ドパミン産生細胞を調節する方法
Ｎｕｒｒｌ誘導体が開示される。更に、ドパミン産生ニューロンの分化誘導方法と、前記誘導体を介してｐ５７ｋｉｐ２の発現を調節する方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、ここにその全部を参考文献として合体させる２００２年８月２６日出願の出願番号６０／４０８，１３２の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、Ｎｕｒｒｌ及びその誘導体と他の分子との相関作用、及びそれらの利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景及び従来技術
中枢神経系（以後、「ＣＮＳ」）に於ける細胞多様化は、最終的には、領域及び細胞型特異的転写因子の調整された発現をもたらす、厳密に調節された相互に絡みあったシグナリング事象のセットに依存する。ジェッセル（Jessell）他，Curr. Opin Neurobiol. 10：599-611（2000）,ビスクー（Briscoe）他，Curr. Opin. Neurobiol. 11:43-49（2001）の記事を参照。たとえば、いかにして転写因子がＣＮＳの発達において細胞多様性を作り出すかに関する理解は、ＣＮＳ関連疾患の治療等のために注目される。
【０００３】
腹側中脳に位置するニューロンの集団は、カテコールアミン神経伝達物質「ドパミン」、以後「ＤＡ」と略称する、を合成し遊離する。中脳ＤＡニューロンは、それらの頭側神経支配標的と共に、主要なドーパミン作動性系路を構成し、たとえば、運動神経支配、認識、判定メカニズム（award mechanism）、記憶処理の調節と制御に関連している。パーローネ‐カパーノ（Perrone-Capano）他，Int. J. Dev. Biol. 44：679-687（2000）を参照。ＤＡ細胞が重要であるもう１つの理由は、臨床的に、これらの細胞は、パーキンソン病などのＣＮＳ障害を有する患者において変性し、精神分裂やその他の障害に関連するプロセスに影響を与えるということである。デュネット（Dunnett）他，Nature 399：A32-39（1999）；バセット（Bassett）他，Can. J. Psychiatry 46：131-137（2001）。
【０００４】
ＤＡ細胞は、胚中脳の腹側床（ventral floor）において発生する。ハインズ（Hynes）他，Curr. Op. Neurobiol. 9：26-36（1999）を参照。「ソニックヘッジホッグ（Sonic hedgehog）」、及び「線維芽細胞成長因子８」として知られている因子による初期シグナリングは、パターニング事象、更に、レチンアルデヒドデハイドロゲナーゼ（“Ｒａｌｄｈ／ＡＨＤ２”）を発現する増殖するドパミン作動性前駆体細胞集団の確立に寄与する。ハインズ（Hynes）他，Neuron 15：33-44（1995）；イェ（Ye）他，Cell 93：755-766（1998），ウォリーン（Walleen）他，Exp. Cell Res. 253：737-746（1999）を参照。細胞が増殖を停止すると、それらは、Ｎｕｒｒｌ 又は“ＮＲ４Ａ２”として知られている分子を発現し始める。「Ｎｕｒｒｌ」は、以後言及するように、核内受容体ファミリのメンバである。ここに共に参考文献として合体させるロー（Law）他，Mol. Endocrinol. 6（12）：2129-35（1992）及びロー（Law）他，ＮＣＢＩ受託番号Ａ４６２２５を参照。
【０００５】
ロー（Law）他によって開示されているマウスＮｕｒｒｌ配列を、ここに配列識別番号１として提示する。尚、ここに記載されるＮｕｒｒｌの誘導体は、更に、位置１３１，１３４及び３５４の三つの残基のみマウスＮｕｒｒｌと異なるヒトＮｕｒｒｌ配列も含むことが意図されている。それもここに参考文献として合体させるスタウスバーグ（Stausberg）他，ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＨ０９２８８を参照。ヒトＮｕｒｒｌ配列中の位置１３１，１３４及び３５４は、ｔ，ｇ及びｅであるのに対して、マウスＮｕｒｒｌ中の位置１３１，１３４及び３５４はｓ，ｓ及びｄである。ここでの使用においてＮｕｒｒｌとは、種の違いに拘わらず（たとえば、哺乳類、ヒト、マウス、霊長類、及びその他の動物種）、全ての形態の分子と、更に、ＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースに開示されているもののような全てのアイソフォームをいう。
【０００６】
Ｎｕｒｒｌは、中脳ＤＡニューロン発達のために必須であることが示されている。詳述すると、Ｎｕｒｒｌノックアウト動物は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、又、その他のドパミン作動性特徴が欠失している。ゼッターストローム（Zetterstrom）他，Science 276:248-250（1997）；カスティロ（Castillo）他，Mol. Cell Neurosci. 11：36-46（1998）；ソースドゥ‐カルデナス（Saucedo-Cardenas）他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：4013-4018（1998）を参照。更に、Ｎｕｒｒｌは、ＤＡ細胞特異的遺伝子の発現の維持、正常細胞の遊走、標的領域神経支配、及び細胞生存のために必要とされる。ソースドゥ‐カルデナス（Saucedo-Cardenas）他，前出；ウォリーン（Walleen）他，Exp. Cell. Res. 253：737-746（1999）。ウォリーン（Walleen）他，Mol. Cell Neurosci 18：649-663（2001）を参照。
【０００７】
ホメオドメイン含有転写因子Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ １及び２（“Ｅｎ１”及び”Ｅｎ２”）及びＬｍｘ１ｂ）を含むＤＡ細胞発達には、その他の転写因子が関連している。しかし、Ｎｕｒｒｌと異なり、これらのたん白質は、発達中の胚におけるよりグローバルなパターニング事象に影響を与えるもののようである。ジョイナー（Joyner）他，Science 251：1239-1243（1991）；ワースト（Wurst）他，Development 120：857-887（1994）；シュミット（Smidt）他，Nat. Neurosci. 3：337-341（2000）；サイモン（Simon）他，J. Neurosci. 21：3126-3134（2001）を参照。しかしこれらの因子全てに共通することは、ＤＡ細胞発達に寄与するそれらが調節する遺伝子がいまだに同定されていないことである。
【０００８】
細胞分化と、細胞周期からの離脱とは、特に発達中の胚においては互いに密に調節されるプロセスである。細胞周期の調節にとって必須であるいくつかの調節機序が、細胞分化に影響を与えるものであることが示されている。チェラッパン（Chellappan）他，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 227：57-103（1998）を参照。
【０００９】
細胞周期制御にとって重要な１つの機序は、ＣＤＫ抑制因子、又は、「Ｃｋｉ」によるサイクリン依存性キナーゼ、又は、「ＣＤＫ」の抑制に関連する。たとえば、ヴィダル（Vidal）他，Gene 247：1-15（2000）を参照。ＣｋｉのＣｉｐ／Ｋｉｐファミリは、p２１Ｃｉｐ１，ｐ２７Ｋｉｐ１及びｐ５７Ｋｉｐ２から成る。それらは、イン・ヴィヴォでの細胞周期離脱（cell cycle exit）と種々の組織の分化とに関連する。たとえば、チェラッパン（Chellapan）他，前出、を参照。これらの内、ｐ５７Ｋｉｐ２のみが、他のＣｋｉによって埋め合わせすることができない胚形成中における重要な役割を果たすものであることが示されている。たとえば、ｐ５７Ｋｉｐ２ヌル変異体マウスは、口蓋裂、消化管異常、腎髄質異形成、副腎皮質過形成及び水晶体細胞過剰増殖、を含む重度の欠陥を示す。ヤン（Yan）他，Genes Dev. 11：973-983（1997），ツァン（Zhang）他，Nature 387：151-158（1997）を参照。更に、ｐ５７Ｋｉｐ２は、p２１Ｃｉｐ１と共に、管状筋細胞と肺の細胞との分化にも関連している。ツァン（Zhang）他，Genes Dev. 13：213-224（1994）参照。これに対して、網膜アマクリン介在ニューロンの異常成熟化を例外として、ｐ５７Ｋｉｐ２遺伝子標的化マウスにおいてＣＮＳ−関連不全は報告されていない。ダイアー（Dyer）他，Development 127：3593-3605（2000）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以下の開示は、Ｎｕｒｒｌによって調節される遺伝子の決定を含む、上述した問題のいくつかについて詳述する。本発明の別の態様は、ＤＡ細胞成熟化の機序に関連する因子の決定に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のこれら及びその他の特徴について以下の開示において詳述する。
【００１２】
いかにＮｕｒｒｌが、ＤＡニューロン分化及び成熟化の過程において必須であるｐ５７Ｋｉｐ２の発現にとって、必須であるかを説明するものである。従って、本発明の１つの特徴は、Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体の投与を介して、ＤＡニューロン分化又は成熟化を誘導するための方法に関する。ここで「その誘導体」とは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の７０以上３００以下のアミノ酸が欠失した分子を意味する。より好ましくは、「その誘導体」とは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の８０以上２７５以下のアミノ酸が欠失した分子、そして最も好ましくは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の９０以上２５０以下のアミノ酸が欠失した分子を意味する。前記欠失は、好ましくは、前記Ｎｕｒｒｌ分子のカルボキシ末端で起こる。
【００１３】
本発明の前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同性である。好ましくは、誘導体は、配列識別番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％相同性であり、更に好ましくは少なくとも９０％相同性である。最も好ましくは、誘導体は配列識別番号１に記載アミノ酸配列に対して少なくとも９５％相同性である。ここで「相同性」とは、配列識別番号１とある程度同一であり、その分子の残りの部分は、同類置換可能である、と定義される。「同類置換」とは、配列識別番号１にあるアミノ酸が、この分子の機能、即ち、そのｐ５７Ｋｉｐ２と相関作用する能力、を変化させないアミノ酸によって置換可能である、ということを意味する。そのような置換は当業者に知られている。たとえば、もしも分子の特定のポイントにおいてグリシンが存在しているならば、アラニンによる置換は同類置換と考えられる。というのは、この置換は、機能に影響しないと予測されるからである。これに対して、もしも前記位置がシトシンによって占められている場合は、遊離スルフヒドリル基により、アラニンによる置換は、実際に、機能に影響を与えると予測される。ロイシンのイソロイシンによる置換、又はその逆、等のその他の例も当業者に知られているので、ここでは繰り返さない。
【００１４】
そのような誘導体の具体例として、Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１−３３５のみから成る前記Ｎｕｒｒｌ誘導体等の、前記分子のカルボキシ末端が欠失した切断バリアントがある。前記諸例に記載した方法を使用して、当業者はその他のバリアントを同定し使用することが可能である。前記Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体は、たとえば、ポリペプチド自身として、又は、前述した例に記載したプラスミドによって例示されるように、組換えデリバリシステム、として投与することができる。ニューロンのほかに、幹細胞等の前駆体細胞も処理可能である。
【００１５】
そのような分子を使用することは、ＣＮＳ関連疾患、特に、ドパミン遊離ニューロンに関連するもの、の治療に有用であると考えられる。そのようなニューロンの変性は、パーキンソン病等の状態の特徴であり、これに対して精神分裂は、過剰なドパミン作動性システムによって特徴付けられる。当業者にとってその他の状態も知られており、ここではそれらについての説明は不要である。
【００１６】
後述する実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとが直接的な物理的相関作用を含むプロセスにおいて、ニューロンの成熟化において協同作用することを示している。従って、ｐ５７Ｋｉｐ２はＣＤＫ、そして、細胞タイプ特異的転写因子の両方と相関作用することがわかる。従って、本発明の別の特徴は、それを、Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体等の前記分子のアゴニスト又はアンタゴニストなどの調節物質と接触させることによってｐ５７Ｋｉｐ２を調節する方法である。
【００１７】
尚、ｐ５７Ｋｉｐ２は、ニューロンが細胞周期を逸脱したあと、ニューロンの分化を促進する。このことは前記データに示されている。
【００１８】
後述するデータは、Ｎｕｒｒｌとｐ５７Ｋｉｐ２との間に相反関係が存在することを示している。本質的には、Ｎｕｒｒｌがｐ５７Ｋｉｐ２の発現を活性化し、これに対してｐ５７Ｋｉｐ２は前述したようにＮｕｒｒｌと協同作用する。前記例に詳述されているように、恐らく前記相関作用には少なくとも１つの中間工程が含まれる。又、発達中のＤＡ細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２の発現が、Ｅｎ１，Ｅｎ２，Ｒａｌｄｈ１及びＰｔｘ３等の大半のその他の分析されたマーカが正常に発現される発達段階においてＮｕｒｒｌに依存することも明らかである。
【００１９】
後述するデータは、事実、ｐ５７Ｋｉｐ２がＮｕｒｒｌの転写活性に対して負の影響を与える可能性があることを示唆している。但し、別のプロモータの状況においては、これら二つの分子間の相関作用は正の影響を与える可能性があることも可能である。これにも拘わらず、本発明の更に別の態様は、Ｎｕｒｒｌを抑制するべく、Ｎｕｒｒｌに対して、ｐ５７Ｋｉｐ２又はその一部のいずれかを投与することによる、あるいは反対に、Ｎｕｒｒｌを刺激するべく、ｐ５７Ｋｉｐ２に対する抗体などのｐ５７Ｋｉｐ２アゴニスト、Ｎｕｒｒｌの非機能性誘導体、等を添加することによる、細胞中のＮｕｒｒｌ活性の調節に関する。
【００２０】
