ナトリウムチャネル阻害ペプチドを用いた鎮痛剤
【課題】本発明の目的は、ナトリウムチャネル阻害ペプチドを用いた鎮痛剤を提供することである。
【解決手段】本発明は、配列番号１〜３に示される、キタウロコアリ由来のナトリウムチャネル阻害活性を有するSKTXペプチド又はその類似ペプチドもしくはその誘導体を有効成分とする鎮痛剤を提供するものである。
【解決手段】本発明は、配列番号１〜３に示される、キタウロコアリ由来のナトリウムチャネル阻害活性を有するSKTXペプチド又はその類似ペプチドもしくはその誘導体を有効成分とする鎮痛剤を提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナトリウムチャネル阻害活性を有するSKTXペプチドの鎮痛剤としての用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来からナトリウムチャネル阻害物質として知られているフグ毒テトロドトキシン(TTX)は、ナトリウムチャネルの活性を阻害することによって機能するものであり、ナトリウムチャネルの研究等に広く用いられている。哺乳類のナトリウムチャネルにはNav1.1-1.9の９種類のサブファミリーとこれらとは相同性の低いNaxが知られているが、この中でもTTXは、Nav 1.1, Nav 1.2, Nav 1.3, Nav 1.4, Nav 1.6, Nav 1.7の活性を阻害する（非特許文献１）。これらのTTXが作用するナトリウムチャネルのサブファミリーは、中枢神経、末梢神経、筋肉組織に分布しており、これらの組織分布を反映してTTXは広範な生命活動に影響し、重篤な障害を人に引き起こす。
一方、ナトリウムチャネルのサブファミリーのいくつかは神経において痛みの伝達にも働き、なかでもNav 1.3, Nav 1.8, Nav 1.9は末梢神経系にあって、痛みの伝達に中心的な役割を果たしている。これのナトリウムチャネルのサブファミリーを特異的に阻害することができれば、人に障害を引き起こすことなく、痛みのみを取り除くことができると考えられている。
とりわけ神経が障害を受けた時に生じる神経因性の痛みと関係の深いNav 1.3に特異的に作用する鎮痛剤の提供が望まれていた（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ogata ,Ohishi Y.(2002)Molecular Diversity of Structure and Function f the Voltage-Gated Na+ Channels. Jpn J Pahrmacol. 88 : 365-377.
【非特許文献２】Craik DJ, Daly NL, Waine C. (2001) The cystine knot motif in toxins and implications for drug design. Toxicon. 39(1): 43-60.
【非特許文献３】砥出勝雄 (2006)疼痛治療薬の基礎 −痛みの基礎および新規疼痛ターゲット− 日薬理誌. 128 : 321-325.
【非特許文献４】Yoshimura, M., Onoyama, K. (2007) A new sibling species of the genus Strumigenys, with a redefinition of S. lewisi Cameron, pp. 664-690. In Snelling, R. R., B. L. Fisher, and P. S. Ward(eds). Advances in antystematics (Hymenoptera: Formicidae): homage to E. O. Wilson - 50 years of contributions. Memoirs of the American Entomological Institute, 80.
【非特許文献５】Bosmans F, Rash ,Zhu S, Diochot S,Lazdunski M, Escoubas P, Tytgat J.(2006)Four novel tarantula toxins as selective modulators of voltage-gated sodium channel subtypes. Mol Pharmacol. 69(2):419-29.
【非特許文献６】Xiao YC, Liang SP. (2003) Purification and characterization of Hainantoxin-V, a tetrodotoxin-sensitive sodium channel inhibitor from the venom of the spider Selenocosmia hainana. Toxicon. 41(6):643-50.
【非特許文献７】Peng K, Chen XD, Liang SP. (2001)The effect of Huwentoxin-I on Ca(2+) channels in differentiated NG108-15 cells, a patch-clamp study. Toxicon. 39(4):491-8.
【非特許文献８】Ebbinghaus J, Legros C, Nolting A, Guette C, Celerier ML, Pongs O, Baehring R. (2004)Modulation of Kv4. 2 channels by a peptide isolated from the venom of the giant bird-eating tarantula Theraphosa leblondi. Toxicon. 43(8):923-32.
【非特許文献９】Conticello SG, Gilad Y, Avidan N, Ben-Asher E, Levy Z, and Fainzilber M. (2001)Mechanisms for evolving hypervariability: the case of conopeptides. Mol. Biol. Evol. 18 (2):120-131.
【非特許文献１０】日本農芸化学会2008年度（平成２０年度）大会講演要旨集 P223 2008年3月5日発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、ナトリウムチャネル阻害ペプチドを有効成分とする鎮痛剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、以前、昆虫のナトリウムチャネルの活性を阻害する物質として注目されている毒産生生物由来の神経毒ペプチド（非特許文献３）に着目し、2007年に新種のアリとして発見された、キタウロコアリ(Strumigenys kumadori)が産生する毒性の高い神経毒ペプチドについて詳細に検討した結果、新規神経毒ペプチド（SKTXペプチド）の３種類の遺伝子クローニングに成功した。そして、これらSKTXペプチドがショウジョウバエ・ナトリウムチャネルの活性を顕著に阻害することを見いだし、特許出願すると共に（特願2008-130862）、平成２０年度日本農芸化学会でも報告した（非特許文献１０）。
本発明者らは、さらにこれらSKTXペプチドに対して、哺乳類のナトリウムチャネル阻害活性がある可能性を期待して鋭意研究を重ねた結果、神経因性の疼痛に中心的な役割を果たしている哺乳類ナトリウムチャネルのサブファミリーNav 1.3の活性を阻害することを見出し、副作用の少ない鎮痛剤に関する本発明を完成させるに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕 ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤；
（ａ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列、
（ｄ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）
（ｅ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕 前記（ｄ）のアミノ酸配列において、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである、前記〔１〕に記載の鎮痛剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドは、Nav 1.1- Nav 1.9及びNax以上10種類のナトリウムチャネルのサブファミリーの中でも、神経因性疼痛に関係すると考えられているNav 1.3の活性を阻害することから、副作用の少ない効果的な鎮痛作用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
