ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ−媒体免疫刺激の変調
【課題】ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を変調する方法を提供する。
【解決手段】Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法。免疫刺激作用の増大したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド。哺乳動物において免疫応答を誘発する医薬の製造のためのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの使用。
【解決手段】Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法。免疫刺激作用の増大したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド。哺乳動物において免疫応答を誘発する医薬の製造のためのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンス法における、および免疫刺激剤としてのオリゴヌクレオチドの治療学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは現代の分子生物学において不可欠の手段となっており、診断プローブ法から、ＰＣＲ、遺伝子発現のアンチセンス抑制に及ぶ極めて多岐にわたる技術に用いられている。このような広範なオリゴヌクレオチドの使用は、オリゴヌクレオチドを合成するための迅速、安価かつ有効な方法に対する需要の増大をもたらしている。
【０００３】
アンチセンスおよび診断への応用のためのオリゴヌクレオチドの合成は、現在、ルーチンに行うことができる。たとえば、非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３；および非特許文献４を参照。
【０００４】
初期の合成法には、ホスホジエステル化学およびホスホトリエステル化学が含まれていた。非特許文献５はオリゴヌクレオチドの合成のためのホスホジエステル化学を開示している。非特許文献６はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成のためのホスホトリエステル化学を開示している。これら初期のアプローチは、さらに有効なホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネート合成法への道を大きく切り開いた。非特許文献７はポリヌクレオチド合成におけるデオキシヌクレオシドホスホルアミダイトの使用を開示している。特許文献１は、Ｈ−ホスホネート法によるオリゴヌクレオチドの最適化合成を開示している。
【０００５】
これら現代の両アプローチは、様々な修飾ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを合成するのに用いられている。非特許文献８は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成を教示している。非特許文献９は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成を開示している。非特許文献１０は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホルアミダイトの合成を開示している。非特許文献１１は、Ｈ−ホスホネート化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホルアミダイトおよびホスホロチオエートの合成を開示している。
【０００６】
さらに最近では、何人かの研究者が疾患の治療に対するアンチセンス法の有効性を示している。非特許文献１２は、サイトメガロウイルスによって誘発されたヒトの網膜炎の治療に対するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの市場売買の承認が得られたことを開示している。残念なことに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用は当初予想されていたよりも複雑なものとなってきた。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによって引き起こされるある種の作用は、予想されるアンチセンスのメカニズムでは説明できなかった。たとえば、非特許文献１３は、「センス」のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが特定の免疫刺激を引き起こすことを教示している。この副作用や他の副作用は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの概念を複雑なものにしている。非特許文献１４は、２つのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド［一つはＨＩＶ−１からのｇａｇ遺伝子に相補的なものであり（
【化１】
（配列番号１））、他はＨＩＶ−１のｒｅｖ遺伝子に相補的なものである（
【化２】
（配列番号２））］によって媒体される免疫刺激を開示している。
【０００７】
一方、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激を誘発しうるという観察は、この副作用を治療用の手段として開発することへの関心をもたらした。これら努力は、ジヌクレオチドＣｐＧを含有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに着目している。非特許文献１５は、ＣｐＧジヌクレオチドを包含するパリンドローム含有ホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インターフェロンαおよびγの合成を誘発し、ナチュラルキラーの活性を高めうることを教示している。非特許文献１６は、ホスホロチオエートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが免疫刺激性であることを開示している。非特許文献１７は、そのようなオリゴヌクレオチドがヒトＢ細胞を活性化することを開示している。非特許文献１８は、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがインフルエンザウイルスに対する免疫応答を高めることを教示している。非特許文献１９は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが強力な免疫刺激剤として作用し、Ｂ型肝炎表面抗原に対する免疫応答を高めることを教示している。特許文献２は、ＣまたはＧの骨格の修飾がこの作用を抑制することを教示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５,１４９,７９８号明細書（AgrawalおよびZamecnik；１９９２年）
【特許文献２】米国特許第５,９６８,９０９号明細書（Agrawal）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Methods in Molecular Biology, Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs, pp.165-189（S. Agrawal編、ヒューマナ・プレス、１９９３）
【非特許文献２】Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp.87-108（F. Eckstein編、１９９１）
【非特許文献３】UhlmannおよびPeyman、上掲、AgrawalおよびIyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995)
【非特許文献４】Antisense Research and Applications（CrookeおよびLebleu編、ＣＲＣプレス、ボカ・ラトン、１９９３）
【非特許文献５】Khoranaら、J. Molec. Biol. 72: 209 (1972）
【非特許文献６】Reese、Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978)
【非特許文献７】BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)
【非特許文献８】AgrawalおよびGoodchild、Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)
【非特許文献９】Connollyら、Biochemistry 23: 3443 (1984)
【非特許文献１０】Jagerら、Biochemistry 27: 7237 (1988)
【非特許文献１１】Agrawalら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)
【非特許文献１２】Crooke、Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viii
【非特許文献１３】McIntyreら、Antisense Res. Dev. 3: 309-322 (1993)
【非特許文献１４】Zhaoら、Biochemical Pharmacology 51: 173-182 (1996)
【非特許文献１５】Kuramotoら、Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992)
【非特許文献１６】Kriegら、Nature 371: 546-549 (1995)
