トバモウイルス抵抗性遺伝子Ｔｍ−１
【課題】 トバモウイルスＴｏＭＶ抵抗性遺伝子Ｔｍ−１様活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【解決手段】 特定のアミノ酸からなるポリペプチドおよび特定の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、Ｔｍ−１様活性を有する。トマト由来の細胞抽出液を用いてＴｏＭＶ ＲＮＡ複製系を構築し、これを用いたアッセイ系を得る。ＴｏＭＶに抵抗性を有する植物体のスクリーニング、そのためのキット、更に該ポリヌクレオチドを導入した植物体の作成、そのためのキットを提供する。
【解決手段】 特定のアミノ酸からなるポリペプチドおよび特定の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、Ｔｍ−１様活性を有する。トマト由来の細胞抽出液を用いてＴｏＭＶ ＲＮＡ複製系を構築し、これを用いたアッセイ系を得る。ＴｏＭＶに抵抗性を有する植物体のスクリーニング、そのためのキット、更に該ポリヌクレオチドを導入した植物体の作成、そのためのキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定された新規遺伝子およびその利用に関するものであり、より詳細には、トマトにおけるＴｍ−１様形質の活性本体であるタンパク質（Ｔｍ−１タンパク質）および該タンパク質をコードする遺伝子（Ｔｍ−１遺伝子）ならびにこれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来からトマトにおけるＴｍ−１形質（本明細書中、以下「Ｔｍ−１様形質」と称する。）は、トマトにおいてトマトモザイクウイルス（トバモウイルス：ＴｏＭＶ、以下適宜「ＴｏＭＶ」と略記する。）の増殖を抑制する半優性遺伝形質として知られている（例えば、非特許文献１、２を参照のこと）。Ｔｍ−１様形質はトマト近縁野生種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）を起源とし、栽培種トマトＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）に広く導入され、ＴｏＭＶ感染による被害の軽減に貢献しているが、Ｔｍ−１様形質の本体である遺伝子（Ｔｍ−１遺伝子）は未だクローニングされておらず、その塩基配列およびアミノ酸配列は同定されていない。
【０００３】
これまでに試みられているＴｍ−１遺伝子の同定手法として、例えば、Ｔｍ−１遺伝子のマッピング解析が行われた。この解析によれば、Ｔｍ−１遺伝子は第２染色体の動原体近くに座乗していると考えられているが、その正確な位置については明らかになっていない（例えば、非特許文献３を参照のこと）。
【０００４】
また、Ｔｍ−１遺伝子は、いわゆる「抵抗性（Ｒ）遺伝子」が示す形質とは異なり、過敏感反応を伴うことなく１細胞内でのＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を抑制するという独特の抵抗性を付与する。このため、Ｔｍ−１遺伝子をポジショナルクローニングにより同定する試みが精力的に行われたが、この遺伝子が動原体およびリボソームＲＮＡコード領域に近接した、組み換え頻度が極度に低い染色領域に座乗するため、Ｔｍ−１様形質の本体である遺伝子と完全に連鎖するマーカーは得られても、遺伝子自体の同定には至らなかった。
【特許文献１】特開２００５−２３７３０２号公報（平成１７年９月８日公開）
【特許文献２】特開２００５−６５６５１号公報（平成１７年３月１７日公開）
【特許文献３】特開２００５−２４５２２９号公報（平成１７年９月１５日公開）
【非特許文献１】Pelham, J., Resistance in Tomato to Tabacco Mosaic virus, Euphytica, 15 (1966): 258-267
【非特許文献２】Buck, kenneth W., Replication of tobacco mosaic virus RNA, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B (1999) 354, 613-627
【非特許文献３】Ohmori, T., Murata, M., Motoyoshi, F., Molecular characterization of RAPD and SCR markers linked to the Tm-1 locus in tomato, Theor Appl Genet (1996) 92: 151-156
【非特許文献４】Komoda, K., Naito, S. and Ishikawa, M. (2004) Replication of plant RNA virus genomes in a cell-free extract of evacuolated plant protoplasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 1863-1867。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
トマトにおいてトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の増殖を抑制する半優性遺伝形質であるＴｍ−１様形質について、従来、Ｔｍ−１様形質の利用は交配可能なトマト近縁種に限られているので、この形質を異種植物に容易に導入することができれば、種々の作物にＴｏＭＶ抵抗性を容易に導入することができる。しかし、Ｔｍ−１様形質の本体である遺伝子は未だ得られていない。
【０００６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｔｍ−１様形質の本体である遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法（特許文献１を参照のこと）を用いた実験系を構築することにより、Ｔｍ−１様形質を有しているトマト由来の細胞抽出液からＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害する活性を測定し得ること、さらにこのＴｏＭＶ ＲＮＡ複製を阻害する活性がＴｏＭＶの増殖を抑制する活性であることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明に係るポリペプチドは、ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって、（ａ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｃ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｄ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または（ｅ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、であることを特徴としている。
【０００８】
本発明に係るポリペプチドは、ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリペプチドのフラグメントであり、かつ、（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位；または（ＩＩ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、を含んでいることを特徴としている。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の部分配列でありかつ配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。
【０００９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００１０】
本発明に係る植物体作製方法は、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するために、上記ポリヌクレオチドを植物体に導入する工程を包含することを特徴としている。
【００１１】
本発明に係る植物体作製キットは、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するために、上記ポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００１２】
本発明に係るスクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記ポリヌクレオチドのフラグメントを目的の植物由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。
【００１３】
本発明に係るスクリーニングキットは、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記ポリヌクレオチドのフラグメントを備えていることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。
【００１５】
本発明に係るスクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
本発明に係るスクリーニングキットは、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記抗体を備えていることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号３０に示される塩基配列またはその相補配列からなることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記オリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することが好ましい。
【００２０】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することが好ましい。
【００２１】
本発明に係る植物体スクリーニングキットは、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記オリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明を用いれば、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製することができる。また、本発明を用いれば、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明者らは、Ｔｍ−１様形質を有しているトマト由来の細胞抽出液からＴｏＭＶ ＲＮＡ複製を阻害する活性（Ｔｍ−１活性）を測定する実験系を構築し、これを用いてＴｍ−１活性を追跡した。その結果、Ｔｍ−１活性に対応する画分に含まれるタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により同定し、対応する遺伝子をクローニングし、本発明を完成するに至った。
【００２６】
〔１：Ｔｍ−１ポリペプチドおよびＴｍ−１ポリヌクレオチド〕
１つの局面において、本発明は、Ｔｍ−１ポリペプチドを提供する。本発明に係るＴｍ−１ポリペプチドは、配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいはこれらの変異体であることが好ましい。
【００２７】
本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドが意図され、「Ｔｍ−１活性」は、ＴｏＭＶの増殖を抑制する活性、好ましくは、ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害する活性が意図される。また、本明細書中で使用される場合、「Ｔｍ−１タンパク質」は「Ｔｍ−１ポリペプチド」と交換可能に使用される。すなわち、Ｔｍ−１タンパク質は、Ｔｍ−１様形質の活性本体であるタンパク質が意図される。
【００２８】
本発明はまた、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドを提供する。本発明に係るＴｍ−１ポリヌクレオチドは、配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体であることが好ましい。本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。また、本明細書中で使用される場合、「Ｔｍ−１遺伝子」は「Ｔｍ−１ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。すなわち、Ｔｍ−１遺伝子は、遺伝形質であるＴｍ−１様形質の本体である。
【００２９】
なお、上述したように、「Ｔｍ−１様形質」は、特定のトマトにおいて見出されたトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の増殖を抑制する半優性遺伝形質が意図される。
【００３０】
本発明者らは、Ｔｍ−１タンパク質が分子量約８０ｋのタンパク質であり、Ｔｍ−１様形質を有していないトマトにおいてもその対照物である分子量約８０ｋのタンパク質が発現していることを見出した。本明細書中で使用される場合、「ｔｍ−１タンパク質」は、Ｔｍ−１様形質を有していないトマトにおいて発現しているｐ８０タンパク質（Ｔｍ−１タンパク質の対照物）が意図され、「ｔｍ−１遺伝子」は「ｔｍ−１ポリヌクレオチド」と交換可能に使用され、ｔｍ−１タンパク質をコードする遺伝子が意図される。本明細書中で使用される場合、「ｐ８０タンパク質」は、Ｔｍ−１タンパク質およびその対照物が意図され、Ｔｍ−１トマト由来のＴｍ−１タンパク質およびｔｍ−１トマト由来のｔｍ−１タンパク質を含むことが意図される。なお、本明細書中で使用される場合、「Ｔｍ−１トマト」は、Ｔｍ−１様形質を有しているトマトが意図され、「ｔｍ−１トマト」はＴｍ−１様形質を有していないトマトが意図される。後述する実施例においては、Ｔｍ−１トマトとしてＧＣＲ２３７系統が用いられ、ｔｍ−１トマトとしてＧＣＲ２３７の準同質遺伝子系統であるＧＣＲ２６が用いられている。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００３２】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００３３】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００３４】
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００３５】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００３６】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１ポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００３７】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００３８】
ポリペプチドを構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００３９】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＴｍ−１活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００４０】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。これらは、本発明に係るポリペプチドのＴｍ−１活性を変化させない。
【００４１】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００４２】
このように、本実施形態に係るＴｍ−１ポリペプチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。
【００４３】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１ポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００４４】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１ポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００４５】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号２、８、１０もしくは１２の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００４８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００５０】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００５１】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体はＴｍ−１ポリペプチドをコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれであることが好ましい：
・配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
・配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５２】
このように、本発明に係るＴｍ−１ポリヌクレオチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下のいずれかであることが好ましい：（１）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；（２）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、（３）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００５４】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。下述する実施例においては、トマトを用いているが、これに限定されない。
【００５５】
このように、本実施形態に係るＴｍ−１ポリペプチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、以下のいずれかであることが好ましい：（１）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（２）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチド；または、（３）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチド。
【００５６】
さらなる局面において、本発明は、Ｔｍ−１ポリペプチドのフラグメントを提供する。本発明者らは、Ｔｍ−１ポリペプチドの種々のＣ末端欠失変異体を作製し、該Ｃ末端欠失変異体が、少なくとも配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位を含んでいればＴｍ−１活性を有していることを見出した。
【００５７】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位を含むポリペプチドまたはその変異体であることが好ましい。本実施形態において、上記変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであればよく、例えば、配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であってもよい。好ましい局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであれば、配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。
