トランスグルタミナーゼ抑制剤として有用なグルコサミンまたはその誘導体
グルコサミンまたはその誘導体を含むトランスグルタミナーゼ抑制剤を開示する。過剰発現の場合、様々な疾病の病因に関与するトランスグルタミナーゼの活性を抑制するためのグルコサミンまたはその誘導体は、そのような疾病の予防および治療に有用である。また、グルコサミンまたはその誘導体を活性成分として含む薬学的組成物、およびトランスグルタミナーゼの抑制方法を開示する。この薬学的組成物を使用するトランスグルタミナーゼの抑制方法は、トランスグルタミナーゼが過剰発現する疾患に苦しめられる患者に治療的に安全且つ効果的に適用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコサミンまたはその誘導体を含むトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）抑制剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、過剰発現の場合、様々な疾病の病因に関与するトランスグルタミナーゼの活性を抑制するためのグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含むトランスグルタミナーゼ抑制剤、およびこれらの新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスグルタミナーゼ(Transglutaminase)は、正常的な状況では血液凝固や傷治癒などの保護的作用をする酵素である。ところが、その発現が調節されない場合には、様々な疾病の病理的メカニズムで主要な役割をするものと知られている(総論. Soo-Youl Kim: New Target Against Inflammatory Diseases: Transglutaminase 2. Archivum Immunologiae & Therapiae Experimentalis 52, 332-337, 2004)。
【０００３】
特に、例えば退行性関節炎や糖尿病、自己免疫筋肉炎、動脈硬化、脳卒中、肝硬変、悪性乳癌、脳膜炎、炎症性胃潰瘍などの炎症性疾患においてトランスグルタミナーゼの発現が多く増加する。
最近、Ｓｏｈｎ等は、モルモットに花粉を用いて誘発させたアレルギー性結膜炎モデルから、ペプチドからなるトランスグルタミナーゼ抑制剤を用いて、ステロイドに匹敵する効果を得ることに成功した(Sohn, J., Kim, T.-I., Yoon, Y.-H., and Kim, S.-Y. Transglutaminase inhibitor: A New Anti-Inflammatory Approach in Allergic Conjunctivitis. J. Clin. Invest. 111, 121-8, 2003; Soo-Youl Kim.Transglutaminase 2 in inflammation. Front Biosci. 11, 3026-3035, 2006)。
【０００４】
このような理由により、新薬開発の次元で安全且つ効果的なトランスグルタミナーゼ抑制剤に関する研究が求められている実情である。
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ、Ｅ．Ｄ．２．３．２．１３）は、カルシウム依存性架橋結合促進酵素であって、タンパク質を構成しているグルタミン残基とリジン残基との間を連結する酵素である。図１に示すように、基質１はグルタミン残基（アシル供与体、アミン受容体）を提供し、基質２はリジン残基（アシル受容体、アミン供与体）を提供し、基質１と基質２とはイソペプチド結合［Ｎε−（γ−グルタミル）−Ｌ−リジン（ＧＧＥＬ）］によって共有結合する。図１において、Ｇ−Ｑ−Ｃ−Ｗ−Ｖ−Ｆ−Ａは、トランスグルタミナーゼの活性部位のアミノ酸配列を示す。この反応は、「ｐｉｎｇ−ｐｏｎｇ」反応であって、リジン残基に代えてモノアミン、ジアミン、ポリアミンなどのアミン化合物がアシル受容体として使用できる。
図１に示したトランスグルタミナーゼの反応メカニズムを考察すると、多くのアミン化合物がトランスグルタミナーゼの活性を抑制することができるものと期待される。このような物質の代表的なものとしては、シスタミン(cystamine) (Nature Genetics 18, 111-117, 1998; Nature Medicine 8, 143-149, 2002)とプトレッシン(putrescine)を挙げることができる。これらに対する生体内外実験結果は、既に多く報告されている。
【０００５】
前述した化合物の他にも別の化学的抑制剤らが開発されたが、いずれも、生体的に用いられる場合、非特異的な別の酵素の抑制を誘発する毒性を持つと知られている。本発明者によって以前に製造されたペプチド抑制剤がトランスグルタミナーゼの抑制剤として有効であるが、コストと安全性の面から、実用化するには依然として多くの問題が残っている。
そこで、本発明者は、既に安全性が認められて商用化されている天然物質のうち、トランスグルタミナーゼ抑制剤として有用な物質をスクリーニングした結果、グルコサミンまたはその誘導体からトランスグルタミナーゼ抑制剤としての活性を見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、グルコサミンまたはその誘導体を含むことを特徴とする、トランスグルタミナーゼ抑制剤を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、活性成分としてグルコサミンまたはその誘導体を使用することを特徴とする、トランスグルタミナーゼの抑制方法を提供することにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、グルコサミンまたはその誘導体を含む、トランスグルタミナーゼの活性の増加により引き起こされる疾病を治療するための薬学的組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、グルコサミンまたはその誘導体を用いて、トランスグルタミナーゼの活性の増加により引き起こされる疾病を治療する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一様態は、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含むトランスグルタミナーゼ抑制剤に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
グルコサミンは、海カニまたはエビ殻の主成分であるキトサンの分解産物である。海カニまたはエビ殻の主成分はキチンとキトサンである。キチンは２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチルグルコサミン）から構成されており、キトサンはキチンの脱アセチル化が起こった多糖類であって、ポリ（β−（１，４）−グルコサミン）である。グルコサミンは、下記化学式１で表される構造を持つ。
【化１】
【００１０】
本発明において、用語「グルコサミン誘導体」は、グルコサミンのヒドロキシ基の水素がアシルまたはアルキル化合物で置換されたもので、下記化学式２で表される構造を持つものをいう。
【化２】
【００１１】
式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖アルキルであって、好ましくは、例えばアセチル(acetyl)、プロピオニル(propionyl)、ブチリル(butyryl)、ペンタノイル(pentanoyl)、ヘキサノイル(hexanoyl)、ヘプタノイル(heptanoyl)、オクタノイル(octanoyl)、ノナノイル(nonanoyl)、デカノイル(decanoyl)、ウンデカノイル(undecanoyl)、ラウリル(lauryl)、トリデカノイル(tridecanoyl)、ミリスチル(myristyl)、ペンタデカノイル(pentadecanoyl)、パルミトイル(palmitoyl)、マルガリル(margaryl)またはステアリル(stearyl)基などのアシル基であり、またはメチル(methyl)、エチル(ethyl)、プロピル(propyl)、ブチル(butyl)、ペンチル(pentyl)、イソプロピル(isopropyl)、イソブチル(isobutyl)またはｓｅｃ−ブチル(sec-butyl)基などのアルキル基である。
【００１２】
前述したようにグルコサミンの１、３、４、６番のアルコール基に疎水性基を導入させる場合、グルコサミンの生理活性をそのまま持っていると信じられるアミン基はそのまま保有する。これにより、グルコサミンの生理活性をそのまま維持しながら天然でよく分解されるし、毒性がなく、重金属に対する高い吸着力を有し、抗菌活性に優れたグルコサミン誘導体を得ることができる。