次に、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のナトリウムチャネル阻害活性を有するSKTXペプチドは、キタウロコアリの毒腺から得られたナトリウムチャネル阻害活性を有する殺昆虫効果の高いペプチドである。
本発明のキタウロコアリ(Strumigenys kumadori)は、フタフシアリ亜科ウロコアリ属のアリで、毒液をトビムシ、ジムカデ等の土壌昆虫に注入してこれらの昆虫を狩るアリである。これまで近縁種のウロコアリと同種として分類されてきたが、形態上の特徴が明らかに異なるため、２００７年に新種のアリとして九州大学熱帯農学研究センターの吉村正志らによって記載された（非特許文献４）。
【０００８】
ナトリウムチャネルは、細胞膜上にあって、刺激に応じてＮａイオンを細胞内へ透過させることにより、活動電位を発生および伝達させ、生体内における神経系の情報伝達を司っている。ナトリウムチャネル阻害活性というとき、チャネル分子に結合して、チャネルの正常な活性を阻害する活性は全て含まれ、ナトリウムチャネル阻害剤とは、そのナトリウムチャネル阻害活性を有する薬剤のことを指す。ナトリウムチャネル阻害活性を有する薬剤の典型的なものとしてフグ毒のTTXがある。TTXは、Nav 1.1, Nav 1.2, Nav 1.3, Nav 1.4, Nav 1.6, Nav 1.7の活性を阻害する。これらのTTXが作用するナトリウムチャネルは、中枢神経、末梢神経、筋肉組織に分布しており、これらの組織分布を反映してTTXは広範な生体組織の活動に影響し、重篤な障害を人に引き起こす。
これに対して、本発明のSKTXペプチドは、哺乳類ナトリウムチャネルのうちで、痛覚に関係する神経系に主に働くNav 1.3に作用するため、重篤な障害を引き起こす危険性が少ないことが期待される。
【０００９】
本発明におけるナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチド（SKTXペプチド)とは、配列番号１〜３に示される、アミノ酸数３５又は３６のキタウロコアリの毒液中のSKTX１〜３ペプチド（SKTXペプチド）のみならず、ナトリウムチャネル阻害活性を失わない程度に、その１部のアミノ酸が欠失したり、他のアミノ酸と置換したり、アミノ酸配列が挿入、付加される変異を有する場合も包含する。その際、他のナトリウムチャネル阻害活性を有する生物毒に共通な６箇所のシステイン残基は保存される必要がある。
具体的には、以下のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｄ）などのアミノ酸配列を含む単離されたペプチドとして表現することができる。ただし、いずれのペプチドにおいても、SKTX成熟ペプチドのアミノ酸配列中の６箇所のシステイン残基は変更されていないアミノ酸配列を含むものである。
（ａ）配列番号１〜３に示されたSKTX１〜３の成熟ペプチドに対応するアミノ酸配列。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列のうち、６箇所のシステイン残基以外のアミノ酸残基が１もしくは数個、すなわち１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個欠失・置換されたアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中に、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個のアミノ酸残基が挿入された、又は当該アミノ酸配列に１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかに示されたアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。なお、ここで相同性とは、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0 (Lasergene))による相同性の算出法（図３）で算出される「同一性」をいう。
（ｄ）ここで、配列番号１〜３で示されるSKTX１〜３ペプチドのアミノ酸配列は、６箇所のシステイン残基以外にも共通配列が多く、７２％の相同性を有している。
したがって、本発明における典型的なSKTXペプチドは、下記式（Ｉ）のような１文字表記のアミノ酸配列として表すことができる。
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
式（Ｉ）中で、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸であってよく、そのうちのX1を含む１〜３個は欠失してもよい。好ましくは、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである。（配列番号７，８）
（ｅ）配列番号４〜６に示された塩基配列によりコードされたアミノ酸配列（配列番号１〜３）を含むアミノ酸配列と共に、配列番号４〜６に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。ここで、ストリンジェントな条件としては、6M 尿素、0.4%SDS、0.5 x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4%SDS、0.1 x SSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。
【００１０】
本発明における、ナトリウムチャネル阻害活性を有し、かつ６つのシステイン残基を有するペプチドを組換えペプチドとして発現し得る核酸とは、配列番号４〜６に示されるSKTXペプチド成熟体をコードするＤＮＡ、配列番号１３，１５又は１７中のSKTXペプチド前駆体をコードするＤＮＡのみならず、以下の（ａ）〜（ｇ）の塩基配列を含む核酸も包含するものである。ただし、発現される組換えペプチドは、配列番号１〜３に共通する６箇所のシステイン残基は保存されているペプチドである。
（ａ）配列番号４〜６に示される塩基配列を含む核酸、配列番号１３，１５、１７中のSKTXペプチド前駆体をコードする核酸（配列番号１３の70〜246位、配列番号１５の82〜267位、配列番号１７の2〜178位に対応する。）、又は配列番号１３，１５、１７に示される塩基配列に含まれる核酸であって、配列番号４〜６と読み枠をそろえた核酸。
（ｂ）（ａ）の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
（ｃ）（ａ）の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列。なお、ここで相同性とは、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0 (Lasergene))による相同性の算出法で算出される「同一性」をいう。
（ｄ）配列番号１〜３に示されたSKTX成熟体ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号１４，１６，１８に示されたSKTX前駆体ペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。ここで、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列とは、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個欠失・置換・挿入された配列をいう。または、配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列に１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列をいう。
（ｆ）配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）。
これらの核酸を含む発現ベクターを用い、形質転換宿主でSKTX１〜３ペプチド又はその類似ペプチドを単独又は融合組換え蛋白として発現させることができるが、その際に選択した宿主に応じて、成熟ペプチドに対応する塩基配列も、シグナル配列を含む前駆体ペプチドに対応する塩基配列も利用可能である。