【００５８】
上述したように、本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチド（すなわち、ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチド）が意図され、「配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体」は、ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって、配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが意図される。
【００５９】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号４０に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはその変異体によってコードされるポリペプチドであることを特徴とすることが好ましい。上記変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよく、例えば、配列番号３９または４０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの変異体によってコードされるポリペプチドであってもよい。好ましい局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであれば、配列番号３９または４０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであり得る。
【００６０】
上述したように、本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図され、「配列番号３９または４０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの変異体」は、配列番号３９または４０に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、配列番号３９もしくは４０に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであることが意図される。
【００６１】
なお、本明細書を読んだ当業者は、上記Ｔｍ−１ポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内に含まれることを、容易に理解する。
【００６２】
本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するために使用され得る。また、本発明を使用すれば、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために適用することができる。
【００６３】
本発明の目的は、Ｔｍ−１ポリペプチドおよびＴｍ−１ポリヌクレオチド、ならびにＴｍ−１ポリペプチドのフラグメントでありかつＴｍ−１活性を有するポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法およびポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得されるＴｍ−１ポリペプチド、およびＴｍ−１ポリヌクレオチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００６４】
〔２：Ｔｍ−１ポリペプチドの生産方法〕
本発明は、Ｔｍ−１ポリペプチドを生産する方法を提供する。一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、Ｔｍ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。
【００６５】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが無細胞タンパク質合成系において用いられることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【００６６】
無細胞タンパク質合成系は細胞内ｍＲＮＡやクローニングされたｃＤＮＡにコードされているさまざまなタンパク質の同定等に広く用いられる手法であり、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。
【００６７】
無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。
【００６８】
なお、種々のウイルス由来遺伝子産物は、その翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を経て活性を発現するものが多いので、各種生化学反応を試験管内で再現するためには細胞内膜成分（例えば、ミクロソーム膜）が添加される必要がある。特許文献２に記載されるような植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液は、細胞内膜成分を保持した無細胞タンパク質合成液として利用し得るのでミクロソーム膜の添加が必要とされないので、好ましい。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「細胞内膜成分」は、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官（すなわち、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞内顆粒全般）が意図される。特に、小胞体およびゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質および分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。
【００７０】
本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが組換え発現系において用いられることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られるＴｍ−１ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【００７１】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【００７２】
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、Ｔｍ−１ポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００７３】
別の実施形態において、Ｔｍ−１ポリペプチドの生産方法は、Ｔｍ−１ポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、後述する抗体またはオリゴヌクレオチドを用いてＴｍ−１ポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、Ｔｍ−１ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【００７４】
さらに他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。
【００７５】
以上のように、本発明に係るポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。
【００７６】
変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。
【００７７】
このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、Ｔｍ−１ポリペプチドのアミノ酸配列、またはＴｍ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
【００７８】
つまり、本発明の目的は、Ｔｍ−１ポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００７９】
なお、Ｔｍ−１ポリペプチドの変異体が所望のＴｍ−１活性を有するか否かを決定するための方法としては、無細胞タンパク質合成系が好ましい。下述する無細胞タンパク質合成系にウイルスＲＮＡを添加することにより、ウイルスＲＮＡを翻訳して複製に必須なウイルスタンパク質を合成させることができる。この系を、本明細書中「インビトロ複製系」と称する。
【００８０】
実施例において後述するように、野生型ＴｏＭＶおよびＴ１（Ｔｍ−１トマトにおいて増殖可能なＴｏＭＶ変異株）のインビトロ複製系に、Ｔｍ−１トマトから得た脱液胞化プロトプラスト細胞抽出液を添加すると、野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡ複製は阻害されたが、Ｔ１のＲＮＡの複製は阻害されなかった。この知見に基づいて、本発明者らは、インビトロ複製系における野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害する活性を指標にＴｍ−１トマトから得た脱液胞化プロトプラスト細胞抽出液からＴｍ−１ポリペプチドを精製している。
【００８１】
作製したＴｍ−１ポリペプチドとともに野生型ＴｏＭＶのインビトロ複製系の反応を行い、野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を検出すれば、Ｔｍ−１タンパク質の変異体でありかつＴｍ−１活性を有するポリペプチドを容易に選択することができる。
【００８２】
〔３：Ｔｍ−１ポリペプチドおよびＴｍ−１ポリヌクレオチドの利用〕
〔３−１：ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体の作製〕
本発明は、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するための方法を提供する。本発明に係る植物体の作製方法は、上述したＴｍ−１ポリヌクレオチドを植物体内に発現可能に導入する工程を包含していればよい。一実施形態において、本発明に係る方法に従ってＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体は、植物形質転換体であり得、本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
【００８３】
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
【００８４】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【００８５】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられ、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法とに大別される。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクター（例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、およびｐＰＺＰ２０２など）が使用され得る。
【００８６】
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００８７】
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。選択マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性に限定されず、例えば、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールなどに対する薬剤耐性が挙げられる。
【００８８】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法などによって組換えベクターが培養細胞に導入されて形質転換される。形質転換の結果として得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【００８９】
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００９０】
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
【００９１】
本発明に係る方法によって作製されたＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体は、特に限定されず、ＴｏＭＶ抵抗性が付与されたことによりその有用性を有し得る植物が挙げられる。このような植物としては、被子植物でも裸子植物でもよい。また、被子植物としては、単子葉植物でも双子葉植物でもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。
【００９２】
本発明はまた、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するためのキットを提供する。本発明に係る植物体の作製キットは、上述したＴｍ−１ポリヌクレオチドを植物体内に発現可能な形態で備えていればよく、一実施形態において、本発明に係るキットを用いてＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体は、植物形質転換体であり得、本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
【００９３】
なお、本発明に係る植物体作製キットは、Ｔｍ−１ポリヌクレオチド以外に、上述した植物体作製方法を実行するために必要とされる試薬などを備えていることが好ましい。すなわち、本明細書を読んだ当業者は、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するためのキットの構成品が、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製する方法において用いられるものであることを容易に理解する。
【００９４】
〔３−２：ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体のスクリーニング〕
本発明は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするための方法を提供する。本発明に係る植物体のスクリーニング方法は、植物体内で発現されているＴｍ−１ポリヌクレオチドを検出する工程を包含していればよい。一実施形態において、本発明に係る方法に従ってスクリーニングされた植物体は、天然であっても形質転換体であってもよい。
【００９５】
本発明は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。
【００９６】
本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドを発現する植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個または数百個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マー（３０塩基、３０ヌクレオチドともいわれる。）または１００マー（１００塩基、１００ヌクレオチドともいわれる。）というように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００９８】
本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドは、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを得るためのＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。上記オリゴヌクレオチドはまた、以下のような用途に使用され得る：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＴｍ−１遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）Ｔｍ−１遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるＴｍ−１ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００９９】
なお、当業者は、上述した用途がいずれも、本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドと目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）との間で生じるハイブリダイゼーションに起因しており、当該オリゴヌクレオチドが、目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）とハイブリダイズさせるために用いられることを容易に理解する。
【０１００】
本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも７ｎｔ（ヌクレオチド）、１０ｎｔ、１２ｎｔ、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図されるが、当業者は、上述した用途に応じて好ましい長さを適宜設定し得る。「少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメント」によって、例えば、配列番号２に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基配列またはその相補配列を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号２に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号２に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【０１０１】
本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。上記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。上記オリゴヌクレオチドを導入することによって、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドの含量を低下させ得、その結果、植物中のＴｍ−１様形質を制御することができる。
【０１０２】
このように、本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドを、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドを発現する植物体または組織を容易に検出（スクリーニング）することができる。さらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、植物体またはその組織もしくは細胞におけるＴｍ−１活性を有するポリペプチドの発現を制御することができる。さらに、本発明に係るスクリーニング方法を用いれば、ｐ８０タンパク質における多型を容易に検出することができる。
【０１０３】
〔３−３：抗体〕
本発明は、ｐ８０タンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。本発明に係る抗体は、ｐ８０タンパク質と特異的に結合し得るものであれば限定されず、ｐ８０タンパク質に対するポリクローナル抗体等でもよいが、ｐ８０タンパク質に対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０５】
