的なプロトコールを用いて分析した。テイコプラニン産生体として選択された候補培養物を、０．３％（ｖ／ｖ）のＳ．ａｕｒｅｕｓの水性懸濁物（１ｍｌあたり１０６細胞を含む）を接種したＤｉｆｃｏ Ｎｏｂｅｌ寒天培地上で実施される微生物アッセイに供した。最後に、テイコプラニン産生体として選択された候補培養物を、分類学的に同定し、そして培養物によって産生されたテイコプラニンとして推定された化合物を、その物理化学的特性に関して分析した。
【００２０】
結論として、本発明者らは、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓに属し、そして先行技術（米国特許第４，２３９，７５１号）に記載された微生物の約２０倍の生産性でテイコプラニンを産生する新規培養物を単離した。
【００２１】
（実施例２）
（テイコプラニンの高産生変異株の単離）
上記母株よりもさらに効率よくテイコプラニンを産生する変異株を単離するために、変異誘発のための処理を紫外線照射によって行った。母株を、オートミール寒天スラントにおいて３２℃で１２日間培養した。通常の生理食塩水緩衝液を、このスラントに加え、そしてこれらを激しく混合し、ついで、懸濁物をＮｏ．２ Ｗａｔｔｍａｎ Ｐａｐｅｒを用いて濾過した。胞子懸濁物を、３０Ｗ 紫外線ランプによる紫外線照射に供し、そして暗所にて２時間４℃で静置した。胞子懸濁物を、１００ｍｇ／Ｌテイコプラニンを含むソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）寒天培地上に移し、そして７日間３２℃でインキュベートした。
【００２２】
病原性微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養物を、プレート上に増殖したコロニーの上に接種し、そして３２℃で１８時間インキュベートした。それら自身の周りに、母株の周りに形成された阻害ゾーンよりもより大きな阻害ゾーンを形成するコロニーを、候補変異株として選択し、そしてこれらを、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧと命名し、コロニーに従う番号を伴わせた。候補変異株を、以下の表１に示す産生培地を含む７Ｌバッチ醗酵槽中で１２０時間培養した。
【００２３】
醗酵槽規模で選択された変異株を、その生産性および安定性について、５回の別個の実験により測定した。驚くべきことに、本発明者らは、先行技術（米国特許第４，２３９，７５１号）において報告された微生物よりも約６０倍高い生産性でテイコプラニンを産生する、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、単離し、そしてこの株をブダペスト条約下で韓国微生物保存センターに、受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託した。
【００２４】
（表１）
（産生培地の組成）
【００２５】
【表１】
（実施例３）
（変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の分類学的同定）
新たに単離したテイコプラニン産生株を細胞脂肪酸、細胞壁組成および１６ｓ ｒＤＮＡ配列の分析によって分類学的に同定した。細胞脂肪酸の分析は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓとの９８％の類似性を示し、そしてこの株のジアミノピメリン酸（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓのジアミノピメリン酸と同じくメソ体である。特に、この新たに単離されたテイコプラニン産生株の１６ｓ ｒＤＮＡの配列は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓの１６ｓ ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示す。結果として、この新たに単離されたテイコプラニン産生株は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓに属すると決定された。しかし、この株は、米国特許第４，２３９，７５１号に記載される株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓとは、以下に記載されるいくつかの培養特性および生理学的特性によって明らかに区別される。従って、この変異株は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５と割当てられ、そしてブダペスト条約の下で、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１として寄託された。
【００２６】
図１は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５が比較１６ｓ ｒＤＮＡ配列決定によって位置決めされた、詳細な系統樹を示す。
【００２７】
（実施例４）
（変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＳ ２３１５の培養特性）
（１）肉眼試験
オートミール寒天培地で生成するコロニーのサイズは、直径３〜４ｍｍである。コロニーの形状は、十分に規定されかつ規則的な輪郭であり、淡橙色を有する中心のドーム様の隆起である。明るい橙色〜深橙色の植物性菌糸体が、培地のほとんどで生成される。しかし、この植物性菌糸体の色は、ジャガイモ、スキムミルクおよびａｖｅｎａ酵母寒天培地では淡褐色である。いくつかの培地では、淡褐色の可溶性色素が生成される。長菌糸から生成された十分に発達した気中菌糸体が、いくつかの培地で見出される。
【００２８】
表２は、種々の標準的な培地で培養したＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の培養特性を報告する。これらの培養特性は、３０℃で７〜１４日間のインキュベーションの後に決定した。
【００２９】
（表２）
（培養特性（３２℃で１４日間インキュベートした））
【００３０】
【表２】
（２）顕微鏡試験
ほとんどの培地で多量に生成された胞子嚢は、主に、コロニーのドーム上で見出される。この胞子嚢は、球形〜楕円形であり、規則的な輪郭を有し、１５〜２０μｍの範囲の直径を有する。胞子嚢柄は、真っ直ぐであり、直径約１５μｍおよび２μｍである。高度に運動性の胞子は、球形〜楕円形であり、直径１．５〜２μｍである。植物性菌糸体は、直径０．５〜１μｍの薄い、ねじれた分枝状の菌糸から構成される。
【００３１】
（実施例５）
（変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の生理学的特性）
