トランスフェリン不含・低鉄培地中での骨髄腫細胞培養
本発明は、トランスフェリン不含、かつ親油性または合成含窒素キレート剤を含まない培養培地中で哺乳動物細胞を培養するための方法に関する。該培地および該培地中で哺乳動物産物を産生することが可能な細胞を培養することにより該産物をもたらすための方法もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鉄を含有する培養培地中であるがトランスフェリンまたは親油性もしくは合成含窒素キレート剤の非存在下に、ある種の哺乳動物細胞を増殖させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養培地は、管理され、人工的でかつｉｎ ｖｉｔｒｏの環境において細胞を維持および増殖させるのに必要な栄養素を提供しなければならない。細胞培養培地の個々の特性は、培養される細胞のタイプに大きく依存し、また培養の方法にはより小さな程度依存する。
【０００３】
哺乳動物細胞は、鉄に対する絶対的な要求性を有し、鉄はｉｎ ｖｉｔｒｏでは細胞培養培地中に供給される。Bertheussen（Cytotechnology 11:219-231, 1993）は、細胞培養培地に鉄の単塩を加えることでは哺乳動物細胞に対して有効に鉄を供給することはできず、それは主として迅速な酸化および鉄の沈殿により細胞に対する鉄の利用能が低下することによる、と述べている。
【０００４】
さらに、遊離型の鉄は高い酸化能を有し、このことは、細胞培養培地の成分の酸化をもたらしうる。それゆえ、この酸化能を低減させるかまたは取り除くように鉄を複合体（錯体）化することが有効であることが証明されている。
【０００５】
ｉｎ ｖｉｖｏでは、鉄は、鉄結合タンパク質であるトランスフェリンによって哺乳動物細胞に提示される。トランスフェリンは、鉄に結合し、細胞表面上のトランスフェリン受容体と相互作用することにより機能する。トランスフェリン−鉄複合体は、その後、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれる。細胞内に入ると、トランスフェリン−鉄複合体は壊れ、そして放出された鉄が鉄輸送タンパク質（フェリチン）と複合体化する。トランスフェリンは再利用される。Thorstensen および Romslo（Biochem. J., 271:1-10 (1990)）は、このｉｎ ｖｉｖｏ鉄輸送メカニズムについて秀逸な総説を提供している。細胞への鉄の輸送を仲介するトランスフェリンの能力は、細胞培養培地にトランスフェリンおよび鉄塩を単に添加することにより細胞培養に利用されてきた。
【０００６】
しかしながら、細胞培養培地に典型的に用いられるトランスフェリンは動物由来のものであり、近年では、細胞培養方法から動物由来のタンパク質を除くという規制的圧力が増大してきている。明らかに、動物由来のタンパク質の使用は、汚染物質および外来性の病原因子（例えばクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）または海綿状脳症（狂牛病））を導入する危険性を伴う。したがって、トランスフェリンに代わる鉄輸送体が求められ、適用されて種々の程度の成功を収めている。代わりとなる鉄輸送体についてのタイプおよび濃度は、多くの場合、培養される哺乳動物細胞のタイプに依存することが見出されてきている。
【０００７】
Kovar および Franek （Biotechnology Letters 9:259-264 (1987)）は、ハイブリドーマ細胞株の培養において、トランスフェリンの代わりに種々の可溶性鉄化合物（例えばクエン酸第二鉄）を用いることができることを実証した。Kovar および Franek は、５μＭ（１．２５ｍｇ／Ｌ）〜５ｍＭ（１２２５ｍｇ／Ｌ）の濃度範囲にわたって、２種類のハイブリドーマ細胞株の増殖を支援するクエン酸第二鉄の能力について調べた。より低い濃度の第二鉄化合物は、数種類の異なる細胞株（特にヒト白血病または上皮由来のもの）のための培養培地中での使用に好適であることが初期の先行技術において提案されていたが、Kovar および Franek は、クエン酸第二鉄がトランスフェリンと同等にハイブリドーマ細胞増殖を支援するためには、５００μＭ（１２２．５ｍｇ／Ｌ）の濃度が必要であったと報告している。Kovar および Franek は、５００μＭのクエン酸第二鉄を含有する培地は他のハイブリドーマ細胞株の培養に好適であること、およびいくつかの種類の骨髄腫細胞タイプの培養にも好適であることを見出した。
【０００８】
Eto ら（Agric. Biol. Chem. 55(3):863-865 (1991)）は、Kovar および Franek と同様の知見を報告している。彼らは、ハイブリドーマ細胞株に対する、１０ｍｇ／Ｌ〜６００ｍｇ／Ｌの濃度範囲にわたるクエン酸第二鉄の増殖刺激作用について調べた。彼らは３００ｍｇ／Ｌをさらなる研究に用いたと報告している。トランスフェリンを用いて達成したのと同等の増殖は、３００ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄を含有する培地に１０μＭの濃度でエタノールアミン（脂質前駆体）を加えたときに観察された。
【０００９】
同様の研究において、Toyoda および Inouye （Agric. Biol. Chem. 55(6):1631-1633 (1991)）は０〜５００μＭの濃度範囲にわたるクエン酸第二鉄を含有する培地中での３種類のハイブリドーマ細胞株の増殖について調べた。彼らは、調べた３種類のハイブリドーマ細胞株のうち２種類に対して、５０μＭ（１２．５ｍｇ／Ｌ）のクエン酸第二鉄が最適であることが見出されたと報告している。この結果は、Eto ら、ならびにKovar および Franek の知見と合致するが、但し３番目の細胞株に対しては５００μＭの濃度が最適であることが明らかとなった。
【００１０】
しかしながら、Kovar および Franek 、Toyoda および Inouye 、ならびにEto らの研究はすべて静置培養において行われたことに注意することが重要である。ＷＯ９４／０２５９２では、１０ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム（ＦＡＣ）は静置培養においてはハイブリドーマ増殖を支援しえたが、これは振盪懸濁培養には当てはまらなかったと報告されている。したがって、振盪懸濁培養において増殖する場合には、ハイブリドーマ細胞が鉄の最適使用を達成する能力は静置培養でのそれとは異なることが明らかである。
【００１１】
ＷＯ９３／００４２３には、無血清・無タンパク質培養培地に対する好適な鉄供給源である、可溶性鉄塩の鉄キレートおよびクエン酸アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属を含む培養培地添加物が記載されている。この出願の実施例は、主にＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞の増殖に関する。実施例５は骨髄腫細胞の増殖を実証することを意図するものであるが、用いたＳＰ２／０細胞は実際は非分泌性マウス／マウスハイブリドーマ細胞であることが注目される。培養条件は、全体を通して静置懸濁培養であるものとして述べてある。
【００１２】
Kovar および Franek は、５００μＭのクエン酸第二鉄を含有する彼らの培地が振盪懸濁培養に好適であったことを主張しているが、この主張を支持する証拠は示されていない。しかしながら、Qi ら（Cytotechnology 21:95-109 (1996)）は、５００μＭ（１２２．５ｍｇ／Ｌ）のクエン酸第二鉄を含有する培地（Kovar および Franek により記載されたのと同様）が、振盪懸濁培養において３種類のハイブリドーマ細胞株の培養に好適であったと報告している。しかし、Qi らは、これらの高濃度（５００μＭ）のクエン酸第二鉄を含有する培地を使用するためには、細胞をこの培地に切り替えさせることが必要であり；ある細胞株の場合には、この切り替え期間が非常に長引いた。Qi らは、これらの条件下では、細胞が適応するのは困難であること、および培地の処方は培地中のクエン酸第二鉄をより有効に鉄を提示する化合物（例えばアウリントリカルボン酸）と置換することにより改善しうるとの意見を述べている。
【００１３】
Kovar および Franek （1978）により引用された先行技術と一致して、数人の研究者が、あるタイプの哺乳動物細胞がより低い濃度の鉄化合物を用いた培養において維持可能であることが見出されていることを報告している。
【００１４】
Ramos らはＷＯ９２／０５２４６で、上皮細胞株の培養において、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株において、トランスフェリンを１０〜１００ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄（約０．６〜１６ｍｇ／Ｌの鉄を提供する）と置き換えうることを報告している。しかしながら、この特許出願では、該培地は骨髄腫細胞株の培養には適していないことが明らかとなったとはっきり述べられている。Keen らはＵＳ５，６３３，１６２で、クエン酸第二鉄、硫酸第一鉄およびクエン酸第二鉄アンモニウム（ＦＡＣ）を、ＣＨＯ細胞の培養においてトランスフェリンを置き換えるために０．２５〜５ｍｇ／Ｌ（０．０４〜０．８ｍｇ／Ｌの鉄と等価）の濃度で用いうることを報告している。
【００１５】
ＷＯ９８／０８９３４では、すべての動物タンパク質（すなわちトランスフェリンおよびインスリン）が置き換えられた代替培地が規定されている。トランスフェリンは硫酸第一鉄（含窒素キレート化合物にキレートされている）により、鉄に基づく濃度０．２８〜１１ｍｇ／Ｌ（１．１ｍｇ／Ｌが最適であることが見出された）で置き換えられている。好適であるとされている含窒素キレート化合物としては以下のものが挙げられる：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）；デスフェロキサミンメシレート；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）。これらのうちでは、ＥＤＴＡが最も好ましい。クエン酸第二鉄はＦｅＣｌ３−クエン酸ナトリウムの形態でも用いられたが、これは硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ−ＥＤＴＡキレートよりも高い濃度を必要とした。
【００１６】
この出願では、トランスフェリン不含培地が、哺乳動物細胞、特に上皮または線維芽細胞を増殖させるのに好適であるということについて述べている。ＣＨＯおよびヒト胎児腎細胞株２９３の増殖の事例が提供されている。
【００１７】
また、一定範囲の細胞タイプが、Neumannova ら（In vitro Cell Dev. Biol., 31:625-632 (1995)）により、１．２５ｍｇ／Ｌ（約０．２ｍｇ／Ｌの鉄）の低濃度のクエン酸第二鉄の形で鉄を含有する培地中での長期増殖についても調べられた。試験した１９種類の細胞株のうち、５種類のみがこの低鉄培地中での長期増殖が可能であった。５種類の細胞株とは、ジャーカット、Ｊ１１１およびＴＨＰ−１（ヒト白血病細胞株）、ＨｅＬａ（ヒト上皮細胞株）およびＸＣ（ラット肉腫）である。ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞株は調べたもののうちに含まれるが、どちらも低鉄培地中では増殖することができないことが見出された。
【００１８】
上述のように、低濃度の第二鉄化合物は、ある種の細胞タイプ（特に上皮およびヒト白血病由来のもの）のための培養培地で用いるのに好適である。しかしながら、トランスフェリン不含培地を用いた振盪懸濁培養でハイブリドーマ細胞を培養するためには、高濃度（例えば１２２．５ｍｇ／Ｌ付近）の鉄化合物が必要であることは、当該技術分野において広く同意されている。
【００１９】
しかしながら、先行技術ではまた、高濃度の鉄は有利ではないことも教示している。Bertheussen は Cytotechnology 11:219-231(1993)において、高濃度の鉄（例えば Kovar および Franek により提案された５００μＭのクエン酸第二鉄）は、これらの高い濃度が培地中の鉄水酸化物の急速な沈殿を引き起こすため、用いるべきではないと述べている。形成されたばかりの鉄水酸化物は他の金属および種々の有機分子を効率よく吸収し、したがって高濃度の鉄を含有する培地の組成および安定性は著しく害されるであろう。
【００２０】
培養中のある種の哺乳動物細胞（特にハイブリドーマ細胞）に鉄を送達することに関して直面する困難に鑑みて、鉄のキレート化（例えば親油性化合物への）のコンセプトが開発された。
【００２１】
鉄キレート剤は、典型的にはヘテロ環式化合物であり、キレート剤中の少なくとも２つの非金属イオンに対して配位結合により金属イオンが結合するものであって、それらは多数の規準（例えばその由来（合成かまたは生物学的に産生される分子か）、水などの溶媒との相互作用（疎水性または親水性）またはその化学量論的相互作用（六座配位のうちの二座配位））を用いて分類することができる。
【００２２】
親油性キレート剤は、２つの異なる性質を有する化合物である：（１）該化合物は疎水性であり多くの場合芳香族であるため、有機溶媒（例えばアルコール）への溶解性を示すが、水への溶解性は限られている；（２）該化合物はまた、典型的には負に荷電した領域を有し、ここで正に荷電した鉄イオンとの静電的相互作用を介して鉄を「結合」させる。細胞培養においては、そのような化合物は脂質に富む細胞膜に引き寄せられると考えられており、それゆえ細胞膜に、そしておそらくそれを介して「結合した」鉄を輸送し、したがって細胞への鉄の供給を促進するものと考えられている（ＵＳ５，０４５，４６８）。親油性キレート剤は、典型的には付随する鉄塩を上回る量を添加する。
【００２３】
親油性キレート剤の使用に関する最も初期の報告のうちの１つは Brock および Stevensen によるものであり（Immunology Letters 15:23-25, (1987)）、彼らはピリドキサルイソニコチノイルヒドラゾン（ＰＩＨ）をニトリロ三酢酸第二鉄とともに用いた。彼らは、ＰＩＨ：ニトリロ三酢酸第二鉄（２：１の比、ＰＩＨに基づいて４０μＭの濃度）が、マウスリンパ球細胞株の培養のためにトランスフェリンを置き換えうることを見出した。
【００２４】
Darfler （ＵＳ５，０４５，４６８／in Vitro Cell. Dev. Biol. 26:769-778, 1990）は、ハイブリドーマ細胞株の培養に好適な無タンパク質培地を報告している。この著者は、有機鉄化合物、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）をＥＤＴＡと共にそれぞれ５．７および５．５ｍｇ／Ｌの濃度で用いることによりトランスフェリンを置き換えうることを見出した。著者は、この培地を「ＡＢＣ培地」と名付けた。
【００２５】
Bertheussen （ＵＳ５０４５４６７／Cytotechnology 11:219-231 (1993)）は、アウリントリカルボン酸、親油性鉄キレート剤、および３μＭの第二鉄イオン（ＦｅＣｌ３の形で添加）を用いることにより、細胞培養培地中のトランスフェリンを置き換えうることを報告した。Bertheussen はこの培地を数種類の細胞タイプを用いて開発し、これが増殖の速いハイブリドーマ細胞株の培養に特に好適であることを見出した。
【００２６】
ＷＯ９４／０２５９２では、振盪懸濁培養中の細胞への鉄の提示におけるトランスフェリンの機能の代わりを務めるために、トロポロンを用いることが提案された。著者は、トロポロンを、付随する鉄を上回る量添加するべきであると述べている。鉄は、種々の鉄化合物を用いて第二鉄または第一鉄イオンとして提示されうるが、ＦＡＣを用いることが最も好ましい。ハイブリドーマ細胞株を用いて、トロポロンおよびＦＡＣの最適濃度がそれぞれ５μＭおよび０．２ｍｇ／Ｌであることが明らかにされた。この培地はまた、ＮＳＯ骨髄腫細胞の増殖にも好適であった。純粋に実験上の対照として、トランスフェリンおよびトロポロンを含まないがＦＡＣを含有する培地について、ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞を用いて調べられた。ＦＡＣ単独（０．１〜１０ｍｇ／Ｌ）では、振盪懸濁培養のハイブリドーマ細胞の増殖を支援できないことが明らかになった。０．２ｍｇ／Ｌの濃度のＦＡＣ単独では、ＮＳＯ骨髄腫細胞株の増殖を支援することができなかった。骨髄腫細胞株を用いては、ＦＡＣ単独の他の濃度については調べられなかった：おそらく著者らは、ＮＳＯとハイブリドーマ細胞株が同様の挙動を示すものと推測し、他の濃度のＦＡＣが細胞増殖を支援することは予測しなかったのだろう。
【００２７】
Keen （Cytotechnology 17:193-202, 1995）は、ラット骨髄腫細胞およびラットハイブリドーマ細胞の培養のための無タンパク質培地の開発を報告している。この培地（Ｗ３８と呼ばれる）は、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩおよびＡＢＣ培地（Darfler により開発された）の１：１：１の混合物に基づいている。したがってこの培地は親油性の鉄供給源としてＳＮＰを、また含窒素キレート剤としてＥＤＴＡを含むものであった。しかしながら、ＳＮＰおよびＥＤＴＡはＡＢＣ培地中に見られる濃度の３分の１であり、Keen は培地中にクエン酸第二鉄を含めることにより鉄濃度を上昇させることが有益であるのを見出した。Ｗ３８培地はまた、コレステロール要求性骨髄腫細胞株であるＮＳ０の培養にも好適であり、これによりコレステロール要求に対して好都合な対策をもたらした（Keen および Steward, Cytotechnology 17:203-211, 1995）。
【００２８】
Epstein らによる最近の特許出願（ＷＯ０１／１６２９４）では、多くの場合、クエン酸のような簡単な鉄担体は培養細胞に対する十分な鉄利用能または鉄取り込みをもたらさないと述べられている。この特許ではまた、一定範囲の親油性鉄キレート化合物を種々の細胞タイプに対して用いて様々な程度の成功を収めることができるとも報告されている。しかしながら、少なくともトランスフェリンと同程度に良好な結果はＦｅＣｌ３および２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシドにキレート化されたソルビトールを用いて得られたのみであった。
【００２９】
したがって、ハイブリドーマ細胞および骨髄腫細胞タイプのトランスフェリン不含培養における、鉄をキレートし、その提示を助けるための親油性化合物の使用が、当該分野の最先端となってきている。しかしながら、細胞培養培地に親油性キレート剤を含めることにはいくつかの欠点がある。親油性キレート剤は多くの場合毒性であり、例えばＳＮＰは非常に毒性が強いものとして分類され、ラットでのＬＤ５０は１ｍｇ／ｋｇ未満である。生体治療用製品の工業的生産のために用いられる細胞株においては、このことは製造技術者および最終製品の両方に対して重大な意味を有する。実際、最終的に精製した生体治療用製品が、親油性キレート剤のいかなる汚染も含まないことを証明するアッセイを開発および確認することが必要であると思われる。さらに、いずれの特定の方法での鉄濃度の最適化も、キレート剤と鉄化合物の２成分系であるためにさらに複雑なものであるだろう。
【００３０】
まとめると、先行技術においては以下のことが示されている：
１． トランスフェリンの非存在下では、ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞は高い鉄濃度（クエン酸第二鉄１２２．５ｍｇ／Ｌ）においては増殖するであろう（Kovar および Franek）。
２． 高い鉄濃度（例えばクエン酸第二鉄１２２．５ｍｇ／Ｌ）は沈殿を引き起こし、これが培養培地にダメージを与える（Bertheussen）。
３． トランスフェリンまたは親油性キレート剤の非存在下では、低い鉄濃度（それぞれ０．１〜１０ｍｇ／Ｌおよび０．２ｍｇ／Ｌ）においては、振盪培養ではハイブリドーマ細胞は増殖せず、また骨髄腫細胞は全く増殖しないであろう（ＷＯ９４／０２５９２）。
４． 親油性キレート剤は、低い鉄濃度での振盪培養においてはハイブリドーマおよび骨髄腫細胞の増殖を可能にするために培地中に必要である（ＷＯ９４／０２５９２）。
５． 低い鉄濃度をある種の哺乳動物細胞の増殖のために用いることができるが、それはＥＤＴＡのような含窒素キレート剤の使用を伴う場合にのみ可能である（ＷＯ９８／０８９３４）。