上述したように、ｐ８０タンパク質には、Ｔｍ−１ポリペプチドおよびｔｍ−１ポリペプチドが包含される。一実施形態において、本発明に係る抗体は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する」は、ｐ８０タンパク質のＴｍ−１ポリペプチドと特異的に結合するが、ｔｍ−１ポリペプチドとは結合しないことが意図される。よって、本発明を用いれば、Ｔｍ−１様形質を有する植物体を容易にスクリーニングすることができる。すなわち、本発明に係る抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含するスクリーニング方法、および、本発明に係る抗体を備えているスクリーニングキットもまた、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするための本発明の範囲に含まれることが容易に理解されるべきである。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０１０７】
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従えば作製され得る。
【０１０８】
モノクローナル抗体は、以下のような方法を用いれば作製され得る。すなわち、Ｔｍ−１ポリペプチドもしくはそのフラグメントまたはその他の誘導体あるいはこれらのアナログ、あるいはこれらを発現する細胞を免疫原として用いてマウス脾臓リンパ球を免疫し、免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマによりモノクローナル抗体を産生させる。モノクローナル抗体を取得するために必要な技術は当該分野において公知である（例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））などを参照のこと）。
【０１０９】
ペプチド抗体は、当該分野に公知の方法によって作製され得る。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
【０１１０】
さらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体に結合する能力がＴｍ−１ポリペプチドまたはそのフラグメントからなる抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるＴｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【０１１１】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントが、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることは、当業者には明白である。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生され得る。あるいは、Ｔｍ−１ポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。
【０１１２】
このように、本実施形態に係る抗体は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合するフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよく、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１１３】
つまり、本発明の目的は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１１４】
〔４：Ｔｍ−１様形質の選別〕
Ｔｍ−１ポリヌクレオチドの利用の１つの局面として、上記３−２項において、ｐ８０コード領域からなるポリヌクレオチド（すなわち、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドまたはｔｍ−１ポリヌクレオチド）を用いた、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体のスクリーニングを説明したが、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体のスクリーニングに好適なポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、ｐ８０コード領域以外の塩基配列からなってもよい。
【０１１５】
Ｔｍ−１ゲノム配列（配列番号３）およびｔｍ−１ゲノム配列（配列番号６）から明らかなように、ｐ８０ゲノム配列は多型を有している。よって、ｐ８０タンパク質を発現するか否かにとらわれることなく、目的の植物がＴｍ−１ゲノム配列を有しているか否かを選別（スクリーニング）することができる。好ましくは、本発明において、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号３０に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを用い得る。
【０１１６】
本発明は、上記オリゴヌクレオチドを利用してＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記オリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。本実施形態に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することが好ましく、配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することがより好ましい。
【０１１７】
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドを利用してＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするためのキットを提供する。一実施形態において、本発明に係る植物体スクリーニングキットは、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記オリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本実施形態に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることが好ましく、配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることがより好ましい。
【０１１８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１９】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１２０】
タバコＢＹ−２培養細胞由来の脱液胞化プロトプラスト抽出液（ＢＹＬ）を用いてＴｏＭＶ ＲＮＡ（野生型またはＴ１（Ｔｍ−１トマトにおいて増殖可能なＴｏＭＶ変異株））のインビトロ複製系を構築し、これらのインビトロ複製系の反応液にＲＮＡ合成基質を加えてインビトロでＴｏＭＶ ＲＮＡを複製させた。続いて、特許文献３に従って、Ｔｍ−１様形質を有しているトマト（Ｔｍ−１トマト）から得た脱液胞化プロトプラスト細胞抽出液を、上記インビトロ複製系に添加すると、野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製は阻害されたが、Ｔ１ ＲＮＡの複製は阻害されなかった。以下、野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製と変異株Ｔ１ ＲＮＡの複製とを比較することによりＴｍ−１活性の有無を判定した。
【０１２１】
〔１：インビトロでのＴｍ−１活性測定系の確立〕
脱イオン水で４回予め洗浄した限外ろ過ユニット（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ５００，ＭＷＣＯ １０，０００，ＰＥＳ：ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて、Ｔｍ−１活性精製画分（０．３〜２ｍｌ）を５０μｌに濃縮した。濃縮サンプルに対して、５００μｌのＴＲバッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ７．４）、８０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭ ＤＴＴ）によるバッファー置換を３回行った。濃縮および脱塩を行った画分２０μｌを、２５μｌのＢＹＬ、０．５μｌの４０ｕ／μｌ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１μｌの１０ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、５μｌの１０×基質混合液と混合して１００ｎｇのＴｏＭＶ ＲＮＡまたはＴ１ ＲＮＡを添加して２３℃で１時間反応させた。さらに、ＲＮＡ複製反応を２３℃で１時間行った。この際、５×Ｒバッファー（非特許文献４を参照のこと）に１５０ｍＭのクレアチンリン酸を加えた。複製したＴｏＭＶおよびＴ１のゲノムＲＮＡをＢＡＳ１０００、ＢＡＳ２５００（いずれもＦｕｊｉ）またはＩｍａｇｅＪ１５を用いて定量し、その比をＴｍ−１活性の指標とした。
【０１２２】
〔２：Ｔｍ−１活性の精製〕
Ｔｍ−１トマト培養細胞プロトプラスト抽出液を出発材料として、以下の手順に従ってＴｍ−１活性を精製した。
【０１２３】
継代後７日目のトマト培養細胞懸濁液１０〜１５ｍｌを、７５ｍｌのＮＤＺ培地（特許文献３を参照のこと）に移し、３日間培養した後にプロトプラストを調製した。これをｐａｃｋｅｄ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅの４倍量の破砕バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ））を添加した後、ダウンス型ホモジェナイザーを用いて破砕した。この破砕液を遠心分離（８００×ｇ）し、得られた上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８Ｔｉを用いて１００，０００×ｇでさらに３０分間遠心分離した。最終的に得られた上清をＳ１００画分とした。必要に応じて、Ｓ１００画分を−８０℃で凍結保存した。
【０１２４】
１００ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＡＮＸ ＦＦカラム（カラム容積５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を２個直列に連結した。このカラムに１８ｍｌのＳ１００画分をアプライし、２５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡ（６０ｍｌ）で洗浄した後、３００ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡで溶出した画分（１０ｍｌ）を回収した（ＡＮＸ０．３画分）。必要に応じて、ＡＮＸ０．３画分を−８０℃で凍結保存した。ＡＮＸ０．３画分（８０ｍｌ）に４０％飽和硫酸アンモニウムを添加した後、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。沈殿を、２ｍｌのバッファーＧ（１０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、３００μｌずつ７回に分けてアプライした。アプライ後、バッファーＧ（サンプル体積を含む）を８．７〜１０．７ｍｌ流した画分（２ｍｌ）を回収した。この画分（１４ｍｌ）を、５６ｍｌのバッファーＣ（１０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で希釈し、バッファーＣで平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ２−Ｉ）にアプライした。１０ｍｌのバッファーＣでカラムを洗浄した後、直線濃度勾配（１０〜３００ｍＭ、１２ｍｌ）のリン酸カリウムを含むバッファーＣで溶出し、Ｔｍ−１活性を示した画分（２ｍｌ）を回収した。この画分を５００μｌずつ分割し、ＳＷ４０Ｔｉ用の遠心チューブに形成した１０ｍｌの１０〜４０％グリセロール密度勾配（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０〜４０％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の上に重層して、４０，０００ｒｐｍにて４℃で１６時間遠心分離した（ＳＷ４０Ｔｉ；Ｂｅｃｋｍａｎ）。上層から１ｍｌずつ回収し、５番目および６番目の画分を活性画分として回収した（８ｍｌ）。この画分を１０ｍｌのバッファーＭ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で希釈し、バッファーＭで平衡化した陰イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライした。１０ｍｌのバッファーＭでカラムを洗浄した後、直線濃度勾配（２００〜３５０ｍＭ、１０ｍｌ）のＮａＣｌを含むバッファーＣで溶出した。溶出液を、溶出開始から１ｍｌずつ回収した。５番目〜９番目の画分のＴｍ−１活性を測定し、各画分に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）によって検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ビス−トリスゲル，ＭＯＰＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、銀染色には銀染色ＭＳキット（和光純薬）を付属のプロトコルに従って使用した。
【０１２５】
図１に最終精製段階であるＭｏｎｏ Ｑカラムクロマトグラフィーの第５〜９画分に含まれているタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色パターン、ならびにＴｍ−１活性の測定結果を示す。図１（Ａ）は、上述した精製過程の最終段階であるＭｏｎｏ Ｑカラムの２００〜３５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分（第５〜９画分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後に銀染色してタンパク質のバンドを検出した結果を示す図である。矢印は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に供したｐ８０のバンドを示す。図１（Ｂ）は、Ｍｏｎｏ Ｑカラムの２００〜３５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分（第５〜９画分）を、インビトロＴｏＭＶ ＲＮＡ翻訳・複製系に加えて反応させた結果を示す図である。上のパネルに［３２Ｐ］標識された合成産物ＲＮＡのパターンを、下のパネルにゲノムＲＮＡへの［３２Ｐ］の取り込みを定量し、Ｉ／Ｔ１の比をとったグラフを示す。〔Ｉ〕はＴｍ−１超感受性ＴｏＭＶ変異株、〔Ｔ１〕はＴｍ−１非感受性ＴｏＭＶ変異株を示す。
【０１２６】
〔３：Ｔｍ−１遺伝子の同定〕
Ｔｍ−１活性と同様の溶出パターンを示した分子量約８０ｋのバンド（ｐ８０；図１ａ中の矢印）をゲルから切り出して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した（株式会社アプロサイエンスによる受託解析を利用）。得られたペプチドには、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）のＥＳＴ「ｇｉ｜３０１３６９４２」に対応する遺伝子産物由来のペプチドと分子量が一致するものが存在した。また別のペプチドはジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のＥＳＴ「ｇｉ｜４２５１０９１３」に対応する遺伝子産物由来のペプチドの分子量と一致した。
【０１２７】
この２つのＥＳＴはこれまでに同定された遺伝子には帰属しなかったが、それぞれに対するＢＬＡＳＴサーチによってシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の遺伝子（Ａｔ５ｇ６６４２０）の異なる領域と相同性を示すことがわかった。そこで、シロイヌナズナおよびジャガイモの配列間で相同な部分に従って、プライマー（５’−ｃｃｃｔｔｔｇｃｔｇａｔｇｃａａａｔｇｃｔａｔｔｇ−３’（配列番号１９）、５’−ｔａａｔａｇｇｇｃｃｔｃｃａｔｇｇｃａｇａｇｃａｃ−３’（配列番号２０））を設計し、Ｔｍ−１様形質を有しているトマト（Ｔｍ−１トマト）であるＧＣＲ２３７、およびＧＣＲ２３７の準同質遺伝子系統でありかつＴｍ−１様形質を有していないトマトであるｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６）からＲＴ−ＰＣＲ法によって約０．５ｋｂｐのｃＤＮＡ部分断片を単離した。ＲＴ−ＰＣＲはＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を付属のプロトコルに従って使用した。この部分断片の塩基配列を決定し、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法により全長ｃＤＮＡを得た。ここで得られたアミノ酸配列より、これをトリプシン消化した際のペプチドの分子量を予測したところ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析において既知配列と有意な分子量相同性を示さなかったペプチドをさらに３つ同定し得た。
【０１２８】
Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ （Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）の種子（アクセッションＰＩ１２６４４５、ＰＩ２５１３０３、ＰＩ２４７０８７、ＰＩ３９０６６１、ＰＩ３９０６６３、ＰＩ３９０５１５）を、ＵＳＤＡ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ ＰＩ Ｓｔａｔｉｏｎより得た。各アクセッションのＴｏＭＶ抵抗性について、ＴｏＭＶ接種後７〜１０日後の接種葉における外被タンパク質の蓄積を調べた。各アクセッションの全ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲ（プライマー；５’−ｔｃｃａｔｔｔｔｇａａａｔｃｔｃｇａｔｔｇｔａａｃａ−３’（配列番号２１）、５’−ｔａａａｇａａａｇａｇｇｔｇａａｇａｃｃａｔａｃａ−３’（配列番号２２））を行い、得られた約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列をシークエンス解析することにより、各アクセッションのトマトｐ８０遺伝子の配列を決定した。
【０１２９】
ＧＣＲ２３７由来のＴｍ−１遺伝子（Ｔｍ−１）およびＧＣＲ２６由来のＴｍ−１遺伝子（ｔｍ−１）のゲノムＤＮＡの配列決定には、プライマー（５’−ａｔｃｔｔｃｔｃａｃｃａｔｔｃｔｃａｃａｃｔｇａｇ−３’（配列番号２３），５’−ａｃｃａｔａｃａｔａｔａｇｇｔｔｃｇｇａｃａｔｔｔ−３’（配列番号２４））を使用し、ＧＣＲ２３７およびＧＣＲ２６のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって得た約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に対してシークエンス解析を行った。
【０１３０】
図２に、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７：２３７ ｐｒｊ）およびｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６：２６ ｐｒｊ）に由来するｐ８０タンパク質のアミノ酸配列の比較を示す。ｐ８０は７５４アミノ酸からなるポリペプチドであり、このｐ８０タンパク質のＮ末端側には、多くのタンパク質と相同性を有する、機能未知の領域が存在した。また、Ｃ末端側には多くの酵素にみられるＴＩＭ ｂａｒｒｅｌ構造をとり得る領域が見出された（図３）。
【０１３１】