【非特許文献１７】Liangら、J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996)
【非特許文献１８】Moldoveanuら、Vaccine 16: 1216-124 (1998)
【非特許文献１９】McCluskieおよびDavis、The Journal of Immunology 161: 4463-4466 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これら報告は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を変調しうる必要性があることを明らかにしている。理想的には、そのような変調は、アンチセンスの応用に対しては免疫刺激作用を低減させること、および免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用を増大させることを含むものでなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を変調する方法を提供する。本発明による方法は、アンチセンスの応用に対しては免疫刺激作用を低減させること、および免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用を増大させることの両者を可能にする。それゆえ、本発明はさらに、いずれの応用に対しても免疫刺激作用の最適レベルを有するオリゴヌクレオチドおよびそのようなオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。
【００１２】
本発明者らは驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾（positional modification）が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激能に劇的な影響を及ぼすことを見出した。とりわけ、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側または３'側の特定の位置でのオリゴヌクレオチドの２'アルキル化またはアルコキシ化が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を高めるかまたは低下させる。
【００１３】
第一の側面において、本発明はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を低下させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを導入することを含み、その際、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、該オリゴヌクレオチドはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。
【００１４】
第二の側面において、本発明は、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを提供する。その際、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシドが２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではない。
【００１５】
第三の側面において、本発明は、哺乳動物において遺伝子発現をアンチセンス特異的に低減させる方法を提供し、該方法は、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドはＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。
【００１６】
第四の側面において、本発明は、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。別の態様では該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【００１７】
第五の側面において、本発明は、免疫刺激作用の増大したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００１８】
第六の側面において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法を提供する。該方法は、哺乳動物にＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではないことを特徴とする。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、アンチセンス法において、および免疫刺激剤としてのオリゴヌクレオチドの治療学的使用に関する。本明細書に引用する特許および公報は当該技術分野における知見のレベルを反映するものであり、その全体を参照のため本明細書に引用する。本明細書に引用した参照文献の教示と本明細書とで矛盾がある場合は、本発明の目的のために後者が優先する。
【００２０】
本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を変調する方法を提供する。本発明による方法は、アンチセンスの応用に対しては免疫刺激作用を低減させること、および免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用を増大させることの両者を可能にする。それゆえ、本発明はさらに、いずれの応用に対しても免疫刺激作用の最適レベルを有するオリゴヌクレオチドおよびそのようなオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。
【００２１】
本発明者らは驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激能に劇的な影響を及ぼすことを見出した。とりわけ、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側または３'側の特定の位置でのオリゴヌクレオチドの２'アルキル化またはアルコキシ化が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を高めるかまたは低下させる。
【００２２】
第一の側面において、本発明はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を低下させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを導入することを含み、その際、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、該オリゴヌクレオチドはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。好ましい態様において、この方法は遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを製造するのに用いる。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'置換ヌクレオシドを１つだけ導入する。幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチド中に２'置換ヌクレオシドを１つだけ導入する。
【００２３】
本発明の最初の３つの側面で使用する「相補的」なる語は、生理条件下でゲノム領域、遺伝子、またはそのＲＮＡ転写物にハイブリダイズする能力を意味する。そのようなハイブリダイゼーションは、通常、相補的な鎖の間で好ましくはワトソン−クリックまたはフーグスティーン型の塩基対を形成する塩基特異的な水素結合の結果であるが、他の水素結合様式および塩基スタッキングもまたハイブリダイゼーションに導くことができる。実際問題として、そのようなハイブリダイゼーションは特定の遺伝子発現の抑制を観察することにより推論できる。
【００２４】
本発明の最初の３つの側面において使用する「アンチセンス活性」なる語は、オリゴヌクレオチドを細胞または動物に導入したときに該オリゴヌクレオチドが相補的なＲＮＡの発現の低減を引き起こすことを意味する。
【００２５】
本発明のこの側面による方法は、合成プロセスでＣｐＧジヌクレオチドの導入直後のサイクルに適当な２'置換モノマーシンソン（synthon）を用いさえすれば、よく知られた合成法のいずれにおいても都合よく行うことができる。好ましいモノマーとしては、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートが挙げられる。それゆえ、本発明の目的のためには、「オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを導入する」とは、単にそのような位置に２'置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを合成することを意味する。
【００２６】
第二の側面において、本発明は、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシドが２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではない、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを提供する。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは約１２〜約５０のヌクレオチド、最も好ましくは約１２〜約３５のヌクレオチドを有するであろう。本発明のこの側面による好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。さらに好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。