【００１３】
本発明において、グルコサミンまたはその誘導体がトランスグルタミナーゼに対して抑制作用を示すメカニズムが明確に確認されてはいないが、グルコサミンの３次構造が椅子形状を有し、グルコサミンのアミン基がトランスグルタミナーゼの活性部位と結合してトランスグルタミナーゼの活性を抑制するものと推測される。
【００１４】
ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、１４Ｃで標識されたプトレッシン(putrescine)をサクシニル化カゼイン(succinylated casein)と結合させるトランスグルタミナーゼの反応にグルコサミンを添加したとき、トランスグルタミナーゼの活性はグルコサミンの濃度が増加するほど減少した（図２）。これは、グルコサミンがプトレッシンと競争してトランスグルタミナーゼの活性を抑制することを立証する。この結果より、グルコサミンまたはその誘導体がトランスグルタミナーゼの抑制剤であることが分かる。
【００１５】
本発明の他の様態は、活性成分としてグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を用いてトランスグルタミナーゼの活性を抑制する方法に関する。ミクログリア(microglia)は、免疫機能細胞であって、ＬＰＳによってＮＦ−κＢを活性化させ且つトランスグルタミナーゼの発現も増加させる。この際、トランスグルタミナーゼの作用を抑制すると、炎症主反応経路において転写物質として作用するＮＦ−κＢの活性も多く低下する。従って、ＬＰＳとグルコサミンを同時に処理すると、トランスグルタミナーゼの活性度とＮＦ−κＢの活性度との連関関係が分かる（図３）。
【００１６】
本発明の実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＬＰＳ処理された細胞においてＮＦ−κＢによって誘導される細胞の標識因子であるｉＮＯＳタンパク質量が増加したとき、グルコサミンで処理してｉＮＯＳタンパク質量が減少することを確認した（図３Ａ）。したがって、トランスグルタミナーゼが過剰発現するとき、グルコサミンまたはその誘導体を用いて、増加したトランスグルタミナーゼの活性を減らすことができることが分かる。
本発明の別の様態は、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む、トランスグルタミナーゼの活性の増加による疾病を予防、治療するための薬学的組成物、およびグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を用いて前記疾病を治療する方法に関する。
【００１７】
本発明において、用語「予防」とは、グルコサミンまたはグルコサミンの誘導体を含む組成物の投与によって、トランスグルタミナーゼの活性の増加による各種疾病の発病を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、前記薬学的組成物の投与によって、トランスグルタミナーゼの活性の増加による各種疾病を好転させ或いは有利に変更する全ての行為を意味する。
本発明において、トランスグルタミナーゼ活性の増加による疾病は、トランスグルタミナーゼの活性の増加、例えばトランスグルタミナーゼの過剰発現などにより引き起こされる各種疾病を含むが、具体的には神経系疾患と癌を含む。
【００１８】
神経系疾患の場合、神経細胞の死亡または損傷に関する疾患であって、特にアルツハイマー病、多発性梗塞性痴呆、アルツハイマー病と多発性梗塞性痴呆との混合型、パーキンソン病、甲状腺機能低下症、アルコール性痴呆アルツハイマー、ハンチントン病など、中枢神経系細胞の損傷および死亡による中枢神経系疾患が代表的である。このような疾病の主要症状は、認知機能の障害や、言語、判断、追想力、空間時間的増力およびその他の新規技術習得の障害などを含み、性格変化、情緒的不安定などの症状が現われるし、終局的には死亡に至る。本発明の薬学的組成物は、神経組織においてトランスグルタミナーゼが過剰発現するなど、トランスグルタミナーゼの活性が増加することにより引き起こされる疾病に使われるが、具体的には脳でトランスグルタミナーゼが過剰発現するハンチントン病(Nature Medicine, Vol 8. Number 2, February 2002 pp143-149)、小脳と大脳の皮質でトランスグルタミナーゼが過剰発現するアルツハイマー病(The Journal of Biological Chemistry, Vol. 274. No. 43. Issue Of October 22, pp 30715-30721)、αシヌクレイン(α synuclein)がトランスグルタミナーゼによって凝集するパーキンソン病(PNAS, February 18,2003, Vol. 100, no.4, pp2047-2052)などに使用できるが、これに制限されず、神経組織でトランスグルタミナーゼが過剰発現する全疾病の治療に使用できる。
【００１９】
癌の場合、癌の転移、化学的耐性、放射性耐性を持つ癌においてトランスグルタミナーゼの顕著な発現増加が確認されたので、トランスグルタミナーゼの抑制は癌の予防および治療の面からも重要である。本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む薬学的組成物を用いて予防または治療できる具体的な癌は、トランスグルタミナーゼの増加が現われる癌、例えば大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門癌、食道癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、子宮癌、乳癌、肺癌、リンパ腺癌、甲状腺癌、前立腺癌、白血病、皮膚癌、結腸癌、脳腫瘍、膀胱癌、卵素癌、胆嚢癌などを含み、これに制限されない。
【００２０】
本発明のグルコサミンまたはグルコサミンの誘導体を含む組成物および治療方法は、ヒドだけでなく、トランスグルタミナーゼの活性の増加による疾病が発病し得る牛、馬、羊、豚、山羊、ラクダ、れい洋、犬、猫などの哺乳動物にも使用できる。
本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む薬学的組成物は、単一剤としても使用することができ、公認された薬学組成物を含んで複合剤に製造して使用することもできる。
【００２１】
グルコサミンまたはグルコサミンの誘導体を含む薬学的組成物は、グルコサミンまたはグルコサミンの誘導体を含むカプセルに賦形剤なしに充填し、或いは微粒固体担体、液体担体またはその両者と均一に十分接触させて製造できる。その後、必要な場合、生成物を好適な製剤に成形して使用することができる。適切な担体賦形剤の例として、澱粉、水、食塩水、エタノール、グリセロール、リンガー液およびデキストロース溶液などを挙げることができ、文献(Remington`s Pharmaceutical Science, 19thEd., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA)などに開示されているところによって、当該技術分野に知られている適切な製剤に製剤化することができる。
【００２２】
本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む薬学的組成物は、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を有効成分として含むいずれの剤形にも適用可能であり、経口用または非経口用にも製造することができる。非経口用剤形は注射用、塗布用、エアロゾルなどのスプレイ型であってもよく、好ましくは注射用またはエアロゾルなどのスプレイ型である。また、経口用剤形も好ましい。
【００２３】
本発明の薬学的組成物を含む経口投与用剤形は、例えば錠剤、トローチ剤、薬用キャンデー、水溶性または油性懸濁液、調製粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤などを含む。錠剤およびカプセルなどの剤形に製剤するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、またはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油を含むことができ、カプセル剤形の場合、前述した物質の他にも脂質などの液体担体をさらに含むことができる。
【００２４】