ｐ８０タンパク質と類似するポリペプチドをコードする遺伝子が、多くの植物（シロイヌナズナなど）において見出された。ｐ８０タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡを、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７）、ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６）、および６つのアクセッションのＬ．ｈｉｒｕｓｕｔｕｍから単離し、これらの塩基配列を決定した。これらの塩基配列を比較した結果、ＧＣＲ２３７の配列は、ＧＣＲ２６の配列とは異なり、Ｔｍ−１様形質が由来したと考えられているＬ．ｈｉｒｕｓｕｔｕｍ ＰＩ１２６４４５の配列と同一であることがわかった。
【０１３２】
図４に、トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍおよびＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）のｐ８０アミノ酸配列比較を示す。系統樹を、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｃｌｕｓｔａｌｗ−ｊ．ｈｔｍｌ）により作成した。野生型ＴｏＭＶの増殖が阻害されたＬ．ｈｉｒｕｓｕｔｕｍ ＰＩ２５１３０３およびＰＩ２４７０８７の配列は、ＰＩ１２６４４５の配列に類似し、野生型ＴｏＭＶの増殖が阻害されなかったＬ．ｈｉｒｕｓｕｔｕｍ ＰＩ３９０６６１、ＰＩ３９０５１５およびＰＩ３９０６６３の配列は、ＰＩ１２６４４５の配列と大きく異なっていた（図４）。この遺伝子は、９個のエキソンからなり、ＧＣＲ２３７とＧＣＲ２６との間で多くの塩基配列多型が見出された。
【０１３３】
なお、ＧＣＲ２３７、ＧＣＲ２６、アクセッションＰＩ１２６４４５、ＰＩ２５１３０３、ＰＩ２４７０８７、ＰＩ３９０６６１、ＰＩ３９０６６３およびＰＩ３９０５１５に由来するｐ８０タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１、４、７、９、１１、１３、１５、１７に示し、それぞれをコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号２、５、８、１０、１２、１４、１６、１８に示した。なお、ＧＣＲ２３７由来のＴｍ−１遺伝子のゲノム配列およびＧＣＲ２６由来のｔｍ−１遺伝子のゲノム配列を、それぞれ配列番号３および６に示した。
【０１３４】
〔４：インビトロ翻訳で合成したＴｍ−１遺伝子産物によるインビトロＴｏＭＶ ＲＮＡ複製阻害〕
Ｔｍ−１ ｃＤＮＡおよびｔｍ−１ ｃＤＮＡをクローニングするために、ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）をベクターとして用いた。ＰＣＲのプライマー（５’−ｇｇａｃｇｔｃｇｃｔａｇｃｔｃｃａｔｔｔｔｇａａａｔｃｔｃｇａｔｔｇｔ−３’（配列番号２５），５’−ｇｇａｇｃｔｃａｃｃａｔａｃａｔａｔａｇｇｔｔｃｇｇａｃａｔｔｔ−３’（配列番号２６））を用いて増幅したＤＮＡをＡａｔII、ＳａｃIで切断し、同酵素で切断したｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）ベクターにクローニングした。下線部は、ＡａｔIIおよびＳａｃIの制限酵素部位を示す。このプラスミドを鋳型にして、Ｔ７プロモーター（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｇａ−３’（配列番号２７））と３’−ＵＴＲに相当するプライマー（５’−ｇｇａｇｃｔｃａｃｃａｔａｃａｔａｔａｇｇｔｔｃｇｇａｃａｔｔｔ−３’（配列番号２８））を用いてＰＣＲを行い、直鎖状ＤＮＡを得た。これを鋳型にしてインビトロ転写反応を行い、対応するｍＲＮＡを得た。インビトロ転写反応には、ＡｍｐｌｉＣａｐTM Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｋｅｒ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を付属のプロトコルに従って使用した。得られたｍＲＮＡ ５００ｆｍｏｌとＴｏＭＶまたはＴ１のＲＮＡ ２５ｆｍｏｌとを混合し、ＢＹＬを３０，０００×ｇで遠心分離して得た上清を用いて１５μｌの系にて翻訳した。翻訳反応を、Ｔｍ−１活性の測定と同様に行った。翻訳後のサンプルを、ＢＹＬを３０，０００×ｇで遠心分離して得た沈殿（元のＢＹＬの３倍濃度になるようにＴＲバッファーに懸濁した）５μｌと混合し、１５℃で１時間インキュベートした。この反応液を用いてインビトロＴｏＭＶ ＲＮＡ複製反応を行い、［３２Ｐ］標識されたＲＮＡ産物を検出した。
【０１３５】
その結果、ＴｏＭＶ ＲＮＡのインビトロ複製系に、ＧＣＲ２３７由来のｐ８０ ｃＤＮＡの翻訳産物を加えたときにのみＴｏＭＶ複製阻害が観察された（図５）。このことは、ｐ８０をコードする遺伝子がＴｍ−１遺伝子であること、およびＴｍ−１タンパク質がトマト以外の植物においてもＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害し得ることを示す。なお、図５に、［３２Ｐ］標識されたゲノムＲＮＡ（アスタリスク）および複製型ＲＮＡ（矢印）を示す。また、図５中、ｐ８０ ｍＲＮＡを添加しなかったコントロールを「−」で示し、Ｔｍ−１感受性の野生型ＴｏＭＶおよびＴｍ−１非感受性のＴｏＭＶ変異株を、「Ｌ」または「Ｔ１」で示した。
【０１３６】
以上のように、タバコの細胞抽出液をベースにしたインビトロＴｏＭＶ ＲＮＡ複製系においてＴｍ−１活性が機能した。このことから、Ｔｍ−１遺伝子を発現させることにより、トマトのみならず幅広い植物種にＴｏＭＶ抵抗性を付与することができると考えられる。
【０１３７】
〔５：ＳＣＡＲマーカー〕
ｐ８０に関連する遺伝子（ｐ８０コード領域およびｐ８０非コード領域を含む。）における多型を調べればＴｍ−１様形質の有無を容易に判定することができると考えられるので、ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎ（ＳＣＡＲ）マーカーを作製し、その有効性を検証した。
【０１３８】
ＧＣＲ２３７とＧＣＲ２６とのＦ２世代の種子（２３個体）を播種し、長日条件下（１６時間明期（２４℃））で生育させた。２週間後、第１本葉または第２本葉にＴｏＭＶ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を機械的に接種した。同一条件下で６日間培養した後、ＴｏＭＶを接種した葉を回収した。回収した葉を、４倍容の抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ）中にて破砕し、１５，０００×ｇにて５分間遠心分離した。得られた上清２．５μｌを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、分離ゲルをＣＢＢ染色した結果を図６（Ａ）に示す。図中、Ｍはプレシジョンｐｌｕｓプロテインスタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を示す。また、上清１３０μｌからイソプロパノールによって沈殿させたゲノムＤＮＡを、１００μｌのＴＥバッファーに懸濁した。
【０１３９】
ＧＣＲ２３７およびＧＣＲ２６のｐ８０ゲノム配列（それぞれ配列番号３および６）に基づいてＳＣＡＲマーカーを作製した。具体的には、ＧＣＲ２３７およびＧＣＲ２６のｐ８０ゲノム配列（イントロン部分）に共通する塩基配列（５’−ｃｃａｃｔｇｔａｔｇａｔｔｔｃｔｇｃｔａｇｔｇａａ−３’（配列番号２９））からなるオリゴヌクレオチド、ＧＣＲ２３７のｐ８０ゲノム配列（イントロン部分）にのみ存在する塩基配列の相補配列（５’−ｇａｇｃｔｔｔａａｃａａａｔａｔａａｇａａｔａａａｇａｃ−３’（配列番号３０））からなるオリゴヌクレオチド、およびＧＣＲ２６のｐ８０ゲノム配列（イントロン部分）にのみ存在する塩基配列の相補配列（５’−ｇｃａａｇｃｔａａｇｇｔｔｔａｃａｔａｔａｔｇｃｃ−３’（配列番号３１））からなるオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチド各０．２μＭを混合したものをプライマーとして用いて、上記ゲノムＤＮＡ懸濁液１μｌをテンプレートにしたＰＣＲを、６０℃のアニーリング温度にて行った。ＰＣＲ用の酵素として、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲ産物５μｌを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１，ＴａＫａＲａ）にて分離し、エチジウムブロミドによって染色した図を図６（Ｂ）に示す。図中、Ｍは、１００ｂｐ ＤＮＡラダー（ＮＥＢ）を示す。
【０１４０】
Ｆ２世代（２３個体）のＴｏＭＶ感受性を顕著に示した個体において、ＴｏＭＶ外被タンパク質（ＴｏＭＶ ＣＰ）の蓄積が観察された（図６（Ａ）中、レーン１、５、９、１３）。また、ＴｏＭＶ感受性を顕著に示す個体においては、ＧＣＲ２３７に由来する１２１ｂｐのＤＮＡフラグメントが増幅されなかった（図６（Ｂ））。これらの結果より、上記ＳＣＡＲマーカーは、植物体におけるＴｍ−１様形質の有無を判別するためのマーカーとして有用であることがわかった。なお、ヘテロの個体のいくつかは、低レベルのＴｏＭＶ増殖が生じたが、これはＴｍ−１様形質が半優性であるからである（Ｆｒａｓｅｒ ａｎｄ Ｌｏｕｇｈｌｉｎ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４８：８７−９６（１９８０）を参照のこと）。
【０１４１】
〔６：Ｔｍ−１遺伝子を発現するタバコに対するＴｏＭＶ感染〕
ＴｏＭＶ感受性であるタバコＢＹ−２細胞に、ＦＬＡＧタグを融合したＧＣＲ２３７由来のｐ８０タンパク質を構成的に発現させた。具体的には、ＧＣＲ２３７由来のＴｍ−１遺伝子の終止コドンを「ＣＴＣ」に置換してＳａｃＩ部位を導入し、ＳａｃＩ部位の下流にＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド（ｇｇａｇｇｔｇａｔｔａｔａａｇｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔａａｇａａｃｔｇｇｔｃａｃａｔｃｃｔｃａａｔｔｔｇａａａａｇｔｇａ（配列番号３２））を付加したＤＮＡを、バイナリーベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。Ｈａｇｉｗａｒａら（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２２，２：３４４−３５３（２００３））の方法に従って、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ １０５株を用いて、ＢＹ−２細胞を形質転換した。カナマイシン耐性を示したカルスを破砕し，抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングによってｐ８０−ＦＬＡＧが発現している細胞（２ライン）を得た。これらの細胞から調製したプロトプラストに、エレクトロポレーションによってＴｏＭＶ ＲＮＡまたはＴ１ ＲＮＡを感染させた（Ｗａｔａｎａｂｅら（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，２１９：６５−６９（１９８７）を参照のこと）。２４時間培養した後、回収したプロトプラストの全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ゲルをＣＢＢ染色した結果を図７に示す。図中、ＮＴは、非形質転換ＢＹ−２細胞由来のプロトプラストタンパク質を示し、Ｍｏは、Ｍｏｃｋ感染した細胞由来のプロトプラストタンパク質を示し、Ｌは、野生型ＴｏＭＶ−Ｌ感染の細胞由来のプロトプラストタンパク質を示し、Ｔ１は、Ｔｍ−１トマトにおいて増殖可能なＴｏＭＶ変異株（Ｔ１）感染の細胞由来のプロトプラストタンパク質を示す。
【０１４２】
図７に示すように、ｐ８０−ＦＬＡＧ発現細胞ではＴｏＭＶ外被タンパク質（ＴｏＭＶ ＣＰ）は検出されなかった。なお、ＴｏＭＶ変異株（Ｔ１）の増殖が許容されたことから、この抵抗性はＴｍ−１遺伝子によるＴｏＭＶ特異的なものと考えられた。この結果より、ｐ８０ ｃＤＮＡを発現する植物が、１細胞レベルでＴｏＭＶ抵抗性を示すこと、異種植物（タバコ）細胞でもその抵抗性は有効であることが明らかになった。
【０１４３】
〔７：Ｔｍ−１タンパク質の欠失変異体におけるＴｍ−１活性〕
上述したｐ８０ ｃＤＮＡと同様の方法に従ってＴｍ−１タンパク質（配列番号１）のアミノ酸第４６〜２６３位を欠く可変スプライシング産物（ｐ８０Ｓｈｏｒｔ）をクローニングし、そのｍＲＮＡを調製した。Ｔｍ−１タンパク質のＣ末端欠失変異体（Ｌ４９０Ｓｔｏｐ（配列番号３３）およびＣ２８４Ｓｔｏｐ（配列番号３４））のｃＤＮＡを以下のように作製した：Ｔ７プロモータの下流にｐ８０ ｃＤＮＡを有するプラスミドをテンプレートにＴ７プライマー（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｇａ−３’：配列番号３５）と塩基置換プライマー（５’−ｇｃｃｃｔｔａｃｔｔａｔｔｔｇａｔｃｔｔｔｃｔａｔｔｔｃｔ−３’ ：配列番号３６）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をテンプレートにしたインビトロ転写反応によりＬ４９０ＳｔｏｐのｍＲＮＡを調製し、塩基置換プライマー（５’−ａｔｃｇｇｇａａｃｔａｔｃｔｃａｔｇｃｃａｔｔａｃ−３’ ：配列番号３７）を用いて同様にＣ２８４ＳｔｏｐのｍＲＮＡを調製した。これらのｍＲＮＡをインビトロでのＴｍ−１活性測定系（ＴｏＭＶまたはＴ１）に供し、サンプルを２．４％ＰＡＧＥにて分離した後にオートラジオグラフィーにてバンドを検出することにより、Ｔｍ−１タンパク質の各欠失変異体におけるＴｍ−１活性の有無を調べた。図８にＴｍ−１タンパク質全長（ｐ８０）、ｐ８０Ｓｈｏｒｔ、Ｌ４９０ＳｔｏｐおよびＣ２８４Ｓｔｏｐの構造概略図を示し、図９に、それぞれのＴｍ−１活性を示す。
【０１４４】
図９に示すように、ｐ８０タンパク質の可変スプライシング産物はＴｍ−１活性を有していないが、ｐ８０タンパク質は少なくとも１〜２８３位のアミノ酸を有していればＴｍ−１活性を保持していることがわかった。
【０１４５】
本発明のＴｍ−１遺伝子はｐ８０タンパク質をコードし、いかなる既知抵抗性遺伝子とも、いかなる機能既知の遺伝子とも、配列上の相同性を有していない。また、Ｔｍ−１遺伝子は、過敏感反応を誘起することなく半優性にウイルスの複製を１細胞レベルで抑制する遺伝因子である。これまでにこのような研究の実績があるものはない。
【０１４６】
これまでに同定されているウイルス抵抗性遺伝子と作用機序が異なると考えられるため、Ｔｍ−１遺伝子とその他の抵抗性遺伝子を組み合わせて使用することにより、より高度で持続的な抵抗性を付与できることが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明を用いれば、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製することができるので、種々の作物においてＴｏＭＶを防除し得る。また、Ｔｍ−１様形質を有しているトマトとＴｍ−１様形質を有していないトマトの間で見出された遺伝子多型は、Ｔｍ−１遺伝子のマーカーとして育種に有効利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、Ｔｍ−１トマト培養細胞プロトプラスト抽出液を各種クロマトグラフィーに供し、最終精製ステップのＭｏｎｏ Ｑカラムクロマトグラフィーにより分画した画分について、各画分に含まれるタンパク質を分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを銀染色した結果、ならびに各画分におけるＴｍ−１活性を測定した結果を示す図である。
【図２】図２は、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７）とｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６）との間でのｐ８０におけるアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図３】図３は、ｐ８０タンパク質の構造を示す図である。
【図４】図４は、トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）とトマト近縁野生種（Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）との間でのｐ８０タンパク質のアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図５】図５は、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７）に由来するｐ８０タンパク質がインビトロでＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害することを示す図である。
【図６】図６は、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７）とｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６）とのＦ２世代におけるＴｏＭＶ抵抗性と、ｐ８０タンパク質をコードする遺伝子における多型との相関を示す図である。
【図７】図７は、ＦＬＡＧタグ化ｐ８０タンパク質を発現したタバコＢＹ−２細胞におけるＴｏＭＶ抵抗性を示す図である。
【図８】図８は、ｐ８０タンパク質の欠失変異体の構造を示す概略図である。
【図９】図９は、ｐ８０タンパク質の欠失変異体のＴｍ−１活性を調べた結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定された新規遺伝子およびその利用に関するものであり、より詳細には、トマトにおけるＴｍ−１様形質の活性本体であるタンパク質（Ｔｍ−１タンパク質）および該タンパク質をコードする遺伝子（Ｔｍ−１遺伝子）ならびにこれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来からトマトにおけるＴｍ−１形質（本明細書中、以下「Ｔｍ−１様形質」と称する。）は、トマトにおいてトマトモザイクウイルス（トバモウイルス：ＴｏＭＶ、以下適宜「ＴｏＭＶ」と略記する。）の増殖を抑制する半優性遺伝形質として知られている（例えば、非特許文献１、２を参照のこと）。Ｔｍ−１様形質はトマト近縁野生種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）を起源とし、栽培種トマトＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）に広く導入され、ＴｏＭＶ感染による被害の軽減に貢献しているが、Ｔｍ−１様形質の本体である遺伝子（Ｔｍ−１遺伝子）は未だクローニングされておらず、その塩基配列およびアミノ酸配列は同定されていない。
【０００３】
これまでに試みられているＴｍ−１遺伝子の同定手法として、例えば、Ｔｍ−１遺伝子のマッピング解析が行われた。この解析によれば、Ｔｍ−１遺伝子は第２染色体の動原体近くに座乗していると考えられているが、その正確な位置については明らかになっていない（例えば、非特許文献３を参照のこと）。
【０００４】
また、Ｔｍ−１遺伝子は、いわゆる「抵抗性（Ｒ）遺伝子」が示す形質とは異なり、過敏感反応を伴うことなく１細胞内でのＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を抑制するという独特の抵抗性を付与する。このため、Ｔｍ−１遺伝子をポジショナルクローニングにより同定する試みが精力的に行われたが、この遺伝子が動原体およびリボソームＲＮＡコード領域に近接した、組み換え頻度が極度に低い染色領域に座乗するため、Ｔｍ−１様形質の本体である遺伝子と完全に連鎖するマーカーは得られても、遺伝子自体の同定には至らなかった。
【特許文献１】特開２００５−２３７３０２号公報（平成１７年９月８日公開）
【特許文献２】特開２００５−６５６５１号公報（平成１７年３月１７日公開）
【特許文献３】特開２００５−２４５２２９号公報（平成１７年９月１５日公開）
