トリテルペン水酸化酵素
ソヤサポゲノールＢは前駆体であるβ-アミリンの２段階の水酸化反応を経て生合成される。しかしながら、この反応に関与する水酸化酵素の遺伝子は明らかにされていなかった。そのため、水酸化酵素についての遺伝子工学的な利用が不可能であった。
発明者らは、ダイズ由来のシトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１に対応する配列がオレアナン型トリテルペンの２４位を水酸化する酵素タンパクをコードしていることを明らかにするとともに、当該遺伝子を遺伝子工学的な手段を用いて利用する方法を提供する。
発明者らは、ダイズ由来のシトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１に対応する配列がオレアナン型トリテルペンの２４位を水酸化する酵素タンパクをコードしていることを明らかにするとともに、当該遺伝子を遺伝子工学的な手段を用いて利用する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来のソヤサポゲノールＢ生合成に関与する酵素遺伝子を遺伝子工学的な手法を用いて形質転換した細胞、ならびにその細胞を利用することによりソヤサポゲノールＢを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ソヤサポゲノールＢ（12-oleanene-3,22,24-triol）は、大豆種子より単離、構造決定されたオレアナン骨格を有するトリテルペン（Chem. Pharm. Bull., 24, p121-129, 1976、Chem. Pharm. Bull., 30, p2294-2297, 1982）（非特許文献１および２）であり、その配糖体であるソヤサポニンはマメ科植物に広く分布している。
これまでにソヤサポゲノールＢに関しては、抗補体活性、血小板凝集抑制作用（特開昭61-37749）（特許文献１）、抗腫瘍活性（特開平10-234396）（特許文献２）および肝保護作用（Bioorg. Med. Chem. Lett., 7, 85-88,1997）（非特許文献３）などが報告されており、医薬品もしくは医薬品原料としての有用性が期待されている。
【０００３】
ソヤサポゲノールＢの製造法としては、大豆種子に含有されるサポニンの糖鎖を加水分解したのち、ソヤサポゲノールＢを精製する方法が知られているが、大豆種子に含有されているサポニンの割合は約0.2％（薬学雑誌104,162-168,1984）（非特許文献４）と少なく、より効率的な製造法が求められている。
ソヤサポゲノールＢの生合成前駆体であるβ−アミリンは、メバロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクアレンが閉環することにより生合成され、その後、２段階の水酸化反応を経てソヤサポゲノールＢが生合成されると推定される。
【０００４】
ソヤサポゲノールＢと構造的に類似するソフォラジオール（12-oleanene-3,22-diol）は槐花（エンジュ）の成分として報告されている物質（薬学雑誌78,1090-1094,1958）（非特許文献５）であるが、このソフォラジオールの２４位を水酸化するとソヤサポゲノールＢを生産することが可能である。
実際、カンゾウの培養細胞由来の水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールの24位を水酸化することによる、ソヤサポゲノールＢの製造法が開示されている。（WO02/086142）（特許文献３）
【０００５】
【特許文献１】特開昭６１−３７７４９号公報
【特許文献２】特開平１０−２３４３９６号公報
【特許文献３】国際公開WO０２／０８６１４２号公報
【非特許文献１】Chem. Pharm. Bull., 24, p121-129, 1976
【非特許文献２】Chem. Pharm. Bull., 30, p2294-2297, 1982
【非特許文献３】Bioorg.Med.Chem. Lett., 7, 85-88,1997
【非特許文献４】薬学雑誌104, 162-168,1984
【非特許文献５】薬学雑誌78, 1090-1094,1958
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ソヤサポゲノールＢの生合成前駆体であるβ−アミリンは、メバロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクアレンが閉環することにより生合成され、その後、２段階の水酸化反応を経てソヤサポゲノールＢが生合成される。しかしながら、この反応に関与する水酸化酵素の遺伝子は明らかにされていなかった。そのため、水酸化酵素についての遺伝子工学的な利用が不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、β−アミリンからソヤサポゲノールＢに至る生合成に関与するシトクロームＰ４５０型の酵素の遺伝子が、ソヤサポゲノールＢの配糖体であるソヤサポニンを高生産するダイズのＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）クローンや機能未同定クローンの中に含まれていると考え、ラノステロール欠損酵母変異株を用いて、これらダイズのクローンの機能解析を行った。解析を行ったクローンのうち配列番号８で表されるポリヌクレオチドを転写及び翻訳させた酵母において本来検出されないオレアナン型トリテルペンの２４位の水酸化活性を検出した。水酸化活性を検出した酵素のポリヌクレオチド配列は配列番号８であり、推定されるポリペプチド配列は配列番号９である。配列番号８に類似する配列として、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１３５４８５、配列番号１０、推定されるポリペプチド配列は配列番号１１）が知られている。配列番号８で表されるポリヌクレオチドと配列番号１０で表されるポリヌクレオチドは、１２１番目、１７１番目および１０８１番目の３箇所が異なる。（以下、配列番号８で表される配列もシトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１と呼ぶことがある。）また、配列番号９で表されるポリペプチドと配列番号１１で表されるポリペプチドは、４１番目および６１番目のアミノ酸が異なる。本発明者らは、配列番号８で表されるポリヌクレオチドがオレアナン型トリテルペンの２４位を水酸化する酵素タンパクをコードしていることを明らかにした。この知見に基づき、本発明者らは鋭意努力し、本発明を完成させた。
【０００８】
従って、本発明は以下の１〜１７に関する。
１. 配列番号８で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
２． ポリヌクレオチドが配列番号８で表されるポリヌクレオチドである上記１に記載の発現ベクター。
３． 上記１または２記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
４． 宿主が微生物である上記３記載の形質転換体。
５． 微生物が酵母である上記４記載の形質転換体。
６． 配列番号８で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびβ−アミリン合成酵素遺伝子を有する発現ベクター。
７． ポリヌクレオチドが配列番号８で表されるポリヌクレオチドである上記６に記載の発現ベクター。
８． 上記６または７記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
９． 宿主が微生物である上記８記載の形質転換体。
１０． 微生物が酵母である上記９記載の形質転換体。
１１． 受託番号FERM BP−10201として寄託されているラノステロール合成酵素欠損酵母変異株。
１２． 上記３から５のいずれかに記載の形質転換体を培養して、上記１に記載のポリペプチドを産生する工程を含むオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドを製造する方法。
１３． 上記８から１０のいずれかに記載の形質転換体を培養して、
1）上記３に記載のポリペプチドを産生する工程および
2）β−アミリン合成酵素を産生する工程
を含むオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドおよびβ−アミリン合成酵素を製造する方法。
１４． 上記３から５のいずれかに記載の形質転換体をオレアナン型トリテルペンに作用させる工程を含む２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
１５． 上記８から１０のいずれかに記載された形質転換体の培養生産による２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
１６． 上記１１に記載の酵母変異株の培養生産による２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、オレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素の遺伝子塩基配列ならびにアミノ酸配列を明らかにすることができた。さらに、当該遺伝子を遺伝子工学的に利用することにより、遺伝子産物である酵素タンパクを大量に生産することができる。
また、生産された酵素タンパク質又は該酵素タンパク質含む形質転換体を用いて、トリテルペンの２４位を水酸化することが可能となった。また当該遺伝子とβ−アミリン合成酵素の遺伝子で形質転換体を用いることにより、２４位が水酸化されたトリテルペンを直接培養生産することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるオレアナン型トリテルペンとしては、β−アミリン、ソフォラジオール、ソヤサポゲノールAおよびBなどが知られているが、本発明におけるオレアナン型トリテルペンは上記に限定されない。
２４位が水酸化されるオレアナン型トリテルペンとしては、β−アミリンやソフォラジオールがあげられるが、本発明の方法により２４位が水酸化される化合物であれば上記に限定されない。２４位が水酸化されたトリテルペンとしては、ソヤサポゲノールAおよびBがあげられるが、本発明による酸化成績体であればソヤサポゲノールAおよびBに限定されない。
本発明によれば、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドおよびその均等体の転写・翻訳産物を利用して２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを製造することができる。なお、均等体とは、同一機能を有し、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１に記載の配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を指す。
【００１１】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、シトクロームP450遺伝子CYP93E1で表される塩基配列を有するDNAの一部又は全部（又は、その相補鎖）をプローブとして、ハイブリダイズを使用する手法（例えば、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等）を用いることによりヌクレオチドのハイブリダイゼーションが確認できる。具体的には、０．５mol/lの塩化ナトリウム存在下、５５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０よりなる）を用いる場合が例示される。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（（Molecular cloning、A Laboratory Manual、 T．マニアティス（T．Maniatis）他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1989年発行）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なDNAとして具体的には、BLAST (National Center for Biotechnology Information)を用いて計算したときに、シトクロームP450遺伝子CYP93E1で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するDNAを挙げることができる。なお、本発明における相同性は、BLASTのパラメータをWordsize:3、Matrix:BLOSOM62、Gap Costs:Existence:11、Extension:1に設定したときの数値を表す。
また、「シトクロームP450遺伝子CYP93E1のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、具体的には、シトクロームP450遺伝子CYP93E1のポリヌクレオチド配列において、１若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ、オレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。シトクロームP450遺伝子CYP93E1のヌクレオチド配列において置換されるヌクレオチドの個数は、上記の相同性を満たし、かつ、オレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードする数であれば特に限定されない。
シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドに対する変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異も含む。人為的に変異させる手段としては、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドを用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、遺伝子工学的に、１又は複数のヌクレオチド残基が欠失、置換、挿入、付加の少なくとも１つがなされているポリヌクレオチドを得る方法が挙げられる。こうして得られた変異ポリヌクレオチドを利用することにより、本酵素の活性の至適温度、熱安定性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、基質特異性等の性質が異なったポリペプチドを得ることが可能となる。
