本発明は、トランスジェニック植物イベントに由来する材料の検出に関する。特に本発明は、トランスジェニック植物イベントの選択に依拠し、トランスジェニック植物イベントに由来する遺伝子組み換え材料が試料中に存在するか不在であるかを検出する方法、試薬、キット及び参照用物質を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック植物イベントに由来する材料の検出に関する。特に、本発明は、トランスジェニック植物イベントに由来し、トランスジェニック植物イベントを選択することができると考えられる、遺伝子組み換え材料が試料内に存在するか又は不在であるかを検出するための方法、 試薬、キット、並びに参照用物質を提供する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝学的にモデファイされた生物(GMO), 特に遺伝学的にモデファイされた植物は、農業において重要であり、食品および飼料の生産及び市場取引においても重要である。
【０００３】
しかしながら、ＧＭＯの存在は、環境および消費者の健康に影響を及ぼすので、新しいＧＭＯを導入するためには、通常、欧州共同体を含む多くの国で、規制の承認を受けることが必要となる。ＧＭＯを含む又はＧＭＯから生産される食品および飼料は、それ自体、認定され、表示が義務付けられている（例えば、規制(EC) no. 1829/2003. Off J Eur Communities: Legis. 2003, L268: 1-23；規制（EC) no. 1830/2003. Off J Eur Communities: Legis. 2003, L268: 24-28参照).
【０００４】
環境において並びに栽培過程および食物生産連鎖を通してＧＭＯを追跡することは、環境リスクアセッスメントにとって基本的なことであり、また消費者の信頼を維持するためには、ＧＭＯ生産物表示等の強制的規定を遵守し、それを証明することも必要である。
【０００５】
このことは、ＧＭＯあるいはＧＭＯを起源とする又は由来する材料（例えば食糧源、成分及び／又は加工された製品）の存在、同一性、及び／または含有量を決めることができる有効な方法を要求する。ＤＮＡが、タンパク質のような他の分子よりも、少なくとも物理的および化学的な食品加工処理によく耐えることができるという点から、DNAをベースとする方法は、大変有用である。例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＧＭＯを起源とするＤＮＡの存在の指標となる核酸量の決定に、特異的および高感度な方法であることが分かっている。
【０００６】
選抜した植物形質転換イベントに由来する遺伝物質が、試料中に存在するか又は不在であるかをはっきりと結論づけることについて、アッセイは有用に用いられる。一般に、このようなアッセイとしては、注目する植物形質転換で見いだされる、固有のイベント特異的なヌクレオチド配列で、他のイベントには存在しない配列を検出できるものが用いられる。このようにして区別されるヌクレオチド配列は、ＧＭＯの内因的ゲノム配列とトランスフォーミング遺伝子の構成配列との間の接合部で、例えば、後者（トランスフォーミング遺伝子構成配列）のゲノム挿入位置に存在しえる。検出は、例えば、接合部に隣接する（flanking）特異的プライマーを用いて、前記接合部の向こう側でのPCR 増幅を含んでもよい (例えば、Hernandezら、2003. Transgenic Res 12：179-189；Hernandezら、2004. J Cereal Sci 39: 99-107；Berdalら、2001. Eur Food Res Technol 213：432-438；Nielsenら、2004. Eur Food Res Technol 219：421-427；又はRonningら、2003. Eur Food Res Technol 216：347-354参照)。
【０００７】
しかしながら、これらのイベント特異的アッセイは、限定的な数のテストを考慮した高価なキットとしてだけ入手できることが多く、単独のイベント由来材料の検出に限定されるため、通常、とても特殊な反応条件を採用している。依然として、生産され、承認され、市場取引されるＧＭＯの数は、増え続けている。試料中のＧＭＯ組成物を一義的に決めるためには、永続的に増え続けている一群の個々のイベントに特異的な検出アッセイを各試料に別々に適用することが原則として必要となるため、多大な労力およびコストを要することになる。
【０００８】
従って、イベント特異的アッセイの出力結果はあいまいでないという特質から、イベント特異的アッセイの採用が望まれ続けている反面、イベント特異的アッセイの使用については、ＧＭＯ検出を改善するように、例えば時間消費、コスト及び労力の意味で、より効果的な標的方式に改善する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
この見地において、本発明は、当該分野で上記で論議された必要性の１つ以上を扱う方法、試薬、キット及び参照用物質を提供する。
【００１０】
一般に、本発明は、試料中の、ＧＭＯ（好ましくは遺伝学的にモデファイされた植物）に由来する材料を検出するための、改善された方法、試薬、キット及び参照用物質を提供する。
【００１１】
特に、試料中の分析しようとする配列の特徴を注意深く選択することによって、試料が、1以上の形質転換イベントに由来する材料を含有している可能性があるかどうか、逆に、試料がそのような形質転換イベントに由来する材料を１つも含有していないかどうかを結論づけることができることを、本発明者らは認識した。ここで、前記配列の特徴はイベント特異的であることを必要とせず、実際に、２つ以上のイベント間で共有されていてもよい。このようにして、本発明のアッセイは、試料がＧＭＯ内容物を含んでいる可能性について、価値ある指標を提供でき、当該試料中に、１以上の特定の形質転換イベントに由来する材料が存在することを証明することが必要な、後に続くテスト（例えば、イベント特異的アッセイのようなもの）の数を効果的に減らすことができる。このことは、ひいては、ＧＭＯ検出法のコスト、時間、労力の有効性を改善できる。例えば、本発明のアッセイは、試料のＧＭＯ組成物の特徴づけに必要とされるイベント特異的アッセイの数を、相当数削減することができる。
【００１２】
また、本発明者らは、公知の、商業上の重要性、及び／又は承認された形質転換イベントを細心に評価し、本発明では、ＧＭＯプロファイリングの適切な有益さを依然として保証しつつ、試料ごとに必要とされる個別のテスト反応の数を減じるように、試料中の分析される配列の特徴を選択した。
【００１３】
本発明は、その別の見地において、上記の適切な統合を実現する。
【００１４】
そして、特に好ましい見地（ここでは、見地「A1」）において、本発明は、試料中に、１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在するか又は不在であるかを知るための検査方法に関する。その方法は、以下の工程を含む。
(1)試料中に、以下のものを含む又はからなる核酸が存在するか又は不在であるかを検出する工程：
a) 「Zm」：トウモロコシ（Zea mays）分類群（taxon）, 好ましくは Zea mays ssp. mays由来及び特異的な核酸
b) 「Bn」：セイヨウアブラナ（Brassica napus）分類群由来及び特異的な核酸,
c) 「Gm」：ダイズ（Glycine max）分類群由来及び特異的な核酸, 及び
下記から選ばれる核酸の１種、１種超、若しくはすべて
d) 「p35S」：カリフラワーモザイクウィルスの35S プロモーター由来の核酸
e) 「tNOS」：アグロバクテリウム＝ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリン（nopaline）シンテターゼ遺伝子の３’ターミネーター由来の核酸
f)「Cry1Ab」：Bacillus thuringiensis の結晶タンパク遺伝子Cry1Ab由来の核酸
g)「PAT/bar」：Streptomyces hygroscopicus のホスフィノトリシン（phosphinothricin）アセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子bar 由来の核酸
h)「PAT/pat」：Streptomyces viridochromogenes のホスフィノトリシン（phosphinothricin）アセチルトランスフェラーゼ (PAT)遺伝子pat 由来の核酸
i) 「CP4-EPSPS」：Agrobacterium sp. CP4a からの５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸合成酵素EPSPS 遺伝子由来の核酸；並びに
(2)イベントBt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21，DAS-59122、その交差物、及びその関連イベント；イベントTopas 19/2，MS1，RF1，RF2，RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac，GS40/90pHoe6/Ac、その交差物（MS1/RF1，MS1/RF2，MS8/RF3を含む）、及びその関連イベント；イベントMON 40-3-2，MON89788，A2704-12，A5547-127，その交差物、及びその関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベントのような１種以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか不在かを結論づける工程。
【００１５】
見地 A1は、かなり限定された数の検出工程を行う間に、識別されるいくつかの植物分類群に属する多数のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に、存在する可能性があるか、不在であるかを調べることが可能である。見地A1の方法により検出されるトランスジェニック植物イベントを、現在承認された及び／又は例えばヨーロッパで取引販売されたトランスジェニック植物イベント、すなわち、特に環境または商業上、試料内に含まれ得るトランスジェニック植物イベントの大きな断片又は実質的に当該イベントの大部分にまで拡張することは有利である。そして、本発明のこの見地では、関連するトランスジェニック植物イベントの重要なスペクトルの検査にとって相対的に厳しくないアッセイを提供する。
【００１６】
好ましくは, 見地Ａ１の工程(1) は、上記で定義されたa)−i)で挙げられたすべての核酸からなる、または当該核酸を含む核酸群が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を含む。これは、試料をテストすることによって得られる情報を効果的に改善するとともに、実質的に多数のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在する可能性または不在を結論づけることができる。
【００１７】
見地Ａ１検出の工程(2)は、個々に存在するトランスジェニック植物イベントについて、特定的に予知しているけれども、将来生成されるいずれのトランスジェニック植物イベント等の他のイベントも、ａ)−c) で定義されるような分類群に属し、且つd)−i)で定義されるような核酸を１つ以上含む限り、検出できることの価値は認められるべきであろう。この所見は、以下で定義されるような発明のいずれの見地においても、必要な変更を加えて適用できる。
【００１８】
見地Ａ１の方法は、少なくとも３つの異なる分類群に属するトランスジェニック植物イベントが試料中に存在するか又は不在であるかを同時に調べることを許容する一方、発明者は、個々の分類群に適用できる方法も意図する。このことは、情報が特定の分類群だけに求められるときには、核酸検出工程数の削減に役立つであろう。
【００１９】
従って、さらなる見地（「A2」）において、本発明は、試料中に、トウモロコシの１つ以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在するか又は不在であるかについて検査する方法を提供する。その方法は、
(1)上記で定義されたa)で挙げられた核酸、及び上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる１種、１種超若しくはすべてからなる、又は含む核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2)イベントBt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21， DAS-59122、その交差物、及びその関連イベントからなる群又は含む群から選ばれるイベント等の、トウモロコシの１つ以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるか結論づける工程；
を含む。
【００２０】
見地Ａ２の工程(1)は、上記で定義されるa)および d)−i)で挙げられた核酸のすべてを含む又はすべてからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を含むことが好ましい。
【００２１】
さらなる見地（「A3」）では、試料中に、アブラナ（oilseed rape）の１つ以上トランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在するか又は不在であるかを検査する方法を提供する。その方法は、
(1) 上記で定義するようなｂ）で挙げられた核酸、及び上記で定義するようなｄ) - i)で挙げられた核酸から選択される１種、１種超、若しくはすべてを含む、又はからなる核酸が試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2) イベントTopas 19/2，MS1，RF1，RF2，RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac， GS40/90pHoe6/Ac、その交差物（MS1/RF1，MS1/RF2，MS8/RF3を含む）、及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選択されるイベント等の、アブラナの１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける
工程を含む。
【００２２】
見地Ａ３の工程(1)では、試料中に、上記で定義されるようなb) 及びd)−i)で挙げられた核酸のすべてを含む又はからなる核酸が、存在するか又は不在であるかを検出する工程を含むことが好ましい。これにより、試料をテストすることによって得られる情報が増大し、比較的より多数のアブラナのトランスジェニック植物イベントに由来する材料の存在の可能性または不在を結論づけることが可能となる。
【００２３】
別の好ましい態様では、見地Ａ３の工程(1)は、試料中に、上記で定義されたb)及びd), e), 及びg)−i)で挙げられた核酸を含む又はからなる核酸が存在するか又は不在であるかを検出する工程を含む。アブラナのイベントの多くは、例えば、見地Ａ３の工程（２）で特異的に限定されるイベントは、上記で定義されたf)で挙げられた核酸を含まなくてもよいことを示している。したがって、見地Ａ３の工程（１）から、f) で挙げられた核酸を省略することで、情報をロスすることなく、テスト数をへらすことができる。
【００２４】
さらなる見地（「A4」）では、試料中に、１以上の大豆トランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在するか又は不在であるか検査する方法を提供する。その方法は、
(1) 上記で定義されたc) で挙げられた核酸及び上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の１種、１種超若しくはすべての核酸を含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2) イベントMON 40-3-2, MON89788，A2704-12，A5547-127、その交差物、及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選択されるイベント等の、１以上の大豆トランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
【００２５】
見地Ａ４の工程（１）は、試料中に、上記で定義されたc) 及び d)−i)で挙げられたすべての核酸を含む又はからなる核酸が存在するか又は不在であるかを検出する工程を含むことが好ましい。これは、試料をテストすることによって得られる情報を増やし、比較的より多数の大豆トランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在する可能性または不在を結論づけることを可能にする。
【００２６】
他の好ましい態様では、見地Ａ４の工程(1)は、上記で定義されたc) 及び d), e), h) 及び i)で挙げられた核酸を含む、又はからなる核酸が試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を含む。多数の大豆イベント、例えば、見地Ａ４の工程 (2)で特定されたイベントは、上記で定義されたf)および g)で挙げられた核酸を含まなくてもよい。従って、見地Ａ４の工程（１）から、f) 及び g)で挙げられた前記核酸を省略することで、情報をロスすることなく、テスト数を減らすことができる。
【００２７】
更なる見地では、上記見地A2−A4のいずれか２つの組み合わせを教示できることも、価値あることであろう。例えば、このことは、選択分類群からトランスジェニックイベントを検出をしたい場合に、テスト作業数を効果的に減らすことができる。
【００２８】
したがって、更なる見地 (「A5」) においては、本発明は、試料中に、１以上のトウモロコシ及び／またはアブラナトランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在するか又は不在であるかを検査する方法を提供する。その方法は、
(1)上記で定義されたa)およびb)で挙げられた核酸、上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸から選ばれる１種、１種超若しくはすべての核酸を含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2)イベントBt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21， DAS-59122，その交差物、及びその関連イベント；イベントTopas 19/2，MS1，RF1，RF2，RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac，GS40/90pHoe6/Ac、その交差物（MS1/RF1， MS1/RF2，MS8/RF3を含む）、及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選ばれるイベントのような、トウモロコシトランスジェニック植物及び／またはアブラナの１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
【００２９】
上記で明らかにされた理由から、見地Ａ５の工程(1)は、上記で定義されたa), b) 及び d)−i)で挙げられるすべての核酸を含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を含むことが好ましい。
【００３０】
更なる見地（「A6」）において、本発明は、試料中に、トウモロコシ及び／又は大豆の１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在するか又は不在であるかを検査する方法を提供する。その方法は、
(1) 上記で定義されたa)およびc)で挙げられた核酸、及び上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる１種、１種超若しくはすべての核酸を含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2) イベントBt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21，DAS-59122、その交差物、及びその関連イベント；及びMON 40-3-2，MON89788，A2704-12，A5547-127、その交差物、及びその関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベントのような、トウモロコシトランスジェニック植物及び／又は大豆の１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
【００３１】
上記で明示された理由から、好ましくは、見地Ａ６の工程 (1)は、試料中に、上記で定義されたa), c) 及び d)−i)で挙げられたすべての核酸を含む又はからなる核酸が存在するか又は不在であるかを検出する工程を含むことができる。
【００３２】
さらなる見地（「A7」）において、本発明は、試料中に、アブラナ及び／又は大豆の１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在するか又は不在であるかを検査する方法を提供する。その方法は、
(1) 上記で定義されたb)およびc)で挙げられた核酸、及び上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる１種、１種超、若しくはすべての核酸を含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2) イベントTopas 19/2，MS1，RF1，RF2，RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac，GS40/90pHoe6/Ac、その交差物（MS1/RF1，MS1/RF2，MS8/RF3を含む）、及びその関連イベント；及びイベントMON 40-3-2，MON89788，A2704-12，A5547-127，その交差物、及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選ばれるイベントのような、アブラナ及び／又は大豆の１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
【００３３】
明示された理由から、見地Ａ７の工程(1)は、好ましくは、上記で定義されたb), c) 及び d) −i)で挙げられた核酸のすべてを含む、又ははからなる核酸が、試料中に、存在するか又は不在であるかを検出する工程を含むことができる。
【００３４】
他の好ましい態様では、見地Ａ７の工程 (1)は、すなわち f)で挙げられた核酸を検出することなく、上記で定義されたb), c) 及び d), e) 及び g)−i) で挙げられたすべての核酸が試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を含む。
【００３５】
そして、見地（「A8」）においては、本発明は、試料中に、トウモロコシ及び／又はアブラナの１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在するか又は不在であるかを検査する工程を提供する。その方法は、
(1) 上記で定義されたa), b) 及び c)で挙げられた核酸から選択される１種、１種超、若しくはすべての核酸、及び上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の１種、１種超、若しくはすべての核酸を含む又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2) イベントBt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21， DAS-59122，その交差物、及びその関連イベント；イベントTopas 19/2，MS1，RF1，RF2， RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac，GS40/90pHoe6/Ac、その交差物（MS1/RF1，MS1/RF2，MS8/RF3を含む）、及びその関連イベント；及びイベントMON 40-3-2， MON89788，A2704-12，A5547-127，その交差物、及びその関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベントのような、１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
【００３６】
上記で明示された理由から、見地Ａ８の工程 (1)は、 好ましくは、上記で定義されたd) - i)で挙げられるすべての核酸を含む核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を含むことができる。
【００３７】
説明したように、上記見地 A1 - A8の方法は、すでに承認され、及び／又は一般に用いられているような、関連のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性があるか、又は不在であるかを検出するのに、好適である。しかしながら、前記方法が、態様においては、上記見地A1−A8の工程（２）で特異的に限定していないイベントなど、さらなるトランスジェニックイベントにも由来する材料の存在または不在をよりよく評価できるように、効果的に適応できることも賞賛すべきであろう。このようにして、試料の組成について、まさにもっと多くの情報を集めることを可能にする。
【００３８】
そして、これらの態様で、上記A1, A2, A5, A6 またはA8のいずれの見地においても、工程 (1)は、核酸 j) 「mCry3A」が試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程をさらに含んでもよい。Bacillus thuringiensisの修飾された結晶タンパク遺伝子 Cry3A由来の核酸；及びそれぞれの見地のいずれもの工程（２）で定義されたイベント群は、さらに、トウモロコシイベントMIR604及び他のトウモロコシイベントを伴う交差物、及びMIR604の関連イベントをさらに含む。
【００３９】
さらなる態様において、上記見地 A1，A2，A5，A6又はA8のいずれの見地においても、工程（１）は、Corynebacterium glutamicum のリジン−非感受性ジヒドロジピコリン酸合成酵素（cDHDPS）遺伝子cordapA由来の核酸である k)「cordapA」及び／またはトウモロコシのGlb1 プロモータ由来の核酸であるl) 「Glb1」の一方又は両方の核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を含む。また、それぞれの見地のいずれかの工程（２）で定義されたイベント群は、さらにトウモロコシイベントLY038，これと他のトウモロコシイベントとの交差物、及びLY038の関連イベントを含む。
【００４０】
さらなる態様では、上記A1, A2, A5, A6 又は A8のいずれかの見地の工程（１）は、さらにBacillus thuringiensisの結晶タンパク遺伝子Cry3Bb1由来の核酸であるm)「Cry3Bb1」が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を、さらに含んでもよい。それぞれいずれの見地においても、工程（２）で定義されたイベント群は、さらに、MON88017、これと他のトウモロコシイベントとの交差物、及びMON88017の関連イベントを含む。
【００４１】
したがって、態様においては、上記A1, A2, A5, A6 又はA8のいずれの見地においても、工程（１）は、上記で定義されたj)−m)で挙げられた核酸の１種、１種超若しくはすべてが試料中に存在するか又は不在であるかの検出工程を、更に含む。そして、それぞれのいずれの見地においても、工程（２）は、トウモロコシイベントMIR604、LY038及びMON88017、他のトウモロコシイベントとの交差物、及びこれらの関連イベントの１種、１種超、若しくはすべてを、さらに含んでもよい。しかしながら、上記で定義されたj)−m)で挙げられた、それぞれの核酸の検出により、トウモロコシイベントMIR604、LY038及び／又はMON88017に由来する材料が試料中に存在することについての、改善された検出を提供することができるとはいえ、すでに上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸の検出により、前記イベントMIR604、LY038及び／又はMON88017に由来する材料が、試料中に存在する可能性ありとの結論を引き出すことも許容する（表３も参照）。
【００４２】
態様においては、上記A1, A3, A5, A7 又はA8のいずれの見地においても、工程（１）は、核酸 n)「Bxn」（Klebsiella pneumoniae ssp. のニトリラーゼ（nitrilase）遺伝子由来の核酸）が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程をさらに含んでもよく、また、それぞれのいずれの見地においても、工程（２）で定義されたイベント群は、アブラナのイベントOXY235、これと他のアブラナのイベントとの交差物、及びOXY235の関連イベントを、更に含んでもよい。しかしながら、上記で定義されたn)で挙げられる核酸の検出により、試料中のアブラナイベントOXY235に由来する材料の存在についての改善された検出を提供できるとはいえ、上記ですでに定義された d)−i)で挙げられる核酸の検出により、前記イベントOXY235に由来する材料が、試料中に存在する可能性ありとの結論を引き出すことを許容する（表３参照）。
【００４３】
こうして、見地（「A9」）において、本発明は、トウモロコシ及び／又はアブラナ及び／又は大豆の１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかについての検査方法を提供する。この方法は、
(1) 上記で定義されたa), b) 及びc)で挙げられた核酸から選ばれる１種、１種超、若しくはすべて；上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる１種、１種超、若しくはすべて；及び所望により、上記で定義されたj)−n)で挙げられた核酸から選ばれる１種、１種超、若しくはすべてを含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2) イベントBt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21，DAS-59122，MIR604，LY038及びMON88017、その交差物；イベントTopas 19/2，MS1，RF1，RF2，RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac，GS40/90pHoe6/Ac，OXY235、その交差物（MS1/RF1，MS1/RF2，MS8/RF3を含む）、及びその関連イベント；及びイベントMON 40-3-2，MON89788，A2704-12，A5547-127、その交差物、及びその関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベントのような、１以上のトランスジェニック植物イベントが、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
【００４４】
上記で明示された理由から、見地A9の工程（１）は、上記で定義されたd) - i)で挙げられたすべての核酸を含む核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を含むことが好ましい。
【００４５】
さらなる有利な態様では、上記見地 A1 - A8 は、こうして、他の分類群に属するトランスジェニックイベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性があるか又は不在であるかについても、評価することができる。
【００４６】
したがって、上記A1 - A8 (または上記で定義された見地の態様の)いずれかの見地における工程（１）は、核酸o)「Or」（Oryza sativa 分類群由来の及び特異的な核酸）が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程をさらに含んでもよい。またそれぞれのいずれかの見地の工程（２）で定義されたイベント群は、さらにライスイベントLL62，LL06 及び LL601、その交差物、及びその関連イベントの１種、１種超若しくはすべてを含んでもよい。
【００４７】
さらなる態様において、上記見地 A1 - A8 (又は上記見地の上記態様)は、核酸p)「Bv」（Beta vulgaris分類群由来の及びこれに特異的な核酸）が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程をさらに含んでもよい。またそれぞれのいずれかの見地の工程（２）で定義されたイベントの群は、さらにテンサイのイベントT120-7，H7-1及びA5-15、その交差物、及びその関連イベントの１種、１種超若しくはすべてを含んでもよい。
【００４８】
さらなる態様において、見地A1−A8（又は上記見地の上記態様）は、核酸q)「Gs」（Gossypium 分類群由来の及びこれに特異的な核酸）が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程をさらに含んでもよい。またそれぞれのいずれかの見地の工程（２）で定義されたイベント群は、さらにコットンイベントLL cotton 25，MON 1445，MON 531，MON15985、その交差物、及びその関連イベントの１種、１種超若しくはすべてを含んでもよい。
【００４９】
さらに発展して、前述の段落のいずれかの態様の工程 (1)は、核酸r)「Cry1Ac」（Bacillus thuringiensisの 結晶タンパク遺伝子Cry1Ac由来の核酸）及び／又は核酸s)「Cry2Ab2」（Bacillus thuringiensisの結晶タンパク遺伝子Cry2Ab2由来の核酸）の一方または双方が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を、さらに含んでもよい。また工程（２）で定義されたイベントの群は、コットンのイベントMON 531，MON15985，及び他のコットンイベントとの交差物およびその関連イベントの一方又は双方を、特に十分に検出することができる。
【００５０】
さらなる態様において、見地A1−A8（又は上記見地の上記態様）は、核酸t)「St」（Solanum tuberosum 分類群由来及びこれに特異的な核酸）が、試料中に存在するか又は不在であるかの検出工程をさらに含んでもよい。またそれぞれの見地のいずれかの工程（２）で定義されたイベントの群は、ポテトのイベントEH92-527-1 及びこの関連イベントをさらに含んでもよい。
【００５１】
さらなる発展においては、前述の段落の態様のいずれかの工程（１）は、核酸u) 「GBSS」（Solanum tuberosumの、顆粒結合（granule bound）デンプン合成酵素遺伝子Gbss由来の核酸）が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程をさらに含み、前記イベントEH92-527-1に由来する材料の検出の信頼性がさらに向上する。
【００５２】
前記方法は、種々の好適な組み合わせで実行してもよく、所望のイベントが検出され、その労力を低減できることがわかるであろう。
【００５３】
こうして、見地（「A10」）では、本発明は、トウモロコシ及び／またはアブラナ及び／又は大豆及び／又はライス及び／又はテンサイ及び／又はコットン及び／又はポテトの１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを検査する方法を提供する。その方法は、
(1) 上記で定義されたa), b), c), o), p) q) 及びt)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の１種、１種超若しくはすべて、上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の１種、１種超若しくはすべて、および所望により、上記で定義されたj)−n), r) s) 及び u)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の１種、１種超若しくはすべてを含む又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2) イベントBt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21，DAS-59122，MIR604，LY038，MON88017、その交差物、及びその関連イベント；イベントTopas 19/2，MS1，RF1，RF2，RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac，GS40/90pHoe6/Ac，OXY235、その交差物（MS1/RF1，MS1/RF2，MS8/RF3を含む）、及びその関連イベント；イベントMON 40-3-2，MON89788，A2704-12，A5547-127、その交差物、及びその関連イベント；イベントLL62，LL06及びLL601、その交差物、及びその関連イベント；イベントT120-7、H7-1 及びA5-15、その交差物、及びその関連イベント；イベントLL cotton 25，MON 1445，MON 531，MON15985、その交差物、及びその関連イベント；イベントEH92-527-1及び関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベント等の、１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
【００５４】
上記で明示された理由から、見地A10の工程（１）は、上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸のすべてを含む核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する方法を含むことが好ましい。
【００５５】
関連する好ましい見地（「A11」）において、本発明は、トウモロコシ及び／またはアブラナ（oilseed rape）及び／又は大豆及び／又はライス及び／又はテンサイ及び／又はコットン及び／又はポテトの１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が存在するか又は不在であるかを検査する方法を提供する。その方法は、
(1) 上記で定義されたでa), b), c), o), p) q) 及び t) で挙げられた核酸から選ばれる核酸の１種、１種超若しくはすべて、上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の１種、１種超若しくはすべてを含む又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2) イベントBt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21，DAS-59122，所望によりMIR604，LY038及びMON88017、その交差物、及びその関連イベント；イベントTopas 19/2，MS1，RF1，RF2，RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac，GS40/90pHoe6/Ac、所望によりOXY235，その交差物（MS1/RF1，MS1/RF2，MS8/RF3を含む）；イベントMON 40-3-2，MON89788，A2704-12，A5547-127、その交差物、及びその関連イベント；イベントLL62，LL06及びLL601、その交差物、及びその関連イベント；イベントT120-7，H7-1及びA5-15、その交差物、及びその関連イベント；及びイベントLL cotton 25，MON 1445，MON 531，MON15985、その交差物、及びその関連イベント；及びイベントEH92-527-1及びその関連イベントを含む又はからなる群から選択されるイベント等の、１以上のトランスジェニック植物イベントが、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
【００５６】
上記で明示された理由から、見地 A11の工程（１）は、上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸のすべてを含む核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する方法を含むことが好ましい。
【００５７】
好ましくは、上記見地 A1〜A11または前記態様のいずれかにおいて、試料中に核酸が存在するか又は不在であるかの検出は、それぞれの核酸に含まれるアンプリコン（amplicon）の増幅を用いて行う。好ましくはＰＣＲを用いて、より好ましくはリアルタイムPCRを用いて検出する。
【００５８】
上記方法において、PCR 増幅を効果的に使用できるようにするために、本発明者らは、プライマー及びプライマー対を細心に探索し、テストして、前記方法において、特に有利なプライマー又はプライマー対を選択した。
【００５９】
同定された好ましいプライマー対を表１に示す。これらは、なかでも、以下の重要な効果を必然的にもたらす。これらのプライマーは、実質的に同じまたは満足できる類似のアニーリング温度を有するので、異なる核酸上でのＰＣＲ増幅が、同じ温度サイクル条件及びそれ故に同じ装置で、実行できるようにする。このことは、方法のスループットを極めて容易にし、労力および廃棄物を減らし、必要とする装置を減らす。プライマー対は、約100 bpのアンプリコンを生産し、それにより、加工食品又は加工飼料の場合のような、属固有の材料が大部分断片化されている試料からでさえ、標的核酸を増幅させる。このプライマー及びプライマー対を用いれば、リアルタイム増幅にふさわしい感度で、適切な特異性をもって増幅できる。さらに、本発明によって提供される方法及びキットの感度及び均一性を確保するために、40 サイクルで、少なくとも 2500 相対蛍光ユニット (RFU)の蛍光で、鋳型を10000コピー生成できるように、プライマー及びプライマー対をデザインした。ここで、異なるプライマーセットのために発生する蛍光値は、好ましくは３倍マージン以内となるようにする。さらに、注目するイベント間で、前記核酸における配列が潜在的に配列が相違するにもかかわらず、（例えば、最適化されたコドンの使用量のために）、注目する実質的にすべてのイベント由来のそれぞれの核酸上で増幅するように、各プライマー対をデザインした。
【００６０】
表１：上記で定義されたa) - i), o), p), q) 及び t)で挙げられた核酸検出のための、PCR用の効果的なプライマー対
【００６１】
【表１】

