ハイスループットアッセイのための３次元組織
３次元生体人工組織を使用してアッセイを行なうことによって薬剤に対する生体人工組織の応答を検出する方法が本明細書において提供される。方法はハイスループットプラットフォームに適合可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００８年６月５日に出願された米国仮特許出願第６１／０５９，１２６号の優先権に対する利益を主張し、引用により全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究の記載］
本発明は、ＮＩＨ／ＮＣＣＡＭによって授与されたＲ４１助成金番号ＡＴ００３９８４下の政府支援を得て行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（序論）
疾患状態に加えて、正常発生の間の生細胞中の多様な生体分子を特徴づける必要性から、細胞ベースのアッセイの開発が望まれている。ハイスループットの細胞ベースのアッセイは、今や生物医学研究の基礎をなすものである。これらのアッセイは、細胞の成分およびプロセスの発見などの基礎研究ならびに薬物開発などの応用研究の両方において使用される。例えば、細胞ベースのアッセイは、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子発現、ならびに細胞内シグナル伝達および細胞間シグナル伝達などの細胞活動および細胞機能のモニタリングのために開発されている。かかるアッセイはハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニング適用のために有用である。しかしながら、検出感度またはシグナル強度が低すぎるので、多くの細胞ベースのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適合可能ではない。さらに、ハイスループットの細胞ベースのアッセイは単層の細胞に対してルーチンに行なわれ、これらのアッセイは組織中の細胞の挙動を適切に表現しない。細胞ベースのアッセイをハイスループット適用に適合させることができるように、感度の増加およびシグナル強度を増加させる必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書において、３次元組織モデルを使用するハイスループット細胞アッセイシステムおよびかかるアッセイを行なう方法を提供する。アッセイは、様々な薬剤およびストレッサーによる処理に対する組織の応答のモニタリングに有用である。３次元組織は、マルチウェルプレート中のウェル内に位置決めしたスキャフォールド上で形成される。組織はウェルの底部の上方に浮遊される。アッセイは浮遊組織上で行なわれ、アッセイのアウトプットはウェル中で測定される。
【０００５】
１つの態様において、薬剤に対する組織の応答を検出する方法が本明細書において提供される。本方法は、薬剤と生体人工組織を接触させる段階と、生体人工組織を使用してインディケーターを産生するアッセイを行う段階と、ウェル中のインディケーターのレベルを検出する段階とを含む。インディケーターのレベルは、薬剤に対する生体人工組織の応答を表す。アッセイにおいて使用される生体人工組織は細胞および細胞外マトリックスを含み、組織接着を促進する留め具なしにスキャフォールド支持体上に形成される。スキャフォールド支持体はウェルの底部の上方に位置決めされる。
【０００６】
アッセイのアウトプットは発色産物または蛍光産物であってもよく、産物の蓄積はプレートリーダーを使用して測定することができる。本発明に従うシステムで実行することができる例示的なアッセイは、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、アポトーシスアッセイ、タンパク質発現アッセイ、遺伝子発現アッセイ、酵素的アッセイ、シグナリングアッセイ（キナーゼ活性アッセイ、Ｃａ２＋シグナリングアッセイおよびＧＰＣＲシグナリングアッセイなど）、ミトコンドリア活性を評価するアッセイおよび細胞外マトリックス分解アッセイを含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本発明は、添付の図面と併用して具体的な実施形態の詳細な説明を参照することによりよく理解することができる。
【図１ａ】図１ｂ中で示される三角形スキャフォールドおよび矩形スキャフォールド（代替の形状）の使用を示すハイスループットシステムを示した図である。
【図１ｂ】再構成３次元組織が形成される支持体を提供する、直径約１ミリメートルのステンレス鋼ワイヤーで作製される三角形スキャフォールドおよび矩形スキャフォールド（代替の形状）を示した図である。
【図２ａ】スキャフォールドの複数の概観図を示す。スキャフォールドの上面図である。
【図２ｂ】スキャフォールドの複数の概観図を示す。スキャフォールドの側面図である。
【図２ｃ】スキャフォールドの複数の概観図を示す。ハイスループット適用における使用の容易性のために、複数のスキャフォールドを互いに接続する１つの手段の側面図である。
【図３】操作された典型的な３次元組織を示す写真である。
【図４】３次元組織と細胞の単層との間の差異を図示する図解である。グラフは、細胞単層の代わりに３次元組織を使用することによって実現されうる細胞ベースのアッセイシグナル強度の増加を実証する。
【図５Ａ】パルペーター（Ｐａｌｐａｔｏｒ）（商標）の写真である。システムは、温度調整プレート（ｄ）上に等尺性力変換器（ａ）、プローブバス（ｂ）およびヒドロゲル組織構築物（ＨＴＣ）ステージ（ｃ）を含む。
【図５Ｂ】ｘ−ｙ−ｚ動作ロボットアーム（添付のプローブを持つ力変換器をＨＴＣの上方に位置決めし、力測定のために組織上にプローブを低下させる）を示す写真である。
【図５Ｃ】添付の力変換器およびプローブを持つロボットアームの概略図である。
【図５Ｄ】プローブをＨＴＣの中央面の１ｍｍ上方に位置決めし（ａ）、次いでそれが最初に接触するまで低下させ（ｂ）、次いで組織を引き伸ばした（ｃ）写真である。
【図５Ｅ】ＨＴＣをへこませる間に記録された代表的な力を示すグラフである。矢印ａ、ｂおよびｃは、（Ｄ）示されるプローブ位置に関連した力測定を示す。
【図５ｆ】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＫＩ１）、サイトカラシンＤ（ＣＤ）、ロテノン（ＲＯＴ）および２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）が用量依存的にＨＴＣ収縮力を減少させたことを示すグラフである。ＨＴＣをプレコンディショニングし、次いで示されるように４つの薬物の様々な濃度により処理した。力は３時間で測定した。力測定は対照の培地で処理したＨＴＣ（Ｆc）と比較して表した。データーは、主に４重、いくつかは２重および３重の重複測定の平均および標準誤差を示す。Ｚ因子＞０．４４（#）および０．５９（*）。
【図５ｇ】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＫＩ１）、サイトカラシンＤ（ＣＤ）、ロテノン（ＲＯＴ）および２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）が用量依存的にＨＴＣ収縮力を減少させたことを示すグラフである。ＨＴＣをプレコンディショニングし、次いで示されるように４つの薬物の様々な濃度により処理した。力は２４時間で測定した。力測定は対照の培地で処理したＨＴＣ（Ｆc）と比較して表した。データーは、主に４重、いくつかは２重および３重の重複測定の平均および標準誤差を示す。Ｚ因子＞０．４４（#）および０．５９（*）。
【図５ｈ】サイトカラシンＤ処理が細胞Ｆ−アクチンを減少させたことを示すグラフである。薬物により２４時間処理したＨＴＣを固定し、アレクサ５６８コンジュゲートファロイジンにより標識した。蛍光強度をプレートリーダーで読み取り、対照の培地で処理したＨＴＣ（ｌc）と比較してプロットした。データーは、３重の重複測定の平均および標準誤差を示す。スチューデントのｔ検定によって、対照（Ｃｔｒｌ）に対して、@ｐ＜０．０２。
【図５ｉ−ｗ】培地（ｉ、ｎ、ｓ）、ＣＤ（ｊ、ｏ、ｔ）、ＲＫＩ１（ｋ、ｐ、ｕ）、ＤＮＰ（ｌ、ｑ、ｖ）およびＲＯＴ（ｍ、ｒ、ｗ）により処理されたＲＥＦ単層を示す顕微鏡写真である。処理後３時間（ｉ〜ｍ）および処理後２４時間（ｎ〜ｒ、ｓ〜ｗ）で、代表的な単層を固定し、アレクサ５６８コンジュゲートファロイジンおよびアレクサ５６８コンジュゲートＤＡＰＩで染色した。ＣＤは３時間で広範囲なアクチン解重合を引き起こした（ｊ）。ＲＫＩ１、ＤＮＰおよびＲＯＴは、限定的な効果から無効果であった。ＣＤおよびＲＯＴにより誘導される細胞毒性は、細胞縮化（ｇ、ｉおよびｊ）および二核性（ｌ）および核崩壊（ｏ）によって明らかであった。（ｇ）および（ｌ）中のスケールバーがより大きいことに注目。イメージは６３倍水浸対物レンズを使用して、ライカ（Ｌｅｉｃａ）社ＳＰ５共焦点顕微鏡上で捕捉した（スケールバー＝５０μｍ）。
【図６ａ】ＤＮＰの脱共役効果は、プレートリーダーを使用する細胞単層において定量化可能でないことを示すグラフである。平均および標準誤差が示される（ｎ＝１１）。
【図６ｂ】同じ効果は、ＨＴＣにおいて定量化可能であることを示すグラフである。平均および標準誤差が示される（ｎ＝４）。
【図６ｃ】ＤＮＰにより処理したＲＥＦ単層における顕微鏡で定量化したＴＭＲＥシグナルの代表的なトレースを示すグラフである。
【図６ｄ】図６（ｄ）は、ＤＮＰにより処理されたＨＴＣの底部細胞層における顕微鏡で定量化したＴＭＲＥシグナルの代表的なトレースを示すグラフである。ＨＴＣの細胞層からの結果（ｃ）と比較して、ＴＭＲＥシグナルにおける減少の大きさはより高かった。
【図６ｅ−ｆ】ＤＮＰの用量依存的に脱共役されたＨＴＣミトコンドリア電位を示すグラフである。ＴＭＲＥ（３０分間１００ｎＭ）をあらかじめローディングしたＨＴＣを、様々な濃度のＣＤ、ＲＫＩ１、ＤＮＰ、およびＲＯＴにより処理した。ＴＭＲＥ蛍光シグナルは、処理後３時間（ａ）および処理後２４時間（ｂ）でプレートリーダーを使用して測定した。シグナル強度は対照の培地で処理したＨＴＣ（ｌc）と比較して表した。４重（いくつかは２重または３重）の重複測定の平均および標準誤差を示す。Ｚ因子＞０．６４（#）および０．４６（*）。
【図７ａ】ＣＤおよびＲＯＴの用量依存的細胞毒性を示すグラフである。薬物で処理したＨＴＣの生存率を２４時間でＭＴＴアッセイによって決定した。フォルマザンの吸光度（生存細胞中のＭＴＴから変換された）をプレートリーダーで読み取り、対照の培地で処理したＨＴＣ（Ａc）と比較して表した。１０％ＤＭＳＯ処理を陽性対照としてこのアッセイに使用し、その値は０．１１±９×１０-3のＡ／Ａｃであった（グラフ中に示されない）。対照ｖｓ．１０％ＤＭＳＯ解析についてＺ因子＞０．８５。データーは、主に４重、いくつかの２重および３重の重複測定の平均および標準誤差を示す。
【図７ｂ】ＨＴＣスクリーニングのワークフロー概略図である。継続期間は、ＨＴＣの各々のプレートを処理するのに必要な時間量を示す。ＨＴＣを合成し、使用の前に４８時間収縮させる。網掛けの平行四辺形は、データー収集点を示す。イン・シトゥーのインディケーター（例えばＴＭＲＥ）については反復測定が可能である。終点アッセイ（例えばＭＴＴ）はＨＴＣの犠牲を必要とし、実験の終わりで実行される。
【図７ｃ−ｆ】化合物のスクリーニングに使用される表現型プロフィールを示すグラフである。生理データー（すなわち、各々の化合物について２４時間で組織力（力）、ミトコンドリア電位（Ｍｉｔ．Ｐｏｔ．）およびＭＴＴ変換（ＭＴＴ Ｃｏｎｖ．））は、最大の効果に対して正規化され（４つの化合物のうちの１つによって）、次いで一次関数または４パラメーターロジスティック関数（線）によりフィッティングさせた。１から０に減少するプロフィールは、化合物がその特異的生理に対して最大の負の効果があることを示す。表現型プロフィールは、ＲＫＩ１は最小の脱共役活性（ミトコンドリア毒性）およびＭＴＴ変換の減少（細胞毒性）を示すが組織力を効果的に減少させた（１から０に）ので、ＲＫＩ１が最適候補化合物であることを明らかに示すことによって化合物選択プロセスを単純化する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
利用可能な細胞ベースのハイスループットスクリーニングアッセイの多くの有用性は、発色インディケーターまたは蛍光インディケーターによって生成されるシグナル強度が低いために限定的である。かかるアッセイは、一般的には組織中に存在する細胞ではなく、単層培養または懸濁培養における細胞を使用する。さらに、単層細胞および懸濁細胞は、必ずしも組織の３次元環境中のインビボの細胞のように挙動しない。ここで示したアッセイおよび組織により、インビボの設定により類似する組織ベースのシステムでこれらのハイスループットアッセイを行なうことが可能になる。さらに、同じ面積の細胞単層と比較して３次元組織中に存在する細胞数が多いために、３次元組織のアッセイによりアウトプットとして生成されるシグナルは増幅される。
【０００９】
本発明は、光学的検出システム（分光測光プレートリーダーおよび蛍光プレートリーダーなど）を使用するアッセイのために細胞生理を測定する効率を改善する。これは操作された組織または生体人工組織などの組織を使用する生理プロファイリングシステムの追加の特色である。米国特許第７，４４９，３０６号中でこれまでに記載されるように、操作された組織（生体人工組織）は、９６ウェルプレートフォーマットを含む小型化されたフォーマットで構築されうる。例えば、操作された組織中で増殖する細胞（３次元組織類器官）は、細胞内活性および／または細胞外活性の生理について報せる蛍光プローブをローディングすることができる。蛍光プローブは強度の変化または発光スペクトルのシフトによって生理的状態を報せる。
【００１０】
薬剤に対する組織の応答を検出する方法が本明細書において提供される。方法は、薬剤と生体人工組織を接触させること、生体人工組織上でインディケーターを産生するアッセイを行なうこと、およびウェル中のインディケーターのレベルを検出することを含む。インディケーターのレベルは、薬剤に対する生体人工組織の応答を表す。アッセイにおいて使用される生体人工組織は細胞および細胞外マトリックスを含み、組織接着を促進する留め具なしにスキャフォールド支持体上に形成される。アッセイはハイスループットスクリーニング法に適合させることができる。
【００１１】
