トロンビン溶液の調製方法
【課題】血液から直接、高いトロンビン活性値を有し、ゲル化しないトロンビン溶液を簡便に調製すること。
【解決手段】アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンを吸着させた後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法を提供する。
【解決手段】アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンを吸着させた後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビン溶液の調製方法に係り、より詳細には、血液を原料とするトロンビン溶液の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビンは血液凝固因子の一つであり、可溶性のフィブリノーゲンに作用して不溶性のフィブリンを生成する、セリンプロテアーゼである。医療現場において、トロンビンとフィブリノーゲンとを混合して使用される生体組織接着剤フィブリン糊は、組織の接着・閉鎖、及びそれに続く創傷治癒を行うための外用接着剤あるいは止血剤として、現在各種の外科手術に広く用いられている。また、トロンビンと多血小板血漿（ＰＲＰ）とを混合して使用される血小板ゲルは、創傷治癒に用いられ、単独で止血剤として用いられる。近年、各種外科手術において、手術直前又は手術中に患者の血液から自己由来のトロンビンを短時間で調製するニーズが高まっている。
【０００３】
トロンビンの調製方法として、特許文献１には、血漿からエタノールによってトロンビンを回収する方法が開示されている。特許文献２には、血漿からプロトロンビンをアニオン交換体へ吸着させ、アニオン交換体からプロトロンビンを溶離する際に、溶離液として塩化カルシウムを用いることにより、同時にトロンビンへの活性化を行い、トロンビンとして回収する方法が開示されている。この方法によれば、比較的トロンビン活性値が高いトロンビンを精製することができる。また、特許文献３には、プロトロンビンを精製する目的で、血漿中のプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させ、アニオン交換体からプロトロンビンを溶出する際に、緩衝液中で塩化カルシウム濃度勾配を直線的に負荷することによりプロトロンビンを溶出する方法が開示されている。更に特許文献４には、活性化剤と吸収剤とを備えた反応室、又は陰イオン性分子排除イオン交換樹脂を供えた反応室に、全血、血漿又は血漿分画を導入し、トロンビン又は他の血液生成物を製剤する装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５０００２６号公報
【特許文献２】米国特許第５，１４３，８３８号明細書
【特許文献３】特開平１０−１５０９８０号公報
【特許文献４】特表２００６−５１５８５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１の方法で得られるトロンビンは、トロンビン活性値が低く、フィブリノーゲンを凝固させるために要する時間が長い。そのため、トロンビン投与直後に急速にフィブリノーゲンを凝固させたい場合には不向きであるという問題点がある。特許文献２及び３の方法は、いずれも血漿又は血漿分画からトロンビンを調製する方法であり、血液から直接トロンビンを調製することができない。そのため、まず血液から血漿を調製する繁雑な操作が必要であると同時に、時間を要するという問題がある。更に、特許文献３の方法は、濃度勾配をかけながら溶出液を分画してプロトロンビンのピークを得る方法であるが、そのピークを選別する必要があり、また液量が増えるので、溶液のトロンビン活性値を高く維持することが困難であるという問題がある。
【０００６】
特許文献４には、全血から吸収剤又は陰イオン性分子排除イオン交換樹脂により水分を除去する方法が記載されているが、水分除去量を少なく設定する場合、トロンビン濃縮率が低下し、トロンビン活性値を高めることはできないという問題がある。また、トロンビン濃縮率を上げるために水分除去量を上げると、トロンビン溶液の液体量に対する血球量の割合が増し、フィルター濾過が困難になるという問題が生じる。この場合、血球とトロンビンの分離操作が必要となるが、特許文献４にはこの分離操作に着目した検討がなされていない。また、この方法では、トロンビンの血液凝固反応を阻害する成分が残存する可能性を否定できないため、トロンビン活性の保存安定性が問題となる。
【０００７】
以上の説明から明らかなように、血液から血漿への繁雑な分離操作を必要とせず、高いトロンビン活性値を有するトロンビン溶液を血液から直接調製する方法が、これまで確立されていない。本発明の課題は、上記従来技術の問題点に鑑み、高いトロンビン活性値を有し、ゲル化しないトロンビン溶液を血液から直接かつ簡便に調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者は、アニオン交換体に吸着させたプロトロンビンをトロンビンへ活性化し、かつアニオン交換体からトロンビンを溶出する溶離液のカルシウムイオン濃度とイオン強度とに着目して、鋭意検討を重ねた。その結果、アニオン交換体を用いたトロンビンの調製方法において、特定の範囲のカルシウムイオン濃度とイオン強度とを持つ溶離液を用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の態様は以下を含む。
（１）アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させた後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法。
（２）溶離液とアニオン交換体との接触時間が２分以上１０分以下である、（１）に記載のトロンビン溶液の調製方法。
（３）アニオン交換体がジエチルアミノエチル基を有するアニオン交換体である、（１）又は（２）に記載のトロンビン溶液の調製方法。
（４）溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、アニオン交換体を等張液で洗浄する、（１）乃至（３）の何れかに記載のトロンビン溶液の調製方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、血液を直接原料として、高いトロンビン活性値を有するトロンビン溶液を簡便に調製できる。またゲル化しない液体であるトロンビン溶液を調製できる。更には、従来技術と比較し、短時間にトロンビン溶液を調製することができる。また得られたトロンビン溶液は高い保存安定性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】溶離液のカルシウムイオン濃度及びイオン強度と、得られるトロンビン溶液の凝固時間法によるトロンビン活性値との関係を示す３次元グラフである。
【図２】溶離液のカルシウムイオン濃度及びイオン強度と、得られるトロンビン溶液の凝固時間法によるトロンビン活性値との関係を示す２次元グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態（以下、本実施の形態という。）を更に詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。本実施の形態は、血液を直接原料とし、アニオン交換体を用いて、ゲル化しないトロンビン溶液を調製する方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させることと、その後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得ることと、を含む。
【００１２】
本実施の形態に係るトロンビン溶液を調製する方法においては、まず、血液をアニオン交換体に接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させる。本実施の形態でいうアニオン交換体とは、アニオン交換基が化学的に結合された多孔材を意味する。アニオン交換基としては、水中でプラスに荷電する官能基であればよく、例えば、強塩基性のトリメチルアンモニウム基や、弱塩基性のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が使用可能である。また、ここでいう多孔材とは、液体が浸入可能な細孔を有する部材を意味し、例えば、球状のスチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの樹脂、球状のセルロース、また、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロースなどのゲル、ポリエステル、ポリプロピレン、セルロースなどの不織布、あるいはその他の多孔性膜や焼結体などが使用可能である。この中でも、球状のセルロースは、タンパク質など生体高分子の分画、精製に広く使用されており、好適に使用できる。あるいは、細孔のないビーズや繊維状のイオン交換体をカラムに充填し、実質的に多孔性のアニオン交換体を形成したものも使用することもできる。