さらに、２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを産生し得る他の微生物、植物、及び、動物（好ましくはオレアナン型トリテルペン産生し得る、植物、より好ましくはマメ科植物、最も好ましくは大豆）に対してシトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１の塩基配列を有するヌクレオチドの一部又は全部（又は、その相補鎖）をプローブとして、ハイブリダイズを使用する手法（例えば、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法）、または、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１の塩基配列を有するヌクレオチドの一部又は全部（又は、その相補鎖）をプライマーとしてPCRを行う手法等によって、シトクロームP450遺伝子CYP93E1のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることもできる。
また、上記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の情報を基にして、化学合成によって得ることもできる。この方法は、ジーン（Gene）、第60(1)巻、第115-127頁(1987)の記載を参照して行うことができる。
【００１２】
さらに、本発明は、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドおよびその均等体を保持する、及び／又は、発現するための自立複製可能なベクター（好ましくは発現ベクター）で宿主を形質転換した形質転換体に関する。該ベクターは、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドおよびその均等体に加え、さらにβ−アミリン合成酵素遺伝子を含んで良い。
【００１３】
宿主の例としては、特に限定されないが、微生物、植物、動物等が挙げられる。微生物としては、酵母、大腸菌等が挙げられ、好ましくは酵母が用いられる。動物としてはカイコがあげられる。植物としては大豆があげられる。植物に本発明のベクターを導入する事で、２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの含量の増加した植物を提供可能である。
【００１４】
形質転換する酵母の例としては、ラノステロールシンターゼを欠いた酵母ＧＩＬ７７（Kushiro, T. et al., Eur. J. Biochem., 256, 238-244, 1998）がある。上記シトクロームP450遺伝子CYP93E1に対応するｃＤＮＡ及びエンドウ由来β−アミリン合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＥＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、ラノステロール合成酵素を欠いた酵母ＧＩＬ７７を形質転換し、２種の遺伝子を共発現させることにより、２４位が水酸化されたトリテルペンを培養生産することが可能となる。
【００１５】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００１６】
宿主細胞が微生物である場合、発現ベクターとしては、例えば、pBluescript (STRATAGENE社製)、pUC18 (タカラバイオ社製)、pUC118 (タカラバイオ社製)、pUC19 (タカラバイオ社製)、pUC119 (タカラバイオ社製)等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌、糸状菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、タカアミラーゼ遺伝子プロモーター、ＴＥＦ１遺伝子プロモーター等の麹菌等に由来するプロモーター等を挙げることができる。
また、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へポリヌクレオチドを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) 〕等を挙げることができる。
【００１７】
酵母菌株が宿主細胞である場合には、発現ベクターとして、例えばpAUR101(タカラバイオ社製)、pAUR112 (タカラバイオ社製)、pI-RED1(東洋紡績社製)等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、解糖系酵素遺伝子プロモーター、Galプロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にポリヌクレオチドを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978) 〕、酢酸リチウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、153, 163 (1983)〕等を挙げることができる。
【００１８】
宿主細胞の培地、培養条件については、公知の方法に従って適宜選択することが可能である。微生物を宿主細胞とする場合、得られた形質転換体を培養する培地は、該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、ポテトデキストロース、グルコース、スクロース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機塩若しくは有機酸のアンモニウム塩その他の窒素化合物、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、肉エキスを用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００１９】
宿主細胞がカイコである場合、例えばバキュロウィルス発現系を用いた公知の方法により、本発明のポリペプチドを発現させることができる。[Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 1-20(2003)]また、植物細胞を宿主として本発明のポリペプチドを形質転換した植物を得る場合、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのTiプラスミドまたはバイナリ−プラスミド系、アグロバクテリウム・リゾジェネスのRiプラスミド、ポリエチレングリコールを用いる直接的な遺伝子伝達またはエレクトロポレーション法が有効である。[Methods in Molecular Biology, 267, Recombinant Gene Expression 329-50(2004)]
【００２０】
また、誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターを導入した形質転換体を培養する場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた場合はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた場合はインドールアクリル酸等を培地に添加することができる。
【００２１】
なお、本発明のポリペプチドの発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング 第２版に記載されている方法等に準じて行うことができる。
【００２２】
上記３〜５記載の形質転換体を使用してオレアナン型トリテルペン２４位水酸化体を製造する場合、形質転換体の培養液に基質となるオレアナン型トリテルペンを添加して培養し、得られた２４位水酸化体を酢酸エチルやエーテルなどの有機溶媒で抽出後、シリカゲルやODSを用いて精製する。
【００２３】
また、形質転換体の培養液から無細胞抽出液を調製してオレアナン型トリテルペン24位水酸体を製造することもできる。この場合、収穫した細胞を懸濁液に懸濁し、ホモジナイザー、超音波破砕機あるいはフレンチプレス等により細胞を破砕後、遠心分離して無細胞抽出液を得る。緩衝液には、ポリペプチドの失活を防ぐため、抗酸化剤、酵素の安定化剤、ポリフェノール吸着剤、金属配位子などを添加することができる。さらに比活性を高めるにはポリペプチドを精製することが有効であり、超遠心機による遠心分離法、硫安等による塩析方、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、電気泳動法などの手法を単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。
【００２４】
得られたポリペプチドを含む緩衝液に、基質となるオレアナン型トリテルペンならびに補酵素を添加して、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃でインキュベートする。補酵素としてはNADHあるいはNADPHが利用でき、グルコース-6-リン酸とグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを用いたNADPH再構成系も併用できる。また、形質転換細胞が産生するNADPH-P450リダクターゼ以外のNADPH-P450リダクターゼを外部から加えて水酸化反応を行うことも可能である。
【００２５】
上記８〜１０記載の形質転換体を使用する場合、形質転換細胞自身が産生する2,3-オキシドスクアレンを利用してオレアナン型トリテルペンが産生されるため、外部からオレアナン型トリテルペンを添加せずに、オレアナン型トリテルペン24位水酸化体を製造することができる。得られた24位水酸化体は酢酸エチルやエーテルなどの有機溶媒で抽出後、シリカゲルやODSを用いて精製する。
以下に本発明の実施例の概略を記載する。
【００２６】
ダイズ由来のＥＳＴ及び機能未同定でかつ全長の塩基配列が報告されているシトクロームＰ４５０クローンを７種（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ１３５４８５、Ｙ１０４９１、Ｙ１０９８２、Ｙ１０９８３、Ｙ１０４９３、ＡＦ０２２４５９、及び、ＴＩＧＲ Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＴＣ１００９２１）選択した。このうち、本活性を示したＣＹＰ９３Ｅ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１３５４８５）に高い相同性を示した配列番号８のポリヌクレオチドについて、以下に記す。ダイズ芽生えより調製したｍＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＹＰ９３Ｅ１に対応するｃＤＮＡ（配列番号８）を増幅し、酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＥＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、ラノステロールシンターゼを欠いた酵母ＧＩＬ７７（Kushiro, T. et al., Eur. J. Biochem., 256, 238-244, 1998）を形質転換し機能解析を行った。形質転換酵母の無細胞抽出液とβ−アミリンを反応させ、生成物をアセチル化し、ＧＣＭＳで解析した。その結果、３，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンを検出した。
【００２７】
同様に、形質転換酵母の無細胞抽出液とソフォラジオールを反応させ、生成物をアセチル化し、ＧＣＭＳで解析した。その結果、トリアセチルソヤサポゲノールＢを検出した。
【００２８】
形質転換酵母の培養にβ−アミリンを投与し、反応後、細胞を収穫した。脂溶性画分を抽出し、アセチル化後、ＧＣＭＳで解析した。その結果、３，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンを検出した。
【００２９】
上記配列番号８のｃＤＮＡ及びエンドウ由来β−アミリン合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＥＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、ラノステロール合成酵素を欠いた酵母ＧＩＬ７７を形質転換し、２種の遺伝子を共発現させた。この形質転換酵母をGIL77/pESC・PSY・CYP93E1と命名し、平成１６年２月６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東１-１-１ 中央第６）に受託番号FERM P-19675として寄託した（平成１７年１月６日にFERM BP-10201に移管）。
【００３０】
形質転換酵母を培養し、細胞を収穫した。脂溶性画分を抽出し、アセチル化後、ＧＣＭＳで解析した。その結果、３，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンを検出した。
【００３１】
同様に、上記配列番号８のｃＤＮＡ及びシロイヌナズナ由来混合トリテルペン合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＥＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、ラノステロールシンターゼを欠いた酵母ＧＩＬ７７を形質転換し、２種の遺伝子を共発現させた。
【００３２】
形質転換酵母を培養し、細胞を収穫した。脂溶性画分を抽出し、アセチル化後、ＧＣＭＳで解析した。その結果、３，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンを検出した。他のジアセトキシトリテルペンは検出限界以下であった。
【００３３】
以上の結果、該酵母において本来検出されないソフォラジオール及びβ−アミリンの２４位に対する水酸化活性が認められたことから、配列番号８はオレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素をコードする遺伝子であると明らかにすることができた。一方、同様に活性を調べた他の６種のＰ４５０遺伝子においては、本活性を検出することはできなかった。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（１）ダイズ芽生えのｃＤＮＡの調製