変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の生理学的特性を、他のテイコプラニン生成体と比較した。表３は、炭素源の使用を報告する。
【００３２】
（表３）
（糖質の使用）
【００３３】
【表３】
表４は、他の生理学的特性を報告する。株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、Ａ．ｕｔｈａｅｎｓｉｓ、Ａ．ｃｏｌｏｒａｄｏｅｎｓｉｓおよびＡ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓと同時に培養した。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ種の一般的な特性と比較すると、糖質の使用に関するＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の特性は、ラムノースおよびラクトースの使用を除いて同じであった。さらに、主要な生理学的特性も、ゼラチンの液状化およびリンゴ酸カルシウムの加水分解を除いて同一であった。結果として、この変異株を、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓに属すると決定したが、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５として割り当てた。なぜなら、この変異株は、生理学的特性ならびに形態学的特性および染色特性に基づいて、すべてのこれらの種とは明らかに区別され得るからである。この変異株を、２００４年７月２８日に、ブダペスト条約の下で、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１として寄託した。
【００３４】
（表４）
（生理学的特性）
【００３５】
【表４】
（実施例６）
（好気性醗酵によるテイコプラニンの産生）
テイコプラニンの産生のために、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、同化可能な炭素源、窒素源、および無機塩源を含む、水性栄養培地中にて好気条件下で醗酵させる。より具体的には、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、実質的な菌糸体増殖が存在するまで、５〜９の範囲のｐＨ値にて、より好ましくはｐＨ７にて、栄養培地中で好気的に前培養する。そのフラスコを、２８〜３４℃にて、より好ましくは３２℃にて、２４〜４８時間振盪し、その後、その前培養物を、最終濃度５〜１０％にてジャー発酵槽に接種するために使用する。上記栄養培地の例として、前培養物は、表５に示されるような以下の組成（ｇ／Ｌ）を有し得る。
【００３６】
（表５）
（前培養培地の組成）
【００３７】
【表５】
Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の醗酵を、以下の通りに実行する。小規模醗酵において、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の前培養物を、表６に列挙される産生培地を含む７Ｌのジャー発酵槽に接種する。
【００３８】
（表６）
（種培養培地の組成）
【００３９】
【表６】
接種物は、３〜１５％の範囲にあり、より好ましくは５％である。醗酵バッチを、９００ｒｐｍにて攪拌しながら、そして３０％より高い空気飽和で曝気を維持しながら、好気条件下でインキュベートする。その温度を、２５〜３７℃にて、より好ましくは３２℃にて、維持する。ｐＨは、醗酵の間に変化するが制御しない。
【００４０】
大規模醗酵（５，０００Ｌ）において、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の前培養物を、表６に列挙される滅菌培地３００Ｌを含む種発酵槽（５００Ｌ）に接種し、その後、上記の好気条件下で３０℃にて４８時間インキュベートする。
【００４１】
その種培養物（３００Ｌ）を、表７に列挙される産生培地３，０００Ｌを含む主発酵槽（５，０００Ｌ）に接種する。
【００４２】
（表７）
（産生培地の組成）
【００４３】
【表７】
その主醗酵を、水中好気条件下で、攪拌（８０〜１５０ｒｐｍ）および曝気（培地の５０〜２００（ｖ／ｖ）％容量、より好ましくは１５０（ｖ／ｖ）％容量）しながら、実行する。
【００４４】
間隔を空けて、培養ブロスを取り出し、増殖、糖の消費、およびテイコプラニンの濃度について分析する。１０ｍｌの培養ブロスを、５Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ１１に調整し、そして４５０ｇにて１０分間遠心分離する。増殖を、ＰＭＶ（充填菌糸体体積（Ｐａｃｋｅｄ Ｍｙｃｅｌｉａｌ Ｖｏｌｕｍｅ））として測定し、テイコプラニンの濃度を、Ｃ１８逆相カラム、ＵＶ検出器、およびクォータナリ（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）・ポンプを備えるＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって決定する。糖の全量を、フェノール−硫酸法によって決定し、グルコースの濃度を、ＤＮＳ法によって測定する。
【００４５】
５，０００Ｌ規模での醗酵の時間経過が、図２に示される。テイコプラニンの合成は、増殖期が終わって全残留糖が３０ｇ／Ｌ未満になったときに、始まる。グルコースの消費は、対数増殖期の間の３６時間で完了し、その後、デキストリンが、増殖およびテイコプラニンの合成のために消費される。
【００４６】
この培地のｐＨは、増殖期の間にｐＨ６．５まで減少し、その後、抗生物質産生期（図２においてデータは、示されない）の間にｐＨ８．０まで上昇した。この増殖は、４８時間でＰＭＶとして２９％に達し、テイコプラニンの合成は、１４０時間まで多少直線的に継続し、１４０時間で、横ばいになり始める。変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５により産生されるテイコプラニンの最大濃度は、３．２ｇ／Ｌであり、これは、米国特許第４，２３９，７５１号において報告されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ． ＡＴＣＣ−３１１２１によるよりも６４倍多い。
【００４７】
（表８）
（テイコプラニンについての生産性の比較）
【００４８】
【表８】