本発明の薬学的組成物を非経口で投与する場合、非経口投与は、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用剤形、坐剤注入方式または呼吸器を介して吸入可能にするエアロゾル剤などのスプレイ用剤形に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を安定剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤する。坐剤として注入するためには、通常の坐薬ベース、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどを含む坐薬または治療浣腸剤などの直腸投与用組成物に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレイ用に剤形化する場合、水分散した濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤と共に配合できる。
【００２５】
本発明の薬学的組成物は、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻内、吸入、眼球内または皮内経路を介して通常の方式で投与することができる。非経口投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、経皮、並びに動脈内注射および注入をを含む投与方式を意味する。本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む薬学的組成物の非経口投与は、好ましい純度の下に薬学的に許容可能な担体、すなわち使用される濃度と投与量で受容体に対して非毒性であり且つ他の製剤成分と化合可能な担体と混合して単位投与量の剤形に調製することが好ましい。特に、製剤は、酸化剤および人体に有害なものと知られているその他の化合物を含まないことが好ましい。
【００２６】
本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体は、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤と共に薬学的組成物の形で投与できる。ヒト患者に投与される場合、本発明の薬学的組成物の総１日使用量が正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定できるのは、当業者には自明なことである。特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、他の製剤が使用されるか否かによる具体的組成物、例えば年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌などの患者の条件、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に使用されるまたは同時に使用される薬物などといった様々な因子、および医薬分野によく知られている類似因子によって異なる適用を行うことが好ましい。当該技術分野に知られている適切な製剤は、文献(Remington`s Pharmaceutical Science, 19thEd., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA)に記載されている。したがって、本発明の目的に適したグルコサミンまたはグルコサミンの誘導体の有効量は、前述した事項を考慮して決定することが好ましい。
以下、本発明を下記の実施例によって具体的に説明する。但し、下記実施例は本発明の理解を助けるためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１：トランスグルタミナーゼ活性度抑制のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
トランスグルタミナーゼが［１，４−１４Ｃ］プトレッシンをサクシニル化カゼインに結合させることを測定し、グルコサミンがプトレッシンと競争してその反応を抑制することを観察した。
【００２８】
反応緩衝溶液（０．５ｍＬ）は、次のように製造された：０．１Ｍトリス−アセテートｐＨ７．５、１％サクシニル化カゼイン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５％ ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５ｍＣｉの［１，４−１４Ｃ］プトレッシン（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；１１８ Ｃｉ／ｍｏｌｅ）。この反応緩衝溶液に、１００μＬとなるように精製されたトランスグルタミナーゼ酵素（Ｓｉｇｍａ Ｔ５３９８）２μＬ（１ｕｎｉｔ／ｍＬ）、および最終濃度がそれぞれ１、１０および１００ｍＭとなるようにグルコサミンを添加し、５０ｍＭトリス−アセテート緩衝溶液で溶液の体積が１００μＬなるようにした。よく混合した後、３７℃で１時間反応させ、４．５ｍＬの冷たい（４℃）７．５％ＴＣＡを混合して反応を終了した。ＴＣＡ−沈殿物をＧＦ−ガラス繊維フィルターで濾過し、５％ＴＣＡで１０倍の体積となるように洗浄した後、乾燥させ、トランスグルタミナーゼ触媒によって１４Ｃ−プトレッシンが標識されたカゼインをβ−カウンターで測定した。
グルコサミン濃度によって測定された相対的なトランスグルタミナーゼ抑制活性（％）を図２に示した。図２に示すように、トランスグルタミナーゼの活性はグルコサミンの濃度に依存的に抑制されることが分かる。
【００２９】
実施例２：ＢＶ２ミクログリアを用いた細胞培養実験
ＬＰＳによって活性化されたミクログリア、マウス(murine)ＢＶ−２細胞は、反応性ミクログリアの表現型および機能的特性を示す。トランスグルタミナーゼ抑制効果を確認するために、ＮＦ−κＢの活性度を観察した。ＮＦ−κＢの活性度の観察は、この転写物質によって誘導されるｉＮＯＳを測定することにより行われた。
細胞は、５％ＣＯ２、３７℃の培養器で１０％牛胎児血清とフェニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤｕｌｖｅｃｃｏの変性Ｅａｇｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持された。ＢＶ−２を活性化させるために、２４時間ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を処理した。
【００３０】
トランスグルタミナーゼの細胞内における活性度を測定するために、１４Ｃ−プトレッシン４．５ｎｍｏｌｅ（１．１１×１０６ｄｐｍ）／ｍＬを培養液に混合して２４時間処理した。細胞は、それぞれ１、１０および１００ｍＭのグルコサミンを処理したものと処理していないものに分け、それぞれ２４時間ＬＰＳを処理した後、ＢＶ−２からプロテアーゼ抑制剤を含んだ放射免疫沈澱測定用緩衝液（１×リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ）で粉砕した。粉砕混合物を１００，０００×ｇで１時間遠心分離し、上澄み液はｉＮＯＳウェスタンブロッティングに使用した。その結果を図３Ａに示した。
【００３１】
遠心分離によって得られた沈殿物は、ＴＥＮＴ緩衝液（５０ｍＭトリス−アセテート、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトン−Ｘ１００）と共に振湯して洗浄した後、１０，０００×ｇで１０分間沈澱させた。沈殿物を０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＤＴＴ溶液で１０分間水浴で沸かし、１００，０００×ｇで１５分間遠心分離して再び沈殿物を得た。前記過程を１回繰り返し行った後、沈殿物はβ−カウンターで放射線を測定した。その測定結果を図３Ｂに示した。
【００３２】
図３Ａに示すように、ＬＰＳ処理によって炎症細胞の標識因子であるｉＮＯＳのタンパク質量が増加するが、ここにグルコサミンを処理すると、ｉＮＯＳが減少する。
このような状況でトランスグルタミナーゼのｉｎ ｖｉｖｏ活性を測定すると、図３Ｂに示すように、グルコサミンの濃度に依存してトランスグルタミナーゼの活性が抑制されることが分かる。
【００３３】
トランスグルタミナーゼによって架橋結合が増加すると、その中に１４Ｃ−プトレッシンが多く増加し、トランスグルタミナーゼが抑制されると、減少する。