【００３１】
細胞培養の分野では、特定の細胞タイプ同士が類似の栄養特性を共有することが重視される。骨髄腫細胞およびハイブリドーマ細胞の両者が、他の細胞タイプは必ずしも示さない顕著な特性（例えばグルタミン要求性）を共有することは特筆すべきである（Bebbington ら、Biotechnology 10:169-175, 1992）。ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞が多くの項目において同様に反応するという事実は、ある程度は驚くべきことでもなく、なぜならハイブリドーマ細胞株は骨髄腫細胞と抗体産生Ｂリンパ球との融合により作り出されるからである（Kohler および Milstein, Nature 256:495-497, 1975）。
【００３２】
上述した先行技術では、ハイブリドーマ細胞および骨髄腫細胞が、トランスフェリンまたは親油性もしくは含窒素キレート剤の非存在下で簡単な鉄担体（例えばクエン酸）を有する培地中に存在する鉄を使用する能力が、例えばＣＨＯ細胞の、対応する能力とは異なっていることが示されている。先行技術の総合的な内容は、ハイブリドーマ細胞および骨髄腫細胞はトランスフェリン不含培養培地中の鉄を使用する能力において同様である、というものである。
【００３３】
特に静置培養における、ハイブリドーマ細胞タイプの増殖のためのトランスフェリン不含培地の開発に時間と努力が費やされてきていることは、上述したように文献から明らかである。この点において、骨髄腫細胞はハイブリドーマ細胞と同じ要求を示すであろうという先行技術に暗示された仮定に基づいて、骨髄腫細胞には同等の努力はなされてきていない。
【００３４】
何年にもわたって、ハイブリドーマ細胞および骨髄腫細胞培養の分野は明らかに、トランスフェリンの代替物として可溶性鉄化合物の形態の鉄の使用からは遠ざかってきており、その代わりに、低鉄濃度の利益を享受するために、親油性または含窒素キレート剤を培養培地中に含めなければならないことを確認してきた。もちろん、細胞が産生するように操作された産物のために該細胞を増殖させる目的で用いる培地中での、そのようなキレート剤の使用はまた、キレート剤で汚染されていないことを確実にするために産物をさらに処理することを必然的に伴う。したがって、培養培地中にそのようなキレート剤を含めることは、産物が純粋であることを示すのに要する時間を引き延ばすのみならず、「毒性」の鉄キレート剤が純粋な産物を汚染していないことを証明するための具体的なアッセイの開発を要することから、製造にかかる費用を増大させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
それゆえ、細胞増殖の継続を可能にするのに十分な鉄を提供しつつ、上記の沈殿ダメージをもたらさない濃度で、培養中のある種の細胞に簡単な形態で鉄を提供することがいまだ求められていることは明らかである。さらに有益なことは、トランスフェリンおよび親油性または含窒素キレート剤を含まない培地を得ることである。目標は、トランスフェリンを含む培地中で得られるのと等価な細胞培養を、トランスフェリンおよび親油性または含窒素キレート剤不含培地中で達成することである。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
ある種の細胞の増殖を支援するトランスフェリン不含培地を提供する必要を満たすために、本発明はとりわけ、鉄を含むがトランスフェリンまたは親油性もしくは含窒素キレート剤を含まない培地中で、振盪（攪拌）懸濁培養において骨髄腫細胞を培養する方法を提供する。本発明では、驚くべきことに、また先行技術で示唆されているのとは反対に、骨髄腫細胞の鉄要求性はハイブリドーマ細胞のものとは異なることを、骨髄腫細胞がハイブリドーマ細胞が必要とするよりも１００倍まで低い培地中鉄濃度において継続的な増殖を示すという予期せぬ結果と共に示す。本発明の方法のさらなる利点は、低鉄濃度の培地中で細胞を培養したときに得られる骨髄腫細胞産物の改善された力価により実証される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
上記に従って、本発明はその最初の態様において、骨髄腫細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の方法であって、以下のステップ：
（ａ） 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含有し、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである；および
（ｂ） 適切な条件下で、振盪懸濁培養を用いて、接種された培養培地を増殖させるステップ、
を含む方法を提供する。
【００３８】
この態様の一実施形態では、本発明は、骨髄腫細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の方法であって、以下のステップ：
（ａ） 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約０．２ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである；および
（ｂ） 適切な条件下で、振盪懸濁培養を用いて、接種された培養培地を増殖させるステップ、
を含む方法を提供する。
【００３９】
第二の態様において、本発明は、哺乳動物細胞産物を取得するための方法であって、前記産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を、前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能な培養培地中で培養すること、ここで前記培養培地は培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである；および前記哺乳動物細胞産物を回収すること、を含む方法を提供する。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は、骨髄腫細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を支援するための培養培地の使用であって、該培養培地は培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである使用を提供する。
【００４１】
本発明のこれらの態様の実施形態では、培地は培地中濃度約０．２ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌでクエン酸第二鉄アンモニウムを含む。
【００４２】
本発明では、培養培地は骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものである。「増殖を支援すること」とは、各継代において（すなわち、ある継代培養（subculture）から次にかけて）細胞数が少なくとも２倍、好ましくは３倍になることを伴う、複数回の継代培養にわたる細胞の継続的増殖を意味する。継代培養の回数は、本発明にとって本質的なものではなく、例えば行った実験の長さ、または産生される産物に依存する。本発明においては、一般的に細胞が少なくとも２回の継代培養にわたる、好ましくは少なくとも３回の継代培養にわたる継続的な増殖を示すことが好ましい。
【００４３】
骨髄腫細胞（他にはリンパ様細胞として知られる）は癌性リンパ球であり、典型的には通常の増殖条件下で無限分裂する。骨髄腫細胞タイプは、それらがモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製のための優秀な融合パートナーであるために有用である。近年、組換え遺伝子技術における宿主細胞としての骨髄腫細胞タイプの重要性が非常に顕著になってきている。このことは特に、グルタミン合成酵素選択マーカーの使用と共にする場合にあてはまり、これは永続的高産生組換え細胞株を作製するためのＮＳ０骨髄腫宿主と共に用いられる（Barnes ら Cytotechnology 32: 109-123, 2000）。
【００４４】
本発明では、いかなる骨髄腫細胞株でも、該培養培地中に用いることができることが期待される。一般的には、骨髄腫細胞株はマウス由来であることが好ましく、その場合、骨髄腫がＮＳ０細胞株またはＰ３シリーズ細胞株であることが特に好ましく、ＮＳＯ細胞株（例えばＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）であることが最も好ましい。他のマウス骨髄腫としては、ＭＯＰＣシリーズ、ＭＰＣ−１１、Ｊ５５８Ｌ、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５および４５．６．ＴＧ１．７が挙げられる。本発明の方法は、ラットおよびヒトの骨髄腫細胞タイプを培養するためにも用いることができる。本発明の方法での使用に適切なラット骨髄腫細胞株としてはＹ０およびＹが挙げられ、適切なヒト骨髄腫細胞株としては、ＨＴＫ、ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６Ｂ１が挙げられる。
【００４５】
骨髄腫細胞株がＮＳＯ細胞である場合、一般的には該細胞株をグルタミン合成酵素発現システムを用いて形質転換することが好ましい。
【００４６】
本発明の細胞培養培地は、トランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤のいずれも含まない。親油性キレート剤は、本発明の目的では、以下の２つの異なる性質を有するキレート剤として定義することができる：（１）疎水性であり、水または細胞培養培地にほとんど溶けないか、不溶性であり、そして多くの場合芳香族である、および（２）負に荷電した領域を有し、ここで正に荷電した鉄イオンとの静電的相互作用を介して鉄を「結合」させる。親油性キレート剤の例は、トロポロンおよびニトロプルシドナトリウムである。本発明の目的では、合成含窒素キレート剤はその構造中に少なくとも１個の窒素原子を含む鉄結合化合物として定義することができる。そのような化合物は疎水性でも親水性でもよい。この点において、「合成」とは、含窒素キレート剤が天然に存在するものではない、すなわち、それらは通常自然界には見出すことができないことを意味する。天然に存在する含窒素キレート剤で合成的に生成されたものはこの定義には包含されず、本発明の方法および使用から除外されない。そのような合成含窒素キレート剤としては、これに限られないが、以下のような化合物が含まれる：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）；デスフェロキサミンメシレート；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）。親油性と合成含窒素キレート剤の両方でありうる化合物も、本発明の方法および使用から除外される。
【００４７】
培地がトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まず、上述の濃度で鉄を含む限りは、そして培地が上記で定義したように骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能である限りは、培地の厳密な組成は本発明にとって重要ではない。
【００４８】
典型的には、細胞培養培地は、アミノ酸、ビタミン類、有機ならびに無機塩類および糖類の供給源を含有するであろう。これら増殖のための必須要素を提供することが可能な化合物は市販されており、細胞増殖のための培地にそれらを組み込むことは、当該技術分野で利用可能な情報に基づいて、当業者の技能の範囲内である。
【００４９】
一般的には、細胞培養培地は公知の基礎培地またはその派生物であって哺乳動物細胞の継続的な増殖を支援するものであることが好ましい。そのような基礎培地は市販されている。適切な基礎培地（本発明の培地を提供するために添加物を加えられてもよい）の例としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地およびロズウェル・パーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）が挙げられる。
【００５０】
本発明の培地は、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含、または化学的組成が明らかなものであってもよい。
【００５１】
あるいはまた、細胞培養培地は継続的増殖に必要な特定の成分の配合により、原則から作製してもよい。
【００５２】
特定の細胞タイプまたは細胞株のための細胞培養培地を調製するときには、基礎培地は、典型的にはその細胞タイプ／株の要求性に応じて改変されるかまたは添加物を加えられるであろう。添加物の選択は当業者の技能の範囲内であり、本発明の必須の態様を構成するものではない。典型的には、そのような添加物としては、脂質（例えばコレステロールおよび脂肪酸）、脂質前駆体（例えばエタノールアミン）、増殖促進因子もしくは調製因子（例えばインスリン）、微量元素（例えばセレン）、ポリマー（例えばプルロニックＦ−６８）およびグルタミン（グルタミン依存性細胞タイプの場合）が挙げられる。
【００５３】
本発明の使用に好適となるように、上述の濃度で培地に鉄を提供する目的で鉄供給源を添加することができる培地の一例は、Qi ら（Cytotechnology 21:95-109 (1996)）により記載されたＣＤＳＳに基づく細胞培養培地である。この培地は改変ＣＤＳＳとして知られ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Gibco BRL.、１×液体、カタログ番号２１３３１）に基づき、以下のものを添加する：ＧＳ添加物（JRH、カタログ番号５８６７２）、４０ｍｌ／Ｌ；クリーブランド微量元素Ｉ（Cellgro、９９−１７５）、０．５ｍｌ／Ｌ；クリーブランド微量元素ＩＩ（Cellgro、９９−１７６）、１ｍｌ／Ｌ；硫酸亜鉛、２μＭ；亜セレン酸ナトリウム、５０ｎＭ；エタノールアミン、２０μＭ；プルロニックＦ６８、１ｇ／Ｌ；炭酸水素ナトリウム、１．３ｇ／Ｌおよび２Ｍ塩酸、３．６ｍｌ／Ｌ。該培地はまた、グルタミン非依存的増殖が不可能な細胞株に対しては６ｍＭグルタミンを、またＮＳ０細胞株に対してはコレステロール脂質濃縮物（Gibco、カタログ番号００−００６１）２ｍｌ／Ｌを含む。
【００５４】
本発明の細胞培養培地は、培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含む。好ましい実施形態では、培養培地中の鉄供給源は可溶性鉄化合物である。用いる可溶性鉄化合物の量は、培地に対してその濃度の鉄を提供するのに十分であるべきであり、培地中の鉄の量がその範囲内である限りは、細胞の増殖を支援するのにちょうど十分であるべきである。培地中の可溶性鉄化合物の厳密な濃度は、用いる具体的な可溶性鉄化合物および用いている細胞株ならびに／または存在する他の培地成分に依存して変わりうる。適切な濃度は、直接的な方法で、例えば慣例的な操作に従った小規模実験（例えば特定の細胞株を用いた特定の培地中での該可溶性鉄化合物に対する用量反応）の実施により決定することができる。
【００５５】
本発明では、培地中の鉄（好ましくは可溶性鉄化合物により提供される）の濃度は、約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約２．４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは約０．０６４ｍｇ／Ｌ〜約１．６ｍｇ／Ｌおよび最も好ましくは約０．１６ｍｇ／Ｌ〜約０．３２ｍｇ／Ｌである。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、培地中の鉄の供給源は可溶性鉄化合物である。適切な可溶性鉄化合物は水または細胞培養培地に可溶性であるが、有機溶媒中には限られた溶解度を示す。そのような化合物は当業者に対して市販されており、当業者にとっては溶解度の測定は容易である。
【００５７】
本発明はまた、鉄供給源がトランスフェリンまたは親油性もしくは合成含窒素キレート剤の非存在下に細胞の継続的増殖を可能にするのに十分な鉄を提供することができる限りにおいては、いずれの代わりの鉄供給源の使用をも予想するものである。
【００５８】
鉄の準備のための、したがって本発明での使用のための適切な可溶性鉄化合物としては、第二鉄および第一鉄塩またはそれらの簡単なキレートが挙げられる。本明細書中で用いる「簡単なキレート」は、上述の親油性または合成含窒素キレート剤を含まないことに注意すべきである。「簡単なキレート」の語句は、本明細書中では、先行技術のいくつかの場面中の「簡単な鉄担体」の語句の使用と同様に用いる。
【００５９】
第二鉄もしくは第一鉄塩またはそれらの簡単なキレート（本発明の方法および使用のための培養培地中で鉄供給源となりうるもの）の例としては、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、および第二鉄アンモニウム化合物が挙げられる。本発明の使用のために好ましいものは、第二鉄アンモニウム化合物である。本発明の使用に適切な具体的な第二鉄アンモニウム化合物としては、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムが挙げられる。本発明の使用のために最も好ましいのは、クエン酸第二鉄アンモニウムである。
【００６０】
本発明の培地は２以上の鉄供給源（例えば適切な鉄含有化合物の混合物）を含んでもよいが、一般的には、該鉄供給源が可溶性鉄化合物である場合には、培地中のそのような化合物は１種類のみであるのが好ましい。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、可溶性鉄化合物はクエン酸第二鉄アンモニウムである。典型的には、本実施形態では、また約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌの範囲で培地に鉄を提供するためには、クエン酸第二鉄アンモニウムを約０．２ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．２ｍｇ／Ｌ〜約１５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは約０．４ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌおよび最も好ましくは約１ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌの濃度で用いるであろう。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、培養培地は第二鉄アンモニウム化合物を含有する。本発明の結果では、そのような第二鉄アンモニウム化合物（特にクエン酸第二鉄アンモニウム）が、例えばクエン酸第二鉄よりも細胞によってより効率よく用いられることが実証されている。特に、クエン酸第二鉄を用いる場合、これは同等な培養培地中に第二鉄アンモニウム化合物の濃度の１０倍で存在しなければならない。このことは、本発明の図１および図２により示され、これによれば少なくとも３回の継代にわたる継続的な細胞増殖のためには、クエン酸第二鉄は少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度で存在しなければならないが、クエン酸第二鉄アンモニウムは０．２ｍｇ／Ｌの濃度で同様のレベルの増殖をもたらすことが明らかである。より低い鉄濃度で抗体力価が最大となることも注目に値する。
【００６３】
本発明の細胞培養培地は、標準的な操作によって個々の成分を適切に混合することにより調製することができる。培地はまた、例えば液体状、または使用の前に再構築するための乾燥粉末培地のように様々な形状で調製してもよい。本発明の培養培地は、適切な条件で保存したときに安定である。
【００６４】
したがって、本発明はまた、骨髄腫細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を支援することが可能な細胞培養培地の調製のための方法であって、前記培地は培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まず；その個々の成分を混合すること、を含む方法を提供する。
【００６５】