【非特許文献１】Pelham, J., Resistance in Tomato to Tabacco Mosaic virus, Euphytica, 15 (1966): 258-267
【非特許文献２】Buck, kenneth W., Replication of tobacco mosaic virus RNA, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B (1999) 354, 613-627
【非特許文献３】Ohmori, T., Murata, M., Motoyoshi, F., Molecular characterization of RAPD and SCR markers linked to the Tm-1 locus in tomato, Theor Appl Genet (1996) 92: 151-156
【非特許文献４】Komoda, K., Naito, S. and Ishikawa, M. (2004) Replication of plant RNA virus genomes in a cell-free extract of evacuolated plant protoplasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 1863-1867。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
トマトにおいてトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の増殖を抑制する半優性遺伝形質であるＴｍ−１様形質について、従来、Ｔｍ−１様形質の利用は交配可能なトマト近縁種に限られているので、この形質を異種植物に容易に導入することができれば、種々の作物にＴｏＭＶ抵抗性を容易に導入することができる。しかし、Ｔｍ−１様形質の本体である遺伝子は未だ得られていない。
【０００６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｔｍ−１様形質の本体である遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、植物におけるＴｍ−１様形質の有無を判定する判定方法（特許文献１を参照のこと）を用いた実験系を構築することにより、Ｔｍ−１様形質を有しているトマト由来の細胞抽出液からＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害する活性を測定し得ること、さらにこのＴｏＭＶ ＲＮＡ複製を阻害する活性がＴｏＭＶの増殖を抑制する活性であることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明に係るポリペプチドは、ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって、（ａ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｃ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（ｄ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または（ｅ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、であることを特徴としている。
【０００８】
本発明に係るポリペプチドは、ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリペプチドのフラグメントであり、かつ、（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位；または（ＩＩ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、を含んでいることを特徴としている。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の部分配列でありかつ配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。
【０００９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００１０】
本発明に係る植物体作製方法は、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するために、上記ポリヌクレオチドを植物体に導入する工程を包含することを特徴としている。
【００１１】
本発明に係る植物体作製キットは、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するために、上記ポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００１２】
本発明に係るスクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記ポリヌクレオチドのフラグメントを目的の植物由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。
【００１３】
本発明に係るスクリーニングキットは、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記ポリヌクレオチドのフラグメントを備えていることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。
【００１５】
本発明に係るスクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
本発明に係るスクリーニングキットは、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記抗体を備えていることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号３０に示される塩基配列またはその相補配列からなることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記オリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することが好ましい。
【００２０】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することが好ましい。
【００２１】
本発明に係る植物体スクリーニングキットは、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記オリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明を用いれば、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製することができる。また、本発明を用いれば、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明者らは、Ｔｍ−１様形質を有しているトマト由来の細胞抽出液からＴｏＭＶ ＲＮＡ複製を阻害する活性（Ｔｍ−１活性）を測定する実験系を構築し、これを用いてＴｍ−１活性を追跡した。その結果、Ｔｍ−１活性に対応する画分に含まれるタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により同定し、対応する遺伝子をクローニングし、本発明を完成するに至った。
【００２６】
〔１：Ｔｍ−１ポリペプチドおよびＴｍ−１ポリヌクレオチド〕
１つの局面において、本発明は、Ｔｍ−１ポリペプチドを提供する。本発明に係るＴｍ−１ポリペプチドは、配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいはこれらの変異体であることが好ましい。
【００２７】
本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドが意図され、「Ｔｍ−１活性」は、ＴｏＭＶの増殖を抑制する活性、好ましくは、ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害する活性が意図される。また、本明細書中で使用される場合、「Ｔｍ−１タンパク質」は「Ｔｍ−１ポリペプチド」と交換可能に使用される。すなわち、Ｔｍ−１タンパク質は、Ｔｍ−１様形質の活性本体であるタンパク質が意図される。
【００２８】
本発明はまた、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドを提供する。本発明に係るＴｍ−１ポリヌクレオチドは、配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体であることが好ましい。本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。また、本明細書中で使用される場合、「Ｔｍ−１遺伝子」は「Ｔｍ−１ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。すなわち、Ｔｍ−１遺伝子は、遺伝形質であるＴｍ−１様形質の本体である。
【００２９】
なお、上述したように、「Ｔｍ−１様形質」は、特定のトマトにおいて見出されたトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の増殖を抑制する半優性遺伝形質が意図される。
【００３０】
本発明者らは、Ｔｍ−１タンパク質が分子量約８０ｋのタンパク質であり、Ｔｍ−１様形質を有していないトマトにおいてもその対照物である分子量約８０ｋのタンパク質が発現していることを見出した。本明細書中で使用される場合、「ｔｍ−１タンパク質」は、Ｔｍ−１様形質を有していないトマトにおいて発現しているｐ８０タンパク質（Ｔｍ−１タンパク質の対照物）が意図され、「ｔｍ−１遺伝子」は「ｔｍ−１ポリヌクレオチド」と交換可能に使用され、ｔｍ−１タンパク質をコードする遺伝子が意図される。本明細書中で使用される場合、「ｐ８０タンパク質」は、Ｔｍ−１タンパク質およびその対照物が意図され、Ｔｍ−１トマト由来のＴｍ−１タンパク質およびｔｍ−１トマト由来のｔｍ−１タンパク質を含むことが意図される。なお、本明細書中で使用される場合、「Ｔｍ−１トマト」は、Ｔｍ−１様形質を有しているトマトが意図され、「ｔｍ−１トマト」はＴｍ−１様形質を有していないトマトが意図される。後述する実施例においては、Ｔｍ−１トマトとしてＧＣＲ２３７系統が用いられ、ｔｍ−１トマトとしてＧＣＲ２３７の準同質遺伝子系統であるＧＣＲ２６が用いられている。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００３２】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００３３】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００３４】
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００３５】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００３６】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１ポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００３７】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００３８】
ポリペプチドを構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００３９】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＴｍ−１活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００４０】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。これらは、本発明に係るポリペプチドのＴｍ−１活性を変化させない。
【００４１】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００４２】
このように、本実施形態に係るＴｍ−１ポリペプチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。
【００４３】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１ポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００４４】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１ポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００４５】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号２、８、１０もしくは１２の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００４８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００５０】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００５１】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体はＴｍ−１ポリペプチドをコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれであることが好ましい：
・配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
・配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５２】
このように、本発明に係るＴｍ−１ポリヌクレオチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下のいずれかであることが好ましい：（１）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；（２）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、（３）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００５４】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。下述する実施例においては、トマトを用いているが、これに限定されない。
【００５５】
このように、本実施形態に係るＴｍ−１ポリペプチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであって、以下のいずれかであることが好ましい：（１）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（２）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチド；または、（３）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチド。
【００５６】
さらなる局面において、本発明は、Ｔｍ−１ポリペプチドのフラグメントを提供する。本発明者らは、Ｔｍ−１ポリペプチドの種々のＣ末端欠失変異体を作製し、該Ｃ末端欠失変異体が、少なくとも配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位を含んでいればＴｍ−１活性を有していることを見出した。
【００５７】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位を含むポリペプチドまたはその変異体であることが好ましい。本実施形態において、上記変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであればよく、例えば、配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であってもよい。好ましい局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであれば、配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。
【００５８】
上述したように、本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチド（すなわち、ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチド）が意図され、「配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体」は、ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって、配列番号３３または３４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが意図される。
【００５９】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号４０に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはその変異体によってコードされるポリペプチドであることを特徴とすることが好ましい。上記変異体は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよく、例えば、配列番号３９または４０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの変異体によってコードされるポリペプチドであってもよい。好ましい局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドであれば、配列番号３９または４０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであり得る。
【００６０】
上述したように、本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図され、「配列番号３９または４０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの変異体」は、配列番号３９または４０に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、配列番号３９もしくは４０に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであることが意図される。
【００６１】
なお、本明細書を読んだ当業者は、上記Ｔｍ−１ポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内に含まれることを、容易に理解する。
【００６２】
本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するために使用され得る。また、本発明を使用すれば、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために適用することができる。
【００６３】
本発明の目的は、Ｔｍ−１ポリペプチドおよびＴｍ−１ポリヌクレオチド、ならびにＴｍ−１ポリペプチドのフラグメントでありかつＴｍ−１活性を有するポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法およびポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得されるＴｍ−１ポリペプチド、およびＴｍ−１ポリヌクレオチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００６４】