【００１３】
本実施の形態でいう血液とは、赤血球を含む末梢血であり、採血したままのものであっても、抗凝固剤、生理食塩液などで希釈されたものであってもよい。トロンビン溶液調製中の血液凝固を防ぐために、抗凝固剤で希釈された血液を好適に使用することができる。抗凝固剤の種類は、クエン酸又はその塩からなる群の他、フサン、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などを使用することができるが、クエン酸又はその塩からなる群を好適に使用することができる。クエン酸又はその塩からなる群としては、例えば、クエン酸ナトリウム溶液、ＡＣＤ(ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ)−Ａ液、ＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ）液などが使用可能である。ＡＣＤ−Ａ液とは、クエン酸ナトリウム、クエン酸、及びブドウ糖からなる溶液であり、ＣＰＤ液はクエン酸ナトリウム、クエン酸、ブドウ糖、及びリン酸二水素ナトリウム二水和物からなる溶液である。また、冷蔵保存あるいは室温保存された血液を使用する場合は、白血球除去フィルターによって白血球を除去された血液を用いてもよい。
【００１４】
血液とアニオン交換体との接触は、例えば、カラムに充填したアニオン交換体に血液をポンプ又は落差により通過させてなされてもよいし、血液全量とアニオン交換体とを容器に入れ、混和してなされてもよいが、全血液中のプロトロンビンを効率よくアニオン交換体と接触させる観点から、先述の接触がより好ましい。本実施の形態によれば、例えば遠心分離などにより血液から血漿を分離する操作を行うことなく、直接血液をアニオン交換体へ接触させ、以下に記載の操作によりトロンビン溶液を調製することができる。そのため、遠心分離などの繁雑な操作が不要となり、またトロンビン溶液の調製時間を短くすることが可能となる。
【００１５】
次に、プロトロンビンを吸着させたアニオン交換体に溶離液を接触させる。溶離液によりアニオン交換体に吸着したプロトロンビンがトロンビンへ活性化され、溶離液中へ溶出し、トロンビン溶液を調製することができる。本実施の形態でいう溶離液とは、アニオン交換体に吸着したプロトロンビンをトロンビンに活性化し、溶離液中へ溶出させ、トロンビン溶液として回収する溶液である。本実施の形態において、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液を用いることで、ゲル化しないトロンビン溶液を直接血液から調製できる。
【００１６】
ここで、「イオン強度」とは、溶液における種々のイオンの電気的（イオン−イオン）相互作用の強さを表す値である。溶液中のイオン種ｉの電荷数をｚi、そのモル濃度をｃiとすると、イオン強度は次式（１）で定義される。
【数１】
【００１７】
アニオン交換体を用いて血液からトロンビン溶液を調製する方法において、本発明者が検討を進めたところ、溶離液のカルシウムイオン濃度とイオン強度とが、得られるトロンビン溶液のトロンビン活性値とゲル化の有無とに影響する重要因子であることをつきとめた。すなわち、カルシウムイオン濃度とイオン強度とを調整した溶離液を用いることにより、アニオン交換体を用いて血液からゲル化しない、高いトロンビン活性値を有するトロンビン溶液の作製が可能となると同時に、短い時間でのトロンビン溶液の調製が可能となることを見出し、本発明を完成するに至ったのである。
【００１８】
溶離液のカルシウムイオンが５ｍｍｏｌ／Ｌより少ない場合、又はイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌより低い場合は、アニオン交換体へ吸着したプロトロンビン由来のトロンビンの収率が低くなり、プロトロンビンを有効に活用できなくなり、トロンビン溶液のトロンビン活性値が低下する。カルシウムイオンは、プロトロンビンをトロンビンへ活性化する活性化剤として作用し、またイオン強度は、カルシウムイオンと相互作用してプロトロンビンからトロンビンへの活性化及び／又はトロンビンの溶離液への溶出を促進するが、カルシウムイオンが５ｍｍｏｌ／Ｌより少ないと、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上としても、得られるトロンビン溶液のトロンビン活性値が有効に上がらない。また、イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌより低いと、カルシウムイオンを５ｍｍｏｌ／Ｌ以上含んでいても、プロトロンビンからトロンビンへの活性化に時間を要し、アニオン交換体と溶離液との接触時間を１時間以上としても、十分なトロンビン活性値が得られない。
【００１９】
また、カルシウムイオンが５０ｍｍｏｌ／Ｌより多い、又はイオン強度が０．４６ｍｏｌ／Ｌより高い場合は、得られるトロンビン溶液がゲル化し、液体として使用することができない。ゲル化する理由は定かではないが、５０ｍｍｏｌ／Ｌより多いカルシウムイオンや０．４６ｍｏｌ／Ｌより大きいイオン強度の環境は、プロトロンビンやトロンビンどうし、又はトロンビンを含む溶出される混在タンパク質どうしが影響し合い、トロンビン溶液を凝集又は変性させると考えられる。
【００２０】
なお、トロンビン活性値は、フィブリノーゲンを凝固させる時間を測定する凝固時間法や、発色性合成基質を分解し、遊離する発色物質の吸光度を測定する合成基質法によって測定可能である。また、トロンビン溶液のゲル化とは、トロンビン溶液の全体又は一部がゼリー状に固化することである。トロンビン溶液全体がゲル化すると、トロンビン溶液は実質使用できなくなる。トロンビン溶液のゲル化が一部であっても、回収できる液量が減少し、回収できた溶液も不安定であって、時間とともにゲル化する可能性があるので好ましくない。
【００２１】
以上の理由から、本実施の形態に係るアニオン交換体を用いて血液からトロンビン溶液を調製する方法において、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液が用いられる。カルシウムイオン濃度とイオン強度の範囲は、より好ましくはカルシウムイオン濃度が１０乃至４０ｍｍｏｌ／Ｌ、且つイオン強度が０．２１乃至０．３２ｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくはカルシウムイオン濃度が２０乃至３０ｍｍｏｌ／Ｌ、且つイオン強度が０．２４乃至０．２９ｍｏｌ／Ｌである。
【００２２】
カルシウム塩としては、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、及び酢酸カルシウムなどを使用することができるが、塩化カルシウムを好適に使用することができる。また、カルシウム塩以外の溶離液の成分としては、プロトロンビンの活性化及びトロンビン活性を阻害するもの以外ならば何でもよい。塩化ナトリウムは生理食塩液に使用される成分であり、一般的にタンパク質の溶解度が高いことが知られており、好適に使用することができる。
【００２３】
トロンビン溶液のトロンビン活性値は、用いる血液の液量と溶離液の液量とで調整できる。血液の液量が多いほどアニオン交換体に吸着するプロトロンビン量が増え、得られるトロンビンの量が増える。溶離液の液量は、アニオン交換体全体に行き渡る液量以上であることが好ましく、溶離液の液量を増やしても、トロンビン溶液全体を回収すれば、トロンビンの収量は変化しない。ただし、溶離液の液量が少ない程トロンビンの濃度が増し、トロンビン活性値が高くなる。トロンビン溶液を希釈しトロンビン活性値を低くしたい場合は、溶離液の液量を増してもよいし、回収後に希釈して液量を増してもよい。
【００２４】
アニオン交換体と溶離液との接触は、アニオン交換体に溶離液を添加することによりなされるが、添加後、アニオン交換体と溶離液とをより均一に混合するために、転倒混和や振動を与えてもよい。あるいは、溶離液の添加時に、溶離液とアニオン交換体とが混和するように勢いよく溶離液を添加してもよい。溶離液を添加後、静置することで十分なプロトロンビンの活性化が進むが、途中転倒混和や振動を与えて混和してもよい。また、アニオン交換体に溶離液を接触させる前に、アニオン交換体から血液を排出させると、接触させる溶離液の液量と得られるトロンビン溶液の液量とがほぼ同量となり、液量を調整できるので好ましい。
【００２５】