水浸１４日後のダイズ（早生枝豆、アタリヤ農園）幼葉から、フェノール／クロロフォルム法により全ＲＮＡを抽出した。これを鋳型として、逆転写酵素SuperscriptII（GIBCOBRL製）と、配列番号１に示すプライマーを用いてｃＤＮＡを調製した。
【００３５】
（２）配列番号８のポリヌクレオチドの増幅
上記（１）で調製したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号２と３に示す、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端に相当する箇所のオリゴＤＮＡをプライマーとして、アニール温度６５℃でＰＣＲ（３０サイクル、宝酒造社製Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を行い、ＣＹＰ９３Ｅ１（配列番号８）の全長クローンを得た。
【００３６】
（３）ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１の構築及び形質転換酵母の作成
上記（２）で得られた全長クローンを制限酵素ＳｐｅＩとＣｌａＩで処理し、酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＳｐｅＩとＣｌａＩサイトに組み込んだ。これをｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅとした。ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅを、酵母ＩＮＶＳＣ２株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｚｙｍｏ Ｒｅａｓｅａｃｈ 社）を用いて導入した。
【００３７】
（４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性試験
グルコースの代わりに２％ラフィノースを含むＳＣ−Ｕ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）２０ｍｌに形質転換酵母を植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで１８時間培養した。ヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）とガラクトース（最終濃度２％）を加え、同条件でさらに２０時間培養した。遠心により細胞を収穫し、２ｍｌのスクリューバイアルへと移し、１００μｌの抽出緩衝液（ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸―カリウム緩衝液に１０％スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１４ｍＭの２−メルカプトエタノールを加えたもの）を加え、再懸濁した。ここに希塩酸にて洗浄した０．４−０．６ｍｍ径のガラスビーズ（井内盛栄堂）を適量加えた。４℃に冷却し、ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＤＥＲ（ＢＩＯＳＰＥＣ社）を用いて細胞の破砕を行った。ここにさらに４００μｌの抽出緩衝液を加えよく攪拌した後、４℃に冷却しながら３５００ｇで５分間遠心分離を行い、約４００μｌの上清を粗酵素液として回収した。それに対し、１００μｌの濃縮反応緩衝液（抽出緩衝液に１０ｍＭ ＮＡＤＰＨ、７５ｍＭ グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）、２．５Ｕ／ｍｌ グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を加えたもの）および５μｌの１０ｍＭのβ−アミリン・メタノール溶液を加えた。これを３０℃、６時間反応させた。１２Ｎ塩酸１０μｌを添加した後、５００μｌの酢酸エチルを用いて脂溶性成分の抽出を２回行い濃縮した。２０μｌのピリジン及び無水酢酸を加えて一晩放置することにより抽出物のアセチル化を行った。これに２００μｌの５０％メタノール水溶液を加えて反応を停止し、２００μｌのヘキサンを用いて抽出を２回行い濃縮した（1)）。対照実験として、2)ｐＥＳＣ−ＵＲＡを用いた形質転換体由来の粗酵素液を用いたもの、3)基質であるβ−アミリンを加えなかったもの、4)１００℃、５分で熱処理した粗酵素液で反応を行ったもの、5)ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１のＧＡＬ１プロモーター抑制のためガラクトースの代わりに同量のグルコースを加えたものについても同様の手法でサンプルを調製した。これを２０μｌのヘキサンに溶解し、１μｌをＧＣ−ＭＳ分析（島津製作所 ガスクロマトグラフ質量分析計 ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０， カラム：ＲＥＳＴＥＫ社 Ｒｔｘ−５ＭＳ，内径０．２５ｍｍ 膜厚０．２５μｍ 長さ３０ｍ， 昇温プログラム：２３０℃で３分間ホールド、 １０℃／分で昇温、 ３３０℃で８分間ホールド）に供した。全イオンモニター（ＴＩＭ）、及び、ｍ／ｚ＝２１８（３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンのベースピーク）のマスクロマトグラムで生成物の有無を解析した。ＴＩＭでは、３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンの生成は認められなかった（結果未記載）。しかしながら、ｍ／Ｚ＝２１８のマスクロマトグラムにおいて３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンが、1)の条件で観測された（図１）。この結果よりＣＹＰ９３Ｅ１翻訳産物はβ−アミリンへの２４位水酸化活性を有することを確認した。
次に、ソフォラジオールに対する反応性を検討するために、ソフォラジオール（５μｌ １０ｍＭ）を基質として、同様に酵素反応を行い、上記と同様にＧＣＭＳ解析を行った。上記の1)の反応条件の生成物のマスクロマトグラム解析（ｍ／Ｚ＝２１６ トリアセチルソヤサポゲノールＢのベースピーク）において、トリアセチルソヤサポゲノールＢのピークが観測された（図２）。これより、ＣＹＰ９３Ｅ１翻訳産物は、β−アミリンのみならず、ソフォラジオールに対しても、２４位水酸化活性を有することが明らかとなった。
【００３８】
（５）ｉｎ ｖｉｖｏ酵素活性試験
グルコースの代わりに２％ラフィノースを含むＳＣ−Ｕ培地２０ｍｌに形質転換酵母を植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで１８時間培養した。ヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）とガラクトース（最終濃度２％）を加え、さらに基質として１０μｌの１０ｍＭのβ−アミリン・メタノール溶液を加えた。酸素を供給するために、ファルコンチューブの上部を綿栓で封じ、無菌的かつ好気的にさらに２４時間培養した。遠心により細胞を収穫し、２ｍｌのスクリューバイアルへ移した。これに２５０μｌの４０％水酸化カリウム水溶液及び２５０μｌのメタノールを加え、十分に攪拌し、１００℃、５分で熱処理した。５００μｌのヘキサンを用いて脂溶性成分の抽出を２回行い濃縮した。２０μｌのピリジン及び無水酢酸を加えて一晩放置することにより抽出物のアセチル化を行った。これに２００μｌの５０％メタノール水溶液を加えて反応を停止し、２００μｌのヘキサンを用いて抽出を２回行い濃縮した（１））。対照実験として、2)ｐＥＳＣ−ＵＲＡを用いた形質転換体を用いたもの、3)基質であるβ−アミリンを加えなかったもの、4)ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１のＧＡＬ１プロモーター抑制のためガラクトースの代わりに同量のグルコースをくわえたものについても同様の手法でサンプルを調製した。これを１０μｌのヘキサンに溶解し、１μｌを（４）における条件と同条件でＧＣ−ＭＳ分析に供した（条件は（４）の実験と同じ）。1)の条件において３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンのピークがＴＩＭで観測され（図３）、かつ、そのピークのＭＳ開裂パターンは標品と一致した（図４）。ＴＩＭのピーク面積比による定量結果から、本条件と同一の条件で１Ｌ培養した場合（約２ｍｇのβ−アミリンを投与）、数μｇの３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンが得られることになる。
【００３９】
（６）発現プラスミドｐＥＳＣ−ＰＳＹの構築
エンドウ由来のβ−アミリン合成酵素ＰＳＹ（ＡＢ０３４８０２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７，３５４３−３４６０，２０００）を組み込んだプラスミドを鋳型に、配列番号４、５に示す、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端に対応するオリゴＤＮＡをプライマーとして、アニール温度５８℃でＰＣＲ（３０サイクル、宝酒造社製Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を行い、ＳａｌＩ及びＮｈｅＩサイトをそれぞれＮ末、Ｃ末に導入したＰＳＹの断片を得た。これをｐＥＳＣ−ＵＲＡのＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトに導入し、ｐＥＳＣ−ＰＳＹを作成し、既知の手法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ., ２６７，３５４３−３４６０，２０００）によりβ−アミリン合成酵素活性を確認した。
【００４０】
（７）発現プラスミドｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１の構築および形質転換酵母の作成
ｐＥＳＣ−ＰＳＹ及びｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１をＳａｌＩ及びＣｌａＩで消化した。得られたＰＳＹを含む断片とＣＹＰ９３Ｅ１を含む断片を連結することにより、ＰＳＹとＣＹＰ９３Ｅ１の共発現プラスミドｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１を構築した。これを酵母ＧＩＬ７７株にＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩを用いて導入し、形質転換体を得た。
【００４１】
（８）ＰＳＹおよびＣＹＰ９３Ｅ１の共発現実験
炭素源として２％グルコースを含むＳＣ−Ｕ培地２０ｍｌにヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）、エルゴステロール（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）、Ｔｗｅｅｎ８０（最終濃度５ｍｇ／ｍｌ）を加えた培地へ形質転換した酵母を植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで１日半培養した。培地を炭素源として２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｕ培地２０ｍｌにヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）、エルゴステロール（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）、Ｔｗｅｅｎ８０（最終濃度５ｍｇ／ｍｌ）を加えた培地へと交換した後、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで１日培養した。細胞をｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸−カリウム緩衝液へ移し、ヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）及びグルコース（最終濃度３％）を加え、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで１日インキュベートした。（４）における実験手法と同様にアセチル化したＧＣ−ＭＳ分析用サンプルを調製した。対照実験として、ｐＥＳＣ−ＵＲＡを用いた形質転換体、ｐＥＳＣ−ＰＳＹ、ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１を用いた形質転換体を用いた形質転換体についても同様の手法でサンプルを調製した。これを１０００μｌのヘキサンに溶解し、１μｌをＧＣ−ＭＳ分析に供した（条件は（４）実験に同じ）。図５に示すようにｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１形質転換酵母を用いた場合のみ３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンに対応するピークがＴＩＭで観測された。ピーク面積比による定量解析の結果、本条件で１Ｌ培養した場合、数百μｇの３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンが得られることになる。
【００４２】
（９）ＧＩＬ７７／ｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１の大量培養（１Ｌ）
５００ｍｌの三角フラスコに２５０ｍｌの炭素源として２％ラフィノースを含むＳＣ−Ｕ培地２５０ｍｌにヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）、エルゴステロール（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）、Ｔｗｅｅｎ８０（最終濃度５ｍｇ／ｍｌ）を加えた培地へ形質転換した酵母を植菌した。これを４本作成し、全量で１Ｌの培養を行った。３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間培養したのち、ガラクトースを加え（最終濃度２％）、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間培養した。細胞全量を１００ｍｌのｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸―カリウム緩衝液へ移し、ヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）及びグルコース（最終濃度３％）を加え、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで１日インキュベートした。