ウェスタンブロッティングサンプルは、トリシン(Tricine)緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた１０〜２０％グラジエントＳＤＳゲルから分離した後、ポリビニリデンジフルオリドメンブレイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移動させた。ウェスタンブロッティングは、以前と同様の方法で行った。ｉＮＯＳ抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｃｏ．から入手し、陰性対照群として乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogense)（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）を購入して対照群として使用した。１次および２次抗体の濃度は、それぞれ５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬとした。そして、強化された化学的発光体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）でブロットした。
【００３４】
実施例３：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫を用いた細胞培養実験
トランスグルタミナーゼの形質感染のために、遺伝子取り込みに使用するヒトの神経芽細胞腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１０％の熱によって非活性化された牛胎児血清、グルタミン、フェニシリン／ストレプトマイシンが含まれたＤｕｌｂｅｃｃｏの変性されたＥａｇｌｅ培地／ＨａｍのＦ１２ 培地（５０：５０）で培養した。クローン変異を回避するために、Ｆｌｐ−ＩｎＴＭシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏ）を導入した。空ベクターのあるＳＨ−ＳＹ５Ｙを陽性対照区（Ｗｉｌｄ）として使用し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターに全長のトランスグルタミナーゼをクローニングしてＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＴＧを製造した。
【００３５】
選別した後、正常細胞の成長基準、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の遊離、４’、６’−ジアミノジノ−２−フェニルインドル、二塩酸塩ステイニング、カスパーゼ(caspase)の活性度、およびアネキシン(annexin)ＶステイニングによってＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＴＧ細胞のアポトーシスは増加していないことを確認した。これは、トランスグルタミナーゼの取り込まれた神経芽細胞腫が酸化的な環境に晒されなければアポトーシスが増加しないという以前の報告と一致する結果である。
【００３６】
このように構築された細胞株では、常時ＮＦ−κＢが活性化され(J. Biol. Chem. 279, 53725-53735, 2004)、トランスグルタミナーゼの過剰発現によるＮＦ−κＢの活性化モデルになった。ここにトランスグルタミナーゼの抑制剤が投与される場合、ＮＦ−κＢはさらに非活性化された。
【００３７】
トランスグルタミナーゼの抑制効果を調べるために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＴＧ細胞に１０ｍＭグルコサミン（ＧＭ）、２００μＭシスタミン（ＣＴＭ）、２ｎＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を添加して３時間培養させた後、Ｓｉｇｍａの核抽出物キットを用いてサイトゾル分画物を得た。前記細胞に何のトランスグルタミナーゼ抑制剤も添加していない培養物から得たサイトゾル分画物を陰性対照群（Ｃｔ）とした。得られたサイトゾル分画物を用いてウェスタンブロッティングを行った。Ｉ−ｋＢα抗体(Cell Signaling)を用いて、前記実施例２に記載の方法と同様の方法によって実験を行った。その実験結果を図４に示した。
図４Ａに示したウェスタンブロッティングでＩ−ｋＢαが検出された結果より、他のトランスグルタミナーゼ抑制剤と同様に、グルコサミンがトランスグルタミナーゼを抑制することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を活性成分として含むことを特徴とする、トランスグルタミナーゼ抑制剤およびトランスグルタミナーゼの抑制方法を提供することができる。
本発明に係るグルコサミンまたはその誘導体を用いてトランスグルタミナーゼを抑制する新規方法は、トランスグルタミナーゼの過剰発現により引き起こされる疾患に苦しめられる患者に治療的に安定且つ効果的に副作用もなく適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能であろう。
【図１】図１はトランスグルタミナーゼの酵素反応メカニズムを示す概略図である。
【図２】図２は本発明の方法に係るｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるグルコサミンのトランスグルタミナーゼ抑制効果を示すグラフである。
【図３】図３はＬＰＳによって活性化されたミクログリア細胞における本発明に係るグルコサミンによるトランスグルタミナーゼの抑制効果を示すもので、図３ＡはｉＮＯＳとＬＤＨのウェスタンブロッティング結果であり、図３Ｂはグルコサミンの濃度によるトランスグルタミナーゼ抑制活性を示すグラフである。
【図４】図４はグルコサミンとグルコサミン以外のトランスグルタミナーゼ抑制剤を用いてトランスグルタミナーゼを抑制することによりＩ−ｋＢαが回復することを検出した結果であって、図４ＡはＩ−ｋＢαのウェスタンブロッティング結果であり、図４Ｂはトランスグルタミナーゼ抑制剤の種類によるＩ−ｋＢαの相対的発現密度を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコサミンまたはその誘導体を含むトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）抑制剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、過剰発現の場合、様々な疾病の病因に関与するトランスグルタミナーゼの活性を抑制するためのグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含むトランスグルタミナーゼ抑制剤、およびこれらの新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスグルタミナーゼ(Transglutaminase)は、正常的な状況では血液凝固や傷治癒などの保護的作用をする酵素である。ところが、その発現が調節されない場合には、様々な疾病の病理的メカニズムで主要な役割をするものと知られている(総論. Soo-Youl Kim: New Target Against Inflammatory Diseases: Transglutaminase 2. Archivum Immunologiae & Therapiae Experimentalis 52, 332-337, 2004)。
【０００３】
特に、例えば退行性関節炎や糖尿病、自己免疫筋肉炎、動脈硬化、脳卒中、肝硬変、悪性乳癌、脳膜炎、炎症性胃潰瘍などの炎症性疾患においてトランスグルタミナーゼの発現が多く増加する。
最近、Ｓｏｈｎ等は、モルモットに花粉を用いて誘発させたアレルギー性結膜炎モデルから、ペプチドからなるトランスグルタミナーゼ抑制剤を用いて、ステロイドに匹敵する効果を得ることに成功した(Sohn, J., Kim, T.-I., Yoon, Y.-H., and Kim, S.-Y. Transglutaminase inhibitor: A New Anti-Inflammatory Approach in Allergic Conjunctivitis. J. Clin. Invest. 111, 121-8, 2003; Soo-Youl Kim.Transglutaminase 2 in inflammation. Front Biosci. 11, 3026-3035, 2006)。
【０００４】
このような理由により、新薬開発の次元で安全且つ効果的なトランスグルタミナーゼ抑制剤に関する研究が求められている実情である。
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ、Ｅ．Ｄ．２．３．２．１３）は、カルシウム依存性架橋結合促進酵素であって、タンパク質を構成しているグルタミン残基とリジン残基との間を連結する酵素である。図１に示すように、基質１はグルタミン残基（アシル供与体、アミン受容体）を提供し、基質２はリジン残基（アシル受容体、アミン供与体）を提供し、基質１と基質２とはイソペプチド結合［Ｎε−（γ−グルタミル）−Ｌ−リジン（ＧＧＥＬ）］によって共有結合する。図１において、Ｇ−Ｑ−Ｃ−Ｗ−Ｖ−Ｆ−Ａは、トランスグルタミナーゼの活性部位のアミノ酸配列を示す。この反応は、「ｐｉｎｇ−ｐｏｎｇ」反応であって、リジン残基に代えてモノアミン、ジアミン、ポリアミンなどのアミン化合物がアシル受容体として使用できる。