トロンビン溶液の回収は、アニオン交換体からフィルターを介して吸引や遠心分離により回収してもよいし、静置又は遠心分離によりアニオン交換体と溶離液とを２層に分け、上層のトロンビン溶液のみを回収してもよい。得られたトロンビン溶液を全て回収する観点から、フィルターを介した回収がより好ましい。フィルターは、アニオン交換体を通過させない孔径のフィルターであれば公知のものを使用することができる。
【００２６】
本実施の形態において、溶離液とアニオン交換体との接触時間は、２分以上１０分以下が望ましい。なお、本実施の形態における接触時間とは、アニオン交換体に溶離液を添加してからトロンビン溶液の回収操作を始めるまでの時間である。本実施の形態によれば、プロトロンビンを吸着させたアニオン交換体に溶離液を接触させると、２分以上でほとんどの吸着プロトロンビンがトロンビンへ活性化され、トロンビンを回収することができる。アニオン交換体と溶離液との接触に偏りがある場合でも、アニオン交換体と溶離液とを接触させた後１０分以内には、溶離液はアニオン交換体全体に行き渡り、プロトロンビンのほとんどが活性化される。したがって、本実施の形態により、溶離液の接触時間を２分以上１０分以下とすることができる。また、上述した通り、血液を直接アニオン交換体へ接触させることができるので、トロンビンの作製時間がより短縮される。
【００２７】
本実施の形態において、アニオン交換基としてＤＥＡＥ基を有するアニオン交換体を用いることがより好ましい。また、本実施の形態において、血液をアニオン交換体と接触させた後、溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、アニオン交換体を等張液で洗浄することが好ましい。洗浄することにより、アニオン交換体上に付着した、例えばフィブリノーゲンなどのトロンビン活性値を下げる性質を有する成分を排除可能であり、得られるトロンビン溶液の活性値がより安定する。また、アニオン交換体の空隙部分に赤血球が残存した場合、得られるトロンビン溶液に赤血球が混在するが、洗浄により赤血球の混在量を減らすこともできる。ここで、洗浄に使用する洗浄液として等張液を用いることにより、残存した赤血球が溶血することなく洗浄することができるので好ましい。
【００２８】
本実施の形態でいう等張液とは、血液と等張である溶液である。洗浄液の浸透圧が１６０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下で赤血球は溶血するため、１６０ｍＯｓｍ／ｋｇより高いことが好ましく、血液（血漿・血清）の浸透圧２７５〜２９０ｍＯｓｍ／ｋｇと等張であることがより好ましい。組成としては、プロトロンビンの活性化及びトロンビン活性を阻害するもの以外ならば何でもよいが、生理食塩液が好適に使用できる。また、洗浄に用いる等張液の液量は、アニオン交換体と混和し洗浄できる液量を用いることができ、使用するアニオン交換体の容積の２〜２０倍がより好ましい。本実施の形態により得られるトロンビン溶液は、使用するまで室温や冷蔵で保存してもよいし、冷凍して保存し、使用前に解凍して用いてもよい。
【実施例】
【００２９】
以下実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。まず、実施例及び比較例における使用されたトロンビン活性値の２種の測定方法を説明する。
【００３０】
［トロンビン活性値測定；凝固時間法］
日本薬局方によるトロンビンの定量法に準じてトロンビン活性値を測定した。フィブリノーゲン溶液（ボルヒール（登録商標）、（財）化学及血清療法研究所）を生理食塩液（大塚生食注、大塚製薬）で希釈し、フィブリノーゲン濃度３ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液を調製した。日本薬局方標準品のトロンビン標準品（（財）日本公定書協会）を生理食塩液に溶かし、４種の標準溶液を調製した。標準溶液の濃度は、下記方法による凝固時間が１４〜６０秒の範囲内となるように濃度を振り調製した。測定サンプルも凝固時間が１４〜６０秒の範囲内となるように生理食塩液で希釈した。測定は血液凝固自動測定装置（ＫＣ４デルタ、ｔｒｉｎｉｔｙ ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用した。
【００３１】
あらかじめ血液凝固自動測定装置を３７℃に加温した。サンプルカップにフィブリノーゲン溶液を１５０μＬ入れ、３７℃で３分間温めた。これにトロンビン標準溶液５０μＬをピペットで吹き込み、同時にタイマーを作動させ、凝固するまでの凝固時間を測定した。５回ずつ測定を行いその平均値を求め、検量線とした。同様に、測定サンプルの凝固時間を測定し、検量線及び希釈倍率からトロンビン活性値を算出した。
【００３２】
［トロンビン活性値測定；発色基質法］
ＮａＣｌ １．７５３ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．７４４ｇ、ＢＳＡ ０．２００ｇ、１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ４ｍｌを注射用水（大塚蒸留水、大塚製薬）１９６ｍＬに溶解して、アッセイバッファーを調製した。発色性合成基質はＳ−２２３８（テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８、積水メディカル）を注射用水で溶解し、濃度２μｍｏｌ／ｍＬの合成基質溶液を調製した。標準溶液として日本薬局方標準品のトロンビン標準品を生理食塩液に溶解し２００Ｕ／ｍＬにしたものを更にアッセイバッファーで希釈し、４種の標準溶液を調製した。
【００３３】
測定サンプルは、まず、吸光度測定結果に誤差を生じないようにトロンビン溶液に微量に混在する赤血球を遠心分離により除去し使用した。なお、赤血球除去操作前後の凝固時間法によるトロンビン活性値に差はみられないことを下記実施例で確認済みである。次に下記測定法における検量線の範囲の吸光度を得られるように、アッセイバッファーで希釈した。測定はマイクロプレート分光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ３８４、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用した。
【００３４】
あらかじめマイクロプレート分光光度計を３７℃に加温した。９６穴マイクロプレートに、アッセイバッファーによって一定の希釈操作を行なった標準溶液又は測定サンプルを各々３ウェルに入れ、合成基質溶液を一定量添加後、４０５ｎｍの吸光度を１０秒間隔で５分カイネティック測定を行った。３ウェルの結果の平均値を測定値とし、４種の標準溶液の測定値から検量線を求め、測定サンプルの測定値から検量線と希釈倍率を元にトロンビン活性値を算出した。
【００３５】
（実施例１〜２６）
注射用水で置換したＤＥＡＥ基を有するアニオン交換体（セルロファインＫＡＮＴＯ ＤＥＡＥ−５００、関東化学）０．５ｍＬを容器容量２．５ｍＬのポリエチレン製のカラム（ラボラトリー・ポリエチレンカラムＳ１０１２、モビテック社）に充填した。溶離液は、注射用水に塩化カルシウム二水和物を５乃至５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、更に塩化ナトリウムでイオン強度が０．１７乃至０．４６ｍｏｌ／Ｌとなるように調製した。また、健常人ボランティアより血液を採取し、血液１００ｍＬに対して抗凝固剤としてＣＰＤ液を１４ｍＬ添加し、ヒト新鮮血液とした。ＣＰＤ液はクエン酸三ナトリウム二水和物３０．０ｇ、ブドウ糖２３．２ｇ、クエン酸一水和物３．５８ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物２．５１ｇを注射用水１Ｌに溶解して調製した。
【００３６】
アニオン交換体カラムに生理食塩液５ｍＬを流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液、平衡化し、ゲルヘッドを出した後、ヒト新鮮血液８ｍＬを流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで濾過した。続いて生理食塩液１０ｍＬを流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで濾過し、アニオン交換体カラムを洗浄し、生理食塩液をアニオン交換体カラムから排出した。次に、出口を閉じたアニオン交換体カラムに、表１に記載の組成の溶離液０．５ｍＬを添加し、ピペッティング２〜３回によりアニオン交換体と溶離液をなじませた後、接触時間として１０分間静置した。アニオン交換体カラムの出口に１ｍＬシリンジをセットし、シリンジで吸引してトロンビン溶液を回収した。このようにして作製したトロンビン溶液のゲル化の有無を目視で確認した。また、ゲル化のないトロンビン溶液は、回収後１〜３時間以内にトロンビン活性値を凝固時間法及び合成基質法で測定した。実施例１乃至２６の結果を、表１、図１、及び図２に示す。