【００４３】
（１０）ＧＩＬ７７／ｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１の１Ｌ培養から生成物の単離
（９）で得た培養から遠心により細胞を収穫し、５０ｍｌの４０％水酸化カリウム水溶液及び５０ｍｌのメタノールを加え、１時間加熱還流を行った。５０ｍｌのヘキサンを用い脂溶性画分の抽出を行った。ヘキサン画分は５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で３回十分に洗浄した。この操作を３回繰り返し抽出を行い、約２３ｍｇの脂溶性画分を得た。
これを２段階のシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。まず、上記脂溶性画分をベンゼンに溶解し、シリカゲルＦＣ−４０（４ｇ、和光純薬）、ヘキサン・酢酸エチル溶媒系を用いて精製した。次に、当該画分をシリカゲルＦＣ−４０（２ｇ）及びベンゼン・酢酸エチル溶媒系を用いて精製し、０．５５ｍｇの３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンを得た。
【００４４】
（１１）発現プラスミドｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３の構築
シロイヌナズナ由来のβ−アミリンを含む９種のトリテルペンを与える多機能型トリテルペン合成酵素ＹＵＰ４３（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔ．, ４１，７７０５−７７１０，２０００）を組み込んだプラスミドを鋳型とし、配列番号６、７に示す、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端に相当するオリゴＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ（アニール温度５８℃、３０サイクル、宝酒造社製Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を行い、ＳａｌＩ及びＮｈｅＩサイトをそれぞれＮ末、Ｃ末に含むＹＵＰ４３の断片を得た。これをｐＥＳＣ−ＵＲＡのＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトに導入し、ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３を作成し、既知の手法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔ．, ４１，７７０５−７７１０，２０００）により多機能型トリテルペン合成酵素活性を確認した。
【００４５】
（１２）発現プラスミドｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１の構築および形質転換酵母の作成
ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３及びｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１をＳａｌＩ及びＣｌａＩで消化した。ＹＵＰ４３を含む断片とＣＹＰ９３Ｅ１を含む断片を連結することによりＹＵＰ４３とＣＹＰ９３Ｅ１を共発現させるプラスミドｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１を構築した。これを酵母ＧＩＬ７７株にＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩを用いて導入し、形質転換体を得た。
【００４６】
（１３）ＹＵＰ４３および配列番号８のポリヌクレオチドの転写・翻訳産物のポリペプチドの共発現実験
（８）と同様の手法により、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３、ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１、ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１、それぞれによる形質転換体ついてサンプルを調製した。これらを１０００μｌのヘキサンに溶解し、１μｌをＧＣ−ＭＳ分析に供した（条件は（４）実験に同じ）。図７に示すようにｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１形質転換酵母を用いた場合のみ、ＴＩＭにおいて３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンのピークが観測された。ＹＵＰ４３におけるβ−アミリンの生産量がＰＳＹのものより低いため、３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンの産生量はｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１形質転換体と比較して低下した。一方、他のトリテルペン（ルペオール、ブチロスペルモール、チルカラジエノール、タラキサステロール、シュードタラキサステロール、バウレエレノール、α−アミリン、マルチフロレノール）の水酸化体と考えられるピークは検出限界以下であった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、2004年2月25日出願の日本特許出願（特願2004-049123）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明により、オレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する酵素を遺伝子工学的に取り扱うことが可能となった。従って、当該水酸化酵素遺伝子を組み込んだ細胞を用い、例えば酵母などによる水酸化酵素の生産、水酸化反応の利用、植物トリテルペンの微生物生産などに利用可能である。また、水酸化酵素の遺伝子を植物に組み込むことによりソヤサポゲノールなどのトリテルペンの生産を増大させる等、農業分野での利用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】は配列番号８の翻訳産物によるβ−アミリンの２４位水酸化活性（in vitro）を示す。さらに詳しくは、生成物をアセチル化後ＧＣＭＳで解析したｍ／Ｚ＝２１８をモニターしたマスクロマトグラムを表す。Ａ〜Ｆは以下の結果を示す。 Ａ：３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品 Ｂ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母から調製した粗酵素液とβ-アミリンをＮＡＤＰＨ再生システム共存下反応させて得られる生成物 Ｃ：Ｂの反応系からβ-アミリンを除いて反応させた生成 Ｄ：Ｂの反応において、熱変性させた粗酵素液を用いて反応させた生成物 Ｅ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母を、グルコースを添加して培養。他はＢと同一条件。 Ｆ：ボイドベクターｐＥＳＣ-ＵＲＡによる形質転換酵母から調製した粗酵素液を使用。他はＢと同一条件。
【図２】は配列番号８の翻訳産物によるソフォラジオール２４位水酸化活性（in vitro）を表す。さらに詳しくは、生成物をアセチル化後ＧＣＭＳで解析したｍ／Ｚ＝２１６をモニターしたマスクロマトグラムを表す。Ａ〜Ｆは以下の結果を示す。 Ａ：トリアセチルソヤサポゲノールＢの標品 Ｂ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母から調製した粗酵素液とβアミリンをＮＡＤＰＨ再生システム共存下反応させて得られた生成物 Ｃ：Ｂの反応系からソフォラジオールを除いて反応させた生成 Ｄ：Ｂの反応において、熱変性させた粗酵素液を用いて反応させた生成物 Ｅ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母を、グルコースを添加して培養。他はＢと同一条件。 Ｆ：ボイドベクターｐＥＳＣ-ＵＲＡによる形質転換酵母から調製した粗酵素液を使用。他はＢと同一条件。
【図３】は配列番号８の翻訳産物によるβ−アミリンに対する２４位水酸化活性（in vivo）生成物を示す。さらに詳しくは、生成物をアセチル化後ＧＣ-ＭＳで解析したＴＩＭによるクロマトグラムを示す。Ａ〜Ｅは以下の結果を示す。 Ａ：３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品（２０ｐｍｏｌ） Ｂ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母にβ-アミリンを投与して得られた生成物 Ｃ：β-アミリンを投与しない場合。他はＢと同じ。 Ｄ：形質転換酵母を、グルコースを添加して培養。他はＢと同一条件。 Ｅ：ボイドベクターｐＥＳＣ-ＵＲＡによる形質転換酵母β-アミリンを投与。他はＢと同一条件。
【図４】は、配列番号８の翻訳産物のβ−アミリン２４位水酸化活性（in vivo）を示す。ＡおよびＢは以下の結果を示す。 Ａ：図３のＢにおいて検出した保持時間１５．３５分のピークのマススペクトル Ｂ：図３のＡ（３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品）のマススペクトル
【図５】はＣＹＰ９３Ｅ１とβ−アミリン合成酵素（ＰＳＹ）の共発現による３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンの生産を示す。さらに詳しくは、各形質転換酵母（ＧＩＬ７７）から得られた脂溶性画分をアセチル化し、ＧＣＭＳ解析によるＴＩＭによるクロマトグラムを示す。Ａ〜Ｅは以下の結果を示す。 Ａ：３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品（２０ｐｍｏｌ） Ｂ：ｐＥＳＣ-ＰＳＹ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母の抽出物 Ｃ：ｐＥＳＣ-ＰＳＹによる形質転換酵母の抽出物 Ｄ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母の抽出物 Ｅ：ｐＥＳＣ-ＵＲＡによる形質転換酵母の抽出物
【図６】はＧＩＬ７７／ｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１の１Ｌ培養から得た生成物の1Ｈ−ＮＭＲを示す。
【図７】は配列番号８の翻訳産物と多機能型トリテルペン合成酵素（ＹＵＰ４３）の共発現による３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンの生産を示す。さらに詳しくは、各形質転換酵母（ＧＩＬ７７）から得られた脂溶性画分をアセチル化し、ＧＣＭＳ解析におけるＴＩＭによるクロマトグラムを示す。Ａ〜Ｅは以下の結果を示す。 Ａ：３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品（２０ｐｍｏｌ） Ｂ：ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母の抽出物 Ｃ：ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３による形質転換酵母の抽出物 Ｄ：ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母の抽出物 Ｅ：ｐＥＳＣ−Ｕｒａによる形質転換酵母の抽出物
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来のソヤサポゲノールＢ生合成に関与する酵素遺伝子を遺伝子工学的な手法を用いて形質転換した細胞、ならびにその細胞を利用することによりソヤサポゲノールＢを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ソヤサポゲノールＢ（12-oleanene-3,22,24-triol）は、大豆種子より単離、構造決定されたオレアナン骨格を有するトリテルペン（Chem. Pharm. Bull., 24, p121-129, 1976、Chem. Pharm. Bull., 30, p2294-2297, 1982）（非特許文献１および２）であり、その配糖体であるソヤサポニンはマメ科植物に広く分布している。
これまでにソヤサポゲノールＢに関しては、抗補体活性、血小板凝集抑制作用（特開昭61-37749）（特許文献１）、抗腫瘍活性（特開平10-234396）（特許文献２）および肝保護作用（Bioorg. Med. Chem. Lett., 7, 85-88,1997）（非特許文献３）などが報告されており、医薬品もしくは医薬品原料としての有用性が期待されている。
【０００３】
ソヤサポゲノールＢの製造法としては、大豆種子に含有されるサポニンの糖鎖を加水分解したのち、ソヤサポゲノールＢを精製する方法が知られているが、大豆種子に含有されているサポニンの割合は約0.2％（薬学雑誌104,162-168,1984）（非特許文献４）と少なく、より効率的な製造法が求められている。
ソヤサポゲノールＢの生合成前駆体であるβ−アミリンは、メバロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクアレンが閉環することにより生合成され、その後、２段階の水酸化反応を経てソヤサポゲノールＢが生合成されると推定される。
【０００４】
ソヤサポゲノールＢと構造的に類似するソフォラジオール（12-oleanene-3,22-diol）は槐花（エンジュ）の成分として報告されている物質（薬学雑誌78,1090-1094,1958）（非特許文献５）であるが、このソフォラジオールの２４位を水酸化するとソヤサポゲノールＢを生産することが可能である。
実際、カンゾウの培養細胞由来の水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールの24位を水酸化することによる、ソヤサポゲノールＢの製造法が開示されている。（WO02/086142）（特許文献３）
【０００５】
【特許文献１】特開昭６１−３７７４９号公報
【特許文献２】特開平１０−２３４３９６号公報