【００２７】
第三の側面において、本発明は、哺乳動物において遺伝子発現をアンチセンス特異的に低減させる方法を提供し、該方法は、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドはＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。
【００２８】
本発明のこの側面による方法において、オリゴヌクレオチドの投与は好ましくは非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻内、膣内、吸入、硝子体内または直腸内でなければならない。治療組成物の投与は、知られた手順を用い、疾患の兆候が現れるのを防ぎまたは疾患のマーカーを代用する（surrogate）のに有効な投与量および期間行う。全身投与する場合には、約０.０１マイクロモル〜約１０マイクロモルのオリゴヌクレオチドの血中レベルが達成されるのに充分な投与量で治療組成物を投与するのが好ましい。局所投与の場合には、これよりもはるかに低い濃度で有効であり、はるかに高い濃度でも許容し得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドの全投与量は、患者１日当たり約０.０１ｍｇのオリゴヌクレオチドから体重１ｋｇ当たり１日あたりで約２００ｍｇのオリゴヌクレオチドの範囲であろう。
【００２９】
オリゴヌクレオチドは製剤化してもよいし、そのままであってもよい。１またはそれ以上の本発明の治療組成物の治療学的有効量を患者に単一の治療エピソードとして同時にまたは連続的に投与するのが望ましい。好ましい態様において、組成物を投与後、補体の活性化、有糸分裂生起およびトロンビンクロットの生成よりなる群から選ばれた生物学的作用を１またはそれ以上測定する。
本発明のこの側面による方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルにおいて有用であり、さらにヒト疾患の治療に有用である。
【００３０】
第四の側面において、本発明は、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、免疫刺激モチーフ（たとえば、ＣｐＧ）含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００３１】
本発明のこの側面による方法は、合成プロセスでＣｐＧジヌクレオチドの導入直後のサイクルに適当な２'置換モノマーシンソンを用いさえすれば、よく知られた合成法のいずれにおいても都合よく行うことができる。好ましいモノマーとしては、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートが挙げられる。それゆえ、本発明の目的のためには、「オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入する」とは、単にそのような位置に２'置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを合成することを意味する。
【００３２】
本発明の第四、第五および第六の側面の目的のためには、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は遺伝子または遺伝子の転写物に正確に相補的なオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが正確に相補的な該遺伝子または遺伝子の転写物の発現を低減しうるものである。
【００３３】
第五の側面において、本発明は、免疫刺激作用の増大した免疫刺激モチーフ（たとえば、ＣｐＧ）含有オリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。本発明の第四、第五および第六の側面による好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０ヌクレオチドであり、安定性を向上させるため修飾したヌクレオチド間結合、修飾した塩基または修飾した糖をさらに含んでいてよい。
【００３４】
第六の側面において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法を提供する。該方法は、哺乳動物に免疫刺激モチーフ（たとえば、ＣｐＧ）含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではないことを特徴とする。本発明のこの側面のある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００３５】
本発明のこの側面による方法において、オリゴヌクレオチドの投与は好ましくは非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻内、膣内、吸入、硝子体内または直腸内でなければならない。治療組成物の投与は、知られた手順を用い、疾患の兆候が現れるのを防ぎまたは疾患のマーカーを代用するのに有効な投与量および期間行う。全身投与する場合には、約０.０１マイクロモル〜約１０マイクロモルのオリゴヌクレオチドの血中レベルが達成されるのに充分な投与量で治療組成物を投与するのが好ましい。局所投与の場合には、これよりもはるかに低い濃度で有効であり、はるかに高い濃度でも許容し得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドの全投与量は、患者１日当たり約０.０１ｍｇのオリゴヌクレオチドから体重１ｋｇ当たり１日あたりで約２００ｍｇのオリゴヌクレオチドの範囲であろう。
【００３６】
１またはそれ以上の本発明の治療組成物の治療学的有効量を患者に単一の治療エピソードとして同時にまたは連続的に投与するのが望ましい。好ましい態様において、組成物を投与後、ＩＬ−１２の誘発および免疫細胞の有糸分裂生起よりなる群から選ばれた生物学的作用を１またはそれ以上測定する。オリゴヌクレオチドは単独または特定の抗原とともに投与してよく、該特定の抗原は該オリゴヌクレオチドに物理的に結合していても結合していなくてもよい。
本発明のこの側面による方法は、免疫系のモデル研究において有用であり、さらにヒト疾患の治療に有用である。
【００３７】
本発明のすべての側面の目的のために、「オリゴヌクレオチド」なる語は、デオキシリボヌクレオチド、または２'−ハロ−ヌクレオシド、２'−Ｏ−置換ヌクレオシド、リボヌクレオシド、デアザヌクレオシドまたはそれらの組み合わせを含む修飾ヌクレオシドを２またはそれ以上からなるポリマーを包含する。そのようなモノマーは、多数の知られたヌクレオシド間結合によって互いに結合されていてよい。ある好ましい態様において、これらヌクレオシド間結合は、非イオン結合、ホウ素結合、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオエート結合、またはホスホルアミデート結合、これらの２'−５'結合、３'−５'結合、３'−３'結合、またはこれらの組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドなる語はまた、化学的に修飾した塩基または糖を有するおよび／または脂肪親和性基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含む（これらに限られるものではない）置換基をさらに有するそのようなポリマーをも包含する。
【００３８】
本発明の目的のためには、「２'−Ｏ−置換」なる語は、ペントース残基２'位のハロゲン（好ましくは、Ｃｌ、ＢｒまたはＦ）による、または１〜６の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基による、または２〜６の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基（その際、そのようなアルキル、アリールまたはアリル基は置換されていないか、またはたとえば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルブアルコキシル、またはアミノ基で置換されていてよい）による置換を意味し、あるいはそのような２'置換は、ヒドロキシ（リボヌクレオシドを生成する）、アミノもしくはハロ基によものであってよいが、２'−Ｈ基によるものであってはならない。
【００３９】
そのようなオリゴヌクレオチドは、たとえばペプチド核酸や固定化（locked）核酸におけるように、修飾した糖（たとえば、アラビノース、ヘキソース）および他の骨格修飾を有するオリゴヌクレオチドを包含する。そのようなオリゴヌクレオチドはまた、図３に示すものを含む（これらに限られるものではない）天然に存在する塩基または修飾したへテロ環を有していてもよい。本発明のすべての側面の目的のため、「ＣｐＧ」または「ＣｐＧジヌクレオチド」なる語はジヌクレオチドの５'−シチジン−グアニジン−３'を意味し、式中のｐはヌクレオチド間結合を示し、該ジヌクレオチド中の糖骨格はデオキシリボースまたは修飾した糖またはその組み合わせである。本発明の最初の３つの側面の好ましい態様において、ｐは上記いずれかのホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、立体特異的な（ＲｐまたはＳｐ）ホスホロチオエート共有結合から選ばれる。非ホスホジエステルで非ホスホロチオエートの態様は免疫刺激作用をさらに低減させるであろう。本発明の最後の３つの側面の好ましい態様では、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選ばれる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】オリゴヌクレオチドの不在下（Ｃ）、リポ多糖の存在下（ＬＰＳ）、または種々のオリゴヌクレオチドの存在下でのマウス脾臓細胞の増殖アッセイの結果を示す。