【００３７】
（比較例１〜１５）
溶離液の塩化カルシウム二水和物の濃度を５ｍｍｏｌ／Ｌ未満又は５０ｍｍｏｌ／Ｌより高くなるように調製したか、又は溶離液のイオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ未満又は０．４６ｍｏｌ／Ｌより高くなるように調製した以外は、実施例１〜２６と同様に実験した。比較例１乃至１５の結果を表２、図１、及び図２に示す。実施例１乃至２６、及び比較例１乃至１５の結果より、溶離液のカルシウムイオンが５ｍｍｏｌ／Ｌより少ない場合、又はイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌより低い場合は、トロンビン溶液のトロンビン活性値が低下することが示された。また、カルシウムイオンが５０ｍｍｏｌ／Ｌより多い、又はイオン強度が０．４６ｍｏｌ／Ｌより高い場合は、得られるトロンビン溶液がゲル化することが示された。
【００３８】
（実施例２７）
アニオン交換体と溶離液との接触時間を２分に変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液のゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５０４Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５３Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、溶離液との接触時間を２分に短縮しても同程度のトロンビン活性値を持つトロンビン溶液を調製できた。結果を表３に示す。
【００３９】
（実施例２８）
アニオン交換体と溶離液との接触時間を５分に変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で４７３Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３４０Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、溶離液との接触時間を５分へ短縮しても同程度のトロンビン活性値を持つトロンビン溶液を調製できた。結果を表３に示す。
【００４０】
（比較例１６）
アニオン交換体と溶離液との接触時間を３０分に変更した以外は、比較例１２と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、比較例１２と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で１８８Ｕ／ｍＬ、合成基質法で１２８Ｕ／ｍＬであった。比較例１２と比較し、溶離液との接触時間を３０分へ延長してもプロトロンビンからトロンビンへの活性化、溶出が不十分であり、トロンビン活性値は低かった。結果を表３に示す。
【００４１】
（実施例２９）
アニオン交換体カラムに添加する溶離液の液量を１．０ｍＬへ変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で２８５Ｕ／ｍＬ、合成基質法で１９６Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、溶離液の液量を２倍へ増やすとトロンビン活性値は１／２となり、溶離液の液量を増してもトロンビンをほぼ同等に回収できた。
【００４２】
（実施例３０）
アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を１６ｍＬに変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で１０３０Ｕ／ｍＬ、合成基質法で７２９Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を２倍に増やすとトロンビン活性値も２倍となり、アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を増やした分、トロンビン活性値は上がった。
【００４３】
（実施例３１）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を室温で２４時間保存し、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５１２Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５６Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を室温で２４時間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
【００４４】
（実施例３２）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、冷蔵４℃で２週間保存し、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５０５Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３３８Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を冷蔵４℃で２週間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
【００４５】
（実施例３３）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、−２０℃で３週間冷凍保存した。冷凍トロンビン溶液を室温で解凍後、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５１９Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５６Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を冷凍−２０℃で３週間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
【００４６】
（実施例３４）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、−２０℃で６ヶ月間冷凍保存した。冷凍トロンビン溶液を室温で解凍後、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５３４Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５０Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を冷凍−２０℃で６ヶ月間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
【００４７】
（実施例３５）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、トロンビン溶液に微量に混在する赤血球を除去し、トロンビン活性値を凝固時間法で測定した。その結果、凝固法によるトロンビン活性値は５１７Ｕ／ｍＬであり、遠心分離操作によるトロンビン活性値の変化はみられなかった。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、血液を直接原料としたトロンビン溶液の調製方法として有用であり、得られたトロンビン溶液は、フィブリン糊や血小板ゲルの１成分として使用したり、止血剤として使用したりするなど、医療用途として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビン溶液の調製方法に係り、より詳細には、血液を原料とするトロンビン溶液の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビンは血液凝固因子の一つであり、可溶性のフィブリノーゲンに作用して不溶性のフィブリンを生成する、セリンプロテアーゼである。医療現場において、トロンビンとフィブリノーゲンとを混合して使用される生体組織接着剤フィブリン糊は、組織の接着・閉鎖、及びそれに続く創傷治癒を行うための外用接着剤あるいは止血剤として、現在各種の外科手術に広く用いられている。また、トロンビンと多血小板血漿（ＰＲＰ）とを混合して使用される血小板ゲルは、創傷治癒に用いられ、単独で止血剤として用いられる。近年、各種外科手術において、手術直前又は手術中に患者の血液から自己由来のトロンビンを短時間で調製するニーズが高まっている。