【特許文献３】国際公開WO０２／０８６１４２号公報
【非特許文献１】Chem. Pharm. Bull., 24, p121-129, 1976
【非特許文献２】Chem. Pharm. Bull., 30, p2294-2297, 1982
【非特許文献３】Bioorg.Med.Chem. Lett., 7, 85-88,1997
【非特許文献４】薬学雑誌104, 162-168,1984
【非特許文献５】薬学雑誌78, 1090-1094,1958
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ソヤサポゲノールＢの生合成前駆体であるβ−アミリンは、メバロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクアレンが閉環することにより生合成され、その後、２段階の水酸化反応を経てソヤサポゲノールＢが生合成される。しかしながら、この反応に関与する水酸化酵素の遺伝子は明らかにされていなかった。そのため、水酸化酵素についての遺伝子工学的な利用が不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、β−アミリンからソヤサポゲノールＢに至る生合成に関与するシトクロームＰ４５０型の酵素の遺伝子が、ソヤサポゲノールＢの配糖体であるソヤサポニンを高生産するダイズのＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）クローンや機能未同定クローンの中に含まれていると考え、ラノステロール欠損酵母変異株を用いて、これらダイズのクローンの機能解析を行った。解析を行ったクローンのうち配列番号８で表されるポリヌクレオチドを転写及び翻訳させた酵母において本来検出されないオレアナン型トリテルペンの２４位の水酸化活性を検出した。水酸化活性を検出した酵素のポリヌクレオチド配列は配列番号８であり、推定されるポリペプチド配列は配列番号９である。配列番号８に類似する配列として、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１３５４８５、配列番号１０、推定されるポリペプチド配列は配列番号１１）が知られている。配列番号８で表されるポリヌクレオチドと配列番号１０で表されるポリヌクレオチドは、１２１番目、１７１番目および１０８１番目の３箇所が異なる。（以下、配列番号８で表される配列もシトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１と呼ぶことがある。）また、配列番号９で表されるポリペプチドと配列番号１１で表されるポリペプチドは、４１番目および６１番目のアミノ酸が異なる。本発明者らは、配列番号８で表されるポリヌクレオチドがオレアナン型トリテルペンの２４位を水酸化する酵素タンパクをコードしていることを明らかにした。この知見に基づき、本発明者らは鋭意努力し、本発明を完成させた。
【０００８】
従って、本発明は以下の１〜１７に関する。
１. 配列番号８で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
２． ポリヌクレオチドが配列番号８で表されるポリヌクレオチドである上記１に記載の発現ベクター。
３． 上記１または２記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
４． 宿主が微生物である上記３記載の形質転換体。
５． 微生物が酵母である上記４記載の形質転換体。
６． 配列番号８で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびβ−アミリン合成酵素遺伝子を有する発現ベクター。
７． ポリヌクレオチドが配列番号８で表されるポリヌクレオチドである上記６に記載の発現ベクター。
８． 上記６または７記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
９． 宿主が微生物である上記８記載の形質転換体。
１０． 微生物が酵母である上記９記載の形質転換体。
１１． 受託番号FERM BP−10201として寄託されているラノステロール合成酵素欠損酵母変異株。
１２． 上記３から５のいずれかに記載の形質転換体を培養して、上記１に記載のポリペプチドを産生する工程を含むオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドを製造する方法。
１３． 上記８から１０のいずれかに記載の形質転換体を培養して、
1）上記３に記載のポリペプチドを産生する工程および
2）β−アミリン合成酵素を産生する工程
を含むオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドおよびβ−アミリン合成酵素を製造する方法。
１４． 上記３から５のいずれかに記載の形質転換体をオレアナン型トリテルペンに作用させる工程を含む２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
１５． 上記８から１０のいずれかに記載された形質転換体の培養生産による２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
１６． 上記１１に記載の酵母変異株の培養生産による２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、オレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素の遺伝子塩基配列ならびにアミノ酸配列を明らかにすることができた。さらに、当該遺伝子を遺伝子工学的に利用することにより、遺伝子産物である酵素タンパクを大量に生産することができる。
また、生産された酵素タンパク質又は該酵素タンパク質含む形質転換体を用いて、トリテルペンの２４位を水酸化することが可能となった。また当該遺伝子とβ−アミリン合成酵素の遺伝子で形質転換体を用いることにより、２４位が水酸化されたトリテルペンを直接培養生産することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるオレアナン型トリテルペンとしては、β−アミリン、ソフォラジオール、ソヤサポゲノールAおよびBなどが知られているが、本発明におけるオレアナン型トリテルペンは上記に限定されない。
２４位が水酸化されるオレアナン型トリテルペンとしては、β−アミリンやソフォラジオールがあげられるが、本発明の方法により２４位が水酸化される化合物であれば上記に限定されない。２４位が水酸化されたトリテルペンとしては、ソヤサポゲノールAおよびBがあげられるが、本発明による酸化成績体であればソヤサポゲノールAおよびBに限定されない。
本発明によれば、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドおよびその均等体の転写・翻訳産物を利用して２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを製造することができる。なお、均等体とは、同一機能を有し、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１に記載の配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を指す。
【００１１】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、シトクロームP450遺伝子CYP93E1で表される塩基配列を有するDNAの一部又は全部（又は、その相補鎖）をプローブとして、ハイブリダイズを使用する手法（例えば、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等）を用いることによりヌクレオチドのハイブリダイゼーションが確認できる。具体的には、０．５mol/lの塩化ナトリウム存在下、５５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０よりなる）を用いる場合が例示される。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（（Molecular cloning、A Laboratory Manual、 T．マニアティス（T．Maniatis）他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1989年発行）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なDNAとして具体的には、BLAST (National Center for Biotechnology Information)を用いて計算したときに、シトクロームP450遺伝子CYP93E1で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するDNAを挙げることができる。なお、本発明における相同性は、BLASTのパラメータをWordsize:3、Matrix:BLOSOM62、Gap Costs:Existence:11、Extension:1に設定したときの数値を表す。
また、「シトクロームP450遺伝子CYP93E1のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、具体的には、シトクロームP450遺伝子CYP93E1のポリヌクレオチド配列において、１若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ、オレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。シトクロームP450遺伝子CYP93E1のヌクレオチド配列において置換されるヌクレオチドの個数は、上記の相同性を満たし、かつ、オレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードする数であれば特に限定されない。
シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドに対する変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異も含む。人為的に変異させる手段としては、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドを用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、遺伝子工学的に、１又は複数のヌクレオチド残基が欠失、置換、挿入、付加の少なくとも１つがなされているポリヌクレオチドを得る方法が挙げられる。こうして得られた変異ポリヌクレオチドを利用することにより、本酵素の活性の至適温度、熱安定性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、基質特異性等の性質が異なったポリペプチドを得ることが可能となる。
さらに、２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを産生し得る他の微生物、植物、及び、動物（好ましくはオレアナン型トリテルペン産生し得る、植物、より好ましくはマメ科植物、最も好ましくは大豆）に対してシトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１の塩基配列を有するヌクレオチドの一部又は全部（又は、その相補鎖）をプローブとして、ハイブリダイズを使用する手法（例えば、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法）、または、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１の塩基配列を有するヌクレオチドの一部又は全部（又は、その相補鎖）をプライマーとしてPCRを行う手法等によって、シトクロームP450遺伝子CYP93E1のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることもできる。
また、上記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の情報を基にして、化学合成によって得ることもできる。この方法は、ジーン（Gene）、第60(1)巻、第115-127頁(1987)の記載を参照して行うことができる。
【００１２】
さらに、本発明は、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドおよびその均等体を保持する、及び／又は、発現するための自立複製可能なベクター（好ましくは発現ベクター）で宿主を形質転換した形質転換体に関する。該ベクターは、シトクロームＰ４５０遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ１のポリヌクレオチドおよびその均等体に加え、さらにβ−アミリン合成酵素遺伝子を含んで良い。
【００１３】
宿主の例としては、特に限定されないが、微生物、植物、動物等が挙げられる。微生物としては、酵母、大腸菌等が挙げられ、好ましくは酵母が用いられる。動物としてはカイコがあげられる。植物としては大豆があげられる。植物に本発明のベクターを導入する事で、２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの含量の増加した植物を提供可能である。
【００１４】
形質転換する酵母の例としては、ラノステロールシンターゼを欠いた酵母ＧＩＬ７７（Kushiro, T. et al., Eur. J. Biochem., 256, 238-244, 1998）がある。上記シトクロームP450遺伝子CYP93E1に対応するｃＤＮＡ及びエンドウ由来β−アミリン合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＥＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、ラノステロール合成酵素を欠いた酵母ＧＩＬ７７を形質転換し、２種の遺伝子を共発現させることにより、２４位が水酸化されたトリテルペンを培養生産することが可能となる。
【００１５】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００１６】