そして、これら塩基配列もしくはその相補配列、又はそれらの配列中の連続して１５塩基以上、好ましくは１７以上、より好ましくは２０以上の塩基配列を含む部分配列からなる核酸は、SKTX１〜３ペプチドと類似のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドをコードする核酸を取得するためのプローブ又はプライマーとして用いることができる。特に、プライマーとしては5’側、3’側のノンコーディング領域に対応する塩基配列も有用に用いられる。
【００１１】
本発明のペプチドは、化学的に合成することもできるが、遺伝子組換え技術を用い形質転換宿主から組換えペプチドとして取得することができる。その際に、用いられる宿主・ベクター系としては、大腸菌、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を宿主とする通常の宿主・ベクター系はいずれも用いることができる。例えば、大腸菌宿主を用いて大量に生産可能であるが、特にコールド・ショックシステム(タカラバイオ株式会社)を用いることで、さらに大量生産が可能となる。また、融合蛋白として取得することができ、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合タンパク質(GE Healthcare)として発現させれば、高い効率で立体構造が正確に形成されたペプチドを大量に取得することができる。その際には、発現させようとする宿主により、成熟体ペプチドをコードするDNAでも、シグナル配列を含むDNAでも適宜用いることができる。
【００１２】
本発明を鎮痛剤として用いる場合に、精製ペプチド、未精製ペプチド、又は複数種の混合ペプチドとして用いてもよく、さらに他の公知の鎮痛剤と併用してもよい。その際のSKTXペプチド又はその薬理学上許容される塩の投与形態としては、注射剤、座薬、塗り薬、貼付剤などの非経口投与形態が望ましい。これら製剤は賦形剤、結合剤、安定剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。エタノールなどを含む通常の水性溶媒に、適量溶解させて（例えば0.00001〜10mg／ml）、皮膚表面に塗布してもよく、また、脊髄くも膜下に直接カテーテルを挿入してペプチド水溶液を投与することができる。
本発明のSKTXペプチド及びその薬理上許容される塩の使用量は症状、年齢、投与方法等によって異なるが、例えば、成人１日あたり、0.00001〜100mg／kg、好ましくは0.001〜10mg／kgを１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
【実施例】
【００１３】
以下に、製造例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
また、特に記載のない限りにおいて、遺伝子工学的手法の詳細は、Molecular Cloning 2nd edition. Cold Spring Harvor Laboratory Press, Cold Spring Harvor, NY. (1989)に記載の方法に従った。
【００１４】
（製造例１）キタウロコアリ由来生理活性ペプチドSKTX1をコードするcDNAの単離
（１−１）キタウロコアリ由来、生理活性ペプチドに共通する合成プライマーの製造
公知のトビキバハリアリ(Myrmecia pilosula)由来の生理活性ペプチドPilosulin及びコモリグモの一種(Oxyopes kitabensis)由来の生理活性ペプチドOxyopininsのアミノ酸配列を比較した。この配列の中で相同性の高く、シグナルペプチドの作用部位に近いアミノ酸配列に対応する塩基配列をプライマーPilosulin/Oxyopinin (5’-ACYTTNGGIAGIACYTT-3’)（配列番号９）として合成した。
【００１５】
（１−２）RNAの単離
キタウロコアリ(Strumigenys kumadori)よりTRIZOL LS溶液（GIBCO BRL）を用いて、その使用方法に従いtotal RNAを抽出した。このtotal RNAから、Oligotex-dT30 (Super)（タカラバイオ株式会社）を用い、その使用方法に従って、poly A+ RNAを精製した。
【００１６】
（１−３）cDNAライブラリーの構築
こうして得られたpoly A+ RNAを鋳型としてcDNA合成キット(Stratagene)を用いて、２本鎖化したcDNAの混合物を得た。これにEcoR Iアダプター（タカラバイオ株式会社）を付加してポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、Xho Iで制限酵素処理後、0.8〜2kbのDNA断片を抽出した。こうして得られたDNA断片を、pSD64TRベクター(Nucleic Acids Res., 12: 7057 (1984) 及びArch. Biochem. Biophys., 428(2): 170-178 (2004))のEcoR I, Xho Iサイトに挿入した。これをcDNAライブラリーとして以降、使用した。
【００１７】
(１−４) SKTX１〜３ cDNAの単離
前記（１−１）で得たcDNAライブラリーを鋳型としたPCR反応によって、プライマー Pilosulin/Oxyopininとプライマー SDA(5’-TTATGTAGCTTAGAGACT-3’)（配列番号１０）を用いてDNAフラグメントを増幅した。増幅したDNAフラグメントを、クローニングベクターpCR2.1 (invitrogen)を用い、サブクローニングした。部分長cDNAの塩基配列を決定し、公知のcDNAの塩基配列と比較した後、新規のペプチドをコードしているものを選択した。新規ペプチドの全長cDNAを単離するために、新規ペプチドの部分長cDNAの塩基配列の一部からプライマーconoR (5’-TTAAAACAGGTCATAGCG-3’)（配列番号１１）を設計し、当該プライマーとベクタープライマー SP6 (5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’)（配列番号１２）を用いて再度同じcDNAライブラリーを鋳型としたPCRを行った。全長cDNAを取得後、全塩基配列を決定し、このクローンをSKTX1、SKTX2、SKTX3と命名した。
DNAの塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)とSP６プライマーを用いて反応し、蛍光自動シークエンサーABI Sequencer377（Applied Biosystems）で解析した。
以上のようにして単離、配列決定したSKTX1 cDNAの塩基配列及び塩基配列から推測されるアミノ酸配列を図１に示す。（SKTX1は、配列番号１３，１４及び１，４に対応。SKTX2は、配列番号１５，１６及び２，５に対応。SKTX3は、配列番号１７，１８及び３，６に対応。）
SKTX1〜3がコードする成熟体ペプチド（図２）は、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0)による相同性の算出法で、クモの神経毒CcoTX（非特許文献５）, HNTX（非特許文献６）, HWTX（非特許文献７）, TLTX（非特許文献８），イモ貝のコノトキシン（非特許文献９）と相同性を示したが、その相同性はシステイン残基に限られており、成熟体ペプチドのアミノ酸配列レベルで３０％〜５０％という低い相同性しか示さない新しいタイプの神経毒ペプチドであることが判明した（図３）。
【００１８】
（製造例２）組換えSKTX1〜3ペプチドの発現・精製
配列番号１〜３で示したアミノ酸配列からなるSKTX1〜3ペプチドを、大腸菌のコールド・ショックシステム(タカラバイオ株式会社)を用いる手法、及びグルタチオンSトランスフェラーゼとの融合タンパク質(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)とする手法の２種類の方法を用いて大腸菌Rossetta Gami2（メルク）で発現させた。いずれの場合も、融合タンパク質を精製したのち、プロテアーゼPreScissionTM (GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いて処理し、SepPakC18により0.1%トリフルオロ酢酸を含む40%のアセトニトリルで溶出し組換えSKTX1ペプチドを精製した。これを凍結乾燥後、蒸留水に溶解させた。