本発明の細胞培養培地は、種々の培養条件での使用に適切である。よって、培地は単層培養および懸濁培養、特に振盪懸濁培養での骨髄腫細胞株の増殖を維持することができる。振盪懸濁培養とは、培養培地中の細胞の均一な懸濁を振盪力によって助ける細胞培養として定義することができる。振盪力を加える方法は当該技術分野で公知であり、例えば機械的振盪インペラーおよび／またはバイオリアクター培養に対する気体の分散、ならびに往復式振盪プラットホーム上に細胞培養フラスコを維持することを含む。本発明の培地は、振盪懸濁培養の、すなわち好適な振盪培養容器（例えば振盪タンクまたはエアーリフト発酵器）を用いた懸濁での、公知の培養技術による細胞培養に特に適している。
【００６６】
したがって、本発明はまた、骨髄腫細胞株の振盪懸濁培養における増殖を支援することが可能な培養培地であって、培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含み、トランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まない培地を提供する。
【００６７】
先行技術では、骨髄腫細胞とハイブリドーマ細胞は、培養培地中で鉄と出会ったときに同様の要求性を有すると教示されてきた。本発明者の結果は、そうではないことを示唆している。図３は、クエン酸第二鉄アンモニウムを含有する培養培地中でのハイブリドーマ細胞株の増殖を例示している。この図から見て取れるように、ハイブリドーマ細胞の増殖は当該分野での予測に対応する、すなわち、高濃度のクエン酸第二鉄アンモニウム（５０ｍｇ／Ｌおよび１００ｍｇ／Ｌ）では細胞は良好に増殖するが、この可溶性鉄化合物のより低い濃度（１０ｍｇ／Ｌ未満）ではそうならない。これを図１（同等の濃度の可溶性鉄化合物を有する培地中での骨髄腫細胞の増殖を示す）と比較した場合、ハイブリドーマ細胞は、同様の増殖のためには骨髄腫細胞よりも培地中に約１００倍多くの鉄を必要とすることが明らかである。
【００６８】
本発明の方法のさらなる利点は、骨髄腫細胞を低鉄含有培地中で培養した場合、すなわち細胞株を本発明の方法に従って培養した場合の骨髄腫細胞産物の改善された力価である。後述の実施例では、培地中の鉄濃度が低い（例えば０．０３ｍｇ／Ｌ〜３．２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１６ｍｇ／Ｌ〜０．３２ｍｇ／Ｌである）場合に、骨髄腫細胞産物の力価が予想外に高いことを示している。
【００６９】
本発明に従って得られうる細胞産物には、培養哺乳動物細胞により産生されるいかなる産物をも含む。典型的には、産物としては、例えばポリペプチドおよびタンパク質、例えば免疫グロブリン（例えばモノクローナルおよび組換え抗体ならびにその断片）、ホルモン（例えばエリスロポエチンおよび成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン））、リンホカイン（例えばインターフェロン）、インターロイキン（例えばインターロイキン２、４、５および６）および工業上または治療上有用な酵素（例えば組織プラスミノゲンアクチベーター）が挙げられる。前記細胞産物を産生できるようにするための、遺伝子組換え技術による骨髄腫細胞の操作の方法は、当該技術分野において汎用されており、通常利用可能である。
【００７０】
細胞産物を取得する目的で、そのような産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を本発明の培地中で培養する。増殖の条件は、例えば用いる細胞株および産生される産物に依存するであろうが、当該技術分野で利用可能な知識を用いて容易に決定されるであろう。
【００７１】
この目的で、本発明はまた、培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含む培養培地の使用であって、前記培地は哺乳類細胞産物の調製のためにトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まない使用を提供する。
【００７２】
骨髄腫細胞および／または培養培地より生成される細胞産物の単離の方法は、当該技術分野で周知であり、通常の操作のうちである。
【００７３】
本明細書中で言及するすべての引用文献は、その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる。本発明は上記の実施形態と関連して記載されているが、上記の記載および以下の実施例は説明のためのものであり本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内での他の態様、利点および改変は、本発明が関連する技術分野の当業者には明らかであろう。
【実施例１】
【００７４】
０．２ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム（ＦＡＣ）は、ＧＳ−ＮＳ０細胞株の継続的増殖を支援することができる
方法
グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現システム（欧州特許明細書第２５６０５５０号）を用いてヒトＩｇＧ抗体を発現する組換えＧＳ−ＮＳ０マウス骨髄腫細胞株（細胞株Ａ）（キレート化鉄供給源を含む独自の無血清培地（ＧＳＦ培地）中であらかじめ継代培養した）を遠心し、キレート剤不含培地中に再懸濁した。この培地に再懸濁した細胞をその後、接種密度２×１０５細胞／ｍｌで実験用フラスコに接種するのに用いた。
【００７５】
実験は、通気孔付きの蓋を取り付けた２５０ｍｌアーレンマイヤーフラスコ（使用容量２０〜５０ｍｌ）を用いて、往復式振盪器中にて３６．５℃、１２５ｒｐｍで、５％ＣＯ２／９５％大気雰囲気下、湿度７５％でインキュベートして行った。
【００７６】
改変ＣＤＳＳ培地を含有する個々のフラスコにＦＡＣのストック溶液を添加して、フラスコが終濃度０．２、０．４、１、２、１０、５０および１００ｍｇ／ＬでＦＡＣを含有するようにした。ＦＡＣのストック溶液は、水中に０．５ｍｇ／Ｌ（ＦＡＣを０．２〜２ｍｇ／Ｌ含有するフラスコに対して）および２５ｍｇ／Ｌ（ＦＡＣを１０〜１００ｍｇ／Ｌ含有するフラスコに対して）の濃度で調製した。ストック溶液は、フラスコへの添加の前にフィルター滅菌した。
【００７７】
１ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリンおよび０．１ｍｇ／ＬのＦＡＣを添加した改変ＣＤＳＳ培地を含有するフラスコを、陽性対照として含めた。トランスフェリンまたはＦＡＣ添加物を含まない改変ＣＤＳＳ培地を含有するフラスコは、陰性対照として含めた。すべてのフラスコに、コレステロール供給源として２ｍｌ／Ｌのコレステロール脂質濃縮物（Gibco）を添加した。コレステロール脂質濃縮物は、シクロデキストリンと複合体化したコレステロールおよび脂肪酸のエマルジョンである。
【００７８】
接種物からのキレート化／貯蔵鉄の持ち越しの影響を最小限にするために、フラスコを３回継代培養した。フラスコは、新しい培地で２×１０５細胞／ｍｌまで希釈することにより３日おきに継代培養した。３回目の継代培養において、フラスコを、低生存率に達するまで完全な増殖サイクルを行わせた（これはしばしば過剰増殖（overegrow）と呼ばれる）。Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ Ｃｅｄｅｘ細胞計数器を用いて細胞計数を行った。抗体力価を、均一ＩｇＧ標準を基準としてサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００７９】
結果
図１ａには、試験したＦＡＣ濃度範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度を示している。この図では、陰性対照培養は１回目の継代培養を越えて増殖することができなかったことが明らかに示されている。０．２ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では、最初の分裂後に増殖することが可能であったが、その後それ以上は増殖することができなかった。これらの培養物が当初の接種後に増殖することが可能であったという事実はおそらく、細胞分裂により枯渇することが避けられない鉄の細胞貯蔵の結果であろう。
【００８０】
図１ａにはまた、０．４ｍｇ／Ｌおよびそれより高い濃度で、数回の継代培養にわたる、および過剰増殖培養の間の、継続的な細胞増殖を支援しうることが明らかに示されている。図１ｃでは、この実験の重複実験において、０．２ｍｇ／ＬのＦＡＣ濃度で継続的細胞増殖を支援することができたことが示されている。
【００８１】
図１ｂには、二重実験の１番目のものからの、過剰増殖培養についての細胞数および抗体産生データが示されている。この図では、トランスフェリン含有対照と同等の増殖（最大生存細胞数および増殖曲線下面積に関して）を、１ｍｇ／Ｌおよびそれより高いＦＡＣ濃度で達成したことを示している。このことは、閾値レベル（１ｍｇ／Ｌ）に達した後では、増殖はＦＡＣ濃度の大きい範囲とほとんど同等であることを示唆している。しかしながら、１０ｍｇ／ＬのＦＡＣ濃度では、少量のさびのような着色沈殿物が観察された。５０ｍｇ／Ｌおよび１００ｍｇ／Ｌではこの沈殿物はもっと多量に見られた。この沈殿物はおそらく、Bertheussen により注意を促された水酸化鉄である（Cytotechnology 11: 219-231, 1993）。
【００８２】
図１ｂにはまた、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された抗体力価が示されている。これは、トランスフェリン含有対照と比較した場合に、ＦＡＣを含有する培養が少なくとも同じ程度の、多くの場合には顕著に多い抗体を産生したことを示している。ＦＡＣ含有培養で得られた抗体力価はまた、ＦＡＣ濃度と反比例の関係を示し、例えば０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では１００ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養よりも３０％を超えて多くの抗体を産生した。
【実施例２】
【００８３】
ＧＳ−ＮＳ０細胞株の継続的増殖を支援するためには、クエン酸第二鉄（ＦＣ）はＦＡＣよりも１桁高い濃度で必要とされる
方法
実施例２の方法はキレート化鉄の供給源のみを除いて実施例１のものと同一である。本実施例では、ＦＡＣの代わりにクエン酸第二鉄（ＦＣ）を用いた。
【００８４】
ＦＣは冷水にはゆっくりとしか溶解しない。したがって、ＦＣのストック溶液を調製するためには、２時間までの間、振盪しながら８０℃に保った水にＦＣを溶かすことが必要であった。ストック溶液は０．５ｍｇ／Ｌ（０．２〜２ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有するフラスコに対して）および１０ｍｇ／Ｌ（１０〜１００ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有するフラスコに対して）の濃度で調製した。
【００８５】
結果
図２ａには、試験したＦＣ濃度の範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度が示されている。これは、陰性対照培養および０．２ｍｇ／ＬのＦＣを含有する培養では１回目の継代培養を越えて増殖することができなかったことを示している。０．４、１および２ｍｇ／ＬのＦＣを含有する培養は、２回目の継代培養を越えて増殖することができなかった。したがって、試験した濃度では、数回の継代培養にわたる、および過剰増殖培養の間の継続的細胞増殖を支援するためには、１０ｍｇ／Ｌかそれより高い濃度でＦＣが必要である。
【００８６】
図２ｂには、過剰増殖培養についての細胞数および抗体産生が示されている。この図では、トランスフェリン含有対照と同等の増殖（最大生存細胞数および増殖曲線下面積に関して）を、１０ｍｇ／Ｌおよびそれより高いＦＣ濃度で達成したことを示している。ＦＡＣと同様に、１０ｍｇ／Ｌおよびそれより多くのＦＣを含有する培養では、少量のさびのような着色沈殿物が観察された。
【００８７】
図２ｂにはまた、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した抗体力価が示されている。これは、トランスフェリン含有対照と比較した場合に、ＦＣを含有する培養が、少なくとも同じ程度の、１０ｍｇ／ＬのＦＣの場合には顕著に多くの抗体を産生したことを示している。ＦＡＣで見られたのと同様に、最も低い濃度のＦＣが最も高い力価をもたらした。
【００８８】
この結果は、トランスフェリンで観察されたのと同等の細胞増殖を支援するためには、ＦＣはＦＡＣより１０倍高い濃度で必要であることを示している。
【実施例３】
【００８９】
振盪懸濁培養において継続的な細胞増殖を得るためには、ハイブリドーマ細胞株はＧＳ−ＮＳ０細胞株よりも２桁を超えて高い濃度のＦＡＣを必要とする
方法
実施例３の方法は、以下の点を除いて実施例１のものと同一である：
抗Ｍｙｃ抗体産生マウスハイブリドーマ細胞株（９Ｅ１０）（１ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリンおよび６ｍＭのグルタミンを添加した改変ＣＤＳＳ中であらかじめ継代培養した）を、接種密度１×１０５細胞／ｍｌで実験用フラスコに接種するのに用いた。
【００９０】
実験は、密閉した蓋を取り付けた２５０ｍｌアーレンマイヤーフラスコを用いて、往復式振盪器中にて３６．５℃、１２５ｒｐｍでインキュベートすることにより行った。フラスコには、当初および２日おきに５％ＣＯ２／９５％大気を通した。
【００９１】
このハイブリドーマ細胞株はコレステロールを要求しないので、フラスコにはコレステロール脂質濃縮物を添加しなかった。
【００９２】
フラスコは、新しい培地で１×１０５細胞／ｍｌまで希釈することにより３日おきに継代培養した。３回目の継代培養において、フラスコを過剰増殖させた。トリパンブルー排除法を用いて細胞計数を行った。
【００９３】
結果
図３ａには、試験したＦＡＣ濃度の範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度が示されている。これは、陰性対照培養ならびに０．２および０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では１回目の継代培養を越えて増殖することができなかったことを示している。１、２および１０ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では２回目の継代培養を越えて増殖することができなかった。したがって、試験した濃度では、増殖を支援するためには５０ｍｇ／Ｌまたはそれより高い濃度でＦＡＣが必要とされる。
【００９４】
図３ｂには、過剰増殖培養の細胞数が示されている。この図では、トランスフェリン含有対照と同等の増殖（最大生存細胞数に関して）を得るためには、１００ｍｇ／ＬのＦＡＣが必要であることが示されている。しかしながら、増殖について、増殖曲線下面積の積分（直角四辺形に近似させた面積の合計から計算した）または累積細胞時間（ＣＣＨ）に関して考えると、トランスフェリン含有対照と同等の増殖は、５０ｍｇ／ＬのＦＡＣにおいて観察される。このことは、最大ＣＣＨを示した棒グラフ（図３ｃ）において明らかに示されている。前に見られたのと同様に、５０および１００ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では、さびのような着色沈殿物が見られた。
【００９５】
この結果は、振盪懸濁培養での継続的細胞増殖のためには、ハイブリドーマ細胞株はＧＳ−ＮＳ０細胞よりも１００倍を超えて高い濃度でＦＡＣを必要とすることを示している。
【実施例４】
【００９６】
細胞増殖の支援および抗体力価を高レベルにすることが可能な栄養豊富な培地中に用いる場合、ＦＡＣは有効な鉄供給源である
実施例４では、鉄の供給源としてのＦＡＣの有用性についてさらに示す。本実施例では、第２の抗体産生組換えＧＳ−ＮＳ０細胞株（細胞株Ｂ）を用いて、ＧＳＦとして知られる独自の無血清培地（唯一規定されていない成分としてウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含有する）中の唯一の鉄供給源としてＦＡＣを用いた。
【００９７】
方法
１０μＭトロポロン（親油性鉄キレート剤［ＷＯ９４／０２５９２参照］）および０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣを鉄供給源として含有する独自の無血清培地中であらかじめ培養した細胞を遠心し、トロポロンおよび鉄不含ＧＳＦ無血清培地中に再懸濁した。この培地に再懸濁した細胞を、その後、接種密度２×１０５細胞／ｍｌで実験用フラスコに接種するのに用いた。
【００９８】
実験は、密閉した蓋を取り付けた２５０ｍｌアーレンマイヤーフラスコ（使用容量５０ｍｌ）を用いて、往復式振盪器中にて３６．５℃、１２５ｒｐｍでインキュベートすることにより行った。フラスコには、当初および２日おきに５％ＣＯ２／９５％大気を通した。
【００９９】
ＧＳＦ（トロポロンおよび鉄不含）培地を含有する個々のフラスコに、ＦＡＣの１ｍｇ／ｍｌストック溶液を添加して、フラスコが終濃度０．２、０．４、０．８、１．２、１．６および２ｍｇ／ＬでＦＡＣを含有するようにした。ストック溶液は、フラスコに添加する前にフィルター滅菌した。５μＭトロポロンおよび０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣ（トランスフェリンと等価であることがあらかじめ示された）を添加した培地を含有するフラスコを陽性対照として含めた。
【０１００】
すべてのフラスコには、１ｍｌ／Ｌの１０００倍濃縮コレステロールおよび脂肪酸添加物（ＣＬＯＣ）も添加した。
【０１０１】
フラスコは、新しい培地で２×１０５細胞／ｍｌまで希釈することにより５日おきに継代培養した。２回目の継代培養において、フラスコを飽和するまで過剰増殖させた。トリパンブルー排除法を用いて細胞計数を行った。抗体力価解析は、均一標準を基準として分析的プロテインＡ ｈｐｌｃを用いて行った。
【０１０２】
結果
図４には、試験したＦＡＣ濃度の範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度が示されている。この図では、０．８ｍｇ／Ｌおよびそれより高い濃度でＦＡＣを含有する培地では、陽性対照培養で見られるのと同等の増殖を支援することができたことが示されている。図４ではまた、過剰増殖培養での抗体産生についても示されている。これは、０．８ｍｇ／Ｌおよびそれより多いＦＡＣでは、対照と少なくとも同等の抗体産生を支援することができることを示している。抗体産生での傾向は、実施例１および２で見られたものとも非常に似通っている。
【０１０３】
この結果は、細胞増殖の支援および抗体力価を高いレベルにすることが可能な栄養豊富な培地中で用いる場合、ＦＡＣが有効であることを示している。
【実施例５】
【０１０４】
鉄供給源としてＦＡＣを含有する培地は、小規模産生系での増殖および抗体産生を支援することができる
方法
細胞株Ｂの発酵は、５μＭトロポロンおよび０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣ（対照）、または１．０ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有するＧＳＦ無血清培地を用いて行った。発酵は、半球型底部を備える７Ｌ（使用容量４．５Ｌ）Ａｐｐｌｉｋｏｎ発酵器中で、海洋用インペラーを用いて１５０ｒｐｍで振盪して行った。発酵は３６．５℃、ｐＨ７．１にて操作し、溶解酸素圧１５％を維持するために大気／酸素を分散した。
【０１０５】
これらの発酵物に対する接種物は発酵で用いたのと同じ培地中の細胞の継代培養から提供した。
【０１０６】
結果
図５には、攪拌・気体分散発酵容器中で、５μＭトロポロン／０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣ（対照）または１ｍｇ／ＬのＦＡＣのいずれかを添加した培地を用いた場合には、同様の細胞増殖および産生特性が見られたことが示されている。
【０１０７】
この結果は、小規模産生系での鉄供給源としてのＦＡＣの有用性を実証するものである。
【実施例６】
【０１０８】
ＦＡＣは無タンパク質培地での高細胞密度までの増殖および高力価の産生を支援することができる
方法