生体人工組織は当業者に利用可能な任意の手段を介して薬剤と接触させることができる。例えば、薬剤は生体人工組織を含有するウェルに加えることができるか、または生体人工組織形成前の細胞に対して提供することができる。あるいは、薬剤は、ウイルスベクターまたはリポソームなどのベクターによって、または受容体仲介性標的化を介して細胞と接触させることができる。
【００１２】
生体人工組織モデルは、病原菌またはベクターを含む、医薬品または可能性のある医薬品、毒素、化学物質、核酸、ペプチド、ポリペプチドおよび微生物を含むが、これらに限定されない様々なクラスの薬剤の効果を定量的および迅速に評価するために使用することができる。例えば、活性化因子として有用な薬剤はウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）；トロンビン、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンゴテンシン（ａｎｇｏｔｅｎｓｉｎ）−ＩＩ、エンドセリン−１、バソプレッシンおよびその組み合わせを含む増殖因子を含むが、これらに限定されない。阻害剤は、アンジオテンシンＩＩ受容体に対する受容体アンタゴニストを含む細胞表面受容体に結合する阻害剤、およびさらに細胞内に作用する阻害剤を含むが、これらに限定されない。本明細書において有用な阻害剤は、ゲニステイン、ハービマイシン、および細胞骨格に対して作用する薬剤を含むシグナル伝達経路を阻害するものを含むが、これらに限定されない。阻害剤は、サイトカラシンＤ、ラトランクリン（ｌａｔｒｕｎｃｌｉｎ）Ｂ、パクリトキソール（ｐａｃｌｉｔｏｘｏｌ）、ノコダゾール、カリキュリンＡ、ブタン−ジオン−モノオキシム（ＢＤＭ）およびその組み合わせも含むが、これらに限定されない。
【００１３】
生体人工組織に提供される薬剤の量は、組織モデルからの応答または組織モデルによる応答を誘発するのに効果的な量である。効果的な量は、一般的には約１ｎＭ乃至１００ｍＭに、適切には１００ｎＭ乃至１ｍＭ、より適切には５００ｎＭ乃至５００μＭの間である。
【００１４】
薬剤による処理後に、生体人工組織上でアッセイを行なうことができる。インディケーター（発色インディケーター、蛍光インディケーターまたは放射性インディケーターなど）を産生するようにデザインできる任意のアッセイは、本発明に従う３次元生体人工組織との使用に適合させることができる。細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、アポトーシスアッセイ、タンパク質発現アッセイ、遺伝子発現アッセイ、酵素的アッセイ、シグナリングアッセイ（キナーゼ活性アッセイ、Ｃａ２＋シグナリングアッセイおよびＧＰＣＲシグナリングアッセイなど）、ミトコンドリア活性を評価するアッセイ、細胞外マトリックス分解アッセイを含むが、これらに限定されないアッセイを、本明細書において記載される方法において使用することができる。細胞の単層との使用のために開発されたアッセイ（特に細胞による薬剤またはアッセイ試薬の取り込みに依存するもの）は、薬剤およびアッセイ試薬が生体人工組織内の細胞によって取り込まれることを可能にするためにより長いインキュベーション時間を必要とするだろう。アッセイ試薬濃度の調整も必要とされる。
【００１５】
最終的に、アッセイによって産生されたインディケーターのレベルが検出される。産生されたインディケーターのレベルは、アッセイのアウトプットまたはアッセイの実行からもたらされたシグナルを表す。レベルは、産生されたインディケーターの量またはインディケーターそれ自体の変化（例えば発光スペクトルの変化、または細胞による標識されたインディケーターの取り込み）に関連しうる。インディケーターのレベルは、薬剤に対する生体人工組織の応答を表す。インディケーターのレベルの検出は、選択されたインディケーターおよびアッセイに依存して、顕微鏡、光学プレートリーダーもしくは蛍光プレートリーダーまたはシンチレーターを利用することができる。顕微鏡によって検出されたシグナルの感度はプレートリーダーよりも高い。顕微鏡は光学シグナルを非常に効率的に収集するために細胞層上に集束する（検出体積は集束した小さいものである）。プレートリーダーは、光線によって照射された大量の分子を検出するために拡散した（非集束）光学ビーム（例えば非集束レーザー）を使用する。従来の細胞培養システムにおいて、プレートリーダーは、単一の細胞層からの光学シグナルを測定する。しかしながら、操作された組織中の細胞は少なくとも５〜１０層を形成し、したがってプレートリーダーは一度に非常に多数の細胞を測定することができ、少なくとも５〜１０倍増幅された光学シグナルがプレートリーダーによって検出される。図４を参照。プレートリーダーは個別の細胞上に集束させることを必要としないので、プレートリーダーはシグナルを非常に迅速に読み取ることができ、したがってプレートリーダーの使用はハイスループット適用に適切である。さらに、顕微鏡によって取り込まれたイメージのアッセイはプレートリーダーを使用して取り込まれたものよりも時間がかかる。
【００１６】
細胞生理の測定のための従来の細胞ベースのアッセイは多くの場合イメージアッセイを使用する。イメージは一般的には自動化顕微鏡によって捕捉され、イメージアッセイソフトウェアによってアッセイされる。処理および処理の効果を測定するアッセイを、数百の細胞からデーターを集めることによって評価しなければならない。単一の細胞から得られたデーターの統計的分散は大きすぎるので、任意の処理の平均効果を予測することができない。統計的に有意なデーターを得るために、最低で数百の細胞からのデーターを収集しなければならない。
【００１７】
プレートリーダーは同じ情報（例えばＣａ濃度）を得るために使用することができるが、シグナルは自動化顕微鏡によって得られたシグナルよりもずっと弱い。この問題に対する１つの解決策は、プレートリーダーによって測定される細胞数を増加させることである。細胞は操作された３次元組織中で多層を形成し、したがってプレートリーダーは同じ面積でより多くの細胞を測定することができる。
【００１８】
プレートリーダーは生細胞の動力学的特性のアッセイのための顕微鏡より優れている。本明細書において開示されるような組織構築物を使用して、シグナルが改善され測定の統計的有意性が高くなることから、細胞ベースの高含有解析に多くの小規模アッセイを適用することが可能になる。現在、一般的には顕微鏡は感度の増加のために使用されるが、本明細書において記載される方法は、プレートリーダーを細胞ベースの高含有解析のために使用することを可能にする。
【００１９】
スキャフォールド２０を表示し、フレーム２２（例えば三角形フレーム）を適切に含む、図１ａおよび１ｂについてここで言及する。再構成組織２６はスキャフォールド２０上に形成される。この図示された実施形態において、ウェル４２は、底部に向かってわずかにテーパーがかかる９６ウェルプレート４０のウェルである。スキャフォールド２０は、各々のウェル４２の底部の上方に（適切には約１ｍｍ）確実に位置決めされる。細胞および記載されるような適切な細胞培養培地を含有する未重合コラーゲン溶液をウェルの中へ注ぎ、ウェルの底部の上方３ｍｍのレベルまで充填する（図１ａ）。９６ウェルプレート４０は５％ＣＯ2３７℃でインキュベーションすることができる。インキュベーションの間に、細胞は生体人工組織２６へと自己集合し、その結果として液体を絞り出すことによってコラーゲンマトリックスを圧縮し、約１０倍まで全体積を減少させる。スキャフォールド２０なしでは、再構成組織または生体人工組織は組織培養培地中で小さな球体浮遊物へと収縮する。
【００２０】
スキャフォールド２０は、金属または非金属またはプラスチックなどの任意の非多孔性生体適合性材料で適切に作製される。実施例において、スキャフォールドはステンレス鋼で作製されていた。当業者は、スキャフォールドを産生するためにガラス、ポリプロピレンまたはポリスチレンを含むが、これらに限定されない他の材料も適切に使用できることを認識する。
【００２１】
フレーム２２は、ウェル４２の底部４３の上方に適切に支持される。フレーム２２は、テーパーがかかったウェルを持つ組織培養プレート４０の使用によってウェルの側面で支持されうる。あるいは、フレーム２２は、ウェルの側面に添付された作りつけのスキャフォールドを持つかまたはフレーム２２が留まる棚を有するウェルを持つ特にデザインされたプレート４０を使用することによって、ウェル４２の底部の上方に支持することができる。別の代替の実施形態において、スキャフォールド２０は、ウェルの底部の上方にフレームを支持するためにフレーム２２に添付された少なくとも１つの脚２４を含むことができる。フレームを支持するのに必要とされる脚２４の数はフレームの形状上に依存して様々である。図１ｂは、４本の脚を持つスキャフォールド２０を図示するが、スキャフォールドは図２中に図示されるように少ないまたは多い脚を持つようにデザインすることができる。脚２４はフレームから下に突き出してウェル４２の底部に接触することによってフレーム２２を支持するために使用することができるか、または脚２４はフレーム２２から上に突き出してウェル４２の上部４５へのスキャフォールドの固着によってスキャフォールド２０のフレームを支持することができる。例えば、脚２４は、スキャフォールド２０がウェルの上部からぶら下がることを可能にする小さなホック構造を端部に有することができる（図２（ｂ））。スキャフォールド２０のフレーム２２はウェル４２の底部の上方に適切に支持されるが、培地中に組織を浸すことができる限り正確な距離は重大ではない。適切にはフレーム２２はウェルの底部の少なくとも約０．２５ｍｍ上方にあり、より適切にはフレームはウェルの底部の少なくとも約０．５または１．０ｍｍ上方にある。
【００２２】
スキャフォールド２０は幅広いアレイ形状をとることができる。コラーゲン含有マトリックスは、図２中に図示されるように円形または矩形などの異なるスキャフォールド形状を使用して、異なる形状へと圧縮することができる。他のスキャフォールド形状（図１ｂおよび図２において示されるものなど）は、異なる幅および形状を持つ組織ストリップを産生した。円形、矩形、三角形、五角形、六角形、または他の高次多角形を含むが、これらに限定されない任意の形状のスキャフォールド２０を使用することができる。スキャフォールドは１つ以上の部材からも形成することができる。例えば、スキャフォールド２２は、それらを接続する１つまたは複数の垂直の部材ありでまたはなしで離れた間隔で配置された２つの並列部材から形成することができる（図１ｂおよび図２）。
【００２３】
本発明の実施形態に従って、細胞は、スキャフォールド（すなわち支持体、例えばワイヤーフレーム）の形状へ順応した組織モデルを形成するように自己集合する。形成において、組織は、スキャフォールドの部材に重層し、部材と間の空間に広がる。例えば、三角形スキャフォールド上で、細胞は３つの縁部の中で膜状の広がりを形成する（図１ａ中で示される）。実施例におけるスキャフォールドは約１ｍｍの断面直径を有する部材で作製されるが、スキャフォールドはより小さな断面直径またはより大きな断面直径を適切に有することができる。適切には、スキャフォールドは、約１００μｍ乃至約２ｍｍの間の断面直径を持つ１つまたは複数の部材から構成される。スキャフォールドは、一般的には組織が部材に重層して、組織が部材の周囲に形成されることを可能にする円筒状部材または管状部材からなる。スキャフォールドを含む部材は、力が加えられるときに組織の裂けを最小限にするために適切にはいくぶん丸くされる。例えば、力が加えられたときに組織が破れないよう縁部が丸くされるならば、矩形断面を持つ部材を利用することができる。部材は、非多孔性材料で適切には作製されており、約２ｍｍ未満、適切には約１ｍｍの断面直径を有する。
【００２４】
生体人工組織は、スキャフォールドを含む部材との間で、またはスキャフォールドを含む部材にわたって水平方向の断面空間に広がる膜構造を形成する。生体人工組織が広がる水平断面空間は適切には１０μｍよりも大きいが、ウェル４２が許容する程度に大きくなりえ、組織は適切には約１００μｍ乃至約５ｍｍの間、より適切には１ｍｍ乃至４ｍｍの間の空間に広がる。図３中に図示される典型的な生体人工組織は約４×４×０．８ ｍｍであり、８ｍｍ×８ｍｍの正方形チャンバー中に形成される（チャンバーの形状はサンプルの目視のために修飾した。組織はホルムアルデヒド（１０％）で固定し、はっきり目視できるようにオレンジ色素で染色した）。
【００２５】
図３は、スキャフォールド２０を含むプロトタイプのマルチウェルプレート４０を図示する。図示された実施形態において、テーブルトップＣＮＣミル（シェーライン・プロダクツ社（Ｓｈｅｒｌｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．）、ビスタ、カリフォルニア）を使用して、ポリカーボネート棒（２５×６０×１０ｍｍ）から、８ウェルプレートを機械加工した。８×８ｍｍの８つの正方形ウェル４２は、フレーム２２（直径１ｍｍ）を構成する２本のステンレス鋼棒を含有していた。２本の棒が４ｍｍ離れるように、ステンレス鋼棒の中心をウェルの底部の２ｍｍ上方およびウェルの側面から２ｍｍに置いた。顕微鏡によるイメージングを促進するために、顕微鏡カバーグラス（ナンバー１厚、フィッシャーブランド（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ））を使用し、シリコングルー（ダウ・ケミカル社（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ミッドランド、ミシガン）を使用して各々のウェルの底部をシールした。
【００２６】
ハイスループットシステムにおける使用の容易性のために、スキャフォールド２０は、マルチウェルプレートフォーマットを使用して、図２Ｃ中で図示されるような、２、４、８、１２または９６のスキャフォールドを含むが、これらに限定されないコネクター２８によってグループでともに連結することができる。スキャフォールド２０をグループでともに連結することによって、スキャフォールドは、マルチウェルプレート４０中で容易に位置決めすることができる。コネクター２８は、容易に分離できるように、例えば迅速な牽引動作が連結を破壊するように作製することができ、使用者は使用するスキャフォールドの数のカスタマイズが可能である。本明細書において記載されるスキャフォールドおよび生体人工組織システムは、６ウェル、８ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、１９２ウェルまたは３８４ウェルのプレートを含むが、これらに限定されない任意のマルチウェルプレートにおいても当業者による使用のために取り入れることができる。