小規模醗酵（７Ｌ）において、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５は、表８において示されるように、米国特許第４，２３９，７５１号において報告されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ． ＡＴＣＣ−３１１２１による５０ｍｇ／Ｌと比較して、６日間以内で３．０ｇ／Ｌより多いテイコプラニンを産生した。大規模醗酵（５，０００Ｌ）において、本変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５は、いくつかの別個の実験において、２．５ｇ／Ｌ〜３．２ｇ／Ｌのテイコプラニンを再現的に産生した。
【００４９】
テイコプラニンは、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ２−３、Ａ２−４、Ａ２−５と呼ばれる５つの主成分の混合物からなる。すべてのテイコプラニン成分は、分子量が１５６４〜１９０８の範囲である糖ペプチドアナログである。これらは、直鎖状ヘプタペプチドアグリコンならびにＤ−マンノースおよびＤ−グルコサミンによって形成される、同じコア糖ペプチドを有する。上記Ａ２群の５つの成分は、さらなるＮ−アシル−グルコサミンを含み、そして異なるアシル脂肪族側鎖によって区別される。これらのＡ２群成分を、逆相ＨＰＬＣにおける保持時間に従って、親油性が増加する順に、Ａ２−１からＡ２−５へと順位付けし得る（図３）。表９は、テイコプラニンＡ２複合体の組成を示す。
【００５０】
（表９）
（テイコプラニンＡ２複合体の組成）
【００５１】
【表９】
Ａ２群の単一成分群は、異なる生物学的活性を有する。Ａ２−３およびＡ２−４は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対して、それぞれ、Ａ２−１およびＡ２−２の両方よりも２倍高い生物学的活性を有する。
【００５２】
図２および表９に示されるように、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）により産生されるテイコプラニンＡ２複合体はまた、５つの成分を含むが、Ａ２群の組成は、米国特許４，２３９，７５１号において報告されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ． ＡＴＣＣ−３１１２１により産生される組成と異なる。換言すると、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）により産生されるテイコプラニンＡ２複合体中のＡ２−３およびＡ２−４の内容量は、米国特許第４，２３９，７５１号において報告されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ． ＡＴＣＣ−３１１２１による内容量よりも、２倍および１．４倍多い。このことは、テイコプラニン複合体の生物学的活性の増加をもたらす。
【００５３】
結論として、醗酵の結果、ならびに培養特性および生理学的特性は、本発明の変異株が、先行技術において報告された他のテイコプラニン産生株とは明確に区別されることを、示す。
【００５４】
（発明の要約）
本発明は、新たな単離変異株培養物Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を提供する。この培養物は、以前に報告された微生物（例えば、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕ ｎｏｖ．ｓｐ．ＡＴＣＣ３１１２１）よりも約６０倍を超えて高い生産性でテイコプラニンを産生する能力を有する。本発明はまた、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、炭素源、窒素源および鉱物塩を含む培養培地中で用いて好気条件でテイコプラニンを産生するための醗酵プロセスを提供する。
【００５５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ、その範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５が比較のための１６ｓ ｒＤＮＡ配列決定によって位置づけられた、系統樹を示す。
【図２】図２は、５０００Ｌ規模で、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を用いた醗酵の時間経過を示す。
【図３】図３は、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）の培養ブロスのＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テイコプラニン（ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）を産生する微生物、およびＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ種に属する単離変異株を用いて好気条件下で、同化可能な炭素源、窒素源および鉱物塩を含む培養培地上でテイコプラニンを調製するための醗酵プロセスに関する。
【０００２】
特に、本発明は、単離された変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）に関する。この微生物は、先行技術（特許文献１）に記載された微生物よりも約６倍を超えて高い生産性で、テイコプラニンを産生する。本発明はまた、この変異株を用いて好気条件下でテイコプラニンを調製するための醗酵プロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
テイコプラニンは、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓによって産生される抗生物質の１つであり、バンコマイシン−リストセチンファミリーの糖ペプチド抗生物質に分類されている。その機構は、細胞壁生合成を阻害することであり、そしてメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＣｌｏｓｔｒｄｉｕｍおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓなどのグラム陽性抗生物質耐性病原体に対して投与されている。
【０００４】
多すぎる抗生物質の投与によって生じている種々の種類の抗生物質に対して耐性の微生物（特に、メチシリン耐性微生物）の出現は、重篤な健康問題を引き起こし得る。さらに、メチシリン耐性微生物はまた、他のあらゆる抗生物質（例えば、アミノグリコシド類、テトラサイクリン類、セファロスポリン類、セファマイシン類、ペネム類、カルバペネム類、およびマクロライド類）に対して耐性であり、このことは、重篤な疾患を生じる。
【０００５】
メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓからの保護という世界規模の問題は、バンコマイシンおよびテイコプラニンの使用の増大を生じた。これらの抗生物質は、これらの病原体の有効な処置のための唯一の薬剤である。