それぞれ１ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する無血清ＧＳＦ（タンパク質［ＢＳＡ］含有）および無タンパク質ＧＳＦ培地との比較を、細胞株Ａ（実施例１参照）の攪拌・気体分散・流加（fed batch）発酵を用いて行った。無タンパク質発酵には、２ｍｌ／Ｌのコレステロール脂質濃縮物（実施例１参照）を添加し、また無血清発酵には１ｍｌ／ＬのＣＬＯＣ添加物（実施例４参照）を添加した。発酵条件は実施例５に記載したのと同様とした。これら発酵物に対する接種物は発酵で用いたのと同じ培地中の細胞の継代培養から提供した。
【０１０９】
結果
図６には、２種類の発酵物での増殖および抗体産生が示されている。この図では、ＦＡＣが両方の培地での良好な増殖および抗体産生を支援することができることが明らかに示されている。
【０１１０】
この結果は、タンパク質含有（すなわち無血清）および無タンパク質培地の両方での高細胞密度までの増殖および高力価の産生を支援するＦＡＣの能力を実証するものである。
【実施例７】
【０１１１】
無タンパク質培地中のＦＡＣは高細胞密度までの増殖および高力価の産生を支援することができる
以下の実施例では、実施例６の無タンパク質培地中の唯一の鉄供給源としてＦＡＣを用いることができること、およびこのＦＡＣ添加培地が一定範囲のＧＳ−ＮＳＯ細胞株について、かつ工業生産規模での高細胞密度および高力価までの増殖を支援することができることを示す。
【０１１２】
方法
異なる抗体を発現する３種類のＧＳ−ＮＳＯ細胞株（細胞株Ｃ、ＤおよびＥ）を、液体窒素貯蔵から、実施例６の無タンパク質・ＦＡＣ含有培地中に直接的に復活させた。培養を無タンパク質ＦＡＣ含有培地中で複数回継代培養し、これらの培養を実験室規模（４．５Ｌ）または試験的規模の流加発酵に接種するのに用いた。これらの流加発酵に用いた培地および栄養分は、高抗体力価をもたらすように最適化した。
【０１１３】
細胞株Ｃは４．５Ｌおよび１００Ｌ規模の両方で、細胞株Ｄは４．５Ｌ規模で、そして細胞株Ｅは１００Ｌ規模で増殖させた。
【０１１４】
結果
図８Ａには、４．５Ｌ発酵での細胞株Ｃの増殖および抗体産生が示されている。図８Ｂには、１００Ｌ発酵での細胞株Ｃの増殖および抗体産生が示されている。図９および図１０には、４．５Ｌ発酵での細胞株Ｄおよび１００Ｌ発酵での細胞株Ｅの増殖および抗体産生がそれぞれ示されている。
【０１１５】
これらの図では、無タンパク質ＦＡＣ培地が、広範囲の細胞株にわたって、また工業生産規模での、良好な増殖および抗体産生性を支援することが明らかに示されている。
【０１１６】
これらの結果は、化学的組成が明らかな、タンパク質および動物成分不含培地において、広範囲の細胞株の増殖および抗体産生を支援するＦＡＣの能力を示している。このことは、これが動物由来化合物からの外来性感染性因子の導入のリスクを排除しうるので、ヒトの治療的使用のための抗体の使用における重要性を有する。
【実施例８】
【０１１７】
ＦＡＣを唯一の鉄供給源として用いて増殖するＮＳ０の能力は、ＧＳ選択システムを用いた形質転換によるものではない
ヒト抗体を発現し、Ｇ４１８選択システムを用いて選択された組換えＮＳ０マウス骨髄腫細胞株を、ＧＳ選択システムの代替物を用いて形質転換したＮＳ０細胞の増殖を支援するＦＡＣの能力を評価するのに用いた。
【０１１８】
方法
１ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、０．１ｍｇ／ＬのＦＡＣおよび６ｍＭのグルタミンを含有するＧＳＦ無血清培地中で培養した細胞を、１ｍｇ／ＬのＦＡＣ、または１ｍｇ／Ｌのトランスフェリンおよび０．１ｍｇ／ＬのＦＡＣのいずれかを含有する新しいＧＳＦ無血清培地で２×１０５まで希釈することにより継代培養した。５日後、フラスコを継代培養し、そして完全な増殖サイクルを行わせた。実験は、密閉した蓋を取り付けた振盪用フラスコ中で、往復式振盪器中にて３６．５℃、１２５ｒｐｍでインキュベートして行った。フラスコには、当初および２日おきに５％ＣＯ２／９５％大気を通した。
【０１１９】
結果
両方の培地中で同等の増殖が見られ、このことは、ＦＡＣが代替選択システムを用いて形質転換したＮＳ０細胞の増殖を支援することが可能であることを示唆した。
【０１２０】
この結果は、ＦＡＣを唯一の鉄供給源として用いて増殖するＮＳ０の能力は、ＧＳ選択システムを用いた形質転換によるものではないことを実証している。
【実施例９】
【０１２１】
改変ＣＤＳＳ培地の調製
改変ＣＤＳＳは以下のように調製した：
マグネチック・スターラーを用いて振盪されているＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Gibco BRL.、１×液体、カタログ番号２１３３１）１Ｌに対して、以下の成分を順番に加え、それぞれが次のものを加える前に完全に溶解していることに注意した：
・１ｇ プルロニックＦ−６８（Sigma Ｐ−１３００）
・５０ｎＭ 亜セレン酸ナトリウム無水物（Sigma Ｓ−５２６１）（２５μＭストック溶液から）
・２μＭ 硫酸亜鉛７水和物（Sigma Ｚ−０２５１）（２ｍＭストック溶液から）
・０．５ｍｌ クリーブランド微量元素Ｉ（Cellgro ９９−１７５）
・１ｍｌ クリーブランド微量元素ＩＩ（Cellgro ９９−１７６）
・２０μＭ エタノールアミン（Sigma Ｅ−０１３５）
・４０ｍｌ ＧＳ添加物（JRH Biosciences ５８６７２）
・１．３ｇ 炭酸水素ナトリウム（(BDH １０２４７５Ｗ）
・３．６ｍｌ ２Ｍ塩酸（BDH １９０６７５Ｔ）
グルタミン依存性細胞株のみに対して：
・０．８８ｇ グルタミン（Sigma Ｇ−５７６３）
トランスフェリン含有対照培地のみに対して：
・０．１ｍｇ クエン酸第二鉄アンモニウム（BDH ２７１６３４Ｋ）（１ｍｇ／ｍｌ ストックから）
・１ｍｇ ヒトトランスフェリン（Serologicals Proteins ８２−３４９）
【０１２２】
培地を混合し、０．２μｍメンブレンを用いて濾過した。
【０１２３】
クエン酸第二鉄アンモニウムのような可溶性鉄化合物を、調製中のいずれかにおいて（すなわち他の成分と同時に）、または培地が調製し終わったときに、ストック溶液から上記の培地に対して加える。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１ａ】振盪懸濁培養条件下において種々の濃度のクエン酸第二鉄アンモニウムで増殖する骨髄腫細胞株の能力を示す。
【図１ｂ】種々の濃度のクエン酸第二鉄アンモニウムで増殖する骨髄腫細胞株により産生された抗体の量を示す。
【図１ｃ】図１ａおよび１ｂの実験の重複実験からの増殖データを示す。
【図２ａ】振盪懸濁培養条件下における種々の濃度のクエン酸第二鉄での骨髄腫細胞株の増殖を示す。
【図２ｂ】図２ａの実験で増殖させた細胞株の細胞数および抗体力価を示す。
【図３ａ】振盪懸濁培養条件下における種々の濃度のクエン酸第二鉄アンモニウムでのハイブリドーマ細胞株の増殖を示す。
【図３ｂ】図３ａの実験での細胞数を示す。
【図３ｃ】図３ａおよび３ｂのように増殖させた細胞株の数学的に計算した比較を示す。
【図４】振盪懸濁培養条件下における種々の濃度のクエン酸第二鉄アンモニウムの栄養豊富・無血清・トランスフェリン不含培地中での骨髄腫細胞株の増殖を示す。
【図５】振盪懸濁発酵増殖条件下における骨髄腫細胞株の増殖に必要な全ての鉄を供給するクエン酸第二鉄アンモニウムの能力を示す。
【図６】振盪懸濁発酵条件下における無タンパク質培地および無血清培地中での骨髄腫細胞株の増殖に必要な全ての鉄を供給するクエン酸第二鉄アンモニウムの能力を示す。
【図７】クエン酸第二鉄アンモニウムを唯一の鉄供給源として増殖する骨髄腫細胞株の能力がＧＳ選択システムを用いた形質転換によるものではないことを示す。
【図８】図８Ａでは実験室規模発酵でのクエン酸第二鉄アンモニウムを添加した無タンパク質培地中での別の骨髄腫細胞株の増殖を示す。図８ＢではＸ軸は時間を日で表し、Ｙ軸は生存細胞数（×１０５細胞／ｍｌ）を表す。
【図９】実験室規模発酵でのクエン酸第二鉄アンモニウムを添加した無タンパク質培地中でのまた別の骨髄腫細胞株の増殖を示す。Ｘ軸は時間を日で表し、Ｙ軸は生存細胞数（×１０５細胞／ｍｌ）を表す。
【図１０】１００Ｌ試験的規模流加発酵でのクエン酸第二鉄アンモニウムを添加した無タンパク質培地中でのまた別の骨髄腫細胞株の増殖を示す。Ｘ軸は時間を日で表し、Ｙ軸は生存細胞数（×１０５細胞／ｍｌ）を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鉄を含有する培養培地中であるがトランスフェリンまたは親油性もしくは合成含窒素キレート剤の非存在下に、ある種の哺乳動物細胞を増殖させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養培地は、管理され、人工的でかつｉｎ ｖｉｔｒｏの環境において細胞を維持および増殖させるのに必要な栄養素を提供しなければならない。細胞培養培地の個々の特性は、培養される細胞のタイプに大きく依存し、また培養の方法にはより小さな程度依存する。
【０００３】
哺乳動物細胞は、鉄に対する絶対的な要求性を有し、鉄はｉｎ ｖｉｔｒｏでは細胞培養培地中に供給される。Bertheussen（Cytotechnology 11:219-231, 1993）は、細胞培養培地に鉄の単塩を加えることでは哺乳動物細胞に対して有効に鉄を供給することはできず、それは主として迅速な酸化および鉄の沈殿により細胞に対する鉄の利用能が低下することによる、と述べている。
【０００４】
さらに、遊離型の鉄は高い酸化能を有し、このことは、細胞培養培地の成分の酸化をもたらしうる。それゆえ、この酸化能を低減させるかまたは取り除くように鉄を複合体（錯体）化することが有効であることが証明されている。
【０００５】
ｉｎ ｖｉｖｏでは、鉄は、鉄結合タンパク質であるトランスフェリンによって哺乳動物細胞に提示される。トランスフェリンは、鉄に結合し、細胞表面上のトランスフェリン受容体と相互作用することにより機能する。トランスフェリン−鉄複合体は、その後、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれる。細胞内に入ると、トランスフェリン−鉄複合体は壊れ、そして放出された鉄が鉄輸送タンパク質（フェリチン）と複合体化する。トランスフェリンは再利用される。Thorstensen および Romslo（Biochem. J., 271:1-10 (1990)）は、このｉｎ ｖｉｖｏ鉄輸送メカニズムについて秀逸な総説を提供している。細胞への鉄の輸送を仲介するトランスフェリンの能力は、細胞培養培地にトランスフェリンおよび鉄塩を単に添加することにより細胞培養に利用されてきた。
【０００６】
しかしながら、細胞培養培地に典型的に用いられるトランスフェリンは動物由来のものであり、近年では、細胞培養方法から動物由来のタンパク質を除くという規制的圧力が増大してきている。明らかに、動物由来のタンパク質の使用は、汚染物質および外来性の病原因子（例えばクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）または海綿状脳症（狂牛病））を導入する危険性を伴う。したがって、トランスフェリンに代わる鉄輸送体が求められ、適用されて種々の程度の成功を収めている。代わりとなる鉄輸送体についてのタイプおよび濃度は、多くの場合、培養される哺乳動物細胞のタイプに依存することが見出されてきている。
【０００７】
Kovar および Franek （Biotechnology Letters 9:259-264 (1987)）は、ハイブリドーマ細胞株の培養において、トランスフェリンの代わりに種々の可溶性鉄化合物（例えばクエン酸第二鉄）を用いることができることを実証した。Kovar および Franek は、５μＭ（１．２５ｍｇ／Ｌ）〜５ｍＭ（１２２５ｍｇ／Ｌ）の濃度範囲にわたって、２種類のハイブリドーマ細胞株の増殖を支援するクエン酸第二鉄の能力について調べた。より低い濃度の第二鉄化合物は、数種類の異なる細胞株（特にヒト白血病または上皮由来のもの）のための培養培地中での使用に好適であることが初期の先行技術において提案されていたが、Kovar および Franek は、クエン酸第二鉄がトランスフェリンと同等にハイブリドーマ細胞増殖を支援するためには、５００μＭ（１２２．５ｍｇ／Ｌ）の濃度が必要であったと報告している。Kovar および Franek は、５００μＭのクエン酸第二鉄を含有する培地は他のハイブリドーマ細胞株の培養に好適であること、およびいくつかの種類の骨髄腫細胞タイプの培養にも好適であることを見出した。
【０００８】
Eto ら（Agric. Biol. Chem. 55(3):863-865 (1991)）は、Kovar および Franek と同様の知見を報告している。彼らは、ハイブリドーマ細胞株に対する、１０ｍｇ／Ｌ〜６００ｍｇ／Ｌの濃度範囲にわたるクエン酸第二鉄の増殖刺激作用について調べた。彼らは３００ｍｇ／Ｌをさらなる研究に用いたと報告している。トランスフェリンを用いて達成したのと同等の増殖は、３００ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄を含有する培地に１０μＭの濃度でエタノールアミン（脂質前駆体）を加えたときに観察された。
【０００９】
同様の研究において、Toyoda および Inouye （Agric. Biol. Chem. 55(6):1631-1633 (1991)）は０〜５００μＭの濃度範囲にわたるクエン酸第二鉄を含有する培地中での３種類のハイブリドーマ細胞株の増殖について調べた。彼らは、調べた３種類のハイブリドーマ細胞株のうち２種類に対して、５０μＭ（１２．５ｍｇ／Ｌ）のクエン酸第二鉄が最適であることが見出されたと報告している。この結果は、Eto ら、ならびにKovar および Franek の知見と合致するが、但し３番目の細胞株に対しては５００μＭの濃度が最適であることが明らかとなった。
【００１０】
しかしながら、Kovar および Franek 、Toyoda および Inouye 、ならびにEto らの研究はすべて静置培養において行われたことに注意することが重要である。ＷＯ９４／０２５９２では、１０ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム（ＦＡＣ）は静置培養においてはハイブリドーマ増殖を支援しえたが、これは振盪懸濁培養には当てはまらなかったと報告されている。したがって、振盪懸濁培養において増殖する場合には、ハイブリドーマ細胞が鉄の最適使用を達成する能力は静置培養でのそれとは異なることが明らかである。
【００１１】
ＷＯ９３／００４２３には、無血清・無タンパク質培養培地に対する好適な鉄供給源である、可溶性鉄塩の鉄キレートおよびクエン酸アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属を含む培養培地添加物が記載されている。この出願の実施例は、主にＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞の増殖に関する。実施例５は骨髄腫細胞の増殖を実証することを意図するものであるが、用いたＳＰ２／０細胞は実際は非分泌性マウス／マウスハイブリドーマ細胞であることが注目される。培養条件は、全体を通して静置懸濁培養であるものとして述べてある。
【００１２】
Kovar および Franek は、５００μＭのクエン酸第二鉄を含有する彼らの培地が振盪懸濁培養に好適であったことを主張しているが、この主張を支持する証拠は示されていない。しかしながら、Qi ら（Cytotechnology 21:95-109 (1996)）は、５００μＭ（１２２．５ｍｇ／Ｌ）のクエン酸第二鉄を含有する培地（Kovar および Franek により記載されたのと同様）が、振盪懸濁培養において３種類のハイブリドーマ細胞株の培養に好適であったと報告している。しかし、Qi らは、これらの高濃度（５００μＭ）のクエン酸第二鉄を含有する培地を使用するためには、細胞をこの培地に切り替えさせることが必要であり；ある細胞株の場合には、この切り替え期間が非常に長引いた。Qi らは、これらの条件下では、細胞が適応するのは困難であること、および培地の処方は培地中のクエン酸第二鉄をより有効に鉄を提示する化合物（例えばアウリントリカルボン酸）と置換することにより改善しうるとの意見を述べている。
【００１３】
Kovar および Franek （1978）により引用された先行技術と一致して、数人の研究者が、あるタイプの哺乳動物細胞がより低い濃度の鉄化合物を用いた培養において維持可能であることが見出されていることを報告している。
【００１４】
Ramos らはＷＯ９２／０５２４６で、上皮細胞株の培養において、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株において、トランスフェリンを１０〜１００ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄（約０．６〜１６ｍｇ／Ｌの鉄を提供する）と置き換えうることを報告している。しかしながら、この特許出願では、該培地は骨髄腫細胞株の培養には適していないことが明らかとなったとはっきり述べられている。Keen らはＵＳ５，６３３，１６２で、クエン酸第二鉄、硫酸第一鉄およびクエン酸第二鉄アンモニウム（ＦＡＣ）を、ＣＨＯ細胞の培養においてトランスフェリンを置き換えるために０．２５〜５ｍｇ／Ｌ（０．０４〜０．８ｍｇ／Ｌの鉄と等価）の濃度で用いうることを報告している。
【００１５】
ＷＯ９８／０８９３４では、すべての動物タンパク質（すなわちトランスフェリンおよびインスリン）が置き換えられた代替培地が規定されている。トランスフェリンは硫酸第一鉄（含窒素キレート化合物にキレートされている）により、鉄に基づく濃度０．２８〜１１ｍｇ／Ｌ（１．１ｍｇ／Ｌが最適であることが見出された）で置き換えられている。好適であるとされている含窒素キレート化合物としては以下のものが挙げられる：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）；デスフェロキサミンメシレート；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）。これらのうちでは、ＥＤＴＡが最も好ましい。クエン酸第二鉄はＦｅＣｌ３−クエン酸ナトリウムの形態でも用いられたが、これは硫酸第一鉄７Ｈ２Ｏ−ＥＤＴＡキレートよりも高い濃度を必要とした。
【００１６】
この出願では、トランスフェリン不含培地が、哺乳動物細胞、特に上皮または線維芽細胞を増殖させるのに好適であるということについて述べている。ＣＨＯおよびヒト胎児腎細胞株２９３の増殖の事例が提供されている。
【００１７】
また、一定範囲の細胞タイプが、Neumannova ら（In vitro Cell Dev. Biol., 31:625-632 (1995)）により、１．２５ｍｇ／Ｌ（約０．２ｍｇ／Ｌの鉄）の低濃度のクエン酸第二鉄の形で鉄を含有する培地中での長期増殖についても調べられた。試験した１９種類の細胞株のうち、５種類のみがこの低鉄培地中での長期増殖が可能であった。５種類の細胞株とは、ジャーカット、Ｊ１１１およびＴＨＰ−１（ヒト白血病細胞株）、ＨｅＬａ（ヒト上皮細胞株）およびＸＣ（ラット肉腫）である。ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞株は調べたもののうちに含まれるが、どちらも低鉄培地中では増殖することができないことが見出された。
【００１８】
上述のように、低濃度の第二鉄化合物は、ある種の細胞タイプ（特に上皮およびヒト白血病由来のもの）のための培養培地で用いるのに好適である。しかしながら、トランスフェリン不含培地を用いた振盪懸濁培養でハイブリドーマ細胞を培養するためには、高濃度（例えば１２２．５ｍｇ／Ｌ付近）の鉄化合物が必要であることは、当該技術分野において広く同意されている。
【００１９】
しかしながら、先行技術ではまた、高濃度の鉄は有利ではないことも教示している。Bertheussen は Cytotechnology 11:219-231(1993)において、高濃度の鉄（例えば Kovar および Franek により提案された５００μＭのクエン酸第二鉄）は、これらの高い濃度が培地中の鉄水酸化物の急速な沈殿を引き起こすため、用いるべきではないと述べている。形成されたばかりの鉄水酸化物は他の金属および種々の有機分子を効率よく吸収し、したがって高濃度の鉄を含有する培地の組成および安定性は著しく害されるであろう。
【００２０】
培養中のある種の哺乳動物細胞（特にハイブリドーマ細胞）に鉄を送達することに関して直面する困難に鑑みて、鉄のキレート化（例えば親油性化合物への）のコンセプトが開発された。
【００２１】