【００２７】
以下の実施例中で理解されるように、多孔性支持材料、またはマジックテープ（Ｖｅｌｃｒｏ ｆａｓｔｅｎｅｒ）などの他の留め具は、使用されるワイヤーフレームの非多孔性ステンレス鋼表面への組織接着を促進するためにさえも必要とされない。コラーゲンは膜または組織ストリップの外側部でより高い程度まで圧縮され、組織が留め具の必要なしにスキャフォールド上に浮かすことを可能にした。したがって、膜のこの外側部は細胞によって生み出された応力に耐えることができ、生体人工組織がワイヤーフレームから裂けることを防止する。
【００２８】
図４中で説明されるように、本発明のいくつかの実施形態に従う生体人工組織は、現行の細胞単層の細胞ベースのアッセイよりもインビボの設定により類似した３次元組織を提供する。細胞数の増加は、特異的試験アッセイについてシグナルアウトプットの増加をもたらす。本発明は、したがって、すべての様式の細胞ベースのアッセイがハイスループットシステムにおいてうまく行える機構を提供する。さらに、他の３次元組織とは異なり、本明細書の組織は光学測定を妨害するメッシュまたはフレーム上で増殖しない。代わりに、組織はフレームに広がり、光学測定が可能である。
【００２９】
本発明のシステムは、検査のために必要とされる組織の小さなサイズのために、少量の試薬を使用するだけでなく、アッセイ手順の全体にわたって一定温度および滅菌済み条件の維持を含む組織培養条件が維持された組織の解析も可能にする。例えば、生体人工組織の汚染を避けるために、アッセイは層流フード中で行なうことができる。さらに、組織内の細胞は、数時間、数日または数週間もの過程にわたって、生体人工組織の同じセットでアッセイを数回繰り返すことができるように安定である。
【００３０】
マルチウェルプレート４０は、生体人工組織の保持のためのスキャフォールド２０を含む特別にデザインされたプレートでありえるか、または適切にはスキャフォールドを加えることができる一般的には市販で入手可能な組織培養マルチウェルプレートでありえる。１枚のプレートあたりウェルの数は変動してもよい。典型的には２乃至１０００のウェルを持つプレートは使用され、適切には５０乃至５００のウェルを持つプレートが使用される。
【００３１】
生体人工組織の形成に使用される細胞は、筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞および心臓細胞を含みうるが、これらに限定されない。生体人工組織は、細胞およびコラーゲンまたは細胞および細胞外マトリックスを含むことができる。生体人工組織の形成中に有用なコラーゲンは、タイプＩ〜ＸＩＩＩのすべてを含むコラーゲンクラス１〜４およびその組み合わせを含む。ヒドロゲルまたはマトリゲル（登録商標）などの様々なタイプの細胞外マトリックスも生体人工組織の形成において使用することができる。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態に従う再構成組織モデル中の細胞は、天然の組織および器官の条件に類似する環境中にある。したがって、この方法を使用するアッセイの結果は、動物モデルを使用して得られるものに類似した結果をもたらす。動物試験のうちのいくつかは本発明に従う組織モデルを使用して置換できることが意図される。例えば、皮膚上で作用する薬剤のいくつかの試験は人工的生組織を使用して行なうことができる。
【実施例】
【００３３】
（方法）
直径１ｍｍのステンレス鋼ワイヤーで作製した三角形フレームを、再構成組織が形成されるスキャフォールドとして用いた。ウェルは底部に向かってわずかにテーパーがかかり、フレームは、ウェルの底部の１ｍｍ上方に確実に位置決めされる（図１ａ）。細胞および適切な細胞培養培地を含有する未重合コラーゲン溶液をウェルの中へ注ぎ、底部の上方に３ｍｍのレベルまでウェルを充填した（図１ｂおよび３）。図３中の８ウェルプレートを５％ＣＯ2で３７℃でインキュベーションした。インキュベーションの間に、細胞は多孔性コラーゲンマトリックスから液体を絞り出すことによってコラーゲンマトリックスを圧縮した。ワイヤーフレームなしでは、再構成組織は組織培養培地中で小さな球体浮遊物へと収縮した。異なる形状のワイヤーフレームの利用によって、コラーゲンマトリックスはフレームの形状に対応する形状へと圧縮されることが見出された。例示的に、図１ａ中で示されるように、三角形のワイヤーフレームは３つの縁部の中で膜状の広がりを生じた。他のワイヤーフレーム形状（図１ｂ中で示されるものなどの）は、異なる幅を持つ組織ストリップを生じた。マジックテープなどの多孔性支持材料は、ワイヤーの非多孔性ステンレス鋼表面への組織接着を促進するためにさえも必要とされなかった。コラーゲンは膜またはストリップの外側部でより高い程度まで圧縮された。したがって、膜のこの外側部は細胞によって生み出された応力に耐えることができ、膜がワイヤーフレームから裂けることを防止した。
【００３４】
（細胞培養およびＨＴＣ形成）
ラット胎仔線維芽細胞（ＲＥＦ−５２）は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓ１１０５０、アトランタ・バイオロジカルズ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）社、ローレンスヴィル、ジョージア）を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＭＴ１００１３ＣＭ、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、ピッツバーグ、ペンシルバニア）中で培養された。細胞は２乃至３日ごとに継代培養した。ヒドロゲル組織構築物（ＨＴＣ）を製作するために、ＲＥＦ−５２細胞（継代４０乃至７０の間）は、１０乃至１５分間０．０５％トリプシン（ＭＴ−２５−０２５−ＣＩ、フィッシャー・サイエンティフィック社）で処理することによって培養プレートから解離した。次いで細胞を１０００ｇで１０分間遠心分離した。トリプシン溶液をデカントし、細胞沈殿を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で再懸濁した。１ｍｌあたり８×１０5細胞の最終濃度を達成するように、この細胞懸濁液をＨＴＣ組織溶液中で希釈した。ＨＴＣ組織溶液は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ、０．０２Ｎ酢酸中の１ｍｇ／ｍｌの１型コラーゲン（３５４２４９、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、サンホセ、カリフォルニア）、コラーゲン中の酸を中和するのに十分な水酸化ナトリウム、ならびにコラーゲンおよびＮａＯＨの体積を補うのに十分な５×ＤＭＥＭからなっていた。早期コラーゲン重合を防止するために、ＨＴＣ組織溶液はカスタムメイド組織モールドの中に分配するまで冷凍した（図３）。モールドは各々、２本の作りつけの水平方向の支持棒を持つ８個の分離したＨＴＣ形成ウェルを含有する。３００マイクロリットルのＨＴＣ組織溶液をこれらのモールド中の各々のウェルの中へ小分けし、次いで３７℃および５％ＣＯ2で３０分間インキュベーションした。インキュベーション期間後に、３５０ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を各々のウェルに加え、モールドをさらに４８時間インキュベーションした。この時、溶液が収縮してウェル中の支持棒に広がるＨＴＣを形成する。
【００３５】
（ＨＴＣ力測定）
パルペーター（商標）（米国特許第７，４４９，３０６号中に記載され、その全体は参照することにより本明細書に組み入れられる）を、ＨＴＣの収縮性を定量するために使用した。モールドを、パルペーター（商標）（各々のウェルの中へプローブを自動的に挿入し、個々のＨＴＣを引き伸ばす）のステージ上に配置した。プローブは、力変換器（引き伸ばしに応答してＨＴＣで誘導された抵抗力を測定し、記録のためにコンピューターへ値をエクスポートする）に接続された。カスタムマトラボ（Ｍａｔｌａｂ）アルゴリズムを使用して力データーを処理およびアッセイし、ＨＴＣ中の活性細胞力を表す数値パラメータを報せる。ＨＴＣ収縮力の安定した測定を得るために、実際の力測定の前の３回の引き伸ばしによるＨＴＣのプレコンディショニングが必要であった。後続する力測定が前の引き伸ばしの３０分以内であったならば、プレコンディショニングは必要ではなかった。処理後２４時間のＨＴＣは、力測定の前に常にプレコンディショニングした。
【００３６】
ＨＴＣのＴＭＲＥ標識およびＭＴＴアッセイ
テトラメチルローダミンのエチルエステル（ＴＭＲＥ、Ｔ−６６９、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カールズバッド、カリフォルニア）を使用してＨＴＣのミトコンドリア電位を定量した。ＨＴＣを３０分間１００ｎＭのＴＭＲＥ中でインキュベーションし、次いで６０分間フェノールレッド不含１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中でインキュベーションした。ＴＭＲＥ蛍光読み取りに対する妨害を防止するために、フェノールレッド不含培地を使用した。標識後に、ＨＴＣを３回の引き伸ばしによりプレコンディショニングし、次いでバックグラウンド力を測定した。次いでＨＴＣのＴＭＲＥシグナルをシナジーＨＴプレートリーダー（バイオテック・インストルメンツ（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社、ウィヌースキー、バーモント）で読み取った。カスタムメイドの取付板を使用してプレートリーダーのプレート保持ラック上に組織のモールドの位置決めをする。蛍光シグナルは、５４３／５９０の励起／放射フィルターセットおよび５０のゲイン設定を使用して底部から読み取った。薬物処理後に所定時間点で各々の力を測定し、続いてＴＭＲＥ蛍光強度も読み取った。
【００３７】
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムを使用してＨＴＣ中の細胞生存率を定量した。薬物暴露後の所定時間で、０．５ｍｇ／ｍｌを達成するように各々のウェルにＭＴＴを加えた。ＭＴＴを２時間ウェル中に放置し、次いで除去した。次いで細胞中で形成されるフォルマザン色素を、５００μｌの０．１Ｎ塩酸含有イソプロパノール（Ｓ７７７９５、フィッシャー・サイエンティフィック社）中で懸濁した。次いで、２００マイクロリットルのフォルマザン溶液を９６ウェルプレートのウェルの中に入れ、シナジーＨＴプレートリーダーで読み取る。５７０ｎｍおよび６５０ｎｍの吸光度を記録し、差（Ａ５７０−Ａ６５０）をフォルマザンの吸光強度として使用した。
【００３８】
（ＨＴＣ薬物処理）
すべて化学物質は、特に断りのない限り、シグマ（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、セント・ルイス、ミズーリ）からのものである。サイトカラシンＤ（ＣＤ、Ｃ８２７３）およびロテノン（ＲＯＴ、Ｒ８８７５）、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ、Ｄ１９８５０１）およびＲｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＫＩ１、５５５５５０、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社、ギブスタウン、ニュージャージー）は、保存のためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｄ４５４０）中で懸濁した。１ｍＭのＣＤ、ＲＯＴおよびＲＫＩ１のストック溶液を、フェノールレッド、ＦＢＳ、グルコースまたはピルベートなしの（−Ｆ／Ｐ／Ｇ）ＤＭＥＭ中で１００μＭ、１０μＭおよび１μＭへ連続的に希釈した。ＤＮＰはＤＭＳＯ中で１Ｍに希釈し、次いで−Ｆ／Ｇ／ＰのＤＭＥＭ中で１００ｍＭ、１０ｍＭおよび１ｍＭに希釈した。ＨＴＣプレコンディショニングおよびバックグラウンド力（すなわち薬物処理前）測定に続いて、５０μｌの適切な薬物希釈物を各々のウェルに加えて所望の処理濃度を達成する。５０マイクロリットルの−Ｆ／Ｇ／ＰのＤＭＥＭを対照ウェルに加えた。薬物添加に際して、ウェル中の培地を４回のピペッティングによって混合した。
【００３９】
ＲＥＦ−５２細胞の処理および固定
ＲＥＦ−５２細胞を１０％ＦＢＳ培地（２ｍｌ）中で３５ｍｍ培養用ディッシュ（５０，０００細胞）でプレーティングした。細胞を一晩インキュベーションし、次いで化合物により処理する。濃縮液のＣＤ、ＲＫＩ１、ＤＮＰおよびＲＯＴを−Ｆ／Ｇ／Ｐ培地中で溶解し、次いで細胞の各々のプレートの中に１０×で希釈する（２ｍｌの培地あたり２２０μｌ）。固定の２４時間前に、細胞を薬物と共にインキュベーションした。固定するために、処理した細胞を２ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｄ５６５２）で１回すすぎ、次いで１ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（シグマ）溶液（ＰＢＳ中）中で３０分間インキュベーションした。固定した細胞を２回すすぎ、次いで２ｍｌのＰＢＳ中で保存した。
【００４０】
ＲＥＦ−５２の標識およびイメージング
固定したＲＥＦ−５２細胞を、１ｍｌの０．１％トリトン（ＢＰ１５１、フィッシャー・サイエンティフィック社）溶液（ＰＢＳ中）中で１５分間インキュベーションすることによって透過性にした。透過性にした細胞は、１ｍｌのＴＢＳＴバッファーで２回すすぎ、次いで１ｍｌのＴＢＳＴ中の５％ヤギ血清で１時間ブロックした。次いで１ミリリットルの２％ヤギ血清含有ＴＢＳＴ中で１：２００に希釈したアレクサ５６８コンジュゲートファロイジン（Ａ１２３８０、インビトロゲン社）を、細胞に加えた。この染色溶液は４００ｎＭのＤＡＰＩ（Ｄ９５６４）も含有した。細胞を３０分間染色し、次いでＴＢＳＴで２回すすいだ。標識した細胞を、ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、バーリンゲーム、カリフォルニア）によりマウントし、カバースライドで覆い、次いでマニキュア液で密封した。次いでプレートをライカＳＰ５共焦点顕微鏡（ライカ・マイクロシステムス（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、バノックバーン、イリノイ）の上で裏返しにし、６３倍水浸対物レンズでイメージングした。アレクサ５６８は５４３のレーザー線を使用して励起し、ＤＡＰＩはマイタイ（ＭａｉＴａｉ）多光子レーザーを使用して励起した。