ここに記載の発達機序は、他の細胞タイプのものに類似するものと推測される。たとえば、前記「背景技術」の項で説明したように、Ｃｋｉのための要件の一部は、それらのＣＤＫインヒビタとしての機能から独立している。他のシステムからの結果がこれを支持している。たとえば、ｐ５７Ｋｉｐ２は、恐らく転写因子ＭｙｏＤに関連するプロセスにおいて筋肉分化を促進することが知られている。更に、細胞増殖の制御と結びつかない機序を介して正常な肺胞の発達に必要とされるｐ２１Ｃｉｐ２とｐ５７Ｋｉｐ２の重複性の活性化（redundant activates）が存在する。前記分子は、又、増殖網膜前駆体細胞の制御と、アマクリン細胞サブセットの運命決定とにおいて機能することも証明されている。又、ｐ２７Ｘｉｃｌとして知られているｐ２７Ｋｉｐ１のアフリカツメガエル（xenopus）同族体が、ＣＤＫの抑制を必要としない機序を介したミューラーグリア細胞分化に関与していることも観察されている。又、胎盤spongiotrophoblastの適切な発達が、ＣＤＫ活性におけるなんら測定可能な増加無く、ｐ５７Ｋｉｐ２遺伝子標的化マウスにおいて乱されることも観察されている。
【００２１】
全体として、ここに記載したＤＡニューロン発達の特徴付けは、たとえばパーキンソン病などにおける、特に治療用移植用に構成された幹細胞の使用に有用であると見なされる。たとえば、この点に関しては、ここに参考文献として合体させるキム（Kim）他，Nature 418：50-56（2002年7月4日）を参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
好適実施例の詳細説明
例１
ここに参考文献として合体させるチョイ（Choi）他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：8943-8947（1992）は、ＭＮ９Ｄと称されるドパミン合成神経細胞ラインについて記載している。ＭＮ９Ｄ細胞におけるＮｕｒｒｌの過剰発現は、細胞周期停止（arrest）、および、平坦な細胞形態、長神経突起の延伸、及びドパミン合成の増加によって特徴付けられる形状成熟化をもたらす。Ｎｕｒｒｌの発現をテトラクリンの制御下においてこのラインのクローンを発達させた。このラインのクローンを「ＭＮ９Ｄ−ＮｕｒｌＴｅｔ−Ｏｎ」と称する。前記クローンは、ＭＮ９Ｄ細胞を、プラスミドｐＴＲ２−ＮｕｒｒｌとｐＴＫ−Ｈｙｇｒｏとによってコトランスフェクトすることによって発達させた。前記第１のプラスミドは、宿主ベクターｐＴＲＥ２中において、ＮｕｒｒｌをコードするｃＤＮＡを含んでいた。コトランスフェクションは、逆テトラクリン制御トランスアクチベータ（reverse tetracycline controlled transactivator）を発現するＭＮ９Ｄ細胞中で、ここに参考文献として合体させるカストロ（Castro）他，J. Biol. Chem 276：43277-43284（2001）に従って行われた。細胞を、ドキシサイクリン（“ｄｏｘ”）、テトラクリン誘導体、（２μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。
【００２３】
前記ドキシサイクリンでの２４時間の処理中に、前記ＭＮ９Ｄ−ＮｕｒｌＴｅｔ−Ｏｎ細胞は、細胞周期のＧ１期において集積された。
【００２４】
免疫細胞蛍光発光法による測定で、前記ｄｏｘ処理細胞におけるＮｕｒｒｌの核内分布を含めて、４８時間後の前記細胞において成熟形態表現型が明らかであった。簡単に説明すると、前述したウォリーン（Walleen）によって記載されているように、市販のフルオロフォアに共役結合された抗−ＩｇＧと共に、一次抗体として抗−Ｎｕｒｒｌ抗体を使用した。細胞を、ＰＦＡで固定し、断片を、ＰＢＳ／０．５％ ＦＢＳ／０．３％−Ｔｒｉｔｏｎ中でブロックし、その後、一次抗体（４℃で１６時間）と二次抗体（室温で１時間）とによって連続的にインキュベートした。
【００２５】
例２
これらの実験は、前記ＭＮ９Ｄ細胞の分化に影響を与えた遺伝子の検索について記載するものである。
【００２６】
この目的のために、標準方法を使用してｄｏｘ処理ＭＮ９Ｄ−ＮｕｒｌＴｅｔ−Ｏｎ細胞から全ＲＮＡを単離し、再び標準方法を使用してｃＤＮＡに逆転写した。次に、以下のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。
tttaccctcg aagccgaag （配列識別番号２）
tgtatgctaa gcgcagaac （配列識別番号３）
（Ｎｕｒｒｌ用）；
cggtggaact ttgacttcgt （配列識別番号４）
gagtgcaaga cagcgacaag （配列識別番号５）
（ｐ２１Ｃｉｐ１用）;
ccgaggagga agatgtcaaa （配列識別番号６）
aaattccact tgcgctgact （配列識別番号７）
（ｐ２７Ｋｉｐ１用）;および、
gagagaactt gctgggcatc （配列識別番号８）
gctttacacc ttgggaccag （配列識別番号９）
（ｐ５７Ｋｉｐ２用）。
【００２７】
更に、Ｇ３ＰＤＨ用には市販のプライマーを使用した。前記ＲＴ−ＰＣＲは、各反応を９４℃にて３分間、その後、種々の回数のサイクルで、９４℃にて３０秒間、５４℃にて４５秒間、７２℃にて１分間、その後、７２℃で３分間行った。種々のサイクルを使用する理由は、種々のたん白質のｍＲＮＡは、細胞における発現レベルが異なるからである。Ｇ３ＰＤＨは、全部で２８サイクル、Ｎｕｒｒｌとｐ２１Ｃｉｐ１は３０サイクル、そしてｐ２７Kip１とｐ５７Ｋｉｐ２は３３サイクル増幅された。前記ｄｏｘ処理後、０，１及び１２時間後にアッセイを行った。Ｃｉｐ／ｋｉｐメンバをコードするｃＤＮＡが陽性対照であったのに対して、ＧＰ３ＰＤＨアッセイは、これが内部対照として作用するハウスキーピング遺伝子であるがために行われた。
【００２８】
その結果は、ｐ２７Ｋｉｐ１のｍＲＮＡは、いずれの測定時点においても誘導されていなかったが、ｐ２１Ｃｉｐ１は、１時間の処理後にアップレギュレーションされ、ｐ５７Ｋｉｐ２も１２時間の処理後に顕著にアップレギュレーションされたが、最初は堆積した。ｐ５７Ｋｉｐ２とｐ２１Ｃｉｐ１たん白質のレベルの対応する増加も観察された。
【００２９】
別の実験において、前記テトラサイクリン依存転写因子を発現したＭＮ９Ｄラインのサブクローンも、上述した要領でｄｏｘによって処理され、細胞周期停止及びＣｋｉ発現に対する影響が特異的で、Ｎｕｒｒｌ発現に依存するものであるか否かを調べた。これは実際に確認された。
【００３０】
これらの実験は、Ｎｕｒｒｌは実際は、ｐ２１Ｃｉｐ１とｐ５７Ｋｉｐ２との両方を調節するが、その調節の機序は異なるものであるということを示している。後者の比較的遅い誘導は、Ｎｕｒｒｌとの相関作用が直接的なものではなく、更に１つ又はそれ以上の中間工程が関与している、ということを示唆している。
【００３１】
例３
これらの実験は、正常な野生型（Ｓｖ１２６／Ｃ５７Ｂ１６）マウスの胚腹側中脳における分子の発現を測定するために構成された。１３．５日齢のマウス胚から矢状断片を取り出し、標準方法と、前出のウォリーン（Walleen）他に拠るジゴキシゲニン標識リボプローブを使用してｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでアッセイした。ｐ２７Ｋｉｐ１分析は免疫蛍光アッセイによって行われたので、これには１つの例外がある。Ｎｕｒｒｌ、ＴＨ，ｐ１７Ｃｉｐ１，ｐ２７Ｋｉｐ１，ｐ５７Ｋｉｐ２の発現パターンを分析した。
【００３２】
腹側中脳において強いＮｕｒｒｌ発現が見られ、ゼッターストローム（Zetterstroem）他，Mol. Brain. Res. 41：111-120（1996）の結果が確認された。（Ｅ１３．５）の時点で、ｐ２１Ｃｉｐ１は、全ＣＮＳ中においてかなり全般的に分布していたのに対して、ｐ５７Ｋｉｐ２は特徴的な発現パターンを示し、主として脳室をライニングしている脳室有糸分裂活性細胞に局在化していた。それは、又、腹側中脳において、ＴＨによって示されたパターンから視覚的に識別不能なパターンにおいても検出された。それは、Ｎｕｒｒｌ発現ドメインと重複し、それが、分化中のＤＡ細胞に発現されることを示した。これに対して、ｐ２７Ｋｉｐ１発現は、この時点では検出されなかった。Ｅ１３．５腹側中脳からの冠状断片の免疫組織化学的画像診断と、共焦点画像診断との両方によって、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとが、発達中のＤＡ細胞中に共発現されることが確認され、ＤＡ細胞分化の重要な段階、即ち、Ｅ１３からＥ１６．５までの間に、比較的一過性のｐ５７Ｋｉｐ２発現があったことが銘記された。
【００３３】
例４
これらの実験は、Ｎｕｒｒｌが発達中のＤＡニューロンにおいてｐ５７Ｋｉｐ２の発現を調節するか否かを調べるために構成された。上述したようにして、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを、野生型及びＮｕｒｒｌヌル変異マウスに対して行った。前出のゼッターストローム（Zetterstroem）他を参照。Ｅ１３．５で冠状断片を採取した。ｐ５７Ｋｉｐ２ｍＲＮＡレベルは、ＮｕｒｒｌとＴＨとの両方が野生型の胚においては分化ＤＡ細胞中に発現される、前記ヌルマウスの外套帯おいては劇的に減少した。ｐ５７Ｋｉｐ２は、外套帯においては選択的に減少調節されたが、隣接する脳室帯においては正常レベルに留まった。ｐ５７Ｋｉｐ２発現のレベル低下は、細胞不全によるものではなかった。というのは、Ｅｎ１／Ｅｎ２，Ｒａｌｄｈ １及びＰｔｘ３等の他のＤＡマーカは、発達のこの段階において正常発現レベルに留まったからである。
【００３４】
従って、これらの結果は、Ｎｕｒｒｌが、成熟中の分裂終了ＤＡ細胞に於けるｐ５７Ｋｉｐ２発現にとって必須であることを明確にしている。
【００３５】
例５
前出のカストロ（Castro）他は、Ｎｕｒｒｌは長い一般的には二極神経突起によって特徴付けられるＭＮ９Ｄ細胞の形態的分化を誘導することを示した。ここに記載の実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２がＤＡ細胞成熟において機能的に重要であるか否かを調べるために構成された。
【００３６】
これをテストするために、ＭＮ９Ｄ細胞を、強化緑色蛍光たん白質（ＥＧＦＰ）をコードする発現ベクターと、Ｎｕｒｒｌとｐ５７Ｋｉｐ２との一方又は両方と、前述したように、標準方法を使用して、コトランスフェクトした。ＥＧＦＰを発現した細胞の数を、前記コトランスフェクション実験の三日後に数え、それらは、前出のカストロ（Castro）他に従って、分化したものと見なした。
【００３７】
その結果は、ｐ５７Ｋｉｐ２の過剰発現は細胞分化を促進するのに不十分であるが、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの発現は、細胞分化の劇的な賦活をもたらすものであることを示した。
【００３８】
例６
これらの実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの間になんらかの直接的な相関作用が存在するか否かを判断するために構成された。これをテストするために、ヒト胚腎臓２９３細胞を使用した。これらを、ｐＣＭＸ−Ｆｌａｇ−Ｎｕｒｒｌを使用した“Ｆｌａｇ”免疫タグされたＮｕｒｒｌ、又は、レイノー（Reynaud）他，Mol. Cell Biol 19：7621-7629（1999）に記載されているように、ｐＣＭＶ−ＨＡ−ｐ５７Ｋｉｐ２を使用したＨＡ−免疫タグされたｐ５７Ｋｉｐ２のいずれか、又はこれらの両方でトランスフェクトした。トランスフェクションプロトコルは、前出のカストロ（Castro）他に従った。対照として、空ベクターを使用した。
【００３９】
前記細胞のトランスフェクションと培養後、ディグマン（Digman）他，Nucleic Acids Res 11：1475-1489（1983）に従って、核内たん白質抽出物を得て、次に、これらを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解した。核細胞抽出物を、抗−Ｎｕｒｒｌ又は抗−ｐ５７Ｋｉｐ２抗体のいずれかを使用して免疫沈降させた。次に、これらを、ジョゼフ（Joseph），Oncogene 20：2877-2888（2001）に従って、市販の抗−ＦＬＡＧ及びＨＡ−抗体で免疫ブロットした。その結果は、これらのたん白質が物理的に相関作用することを示した。
【００４０】
これらの実験に対する追跡実験で、前出のカストロ（Castro）他に従って、
agcttgagtt ttaaaaggtc atgctcaatt t
（配列識別番号１０）と、その３２P標識相補体ＮＢＲＥ（特異的Ｎｕｒｒｌ ＤＮＡ結合部位）プローブとを使用して、ゲルシフト実験を行った。これは、定義されたＮｕｒｒｌ結合部位である。前記配列“aaaggtca”は、特に重要であった。バンドをオートラジオグラフィーによって可視化した。Ｎｕｒｒｌにおけるシフトと、ＮＢＲＥに結合したＮｕｒｒｌ／ｐ５７Ｋｉｐ２複合物におけるスーパーシフトが見られた。更に別の実験において、前記抽出物と、ＨＡ特異的抗体との組み合わせは、ＮＢＲＥプローブに結合したＮｕｒｒｌに対するｐ５７Ｋｉｐ２の結合を消滅させた。
【００４１】
ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの間に直接的な相関作用があるか否かを調べる別の実験において、１５日齢のラット胚の腹側中脳からの細胞を使用した。上述した手順に従って、全細胞抽出物を調製した。次に、これらを、抗−Ｎｕｒｒｌ又は抗−ＩｇＧ（対照）抗体を使用して免疫沈降させた。その結果得られた免疫複合体を、上述したプロトコルに従って、抗−ｐ５７Ｋｉｐ２抗体を使用して免疫ブロットした。前述したように、ｐ５７Ｋｉｐ２をコードする発現ベクターによってトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞からの核細胞抽出物を、対照として使用した。これらの結果も、前記たん白質間の物理的相関作用を示した。
【００４２】
これらの実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２がＮｕｒｒｌ転写活性を調節可能であるということを示唆した。このことについて以下の例で説明する。
【００４３】
例７
ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの間の相関作用を確認するために、哺乳類細胞ツーハイブリッドアッセイを行った。前述のカストロ（Castro）他に記載の方法を使用して、発現ベクターＶＰ１６-ｐ５７Ｋｉｐ２とＧａｌ４ＤＢＤ−Ｎｕｒｒｌ（１−２６２）のいずれか一方又は両方、および、H.simplexチミジンキナーゼ遺伝子最小プロモーター（パールマン（Perlmann）他，Genes Dev 9, 769-82 （1995）を参照）の上流側でクローニングされた４ ＵＡＳ Ｇａｌ４結合部位によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子で、ＨＥＫ−２９３細胞をコトランスフェクトした。ＶＰ１６−ｐ５７Ｋｉｐ２は、ｐＣＭＸ−ＶＰ１６からの、単純ヘルペスウイルスからのＶＰ１６転写トランス活性化ドメインをコードし、そのあと、全長、インフレームの、マウスｐ５７Ｋｉｐ２のｃＤＮＡ配列が続く。Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｎｕｒｒｌ （１−２６２）は、ｐＣＭＸ−Ｇａｌ４ベクターの酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン（残基１−１４７）とインフレームの、Ｎｕｒｒｌの最初の２６２のアミノ酸残基をコードする。Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｎｕｒｒｌプラスミドが使用された理由は、それが前記レポーター遺伝子をＮｕｒｒｌアミノ末端ドメイン内のトランス活性化ドメインの存在によって活性化するからである。更に、ＶＰ１６のみをコードするプラスミドと、Ｇａｌ４ＤＢＤのみをコードするプラスミドとが使用された。