【００６２】
こうして、本発明は、上記見地A1〜A11あるいは上記見地のいずれかの態様において定義された方法を提供する。ここで、上記で定義されたa) - i), o), p), q)及びt) で挙げられたうちのいずれかの核酸が、試料中に存在するか、または不在であるかを、表１で示した、それぞれのプライマー対を用いたＰＣＲ増幅を用いて検出する。
【００６３】
表１は、ある核酸（例えば「CP4-EPSPS」）上での増幅のための、１つ以上のforwardおよび／又は reverseプライマーを挙げているので、前記forwardプライマーの１つ又はいずれかの組み合わせを、前記reverseプライマーの１つ又はいずれかと組合わせて用いることで増幅できる。
【００６４】
表１に挙げたプライマー配列が、最適な増幅のために改良されて提供される一方、表１のプライマーと比較してみて、ある程度の制限をもって配列を変更したバリアントプライマーを用いるときにも、本発明の方法は、適切に達成できることが認められる。
【００６５】
そして、上記見地及び態様も、注目する核酸は、表１で挙げられた対応するプライマーと比較して１以上の配列変更を含むバリアントプライマーを用いるＰＣＲ増幅により検出される。前記配列の変更とは、例えば、そのようなバリアントプライマー／プライマー対が、それぞれのアンプリコンの適切な増幅をなおも達成できる範囲内での１以上の欠失、挿入及び／又は置換をいう。 好ましくは、そのようなバリアントプライマーは、表１で挙げられたプライマーと、85%以上, より好ましくは 90%以上, さらにより好ましくは95%以上,さらにより好ましくは 96%以上, 97%以上, 98%以上または 99%以上の同一性を示すだろう。配列アライメント及び配列同一性の決定は、例えば、Altschulらにより1990年に最初に説明された(J Mol Biol 215: 403-10)「Basic Local Alignment Search Tool」(BLAST) やTatusova とMaddenにより1999年に説明されたアルゴリズム「Blast 2 sequences」(FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)等を用いて、行うことができる。
【００６６】
表１で挙げられたプライマー又はそのバリアントは、効果的に派生してもよい。例えば、前記プライマーまたはそのバリアントは標識してもよく、例えばリアルタイムPCRの応用のように、増幅による産物の検出を可能にする。そして、このような派生に際して、例えば、１以上の標識部分及び／又は１以上のアクセサリー部分 (例えば、消光（quenching）部分、FRET部分など)の導入を必然的に伴ってもよく、標識又はアクセサリー部分の導入及び／又は適切な作用のために、プライマー配列のモデファイが必要となる場合には、それを許容する。当業者は、標識付けのために、プライマー及びプライマー対をモデファイする方法について、一般に精通している。このように派生したプライマー及びプライマー対の使用は、リアルタイムPCR、特に２以上の異なる標識を付けた増幅生産物は、多様な増幅反応が続けられるような場合に有用である。
【００６７】
そして、上記見地及び態様は、表１に挙げられたプライマー及びプライマー対またはそのバリアントの誘導物を用いたPCR増幅による、注目する核酸の検出方法にも拡張される。
【００６８】
実施例により、さらに好ましい見地 (「A12」)では、本発明は、１以上のトランスジェニック植物イベント）（特に、トウモロコシ及び／又はアブラナ及び／又は大豆及び／又はライス及び／又はテンサイ及び／又はコットン及び／又はポテトの１以上のトランスジェニック植物）に由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを検査する方法を提供する。その方法は、
(1) 上記で定義されたa), b), c), o), p) q)および t)で挙げられる核酸から選ばれる１種、１種超若しくはすべて、上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸から選ばれる１種若しくは１種超若しくはすべてを含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程；並びに
(2) イベントBt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21，DAS-59122、所望により、MIR604，LY038 及び MON88017、その交差物、及びその関連イベント；イベントTopas 19/2，MS1，RF1，RF2，RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac，GS40/90pHoe6/Ac、所望によりOXY235、その交差物（MS1/RF1，MS1/RF2，MS8/RF3を含む）、及びその関連イベント；イベントMON 40-3-2，MON89788，A2704-12，A5547-127、その交差物、及びその関連イベント；イベントLL62，LL06 及びLL601、その交差物、及び関連イベント；イベントT120-7，H7-1及び A5-15、その交差物、及びその関連イベント；イベントLL cotton 25，MON 1445，MON 531，MON15985、その交差物、及びその関連イベント；イベントEH92-527-1及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選ばれるイベント等の、１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程を含み、
工程（１）における、試料中の核酸の存在または不在の検出は、表１に示されるそれぞれのプライマー及びプライマー対、またはバリアントまたはその誘導物を用いたＰＣＲ増幅を用いて行われる。
【００６９】
上記理由から、見地 A１２の工程（１）は、好ましくは、上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸のすべてを含む核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する方法を含むことができる。好ましい態様において、見地A12の工程（１）は、上記で定義されたa) - i)で挙げられた核酸を少なくとも含む核酸が、試料中に存在するか、又は不在であるかを検出する工程を含むことができる。
【００７０】
ある見地において、本発明は、さらに、上記a)−u)で挙げられた核酸を含む又はからなる核酸のアンプリコン（amplicon）の増幅に適したプライマー及びプライマー対及びバリアントまたはその誘導物を提供する。特に、本発明者らによって、表１に挙げられたプライマー対の同定に投じたかなりの努力の点において、本発明は、表１で挙げられたプライマー及びプライマー対だけでなく、所望により、前記プライマー及び／又はプライマー対またはそのバリアントまたはその誘導物のいずれかの好適な組み合わせにおける、そのバリアント及び誘導物を提供する。
【００７１】
さらに、本発明は、好ましいプライマー及びプライマー対、前記増幅産物を含むベクター及びプラスミド、前記ベクター及びプラスミドで形質転換し、前記ベクター及びプラスミドを含んだ組み換え微生物を用いて得ることができる増幅産物も提供する。
【００７２】
結果として、好ましい態様では、本発明は、組み換え E. coli（２００７年１月１０日に、ブタペスト条約に準じて、ベルギーの微生物保存機関（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms：BCCM）、Laboratorium voor Moleculaire Biologie - Plasmidencollectie (BCCM/LMBP) (べルギーのゲント大学、Technologiepark 927, B-9052 Gent-Zwijnaarde）に、LMBPアクセッションナンバーLMBP 5452、LMBP 5453、LMBP 5454、LMBP 5455、LMBP 5456、LMBP 5457、LMBP 5458、LMBP 5459及びLMBP 5460として寄託され、２００７年３月６日に、LMBP アクセッションナンバーLMBP 5451として寄託され、２００７年４月１９日に、LMBP アクセッションナンバーLMBP 5587、LMBP 5588、LMBP 5589及びLMBP 5590として寄託された)に関し、さらに前記寄託された組み換えE. coliから得ることができる、単離された組み換えプラスミド、及び前記プラスミドの単離されたインサート、好ましくは単離されたそのEcoRI-EcoRI インサートにも関する。
【００７３】
そのようなプラスミド若しくはベクター又はそのインサート、及びこれらの組み合わせは、特に、上記方法の増幅反応において、ポジティブコントロール、それぞれのアンプリコンにとって、参照及び／又はキャリブレータとして有用である。
【００７４】
さらに、本発明は、上記で定義された１以上の見地及び態様の方法において、１以上の試薬を含むキットにも及ぶ。例えば、このようなキットは、特に表１で挙げられたような上記プライマー及び／又はプライマー対、または前記プライマーのバリアントまたは誘導物、及び／又は１以上の上記増幅産物、そのようなものを含むベクター、プラスミド、または前記ベクターまたはプラスミドのインサート、及び／又はコンピュータ装置が本発明の方法の工程（２）を実行するように、プログラム可能な指示を含むデータキャリアを含むことができる（下記参照）。このようなキットは、ユーザーが本発明の方法を実行する、及びそうして得られるデータを翻訳する指示を、都合よく更に含んでもよい。
【００７５】
本発明は、上記で定義された見地及び態様の工程（２）を実行する、すなわち、対象とする種々のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性または不在を結論づける、複雑でなく且つ簡単な手法も教示する。特に、上記見地及び態様の工程（１）において、試料のために要求された結果は、試料中に存在するとして、前記工程（１）（ステップ(i)）において検出された上記a) - u)で挙げられた核酸を含む又はからなる核酸から選ばれた核酸からなる、すなわちコレクションを代表しているセット「G_SAM」として表示される。
【００７６】
さらに、注目する、いずれのトランスジェニック植物イベントも、前記イベントで見いだされる上記a) - u)で挙げられた核酸を含む又はからなる核酸から選ばれる核酸のコレクション、すなわちそのコレクションを代表している、セット「G_X」（ここで、X は、注目するイベントを指定する）として表示することができる。そして、もし試料が前記イベントの由来物質、又はそのようなものを含む交差物、または関連イベントを含むならば、工程（１）で検出されるだろう（ステップ(ii))。
【００７７】
特定例の態様において、セットG_Xは、上記で特定した限定したイベントを表示するセットから選ばれることが好ましい。特異的に限定するセットとしては、例えば、以下のセットを含む：トウモロコシイベントセットG_Bt176 ∈{Zm；p35S；Cry1Ab；PAT/bar}、G_Bt11∈{Zm；p35S；tNOS；Cry1Ab；PAT/pat}、G_Bt10 ∈ {Zm；p35S；tNOS；Cry1Ab；PAT/pat}、G_MON810 ∈{Zm；p35S；tNOS；Cry1Ab}、G_MON863 ∈{Zm；p35S；tNOS}、G_TC1507 ∈ {Zm；p35S；PAT/pat}、G_NK603∈{Zm；p35S；tNOS；CP4-EPSPS}、G_T25∈ {Zm；p35S；PAT/pat}、G_GA21∈{Zm；tNOS}、G_DAS-59122∈{Zm；p35S；PAT/bar}、G_MIR604 ∈{Zm；tNOS；mCry3A}、G_LY038∈{Zm；p35S；tNOS；cordapA；Glb1}、及び G_MON88017∈{Zm；p35S；tNOS；CP4-EPSPS；Cry3Bb1}、アブラナイベントセットG_{Topas 19/2} ∈{Bn；p35S；PAT/pat}、G_MS1∈{Bn；tNOS；PAT/bar}、G_RF1 ∈{Bn；tNOS；PAT/bar}、G_RF2∈{Bn；tNOS；PAT/bar}、G_MS1/RF1∈{Bn；tNOS；PAT/bar}、G_MS1/RF2∈{Bn；tNOS；PAT/bar}、G_MS8 ∈{Bn；tNOS；PAT/bar}、G_RF3∈{Bn；tNOS；PAT/bar}、G_MS8/RF3∈{Bn；tNOS；PAT/bar}、G_GT73∈{Bn；CP4-EPSPS}、G_T45∈{Bn；p35S；PAT/pat}、G_{Liberator pHoe6/Ac}∈{Bn；p35S；PAT/pat}、G_{GS40/90pHoe6/Ac}∈{Bn；p35S；PAT/pat}、G_OXY235∈{Bn；p35S；Bxn}；大豆イベントセットG_MON40-3-2∈ {Gm；p35S；tNOS；CP4-EPSPS}、G_MON89788∈{Gm；CP4-EPSPS}、G_A2704-12∈{Gm；p35S；PAT/pat}、及びG_A5547-127∈{Gm；p35S；PAT/pat}、ライスイベントセットG_LL62∈{Or；p35S；PAT/bar}、G_LL06∈{Or；p35S；PAT/bar} 及びG_LL601 ∈{Or；p35S；tNOS；PAT/bar}、テンサイイベントセットG_T120-7∈{Bv；p35S；PAT/pat}、G_H7-1∈{Bv；p35S；CP4-EPSPS}、及び G_A5-15∈{Bv；p35S；tNOS；CP4-EPSPS}、コットンイベントセットG_{LL cotton 25}∈{Gs；p35S；tNOS；PAT/bar}、G_MON1445 ∈{Gs；p35S；tNOS；CP4-EPSPS}、G_MON531∈{Gs；p35S；tNOS；cry1Ac}及びG_MON15985 ∈{Gs；p35S；tNOS；cry1Ac；cry2Ab2}、及びポテトイベントセットG_EH92-527-1∈{St；tNOS；Gbss}。ここで、{ } 内に示されていることは、そのようなイベントで見いだされた上記a) −u) で挙げられた核酸であり、これらのイベントに由来する材料中で検出され得る。もし、検出工程（１）が上記ａ)−u)で挙げられた核酸以外の核酸をさらに含んでいる場合には、そのような核酸が、上記で定義されたセットに含まれていると、効果的に結論づけることができる。
【００７８】
上記方法は、上記 a)−u)のすべての核酸の存在についてテストするわけではないので、試料セットはイベントセットと同様に、効果的にテストされる核酸の存在に関して定義されることができると理解される。d) - i)で定義された核酸に加えて特定の特色に対応する、上記で定義されたj) - n)、r)、s) 及びu)で挙げられた核酸の存在についてテストしない場合、いくつかのイベントに対応するセットを、より狭い方式で定義してもよい。特に限定はしないが、例えば、具体的には、トウモロコシイベントセットG_MIR604∈{Zm；tNOS}、G_LY038∈{Zm；p35S；tNOS}、G_MON88017 ∈{Zm；p35S；tNOS；CP4-EPSPS }；アブラナイベントセットG_OXY235∈{Bn；p35S }；コットンイベントセットG_MON531 ∈{Gs；p35S；tNOS}、G_MON15985 ∈{Gs；p35S；tNOS}；及びポテトイベントセットG_EH92-527-1 ∈{St；tNOS}が挙げられる。
【００７９】
そして、試料中に注目するイベントＸに由来する材料が存在するかということに関しては、注目するセット G_X それぞれについての論理演算を実行することによって、以下のように決定することができる（ステップiii)：
−もし G_XがG_SAMと等しいならば(G_X=G_SAM)、トランスジェニック植物イベントX、またはその交差物、またはその関連イベント由来物質由が試料中に存在している可能性がある；
−もし、G_X がG_SAM の適当なサブセットであれば(G_X ⊂G_SAM)、トランスジェニック植物イベントX、またはその交差物、またはその関連イベントが、試料中に存在している可能性がある；
−もし、G_X がG_SAM と等しくなく、且つ G_X がG_SAMの適当なサブセットでないならば
【数１】