【００１９】
（２−１）SKTX1〜3ペプチドを大腸菌のコールド・ショックシステムを用いて発現させた場合
SKTX1〜3 cDNAの成熟体ペプチドをコードする塩基配列（配列番号４〜６）をpCOLD II（タカラバイオ株式会社）ヒスチジンヘキサマーの配列とPreScissionTMの認識配列とともに、BamHIサイトに接続し、ｐCOLD-SKTX1〜3 を作成した。これを大腸菌、BL21に大腸菌のシャペロニン配列をもつｐGro7（タカラバイオ株式会社）とともに共形質転換した。この形質転換した大腸菌をLB (0.02%アラビノースを含む)培地中で３７度、３時間培養した後、１５度に温度を低下させて1 μMになるようIPTGを添加し、オーバーナイトで大腸菌を培養した。この培養液から大腸菌を回収しNi-NTA（Qiagen）とSepPakC18（Waters）を用いて組み換えペプチドを精製した。このペプチドはN末端側にヒスチジンヘキサマーの配列とPreScissionTMの認識配列を持っていたので、プロテアーゼPreScissionTMを用いて４度、オーバーナイトで反応させて余分な配列のないSKTX1ペプチドを取得した。プロテアーゼ処理はTagzyme (Qiagen)を用いて３７度で１時間の反応を行っても同じ余分な配列のないSKTX1ペプチドを取得することができた。
【００２０】
（２−２）SKTX1〜3ペプチドを大腸菌の発現ベクターpGEXを用いて発現させた場合
SKTX1〜3 cDNAの成熟体ペプチドをコードする塩基配列（配列番号４〜６）をPreScissionTMの認識配列とともに、pGEX-2T（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）のBamH IサイトとEcoR Iサイトの間に接続し、ｐGEX-SKTX1を作成した。これを大腸菌Rossetta Gami2に形質転換した。この形質転換した大腸菌をLB培地中で３７度、３時間培養した後、２０度に温度を低下させて1 μMになるようIPTGを添加し、オーバーナイトで大腸菌を培養した。この培養液から大腸菌を回収しグルタチオンセファロース（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）とSepPakC18（Waters）を用いて組み換えペプチドを精製した。このペプチドはN末端側にグルタチオンSトランスフェラーゼとPreScissionTMの認識配列を持っていたので、プロテアーゼPreScissionTMを用いて４度、オーバーナイトで反応させて余分な配列のないSKTX1〜3ペプチドを取得した。
【００２１】
（実施例）SKTX1〜3ペプチドのナトリウムチャネル・阻害活性
従来のアフリカツメガエル卵母細胞を用いた二本差し膜電位固定法は、例えば「Ion Channels. Edited by: Bernardo Rudy, Methods in Enzymology Volume 207, Pages 3-917 (1992)」等に詳述されている。
その代表的な手法は、以下の方法に従い、イオンチャネルの活性を電気生理学的解析にするという方法である（図４）。
（１）イオンチャネルcRNAを合成し、
（２）そのcRNAを卵母細胞へ注入しチャネル分子を細胞膜表面に発現させて、
（３）２日〜４日後に、２本の微小電極を卵母細胞に差し込み、膜内外で電圧を変化させることによって誘起されるイオンの流出もしくは流入を、電流量の変化に置き換えて測定する。
本実施例では、上記方法の（１）の段階でのイオンチャネルcRNAとしてラット・ナトリウムチャネルαサブユニット Nav 1.3を使用した。また、（３）の段階で、前記（製造例２）で取得したSKTX１ペプチドを添加し、５分後にイオンチャネルの活性を測定した。
この結果とSKTX1〜3ペプチド無添加の状態のイオンチャネルの活性とを比較した。その結果、SKTX１ペプチドは、1μMにおいてラットのナトリウムチャネルの活性をほぼ完全に阻害した（図４A）。また、この時ナトリウムチャネルの電位依存性を変化させることはなかった（図４B）。
【００２２】
（参考例）SKTX1〜3ペプチドのフタフシコオロギに対する作用
従来のフタフシコオロギを用いた殺虫活性は、「Scorpion toxins affecting insects: Loret. E.P., Methods in Neuroscience Volume 8, Pages 381-395 (1992)」等に詳述されている。
その代表的な手法は、
（１）フタフシコオロギ（平均 0.2g）の中肢と後肢の間に、10 μl用のハミルトンシリンジを用いて、
5 μlのPBSに溶解させた80μMペプチド溶液を注入し、
（２）昆虫の変化を５，１５，６０分, １８時間後に観察する
という方法である。
参考例では、この方法に従い本発明のペプチドの殺虫活性を評価した結果、SKTX1では５０％のコオロギで麻痺作用が起き,その麻痺が３０分間以上にわたって持続した。SKTX2では、６０％のコオロギで麻痺作用が起き,その麻痺が１８時間以上にわたって持続した。
したがって、本発明のペプチドの殺虫活性が実証された。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】SKTXのcDNAの塩基配列とアミノ酸配列 Ａ：SKTX1（２５〜５９位が成熟体ペプチド） Ｂ：SKTX2（２７〜６２位が成熟体ペプチド） Ｃ：SKTX3（２５〜５９位が成熟体ペプチド）
【図２】SKTXの成熟体ペプチドのアミノ酸配列 （１−４番目、２−５番目、３−６番目のシステイン残基がジスルフィド結合で架橋されていると推定される。）Ａ：SKTX1、Ｂ：SKTX2、Ｃ：SKTX3
【図３】SKTXペプチドと相同性のある毒性ペプチドとの比較：SKTXはクモ毒、コノトキシンなどと３０〜５０％程度の相同性を示す。ICKを持つペプチドはアミノ酸配列の微妙な違いによって生理活性が大きく異なることが知られている。アステリスクはC末端のアミド化を示す。
【図４】SKTX１ペプチドのラット・ナトリウムチャネルの阻害活性 Ａ：濃度依存的変化 Ｂ：電位依存的変化
【図５】参考図１：SKTX１ペプチドのショウジョウバエ・ナトリウムチャネルの阻害活性 Ａ：濃度依存的変化 Ｂ：電位依存的変化
【図６】参考図２：SKTX２ペプチドのショウジョウバエ・ナトリウムチャネルの阻害活性 Ａ：濃度依存的変化 Ｂ：電位依存的変化
【図７】参考図３：SKTX３ペプチドのショウジョウバエ・ナトリウムチャネルの阻害活性 Ａ：濃度依存的変化 Ｂ：電位依存的変化
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナトリウムチャネル阻害活性を有するSKTXペプチドの鎮痛剤としての用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来からナトリウムチャネル阻害物質として知られているフグ毒テトロドトキシン(TTX)は、ナトリウムチャネルの活性を阻害することによって機能するものであり、ナトリウムチャネルの研究等に広く用いられている。哺乳類のナトリウムチャネルにはNav1.1-1.9の９種類のサブファミリーとこれらとは相同性の低いNaxが知られているが、この中でもTTXは、Nav 1.1, Nav 1.2, Nav 1.3, Nav 1.4, Nav 1.6, Nav 1.7の活性を阻害する（非特許文献１）。これらのTTXが作用するナトリウムチャネルのサブファミリーは、中枢神経、末梢神経、筋肉組織に分布しており、これらの組織分布を反映してTTXは広範な生命活動に影響し、重篤な障害を人に引き起こす。
一方、ナトリウムチャネルのサブファミリーのいくつかは神経において痛みの伝達にも働き、なかでもNav 1.3, Nav 1.8, Nav 1.9は末梢神経系にあって、痛みの伝達に中心的な役割を果たしている。これのナトリウムチャネルのサブファミリーを特異的に阻害することができれば、人に障害を引き起こすことなく、痛みのみを取り除くことができると考えられている。
とりわけ神経が障害を受けた時に生じる神経因性の痛みと関係の深いNav 1.3に特異的に作用する鎮痛剤の提供が望まれていた（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ogata ,Ohishi Y.(2002)Molecular Diversity of Structure and Function f the Voltage-Gated Na+ Channels. Jpn J Pahrmacol. 88 : 365-377.