【００４１】
統計的解析
スチューデントのｔ検定を使用して対照ＨＴＣに対するＣＤ処理したＨＴＣの蛍光シグナルの減少を検定する（図１ｈ）。Ｚ因子を使用してパルペーター（図１ｆおよび１ｇ）、ＴＭＲＥ（図２ａおよび２ｂ）およびＭＴＴ（図３ａ）のアッセイのシグナル対ノイズ比を評価した。ＭＴＴアッセイにおいて、１０％ＤＭＳＯを陽性対照として使用した。
【００４２】
結果
化合物スクリーニングについて細胞力学を測定するために、我々は、小型化されたヒドロゲル組織構築物（ＨＴＣ）を製作する技術、および組織の力学的特性を定量するハイスループットスクリーニングシステム（パルペーター（商標））（図５ａ、５ｂ、５ｃ）を開発した。３次元ＨＴＣはより自然な微小環境を提供し、細胞はよりインビボの形態および生理を模倣することができる。さらに、自己支持型ＨＴＣは細胞力学の測定のための力プローブを使用して引き伸ばすことができる（図６ｄ）。このシステムを使用すると、ＨＴＣの力学的特性は、細胞標識、高度な顕微鏡検査、またはイメージアッセイなしに、定量的に測定することができる（図６ｅ）。
【００４３】
この研究において、周知の標的および生物学的効果を持つ４つの異なるクラスの化合物をＨＴＣに加え、ＨＴＣ力学に対するそれらの用量依存的効果を決定した。ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＫＩ）（Ｈ−１１５２）およびサイトカラシンＤ（ＣＤ）（アクチン重合を妨害する）によりＨＴＣを３時間および２４時間処理すると、用量依存的に組織力が減少した。（両方のＥＣ50は〜０．１μＭ、図５ｆ、３時間）。ジニトロフェノール（ＤＮＰ）（ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）の脱共役剤）も組織力を減少させたが、Ｈ−１１５２またはＣＤよりも〜１０，０００倍高い濃度であった。ロテノン（ＲＯＴ）（哺乳類細胞に対する周知の毒性効果を持つ広く使用される殺虫剤）も組織力を減少させた。水性培地中で低可溶性（〜１００μＭ）であるために、ＲＯＴ濃度をさらに増加させることができなかった。一般的には、すべての化合物の２４時間のインキュベーションは、力減少に対する効果を促進した（図５ｇ）。特に、ＤＮＰのＥＣ50は、追加の〜２０時間のインキュベーションによって１．３ｍＭから２０μＭまで低下した。しかしながら、最高濃度のＤＮＰ、ＣＤおよびＨ−１１５２は２４時間で組織力をさらに減少させず、これらの用量が３時間で最大効果を達成したことを示唆する。これらの結果は、各々の化合物が組織力を減少させることに効果的であることを実証する。
【００４４】
組織力は、細胞骨格（特にアクチンおよびミオシン）の全体性を介して維持される。化合物により処理されたＨＴＣ中のＦ（線維状）−アクチンの量を定量化するために、ＨＴＣをアレクサ５４６コンジュゲートファロイジンにより染色した。アレクサファロイジンの強度をプレートリーダーによって測定したところ、ＣＤ（２μＭ）により処理したＨＴＣ中のＦ−アクチン含有量は有意に減少した（図５ｈ）。これは、組織力のＣＤ仲介性減少がインタクトなＦ−アクチンの損失のためであるという我々の以前の報告に一致している。しかしながら、Ｈ１１５２およびＤＮＰによる力減少はＦ−アクチンの損失に関連しなかった。これらのＨＴＣ中のアレクサファロイジン標識は対照と同等だった。Ｆ−アクチンはＲＯＴ処理によっても減少したが、この結果は不十分な統計的有意性のために決定的でなかった。２μＭのＣＤにより処理したファロイジン染色細胞の顕微鏡アッセイから、早ければ３時間でＦ−アクチンが広範囲に破壊されていることが示された（図５ｊ）。２４時間までに、あまり伸展していない（図５ｏ）二核の（図５ｔ）細胞内に、短いＦ−アクチンは再分布した。
【００４５】
ＲＫＩ、ＤＮＰおよびＲＯＴはＦ−アクチン形態にめざましく影響しなかった（図５ｋ−ｍ）。ＲＫＩ処理細胞は、膜ラッフリングの限定および細胞の中央領域のファロイジン染色の減少を示した（図５ｃ）。ＤＮＰ（図５ｑ）およびＲＯＴ（図５ｒ）により２４時間処理した細胞の密集度は、対照（図５ｎ）の密集度より少なかった。ＲＯＴ処理細胞における顕著な核断片化は、アポトーシスの誘導を示した（図５ｗ）。これらのイメージにおけるこれらの形態変化は手動で見分けることができるが、自動化定量ＨＴＰ解析は高度な解析アルゴリズムを必要とする。
【００４６】
化合物が組織力を減少させる原因となる機構をさらに同定するために、ミトコンドリア電位の変化を生物学的色素テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）を使用して定量した。ＴＭＲＥは陽イオン性であり、ＭＭＰの関数としてミトコンドリア中に蓄積する。ＤＮＰ処理した９６ウェルプレート中の単層およびＨＴＣの最初の研究から、ＴＭＲＥ標識のＤＮＰ仲介性減少はプレートリーダー上の単層において検出可能でない（図６ａ）が、ＨＴＣにおいて容易に定量化可能である（図６ｂ）ことが示された。共焦点顕微鏡を使用するＴＭＲＥ蓄積に対するＤＮＰの効果のより詳しい研究から、単層およびＨＴＣの両方においてシグナル検出が改善された（図６ｃ、ｄ）。しかしながら、ＨＴＣ実験は、ＤＮＰによる用量依存的ＭＭＰ減少の検出において細胞単層実験よりも優れた感度を示した。シグナル検出の優れた感度、データーの改善されたシグナル対ノイズ比、およびＨＴＰ適用に対するプレートリーダースキャニングの適合性を考慮して、化合物のＭＭＰに対する効果の研究のためにＨＴＣを使用した。
【００４７】
３時間のＤＮＰ処理により、ＭＭＰは脱共役され、ＥＣ50は〜３４０μＭでＴＭＲＥシグナルを用量依存的に減少させた（図６ｅ）。追加の２１時間のインキュベーションは、わずかにＤＮＰの効果を促進し、ＥＣ50を〜９５μＭまでさらに減少させた（図６ｆ）。２４時間の処理によるＴＭＲＥのＥＣ50のこの３．６倍の減少は、組織力に対するＤＮＰの効果のＥＣ50の６５倍の減少よりも有意に少なかった（図５ｆ、ｇ）。この差は、ＤＮＰの迅速なＭＭＰ脱共役により細胞収縮活性の段階的な減少がもたらされることを示唆する。アクチン重合およびミオシン依存的細胞収縮はＡＴＰを必要とするので、ＭＭＰの迅速な損失はミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生を減少させ、したがって細胞収縮性を減少させることが予想される。組織力のこの時間遅延の減少は、細胞内ＡＴＰ蓄えの存在および／またはＡＴＰ産生のための解糖をアップレギュレートする細胞の能力を示す。解糖を介するＡＴＰ産生のアップレギュレーションは腫瘍細胞およびいくつかの細胞株で報告されている。ＣＤ、ＲＫＩおよびＲＯＴの処理によりミトコンドリア膜電位は減少したが、それらがＭＭＰを減少させた程度は１０〜２０％に限定された（図６ｅ、ｆ）。
【００４８】
最終的に化合物の細胞生存率に対する効果を測定するために、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を使用するアッセイを行なった。細胞において、黄色のＭＴＴはコハク酸デヒドロゲナーゼによって紫色のフォルマザンに変換され、この変化を５００〜６００ｎｍの間の光線吸光度によって定量することができ、プレートリーダーを使用して定量的に記録した。ＭＴＴアッセイによって検出されるように、３時間の処理は生存率の有意な損失をもたらさなかった（結果は示さない）。２４時間のＣＤおよびＲＯＴの処理により、ＨＴＣの生存率は用量依存的減少を示した（図７ａ）。０．２μＭおよび２μＭのＣＤ処理によりＭＴＴシグナルは４０％減少した。ＣＤ毒性の観察されたレベルは、ヒト類表皮細胞株において５〜３０μＭと報告されているＬＤ50に類似していた。より高いＲＯＴ濃度（１０μＭ）がＭＴＴシグナルを４０％減少させるために必要であった（図７ａ）。ＲＯＴ毒性のこのレベルは、ＨｅｐＧ２細胞において今までに報告された２５％毒性よりもわずかに高い。２４時間のＲＫＩおよびＤＮＰの処理はＭＴＴシグナルに影響しなかった。
【００４９】
ＨＴＣ力測定、ＴＭＲＥ定量化およびＭＭＴアッセイは同じＨＴＣサンプルで行なわれた。統合されたスクリーニングワークフロー（図７ｂ）の図解は、ＨＴＣを使用する高含量の生理的情報の獲得の効率を示す。結果を、化合物の生理的影響力を表わす表現型プロフィールのパネルとして要約した（図７ｃ〜ｆ）。ＤＮＰ、ＣＤおよびＲＫＩのすべては、ＨＴＣ力の減少に非常に効果的であった。しかしながら、ＤＮＰはミトコンドリア電位の大規模な脱共役効果を示すが（図７ｃ）、ＣＤは高毒性である（図７ｄ）。一方ＲＯＴは、ＨＴＣ力、ミトコンドリア電位および生存率に対して穏やかな負の影響を有していた（図７ｆ）。ＲＫＩは、限定的なミトコンドリア毒性および生存率毒性を持ち、０．１μＭの力減少のＥＣ50を持つ最も優れた候補化合物であると同定された。ＲＫＩが組織硬度を効果的に減少させることができる心臓保護性非毒性化合物であることが周知であるので、この結果は驚くべきことではない。さらに、ＲＫＩ薬物（ファスジル）は、アテローム性動脈硬化症および高コレステロール血症についての第ＩＩ相臨床研究を最近完了した。
【００５０】
要約すると、本発明者は、組織収縮力を減少させることができ、さらにミトコンドリア機能および細胞生存率に対して最小効果を有する化合物についてスクリーニングするために、どのようにＨＴＣを使用することができるか実証した。このＨＴＣベースのスクリーニングシステムにより、２次元培養と比較してより自然な微小環境（すなわち、３次元マトリックス構造中に包埋された）内で細胞生理学を研究し、力学的力を定量することができる。
【００５１】
さらに、ＨＴＣ中の細胞のコンパクトで多層の配列は、検出限界および蛍光アッセイのシグナル対ノイズ比を大幅に増加させた。０．４４乃至０．８５にわたるＺ因子であり、アッセイが高精度およびロバスト性があるので、既存のＨＴＰスクリーニングワークフローへとＨＴＣを組み入れことが促進されるだろう。
【００５２】
要約すると、本発明者は、細胞ベースのアッセイを行なうために３次元組織モデルを利用するハイスループットシステムを提供する。前述の説明は本発明の原理の例証に過ぎないと見なされる。さらに、当業者であれば多数の修正および変形形態を容易に考えつくことができるので、本発明は、図示され記載された厳密な構成および方法に限定されるものではなく、したがって、すべての修正および均等物は本発明の範囲以内にあると考えられる。
【図２】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００８年６月５日に出願された米国仮特許出願第６１／０５９，１２６号の優先権に対する利益を主張し、引用により全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究の記載］
本発明は、ＮＩＨ／ＮＣＣＡＭによって授与されたＲ４１助成金番号ＡＴ００３９８４下の政府支援を得て行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（序論）
疾患状態に加えて、正常発生の間の生細胞中の多様な生体分子を特徴づける必要性から、細胞ベースのアッセイの開発が望まれている。ハイスループットの細胞ベースのアッセイは、今や生物医学研究の基礎をなすものである。これらのアッセイは、細胞の成分およびプロセスの発見などの基礎研究ならびに薬物開発などの応用研究の両方において使用される。例えば、細胞ベースのアッセイは、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子発現、ならびに細胞内シグナル伝達および細胞間シグナル伝達などの細胞活動および細胞機能のモニタリングのために開発されている。かかるアッセイはハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニング適用のために有用である。しかしながら、検出感度またはシグナル強度が低すぎるので、多くの細胞ベースのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適合可能ではない。さらに、ハイスループットの細胞ベースのアッセイは単層の細胞に対してルーチンに行なわれ、これらのアッセイは組織中の細胞の挙動を適切に表現しない。細胞ベースのアッセイをハイスループット適用に適合させることができるように、感度の増加およびシグナル強度を増加させる必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書において、３次元組織モデルを使用するハイスループット細胞アッセイシステムおよびかかるアッセイを行なう方法を提供する。アッセイは、様々な薬剤およびストレッサーによる処理に対する組織の応答のモニタリングに有用である。３次元組織は、マルチウェルプレート中のウェル内に位置決めしたスキャフォールド上で形成される。組織はウェルの底部の上方に浮遊される。アッセイは浮遊組織上で行なわれ、アッセイのアウトプットはウェル中で測定される。
【０００５】
１つの態様において、薬剤に対する組織の応答を検出する方法が本明細書において提供される。本方法は、薬剤と生体人工組織を接触させる段階と、生体人工組織を使用してインディケーターを産生するアッセイを行う段階と、ウェル中のインディケーターのレベルを検出する段階とを含む。インディケーターのレベルは、薬剤に対する生体人工組織の応答を表す。アッセイにおいて使用される生体人工組織は細胞および細胞外マトリックスを含み、組織接着を促進する留め具なしにスキャフォールド支持体上に形成される。スキャフォールド支持体はウェルの底部の上方に位置決めされる。
【０００６】
アッセイのアウトプットは発色産物または蛍光産物であってもよく、産物の蓄積はプレートリーダーを使用して測定することができる。本発明に従うシステムで実行することができる例示的なアッセイは、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、アポトーシスアッセイ、タンパク質発現アッセイ、遺伝子発現アッセイ、酵素的アッセイ、シグナリングアッセイ（キナーゼ活性アッセイ、Ｃａ２＋シグナリングアッセイおよびＧＰＣＲシグナリングアッセイなど）、ミトコンドリア活性を評価するアッセイおよび細胞外マトリックス分解アッセイを含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本発明は、添付の図面と併用して具体的な実施形態の詳細な説明を参照することによりよく理解することができる。