トランスジェニック植物イベントX、またはその交差物、またはその関連イベントが、試料中に不在である。
好ましい態様では、これらの論理演算は、コンピュータ装置によって、有効に実行されることができる。
【００８０】
本発明の方法の工程（２）で用いる、上記アルゴリズムが、特定の核酸の検出を用いて、あるイベントに由来する材料が存在することを結論づけることとの関係において、本明細書ですでに説明したが、前記アルゴリズムは、上記a)−u)で挙げられた以外のまたは追加となる核酸のようないずれかの核酸の検出を用いて、上記で特定されたイベント以外または追加となるイベント等のいずれかのイベントが存在することを結論づけることを目的とする方法にも、原則として、たやすく適用される。
【００８１】
本発明の、これらの見地及び更なる見地、及び好ましい態様は、以下の欄、及び添付されたクレームにおいて、説明される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１（Ａ−Ｆ）】表４に挙げたプライマーセット、及び特にpUC18におけるクローニングベクター（例えば、表５で挙げられたプラスミド）中に存在するプライマーセットを用いて増幅したアンプリコンの選択配列を示す。その配列は、インサートされたアンプリコンの隣接配列となる（flanking）マルチプルクローニングサイトからの部分的配列を含んでもよいことがわかる。
【図２】（Ａ）は、p35S/tNOSのマルチプレックス（multiplex）ＰＣＲテストの結果であり、（Ｂ）は、p35S/tNOS特異的な複合化テストの分離カーブである。
【図３】表８に挙げた+/- 8300鋳型コピーを用いたデータをグラフに示す。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
ここで用いられている単数形表現「１つの」、「ある」、及び「その」は、本明細書において他の明示がない限り、単数または複数の双方を含む。
【００８４】
ここで用いられている用語「含む」及び「含まれる」は、「包含する」、「包含している」又は 「含有する」「含有している」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、限定しない構成要素、要件、及び方法の工程の追加を排除しない。
【００８５】
ここで用いられている用語「約」は、パラメータ、量、時間的期間等の測定可能な値を示すとき、開示された発明を達成するのにふさわしい限り、特定値から、±20%以下、 好ましくは±10%以下、より 好ましくは±5%以下、さらにより 好ましくは±1%以下、さらによりもっと好ましくは±0.1%以下の変動に拡張する意味である。修飾的な「約」が参照する値は、それ自体も特定的に好ましい値として開示されている。
【００８６】
エンドポイントによる数値限定範囲は、その範囲内に包含されるすべての数字および小部分を含み、また限定したエンドポイントも含む。
【００８７】
本明細書に挙げられたすべての文書は、完全に、本明細書に、参照のために組み入れられる。特に、本明細書で特定して参照したすべての文書の教示事項は、参照により組み入れられる。
【００８８】
そして、いくつかの見地において、特に、課題を解決する手段の欄で説明された見地A1 - A12において、本発明は、１つ以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを検査する方法に関し、その方法は、
工程（１）：課題を解決する手段の欄のa) - u)で挙げられた核酸の１種、１種超若しくはすべてを含む又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出（特に与えられたアッセイの目的に依存する特定の選択）する工程、
工程（２）：課題を解決する手段の欄で詳述した核酸のいくつかまたはすべてを含むまたはからなる群から選ばれる、１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
【００８９】
「トランスジェニック植物イベント」は、ヘテロ核酸と植物細胞の独立した形質転換を伴っておこり、典型的には、１つの核酸構成は、注目する１つ以上のトランスジーン；注目する前記トランスジーンを含む構成または構成の一部分を、植物ゲノムへ挿入した結果生じた植物集団の再生；及び１以上、好ましくは１つ、特にゲノム位置への挿入によって特徴づけられる特定の植物の選択を含む。こうして用語「トランスジェニック植物イベント」は、最初に、そうして選ばれた形質転換植物体に拡張するとともに、対象のトランスジーンなどの挿入された核酸を含む、いずれの継代子孫も含む。前記子孫としては、例えば、前記挿入に対してヘミ接合またはホモ接合であってもよい。また、前記子孫は、例えば、栄養繁殖または性交差（sexual crossing）により得られてもよい。
【００９０】
ここで用いられている用語「植物」は、特に限定しない限り、一般に、植物細胞；植物プロトプラスト、植物組織；植物体が再生されることができるような植物細胞または組織の培養；植物カルス又は群団（clumps）；植物体及びその一部分にまで拡張される。例えば、花、花被片、花弁、萼片、葯、花粉、種子、果実、果皮、さや、葉、葉柄、幹、根、根茎、芽茎、塊茎、苗条などに拡張される。ここで用いられる用語は、一般に、植物界内で当該分野に分類されるあらゆる分類群の植物に拡張される。さらに、ここで理解されるような植物は、特に限定がない限り、地上植物（胚(embryophytes)）に属する、具体的には、維管束のない植物(コケ類（bryophytes) 及び維管束植物類(tracheophytes)に属することが好ましい。より好ましくは、特に限定しない限り、ヒカゲノカズラ類（lycopodiophyta）、トクサ植物門（equisetophyta）、シダ植物（peridophyta）、マツバラン類（psilotophyta）, ハナヤスリ目（ophioglossophyta）、および種子植物(spermatophytes)等の維管束植物類(tracheophytes) に属する。さらにより好ましくは、特に限定しない限り、例えば、マツ類（pinophyta）、ソテツ類（cycadophyta）、イチョウ類（ginkgophyta）およびマオウ類（gnetophyta）のように種子が露出状態となる植物(裸子植物)や、単子葉類(liliopsida)および双子葉類(被子植物)などの被子植物のような花をつける植物 (被子植物)は、種子植物(spermatophytes)に属する。好ましい植物は、農業や園芸に共通して適用され得る。特に限定しないが、例えば、好ましい穀物植物としては、トウモロコシ、小麦、ライス、オオムギ、モロコシ、たばこ、トマト、ポテト、アブラナ、大豆、テンサイ、 エンドウ、ひまわり、コットン、ピーナッツ、花 (例えばカーネーション)などが挙げられる。
【００９１】
用語「材料（material）」は、一般に天然物をいう。用語「トランスジェニック植物イベントに由来する材料」は、特に限定しないが、具体的には、トランスジェニック植物イベント有機体；トランスジェニック植物イベント有機体の一部分（例えば、花、花被片、花弁、萼, 葯, 花粉, 種子, 果物、果皮, サヤ, 葉、葉柄, 幹, 根, 根茎, 芽茎, 塊茎又は苗条、またはこれらの部分；トランスジェニック植物イベントの細胞、プロトプラスト、組織、カルスまたは群団（clumps）；または上記のいずれかが、川下段階で１以上の処理工程を受けることによって得られる材料など）などのトランスジェニック植物イベントに拡張する。これらの川下段階での処理工程としては、農業、園芸またはあらゆる川下産業において、特定の植物材料を処理するのに用いられる、いずれの操作も含む。川下産業としては、例えば、飲料業などの食品産業、飼料業、織物産業（例えばコットン、リネン、竹など）、燃料業（例えばアブラナ)、潤滑業(例えば、トウゴマ), 塗料業(例えばアマニ油、桐油）、化粧品及び薬品産業などが挙げられる。
【００９２】
具体的には、特に限定しないが、このような川下段階での処理には、収穫；不要な外層の除去（例えば、皮むき（peeling）、皮はぎ（skinning）など）；乾燥（例えば、空気乾燥、日光乾燥、スプレー乾燥、フリーズドライ、ジュース濃縮など）；縮小化（例えば、粉砕、ミル、チョップ、スライスなど）；液化（例えばジュース収集）；保存処理（例えば真空ボトル詰め、錫メッキ、缶詰め、低温殺菌、保存剤の添加など）；加圧（例えば、油収集）； 水素添加（例えば、野菜油の飽和）；冷浸；乳化；加熱処理（例えば、料理、加圧料理、蒸す、オーブンで焼く、燻製、揚げる、グリルするなど）；発酵（例えば、酵母、菌及び／又は真菌類による）；冷凍；などが挙げられる。
【００９３】
ここで用いられる用語「試料」は、広義には、品質コントロールのための検査のために存在しているより大きな材料全体の代表的部分または小部分をいう。好ましくは、本発明の方法により検査される試料は、注目する１以上のトランスジェニックイベントに由来する材料を潜在的に含むと疑われるものである。例えば、植物若しくはその部分又はこれらに由来する材料を含むとして、または多分可能性として含むと知られている材料を代表する試料は疑わしいと考えられる。好ましい試料では、植物若しくはその部分又はそれに由来する材料を含むとして、または多分可能性として含むと知られている材料を代表する試料であってもよく、前記植物若しくはその部分は、検査される試料内に存在する注目するトランスジェニックイベントと同じ分類群に属する。例えば、試料は、植物またはその部分の代表であり、収集された又は収穫された植物またはその一部（果物、種子、サヤ、花など）又は、川下段階でこれらに１以上の処理を適用することによって得られる中間材料又は最終材料の代表例、又はこれらの材料を含む製品、例えば加工食品、飼料生産物であってもよい。
【００９４】
そして、１つの態様において、試料は、植物または花、花被片, 花弁、萼片、葯, 花粉、種子,果実、果皮、サヤ、葉、葉柄 、幹、根、根茎、芽茎、塊茎、または苗条若しくはその一部分、植物細胞、植物プロトプラスト、及び／又は植物組織等の植物の一部；及び／又は植物に由来する材料、好ましくは加工食品又は飼料の材料を包含する食品又は飼料を含むことができる。
【００９５】
本発明の方法は、核酸、すなわち、注目するトランスジェニック植物イベントに起源のある又は由来する遺伝物質及び好ましくはゲノムＤＮＡが、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する。このような核酸の存在又は不在は、試料中にこの核酸が存在するか不在であるかについての指標、および各トランスジェニック植物イベントに由来する材料（例えばトランスジェニック植物イベントに適用される種々の処理工程の間に、前記核酸と共に精製、又は共に分離する材料）が試料中に存在する可能性があるか不在であるかの指標となる。
【００９６】
核酸、特にゲノムＤＮＡは、比較的耐性あるものとして知られており、その配列特異的検出を可能にするＤＮＡ分子長は、後に続く工程及びさらには最終生産物においても見出されることができるくらいに、例えば食品又は飼料産業等の農業および産業における植物材料に適用される種々の処理工程においても保持されることができる。
【００９７】
したがって、本発明の好ましい試料は、核酸を含み、より好ましくはゲノムＤＮＡを含み、さらに好ましくは、配列特異的検出を可能とする最小サイズが、例えば、平均して、最小約 20 bp, 例えば、約30 bp以上、好ましくは50 bp以上、例えば、約 75 bp以上、さらに 好ましくは、約100 bp以上, 例えば、約150 bp以上、さらにより好ましくは、約200 bp以上、または約 300 bp以上、又は約 500 bp以上、又は約１kb以上である。
【００９８】
トランスジェニック植物イベントについて、実際に共通して行われるほとんどの処理工程は、結果産物において、及び検査される試料において、上記のような検出可能な核酸を保持すると考えられるけれども、発明者は、前記試料が検出可能な植物由来の核酸を含むかどうかの確認で、狙いを定めたポジティブコントロールも意図する。
【００９９】
特に、本発明の方法は、植物属に由来する核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を、さらに含んでもよい。好ましい態様において、植物属に由来する核酸は、種々の植物分類群に存在している遺伝子に由来し、好ましくは、植物分類群間で高率に保持されている（例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらにより好ましくは96%以上、97%以上、98%以上若しくは99%以上の配列同一性を有する）。前記植物属に由来する核酸は、少なくとも種子植物内で；あるいは被子植物内で、単子葉及び双子葉間及び／又は内で；好ましくは農業および産業に共通に用いられた植物分類群間で、高率に保存されていることが好ましい。例えば、限定しないがトウモロコシ、小麦、ライス、オオムギ、モロコシ、たばこ、トマト、ポテト、アブラナ、大豆、テンサイ、エンドウ、ひまわり、コットン、ピーナッツ、花 (例えばカーネーション)；あるいは好ましくは、少なくとも試料において、テストされるトランスジェニック植物イベントの分類群を含む、又はからなる植物間で保持されることが好ましい。
【０１００】
好ましい態様では、前記植物属に由来する核酸が、Rubisco遺伝子の葉緑体の小サブユニット又はCHL-tRNAシンテターゼ遺伝子由来である。
【０１０１】
上述のように、本発明の方法は、工程（１）において、課題を解決するための手段の欄で、a)−u)で挙げた１種、１種超若しくはすべての核酸を含む又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程を含む。ここで用いられている用語「検出する」又は「検出」は、試料中で与えられている核酸の存在又は不在を決定する手段に拡張される。
【０１０２】
試料中に特定の核酸分子が存在することは、前記核酸分子内に含まれるそれぞれの核酸配列に特異的にハイブリダイズする１以上の試薬を用いて検出できることが好ましい。
【０１０３】
用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズ」は、核酸鎖が、塩基対、好ましくはワトソンークリック塩基対を通じて、同じまたは他のポリヌクレオチド鎖に含まれる相補的なまたは実質的に相補的配列とアニールすることによるプロセスをいう。
【０１０４】
用語「相補的」および「相補」は、許容される塩（イオン強度）および温度条件下での、塩基対、好ましくはワトソンークリック塩基対による、ポリヌクレオチドの正常な結合をいう。具体的には、相補的なワトソンークリック塩基対は、塩基AとT, AとU または GとCの間でおこる。例えば配列A-G-T (すなわち 5'-A-G-T-3')の相補配列は、A-C-T (すなわち5'-A-C-T-3')である。
【０１０５】
核酸鎖（Ｂ）に対する核酸鎖（Ａ）の「相補性の程度」は、核酸鎖（Ａ）と核酸鎖（Ｂ）がアニールされるとき、好ましくは高ストリンジェントな条件でアニールされるときの、核酸鎖（Ｂ）のヌクレオチドとのマッチ、すなわちワトソンークリック塩基対の形成が期待されるであろう、ヌクレオチドの核酸鎖（Ａ）における割合（パーセント）で表わされる。
【０１０６】
ここで用いられる「相補的な」は、核酸鎖のそれぞれすべてのヌクレオチドが、鎖がアニールするときに結合するであろうというような、全体的に相補的であることをいう。具体的には、もし比較的長い鎖が、比較的短い核酸鎖の配列に完全に相補的な配列を含んでいるならば、比較的長い核酸鎖に対して、比較的短い核酸鎖は、全体的に相補性を示すだろう。「実質的に相補的」とは、大部分は相補的であるが、全体としては相補でない、特に85%以上相補的、例えば90%以上相補的、好ましくは95%以上相補的、例えば、96%、97%、98% または99% 以上相補的であることをいう。
【０１０７】
「特異的にハイブリダイズする」および「特異的ハイブリダイゼーション」は、与えられた配列に対して、試薬がランダムで無関係な配列にハイブリダイズするときよりも、よりたやすくハイブリダイズするときの状況をいう。例えば、与えられたヌクレオチド配列（Ａ）に特異的にハイブリダイズする試薬は、前記ポリヌクレオチド（Ａ）に特異的にハイブリダイズするような条件下で、他のポリヌクレオチドにほとんど又はまったくハイブリダイズしないことが好ましく、あるいは核酸配列（Ａ）のホモローグまたはオルソローグに、ほとんど又はまったくハイブリダイズしないことが好ましい。
【０１０８】
上記a)−u)で挙げられた核酸内に含まれるそれぞれのヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズできる試薬を、プローブまたはプライマーとすることが好ましい。
【０１０９】
「プローブ」は、単離された核酸であり、検出可能な標識またはレポータ部分が所望により付けられている。前記標識またはレポータ部分としては、例えば、ラジオアイソトープ (例えば、³²P，³³P)、リガンド、化学発光剤、フルオロフォア（例えば、フルオロセイン、テトラクロロフルオレセイン、TAMRA，ROX，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Texas Redなど)、ビタミン(例えばビオチン)、ステロイド(例えばジゴキシン)、酵素 (例えば、HRP， APなど)等があげられる。このようなプローブは、本発明の場合、上記a)−u)で挙げた核酸、好ましくはゲノムDNAの場合には、標的核酸鎖に含まれる配列に相補的または実質的に相補的である。本発明のプローブは、デオキシリボ核酸、リボ核酸又はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの双方を含む核酸であってもよいし；標準的なプリン及び／又はピリミジン塩基（A, G, T, C, U 及び／又はＩ）を含み、また他の天然、化学的または生化学的に修飾された（例えばメチル化された）、非天然または誘導されたヌクレオチド塩基を含んでもよく；RNAまたはDNA内で典型的に見いだされることができるような、糖が結合したリン酸塩を含む骨格を含んでもよい。また、１つ以上修飾された又は置換された(例えば、2'-O-メチル化又は2'-O-エチル化等の2'-O-アルキル化；あるいは例えば、2'-O,4'-C-エチル化等の2'-O,4'-C-アルキニレート化）糖、あるいは１以上修飾された又は置換されたリン酸塩基−例えば、核酸における骨格アナローグは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホソホネート、ホスホロアミデート（phosphoramidate）、アルキルホスホトリエステル、スルファミン酸塩、3'-チオアセタール、メチレン(メチルイミノ), 3'-N-カルバメート、モルホリノカルバメート、及びペプチド核酸 (PNAs)を含んでもよい。
【０１１０】
プローブは、１０ヌクレオチド以上の長さであり、例えば、11以上、12,以上、13以上、または14 ヌクレオチド以上の長さであり、好ましくは 15 ヌクレオチド以上、例えば、１6以上、17以上、18以上、または19 ヌクレオチド以上の長さであり、より好ましくは20ヌクレオチド以上の長さ、例えば、21以上、22以上、23以上、24以上の長さであり、さらにより好ましくは25ヌクレオチド以上の長さであり、例えば、30以上、35以上、40以上、45以上、50以上、75以上、100以上または200ヌクレオチド以上の長さである。
【０１１１】
「プライマー」は、単離された核酸であり、好ましくはデオキシリボ核酸であり、あるいは他の好ましい例としてはリボ核酸若しくはPNASであって、前記標的核酸にアニールされることができ、核酸ポリメリゼーションのためのヌクレオチド及び薬剤の存在下では、DNA 依存型またはRNA依存型ポリメラーゼのように、プライマー伸長産物の合成開始点として作用できる、標的核酸に含まれる配列(本発明の場合には、上記ａ) - u)に挙げられた核酸を含む又はからなる核酸、好ましくはゲノムＤＮＡに含まれる配列）に相補的又は実質的に相補的なものである。
【０１１２】
プライマーは、ポリメリゼーション用薬剤の存在下で、伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さが必要とされる。このような典型的なプライマーとしては、１０ヌクレオチド以上の長さ、例えば11以上、12以上、13以上または14ヌクレオチド以上の長さ、好ましくは15 ヌクレオチドの長さ、例えば、16以上、17以上、18以上、または19ヌクレオチド以上の長さ、さらに好ましくは20ヌクレオチド以上の長さであることが好ましい。さらに好ましいプライマーは、約１０〜約４０ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは約15〜約30ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは約20〜約25ヌクレオチドの長さである。
【０１１３】
「プライマー対」は、標的核酸内（本発明の場合には、上記a) - u)で挙げられた核酸を含む、又はからなる核酸内、好ましくはゲノムＤＮＡ内）で、好適な核酸増幅法により、アンプリコンを増幅するのに適したプライマーの組み合わせをいう。従って、特異的にハイブリダイズするようにデザインされたプライマー対を用いて、与えられた標的核酸内で、アンプリコンを増幅できるということは、試料中に、前記標的核酸が（任意の量）存在することを示す。
【０１１４】
プローブ及びプライマーの調製方法及び使用方法は、特に限定しないが、具体的には、 Molecular Cloning:「実験マニュアル、２版、１−３巻、Sambrookら、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス社、Cold Spring Harbor, N.Y., 1989年（「Sambrookら、1989年」）；分子生物学の最新プロトコル、ed. Ausubelら、Greene Publishing and Wiley-Interscience, ニューヨーク、1992年（周期的にアップデートされる) (「Ausubelら、1992年」)；及びInnisら、PCRプロトコル：方法及び応用へのガイド、アカデミックプレス社：サンディエゴ、1990年。PCRプライマー塩基対は、例えば、Primer3のような目的のために作成されたコンピュータプログラム（RozenおよびSkaletsky. 2000年、一般的ユーザーおよび生物学者プログラマーのためには、WWW上のPrimer3。In: Krawetz S, Misener S (eds) バイオインフォマティクスの方法及びプロトコル：Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, ニュージャージー州、365−386頁)またはAccelrysのGCG^TM v. 11.1.2パッケージを用いることによって、既知配列から誘導されることができる。
【０１１５】
標的核酸、例えば、上記a) −u)で挙げられた核酸を含む又はからなる核酸内で、それぞれの相補配列に対する、本発明のプローブ、プライマーまたはプライマー対の特異的ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好ましく達成されることができる。
【０１１６】
「高ストリンジェント」な条件は、例えば、以下のような状態と等価な状態を含む。すなわち約500ヌクレオチドの長さのプローブが採用されるときには、5×SSPE (43.8g/l NaCl、6.9 g/l NaH₂PO₄.H₂O及び1.85 g/l EDTA、NaOHで pH7.4に調整)、0.1% SDS、5×Denhardt's 試薬 (50×Denhardt's は、500 mlあたり、5 gのFicoll (Type 400,ファルマシア社)、5 g のBSA (Fraction V；シグマ社) 及び100 μg/mlの変性されたサケの精子DNAを含む)からなる溶液中で、６５℃で、結合またはハイブリダイズさせ、続いて、5×SSPE、0.1% SDSを含む溶液で65 ℃で洗浄するような状態。おおよそ約2０〜100ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約30〜100ヌクレオチドの長さ、例えば30〜50ヌクレオチドの長さを超える核酸にとって「高ストリンジェント」なハイブリダイゼーションの他の条件としては、例えば、6×SSCにおける45℃でのハイブリダイゼーション、続いて、0.2×SSC、0.1% SDSまたは均等な0.1×SSC、0.1% SDSを用いた65℃での１回以上の洗浄と等価な条件が挙げられる。多くの等価な条件は、ストリンジェントな条件に変更して採用され得る。変更の条件としては、プローブの長さ及び特性(DNA, RNA, 塩基組成)、標的の特性（溶液に存在するあるいは固定されたDNA、RNA、塩基組成など）および塩濃度及び他の成分(例えば、ホルムアミド、デキストラン、サルフェート、ポリエチレングリコールの存在または不在)のようなファクターが考えられる。また、ハイブリダイゼーション溶液を変更することにより、等価ではないが、上記で挙げた条件とは異なる、低ストリンジェント又は高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を調製することができる。さらに、当業者は、高ストリンジェント条件（例えば、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄工程の高温化、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの使用など)下でのハイブリダイゼーションを促進する条件に精通している。ハイブリダイゼーション反応を行うためのガイダンスは、例えば、分子生物学の最新プロトコル、John Wiley & Sons、ニューヨーク州、6.3.1-6.3.6, 1989年、及びさらに最近のアップデート版で見つけることができ、これらはすべて、参照により組み込まれる。
【０１１７】
プライマー対を用いた標的核酸内でのアンプリコンの増幅に関して、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェントな条件」とは、プライマー対が、そのそれぞれの標的核酸配列に対してのみハイブリダイズできるような条件で、且つ実質的には所望でない、すなわち非特異的増幅による産物を生産することなく、固有の増幅産物すなわちアンプリコンを生産できるようにする条件である。例えば、ストリンジェントな条件（例えば、ゲル電気泳動により分析される、またはTmの決定などにより分析されるような条件）で増幅反応が行われるときには、非特異的生産物は、増幅反応における増幅産物の総量（例えば重量）の20%未満であることが好ましく、より好ましくは10%未満、さらにより好ましくは5%未満、例えば、4%未満、3%未満、あるいは2%未満、さらにより好ましくは1%未満、例えば0.1%未満あるいは0.01%未満であることが好ましい。
【０１１８】
従来の方法は、試料内での標的核酸とプローブの特異的ハイブリダイゼーションを検出するのに用いることができる。例えば、試料からの核酸好ましくはDNAを固体支持体上に固定し、変性されて、（例えば、サザンブロッティング、スロットブロッティング、ドットブロッティングなどにより）、それぞれのプローブとハイブリダイズさせる。もし、プローブ（及び結果として検出され得るプローブの標識）が固体支持体上に保持されているならば、プローブに特異的な標的核酸が試料内に存在することを示す。
【０１１９】
同様に、現存しているいずれの核酸増幅法も、注目する標的配列内からアンプリコンを増幅するのに用いることができ、これにより、試料内に、標的に対応する配列が存在していることが示される。前記核酸増幅法としては、特に限定しないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) (US 4,683,202; US 4,965,188)、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法（US 5,455,166; EP 0684315)、LCR、TAS、3SR、NASBA (US 5,409,818; EP 0329822)、RCAおよびQ-beta 増幅などが挙げられる。
【０１２０】
特に好ましい態様においては、本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) を用いて、上記a) - u)で挙げられた核酸を含む、またはからなる核酸から選ばれる標的核酸内からアンプリコンを増幅する。用語「ポリメラーゼ連鎖反応」および「PCR」は、当該分野、具体的には、熱安定性DNA ポリメラーゼと２つのプライマー（一方のプライマーは増幅される配列の一端で（＋）鎖に相補的であり、もう一方のプライマーは他端で（−）鎖に相補的）、特にオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標的核酸配列、特に標的ＤＮＡ配列を増幅する方法のような、いずれの方法も、広く包含する。この用語は、例えば、高high-fidelity PCR、hot-start PCR、touch-down PCR、nested PCR、multiplex PCR、定量PCR、定量リアルタイムPCR、long-range PCR、RT-PCR (例えばＰＣＲプロトコル：方法及び応用へのガイド、eds. Innisら、アカデミックプレス社、サンディエゴ、1990年参照）等のようなプロトタイプPCRの部分的変更にも拡張される。