宿主細胞が微生物である場合、発現ベクターとしては、例えば、pBluescript (STRATAGENE社製)、pUC18 (タカラバイオ社製)、pUC118 (タカラバイオ社製)、pUC19 (タカラバイオ社製)、pUC119 (タカラバイオ社製)等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌、糸状菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、タカアミラーゼ遺伝子プロモーター、ＴＥＦ１遺伝子プロモーター等の麹菌等に由来するプロモーター等を挙げることができる。
また、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へポリヌクレオチドを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) 〕等を挙げることができる。
【００１７】
酵母菌株が宿主細胞である場合には、発現ベクターとして、例えばpAUR101(タカラバイオ社製)、pAUR112 (タカラバイオ社製)、pI-RED1(東洋紡績社製)等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、解糖系酵素遺伝子プロモーター、Galプロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にポリヌクレオチドを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978) 〕、酢酸リチウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）、153, 163 (1983)〕等を挙げることができる。
【００１８】
宿主細胞の培地、培養条件については、公知の方法に従って適宜選択することが可能である。微生物を宿主細胞とする場合、得られた形質転換体を培養する培地は、該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、ポテトデキストロース、グルコース、スクロース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機塩若しくは有機酸のアンモニウム塩その他の窒素化合物、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、肉エキスを用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００１９】
宿主細胞がカイコである場合、例えばバキュロウィルス発現系を用いた公知の方法により、本発明のポリペプチドを発現させることができる。[Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 1-20(2003)]また、植物細胞を宿主として本発明のポリペプチドを形質転換した植物を得る場合、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのTiプラスミドまたはバイナリ−プラスミド系、アグロバクテリウム・リゾジェネスのRiプラスミド、ポリエチレングリコールを用いる直接的な遺伝子伝達またはエレクトロポレーション法が有効である。[Methods in Molecular Biology, 267, Recombinant Gene Expression 329-50(2004)]
【００２０】
また、誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターを導入した形質転換体を培養する場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた場合はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた場合はインドールアクリル酸等を培地に添加することができる。
【００２１】
なお、本発明のポリペプチドの発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング 第２版に記載されている方法等に準じて行うことができる。
【００２２】
上記３〜５記載の形質転換体を使用してオレアナン型トリテルペン２４位水酸化体を製造する場合、形質転換体の培養液に基質となるオレアナン型トリテルペンを添加して培養し、得られた２４位水酸化体を酢酸エチルやエーテルなどの有機溶媒で抽出後、シリカゲルやODSを用いて精製する。
【００２３】
また、形質転換体の培養液から無細胞抽出液を調製してオレアナン型トリテルペン24位水酸体を製造することもできる。この場合、収穫した細胞を懸濁液に懸濁し、ホモジナイザー、超音波破砕機あるいはフレンチプレス等により細胞を破砕後、遠心分離して無細胞抽出液を得る。緩衝液には、ポリペプチドの失活を防ぐため、抗酸化剤、酵素の安定化剤、ポリフェノール吸着剤、金属配位子などを添加することができる。さらに比活性を高めるにはポリペプチドを精製することが有効であり、超遠心機による遠心分離法、硫安等による塩析方、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、電気泳動法などの手法を単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。
【００２４】
得られたポリペプチドを含む緩衝液に、基質となるオレアナン型トリテルペンならびに補酵素を添加して、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃でインキュベートする。補酵素としてはNADHあるいはNADPHが利用でき、グルコース-6-リン酸とグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを用いたNADPH再構成系も併用できる。また、形質転換細胞が産生するNADPH-P450リダクターゼ以外のNADPH-P450リダクターゼを外部から加えて水酸化反応を行うことも可能である。
【００２５】
上記８〜１０記載の形質転換体を使用する場合、形質転換細胞自身が産生する2,3-オキシドスクアレンを利用してオレアナン型トリテルペンが産生されるため、外部からオレアナン型トリテルペンを添加せずに、オレアナン型トリテルペン24位水酸化体を製造することができる。得られた24位水酸化体は酢酸エチルやエーテルなどの有機溶媒で抽出後、シリカゲルやODSを用いて精製する。
以下に本発明の実施例の概略を記載する。
【００２６】
ダイズ由来のＥＳＴ及び機能未同定でかつ全長の塩基配列が報告されているシトクロームＰ４５０クローンを７種（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ１３５４８５、Ｙ１０４９１、Ｙ１０９８２、Ｙ１０９８３、Ｙ１０４９３、ＡＦ０２２４５９、及び、ＴＩＧＲ Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＴＣ１００９２１）選択した。このうち、本活性を示したＣＹＰ９３Ｅ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１３５４８５）に高い相同性を示した配列番号８のポリヌクレオチドについて、以下に記す。ダイズ芽生えより調製したｍＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＹＰ９３Ｅ１に対応するｃＤＮＡ（配列番号８）を増幅し、酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＥＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、ラノステロールシンターゼを欠いた酵母ＧＩＬ７７（Kushiro, T. et al., Eur. J. Biochem., 256, 238-244, 1998）を形質転換し機能解析を行った。形質転換酵母の無細胞抽出液とβ−アミリンを反応させ、生成物をアセチル化し、ＧＣＭＳで解析した。その結果、３，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンを検出した。
【００２７】
同様に、形質転換酵母の無細胞抽出液とソフォラジオールを反応させ、生成物をアセチル化し、ＧＣＭＳで解析した。その結果、トリアセチルソヤサポゲノールＢを検出した。
【００２８】
形質転換酵母の培養にβ−アミリンを投与し、反応後、細胞を収穫した。脂溶性画分を抽出し、アセチル化後、ＧＣＭＳで解析した。その結果、３，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンを検出した。
【００２９】
上記配列番号８のｃＤＮＡ及びエンドウ由来β−アミリン合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＥＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、ラノステロール合成酵素を欠いた酵母ＧＩＬ７７を形質転換し、２種の遺伝子を共発現させた。この形質転換酵母をGIL77/pESC・PSY・CYP93E1と命名し、平成１６年２月６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東１-１-１ 中央第６）に受託番号FERM P-19675として寄託した（平成１７年１月６日にFERM BP-10201に移管）。
【００３０】
形質転換酵母を培養し、細胞を収穫した。脂溶性画分を抽出し、アセチル化後、ＧＣＭＳで解析した。その結果、３，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンを検出した。
【００３１】
同様に、上記配列番号８のｃＤＮＡ及びシロイヌナズナ由来混合トリテルペン合成酵素遺伝子を酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＥＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、ラノステロールシンターゼを欠いた酵母ＧＩＬ７７を形質転換し、２種の遺伝子を共発現させた。
【００３２】
形質転換酵母を培養し、細胞を収穫した。脂溶性画分を抽出し、アセチル化後、ＧＣＭＳで解析した。その結果、３，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンを検出した。他のジアセトキシトリテルペンは検出限界以下であった。
【００３３】
以上の結果、該酵母において本来検出されないソフォラジオール及びβ−アミリンの２４位に対する水酸化活性が認められたことから、配列番号８はオレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素をコードする遺伝子であると明らかにすることができた。一方、同様に活性を調べた他の６種のＰ４５０遺伝子においては、本活性を検出することはできなかった。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（１）ダイズ芽生えのｃＤＮＡの調製
水浸１４日後のダイズ（早生枝豆、アタリヤ農園）幼葉から、フェノール／クロロフォルム法により全ＲＮＡを抽出した。これを鋳型として、逆転写酵素SuperscriptII（GIBCOBRL製）と、配列番号１に示すプライマーを用いてｃＤＮＡを調製した。
【００３５】
（２）配列番号８のポリヌクレオチドの増幅
上記（１）で調製したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号２と３に示す、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端に相当する箇所のオリゴＤＮＡをプライマーとして、アニール温度６５℃でＰＣＲ（３０サイクル、宝酒造社製Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を行い、ＣＹＰ９３Ｅ１（配列番号８）の全長クローンを得た。
【００３６】
（３）ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１の構築及び形質転換酵母の作成
上記（２）で得られた全長クローンを制限酵素ＳｐｅＩとＣｌａＩで処理し、酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＳｐｅＩとＣｌａＩサイトに組み込んだ。これをｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅとした。ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅを、酵母ＩＮＶＳＣ２株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｚｙｍｏ Ｒｅａｓｅａｃｈ 社）を用いて導入した。
【００３７】
（４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性試験