【図１ａ】図１ｂ中で示される三角形スキャフォールドおよび矩形スキャフォールド（代替の形状）の使用を示すハイスループットシステムを示した図である。
【図１ｂ】再構成３次元組織が形成される支持体を提供する、直径約１ミリメートルのステンレス鋼ワイヤーで作製される三角形スキャフォールドおよび矩形スキャフォールド（代替の形状）を示した図である。
【図２ａ】スキャフォールドの複数の概観図を示す。スキャフォールドの上面図である。
【図２ｂ】スキャフォールドの複数の概観図を示す。スキャフォールドの側面図である。
【図２ｃ】スキャフォールドの複数の概観図を示す。ハイスループット適用における使用の容易性のために、複数のスキャフォールドを互いに接続する１つの手段の側面図である。
【図３】操作された典型的な３次元組織を示す写真である。
【図４】３次元組織と細胞の単層との間の差異を図示する図解である。グラフは、細胞単層の代わりに３次元組織を使用することによって実現されうる細胞ベースのアッセイシグナル強度の増加を実証する。
【図５Ａ】パルペーター（Ｐａｌｐａｔｏｒ）（商標）の写真である。システムは、温度調整プレート（ｄ）上に等尺性力変換器（ａ）、プローブバス（ｂ）およびヒドロゲル組織構築物（ＨＴＣ）ステージ（ｃ）を含む。
【図５Ｂ】ｘ−ｙ−ｚ動作ロボットアーム（添付のプローブを持つ力変換器をＨＴＣの上方に位置決めし、力測定のために組織上にプローブを低下させる）を示す写真である。
【図５Ｃ】添付の力変換器およびプローブを持つロボットアームの概略図である。
【図５Ｄ】プローブをＨＴＣの中央面の１ｍｍ上方に位置決めし（ａ）、次いでそれが最初に接触するまで低下させ（ｂ）、次いで組織を引き伸ばした（ｃ）写真である。
【図５Ｅ】ＨＴＣをへこませる間に記録された代表的な力を示すグラフである。矢印ａ、ｂおよびｃは、（Ｄ）示されるプローブ位置に関連した力測定を示す。
【図５ｆ】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＫＩ１）、サイトカラシンＤ（ＣＤ）、ロテノン（ＲＯＴ）および２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）が用量依存的にＨＴＣ収縮力を減少させたことを示すグラフである。ＨＴＣをプレコンディショニングし、次いで示されるように４つの薬物の様々な濃度により処理した。力は３時間で測定した。力測定は対照の培地で処理したＨＴＣ（Ｆc）と比較して表した。データーは、主に４重、いくつかは２重および３重の重複測定の平均および標準誤差を示す。Ｚ因子＞０．４４（#）および０．５９（*）。
【図５ｇ】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＫＩ１）、サイトカラシンＤ（ＣＤ）、ロテノン（ＲＯＴ）および２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）が用量依存的にＨＴＣ収縮力を減少させたことを示すグラフである。ＨＴＣをプレコンディショニングし、次いで示されるように４つの薬物の様々な濃度により処理した。力は２４時間で測定した。力測定は対照の培地で処理したＨＴＣ（Ｆc）と比較して表した。データーは、主に４重、いくつかは２重および３重の重複測定の平均および標準誤差を示す。Ｚ因子＞０．４４（#）および０．５９（*）。
【図５ｈ】サイトカラシンＤ処理が細胞Ｆ−アクチンを減少させたことを示すグラフである。薬物により２４時間処理したＨＴＣを固定し、アレクサ５６８コンジュゲートファロイジンにより標識した。蛍光強度をプレートリーダーで読み取り、対照の培地で処理したＨＴＣ（ｌc）と比較してプロットした。データーは、３重の重複測定の平均および標準誤差を示す。スチューデントのｔ検定によって、対照（Ｃｔｒｌ）に対して、@ｐ＜０．０２。
【図５ｉ−ｗ】培地（ｉ、ｎ、ｓ）、ＣＤ（ｊ、ｏ、ｔ）、ＲＫＩ１（ｋ、ｐ、ｕ）、ＤＮＰ（ｌ、ｑ、ｖ）およびＲＯＴ（ｍ、ｒ、ｗ）により処理されたＲＥＦ単層を示す顕微鏡写真である。処理後３時間（ｉ〜ｍ）および処理後２４時間（ｎ〜ｒ、ｓ〜ｗ）で、代表的な単層を固定し、アレクサ５６８コンジュゲートファロイジンおよびアレクサ５６８コンジュゲートＤＡＰＩで染色した。ＣＤは３時間で広範囲なアクチン解重合を引き起こした（ｊ）。ＲＫＩ１、ＤＮＰおよびＲＯＴは、限定的な効果から無効果であった。ＣＤおよびＲＯＴにより誘導される細胞毒性は、細胞縮化（ｇ、ｉおよびｊ）および二核性（ｌ）および核崩壊（ｏ）によって明らかであった。（ｇ）および（ｌ）中のスケールバーがより大きいことに注目。イメージは６３倍水浸対物レンズを使用して、ライカ（Ｌｅｉｃａ）社ＳＰ５共焦点顕微鏡上で捕捉した（スケールバー＝５０μｍ）。
【図６ａ】ＤＮＰの脱共役効果は、プレートリーダーを使用する細胞単層において定量化可能でないことを示すグラフである。平均および標準誤差が示される（ｎ＝１１）。
【図６ｂ】同じ効果は、ＨＴＣにおいて定量化可能であることを示すグラフである。平均および標準誤差が示される（ｎ＝４）。
【図６ｃ】ＤＮＰにより処理したＲＥＦ単層における顕微鏡で定量化したＴＭＲＥシグナルの代表的なトレースを示すグラフである。
【図６ｄ】図６（ｄ）は、ＤＮＰにより処理されたＨＴＣの底部細胞層における顕微鏡で定量化したＴＭＲＥシグナルの代表的なトレースを示すグラフである。ＨＴＣの細胞層からの結果（ｃ）と比較して、ＴＭＲＥシグナルにおける減少の大きさはより高かった。
【図６ｅ−ｆ】ＤＮＰの用量依存的に脱共役されたＨＴＣミトコンドリア電位を示すグラフである。ＴＭＲＥ（３０分間１００ｎＭ）をあらかじめローディングしたＨＴＣを、様々な濃度のＣＤ、ＲＫＩ１、ＤＮＰ、およびＲＯＴにより処理した。ＴＭＲＥ蛍光シグナルは、処理後３時間（ａ）および処理後２４時間（ｂ）でプレートリーダーを使用して測定した。シグナル強度は対照の培地で処理したＨＴＣ（ｌc）と比較して表した。４重（いくつかは２重または３重）の重複測定の平均および標準誤差を示す。Ｚ因子＞０．６４（#）および０．４６（*）。
【図７ａ】ＣＤおよびＲＯＴの用量依存的細胞毒性を示すグラフである。薬物で処理したＨＴＣの生存率を２４時間でＭＴＴアッセイによって決定した。フォルマザンの吸光度（生存細胞中のＭＴＴから変換された）をプレートリーダーで読み取り、対照の培地で処理したＨＴＣ（Ａc）と比較して表した。１０％ＤＭＳＯ処理を陽性対照としてこのアッセイに使用し、その値は０．１１±９×１０-3のＡ／Ａｃであった（グラフ中に示されない）。対照ｖｓ．１０％ＤＭＳＯ解析についてＺ因子＞０．８５。データーは、主に４重、いくつかの２重および３重の重複測定の平均および標準誤差を示す。
【図７ｂ】ＨＴＣスクリーニングのワークフロー概略図である。継続期間は、ＨＴＣの各々のプレートを処理するのに必要な時間量を示す。ＨＴＣを合成し、使用の前に４８時間収縮させる。網掛けの平行四辺形は、データー収集点を示す。イン・シトゥーのインディケーター（例えばＴＭＲＥ）については反復測定が可能である。終点アッセイ（例えばＭＴＴ）はＨＴＣの犠牲を必要とし、実験の終わりで実行される。
【図７ｃ−ｆ】化合物のスクリーニングに使用される表現型プロフィールを示すグラフである。生理データー（すなわち、各々の化合物について２４時間で組織力（力）、ミトコンドリア電位（Ｍｉｔ．Ｐｏｔ．）およびＭＴＴ変換（ＭＴＴ Ｃｏｎｖ．））は、最大の効果に対して正規化され（４つの化合物のうちの１つによって）、次いで一次関数または４パラメーターロジスティック関数（線）によりフィッティングさせた。１から０に減少するプロフィールは、化合物がその特異的生理に対して最大の負の効果があることを示す。表現型プロフィールは、ＲＫＩ１は最小の脱共役活性（ミトコンドリア毒性）およびＭＴＴ変換の減少（細胞毒性）を示すが組織力を効果的に減少させた（１から０に）ので、ＲＫＩ１が最適候補化合物であることを明らかに示すことによって化合物選択プロセスを単純化する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
利用可能な細胞ベースのハイスループットスクリーニングアッセイの多くの有用性は、発色インディケーターまたは蛍光インディケーターによって生成されるシグナル強度が低いために限定的である。かかるアッセイは、一般的には組織中に存在する細胞ではなく、単層培養または懸濁培養における細胞を使用する。さらに、単層細胞および懸濁細胞は、必ずしも組織の３次元環境中のインビボの細胞のように挙動しない。ここで示したアッセイおよび組織により、インビボの設定により類似する組織ベースのシステムでこれらのハイスループットアッセイを行なうことが可能になる。さらに、同じ面積の細胞単層と比較して３次元組織中に存在する細胞数が多いために、３次元組織のアッセイによりアウトプットとして生成されるシグナルは増幅される。
【０００９】
本発明は、光学的検出システム（分光測光プレートリーダーおよび蛍光プレートリーダーなど）を使用するアッセイのために細胞生理を測定する効率を改善する。これは操作された組織または生体人工組織などの組織を使用する生理プロファイリングシステムの追加の特色である。米国特許第７，４４９，３０６号中でこれまでに記載されるように、操作された組織（生体人工組織）は、９６ウェルプレートフォーマットを含む小型化されたフォーマットで構築されうる。例えば、操作された組織中で増殖する細胞（３次元組織類器官）は、細胞内活性および／または細胞外活性の生理について報せる蛍光プローブをローディングすることができる。蛍光プローブは強度の変化または発光スペクトルのシフトによって生理的状態を報せる。
【００１０】
薬剤に対する組織の応答を検出する方法が本明細書において提供される。方法は、薬剤と生体人工組織を接触させること、生体人工組織上でインディケーターを産生するアッセイを行なうこと、およびウェル中のインディケーターのレベルを検出することを含む。インディケーターのレベルは、薬剤に対する生体人工組織の応答を表す。アッセイにおいて使用される生体人工組織は細胞および細胞外マトリックスを含み、組織接着を促進する留め具なしにスキャフォールド支持体上に形成される。アッセイはハイスループットスクリーニング法に適合させることができる。
【００１１】
生体人工組織は当業者に利用可能な任意の手段を介して薬剤と接触させることができる。例えば、薬剤は生体人工組織を含有するウェルに加えることができるか、または生体人工組織形成前の細胞に対して提供することができる。あるいは、薬剤は、ウイルスベクターまたはリポソームなどのベクターによって、または受容体仲介性標的化を介して細胞と接触させることができる。
【００１２】
生体人工組織モデルは、病原菌またはベクターを含む、医薬品または可能性のある医薬品、毒素、化学物質、核酸、ペプチド、ポリペプチドおよび微生物を含むが、これらに限定されない様々なクラスの薬剤の効果を定量的および迅速に評価するために使用することができる。例えば、活性化因子として有用な薬剤はウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）；トロンビン、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンゴテンシン（ａｎｇｏｔｅｎｓｉｎ）−ＩＩ、エンドセリン−１、バソプレッシンおよびその組み合わせを含む増殖因子を含むが、これらに限定されない。阻害剤は、アンジオテンシンＩＩ受容体に対する受容体アンタゴニストを含む細胞表面受容体に結合する阻害剤、およびさらに細胞内に作用する阻害剤を含むが、これらに限定されない。本明細書において有用な阻害剤は、ゲニステイン、ハービマイシン、および細胞骨格に対して作用する薬剤を含むシグナル伝達経路を阻害するものを含むが、これらに限定されない。阻害剤は、サイトカラシンＤ、ラトランクリン（ｌａｔｒｕｎｃｌｉｎ）Ｂ、パクリトキソール（ｐａｃｌｉｔｏｘｏｌ）、ノコダゾール、カリキュリンＡ、ブタン−ジオン−モノオキシム（ＢＤＭ）およびその組み合わせも含むが、これらに限定されない。
【００１３】
生体人工組織に提供される薬剤の量は、組織モデルからの応答または組織モデルによる応答を誘発するのに効果的な量である。効果的な量は、一般的には約１ｎＭ乃至１００ｍＭに、適切には１００ｎＭ乃至１ｍＭ、より適切には５００ｎＭ乃至５００μＭの間である。
【００１４】
薬剤による処理後に、生体人工組織上でアッセイを行なうことができる。インディケーター（発色インディケーター、蛍光インディケーターまたは放射性インディケーターなど）を産生するようにデザインできる任意のアッセイは、本発明に従う３次元生体人工組織との使用に適合させることができる。細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、アポトーシスアッセイ、タンパク質発現アッセイ、遺伝子発現アッセイ、酵素的アッセイ、シグナリングアッセイ（キナーゼ活性アッセイ、Ｃａ２＋シグナリングアッセイおよびＧＰＣＲシグナリングアッセイなど）、ミトコンドリア活性を評価するアッセイ、細胞外マトリックス分解アッセイを含むが、これらに限定されないアッセイを、本明細書において記載される方法において使用することができる。細胞の単層との使用のために開発されたアッセイ（特に細胞による薬剤またはアッセイ試薬の取り込みに依存するもの）は、薬剤およびアッセイ試薬が生体人工組織内の細胞によって取り込まれることを可能にするためにより長いインキュベーション時間を必要とするだろう。アッセイ試薬濃度の調整も必要とされる。
【００１５】
最終的に、アッセイによって産生されたインディケーターのレベルが検出される。産生されたインディケーターのレベルは、アッセイのアウトプットまたはアッセイの実行からもたらされたシグナルを表す。レベルは、産生されたインディケーターの量またはインディケーターそれ自体の変化（例えば発光スペクトルの変化、または細胞による標識されたインディケーターの取り込み）に関連しうる。インディケーターのレベルは、薬剤に対する生体人工組織の応答を表す。インディケーターのレベルの検出は、選択されたインディケーターおよびアッセイに依存して、顕微鏡、光学プレートリーダーもしくは蛍光プレートリーダーまたはシンチレーターを利用することができる。顕微鏡によって検出されたシグナルの感度はプレートリーダーよりも高い。顕微鏡は光学シグナルを非常に効率的に収集するために細胞層上に集束する（検出体積は集束した小さいものである）。プレートリーダーは、光線によって照射された大量の分子を検出するために拡散した（非集束）光学ビーム（例えば非集束レーザー）を使用する。従来の細胞培養システムにおいて、プレートリーダーは、単一の細胞層からの光学シグナルを測定する。しかしながら、操作された組織中の細胞は少なくとも５〜１０層を形成し、したがってプレートリーダーは一度に非常に多数の細胞を測定することができ、少なくとも５〜１０倍増幅された光学シグナルがプレートリーダーによって検出される。図４を参照。プレートリーダーは個別の細胞上に集束させることを必要としないので、プレートリーダーはシグナルを非常に迅速に読み取ることができ、したがってプレートリーダーの使用はハイスループット適用に適切である。さらに、顕微鏡によって取り込まれたイメージのアッセイはプレートリーダーを使用して取り込まれたものよりも時間がかかる。