【０１２１】
上記増幅方法、特にＰＣＲを用いて得られる増幅産物は、例えば、その増幅産物の存在又は不在、特異性及び／又は量について、当該分野で共通のいずれの方法によっても、評価できる。例えば、(増幅特異性の指標としての）サイズ、及び／又は増幅産物の量が、例えばエチジウムブロマイド等の好適なＤＮＡ結合染料を用いて、増幅産物を視覚化するようなアガロースゲル電気泳動、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて評価することができる。
【０１２２】
あるいは、増幅による産物は、増幅産物内の特異的配列にハイブリダイズするプローブを採用する方法により評価されてもよい。例えば、増幅産物を、固体支持体に固定し、変性し、続いて標識したプローブとハイブリダイズしてもよい。
【０１２３】
さもなければ、例えば、１または双方のプライマーにおいて検出され得る標識（例えばフルオロフォア）を含むことによって、及び／又は増幅する間に、増幅産物の中に組み入れられる基質ヌクレオチドにより、増幅産物自体を標識してもよい。そうして得られたＰＣＲ生産物は、続いて変性され、固体支持体に支持された特異的な（オリゴヌクレオチド）プローブとハイブリダイズされてもよい。こうして固体支持体上での選択される位置において、検出され得る標識の存在および量は、それぞれ増幅産物の特異性および量を示す。例えば、そのようなセットアップは、プローブアレイ、例えばマイクロアレイを用いる使用に適している。
【０１２４】
さらなる具体的な方法では、増幅産物は、クローニングおよびシークエンシング；ダイレクトシークエンシング；オリゴヌクレオチド仲介ピロシークエンシング（Ahmadianら、2000年、Anal Biochem 280：103−110頁）；クロマトグラフィ、例えばDHPLC、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(Landegrenら、1988年、Science 241：1077；Eggerdingら、1995年、Hum Mutat 5：153−165頁；Nickersonら、1990年、PNAS 87：8923−8927頁）；RNAse プロテクションアッセイなどを用いて評価されることができる。
【０１２５】
増幅産物を評価するのに特に有用な方式は、リアルタイム−増幅法、特にリアルタイムＰＣＲである。用語「リアルタイム増幅」は、いずれかの増幅手法を意味することを意図し、好ましくは PCR (「リアルタイムＰＣＲ」)を意図する。ＰＣＲは、進行中の増幅反応の過程をモニターすることを可能にする（例えば、リアルタイムPCR：エッセンシャルガイド、eds. Edwardsら、ホライズンサイエンティフィックプレス社、2004年；Marras SAE ら、2006年、分子と他の蛍光核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムアッセイ。 種々のリアルタイムPCRプラットホームの論議のためには、Clin Chim Acta 363：48−60頁参照).。
【０１２６】
具体的には、特に限定しないが、リアルタイム増幅、特にリアルタイムＰＣＲは、ここで意図されるように、例えば、アプライドバイオシステムズ社により開発されたTaqMan^TM システムのように、ＤＮＡ増幅が１周する間に、蛍光遺伝子（fluorogenic）プローブが離れて検出を行う、従来のシステムを十分に拡張する(Hollandら、1991年、Thermus aquaticus DNAポリメラーゼの5'-3'エキキソヌクレアーゼ活性を利用することによる、特異的ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出。PNAS 88: 7276-80)。その方法は、プライマーが伸長する間に、Taq ポリメラーゼの5' エキソヌクレアーゼ活性により、PCRプライマー間で、標的ＤＮＡにハイブリダイズされた、二重に標識された蛍光遺伝子（fluorogenic）プローブを分解する。プローブの分解前は、プローブの5'末端にある6-カルボキシフルオロセイン(6-FAM)のようなレポータフルオロフォアが、蛍光共鳴エネルギートランスファー(FRET)を通して、6-カルボキシ−テトラメチルローダニン(TAMRA)によって、消光されている。プローブの分解に従って、FAMが分離する。分離の結果は生じる蛍光は、増幅産物が蓄積する対数増殖期（log phase）の間に、518 nm付近で、リアルタイムで測定され、標的核酸のコピー数に比例する。
【０１２７】
さらに、リアルタイム増殖、特にリアルタイムＰＣＲの検出システムでは、例えば、分子ビーコン（molecular beacon）に基づいたシステムのように、FRETを利用することもできる。分子ビーコンは、ステムループヘアピン構造を有する一重鎖のポリヌクレオチドプローブである。ループ位置は、評価されるアンプリコン内の配列に相補的なプローブ配列であり、ステムは、分子ビーコンの向かい合っている両端に位置する短い相補的配列により形成される。分子ビーコンは、一方端をフルオロフォア（例えば 6-FAM)で、他方端をクエンチャー（例えばTAMRA)で標識する。プローブが溶液内でフリーのときは、ステムにおいて、フルオロフォアとクエンチャーが接近するように保持されているため、フルオロフォアの蛍光がFRETにより消光されるようになっている。しかしながら、プローブが相補的に標的に結合すると、プローブ−標的ハイブリッドとなることにより、ステムをほどき、クエンチャーからフルオロフォアが分離して、蛍光が回復する。従って、アンプリコンの量が増幅により増加するとき、アンプリコンの増加量は、対応するビーコンの蛍光の増加としてモニタされることができる(例えば、Manganelliら、2001年、分子ビーコンを用いたリアルタイムPCR。Methods Mol Med 54：295−310頁；Marras SAE. 2006年、蛍光核酸ハイブリダイゼーションのための、フルオロフォアとクエンチャーのペアの選択。Methods Mol Biol 335：3-16；Marras SAEら、2006. 分子ビーコンと他の蛍光核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムアッセイ。さらに、分子ビーコン検出の論述のためにはClin Chim Acta 363：48-60）。
【０１２８】
本発明で用いるのに、特に有効なリアルタイムPCR増幅及び検出システムは、インビトロジェン社(Carlsbad, CA)によって市販されているLight Upon Extension (LUX^TM) システム、並びにNazarenkoら、2002年（核酸リサーチ30: e37) 及びNazarenkoら、2002年（核酸リサーチ30: 2089-2095)に詳述されている。このシステムは、通常、プライマー対のうちの一方のプライマーがフルオロフォア（例えば、FAM 又はJOEまたはAlexa Fluor 546のような)によって標識されているプライマー対を採用している。プライマーの「フリー」の状態での構造は、結合しているフルオロフォアのシグナルは消光している。プライマーがひとたび増幅産物に組み入れられて、伸長したコンフォーメーションを有するようになると、フルオロフォアのシグナル強度が増大する。表１及び４で挙げられた特に好ましいプライマーのような本発明のプライマー配列は、Nazarenkoら、2002年に発表の上記刊行物の指示に従う、あるいはwww.invitrogen.com/lux.でインビトロジェン社によって提供されているソフトウェアツールを用いた、LUX^TM 技術を用いて行うのに適合して作られてもよい。各プライマーセットは、異なるフルオロフォアを用いて標識されるので、LUX^TM 技術は、異なるプライマーセットを用いる２以上の増幅を複合化（すなわち、単一反応において実行）するのに適している。
【０１２９】
リアルタイムで増幅産物を検出及び評価する追加的方法の説明としては、例えば、隣接するプローブ；Taqman^TMのような5'-ヌクレアーゼプローブ；ライトアッププローブ；Duplex scorpionプライマー；Amplifluorプライマー；及び更なる択一的蛍光ハイブリダイゼーションプローブフォーマット（例えば、Marras SAEら、2006年。分子ビーコン及び他の蛍光核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムアッセイ、Clin Chim Acta 363：48-60、特にこの中のセクション6及びレフェレンス部分を参照。
【０１３０】
より好ましい態様において、本発明のリアルタイム増幅、好ましくはリアルタイムPCRは、(実質的に)配列非特異的試薬を用いて、増幅産物の蓄積を検出し評価する。これらのシステムは、通常、配列に実質的に非特異的な方式において、ＤＮＡ、好ましくは二重鎖ＤＮＡに結合する（すなわちＤＮＡに結合している）蛍光色素（蛍光染料）を採用しており、このような結合に基づいて蛍光が達成され、強められる。従って、蛍光の増大を観察することは、増幅産物（二重鎖）の蓄積及び蓄積量の指標の観察となる。前記蛍光色素が、二重鎖ＤＮＡに、優先的に又は排他的に結合する場合、及び／又は二重鎖ＤＮＡが結合されるときに蛍光が優先的に又は排他的に強められる場合には、増幅産物の特異性は、「融解曲線」すなわち蛍光vs温度をプロットし、産物のTm（すなわち産物の５０％が融解して、強められた蛍光が失われる温度）を決定することにより決めることができる。１つの増幅産物に対して予期される１つのTm（あるいは複合的増幅においては、予期される多数のTm）を観察することで、増幅の特異性を検証する。
【０１３１】
上記配列非特異的な検出方法において用いられる蛍光色素としては、例えば、限定しないが、主溝バインダー、副溝バインダー、インターカレーションを起こす染料などが挙げられる。具体的には、例えば、サイバーグリーン（SYBR GREEN）Ｉ（2-[N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-プロピルアミノ]-4-[2,3-ジヒドロ-3-メチル-(ベンゾ-1,3-チアゾール-2-イル)-メチリデン]-1-フェニル-キノリニウム；Zipperら、2004年、核酸リサーチ32: e103)、エチジウムブロマイド、ヘキスト33258, PicoGreen^TM (モレキュラープローブス社), 好ましくはサイバーグリーンＩまたはPicoGreen^TMが挙げられる。
【０１３２】
さらに好ましい態様では、本発明の方法におけるリアルタイム増幅反応を、複合化してもよい。すなわち、２以上の異なるアンプリコンを、同じ試料上の同じ反応で、２以上の対応するプライマー対を用いて増幅させることができる。このときのプライマーは、本発明者らにより試みられ、具体的には、表１または表４のいずれかで挙げたプライマー、またはバリアント、またはその誘導体は、実質的または類似の反応条件（例えば、反応組成物および温度サイクル条件）で増幅し、さらにこれらが類似のサイズの生産物を生産するという理由により、複合的用途に特に適合することができる。
【０１３３】
複合化に対しては、反応で生じる異なる増幅産物を区別できることが一般に要求されることは、十分理解できる。現在の状況では、配列に特異的でない方法(例えば、サイバーグリーンまたは他のDNA結合染料）が、増幅産物の検出に用いられるならば、複合化は、融解曲線を作製することによって区別されるような十分に非類似なＴｍ（例えば、約5℃以上異なっている）で、具体的に予見することができる。しかしながら、アンプリコン特異的検出方法（例えば、異なるアンプリコンに対して、異なる標識付けされたプライマーまたは異なる標識付けされたプローブ）が用いられるところでは、現在のテストとはかけ離れた複合が、原則として可能である。
【０１３４】
そして、プライマー対を用いた増幅のためのプローブ及び／又は鋳型を用いる上記で定義された検出用の標的は、試料中に含まれるそれぞれのトランスジェニック植物イベントの起源となる核酸となるであろう。この標的及び／又は鋳型核酸は、他の核酸タイプ（例えば、hnRNAやmRNAなど）よりもはるかに安定で、試料中によりよく保存されることが期待できるという理由から、前記トランスジェニックイベントが起源とするゲノムＤＮＡであることが好ましい。とはいえ、本発明は、mRNAやcDNA、あるいは利用可能なところではプラスミド由来DNAの（例えば、対応するRT-PCTアッセイによる）検出も、意図する。
【０１３５】
本発明は、こうして、核酸、好ましくは上記a)−u)で挙げられた核酸を含む又はからなる核酸が試料中に存在するか又は不在であるかを検出する１手段として、試料中に上記核酸が存在するか又は不在であるか検出するのに必要である核酸について、特異的にハイブリダイズし、対応するアンプリコンを増幅するように設計したプライマー対を用いた増幅を採用することが好ましい。
【０１３６】
この点において、本発明者らは、トランスジェニック植物イベントの由来材料が、（例えば上記のような）川下段階で１以上の処理工程にさらされる場合には、ゲノムＤＮＡのような核酸が断片化されてもよいと認識した。従って、そのように断片化されたＤＮＡからも各アンプリコンが代表的に増幅されるチャンスを増大するために、本発明は、アンプリコンのサイズを効果的に小さくすることも教示する。
【０１３７】
従って、本発明の態様においては、アンプリコンは、約300 bp未満、例えば280bp未満、260bp未満、240bp未満、220bp未満、より好ましくは、約200bp未満、例えば、190bp未満、180bp未満、170bp未満、または160bp未満、さらにより好ましくは、約150bp未満、例えば、140bp未満、130bp未満、120bp以下、110bp未満、さらにまたより好ましくは、約100bp未満、そしてなおもより好ましくは、約90bp未満、例えば、約85bp、約80bp、約75bp、約70bp、約65bp、約60bp、約55bpまたは約50bpである。
【０１３８】
さらに好ましい態様では、アンプリコンは、約50bp〜150bp、約50bp〜約100bp、好ましくは、約50bp〜約90bp、より好ましくは、約60bp〜約80bp、さらにより好ましくは、約65bp〜75bpである。
【０１３９】
説明したように、上記方法は、試料中の特定の核酸、好ましくはゲノムＤＮＡを検出する。いくつかの耐久性ある検出プロトコル、例えばいくつかのＰＣＲプロトコルについては、試料中の構成核酸を前もって精製または豊富化しなくても、遂行できるという効果を認めることができる。一方、核酸、好ましくはゲノムＤＮＡのような核酸が、試料から最初に豊富化され、単離されるならば、本発明の検出を、より一様に行ってもよい。試料、特に植物材料を含む試料から、ゲノムＤＮＡ等の核酸を単離する方法は、当該分野で古くから存在する。特に限定しないが、例えば、有機溶媒抽出(例えば、フェノール−クロロホルム抽出)およびエタノールまたはイソプロピルアルコール沈殿；イオン交換樹脂への結合；塩化セシウム密度分離；スピン−カラムクロマトグラフィ、磁気分離など(例えば、Milligan 1992年、植物DNAの単離、59−88ページ、Hoelzel, ed、ポピュレーションの分子遺伝学的解析：実行的アプローチ、IRLプレス社、オックスフォード、英国参照)の方法が挙げられる。
【０１４０】
このように単離されたＤＮＡの量は、例えば、ゲル電気泳動により、及び／又はA₂₆₀/A₂₈₀ 吸収比を測定することによって、評価される。好ましくは、本発明の検出方法で用いられる核酸のA₂₆₀/A₂₈₀ 比は１.6〜2.3であり、より好ましくは1.6〜2.0、さらにより好ましくは1.7〜1.9、さらにまたより好ましくは1.75〜1.85、及びもっとも好ましくは、約1.8である。このように単離されたDNAの量は、例えば、吸収A₂₆₀を測定することによって(Sambrook 1989年）、あるいは好ましくはPicoGreen^TM またはサイバーグリーンＩ蛍光色素を用いて評価してもよい(Ahnら、1996年、核酸リサーチ 24：2623−5；Schneebergerら、1995年、PCR Methods Appl 4：234−8)。
【０１４１】
好ましい態様において、本発明の方法で用いられる核酸物質（具体的にはゲノムＤＮＡ）の調製は、より小さい平均サイズの核酸断片を得るための当該分野で知られている断片化、例えば、酵素消化、または超音波処理を用いる断片化をともなってもよい。そのように断片化された核酸の好ましい平均長さは、200〜2000 bp、より 好ましくは300〜1500bp、さらにより好ましくは500〜1000bp、例えば、約 500、約600、約700、約800、約900または約1000bpである。
【０１４２】
上記方法は、このようにして、試料中に選択した核酸が存在するか又は不在であるかを検出し、好ましくは、以下に述べるような、検出システム及びプロトコルを用いて検出する。ここで用いられるように、好適な検出アッセイを用いて、試料中の核酸で得られるシグナル(例えば、蛍光シグナル、化学発光シグナル、酵素反応シグナルなど）の強度値（シグナル量）が、ネガティブコントロール中の核酸について得られるシグナル強度値よりも大きく、好ましくは統計学的に顕著に大きいときには、目的とする核酸が試料中に「存在」すると、一般に結論づけられる。
【０１４３】
ネガティブコントロールは、アッセイされる核酸を含まないが、例えば、当該コントロール中に含まれる含まれる植物材料のタイプおよび量も、植物材料がさらされる川下段階での処理等の他の点において、好ましくはほとんどの他の点において、有効に試料に匹敵できる。
【０１４４】
好ましくは、本発明の検出方法は、試料から単離された核酸上で、より好ましくはゲノムＤＮＡ上で行われてもよい（上記参照）。このような場合、ネガティブコントロールは、検出に供される核酸を含まずに、実質的に単離された核酸からなっていてもよい。好ましい検出法では、試料と参照用のネガティブコントロールとの双方から、同じまたはほとんど同じ量だけ単離された核酸を採用するだろう。また、好ましくは、試料およびネガティブコントロールから単離された核酸の純度及び／又は品質は、同じであっても、ほとんど同じであってもよく；さらに好ましくは、試料およびネガティブコントロールの双方からの核酸の単離について、同じ単離方法を用いてもよい。
【０１４５】
上記状況において、試料中に核酸が存在するために得られるシグナル強度値が、ネガティブコントロールにおいて得られるシグナル強度値の少なくとも2倍以上、例えば、3倍以上、又は4倍以上、より好ましくは 5倍以上、例えば、6倍以上、7倍以上、8倍以上、または9倍以上、さらにより好ましくは10倍以上、例えば、15倍以上、さらにまたより好ましくは20倍以上、例えば30倍以上、または40倍以上、なおもまだより好ましくは、50倍以上、例えば、100倍以上、200倍以上、300以上、400以上、500倍以上、1000倍以上、あるいはネガティブコントロールにおけるシグナルよりもはるかに大きいシグナル強度値（シグナル量）が得られるとき、与えられた核酸が試料内に存在していると結論づけられることが好ましい。
【０１４６】
そして、試料中で分析される核酸用に得られたシグナル値（シグナル量）が、ネガティブコントロールにおいて分析される核酸用に得られるシグナル値よりも大きくないとき（例えば、同じ、ほとんど同じ又はより低い）、または好ましくは上記特定された好ましい複合よりも大きくないときは、試料中に前記核酸は「不在」であると、一般に結論づけられる。
【０１４７】
好ましい態様においては、注目する核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかは、リアルタイム増幅により、好ましくはリアルタイムPCRにより評価される。これらのシステムにおいて、試料中に与えられる核酸としての鋳型量を表すのに用いられる共通の度合いは、C_t 値である。簡潔にいうと、C_t 値は、結果として生じる増幅産物に起因する蛍光（△R_n）が所定の蛍光閾値を越えるサイクル数をいう。閾値は蛍光の基準線を超えるが、増殖の対数増殖期内にセットされる（すなわち、蛍光 vsサイクル#データのプロットで、log ２で直線状になるような位置内にセットされるサイクル数をいう）。
【０１４８】
従って、リアルタイム増殖は、試料のC_t（「SAM C_t」）がネガティブコントロールのC_t （「NC C_t」）よりも低い場合には、一般に、与えられる核酸が試料中に存在すると結論づける。好ましくは 、SAM C_t ≦（NC C_t−１）のとき、例えば、SAM C_t ≦（NC C_t −２）、SAM C_t≦（NC C_t −３）またはSAM C_t ≦（NC C_t −４）のとき、より好ましくは、SAM C_t ≦（NC C_t −５）のとき、例えばSAM C_t ≦（NC C_t −６）、SAM C_t ≦（NC C_t −７）、SAM C_t ≦（NC C_t −８）あるいはSAM C_t ≦（NC C_t −９）、さらに好ましくは、SAM C_t ≦（NC C_t −１０）のとき、例えばSAM C_t ≦（NC C_t −１１）、SAM C_t ≦（NC C_t −１２）、SAM C_t≦（NC C_t −１３）、SAM C_t ≦（NC C_t −１３）またはSAM C_t ≦（NC C_t −１４）、さらにまたより好ましくは、SAM C_t ≦（NC C_t −１５）のとき、例えばSAM C_t ≦（NC C_t −１６)、SAM C_t ≦（NC C_t −１７）、SAM C_t ≦（NC C_t −１８）またはSAM C_t ≦（NC C_t −１９）、なおもより好ましくは、SAM C_t≦（NC C_t−２０）のとき、例えばSAM C_t ≦（NC C_t −２５）、SAM C_t ≦（NC C_t −３０）またはSAM C_t ≦（NC C_t −３５）のときに、試料中に存在すると結論づける。
【０１４９】
そして、リアルタイム増幅において、SAM C_t がNC C_t,よりも低くないとき(例えば、同じ、ほとんど同じか大きいとき)あるいは好ましくは、上記で特定した、好ましい差よりも低くないとき、試料中に前記核酸が「不在」であると、一般に結論づけることができる。
【０１５０】
上述のように、配列特異的プローブを採用しないリアルタイム増幅システムにおいて、（例えば、増幅産物が、例えばサイバーグリーンＩ等の配列非特異的DNA染料を用いて検出されるときに）、融解曲線を作製し、Ｔｍを決定することによって、増幅産物の特異性を確実にすることができる。観察されるＴｍが、予期したアンプリコンの融点の計算値及び／又は実験で決められた値と同じ又は実質的に同じとき(好ましくは±3℃、より好ましくは ±2℃、さらに好ましくは ±1℃、さらにより好ましくは ±0.5℃、なおもより好ましくは ±0.2℃又は±0.1℃の範囲内)、特異的増幅産物が存在すると結論づけられる。
【０１５１】
さらに、増幅産物の融解曲線分析が、単一のＴｍを表しているとき、特異的増幅であると結論づけることができる。あるいは又はさらに、増幅産物がゲル電気泳動において、単一の予期されたサイズを表しているとき、増幅産物であると結論づけることができて、好ましい。しかしながら、実際には、非特異的産物は、ある程度、耐久性があるだろう。このような非特異的増幅産物が実際に現れるときは、増幅産物の総量に対する非特異的増幅産物の重量(w/w)が、50%未満、より好ましくは40%未満、さらに好ましくは30%未満、さらにより好ましくは20%未満、またさらにより好ましくは10%未満、さらにより好ましくは5%未満、よりさらに好ましくは2%未満、およびもっとも好ましくは1%未満、例えば0.5%未満または0.1%未満であることが好ましい。このような非特異的産物は、例えば、融解曲線分析における１つ以上のＴｍピークの出現により、及び／又はゲル電気泳動上の１つ以上の追加産物の出現により、観察され得る。
【０１５２】
本発明のさらなる発展においては、異なるイベントが起源とする核酸について、同じプライマーセットを用いて増幅したアンプリコンが、このようなアンプリコン間での配列におけるいくつかの違いのためと考えられるような、区別されるTm値を示し得ることに、留意する。例えば、特に限定しないが、Bt11及びBt176におけるプライマーセット SEQ ID NO: 11及び12 (表4) を用いて増幅したアンプリコンは、Ｔｍについて、そのような違いを示す。従って、観察されたTm値は、特定のイベントから、核酸の存在または不在についてのさらに詳細な指標を与えるように、本発明の方法において更に特徴的な情報となり得る。
【０１５３】
あるいは又はさらに、さらなる変形においては、１以上のイベントからの特定のプライマーセットを用いて増幅できるであろう一方、同プライマーは、プライマー結合部位におけるいくつかの配列の差異のために、他の１以上のイベントにおいて、対応する核酸を増幅しないと考えられる。このような状況は、（注目するすべての植物イベント由来の核酸を増幅するプライマーセットを選択するほどにも有効でないと思われることもあり得るときに）、異なるイベント由来の対応できる核酸を増幅するのに２つ以上のプライマーセットを必要とする一方、特定のイベントからの核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかについての追加情報を提供するという有利な点がある。例えば、Cry1Ab 核酸は、プライマーセットSEQ ID NO: 30 及び31を用いたMON810とプライマーセットSEQ ID NO: 11及び12を用いたBt11及びBt176とから、効果的に検出されることができる（表4)。
【０１５４】
増幅反応、例えばＰＣＲが、非特異的「プライマー−ダイマー」副産物を生成し得ることを、当業者は知っている。このようなプライマー−ダイマー産物は、差異、ほとんどの場合は、より小さいサイズ及び／又はＴｍの差異により、特異的増幅による産物から、極めて容易に区別されることができる。そして、当業者は、増幅反応の分析におけるそのような人工物の影響を認識し、最小化できるであろう。本発明の好ましいプライマーは、表１および表４で挙げたプライマーのように、プライマー−ダイマーの影響を最小化するように、デザインした。
【０１５５】
さらなる論点は、本発明において用いられる検出方法の感度である。感度は、その「検出限界（ＬＯＤ）」として、効果的に表現され得るもので、やむを得ず定量化しないけれども、確実に検出されることができる試料中の分析物（ここでは検出されるように与えられる核酸）のもっとも低い量または濃度をいう。ここで用いられる「確実に検出される」とは、ＬＯＤ量または濃度の分析物を含む試料が、繰り返される検出の50%以上、好ましくは、繰り返される結果の60%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上、そして最も好ましくは95%以上又はまさに繰り返される検出の99%以上というポジティブな結果を与えるだろうという意味である。
【０１５６】
好ましくは、本発明で用いるのにふさわしい検出方法のLODは、ここでは、検出に供される試料内での注目する与えられた核酸のＬＯＤコピー数として表わされ、10000以下、例えば、9000以下、8000以下、7000以下、6000以下、より好ましくは 5000以下、例えば4000以下、3000以下、または2000以下、さらにより好ましくは 1000以下、例えば900以下、800以下、700以下、600以下、またさらにより好ましくは 500以下、例えば400 以下、300以下、200以下、よりさらに好ましくは100以下、例えば90以下、80以下、70以下、60以下、最も好ましくは 50以下である。具体的に好ましい態様には、40以下、30以下、20以下、まさに1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 または9のような10以下である。本発明の好ましいプライマーは、表１及び表4に挙げられた核酸のように、特定の高感度（低いＬＯＤ）を達成するように設計された。
【０１５７】
ここで用いられる用語「トウモロコシ」は、Zea mays, 好ましくは Zea mays ssp. mays,及びトウモロコシを生み出すことができるあらゆる植物の変種を含み、野生トウモロコシ種を含む。用語「ナタネ（rapeseed）」、「アブラナ（oilseed rape）」または「セイヨウアブラナ（canola）」は、Brassica napusと相互変換可能であり、ナタネを生成するあらゆる植物の変種を含み、野生ナタネ種を含む。用語「ソーヤ（soya）」、「ソイ（soy）」「ダイズ（soya bean）」または「大豆（soyabean）」は、Glycine maxと相互変換可能であり、大豆を生み出すあらゆる植物の変種を含み、野生大豆種を含む。用語「ライス」は、 Oryza sativaをいい、インディカ種、ジャポニカ種、及びライスを生み出すあらゆる植物の変種を含み、野生ライス種を含むがこれらに限定しない。用語「テンサイ」は、Beta vulgarisをいい、テンサイを生み出すあらゆる植物の変種を含み、野生テンサイ種を含む。用語「コットン」は、Gossypium species、 好ましくは Gossypium hirsutumをいい、コットンを生み出すあらゆる植物の変種を含み、野生コットン種を含む。用語「ポテト」は、Solanum tuberosumをいい、ポテトを生み出すあらゆる植物の変種を含み、野生ポテト種を含む。
【０１５８】
トランスジェニック植物イベントは、ここでは、当該分野で共通に採用される及び当業者に知られたような名称により参照される。にもかかわらず、さらなるアシスタンスにより、下記表２は、特定されたイベントの、特異的同定に十分な情報を要約する。
表２：トランスジェニック植物イベントの同定
【表２−１】