【０００６】
テイコプラニンは、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ．（ＡＴＣＣ−３１１２１）株を炭素源、窒素源および無機塩を含む培養培地中で培養することによって産生される抗生物質である（非特許文献１，特許文献１）。しかし、特許文献１に記載された株は、市販規模では所望されるものではない。なぜなら、これは、５０ｍｇ／Ｌ未満の生産性でテイコプラニンを高コストで産生するからである。
【特許文献１】米国特許第４，２３９，７５１号
【非特許文献１】Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２７６−２８３，１９７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
テイコプラニンを産生する上記株に比べてより高い生産性を有する変異株の単離が必要とされている。また、このような変異株を用いて好気条件下でテイコプラニンを調製するための醗酵プロセスの開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅａｅ科のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓのテイコプラニン産生株に対する本研究者らのスクリーニング研究過程において、本発明者らは、大韓民国の雪嶽山（Ｓｏｒａｋ Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ｋｏｒｅａ）において収集された土壌サンプルから新規株を単離した。この単離株は、先行技術文献（米国特許第４，２３９，７５１号）に記載された株の約２０倍の生産性でテイコプラニンを産生する。
【０００９】
この株は、反復的な変異誘発処理に供された。ついで、テイコプラニン耐性変異株が単離された。この変異株は、先行技術文献（米国特許第４，２３９，７５１号）に記載された株の約６０倍の生産性でテイコプラニンを産生する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の目的は、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託された変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｐｌａｎｅｓ ＢＮＧ２３１５を用いて、テイコプラニンを最大限産生するための醗酵方法を提供することである。この方法は、以下の工程を包含する： ｉ）グルコース１５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、デキストリン４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ、ペプトン４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌ、ナタネ粗引き粉（ｍｅａｌ）１６ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、ダイズ粉１６ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ〜０．６ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３ ４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌ、およびＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ〜１．４ｇ／Ｌを含む産生培地上で、該培地の曝気速度が１分間当たり、１培地容量につき、空気０．５〜２．０容量である条件で変異株細胞を醗酵させる工程；ｉｉ）該変異株細胞および他の残渣を、該醗酵培地から取り除く工程；およびｉｉｉ）工程ｉｉ）の該醗酵培地からテイコプラニンを単離および回収する工程。
【００１１】
さらに、醗酵のために使用されるこの変異株細胞は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）を、グルコース２５ｇ／Ｌ〜３５ｇ／Ｌ、酵母抽出物２．０ｇ／Ｌ〜３．０ｇ／Ｌ、ダイズ粉７．０ｇ／Ｌ〜１１．０ｇ／Ｌ、ナタネ粗引き粉７．０ｇ／Ｌ〜１１．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ〜１．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．０８ｇ／Ｌ〜０．１２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ〜０．６ｇ／ＬおよびＣａＣＯ３ ４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌを含む培地において培養することによって調製される。
【００１２】
他方、本発明はまた、韓国微生物保存センターに、受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託されている、単離されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を提供する。
【００１３】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１４】
Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ．（ＡＴＣＣ−３１１２１）株に比べてより高い生産性を有する変異株が、単離された。また、このような変異株を用いて好気条件下でテイコプラニンを調製するための醗酵プロセスが、開発された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
上記変異株は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓに属することが、細胞の脂肪酸分析および１６ｓ ｒＤＮＡ配列分析などの分類学的調査を通じて決定された。
【００１６】
しかし、この変異株は、いくつかの培養上および生理学上の特性、ならびにテイコプラニンを産生する能力という点で、米国特許第４，２３９，７５１号に記載されたオリジナル株とは明らかに区別される。従って、新たに単離された培養物を、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３と命名し、この培養物に対して紫外線照射処理によって得られたその変異株を、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５と命名した。