鉄キレート剤は、典型的にはヘテロ環式化合物であり、キレート剤中の少なくとも２つの非金属イオンに対して配位結合により金属イオンが結合するものであって、それらは多数の規準（例えばその由来（合成かまたは生物学的に産生される分子か）、水などの溶媒との相互作用（疎水性または親水性）またはその化学量論的相互作用（六座配位のうちの二座配位））を用いて分類することができる。
【００２２】
親油性キレート剤は、２つの異なる性質を有する化合物である：（１）該化合物は疎水性であり多くの場合芳香族であるため、有機溶媒（例えばアルコール）への溶解性を示すが、水への溶解性は限られている；（２）該化合物はまた、典型的には負に荷電した領域を有し、ここで正に荷電した鉄イオンとの静電的相互作用を介して鉄を「結合」させる。細胞培養においては、そのような化合物は脂質に富む細胞膜に引き寄せられると考えられており、それゆえ細胞膜に、そしておそらくそれを介して「結合した」鉄を輸送し、したがって細胞への鉄の供給を促進するものと考えられている（ＵＳ５，０４５，４６８）。親油性キレート剤は、典型的には付随する鉄塩を上回る量を添加する。
【００２３】
親油性キレート剤の使用に関する最も初期の報告のうちの１つは Brock および Stevensen によるものであり（Immunology Letters 15:23-25, (1987)）、彼らはピリドキサルイソニコチノイルヒドラゾン（ＰＩＨ）をニトリロ三酢酸第二鉄とともに用いた。彼らは、ＰＩＨ：ニトリロ三酢酸第二鉄（２：１の比、ＰＩＨに基づいて４０μＭの濃度）が、マウスリンパ球細胞株の培養のためにトランスフェリンを置き換えうることを見出した。
【００２４】
Darfler （ＵＳ５，０４５，４６８／in Vitro Cell. Dev. Biol. 26:769-778, 1990）は、ハイブリドーマ細胞株の培養に好適な無タンパク質培地を報告している。この著者は、有機鉄化合物、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）をＥＤＴＡと共にそれぞれ５．７および５．５ｍｇ／Ｌの濃度で用いることによりトランスフェリンを置き換えうることを見出した。著者は、この培地を「ＡＢＣ培地」と名付けた。
【００２５】
Bertheussen （ＵＳ５０４５４６７／Cytotechnology 11:219-231 (1993)）は、アウリントリカルボン酸、親油性鉄キレート剤、および３μＭの第二鉄イオン（ＦｅＣｌ３の形で添加）を用いることにより、細胞培養培地中のトランスフェリンを置き換えうることを報告した。Bertheussen はこの培地を数種類の細胞タイプを用いて開発し、これが増殖の速いハイブリドーマ細胞株の培養に特に好適であることを見出した。
【００２６】
ＷＯ９４／０２５９２では、振盪懸濁培養中の細胞への鉄の提示におけるトランスフェリンの機能の代わりを務めるために、トロポロンを用いることが提案された。著者は、トロポロンを、付随する鉄を上回る量添加するべきであると述べている。鉄は、種々の鉄化合物を用いて第二鉄または第一鉄イオンとして提示されうるが、ＦＡＣを用いることが最も好ましい。ハイブリドーマ細胞株を用いて、トロポロンおよびＦＡＣの最適濃度がそれぞれ５μＭおよび０．２ｍｇ／Ｌであることが明らかにされた。この培地はまた、ＮＳＯ骨髄腫細胞の増殖にも好適であった。純粋に実験上の対照として、トランスフェリンおよびトロポロンを含まないがＦＡＣを含有する培地について、ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞を用いて調べられた。ＦＡＣ単独（０．１〜１０ｍｇ／Ｌ）では、振盪懸濁培養のハイブリドーマ細胞の増殖を支援できないことが明らかになった。０．２ｍｇ／Ｌの濃度のＦＡＣ単独では、ＮＳＯ骨髄腫細胞株の増殖を支援することができなかった。骨髄腫細胞株を用いては、ＦＡＣ単独の他の濃度については調べられなかった：おそらく著者らは、ＮＳＯとハイブリドーマ細胞株が同様の挙動を示すものと推測し、他の濃度のＦＡＣが細胞増殖を支援することは予測しなかったのだろう。
【００２７】
Keen （Cytotechnology 17:193-202, 1995）は、ラット骨髄腫細胞およびラットハイブリドーマ細胞の培養のための無タンパク質培地の開発を報告している。この培地（Ｗ３８と呼ばれる）は、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩおよびＡＢＣ培地（Darfler により開発された）の１：１：１の混合物に基づいている。したがってこの培地は親油性の鉄供給源としてＳＮＰを、また含窒素キレート剤としてＥＤＴＡを含むものであった。しかしながら、ＳＮＰおよびＥＤＴＡはＡＢＣ培地中に見られる濃度の３分の１であり、Keen は培地中にクエン酸第二鉄を含めることにより鉄濃度を上昇させることが有益であるのを見出した。Ｗ３８培地はまた、コレステロール要求性骨髄腫細胞株であるＮＳ０の培養にも好適であり、これによりコレステロール要求に対して好都合な対策をもたらした（Keen および Steward, Cytotechnology 17:203-211, 1995）。
【００２８】
Epstein らによる最近の特許出願（ＷＯ０１／１６２９４）では、多くの場合、クエン酸のような簡単な鉄担体は培養細胞に対する十分な鉄利用能または鉄取り込みをもたらさないと述べられている。この特許ではまた、一定範囲の親油性鉄キレート化合物を種々の細胞タイプに対して用いて様々な程度の成功を収めることができるとも報告されている。しかしながら、少なくともトランスフェリンと同程度に良好な結果はＦｅＣｌ３および２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシドにキレート化されたソルビトールを用いて得られたのみであった。
【００２９】
したがって、ハイブリドーマ細胞および骨髄腫細胞タイプのトランスフェリン不含培養における、鉄をキレートし、その提示を助けるための親油性化合物の使用が、当該分野の最先端となってきている。しかしながら、細胞培養培地に親油性キレート剤を含めることにはいくつかの欠点がある。親油性キレート剤は多くの場合毒性であり、例えばＳＮＰは非常に毒性が強いものとして分類され、ラットでのＬＤ５０は１ｍｇ／ｋｇ未満である。生体治療用製品の工業的生産のために用いられる細胞株においては、このことは製造技術者および最終製品の両方に対して重大な意味を有する。実際、最終的に精製した生体治療用製品が、親油性キレート剤のいかなる汚染も含まないことを証明するアッセイを開発および確認することが必要であると思われる。さらに、いずれの特定の方法での鉄濃度の最適化も、キレート剤と鉄化合物の２成分系であるためにさらに複雑なものであるだろう。
【００３０】
まとめると、先行技術においては以下のことが示されている：
１． トランスフェリンの非存在下では、ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞は高い鉄濃度（クエン酸第二鉄１２２．５ｍｇ／Ｌ）においては増殖するであろう（Kovar および Franek）。
２． 高い鉄濃度（例えばクエン酸第二鉄１２２．５ｍｇ／Ｌ）は沈殿を引き起こし、これが培養培地にダメージを与える（Bertheussen）。
３． トランスフェリンまたは親油性キレート剤の非存在下では、低い鉄濃度（それぞれ０．１〜１０ｍｇ／Ｌおよび０．２ｍｇ／Ｌ）においては、振盪培養ではハイブリドーマ細胞は増殖せず、また骨髄腫細胞は全く増殖しないであろう（ＷＯ９４／０２５９２）。
４． 親油性キレート剤は、低い鉄濃度での振盪培養においてはハイブリドーマおよび骨髄腫細胞の増殖を可能にするために培地中に必要である（ＷＯ９４／０２５９２）。
５． 低い鉄濃度をある種の哺乳動物細胞の増殖のために用いることができるが、それはＥＤＴＡのような含窒素キレート剤の使用を伴う場合にのみ可能である（ＷＯ９８／０８９３４）。
【００３１】
細胞培養の分野では、特定の細胞タイプ同士が類似の栄養特性を共有することが重視される。骨髄腫細胞およびハイブリドーマ細胞の両者が、他の細胞タイプは必ずしも示さない顕著な特性（例えばグルタミン要求性）を共有することは特筆すべきである（Bebbington ら、Biotechnology 10:169-175, 1992）。ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞が多くの項目において同様に反応するという事実は、ある程度は驚くべきことでもなく、なぜならハイブリドーマ細胞株は骨髄腫細胞と抗体産生Ｂリンパ球との融合により作り出されるからである（Kohler および Milstein, Nature 256:495-497, 1975）。
【００３２】
上述した先行技術では、ハイブリドーマ細胞および骨髄腫細胞が、トランスフェリンまたは親油性もしくは含窒素キレート剤の非存在下で簡単な鉄担体（例えばクエン酸）を有する培地中に存在する鉄を使用する能力が、例えばＣＨＯ細胞の、対応する能力とは異なっていることが示されている。先行技術の総合的な内容は、ハイブリドーマ細胞および骨髄腫細胞はトランスフェリン不含培養培地中の鉄を使用する能力において同様である、というものである。
【００３３】
特に静置培養における、ハイブリドーマ細胞タイプの増殖のためのトランスフェリン不含培地の開発に時間と努力が費やされてきていることは、上述したように文献から明らかである。この点において、骨髄腫細胞はハイブリドーマ細胞と同じ要求を示すであろうという先行技術に暗示された仮定に基づいて、骨髄腫細胞には同等の努力はなされてきていない。
【００３４】
何年にもわたって、ハイブリドーマ細胞および骨髄腫細胞培養の分野は明らかに、トランスフェリンの代替物として可溶性鉄化合物の形態の鉄の使用からは遠ざかってきており、その代わりに、低鉄濃度の利益を享受するために、親油性または含窒素キレート剤を培養培地中に含めなければならないことを確認してきた。もちろん、細胞が産生するように操作された産物のために該細胞を増殖させる目的で用いる培地中での、そのようなキレート剤の使用はまた、キレート剤で汚染されていないことを確実にするために産物をさらに処理することを必然的に伴う。したがって、培養培地中にそのようなキレート剤を含めることは、産物が純粋であることを示すのに要する時間を引き延ばすのみならず、「毒性」の鉄キレート剤が純粋な産物を汚染していないことを証明するための具体的なアッセイの開発を要することから、製造にかかる費用を増大させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
それゆえ、細胞増殖の継続を可能にするのに十分な鉄を提供しつつ、上記の沈殿ダメージをもたらさない濃度で、培養中のある種の細胞に簡単な形態で鉄を提供することがいまだ求められていることは明らかである。さらに有益なことは、トランスフェリンおよび親油性または含窒素キレート剤を含まない培地を得ることである。目標は、トランスフェリンを含む培地中で得られるのと等価な細胞培養を、トランスフェリンおよび親油性または含窒素キレート剤不含培地中で達成することである。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
ある種の細胞の増殖を支援するトランスフェリン不含培地を提供する必要を満たすために、本発明はとりわけ、鉄を含むがトランスフェリンまたは親油性もしくは含窒素キレート剤を含まない培地中で、振盪（攪拌）懸濁培養において骨髄腫細胞を培養する方法を提供する。本発明では、驚くべきことに、また先行技術で示唆されているのとは反対に、骨髄腫細胞の鉄要求性はハイブリドーマ細胞のものとは異なることを、骨髄腫細胞がハイブリドーマ細胞が必要とするよりも１００倍まで低い培地中鉄濃度において継続的な増殖を示すという予期せぬ結果と共に示す。本発明の方法のさらなる利点は、低鉄濃度の培地中で細胞を培養したときに得られる骨髄腫細胞産物の改善された力価により実証される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
上記に従って、本発明はその最初の態様において、骨髄腫細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の方法であって、以下のステップ：
（ａ） 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含有し、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである；および
（ｂ） 適切な条件下で、振盪懸濁培養を用いて、接種された培養培地を増殖させるステップ、
を含む方法を提供する。
【００３８】
この態様の一実施形態では、本発明は、骨髄腫細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の方法であって、以下のステップ：
（ａ） 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約０．２ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである；および
（ｂ） 適切な条件下で、振盪懸濁培養を用いて、接種された培養培地を増殖させるステップ、
を含む方法を提供する。
【００３９】
第二の態様において、本発明は、哺乳動物細胞産物を取得するための方法であって、前記産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を、前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能な培養培地中で培養すること、ここで前記培養培地は培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである；および前記哺乳動物細胞産物を回収すること、を含む方法を提供する。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は、骨髄腫細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を支援するための培養培地の使用であって、該培養培地は培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである使用を提供する。
【００４１】
本発明のこれらの態様の実施形態では、培地は培地中濃度約０．２ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌでクエン酸第二鉄アンモニウムを含む。
【００４２】
本発明では、培養培地は骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものである。「増殖を支援すること」とは、各継代において（すなわち、ある継代培養（subculture）から次にかけて）細胞数が少なくとも２倍、好ましくは３倍になることを伴う、複数回の継代培養にわたる細胞の継続的増殖を意味する。継代培養の回数は、本発明にとって本質的なものではなく、例えば行った実験の長さ、または産生される産物に依存する。本発明においては、一般的に細胞が少なくとも２回の継代培養にわたる、好ましくは少なくとも３回の継代培養にわたる継続的な増殖を示すことが好ましい。
【００４３】
骨髄腫細胞（他にはリンパ様細胞として知られる）は癌性リンパ球であり、典型的には通常の増殖条件下で無限分裂する。骨髄腫細胞タイプは、それらがモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製のための優秀な融合パートナーであるために有用である。近年、組換え遺伝子技術における宿主細胞としての骨髄腫細胞タイプの重要性が非常に顕著になってきている。このことは特に、グルタミン合成酵素選択マーカーの使用と共にする場合にあてはまり、これは永続的高産生組換え細胞株を作製するためのＮＳ０骨髄腫宿主と共に用いられる（Barnes ら Cytotechnology 32: 109-123, 2000）。
【００４４】
本発明では、いかなる骨髄腫細胞株でも、該培養培地中に用いることができることが期待される。一般的には、骨髄腫細胞株はマウス由来であることが好ましく、その場合、骨髄腫がＮＳ０細胞株またはＰ３シリーズ細胞株であることが特に好ましく、ＮＳＯ細胞株（例えばＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）であることが最も好ましい。他のマウス骨髄腫としては、ＭＯＰＣシリーズ、ＭＰＣ−１１、Ｊ５５８Ｌ、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５および４５．６．ＴＧ１．７が挙げられる。本発明の方法は、ラットおよびヒトの骨髄腫細胞タイプを培養するためにも用いることができる。本発明の方法での使用に適切なラット骨髄腫細胞株としてはＹ０およびＹが挙げられ、適切なヒト骨髄腫細胞株としては、ＨＴＫ、ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６Ｂ１が挙げられる。
【００４５】
骨髄腫細胞株がＮＳＯ細胞である場合、一般的には該細胞株をグルタミン合成酵素発現システムを用いて形質転換することが好ましい。
【００４６】
本発明の細胞培養培地は、トランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤のいずれも含まない。親油性キレート剤は、本発明の目的では、以下の２つの異なる性質を有するキレート剤として定義することができる：（１）疎水性であり、水または細胞培養培地にほとんど溶けないか、不溶性であり、そして多くの場合芳香族である、および（２）負に荷電した領域を有し、ここで正に荷電した鉄イオンとの静電的相互作用を介して鉄を「結合」させる。親油性キレート剤の例は、トロポロンおよびニトロプルシドナトリウムである。本発明の目的では、合成含窒素キレート剤はその構造中に少なくとも１個の窒素原子を含む鉄結合化合物として定義することができる。そのような化合物は疎水性でも親水性でもよい。この点において、「合成」とは、含窒素キレート剤が天然に存在するものではない、すなわち、それらは通常自然界には見出すことができないことを意味する。天然に存在する含窒素キレート剤で合成的に生成されたものはこの定義には包含されず、本発明の方法および使用から除外されない。そのような合成含窒素キレート剤としては、これに限られないが、以下のような化合物が含まれる：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）；デスフェロキサミンメシレート；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）。親油性と合成含窒素キレート剤の両方でありうる化合物も、本発明の方法および使用から除外される。
【００４７】
培地がトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まず、上述の濃度で鉄を含む限りは、そして培地が上記で定義したように骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能である限りは、培地の厳密な組成は本発明にとって重要ではない。
【００４８】
典型的には、細胞培養培地は、アミノ酸、ビタミン類、有機ならびに無機塩類および糖類の供給源を含有するであろう。これら増殖のための必須要素を提供することが可能な化合物は市販されており、細胞増殖のための培地にそれらを組み込むことは、当該技術分野で利用可能な情報に基づいて、当業者の技能の範囲内である。
【００４９】
一般的には、細胞培養培地は公知の基礎培地またはその派生物であって哺乳動物細胞の継続的な増殖を支援するものであることが好ましい。そのような基礎培地は市販されている。適切な基礎培地（本発明の培地を提供するために添加物を加えられてもよい）の例としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地およびロズウェル・パーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）が挙げられる。
【００５０】
本発明の培地は、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含、または化学的組成が明らかなものであってもよい。
【００５１】
あるいはまた、細胞培養培地は継続的増殖に必要な特定の成分の配合により、原則から作製してもよい。
【００５２】