【表２−２】

【０１５９】
上記で挙げられた固有の識別子（ＵＩ：unique identifier）は、経済協力開発機構（OECD）によってきまった場所にセットされたトランスジェニック植物イベント固有の分類システムを示し、その刊行物ENV/JM/MONO(2002)7（２００４年１０月２０日の「トランスジェニック植物に対する固有の識別子のためのOECDガイダンス」、及び２００６年１１月７日のENV/JM/MONO(2002)7/REV1）に説明されている。前記固有の識別子は、ヨーロッパを含んで国際的に使用され、認められ、委託される（例えば、２００４年１月１４日に設立された、遺伝的にモデファイされた生物の発展システム及び固有の識別子の委託システムである取締委員会（ＥＣ）Ｎｏ．65／2004参照）。
【０１６０】
例えば、宿主分類群における情報、形質転換構成成分、挿入された配列などのような、上記の及び更に対象とするトランスジェニック植物イベントに関する詳細な情報は、種々の取締公共事業機関の公のポータルサイト、例えば、OECD BioTrack Product Database (http://www2.oecd.org/biotech/default.aspx)、米国FDA (http://www.cfsan.fda.gov/)、ＧＭ食糧品の欧州登録委員会（the European Community Register of GM Food and Feed）(http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm)、Agbios データベース(www.agbios.com)、またはEC GMO Compassデータベース (http://www.gmo-compass.org/)、及び科学的文献などを通じてアクセスすることができる。当業者は、これらのデータべースソース源に精通しており、使うことができる。
【０１６１】
さらに、イベント特異的検出方法及び構築物特異的検出方法（例えば、Codex Alimentarium参照）は、上記及び更なるイベントを明確に区別することができて有効である。例えば、欧州委員会参照研究所（European Community Reference Laboratory：CRL） (http://gmo-crl.jrc.it/; http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm)は、作成者およびＣＲＬ自体によって提供される、科学的文献で説明され、又は展開されたイベント特異的検出のための有効な方法を挙げている。
【０１６２】
上記で示したように、本発明は、選択イベントに由来する材料、その交差物、またはその関連イベントが、試料中に存在するか又は不在であるかの結論づけを可能とする。
【０１６３】
本明細書における用語「その交差物」とは、結果として生じる子孫が、交差されている２以上の親のイベントからのトランスジェニック挿入物を含むように、２以上の匹敵するイベント（すなわち、交差されることができるイベント、特に同じ分類群に属する特定イベント）が１代以上続いておこる交差により得られる子孫をいう。
【０１６４】
本明細書における用語「その関連イベント」とは、それぞれ特定されたイベントの分類群構築物と同じ分類群、同じ形質転換構築物の中へ導入することによって生み出されたイベントをいうが、それにもかかわらず、特定されたイベントと区別される。例えば、前記イベントは、典型的には、形質転換構築物のゲノム組み込み数及び／又は部位が異なっていてもよい。このようなイベントは、しばしば、それら自身が公共事業機関に提出され得る。ほかの場合には、そのような関連イベントは、望まれない汚染として、存在し得る。そして、本発明の方法は、形質転換構築物内からの遺伝的要素を検出することにより、このようなイベントを検出できるようにする。
【０１６５】
上記で示したように、本発明の方法は、上記で定義されたa)−u)で挙げられた核酸を含む又はからなる、１以上の核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出することを含む。
【０１６６】
この点、a)「Zm」、b)「Bn」、c)「Gm」、o)「Or」、p)「Bv」、q)「Gs」、及びt) 「St」で挙げられた核酸として定義されるような、与えられた分類群に「由来及び特異的な核酸」という表現は、試料中の前記核酸が、与えられた分類群の遺伝物質、好ましくはゲノムＤＮＡを起源とし、且つ上記で挙げた残りの分類群等の他の分類群を起源とする遺伝物質中には存在しないこと（与えられた検出方法を用いて検出されることができないであろう）ことを意味する。例えば、特に限定しないが、与えられた分類群由来の前記核酸は、他の分類群におけるホモローグでなくてもよいし、他の分類群におけるホモローグであってもよい。また、それらが選択された検出方法により検出されないように、十分に別個の配列を有していてもよい。例えば、検出部位（例えば、与えられた核酸内で、１つのプローブまたは１以上の増幅プライマーがハイブリダイズするであろう部位）で、そのようなホモローグは、与えられた核酸との配列同一性が、１００％未満の配列同一性、好ましくは95%未満、より好ましくは90%未満、さらに好ましくは85%未満、さらにより好ましくは80%未満、及び最も好ましくは75%未満、より好ましい例示される態様においては、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、あるいは50%未満であってもよい。
【０１６７】
さらに、特にa)−u)で用いられる用語、核酸「由来の」は、前記核酸が、それらとは部分構造的に異なっていても、試料中で見いだされるように、前記核酸が、それぞれの分類群、遺伝的要素、遺伝子、オープンリーディングフレームなどを起源とすることを意味する。
【０１６８】
例えば、植物材料の川下段階での処理は、核酸(例えば、DNA)構造における、交代の原因となり得て、多分、最も著しく、その断片化を引き起こし得る。さらに、機能的断片又は全長要素のバリアントは、ときどき、トランスジェニック植物において用いられてもよい。従って、上記a)−u)で特定された核酸「に由来する」核酸は、その断片が起源の核酸に対して特異的に帰結できる限り、断片等であってもよい。例えば、断片が由来する配列の少なくとも連続１５ｂｐ以上、好ましくは、連続20bp以上、例えば、連続30ｂｐ以上または連続40bp以上、さらに好ましくは、連続50bp、例えば連続60以上または連続70bp以上、さらにより好ましくは連続80bp以上、例えば、連続90bp以上、またさらに好ましくは連続100bp以上、例えば連続150bp以上、またさらにより好ましくは連続200ｂp以上、例えば、連続300bp以上、連続400bp以上または連続500bp以上を含んでいることが好ましく、より好ましくは全長要素を含んでいる。
【０１６９】
植物物質の川下段階における処理から予期される他の核酸修飾、例えば、部分的脱アミノ反応なども、用語「に由来する」に意図される。
【０１７０】
好ましい態様において、核酸a) 「Zm」は、Zea maysの内因性アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子(adh-1) に由来する。例えば、Zea maysのadh-1 遺伝子配列は、特に限定しないが、GenBank データべース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のアクセッションナンバーAF123535.1で見いだされる。
【０１７１】
さらに好ましい態様においては、核酸 b)「Bn」は、Brassica napusの内因性アセチル-CoAカルボキシラーゼ遺伝子(acc)または内因性クルシフェリン（cruciferin）遺伝子に由来する。Brassica napusのacc 遺伝子は、例えば、特に限定しないが、GenBankデータベースのアクセッションナンバーX77576.1で見いだされ、Brassica napusのクルシフェリン（cruciferin）遺伝子は、例えば、特に限定しないが、GenBankデータベースのアクセッションナンバーX14555.1で見いだされる。
【０１７２】
さらに好ましい態様において、核酸 c) 「Gm」は、Glycine max.の内因性レクチン遺伝子(lec)に由来する。Glycine maxのlec 遺伝子としては、特に限定しないが、GenBankデータベースのアクセッションナンバーK00821.1で見いだされる。
【０１７３】
さらに好ましい態様において、核酸 o)「Or」は、Oryza sativa.の内因性ホスホリラーゼD 遺伝子 (pld)に由来する。Oryza sativaのpld 遺伝子の配列は、例えば、特に限定しないが、アクセッションナンバーAB001919で見いだされる。
【０１７４】
好ましい態様において、核酸 p)「Bv」は、Beta vulgarisの内因性グルタミンシンテターゼ遺伝子（GluA3）に由来する。Beta vulgarisの GluA3 遺伝子の配列は、例えば、特に限定しないが、GenBankデータベースのアクセッションナンバーAY026353.1で見いだされる。
【０１７５】
好ましい態様において、核酸 q)「Gs」は、Gossypiumの内因性sinopsis arabidopsis ホモローグ7遺伝子(sah-7) に由来する。Gossypium のsah-7遺伝子の配列は、例えば、特に限定しないが、GenBankデータベースにおけるアクセッションナンバーAY117067で見いだされる (著者：Senchina ら、2003年、Mol Biol Evol 20 (4): 633−643頁)。
【０１７６】
好ましい態様において、核酸 t)「St」は、Solanum tuberosumの内因性UDP-グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子 (UGPase)に由来する。Solanum tuberosum のUGPase遺伝子の配列は、例えば、特に限定しないが、GenBankデータベースのアクセッションナンバーU20345に見いだされる。
【０１７７】
さらに好ましい態様において、遺伝植物由来の核酸は、Zea maysの内因性葉緑素のRBCL遺伝子 (rbcl)に由来する。Zea maysのrbcl 遺伝子の配列は、例えば、特に限定しないが、GenBankデータベースのアクセッションナンバーZ11973.1で見いだされる。
【０１７８】
当業者は、本発明方法の検出工程で用いるために、上記で挙げられた配列からの特異的プローブまたはプライマー対をデザインすることができ、立証することができる。
【０１７９】
d)−n)、r)、s) 及びu)に挙げた核酸のために、本明細書で特定した配列要素及び遺伝子を参照することは、植物の遺伝的修飾分野で、当業者に知られている。そして、当業者は、これらの名称が何の配列を参照するかを理解し、また、トランスジェニック植物の発生に共通であるこれらの配列への交代レベルを認識するであろう。
【０１８０】
一態様において、トランスジェニックイベントに存在する核酸は、ここで限定される遺伝子の、特に上記f) - n), r), s) 及び u)で挙げた遺伝子の、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはその機能的部分（すなわち、トランスジェニック植物における所望の効果を達成する部分）を含んでもよい。
【０１８１】
にもかかわらず、さらに明らかにするために、特に限定しないが、我々は、ここで、以下に、d) - n), r), s) 及び u)で参照した特定の遺伝子及び要素のための配列例、並びに植物属に由来する典型的な核酸を列挙する。
配列要素／遺伝子 GenBank アクセッションナンバー
CMV p35Sプロモーター V00140 (CAMV ゲノム全体)
NOS ターミネータ V00087.1
Cry1Ab ORF AF465640
bar遺伝子ORF AY346130.1
pat遺伝子ORF DQ156557.1
EPSPS 遺伝子ORF AY125353.1
修飾されたCry3A遺伝子ORF AR836206.1
Glb1プロモーター CS155614.1
Cry3Bb1 遺伝子ORF CS410008.1
Bxn 遺伝子ORF E01313.1
Cry1Ac遺伝子ORF EF094884.1
Cry2Ab2遺伝子ORF DQ361266.1
Gbss遺伝子ORF X58453.1
Zea mays葉緑素のrbcL遺伝子 Z11973.1
【０１８２】
トランスジェニック植物イベントに実際に存在する核酸は、上記適例となる配列から、ある程度異なり得る配列を含むことができる。例えば、そのような相違としては、塩基の欠失、追加及び／又は置換、および切断（例えば、機能的断片の包含）、他の要素への融合（例えば、膜トランスポートとの融合または細胞小器官の局在化シグナル）などがある。
【０１８３】
トランスジェニックイベントで見いだされる上記及び他の要素の実際の配列は、多くの場合に決定されていて、GenBank及び他の配列データベースを通じてアクセス可能である。従って、プローブの起源にもっとも適した上記核酸、またはそこからのアンプリコン内の領域を同定するために、配列アライメントを行うことができるであろう。
【０１８４】
そして、プローブまたはアンプリコン（及び対応するプライマーセット）は、上記核酸の各々の位置に効果的に由来していることから、ほとんどのトランスジェニックイベントで見いだされる、及び／又は種々のトランスジェニックイベント間で最も高い配列の同一性を示すことができる。当業者は、必要な配列アラインメントを達成するために、この指示に従うことができる。
【０１８５】
課題を解決する手段の欄で示されたように、本発明も、上記方法の工程（２）で用いられる注目する、１以上のトランスジェニック植物イベントが存在する可能性又は不在であると結論づける効果的な手法を提供する。特に、工程（１）において、試料で得られた結論は、試料中に存在するとして検出された、上記a)−u)で挙げられた核酸を含むまたはからなる核酸から選ばれる、これらの核酸のコレクションを表しているセット G_SAMとして表示し、そして、評価しようとする個々のイベントを表している、注目する１以上のセットG_Xと、上記セット G_SAMとを比較する。注目するG_Xのセットは、すなわち、それぞれのイベントで見いだされる、上記a)−u)で挙げられた核酸を含むまたはからなる核酸から選ばれる核酸からなり（すなわち、これらの核酸のコレクションを表す）、そして、それぞれのイベント、またはそのようなイベントを含む交差物、又はその関連イベントに由来する材料を、試料が含むかどうかということについて、（前記工程（１）が前記核酸の存在を検出する範囲において）工程（１）で検出されるだろう。
【０１８６】
下記表３は、上記a)−u)で挙げられたものの核酸が、特に対象とするイベント中に存在することを列挙する。
表３：イベントの特徴
【表３−１】


【表３−２】

【０１８７】
すでに説明したように、
・もし、G_X がG_SAM と等しいならば(G_X= G_SAM)、トランスジェニック植物イベントＸ、又はその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性あり；
・もし、G_X が適当なサブセットG_SAM であるならば(G_X⊂G_SAM)、トランスジェニック植物イベントX、その交差物、またはその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性あり；
・もし、G_X が G_SAM と等しくなく、且つG_X がG_SAM,の適当なサブセットでないならば
【数１】