【００１７】
ついで、この変異株は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５として、ブダペスト条約下で、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；住所：大韓民国ソウル，ソデムン−ク，ホンジェ１−ドン、ユリムビルディング、３６１−２２１）に、２００４年７月２８日に、受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１として寄託された。
【００１８】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００１９】
（実施例１）
（テイコプラニン産生微生物の単離）
変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３を、大韓民国雪嶽山から収集した土壌サンプルから、キャピラリーチューブ法により単離した。上記の土壌サンプルからの微生物を、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓのメンバーの同定のための選択培地上に接種した。ついで、分類学的な特性によってＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓのメンバーとして選択された候補培養物を、グルコース、デキストリン、ダイズ粉、ジャガイモタンパク質、および鉱物塩を含む水性栄養培地中で増殖させた。この培養ブロスを濾過し、そして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、テイコプラニンのアッセイについて標準的なプロトコールを用いて分析した。テイコプラニン産生体として選択された候補培養物を、０．３％（ｖ／ｖ）のＳ．ａｕｒｅｕｓの水性懸濁物（１ｍｌあたり１０６細胞を含む）を接種したＤｉｆｃｏ Ｎｏｂｅｌ寒天培地上で実施される微生物アッセイに供した。最後に、テイコプラニン産生体として選択された候補培養物を、分類学的に同定し、そして培養物によって産生されたテイコプラニンとして推定された化合物を、その物理化学的特性に関して分析した。
【００２０】
結論として、本発明者らは、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓに属し、そして先行技術（米国特許第４，２３９，７５１号）に記載された微生物の約２０倍の生産性でテイコプラニンを産生する新規培養物を単離した。
【００２１】
（実施例２）
（テイコプラニンの高産生変異株の単離）
上記母株よりもさらに効率よくテイコプラニンを産生する変異株を単離するために、変異誘発のための処理を紫外線照射によって行った。母株を、オートミール寒天スラントにおいて３２℃で１２日間培養した。通常の生理食塩水緩衝液を、このスラントに加え、そしてこれらを激しく混合し、ついで、懸濁物をＮｏ．２ Ｗａｔｔｍａｎ Ｐａｐｅｒを用いて濾過した。胞子懸濁物を、３０Ｗ 紫外線ランプによる紫外線照射に供し、そして暗所にて２時間４℃で静置した。胞子懸濁物を、１００ｍｇ／Ｌテイコプラニンを含むソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）寒天培地上に移し、そして７日間３２℃でインキュベートした。
【００２２】
病原性微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養物を、プレート上に増殖したコロニーの上に接種し、そして３２℃で１８時間インキュベートした。それら自身の周りに、母株の周りに形成された阻害ゾーンよりもより大きな阻害ゾーンを形成するコロニーを、候補変異株として選択し、そしてこれらを、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧと命名し、コロニーに従う番号を伴わせた。候補変異株を、以下の表１に示す産生培地を含む７Ｌバッチ醗酵槽中で１２０時間培養した。
【００２３】
醗酵槽規模で選択された変異株を、その生産性および安定性について、５回の別個の実験により測定した。驚くべきことに、本発明者らは、先行技術（米国特許第４，２３９，７５１号）において報告された微生物よりも約６０倍高い生産性でテイコプラニンを産生する、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、単離し、そしてこの株をブダペスト条約下で韓国微生物保存センターに、受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託した。
【００２４】
（表１）
（産生培地の組成）
【００２５】
【表１】
（実施例３）
（変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の分類学的同定）
新たに単離したテイコプラニン産生株を細胞脂肪酸、細胞壁組成および１６ｓ ｒＤＮＡ配列の分析によって分類学的に同定した。細胞脂肪酸の分析は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓとの９８％の類似性を示し、そしてこの株のジアミノピメリン酸（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓのジアミノピメリン酸と同じくメソ体である。特に、この新たに単離されたテイコプラニン産生株の１６ｓ ｒＤＮＡの配列は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓの１６ｓ ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示す。結果として、この新たに単離されたテイコプラニン産生株は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓに属すると決定された。しかし、この株は、米国特許第４，２３９，７５１号に記載される株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓとは、以下に記載されるいくつかの培養特性および生理学的特性によって明らかに区別される。従って、この変異株は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５と割当てられ、そしてブダペスト条約の下で、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１として寄託された。
【００２６】
図１は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５が比較１６ｓ ｒＤＮＡ配列決定によって位置決めされた、詳細な系統樹を示す。
【００２７】