グルコースの代わりに２％ラフィノースを含むＳＣ−Ｕ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）２０ｍｌに形質転換酵母を植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで１８時間培養した。ヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）とガラクトース（最終濃度２％）を加え、同条件でさらに２０時間培養した。遠心により細胞を収穫し、２ｍｌのスクリューバイアルへと移し、１００μｌの抽出緩衝液（ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸―カリウム緩衝液に１０％スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１４ｍＭの２−メルカプトエタノールを加えたもの）を加え、再懸濁した。ここに希塩酸にて洗浄した０．４−０．６ｍｍ径のガラスビーズ（井内盛栄堂）を適量加えた。４℃に冷却し、ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＤＥＲ（ＢＩＯＳＰＥＣ社）を用いて細胞の破砕を行った。ここにさらに４００μｌの抽出緩衝液を加えよく攪拌した後、４℃に冷却しながら３５００ｇで５分間遠心分離を行い、約４００μｌの上清を粗酵素液として回収した。それに対し、１００μｌの濃縮反応緩衝液（抽出緩衝液に１０ｍＭ ＮＡＤＰＨ、７５ｍＭ グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）、２．５Ｕ／ｍｌ グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を加えたもの）および５μｌの１０ｍＭのβ−アミリン・メタノール溶液を加えた。これを３０℃、６時間反応させた。１２Ｎ塩酸１０μｌを添加した後、５００μｌの酢酸エチルを用いて脂溶性成分の抽出を２回行い濃縮した。２０μｌのピリジン及び無水酢酸を加えて一晩放置することにより抽出物のアセチル化を行った。これに２００μｌの５０％メタノール水溶液を加えて反応を停止し、２００μｌのヘキサンを用いて抽出を２回行い濃縮した（1)）。対照実験として、2)ｐＥＳＣ−ＵＲＡを用いた形質転換体由来の粗酵素液を用いたもの、3)基質であるβ−アミリンを加えなかったもの、4)１００℃、５分で熱処理した粗酵素液で反応を行ったもの、5)ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１のＧＡＬ１プロモーター抑制のためガラクトースの代わりに同量のグルコースを加えたものについても同様の手法でサンプルを調製した。これを２０μｌのヘキサンに溶解し、１μｌをＧＣ−ＭＳ分析（島津製作所 ガスクロマトグラフ質量分析計 ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０， カラム：ＲＥＳＴＥＫ社 Ｒｔｘ−５ＭＳ，内径０．２５ｍｍ 膜厚０．２５μｍ 長さ３０ｍ， 昇温プログラム：２３０℃で３分間ホールド、 １０℃／分で昇温、 ３３０℃で８分間ホールド）に供した。全イオンモニター（ＴＩＭ）、及び、ｍ／ｚ＝２１８（３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンのベースピーク）のマスクロマトグラムで生成物の有無を解析した。ＴＩＭでは、３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンの生成は認められなかった（結果未記載）。しかしながら、ｍ／Ｚ＝２１８のマスクロマトグラムにおいて３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンが、1)の条件で観測された（図１）。この結果よりＣＹＰ９３Ｅ１翻訳産物はβ−アミリンへの２４位水酸化活性を有することを確認した。
次に、ソフォラジオールに対する反応性を検討するために、ソフォラジオール（５μｌ １０ｍＭ）を基質として、同様に酵素反応を行い、上記と同様にＧＣＭＳ解析を行った。上記の1)の反応条件の生成物のマスクロマトグラム解析（ｍ／Ｚ＝２１６ トリアセチルソヤサポゲノールＢのベースピーク）において、トリアセチルソヤサポゲノールＢのピークが観測された（図２）。これより、ＣＹＰ９３Ｅ１翻訳産物は、β−アミリンのみならず、ソフォラジオールに対しても、２４位水酸化活性を有することが明らかとなった。
【００３８】
（５）ｉｎ ｖｉｖｏ酵素活性試験
グルコースの代わりに２％ラフィノースを含むＳＣ−Ｕ培地２０ｍｌに形質転換酵母を植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで１８時間培養した。ヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）とガラクトース（最終濃度２％）を加え、さらに基質として１０μｌの１０ｍＭのβ−アミリン・メタノール溶液を加えた。酸素を供給するために、ファルコンチューブの上部を綿栓で封じ、無菌的かつ好気的にさらに２４時間培養した。遠心により細胞を収穫し、２ｍｌのスクリューバイアルへ移した。これに２５０μｌの４０％水酸化カリウム水溶液及び２５０μｌのメタノールを加え、十分に攪拌し、１００℃、５分で熱処理した。５００μｌのヘキサンを用いて脂溶性成分の抽出を２回行い濃縮した。２０μｌのピリジン及び無水酢酸を加えて一晩放置することにより抽出物のアセチル化を行った。これに２００μｌの５０％メタノール水溶液を加えて反応を停止し、２００μｌのヘキサンを用いて抽出を２回行い濃縮した（１））。対照実験として、2)ｐＥＳＣ−ＵＲＡを用いた形質転換体を用いたもの、3)基質であるβ−アミリンを加えなかったもの、4)ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１のＧＡＬ１プロモーター抑制のためガラクトースの代わりに同量のグルコースをくわえたものについても同様の手法でサンプルを調製した。これを１０μｌのヘキサンに溶解し、１μｌを（４）における条件と同条件でＧＣ−ＭＳ分析に供した（条件は（４）の実験と同じ）。1)の条件において３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンのピークがＴＩＭで観測され（図３）、かつ、そのピークのＭＳ開裂パターンは標品と一致した（図４）。ＴＩＭのピーク面積比による定量結果から、本条件と同一の条件で１Ｌ培養した場合（約２ｍｇのβ−アミリンを投与）、数μｇの３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンが得られることになる。
【００３９】
（６）発現プラスミドｐＥＳＣ−ＰＳＹの構築
エンドウ由来のβ−アミリン合成酵素ＰＳＹ（ＡＢ０３４８０２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７，３５４３−３４６０，２０００）を組み込んだプラスミドを鋳型に、配列番号４、５に示す、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端に対応するオリゴＤＮＡをプライマーとして、アニール温度５８℃でＰＣＲ（３０サイクル、宝酒造社製Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を行い、ＳａｌＩ及びＮｈｅＩサイトをそれぞれＮ末、Ｃ末に導入したＰＳＹの断片を得た。これをｐＥＳＣ−ＵＲＡのＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトに導入し、ｐＥＳＣ−ＰＳＹを作成し、既知の手法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ., ２６７，３５４３−３４６０，２０００）によりβ−アミリン合成酵素活性を確認した。
【００４０】
（７）発現プラスミドｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１の構築および形質転換酵母の作成
ｐＥＳＣ−ＰＳＹ及びｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１をＳａｌＩ及びＣｌａＩで消化した。得られたＰＳＹを含む断片とＣＹＰ９３Ｅ１を含む断片を連結することにより、ＰＳＹとＣＹＰ９３Ｅ１の共発現プラスミドｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１を構築した。これを酵母ＧＩＬ７７株にＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩを用いて導入し、形質転換体を得た。
【００４１】
（８）ＰＳＹおよびＣＹＰ９３Ｅ１の共発現実験
炭素源として２％グルコースを含むＳＣ−Ｕ培地２０ｍｌにヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）、エルゴステロール（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）、Ｔｗｅｅｎ８０（最終濃度５ｍｇ／ｍｌ）を加えた培地へ形質転換した酵母を植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで１日半培養した。培地を炭素源として２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｕ培地２０ｍｌにヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）、エルゴステロール（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）、Ｔｗｅｅｎ８０（最終濃度５ｍｇ／ｍｌ）を加えた培地へと交換した後、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで１日培養した。細胞をｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸−カリウム緩衝液へ移し、ヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）及びグルコース（最終濃度３％）を加え、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで１日インキュベートした。（４）における実験手法と同様にアセチル化したＧＣ−ＭＳ分析用サンプルを調製した。対照実験として、ｐＥＳＣ−ＵＲＡを用いた形質転換体、ｐＥＳＣ−ＰＳＹ、ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１を用いた形質転換体を用いた形質転換体についても同様の手法でサンプルを調製した。これを１０００μｌのヘキサンに溶解し、１μｌをＧＣ−ＭＳ分析に供した（条件は（４）実験に同じ）。図５に示すようにｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１形質転換酵母を用いた場合のみ３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンに対応するピークがＴＩＭで観測された。ピーク面積比による定量解析の結果、本条件で１Ｌ培養した場合、数百μｇの３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンが得られることになる。
【００４２】
（９）ＧＩＬ７７／ｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１の大量培養（１Ｌ）
５００ｍｌの三角フラスコに２５０ｍｌの炭素源として２％ラフィノースを含むＳＣ−Ｕ培地２５０ｍｌにヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）、エルゴステロール（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）、Ｔｗｅｅｎ８０（最終濃度５ｍｇ／ｍｌ）を加えた培地へ形質転換した酵母を植菌した。これを４本作成し、全量で１Ｌの培養を行った。３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間培養したのち、ガラクトースを加え（最終濃度２％）、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間培養した。細胞全量を１００ｍｌのｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸―カリウム緩衝液へ移し、ヘミン（最終濃度１３μｇ／ｍｌ）及びグルコース（最終濃度３％）を加え、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで１日インキュベートした。
【００４３】
（１０）ＧＩＬ７７／ｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１の１Ｌ培養から生成物の単離
（９）で得た培養から遠心により細胞を収穫し、５０ｍｌの４０％水酸化カリウム水溶液及び５０ｍｌのメタノールを加え、１時間加熱還流を行った。５０ｍｌのヘキサンを用い脂溶性画分の抽出を行った。ヘキサン画分は５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で３回十分に洗浄した。この操作を３回繰り返し抽出を行い、約２３ｍｇの脂溶性画分を得た。
これを２段階のシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。まず、上記脂溶性画分をベンゼンに溶解し、シリカゲルＦＣ−４０（４ｇ、和光純薬）、ヘキサン・酢酸エチル溶媒系を用いて精製した。次に、当該画分をシリカゲルＦＣ−４０（２ｇ）及びベンゼン・酢酸エチル溶媒系を用いて精製し、０．５５ｍｇの３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンを得た。
【００４４】
（１１）発現プラスミドｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３の構築
シロイヌナズナ由来のβ−アミリンを含む９種のトリテルペンを与える多機能型トリテルペン合成酵素ＹＵＰ４３（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔ．, ４１，７７０５−７７１０，２０００）を組み込んだプラスミドを鋳型とし、配列番号６、７に示す、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端に相当するオリゴＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ（アニール温度５８℃、３０サイクル、宝酒造社製Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を行い、ＳａｌＩ及びＮｈｅＩサイトをそれぞれＮ末、Ｃ末に含むＹＵＰ４３の断片を得た。これをｐＥＳＣ−ＵＲＡのＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトに導入し、ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３を作成し、既知の手法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔ．, ４１，７７０５−７７１０，２０００）により多機能型トリテルペン合成酵素活性を確認した。
【００４５】
（１２）発現プラスミドｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１の構築および形質転換酵母の作成
ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３及びｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１をＳａｌＩ及びＣｌａＩで消化した。ＹＵＰ４３を含む断片とＣＹＰ９３Ｅ１を含む断片を連結することによりＹＵＰ４３とＣＹＰ９３Ｅ１を共発現させるプラスミドｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１を構築した。これを酵母ＧＩＬ７７株にＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩを用いて導入し、形質転換体を得た。