【００４４】
次に、細胞を収集し、前出のパールマン（Perlmann）他に従って分析した。β−ガラクトシダーゼ活性への正規化後、相対的光ユニット（ＲＬＵ）を算出した。その結果は、予想通り、Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｎｕｒｒｌ （１−２６２）はレポーター遺伝子を活性化することを示した。レポーター遺伝子の活性化は、ＶＰ１６−ｐ５７Ｋｉｐ２でのコトランスフェクションによって強力に増強された。これらの結果も、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの間に物理的相関作用が起こることを示した。
【００４５】
例８
この次の実験は、ｐ２１Ｃｉｐ１又はｐ２７Ｋｉｐ１のいずれかがＮｕｒｒｌと相関作用するか否かを調べるように構成された。ＨＥＫ−２９３細胞を、ＨＡ−ｐ２１Ｃｉｐ１又はＨＡ−ｐ２７Ｋｉｐ１をコードする発現ベクターでトランスフェクトさせた。対照として空の発現ベクターを使用した。トランスフェクションは、前述した標準プロトコルに従って行われた。トランスフェクション処理が成功するように、細胞のトランスフェクションと培養後、核細胞抽出物を、前出のディグナム（Dignam）他に従って得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解した。次に、それらを、前出のジョゼフ（Joseph）他に従って、市販の抗−p２１及び抗−ｐ２７抗体によって免疫ブロットした。
【００４６】
次に、ＨＥＫ−２９３細胞を、ＨＡ−ｐ２１Ｃｉｐ１又はＨＡ−ｐ２７Ｋｉｐ１のいずれかをコードする発現ベクターと前記空のベクター（対照）、或いは、Ｆｌａｇ−Ｎｕｒｒｌをコードする発現ベクターｐＣＭＸ−Ｆｌａｇ−Ｎｕｒｒｌ、即ち、ＮｕｒｒｌのＦＬＡＧ標識化したもの、のいずれかでコトランスフェクトさせた。核細胞抽出物を得て、抗−Ｎｕｒｒｌ抗体を使用して免疫沈降させた。免疫複合体を、抗−ｐ２１Ｃｉｐ１又は抗−ｐ２７Ｋｉｐ１を使用して免疫ブロットした。すべてのプロトコルは前述したものに従った。その結果は、前記免疫ブロットが抗−ｐ２１Ｃｉｐ１又は抗−ｐ２７Ｋｉｐ１抗体によってプローブされた時になんらシグナルが発生しないことから、p２１Ｃｉｐ１とｐ２７Ｋｉｐ１のいずれもＮｕｒｒｌと相関作用しないこと、を示した。
【００４７】
例９
これらの実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２がＮｕｒｒｌの転写活性に対していかなるタイプの影響を与えるかを調べるように構成された。
【００４８】
ＭＮ９Ｄ細胞を、先ず、前出のパールマン（Perlmann）他に記載されているように“ＮＢＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃ”と称されるＮＢＲＥの三つのコピーを含むルシフェラーゼレポータープラスミドと、Ｎｕｒｒｌを発現するベクター、又は、ｐ５７Ｋｉｐ２を発現するベクターのいずれか、でトランスフェクトした。トランスフェクションと培養の２４時間後に細胞を収集し、細胞抽出物を採取し、次に、これらのルシフェラーゼ活性と、対照として、β-ガラクトシダーゼ活性、とをアッセイした。
【００４９】
その結果は、ｐ５７Ｋｉｐ２が、投与量依存的に、レポーター遺伝子活性に対して負の影響を与えることを示した。対照実験において、ｐ５７Ｋｉｐ２は、レチノール酸レポーター依存レポーター遺伝子を抑制しなかった。
【００５０】
これらの結果から、Ｎｕｒｒｌとｐ５７Ｋｉｐ２は、これら二つのたん白質間の直接的相関作用に依存する可能性のある機序を介して、ＭＮ９Ｄ細胞の成熟化を誘導において協同作用するものであるという結論が導かれる。
【００５１】
例１０
この例は、前述したたん白質−たん白質相関作用の構造的特長を明らかにするように構成された実験を記載するものである。
【００５２】
ベクターｐＣＭＸ−Ｎｕｒｒｌ１−３５５，ｐＣＭＸ−Ｎｕｒｒｌ９４−５９８及びｐＣＭＸ−Ｎｕｒｒｌ１１８３−５９８を使用して、Ｎｕｒｒｌの三つの切断端誘導体が作成された。第１のものは、カルボキシ末端ＬＢＤ／ＡＦ２ドメインを欠失したもので、残りの二つは、それぞれ、ＡＦ１トランス活性化ドメインの最初のアミノ末端９３及び１８２アミノ酸残基を欠失したものである。これらのベクターと、更に、ＮｕｒｒｌとＨＡ−ｐ５７Ｋｉｐ２とをコードするベクターとを、前述した要領で、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションするのに使用した。全ての細胞は、ＨＡ−ｐ５７Ｋｉｐ２ベクターと、前記Ｎｕｒｒコンストラクトの１つ又は対照ベクターとによってコトランスフェクションされた。
【００５３】
培養後、共免疫沈降アッセイを行い、これにより、Ｎｕｒｒｌに対する抗体（前出のウォリーン（Walleen）他を参照）と、ＨＡに対する抗体と、プロテインセファロース−プレ清澄化核抽出物をインキュベートした。抽出物は、核抽出物緩衝液中で一晩４℃で抗体とインキュベートされた。プロテインＡ又はプロテインＧセファロースに結合した免疫複合体を、遠心分離によって収集し、ＲＩＰＡ緩衝液中で三回洗浄した。
【００５４】
その結果は、カルボキシ末端ＬＢＤ／ＡＦ２ドメインの欠失はｐ５７Ｋｉｐ２との相関作用に影響しなかったのに対して、前記アミノ末端ドメインの短い欠失と長い欠失との両方は、相関作用を完全に消滅させたことを示した。
【００５５】
追跡実験において、ＭＮ９Ｄ細胞を、前述したＥＧＦＰベクターと、前述した４つのＮｕｒｒｌベクターの１つのみ、又は、ｐ５７Ｋｉｐ２発現ベクターと共にコトランスフェクションし、細胞の成熟におけるＮｕｒｒｌと前記三つのＮｕｒｒｌ切断誘導体の影響を調べた。分化を、前述したように三日後にアッセイした。
【００５６】
前記Ｎｕｒｒｌ９４−５９８とＮｕｒｒｌ１８３−５９８誘導体は、成熟化の誘導においてｐ５７Ｋｉｐ２と協同作用しなかったが、前記カルボキシ末端の欠失は、協同性と成熟化に対してなんら影響を与えなかった。Ｎｕｒｒｌに加えて、前記三つの誘導体は、単体で発現された時には、ＭＮ９Ｄ細胞成熟化を誘導したが、但しそのレベルは低かった。従って、最高レベルの分化には、ｐ５７Ｋｉｐ２とｐ５７Ｋｉｐ２と相互作用可能なＮｕｒｒｌ誘導体との両方の発現が必要であった。
【００５７】
又、Ｎｕｒｒｌ１８３−５９８のみならず野生型Ｎｕｒｒｌもｐ５７Ｋｉｐ２の発現を誘導することも観察された。これは、この誘導体が細胞成熟において、ｐ５７Ｋｉｐ２と機能的に協同作用することが出来ないことが、他の必須のＮｕｒｒｌ機能の不活性化によるものではないということを示している。
【００５８】
例１１
ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの共発現によって誘導される成熟化に対する観察された影響に鑑みて、ｐ５７Ｋｉｐ２によって細胞成熟に対してどのような寄与が提供されるのかを調べるための実験を行った。
【００５９】
これをテストするために、ＭＮ９Ｄ細胞を、前述したように、EGFP及びＮｕｒｒｌの発現ベクター単体、又は、アンチセンスコンストラクトｐＣＭＸ−ａｓｐ５７Ｋｉｐ２と共に、コトランスフェクションさせた。このアンチセンスコンストラクトは、ｐＥＸ１０Ｘ−ｐ５７Ｋｉｐ２からのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、そのＥｃｏＲＩ部位として、アンチセンス配向で発現ベクターｐＣＭＸに挿入することによって得られた。前述したように、成熟化を判断するためのものと同じシステムを使用した。“ａｓｐ５７”ＲＮＡ、即ち、前記アンチセンスコンストラクト、は、Ｎｕｒｒｌによって誘導される細胞成熟化を消滅させた。それは、又、内因性ｐ５７Ｋｉｐ２のたん白質発現と、更に、コトランスフェクションされた発現ベクターから発現されたｐ５７Ｋｉｐ２のたん白質発現を抑制した。
【００６０】
更に別の実験において、２４時間後にトランスフェクション細胞を収集し、ここに参考文献として合体させるジョゼフ（Joseph）他，Oncogene 21：65-77（2002）に記載されているようにＦＡＣＳによって分析した。細胞をＥＧＦＰ発現によって選別し、細胞周期の異なる時期におけるそれらの分布を、ＤＮＡの定量化によって決定した。ａｓｐ５７発現は、恐らくは、前述したｐ２１Ｃｉｐ１のＮｕｒｒｌ誘導発現により、Ｎｕｒｒｌによって誘導される細胞周期停止を乱さなかった。従って、これらのデータは、これらの細胞において、成熟化と細胞周期停止が互いに独立的に制御されることを示している。この観察の派生的内容について以下の例で詳述する。
【００６１】
例１２
この実験は、細胞成熟化のための具体的な要件を更に調べるために行われた。ワタナベ（Watanabe）他，Proc Natl AcadSci USA 95, 1392-7（1998）に記載されているようにｐ５７Ｋｉｐ２の変異誘導体（ｐ５７ＣＫｍｕｔ）を使用した。なぜなら、ｐ５７ＣＫｍｕｔは、ＣＤＫ活性を抑制するために使用することができないからである。ＭＮ９Ｄ細胞を、ＥＧＦＰとＮｕｒｒｌ又はＮｕｒｒｌ１−３５５のいずれかをコードする発現ベクター、のみ、又は、ｐ５７Ｋｉｐ２又はｐ５７ＣＫｍｕｔの発現ベクター、とトランスフェクションした。トランスフェクションは、前述した方法によって行われた。ｐ５７ＣＫｍｕｔの発現は、細胞周期停止を誘導することは出来ないが、ｐ５７ＣＫｍｕｔはＭＮ９Ｄ細胞の成熟化においてＮｕｒｒｌと協同作用する能力は保持していた。これらのデータは、ｐ５７Ｋｉｐ２は、ＣＤＫ活性を抑制するその能力とは独立的な機序によってＤＡ細胞成熟化を促進する、ということを示している。それは、更に、ｐ５７Ｋｉｐ２が、Ｎｕｒｒｌとの直接的相関作用に関連する機序を介して、ＭＮ９Ｄ細胞成熟化において協同作用するとの見解を支持している。
【００６２】
例１３
前述の実験において得られた結果は、ｐ５７Ｋｉｐ２がＤＡ細胞発達に関与しているかもしれないことを示唆した。これを調べるために、ｐ５７Ｋｉｐ２ヌルマウスを使用した（前出のヤン（Yan）他を参照）。具体的には、上述したように、１３．５日と１８．５日齢のマウスの胚から冠状断片を採取し、それらを、同様に前述したように分析した。
【００６３】
Ｅ１３．５において、中脳ＤＡ細胞は、ＤＡニューロンマーカ遺伝子、細胞増殖及びアポトーシスとに基づき、前記ヌルマウス胚において正常に見えた。
【００６４】
しかしながら、Ｅ１８．５において、ｐ５７Ｋｉｐ２の不在は腹側中脳におけるＴＨ免疫応答性において劇的な低下をもたらした。ＴＨ発現は、青斑核と嗅球とを含む、カテコールアミン作動性ニューロンが位置する、脳の他の領域においては影響されなかった。従って、前記表現型は、中脳ＤＡニューロンに対して選択的である。
【００６５】
Ｎｕｒｒｌのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを行い、Ｎｕｒｒｌ発現が、前記ヌルマウスＥ１８．５胚の腹側中脳においては減少するが、他の領域においては正常であることが確認された。
【００６６】
更に、ＴＨとＮｕｒｒｌの発現は、腹側中脳の側方領域において特に弱く、このことは、ＴＨ及びＮｕｒｒｌ発現細胞が変異脳の内側部位に留まることを示唆している。
【００６７】
これらのデータは、後期懐胎期間中にｐ５７Ｋｉｐ２発現の開始が起こるということの裏付けを提供するものである。
【００６８】
例１４
前の実験は、ＭＮ９Ｄ細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２の重要性を示した。イン・ヴィヴォでのＤＡ細胞分化の重要な段階におけるこのたん白質の発現によって、ｐ５７Ｋｉｐ２がＤＡ細胞発達において役割を果たすものであるか否かを調べる追加実験が示唆された。より具体的には、この実験は、ＣＳＭ１４．１細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２発現を調べるために行われた。
【００６９】
ＣＳＭ１４．１は、ラットの胚腹側中脳から確立され、温度感応性ラージＴ−抗原によって不死化された細胞である（デュランド（Durand）他， Neurosci. Abstr.（1990）を参照）。これらの細胞が使用された理由は、それらは、未熟神経前駆体細胞に類似し、低濃度の血清中で３９℃にて成長させ、成熟ＤＡ細胞表現型に分化するように誘導可能であるからである。
【００７０】
ＣＳＭ１４．１細胞を、５％ＣＯ２中で、１０％ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリンと１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンとを添加したＤＭＥ−Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ中で３５℃（許容温度）で維持した。細胞分化を誘導するために、ＦＢＳを１％に減らし、温度を３９℃（非許容温度）に上げた、前出デュランド（Durand）他，Anat. 20: 61-69（2002）。これら両方のケースにおいて、細胞は４日間培養された。
【００７１】
標準方法により細胞から全細胞抽出物を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。次に、これらを市販の抗−Ｎｕｒｒｌ又は抗−ｐ５７抗体又は、一般ニューロンマーカＮｅｕＮで免疫ブロットした。均一なローディングを確保するためにフィルターをポンソー（Ponceau）染色した。その結果は、Ｎｕｒｒｌ，ｐ５７Ｋｉｐ２及びＮｅｕＮは、細胞が分化するとき誘導されることを示した。
【００７２】
別の実験において、細胞のサンプルを、前述した発現ベクターｐＣＭＸ−ａｓｐ５７Ｋｉｐ２でトランスフェクションし、３３℃（１０％ＦＢＳ）又は３９℃（１％ＦＢＳ）のいずれかで４日間培養した。対照として、空発現ベクターを使用した。ここでも、細胞は４日間培養された。ｐＣＭＸ−ａｓｐ５７Ｋｉｐ２でのトランスフェクションによって、低レベルのＮｅｕＮによって示されているように、成熟表現型の獲得が抑制された。このことは、ｐＣＭＸ−ａｓｐ５７Ｋｉｐ２が細胞分化において重要であることを示している。
【００７３】
例１５
これらの実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２ヌルマウス（Ｅ１８．５マウス）の腹側中脳における細胞死の発生を分析するために構成された。
【００７４】
ここに参考文献として合体させるジョゼフ（Joseph）他，Oncogene 21：65-77（2002）に従って、予めＴＨ免疫検出の処理をされた細胞に対してin situ核内ＤＮＡフラグメンテーションアッセイを行った。陽性の細胞を、二の異なる個体によって個々に計数した。