（実施例４）
（変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＳ ２３１５の培養特性）
（１）肉眼試験
オートミール寒天培地で生成するコロニーのサイズは、直径３〜４ｍｍである。コロニーの形状は、十分に規定されかつ規則的な輪郭であり、淡橙色を有する中心のドーム様の隆起である。明るい橙色〜深橙色の植物性菌糸体が、培地のほとんどで生成される。しかし、この植物性菌糸体の色は、ジャガイモ、スキムミルクおよびａｖｅｎａ酵母寒天培地では淡褐色である。いくつかの培地では、淡褐色の可溶性色素が生成される。長菌糸から生成された十分に発達した気中菌糸体が、いくつかの培地で見出される。
【００２８】
表２は、種々の標準的な培地で培養したＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の培養特性を報告する。これらの培養特性は、３０℃で７〜１４日間のインキュベーションの後に決定した。
【００２９】
（表２）
（培養特性（３２℃で１４日間インキュベートした））
【００３０】
【表２】
（２）顕微鏡試験
ほとんどの培地で多量に生成された胞子嚢は、主に、コロニーのドーム上で見出される。この胞子嚢は、球形〜楕円形であり、規則的な輪郭を有し、１５〜２０μｍの範囲の直径を有する。胞子嚢柄は、真っ直ぐであり、直径約１５μｍおよび２μｍである。高度に運動性の胞子は、球形〜楕円形であり、直径１．５〜２μｍである。植物性菌糸体は、直径０．５〜１μｍの薄い、ねじれた分枝状の菌糸から構成される。
【００３１】
（実施例５）
（変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の生理学的特性）
変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の生理学的特性を、他のテイコプラニン生成体と比較した。表３は、炭素源の使用を報告する。
【００３２】
（表３）
（糖質の使用）
【００３３】
【表３】
表４は、他の生理学的特性を報告する。株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、Ａ．ｕｔｈａｅｎｓｉｓ、Ａ．ｃｏｌｏｒａｄｏｅｎｓｉｓおよびＡ．ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓと同時に培養した。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ種の一般的な特性と比較すると、糖質の使用に関するＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の特性は、ラムノースおよびラクトースの使用を除いて同じであった。さらに、主要な生理学的特性も、ゼラチンの液状化およびリンゴ酸カルシウムの加水分解を除いて同一であった。結果として、この変異株を、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓに属すると決定したが、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５として割り当てた。なぜなら、この変異株は、生理学的特性ならびに形態学的特性および染色特性に基づいて、すべてのこれらの種とは明らかに区別され得るからである。この変異株を、２００４年７月２８日に、ブダペスト条約の下で、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１として寄託した。
【００３４】
（表４）
（生理学的特性）
【００３５】
【表４】
（実施例６）
（好気性醗酵によるテイコプラニンの産生）
テイコプラニンの産生のために、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、同化可能な炭素源、窒素源、および無機塩源を含む、水性栄養培地中にて好気条件下で醗酵させる。より具体的には、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、実質的な菌糸体増殖が存在するまで、５〜９の範囲のｐＨ値にて、より好ましくはｐＨ７にて、栄養培地中で好気的に前培養する。そのフラスコを、２８〜３４℃にて、より好ましくは３２℃にて、２４〜４８時間振盪し、その後、その前培養物を、最終濃度５〜１０％にてジャー発酵槽に接種するために使用する。上記栄養培地の例として、前培養物は、表５に示されるような以下の組成（ｇ／Ｌ）を有し得る。
【００３６】
（表５）
（前培養培地の組成）
【００３７】
【表５】
Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の醗酵を、以下の通りに実行する。小規模醗酵において、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の前培養物を、表６に列挙される産生培地を含む７Ｌのジャー発酵槽に接種する。
【００３８】
（表６）
（種培養培地の組成）
【００３９】
【表６】
接種物は、３〜１５％の範囲にあり、より好ましくは５％である。醗酵バッチを、９００ｒｐｍにて攪拌しながら、そして３０％より高い空気飽和で曝気を維持しながら、好気条件下でインキュベートする。その温度を、２５〜３７℃にて、より好ましくは３２℃にて、維持する。ｐＨは、醗酵の間に変化するが制御しない。
【００４０】
大規模醗酵（５，０００Ｌ）において、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５の前培養物を、表６に列挙される滅菌培地３００Ｌを含む種発酵槽（５００Ｌ）に接種し、その後、上記の好気条件下で３０℃にて４８時間インキュベートする。
【００４１】
その種培養物（３００Ｌ）を、表７に列挙される産生培地３，０００Ｌを含む主発酵槽（５，０００Ｌ）に接種する。
【００４２】
（表７）
（産生培地の組成）
【００４３】
【表７】
その主醗酵を、水中好気条件下で、攪拌（８０〜１５０ｒｐｍ）および曝気（培地の５０〜２００（ｖ／ｖ）％容量、より好ましくは１５０（ｖ／ｖ）％容量）しながら、実行する。
【００４４】
間隔を空けて、培養ブロスを取り出し、増殖、糖の消費、およびテイコプラニンの濃度について分析する。１０ｍｌの培養ブロスを、５Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ１１に調整し、そして４５０ｇにて１０分間遠心分離する。増殖を、ＰＭＶ（充填菌糸体体積（Ｐａｃｋｅｄ Ｍｙｃｅｌｉａｌ Ｖｏｌｕｍｅ））として測定し、テイコプラニンの濃度を、Ｃ１８逆相カラム、ＵＶ検出器、およびクォータナリ（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）・ポンプを備えるＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって決定する。糖の全量を、フェノール−硫酸法によって決定し、グルコースの濃度を、ＤＮＳ法によって測定する。