〔２：Ｔｍ−１ポリペプチドの生産方法〕
本発明は、Ｔｍ−１ポリペプチドを生産する方法を提供する。一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、Ｔｍ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。
【００６５】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが無細胞タンパク質合成系において用いられることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【００６６】
無細胞タンパク質合成系は細胞内ｍＲＮＡやクローニングされたｃＤＮＡにコードされているさまざまなタンパク質の同定等に広く用いられる手法であり、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。
【００６７】
無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。
【００６８】
なお、種々のウイルス由来遺伝子産物は、その翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を経て活性を発現するものが多いので、各種生化学反応を試験管内で再現するためには細胞内膜成分（例えば、ミクロソーム膜）が添加される必要がある。特許文献２に記載されるような植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液は、細胞内膜成分を保持した無細胞タンパク質合成液として利用し得るのでミクロソーム膜の添加が必要とされないので、好ましい。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「細胞内膜成分」は、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官（すなわち、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞内顆粒全般）が意図される。特に、小胞体およびゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質および分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。
【００７０】
本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが組換え発現系において用いられることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られるＴｍ−１ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【００７１】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【００７２】
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、Ｔｍ−１ポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００７３】
別の実施形態において、Ｔｍ−１ポリペプチドの生産方法は、Ｔｍ−１ポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、後述する抗体またはオリゴヌクレオチドを用いてＴｍ−１ポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、Ｔｍ−１ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【００７４】
さらに他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。
【００７５】
以上のように、本発明に係るポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。
【００７６】
変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。
【００７７】
このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、Ｔｍ−１ポリペプチドのアミノ酸配列、またはＴｍ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
【００７８】
つまり、本発明の目的は、Ｔｍ−１ポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００７９】
なお、Ｔｍ−１ポリペプチドの変異体が所望のＴｍ−１活性を有するか否かを決定するための方法としては、無細胞タンパク質合成系が好ましい。下述する無細胞タンパク質合成系にウイルスＲＮＡを添加することにより、ウイルスＲＮＡを翻訳して複製に必須なウイルスタンパク質を合成させることができる。この系を、本明細書中「インビトロ複製系」と称する。
【００８０】
実施例において後述するように、野生型ＴｏＭＶおよびＴ１（Ｔｍ−１トマトにおいて増殖可能なＴｏＭＶ変異株）のインビトロ複製系に、Ｔｍ−１トマトから得た脱液胞化プロトプラスト細胞抽出液を添加すると、野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡ複製は阻害されたが、Ｔ１のＲＮＡの複製は阻害されなかった。この知見に基づいて、本発明者らは、インビトロ複製系における野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害する活性を指標にＴｍ−１トマトから得た脱液胞化プロトプラスト細胞抽出液からＴｍ−１ポリペプチドを精製している。
【００８１】
作製したＴｍ−１ポリペプチドとともに野生型ＴｏＭＶのインビトロ複製系の反応を行い、野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を検出すれば、Ｔｍ−１タンパク質の変異体でありかつＴｍ−１活性を有するポリペプチドを容易に選択することができる。
【００８２】
〔３：Ｔｍ−１ポリペプチドおよびＴｍ−１ポリヌクレオチドの利用〕
〔３−１：ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体の作製〕
本発明は、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するための方法を提供する。本発明に係る植物体の作製方法は、上述したＴｍ−１ポリヌクレオチドを植物体内に発現可能に導入する工程を包含していればよい。一実施形態において、本発明に係る方法に従ってＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体は、植物形質転換体であり得、本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
【００８３】
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
【００８４】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【００８５】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられ、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法とに大別される。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクター（例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、およびｐＰＺＰ２０２など）が使用され得る。
【００８６】
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００８７】
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。選択マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性に限定されず、例えば、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールなどに対する薬剤耐性が挙げられる。
【００８８】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法などによって組換えベクターが培養細胞に導入されて形質転換される。形質転換の結果として得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【００８９】
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００９０】
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
【００９１】
本発明に係る方法によって作製されたＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体は、特に限定されず、ＴｏＭＶ抵抗性が付与されたことによりその有用性を有し得る植物が挙げられる。このような植物としては、被子植物でも裸子植物でもよい。また、被子植物としては、単子葉植物でも双子葉植物でもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。
【００９２】
本発明はまた、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するためのキットを提供する。本発明に係る植物体の作製キットは、上述したＴｍ−１ポリヌクレオチドを植物体内に発現可能な形態で備えていればよく、一実施形態において、本発明に係るキットを用いてＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体は、植物形質転換体であり得、本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
【００９３】
なお、本発明に係る植物体作製キットは、Ｔｍ−１ポリヌクレオチド以外に、上述した植物体作製方法を実行するために必要とされる試薬などを備えていることが好ましい。すなわち、本明細書を読んだ当業者は、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するためのキットの構成品が、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製する方法において用いられるものであることを容易に理解する。
【００９４】
〔３−２：ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体のスクリーニング〕
本発明は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするための方法を提供する。本発明に係る植物体のスクリーニング方法は、植物体内で発現されているＴｍ−１ポリヌクレオチドを検出する工程を包含していればよい。一実施形態において、本発明に係る方法に従ってスクリーニングされた植物体は、天然であっても形質転換体であってもよい。
【００９５】
本発明は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。
【００９６】
本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドを発現する植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個または数百個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マー（３０塩基、３０ヌクレオチドともいわれる。）または１００マー（１００塩基、１００ヌクレオチドともいわれる。）というように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００９８】
本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドは、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを得るためのＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。上記オリゴヌクレオチドはまた、以下のような用途に使用され得る：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＴｍ−１遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）Ｔｍ−１遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるＴｍ−１ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００９９】
なお、当業者は、上述した用途がいずれも、本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドと目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）との間で生じるハイブリダイゼーションに起因しており、当該オリゴヌクレオチドが、目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）とハイブリダイズさせるために用いられることを容易に理解する。
【０１００】
本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも７ｎｔ（ヌクレオチド）、１０ｎｔ、１２ｎｔ、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図されるが、当業者は、上述した用途に応じて好ましい長さを適宜設定し得る。「少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメント」によって、例えば、配列番号２に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基配列またはその相補配列を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号２に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号２に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【０１０１】
本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。上記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。上記オリゴヌクレオチドを導入することによって、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドの含量を低下させ得、その結果、植物中のＴｍ−１様形質を制御することができる。
【０１０２】
このように、本発明に係るスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドを、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、Ｔｍ−１活性を有するポリペプチドを発現する植物体または組織を容易に検出（スクリーニング）することができる。さらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、植物体またはその組織もしくは細胞におけるＴｍ−１活性を有するポリペプチドの発現を制御することができる。さらに、本発明に係るスクリーニング方法を用いれば、ｐ８０タンパク質における多型を容易に検出することができる。
【０１０３】
〔３−３：抗体〕
本発明は、ｐ８０タンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。本発明に係る抗体は、ｐ８０タンパク質と特異的に結合し得るものであれば限定されず、ｐ８０タンパク質に対するポリクローナル抗体等でもよいが、ｐ８０タンパク質に対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０５】
上述したように、ｐ８０タンパク質には、Ｔｍ−１ポリペプチドおよびｔｍ−１ポリペプチドが包含される。一実施形態において、本発明に係る抗体は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する」は、ｐ８０タンパク質のＴｍ−１ポリペプチドと特異的に結合するが、ｔｍ−１ポリペプチドとは結合しないことが意図される。よって、本発明を用いれば、Ｔｍ−１様形質を有する植物体を容易にスクリーニングすることができる。すなわち、本発明に係る抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含するスクリーニング方法、および、本発明に係る抗体を備えているスクリーニングキットもまた、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするための本発明の範囲に含まれることが容易に理解されるべきである。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０１０７】
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従えば作製され得る。
【０１０８】
モノクローナル抗体は、以下のような方法を用いれば作製され得る。すなわち、Ｔｍ−１ポリペプチドもしくはそのフラグメントまたはその他の誘導体あるいはこれらのアナログ、あるいはこれらを発現する細胞を免疫原として用いてマウス脾臓リンパ球を免疫し、免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマによりモノクローナル抗体を産生させる。モノクローナル抗体を取得するために必要な技術は当該分野において公知である（例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））などを参照のこと）。
【０１０９】
ペプチド抗体は、当該分野に公知の方法によって作製され得る。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
【０１１０】
さらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体に結合する能力がＴｍ−１ポリペプチドまたはそのフラグメントからなる抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるＴｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【０１１１】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントが、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることは、当業者には明白である。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生され得る。あるいは、Ｔｍ−１ポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。
【０１１２】
このように、本実施形態に係る抗体は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合するフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよく、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１１３】
つまり、本発明の目的は、Ｔｍ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１１４】