【非特許文献２】Craik DJ, Daly NL, Waine C. (2001) The cystine knot motif in toxins and implications for drug design. Toxicon. 39(1): 43-60.
【非特許文献３】砥出勝雄 (2006)疼痛治療薬の基礎 −痛みの基礎および新規疼痛ターゲット− 日薬理誌. 128 : 321-325.
【非特許文献４】Yoshimura, M., Onoyama, K. (2007) A new sibling species of the genus Strumigenys, with a redefinition of S. lewisi Cameron, pp. 664-690. In Snelling, R. R., B. L. Fisher, and P. S. Ward(eds). Advances in antystematics (Hymenoptera: Formicidae): homage to E. O. Wilson - 50 years of contributions. Memoirs of the American Entomological Institute, 80.
【非特許文献５】Bosmans F, Rash ,Zhu S, Diochot S,Lazdunski M, Escoubas P, Tytgat J.(2006)Four novel tarantula toxins as selective modulators of voltage-gated sodium channel subtypes. Mol Pharmacol. 69(2):419-29.
【非特許文献６】Xiao YC, Liang SP. (2003) Purification and characterization of Hainantoxin-V, a tetrodotoxin-sensitive sodium channel inhibitor from the venom of the spider Selenocosmia hainana. Toxicon. 41(6):643-50.
【非特許文献７】Peng K, Chen XD, Liang SP. (2001)The effect of Huwentoxin-I on Ca(2+) channels in differentiated NG108-15 cells, a patch-clamp study. Toxicon. 39(4):491-8.
【非特許文献８】Ebbinghaus J, Legros C, Nolting A, Guette C, Celerier ML, Pongs O, Baehring R. (2004)Modulation of Kv4. 2 channels by a peptide isolated from the venom of the giant bird-eating tarantula Theraphosa leblondi. Toxicon. 43(8):923-32.
【非特許文献９】Conticello SG, Gilad Y, Avidan N, Ben-Asher E, Levy Z, and Fainzilber M. (2001)Mechanisms for evolving hypervariability: the case of conopeptides. Mol. Biol. Evol. 18 (2):120-131.
【非特許文献１０】日本農芸化学会2008年度（平成２０年度）大会講演要旨集 P223 2008年3月5日発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、ナトリウムチャネル阻害ペプチドを有効成分とする鎮痛剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、以前、昆虫のナトリウムチャネルの活性を阻害する物質として注目されている毒産生生物由来の神経毒ペプチド（非特許文献３）に着目し、2007年に新種のアリとして発見された、キタウロコアリ(Strumigenys kumadori)が産生する毒性の高い神経毒ペプチドについて詳細に検討した結果、新規神経毒ペプチド（SKTXペプチド）の３種類の遺伝子クローニングに成功した。そして、これらSKTXペプチドがショウジョウバエ・ナトリウムチャネルの活性を顕著に阻害することを見いだし、特許出願すると共に（特願2008-130862）、平成２０年度日本農芸化学会でも報告した（非特許文献１０）。
本発明者らは、さらにこれらSKTXペプチドに対して、哺乳類のナトリウムチャネル阻害活性がある可能性を期待して鋭意研究を重ねた結果、神経因性の疼痛に中心的な役割を果たしている哺乳類ナトリウムチャネルのサブファミリーNav 1.3の活性を阻害することを見出し、副作用の少ない鎮痛剤に関する本発明を完成させるに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕 ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤；
（ａ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列、
（ｄ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）
（ｅ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕 前記（ｄ）のアミノ酸配列において、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである、前記〔１〕に記載の鎮痛剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドは、Nav 1.1- Nav 1.9及びNax以上10種類のナトリウムチャネルのサブファミリーの中でも、神経因性疼痛に関係すると考えられているNav 1.3の活性を阻害することから、副作用の少ない効果的な鎮痛作用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
次に、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のナトリウムチャネル阻害活性を有するSKTXペプチドは、キタウロコアリの毒腺から得られたナトリウムチャネル阻害活性を有する殺昆虫効果の高いペプチドである。
本発明のキタウロコアリ(Strumigenys kumadori)は、フタフシアリ亜科ウロコアリ属のアリで、毒液をトビムシ、ジムカデ等の土壌昆虫に注入してこれらの昆虫を狩るアリである。これまで近縁種のウロコアリと同種として分類されてきたが、形態上の特徴が明らかに異なるため、２００７年に新種のアリとして九州大学熱帯農学研究センターの吉村正志らによって記載された（非特許文献４）。
【０００８】
ナトリウムチャネルは、細胞膜上にあって、刺激に応じてＮａイオンを細胞内へ透過させることにより、活動電位を発生および伝達させ、生体内における神経系の情報伝達を司っている。ナトリウムチャネル阻害活性というとき、チャネル分子に結合して、チャネルの正常な活性を阻害する活性は全て含まれ、ナトリウムチャネル阻害剤とは、そのナトリウムチャネル阻害活性を有する薬剤のことを指す。ナトリウムチャネル阻害活性を有する薬剤の典型的なものとしてフグ毒のTTXがある。TTXは、Nav 1.1, Nav 1.2, Nav 1.3, Nav 1.4, Nav 1.6, Nav 1.7の活性を阻害する。これらのTTXが作用するナトリウムチャネルは、中枢神経、末梢神経、筋肉組織に分布しており、これらの組織分布を反映してTTXは広範な生体組織の活動に影響し、重篤な障害を人に引き起こす。
これに対して、本発明のSKTXペプチドは、哺乳類ナトリウムチャネルのうちで、痛覚に関係する神経系に主に働くNav 1.3に作用するため、重篤な障害を引き起こす危険性が少ないことが期待される。