【図２】オリゴヌクレオチドを投与しないまたは種々のオリゴヌクレオチドを投与したマウスでの脾臓肥大を示す。
【図３】修飾塩基の好ましい態様を示す。
【００４１】
下記実施例は本発明のある種の好ましい態様をさらに説明することを意図するものであって、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
実施例１
インビトロでの免疫刺激作用の変調
ＣｐＧモチーフを含有するＰＳ−オリゴの化学修飾の位置の影響を調べるため、本発明者らは２つのオリゴヌクレオチドを選んだ。オリゴ１は一つのＣｐＧモチーフを含み、オリゴ１５は２つのＣｐＧモチーフを含む。これら２つのオリゴはいずれも以前に調べられており、免疫刺激性であることが示されている。本試験においてオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を評価するため、本発明者らはマウスの脾臓細胞増殖アッセイを用いた。
【００４２】
表１：オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートおよび修飾部位
【表１】
【００４３】
マウス脾臓リンパ球を、０.１、１および１０μｇ／ｍＬの濃度のオリゴヌクレオチドとともに培養した。オリゴ１は細胞増殖に対して用量依存的な作用を誘発した。０.１μｇ／ｍＬでは増殖指標は２.８７であった（図１）。オリゴ１のＣｐＧモチーフの５'フランキングＧＡデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換すると（オリゴ２）、使用したすべての濃度で細胞増殖の完全な抑制という結果となった（図１）。０.１μｇ／ｍＬでは細胞増殖指標は培地単独の場合と同様であった。オリゴ１のＣｐＧモチーフの３'フランキングＴＴデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換すると（オリゴ６）、細胞増殖に対するそのような影響はなかった。オリゴ６の増殖指標は２.０７であった（図１）。
【００４４】
ＣｐＧモチーフからさらに離れた位置で５'フランキング領域中の２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換することが誘発細胞増殖に影響を及ぼすか否かをさらに理解するため、本発明者らはオリゴ３、４および５を合成した（表１）。置換部位とＣｐＧモチーフとの間でそれぞれ１つ、２つおよび３つのデオキシヌクレオシドだけ離れた位置にある２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換した。オリゴ３、４および５の増殖指標はそれぞれ３.４２、８.４４および１０.３８であり、これはオリゴ１と比較するとそれぞれ２９％、２９７％および４００％の増大である（図１）。オリゴ５におけるよりもさらに５'末端側の残りのデオキシヌクレオシドを置換しても増殖指標の増大は示されなかった（データは示していない）。
【００４５】
同様の置換をオリゴ１のＣｐＧモチーフの３'フランキング領域で行った。オリゴ７、８、９、１０および１１を合成したが、これらはＣｐＧモチーフと２'−ＯＭｅ置換部位との間でそれぞれ１つ、２つ、３つ、４つおよび５つのデオキシヌクレオシドだけ離れた位置にある２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換したものである。オリゴ７、８、９、１０および１１の増殖指標はそれぞれ３.６３、７.２２、７.０１、８.８５および９.２４であった。オリゴ１と比較するとオリゴ７、８、９、１０および１１の増殖指標の増大は、それぞれ３９％、２３１％、２２１％、３１７％および３３８％の増大であった。
【００４６】
これらの結果から、ＣｐＧモチーフの５'末端または３'末端のいずれかでの２つのデオキシヌクレオチドの置換（たとえば、オリゴ５または９）は免疫刺激活性を増大させることが明らかである。オリゴ５またはオリゴ９に施した置換が免疫刺激活性をさらに増大させるうえで付加的な効果を有することが可能であろうか？本発明者らは、３'末端および５'末端の両者で２つのデオキシヌクレオシドが２'−ＯＭｅで置換されたオリゴ１２を合成した。オリゴ１２はオリゴ５と比較すると増殖指標をさらに増大させることはなかったが、オリゴ９と比較すると増殖指標を増大させた。
【００４７】
オリゴ３〜５およびオリゴ７〜１１を用いた上記観察が配列特異的なものであるか一般的なものであるかを調べるため、本発明者らはオリゴ１５（２つのＣｐＧモチーフを含む）に同様の修飾を施した。オリゴ１５は０.１μｇ／ｍＬの濃度で５.８３の増殖指標を有していた。ＣｐＧモチーフと置換部位との間で２つのデオキシヌクレオシドだけ離れた位置にある、個々のＣｐＧモチーフの５'末端の２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換すると（オリゴ１６および１７）、それぞれ７.３４および７.１３の増殖指標が示されたが、これはオリゴ１５と比較すると２０％の増大にすぎない。両ＣｐＧモチーフの５'フランキング領域での２つのデオキシヌクレオシドの置換（オリゴ１８）は１０.６２の一層高い増殖指標を示したが、これはオリゴ１５と比較すると約５０％の増大である。
【００４８】
実施例２
免疫刺激活性に及ぼすヌクレアーゼ安定性の効果
部位特異的な置換に加えて、本発明者らはまた、ＣｐＧモチーフを含有するＰＳ−オリゴの代謝安定性の増大が細胞増殖の増大という結果となるか否か、およびそのような代謝安定性の増大を５'置換と組み合わせて細胞増殖活性をさらに増大させることができるか否かを調べた。オリゴ１の３'末端の４つの連続したデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換した（これはヌクレアーゼに対する安定性の有意の増大という結果となる）オリゴ１３を合成した。オリゴ１３は１１.９２という増殖指標を有していたが、これはオリゴ１と比較すると約４８０％の増大である（図１）。５'末端の２つのデオキシヌクレオシドの置換によるオリゴ１３のさらなる修飾（オリゴ１４）は、増殖指標のさらなる増大という結果とはならなかった。
【００４９】
上記のようなＰＳ−オリゴ中の修飾が免疫刺激活性を変調することを細胞培養アッセイに基づいて観察した後、本発明者らは表１に列挙したオリゴヌクレオチドをマウスに腹腔内投与して脾臓重量を測定し、置換がインビボでも同様の作用を有するか否かを確認した。オリゴ１の投与は脾臓重量の約５０％の増大を引き起こした（図２）。オリゴ２は細胞培養アッセイでは免疫刺激活性を示さなかったものであるが、脾臓重量の増大を示さなかった（図２）。ＣｐＧモチーフから５'末端側へ２つのデオキシヌクレオチドを置換したオリゴ３、４および５は脾臓重量の漸進的な増大を示し、これはオリゴ１で処置したマウスと比較してそれぞれ６７％、９５％および１５７％の増大であり（図２）、免疫刺激活性の増大が確認された。ＣｐＧモチーフの３'末端側での２つのデオキシヌクレオシドの２'−ＯＭｅによる置換は、一般に一層有意でない脾臓重量の増大をもたらした。オリゴ６および１１だけが、オリゴ１と比較して９７％および９５％の脾臓重量の増大を引き起こした。３'末端および５'末端の両者で置換を施したオリゴ１２は、オリゴ１と比較して９５％の脾臓重量の増大を示した（図２）。
【００５０】
オリゴ１５、１６、１７および１８はすべて２つのＣｐＧモチーフを含むが、５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した後に脾臓重量の増大を示した。オリゴ１５は未処置のマウスと比較して１７５％の脾臓重量の増大を引き起こした。オリゴ１６はＣｐＧモチーフの５'末端が２つとも２'−ＯＭｅで置換したものであるが、オリゴ１５と比較して９３％の脾臓重量の増大を引き起こした（図２）。オリゴ１７は一つのＣｐＧの５'末端に置換を有するものであるが（しかし、他のＣｐＧモチーフの３'末端に置換を有する）、脾臓重量のさらなる増大を示さなかった。両ＣｐＧモチーフの５'末端での置換はオリゴ１６と比較して脾臓重量のさらなる増大という結果とならなかったが、オリゴ１５と比較すると約６０％だけの増大であった（図２）。
【００５１】
オリゴ１３はオリゴ１と比較して代謝的に安定しているものであるが、オリゴ１と比較して脾臓重量の１１４％の増大を示し、細胞増殖データと一致していた。同様の結果は、代謝安定性が増大し、ＣｐＧモチーフの５'末端で置換されているオリゴ１４でも観察された（図２）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンス法における、および免疫刺激剤としてのオリゴヌクレオチドの治療学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは現代の分子生物学において不可欠の手段となっており、診断プローブ法から、ＰＣＲ、遺伝子発現のアンチセンス抑制に及ぶ極めて多岐にわたる技術に用いられている。このような広範なオリゴヌクレオチドの使用は、オリゴヌクレオチドを合成するための迅速、安価かつ有効な方法に対する需要の増大をもたらしている。
【０００３】
アンチセンスおよび診断への応用のためのオリゴヌクレオチドの合成は、現在、ルーチンに行うことができる。たとえば、非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３；および非特許文献４を参照。
【０００４】