【００４５】
５，０００Ｌ規模での醗酵の時間経過が、図２に示される。テイコプラニンの合成は、増殖期が終わって全残留糖が３０ｇ／Ｌ未満になったときに、始まる。グルコースの消費は、対数増殖期の間の３６時間で完了し、その後、デキストリンが、増殖およびテイコプラニンの合成のために消費される。
【００４６】
この培地のｐＨは、増殖期の間にｐＨ６．５まで減少し、その後、抗生物質産生期（図２においてデータは、示されない）の間にｐＨ８．０まで上昇した。この増殖は、４８時間でＰＭＶとして２９％に達し、テイコプラニンの合成は、１４０時間まで多少直線的に継続し、１４０時間で、横ばいになり始める。変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５により産生されるテイコプラニンの最大濃度は、３．２ｇ／Ｌであり、これは、米国特許第４，２３９，７５１号において報告されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ． ＡＴＣＣ−３１１２１によるよりも６４倍多い。
【００４７】
（表８）
（テイコプラニンについての生産性の比較）
【００４８】
【表８】
小規模醗酵（７Ｌ）において、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５は、表８において示されるように、米国特許第４，２３９，７５１号において報告されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ． ＡＴＣＣ−３１１２１による５０ｍｇ／Ｌと比較して、６日間以内で３．０ｇ／Ｌより多いテイコプラニンを産生した。大規模醗酵（５，０００Ｌ）において、本変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５は、いくつかの別個の実験において、２．５ｇ／Ｌ〜３．２ｇ／Ｌのテイコプラニンを再現的に産生した。
【００４９】
テイコプラニンは、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ２−３、Ａ２−４、Ａ２−５と呼ばれる５つの主成分の混合物からなる。すべてのテイコプラニン成分は、分子量が１５６４〜１９０８の範囲である糖ペプチドアナログである。これらは、直鎖状ヘプタペプチドアグリコンならびにＤ−マンノースおよびＤ−グルコサミンによって形成される、同じコア糖ペプチドを有する。上記Ａ２群の５つの成分は、さらなるＮ−アシル−グルコサミンを含み、そして異なるアシル脂肪族側鎖によって区別される。これらのＡ２群成分を、逆相ＨＰＬＣにおける保持時間に従って、親油性が増加する順に、Ａ２−１からＡ２−５へと順位付けし得る（図３）。表９は、テイコプラニンＡ２複合体の組成を示す。
【００５０】
（表９）
（テイコプラニンＡ２複合体の組成）
【００５１】
【表９】
Ａ２群の単一成分群は、異なる生物学的活性を有する。Ａ２−３およびＡ２−４は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対して、それぞれ、Ａ２−１およびＡ２−２の両方よりも２倍高い生物学的活性を有する。
【００５２】
図２および表９に示されるように、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）により産生されるテイコプラニンＡ２複合体はまた、５つの成分を含むが、Ａ２群の組成は、米国特許４，２３９，７５１号において報告されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ． ＡＴＣＣ−３１１２１により産生される組成と異なる。換言すると、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）により産生されるテイコプラニンＡ２複合体中のＡ２−３およびＡ２−４の内容量は、米国特許第４，２３９，７５１号において報告されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｎｏｖ． ｓｐ． ＡＴＣＣ−３１１２１による内容量よりも、２倍および１．４倍多い。このことは、テイコプラニン複合体の生物学的活性の増加をもたらす。
【００５３】
結論として、醗酵の結果、ならびに培養特性および生理学的特性は、本発明の変異株が、先行技術において報告された他のテイコプラニン産生株とは明確に区別されることを、示す。
【００５４】
（発明の要約）
本発明は、新たな単離変異株培養物Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を提供する。この培養物は、以前に報告された微生物（例えば、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕ ｎｏｖ．ｓｐ．ＡＴＣＣ３１１２１）よりも約６０倍を超えて高い生産性でテイコプラニンを産生する能力を有する。本発明はまた、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を、炭素源、窒素源および鉱物塩を含む培養培地中で用いて好気条件でテイコプラニンを産生するための醗酵プロセスを提供する。
【００５５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ、その範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５が比較のための１６ｓ ｒＤＮＡ配列決定によって位置づけられた、系統樹を示す。
【図２】図２は、５０００Ｌ規模で、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を用いた醗酵の時間経過を示す。
【図３】図３は、変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）の培養ブロスのＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託された変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を用いる、テイコプラニンの最大産生のための醗酵方法であって、該方法は、以下の工程：