図１に示したトランスグルタミナーゼの反応メカニズムを考察すると、多くのアミン化合物がトランスグルタミナーゼの活性を抑制することができるものと期待される。このような物質の代表的なものとしては、シスタミン(cystamine) (Nature Genetics 18, 111-117, 1998; Nature Medicine 8, 143-149, 2002)とプトレッシン(putrescine)を挙げることができる。これらに対する生体内外実験結果は、既に多く報告されている。
【０００５】
前述した化合物の他にも別の化学的抑制剤らが開発されたが、いずれも、生体的に用いられる場合、非特異的な別の酵素の抑制を誘発する毒性を持つと知られている。本発明者によって以前に製造されたペプチド抑制剤がトランスグルタミナーゼの抑制剤として有効であるが、コストと安全性の面から、実用化するには依然として多くの問題が残っている。
そこで、本発明者は、既に安全性が認められて商用化されている天然物質のうち、トランスグルタミナーゼ抑制剤として有用な物質をスクリーニングした結果、グルコサミンまたはその誘導体からトランスグルタミナーゼ抑制剤としての活性を見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、グルコサミンまたはその誘導体を含むことを特徴とする、トランスグルタミナーゼ抑制剤を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、活性成分としてグルコサミンまたはその誘導体を使用することを特徴とする、トランスグルタミナーゼの抑制方法を提供することにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、グルコサミンまたはその誘導体を含む、トランスグルタミナーゼの活性の増加により引き起こされる疾病を治療するための薬学的組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、グルコサミンまたはその誘導体を用いて、トランスグルタミナーゼの活性の増加により引き起こされる疾病を治療する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一様態は、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含むトランスグルタミナーゼ抑制剤に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
グルコサミンは、海カニまたはエビ殻の主成分であるキトサンの分解産物である。海カニまたはエビ殻の主成分はキチンとキトサンである。キチンは２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチルグルコサミン）から構成されており、キトサンはキチンの脱アセチル化が起こった多糖類であって、ポリ（β−（１，４）−グルコサミン）である。グルコサミンは、下記化学式１で表される構造を持つ。
【化１】
【００１０】
本発明において、用語「グルコサミン誘導体」は、グルコサミンのヒドロキシ基の水素がアシルまたはアルキル化合物で置換されたもので、下記化学式２で表される構造を持つものをいう。
【化２】
【００１１】
式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖アルキルであって、好ましくは、例えばアセチル(acetyl)、プロピオニル(propionyl)、ブチリル(butyryl)、ペンタノイル(pentanoyl)、ヘキサノイル(hexanoyl)、ヘプタノイル(heptanoyl)、オクタノイル(octanoyl)、ノナノイル(nonanoyl)、デカノイル(decanoyl)、ウンデカノイル(undecanoyl)、ラウリル(lauryl)、トリデカノイル(tridecanoyl)、ミリスチル(myristyl)、ペンタデカノイル(pentadecanoyl)、パルミトイル(palmitoyl)、マルガリル(margaryl)またはステアリル(stearyl)基などのアシル基であり、またはメチル(methyl)、エチル(ethyl)、プロピル(propyl)、ブチル(butyl)、ペンチル(pentyl)、イソプロピル(isopropyl)、イソブチル(isobutyl)またはｓｅｃ−ブチル(sec-butyl)基などのアルキル基である。
【００１２】
前述したようにグルコサミンの１、３、４、６番のアルコール基に疎水性基を導入させる場合、グルコサミンの生理活性をそのまま持っていると信じられるアミン基はそのまま保有する。これにより、グルコサミンの生理活性をそのまま維持しながら天然でよく分解されるし、毒性がなく、重金属に対する高い吸着力を有し、抗菌活性に優れたグルコサミン誘導体を得ることができる。
【００１３】
本発明において、グルコサミンまたはその誘導体がトランスグルタミナーゼに対して抑制作用を示すメカニズムが明確に確認されてはいないが、グルコサミンの３次構造が椅子形状を有し、グルコサミンのアミン基がトランスグルタミナーゼの活性部位と結合してトランスグルタミナーゼの活性を抑制するものと推測される。
【００１４】
ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、１４Ｃで標識されたプトレッシン(putrescine)をサクシニル化カゼイン(succinylated casein)と結合させるトランスグルタミナーゼの反応にグルコサミンを添加したとき、トランスグルタミナーゼの活性はグルコサミンの濃度が増加するほど減少した（図２）。これは、グルコサミンがプトレッシンと競争してトランスグルタミナーゼの活性を抑制することを立証する。この結果より、グルコサミンまたはその誘導体がトランスグルタミナーゼの抑制剤であることが分かる。
【００１５】
本発明の他の様態は、活性成分としてグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を用いてトランスグルタミナーゼの活性を抑制する方法に関する。ミクログリア(microglia)は、免疫機能細胞であって、ＬＰＳによってＮＦ−κＢを活性化させ且つトランスグルタミナーゼの発現も増加させる。この際、トランスグルタミナーゼの作用を抑制すると、炎症主反応経路において転写物質として作用するＮＦ−κＢの活性も多く低下する。従って、ＬＰＳとグルコサミンを同時に処理すると、トランスグルタミナーゼの活性度とＮＦ−κＢの活性度との連関関係が分かる（図３）。
【００１６】
本発明の実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＬＰＳ処理された細胞においてＮＦ−κＢによって誘導される細胞の標識因子であるｉＮＯＳタンパク質量が増加したとき、グルコサミンで処理してｉＮＯＳタンパク質量が減少することを確認した（図３Ａ）。したがって、トランスグルタミナーゼが過剰発現するとき、グルコサミンまたはその誘導体を用いて、増加したトランスグルタミナーゼの活性を減らすことができることが分かる。
本発明の別の様態は、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む、トランスグルタミナーゼの活性の増加による疾病を予防、治療するための薬学的組成物、およびグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を用いて前記疾病を治療する方法に関する。
【００１７】
本発明において、用語「予防」とは、グルコサミンまたはグルコサミンの誘導体を含む組成物の投与によって、トランスグルタミナーゼの活性の増加による各種疾病の発病を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、前記薬学的組成物の投与によって、トランスグルタミナーゼの活性の増加による各種疾病を好転させ或いは有利に変更する全ての行為を意味する。
本発明において、トランスグルタミナーゼ活性の増加による疾病は、トランスグルタミナーゼの活性の増加、例えばトランスグルタミナーゼの過剰発現などにより引き起こされる各種疾病を含むが、具体的には神経系疾患と癌を含む。
【００１８】