初期の合成法には、ホスホジエステル化学およびホスホトリエステル化学が含まれていた。非特許文献５はオリゴヌクレオチドの合成のためのホスホジエステル化学を開示している。非特許文献６はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成のためのホスホトリエステル化学を開示している。これら初期のアプローチは、さらに有効なホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネート合成法への道を大きく切り開いた。非特許文献７はポリヌクレオチド合成におけるデオキシヌクレオシドホスホルアミダイトの使用を開示している。特許文献１は、Ｈ−ホスホネート法によるオリゴヌクレオチドの最適化合成を開示している。
【０００５】
これら現代の両アプローチは、様々な修飾ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを合成するのに用いられている。非特許文献８は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成を教示している。非特許文献９は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成を開示している。非特許文献１０は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホルアミダイトの合成を開示している。非特許文献１１は、Ｈ−ホスホネート化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホルアミダイトおよびホスホロチオエートの合成を開示している。
【０００６】
さらに最近では、何人かの研究者が疾患の治療に対するアンチセンス法の有効性を示している。非特許文献１２は、サイトメガロウイルスによって誘発されたヒトの網膜炎の治療に対するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの市場売買の承認が得られたことを開示している。残念なことに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用は当初予想されていたよりも複雑なものとなってきた。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによって引き起こされるある種の作用は、予想されるアンチセンスのメカニズムでは説明できなかった。たとえば、非特許文献１３は、「センス」のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが特定の免疫刺激を引き起こすことを教示している。この副作用や他の副作用は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの概念を複雑なものにしている。非特許文献１４は、２つのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド［一つはＨＩＶ−１からのｇａｇ遺伝子に相補的なものであり（
【化１】
（配列番号１））、他はＨＩＶ−１のｒｅｖ遺伝子に相補的なものである（
【化２】
（配列番号２））］によって媒体される免疫刺激を開示している。
【０００７】
一方、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激を誘発しうるという観察は、この副作用を治療用の手段として開発することへの関心をもたらした。これら努力は、ジヌクレオチドＣｐＧを含有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに着目している。非特許文献１５は、ＣｐＧジヌクレオチドを包含するパリンドローム含有ホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インターフェロンαおよびγの合成を誘発し、ナチュラルキラーの活性を高めうることを教示している。非特許文献１６は、ホスホロチオエートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが免疫刺激性であることを開示している。非特許文献１７は、そのようなオリゴヌクレオチドがヒトＢ細胞を活性化することを開示している。非特許文献１８は、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがインフルエンザウイルスに対する免疫応答を高めることを教示している。非特許文献１９は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが強力な免疫刺激剤として作用し、Ｂ型肝炎表面抗原に対する免疫応答を高めることを教示している。特許文献２は、ＣまたはＧの骨格の修飾がこの作用を抑制することを教示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５,１４９,７９８号明細書（AgrawalおよびZamecnik；１９９２年）
【特許文献２】米国特許第５,９６８,９０９号明細書（Agrawal）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Methods in Molecular Biology, Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs, pp.165-189（S. Agrawal編、ヒューマナ・プレス、１９９３）
【非特許文献２】Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp.87-108（F. Eckstein編、１９９１）
【非特許文献３】UhlmannおよびPeyman、上掲、AgrawalおよびIyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995)
【非特許文献４】Antisense Research and Applications（CrookeおよびLebleu編、ＣＲＣプレス、ボカ・ラトン、１９９３）
【非特許文献５】Khoranaら、J. Molec. Biol. 72: 209 (1972）
【非特許文献６】Reese、Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978)
【非特許文献７】BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)
【非特許文献８】AgrawalおよびGoodchild、Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)
【非特許文献９】Connollyら、Biochemistry 23: 3443 (1984)
【非特許文献１０】Jagerら、Biochemistry 27: 7237 (1988)
【非特許文献１１】Agrawalら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)
【非特許文献１２】Crooke、Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viii
【非特許文献１３】McIntyreら、Antisense Res. Dev. 3: 309-322 (1993)
【非特許文献１４】Zhaoら、Biochemical Pharmacology 51: 173-182 (1996)
【非特許文献１５】Kuramotoら、Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992)
【非特許文献１６】Kriegら、Nature 371: 546-549 (1995)
【非特許文献１７】Liangら、J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996)
【非特許文献１８】Moldoveanuら、Vaccine 16: 1216-124 (1998)
【非特許文献１９】McCluskieおよびDavis、The Journal of Immunology 161: 4463-4466 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これら報告は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を変調しうる必要性があることを明らかにしている。理想的には、そのような変調は、アンチセンスの応用に対しては免疫刺激作用を低減させること、および免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用を増大させることを含むものでなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を変調する方法を提供する。本発明による方法は、アンチセンスの応用に対しては免疫刺激作用を低減させること、および免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用を増大させることの両者を可能にする。それゆえ、本発明はさらに、いずれの応用に対しても免疫刺激作用の最適レベルを有するオリゴヌクレオチドおよびそのようなオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。
【００１２】
本発明者らは驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾（positional modification）が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激能に劇的な影響を及ぼすことを見出した。とりわけ、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側または３'側の特定の位置でのオリゴヌクレオチドの２'アルキル化またはアルコキシ化が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を高めるかまたは低下させる。