【０００９】
本発明におけるナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチド（SKTXペプチド)とは、配列番号１〜３に示される、アミノ酸数３５又は３６のキタウロコアリの毒液中のSKTX１〜３ペプチド（SKTXペプチド）のみならず、ナトリウムチャネル阻害活性を失わない程度に、その１部のアミノ酸が欠失したり、他のアミノ酸と置換したり、アミノ酸配列が挿入、付加される変異を有する場合も包含する。その際、他のナトリウムチャネル阻害活性を有する生物毒に共通な６箇所のシステイン残基は保存される必要がある。
具体的には、以下のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｄ）などのアミノ酸配列を含む単離されたペプチドとして表現することができる。ただし、いずれのペプチドにおいても、SKTX成熟ペプチドのアミノ酸配列中の６箇所のシステイン残基は変更されていないアミノ酸配列を含むものである。
（ａ）配列番号１〜３に示されたSKTX１〜３の成熟ペプチドに対応するアミノ酸配列。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列のうち、６箇所のシステイン残基以外のアミノ酸残基が１もしくは数個、すなわち１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個欠失・置換されたアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中に、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個のアミノ酸残基が挿入された、又は当該アミノ酸配列に１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかに示されたアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。なお、ここで相同性とは、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0 (Lasergene))による相同性の算出法（図３）で算出される「同一性」をいう。
（ｄ）ここで、配列番号１〜３で示されるSKTX１〜３ペプチドのアミノ酸配列は、６箇所のシステイン残基以外にも共通配列が多く、７２％の相同性を有している。
したがって、本発明における典型的なSKTXペプチドは、下記式（Ｉ）のような１文字表記のアミノ酸配列として表すことができる。
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
式（Ｉ）中で、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸であってよく、そのうちのX1を含む１〜３個は欠失してもよい。好ましくは、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである。（配列番号７，８）
（ｅ）配列番号４〜６に示された塩基配列によりコードされたアミノ酸配列（配列番号１〜３）を含むアミノ酸配列と共に、配列番号４〜６に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。ここで、ストリンジェントな条件としては、6M 尿素、0.4%SDS、0.5 x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4%SDS、0.1 x SSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。
【００１０】
本発明における、ナトリウムチャネル阻害活性を有し、かつ６つのシステイン残基を有するペプチドを組換えペプチドとして発現し得る核酸とは、配列番号４〜６に示されるSKTXペプチド成熟体をコードするＤＮＡ、配列番号１３，１５又は１７中のSKTXペプチド前駆体をコードするＤＮＡのみならず、以下の（ａ）〜（ｇ）の塩基配列を含む核酸も包含するものである。ただし、発現される組換えペプチドは、配列番号１〜３に共通する６箇所のシステイン残基は保存されているペプチドである。
（ａ）配列番号４〜６に示される塩基配列を含む核酸、配列番号１３，１５、１７中のSKTXペプチド前駆体をコードする核酸（配列番号１３の70〜246位、配列番号１５の82〜267位、配列番号１７の2〜178位に対応する。）、又は配列番号１３，１５、１７に示される塩基配列に含まれる核酸であって、配列番号４〜６と読み枠をそろえた核酸。
（ｂ）（ａ）の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
（ｃ）（ａ）の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列。なお、ここで相同性とは、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0 (Lasergene))による相同性の算出法で算出される「同一性」をいう。
（ｄ）配列番号１〜３に示されたSKTX成熟体ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号１４，１６，１８に示されたSKTX前駆体ペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。ここで、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列とは、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個欠失・置換・挿入された配列をいう。または、配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列に１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列をいう。
（ｆ）配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）。
これらの核酸を含む発現ベクターを用い、形質転換宿主でSKTX１〜３ペプチド又はその類似ペプチドを単独又は融合組換え蛋白として発現させることができるが、その際に選択した宿主に応じて、成熟ペプチドに対応する塩基配列も、シグナル配列を含む前駆体ペプチドに対応する塩基配列も利用可能である。
そして、これら塩基配列もしくはその相補配列、又はそれらの配列中の連続して１５塩基以上、好ましくは１７以上、より好ましくは２０以上の塩基配列を含む部分配列からなる核酸は、SKTX１〜３ペプチドと類似のナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドをコードする核酸を取得するためのプローブ又はプライマーとして用いることができる。特に、プライマーとしては5’側、3’側のノンコーディング領域に対応する塩基配列も有用に用いられる。
【００１１】
本発明のペプチドは、化学的に合成することもできるが、遺伝子組換え技術を用い形質転換宿主から組換えペプチドとして取得することができる。その際に、用いられる宿主・ベクター系としては、大腸菌、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を宿主とする通常の宿主・ベクター系はいずれも用いることができる。例えば、大腸菌宿主を用いて大量に生産可能であるが、特にコールド・ショックシステム(タカラバイオ株式会社)を用いることで、さらに大量生産が可能となる。また、融合蛋白として取得することができ、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合タンパク質(GE Healthcare)として発現させれば、高い効率で立体構造が正確に形成されたペプチドを大量に取得することができる。その際には、発現させようとする宿主により、成熟体ペプチドをコードするDNAでも、シグナル配列を含むDNAでも適宜用いることができる。