神経系疾患の場合、神経細胞の死亡または損傷に関する疾患であって、特にアルツハイマー病、多発性梗塞性痴呆、アルツハイマー病と多発性梗塞性痴呆との混合型、パーキンソン病、甲状腺機能低下症、アルコール性痴呆アルツハイマー、ハンチントン病など、中枢神経系細胞の損傷および死亡による中枢神経系疾患が代表的である。このような疾病の主要症状は、認知機能の障害や、言語、判断、追想力、空間時間的増力およびその他の新規技術習得の障害などを含み、性格変化、情緒的不安定などの症状が現われるし、終局的には死亡に至る。本発明の薬学的組成物は、神経組織においてトランスグルタミナーゼが過剰発現するなど、トランスグルタミナーゼの活性が増加することにより引き起こされる疾病に使われるが、具体的には脳でトランスグルタミナーゼが過剰発現するハンチントン病(Nature Medicine, Vol 8. Number 2, February 2002 pp143-149)、小脳と大脳の皮質でトランスグルタミナーゼが過剰発現するアルツハイマー病(The Journal of Biological Chemistry, Vol. 274. No. 43. Issue Of October 22, pp 30715-30721)、αシヌクレイン(α synuclein)がトランスグルタミナーゼによって凝集するパーキンソン病(PNAS, February 18,2003, Vol. 100, no.4, pp2047-2052)などに使用できるが、これに制限されず、神経組織でトランスグルタミナーゼが過剰発現する全疾病の治療に使用できる。
【００１９】
癌の場合、癌の転移、化学的耐性、放射性耐性を持つ癌においてトランスグルタミナーゼの顕著な発現増加が確認されたので、トランスグルタミナーゼの抑制は癌の予防および治療の面からも重要である。本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む薬学的組成物を用いて予防または治療できる具体的な癌は、トランスグルタミナーゼの増加が現われる癌、例えば大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門癌、食道癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、子宮癌、乳癌、肺癌、リンパ腺癌、甲状腺癌、前立腺癌、白血病、皮膚癌、結腸癌、脳腫瘍、膀胱癌、卵素癌、胆嚢癌などを含み、これに制限されない。
【００２０】
本発明のグルコサミンまたはグルコサミンの誘導体を含む組成物および治療方法は、ヒドだけでなく、トランスグルタミナーゼの活性の増加による疾病が発病し得る牛、馬、羊、豚、山羊、ラクダ、れい洋、犬、猫などの哺乳動物にも使用できる。
本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む薬学的組成物は、単一剤としても使用することができ、公認された薬学組成物を含んで複合剤に製造して使用することもできる。
【００２１】
グルコサミンまたはグルコサミンの誘導体を含む薬学的組成物は、グルコサミンまたはグルコサミンの誘導体を含むカプセルに賦形剤なしに充填し、或いは微粒固体担体、液体担体またはその両者と均一に十分接触させて製造できる。その後、必要な場合、生成物を好適な製剤に成形して使用することができる。適切な担体賦形剤の例として、澱粉、水、食塩水、エタノール、グリセロール、リンガー液およびデキストロース溶液などを挙げることができ、文献(Remington`s Pharmaceutical Science, 19thEd., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA)などに開示されているところによって、当該技術分野に知られている適切な製剤に製剤化することができる。
【００２２】
本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む薬学的組成物は、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を有効成分として含むいずれの剤形にも適用可能であり、経口用または非経口用にも製造することができる。非経口用剤形は注射用、塗布用、エアロゾルなどのスプレイ型であってもよく、好ましくは注射用またはエアロゾルなどのスプレイ型である。また、経口用剤形も好ましい。
【００２３】
本発明の薬学的組成物を含む経口投与用剤形は、例えば錠剤、トローチ剤、薬用キャンデー、水溶性または油性懸濁液、調製粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤などを含む。錠剤およびカプセルなどの剤形に製剤するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、またはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油を含むことができ、カプセル剤形の場合、前述した物質の他にも脂質などの液体担体をさらに含むことができる。
【００２４】
本発明の薬学的組成物を非経口で投与する場合、非経口投与は、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用剤形、坐剤注入方式または呼吸器を介して吸入可能にするエアロゾル剤などのスプレイ用剤形に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を安定剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤する。坐剤として注入するためには、通常の坐薬ベース、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどを含む坐薬または治療浣腸剤などの直腸投与用組成物に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレイ用に剤形化する場合、水分散した濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤と共に配合できる。
【００２５】
本発明の薬学的組成物は、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻内、吸入、眼球内または皮内経路を介して通常の方式で投与することができる。非経口投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、経皮、並びに動脈内注射および注入をを含む投与方式を意味する。本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む薬学的組成物の非経口投与は、好ましい純度の下に薬学的に許容可能な担体、すなわち使用される濃度と投与量で受容体に対して非毒性であり且つ他の製剤成分と化合可能な担体と混合して単位投与量の剤形に調製することが好ましい。特に、製剤は、酸化剤および人体に有害なものと知られているその他の化合物を含まないことが好ましい。
【００２６】
本発明のグルコサミンまたはグルコサミン誘導体は、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤と共に薬学的組成物の形で投与できる。ヒト患者に投与される場合、本発明の薬学的組成物の総１日使用量が正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定できるのは、当業者には自明なことである。特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、他の製剤が使用されるか否かによる具体的組成物、例えば年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌などの患者の条件、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に使用されるまたは同時に使用される薬物などといった様々な因子、および医薬分野によく知られている類似因子によって異なる適用を行うことが好ましい。当該技術分野に知られている適切な製剤は、文献(Remington`s Pharmaceutical Science, 19thEd., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA)に記載されている。したがって、本発明の目的に適したグルコサミンまたはグルコサミンの誘導体の有効量は、前述した事項を考慮して決定することが好ましい。
以下、本発明を下記の実施例によって具体的に説明する。但し、下記実施例は本発明の理解を助けるためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１：トランスグルタミナーゼ活性度抑制のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
トランスグルタミナーゼが［１，４−１４Ｃ］プトレッシンをサクシニル化カゼインに結合させることを測定し、グルコサミンがプトレッシンと競争してその反応を抑制することを観察した。
【００２８】