トランスジェニック植物イベントX、その交差物、又はその関連イベントに由来する材料は、試料中に存在しない。
【０１８８】
さらに好ましい態様においては、もしG_XがG_SAM,と等しく、且つ（具体的には、G_Bt176, G_Bt11, G_Bt10, G_MON810, G_MON863, G_TC1507, G_NK603, G_T25, G_GA21, G_DAS-59122, G_MIR604, G_LY038, G_MON88017, G_{Topas 19/2}, G_MS1, G_RF1, G_RF2, G_MS1/RF1, G_MS1/RF2, G_MS8, G_RF3, G_MS8/RF3, G_GT73, G_T45, G_{Liberator pHoe6/Ac}, G_{GS40/90pHoe6/Ac}, G_OXY235, G_MON40-3-2, G_MON89788, G_A2704-12, G_A5547-127, GLL62, G_LL06, G_LL601, G_T120-7, G_H7-1, G_A5-15, G_{LL cotton 25}, G_MON1445, G_MON531, G_MON15985 及びG_EH92-527-1を含む群またはからなる群から選ばれるイベントを表示するセット）G_X以外には等しいイベントセットは１つもない、または２つ以上のセットの合計でもないならば、トランスジェニック植物イベントX又はその交差物、またはその関連イベントの由来物質は、試料中に存在する。
【０１８９】
この方式の評価のさらなる発展においては、上記a)−u)で挙げられた核酸を含む、またはからなる核酸に、それぞれ固有値を割り当てる。そして、セット G_SAM は、試料中に存在するとして工程(1)で検出しようとするこれらの核酸に割り当てられた、多数の固有の値となる値「VG_SAM」を割り当てる；そして、注目するG_Xのセットには、上記a) - u)で挙げられた核酸を含む又はからなる核酸から選ばれる核酸に割り当てられた多くの固有値となる「VG_X」を割り当てて、工程 (1)で検出されるであろう。
【０１９０】
従って、好ましい例においては、核酸「Zm」、「Bn」、「Gm」、「p35S」、「tNOS」、「Cry1Ab」、「PAT/bar」、「PAT/pat」、「CP4-EPSPS」、「mCry3A」、「cordap A」、「Glb1」、「Cry3Bb1」、「Bxn」、「Or」、「Bv」、「Gs」、「Cry1Ac」、「Cry2ab2」、「St」及び「Gbss」について、それぞれ値「V_Zm」、「V_Bn」、「V_Gm」、「V_p35S」、「V_tNOS」、「V_Cry1Ab」、「V_PAT/bar」、「V_PAT/pat」、「V_CP4-EPSPS」、「V_mCry3A」、「V_{cordap A}」、「V_Glb1」、「V_Cry3Bb1」、「V_Bxn」、「V_Or」、「V_Bv」、「V_Gs」、「V_Cry1Ac」、「V_Cry2ab2」、「V_St」及び「V_Gbss」を割り当てる。そして、注目するG_Xの各セットについては、以下の値を含む又はからなる群から選ばれる、それぞれの値「VG_X」を割り当てる：「VG_Bt176」、「VG_Bt11」、「VG_Bt10」、「VG_MON810」、「VG_MON863」、「VG_TC1507」、「VG_NK603」、「V"G_T25」、「VG_GA21」、「VG_DAS-59122」、「VG_MIR604」、「VG_LY038」、「VG_MON88017」、「VG_{Topas 19/2}」、「VG_MS1」、「VG_RF1」、「VG_RF2」、「VG_MS1/RF1」、「VG_MS1/RF2」、「VG_MS8」、「VG_RF3」、「VG_MS8/RF3」、「VG_GT73」、「VG_T45」、「VG_{Liberator pHoe6/Ac}」、「VG_{GS40/90pHoe6/Ac}」、「VG_OXY235」、「VG_MON40-3-2」、「VG_MON89788」、「VG_A2704-12」、「VG_A5547-127」、「VG_LL62」、「VG_LL06」、「VG_LL601」、「VG_T120-7」、「VG_H7-1」、「VG_A5-15」、「VG_{LL cotton 25}」、「VG_MON1445」、「VG_MON531」、「VG_MON15985」又は「VG_EH92-527-1」。
ここで、
- VG_Bt176 = V_Zm × V_p35S × V_Cry1Ab × V_PAT/bar,
- VG_Bt11 =V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ab × V_PAT/pat,
- VG_Bt10 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ab × V_PAT/pat,
- VG_MON810 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ab,
- VG_MON863 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS,
- VG_TC1507 = V_Zm × V_p35S × V_PAT/pat,
- VG_NK603 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSPS,
- VG_T25 = V_Zm × V_p35S × V_PAT/pat,
- VG_GA21 = V_Zm × V_tNOS,
- VG_DAS-59122 = V_Zm × V_p35S × V_PAT/bar,
- VG_MIR604 = V_Zm × V_tNOS × V_mCry3A,
- VG_LY038 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_cordapA × V_Glb1,
- VG_MON88017 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSPS × V_Cry3Bb1,
- VG_{Topas 19/2} = V_Bn × V_p35S × V_PAT/pat,
- VG_MS1 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_RF1 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_RF2 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_MS8 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_RF3 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_MS1/RF1 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_MS1/RF2 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_MS8/RF3 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_GT73 = V_Bn × V_CP4-EPSPS,
- VG_T45 = V_Bn × V_p35S × V_PAT/pat,
- VG_{Liberator pHoe6/Ac} = V_Bn × V_p35S × V_PAT/pat,
- VG_{GS40/90pHoe6/Ac} = V_Bn × V_p35S × V_PAT/pat,
- VG_OXY235 = V_Bn × V_p35S × V_Bxn,
- VG_MON40-3-2 = V_Gm × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSPS,
- VG_MON89788 = V_Gm × V_CP4-EPSPS,
- VG_A2704-12 = V_Gm × V_p35S × V_PAT/pat,
- VG_A5547-127 = V_Gm × V_p35S × V_PAT/pat,
- VG_LL62 = V_Or × V_p35S × V_PAT/bar,
- VG_LL06 = V_Or × V_p35S × V_PAT/bar,
- VG_LL601 = V_Or × V_p35S × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_T120-7 = V_Bv × V_p35S × V_PAT/pat,
- VG_H7-1 = V_Bv × V_p35S × V_CP4-EPSPS,
- VG_A5-15 = V_Bv × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSPS,
- VG_{LL cotton 25} = V_Gs × V_p35S × V_tNOS × V_PAT/bar,
- VG_MON1445 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSPS,
- VG_MON531 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ac,
- VG_MON15985 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ac × V_Cry1Ac,
- 又はVG_EH92-527-1 = V_St × V_tNOS × V_Gbss
である。
【０１９１】
この方法は、必ずしもa)−u)のすべての核酸の存在をテストしなくても、上記値は、効果的にテストされる、これらの核酸の存在によって、定義されるであろうことに気付く。特に限定しないが、例えば、d)−i)で定義された核酸に加えて、特異的な特性に対応する、上記で定義されたj)−n), r) s) 及u)で挙げられた核酸の存在がテストされない場合、いくつかのイベントに対応する値は、より狭い方式で定義されてもよい。具体的には、トウモロコシのイベント値VG_MIR604 = V_Zm × V_tNOS, VG_LY038 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS, VG_MON88017 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSP；アブラナのイベント値VG_OXY235 = V_Bn × V_p35S；コットンのイベント値VG_MON531 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS, VG_MON15985 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS；及びポテトのイベント値VG_EH92-527-1 = V_St × V_tNOSなどが挙げられる。
【０１９２】
結果的に、この態様のステップ(iii)は、注目するG_Xの各セットについて論理演算を行うことを含むであろう：
・もし、 VG_SAM / VG_X が1に等しいならば、トランスジェニック植物イベントX またはその交差物、またはその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性あり；
・もし、VG_SAM / VG_X が、値V_Zm，V_Bn，V_Gm ，V_p35S，V_tNOS，V_Cry1Ab，V_PAT/bar，V_PAT/pat，V_CP4-EPSPS，V_mCry3A ，V_{cordap A}， V_Glb1， V_Cry3Bb1 ，V_Bxn ，V_Or， V_Bv，V_Gs， V_Cry1Ac ，V_Cry2ab2 ，V_St 及び V_Gbssを含む群又はからなる群から選ばれる１つの値、または２つ以上の値の複合と等しいならば、トランスジェニック植物イベントX又はその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性がある；
・もし、VG_SAM / VG_X が 1と等しくないならば、且つ値V_Zm，V_Bn，V_Gm ，V_p35S，V_tNOS，V_Cry1Ab， V_PAT/bar，V_PAT/pat，V_CP4-EPSPS，V_mCry3A ，V_{cordap A}， V_Glb1， V_Cry3Bb1 ，V_Bxn ，V_Or， V_Bv，V_Gs， V_Cry1Ac ，V_Cry2ab2 ，V_St 及び V_Gbssを含む、又はからなる群から選ばれる１つの値、または２つ以上の値の複合とも等しくないならば、トランスジェニック植物 イベントX、その交差物、又はその関連イベントに由来する材料は試料中に存在しない。
【０１９３】
さらに上記態様の好ましい変形においては、もし、VG_SAM / VG_X が 1と等しく、且つ（具体的には、VG_Bt176 ，VG_Bt11 ，VG_Bt10 ，VG_MON810 ，VG_MON863 ，VG_TC1507 ，VG_NK603 ，VG_T25 ，VG_GA21 ， VG_DAS-59122 ，VG_MIR604 ，VG_LY038 ，VG_MON88017 ，VG_{Topas 19/2} ，VG_MS1， VG_RF1 ，VG_RF2 ，VG_MS1/RF1 ， VG_MS1/RF2 ，VG_MS8 ，VG_RF3 ，VG_MS8/RF3 ，VG_GT73 ，VG_T45 ，VG_{Liberator pHoe6/Ac} ，VG_{GS40/90pHoe6/Ac} ，VG_OXY235 ，VG_MON40-3-2 ，VG_MON89788 ，VG_A2704-12 ，VG_A5547-127 ，VG_LL62 ，VG_LL06 ，VG_LL601，VG_T120-7 ，VG_H7-1 ，VG_A5-15 ，VG_{LL cotton 25} ，VG_MON1445 ，VG_MON531 ，VG_MON15985 及びG_EH92-527-1を含む、またはからなる群から選ばれる値で）VG_X 以外には等しいイベントを表示する１つの値、または２つ以上が複合したセットもないならば、トランスジェニック植物イベントX又はその交差物、又はその関連イベント由来物質が、試料中に存在する。
【０１９４】
さらに好ましい態様においては、a)−u)で挙げられた核酸を含む、又はからなる核酸に割り当てられた固有の値、すなわち、V_Zm ，V_Bn ，V_Gm ，V_p35S ，V_tNOS ，V_Cry1Ab ，V_PAT/bar， V_PAT/pat ，V_CP4-EPSPS ，V_mCry3A ，V_{cordap A} ，V_Glb1 ，V_Cry3Bb1 ，V_Bxn， V_Or ，V_Bv ，V_Gs ，V_Cry1Ac ， V_Cry2ab2 ，V_St 及びV_Gbssを含む又はからなる群から選ばれる値は、独自の主要な数値で、ステップ(iii)は、注目するG_X の各セットについての下記論理演算の実行を含んでいる：
・もし、VG_SAM / VG_X が1に等しいならば、トランスジェニック植物イベントXまたはその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性がある；
・もし、VG_SAM / VG_X が1より大きい整数ならば、トランスジェニック植物イベントX 又はその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性がある；
・もし、VG_SAM / VG_X が整数でないならば、トランスジェニック植物イベントX 、その交差物又はその関連イベントに由来する材料は、試料中に存在しない。
【０１９５】
本発明者らは、前述の段落で説明したように、個々に分析された特性（核酸）を主要数字を用いて表すことにより、とてもわかりやすく効果的なストリームラインとし、データの分析を容易にする。
【０１９６】
この点において、本明細書で説明した主要数を用いたデータ分析法、例えば、分子生物学または分子薬学等の分野のような他の用途に適用することも、本発明者らは意図する。そして、ある１つの用途においては、その方法は、一般に、試料の組成を決めるために用いられることができ、前記試料は、２つ以上の異なるイベント (この段落で用いられる「イベント」の用語は、一般的な意味で用いており、トランスジェニック植物イベントに限定しない)またはその物質を含んでもよく、各イベントは、１つ以上の特徴または特性（この段落で用いられる用語「特徴および特性」は、一般的な意味を有するとはいえ、好ましくは核酸を含むが、これに限定しない）により特徴づけられる。そして、各イベントと同様に試料は、テストされる特徴又は特性の各々に割り当てられる固有の主要値の生産物として表示することができ（すなわち、演算「×」）、前記試料中に前記イベントまたはその物質が存在する可能性又は不在であるかについて、おのおの別個のイベントに割り当てられ、計算される値で、その試料のために得られた値を除する（すなわち、演算「／」）ことによって、上記で説明したような除算結果に必要な変更を加えることを考慮しつつ、テストしてもよい。
【０１９７】
好ましい態様において、方法の工程（２）の上記計算ステップは、例えば、計算機やコンピュータなどのコンピュータ装置を用いて行われることができる。本発明のさらなる見地では、上記計算を実行するコンピュータ装置、コンピュータ装置が本発明の方法の工程（２）を実行するように、上記計算等のプログラム可能な指示を含むデータキャリア（例えば、ディスケットやCD-ROMなど）を実行するコンピュータ装置や、そのようなデータキャリアとともに本発明の方法で有用な１以上の試薬も一緒に含むキットも意図する。また、本発明は、工程（２）のアルゴリズムの実行を可能とするウェブをベースとするアプリケーションも意図し、所望により、試料中に存在する可能性があるイベントについての情報は、埋設されたハイパーリンクによって結びつけられたデータベースに直接アクセスできる。
【０１９８】
上記説明で用いられたれた識別子（identifier）「G_SAM」、「G_X」、「VG_SAM」、「VG_X」などは、土台をなすコンセプト、中でもセットと値それぞれを表示するように、ここで任意に選択されてもよく、また他の識別子（例えば、他の文字、用語または表現）に置換して、前記セット及び値を表してもよい。
【０１９９】
上述のように、本発明の方法は、注目する核酸の存在又は不在を、特に上記a) - u)で挙げられた核酸を含む群又はからなる群から選ばれる核酸の存在または不在を、増幅、特にこれらからのアンプリコンのＰＣＲ増幅を用いて、評価することが好ましい。
【０２００】
当業者は、一般に、既知の核酸配列からの特異的増幅のための独自のプライマーセットをデザインできることがわかる。
【０２０１】
それにもかかわらず、すでに述べたように、現在の方法論に用いられるとき、本発明者らにより注意深くデザインされて、多くの利益を提供できた、特に効果的なプライマー対を、表１は、列挙している。表１は、本発明者らの基礎的な選択を残しているけれども、表４は、さらに、表１のプライマーを列挙していて、本発明の方法でとても満足できるように実行できる追加的プライマー及びプライマー対をさらに含んでいる。これらのプライマーセットは、関連植物イベントに存在するような核酸、及び種々に処理された植物材料からの核酸からの増幅を有効に達成することができ、また、本明細書の他のところで説明されたような種々の効果を伴う。
【０２０２】
表４：プライマー配列
【表４−１】


【表４−２】

【０２０３】
表４は、異なるプライマーセットによる、ある核酸上での増幅に関する１超の列（例えば、「Cry1Ab」及び「CP4-EPSPS」のためのいくつかの列など）を含む場合、表４の前記異なる列のいずれの１以上のプライマーセットでも、増幅のために用いられることができる。表４は、単一の列において、ある核酸(例えば「Bn」(ACC)、「Gm」(レクチン)または「CP4-EPSPS」のような）の増幅のための、１超のforward及び／又はreverseプライマーを列挙しており、前記forwardプライマーのいずれか１つ又はいずれかの組み合わせを、前記reverseプライマーのいずれか１つ又はいずれかの組み合わせとともに用いて、増幅することができる。
【０２０４】
さらに、本発明は、そのようなプライマー／プライマー対が、なおも、それぞれのアンプリコンの適切な増幅を達成できる限りは、表４に列挙したプライマーに対して、例えば、１以上の欠失、挿入及び／又は置換等の、１以上の配列バリエーションを含むバリアントのプライマーも提供する。好ましくは、そのようなバリアントプライマーは、表４に列挙されたプライマーに対して、85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、またさらに好ましくは 96%以上、97%以上、98%以上または 99%以上の配列同一性を示すだろう。配列アラインメント及び配列同一性の決定は、例えば、最初にAltschulらによって1990年に説明されたBasic Local Alignment Search Tool (BLAST) (J Mol Biol 215：403−10)や、Tatusova とMaddenによって1999年に説明されたアルゴリズムである「Blast 2 sequences」（FEMS Microbiol Lett 174：247-250）などを用いて、行うことができる。
【０２０５】
さらに、本発明は、表１または表４のいずれかに列挙されたプライマー対を用いて、それぞれの核酸から増幅される核酸内からのアンプリコンの増幅に適した、第２の（nested）プライマー及びプライマー対も意図する。
【０２０６】
本発明は、表１または表４のいずれかに列挙されたプライマー及びプライマー対の、本明細書のどこか他のところで説明されたような、誘導体も意図する。
【０２０７】
さらに、本発明は、表１または表４のいずれかに列挙されたプライマー及びプライマー対だけでなく、そのバリアントおよび誘導体も提供し、所望により、前記プライマー及び／又はプライマー対又はそのバリアントまたは誘導体の適当ないずれかの組み合わせにおいても列挙されるプライマー及び／又はプライマー対を提供する。
【０２０８】
さらなる見地において、本発明は、前記プライマー及びプライマー対を用いて、特に表１または表４のいずれかに示されたプライマー対又はそのバリアントまたは誘導物を用いて、それぞれの核酸から得られ得る増幅産物を提供する。前記増幅産物は、更なる処理をされてもよい。更なる処理としては、例えば、単離、好適なベクターまたはプラスミドにおけるクローン化、組み換え宿主（例えば、E. coli）のような好適な宿主菌へのトランスフォーム、宿主に伴う増殖及びそこからの単離、配列解析などが挙げられる。
【０２０９】
効果的には、好ましくはクローン化され、再度単離化され、そして好適なプラスミドまたはベクターにおいて多分含まれる前記増幅産物は、ポジティブコントロールとして用いられて、試料中のそれぞれの核酸の検出を目的とする本発明の方法の検出ステップの作用を検証することができる。あるいは、さらに、そのような（クローン化された又は単離された）増幅産物は、試料中の特定の鋳型の量を、例えばリアルタイムＰＣＲで決定するキャリブレータとして用いられてもよい。
【０２１０】
したがって、更なる見地においては、本発明は、ブタベスト条約のもとでベルギーの微生物共同コレクション（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms：BCCM）に、２００７年１月１０日に寄託された組み換えE. coli（LMBPアクセッションバンバーLMBP 5452, LMBP 5453, LMBP 5454, LMBP 5455, LMBP 5456, LMBP 5457, LMBP 5458, LMBP 5459及びLMBP 5460）、2007年３月６日に寄託された（LMBPアクセッションナンバーLMBP 5451）、2007年４月１９日に寄託された（LMBP アクセッションナンバーLMBP 5587, LMBP 5588, LMBP 5589 及びLMBP 5590）を提供する。
【０２１１】
前記組み換え E. coli は、表５に列挙されたプライマーセットを用いて鋳型イベントで得られた、pUC18 クローニングベクター MCSのEcoRI 部位でクローン化された増幅産物を含む。
【０２１２】
【表５】