〔４：Ｔｍ−１様形質の選別〕
Ｔｍ−１ポリヌクレオチドの利用の１つの局面として、上記３−２項において、ｐ８０コード領域からなるポリヌクレオチド（すなわち、Ｔｍ−１ポリヌクレオチドまたはｔｍ−１ポリヌクレオチド）を用いた、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体のスクリーニングを説明したが、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体のスクリーニングに好適なポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、ｐ８０コード領域以外の塩基配列からなってもよい。
【０１１５】
Ｔｍ−１ゲノム配列（配列番号３）およびｔｍ−１ゲノム配列（配列番号６）から明らかなように、ｐ８０ゲノム配列は多型を有している。よって、ｐ８０タンパク質を発現するか否かにとらわれることなく、目的の植物がＴｍ−１ゲノム配列を有しているか否かを選別（スクリーニング）することができる。好ましくは、本発明において、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号３０に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを用い得る。
【０１１６】
本発明は、上記オリゴヌクレオチドを利用してＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記オリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。本実施形態に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することが好ましく、配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することがより好ましい。
【０１１７】
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドを利用してＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするためのキットを提供する。一実施形態において、本発明に係る植物体スクリーニングキットは、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、上記オリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本実施形態に係る植物体スクリーニング方法は、ＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするために、配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることが好ましく、配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることがより好ましい。
【０１１８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１９】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１２０】
タバコＢＹ−２培養細胞由来の脱液胞化プロトプラスト抽出液（ＢＹＬ）を用いてＴｏＭＶ ＲＮＡ（野生型またはＴ１（Ｔｍ−１トマトにおいて増殖可能なＴｏＭＶ変異株））のインビトロ複製系を構築し、これらのインビトロ複製系の反応液にＲＮＡ合成基質を加えてインビトロでＴｏＭＶ ＲＮＡを複製させた。続いて、特許文献３に従って、Ｔｍ−１様形質を有しているトマト（Ｔｍ−１トマト）から得た脱液胞化プロトプラスト細胞抽出液を、上記インビトロ複製系に添加すると、野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製は阻害されたが、Ｔ１ ＲＮＡの複製は阻害されなかった。以下、野生型ＴｏＭＶ ＲＮＡの複製と変異株Ｔ１ ＲＮＡの複製とを比較することによりＴｍ−１活性の有無を判定した。
【０１２１】
〔１：インビトロでのＴｍ−１活性測定系の確立〕
脱イオン水で４回予め洗浄した限外ろ過ユニット（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ５００，ＭＷＣＯ １０，０００，ＰＥＳ：ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて、Ｔｍ−１活性精製画分（０．３〜２ｍｌ）を５０μｌに濃縮した。濃縮サンプルに対して、５００μｌのＴＲバッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ７．４）、８０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭ ＤＴＴ）によるバッファー置換を３回行った。濃縮および脱塩を行った画分２０μｌを、２５μｌのＢＹＬ、０．５μｌの４０ｕ／μｌ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１μｌの１０ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、５μｌの１０×基質混合液と混合して１００ｎｇのＴｏＭＶ ＲＮＡまたはＴ１ ＲＮＡを添加して２３℃で１時間反応させた。さらに、ＲＮＡ複製反応を２３℃で１時間行った。この際、５×Ｒバッファー（非特許文献４を参照のこと）に１５０ｍＭのクレアチンリン酸を加えた。複製したＴｏＭＶおよびＴ１のゲノムＲＮＡをＢＡＳ１０００、ＢＡＳ２５００（いずれもＦｕｊｉ）またはＩｍａｇｅＪ１５を用いて定量し、その比をＴｍ−１活性の指標とした。
【０１２２】
〔２：Ｔｍ−１活性の精製〕
Ｔｍ−１トマト培養細胞プロトプラスト抽出液を出発材料として、以下の手順に従ってＴｍ−１活性を精製した。
【０１２３】
継代後７日目のトマト培養細胞懸濁液１０〜１５ｍｌを、７５ｍｌのＮＤＺ培地（特許文献３を参照のこと）に移し、３日間培養した後にプロトプラストを調製した。これをｐａｃｋｅｄ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅの４倍量の破砕バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ））を添加した後、ダウンス型ホモジェナイザーを用いて破砕した。この破砕液を遠心分離（８００×ｇ）し、得られた上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８Ｔｉを用いて１００，０００×ｇでさらに３０分間遠心分離した。最終的に得られた上清をＳ１００画分とした。必要に応じて、Ｓ１００画分を−８０℃で凍結保存した。
【０１２４】
１００ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＡＮＸ ＦＦカラム（カラム容積５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を２個直列に連結した。このカラムに１８ｍｌのＳ１００画分をアプライし、２５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡ（６０ｍｌ）で洗浄した後、３００ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡで溶出した画分（１０ｍｌ）を回収した（ＡＮＸ０．３画分）。必要に応じて、ＡＮＸ０．３画分を−８０℃で凍結保存した。ＡＮＸ０．３画分（８０ｍｌ）に４０％飽和硫酸アンモニウムを添加した後、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。沈殿を、２ｍｌのバッファーＧ（１０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、３００μｌずつ７回に分けてアプライした。アプライ後、バッファーＧ（サンプル体積を含む）を８．７〜１０．７ｍｌ流した画分（２ｍｌ）を回収した。この画分（１４ｍｌ）を、５６ｍｌのバッファーＣ（１０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で希釈し、バッファーＣで平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ２−Ｉ）にアプライした。１０ｍｌのバッファーＣでカラムを洗浄した後、直線濃度勾配（１０〜３００ｍＭ、１２ｍｌ）のリン酸カリウムを含むバッファーＣで溶出し、Ｔｍ−１活性を示した画分（２ｍｌ）を回収した。この画分を５００μｌずつ分割し、ＳＷ４０Ｔｉ用の遠心チューブに形成した１０ｍｌの１０〜４０％グリセロール密度勾配（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０〜４０％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の上に重層して、４０，０００ｒｐｍにて４℃で１６時間遠心分離した（ＳＷ４０Ｔｉ；Ｂｅｃｋｍａｎ）。上層から１ｍｌずつ回収し、５番目および６番目の画分を活性画分として回収した（８ｍｌ）。この画分を１０ｍｌのバッファーＭ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＯＡｃ、１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で希釈し、バッファーＭで平衡化した陰イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライした。１０ｍｌのバッファーＭでカラムを洗浄した後、直線濃度勾配（２００〜３５０ｍＭ、１０ｍｌ）のＮａＣｌを含むバッファーＣで溶出した。溶出液を、溶出開始から１ｍｌずつ回収した。５番目〜９番目の画分のＴｍ−１活性を測定し、各画分に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）によって検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ビス−トリスゲル，ＭＯＰＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、銀染色には銀染色ＭＳキット（和光純薬）を付属のプロトコルに従って使用した。
【０１２５】
図１に最終精製段階であるＭｏｎｏ Ｑカラムクロマトグラフィーの第５〜９画分に含まれているタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色パターン、ならびにＴｍ−１活性の測定結果を示す。図１（Ａ）は、上述した精製過程の最終段階であるＭｏｎｏ Ｑカラムの２００〜３５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分（第５〜９画分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後に銀染色してタンパク質のバンドを検出した結果を示す図である。矢印は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に供したｐ８０のバンドを示す。図１（Ｂ）は、Ｍｏｎｏ Ｑカラムの２００〜３５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分（第５〜９画分）を、インビトロＴｏＭＶ ＲＮＡ翻訳・複製系に加えて反応させた結果を示す図である。上のパネルに［３２Ｐ］標識された合成産物ＲＮＡのパターンを、下のパネルにゲノムＲＮＡへの［３２Ｐ］の取り込みを定量し、Ｉ／Ｔ１の比をとったグラフを示す。〔Ｉ〕はＴｍ−１超感受性ＴｏＭＶ変異株、〔Ｔ１〕はＴｍ−１非感受性ＴｏＭＶ変異株を示す。
【０１２６】
〔３：Ｔｍ−１遺伝子の同定〕
Ｔｍ−１活性と同様の溶出パターンを示した分子量約８０ｋのバンド（ｐ８０；図１ａ中の矢印）をゲルから切り出して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した（株式会社アプロサイエンスによる受託解析を利用）。得られたペプチドには、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）のＥＳＴ「ｇｉ｜３０１３６９４２」に対応する遺伝子産物由来のペプチドと分子量が一致するものが存在した。また別のペプチドはジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のＥＳＴ「ｇｉ｜４２５１０９１３」に対応する遺伝子産物由来のペプチドの分子量と一致した。
【０１２７】
この２つのＥＳＴはこれまでに同定された遺伝子には帰属しなかったが、それぞれに対するＢＬＡＳＴサーチによってシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の遺伝子（Ａｔ５ｇ６６４２０）の異なる領域と相同性を示すことがわかった。そこで、シロイヌナズナおよびジャガイモの配列間で相同な部分に従って、プライマー（５’−ｃｃｃｔｔｔｇｃｔｇａｔｇｃａａａｔｇｃｔａｔｔｇ−３’（配列番号１９）、５’−ｔａａｔａｇｇｇｃｃｔｃｃａｔｇｇｃａｇａｇｃａｃ−３’（配列番号２０））を設計し、Ｔｍ−１様形質を有しているトマト（Ｔｍ−１トマト）であるＧＣＲ２３７、およびＧＣＲ２３７の準同質遺伝子系統でありかつＴｍ−１様形質を有していないトマトであるｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６）からＲＴ−ＰＣＲ法によって約０．５ｋｂｐのｃＤＮＡ部分断片を単離した。ＲＴ−ＰＣＲはＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を付属のプロトコルに従って使用した。この部分断片の塩基配列を決定し、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法により全長ｃＤＮＡを得た。ここで得られたアミノ酸配列より、これをトリプシン消化した際のペプチドの分子量を予測したところ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析において既知配列と有意な分子量相同性を示さなかったペプチドをさらに３つ同定し得た。
【０１２８】
Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ （Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）の種子（アクセッションＰＩ１２６４４５、ＰＩ２５１３０３、ＰＩ２４７０８７、ＰＩ３９０６６１、ＰＩ３９０６６３、ＰＩ３９０５１５）を、ＵＳＤＡ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ ＰＩ Ｓｔａｔｉｏｎより得た。各アクセッションのＴｏＭＶ抵抗性について、ＴｏＭＶ接種後７〜１０日後の接種葉における外被タンパク質の蓄積を調べた。各アクセッションの全ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲ（プライマー；５’−ｔｃｃａｔｔｔｔｇａａａｔｃｔｃｇａｔｔｇｔａａｃａ−３’（配列番号２１）、５’−ｔａａａｇａａａｇａｇｇｔｇａａｇａｃｃａｔａｃａ−３’（配列番号２２））を行い、得られた約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列をシークエンス解析することにより、各アクセッションのトマトｐ８０遺伝子の配列を決定した。
【０１２９】
ＧＣＲ２３７由来のＴｍ−１遺伝子（Ｔｍ−１）およびＧＣＲ２６由来のＴｍ−１遺伝子（ｔｍ−１）のゲノムＤＮＡの配列決定には、プライマー（５’−ａｔｃｔｔｃｔｃａｃｃａｔｔｃｔｃａｃａｃｔｇａｇ−３’（配列番号２３），５’−ａｃｃａｔａｃａｔａｔａｇｇｔｔｃｇｇａｃａｔｔｔ−３’（配列番号２４））を使用し、ＧＣＲ２３７およびＧＣＲ２６のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって得た約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に対してシークエンス解析を行った。
【０１３０】
図２に、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７：２３７ ｐｒｊ）およびｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６：２６ ｐｒｊ）に由来するｐ８０タンパク質のアミノ酸配列の比較を示す。ｐ８０は７５４アミノ酸からなるポリペプチドであり、このｐ８０タンパク質のＮ末端側には、多くのタンパク質と相同性を有する、機能未知の領域が存在した。また、Ｃ末端側には多くの酵素にみられるＴＩＭ ｂａｒｒｅｌ構造をとり得る領域が見出された（図３）。
【０１３１】
ｐ８０タンパク質と類似するポリペプチドをコードする遺伝子が、多くの植物（シロイヌナズナなど）において見出された。ｐ８０タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡを、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７）、ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６）、および６つのアクセッションのＬ．ｈｉｒｕｓｕｔｕｍから単離し、これらの塩基配列を決定した。これらの塩基配列を比較した結果、ＧＣＲ２３７の配列は、ＧＣＲ２６の配列とは異なり、Ｔｍ−１様形質が由来したと考えられているＬ．ｈｉｒｕｓｕｔｕｍ ＰＩ１２６４４５の配列と同一であることがわかった。
【０１３２】
図４に、トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍおよびＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）のｐ８０アミノ酸配列比較を示す。系統樹を、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｃｌｕｓｔａｌｗ−ｊ．ｈｔｍｌ）により作成した。野生型ＴｏＭＶの増殖が阻害されたＬ．ｈｉｒｕｓｕｔｕｍ ＰＩ２５１３０３およびＰＩ２４７０８７の配列は、ＰＩ１２６４４５の配列に類似し、野生型ＴｏＭＶの増殖が阻害されなかったＬ．ｈｉｒｕｓｕｔｕｍ ＰＩ３９０６６１、ＰＩ３９０５１５およびＰＩ３９０６６３の配列は、ＰＩ１２６４４５の配列と大きく異なっていた（図４）。この遺伝子は、９個のエキソンからなり、ＧＣＲ２３７とＧＣＲ２６との間で多くの塩基配列多型が見出された。
【０１３３】
なお、ＧＣＲ２３７、ＧＣＲ２６、アクセッションＰＩ１２６４４５、ＰＩ２５１３０３、ＰＩ２４７０８７、ＰＩ３９０６６１、ＰＩ３９０６６３およびＰＩ３９０５１５に由来するｐ８０タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１、４、７、９、１１、１３、１５、１７に示し、それぞれをコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号２、５、８、１０、１２、１４、１６、１８に示した。なお、ＧＣＲ２３７由来のＴｍ−１遺伝子のゲノム配列およびＧＣＲ２６由来のｔｍ−１遺伝子のゲノム配列を、それぞれ配列番号３および６に示した。
【０１３４】
〔４：インビトロ翻訳で合成したＴｍ−１遺伝子産物によるインビトロＴｏＭＶ ＲＮＡ複製阻害〕