【００１３】
第一の側面において、本発明はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を低下させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを導入することを含み、その際、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、該オリゴヌクレオチドはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。
【００１４】
第二の側面において、本発明は、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを提供する。その際、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシドが２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではない。
【００１５】
第三の側面において、本発明は、哺乳動物において遺伝子発現をアンチセンス特異的に低減させる方法を提供し、該方法は、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドはＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。
【００１６】
第四の側面において、本発明は、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。別の態様では該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【００１７】
第五の側面において、本発明は、免疫刺激作用の増大したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００１８】
第六の側面において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法を提供する。該方法は、哺乳動物にＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではないことを特徴とする。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、アンチセンス法において、および免疫刺激剤としてのオリゴヌクレオチドの治療学的使用に関する。本明細書に引用する特許および公報は当該技術分野における知見のレベルを反映するものであり、その全体を参照のため本明細書に引用する。本明細書に引用した参照文献の教示と本明細書とで矛盾がある場合は、本発明の目的のために後者が優先する。
【００２０】
本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を変調する方法を提供する。本発明による方法は、アンチセンスの応用に対しては免疫刺激作用を低減させること、および免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用を増大させることの両者を可能にする。それゆえ、本発明はさらに、いずれの応用に対しても免疫刺激作用の最適レベルを有するオリゴヌクレオチドおよびそのようなオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。
【００２１】
本発明者らは驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激能に劇的な影響を及ぼすことを見出した。とりわけ、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側または３'側の特定の位置でのオリゴヌクレオチドの２'アルキル化またはアルコキシ化が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を高めるかまたは低下させる。
【００２２】
第一の側面において、本発明はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を低下させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを導入することを含み、その際、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、該オリゴヌクレオチドはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。好ましい態様において、この方法は遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを製造するのに用いる。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'置換ヌクレオシドを１つだけ導入する。幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチド中に２'置換ヌクレオシドを１つだけ導入する。
【００２３】
本発明の最初の３つの側面で使用する「相補的」なる語は、生理条件下でゲノム領域、遺伝子、またはそのＲＮＡ転写物にハイブリダイズする能力を意味する。そのようなハイブリダイゼーションは、通常、相補的な鎖の間で好ましくはワトソン−クリックまたはフーグスティーン型の塩基対を形成する塩基特異的な水素結合の結果であるが、他の水素結合様式および塩基スタッキングもまたハイブリダイゼーションに導くことができる。実際問題として、そのようなハイブリダイゼーションは特定の遺伝子発現の抑制を観察することにより推論できる。
【００２４】
本発明の最初の３つの側面において使用する「アンチセンス活性」なる語は、オリゴヌクレオチドを細胞または動物に導入したときに該オリゴヌクレオチドが相補的なＲＮＡの発現の低減を引き起こすことを意味する。
【００２５】
本発明のこの側面による方法は、合成プロセスでＣｐＧジヌクレオチドの導入直後のサイクルに適当な２'置換モノマーシンソン（synthon）を用いさえすれば、よく知られた合成法のいずれにおいても都合よく行うことができる。好ましいモノマーとしては、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートが挙げられる。それゆえ、本発明の目的のためには、「オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを導入する」とは、単にそのような位置に２'置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを合成することを意味する。
【００２６】
第二の側面において、本発明は、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシドが２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではない、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを提供する。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは約１２〜約５０のヌクレオチド、最も好ましくは約１２〜約３５のヌクレオチドを有するであろう。本発明のこの側面による好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的である。さらに好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を有する。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。
【００２７】
第三の側面において、本発明は、哺乳動物において遺伝子発現をアンチセンス特異的に低減させる方法を提供し、該方法は、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドはＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。
【００２８】
本発明のこの側面による方法において、オリゴヌクレオチドの投与は好ましくは非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻内、膣内、吸入、硝子体内または直腸内でなければならない。治療組成物の投与は、知られた手順を用い、疾患の兆候が現れるのを防ぎまたは疾患のマーカーを代用する（surrogate）のに有効な投与量および期間行う。全身投与する場合には、約０.０１マイクロモル〜約１０マイクロモルのオリゴヌクレオチドの血中レベルが達成されるのに充分な投与量で治療組成物を投与するのが好ましい。局所投与の場合には、これよりもはるかに低い濃度で有効であり、はるかに高い濃度でも許容し得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドの全投与量は、患者１日当たり約０.０１ｍｇのオリゴヌクレオチドから体重１ｋｇ当たり１日あたりで約２００ｍｇのオリゴヌクレオチドの範囲であろう。
【００２９】
オリゴヌクレオチドは製剤化してもよいし、そのままであってもよい。１またはそれ以上の本発明の治療組成物の治療学的有効量を患者に単一の治療エピソードとして同時にまたは連続的に投与するのが望ましい。好ましい態様において、組成物を投与後、補体の活性化、有糸分裂生起およびトロンビンクロットの生成よりなる群から選ばれた生物学的作用を１またはそれ以上測定する。
本発明のこの側面による方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルにおいて有用であり、さらにヒト疾患の治療に有用である。