【０００３】
トロンビンの調製方法として、特許文献１には、血漿からエタノールによってトロンビンを回収する方法が開示されている。特許文献２には、血漿からプロトロンビンをアニオン交換体へ吸着させ、アニオン交換体からプロトロンビンを溶離する際に、溶離液として塩化カルシウムを用いることにより、同時にトロンビンへの活性化を行い、トロンビンとして回収する方法が開示されている。この方法によれば、比較的トロンビン活性値が高いトロンビンを精製することができる。また、特許文献３には、プロトロンビンを精製する目的で、血漿中のプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させ、アニオン交換体からプロトロンビンを溶出する際に、緩衝液中で塩化カルシウム濃度勾配を直線的に負荷することによりプロトロンビンを溶出する方法が開示されている。更に特許文献４には、活性化剤と吸収剤とを備えた反応室、又は陰イオン性分子排除イオン交換樹脂を供えた反応室に、全血、血漿又は血漿分画を導入し、トロンビン又は他の血液生成物を製剤する装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５０００２６号公報
【特許文献２】米国特許第５，１４３，８３８号明細書
【特許文献３】特開平１０−１５０９８０号公報
【特許文献４】特表２００６−５１５８５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１の方法で得られるトロンビンは、トロンビン活性値が低く、フィブリノーゲンを凝固させるために要する時間が長い。そのため、トロンビン投与直後に急速にフィブリノーゲンを凝固させたい場合には不向きであるという問題点がある。特許文献２及び３の方法は、いずれも血漿又は血漿分画からトロンビンを調製する方法であり、血液から直接トロンビンを調製することができない。そのため、まず血液から血漿を調製する繁雑な操作が必要であると同時に、時間を要するという問題がある。更に、特許文献３の方法は、濃度勾配をかけながら溶出液を分画してプロトロンビンのピークを得る方法であるが、そのピークを選別する必要があり、また液量が増えるので、溶液のトロンビン活性値を高く維持することが困難であるという問題がある。
【０００６】
特許文献４には、全血から吸収剤又は陰イオン性分子排除イオン交換樹脂により水分を除去する方法が記載されているが、水分除去量を少なく設定する場合、トロンビン濃縮率が低下し、トロンビン活性値を高めることはできないという問題がある。また、トロンビン濃縮率を上げるために水分除去量を上げると、トロンビン溶液の液体量に対する血球量の割合が増し、フィルター濾過が困難になるという問題が生じる。この場合、血球とトロンビンの分離操作が必要となるが、特許文献４にはこの分離操作に着目した検討がなされていない。また、この方法では、トロンビンの血液凝固反応を阻害する成分が残存する可能性を否定できないため、トロンビン活性の保存安定性が問題となる。
【０００７】
以上の説明から明らかなように、血液から血漿への繁雑な分離操作を必要とせず、高いトロンビン活性値を有するトロンビン溶液を血液から直接調製する方法が、これまで確立されていない。本発明の課題は、上記従来技術の問題点に鑑み、高いトロンビン活性値を有し、ゲル化しないトロンビン溶液を血液から直接かつ簡便に調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者は、アニオン交換体に吸着させたプロトロンビンをトロンビンへ活性化し、かつアニオン交換体からトロンビンを溶出する溶離液のカルシウムイオン濃度とイオン強度とに着目して、鋭意検討を重ねた。その結果、アニオン交換体を用いたトロンビンの調製方法において、特定の範囲のカルシウムイオン濃度とイオン強度とを持つ溶離液を用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の態様は以下を含む。
（１）アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させた後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法。
（２）溶離液とアニオン交換体との接触時間が２分以上１０分以下である、（１）に記載のトロンビン溶液の調製方法。
（３）アニオン交換体がジエチルアミノエチル基を有するアニオン交換体である、（１）又は（２）に記載のトロンビン溶液の調製方法。
（４）溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、アニオン交換体を等張液で洗浄する、（１）乃至（３）の何れかに記載のトロンビン溶液の調製方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、血液を直接原料として、高いトロンビン活性値を有するトロンビン溶液を簡便に調製できる。またゲル化しない液体であるトロンビン溶液を調製できる。更には、従来技術と比較し、短時間にトロンビン溶液を調製することができる。また得られたトロンビン溶液は高い保存安定性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】溶離液のカルシウムイオン濃度及びイオン強度と、得られるトロンビン溶液の凝固時間法によるトロンビン活性値との関係を示す３次元グラフである。
【図２】溶離液のカルシウムイオン濃度及びイオン強度と、得られるトロンビン溶液の凝固時間法によるトロンビン活性値との関係を示す２次元グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態（以下、本実施の形態という。）を更に詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。本実施の形態は、血液を直接原料とし、アニオン交換体を用いて、ゲル化しないトロンビン溶液を調製する方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させることと、その後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得ることと、を含む。
【００１２】
本実施の形態に係るトロンビン溶液を調製する方法においては、まず、血液をアニオン交換体に接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させる。本実施の形態でいうアニオン交換体とは、アニオン交換基が化学的に結合された多孔材を意味する。アニオン交換基としては、水中でプラスに荷電する官能基であればよく、例えば、強塩基性のトリメチルアンモニウム基や、弱塩基性のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が使用可能である。また、ここでいう多孔材とは、液体が浸入可能な細孔を有する部材を意味し、例えば、球状のスチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの樹脂、球状のセルロース、また、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロースなどのゲル、ポリエステル、ポリプロピレン、セルロースなどの不織布、あるいはその他の多孔性膜や焼結体などが使用可能である。この中でも、球状のセルロースは、タンパク質など生体高分子の分画、精製に広く使用されており、好適に使用できる。あるいは、細孔のないビーズや繊維状のイオン交換体をカラムに充填し、実質的に多孔性のアニオン交換体を形成したものも使用することもできる。
【００１３】
本実施の形態でいう血液とは、赤血球を含む末梢血であり、採血したままのものであっても、抗凝固剤、生理食塩液などで希釈されたものであってもよい。トロンビン溶液調製中の血液凝固を防ぐために、抗凝固剤で希釈された血液を好適に使用することができる。抗凝固剤の種類は、クエン酸又はその塩からなる群の他、フサン、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などを使用することができるが、クエン酸又はその塩からなる群を好適に使用することができる。クエン酸又はその塩からなる群としては、例えば、クエン酸ナトリウム溶液、ＡＣＤ(ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ)−Ａ液、ＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ）液などが使用可能である。ＡＣＤ−Ａ液とは、クエン酸ナトリウム、クエン酸、及びブドウ糖からなる溶液であり、ＣＰＤ液はクエン酸ナトリウム、クエン酸、ブドウ糖、及びリン酸二水素ナトリウム二水和物からなる溶液である。また、冷蔵保存あるいは室温保存された血液を使用する場合は、白血球除去フィルターによって白血球を除去された血液を用いてもよい。