Ｔｍ−１ ｃＤＮＡおよびｔｍ−１ ｃＤＮＡをクローニングするために、ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）をベクターとして用いた。ＰＣＲのプライマー（５’−ｇｇａｃｇｔｃｇｃｔａｇｃｔｃｃａｔｔｔｔｇａａａｔｃｔｃｇａｔｔｇｔ−３’（配列番号２５），５’−ｇｇａｇｃｔｃａｃｃａｔａｃａｔａｔａｇｇｔｔｃｇｇａｃａｔｔｔ−３’（配列番号２６））を用いて増幅したＤＮＡをＡａｔII、ＳａｃIで切断し、同酵素で切断したｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）ベクターにクローニングした。下線部は、ＡａｔIIおよびＳａｃIの制限酵素部位を示す。このプラスミドを鋳型にして、Ｔ７プロモーター（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｇａ−３’（配列番号２７））と３’−ＵＴＲに相当するプライマー（５’−ｇｇａｇｃｔｃａｃｃａｔａｃａｔａｔａｇｇｔｔｃｇｇａｃａｔｔｔ−３’（配列番号２８））を用いてＰＣＲを行い、直鎖状ＤＮＡを得た。これを鋳型にしてインビトロ転写反応を行い、対応するｍＲＮＡを得た。インビトロ転写反応には、ＡｍｐｌｉＣａｐTM Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｋｅｒ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を付属のプロトコルに従って使用した。得られたｍＲＮＡ ５００ｆｍｏｌとＴｏＭＶまたはＴ１のＲＮＡ ２５ｆｍｏｌとを混合し、ＢＹＬを３０，０００×ｇで遠心分離して得た上清を用いて１５μｌの系にて翻訳した。翻訳反応を、Ｔｍ−１活性の測定と同様に行った。翻訳後のサンプルを、ＢＹＬを３０，０００×ｇで遠心分離して得た沈殿（元のＢＹＬの３倍濃度になるようにＴＲバッファーに懸濁した）５μｌと混合し、１５℃で１時間インキュベートした。この反応液を用いてインビトロＴｏＭＶ ＲＮＡ複製反応を行い、［３２Ｐ］標識されたＲＮＡ産物を検出した。
【０１３５】
その結果、ＴｏＭＶ ＲＮＡのインビトロ複製系に、ＧＣＲ２３７由来のｐ８０ ｃＤＮＡの翻訳産物を加えたときにのみＴｏＭＶ複製阻害が観察された（図５）。このことは、ｐ８０をコードする遺伝子がＴｍ−１遺伝子であること、およびＴｍ−１タンパク質がトマト以外の植物においてもＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害し得ることを示す。なお、図５に、［３２Ｐ］標識されたゲノムＲＮＡ（アスタリスク）および複製型ＲＮＡ（矢印）を示す。また、図５中、ｐ８０ ｍＲＮＡを添加しなかったコントロールを「−」で示し、Ｔｍ−１感受性の野生型ＴｏＭＶおよびＴｍ−１非感受性のＴｏＭＶ変異株を、「Ｌ」または「Ｔ１」で示した。
【０１３６】
以上のように、タバコの細胞抽出液をベースにしたインビトロＴｏＭＶ ＲＮＡ複製系においてＴｍ−１活性が機能した。このことから、Ｔｍ−１遺伝子を発現させることにより、トマトのみならず幅広い植物種にＴｏＭＶ抵抗性を付与することができると考えられる。
【０１３７】
〔５：ＳＣＡＲマーカー〕
ｐ８０に関連する遺伝子（ｐ８０コード領域およびｐ８０非コード領域を含む。）における多型を調べればＴｍ−１様形質の有無を容易に判定することができると考えられるので、ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎ（ＳＣＡＲ）マーカーを作製し、その有効性を検証した。
【０１３８】
ＧＣＲ２３７とＧＣＲ２６とのＦ２世代の種子（２３個体）を播種し、長日条件下（１６時間明期（２４℃））で生育させた。２週間後、第１本葉または第２本葉にＴｏＭＶ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を機械的に接種した。同一条件下で６日間培養した後、ＴｏＭＶを接種した葉を回収した。回収した葉を、４倍容の抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ）中にて破砕し、１５，０００×ｇにて５分間遠心分離した。得られた上清２．５μｌを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、分離ゲルをＣＢＢ染色した結果を図６（Ａ）に示す。図中、Ｍはプレシジョンｐｌｕｓプロテインスタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を示す。また、上清１３０μｌからイソプロパノールによって沈殿させたゲノムＤＮＡを、１００μｌのＴＥバッファーに懸濁した。
【０１３９】
ＧＣＲ２３７およびＧＣＲ２６のｐ８０ゲノム配列（それぞれ配列番号３および６）に基づいてＳＣＡＲマーカーを作製した。具体的には、ＧＣＲ２３７およびＧＣＲ２６のｐ８０ゲノム配列（イントロン部分）に共通する塩基配列（５’−ｃｃａｃｔｇｔａｔｇａｔｔｔｃｔｇｃｔａｇｔｇａａ−３’（配列番号２９））からなるオリゴヌクレオチド、ＧＣＲ２３７のｐ８０ゲノム配列（イントロン部分）にのみ存在する塩基配列の相補配列（５’−ｇａｇｃｔｔｔａａｃａａａｔａｔａａｇａａｔａａａｇａｃ−３’（配列番号３０））からなるオリゴヌクレオチド、およびＧＣＲ２６のｐ８０ゲノム配列（イントロン部分）にのみ存在する塩基配列の相補配列（５’−ｇｃａａｇｃｔａａｇｇｔｔｔａｃａｔａｔａｔｇｃｃ−３’（配列番号３１））からなるオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチド各０．２μＭを混合したものをプライマーとして用いて、上記ゲノムＤＮＡ懸濁液１μｌをテンプレートにしたＰＣＲを、６０℃のアニーリング温度にて行った。ＰＣＲ用の酵素として、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲ産物５μｌを４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１，ＴａＫａＲａ）にて分離し、エチジウムブロミドによって染色した図を図６（Ｂ）に示す。図中、Ｍは、１００ｂｐ ＤＮＡラダー（ＮＥＢ）を示す。
【０１４０】
Ｆ２世代（２３個体）のＴｏＭＶ感受性を顕著に示した個体において、ＴｏＭＶ外被タンパク質（ＴｏＭＶ ＣＰ）の蓄積が観察された（図６（Ａ）中、レーン１、５、９、１３）。また、ＴｏＭＶ感受性を顕著に示す個体においては、ＧＣＲ２３７に由来する１２１ｂｐのＤＮＡフラグメントが増幅されなかった（図６（Ｂ））。これらの結果より、上記ＳＣＡＲマーカーは、植物体におけるＴｍ−１様形質の有無を判別するためのマーカーとして有用であることがわかった。なお、ヘテロの個体のいくつかは、低レベルのＴｏＭＶ増殖が生じたが、これはＴｍ−１様形質が半優性であるからである（Ｆｒａｓｅｒ ａｎｄ Ｌｏｕｇｈｌｉｎ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４８：８７−９６（１９８０）を参照のこと）。
【０１４１】
〔６：Ｔｍ−１遺伝子を発現するタバコに対するＴｏＭＶ感染〕
ＴｏＭＶ感受性であるタバコＢＹ−２細胞に、ＦＬＡＧタグを融合したＧＣＲ２３７由来のｐ８０タンパク質を構成的に発現させた。具体的には、ＧＣＲ２３７由来のＴｍ−１遺伝子の終止コドンを「ＣＴＣ」に置換してＳａｃＩ部位を導入し、ＳａｃＩ部位の下流にＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド（ｇｇａｇｇｔｇａｔｔａｔａａｇｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔａａｇａａｃｔｇｇｔｃａｃａｔｃｃｔｃａａｔｔｔｇａａａａｇｔｇａ（配列番号３２））を付加したＤＮＡを、バイナリーベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。Ｈａｇｉｗａｒａら（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２２，２：３４４−３５３（２００３））の方法に従って、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ １０５株を用いて、ＢＹ−２細胞を形質転換した。カナマイシン耐性を示したカルスを破砕し，抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングによってｐ８０−ＦＬＡＧが発現している細胞（２ライン）を得た。これらの細胞から調製したプロトプラストに、エレクトロポレーションによってＴｏＭＶ ＲＮＡまたはＴ１ ＲＮＡを感染させた（Ｗａｔａｎａｂｅら（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，２１９：６５−６９（１９８７）を参照のこと）。２４時間培養した後、回収したプロトプラストの全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ゲルをＣＢＢ染色した結果を図７に示す。図中、ＮＴは、非形質転換ＢＹ−２細胞由来のプロトプラストタンパク質を示し、Ｍｏは、Ｍｏｃｋ感染した細胞由来のプロトプラストタンパク質を示し、Ｌは、野生型ＴｏＭＶ−Ｌ感染の細胞由来のプロトプラストタンパク質を示し、Ｔ１は、Ｔｍ−１トマトにおいて増殖可能なＴｏＭＶ変異株（Ｔ１）感染の細胞由来のプロトプラストタンパク質を示す。
【０１４２】
図７に示すように、ｐ８０−ＦＬＡＧ発現細胞ではＴｏＭＶ外被タンパク質（ＴｏＭＶ ＣＰ）は検出されなかった。なお、ＴｏＭＶ変異株（Ｔ１）の増殖が許容されたことから、この抵抗性はＴｍ−１遺伝子によるＴｏＭＶ特異的なものと考えられた。この結果より、ｐ８０ ｃＤＮＡを発現する植物が、１細胞レベルでＴｏＭＶ抵抗性を示すこと、異種植物（タバコ）細胞でもその抵抗性は有効であることが明らかになった。
【０１４３】
〔７：Ｔｍ−１タンパク質の欠失変異体におけるＴｍ−１活性〕
上述したｐ８０ ｃＤＮＡと同様の方法に従ってＴｍ−１タンパク質（配列番号１）のアミノ酸第４６〜２６３位を欠く可変スプライシング産物（ｐ８０Ｓｈｏｒｔ）をクローニングし、そのｍＲＮＡを調製した。Ｔｍ−１タンパク質のＣ末端欠失変異体（Ｌ４９０Ｓｔｏｐ（配列番号３３）およびＣ２８４Ｓｔｏｐ（配列番号３４））のｃＤＮＡを以下のように作製した：Ｔ７プロモータの下流にｐ８０ ｃＤＮＡを有するプラスミドをテンプレートにＴ７プライマー（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｇａ−３’：配列番号３５）と塩基置換プライマー（５’−ｇｃｃｃｔｔａｃｔｔａｔｔｔｇａｔｃｔｔｔｃｔａｔｔｔｃｔ−３’ ：配列番号３６）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をテンプレートにしたインビトロ転写反応によりＬ４９０ＳｔｏｐのｍＲＮＡを調製し、塩基置換プライマー（５’−ａｔｃｇｇｇａａｃｔａｔｃｔｃａｔｇｃｃａｔｔａｃ−３’ ：配列番号３７）を用いて同様にＣ２８４ＳｔｏｐのｍＲＮＡを調製した。これらのｍＲＮＡをインビトロでのＴｍ−１活性測定系（ＴｏＭＶまたはＴ１）に供し、サンプルを２．４％ＰＡＧＥにて分離した後にオートラジオグラフィーにてバンドを検出することにより、Ｔｍ−１タンパク質の各欠失変異体におけるＴｍ−１活性の有無を調べた。図８にＴｍ−１タンパク質全長（ｐ８０）、ｐ８０Ｓｈｏｒｔ、Ｌ４９０ＳｔｏｐおよびＣ２８４Ｓｔｏｐの構造概略図を示し、図９に、それぞれのＴｍ−１活性を示す。
【０１４４】
図９に示すように、ｐ８０タンパク質の可変スプライシング産物はＴｍ−１活性を有していないが、ｐ８０タンパク質は少なくとも１〜２８３位のアミノ酸を有していればＴｍ−１活性を保持していることがわかった。
【０１４５】
本発明のＴｍ−１遺伝子はｐ８０タンパク質をコードし、いかなる既知抵抗性遺伝子とも、いかなる機能既知の遺伝子とも、配列上の相同性を有していない。また、Ｔｍ−１遺伝子は、過敏感反応を誘起することなく半優性にウイルスの複製を１細胞レベルで抑制する遺伝因子である。これまでにこのような研究の実績があるものはない。
【０１４６】
これまでに同定されているウイルス抵抗性遺伝子と作用機序が異なると考えられるため、Ｔｍ−１遺伝子とその他の抵抗性遺伝子を組み合わせて使用することにより、より高度で持続的な抵抗性を付与できることが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明を用いれば、ＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製することができるので、種々の作物においてＴｏＭＶを防除し得る。また、Ｔｍ−１様形質を有しているトマトとＴｍ−１様形質を有していないトマトの間で見出された遺伝子多型は、Ｔｍ−１遺伝子のマーカーとして育種に有効利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、Ｔｍ−１トマト培養細胞プロトプラスト抽出液を各種クロマトグラフィーに供し、最終精製ステップのＭｏｎｏ Ｑカラムクロマトグラフィーにより分画した画分について、各画分に含まれるタンパク質を分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを銀染色した結果、ならびに各画分におけるＴｍ−１活性を測定した結果を示す図である。
【図２】図２は、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７）とｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６）との間でのｐ８０におけるアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図３】図３は、ｐ８０タンパク質の構造を示す図である。
【図４】図４は、トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）とトマト近縁野生種（Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）との間でのｐ８０タンパク質のアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図５】図５は、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７）に由来するｐ８０タンパク質がインビトロでＴｏＭＶ ＲＮＡの複製を阻害することを示す図である。
【図６】図６は、Ｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２３７）とｔｍ−１トマト（ＧＣＲ２６）とのＦ２世代におけるＴｏＭＶ抵抗性と、ｐ８０タンパク質をコードする遺伝子における多型との相関を示す図である。
【図７】図７は、ＦＬＡＧタグ化ｐ８０タンパク質を発現したタバコＢＹ−２細胞におけるＴｏＭＶ抵抗性を示す図である。
【図８】図８は、ｐ８０タンパク質の欠失変異体の構造を示す概略図である。
【図９】図９は、ｐ８０タンパク質の欠失変異体のＴｍ−１活性を調べた結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または
（ｅ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のいずれかであることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント；または
（ｂ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント
のいずれかであり、かつ
（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位；または
（ＩＩ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を含んでいることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを植物体に導入する工程を包含することを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製する方法。
【請求項５】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するためのキット。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法。
【請求項７】
請求項３に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするためのキット。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含することを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の抗体を備えていることを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするためのキット。
【請求項１１】
配列番号３０に示される塩基配列またはその相補配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするためのキット。
【請求項１６】
配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【請求項１】
ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または
（ｅ）配列番号２、８、１０もしくは１２に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のいずれかであることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
ＴｏＭＶの増殖を抑制するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント；または
（ｂ）配列番号１、７、９もしくは１１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント
のいずれかであり、かつ
（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位；または
（ＩＩ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２８３位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を含んでいることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを植物体に導入する工程を包含することを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製する方法。
【請求項５】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性が付与された植物体を作製するためのキット。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法。
【請求項７】
請求項３に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするためのキット。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含することを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の抗体を備えていることを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするためのキット。
【請求項１１】
配列番号３０に示される塩基配列またはその相補配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴とするＴｏＭＶ抵抗性を有している植物体をスクリーニングするためのキット。
【請求項１６】
配列番号２９に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
配列番号３１に示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【図２】
【図３】
【図４】
【図８】
【図１】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図３】
【図４】
【図８】
【図１】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【公開番号】特開２００７−２６７６１７（Ｐ２００７−２６７６１７Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９４１５２（Ｐ２００６−９４１５２）
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
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