【００７５】
野生型との比較において、ヌルマウスにおいて全ドパミン作動性領域におけるアポトーシス細胞の増加が観察された。実際、この増加は２倍以上であった。この増加は、前記中脳ドパミン作動性領域に特異的であり、その他の部位では観察されず、これによって、中脳ＤＡ細胞の正常な発達においてｐ５７Ｋｉｐ２が厳格に要求されるという結論が導かれた。
【００７６】
以上の開示は、いかにＮｕｒｒｌが、ＤＡニューロン分化及び成熟化の過程において必須であるｐ５７Ｋｉｐ２の発現にとって必須であるかを説明するものである。従って、本発明の１つの特徴は、Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体の投与を介して、ＤＡニューロン分化又は成熟化を誘導するための方法に関する。ここで「その誘導体」とは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の７０以上３００以下のアミノ酸が欠失した分子を意味する。より好ましくは、「その誘導体」とは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の８０以上２７５以下のアミノ酸が欠失した分子、そして最も好ましくは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の９０以上２５０以下のアミノ酸が欠失した分子を意味する。前記欠失は、好ましくは、前記Ｎｕｒｒｌ分子のカルボキシ末端で起こる。
【００７７】
本発明の前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同性である。好ましくは、誘導体は、配列識別番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％相同性であり、更に好ましくは少なくとも９０％相同性である。最も好ましくは、誘導体は配列識別番号１に記載アミノ酸配列に対して少なくとも９５％相同性である。ここで「相同性」とは、配列識別番号１とある程度同一であり、その分子の残りの部分は、同類置換可能である、と定義される。「同類置換」とは、配列識別番号１にあるアミノ酸が、この分子の機能、即ち、そのｐ５７Ｋｉｐ２と相関作用する能力、を変化させないアミノ酸によって置換可能である、ということを意味する。そのような置換は当業者に知られている。たとえば、もしも分子の特定のポイントにおいてグリシンが存在しているならば、アラニンによる置換は同類置換と考えられる。というのは、この置換は、機能に影響しないと予測されるからである。これに対して、もしも前記位置がシトシンによって占められている場合は、遊離スルフヒドリル基により、アラニンによる置換は、実際に、機能に影響を与えると予測される。ロイシンのイソロイシンによる置換、又はその逆、等のその他の例も当業者に知られているので、ここでは繰り返さない。
【００７８】
そのような誘導体の具体例として、前述したように、Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１−３３５のみから成る前記Ｎｕｒｒｌ誘導体等の、前記分子のカルボキシ末端が欠失した切断バリアントがある。前記諸例に記載した方法を使用して、当業者はその他のバリアントを同定し使用することが可能である。前記Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体は、たとえば、ポリペプチド自身として、又は、前述した例に記載したプラスミドによって例示されるように、組換えデリバリシステム、として投与することができる。ニューロンのほかに、幹細胞等の前駆体細胞も処理可能である。
【００７９】
そのような分子を使用することは、ＣＮＳ関連疾患、特に、ドパミン遊離ニューロンに関連するもの、の治療に有用であると考えられる。そのようなニューロンの変性は、パーキンソン病等の状態の特徴であり、これに対して精神分裂は、過剰なドパミン作動性システムによって特徴付けられる。当業者にとってその他の状態も知られており、ここではそれらについての説明は不要である。
【００８０】
上述した実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとが直接的な物理的相関作用を含むプロセスにおいて、ニューロンの成熟化において協同作用することを示している。従って、ｐ５７Ｋｉｐ２はＣＤＫ、そして、細胞タイプ特異的転写因子の両方と相関作用することがわかる。従って、本発明の別の特徴は、それを、Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体等の前記分子のアゴニスト又はアンタゴニストなどの調節物質と接触させることによってｐ５７Ｋｉｐ２を調節する方法である。
【００８１】
尚、ｐ５７Ｋｉｐ２は、ニューロンが細胞周期を逸脱したあと、ニューロンの分化を促進する。このことは前記データに示されている。
【００８２】
前記データは、Ｎｕｒｒｌとｐ５７Ｋｉｐ２との間に相反関係が存在することを示している。本質的には、Ｎｕｒｒｌがｐ５７Ｋｉｐ２の発現を活性化し、これに対してｐ５７Ｋｉｐ２は前述したようにＮｕｒｒｌと協同作用する。前記例に詳述されているように、恐らく前記相関作用には少なくとも１つの中間工程が含まれる。又、発達中のＤＡ細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２の発現が、Ｅｎ１，Ｅｎ２，Ｒａｌｄｈ１及びＰｔｘ３等の大半のその他の分析されたマーカが正常に発現される発達段階においてＮｕｒｒｌに依存することも明らかである。
【００８３】
前述したデータは、事実、ｐ５７Ｋｉｐ２がＮｕｒｒｌの転写活性に対して負の影響を与える可能性があることを示唆している。但し、別のプロモータの状況においては、これら二つの分子間の相関作用は正の影響を与える可能性があることも可能である。これにも拘わらず、本発明の更に別の態様は、Ｎｕｒｒｌを抑制するべく、Ｎｕｒｒｌに対して、ｐ５７Ｋｉｐ２又はその一部のいずれかを投与することによる、あるいは反対に、Ｎｕｒｒｌを刺激するべく、ｐ５７Ｋｉｐ２に対する抗体などのｐ５７Ｋｉｐ２アゴニスト、Ｎｕｒｒｌの非機能性誘導体、等を添加することによる、細胞中のＮｕｒｒｌ活性の調節に関する。
【００８４】
ここに記載の発達機序は、他の細胞タイプのものに類似するものと推測される。たとえば、前記「背景技術」の項で説明したように、Ｃｋｉのための要件の一部は、それらのＣＤＫインヒビタとしての機能から独立している。他のシステムからの結果がこれを支持している。たとえば、ｐ５７Ｋｉｐ２は、恐らく転写因子ＭｙｏＤに関連するプロセスにおいて筋肉分化を促進することが知られている。更に、細胞増殖の制御と結びつかない機序を介して正常な肺胞の発達に必要とされるｐ２１Ｃｉｐ２とｐ５７Ｋｉｐ２の重複性の活性化（redundant activates）が存在する。前記分子は、又、増殖網膜前駆体細胞の制御と、アマクリン細胞サブセットの運命決定とにおいて機能することも証明されている。又、ｐ２７Ｘｉｃｌとして知られているｐ２７Ｋｉｐ１のアフリカツメガエル（xenopus）同族体が、ＣＤＫの抑制を必要としない機序を介したミューラーグリア細胞分化に関与していることも観察されている。又、胎盤spongiotrophoblastの適切な発達が、ＣＤＫ活性におけるなんら測定可能な増加無く、ｐ５７Ｋｉｐ２遺伝子標的化マウスにおいて乱されることも観察されている。
【００８５】
全体として、ここに記載したＤＡニューロン発達の特徴付けは、たとえばパーキンソン病などにおける、特に治療用移植用に構成された幹細胞の使用に有用であると見なされる。たとえば、この点に関しては、ここに参考文献として合体させるキム（Kim）他，Nature 418：50-56（2002年7月4日）を参照。
【００８６】
本発明のその他の特徴は、当業者にとって明らかであり、ここに繰り返す必要はない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、ここにその全部を参考文献として合体させる２００２年８月２６日出願の出願番号６０／４０８，１３２の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、Ｎｕｒｒｌ及びその誘導体と他の分子との相関作用、及びそれらの利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景及び従来技術
中枢神経系（以後、「ＣＮＳ」）に於ける細胞多様化は、最終的には、領域及び細胞型特異的転写因子の調整された発現をもたらす、厳密に調節された相互に絡みあったシグナリング事象のセットに依存する。ジェッセル（Jessell）他，Curr. Opin Neurobiol. 10：599-611（2000）,ビスクー（Briscoe）他，Curr. Opin. Neurobiol. 11:43-49（2001）の記事を参照。たとえば、いかにして転写因子がＣＮＳの発達において細胞多様性を作り出すかに関する理解は、ＣＮＳ関連疾患の治療等のために注目される。
【０００３】
腹側中脳に位置するニューロンの集団は、カテコールアミン神経伝達物質「ドパミン」、以後「ＤＡ」と略称する、を合成し遊離する。中脳ＤＡニューロンは、それらの頭側神経支配標的と共に、主要なドーパミン作動性系路を構成し、たとえば、運動神経支配、認識、判定メカニズム（award mechanism）、記憶処理の調節と制御に関連している。パーローネ‐カパーノ（Perrone-Capano）他，Int. J. Dev. Biol. 44：679-687（2000）を参照。ＤＡ細胞が重要であるもう１つの理由は、臨床的に、これらの細胞は、パーキンソン病などのＣＮＳ障害を有する患者において変性し、精神分裂やその他の障害に関連するプロセスに影響を与えるということである。デュネット（Dunnett）他，Nature 399：A32-39（1999）；バセット（Bassett）他，Can. J. Psychiatry 46：131-137（2001）。
【０００４】
ＤＡ細胞は、胚中脳の腹側床（ventral floor）において発生する。ハインズ（Hynes）他，Curr. Op. Neurobiol. 9：26-36（1999）を参照。「ソニックヘッジホッグ（Sonic hedgehog）」、及び「線維芽細胞成長因子８」として知られている因子による初期シグナリングは、パターニング事象、更に、レチンアルデヒドデハイドロゲナーゼ（“Ｒａｌｄｈ／ＡＨＤ２”）を発現する増殖するドパミン作動性前駆体細胞集団の確立に寄与する。ハインズ（Hynes）他，Neuron 15：33-44（1995）；イェ（Ye）他，Cell 93：755-766（1998），ウォリーン（Walleen）他，Exp. Cell Res. 253：737-746（1999）を参照。細胞が増殖を停止すると、それらは、Ｎｕｒｒｌ 又は“ＮＲ４Ａ２”として知られている分子を発現し始める。「Ｎｕｒｒｌ」は、以後言及するように、核内受容体ファミリのメンバである。ここに共に参考文献として合体させるロー（Law）他，Mol. Endocrinol. 6（12）：2129-35（1992）及びロー（Law）他，ＮＣＢＩ受託番号Ａ４６２２５を参照。
【０００５】
ロー（Law）他によって開示されているマウスＮｕｒｒｌ配列を、ここに配列識別番号１として提示する。尚、ここに記載されるＮｕｒｒｌの誘導体は、更に、位置１３１，１３４及び３５４の三つの残基のみマウスＮｕｒｒｌと異なるヒトＮｕｒｒｌ配列も含むことが意図されている。それもここに参考文献として合体させるスタウスバーグ（Stausberg）他，ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＨ０９２８８を参照。ヒトＮｕｒｒｌ配列中の位置１３１，１３４及び３５４は、ｔ，ｇ及びｅであるのに対して、マウスＮｕｒｒｌ中の位置１３１，１３４及び３５４はｓ，ｓ及びｄである。ここでの使用においてＮｕｒｒｌとは、種の違いに拘わらず（たとえば、哺乳類、ヒト、マウス、霊長類、及びその他の動物種）、全ての形態の分子と、更に、ＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースに開示されているもののような全てのアイソフォームをいう。
【０００６】
Ｎｕｒｒｌは、中脳ＤＡニューロン発達のために必須であることが示されている。詳述すると、Ｎｕｒｒｌノックアウト動物は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、又、その他のドパミン作動性特徴が欠失している。ゼッターストローム（Zetterstrom）他，Science 276:248-250（1997）；カスティロ（Castillo）他，Mol. Cell Neurosci. 11：36-46（1998）；ソースドゥ‐カルデナス（Saucedo-Cardenas）他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：4013-4018（1998）を参照。更に、Ｎｕｒｒｌは、ＤＡ細胞特異的遺伝子の発現の維持、正常細胞の遊走、標的領域神経支配、及び細胞生存のために必要とされる。ソースドゥ‐カルデナス（Saucedo-Cardenas）他，前出；ウォリーン（Walleen）他，Exp. Cell. Res. 253：737-746（1999）。ウォリーン（Walleen）他，Mol. Cell Neurosci 18：649-663（2001）を参照。
【０００７】
ホメオドメイン含有転写因子Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ １及び２（“Ｅｎ１”及び”Ｅｎ２”）及びＬｍｘ１ｂ）を含むＤＡ細胞発達には、その他の転写因子が関連している。しかし、Ｎｕｒｒｌと異なり、これらのたん白質は、発達中の胚におけるよりグローバルなパターニング事象に影響を与えるもののようである。ジョイナー（Joyner）他，Science 251：1239-1243（1991）；ワースト（Wurst）他，Development 120：857-887（1994）；シュミット（Smidt）他，Nat. Neurosci. 3：337-341（2000）；サイモン（Simon）他，J. Neurosci. 21：3126-3134（2001）を参照。しかしこれらの因子全てに共通することは、ＤＡ細胞発達に寄与するそれらが調節する遺伝子がいまだに同定されていないことである。
【０００８】
細胞分化と、細胞周期からの離脱とは、特に発達中の胚においては互いに密に調節されるプロセスである。細胞周期の調節にとって必須であるいくつかの調節機序が、細胞分化に影響を与えるものであることが示されている。チェラッパン（Chellappan）他，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 227：57-103（1998）を参照。
【０００９】