【００１６】
細胞生理の測定のための従来の細胞ベースのアッセイは多くの場合イメージアッセイを使用する。イメージは一般的には自動化顕微鏡によって捕捉され、イメージアッセイソフトウェアによってアッセイされる。処理および処理の効果を測定するアッセイを、数百の細胞からデーターを集めることによって評価しなければならない。単一の細胞から得られたデーターの統計的分散は大きすぎるので、任意の処理の平均効果を予測することができない。統計的に有意なデーターを得るために、最低で数百の細胞からのデーターを収集しなければならない。
【００１７】
プレートリーダーは同じ情報（例えばＣａ濃度）を得るために使用することができるが、シグナルは自動化顕微鏡によって得られたシグナルよりもずっと弱い。この問題に対する１つの解決策は、プレートリーダーによって測定される細胞数を増加させることである。細胞は操作された３次元組織中で多層を形成し、したがってプレートリーダーは同じ面積でより多くの細胞を測定することができる。
【００１８】
プレートリーダーは生細胞の動力学的特性のアッセイのための顕微鏡より優れている。本明細書において開示されるような組織構築物を使用して、シグナルが改善され測定の統計的有意性が高くなることから、細胞ベースの高含有解析に多くの小規模アッセイを適用することが可能になる。現在、一般的には顕微鏡は感度の増加のために使用されるが、本明細書において記載される方法は、プレートリーダーを細胞ベースの高含有解析のために使用することを可能にする。
【００１９】
スキャフォールド２０を表示し、フレーム２２（例えば三角形フレーム）を適切に含む、図１ａおよび１ｂについてここで言及する。再構成組織２６はスキャフォールド２０上に形成される。この図示された実施形態において、ウェル４２は、底部に向かってわずかにテーパーがかかる９６ウェルプレート４０のウェルである。スキャフォールド２０は、各々のウェル４２の底部の上方に（適切には約１ｍｍ）確実に位置決めされる。細胞および記載されるような適切な細胞培養培地を含有する未重合コラーゲン溶液をウェルの中へ注ぎ、ウェルの底部の上方３ｍｍのレベルまで充填する（図１ａ）。９６ウェルプレート４０は５％ＣＯ2３７℃でインキュベーションすることができる。インキュベーションの間に、細胞は生体人工組織２６へと自己集合し、その結果として液体を絞り出すことによってコラーゲンマトリックスを圧縮し、約１０倍まで全体積を減少させる。スキャフォールド２０なしでは、再構成組織または生体人工組織は組織培養培地中で小さな球体浮遊物へと収縮する。
【００２０】
スキャフォールド２０は、金属または非金属またはプラスチックなどの任意の非多孔性生体適合性材料で適切に作製される。実施例において、スキャフォールドはステンレス鋼で作製されていた。当業者は、スキャフォールドを産生するためにガラス、ポリプロピレンまたはポリスチレンを含むが、これらに限定されない他の材料も適切に使用できることを認識する。
【００２１】
フレーム２２は、ウェル４２の底部４３の上方に適切に支持される。フレーム２２は、テーパーがかかったウェルを持つ組織培養プレート４０の使用によってウェルの側面で支持されうる。あるいは、フレーム２２は、ウェルの側面に添付された作りつけのスキャフォールドを持つかまたはフレーム２２が留まる棚を有するウェルを持つ特にデザインされたプレート４０を使用することによって、ウェル４２の底部の上方に支持することができる。別の代替の実施形態において、スキャフォールド２０は、ウェルの底部の上方にフレームを支持するためにフレーム２２に添付された少なくとも１つの脚２４を含むことができる。フレームを支持するのに必要とされる脚２４の数はフレームの形状上に依存して様々である。図１ｂは、４本の脚を持つスキャフォールド２０を図示するが、スキャフォールドは図２中に図示されるように少ないまたは多い脚を持つようにデザインすることができる。脚２４はフレームから下に突き出してウェル４２の底部に接触することによってフレーム２２を支持するために使用することができるか、または脚２４はフレーム２２から上に突き出してウェル４２の上部４５へのスキャフォールドの固着によってスキャフォールド２０のフレームを支持することができる。例えば、脚２４は、スキャフォールド２０がウェルの上部からぶら下がることを可能にする小さなホック構造を端部に有することができる（図２（ｂ））。スキャフォールド２０のフレーム２２はウェル４２の底部の上方に適切に支持されるが、培地中に組織を浸すことができる限り正確な距離は重大ではない。適切にはフレーム２２はウェルの底部の少なくとも約０．２５ｍｍ上方にあり、より適切にはフレームはウェルの底部の少なくとも約０．５または１．０ｍｍ上方にある。
【００２２】
スキャフォールド２０は幅広いアレイ形状をとることができる。コラーゲン含有マトリックスは、図２中に図示されるように円形または矩形などの異なるスキャフォールド形状を使用して、異なる形状へと圧縮することができる。他のスキャフォールド形状（図１ｂおよび図２において示されるものなど）は、異なる幅および形状を持つ組織ストリップを産生した。円形、矩形、三角形、五角形、六角形、または他の高次多角形を含むが、これらに限定されない任意の形状のスキャフォールド２０を使用することができる。スキャフォールドは１つ以上の部材からも形成することができる。例えば、スキャフォールド２２は、それらを接続する１つまたは複数の垂直の部材ありでまたはなしで離れた間隔で配置された２つの並列部材から形成することができる（図１ｂおよび図２）。
【００２３】
本発明の実施形態に従って、細胞は、スキャフォールド（すなわち支持体、例えばワイヤーフレーム）の形状へ順応した組織モデルを形成するように自己集合する。形成において、組織は、スキャフォールドの部材に重層し、部材と間の空間に広がる。例えば、三角形スキャフォールド上で、細胞は３つの縁部の中で膜状の広がりを形成する（図１ａ中で示される）。実施例におけるスキャフォールドは約１ｍｍの断面直径を有する部材で作製されるが、スキャフォールドはより小さな断面直径またはより大きな断面直径を適切に有することができる。適切には、スキャフォールドは、約１００μｍ乃至約２ｍｍの間の断面直径を持つ１つまたは複数の部材から構成される。スキャフォールドは、一般的には組織が部材に重層して、組織が部材の周囲に形成されることを可能にする円筒状部材または管状部材からなる。スキャフォールドを含む部材は、力が加えられるときに組織の裂けを最小限にするために適切にはいくぶん丸くされる。例えば、力が加えられたときに組織が破れないよう縁部が丸くされるならば、矩形断面を持つ部材を利用することができる。部材は、非多孔性材料で適切には作製されており、約２ｍｍ未満、適切には約１ｍｍの断面直径を有する。
【００２４】
生体人工組織は、スキャフォールドを含む部材との間で、またはスキャフォールドを含む部材にわたって水平方向の断面空間に広がる膜構造を形成する。生体人工組織が広がる水平断面空間は適切には１０μｍよりも大きいが、ウェル４２が許容する程度に大きくなりえ、組織は適切には約１００μｍ乃至約５ｍｍの間、より適切には１ｍｍ乃至４ｍｍの間の空間に広がる。図３中に図示される典型的な生体人工組織は約４×４×０．８ ｍｍであり、８ｍｍ×８ｍｍの正方形チャンバー中に形成される（チャンバーの形状はサンプルの目視のために修飾した。組織はホルムアルデヒド（１０％）で固定し、はっきり目視できるようにオレンジ色素で染色した）。
【００２５】
図３は、スキャフォールド２０を含むプロトタイプのマルチウェルプレート４０を図示する。図示された実施形態において、テーブルトップＣＮＣミル（シェーライン・プロダクツ社（Ｓｈｅｒｌｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．）、ビスタ、カリフォルニア）を使用して、ポリカーボネート棒（２５×６０×１０ｍｍ）から、８ウェルプレートを機械加工した。８×８ｍｍの８つの正方形ウェル４２は、フレーム２２（直径１ｍｍ）を構成する２本のステンレス鋼棒を含有していた。２本の棒が４ｍｍ離れるように、ステンレス鋼棒の中心をウェルの底部の２ｍｍ上方およびウェルの側面から２ｍｍに置いた。顕微鏡によるイメージングを促進するために、顕微鏡カバーグラス（ナンバー１厚、フィッシャーブランド（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ））を使用し、シリコングルー（ダウ・ケミカル社（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ミッドランド、ミシガン）を使用して各々のウェルの底部をシールした。
【００２６】
ハイスループットシステムにおける使用の容易性のために、スキャフォールド２０は、マルチウェルプレートフォーマットを使用して、図２Ｃ中で図示されるような、２、４、８、１２または９６のスキャフォールドを含むが、これらに限定されないコネクター２８によってグループでともに連結することができる。スキャフォールド２０をグループでともに連結することによって、スキャフォールドは、マルチウェルプレート４０中で容易に位置決めすることができる。コネクター２８は、容易に分離できるように、例えば迅速な牽引動作が連結を破壊するように作製することができ、使用者は使用するスキャフォールドの数のカスタマイズが可能である。本明細書において記載されるスキャフォールドおよび生体人工組織システムは、６ウェル、８ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、１９２ウェルまたは３８４ウェルのプレートを含むが、これらに限定されない任意のマルチウェルプレートにおいても当業者による使用のために取り入れることができる。
【００２７】
以下の実施例中で理解されるように、多孔性支持材料、またはマジックテープ（Ｖｅｌｃｒｏ ｆａｓｔｅｎｅｒ）などの他の留め具は、使用されるワイヤーフレームの非多孔性ステンレス鋼表面への組織接着を促進するためにさえも必要とされない。コラーゲンは膜または組織ストリップの外側部でより高い程度まで圧縮され、組織が留め具の必要なしにスキャフォールド上に浮かすことを可能にした。したがって、膜のこの外側部は細胞によって生み出された応力に耐えることができ、生体人工組織がワイヤーフレームから裂けることを防止する。
【００２８】
図４中で説明されるように、本発明のいくつかの実施形態に従う生体人工組織は、現行の細胞単層の細胞ベースのアッセイよりもインビボの設定により類似した３次元組織を提供する。細胞数の増加は、特異的試験アッセイについてシグナルアウトプットの増加をもたらす。本発明は、したがって、すべての様式の細胞ベースのアッセイがハイスループットシステムにおいてうまく行える機構を提供する。さらに、他の３次元組織とは異なり、本明細書の組織は光学測定を妨害するメッシュまたはフレーム上で増殖しない。代わりに、組織はフレームに広がり、光学測定が可能である。
【００２９】
本発明のシステムは、検査のために必要とされる組織の小さなサイズのために、少量の試薬を使用するだけでなく、アッセイ手順の全体にわたって一定温度および滅菌済み条件の維持を含む組織培養条件が維持された組織の解析も可能にする。例えば、生体人工組織の汚染を避けるために、アッセイは層流フード中で行なうことができる。さらに、組織内の細胞は、数時間、数日または数週間もの過程にわたって、生体人工組織の同じセットでアッセイを数回繰り返すことができるように安定である。
【００３０】
マルチウェルプレート４０は、生体人工組織の保持のためのスキャフォールド２０を含む特別にデザインされたプレートでありえるか、または適切にはスキャフォールドを加えることができる一般的には市販で入手可能な組織培養マルチウェルプレートでありえる。１枚のプレートあたりウェルの数は変動してもよい。典型的には２乃至１０００のウェルを持つプレートは使用され、適切には５０乃至５００のウェルを持つプレートが使用される。
【００３１】
生体人工組織の形成に使用される細胞は、筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞および心臓細胞を含みうるが、これらに限定されない。生体人工組織は、細胞およびコラーゲンまたは細胞および細胞外マトリックスを含むことができる。生体人工組織の形成中に有用なコラーゲンは、タイプＩ〜ＸＩＩＩのすべてを含むコラーゲンクラス１〜４およびその組み合わせを含む。ヒドロゲルまたはマトリゲル（登録商標）などの様々なタイプの細胞外マトリックスも生体人工組織の形成において使用することができる。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態に従う再構成組織モデル中の細胞は、天然の組織および器官の条件に類似する環境中にある。したがって、この方法を使用するアッセイの結果は、動物モデルを使用して得られるものに類似した結果をもたらす。動物試験のうちのいくつかは本発明に従う組織モデルを使用して置換できることが意図される。例えば、皮膚上で作用する薬剤のいくつかの試験は人工的生組織を使用して行なうことができる。
【実施例】
【００３３】
（方法）
直径１ｍｍのステンレス鋼ワイヤーで作製した三角形フレームを、再構成組織が形成されるスキャフォールドとして用いた。ウェルは底部に向かってわずかにテーパーがかかり、フレームは、ウェルの底部の１ｍｍ上方に確実に位置決めされる（図１ａ）。細胞および適切な細胞培養培地を含有する未重合コラーゲン溶液をウェルの中へ注ぎ、底部の上方に３ｍｍのレベルまでウェルを充填した（図１ｂおよび３）。図３中の８ウェルプレートを５％ＣＯ2で３７℃でインキュベーションした。インキュベーションの間に、細胞は多孔性コラーゲンマトリックスから液体を絞り出すことによってコラーゲンマトリックスを圧縮した。ワイヤーフレームなしでは、再構成組織は組織培養培地中で小さな球体浮遊物へと収縮した。異なる形状のワイヤーフレームの利用によって、コラーゲンマトリックスはフレームの形状に対応する形状へと圧縮されることが見出された。例示的に、図１ａ中で示されるように、三角形のワイヤーフレームは３つの縁部の中で膜状の広がりを生じた。他のワイヤーフレーム形状（図１ｂ中で示されるものなどの）は、異なる幅を持つ組織ストリップを生じた。マジックテープなどの多孔性支持材料は、ワイヤーの非多孔性ステンレス鋼表面への組織接着を促進するためにさえも必要とされなかった。コラーゲンは膜またはストリップの外側部でより高い程度まで圧縮された。したがって、膜のこの外側部は細胞によって生み出された応力に耐えることができ、膜がワイヤーフレームから裂けることを防止した。