特定の細胞タイプまたは細胞株のための細胞培養培地を調製するときには、基礎培地は、典型的にはその細胞タイプ／株の要求性に応じて改変されるかまたは添加物を加えられるであろう。添加物の選択は当業者の技能の範囲内であり、本発明の必須の態様を構成するものではない。典型的には、そのような添加物としては、脂質（例えばコレステロールおよび脂肪酸）、脂質前駆体（例えばエタノールアミン）、増殖促進因子もしくは調製因子（例えばインスリン）、微量元素（例えばセレン）、ポリマー（例えばプルロニックＦ−６８）およびグルタミン（グルタミン依存性細胞タイプの場合）が挙げられる。
【００５３】
本発明の使用に好適となるように、上述の濃度で培地に鉄を提供する目的で鉄供給源を添加することができる培地の一例は、Qi ら（Cytotechnology 21:95-109 (1996)）により記載されたＣＤＳＳに基づく細胞培養培地である。この培地は改変ＣＤＳＳとして知られ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Gibco BRL.、１×液体、カタログ番号２１３３１）に基づき、以下のものを添加する：ＧＳ添加物（JRH、カタログ番号５８６７２）、４０ｍｌ／Ｌ；クリーブランド微量元素Ｉ（Cellgro、９９−１７５）、０．５ｍｌ／Ｌ；クリーブランド微量元素ＩＩ（Cellgro、９９−１７６）、１ｍｌ／Ｌ；硫酸亜鉛、２μＭ；亜セレン酸ナトリウム、５０ｎＭ；エタノールアミン、２０μＭ；プルロニックＦ６８、１ｇ／Ｌ；炭酸水素ナトリウム、１．３ｇ／Ｌおよび２Ｍ塩酸、３．６ｍｌ／Ｌ。該培地はまた、グルタミン非依存的増殖が不可能な細胞株に対しては６ｍＭグルタミンを、またＮＳ０細胞株に対してはコレステロール脂質濃縮物（Gibco、カタログ番号００−００６１）２ｍｌ／Ｌを含む。
【００５４】
本発明の細胞培養培地は、培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含む。好ましい実施形態では、培養培地中の鉄供給源は可溶性鉄化合物である。用いる可溶性鉄化合物の量は、培地に対してその濃度の鉄を提供するのに十分であるべきであり、培地中の鉄の量がその範囲内である限りは、細胞の増殖を支援するのにちょうど十分であるべきである。培地中の可溶性鉄化合物の厳密な濃度は、用いる具体的な可溶性鉄化合物および用いている細胞株ならびに／または存在する他の培地成分に依存して変わりうる。適切な濃度は、直接的な方法で、例えば慣例的な操作に従った小規模実験（例えば特定の細胞株を用いた特定の培地中での該可溶性鉄化合物に対する用量反応）の実施により決定することができる。
【００５５】
本発明では、培地中の鉄（好ましくは可溶性鉄化合物により提供される）の濃度は、約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約２．４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは約０．０６４ｍｇ／Ｌ〜約１．６ｍｇ／Ｌおよび最も好ましくは約０．１６ｍｇ／Ｌ〜約０．３２ｍｇ／Ｌである。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、培地中の鉄の供給源は可溶性鉄化合物である。適切な可溶性鉄化合物は水または細胞培養培地に可溶性であるが、有機溶媒中には限られた溶解度を示す。そのような化合物は当業者に対して市販されており、当業者にとっては溶解度の測定は容易である。
【００５７】
本発明はまた、鉄供給源がトランスフェリンまたは親油性もしくは合成含窒素キレート剤の非存在下に細胞の継続的増殖を可能にするのに十分な鉄を提供することができる限りにおいては、いずれの代わりの鉄供給源の使用をも予想するものである。
【００５８】
鉄の準備のための、したがって本発明での使用のための適切な可溶性鉄化合物としては、第二鉄および第一鉄塩またはそれらの簡単なキレートが挙げられる。本明細書中で用いる「簡単なキレート」は、上述の親油性または合成含窒素キレート剤を含まないことに注意すべきである。「簡単なキレート」の語句は、本明細書中では、先行技術のいくつかの場面中の「簡単な鉄担体」の語句の使用と同様に用いる。
【００５９】
第二鉄もしくは第一鉄塩またはそれらの簡単なキレート（本発明の方法および使用のための培養培地中で鉄供給源となりうるもの）の例としては、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、および第二鉄アンモニウム化合物が挙げられる。本発明の使用のために好ましいものは、第二鉄アンモニウム化合物である。本発明の使用に適切な具体的な第二鉄アンモニウム化合物としては、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムが挙げられる。本発明の使用のために最も好ましいのは、クエン酸第二鉄アンモニウムである。
【００６０】
本発明の培地は２以上の鉄供給源（例えば適切な鉄含有化合物の混合物）を含んでもよいが、一般的には、該鉄供給源が可溶性鉄化合物である場合には、培地中のそのような化合物は１種類のみであるのが好ましい。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、可溶性鉄化合物はクエン酸第二鉄アンモニウムである。典型的には、本実施形態では、また約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌの範囲で培地に鉄を提供するためには、クエン酸第二鉄アンモニウムを約０．２ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．２ｍｇ／Ｌ〜約１５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは約０．４ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌおよび最も好ましくは約１ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌの濃度で用いるであろう。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、培養培地は第二鉄アンモニウム化合物を含有する。本発明の結果では、そのような第二鉄アンモニウム化合物（特にクエン酸第二鉄アンモニウム）が、例えばクエン酸第二鉄よりも細胞によってより効率よく用いられることが実証されている。特に、クエン酸第二鉄を用いる場合、これは同等な培養培地中に第二鉄アンモニウム化合物の濃度の１０倍で存在しなければならない。このことは、本発明の図１および図２により示され、これによれば少なくとも３回の継代にわたる継続的な細胞増殖のためには、クエン酸第二鉄は少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度で存在しなければならないが、クエン酸第二鉄アンモニウムは０．２ｍｇ／Ｌの濃度で同様のレベルの増殖をもたらすことが明らかである。より低い鉄濃度で抗体力価が最大となることも注目に値する。
【００６３】
本発明の細胞培養培地は、標準的な操作によって個々の成分を適切に混合することにより調製することができる。培地はまた、例えば液体状、または使用の前に再構築するための乾燥粉末培地のように様々な形状で調製してもよい。本発明の培養培地は、適切な条件で保存したときに安定である。
【００６４】
したがって、本発明はまた、骨髄腫細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を支援することが可能な細胞培養培地の調製のための方法であって、前記培地は培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まず；その個々の成分を混合すること、を含む方法を提供する。
【００６５】
本発明の細胞培養培地は、種々の培養条件での使用に適切である。よって、培地は単層培養および懸濁培養、特に振盪懸濁培養での骨髄腫細胞株の増殖を維持することができる。振盪懸濁培養とは、培養培地中の細胞の均一な懸濁を振盪力によって助ける細胞培養として定義することができる。振盪力を加える方法は当該技術分野で公知であり、例えば機械的振盪インペラーおよび／またはバイオリアクター培養に対する気体の分散、ならびに往復式振盪プラットホーム上に細胞培養フラスコを維持することを含む。本発明の培地は、振盪懸濁培養の、すなわち好適な振盪培養容器（例えば振盪タンクまたはエアーリフト発酵器）を用いた懸濁での、公知の培養技術による細胞培養に特に適している。
【００６６】
したがって、本発明はまた、骨髄腫細胞株の振盪懸濁培養における増殖を支援することが可能な培養培地であって、培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含み、トランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まない培地を提供する。
【００６７】
先行技術では、骨髄腫細胞とハイブリドーマ細胞は、培養培地中で鉄と出会ったときに同様の要求性を有すると教示されてきた。本発明者の結果は、そうではないことを示唆している。図３は、クエン酸第二鉄アンモニウムを含有する培養培地中でのハイブリドーマ細胞株の増殖を例示している。この図から見て取れるように、ハイブリドーマ細胞の増殖は当該分野での予測に対応する、すなわち、高濃度のクエン酸第二鉄アンモニウム（５０ｍｇ／Ｌおよび１００ｍｇ／Ｌ）では細胞は良好に増殖するが、この可溶性鉄化合物のより低い濃度（１０ｍｇ／Ｌ未満）ではそうならない。これを図１（同等の濃度の可溶性鉄化合物を有する培地中での骨髄腫細胞の増殖を示す）と比較した場合、ハイブリドーマ細胞は、同様の増殖のためには骨髄腫細胞よりも培地中に約１００倍多くの鉄を必要とすることが明らかである。
【００６８】
本発明の方法のさらなる利点は、骨髄腫細胞を低鉄含有培地中で培養した場合、すなわち細胞株を本発明の方法に従って培養した場合の骨髄腫細胞産物の改善された力価である。後述の実施例では、培地中の鉄濃度が低い（例えば０．０３ｍｇ／Ｌ〜３．２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１６ｍｇ／Ｌ〜０．３２ｍｇ／Ｌである）場合に、骨髄腫細胞産物の力価が予想外に高いことを示している。
【００６９】
本発明に従って得られうる細胞産物には、培養哺乳動物細胞により産生されるいかなる産物をも含む。典型的には、産物としては、例えばポリペプチドおよびタンパク質、例えば免疫グロブリン（例えばモノクローナルおよび組換え抗体ならびにその断片）、ホルモン（例えばエリスロポエチンおよび成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン））、リンホカイン（例えばインターフェロン）、インターロイキン（例えばインターロイキン２、４、５および６）および工業上または治療上有用な酵素（例えば組織プラスミノゲンアクチベーター）が挙げられる。前記細胞産物を産生できるようにするための、遺伝子組換え技術による骨髄腫細胞の操作の方法は、当該技術分野において汎用されており、通常利用可能である。
【００７０】
細胞産物を取得する目的で、そのような産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を本発明の培地中で培養する。増殖の条件は、例えば用いる細胞株および産生される産物に依存するであろうが、当該技術分野で利用可能な知識を用いて容易に決定されるであろう。
【００７１】
この目的で、本発明はまた、培地中濃度約０．０３ｍｇ／Ｌ〜約３．２ｍｇ／Ｌで鉄を含む培養培地の使用であって、前記培地は哺乳類細胞産物の調製のためにトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まない使用を提供する。
【００７２】
骨髄腫細胞および／または培養培地より生成される細胞産物の単離の方法は、当該技術分野で周知であり、通常の操作のうちである。
【００７３】
本明細書中で言及するすべての引用文献は、その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる。本発明は上記の実施形態と関連して記載されているが、上記の記載および以下の実施例は説明のためのものであり本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内での他の態様、利点および改変は、本発明が関連する技術分野の当業者には明らかであろう。
【実施例１】
【００７４】
０．２ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム（ＦＡＣ）は、ＧＳ−ＮＳ０細胞株の継続的増殖を支援することができる
方法
グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現システム（欧州特許明細書第２５６０５５０号）を用いてヒトＩｇＧ抗体を発現する組換えＧＳ−ＮＳ０マウス骨髄腫細胞株（細胞株Ａ）（キレート化鉄供給源を含む独自の無血清培地（ＧＳＦ培地）中であらかじめ継代培養した）を遠心し、キレート剤不含培地中に再懸濁した。この培地に再懸濁した細胞をその後、接種密度２×１０５細胞／ｍｌで実験用フラスコに接種するのに用いた。
【００７５】
実験は、通気孔付きの蓋を取り付けた２５０ｍｌアーレンマイヤーフラスコ（使用容量２０〜５０ｍｌ）を用いて、往復式振盪器中にて３６．５℃、１２５ｒｐｍで、５％ＣＯ２／９５％大気雰囲気下、湿度７５％でインキュベートして行った。
【００７６】
改変ＣＤＳＳ培地を含有する個々のフラスコにＦＡＣのストック溶液を添加して、フラスコが終濃度０．２、０．４、１、２、１０、５０および１００ｍｇ／ＬでＦＡＣを含有するようにした。ＦＡＣのストック溶液は、水中に０．５ｍｇ／Ｌ（ＦＡＣを０．２〜２ｍｇ／Ｌ含有するフラスコに対して）および２５ｍｇ／Ｌ（ＦＡＣを１０〜１００ｍｇ／Ｌ含有するフラスコに対して）の濃度で調製した。ストック溶液は、フラスコへの添加の前にフィルター滅菌した。
【００７７】
１ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリンおよび０．１ｍｇ／ＬのＦＡＣを添加した改変ＣＤＳＳ培地を含有するフラスコを、陽性対照として含めた。トランスフェリンまたはＦＡＣ添加物を含まない改変ＣＤＳＳ培地を含有するフラスコは、陰性対照として含めた。すべてのフラスコに、コレステロール供給源として２ｍｌ／Ｌのコレステロール脂質濃縮物（Gibco）を添加した。コレステロール脂質濃縮物は、シクロデキストリンと複合体化したコレステロールおよび脂肪酸のエマルジョンである。
【００７８】
接種物からのキレート化／貯蔵鉄の持ち越しの影響を最小限にするために、フラスコを３回継代培養した。フラスコは、新しい培地で２×１０５細胞／ｍｌまで希釈することにより３日おきに継代培養した。３回目の継代培養において、フラスコを、低生存率に達するまで完全な増殖サイクルを行わせた（これはしばしば過剰増殖（overegrow）と呼ばれる）。Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ Ｃｅｄｅｘ細胞計数器を用いて細胞計数を行った。抗体力価を、均一ＩｇＧ標準を基準としてサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００７９】
結果
図１ａには、試験したＦＡＣ濃度範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度を示している。この図では、陰性対照培養は１回目の継代培養を越えて増殖することができなかったことが明らかに示されている。０．２ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では、最初の分裂後に増殖することが可能であったが、その後それ以上は増殖することができなかった。これらの培養物が当初の接種後に増殖することが可能であったという事実はおそらく、細胞分裂により枯渇することが避けられない鉄の細胞貯蔵の結果であろう。
【００８０】
図１ａにはまた、０．４ｍｇ／Ｌおよびそれより高い濃度で、数回の継代培養にわたる、および過剰増殖培養の間の、継続的な細胞増殖を支援しうることが明らかに示されている。図１ｃでは、この実験の重複実験において、０．２ｍｇ／ＬのＦＡＣ濃度で継続的細胞増殖を支援することができたことが示されている。
【００８１】
図１ｂには、二重実験の１番目のものからの、過剰増殖培養についての細胞数および抗体産生データが示されている。この図では、トランスフェリン含有対照と同等の増殖（最大生存細胞数および増殖曲線下面積に関して）を、１ｍｇ／Ｌおよびそれより高いＦＡＣ濃度で達成したことを示している。このことは、閾値レベル（１ｍｇ／Ｌ）に達した後では、増殖はＦＡＣ濃度の大きい範囲とほとんど同等であることを示唆している。しかしながら、１０ｍｇ／ＬのＦＡＣ濃度では、少量のさびのような着色沈殿物が観察された。５０ｍｇ／Ｌおよび１００ｍｇ／Ｌではこの沈殿物はもっと多量に見られた。この沈殿物はおそらく、Bertheussen により注意を促された水酸化鉄である（Cytotechnology 11: 219-231, 1993）。
【００８２】
図１ｂにはまた、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された抗体力価が示されている。これは、トランスフェリン含有対照と比較した場合に、ＦＡＣを含有する培養が少なくとも同じ程度の、多くの場合には顕著に多い抗体を産生したことを示している。ＦＡＣ含有培養で得られた抗体力価はまた、ＦＡＣ濃度と反比例の関係を示し、例えば０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では１００ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養よりも３０％を超えて多くの抗体を産生した。
【実施例２】
【００８３】
ＧＳ−ＮＳ０細胞株の継続的増殖を支援するためには、クエン酸第二鉄（ＦＣ）はＦＡＣよりも１桁高い濃度で必要とされる
方法
実施例２の方法はキレート化鉄の供給源のみを除いて実施例１のものと同一である。本実施例では、ＦＡＣの代わりにクエン酸第二鉄（ＦＣ）を用いた。
【００８４】
ＦＣは冷水にはゆっくりとしか溶解しない。したがって、ＦＣのストック溶液を調製するためには、２時間までの間、振盪しながら８０℃に保った水にＦＣを溶かすことが必要であった。ストック溶液は０．５ｍｇ／Ｌ（０．２〜２ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有するフラスコに対して）および１０ｍｇ／Ｌ（１０〜１００ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有するフラスコに対して）の濃度で調製した。
【００８５】
結果
図２ａには、試験したＦＣ濃度の範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度が示されている。これは、陰性対照培養および０．２ｍｇ／ＬのＦＣを含有する培養では１回目の継代培養を越えて増殖することができなかったことを示している。０．４、１および２ｍｇ／ＬのＦＣを含有する培養は、２回目の継代培養を越えて増殖することができなかった。したがって、試験した濃度では、数回の継代培養にわたる、および過剰増殖培養の間の継続的細胞増殖を支援するためには、１０ｍｇ／Ｌかそれより高い濃度でＦＣが必要である。
【００８６】
図２ｂには、過剰増殖培養についての細胞数および抗体産生が示されている。この図では、トランスフェリン含有対照と同等の増殖（最大生存細胞数および増殖曲線下面積に関して）を、１０ｍｇ／Ｌおよびそれより高いＦＣ濃度で達成したことを示している。ＦＡＣと同様に、１０ｍｇ／Ｌおよびそれより多くのＦＣを含有する培養では、少量のさびのような着色沈殿物が観察された。
【００８７】
図２ｂにはまた、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した抗体力価が示されている。これは、トランスフェリン含有対照と比較した場合に、ＦＣを含有する培養が、少なくとも同じ程度の、１０ｍｇ／ＬのＦＣの場合には顕著に多くの抗体を産生したことを示している。ＦＡＣで見られたのと同様に、最も低い濃度のＦＣが最も高い力価をもたらした。
【００８８】
この結果は、トランスフェリンで観察されたのと同等の細胞増殖を支援するためには、ＦＣはＦＡＣより１０倍高い濃度で必要であることを示している。
【実施例３】
【００８９】
振盪懸濁培養において継続的な細胞増殖を得るためには、ハイブリドーマ細胞株はＧＳ−ＮＳ０細胞株よりも２桁を超えて高い濃度のＦＡＣを必要とする
方法
実施例３の方法は、以下の点を除いて実施例１のものと同一である：