細胞周期制御にとって重要な１つの機序は、ＣＤＫ抑制因子、又は、「Ｃｋｉ」によるサイクリン依存性キナーゼ、又は、「ＣＤＫ」の抑制に関連する。たとえば、ヴィダル（Vidal）他，Gene 247：1-15（2000）を参照。ＣｋｉのＣｉｐ／Ｋｉｐファミリは、p２１Ｃｉｐ１，ｐ２７Ｋｉｐ１及びｐ５７Ｋｉｐ２から成る。それらは、イン・ヴィヴォでの細胞周期離脱（cell cycle exit）と種々の組織の分化とに関連する。たとえば、チェラッパン（Chellapan）他，前出、を参照。これらの内、ｐ５７Ｋｉｐ２のみが、他のＣｋｉによって埋め合わせすることができない胚形成中における重要な役割を果たすものであることが示されている。たとえば、ｐ５７Ｋｉｐ２ヌル変異体マウスは、口蓋裂、消化管異常、腎髄質異形成、副腎皮質過形成及び水晶体細胞過剰増殖、を含む重度の欠陥を示す。ヤン（Yan）他，Genes Dev. 11：973-983（1997），ツァン（Zhang）他，Nature 387：151-158（1997）を参照。更に、ｐ５７Ｋｉｐ２は、p２１Ｃｉｐ１と共に、管状筋細胞と肺の細胞との分化にも関連している。ツァン（Zhang）他，Genes Dev. 13：213-224（1994）参照。これに対して、網膜アマクリン介在ニューロンの異常成熟化を例外として、ｐ５７Ｋｉｐ２遺伝子標的化マウスにおいてＣＮＳ−関連不全は報告されていない。ダイアー（Dyer）他，Development 127：3593-3605（2000）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以下の開示は、Ｎｕｒｒｌによって調節される遺伝子の決定を含む、上述した問題のいくつかについて詳述する。本発明の別の態様は、ＤＡ細胞成熟化の機序に関連する因子の決定に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のこれら及びその他の特徴について以下の開示において詳述する。
【００１２】
いかにＮｕｒｒｌが、ＤＡニューロン分化及び成熟化の過程において必須であるｐ５７Ｋｉｐ２の発現にとって、必須であるかを説明するものである。従って、本発明の１つの特徴は、Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体の投与を介して、ＤＡニューロン分化又は成熟化を誘導するための方法に関する。ここで「その誘導体」とは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の７０以上３００以下のアミノ酸が欠失した分子を意味する。より好ましくは、「その誘導体」とは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の８０以上２７５以下のアミノ酸が欠失した分子、そして最も好ましくは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の９０以上２５０以下のアミノ酸が欠失した分子を意味する。前記欠失は、好ましくは、前記Ｎｕｒｒｌ分子のカルボキシ末端で起こる。
【００１３】
本発明の前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同性である。好ましくは、誘導体は、配列識別番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％相同性であり、更に好ましくは少なくとも９０％相同性である。最も好ましくは、誘導体は配列識別番号１に記載アミノ酸配列に対して少なくとも９５％相同性である。ここで「相同性」とは、配列識別番号１とある程度同一であり、その分子の残りの部分は、同類置換可能である、と定義される。「同類置換」とは、配列識別番号１にあるアミノ酸が、この分子の機能、即ち、そのｐ５７Ｋｉｐ２と相関作用する能力、を変化させないアミノ酸によって置換可能である、ということを意味する。そのような置換は当業者に知られている。たとえば、もしも分子の特定のポイントにおいてグリシンが存在しているならば、アラニンによる置換は同類置換と考えられる。というのは、この置換は、機能に影響しないと予測されるからである。これに対して、もしも前記位置がシトシンによって占められている場合は、遊離スルフヒドリル基により、アラニンによる置換は、実際に、機能に影響を与えると予測される。ロイシンのイソロイシンによる置換、又はその逆、等のその他の例も当業者に知られているので、ここでは繰り返さない。
【００１４】
そのような誘導体の具体例として、Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１−３３５のみから成る前記Ｎｕｒｒｌ誘導体等の、前記分子のカルボキシ末端が欠失した切断バリアントがある。前記諸例に記載した方法を使用して、当業者はその他のバリアントを同定し使用することが可能である。前記Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体は、たとえば、ポリペプチド自身として、又は、前述した例に記載したプラスミドによって例示されるように、組換えデリバリシステム、として投与することができる。ニューロンのほかに、幹細胞等の前駆体細胞も処理可能である。
【００１５】
そのような分子を使用することは、ＣＮＳ関連疾患、特に、ドパミン遊離ニューロンに関連するもの、の治療に有用であると考えられる。そのようなニューロンの変性は、パーキンソン病等の状態の特徴であり、これに対して精神分裂は、過剰なドパミン作動性システムによって特徴付けられる。当業者にとってその他の状態も知られており、ここではそれらについての説明は不要である。
【００１６】
後述する実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとが直接的な物理的相関作用を含むプロセスにおいて、ニューロンの成熟化において協同作用することを示している。従って、ｐ５７Ｋｉｐ２はＣＤＫ、そして、細胞タイプ特異的転写因子の両方と相関作用することがわかる。従って、本発明の別の特徴は、それを、Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体等の前記分子のアゴニスト又はアンタゴニストなどの調節物質と接触させることによってｐ５７Ｋｉｐ２を調節する方法である。
【００１７】
尚、ｐ５７Ｋｉｐ２は、ニューロンが細胞周期を逸脱したあと、ニューロンの分化を促進する。このことは前記データに示されている。
【００１８】
後述するデータは、Ｎｕｒｒｌとｐ５７Ｋｉｐ２との間に相反関係が存在することを示している。本質的には、Ｎｕｒｒｌがｐ５７Ｋｉｐ２の発現を活性化し、これに対してｐ５７Ｋｉｐ２は前述したようにＮｕｒｒｌと協同作用する。前記例に詳述されているように、恐らく前記相関作用には少なくとも１つの中間工程が含まれる。又、発達中のＤＡ細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２の発現が、Ｅｎ１，Ｅｎ２，Ｒａｌｄｈ１及びＰｔｘ３等の大半のその他の分析されたマーカが正常に発現される発達段階においてＮｕｒｒｌに依存することも明らかである。
【００１９】
後述するデータは、事実、ｐ５７Ｋｉｐ２がＮｕｒｒｌの転写活性に対して負の影響を与える可能性があることを示唆している。但し、別のプロモータの状況においては、これら二つの分子間の相関作用は正の影響を与える可能性があることも可能である。これにも拘わらず、本発明の更に別の態様は、Ｎｕｒｒｌを抑制するべく、Ｎｕｒｒｌに対して、ｐ５７Ｋｉｐ２又はその一部のいずれかを投与することによる、あるいは反対に、Ｎｕｒｒｌを刺激するべく、ｐ５７Ｋｉｐ２に対する抗体などのｐ５７Ｋｉｐ２アゴニスト、Ｎｕｒｒｌの非機能性誘導体、等を添加することによる、細胞中のＮｕｒｒｌ活性の調節に関する。
【００２０】
ここに記載の発達機序は、他の細胞タイプのものに類似するものと推測される。たとえば、前記「背景技術」の項で説明したように、Ｃｋｉのための要件の一部は、それらのＣＤＫインヒビタとしての機能から独立している。他のシステムからの結果がこれを支持している。たとえば、ｐ５７Ｋｉｐ２は、恐らく転写因子ＭｙｏＤに関連するプロセスにおいて筋肉分化を促進することが知られている。更に、細胞増殖の制御と結びつかない機序を介して正常な肺胞の発達に必要とされるｐ２１Ｃｉｐ２とｐ５７Ｋｉｐ２の重複性の活性化（redundant activates）が存在する。前記分子は、又、増殖網膜前駆体細胞の制御と、アマクリン細胞サブセットの運命決定とにおいて機能することも証明されている。又、ｐ２７Ｘｉｃｌとして知られているｐ２７Ｋｉｐ１のアフリカツメガエル（xenopus）同族体が、ＣＤＫの抑制を必要としない機序を介したミューラーグリア細胞分化に関与していることも観察されている。又、胎盤spongiotrophoblastの適切な発達が、ＣＤＫ活性におけるなんら測定可能な増加無く、ｐ５７Ｋｉｐ２遺伝子標的化マウスにおいて乱されることも観察されている。
【００２１】
全体として、ここに記載したＤＡニューロン発達の特徴付けは、たとえばパーキンソン病などにおける、特に治療用移植用に構成された幹細胞の使用に有用であると見なされる。たとえば、この点に関しては、ここに参考文献として合体させるキム（Kim）他，Nature 418：50-56（2002年7月4日）を参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
好適実施例の詳細説明
例１
ここに参考文献として合体させるチョイ（Choi）他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：8943-8947（1992）は、ＭＮ９Ｄと称されるドパミン合成神経細胞ラインについて記載している。ＭＮ９Ｄ細胞におけるＮｕｒｒｌの過剰発現は、細胞周期停止（arrest）、および、平坦な細胞形態、長神経突起の延伸、及びドパミン合成の増加によって特徴付けられる形状成熟化をもたらす。Ｎｕｒｒｌの発現をテトラクリンの制御下においてこのラインのクローンを発達させた。このラインのクローンを「ＭＮ９Ｄ−ＮｕｒｌＴｅｔ−Ｏｎ」と称する。前記クローンは、ＭＮ９Ｄ細胞を、プラスミドｐＴＲ２−ＮｕｒｒｌとｐＴＫ−Ｈｙｇｒｏとによってコトランスフェクトすることによって発達させた。前記第１のプラスミドは、宿主ベクターｐＴＲＥ２中において、ＮｕｒｒｌをコードするｃＤＮＡを含んでいた。コトランスフェクションは、逆テトラクリン制御トランスアクチベータ（reverse tetracycline controlled transactivator）を発現するＭＮ９Ｄ細胞中で、ここに参考文献として合体させるカストロ（Castro）他，J. Biol. Chem 276：43277-43284（2001）に従って行われた。細胞を、ドキシサイクリン（“ｄｏｘ”）、テトラクリン誘導体、（２μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。
【００２３】
前記ドキシサイクリンでの２４時間の処理中に、前記ＭＮ９Ｄ−ＮｕｒｌＴｅｔ−Ｏｎ細胞は、細胞周期のＧ１期において集積された。
【００２４】
免疫細胞蛍光発光法による測定で、前記ｄｏｘ処理細胞におけるＮｕｒｒｌの核内分布を含めて、４８時間後の前記細胞において成熟形態表現型が明らかであった。簡単に説明すると、前述したウォリーン（Walleen）によって記載されているように、市販のフルオロフォアに共役結合された抗−ＩｇＧと共に、一次抗体として抗−Ｎｕｒｒｌ抗体を使用した。細胞を、ＰＦＡで固定し、断片を、ＰＢＳ／０．５％ ＦＢＳ／０．３％−Ｔｒｉｔｏｎ中でブロックし、その後、一次抗体（４℃で１６時間）と二次抗体（室温で１時間）とによって連続的にインキュベートした。
【００２５】
例２
これらの実験は、前記ＭＮ９Ｄ細胞の分化に影響を与えた遺伝子の検索について記載するものである。
【００２６】
この目的のために、標準方法を使用してｄｏｘ処理ＭＮ９Ｄ−ＮｕｒｌＴｅｔ−Ｏｎ細胞から全ＲＮＡを単離し、再び標準方法を使用してｃＤＮＡに逆転写した。次に、以下のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。
tttaccctcg aagccgaag （配列識別番号２）
tgtatgctaa gcgcagaac （配列識別番号３）
（Ｎｕｒｒｌ用）；
cggtggaact ttgacttcgt （配列識別番号４）
gagtgcaaga cagcgacaag （配列識別番号５）
（ｐ２１Ｃｉｐ１用）;
ccgaggagga agatgtcaaa （配列識別番号６）
aaattccact tgcgctgact （配列識別番号７）
（ｐ２７Ｋｉｐ１用）;および、
gagagaactt gctgggcatc （配列識別番号８）
gctttacacc ttgggaccag （配列識別番号９）
（ｐ５７Ｋｉｐ２用）。
【００２７】
更に、Ｇ３ＰＤＨ用には市販のプライマーを使用した。前記ＲＴ−ＰＣＲは、各反応を９４℃にて３分間、その後、種々の回数のサイクルで、９４℃にて３０秒間、５４℃にて４５秒間、７２℃にて１分間、その後、７２℃で３分間行った。種々のサイクルを使用する理由は、種々のたん白質のｍＲＮＡは、細胞における発現レベルが異なるからである。Ｇ３ＰＤＨは、全部で２８サイクル、Ｎｕｒｒｌとｐ２１Ｃｉｐ１は３０サイクル、そしてｐ２７Kip１とｐ５７Ｋｉｐ２は３３サイクル増幅された。前記ｄｏｘ処理後、０，１及び１２時間後にアッセイを行った。Ｃｉｐ／ｋｉｐメンバをコードするｃＤＮＡが陽性対照であったのに対して、ＧＰ３ＰＤＨアッセイは、これが内部対照として作用するハウスキーピング遺伝子であるがために行われた。
【００２８】
その結果は、ｐ２７Ｋｉｐ１のｍＲＮＡは、いずれの測定時点においても誘導されていなかったが、ｐ２１Ｃｉｐ１は、１時間の処理後にアップレギュレーションされ、ｐ５７Ｋｉｐ２も１２時間の処理後に顕著にアップレギュレーションされたが、最初は堆積した。ｐ５７Ｋｉｐ２とｐ２１Ｃｉｐ１たん白質のレベルの対応する増加も観察された。
【００２９】
別の実験において、前記テトラサイクリン依存転写因子を発現したＭＮ９Ｄラインのサブクローンも、上述した要領でｄｏｘによって処理され、細胞周期停止及びＣｋｉ発現に対する影響が特異的で、Ｎｕｒｒｌ発現に依存するものであるか否かを調べた。これは実際に確認された。
【００３０】
これらの実験は、Ｎｕｒｒｌは実際は、ｐ２１Ｃｉｐ１とｐ５７Ｋｉｐ２との両方を調節するが、その調節の機序は異なるものであるということを示している。後者の比較的遅い誘導は、Ｎｕｒｒｌとの相関作用が直接的なものではなく、更に１つ又はそれ以上の中間工程が関与している、ということを示唆している。
【００３１】
例３
これらの実験は、正常な野生型（Ｓｖ１２６／Ｃ５７Ｂ１６）マウスの胚腹側中脳における分子の発現を測定するために構成された。１３．５日齢のマウス胚から矢状断片を取り出し、標準方法と、前出のウォリーン（Walleen）他に拠るジゴキシゲニン標識リボプローブを使用してｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでアッセイした。ｐ２７Ｋｉｐ１分析は免疫蛍光アッセイによって行われたので、これには１つの例外がある。Ｎｕｒｒｌ、ＴＨ，ｐ１７Ｃｉｐ１，ｐ２７Ｋｉｐ１，ｐ５７Ｋｉｐ２の発現パターンを分析した。
【００３２】