【００３０】
第四の側面において、本発明は、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、免疫刺激モチーフ（たとえば、ＣｐＧ）含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００３１】
本発明のこの側面による方法は、合成プロセスでＣｐＧジヌクレオチドの導入直後のサイクルに適当な２'置換モノマーシンソンを用いさえすれば、よく知られた合成法のいずれにおいても都合よく行うことができる。好ましいモノマーとしては、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートが挙げられる。それゆえ、本発明の目的のためには、「オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入する」とは、単にそのような位置に２'置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを合成することを意味する。
【００３２】
本発明の第四、第五および第六の側面の目的のためには、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は遺伝子または遺伝子の転写物に正確に相補的なオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが正確に相補的な該遺伝子または遺伝子の転写物の発現を低減しうるものである。
【００３３】
第五の側面において、本発明は、免疫刺激作用の増大した免疫刺激モチーフ（たとえば、ＣｐＧ）含有オリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。本発明の第四、第五および第六の側面による好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０ヌクレオチドであり、安定性を向上させるため修飾したヌクレオチド間結合、修飾した塩基または修飾した糖をさらに含んでいてよい。
【００３４】
第六の側面において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法を提供する。該方法は、哺乳動物に免疫刺激モチーフ（たとえば、ＣｐＧ）含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではないことを特徴とする。本発明のこの側面のある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００３５】
本発明のこの側面による方法において、オリゴヌクレオチドの投与は好ましくは非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻内、膣内、吸入、硝子体内または直腸内でなければならない。治療組成物の投与は、知られた手順を用い、疾患の兆候が現れるのを防ぎまたは疾患のマーカーを代用するのに有効な投与量および期間行う。全身投与する場合には、約０.０１マイクロモル〜約１０マイクロモルのオリゴヌクレオチドの血中レベルが達成されるのに充分な投与量で治療組成物を投与するのが好ましい。局所投与の場合には、これよりもはるかに低い濃度で有効であり、はるかに高い濃度でも許容し得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドの全投与量は、患者１日当たり約０.０１ｍｇのオリゴヌクレオチドから体重１ｋｇ当たり１日あたりで約２００ｍｇのオリゴヌクレオチドの範囲であろう。
【００３６】
１またはそれ以上の本発明の治療組成物の治療学的有効量を患者に単一の治療エピソードとして同時にまたは連続的に投与するのが望ましい。好ましい態様において、組成物を投与後、ＩＬ−１２の誘発および免疫細胞の有糸分裂生起よりなる群から選ばれた生物学的作用を１またはそれ以上測定する。オリゴヌクレオチドは単独または特定の抗原とともに投与してよく、該特定の抗原は該オリゴヌクレオチドに物理的に結合していても結合していなくてもよい。
本発明のこの側面による方法は、免疫系のモデル研究において有用であり、さらにヒト疾患の治療に有用である。
【００３７】
本発明のすべての側面の目的のために、「オリゴヌクレオチド」なる語は、デオキシリボヌクレオチド、または２'−ハロ−ヌクレオシド、２'−Ｏ−置換ヌクレオシド、リボヌクレオシド、デアザヌクレオシドまたはそれらの組み合わせを含む修飾ヌクレオシドを２またはそれ以上からなるポリマーを包含する。そのようなモノマーは、多数の知られたヌクレオシド間結合によって互いに結合されていてよい。ある好ましい態様において、これらヌクレオシド間結合は、非イオン結合、ホウ素結合、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオエート結合、またはホスホルアミデート結合、これらの２'−５'結合、３'−５'結合、３'−３'結合、またはこれらの組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドなる語はまた、化学的に修飾した塩基または糖を有するおよび／または脂肪親和性基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含む（これらに限られるものではない）置換基をさらに有するそのようなポリマーをも包含する。
【００３８】
本発明の目的のためには、「２'−Ｏ−置換」なる語は、ペントース残基２'位のハロゲン（好ましくは、Ｃｌ、ＢｒまたはＦ）による、または１〜６の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基による、または２〜６の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基（その際、そのようなアルキル、アリールまたはアリル基は置換されていないか、またはたとえば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルブアルコキシル、またはアミノ基で置換されていてよい）による置換を意味し、あるいはそのような２'置換は、ヒドロキシ（リボヌクレオシドを生成する）、アミノもしくはハロ基によものであってよいが、２'−Ｈ基によるものであってはならない。
【００３９】
そのようなオリゴヌクレオチドは、たとえばペプチド核酸や固定化（locked）核酸におけるように、修飾した糖（たとえば、アラビノース、ヘキソース）および他の骨格修飾を有するオリゴヌクレオチドを包含する。そのようなオリゴヌクレオチドはまた、図３に示すものを含む（これらに限られるものではない）天然に存在する塩基または修飾したへテロ環を有していてもよい。本発明のすべての側面の目的のため、「ＣｐＧ」または「ＣｐＧジヌクレオチド」なる語はジヌクレオチドの５'−シチジン−グアニジン−３'を意味し、式中のｐはヌクレオチド間結合を示し、該ジヌクレオチド中の糖骨格はデオキシリボースまたは修飾した糖またはその組み合わせである。本発明の最初の３つの側面の好ましい態様において、ｐは上記いずれかのホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、立体特異的な（ＲｐまたはＳｐ）ホスホロチオエート共有結合から選ばれる。非ホスホジエステルで非ホスホロチオエートの態様は免疫刺激作用をさらに低減させるであろう。本発明の最後の３つの側面の好ましい態様では、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選ばれる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】オリゴヌクレオチドの不在下（Ｃ）、リポ多糖の存在下（ＬＰＳ）、または種々のオリゴヌクレオチドの存在下でのマウス脾臓細胞の増殖アッセイの結果を示す。
【図２】オリゴヌクレオチドを投与しないまたは種々のオリゴヌクレオチドを投与したマウスでの脾臓肥大を示す。
【図３】修飾塩基の好ましい態様を示す。
【００４１】
下記実施例は本発明のある種の好ましい態様をさらに説明することを意図するものであって、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
実施例１
インビトロでの免疫刺激作用の変調
ＣｐＧモチーフを含有するＰＳ−オリゴの化学修飾の位置の影響を調べるため、本発明者らは２つのオリゴヌクレオチドを選んだ。オリゴ１は一つのＣｐＧモチーフを含み、オリゴ１５は２つのＣｐＧモチーフを含む。これら２つのオリゴはいずれも以前に調べられており、免疫刺激性であることが示されている。本試験においてオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を評価するため、本発明者らはマウスの脾臓細胞増殖アッセイを用いた。
【００４２】
表１：オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートおよび修飾部位
【表１】
【００４３】
マウス脾臓リンパ球を、０.１、１および１０μｇ／ｍＬの濃度のオリゴヌクレオチドとともに培養した。オリゴ１は細胞増殖に対して用量依存的な作用を誘発した。０.１μｇ／ｍＬでは増殖指標は２.８７であった（図１）。オリゴ１のＣｐＧモチーフの５'フランキングＧＡデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換すると（オリゴ２）、使用したすべての濃度で細胞増殖の完全な抑制という結果となった（図１）。０.１μｇ／ｍＬでは細胞増殖指標は培地単独の場合と同様であった。オリゴ１のＣｐＧモチーフの３'フランキングＴＴデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換すると（オリゴ６）、細胞増殖に対するそのような影響はなかった。オリゴ６の増殖指標は２.０７であった（図１）。