【０２１３】
表５に挙げられたような寄託されたプラスミド及びE. coli に加えて、本発明は、さらに、例えば増幅されたインサートを含む、pUC18などの、適例なプラスミドも提供する。前記増幅されるインサートとしては、例えば、以下を用いたものが挙げられる。
・Brassica acc遺伝子のためのプライマー対SEQ ID NO: 3 及び4（OSR wt上で増幅される適例なインサート配列を図１のSEQ ID NO: 44に示す)；
・CP4-EPSPプライマー対SEQ ID NO: 18及び19、及びSEQ ID NO: 50及び19(図１にSEQ ID NO: 45及び46で示される、それぞれの適例なインサート配列を得るために、イベント 40-3-2及びイベント NK603それぞれについて増幅される適例なインサート）(プライマー SEQ ID NO: 17も、プライマーSEQ ID NO: 19と組み合わせて用いてもよい；しかしながら、プライマーSEQ ID NO: 17は、SEQ ID NO: 50と比べて、ヌクレオチド20でミスマッチ配列を含むので、後者（プライマーSEQ ID NO：５０）の方がより好ましい)
・トウモロコシadh-1遺伝子のためのプライマー対SEQ ID NO: 1及び2 (野生型トウモロコシについて増幅される、図１の適例なインサート配列SEQ ID NO: 32)；
・大豆レクチン遺伝子のためのプライマー対SEQ ID NO: 5及び49（野生型大豆について増幅した適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 33)；
・Zea mays adh-1 遺伝子内のより短いアンプリコン のためのプライマー対SEQ ID NO: 56及び57 (適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 70)；
・Glycin maxレクチンアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO:58及び59 (SLTM) (適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 71)；
・p35S要素内でのより短いアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 60及び61 (適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 72)；
・Beta vulgaris GluA3 遺伝子内のアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 64及び65 (適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 76)；
・Gossypium sah-7遺伝子内のアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 66及び67(適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 77)；
・ポテトUGPase遺伝子内のアンプリコン のためのプライマー対SEQ ID NO: 68及び69 (適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 78)；
・Cry1Ab 特性内での アンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 11及び12 (MON 810物質について増幅された適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 73)；
・CP4-EPSPS特性内でのアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 22及び62 (RRS)または22及び63 (GT 73) （GT73について増幅された適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 74、及びRRS について増幅された適例なインサート配列 図１のSEQ ID NO: 75)。
【０２１４】
対応するアンプリコンのサイズがより短いときには、プライマー対SEQ ID NO：22及び23、又はプライマーSEQ ID NO：62及び63のいずれか１つ若しくは双方とSEQ ID NO：22との組み合わせを用いて、未処理の植物材料（例えば、植物組織又は種子）及び処理された植物材料（例えば、食品又は飼料）の双方から、CP4-EPSPSを増幅することが好ましいといえる。一方、プライマー対SEQ ID NO：１８と１9またはプライマー対SEQ ID NO：５０と１９は、より長いアンプリコンを画定するので、未処理の材料用に好ましく用いることができる。よって、プライマー対として、SEQ ID NO：22と23の組み合わせ、又はSEQ ID NO: 22とプライマーSEQ ID NO: 62若しくは63のいずれか１つ又は双方との組み合わせが、本発明の方法及びキットにおいてより好ましい。
【０２１５】
本発明は、さらに、表５で挙げられた組み換え大腸菌から得ることができる、単離された組み換えプラスミドと、単離されたインサート、好ましくは、その大腸菌インサートを提供する。本発明は、そのように単離されたプラスミドで形質転換された組み換え微生物も、更に提供する。
【０２１６】
また、当業者は、本発明がその前記プラスミドまたはインサートの組み合わせで、試料において検出しようとする核酸の代表となるような組み合わせも提供し得ることの価値を認めることができる。
【０２１７】
さらに、本発明は、表５において見いだされ、表５のバクテリアから得ることができる、組み換えプラスミド又はインサートの使用、あるいは本発明の方法において、ポジティブコントロール及び／又はキャリブレータとして使用するための上記で説明された他のものも提供する。例えば、本発明の方法及びキットにおいては、１つ以上のイベントの核酸が、さらなる定量化を判断する量だけ存在するかどうか、あるいは受け入れられる閾値未満で存在するのかどうかを決定することを容易にするのに適当な量だけ、上記プラスミド又はインサートが含まれていればよい。
【０２１８】
本発明のさらなる発展において、特に表１または表４に挙げられたプライマーまたはバリアントまたはその誘導物などの、本発明のいずれかのプライマーを、ゲノム歩行戦略に用いて、 イベントのゲノムＤＮＡにおける前記プライマーに隣接する配列を同定し得ることも意図する。同様に、本発明のいずれかのアンプリコンの配列に基づいてデザインされたいずれかのプライマー、特にSEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 78のアンプリコン配列のいずれかの中に位置する、またはオーバーラップするいずれかのプライマーを、ゲノム歩行戦略に用いて、あるイベントのゲノムＤＮＡ内の前記アンプリコンに隣接する配列を同定してもよい。
【０２１９】
本発明の増幅方法は、特定のイベントに表立って起因できない特徴（例えば、長さ、Ｔｍまたは配列）を有するアンプリコンを製造する場合に、この見地は特に有用であろう。そのような状況において、問題のアンプリコンの外側でのゲノム歩行は、イベントについての追加の配列情報を提供し、これにより、前記イベントを同定するのに役立つ。特に好ましい態様においては、特定のプライマーがｐ３５またはtNOS アンプリコンから導き出されてもよい。
【０２２０】
一般に、ゲノム歩行戦略は、当該分野でよく知られている。例えば、中でも、逆PCRまたはRileyらが1990年に発表したvectorette法（核酸リサーチ18: 2887-90)で Universal Vectorette^TM System (シグマ社)として市販されている方法、さらにvectorette法を単純化したもの(例えば、Kilstrup & Kristiansen 2000年、核酸リサーチ28: e55参照)などが挙げられる。
【０２２１】
特定の態様において、本発明者らは、２ステップ型ゲノム歩行法を意図している。第１段階目の増幅工程は、本発明のLUX^TM (または別の手段）で標識付けしたプライマーを、ランダムプライマー(一般に、約 8〜15 bp長)混合物と一緒に用いて、好ましくは、ストリンジェンシーが増加していく勾配ＰＣＲ（gradient PCR）の条件を用いる。プライマーの標識は、標識したプライマーを含む増幅が起こっているかどうかに従うことを許容する。第２段階目の増幅工程においては、nested PCRが、アンプリコンからの他の第２の（nested）primerを用いて、好ましくは、LUX^TM 又は他の方法で標識した、前記ランダムプライマーを用いて、且つハイストリンジェントなPCR条件で、行われる。プライマーの標識は、標識付けされたプライマーを含む増幅が起こっているかどうかに従うことを許容する。結局、そのようにして得られた産物を配列解析し、これにより、アンプリコンに隣接する配列を同定する。
【０２２２】
さらなる見地において、本発明は、本発明の方法を実行するための部分のキットを提供する。すなわち、１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性があるか、又は不在であるかを調べるための部分のキットを提供する。
【０２２３】
本発明のキットの一態様では、上記a)−u) で挙げられた１以上の、またはすべての核酸の検出に適したプローブを含むことができる。
【０２２４】
本発明のキットの一態様では、上記で定義されたa)−u) で挙げられた１以上の、またはすべての核酸内からのアンプリコンの増幅に適したプライマー、好ましくはプライマー対を含むことができる。
【０２２５】
本発明のキットの他の態様においては、上記a)−i)で挙げた１種、１種超及び好ましくはすべての核酸の増幅に適したプライマー、好ましくはプライマー対を含んでもよい。
【０２２６】
本発明のキットの他の態様においては、上記a)−i), o), p), q) 及び t)で挙げた１種、１種超、好ましくはすべての核酸の増幅に適したプライマー、好ましくはプライマー対を含んでもよい。
【０２２７】
本発明のキットの他の態様においては、上記a)−c) で挙げた１種、１種超及び好ましくはすべての核酸、上記d)−i)で挙げた１種、１種超、および好ましくは全ての核酸の増幅に適したプライマー、好ましくはプライマー対を含んでもよい。
【０２２８】
キットの他の態様においては、上記a) - c), o), p), q), t)で挙げた１種、１種超、又はすべての核酸、及び上記d) - i)に挙げた、１種、１種超又は好ましくはすべての核酸の増幅に適したプライマー、好ましくはプライマー対を含んでもよい。
【０２２９】
さらに、本発明のキットは、本明細書で説明したように、植物属固有の配列の増幅のためのプライマーまたはプライマー対を含んでもよい。
ここで教示された種々の核酸の増幅のためのプライマー及びプライマー対は、ある者が検出したいとするトランスジェニックイベントに関する採択に従って、種々にデザインされたキットに含まれていてもよい。
【０２３０】
好ましい態様において、先の段落で論じたように、増幅しようとする核酸の種々の選択を考慮して、本発明のキットは、表１または表４のいずれかで定義されたような、１種以上又はすべてのプライマー、好ましくは１種超又はすべてのプライマー対、またはそのバリアントまたはその誘導物を含んでもよい。
【０２３１】
特に好ましい態様においては、本発明のキットに含まれる、いずれかのプライマー対の一方又は双方のプライマーが標識付けされてもよい。
【０２３２】
他の特に好ましい態様においては、キットに含まれるプライマー対は、少なくとも１つ、通常１つが、上記で定義されたLUX^TM 検出システムを用いるリアルタイム検出に好適なフルオロフォアで標識され、デザインされたプライマーを含んでもよい。
【０２３３】
さらなる態様において、本発明のキットは、また、例えば、クローン化され、再び単離され、そして前述のように、本発明の方法でポジティブコントロール及び／又はキャリブレータとして用いられることができる好適なプラスミド又はベクターの中へ含まれることが可能である、増幅産物を含んでもよい。正確に測定された量または希釈された増幅産物、（例えば、クローン化され、再度単離されて、多分好適なプラスミドまたはベクターに挿入される増幅産物）が、そのような目的のために提供されてもよい。前述のように、そのような試薬の種々の組み合わせが意図されてもよい。
【０２３４】
特定の態様において、キットは、表５で挙げた大腸菌体の１種、１種超若しくはすべて、及び／又はこれらから得ることができるプラスミド、及び／又はインサート物、好ましくは前記プラスミドのEcoRIインサートまたはその組み換え体を含んでもよい。
【０２３５】
更なる態様において、すでに説明したように、前記キットは、コンピュータ装置が、本発明の方法の工程（２）の操作を実行するようにプログラム可能な指示を含むデータキャリアを含んでもよい。
【０２３６】
そのようなキットは、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、検出などに有用な要素等の要素を、更に含んでもよいことがわかる。当業者は、そのような要素の可能な使用を認めるだろう。
【０２３７】
好ましい態様においては、本発明のキットは、１以上の反応用隔室を含んでもよい。例えば、マルチウェルストリップまたはプレート（マルチウェルフォーマット）内に提供される反応用隔室を含む。ここで、各反応用隔室は、PCR増幅反応に必要なすべての成分（例えば、ヌクレオチド、塩、熱安定性ポリメラーゼなど)の組成物を含み、そして、上記で定義されたような、所望の１以上（複合された）プライマー対を含むが、鋳型ＤＮＡは含まない。従って、ユーザーが、一旦、分析しようとする試料ＤＮＡを、前記組成物に導きいれると、PCR反応を開始できるであろう。場合により、安定性を確保するために、Taqまたは他の熱安定性ポリメラーゼは、組成物から除外されてもよく（しかし、キットの中には、別々に含まれ得る）、ユーザーによって追加されることを必要としてもよい。一般に、その組成物は液体であることから、特に、運搬及び保管の目的のために、凍結されていてもよい。しかしながら、凍結乾燥された組成物も、本発明に、意図される。
【実施例】
【０２３８】
実施例１：表１及び４に挙げた選択プライマー対のための増幅条件
サイバーグリーンを用いた検出リアルタイムPCRを、表１及び４に挙げられたそれぞれのプライマー対を用いて、核酸「p35S」、「tNOS」、「Cry1Ab」、「PAT/Bar」、「PAT/pat」及び「CP4-EPSPS」からのアンプリコンの増幅のために最適化した。
【０２３９】
イベントBt11、Bt176、MON810、MON40-3-2、TC1507、NK603、MS8/RF3（表5参照）の核酸を含むイベント (ポジティブコントロール)またはこれらの核酸を欠いたイベント(ネガティブコントロール）で、葉組織材料からのCTAB 単離を用いて、ＤＮＡを単離した。
【０２４０】
PCR反応は、総体積 20μl中に、サイバーグリーンPCRマスター Mix (Diagenode, ref: GMO-GS2X-A300) 1×、Forwardプライマー 250 nM、Reverseプライマー 250 nM、鋳型DNA 50 ng を含む。PCR サイクルは、ステップ1：1× [50℃、120 sec]；ステップ2：1× [95℃ 、600 sec]；及びステップ 3：40×[95℃ ，15sec、60℃，60sec]で、蛍光取得を伴う。アプライド バイオシステムズ プリズム（Applied Biosystems Prism）7700 が、用いられた。融解曲線分析は、50℃ から95℃まで、1200 sec.以上での勾配で行われた。
【０２４１】
すべてのプライマー対について、１つの特異的なＴｍを示し、またアガロース電気泳動上で単一のバンドにより示されるように、特異的な増幅産物を得る。これらのアッセイは、LODが低い：
RBCL：プライマーSEQ ID NO: 26 及びSEQ ID NO: 27；Tm = 76．5℃；サイズ = 95 bp; LOD = ± 0.039 ng標的DNA
トウモロコシADH (長い方のアンプリコン)：プライマーSEQ ID NO: 1 及びSEQ ID NO: 2；Tm = 79．5℃；サイズ= 138bp；LOD = ± 0.016 ng 標的DNA (± 6 ハプロイド ゲノム)
トウモロコシADH (短い方のアンプリコン)：プライマーSEQ ID NO: 56及びSEQ ID NO: 57；Tm = 75．5℃；サイズ= 83 bp；LOD = ± 0.016 ng標的DNA (± 6 ハプロイド ゲノム)
アブラナACC；プライマーSEQ ID NO: 79 及びSEQ ID NO: 3；Tm = 79℃；サイズ= 103 bp；LOD = ± 0.05 ng標的DNA (± 20 ハプロイド ゲノム)
アブラナクルシフェリン：プライマーSEQ ID NO: 24及びSEQ ID NO: 25；Tm = 80℃；サイズ= 85 bp；LOD = ± 0.015 ng 標的DNA (± 12 ハプロイド ゲノム)
大豆レクチン(長い方のアンプリコン)：プライマーSEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 49；Tm = 81．5℃；サイズ= 178 bp；LOD = ± 0.016 ng標的DNA (± 13 ハプロイド ゲノム)
大豆（レクチン）：プライマーSEQ ID NO: 58及びSEQ ID NO: 59 (SLTM)；Tm = 79．5℃；サイズ= 81 bp；LOD = ± 0.063 ng標的DNA (± 50 ハプロイド ゲノム)
ライスPLD：プライマーSEQ ID NO: 20及びSEQ ID NO: 21；Tm = 76．5℃；サイズ= 80 bp；LOD = ± 0.01 ng 標的DNA (± 20 ハプロイド ゲノム)
テンサイGluA3：プライマーSEQ ID NO: 64及びSEQ ID NO: 65；Tm = 77℃；サイズ= 118 bp；LOD = ± 0.01 ng 標的DNA (± 13 ハプロイド ゲノム)
コットンSAH7：プライマー SEQ ID NO: 66及びSEQ ID NO: 67；Tm = 75．5℃；サイズ= 115 bp；LOD = ± 0.02 ng 標的DNA (± 9 ハプロイド ゲノム)
ポテトUGPase：プライマーSEQ ID NO: 68及びSEQ ID NO: 69；Tm = 81℃；サイズ= 87 bp；LOD = ± 0.0002 ng標的DNA
p35S (長い方のアンプリコン)：プライマーSEQ ID NO: 7及びSEQ ID NO: 8；Tm = 80．5℃；サイズ= 147 bp；LOD = ± 0.016 ng 標的DNA (± 6 ハプロイド ゲノム)
p35S (短い方のアンプリコン)：プライマーSEQ ID NO: 60及びSEQ ID NO: 61；Tm = 76℃；サイズ = 75 bp；LOD：RRS 100% ± 0.032 ng 標的DNA (± 25 ハプロイド ゲノム)；NK603 5% ± 6,25 ng 標的DNA (± 62．5 ハプロイド ゲノム)
tNOS-L：プライマーSEQ ID NO: 28及びSEQ ID NO: 29；Tm = 72℃；サイズ= 172 bp；LOD = ± 0.03 ng標的DNA (± 25 ハプロイド ゲノム)
tNOS-D：プライマーSEQ ID NO: 9及びSEQ ID NO: 10；Tm = 72℃；サイズ= 69 bp；LOD = ± 0.03 ng標的DNA (± 25 ハプロイド ゲノム)
Cry1Ab：プライマーSEQ ID NO: 11及びSEQ ID NO: 12；Tm = 78．5℃；サイズ= 73 bp；LOD = ± 0.06 ng (±12 ハプロイド ゲノム)
PAT/Bar：プライマーSEQ ID NO: 13 及びSEQ ID NO: 14；Tm = 80℃；サイズ= 69bp；LOD = ± 0.125ng (±50 ハプロイド ゲノム)
PAT/pat：プライマーSEQ ID NO: 15及びSEQ ID NO: 16；Tm = 77℃；サイズ= 109 bp；LOD = ± 0.03ng (±12 ハプロイド ゲノム)
CP4-EPSP：プライマーSEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 62及びSEQ ID NO: 63；Tm = 80．5または84．5℃；サイズ= 108 bp；LOD：NK603 5% ±3,125 ng (±31 ハプロイド ゲノム)、RRS 100% ±0．032 ng (±25 ハプロイド ゲノム)、GT73 100% ±0．016 ng (±12 ハプロイド ゲノム)
CP4-EPSP：プライマーSEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及びSEQ ID NO: 19；Tm = 85℃；サイズ= 94 bp 又は124 bp；LOD = ±0.03 ng (±25 ハプロイド ゲノム)
【０２４２】
実施例２：本発明の単純化された方法の例
無関係なDNAキャリアにBt176 DNAを添加することによって、仮想試料を作製した。この試料は、実施例１のリアルタイムＰＣＲ法を用いて、「p35S」，「tNOS」，「Cry1Ab」，「PAT/Bar」，「PAT/pat」及び 「CP4-EPSPS」の有無検出のためにスクリーニングされた。
【０２４３】
本発明の単純化された方法は、試料中に、Bt176、Bt11 及びNK603に由来する材料が存在する可能性があるか又は不在であるかを結論づけることを意図する。
【０２４４】
テストの結果、試料は、p35S, Cry1AbおよびPat/Barについて陽性であるが、他のテストされた核酸については陽性でない。よって、この試料は、セットG_SAM∈{p35S；Cry1Ab；Pat/bar}で表わされる。この実施例のアッセイにおいて（トウモロコシの核酸の存在が調べられない場合)、イベントBt176は、セットG_Bt176 ∈{p35S；Cry1Ab；Pat/bar}により、イベント Bt11はセットG_Bt11∈{p35S；tNOS；Cry1Ab；Pat/pat} により、イベント NK603はセットG_NK603∈{p35S；tNOS；CP4-EPSP}として表わされる。
【０２４５】
従って、G_Bt176 = G_SAMなので、イベントBt176に由来する材料が試料中に存在し得る。他方、
【数２】


なので、イベントBt11に由来する材料は、試料中に存在しない。同様に、
【数３】


なので、イベントNK603からの材料は、試料中に存在しない。
【０２４６】
択一的表示として、「p35S」、「tNOS」、「Cry1Ab」、「PAT/Bar」、「PAT/pat」及び「CP4-EPSPS」は、それぞれ主要値V_p35S = 3, V_tNOS = 5, V_Cry1Ab = 7, V_PAT/Bar = 11, V_PAT/pat = 13及び V_CP4-EPSPS = 17を割り当てる。
【０２４７】
結果として、セットG_SAM は、ここで検出される核酸にそれぞれ割り当てられた複数の値である、VG_SAMに割り当てられた値である。すなわち、VG_SAM = V_p35S × V_Cry1Ab × V_PAT/Bar = 231。さらに、セット G_Bt176 は、イベント Bt176の中で見いだされる、テストされた核酸の値に割りあてられた複数の値であるVG_Bt176に割り当てられた値である。すなわち、VG_Bt176 = V_p35S ×V_Cry1Ab ×V_PAT/Bar = 231。同様に、セットG_Bt11 は、VG_Bt11 = V_p35S ×V_tNOS ×V_Cry1Ab ×V_PAT/Pat = 1365に割り当てられる値であり；セットG_NK603 は、VG_NK603 = V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSP = 255に割り当てられる値である。
【０２４８】
したがって、VG_SAM/VG_Bt176 = 1なので、イベントBt176に由来する材料が、試料中に存在し得る。他方、VG_SAM/VG_Bt11 = 0.169、すなわち１でなく、１より大きな整数でもないので、イベント Bt11に由来する材料は、試料中に存在しない。同様に、VG_SAM/VG_NK603 = 0.906、すなわち、１ではなく、且つ１より大きな整数でないので、イベント NK603に由来する材料は存在しない。
【０２４９】
実施例３：本発明のキットの実施例の説明（９６ウェルプレートのセットアップ）
スクリーニングされる核酸：表１で定義されたプライマー対を用いて、上記で定義されたような遺伝子「Zm」、「Bn」、「Gm」、「p35S」、「tNOS」、「CP4-EPSPS」、「Cry1Ab」、「PAT/bar」、「PAT/pat」、並びに、プライマー対SEQ ID NO: 26及び27 (表4)を用いて増幅される植物属の遺伝子。
【０２５０】
場合により、必要に応じて、そのキットは、表１に定義された対応するプライマー対を用いて、ライス（「Or」）、コットン（「Gs」）、テンサイ（「Bv」）及び／又はポテト（「St」）に対する分類群マーカーを含んでもよい。
【０２５１】
サイバーグリーンQ-PCR法の操作条件
・試薬：HS Taq-ポリメラーゼを含むサイバーグリーンPCRマスターMix；プライマー20 μM；ヌクレアーゼフリー水
・装置：ABI PRISMO 7700配列検出システム、7300 リアルタイムPCRシステム、層流（Laminar Flow）、ピペット 20, 200及び1000 ml、滅菌（Sterile）、エアロゾル耐性ピペットチップ、Optical 96ウェル反応プレート、光学カップ
・プロトコル：PCR は、ABI PRISMO 7700 配列検出システム又は 7300リアルタイムPCRシステムにおいて、製造者の指示に従って行う。 ある一般的なPCRプログラムを用いる。
PCR Mix調製：PCR Mixには、鋳型DNA以外のＰＣＲ反応のすべての要素が含まれる。この操作は、層流（Laminar Flow）に従って実行される。層流は、この種の操作にだけ用いられる。
表６： Q-PCRスクリーニングの反応混合物
【表６】


DNA調製：鋳型DNAは、標準CTAB DNA抽出法を用いて抽出され、DNA濃度は、ピコグリーン蛍光決定によって測定される。
PCRセットアップ：PCRセットアップは、層流に従って実行される。鋳型DNAとPCRミックスは、異なる場所で組み合わされる。
PCRラン：PCRは、ユーザーマニュアルで説明されたように、製造者の指示に従って行われるだろう。
【０２５２】
熱サイクル条件は、下記表７に挙げられている。
表７：熱サイクルランニングコンディション
【表７−１】

【０２５３】
続いて、「融解曲線」分析を、標準プログラム(例えば、50℃から95 ℃までの勾配融解での、蛍光の減少をモニターする)を用いて行う。
【０２５４】
食料／飼料製品のためのGMOスクリーニング96ウェルプレートセットアップ
あらゆる一般的な食品／飼料マーカー、ライスマーカー(認可されていないライスイベントの検出) 及び CAMV リバーストランスクリプターゼマーカー（CaMV コントロールの不在)を. 含むセットアップについて、下記に説明する。
９６プレートセットアップ
【表７−２】

【０２５５】
ポジティブコントロール(+)は、対応するアンプリコン (プラスミドまたはインサート)であろう。本明細書、特に表５で説明されるように、あるコピー数 (例えば100コピー／ウェル)でのアンプリコンであろう。
【０２５６】
試料ウェルは、（例えば、最初にポジティブコントロール、ついで、試料、そして最後は、NTCとネガティブコントロールと）続いて起こるように、開かれることができることは、技術的に予測されるであろう。
【０２５７】
各ウェルに対するＣt値とTm値は、記録され、それぞれの試料中に存在するGM-セット決定のための、決定分析で用いられる。
【０２５８】
原則として、（顧客のために大きく融通をきかせることにより）各々の列は、択一的なセットアップで別々に製造することができるだろう
【０２５９】
実施例４： p35S, tNOS マルチプレックスPCR
本実施例は、p35S 及び tNOS アンプリコンのマルチプレックスＰＣＲ増幅の例を示す。ここで、検出は、サイバーグリーンによってなされ、増幅産物は、その融点(Tm)の差異に基づいて、区別される。
【０２６０】
用いたプライマー対 (20μM):
p35S: SEQ ID NO: 60 及び 61
tNOS: SEQ ID NO: 9 及び10
鋳型 (50 ng)：Roundup Ready Soybean (RRS) 100% (ダブルポジティブコントロール)
PCR プログラム： 95℃ 10’, (95℃ 15''、60℃ 1’) x 40 cycles
融解プログラム： 20’で50℃〜95℃
【０２６１】
p35SとtNOS双方のアンプリコンは、異なるTm (図２参照)に基づいて区別可能なので、サイバーグリーンについてp35SとtNOSのPCR法の複合が可能である。このように、異なる２つの標的p35S 及びtNOSの存在について、１つのＰＣＲだけ用いて情報を得ることができる。
【０２６２】
実施例５：サイバーグリーンを用いるときの追加的複合の可能性
実施例４の実験と類似の実験により、さらに、以下の複合的組み合わせが実行可能であることが示された：
1. トウモロコシadh-1 (SEQ ID NO: 56 及び 57)と大豆SLTM (SEQ ID NO: 58及び 59)
2. トウモロコシadh-1 (SEQ ID NO: 56及び57)とアブラナクルシフェリン（SEQ ID NO: 24及び25)
3. 大豆SLTM (SEQ ID NO: 58 及び59) とコットンsah-7 (SEQ ID NO: 66 及び 67)
4. コットンsah-7 (SEQ ID NO: 66及び67)とアブラナクルシフェリン（SEQ ID NO: 24及び 25)
【０２６３】
実施例６：本発明のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲのパラメータ
実施例１で限定された条件及びプライマーを用いて、それぞれのアンプリコン インサートを含む参照用プラスミドを限定したコピー数だけ反応させた。そして、40サイクル続けた(すなわち、比較的変動の少ない時期に近づく又は達する)相対蛍光（RFU）を決定した。表８の結果(+/- 8300鋳型コピーを用いた結果については、図３にもグラフで示す）は、本実施例の方法及びプライマーが、RFU値が少なくとも2500に達する（これは３倍のマージン以内にある）まで生成できることを示す。
【表８−１】