腹側中脳において強いＮｕｒｒｌ発現が見られ、ゼッターストローム（Zetterstroem）他，Mol. Brain. Res. 41：111-120（1996）の結果が確認された。（Ｅ１３．５）の時点で、ｐ２１Ｃｉｐ１は、全ＣＮＳ中においてかなり全般的に分布していたのに対して、ｐ５７Ｋｉｐ２は特徴的な発現パターンを示し、主として脳室をライニングしている脳室有糸分裂活性細胞に局在化していた。それは、又、腹側中脳において、ＴＨによって示されたパターンから視覚的に識別不能なパターンにおいても検出された。それは、Ｎｕｒｒｌ発現ドメインと重複し、それが、分化中のＤＡ細胞に発現されることを示した。これに対して、ｐ２７Ｋｉｐ１発現は、この時点では検出されなかった。Ｅ１３．５腹側中脳からの冠状断片の免疫組織化学的画像診断と、共焦点画像診断との両方によって、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとが、発達中のＤＡ細胞中に共発現されることが確認され、ＤＡ細胞分化の重要な段階、即ち、Ｅ１３からＥ１６．５までの間に、比較的一過性のｐ５７Ｋｉｐ２発現があったことが銘記された。
【００３３】
例４
これらの実験は、Ｎｕｒｒｌが発達中のＤＡニューロンにおいてｐ５７Ｋｉｐ２の発現を調節するか否かを調べるために構成された。上述したようにして、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを、野生型及びＮｕｒｒｌヌル変異マウスに対して行った。前出のゼッターストローム（Zetterstroem）他を参照。Ｅ１３．５で冠状断片を採取した。ｐ５７Ｋｉｐ２ｍＲＮＡレベルは、ＮｕｒｒｌとＴＨとの両方が野生型の胚においては分化ＤＡ細胞中に発現される、前記ヌルマウスの外套帯おいては劇的に減少した。ｐ５７Ｋｉｐ２は、外套帯においては選択的に減少調節されたが、隣接する脳室帯においては正常レベルに留まった。ｐ５７Ｋｉｐ２発現のレベル低下は、細胞不全によるものではなかった。というのは、Ｅｎ１／Ｅｎ２，Ｒａｌｄｈ １及びＰｔｘ３等の他のＤＡマーカは、発達のこの段階において正常発現レベルに留まったからである。
【００３４】
従って、これらの結果は、Ｎｕｒｒｌが、成熟中の分裂終了ＤＡ細胞に於けるｐ５７Ｋｉｐ２発現にとって必須であることを明確にしている。
【００３５】
例５
前出のカストロ（Castro）他は、Ｎｕｒｒｌは長い一般的には二極神経突起によって特徴付けられるＭＮ９Ｄ細胞の形態的分化を誘導することを示した。ここに記載の実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２がＤＡ細胞成熟において機能的に重要であるか否かを調べるために構成された。
【００３６】
これをテストするために、ＭＮ９Ｄ細胞を、強化緑色蛍光たん白質（ＥＧＦＰ）をコードする発現ベクターと、Ｎｕｒｒｌとｐ５７Ｋｉｐ２との一方又は両方と、前述したように、標準方法を使用して、コトランスフェクトした。ＥＧＦＰを発現した細胞の数を、前記コトランスフェクション実験の三日後に数え、それらは、前出のカストロ（Castro）他に従って、分化したものと見なした。
【００３７】
その結果は、ｐ５７Ｋｉｐ２の過剰発現は細胞分化を促進するのに不十分であるが、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの発現は、細胞分化の劇的な賦活をもたらすものであることを示した。
【００３８】
例６
これらの実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの間になんらかの直接的な相関作用が存在するか否かを判断するために構成された。これをテストするために、ヒト胚腎臓２９３細胞を使用した。これらを、ｐＣＭＸ−Ｆｌａｇ−Ｎｕｒｒｌを使用した“Ｆｌａｇ”免疫タグされたＮｕｒｒｌ、又は、レイノー（Reynaud）他，Mol. Cell Biol 19：7621-7629（1999）に記載されているように、ｐＣＭＶ−ＨＡ−ｐ５７Ｋｉｐ２を使用したＨＡ−免疫タグされたｐ５７Ｋｉｐ２のいずれか、又はこれらの両方でトランスフェクトした。トランスフェクションプロトコルは、前出のカストロ（Castro）他に従った。対照として、空ベクターを使用した。
【００３９】
前記細胞のトランスフェクションと培養後、ディグマン（Digman）他，Nucleic Acids Res 11：1475-1489（1983）に従って、核内たん白質抽出物を得て、次に、これらを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解した。核細胞抽出物を、抗−Ｎｕｒｒｌ又は抗−ｐ５７Ｋｉｐ２抗体のいずれかを使用して免疫沈降させた。次に、これらを、ジョゼフ（Joseph），Oncogene 20：2877-2888（2001）に従って、市販の抗−ＦＬＡＧ及びＨＡ−抗体で免疫ブロットした。その結果は、これらのたん白質が物理的に相関作用することを示した。
【００４０】
これらの実験に対する追跡実験で、前出のカストロ（Castro）他に従って、
agcttgagtt ttaaaaggtc atgctcaatt t
（配列識別番号１０）と、その３２P標識相補体ＮＢＲＥ（特異的Ｎｕｒｒｌ ＤＮＡ結合部位）プローブとを使用して、ゲルシフト実験を行った。これは、定義されたＮｕｒｒｌ結合部位である。前記配列“aaaggtca”は、特に重要であった。バンドをオートラジオグラフィーによって可視化した。Ｎｕｒｒｌにおけるシフトと、ＮＢＲＥに結合したＮｕｒｒｌ／ｐ５７Ｋｉｐ２複合物におけるスーパーシフトが見られた。更に別の実験において、前記抽出物と、ＨＡ特異的抗体との組み合わせは、ＮＢＲＥプローブに結合したＮｕｒｒｌに対するｐ５７Ｋｉｐ２の結合を消滅させた。
【００４１】
ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの間に直接的な相関作用があるか否かを調べる別の実験において、１５日齢のラット胚の腹側中脳からの細胞を使用した。上述した手順に従って、全細胞抽出物を調製した。次に、これらを、抗−Ｎｕｒｒｌ又は抗−ＩｇＧ（対照）抗体を使用して免疫沈降させた。その結果得られた免疫複合体を、上述したプロトコルに従って、抗−ｐ５７Ｋｉｐ２抗体を使用して免疫ブロットした。前述したように、ｐ５７Ｋｉｐ２をコードする発現ベクターによってトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞からの核細胞抽出物を、対照として使用した。これらの結果も、前記たん白質間の物理的相関作用を示した。
【００４２】
これらの実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２がＮｕｒｒｌ転写活性を調節可能であるということを示唆した。このことについて以下の例で説明する。
【００４３】
例７
ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの間の相関作用を確認するために、哺乳類細胞ツーハイブリッドアッセイを行った。前述のカストロ（Castro）他に記載の方法を使用して、発現ベクターＶＰ１６-ｐ５７Ｋｉｐ２とＧａｌ４ＤＢＤ−Ｎｕｒｒｌ（１−２６２）のいずれか一方又は両方、および、H.simplexチミジンキナーゼ遺伝子最小プロモーター（パールマン（Perlmann）他，Genes Dev 9, 769-82 （1995）を参照）の上流側でクローニングされた４ ＵＡＳ Ｇａｌ４結合部位によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子で、ＨＥＫ−２９３細胞をコトランスフェクトした。ＶＰ１６−ｐ５７Ｋｉｐ２は、ｐＣＭＸ−ＶＰ１６からの、単純ヘルペスウイルスからのＶＰ１６転写トランス活性化ドメインをコードし、そのあと、全長、インフレームの、マウスｐ５７Ｋｉｐ２のｃＤＮＡ配列が続く。Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｎｕｒｒｌ （１−２６２）は、ｐＣＭＸ−Ｇａｌ４ベクターの酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン（残基１−１４７）とインフレームの、Ｎｕｒｒｌの最初の２６２のアミノ酸残基をコードする。Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｎｕｒｒｌプラスミドが使用された理由は、それが前記レポーター遺伝子をＮｕｒｒｌアミノ末端ドメイン内のトランス活性化ドメインの存在によって活性化するからである。更に、ＶＰ１６のみをコードするプラスミドと、Ｇａｌ４ＤＢＤのみをコードするプラスミドとが使用された。
【００４４】
次に、細胞を収集し、前出のパールマン（Perlmann）他に従って分析した。β−ガラクトシダーゼ活性への正規化後、相対的光ユニット（ＲＬＵ）を算出した。その結果は、予想通り、Ｇａｌ４ＤＢＤ−Ｎｕｒｒｌ （１−２６２）はレポーター遺伝子を活性化することを示した。レポーター遺伝子の活性化は、ＶＰ１６−ｐ５７Ｋｉｐ２でのコトランスフェクションによって強力に増強された。これらの結果も、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの間に物理的相関作用が起こることを示した。
【００４５】
例８
この次の実験は、ｐ２１Ｃｉｐ１又はｐ２７Ｋｉｐ１のいずれかがＮｕｒｒｌと相関作用するか否かを調べるように構成された。ＨＥＫ−２９３細胞を、ＨＡ−ｐ２１Ｃｉｐ１又はＨＡ−ｐ２７Ｋｉｐ１をコードする発現ベクターでトランスフェクトさせた。対照として空の発現ベクターを使用した。トランスフェクションは、前述した標準プロトコルに従って行われた。トランスフェクション処理が成功するように、細胞のトランスフェクションと培養後、核細胞抽出物を、前出のディグナム（Dignam）他に従って得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解した。次に、それらを、前出のジョゼフ（Joseph）他に従って、市販の抗−p２１及び抗−ｐ２７抗体によって免疫ブロットした。
【００４６】
次に、ＨＥＫ−２９３細胞を、ＨＡ−ｐ２１Ｃｉｐ１又はＨＡ−ｐ２７Ｋｉｐ１のいずれかをコードする発現ベクターと前記空のベクター（対照）、或いは、Ｆｌａｇ−Ｎｕｒｒｌをコードする発現ベクターｐＣＭＸ−Ｆｌａｇ−Ｎｕｒｒｌ、即ち、ＮｕｒｒｌのＦＬＡＧ標識化したもの、のいずれかでコトランスフェクトさせた。核細胞抽出物を得て、抗−Ｎｕｒｒｌ抗体を使用して免疫沈降させた。免疫複合体を、抗−ｐ２１Ｃｉｐ１又は抗−ｐ２７Ｋｉｐ１を使用して免疫ブロットした。すべてのプロトコルは前述したものに従った。その結果は、前記免疫ブロットが抗−ｐ２１Ｃｉｐ１又は抗−ｐ２７Ｋｉｐ１抗体によってプローブされた時になんらシグナルが発生しないことから、p２１Ｃｉｐ１とｐ２７Ｋｉｐ１のいずれもＮｕｒｒｌと相関作用しないこと、を示した。
【００４７】
例９
これらの実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２がＮｕｒｒｌの転写活性に対していかなるタイプの影響を与えるかを調べるように構成された。
【００４８】
ＭＮ９Ｄ細胞を、先ず、前出のパールマン（Perlmann）他に記載されているように“ＮＢＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃ”と称されるＮＢＲＥの三つのコピーを含むルシフェラーゼレポータープラスミドと、Ｎｕｒｒｌを発現するベクター、又は、ｐ５７Ｋｉｐ２を発現するベクターのいずれか、でトランスフェクトした。トランスフェクションと培養の２４時間後に細胞を収集し、細胞抽出物を採取し、次に、これらのルシフェラーゼ活性と、対照として、β-ガラクトシダーゼ活性、とをアッセイした。
【００４９】
その結果は、ｐ５７Ｋｉｐ２が、投与量依存的に、レポーター遺伝子活性に対して負の影響を与えることを示した。対照実験において、ｐ５７Ｋｉｐ２は、レチノール酸レポーター依存レポーター遺伝子を抑制しなかった。
【００５０】
これらの結果から、Ｎｕｒｒｌとｐ５７Ｋｉｐ２は、これら二つのたん白質間の直接的相関作用に依存する可能性のある機序を介して、ＭＮ９Ｄ細胞の成熟化を誘導において協同作用するものであるという結論が導かれる。
【００５１】
例１０
この例は、前述したたん白質−たん白質相関作用の構造的特長を明らかにするように構成された実験を記載するものである。
【００５２】
ベクターｐＣＭＸ−Ｎｕｒｒｌ１−３５５，ｐＣＭＸ−Ｎｕｒｒｌ９４−５９８及びｐＣＭＸ−Ｎｕｒｒｌ１１８３−５９８を使用して、Ｎｕｒｒｌの三つの切断端誘導体が作成された。第１のものは、カルボキシ末端ＬＢＤ／ＡＦ２ドメインを欠失したもので、残りの二つは、それぞれ、ＡＦ１トランス活性化ドメインの最初のアミノ末端９３及び１８２アミノ酸残基を欠失したものである。これらのベクターと、更に、ＮｕｒｒｌとＨＡ−ｐ５７Ｋｉｐ２とをコードするベクターとを、前述した要領で、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションするのに使用した。全ての細胞は、ＨＡ−ｐ５７Ｋｉｐ２ベクターと、前記Ｎｕｒｒコンストラクトの１つ又は対照ベクターとによってコトランスフェクションされた。
【００５３】
培養後、共免疫沈降アッセイを行い、これにより、Ｎｕｒｒｌに対する抗体（前出のウォリーン（Walleen）他を参照）と、ＨＡに対する抗体と、プロテインセファロース−プレ清澄化核抽出物をインキュベートした。抽出物は、核抽出物緩衝液中で一晩４℃で抗体とインキュベートされた。プロテインＡ又はプロテインＧセファロースに結合した免疫複合体を、遠心分離によって収集し、ＲＩＰＡ緩衝液中で三回洗浄した。
【００５４】
その結果は、カルボキシ末端ＬＢＤ／ＡＦ２ドメインの欠失はｐ５７Ｋｉｐ２との相関作用に影響しなかったのに対して、前記アミノ末端ドメインの短い欠失と長い欠失との両方は、相関作用を完全に消滅させたことを示した。
【００５５】
追跡実験において、ＭＮ９Ｄ細胞を、前述したＥＧＦＰベクターと、前述した４つのＮｕｒｒｌベクターの１つのみ、又は、ｐ５７Ｋｉｐ２発現ベクターと共にコトランスフェクションし、細胞の成熟におけるＮｕｒｒｌと前記三つのＮｕｒｒｌ切断誘導体の影響を調べた。分化を、前述したように三日後にアッセイした。
【００５６】
前記Ｎｕｒｒｌ９４−５９８とＮｕｒｒｌ１８３−５９８誘導体は、成熟化の誘導においてｐ５７Ｋｉｐ２と協同作用しなかったが、前記カルボキシ末端の欠失は、協同性と成熟化に対してなんら影響を与えなかった。Ｎｕｒｒｌに加えて、前記三つの誘導体は、単体で発現された時には、ＭＮ９Ｄ細胞成熟化を誘導したが、但しそのレベルは低かった。従って、最高レベルの分化には、ｐ５７Ｋｉｐ２とｐ５７Ｋｉｐ２と相互作用可能なＮｕｒｒｌ誘導体との両方の発現が必要であった。
【００５７】
又、Ｎｕｒｒｌ１８３−５９８のみならず野生型Ｎｕｒｒｌもｐ５７Ｋｉｐ２の発現を誘導することも観察された。これは、この誘導体が細胞成熟において、ｐ５７Ｋｉｐ２と機能的に協同作用することが出来ないことが、他の必須のＮｕｒｒｌ機能の不活性化によるものではないということを示している。
【００５８】
例１１
ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとの共発現によって誘導される成熟化に対する観察された影響に鑑みて、ｐ５７Ｋｉｐ２によって細胞成熟に対してどのような寄与が提供されるのかを調べるための実験を行った。
【００５９】