【００１２】
本発明を鎮痛剤として用いる場合に、精製ペプチド、未精製ペプチド、又は複数種の混合ペプチドとして用いてもよく、さらに他の公知の鎮痛剤と併用してもよい。その際のSKTXペプチド又はその薬理学上許容される塩の投与形態としては、注射剤、座薬、塗り薬、貼付剤などの非経口投与形態が望ましい。これら製剤は賦形剤、結合剤、安定剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。エタノールなどを含む通常の水性溶媒に、適量溶解させて（例えば0.00001〜10mg／ml）、皮膚表面に塗布してもよく、また、脊髄くも膜下に直接カテーテルを挿入してペプチド水溶液を投与することができる。
本発明のSKTXペプチド及びその薬理上許容される塩の使用量は症状、年齢、投与方法等によって異なるが、例えば、成人１日あたり、0.00001〜100mg／kg、好ましくは0.001〜10mg／kgを１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
【実施例】
【００１３】
以下に、製造例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
また、特に記載のない限りにおいて、遺伝子工学的手法の詳細は、Molecular Cloning 2nd edition. Cold Spring Harvor Laboratory Press, Cold Spring Harvor, NY. (1989)に記載の方法に従った。
【００１４】
（製造例１）キタウロコアリ由来生理活性ペプチドSKTX1をコードするcDNAの単離
（１−１）キタウロコアリ由来、生理活性ペプチドに共通する合成プライマーの製造
公知のトビキバハリアリ(Myrmecia pilosula)由来の生理活性ペプチドPilosulin及びコモリグモの一種(Oxyopes kitabensis)由来の生理活性ペプチドOxyopininsのアミノ酸配列を比較した。この配列の中で相同性の高く、シグナルペプチドの作用部位に近いアミノ酸配列に対応する塩基配列をプライマーPilosulin/Oxyopinin (5’-ACYTTNGGIAGIACYTT-3’)（配列番号９）として合成した。
【００１５】
（１−２）RNAの単離
キタウロコアリ(Strumigenys kumadori)よりTRIZOL LS溶液（GIBCO BRL）を用いて、その使用方法に従いtotal RNAを抽出した。このtotal RNAから、Oligotex-dT30 (Super)（タカラバイオ株式会社）を用い、その使用方法に従って、poly A+ RNAを精製した。
【００１６】
（１−３）cDNAライブラリーの構築
こうして得られたpoly A+ RNAを鋳型としてcDNA合成キット(Stratagene)を用いて、２本鎖化したcDNAの混合物を得た。これにEcoR Iアダプター（タカラバイオ株式会社）を付加してポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、Xho Iで制限酵素処理後、0.8〜2kbのDNA断片を抽出した。こうして得られたDNA断片を、pSD64TRベクター(Nucleic Acids Res., 12: 7057 (1984) 及びArch. Biochem. Biophys., 428(2): 170-178 (2004))のEcoR I, Xho Iサイトに挿入した。これをcDNAライブラリーとして以降、使用した。
【００１７】
(１−４) SKTX１〜３ cDNAの単離
前記（１−１）で得たcDNAライブラリーを鋳型としたPCR反応によって、プライマー Pilosulin/Oxyopininとプライマー SDA(5’-TTATGTAGCTTAGAGACT-3’)（配列番号１０）を用いてDNAフラグメントを増幅した。増幅したDNAフラグメントを、クローニングベクターpCR2.1 (invitrogen)を用い、サブクローニングした。部分長cDNAの塩基配列を決定し、公知のcDNAの塩基配列と比較した後、新規のペプチドをコードしているものを選択した。新規ペプチドの全長cDNAを単離するために、新規ペプチドの部分長cDNAの塩基配列の一部からプライマーconoR (5’-TTAAAACAGGTCATAGCG-3’)（配列番号１１）を設計し、当該プライマーとベクタープライマー SP6 (5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’)（配列番号１２）を用いて再度同じcDNAライブラリーを鋳型としたPCRを行った。全長cDNAを取得後、全塩基配列を決定し、このクローンをSKTX1、SKTX2、SKTX3と命名した。
DNAの塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)とSP６プライマーを用いて反応し、蛍光自動シークエンサーABI Sequencer377（Applied Biosystems）で解析した。
以上のようにして単離、配列決定したSKTX1 cDNAの塩基配列及び塩基配列から推測されるアミノ酸配列を図１に示す。（SKTX1は、配列番号１３，１４及び１，４に対応。SKTX2は、配列番号１５，１６及び２，５に対応。SKTX3は、配列番号１７，１８及び３，６に対応。）
SKTX1〜3がコードする成熟体ペプチド（図２）は、Clastal W法(解析ソフトDNASTAR Version 5.0)による相同性の算出法で、クモの神経毒CcoTX（非特許文献５）, HNTX（非特許文献６）, HWTX（非特許文献７）, TLTX（非特許文献８），イモ貝のコノトキシン（非特許文献９）と相同性を示したが、その相同性はシステイン残基に限られており、成熟体ペプチドのアミノ酸配列レベルで３０％〜５０％という低い相同性しか示さない新しいタイプの神経毒ペプチドであることが判明した（図３）。
【００１８】
（製造例２）組換えSKTX1〜3ペプチドの発現・精製
配列番号１〜３で示したアミノ酸配列からなるSKTX1〜3ペプチドを、大腸菌のコールド・ショックシステム(タカラバイオ株式会社)を用いる手法、及びグルタチオンSトランスフェラーゼとの融合タンパク質(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)とする手法の２種類の方法を用いて大腸菌Rossetta Gami2（メルク）で発現させた。いずれの場合も、融合タンパク質を精製したのち、プロテアーゼPreScissionTM (GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いて処理し、SepPakC18により0.1%トリフルオロ酢酸を含む40%のアセトニトリルで溶出し組換えSKTX1ペプチドを精製した。これを凍結乾燥後、蒸留水に溶解させた。
【００１９】
（２−１）SKTX1〜3ペプチドを大腸菌のコールド・ショックシステムを用いて発現させた場合
SKTX1〜3 cDNAの成熟体ペプチドをコードする塩基配列（配列番号４〜６）をpCOLD II（タカラバイオ株式会社）ヒスチジンヘキサマーの配列とPreScissionTMの認識配列とともに、BamHIサイトに接続し、ｐCOLD-SKTX1〜3 を作成した。これを大腸菌、BL21に大腸菌のシャペロニン配列をもつｐGro7（タカラバイオ株式会社）とともに共形質転換した。この形質転換した大腸菌をLB (0.02%アラビノースを含む)培地中で３７度、３時間培養した後、１５度に温度を低下させて1 μMになるようIPTGを添加し、オーバーナイトで大腸菌を培養した。この培養液から大腸菌を回収しNi-NTA（Qiagen）とSepPakC18（Waters）を用いて組み換えペプチドを精製した。このペプチドはN末端側にヒスチジンヘキサマーの配列とPreScissionTMの認識配列を持っていたので、プロテアーゼPreScissionTMを用いて４度、オーバーナイトで反応させて余分な配列のないSKTX1ペプチドを取得した。プロテアーゼ処理はTagzyme (Qiagen)を用いて３７度で１時間の反応を行っても同じ余分な配列のないSKTX1ペプチドを取得することができた。