【００１４】
血液とアニオン交換体との接触は、例えば、カラムに充填したアニオン交換体に血液をポンプ又は落差により通過させてなされてもよいし、血液全量とアニオン交換体とを容器に入れ、混和してなされてもよいが、全血液中のプロトロンビンを効率よくアニオン交換体と接触させる観点から、先述の接触がより好ましい。本実施の形態によれば、例えば遠心分離などにより血液から血漿を分離する操作を行うことなく、直接血液をアニオン交換体へ接触させ、以下に記載の操作によりトロンビン溶液を調製することができる。そのため、遠心分離などの繁雑な操作が不要となり、またトロンビン溶液の調製時間を短くすることが可能となる。
【００１５】
次に、プロトロンビンを吸着させたアニオン交換体に溶離液を接触させる。溶離液によりアニオン交換体に吸着したプロトロンビンがトロンビンへ活性化され、溶離液中へ溶出し、トロンビン溶液を調製することができる。本実施の形態でいう溶離液とは、アニオン交換体に吸着したプロトロンビンをトロンビンに活性化し、溶離液中へ溶出させ、トロンビン溶液として回収する溶液である。本実施の形態において、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液を用いることで、ゲル化しないトロンビン溶液を直接血液から調製できる。
【００１６】
ここで、「イオン強度」とは、溶液における種々のイオンの電気的（イオン−イオン）相互作用の強さを表す値である。溶液中のイオン種ｉの電荷数をｚi、そのモル濃度をｃiとすると、イオン強度は次式（１）で定義される。
【数１】
【００１７】
アニオン交換体を用いて血液からトロンビン溶液を調製する方法において、本発明者が検討を進めたところ、溶離液のカルシウムイオン濃度とイオン強度とが、得られるトロンビン溶液のトロンビン活性値とゲル化の有無とに影響する重要因子であることをつきとめた。すなわち、カルシウムイオン濃度とイオン強度とを調整した溶離液を用いることにより、アニオン交換体を用いて血液からゲル化しない、高いトロンビン活性値を有するトロンビン溶液の作製が可能となると同時に、短い時間でのトロンビン溶液の調製が可能となることを見出し、本発明を完成するに至ったのである。
【００１８】
溶離液のカルシウムイオンが５ｍｍｏｌ／Ｌより少ない場合、又はイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌより低い場合は、アニオン交換体へ吸着したプロトロンビン由来のトロンビンの収率が低くなり、プロトロンビンを有効に活用できなくなり、トロンビン溶液のトロンビン活性値が低下する。カルシウムイオンは、プロトロンビンをトロンビンへ活性化する活性化剤として作用し、またイオン強度は、カルシウムイオンと相互作用してプロトロンビンからトロンビンへの活性化及び／又はトロンビンの溶離液への溶出を促進するが、カルシウムイオンが５ｍｍｏｌ／Ｌより少ないと、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上としても、得られるトロンビン溶液のトロンビン活性値が有効に上がらない。また、イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌより低いと、カルシウムイオンを５ｍｍｏｌ／Ｌ以上含んでいても、プロトロンビンからトロンビンへの活性化に時間を要し、アニオン交換体と溶離液との接触時間を１時間以上としても、十分なトロンビン活性値が得られない。
【００１９】
また、カルシウムイオンが５０ｍｍｏｌ／Ｌより多い、又はイオン強度が０．４６ｍｏｌ／Ｌより高い場合は、得られるトロンビン溶液がゲル化し、液体として使用することができない。ゲル化する理由は定かではないが、５０ｍｍｏｌ／Ｌより多いカルシウムイオンや０．４６ｍｏｌ／Ｌより大きいイオン強度の環境は、プロトロンビンやトロンビンどうし、又はトロンビンを含む溶出される混在タンパク質どうしが影響し合い、トロンビン溶液を凝集又は変性させると考えられる。
【００２０】
なお、トロンビン活性値は、フィブリノーゲンを凝固させる時間を測定する凝固時間法や、発色性合成基質を分解し、遊離する発色物質の吸光度を測定する合成基質法によって測定可能である。また、トロンビン溶液のゲル化とは、トロンビン溶液の全体又は一部がゼリー状に固化することである。トロンビン溶液全体がゲル化すると、トロンビン溶液は実質使用できなくなる。トロンビン溶液のゲル化が一部であっても、回収できる液量が減少し、回収できた溶液も不安定であって、時間とともにゲル化する可能性があるので好ましくない。
【００２１】
以上の理由から、本実施の形態に係るアニオン交換体を用いて血液からトロンビン溶液を調製する方法において、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液が用いられる。カルシウムイオン濃度とイオン強度の範囲は、より好ましくはカルシウムイオン濃度が１０乃至４０ｍｍｏｌ／Ｌ、且つイオン強度が０．２１乃至０．３２ｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくはカルシウムイオン濃度が２０乃至３０ｍｍｏｌ／Ｌ、且つイオン強度が０．２４乃至０．２９ｍｏｌ／Ｌである。
【００２２】
カルシウム塩としては、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、及び酢酸カルシウムなどを使用することができるが、塩化カルシウムを好適に使用することができる。また、カルシウム塩以外の溶離液の成分としては、プロトロンビンの活性化及びトロンビン活性を阻害するもの以外ならば何でもよい。塩化ナトリウムは生理食塩液に使用される成分であり、一般的にタンパク質の溶解度が高いことが知られており、好適に使用することができる。
【００２３】
トロンビン溶液のトロンビン活性値は、用いる血液の液量と溶離液の液量とで調整できる。血液の液量が多いほどアニオン交換体に吸着するプロトロンビン量が増え、得られるトロンビンの量が増える。溶離液の液量は、アニオン交換体全体に行き渡る液量以上であることが好ましく、溶離液の液量を増やしても、トロンビン溶液全体を回収すれば、トロンビンの収量は変化しない。ただし、溶離液の液量が少ない程トロンビンの濃度が増し、トロンビン活性値が高くなる。トロンビン溶液を希釈しトロンビン活性値を低くしたい場合は、溶離液の液量を増してもよいし、回収後に希釈して液量を増してもよい。
【００２４】
アニオン交換体と溶離液との接触は、アニオン交換体に溶離液を添加することによりなされるが、添加後、アニオン交換体と溶離液とをより均一に混合するために、転倒混和や振動を与えてもよい。あるいは、溶離液の添加時に、溶離液とアニオン交換体とが混和するように勢いよく溶離液を添加してもよい。溶離液を添加後、静置することで十分なプロトロンビンの活性化が進むが、途中転倒混和や振動を与えて混和してもよい。また、アニオン交換体に溶離液を接触させる前に、アニオン交換体から血液を排出させると、接触させる溶離液の液量と得られるトロンビン溶液の液量とがほぼ同量となり、液量を調整できるので好ましい。
【００２５】
トロンビン溶液の回収は、アニオン交換体からフィルターを介して吸引や遠心分離により回収してもよいし、静置又は遠心分離によりアニオン交換体と溶離液とを２層に分け、上層のトロンビン溶液のみを回収してもよい。得られたトロンビン溶液を全て回収する観点から、フィルターを介した回収がより好ましい。フィルターは、アニオン交換体を通過させない孔径のフィルターであれば公知のものを使用することができる。
【００２６】
本実施の形態において、溶離液とアニオン交換体との接触時間は、２分以上１０分以下が望ましい。なお、本実施の形態における接触時間とは、アニオン交換体に溶離液を添加してからトロンビン溶液の回収操作を始めるまでの時間である。本実施の形態によれば、プロトロンビンを吸着させたアニオン交換体に溶離液を接触させると、２分以上でほとんどの吸着プロトロンビンがトロンビンへ活性化され、トロンビンを回収することができる。アニオン交換体と溶離液との接触に偏りがある場合でも、アニオン交換体と溶離液とを接触させた後１０分以内には、溶離液はアニオン交換体全体に行き渡り、プロトロンビンのほとんどが活性化される。したがって、本実施の形態により、溶離液の接触時間を２分以上１０分以下とすることができる。また、上述した通り、血液を直接アニオン交換体へ接触させることができるので、トロンビンの作製時間がより短縮される。
【００２７】