反応緩衝溶液（０．５ｍＬ）は、次のように製造された：０．１Ｍトリス−アセテートｐＨ７．５、１％サクシニル化カゼイン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５％ ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５ｍＣｉの［１，４−１４Ｃ］プトレッシン（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；１１８ Ｃｉ／ｍｏｌｅ）。この反応緩衝溶液に、１００μＬとなるように精製されたトランスグルタミナーゼ酵素（Ｓｉｇｍａ Ｔ５３９８）２μＬ（１ｕｎｉｔ／ｍＬ）、および最終濃度がそれぞれ１、１０および１００ｍＭとなるようにグルコサミンを添加し、５０ｍＭトリス−アセテート緩衝溶液で溶液の体積が１００μＬなるようにした。よく混合した後、３７℃で１時間反応させ、４．５ｍＬの冷たい（４℃）７．５％ＴＣＡを混合して反応を終了した。ＴＣＡ−沈殿物をＧＦ−ガラス繊維フィルターで濾過し、５％ＴＣＡで１０倍の体積となるように洗浄した後、乾燥させ、トランスグルタミナーゼ触媒によって１４Ｃ−プトレッシンが標識されたカゼインをβ−カウンターで測定した。
グルコサミン濃度によって測定された相対的なトランスグルタミナーゼ抑制活性（％）を図２に示した。図２に示すように、トランスグルタミナーゼの活性はグルコサミンの濃度に依存的に抑制されることが分かる。
【００２９】
実施例２：ＢＶ２ミクログリアを用いた細胞培養実験
ＬＰＳによって活性化されたミクログリア、マウス(murine)ＢＶ−２細胞は、反応性ミクログリアの表現型および機能的特性を示す。トランスグルタミナーゼ抑制効果を確認するために、ＮＦ−κＢの活性度を観察した。ＮＦ−κＢの活性度の観察は、この転写物質によって誘導されるｉＮＯＳを測定することにより行われた。
細胞は、５％ＣＯ２、３７℃の培養器で１０％牛胎児血清とフェニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤｕｌｖｅｃｃｏの変性Ｅａｇｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持された。ＢＶ−２を活性化させるために、２４時間ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を処理した。
【００３０】
トランスグルタミナーゼの細胞内における活性度を測定するために、１４Ｃ−プトレッシン４．５ｎｍｏｌｅ（１．１１×１０６ｄｐｍ）／ｍＬを培養液に混合して２４時間処理した。細胞は、それぞれ１、１０および１００ｍＭのグルコサミンを処理したものと処理していないものに分け、それぞれ２４時間ＬＰＳを処理した後、ＢＶ−２からプロテアーゼ抑制剤を含んだ放射免疫沈澱測定用緩衝液（１×リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ）で粉砕した。粉砕混合物を１００，０００×ｇで１時間遠心分離し、上澄み液はｉＮＯＳウェスタンブロッティングに使用した。その結果を図３Ａに示した。
【００３１】
遠心分離によって得られた沈殿物は、ＴＥＮＴ緩衝液（５０ｍＭトリス−アセテート、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトン−Ｘ１００）と共に振湯して洗浄した後、１０，０００×ｇで１０分間沈澱させた。沈殿物を０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＤＴＴ溶液で１０分間水浴で沸かし、１００，０００×ｇで１５分間遠心分離して再び沈殿物を得た。前記過程を１回繰り返し行った後、沈殿物はβ−カウンターで放射線を測定した。その測定結果を図３Ｂに示した。
【００３２】
図３Ａに示すように、ＬＰＳ処理によって炎症細胞の標識因子であるｉＮＯＳのタンパク質量が増加するが、ここにグルコサミンを処理すると、ｉＮＯＳが減少する。
このような状況でトランスグルタミナーゼのｉｎ ｖｉｖｏ活性を測定すると、図３Ｂに示すように、グルコサミンの濃度に依存してトランスグルタミナーゼの活性が抑制されることが分かる。
【００３３】
トランスグルタミナーゼによって架橋結合が増加すると、その中に１４Ｃ−プトレッシンが多く増加し、トランスグルタミナーゼが抑制されると、減少する。
ウェスタンブロッティングサンプルは、トリシン(Tricine)緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた１０〜２０％グラジエントＳＤＳゲルから分離した後、ポリビニリデンジフルオリドメンブレイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移動させた。ウェスタンブロッティングは、以前と同様の方法で行った。ｉＮＯＳ抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｃｏ．から入手し、陰性対照群として乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogense)（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）を購入して対照群として使用した。１次および２次抗体の濃度は、それぞれ５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬとした。そして、強化された化学的発光体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）でブロットした。
【００３４】
実施例３：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫を用いた細胞培養実験
トランスグルタミナーゼの形質感染のために、遺伝子取り込みに使用するヒトの神経芽細胞腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１０％の熱によって非活性化された牛胎児血清、グルタミン、フェニシリン／ストレプトマイシンが含まれたＤｕｌｂｅｃｃｏの変性されたＥａｇｌｅ培地／ＨａｍのＦ１２ 培地（５０：５０）で培養した。クローン変異を回避するために、Ｆｌｐ−ＩｎＴＭシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏ）を導入した。空ベクターのあるＳＨ−ＳＹ５Ｙを陽性対照区（Ｗｉｌｄ）として使用し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターに全長のトランスグルタミナーゼをクローニングしてＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＴＧを製造した。
【００３５】
選別した後、正常細胞の成長基準、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の遊離、４’、６’−ジアミノジノ−２−フェニルインドル、二塩酸塩ステイニング、カスパーゼ(caspase)の活性度、およびアネキシン(annexin)ＶステイニングによってＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＴＧ細胞のアポトーシスは増加していないことを確認した。これは、トランスグルタミナーゼの取り込まれた神経芽細胞腫が酸化的な環境に晒されなければアポトーシスが増加しないという以前の報告と一致する結果である。
【００３６】
このように構築された細胞株では、常時ＮＦ−κＢが活性化され(J. Biol. Chem. 279, 53725-53735, 2004)、トランスグルタミナーゼの過剰発現によるＮＦ−κＢの活性化モデルになった。ここにトランスグルタミナーゼの抑制剤が投与される場合、ＮＦ−κＢはさらに非活性化された。
【００３７】
トランスグルタミナーゼの抑制効果を調べるために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＴＧ細胞に１０ｍＭグルコサミン（ＧＭ）、２００μＭシスタミン（ＣＴＭ）、２ｎＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を添加して３時間培養させた後、Ｓｉｇｍａの核抽出物キットを用いてサイトゾル分画物を得た。前記細胞に何のトランスグルタミナーゼ抑制剤も添加していない培養物から得たサイトゾル分画物を陰性対照群（Ｃｔ）とした。得られたサイトゾル分画物を用いてウェスタンブロッティングを行った。Ｉ−ｋＢα抗体(Cell Signaling)を用いて、前記実施例２に記載の方法と同様の方法によって実験を行った。その実験結果を図４に示した。