抗Ｍｙｃ抗体産生マウスハイブリドーマ細胞株（９Ｅ１０）（１ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリンおよび６ｍＭのグルタミンを添加した改変ＣＤＳＳ中であらかじめ継代培養した）を、接種密度１×１０５細胞／ｍｌで実験用フラスコに接種するのに用いた。
【００９０】
実験は、密閉した蓋を取り付けた２５０ｍｌアーレンマイヤーフラスコを用いて、往復式振盪器中にて３６．５℃、１２５ｒｐｍでインキュベートすることにより行った。フラスコには、当初および２日おきに５％ＣＯ２／９５％大気を通した。
【００９１】
このハイブリドーマ細胞株はコレステロールを要求しないので、フラスコにはコレステロール脂質濃縮物を添加しなかった。
【００９２】
フラスコは、新しい培地で１×１０５細胞／ｍｌまで希釈することにより３日おきに継代培養した。３回目の継代培養において、フラスコを過剰増殖させた。トリパンブルー排除法を用いて細胞計数を行った。
【００９３】
結果
図３ａには、試験したＦＡＣ濃度の範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度が示されている。これは、陰性対照培養ならびに０．２および０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では１回目の継代培養を越えて増殖することができなかったことを示している。１、２および１０ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では２回目の継代培養を越えて増殖することができなかった。したがって、試験した濃度では、増殖を支援するためには５０ｍｇ／Ｌまたはそれより高い濃度でＦＡＣが必要とされる。
【００９４】
図３ｂには、過剰増殖培養の細胞数が示されている。この図では、トランスフェリン含有対照と同等の増殖（最大生存細胞数に関して）を得るためには、１００ｍｇ／ＬのＦＡＣが必要であることが示されている。しかしながら、増殖について、増殖曲線下面積の積分（直角四辺形に近似させた面積の合計から計算した）または累積細胞時間（ＣＣＨ）に関して考えると、トランスフェリン含有対照と同等の増殖は、５０ｍｇ／ＬのＦＡＣにおいて観察される。このことは、最大ＣＣＨを示した棒グラフ（図３ｃ）において明らかに示されている。前に見られたのと同様に、５０および１００ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する培養では、さびのような着色沈殿物が見られた。
【００９５】
この結果は、振盪懸濁培養での継続的細胞増殖のためには、ハイブリドーマ細胞株はＧＳ−ＮＳ０細胞よりも１００倍を超えて高い濃度でＦＡＣを必要とすることを示している。
【実施例４】
【００９６】
細胞増殖の支援および抗体力価を高レベルにすることが可能な栄養豊富な培地中に用いる場合、ＦＡＣは有効な鉄供給源である
実施例４では、鉄の供給源としてのＦＡＣの有用性についてさらに示す。本実施例では、第２の抗体産生組換えＧＳ−ＮＳ０細胞株（細胞株Ｂ）を用いて、ＧＳＦとして知られる独自の無血清培地（唯一規定されていない成分としてウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含有する）中の唯一の鉄供給源としてＦＡＣを用いた。
【００９７】
方法
１０μＭトロポロン（親油性鉄キレート剤［ＷＯ９４／０２５９２参照］）および０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣを鉄供給源として含有する独自の無血清培地中であらかじめ培養した細胞を遠心し、トロポロンおよび鉄不含ＧＳＦ無血清培地中に再懸濁した。この培地に再懸濁した細胞を、その後、接種密度２×１０５細胞／ｍｌで実験用フラスコに接種するのに用いた。
【００９８】
実験は、密閉した蓋を取り付けた２５０ｍｌアーレンマイヤーフラスコ（使用容量５０ｍｌ）を用いて、往復式振盪器中にて３６．５℃、１２５ｒｐｍでインキュベートすることにより行った。フラスコには、当初および２日おきに５％ＣＯ２／９５％大気を通した。
【００９９】
ＧＳＦ（トロポロンおよび鉄不含）培地を含有する個々のフラスコに、ＦＡＣの１ｍｇ／ｍｌストック溶液を添加して、フラスコが終濃度０．２、０．４、０．８、１．２、１．６および２ｍｇ／ＬでＦＡＣを含有するようにした。ストック溶液は、フラスコに添加する前にフィルター滅菌した。５μＭトロポロンおよび０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣ（トランスフェリンと等価であることがあらかじめ示された）を添加した培地を含有するフラスコを陽性対照として含めた。
【０１００】
すべてのフラスコには、１ｍｌ／Ｌの１０００倍濃縮コレステロールおよび脂肪酸添加物（ＣＬＯＣ）も添加した。
【０１０１】
フラスコは、新しい培地で２×１０５細胞／ｍｌまで希釈することにより５日おきに継代培養した。２回目の継代培養において、フラスコを飽和するまで過剰増殖させた。トリパンブルー排除法を用いて細胞計数を行った。抗体力価解析は、均一標準を基準として分析的プロテインＡ ｈｐｌｃを用いて行った。
【０１０２】
結果
図４には、試験したＦＡＣ濃度の範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度が示されている。この図では、０．８ｍｇ／Ｌおよびそれより高い濃度でＦＡＣを含有する培地では、陽性対照培養で見られるのと同等の増殖を支援することができたことが示されている。図４ではまた、過剰増殖培養での抗体産生についても示されている。これは、０．８ｍｇ／Ｌおよびそれより多いＦＡＣでは、対照と少なくとも同等の抗体産生を支援することができることを示している。抗体産生での傾向は、実施例１および２で見られたものとも非常に似通っている。
【０１０３】
この結果は、細胞増殖の支援および抗体力価を高いレベルにすることが可能な栄養豊富な培地中で用いる場合、ＦＡＣが有効であることを示している。
【実施例５】
【０１０４】
鉄供給源としてＦＡＣを含有する培地は、小規模産生系での増殖および抗体産生を支援することができる
方法
細胞株Ｂの発酵は、５μＭトロポロンおよび０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣ（対照）、または１．０ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有するＧＳＦ無血清培地を用いて行った。発酵は、半球型底部を備える７Ｌ（使用容量４．５Ｌ）Ａｐｐｌｉｋｏｎ発酵器中で、海洋用インペラーを用いて１５０ｒｐｍで振盪して行った。発酵は３６．５℃、ｐＨ７．１にて操作し、溶解酸素圧１５％を維持するために大気／酸素を分散した。
【０１０５】
これらの発酵物に対する接種物は発酵で用いたのと同じ培地中の細胞の継代培養から提供した。
【０１０６】
結果
図５には、攪拌・気体分散発酵容器中で、５μＭトロポロン／０．４ｍｇ／ＬのＦＡＣ（対照）または１ｍｇ／ＬのＦＡＣのいずれかを添加した培地を用いた場合には、同様の細胞増殖および産生特性が見られたことが示されている。
【０１０７】
この結果は、小規模産生系での鉄供給源としてのＦＡＣの有用性を実証するものである。
【実施例６】
【０１０８】
ＦＡＣは無タンパク質培地での高細胞密度までの増殖および高力価の産生を支援することができる
方法
それぞれ１ｍｇ／ＬのＦＡＣを含有する無血清ＧＳＦ（タンパク質［ＢＳＡ］含有）および無タンパク質ＧＳＦ培地との比較を、細胞株Ａ（実施例１参照）の攪拌・気体分散・流加（fed batch）発酵を用いて行った。無タンパク質発酵には、２ｍｌ／Ｌのコレステロール脂質濃縮物（実施例１参照）を添加し、また無血清発酵には１ｍｌ／ＬのＣＬＯＣ添加物（実施例４参照）を添加した。発酵条件は実施例５に記載したのと同様とした。これら発酵物に対する接種物は発酵で用いたのと同じ培地中の細胞の継代培養から提供した。
【０１０９】
結果
図６には、２種類の発酵物での増殖および抗体産生が示されている。この図では、ＦＡＣが両方の培地での良好な増殖および抗体産生を支援することができることが明らかに示されている。
【０１１０】
この結果は、タンパク質含有（すなわち無血清）および無タンパク質培地の両方での高細胞密度までの増殖および高力価の産生を支援するＦＡＣの能力を実証するものである。
【実施例７】
【０１１１】
無タンパク質培地中のＦＡＣは高細胞密度までの増殖および高力価の産生を支援することができる
以下の実施例では、実施例６の無タンパク質培地中の唯一の鉄供給源としてＦＡＣを用いることができること、およびこのＦＡＣ添加培地が一定範囲のＧＳ−ＮＳＯ細胞株について、かつ工業生産規模での高細胞密度および高力価までの増殖を支援することができることを示す。
【０１１２】
方法
異なる抗体を発現する３種類のＧＳ−ＮＳＯ細胞株（細胞株Ｃ、ＤおよびＥ）を、液体窒素貯蔵から、実施例６の無タンパク質・ＦＡＣ含有培地中に直接的に復活させた。培養を無タンパク質ＦＡＣ含有培地中で複数回継代培養し、これらの培養を実験室規模（４．５Ｌ）または試験的規模の流加発酵に接種するのに用いた。これらの流加発酵に用いた培地および栄養分は、高抗体力価をもたらすように最適化した。
【０１１３】
細胞株Ｃは４．５Ｌおよび１００Ｌ規模の両方で、細胞株Ｄは４．５Ｌ規模で、そして細胞株Ｅは１００Ｌ規模で増殖させた。
【０１１４】
結果
図８Ａには、４．５Ｌ発酵での細胞株Ｃの増殖および抗体産生が示されている。図８Ｂには、１００Ｌ発酵での細胞株Ｃの増殖および抗体産生が示されている。図９および図１０には、４．５Ｌ発酵での細胞株Ｄおよび１００Ｌ発酵での細胞株Ｅの増殖および抗体産生がそれぞれ示されている。
【０１１５】
これらの図では、無タンパク質ＦＡＣ培地が、広範囲の細胞株にわたって、また工業生産規模での、良好な増殖および抗体産生性を支援することが明らかに示されている。
【０１１６】
これらの結果は、化学的組成が明らかな、タンパク質および動物成分不含培地において、広範囲の細胞株の増殖および抗体産生を支援するＦＡＣの能力を示している。このことは、これが動物由来化合物からの外来性感染性因子の導入のリスクを排除しうるので、ヒトの治療的使用のための抗体の使用における重要性を有する。
【実施例８】
【０１１７】
ＦＡＣを唯一の鉄供給源として用いて増殖するＮＳ０の能力は、ＧＳ選択システムを用いた形質転換によるものではない
ヒト抗体を発現し、Ｇ４１８選択システムを用いて選択された組換えＮＳ０マウス骨髄腫細胞株を、ＧＳ選択システムの代替物を用いて形質転換したＮＳ０細胞の増殖を支援するＦＡＣの能力を評価するのに用いた。
【０１１８】
方法
１ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、０．１ｍｇ／ＬのＦＡＣおよび６ｍＭのグルタミンを含有するＧＳＦ無血清培地中で培養した細胞を、１ｍｇ／ＬのＦＡＣ、または１ｍｇ／Ｌのトランスフェリンおよび０．１ｍｇ／ＬのＦＡＣのいずれかを含有する新しいＧＳＦ無血清培地で２×１０５まで希釈することにより継代培養した。５日後、フラスコを継代培養し、そして完全な増殖サイクルを行わせた。実験は、密閉した蓋を取り付けた振盪用フラスコ中で、往復式振盪器中にて３６．５℃、１２５ｒｐｍでインキュベートして行った。フラスコには、当初および２日おきに５％ＣＯ２／９５％大気を通した。
【０１１９】
結果
両方の培地中で同等の増殖が見られ、このことは、ＦＡＣが代替選択システムを用いて形質転換したＮＳ０細胞の増殖を支援することが可能であることを示唆した。
【０１２０】
この結果は、ＦＡＣを唯一の鉄供給源として用いて増殖するＮＳ０の能力は、ＧＳ選択システムを用いた形質転換によるものではないことを実証している。
【実施例９】
【０１２１】
改変ＣＤＳＳ培地の調製
改変ＣＤＳＳは以下のように調製した：
マグネチック・スターラーを用いて振盪されているＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Gibco BRL.、１×液体、カタログ番号２１３３１）１Ｌに対して、以下の成分を順番に加え、それぞれが次のものを加える前に完全に溶解していることに注意した：
・１ｇ プルロニックＦ−６８（Sigma Ｐ−１３００）
・５０ｎＭ 亜セレン酸ナトリウム無水物（Sigma Ｓ−５２６１）（２５μＭストック溶液から）
・２μＭ 硫酸亜鉛７水和物（Sigma Ｚ−０２５１）（２ｍＭストック溶液から）
・０．５ｍｌ クリーブランド微量元素Ｉ（Cellgro ９９−１７５）
・１ｍｌ クリーブランド微量元素ＩＩ（Cellgro ９９−１７６）
・２０μＭ エタノールアミン（Sigma Ｅ−０１３５）
・４０ｍｌ ＧＳ添加物（JRH Biosciences ５８６７２）
・１．３ｇ 炭酸水素ナトリウム（(BDH １０２４７５Ｗ）
・３．６ｍｌ ２Ｍ塩酸（BDH １９０６７５Ｔ）
グルタミン依存性細胞株のみに対して：
・０．８８ｇ グルタミン（Sigma Ｇ−５７６３）
トランスフェリン含有対照培地のみに対して：
・０．１ｍｇ クエン酸第二鉄アンモニウム（BDH ２７１６３４Ｋ）（１ｍｇ／ｍｌ ストックから）
・１ｍｇ ヒトトランスフェリン（Serologicals Proteins ８２−３４９）
【０１２２】
培地を混合し、０．２μｍメンブレンを用いて濾過した。
【０１２３】
クエン酸第二鉄アンモニウムのような可溶性鉄化合物を、調製中のいずれかにおいて（すなわち他の成分と同時に）、または培地が調製し終わったときに、ストック溶液から上記の培地に対して加える。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１ａ】振盪懸濁培養条件下において種々の濃度のクエン酸第二鉄アンモニウムで増殖する骨髄腫細胞株の能力を示す。
【図１ｂ】種々の濃度のクエン酸第二鉄アンモニウムで増殖する骨髄腫細胞株により産生された抗体の量を示す。
【図１ｃ】図１ａおよび１ｂの実験の重複実験からの増殖データを示す。
【図２ａ】振盪懸濁培養条件下における種々の濃度のクエン酸第二鉄での骨髄腫細胞株の増殖を示す。
【図２ｂ】図２ａの実験で増殖させた細胞株の細胞数および抗体力価を示す。
【図３ａ】振盪懸濁培養条件下における種々の濃度のクエン酸第二鉄アンモニウムでのハイブリドーマ細胞株の増殖を示す。
【図３ｂ】図３ａの実験での細胞数を示す。
【図３ｃ】図３ａおよび３ｂのように増殖させた細胞株の数学的に計算した比較を示す。
【図４】振盪懸濁培養条件下における種々の濃度のクエン酸第二鉄アンモニウムの栄養豊富・無血清・トランスフェリン不含培地中での骨髄腫細胞株の増殖を示す。
【図５】振盪懸濁発酵増殖条件下における骨髄腫細胞株の増殖に必要な全ての鉄を供給するクエン酸第二鉄アンモニウムの能力を示す。
【図６】振盪懸濁発酵条件下における無タンパク質培地および無血清培地中での骨髄腫細胞株の増殖に必要な全ての鉄を供給するクエン酸第二鉄アンモニウムの能力を示す。
【図７】クエン酸第二鉄アンモニウムを唯一の鉄供給源として増殖する骨髄腫細胞株の能力がＧＳ選択システムを用いた形質転換によるものではないことを示す。
【図８】図８Ａでは実験室規模発酵でのクエン酸第二鉄アンモニウムを添加した無タンパク質培地中での別の骨髄腫細胞株の増殖を示す。図８ＢではＸ軸は時間を日で表し、Ｙ軸は生存細胞数（×１０５細胞／ｍｌ）を表す。
【図９】実験室規模発酵でのクエン酸第二鉄アンモニウムを添加した無タンパク質培地中でのまた別の骨髄腫細胞株の増殖を示す。Ｘ軸は時間を日で表し、Ｙ軸は生存細胞数（×１０５細胞／ｍｌ）を表す。
【図１０】１００Ｌ試験的規模流加発酵でのクエン酸第二鉄アンモニウムを添加した無タンパク質培地中でのまた別の骨髄腫細胞株の増殖を示す。Ｘ軸は時間を日で表し、Ｙ軸は生存細胞数（×１０５細胞／ｍｌ）を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄腫細胞株のin vitro培養の方法であって、以下のステップ：
（ａ） 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約0.03mg/L〜約3.2mg/Lで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない；および
（ｂ） 適切な条件下において、振盪懸濁培養を用いて、接種した培養培地を増殖させるステップ、
を含む、上記方法。
【請求項２】
培地中の鉄濃度が約0.03mg/L〜約2.4mg/Lである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培地中の鉄濃度が約0.064mg/L〜約1.6mg/Lである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
培地中の鉄濃度が約0.16mg/L〜約0.32mg/Lである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
鉄の供給源が可溶性鉄化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
可溶性鉄化合物が、第一鉄塩もしくは第二鉄塩またはそれらの簡単なキレート（simple chelate）からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
可溶性鉄化合物が、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄および第二鉄アンモニウム化合物からなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
第二鉄アンモニウム化合物が、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
第二鉄アンモニウム化合物がクエン酸第二鉄アンモニウムである、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
骨髄腫細胞株のin vitro培養の方法であって、以下のステップ：
（ａ） 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約0.2mg/L〜約20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない；および
（ｂ） 適切な条件下において、振盪懸濁培養を用いて、接種した培養培地を増殖させるステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１１】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.2mg/L〜約15mg/Lの濃度で存在する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.4mg/L〜約10mg/Lの濃度で存在する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約1mg/L〜約2mg/Lの濃度で存在する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
培地が、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含であるか、または化学的組成が明らかなものである、請求項１または１０記載の方法。
【請求項１５】
骨髄腫細胞株が、NSOシリーズ、P3シリーズ、MOPCシリーズ、MPC-11、J558L、K6H6/B5、45.6.TG1.7、Y0、Y3HTK、RPMI 8226およびU266B1からなる群より選択される、請求項１または１０記載の方法。
【請求項１６】
骨髄腫細胞株がNSO細胞株である、請求項１または１０記載の方法。
【請求項１７】
振盪懸濁培養条件下での骨髄腫細胞株のin vitro増殖を支援するための培養培地の使用であって、該培養培地が培地中濃度約0.03mg/L〜約3.2mg/Lで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない、上記使用。
【請求項１８】
培地中の鉄濃度が約0.03mg/L〜約2.4mg/Lである、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
培地中の鉄濃度が約０．０６４ｍｇ／Ｌ〜約１．６ｍｇ／Ｌである、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
培地中の鉄濃度が約０．１６ｍｇ／Ｌ〜約０．３２ｍｇ／Ｌである、請求項１７記載の使用。
【請求項２１】
鉄の供給源が可溶性鉄化合物である、請求項１７記載の使用。