本実施の形態において、アニオン交換基としてＤＥＡＥ基を有するアニオン交換体を用いることがより好ましい。また、本実施の形態において、血液をアニオン交換体と接触させた後、溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、アニオン交換体を等張液で洗浄することが好ましい。洗浄することにより、アニオン交換体上に付着した、例えばフィブリノーゲンなどのトロンビン活性値を下げる性質を有する成分を排除可能であり、得られるトロンビン溶液の活性値がより安定する。また、アニオン交換体の空隙部分に赤血球が残存した場合、得られるトロンビン溶液に赤血球が混在するが、洗浄により赤血球の混在量を減らすこともできる。ここで、洗浄に使用する洗浄液として等張液を用いることにより、残存した赤血球が溶血することなく洗浄することができるので好ましい。
【００２８】
本実施の形態でいう等張液とは、血液と等張である溶液である。洗浄液の浸透圧が１６０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下で赤血球は溶血するため、１６０ｍＯｓｍ／ｋｇより高いことが好ましく、血液（血漿・血清）の浸透圧２７５〜２９０ｍＯｓｍ／ｋｇと等張であることがより好ましい。組成としては、プロトロンビンの活性化及びトロンビン活性を阻害するもの以外ならば何でもよいが、生理食塩液が好適に使用できる。また、洗浄に用いる等張液の液量は、アニオン交換体と混和し洗浄できる液量を用いることができ、使用するアニオン交換体の容積の２〜２０倍がより好ましい。本実施の形態により得られるトロンビン溶液は、使用するまで室温や冷蔵で保存してもよいし、冷凍して保存し、使用前に解凍して用いてもよい。
【実施例】
【００２９】
以下実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。まず、実施例及び比較例における使用されたトロンビン活性値の２種の測定方法を説明する。
【００３０】
［トロンビン活性値測定；凝固時間法］
日本薬局方によるトロンビンの定量法に準じてトロンビン活性値を測定した。フィブリノーゲン溶液（ボルヒール（登録商標）、（財）化学及血清療法研究所）を生理食塩液（大塚生食注、大塚製薬）で希釈し、フィブリノーゲン濃度３ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液を調製した。日本薬局方標準品のトロンビン標準品（（財）日本公定書協会）を生理食塩液に溶かし、４種の標準溶液を調製した。標準溶液の濃度は、下記方法による凝固時間が１４〜６０秒の範囲内となるように濃度を振り調製した。測定サンプルも凝固時間が１４〜６０秒の範囲内となるように生理食塩液で希釈した。測定は血液凝固自動測定装置（ＫＣ４デルタ、ｔｒｉｎｉｔｙ ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用した。
【００３１】
あらかじめ血液凝固自動測定装置を３７℃に加温した。サンプルカップにフィブリノーゲン溶液を１５０μＬ入れ、３７℃で３分間温めた。これにトロンビン標準溶液５０μＬをピペットで吹き込み、同時にタイマーを作動させ、凝固するまでの凝固時間を測定した。５回ずつ測定を行いその平均値を求め、検量線とした。同様に、測定サンプルの凝固時間を測定し、検量線及び希釈倍率からトロンビン活性値を算出した。
【００３２】
［トロンビン活性値測定；発色基質法］
ＮａＣｌ １．７５３ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．７４４ｇ、ＢＳＡ ０．２００ｇ、１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ４ｍｌを注射用水（大塚蒸留水、大塚製薬）１９６ｍＬに溶解して、アッセイバッファーを調製した。発色性合成基質はＳ−２２３８（テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８、積水メディカル）を注射用水で溶解し、濃度２μｍｏｌ／ｍＬの合成基質溶液を調製した。標準溶液として日本薬局方標準品のトロンビン標準品を生理食塩液に溶解し２００Ｕ／ｍＬにしたものを更にアッセイバッファーで希釈し、４種の標準溶液を調製した。
【００３３】
測定サンプルは、まず、吸光度測定結果に誤差を生じないようにトロンビン溶液に微量に混在する赤血球を遠心分離により除去し使用した。なお、赤血球除去操作前後の凝固時間法によるトロンビン活性値に差はみられないことを下記実施例で確認済みである。次に下記測定法における検量線の範囲の吸光度を得られるように、アッセイバッファーで希釈した。測定はマイクロプレート分光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ３８４、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用した。
【００３４】
あらかじめマイクロプレート分光光度計を３７℃に加温した。９６穴マイクロプレートに、アッセイバッファーによって一定の希釈操作を行なった標準溶液又は測定サンプルを各々３ウェルに入れ、合成基質溶液を一定量添加後、４０５ｎｍの吸光度を１０秒間隔で５分カイネティック測定を行った。３ウェルの結果の平均値を測定値とし、４種の標準溶液の測定値から検量線を求め、測定サンプルの測定値から検量線と希釈倍率を元にトロンビン活性値を算出した。
【００３５】
（実施例１〜２６）
注射用水で置換したＤＥＡＥ基を有するアニオン交換体（セルロファインＫＡＮＴＯ ＤＥＡＥ−５００、関東化学）０．５ｍＬを容器容量２．５ｍＬのポリエチレン製のカラム（ラボラトリー・ポリエチレンカラムＳ１０１２、モビテック社）に充填した。溶離液は、注射用水に塩化カルシウム二水和物を５乃至５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、更に塩化ナトリウムでイオン強度が０．１７乃至０．４６ｍｏｌ／Ｌとなるように調製した。また、健常人ボランティアより血液を採取し、血液１００ｍＬに対して抗凝固剤としてＣＰＤ液を１４ｍＬ添加し、ヒト新鮮血液とした。ＣＰＤ液はクエン酸三ナトリウム二水和物３０．０ｇ、ブドウ糖２３．２ｇ、クエン酸一水和物３．５８ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物２．５１ｇを注射用水１Ｌに溶解して調製した。
【００３６】
アニオン交換体カラムに生理食塩液５ｍＬを流速１ｍＬ／ｍｉｎで通液、平衡化し、ゲルヘッドを出した後、ヒト新鮮血液８ｍＬを流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで濾過した。続いて生理食塩液１０ｍＬを流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで濾過し、アニオン交換体カラムを洗浄し、生理食塩液をアニオン交換体カラムから排出した。次に、出口を閉じたアニオン交換体カラムに、表１に記載の組成の溶離液０．５ｍＬを添加し、ピペッティング２〜３回によりアニオン交換体と溶離液をなじませた後、接触時間として１０分間静置した。アニオン交換体カラムの出口に１ｍＬシリンジをセットし、シリンジで吸引してトロンビン溶液を回収した。このようにして作製したトロンビン溶液のゲル化の有無を目視で確認した。また、ゲル化のないトロンビン溶液は、回収後１〜３時間以内にトロンビン活性値を凝固時間法及び合成基質法で測定した。実施例１乃至２６の結果を、表１、図１、及び図２に示す。
【００３７】
（比較例１〜１５）
溶離液の塩化カルシウム二水和物の濃度を５ｍｍｏｌ／Ｌ未満又は５０ｍｍｏｌ／Ｌより高くなるように調製したか、又は溶離液のイオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ未満又は０．４６ｍｏｌ／Ｌより高くなるように調製した以外は、実施例１〜２６と同様に実験した。比較例１乃至１５の結果を表２、図１、及び図２に示す。実施例１乃至２６、及び比較例１乃至１５の結果より、溶離液のカルシウムイオンが５ｍｍｏｌ／Ｌより少ない場合、又はイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌより低い場合は、トロンビン溶液のトロンビン活性値が低下することが示された。また、カルシウムイオンが５０ｍｍｏｌ／Ｌより多い、又はイオン強度が０．４６ｍｏｌ／Ｌより高い場合は、得られるトロンビン溶液がゲル化することが示された。
【００３８】
（実施例２７）
アニオン交換体と溶離液との接触時間を２分に変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液のゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５０４Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５３Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、溶離液との接触時間を２分に短縮しても同程度のトロンビン活性値を持つトロンビン溶液を調製できた。結果を表３に示す。