【００３４】
（細胞培養およびＨＴＣ形成）
ラット胎仔線維芽細胞（ＲＥＦ−５２）は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓ１１０５０、アトランタ・バイオロジカルズ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）社、ローレンスヴィル、ジョージア）を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＭＴ１００１３ＣＭ、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、ピッツバーグ、ペンシルバニア）中で培養された。細胞は２乃至３日ごとに継代培養した。ヒドロゲル組織構築物（ＨＴＣ）を製作するために、ＲＥＦ−５２細胞（継代４０乃至７０の間）は、１０乃至１５分間０．０５％トリプシン（ＭＴ−２５−０２５−ＣＩ、フィッシャー・サイエンティフィック社）で処理することによって培養プレートから解離した。次いで細胞を１０００ｇで１０分間遠心分離した。トリプシン溶液をデカントし、細胞沈殿を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で再懸濁した。１ｍｌあたり８×１０5細胞の最終濃度を達成するように、この細胞懸濁液をＨＴＣ組織溶液中で希釈した。ＨＴＣ組織溶液は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ、０．０２Ｎ酢酸中の１ｍｇ／ｍｌの１型コラーゲン（３５４２４９、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、サンホセ、カリフォルニア）、コラーゲン中の酸を中和するのに十分な水酸化ナトリウム、ならびにコラーゲンおよびＮａＯＨの体積を補うのに十分な５×ＤＭＥＭからなっていた。早期コラーゲン重合を防止するために、ＨＴＣ組織溶液はカスタムメイド組織モールドの中に分配するまで冷凍した（図３）。モールドは各々、２本の作りつけの水平方向の支持棒を持つ８個の分離したＨＴＣ形成ウェルを含有する。３００マイクロリットルのＨＴＣ組織溶液をこれらのモールド中の各々のウェルの中へ小分けし、次いで３７℃および５％ＣＯ2で３０分間インキュベーションした。インキュベーション期間後に、３５０ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を各々のウェルに加え、モールドをさらに４８時間インキュベーションした。この時、溶液が収縮してウェル中の支持棒に広がるＨＴＣを形成する。
【００３５】
（ＨＴＣ力測定）
パルペーター（商標）（米国特許第７，４４９，３０６号中に記載され、その全体は参照することにより本明細書に組み入れられる）を、ＨＴＣの収縮性を定量するために使用した。モールドを、パルペーター（商標）（各々のウェルの中へプローブを自動的に挿入し、個々のＨＴＣを引き伸ばす）のステージ上に配置した。プローブは、力変換器（引き伸ばしに応答してＨＴＣで誘導された抵抗力を測定し、記録のためにコンピューターへ値をエクスポートする）に接続された。カスタムマトラボ（Ｍａｔｌａｂ）アルゴリズムを使用して力データーを処理およびアッセイし、ＨＴＣ中の活性細胞力を表す数値パラメータを報せる。ＨＴＣ収縮力の安定した測定を得るために、実際の力測定の前の３回の引き伸ばしによるＨＴＣのプレコンディショニングが必要であった。後続する力測定が前の引き伸ばしの３０分以内であったならば、プレコンディショニングは必要ではなかった。処理後２４時間のＨＴＣは、力測定の前に常にプレコンディショニングした。
【００３６】
ＨＴＣのＴＭＲＥ標識およびＭＴＴアッセイ
テトラメチルローダミンのエチルエステル（ＴＭＲＥ、Ｔ−６６９、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カールズバッド、カリフォルニア）を使用してＨＴＣのミトコンドリア電位を定量した。ＨＴＣを３０分間１００ｎＭのＴＭＲＥ中でインキュベーションし、次いで６０分間フェノールレッド不含１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中でインキュベーションした。ＴＭＲＥ蛍光読み取りに対する妨害を防止するために、フェノールレッド不含培地を使用した。標識後に、ＨＴＣを３回の引き伸ばしによりプレコンディショニングし、次いでバックグラウンド力を測定した。次いでＨＴＣのＴＭＲＥシグナルをシナジーＨＴプレートリーダー（バイオテック・インストルメンツ（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社、ウィヌースキー、バーモント）で読み取った。カスタムメイドの取付板を使用してプレートリーダーのプレート保持ラック上に組織のモールドの位置決めをする。蛍光シグナルは、５４３／５９０の励起／放射フィルターセットおよび５０のゲイン設定を使用して底部から読み取った。薬物処理後に所定時間点で各々の力を測定し、続いてＴＭＲＥ蛍光強度も読み取った。
【００３７】
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムを使用してＨＴＣ中の細胞生存率を定量した。薬物暴露後の所定時間で、０．５ｍｇ／ｍｌを達成するように各々のウェルにＭＴＴを加えた。ＭＴＴを２時間ウェル中に放置し、次いで除去した。次いで細胞中で形成されるフォルマザン色素を、５００μｌの０．１Ｎ塩酸含有イソプロパノール（Ｓ７７７９５、フィッシャー・サイエンティフィック社）中で懸濁した。次いで、２００マイクロリットルのフォルマザン溶液を９６ウェルプレートのウェルの中に入れ、シナジーＨＴプレートリーダーで読み取る。５７０ｎｍおよび６５０ｎｍの吸光度を記録し、差（Ａ５７０−Ａ６５０）をフォルマザンの吸光強度として使用した。
【００３８】
（ＨＴＣ薬物処理）
すべて化学物質は、特に断りのない限り、シグマ（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、セント・ルイス、ミズーリ）からのものである。サイトカラシンＤ（ＣＤ、Ｃ８２７３）およびロテノン（ＲＯＴ、Ｒ８８７５）、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ、Ｄ１９８５０１）およびＲｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＫＩ１、５５５５５０、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社、ギブスタウン、ニュージャージー）は、保存のためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｄ４５４０）中で懸濁した。１ｍＭのＣＤ、ＲＯＴおよびＲＫＩ１のストック溶液を、フェノールレッド、ＦＢＳ、グルコースまたはピルベートなしの（−Ｆ／Ｐ／Ｇ）ＤＭＥＭ中で１００μＭ、１０μＭおよび１μＭへ連続的に希釈した。ＤＮＰはＤＭＳＯ中で１Ｍに希釈し、次いで−Ｆ／Ｇ／ＰのＤＭＥＭ中で１００ｍＭ、１０ｍＭおよび１ｍＭに希釈した。ＨＴＣプレコンディショニングおよびバックグラウンド力（すなわち薬物処理前）測定に続いて、５０μｌの適切な薬物希釈物を各々のウェルに加えて所望の処理濃度を達成する。５０マイクロリットルの−Ｆ／Ｇ／ＰのＤＭＥＭを対照ウェルに加えた。薬物添加に際して、ウェル中の培地を４回のピペッティングによって混合した。
【００３９】
ＲＥＦ−５２細胞の処理および固定
ＲＥＦ−５２細胞を１０％ＦＢＳ培地（２ｍｌ）中で３５ｍｍ培養用ディッシュ（５０，０００細胞）でプレーティングした。細胞を一晩インキュベーションし、次いで化合物により処理する。濃縮液のＣＤ、ＲＫＩ１、ＤＮＰおよびＲＯＴを−Ｆ／Ｇ／Ｐ培地中で溶解し、次いで細胞の各々のプレートの中に１０×で希釈する（２ｍｌの培地あたり２２０μｌ）。固定の２４時間前に、細胞を薬物と共にインキュベーションした。固定するために、処理した細胞を２ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｄ５６５２）で１回すすぎ、次いで１ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（シグマ）溶液（ＰＢＳ中）中で３０分間インキュベーションした。固定した細胞を２回すすぎ、次いで２ｍｌのＰＢＳ中で保存した。
【００４０】
ＲＥＦ−５２の標識およびイメージング
固定したＲＥＦ−５２細胞を、１ｍｌの０．１％トリトン（ＢＰ１５１、フィッシャー・サイエンティフィック社）溶液（ＰＢＳ中）中で１５分間インキュベーションすることによって透過性にした。透過性にした細胞は、１ｍｌのＴＢＳＴバッファーで２回すすぎ、次いで１ｍｌのＴＢＳＴ中の５％ヤギ血清で１時間ブロックした。次いで１ミリリットルの２％ヤギ血清含有ＴＢＳＴ中で１：２００に希釈したアレクサ５６８コンジュゲートファロイジン（Ａ１２３８０、インビトロゲン社）を、細胞に加えた。この染色溶液は４００ｎＭのＤＡＰＩ（Ｄ９５６４）も含有した。細胞を３０分間染色し、次いでＴＢＳＴで２回すすいだ。標識した細胞を、ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、バーリンゲーム、カリフォルニア）によりマウントし、カバースライドで覆い、次いでマニキュア液で密封した。次いでプレートをライカＳＰ５共焦点顕微鏡（ライカ・マイクロシステムス（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、バノックバーン、イリノイ）の上で裏返しにし、６３倍水浸対物レンズでイメージングした。アレクサ５６８は５４３のレーザー線を使用して励起し、ＤＡＰＩはマイタイ（ＭａｉＴａｉ）多光子レーザーを使用して励起した。
【００４１】
統計的解析
スチューデントのｔ検定を使用して対照ＨＴＣに対するＣＤ処理したＨＴＣの蛍光シグナルの減少を検定する（図１ｈ）。Ｚ因子を使用してパルペーター（図１ｆおよび１ｇ）、ＴＭＲＥ（図２ａおよび２ｂ）およびＭＴＴ（図３ａ）のアッセイのシグナル対ノイズ比を評価した。ＭＴＴアッセイにおいて、１０％ＤＭＳＯを陽性対照として使用した。
【００４２】
結果
化合物スクリーニングについて細胞力学を測定するために、我々は、小型化されたヒドロゲル組織構築物（ＨＴＣ）を製作する技術、および組織の力学的特性を定量するハイスループットスクリーニングシステム（パルペーター（商標））（図５ａ、５ｂ、５ｃ）を開発した。３次元ＨＴＣはより自然な微小環境を提供し、細胞はよりインビボの形態および生理を模倣することができる。さらに、自己支持型ＨＴＣは細胞力学の測定のための力プローブを使用して引き伸ばすことができる（図６ｄ）。このシステムを使用すると、ＨＴＣの力学的特性は、細胞標識、高度な顕微鏡検査、またはイメージアッセイなしに、定量的に測定することができる（図６ｅ）。
【００４３】
この研究において、周知の標的および生物学的効果を持つ４つの異なるクラスの化合物をＨＴＣに加え、ＨＴＣ力学に対するそれらの用量依存的効果を決定した。ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＫＩ）（Ｈ−１１５２）およびサイトカラシンＤ（ＣＤ）（アクチン重合を妨害する）によりＨＴＣを３時間および２４時間処理すると、用量依存的に組織力が減少した。（両方のＥＣ50は〜０．１μＭ、図５ｆ、３時間）。ジニトロフェノール（ＤＮＰ）（ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）の脱共役剤）も組織力を減少させたが、Ｈ−１１５２またはＣＤよりも〜１０，０００倍高い濃度であった。ロテノン（ＲＯＴ）（哺乳類細胞に対する周知の毒性効果を持つ広く使用される殺虫剤）も組織力を減少させた。水性培地中で低可溶性（〜１００μＭ）であるために、ＲＯＴ濃度をさらに増加させることができなかった。一般的には、すべての化合物の２４時間のインキュベーションは、力減少に対する効果を促進した（図５ｇ）。特に、ＤＮＰのＥＣ50は、追加の〜２０時間のインキュベーションによって１．３ｍＭから２０μＭまで低下した。しかしながら、最高濃度のＤＮＰ、ＣＤおよびＨ−１１５２は２４時間で組織力をさらに減少させず、これらの用量が３時間で最大効果を達成したことを示唆する。これらの結果は、各々の化合物が組織力を減少させることに効果的であることを実証する。
【００４４】
組織力は、細胞骨格（特にアクチンおよびミオシン）の全体性を介して維持される。化合物により処理されたＨＴＣ中のＦ（線維状）−アクチンの量を定量化するために、ＨＴＣをアレクサ５４６コンジュゲートファロイジンにより染色した。アレクサファロイジンの強度をプレートリーダーによって測定したところ、ＣＤ（２μＭ）により処理したＨＴＣ中のＦ−アクチン含有量は有意に減少した（図５ｈ）。これは、組織力のＣＤ仲介性減少がインタクトなＦ−アクチンの損失のためであるという我々の以前の報告に一致している。しかしながら、Ｈ１１５２およびＤＮＰによる力減少はＦ−アクチンの損失に関連しなかった。これらのＨＴＣ中のアレクサファロイジン標識は対照と同等だった。Ｆ−アクチンはＲＯＴ処理によっても減少したが、この結果は不十分な統計的有意性のために決定的でなかった。２μＭのＣＤにより処理したファロイジン染色細胞の顕微鏡アッセイから、早ければ３時間でＦ−アクチンが広範囲に破壊されていることが示された（図５ｊ）。２４時間までに、あまり伸展していない（図５ｏ）二核の（図５ｔ）細胞内に、短いＦ−アクチンは再分布した。
【００４５】