【請求項２２】
可溶性鉄化合物が、第一鉄塩もしくは第二鉄塩またはそれらの簡単なキレート（simple chelate）からなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
可溶性鉄化合物が、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄および第二鉄アンモニウム化合物からなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２４】
第二鉄アンモニウム化合物が、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
第二鉄アンモニウム化合物がクエン酸第二鉄アンモニウムである、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
振盪懸濁培養条件下での骨髄腫細胞株のin vitro増殖を支援するための培養培地の使用であって、該培養培地が培地中濃度約0.2mg/L〜約20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない、上記使用。
【請求項２７】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.2mg/L〜約15mg/Lの濃度で存在する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.4mg/L〜約10mg/Lの濃度で存在する、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約1mg/L〜約2mg/Lの濃度で存在する、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
培地が、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含、または化学的組成が明らかなものである、請求項１７または２６記載の方法。
【請求項３１】
骨髄腫細胞株が、NSOシリーズ、P3シリーズ、MOPCシリーズ、MPC-11、J558L、K6H6/B5、45.6.TG1.7、Y0、Y3HTK、RPMI 8226およびU266B1からなる群より選択される、請求項１７または２６記載の方法。
【請求項３２】
骨髄腫細胞株がNSO細胞株である、請求項１７または２６記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物細胞産物を取得する方法であって、前記産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を振盪懸濁培養下および前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能な培養培地中で培養すること、ここで前記培地が培地中濃度約0.03mg/L〜約3.2mg/Lで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有せず；および前記哺乳動物細胞産物を回収すること、を含む、上記方法。
【請求項３４】
培地中の鉄濃度が約0.03mg/L〜約2.4mg/Lである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
培地中の鉄濃度が約0.064mg/L〜約1.6mg/Lである、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
培地中の鉄濃度が約0.16mg/L〜約0.32mg/Lである、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
鉄の供給源が可溶性鉄化合物である、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
可溶性鉄化合物が、第一鉄塩もしくは第二鉄塩またはそれらの簡単なキレート（simple chelate）からなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
可溶性鉄化合物が、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄および第二鉄アンモニウム化合物からなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
第二鉄アンモニウム化合物が、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群より選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
第二鉄アンモニウム化合物がクエン酸第二鉄アンモニウムである、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物細胞産物を取得する方法であって、前記産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を振盪懸濁培養下および前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能な培養培地中で培養すること、ここで前記培地が培地中濃度約0.2mg/L〜約20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有せず；および前記哺乳動物細胞産物を回収すること、を含む、上記方法。
【請求項４３】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.2mg/L〜約15mg/Lの濃度で存在する、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.4mg/L〜約10mg/Lの濃度で存在する、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約1mg/L〜約2mg/Lの濃度で存在する、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
培地が、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含、または化学的組成が明らかなものである、請求項３３または４２記載の方法。
【請求項４７】
骨髄腫細胞株が、NSOシリーズ、P3シリーズ、MOPCシリーズ、MPC-11、J558L、K6H6/B5、45.6.TG1.7、Y0、Y3HTK、RPMI 8226およびU266B1からなる群より選択される、請求項３３または４２記載の方法。
【請求項４８】
骨髄腫細胞株がNSO細胞株である、請求項３３または４２記載の方法。
【請求項４９】
細胞産物が、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、リンホカイン、インターロイキンおよび工業上かつ治療上有用な酵素からなる群より選択される、請求項３３または４２記載の方法。
【請求項５０】
細胞産物が抗体またはその断片である、請求項４９記載の方法。
【請求項１】
骨髄腫細胞株のin vitro培養の方法であって、以下のステップ：
（ａ） 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約0.03mg/L〜約3.2mg/Lで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない；および
（ｂ） 適切な条件下において、振盪懸濁培養を用いて、接種した培養培地を増殖させるステップ、
を含む、上記方法。
【請求項２】
培地中の鉄濃度が約0.03mg/L〜約2.4mg/Lである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培地中の鉄濃度が約0.064mg/L〜約1.6mg/Lである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
培地中の鉄濃度が約0.16mg/L〜約0.32mg/Lである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
鉄の供給源が可溶性鉄化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
可溶性鉄化合物が、第一鉄塩もしくは第二鉄塩またはそれらの簡単なキレート（simple chelate）からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
可溶性鉄化合物が、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄および第二鉄アンモニウム化合物からなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
第二鉄アンモニウム化合物が、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
第二鉄アンモニウム化合物がクエン酸第二鉄アンモニウムである、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
骨髄腫細胞株のin vitro培養の方法であって、以下のステップ：
（ａ） 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約0.2mg/L〜約20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない；および
（ｂ） 適切な条件下において、振盪懸濁培養を用いて、接種した培養培地を増殖させるステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１１】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.2mg/L〜約15mg/Lの濃度で存在する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.4mg/L〜約10mg/Lの濃度で存在する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約1mg/L〜約2mg/Lの濃度で存在する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
培地が、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含であるか、または化学的組成が明らかなものである、請求項１または１０記載の方法。
【請求項１５】
骨髄腫細胞株が、NSOシリーズ、P3シリーズ、MOPCシリーズ、MPC-11、J558L、K6H6/B5、45.6.TG1.7、Y0、Y3HTK、RPMI 8226およびU266B1からなる群より選択される、請求項１または１０記載の方法。
【請求項１６】
骨髄腫細胞株がNSO細胞株である、請求項１または１０記載の方法。
【請求項１７】
振盪懸濁培養条件下での骨髄腫細胞株のin vitro増殖を支援するための培養培地の使用であって、該培養培地が培地中濃度約0.03mg/L〜約3.2mg/Lで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない、上記使用。
【請求項１８】
培地中の鉄濃度が約0.03mg/L〜約2.4mg/Lである、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
培地中の鉄濃度が約０．０６４ｍｇ／Ｌ〜約１．６ｍｇ／Ｌである、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
培地中の鉄濃度が約０．１６ｍｇ／Ｌ〜約０．３２ｍｇ／Ｌである、請求項１７記載の使用。
【請求項２１】
鉄の供給源が可溶性鉄化合物である、請求項１７記載の使用。
【請求項２２】
可溶性鉄化合物が、第一鉄塩もしくは第二鉄塩またはそれらの簡単なキレート（simple chelate）からなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
可溶性鉄化合物が、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄および第二鉄アンモニウム化合物からなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２４】
第二鉄アンモニウム化合物が、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
第二鉄アンモニウム化合物がクエン酸第二鉄アンモニウムである、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
振盪懸濁培養条件下での骨髄腫細胞株のin vitro増殖を支援するための培養培地の使用であって、該培養培地が培地中濃度約0.2mg/L〜約20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない、上記使用。
【請求項２７】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.2mg/L〜約15mg/Lの濃度で存在する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.4mg/L〜約10mg/Lの濃度で存在する、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約1mg/L〜約2mg/Lの濃度で存在する、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
培地が、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含、または化学的組成が明らかなものである、請求項１７または２６記載の方法。
【請求項３１】
骨髄腫細胞株が、NSOシリーズ、P3シリーズ、MOPCシリーズ、MPC-11、J558L、K6H6/B5、45.6.TG1.7、Y0、Y3HTK、RPMI 8226およびU266B1からなる群より選択される、請求項１７または２６記載の方法。
【請求項３２】
骨髄腫細胞株がNSO細胞株である、請求項１７または２６記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物細胞産物を取得する方法であって、前記産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を振盪懸濁培養下および前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能な培養培地中で培養すること、ここで前記培地が培地中濃度約0.03mg/L〜約3.2mg/Lで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有せず；および前記哺乳動物細胞産物を回収すること、を含む、上記方法。
【請求項３４】
培地中の鉄濃度が約0.03mg/L〜約2.4mg/Lである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
培地中の鉄濃度が約0.064mg/L〜約1.6mg/Lである、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
培地中の鉄濃度が約0.16mg/L〜約0.32mg/Lである、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
鉄の供給源が可溶性鉄化合物である、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
可溶性鉄化合物が、第一鉄塩もしくは第二鉄塩またはそれらの簡単なキレート（simple chelate）からなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
可溶性鉄化合物が、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄および第二鉄アンモニウム化合物からなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
第二鉄アンモニウム化合物が、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群より選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
第二鉄アンモニウム化合物がクエン酸第二鉄アンモニウムである、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物細胞産物を取得する方法であって、前記産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を振盪懸濁培養下および前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能な培養培地中で培養すること、ここで前記培地が培地中濃度約0.2mg/L〜約20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有せず；および前記哺乳動物細胞産物を回収すること、を含む、上記方法。
【請求項４３】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.2mg/L〜約15mg/Lの濃度で存在する、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約0.4mg/L〜約10mg/Lの濃度で存在する、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に約1mg/L〜約2mg/Lの濃度で存在する、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
培地が、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含、または化学的組成が明らかなものである、請求項３３または４２記載の方法。
【請求項４７】
骨髄腫細胞株が、NSOシリーズ、P3シリーズ、MOPCシリーズ、MPC-11、J558L、K6H6/B5、45.6.TG1.7、Y0、Y3HTK、RPMI 8226およびU266B1からなる群より選択される、請求項３３または４２記載の方法。
【請求項４８】
骨髄腫細胞株がNSO細胞株である、請求項３３または４２記載の方法。
【請求項４９】
細胞産物が、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、リンホカイン、インターロイキンおよび工業上かつ治療上有用な酵素からなる群より選択される、請求項３３または４２記載の方法。
【請求項５０】
細胞産物が抗体またはその断片である、請求項４９記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５０１６０６（Ｐ２００７−５０１６０６Ａ）
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２２３８９（Ｐ２００６−５２２３８９）
【出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３２７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４８００
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６０４２２６５）ケンブリッジ アンチボディー テクノロジー リミテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３２７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４８００
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６０４２２６５）ケンブリッジ アンチボディー テクノロジー リミテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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