【００３９】
（実施例２８）
アニオン交換体と溶離液との接触時間を５分に変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で４７３Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３４０Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、溶離液との接触時間を５分へ短縮しても同程度のトロンビン活性値を持つトロンビン溶液を調製できた。結果を表３に示す。
【００４０】
（比較例１６）
アニオン交換体と溶離液との接触時間を３０分に変更した以外は、比較例１２と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、比較例１２と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で１８８Ｕ／ｍＬ、合成基質法で１２８Ｕ／ｍＬであった。比較例１２と比較し、溶離液との接触時間を３０分へ延長してもプロトロンビンからトロンビンへの活性化、溶出が不十分であり、トロンビン活性値は低かった。結果を表３に示す。
【００４１】
（実施例２９）
アニオン交換体カラムに添加する溶離液の液量を１．０ｍＬへ変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で２８５Ｕ／ｍＬ、合成基質法で１９６Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、溶離液の液量を２倍へ増やすとトロンビン活性値は１／２となり、溶離液の液量を増してもトロンビンをほぼ同等に回収できた。
【００４２】
（実施例３０）
アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を１６ｍＬに変更した以外は、実施例１３と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例１３と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で１０３０Ｕ／ｍＬ、合成基質法で７２９Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を２倍に増やすとトロンビン活性値も２倍となり、アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を増やした分、トロンビン活性値は上がった。
【００４３】
（実施例３１）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を室温で２４時間保存し、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５１２Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５６Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を室温で２４時間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
【００４４】
（実施例３２）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、冷蔵４℃で２週間保存し、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５０５Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３３８Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を冷蔵４℃で２週間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
【００４５】
（実施例３３）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、−２０℃で３週間冷凍保存した。冷凍トロンビン溶液を室温で解凍後、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５１９Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５６Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を冷凍−２０℃で３週間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
【００４６】
（実施例３４）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、−２０℃で６ヶ月間冷凍保存した。冷凍トロンビン溶液を室温で解凍後、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で５３４Ｕ／ｍＬ、合成基質法で３５０Ｕ／ｍＬであった。実施例１３と比較し、トロンビン溶液を冷凍−２０℃で６ヶ月間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表４に示す。
【００４７】
（実施例３５）
実施例１３で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、トロンビン溶液に微量に混在する赤血球を除去し、トロンビン活性値を凝固時間法で測定した。その結果、凝固法によるトロンビン活性値は５１７Ｕ／ｍＬであり、遠心分離操作によるトロンビン活性値の変化はみられなかった。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、血液を直接原料としたトロンビン溶液の調製方法として有用であり、得られたトロンビン溶液は、フィブリン糊や血小板ゲルの１成分として使用したり、止血剤として使用したりするなど、医療用途として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンを吸着させた後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法。
【請求項２】
前記溶離液とアニオン交換体の接触時間が２分以上１０分以下である、請求項１に記載のトロンビン溶液の調製方法。
【請求項３】
前記アニオン交換体がジエチルアミノエチル基を有するアニオン交換体である、請求項１又は２に記載のトロンビン溶液の調製方法。
【請求項４】
前記溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、該アニオン交換体を等張液で洗浄する、請求項１乃至３の何れかに記載のトロンビン溶液の調製方法。
【請求項１】
アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンを吸着させた後、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以上０．４６ｍｏｌ／Ｌ以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法。
【請求項２】
前記溶離液とアニオン交換体の接触時間が２分以上１０分以下である、請求項１に記載のトロンビン溶液の調製方法。
【請求項３】
前記アニオン交換体がジエチルアミノエチル基を有するアニオン交換体である、請求項１又は２に記載のトロンビン溶液の調製方法。
【請求項４】
前記溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、該アニオン交換体を等張液で洗浄する、請求項１乃至３の何れかに記載のトロンビン溶液の調製方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２５４６０６（Ｐ２０１０−２５４６０６Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０５２０７（Ｐ２００９−１０５２０７）
【出願日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（０００１１６８０６）旭化成クラレメディカル株式会社 (133)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（０００１１６８０６）旭化成クラレメディカル株式会社 (133)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]