【００２０】
（２−２）SKTX1〜3ペプチドを大腸菌の発現ベクターpGEXを用いて発現させた場合
SKTX1〜3 cDNAの成熟体ペプチドをコードする塩基配列（配列番号４〜６）をPreScissionTMの認識配列とともに、pGEX-2T（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）のBamH IサイトとEcoR Iサイトの間に接続し、ｐGEX-SKTX1を作成した。これを大腸菌Rossetta Gami2に形質転換した。この形質転換した大腸菌をLB培地中で３７度、３時間培養した後、２０度に温度を低下させて1 μMになるようIPTGを添加し、オーバーナイトで大腸菌を培養した。この培養液から大腸菌を回収しグルタチオンセファロース（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）とSepPakC18（Waters）を用いて組み換えペプチドを精製した。このペプチドはN末端側にグルタチオンSトランスフェラーゼとPreScissionTMの認識配列を持っていたので、プロテアーゼPreScissionTMを用いて４度、オーバーナイトで反応させて余分な配列のないSKTX1〜3ペプチドを取得した。
【００２１】
（実施例）SKTX1〜3ペプチドのナトリウムチャネル・阻害活性
従来のアフリカツメガエル卵母細胞を用いた二本差し膜電位固定法は、例えば「Ion Channels. Edited by: Bernardo Rudy, Methods in Enzymology Volume 207, Pages 3-917 (1992)」等に詳述されている。
その代表的な手法は、以下の方法に従い、イオンチャネルの活性を電気生理学的解析にするという方法である（図４）。
（１）イオンチャネルcRNAを合成し、
（２）そのcRNAを卵母細胞へ注入しチャネル分子を細胞膜表面に発現させて、
（３）２日〜４日後に、２本の微小電極を卵母細胞に差し込み、膜内外で電圧を変化させることによって誘起されるイオンの流出もしくは流入を、電流量の変化に置き換えて測定する。
本実施例では、上記方法の（１）の段階でのイオンチャネルcRNAとしてラット・ナトリウムチャネルαサブユニット Nav 1.3を使用した。また、（３）の段階で、前記（製造例２）で取得したSKTX１ペプチドを添加し、５分後にイオンチャネルの活性を測定した。
この結果とSKTX1〜3ペプチド無添加の状態のイオンチャネルの活性とを比較した。その結果、SKTX１ペプチドは、1μMにおいてラットのナトリウムチャネルの活性をほぼ完全に阻害した（図４A）。また、この時ナトリウムチャネルの電位依存性を変化させることはなかった（図４B）。
【００２２】
（参考例）SKTX1〜3ペプチドのフタフシコオロギに対する作用
従来のフタフシコオロギを用いた殺虫活性は、「Scorpion toxins affecting insects: Loret. E.P., Methods in Neuroscience Volume 8, Pages 381-395 (1992)」等に詳述されている。
その代表的な手法は、
（１）フタフシコオロギ（平均 0.2g）の中肢と後肢の間に、10 μl用のハミルトンシリンジを用いて、
5 μlのPBSに溶解させた80μMペプチド溶液を注入し、
（２）昆虫の変化を５，１５，６０分, １８時間後に観察する
という方法である。
参考例では、この方法に従い本発明のペプチドの殺虫活性を評価した結果、SKTX1では５０％のコオロギで麻痺作用が起き,その麻痺が３０分間以上にわたって持続した。SKTX2では、６０％のコオロギで麻痺作用が起き,その麻痺が１８時間以上にわたって持続した。
したがって、本発明のペプチドの殺虫活性が実証された。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】SKTXのcDNAの塩基配列とアミノ酸配列 Ａ：SKTX1（２５〜５９位が成熟体ペプチド） Ｂ：SKTX2（２７〜６２位が成熟体ペプチド） Ｃ：SKTX3（２５〜５９位が成熟体ペプチド）
【図２】SKTXの成熟体ペプチドのアミノ酸配列 （１−４番目、２−５番目、３−６番目のシステイン残基がジスルフィド結合で架橋されていると推定される。）Ａ：SKTX1、Ｂ：SKTX2、Ｃ：SKTX3
【図３】SKTXペプチドと相同性のある毒性ペプチドとの比較：SKTXはクモ毒、コノトキシンなどと３０〜５０％程度の相同性を示す。ICKを持つペプチドはアミノ酸配列の微妙な違いによって生理活性が大きく異なることが知られている。アステリスクはC末端のアミド化を示す。
【図４】SKTX１ペプチドのラット・ナトリウムチャネルの阻害活性 Ａ：濃度依存的変化 Ｂ：電位依存的変化
【図５】参考図１：SKTX１ペプチドのショウジョウバエ・ナトリウムチャネルの阻害活性 Ａ：濃度依存的変化 Ｂ：電位依存的変化
【図６】参考図２：SKTX２ペプチドのショウジョウバエ・ナトリウムチャネルの阻害活性 Ａ：濃度依存的変化 Ｂ：電位依存的変化
【図７】参考図３：SKTX３ペプチドのショウジョウバエ・ナトリウムチャネルの阻害活性 Ａ：濃度依存的変化 Ｂ：電位依存的変化
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤；
（ａ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列、
（ｄ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）
（ｅ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
【請求項２】
前記（ｄ）のアミノ酸配列において、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである、請求項１に記載の鎮痛剤。
【請求項１】
ナトリウムチャネル阻害活性を有するペプチドであって、以下（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤；
（ａ）配列番号１〜３に示されたいずれかのアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、当該配列中の６箇所のシステイン残基以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ当該配列中の６箇所のシステイン残基が保存されたアミノ酸配列、
（ｄ）下記式（Ｉ）に記載されたアミノ酸配列、
式（Ｉ）
DX1CX2GWX3X4GCDPSX5X6GX7CCX8GYX9CSYKYPWCRYX10LF
（式中、X1〜X10は、それぞれ任意のアミノ酸を表す。ただし、X1は欠失していてもよい。）
（ｅ）配列番号４〜６に示されたいずれかの塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
【請求項２】
前記（ｄ）のアミノ酸配列において、式（Ｉ）中のX1が欠失しているかTであり、X2がT,L又はGであり、X3がM又はFであり、X4がG又はSであり、X5がK又はQであり、X6がT又はKであり、X7がE又はQであり、X8がS又はEであり、X9がV又はTであり、X10がD,E又はKである、請求項１に記載の鎮痛剤。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−１２６４８５（Ｐ２０１０−１２６４８５Ａ）
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０２６２５（Ｐ２００８−３０２６２５）
【出願日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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