【００４４】
ＣｐＧモチーフからさらに離れた位置で５'フランキング領域中の２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換することが誘発細胞増殖に影響を及ぼすか否かをさらに理解するため、本発明者らはオリゴ３、４および５を合成した（表１）。置換部位とＣｐＧモチーフとの間でそれぞれ１つ、２つおよび３つのデオキシヌクレオシドだけ離れた位置にある２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換した。オリゴ３、４および５の増殖指標はそれぞれ３.４２、８.４４および１０.３８であり、これはオリゴ１と比較するとそれぞれ２９％、２９７％および４００％の増大である（図１）。オリゴ５におけるよりもさらに５'末端側の残りのデオキシヌクレオシドを置換しても増殖指標の増大は示されなかった（データは示していない）。
【００４５】
同様の置換をオリゴ１のＣｐＧモチーフの３'フランキング領域で行った。オリゴ７、８、９、１０および１１を合成したが、これらはＣｐＧモチーフと２'−ＯＭｅ置換部位との間でそれぞれ１つ、２つ、３つ、４つおよび５つのデオキシヌクレオシドだけ離れた位置にある２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換したものである。オリゴ７、８、９、１０および１１の増殖指標はそれぞれ３.６３、７.２２、７.０１、８.８５および９.２４であった。オリゴ１と比較するとオリゴ７、８、９、１０および１１の増殖指標の増大は、それぞれ３９％、２３１％、２２１％、３１７％および３３８％の増大であった。
【００４６】
これらの結果から、ＣｐＧモチーフの５'末端または３'末端のいずれかでの２つのデオキシヌクレオチドの置換（たとえば、オリゴ５または９）は免疫刺激活性を増大させることが明らかである。オリゴ５またはオリゴ９に施した置換が免疫刺激活性をさらに増大させるうえで付加的な効果を有することが可能であろうか？本発明者らは、３'末端および５'末端の両者で２つのデオキシヌクレオシドが２'−ＯＭｅで置換されたオリゴ１２を合成した。オリゴ１２はオリゴ５と比較すると増殖指標をさらに増大させることはなかったが、オリゴ９と比較すると増殖指標を増大させた。
【００４７】
オリゴ３〜５およびオリゴ７〜１１を用いた上記観察が配列特異的なものであるか一般的なものであるかを調べるため、本発明者らはオリゴ１５（２つのＣｐＧモチーフを含む）に同様の修飾を施した。オリゴ１５は０.１μｇ／ｍＬの濃度で５.８３の増殖指標を有していた。ＣｐＧモチーフと置換部位との間で２つのデオキシヌクレオシドだけ離れた位置にある、個々のＣｐＧモチーフの５'末端の２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換すると（オリゴ１６および１７）、それぞれ７.３４および７.１３の増殖指標が示されたが、これはオリゴ１５と比較すると２０％の増大にすぎない。両ＣｐＧモチーフの５'フランキング領域での２つのデオキシヌクレオシドの置換（オリゴ１８）は１０.６２の一層高い増殖指標を示したが、これはオリゴ１５と比較すると約５０％の増大である。
【００４８】
実施例２
免疫刺激活性に及ぼすヌクレアーゼ安定性の効果
部位特異的な置換に加えて、本発明者らはまた、ＣｐＧモチーフを含有するＰＳ−オリゴの代謝安定性の増大が細胞増殖の増大という結果となるか否か、およびそのような代謝安定性の増大を５'置換と組み合わせて細胞増殖活性をさらに増大させることができるか否かを調べた。オリゴ１の３'末端の４つの連続したデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換した（これはヌクレアーゼに対する安定性の有意の増大という結果となる）オリゴ１３を合成した。オリゴ１３は１１.９２という増殖指標を有していたが、これはオリゴ１と比較すると約４８０％の増大である（図１）。５'末端の２つのデオキシヌクレオシドの置換によるオリゴ１３のさらなる修飾（オリゴ１４）は、増殖指標のさらなる増大という結果とはならなかった。
【００４９】
上記のようなＰＳ−オリゴ中の修飾が免疫刺激活性を変調することを細胞培養アッセイに基づいて観察した後、本発明者らは表１に列挙したオリゴヌクレオチドをマウスに腹腔内投与して脾臓重量を測定し、置換がインビボでも同様の作用を有するか否かを確認した。オリゴ１の投与は脾臓重量の約５０％の増大を引き起こした（図２）。オリゴ２は細胞培養アッセイでは免疫刺激活性を示さなかったものであるが、脾臓重量の増大を示さなかった（図２）。ＣｐＧモチーフから５'末端側へ２つのデオキシヌクレオチドを置換したオリゴ３、４および５は脾臓重量の漸進的な増大を示し、これはオリゴ１で処置したマウスと比較してそれぞれ６７％、９５％および１５７％の増大であり（図２）、免疫刺激活性の増大が確認された。ＣｐＧモチーフの３'末端側での２つのデオキシヌクレオシドの２'−ＯＭｅによる置換は、一般に一層有意でない脾臓重量の増大をもたらした。オリゴ６および１１だけが、オリゴ１と比較して９７％および９５％の脾臓重量の増大を引き起こした。３'末端および５'末端の両者で置換を施したオリゴ１２は、オリゴ１と比較して９５％の脾臓重量の増大を示した（図２）。
【００５０】
オリゴ１５、１６、１７および１８はすべて２つのＣｐＧモチーフを含むが、５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した後に脾臓重量の増大を示した。オリゴ１５は未処置のマウスと比較して１７５％の脾臓重量の増大を引き起こした。オリゴ１６はＣｐＧモチーフの５'末端が２つとも２'−ＯＭｅで置換したものであるが、オリゴ１５と比較して９３％の脾臓重量の増大を引き起こした（図２）。オリゴ１７は一つのＣｐＧの５'末端に置換を有するものであるが（しかし、他のＣｐＧモチーフの３'末端に置換を有する）、脾臓重量のさらなる増大を示さなかった。両ＣｐＧモチーフの５'末端での置換はオリゴ１６と比較して脾臓重量のさらなる増大という結果とならなかったが、オリゴ１５と比較すると約６０％だけの増大であった（図２）。
【００５１】
オリゴ１３はオリゴ１と比較して代謝的に安定しているものであるが、オリゴ１と比較して脾臓重量の１１４％の増大を示し、細胞増殖データと一致していた。同様の結果は、代謝安定性が増大し、ＣｐＧモチーフの５'末端で置換されているオリゴ１４でも観察された（図２）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法であって、該オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入することを含む方法。
【請求項２】
免疫刺激作用の増大したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
長さが６〜５０ヌクレオチドである、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
修飾したヌクレオチド間結合、修飾した塩基または修飾した糖をさらに含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
哺乳動物において免疫応答を誘発する医薬の製造のためのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの使用であって、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではないことを特徴とする、使用。
【請求項１】
Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法であって、該オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入することを含む方法。
【請求項２】
免疫刺激作用の増大したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
長さが６〜５０ヌクレオチドである、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
修飾したヌクレオチド間結合、修飾した塩基または修飾した糖をさらに含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
哺乳動物において免疫応答を誘発する医薬の製造のためのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの使用であって、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではないことを特徴とする、使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１９５２７（Ｐ２０１１−１９５２７Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２１２５４４（Ｐ２０１０−２１２５４４）
【出願日】平成２２年９月２２日（２０１０．９．２２）
【分割の表示】特願２００１−５１７６８９（Ｐ２００１−５１７６８９）の分割
【原出願日】平成１２年８月１４日（２０００．８．１４）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１２５４４（Ｐ２０１０−２１２５４４）
【出願日】平成２２年９月２２日（２０１０．９．２２）
【分割の表示】特願２００１−５１７６８９（Ｐ２００１−５１７６８９）の分割
【原出願日】平成１２年８月１４日（２０００．８．１４）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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