ＲＫＩ、ＤＮＰおよびＲＯＴはＦ−アクチン形態にめざましく影響しなかった（図５ｋ−ｍ）。ＲＫＩ処理細胞は、膜ラッフリングの限定および細胞の中央領域のファロイジン染色の減少を示した（図５ｃ）。ＤＮＰ（図５ｑ）およびＲＯＴ（図５ｒ）により２４時間処理した細胞の密集度は、対照（図５ｎ）の密集度より少なかった。ＲＯＴ処理細胞における顕著な核断片化は、アポトーシスの誘導を示した（図５ｗ）。これらのイメージにおけるこれらの形態変化は手動で見分けることができるが、自動化定量ＨＴＰ解析は高度な解析アルゴリズムを必要とする。
【００４６】
化合物が組織力を減少させる原因となる機構をさらに同定するために、ミトコンドリア電位の変化を生物学的色素テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）を使用して定量した。ＴＭＲＥは陽イオン性であり、ＭＭＰの関数としてミトコンドリア中に蓄積する。ＤＮＰ処理した９６ウェルプレート中の単層およびＨＴＣの最初の研究から、ＴＭＲＥ標識のＤＮＰ仲介性減少はプレートリーダー上の単層において検出可能でない（図６ａ）が、ＨＴＣにおいて容易に定量化可能である（図６ｂ）ことが示された。共焦点顕微鏡を使用するＴＭＲＥ蓄積に対するＤＮＰの効果のより詳しい研究から、単層およびＨＴＣの両方においてシグナル検出が改善された（図６ｃ、ｄ）。しかしながら、ＨＴＣ実験は、ＤＮＰによる用量依存的ＭＭＰ減少の検出において細胞単層実験よりも優れた感度を示した。シグナル検出の優れた感度、データーの改善されたシグナル対ノイズ比、およびＨＴＰ適用に対するプレートリーダースキャニングの適合性を考慮して、化合物のＭＭＰに対する効果の研究のためにＨＴＣを使用した。
【００４７】
３時間のＤＮＰ処理により、ＭＭＰは脱共役され、ＥＣ50は〜３４０μＭでＴＭＲＥシグナルを用量依存的に減少させた（図６ｅ）。追加の２１時間のインキュベーションは、わずかにＤＮＰの効果を促進し、ＥＣ50を〜９５μＭまでさらに減少させた（図６ｆ）。２４時間の処理によるＴＭＲＥのＥＣ50のこの３．６倍の減少は、組織力に対するＤＮＰの効果のＥＣ50の６５倍の減少よりも有意に少なかった（図５ｆ、ｇ）。この差は、ＤＮＰの迅速なＭＭＰ脱共役により細胞収縮活性の段階的な減少がもたらされることを示唆する。アクチン重合およびミオシン依存的細胞収縮はＡＴＰを必要とするので、ＭＭＰの迅速な損失はミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生を減少させ、したがって細胞収縮性を減少させることが予想される。組織力のこの時間遅延の減少は、細胞内ＡＴＰ蓄えの存在および／またはＡＴＰ産生のための解糖をアップレギュレートする細胞の能力を示す。解糖を介するＡＴＰ産生のアップレギュレーションは腫瘍細胞およびいくつかの細胞株で報告されている。ＣＤ、ＲＫＩおよびＲＯＴの処理によりミトコンドリア膜電位は減少したが、それらがＭＭＰを減少させた程度は１０〜２０％に限定された（図６ｅ、ｆ）。
【００４８】
最終的に化合物の細胞生存率に対する効果を測定するために、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を使用するアッセイを行なった。細胞において、黄色のＭＴＴはコハク酸デヒドロゲナーゼによって紫色のフォルマザンに変換され、この変化を５００〜６００ｎｍの間の光線吸光度によって定量することができ、プレートリーダーを使用して定量的に記録した。ＭＴＴアッセイによって検出されるように、３時間の処理は生存率の有意な損失をもたらさなかった（結果は示さない）。２４時間のＣＤおよびＲＯＴの処理により、ＨＴＣの生存率は用量依存的減少を示した（図７ａ）。０．２μＭおよび２μＭのＣＤ処理によりＭＴＴシグナルは４０％減少した。ＣＤ毒性の観察されたレベルは、ヒト類表皮細胞株において５〜３０μＭと報告されているＬＤ50に類似していた。より高いＲＯＴ濃度（１０μＭ）がＭＴＴシグナルを４０％減少させるために必要であった（図７ａ）。ＲＯＴ毒性のこのレベルは、ＨｅｐＧ２細胞において今までに報告された２５％毒性よりもわずかに高い。２４時間のＲＫＩおよびＤＮＰの処理はＭＴＴシグナルに影響しなかった。
【００４９】
ＨＴＣ力測定、ＴＭＲＥ定量化およびＭＭＴアッセイは同じＨＴＣサンプルで行なわれた。統合されたスクリーニングワークフロー（図７ｂ）の図解は、ＨＴＣを使用する高含量の生理的情報の獲得の効率を示す。結果を、化合物の生理的影響力を表わす表現型プロフィールのパネルとして要約した（図７ｃ〜ｆ）。ＤＮＰ、ＣＤおよびＲＫＩのすべては、ＨＴＣ力の減少に非常に効果的であった。しかしながら、ＤＮＰはミトコンドリア電位の大規模な脱共役効果を示すが（図７ｃ）、ＣＤは高毒性である（図７ｄ）。一方ＲＯＴは、ＨＴＣ力、ミトコンドリア電位および生存率に対して穏やかな負の影響を有していた（図７ｆ）。ＲＫＩは、限定的なミトコンドリア毒性および生存率毒性を持ち、０．１μＭの力減少のＥＣ50を持つ最も優れた候補化合物であると同定された。ＲＫＩが組織硬度を効果的に減少させることができる心臓保護性非毒性化合物であることが周知であるので、この結果は驚くべきことではない。さらに、ＲＫＩ薬物（ファスジル）は、アテローム性動脈硬化症および高コレステロール血症についての第ＩＩ相臨床研究を最近完了した。
【００５０】
要約すると、本発明者は、組織収縮力を減少させることができ、さらにミトコンドリア機能および細胞生存率に対して最小効果を有する化合物についてスクリーニングするために、どのようにＨＴＣを使用することができるか実証した。このＨＴＣベースのスクリーニングシステムにより、２次元培養と比較してより自然な微小環境（すなわち、３次元マトリックス構造中に包埋された）内で細胞生理学を研究し、力学的力を定量することができる。
【００５１】
さらに、ＨＴＣ中の細胞のコンパクトで多層の配列は、検出限界および蛍光アッセイのシグナル対ノイズ比を大幅に増加させた。０．４４乃至０．８５にわたるＺ因子であり、アッセイが高精度およびロバスト性があるので、既存のＨＴＰスクリーニングワークフローへとＨＴＣを組み入れことが促進されるだろう。
【００５２】
要約すると、本発明者は、細胞ベースのアッセイを行なうために３次元組織モデルを利用するハイスループットシステムを提供する。前述の説明は本発明の原理の例証に過ぎないと見なされる。さらに、当業者であれば多数の修正および変形形態を容易に考えつくことができるので、本発明は、図示され記載された厳密な構成および方法に限定されるものではなく、したがって、すべての修正および均等物は本発明の範囲以内にあると考えられる。
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤に対する組織の応答を検出する方法であって、
（ａ）生体人工組織は細胞および細胞外マトリックスを含み、生体人工組織は組織接着を促進する留め具なしのスキャフォールド支持体上に形成され、スキャフォールド支持体はウェルの底部の上方に位置決めされて、薬剤と生体人工組織を接触させる段階と、
（ｂ）生体人工組織を使用してアッセイを行ない、アッセイでインディケーターを産生する段階と、
（ｃ）薬剤に対する生体人工組織の応答を表す、ウェル中のインディケーターのレベルを検出する段階と、
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞が、筋細胞、非筋細胞、内皮細胞および心臓細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウェルがマルチウェルプレート内に位置決めされる、請求項１または２のいずれか一項に方法。
【請求項４】
前記マルチウェルプレートが２乃至１０，０００のウェルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記スキャフォールド支持体がワイヤーフレームである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ワイヤーがステンレス鋼ワイヤーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が疾患に関与することが既知である細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記インディケーターが、発色測定用インディケーターまたは蛍光測定用インディケーターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記インディケーターのレベルが顕微鏡を使用して検出される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インディケーターが放射性標識である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インディケーターのレベルがシンチレーターを使用して検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記インディケーターのレベルがマルチウェルプレートリーダーを使用して検出される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイが、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、アポトーシスアッセイ、タンパク質発現アッセイ、遺伝子発現アッセイ、酵素的アッセイおよび細胞シグナリングアッセイからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が候補医薬品である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法がハイスループットスクリーニング方法である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
薬剤に対する組織の応答を検出する方法であって、
（ａ）生体人工組織は細胞および細胞外マトリックスを含み、生体人工組織は組織接着を促進する留め具なしのスキャフォールド支持体上に形成され、スキャフォールド支持体はウェルの底部の上方に位置決めされて、薬剤と生体人工組織を接触させる段階と、
（ｂ）生体人工組織を使用してアッセイを行ない、アッセイでインディケーターを産生する段階と、
（ｃ）薬剤に対する生体人工組織の応答を表す、ウェル中のインディケーターのレベルを検出する段階と、
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞が、筋細胞、非筋細胞、内皮細胞および心臓細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウェルがマルチウェルプレート内に位置決めされる、請求項１または２のいずれか一項に方法。
【請求項４】
前記マルチウェルプレートが２乃至１０，０００のウェルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記スキャフォールド支持体がワイヤーフレームである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ワイヤーがステンレス鋼ワイヤーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が疾患に関与することが既知である細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記インディケーターが、発色測定用インディケーターまたは蛍光測定用インディケーターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記インディケーターのレベルが顕微鏡を使用して検出される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インディケーターが放射性標識である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インディケーターのレベルがシンチレーターを使用して検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記インディケーターのレベルがマルチウェルプレートリーダーを使用して検出される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイが、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、アポトーシスアッセイ、タンパク質発現アッセイ、遺伝子発現アッセイ、酵素的アッセイおよび細胞シグナリングアッセイからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が候補医薬品である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法がハイスループットスクリーニング方法である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【図３】
【図６】
【図７】
【図７−１】
【図１】
【図４】
【図５】
【図５−１】
【図６】
【図７】
【図７−１】
【図１】
【図４】
【図５】
【図５−１】
【公表番号】特表２０１１−５２４１６７（Ｐ２０１１−５２４１６７Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２６９５（Ｐ２０１１−５１２６９５）
【出願日】平成２１年６月５日（２００９．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６４３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４９３６３
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５１０３２１８９３）メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月５日（２００９．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６４３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４９３６３
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５１０３２１８９３）メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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