【００４６】
（１３）ＹＵＰ４３および配列番号８のポリヌクレオチドの転写・翻訳産物のポリペプチドの共発現実験
（８）と同様の手法により、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３、ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１、ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１、それぞれによる形質転換体ついてサンプルを調製した。これらを１０００μｌのヘキサンに溶解し、１μｌをＧＣ−ＭＳ分析に供した（条件は（４）実験に同じ）。図７に示すようにｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１形質転換酵母を用いた場合のみ、ＴＩＭにおいて３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンのピークが観測された。ＹＵＰ４３におけるβ−アミリンの生産量がＰＳＹのものより低いため、３β，２４−ジアセトキシ−１２−オレアネンの産生量はｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１形質転換体と比較して低下した。一方、他のトリテルペン（ルペオール、ブチロスペルモール、チルカラジエノール、タラキサステロール、シュードタラキサステロール、バウレエレノール、α−アミリン、マルチフロレノール）の水酸化体と考えられるピークは検出限界以下であった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、2004年2月25日出願の日本特許出願（特願2004-049123）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明により、オレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する酵素を遺伝子工学的に取り扱うことが可能となった。従って、当該水酸化酵素遺伝子を組み込んだ細胞を用い、例えば酵母などによる水酸化酵素の生産、水酸化反応の利用、植物トリテルペンの微生物生産などに利用可能である。また、水酸化酵素の遺伝子を植物に組み込むことによりソヤサポゲノールなどのトリテルペンの生産を増大させる等、農業分野での利用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】は配列番号８の翻訳産物によるβ−アミリンの２４位水酸化活性（in vitro）を示す。さらに詳しくは、生成物をアセチル化後ＧＣＭＳで解析したｍ／Ｚ＝２１８をモニターしたマスクロマトグラムを表す。Ａ〜Ｆは以下の結果を示す。 Ａ：３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品 Ｂ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母から調製した粗酵素液とβ-アミリンをＮＡＤＰＨ再生システム共存下反応させて得られる生成物 Ｃ：Ｂの反応系からβ-アミリンを除いて反応させた生成 Ｄ：Ｂの反応において、熱変性させた粗酵素液を用いて反応させた生成物 Ｅ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母を、グルコースを添加して培養。他はＢと同一条件。 Ｆ：ボイドベクターｐＥＳＣ-ＵＲＡによる形質転換酵母から調製した粗酵素液を使用。他はＢと同一条件。
【図２】は配列番号８の翻訳産物によるソフォラジオール２４位水酸化活性（in vitro）を表す。さらに詳しくは、生成物をアセチル化後ＧＣＭＳで解析したｍ／Ｚ＝２１６をモニターしたマスクロマトグラムを表す。Ａ〜Ｆは以下の結果を示す。 Ａ：トリアセチルソヤサポゲノールＢの標品 Ｂ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母から調製した粗酵素液とβアミリンをＮＡＤＰＨ再生システム共存下反応させて得られた生成物 Ｃ：Ｂの反応系からソフォラジオールを除いて反応させた生成 Ｄ：Ｂの反応において、熱変性させた粗酵素液を用いて反応させた生成物 Ｅ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母を、グルコースを添加して培養。他はＢと同一条件。 Ｆ：ボイドベクターｐＥＳＣ-ＵＲＡによる形質転換酵母から調製した粗酵素液を使用。他はＢと同一条件。
【図３】は配列番号８の翻訳産物によるβ−アミリンに対する２４位水酸化活性（in vivo）生成物を示す。さらに詳しくは、生成物をアセチル化後ＧＣ-ＭＳで解析したＴＩＭによるクロマトグラムを示す。Ａ〜Ｅは以下の結果を示す。 Ａ：３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品（２０ｐｍｏｌ） Ｂ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母にβ-アミリンを投与して得られた生成物 Ｃ：β-アミリンを投与しない場合。他はＢと同じ。 Ｄ：形質転換酵母を、グルコースを添加して培養。他はＢと同一条件。 Ｅ：ボイドベクターｐＥＳＣ-ＵＲＡによる形質転換酵母β-アミリンを投与。他はＢと同一条件。
【図４】は、配列番号８の翻訳産物のβ−アミリン２４位水酸化活性（in vivo）を示す。ＡおよびＢは以下の結果を示す。 Ａ：図３のＢにおいて検出した保持時間１５．３５分のピークのマススペクトル Ｂ：図３のＡ（３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品）のマススペクトル
【図５】はＣＹＰ９３Ｅ１とβ−アミリン合成酵素（ＰＳＹ）の共発現による３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンの生産を示す。さらに詳しくは、各形質転換酵母（ＧＩＬ７７）から得られた脂溶性画分をアセチル化し、ＧＣＭＳ解析によるＴＩＭによるクロマトグラムを示す。Ａ〜Ｅは以下の結果を示す。 Ａ：３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品（２０ｐｍｏｌ） Ｂ：ｐＥＳＣ-ＰＳＹ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母の抽出物 Ｃ：ｐＥＳＣ-ＰＳＹによる形質転換酵母の抽出物 Ｄ：ｐＥＳＣ-ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母の抽出物 Ｅ：ｐＥＳＣ-ＵＲＡによる形質転換酵母の抽出物
【図６】はＧＩＬ７７／ｐＥＳＣ−ＰＳＹ−ＣＹＰ９３Ｅ１の１Ｌ培養から得た生成物の1Ｈ−ＮＭＲを示す。
【図７】は配列番号８の翻訳産物と多機能型トリテルペン合成酵素（ＹＵＰ４３）の共発現による３β，２４−ジヒドロキシ−１２−オレアネンの生産を示す。さらに詳しくは、各形質転換酵母（ＧＩＬ７７）から得られた脂溶性画分をアセチル化し、ＧＣＭＳ解析におけるＴＩＭによるクロマトグラムを示す。Ａ〜Ｅは以下の結果を示す。 Ａ：３β，２４-ジアセトキシ-１２-オレアネンの標品（２０ｐｍｏｌ） Ｂ：ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３−ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母の抽出物 Ｃ：ｐＥＳＣ−ＹＵＰ４３による形質転換酵母の抽出物 Ｄ：ｐＥＳＣ−ＣＹＰ９３Ｅ１による形質転換酵母の抽出物 Ｅ：ｐＥＳＣ−Ｕｒａによる形質転換酵母の抽出物
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが配列番号８で表されるポリヌクレオチドである請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
請求項１または２記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
【請求項４】
宿主が微生物である請求項３記載の形質転換体。
【請求項５】
微生物が酵母である請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
配列番号８で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびβ−アミリン合成酵素遺伝子を有する発現ベクター。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが配列番号８で表されるポリヌクレオチドである請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項６または７記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
【請求項９】
宿主が微生物である請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
微生物が酵母である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
受託番号FERM BP−10201として寄託されているラノステロール合成酵素欠損酵母変異株。
【請求項１２】
請求項３から５のいずれかに記載の形質転換体を培養して、請求項１に記載のポリペプチドを産生する工程を含むオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドを製造する方法。
【請求項１３】
請求項８から１０のいずれかに記載の形質転換体を培養して、
1）請求項３に記載のポリペプチドを産生する工程および
2）β−アミリン合成酵素を産生する工程
を含むオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドおよびβ−アミリン合成酵素を製造する方法。
【請求項１４】
請求項３から５のいずれかに記載の形質転換体をオレアナン型トリテルペンに作用させる工程を含む２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項１５】
請求項８から１０のいずれかに記載された形質転換体の培養生産による２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の酵母変異株の培養生産による２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項１】
配列番号８で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが配列番号８で表されるポリヌクレオチドである請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
請求項１または２記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
【請求項４】
宿主が微生物である請求項３記載の形質転換体。
【請求項５】
微生物が酵母である請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
配列番号８で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびβ−アミリン合成酵素遺伝子を有する発現ベクター。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが配列番号８で表されるポリヌクレオチドである請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項６または７記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体。
【請求項９】
宿主が微生物である請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
微生物が酵母である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
受託番号FERM BP−10201として寄託されているラノステロール合成酵素欠損酵母変異株。
【請求項１２】
請求項３から５のいずれかに記載の形質転換体を培養して、請求項１に記載のポリペプチドを産生する工程を含むオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドを製造する方法。
【請求項１３】
請求項８から１０のいずれかに記載の形質転換体を培養して、
1）請求項３に記載のポリペプチドを産生する工程および
2）β−アミリン合成酵素を産生する工程
を含むオレアナン型トリテルペンの24位を水酸化する活性を有するポリペプチドおよびβ−アミリン合成酵素を製造する方法。
【請求項１４】
請求項３から５のいずれかに記載の形質転換体をオレアナン型トリテルペンに作用させる工程を含む２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項１５】
請求項８から１０のいずれかに記載された形質転換体の培養生産による２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の酵母変異株の培養生産による２４位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８０５７２
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【発行日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１０３２７（Ｐ２００６−５１０３２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３２０５
【国際出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【発行日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３２０５
【国際出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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