これをテストするために、ＭＮ９Ｄ細胞を、前述したように、EGFP及びＮｕｒｒｌの発現ベクター単体、又は、アンチセンスコンストラクトｐＣＭＸ−ａｓｐ５７Ｋｉｐ２と共に、コトランスフェクションさせた。このアンチセンスコンストラクトは、ｐＥＸ１０Ｘ−ｐ５７Ｋｉｐ２からのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、そのＥｃｏＲＩ部位として、アンチセンス配向で発現ベクターｐＣＭＸに挿入することによって得られた。前述したように、成熟化を判断するためのものと同じシステムを使用した。“ａｓｐ５７”ＲＮＡ、即ち、前記アンチセンスコンストラクト、は、Ｎｕｒｒｌによって誘導される細胞成熟化を消滅させた。それは、又、内因性ｐ５７Ｋｉｐ２のたん白質発現と、更に、コトランスフェクションされた発現ベクターから発現されたｐ５７Ｋｉｐ２のたん白質発現を抑制した。
【００６０】
更に別の実験において、２４時間後にトランスフェクション細胞を収集し、ここに参考文献として合体させるジョゼフ（Joseph）他，Oncogene 21：65-77（2002）に記載されているようにＦＡＣＳによって分析した。細胞をＥＧＦＰ発現によって選別し、細胞周期の異なる時期におけるそれらの分布を、ＤＮＡの定量化によって決定した。ａｓｐ５７発現は、恐らくは、前述したｐ２１Ｃｉｐ１のＮｕｒｒｌ誘導発現により、Ｎｕｒｒｌによって誘導される細胞周期停止を乱さなかった。従って、これらのデータは、これらの細胞において、成熟化と細胞周期停止が互いに独立的に制御されることを示している。この観察の派生的内容について以下の例で詳述する。
【００６１】
例１２
この実験は、細胞成熟化のための具体的な要件を更に調べるために行われた。ワタナベ（Watanabe）他，Proc Natl AcadSci USA 95, 1392-7（1998）に記載されているようにｐ５７Ｋｉｐ２の変異誘導体（ｐ５７ＣＫｍｕｔ）を使用した。なぜなら、ｐ５７ＣＫｍｕｔは、ＣＤＫ活性を抑制するために使用することができないからである。ＭＮ９Ｄ細胞を、ＥＧＦＰとＮｕｒｒｌ又はＮｕｒｒｌ１−３５５のいずれかをコードする発現ベクター、のみ、又は、ｐ５７Ｋｉｐ２又はｐ５７ＣＫｍｕｔの発現ベクター、とトランスフェクションした。トランスフェクションは、前述した方法によって行われた。ｐ５７ＣＫｍｕｔの発現は、細胞周期停止を誘導することは出来ないが、ｐ５７ＣＫｍｕｔはＭＮ９Ｄ細胞の成熟化においてＮｕｒｒｌと協同作用する能力は保持していた。これらのデータは、ｐ５７Ｋｉｐ２は、ＣＤＫ活性を抑制するその能力とは独立的な機序によってＤＡ細胞成熟化を促進する、ということを示している。それは、更に、ｐ５７Ｋｉｐ２が、Ｎｕｒｒｌとの直接的相関作用に関連する機序を介して、ＭＮ９Ｄ細胞成熟化において協同作用するとの見解を支持している。
【００６２】
例１３
前述の実験において得られた結果は、ｐ５７Ｋｉｐ２がＤＡ細胞発達に関与しているかもしれないことを示唆した。これを調べるために、ｐ５７Ｋｉｐ２ヌルマウスを使用した（前出のヤン（Yan）他を参照）。具体的には、上述したように、１３．５日と１８．５日齢のマウスの胚から冠状断片を採取し、それらを、同様に前述したように分析した。
【００６３】
Ｅ１３．５において、中脳ＤＡ細胞は、ＤＡニューロンマーカ遺伝子、細胞増殖及びアポトーシスとに基づき、前記ヌルマウス胚において正常に見えた。
【００６４】
しかしながら、Ｅ１８．５において、ｐ５７Ｋｉｐ２の不在は腹側中脳におけるＴＨ免疫応答性において劇的な低下をもたらした。ＴＨ発現は、青斑核と嗅球とを含む、カテコールアミン作動性ニューロンが位置する、脳の他の領域においては影響されなかった。従って、前記表現型は、中脳ＤＡニューロンに対して選択的である。
【００６５】
Ｎｕｒｒｌのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを行い、Ｎｕｒｒｌ発現が、前記ヌルマウスＥ１８．５胚の腹側中脳においては減少するが、他の領域においては正常であることが確認された。
【００６６】
更に、ＴＨとＮｕｒｒｌの発現は、腹側中脳の側方領域において特に弱く、このことは、ＴＨ及びＮｕｒｒｌ発現細胞が変異脳の内側部位に留まることを示唆している。
【００６７】
これらのデータは、後期懐胎期間中にｐ５７Ｋｉｐ２発現の開始が起こるということの裏付けを提供するものである。
【００６８】
例１４
前の実験は、ＭＮ９Ｄ細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２の重要性を示した。イン・ヴィヴォでのＤＡ細胞分化の重要な段階におけるこのたん白質の発現によって、ｐ５７Ｋｉｐ２がＤＡ細胞発達において役割を果たすものであるか否かを調べる追加実験が示唆された。より具体的には、この実験は、ＣＳＭ１４．１細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２発現を調べるために行われた。
【００６９】
ＣＳＭ１４．１は、ラットの胚腹側中脳から確立され、温度感応性ラージＴ−抗原によって不死化された細胞である（デュランド（Durand）他， Neurosci. Abstr.（1990）を参照）。これらの細胞が使用された理由は、それらは、未熟神経前駆体細胞に類似し、低濃度の血清中で３９℃にて成長させ、成熟ＤＡ細胞表現型に分化するように誘導可能であるからである。
【００７０】
ＣＳＭ１４．１細胞を、５％ＣＯ２中で、１０％ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリンと１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンとを添加したＤＭＥ−Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ中で３５℃（許容温度）で維持した。細胞分化を誘導するために、ＦＢＳを１％に減らし、温度を３９℃（非許容温度）に上げた、前出デュランド（Durand）他，Anat. 20: 61-69（2002）。これら両方のケースにおいて、細胞は４日間培養された。
【００７１】
標準方法により細胞から全細胞抽出物を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。次に、これらを市販の抗−Ｎｕｒｒｌ又は抗−ｐ５７抗体又は、一般ニューロンマーカＮｅｕＮで免疫ブロットした。均一なローディングを確保するためにフィルターをポンソー（Ponceau）染色した。その結果は、Ｎｕｒｒｌ，ｐ５７Ｋｉｐ２及びＮｅｕＮは、細胞が分化するとき誘導されることを示した。
【００７２】
別の実験において、細胞のサンプルを、前述した発現ベクターｐＣＭＸ−ａｓｐ５７Ｋｉｐ２でトランスフェクションし、３３℃（１０％ＦＢＳ）又は３９℃（１％ＦＢＳ）のいずれかで４日間培養した。対照として、空発現ベクターを使用した。ここでも、細胞は４日間培養された。ｐＣＭＸ−ａｓｐ５７Ｋｉｐ２でのトランスフェクションによって、低レベルのＮｅｕＮによって示されているように、成熟表現型の獲得が抑制された。このことは、ｐＣＭＸ−ａｓｐ５７Ｋｉｐ２が細胞分化において重要であることを示している。
【００７３】
例１５
これらの実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２ヌルマウス（Ｅ１８．５マウス）の腹側中脳における細胞死の発生を分析するために構成された。
【００７４】
ここに参考文献として合体させるジョゼフ（Joseph）他，Oncogene 21：65-77（2002）に従って、予めＴＨ免疫検出の処理をされた細胞に対してin situ核内ＤＮＡフラグメンテーションアッセイを行った。陽性の細胞を、二の異なる個体によって個々に計数した。
【００７５】
野生型との比較において、ヌルマウスにおいて全ドパミン作動性領域におけるアポトーシス細胞の増加が観察された。実際、この増加は２倍以上であった。この増加は、前記中脳ドパミン作動性領域に特異的であり、その他の部位では観察されず、これによって、中脳ＤＡ細胞の正常な発達においてｐ５７Ｋｉｐ２が厳格に要求されるという結論が導かれた。
【００７６】
以上の開示は、いかにＮｕｒｒｌが、ＤＡニューロン分化及び成熟化の過程において必須であるｐ５７Ｋｉｐ２の発現にとって必須であるかを説明するものである。従って、本発明の１つの特徴は、Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体の投与を介して、ＤＡニューロン分化又は成熟化を誘導するための方法に関する。ここで「その誘導体」とは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の７０以上３００以下のアミノ酸が欠失した分子を意味する。より好ましくは、「その誘導体」とは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の８０以上２７５以下のアミノ酸が欠失した分子、そして最も好ましくは、配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の９０以上２５０以下のアミノ酸が欠失した分子を意味する。前記欠失は、好ましくは、前記Ｎｕｒｒｌ分子のカルボキシ末端で起こる。
【００７７】
本発明の前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同性である。好ましくは、誘導体は、配列識別番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％相同性であり、更に好ましくは少なくとも９０％相同性である。最も好ましくは、誘導体は配列識別番号１に記載アミノ酸配列に対して少なくとも９５％相同性である。ここで「相同性」とは、配列識別番号１とある程度同一であり、その分子の残りの部分は、同類置換可能である、と定義される。「同類置換」とは、配列識別番号１にあるアミノ酸が、この分子の機能、即ち、そのｐ５７Ｋｉｐ２と相関作用する能力、を変化させないアミノ酸によって置換可能である、ということを意味する。そのような置換は当業者に知られている。たとえば、もしも分子の特定のポイントにおいてグリシンが存在しているならば、アラニンによる置換は同類置換と考えられる。というのは、この置換は、機能に影響しないと予測されるからである。これに対して、もしも前記位置がシトシンによって占められている場合は、遊離スルフヒドリル基により、アラニンによる置換は、実際に、機能に影響を与えると予測される。ロイシンのイソロイシンによる置換、又はその逆、等のその他の例も当業者に知られているので、ここでは繰り返さない。
【００７８】
そのような誘導体の具体例として、前述したように、Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１−３３５のみから成る前記Ｎｕｒｒｌ誘導体等の、前記分子のカルボキシ末端が欠失した切断バリアントがある。前記諸例に記載した方法を使用して、当業者はその他のバリアントを同定し使用することが可能である。前記Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体は、たとえば、ポリペプチド自身として、又は、前述した例に記載したプラスミドによって例示されるように、組換えデリバリシステム、として投与することができる。ニューロンのほかに、幹細胞等の前駆体細胞も処理可能である。
【００７９】
そのような分子を使用することは、ＣＮＳ関連疾患、特に、ドパミン遊離ニューロンに関連するもの、の治療に有用であると考えられる。そのようなニューロンの変性は、パーキンソン病等の状態の特徴であり、これに対して精神分裂は、過剰なドパミン作動性システムによって特徴付けられる。当業者にとってその他の状態も知られており、ここではそれらについての説明は不要である。
【００８０】
上述した実験は、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌとが直接的な物理的相関作用を含むプロセスにおいて、ニューロンの成熟化において協同作用することを示している。従って、ｐ５７Ｋｉｐ２はＣＤＫ、そして、細胞タイプ特異的転写因子の両方と相関作用することがわかる。従って、本発明の別の特徴は、それを、Ｎｕｒｒｌ又はその誘導体等の前記分子のアゴニスト又はアンタゴニストなどの調節物質と接触させることによってｐ５７Ｋｉｐ２を調節する方法である。
【００８１】
尚、ｐ５７Ｋｉｐ２は、ニューロンが細胞周期を逸脱したあと、ニューロンの分化を促進する。このことは前記データに示されている。
【００８２】
前記データは、Ｎｕｒｒｌとｐ５７Ｋｉｐ２との間に相反関係が存在することを示している。本質的には、Ｎｕｒｒｌがｐ５７Ｋｉｐ２の発現を活性化し、これに対してｐ５７Ｋｉｐ２は前述したようにＮｕｒｒｌと協同作用する。前記例に詳述されているように、恐らく前記相関作用には少なくとも１つの中間工程が含まれる。又、発達中のＤＡ細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２の発現が、Ｅｎ１，Ｅｎ２，Ｒａｌｄｈ１及びＰｔｘ３等の大半のその他の分析されたマーカが正常に発現される発達段階においてＮｕｒｒｌに依存することも明らかである。
【００８３】
前述したデータは、事実、ｐ５７Ｋｉｐ２がＮｕｒｒｌの転写活性に対して負の影響を与える可能性があることを示唆している。但し、別のプロモータの状況においては、これら二つの分子間の相関作用は正の影響を与える可能性があることも可能である。これにも拘わらず、本発明の更に別の態様は、Ｎｕｒｒｌを抑制するべく、Ｎｕｒｒｌに対して、ｐ５７Ｋｉｐ２又はその一部のいずれかを投与することによる、あるいは反対に、Ｎｕｒｒｌを刺激するべく、ｐ５７Ｋｉｐ２に対する抗体などのｐ５７Ｋｉｐ２アゴニスト、Ｎｕｒｒｌの非機能性誘導体、等を添加することによる、細胞中のＮｕｒｒｌ活性の調節に関する。
【００８４】
ここに記載の発達機序は、他の細胞タイプのものに類似するものと推測される。たとえば、前記「背景技術」の項で説明したように、Ｃｋｉのための要件の一部は、それらのＣＤＫインヒビタとしての機能から独立している。他のシステムからの結果がこれを支持している。たとえば、ｐ５７Ｋｉｐ２は、恐らく転写因子ＭｙｏＤに関連するプロセスにおいて筋肉分化を促進することが知られている。更に、細胞増殖の制御と結びつかない機序を介して正常な肺胞の発達に必要とされるｐ２１Ｃｉｐ２とｐ５７Ｋｉｐ２の重複性の活性化（redundant activates）が存在する。前記分子は、又、増殖網膜前駆体細胞の制御と、アマクリン細胞サブセットの運命決定とにおいて機能することも証明されている。又、ｐ２７Ｘｉｃｌとして知られているｐ２７Ｋｉｐ１のアフリカツメガエル（xenopus）同族体が、ＣＤＫの抑制を必要としない機序を介したミューラーグリア細胞分化に関与していることも観察されている。又、胎盤spongiotrophoblastの適切な発達が、ＣＤＫ活性におけるなんら測定可能な増加無く、ｐ５７Ｋｉｐ２遺伝子標的化マウスにおいて乱されることも観察されている。
【００８５】
全体として、ここに記載したＤＡニューロン発達の特徴付けは、たとえばパーキンソン病などにおける、特に治療用移植用に構成された幹細胞の使用に有用であると見なされる。たとえば、この点に関しては、ここに参考文献として合体させるキム（Kim）他，Nature 418：50-56（2002年7月4日）を参照。
【００８６】