【表８−２】

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が試料中に存在するか不在であるかを検査する方法であって、
（１）試料中に下記核酸が存在するか不在であるかを検出する工程：
a)「Zm」：トウモロコシ分類群、 好ましくはZea mays ssp. maysに由来する核酸及び特異的な核酸、
b) 「Bn」：Brassica napus 分類群由来及び特異的な核酸、
c) 「Gm」：Glycine max 分類群由来及び特異的な核酸、
o)「Or」： Oryza sativa 分類群由来及び特異的な核酸、
p) 「Bv」：Beta vulgaris 分類群由来及び特異的な核酸、
q) 「Gs」：Gossypium 分類群由来及び特異的な核酸、及び
t)「St」：Solanum tuberosum 分類群由来及び特異的な核酸
から選ばれる核酸の１種、１種超、またはすべての核酸；並びに
d) 「p35S」：カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモータ由来の核酸
e) 「tNOS」：Agrobacterium tumefaciensノパリン（nopaline）シンテターゼ遺伝子の３’ターミネータ由来の核酸、
f)「Cry1Ab」：Bacillus thuringiensisの結晶タンパク遺伝子Cry1Ab由来の核酸
g) 「PAT/bar」：Streptomyces hygroscopicusのホスフィノトリシン（phosphinothricin）アセチルトランスフェラーゼ（PAT）遺伝子bar由来の核酸
h) 「PAT/pat」：Streptomyces viridochromogenesのホスフィノトリシン（phosphinothricin）アセチルトランスフェラーゼ (PAT)遺伝子pat、及び
i) 「CP4-EPSPS」：Agrobacterium sp. CP4由来の5−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸合成酵素EPSPS遺伝子；
から選ばれる核酸の１種、１種超、またはすべての核酸；並びに
（２）イベント Bt176，Bt11，Bt10，MON810，MON863，TC1507，NK603，T25，GA21，DAS-59122，MIR604，LY038，MON88017，その交差物、およびその関連イベント；イベント Topas 19/2，MS1，RF1，RF2，RF3，MS8，GT73，T45，Liberator pHoe6/Ac，GS40/90pHoe6/Ac，OXY235、その交差物（MS1/RF1，MS1/RF2，MS8/RF3を含む）、及びその関連イベント；イベント MON 40-3-2，MON89788，A2704-12，A5547-127，その交差物，及びその関連イベント；イベント LL62，LL06及びLL601，これらの交差物、及びその関連イベント；イベント T120-7，H7-1及びA5-15，その交差物、及びその関連イベント；イベント LLコットン25，MON 1445，MON 531，MON15985，その交差物、及びその関連イベント；及びイベント EH92-527-1及びその関連イベント、
を含む群から選ばれる、１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか、不在であるかを結論づける工程
を含み、
工程（１）における試料中の核酸の存在又は不在の検出は、下記表に示すそれぞれの核酸についてのプライマー対またはそのバリアントまたは前記プライマー対の誘導物を用いるPCR増幅、好ましくはリアルタイムPCR増幅により行う方法。
【表９】

【請求項２】
工程（１）は、 d)−i)で挙げられた全ての核酸を含む核酸が、試料中に存在するか、不在であるかを検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）は、a)−c)及びd)−i)で挙げられた全ての核酸を含む核酸が、試料中に存在するか、不在であるかを検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（１）は、Bacillus thuringiensisの修飾された結晶タンパク遺伝子Cry3A由来の核酸であるj)「mCry3A」が、試料中に存在するか不在であるかを検出する工程を更に含み；及び／又は
工程（１）は、Corynebacterium glutamicumのリジン−非感受性ジヒドロジピコリン酸合成酵素（cDHDPS）遺伝子cordapA由来の核酸であるk)「cordapA」、及び／又はトウモロコシのGlb1プロモータ由来の核酸であるl)「Glb1」の一方又は双方が、試料中に存在するか不在であるかを検出する工程を更に含み；及び／又は
工程（１）は、Bacillus thuringiensisの結晶タンパク遺伝子Cry3Bb1由来の核酸であるm) 「Cry3Bb1」が、試料中に存在するか不在であるかを検出する工程を更に含み；及び／又は
工程（１）は、 Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenaeのニトリラーゼ遺伝子Bxn由来の核酸であるn)「Bxn」が、試料中に存在するか不在であるかを検出する工程を更に含み；及び／又は
工程（１）は、Bacillus thuringiensisの結晶タンパク遺伝子Cry1Ac 由来の核酸である r) 「Cry1Ac」及び／又は Bacillus thuringiensisの結晶タンパク遺伝子Cry2Ab2 由来の核酸であるs)「Cry2Ab2」が試料中に存在するか不在であるかを検出する工程を更に含み；及び／又は
工程（１）は、Solanum tuberosumの顆粒結合（granule bound）デンプン合成酵素遺伝子Gbss由来の核酸であるu)「GBSS」が試料中に存在するか不在であるかを検出する工程を更に含む；
請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
植物属に由来している核酸、好ましくは葉緑体のRubisco遺伝子のスモールサブユニット由来又はCHL-tRNAシンテターゼ遺伝子由来の核酸が、試料中に存在するか不在であるかを検出する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲ増幅、好ましくはプライマー対 5' AGGTCTAADGGRTAAGCTAC 3' (SEQ ID NO: 26) 及び5' AGYCTTGATCGTTACAAAGG 3' (SEQ ID NO: 27)、または当該プライマー対のバリアント若しくは誘導物を用いるリアルタイムＰＣＲ増幅を行って、前記植物属に由来している核酸の存在又は不在を検出する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅による産物は、実質的に配列非特異的検出方法、好ましくはＤＮＡ結合蛍光染料、より好ましくはサイバーグリーン（SYBR Green）又はピコグリーン（PicoGreen）を用いて検出される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記増幅による産物の特異性を、好ましくは融解曲線分析（Ｔｍ）及び／又はゲル電気泳動によるサイズ決定を用いて、さらに検証する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記増幅による産物は、プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマー中に存在するフルオロフォア標識を、Light Upon Extension (LUX^TM) テクノロジーなどを用いて検出する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記試料は、花、花被片、花弁、萼、葯、花粉、種子、果実、果皮、鞘、葉、葉柄、幹、根、根茎、芽茎、塊茎、若しくは苗条、又はこれらの部分、植物細胞、植物プロトプラスト、及び／又は植物組織、及び／又は植物に由来する材料、好ましくは加工食品又は飼料の材料を包含する食品又は飼料の材料を含んでいる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（１）において、下記表に示すそれぞれの核酸についてのプライマー対、又は当該プライマー対のバリアント、又は誘導物を用いて、ＰＣＲ増幅、好ましくはリアルタイムPCR増幅を行うことにより、試料中に核酸が存在するか不在であるかを検出する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【表１０−１】


【表１０−２】

【請求項１２】
前記工程（２）は、
(i) 工程（１）検出された核酸からなるセット「G_SAM」が、試料中に存在すると定義し；
(ii) イベントBt176、Bt11、Bt10、MON810、MON863、TC1507、NK603、T25、A21、DAS-59122、MIR604、LY038、MON88017、Topas 19/2、MS1、RF1、RF2、MS1/RF1、MS1/RF2、MS8、RF3、MS8/RF3、GT73、T45、Liberator pHoe6/Ac、GS40/90pHoe6/Ac、OXY235；MON40-3-2、MON89788、A2704-12、A5547-127、LL62、LL06、LL601、T120-7、H7-1、A5-15、LL cotton 25、MON1445、MON531、MON15985及びEH92-527-1を含む、又はからなる群から選ばれる、注目する１つ以上のトランスジェニック植物イベント（「Ｘ」）にそれぞれ対応するように、セット「G_Bt176」、「G_Bt11」、「G_Bt10」、「G_MON810」、「G_MON863」、「G_TC1507」、「G_NK603」、「G_T25」、「G_GA21」、「G_DAS-59122」、「G_MIR604」、「G_LY038」、「G_MON88017」、「G_{Topas 19/2}」、「G_MS1」、「G_RF1」、「G_RF2」、「G_MS1/RF1」、「G_MS1/RF2」、「G_MS8」、「G_RF3」、「G_MS8/RF3」「G_GT73」、「G_T45」、「G_{Liberator pHoe6/Ac}」、「G_{GS40/90pHoe6/Ac}」、「G_OXY235」；「G_MON40-3-2」、「G_MON89788」、「G_A2704-12」、「G_A5547-127」、「G_LL62」、「G_LL06」、「G_LL601」、「G_T120-7」、「G_H7-1」、「G_A5-15」、「G_{LL cotton 25}」、「G_MON1445」、「G_MON531」、「G_MON15985」 及び「G_EH92-527-1」を含む又はからなるセットの群から選ばれる、注目する１つ以上のセット（「G_X」）を定義し；
ここで、
【数４−１】


【数４−２】


(iii)注目するG_Xの各セットについて下記論理演算を実行する：
- もし、G_X がG_SAMと等しいときは（G_X = G_SAM)、トランスジェニック植物イベントＸ又はその交差物又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在している可能性がある；
- もし、G_X がG_SAMの適当なサブセットのときは（G_X ⊂G_SAM)、トランスジェニック植物イベントＸ又はその交差物、またはその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在している可能性がある；
- もし、G_X がG_SAM に等しくなく、且つG_X がG_SAMの適当なサブセットでもないとき
【数１】


トランスジェニック植物イベントＸ又はその交差物又はその関連イベントに由来する材料は、試料中に不在である；
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
G_X がG_SAMに等しい場合であって、且つG_Bt176，G_Bt11，G_Bt10，G_MON810， G_MON863，G_TC1507，G_NK603，G_T25，G_GA21，G_DAS-59122，G_MIR604，G_LY038，G_MON88017，G_{Topas 19/2}，G_MS1，G_RF1，G_RF2，G_MS1/RF1，G_MS1/RF2，G_MS8，G_RF3，G_MS8/RF3，G_GT73，G_T45，G_{Liberator pHoe6/Ac}，G_{GS40/90pHoe6/Ac}，G_OXY235；G_MON40-3-2，G_MON89788，G_A2704-12，G_A5547-127，G_LL62，G_LL06，G_LL601，G_T120-7，G_H7-1，G_A5-15，G_{LL cotton 25}，G_MON1445，G_MON531，G_MON15985 を含む又はからなる群から選ばれる１つのセット又は２つ以上のセットの合計で、G_X 以外には、等しいものがない場合には、トランスジェニック植物イベントＸ又はその交差物又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在しているとする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
「Zm」，「Bn」，「Gm」，「p35S」，「tNOS」，「Cry1Ab」，「PAT/bar」，「PAT/pat」，「CP4-EPSPS」，「mCry3A」，「cordap A」，「Glb1」，「Cry3Bb1」，「Bxn」，「Or」，「Bv」，「Gs」，「Cry1Ac」，「Cry2ab2」，「St」及び「Gbss」を含む又はからなる群から選ばれる核酸について、それぞれ固有値「V_Zm」，「V_Bn」，「V_Gm」，「V_p35S」，「V_tNOS」，「V_Cry1Ab」，「V_PAT/bar」，「V_PAT/pat」，「V_CP4-EPSPS」，「V_mCry3A」，「V_{cordap A}」，「V_Glb1」，「V_Cry3Bb1」，「V_Bxn」，「V_Or」，「V_Bv」，「V_Gs」，「V_Cry1Ac」，「V_Cry2ab2」，「V_St」及び「V_Gbss」を割り当て；
注目するG_Xについて「VG_Bt176」，「VG_Bt11」，「VG_Bt10」，「VG_MON810」，「VG_MON863」，「VG_TC1507」，「VG_NK603」，「VG_T25」，「VG_GA21」，「VG_DAS-59122」，「VG_MIR604」，「VG_LY038」，「VG_MON88017」，「VG_{Topas 19/2}」，「VG_MS1」，「VG_RF1」，「VG_RF2」，「VG_MS1/RF1」，「VG_MS1/RF2」，「VG_MS8」，「VG_RF3」，「VG_MS8/RF3」，「VG_GT73」，「VG_T45」，「VG_{Liberator pHoe6/Ac}」，「VG_{GS40/90pHoe6/Ac}」，「VG_OXY235」，「VG_MON40-3-2」，「VG_MON89788」，「VG_A2704-12」，「VG_A5547-127」，「VG_LL62」，「VG_LL06」，「VG_LL601」，「VG_T120-7」，「VG_H7-1」，「VG_A5-15」，「VG_{LL cotton 25}」，「VG_MON1445」，「VG_MON531」，「VG_MON15985」及び「VG_EH92-527-1」を含む又はからなる群から選ばれる割り当て値「VG_X」とし、
ここで
- VG_Bt176 = V_Zm × V_p35S × V_Cry1Ab × V_PAT/bar，
- VG_Bt11 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ab × V_PAT/pat，
- VG_Bt10 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ab × V_PAT/pat，
- VG_MON810 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ab ，
- VG_MON863 = V_Zm ×V_p35S× V_tNOS ，
- VG_TC1507 = V_Zm × V_p35S × V_PAT/pat，
- VG_NK603 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSPS，
- VG_T25 = V_Zm × V_p35S× V_PAT/pat，
- VG_GA21 = V_Zm × V_p35S，
- VG_DAS-59122 = V_Zm × V_p35S × V_PAT/bar，
- VG_MIR604 = V_Zm × V_tNOS × V_mCry3A ，若しくはVG_MIR604 = V_Zm × V_tNOS ，
- VG_LY038 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_cordapA × V_Glb1，若しくはVG_LY038 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS ，
- VG_MON88017 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSP × V_Cry3Bb1，若しくはVG_MON88017 = V_Zm × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSP，
- VG_{Topas 19/2} = V_Bn × V_p35S × V_PAT/pat，
- VG_MS1 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_RF1 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_RF2 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_MS8 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_RF3 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_MS1/RF1 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_MS1/RF2 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_MS8/RF3 = V_Bn × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_GT73 = V_Bn × V_CP4-EPSPS，
- VG_T45 = V_Bn × V_p35S × V_PAT/pat，
- VG_{Liberator pHoe6/Ac} = V_Bn × V_p35S × V_PAT/pat，
- VG_{GS40/90pHoe6/Ac} = V_Bn × V_p35S × V_PAT/pat，
- VG_OXY235 = V_Bn × V_p35S × V_Bxn，若しくはVG_OXY235 = V_Bn × V_p35S，
- VG_MON40-3-2 = V_Gm × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSPS，
- VG_MON89788 = V_Gm × VCP4-EPSPS，
- VG_A2704-12 = V_Gm × V_p35S × V_PAT/pat，
- VG_A5547-127 = V_Gm × V_p35S × V_PAT/pat，
- VG_LL62 = V_Or × V_p35S × V_PAT/bar，
- VG_LL06 = V_Or × V_p35S × V_PAT/bar，
- VG_LL601 = V_Or × V_p35S × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_T120-7 = V_Bv × V_p35S × V_PAT/pat，
- VG_H7-1 = V_Bv × V_p35S × V_CP4-EPSPS，
- VG_A5-15 = V_Bv × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSPS，
- VG_{LL cotton 25} = V_Gs × V_p35S × V_tNOS × V_PAT/bar，
- VG_MON1445 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS × V_CP4-EPSPS，
- VG_MON531 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ac，若しくはVG_MON531 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS ，
- VG_MON15985 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS × V_Cry1Ac × V_Cry2Ab2，若しくはVG_MON15985 = V_Gs × V_p35S × V_tNOS ，
- 及びVG_EH92-527-1 = V_St × V_tNOS × V_Gbss，若しくはVG_EH92-527-1 = V_St × V_tNOS ，
及びセットG_SAM は、試料中に存在するとして検出された核酸に割り当てられた複数の固有値である値「VG_SAM」であり；並びに
ステップ(iii)は、注目するG_X の各セットのために、下記論理演算の実行を含む：
-もし、VG_SAM / VG_X が１に等しいならば、トランスジェニック植物イベントX又はその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が試料中に存在する可能性あり；
-もし、VG_SAM / VG_X が、 値V_Zm，V_Bn，V_Gm，V_p35S，V_tNOS ，V_Cry1Ab，V_PAT/bar，V_PAT/pat，V_CP4-EPSPS，V_mCry3A，V_{cordap A}，V_Glb1，V_Cry3Bb1，V_Bxn，V_Or，V_Bv，V_Gs，V_Cry1Ac，V_Cry2ab2，V_St及びV_Gbssを含む又はからなる群から選ばれる１つ又は２つ以上の複数の値と等しい場合には、トランスジェニック植物イベントＸ又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性あり；
- もし、VG_SAM / VG_Xが１と等しくなく、且つ値V_Zm，V_Bn，V_Gm，V_p35S，V_tNOS，V_Cry1Ab，V_PAT/bar，V_PAT/pat，V_CP4-EPSPS，V_mCry3A，V_{cordap A}，V_Glb1，V_Cry3Bb1，V_Bxn，V_Or，V_Bv，V_Gs，V_Cry1Ac，V_Cry2ab2，V_St 及びV_Gbssを含む又はからなる群から選ばれる１つの値又は２つ以上の複数の値と等しくない場合には、試料中に、トランスジェニック植物イベントＸ又はその交差物、又はその関連イベントが不在である。
【請求項１５】
もし、VG_SAM / VG_X が1と等しい場合で且つVG_Bt176，VG_Bt11，VG_Bt10，VG_MON810，VG_MON863，VG_TC1507，VG_NK603，VG_T25，VG_GA21，VG_DAS-59122，VG_MIR604，VG_LY038，VG_MON88017，VG_{Topas 19/2}，VG_MS1，VG_RF1，VG_RF2，VG_MS1/RF1，VG_MS1/RF2，VG_MS8，VG_RF3，VG_MS8/RF3，VG_GT73，VG_T45，VG_{Liberator pHoe6/Ac}，VG_{GS40/90pHoe6/Ac}，VG_OXY235，VG_MON40-3-2，VG_MON89788，VG_A2704-12，VG_A5547-127，VG_LL62，VG_LL06，VG_LL601，VG_T120-7，VG_H7-1，VG_A5-15，VG_{LL cotton 25}，VG_MON1445，VG_MON531，VG_MON15985 及びVG_EH92-527-1 を含む又はからなる群から選ばれる１つの値も、２つ以上の値の複数のセットのいずれも、VG_X以外は、等しくない場合には、トランスジェニック植物イベントX 又はその交差物、又はその関連イベントが、試料中に存在するとする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
値V_Zm，V_Bn，V_Gm，V_p35S，V_tNOS，V_Cry1Ab，V_PAT/bar，V_PAT/pat，V_CP4-EPSPS，V_mCry3A，V_{cordap A}，V_Glb1，V_Cry3Bb1，V_Bxn，V_Or，V_Bv，V_Gs，V_Cry1Ac，V_Cry2ab2，V_St 及びV_Gbss が固有の主要数であり、
ステップ(iii)は、注目するG_X のための下記論理演算の各セットの実行工程を含む：
・もし、VG_SAM ／VG_X が１と等しいならば、トランスジェニック植物X 又はその交差物又はその関連イベントに由来する材料を、試料中に含んでいる可能性がある；
・もし、VG_SAM ／VG_X が１以上の整数ならば、トランスジェニック植物イベントX又はその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性がある；
・もし、VG_SAM ／VG_X が整数でないならば、トランスジェニック植物イベントX若しくはその交差物、若しくはその関連イベントに由来する材料は、試料中に存在しない；
請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（２）は、コンピュータ装置により実行される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１、６、及び１１で定義されたプライマー及びプライマー対。
【請求項１９】
請求項１、６、及び１１で定義されたプライマー対を用いることによって得ることができる増幅産物；当該増幅産物を含む組み換えベクター及びプラスミド；前記ベクター及び／又はプラスミドで形質転換された組み換え微生物。
【請求項２０】
ブタペスト条約に基づき、ベルギーの微生物共同コレクション（ＢＣＣＭ）に、２００７年１月１０日に寄託されたLMBP アクセッショナンバーLMBP 5452，LMBP 5453，LMBP 5454 ，LMBP 5455，LMBP 5456，LMBP 5457，LMBP 5458，LMBP 5459及びLMBP 5460、２００７年３月６日に寄託されたLMBPアクセッションナンバーLMBP 5451、２００７年４月１９日に寄託されたLMBPアクセッションナンバーLMBP 5587，LMBP 5588，LMBP 5589及びLMBP 5590である、組み換え大腸菌。
【請求項２１】
請求項２０に記載のいずれかの組み換え大腸菌から得ることができる単離された組み換えプラスミド、又は前記プラスミドの単離されたインサート、好ましくはその単離されたEcoRI-EcoRI インサート。
【請求項２２】
請求項２１に記載のプラスミドで形質転換された組み換え微生物。
【請求項２３】
１以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が試料中に存在するか不在であるかを調べるキットであって、１種、１種超若しくは全てのプライマー、好ましくは請求項１，６及び１１で定義された１種、１種超、若しくは全てのプライマー対、または当該プライマー対のバリアント若しくは誘導体を含むキット。
【請求項２４】
請求項１で定義された核酸「Zm」，「Bn」，「Gm」，「p35S」，「tNOS」，「Cry1Ab」，「PAT/bar」，「PAT/pat」及び「CP4-EPSPS」の増幅のための、プライマー対又はそのバリアント又は誘導体を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
請求項１〜５に記載の核酸の増幅のためのポジティブコントロールとして好適な１以上の核酸を、さらに含む、請求項２３又は２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
請求項２０で定義された１以上の組み換え大腸菌、請求項２２で定義された組み換え微生物、請求項２１に記載の単離された組み換えプラスミド又はインサートを含む、請求項２３〜２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
コンピュータ装置に、請求項１〜１７のいずれかに記載の工程（２）を実行させるようにプログラム可能な指示を含むデータキャリアをさらに含む請求項２３〜２６のいずれかに記載のキット。

【図２】

【図３】

【公表番号】特表２０１０−５１６２７０（Ｐ２０１０−５１６２７０Ａ）
【公表日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４６７８０（Ｐ２００９−５４６７８０）
【出願日】平成２０年１月２９日（２００８．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５１０５９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９２８６６
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（５０９２００２００）サイエンティフィック　インスティテュート　オブ　パブリック　ヘルス（アイピーエイチ） (1)
【Ｆターム（参考）】