ｉ）グルコース１５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、デキストリン４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ、ペプトン４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌ、ナタネ粗引き粉１６ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、ダイズ粉１６ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ〜０．６ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３ ４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌ、およびＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ〜１．４ｇ／Ｌを含む産生培地上で、該培地の曝気速度が１分間当たり、１培地容量につき、空気０．５容量〜２．０容量である条件で変異株細胞を醗酵させる工程；
ｉｉ）該変異株細胞および他の残渣を、該醗酵培地から取り除く工程；および
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の該醗酵培地からテイコプラニンを単離および回収する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
醗酵に使用される前記変異株細胞は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）を、グルコース２５ｇ／Ｌ〜３５ｇ／Ｌ、酵母抽出物２．０ｇ／Ｌ〜３．０ｇ／Ｌ、ダイズ粉７．０ｇ／Ｌ〜１１．０ｇ／Ｌ、ナタネ粗引き粉７．０ｇ／Ｌ〜１１．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ〜１．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．０８ｇ／Ｌ〜０．１２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ〜０．６ｇ／ＬおよびＣａＣＯ３ ４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌを含む培地において培養することによって調製される、請求項１に記載の醗酵方法。
【請求項３】
韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託されている、単離されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５。
【請求項１】
韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託された変異株Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５を用いる、テイコプラニンの最大産生のための醗酵方法であって、該方法は、以下の工程：
ｉ）グルコース１５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、デキストリン４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ、ペプトン４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌ、ナタネ粗引き粉１６ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、ダイズ粉１６ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ〜０．６ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３ ４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌ、およびＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ〜１．４ｇ／Ｌを含む産生培地上で、該培地の曝気速度が１分間当たり、１培地容量につき、空気０．５容量〜２．０容量である条件で変異株細胞を醗酵させる工程；
ｉｉ）該変異株細胞および他の残渣を、該醗酵培地から取り除く工程；および
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の該醗酵培地からテイコプラニンを単離および回収する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
醗酵に使用される前記変異株細胞は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５（ＫＣＣＭ−１０６０１）を、グルコース２５ｇ／Ｌ〜３５ｇ／Ｌ、酵母抽出物２．０ｇ／Ｌ〜３．０ｇ／Ｌ、ダイズ粉７．０ｇ／Ｌ〜１１．０ｇ／Ｌ、ナタネ粗引き粉７．０ｇ／Ｌ〜１１．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ〜１．４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．０８ｇ／Ｌ〜０．１２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ〜０．６ｇ／ＬおよびＣａＣＯ３ ４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌを含む培地において培養することによって調製される、請求項１に記載の醗酵方法。
【請求項３】
韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ−１０６０１で寄託されている、単離されたＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＢＮＧ ２３１５。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−１６６７３９（Ｐ２００６−１６６７３９Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３６０６３９（Ｐ２００４−３６０６３９）
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【出願人】（５０４４５８１２７）バイオンジーン カンパニー， リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【出願人】（５０４４５８１２７）バイオンジーン カンパニー， リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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