本発明のその他の特徴は、当業者にとって明らかであり、ここに繰り返す必要はない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の７０以上３００以下のアミノ酸が欠失した単離Ｎｕｒｒｌ誘導体であって、前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同である、単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項２】
配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の８０以上２７５以下のアミノ酸が欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項３】
配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の９０以上２５０以下のアミノ酸が欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項４】
前記アミノ酸を配列識別番号１のC末端において欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項５】
前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％相同である、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項６】
前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同である、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項７】
前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％相同である、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項８】
Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１-１８２が欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項９】
Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１-３５５から成る、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項１０】
Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１-９３が欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項１１】
請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体をコードする単離核酸分子。
【請求項１２】
プロモータに作動リンクされている、請求項１の単離核酸分子を備える発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１の単離核酸分子でトランスフォーム又はトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項１４】
請求項１２の発現ベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項１５】
ドパミン産生ニューロン又は幹細胞を、前記ニューロン又は幹細胞の分化又は成熟化を刺激するのに十分な、Ｎｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体と接触させる工程を含む、ドパミン産生ニューロンの分化又は成熟化を誘導する方法。
【請求項１６】
前記Ｎｕｒｒｌ誘導体は、Ｎｕｒｒｌのカルボキシ末端の一部を欠失している、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記Ｎｕｒｒｌ誘導体はＮｕｒｒｌのアミノ酸１-３５５から成る、請求項１６の方法。
【請求項１８】
更に、前記ドパミン産生ニューロン又は幹細胞を、該ニューロン又は幹細胞の分化又は成熟化を刺激するのに十分な、ｐ５７Ｋｉｐ２と接触させる工程を有する、請求項１５の方法。
【請求項１９】
パーキンソン病の患者に於ける分化と成熟化を誘導する、請求項１５の方法。
【請求項２０】
前記細胞を調節物質と接触させる工程を有する、ｐ５７Ｋｉｐ２を発現する細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２の発現を調節する方法。
【請求項２１】
前記調節物質は、Ｎｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記Ｎｕｒｒｌ誘導体は、Ｎｕｒｒｌのカルボキシ末端の一部を欠失している、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記Ｎｕｒｒｌ誘導体は、Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１−３５５から成る、請求項２１の方法。
【請求項２４】
Ｎｕｒｒｌをｐ５７Ｋｉｐ２又はその一部と接触させる工程を有する、細胞におけるＮｕｒｒｌ活性を抑制する方法。
【請求項２５】
Ｎｕｒｒｌをｐ５７Ｋｉｐ２アンタゴニストと接触させる工程を有する、細胞におけるＮｕｒｒｌ活性を刺激する方法。
【請求項２６】
前記アンタゴニストは、ｐ５７Ｋｉｐ２に対する抗体である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記アンタゴニストは、Ｎｕｒｒｌの非機能性誘導体である、請求項２５の方法。
【請求項２８】
ニューロン細胞の発達を、それを必要とする対象体において、誘導する方法であって、幹細胞のサンプルを、対象体のニューロン細胞発達が望まれる部位に導入する工程を有し、その後、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体を、前記幹細胞の成熟化を加速するのに十分な量、投与する、ニューロン細胞の発達を誘導する方法。
【請求項２９】
ニューロン細胞の発達を、それを必要とする対象体において、誘導する方法であって、幹細胞のサンプルを、対象体のニューロン細胞発達が望まれる部位に導入する工程を有し、前記サンプルは、導入に先立って、前記幹細胞の成熟化を加速するのに十分な量のｐ５７Ｋｉｐ２と、Ｎｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体とによって処理されている、ニューロン細胞の発達を誘導する方法。
【請求項３０】
幹細胞を、該幹細胞のドパミン産生細胞への分化を刺激するのに十分な量の、ｐ５７Ｋｉｐ２と、Ｎｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体とに接触させる工程を有する、ドパミン産生細胞を生成する方法。
【請求項１】
配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の７０以上３００以下のアミノ酸が欠失した単離Ｎｕｒｒｌ誘導体であって、前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同である、単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項２】
配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の８０以上２７５以下のアミノ酸が欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項３】
配列識別番号１に記載のＮｕｒｒｌのアミノ酸配列の９０以上２５０以下のアミノ酸が欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項４】
前記アミノ酸を配列識別番号１のC末端において欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項５】
前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％相同である、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項６】
前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同である、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項７】
前記誘導体は、配列識別番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％相同である、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項８】
Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１-１８２が欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項９】
Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１-３５５から成る、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項１０】
Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１-９３が欠失している、請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体。
【請求項１１】
請求項１の単離Ｎｕｒｒｌ誘導体をコードする単離核酸分子。
【請求項１２】
プロモータに作動リンクされている、請求項１の単離核酸分子を備える発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１の単離核酸分子でトランスフォーム又はトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項１４】
請求項１２の発現ベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項１５】
ドパミン産生ニューロン又は幹細胞を、前記ニューロン又は幹細胞の分化又は成熟化を刺激するのに十分な、Ｎｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体と接触させる工程を含む、ドパミン産生ニューロンの分化又は成熟化を誘導する方法。
【請求項１６】
前記Ｎｕｒｒｌ誘導体は、Ｎｕｒｒｌのカルボキシ末端の一部を欠失している、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記Ｎｕｒｒｌ誘導体はＮｕｒｒｌのアミノ酸１-３５５から成る、請求項１６の方法。
【請求項１８】
更に、前記ドパミン産生ニューロン又は幹細胞を、該ニューロン又は幹細胞の分化又は成熟化を刺激するのに十分な、ｐ５７Ｋｉｐ２と接触させる工程を有する、請求項１５の方法。
【請求項１９】
パーキンソン病の患者に於ける分化と成熟化を誘導する、請求項１５の方法。
【請求項２０】
前記細胞を調節物質と接触させる工程を有する、ｐ５７Ｋｉｐ２を発現する細胞におけるｐ５７Ｋｉｐ２の発現を調節する方法。
【請求項２１】
前記調節物質は、Ｎｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記Ｎｕｒｒｌ誘導体は、Ｎｕｒｒｌのカルボキシ末端の一部を欠失している、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記Ｎｕｒｒｌ誘導体は、Ｎｕｒｒｌのアミノ酸１−３５５から成る、請求項２１の方法。
【請求項２４】
Ｎｕｒｒｌをｐ５７Ｋｉｐ２又はその一部と接触させる工程を有する、細胞におけるＮｕｒｒｌ活性を抑制する方法。
【請求項２５】
Ｎｕｒｒｌをｐ５７Ｋｉｐ２アンタゴニストと接触させる工程を有する、細胞におけるＮｕｒｒｌ活性を刺激する方法。
【請求項２６】
前記アンタゴニストは、ｐ５７Ｋｉｐ２に対する抗体である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記アンタゴニストは、Ｎｕｒｒｌの非機能性誘導体である、請求項２５の方法。
【請求項２８】
ニューロン細胞の発達を、それを必要とする対象体において、誘導する方法であって、幹細胞のサンプルを、対象体のニューロン細胞発達が望まれる部位に導入する工程を有し、その後、ｐ５７Ｋｉｐ２とＮｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体を、前記幹細胞の成熟化を加速するのに十分な量、投与する、ニューロン細胞の発達を誘導する方法。
【請求項２９】
ニューロン細胞の発達を、それを必要とする対象体において、誘導する方法であって、幹細胞のサンプルを、対象体のニューロン細胞発達が望まれる部位に導入する工程を有し、前記サンプルは、導入に先立って、前記幹細胞の成熟化を加速するのに十分な量のｐ５７Ｋｉｐ２と、Ｎｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体とによって処理されている、ニューロン細胞の発達を誘導する方法。
【請求項３０】
幹細胞を、該幹細胞のドパミン産生細胞への分化を刺激するのに十分な量の、ｐ５７Ｋｉｐ２と、Ｎｕｒｒｌ又は請求項１のＮｕｒｒｌ誘導体とに接触させる工程を有する、ドパミン産生細胞を生成する方法。
【公表番号】特表２００６−５１１２０５（Ｐ２００６−５１１２０５Ａ）
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３１２１９（Ｐ２００４−５３１２１９）
【出願日】平成１５年８月２６日（２００３．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６６８７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１８６４３
【国際公開日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（５０００２５５７０）ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月２６日（２００３．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６６８７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１８６４３
【国際公開日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（５０００２５５７０）ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ (16)
【Ｆターム（参考）】
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