図４Ａに示したウェスタンブロッティングでＩ−ｋＢαが検出された結果より、他のトランスグルタミナーゼ抑制剤と同様に、グルコサミンがトランスグルタミナーゼを抑制することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を活性成分として含むことを特徴とする、トランスグルタミナーゼ抑制剤およびトランスグルタミナーゼの抑制方法を提供することができる。
本発明に係るグルコサミンまたはその誘導体を用いてトランスグルタミナーゼを抑制する新規方法は、トランスグルタミナーゼの過剰発現により引き起こされる疾患に苦しめられる患者に治療的に安定且つ効果的に副作用もなく適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能であろう。
【図１】図１はトランスグルタミナーゼの酵素反応メカニズムを示す概略図である。
【図２】図２は本発明の方法に係るｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるグルコサミンのトランスグルタミナーゼ抑制効果を示すグラフである。
【図３】図３はＬＰＳによって活性化されたミクログリア細胞における本発明に係るグルコサミンによるトランスグルタミナーゼの抑制効果を示すもので、図３ＡはｉＮＯＳとＬＤＨのウェスタンブロッティング結果であり、図３Ｂはグルコサミンの濃度によるトランスグルタミナーゼ抑制活性を示すグラフである。
【図４】図４はグルコサミンとグルコサミン以外のトランスグルタミナーゼ抑制剤を用いてトランスグルタミナーゼを抑制することによりＩ−ｋＢαが回復することを検出した結果であって、図４ＡはＩ−ｋＢαのウェスタンブロッティング結果であり、図４Ｂはトランスグルタミナーゼ抑制剤の種類によるＩ−ｋＢαの相対的発現密度を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含むトランスグルタミナーゼ抑制剤。
【請求項２】
グルコサミン誘導体は下記化学式２で表されることを特徴とする、請求項１に記載のトランスグルタミナーゼ抑制剤。
【化１】
（式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基である。）
【請求項３】
グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を用いてトランスグルタミナーゼの活性を抑制する方法。
【請求項４】
グルコサミン誘導体は下記化学式２で表されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【化２】
（式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基である。）
【請求項５】
グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む、トランスグルタミナーゼの活性の増加により引き起こされる疾病を治療または予防するための薬学的組成物。
【請求項６】
前記疾病は癌または神経系疾患であることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
神経系疾患はアルツハイマー病、ハンチントン病またはパーキンソン病であることを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
グルコサミン誘導体は下記化学式２で表されることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【化３】
（式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基である。）
【請求項９】
グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を投与することを含む、トランスグルタミナーゼの活性の増加により引き起こされる疾病の治療または予防方法。
【請求項１０】
グルコサミン誘導体は下記化学式２で表されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【化４】
（式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基である。）
【請求項１１】
前記疾病は癌または神経系疾患であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
神経系疾患はアルツハイマー病、ハンチントン病またはパーキンソン病であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含むトランスグルタミナーゼ抑制剤。
【請求項２】
グルコサミン誘導体は下記化学式２で表されることを特徴とする、請求項１に記載のトランスグルタミナーゼ抑制剤。
【化１】
（式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基である。）
【請求項３】
グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を用いてトランスグルタミナーゼの活性を抑制する方法。
【請求項４】
グルコサミン誘導体は下記化学式２で表されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【化２】
（式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基である。）
【請求項５】
グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を含む、トランスグルタミナーゼの活性の増加により引き起こされる疾病を治療または予防するための薬学的組成物。
【請求項６】
前記疾病は癌または神経系疾患であることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
神経系疾患はアルツハイマー病、ハンチントン病またはパーキンソン病であることを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
グルコサミン誘導体は下記化学式２で表されることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【化３】
（式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基である。）
【請求項９】
グルコサミンまたはグルコサミン誘導体を投与することを含む、トランスグルタミナーゼの活性の増加により引き起こされる疾病の治療または予防方法。
【請求項１０】
グルコサミン誘導体は下記化学式２で表されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【化４】
（式中、Ｒは炭素数２〜１８のアシル基、または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基である。）
【請求項１１】
前記疾病は癌または神経系疾患であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
神経系疾患はアルツハイマー病、ハンチントン病またはパーキンソン病であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５０３０６１（Ｐ２００９−５０３０６１Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２４８７９（Ｐ２００８−５２４８７９）
【出願日】平成１８年６月２３日（２００６．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００２４３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２６９９６
【国際公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５０７１５１１２４）ナショナル キャンサー センター (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２３日（２００６．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００２４３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２６９９６
【国際公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５０７１５１１２４）ナショナル キャンサー センター (9)
【Ｆターム（参考）】
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