ハイブリダイズ装置およびハイブリダイズ方法
【課題】本発明は、再現性の良好なハイブリダイズ反応を実現可能なハイブリダイズ装置を提供する。
【解決手段】核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置２を、核酸プローブが固定された基板の該核酸プローブの固定領域６を含んでハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティ１２を形成するカバー部材１０を備え、キャビティ１２の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域１６を有するものとする。ハイブリダイズ反応を実施するキャビティに露出される領域の表面特性を制御することで、シグナル強度を向上させ、また、そのバラツキを抑制して再現性の良好なハイブリダイズ反応を実施できる。
【解決手段】核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置２を、核酸プローブが固定された基板の該核酸プローブの固定領域６を含んでハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティ１２を形成するカバー部材１０を備え、キャビティ１２の内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域１６を有するものとする。ハイブリダイズ反応を実施するキャビティに露出される領域の表面特性を制御することで、シグナル強度を向上させ、また、そのバラツキを抑制して再現性の良好なハイブリダイズ反応を実施できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置、ハイブリダイズ方法および核酸アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡマイクロアレイなどの核酸プローブを固定した基板における核酸ハイブリダイズ反応を行うハイブリダイズ装置としては、例えば、特許文献１，２に示されるように、基板と基板に付着される可撓性層とを備えるものが提案されている。これらのハイブリダイズ装置では、作業者によるバラツキを低減し、小さな反応空間での核酸のハイブリダイズ効率を向上させるものとして、かかる空間内の流体成分に可撓性層を介してローラーにより外力を加えて積極的に混合を行わせている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００３−５１７１５６号公報
【特許文献２】特表２００３−５１７５９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ハイブリダイズ反応の結果得られるシグナル強度などのバラツキや不安定性は主としてハイブリダイズ反応中において生じるものである。しかしながら、かかるハイブリダイズ反応の場である反応空間あるいは内部の流体成分への外力の付加という手段によっては、ハイブリダイズ反応の不安定性が増大するばかりかハイブリダイズ反応の効率の増大という目的に対しても十分な効果が得られていない。したがって、現状においても依然として、微小な反応空間におけるハイブリダイズ反応の不安定性や不均一性を解決するという要望が存在しているが、具体的解決策は見出されていない。
【０００５】
そこで、本発明の一つの目的は、再現性の良好なハイブリダイズ反応を実現可能なハイブリダイズ装置およびハイブリダイズ方法を提供することである。また、本発明の他の一つの目的は、精度（正確性）の良好なハイブリダイズ反応を実現可能なハイブリダイズ装置およびハイブリダイズ方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記した課題について検討したところ、ハイブリダイズ反応を実施するキャビティに露出される領域の表面特性やキャビティの構造等が大きくシグナル強度やそのバラツキ（変動係数）に影響していることを見出し、これらを制御することでシグナル強度を向上させ、また、そのバラツキを抑制して再現性の良好なハイブリダイズ反応を実施できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、前記キャビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、装置が提供される。この形態においては、前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有していることが好ましい態様であり、さらに、前記カバー部材は、前記核酸プローブの固定領域に対向する領域に前記疎水性領域を有していることが好ましい態様である。これらの態様において、前記疎水性領域は、水の接触角が３０°以上であることが好ましい態様である。
【０００８】
本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域の厚みが３００μｍ以上である、装置が提供される。この形態において、前記カバー部材は前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有していることが好ましい態様である。
【０００９】
本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下である、装置が提供される。この形態においては、前記空間高さは１５μｍ以上であることが好ましい態様であり、前記カバー部材は前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有していることが好ましい態様である。
【００１０】
これらのいずれかのハイブリダイズ装置において、前記カバー部材は、少なくともシート体と、該シート体と前記基板との間に介在させるスペーサと、を備える、装置が提供される。また、上記したいずれかのハイブリダイズ装置において、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には前記チャンバー内に液体を供給するための開口を有し、該開口はその一部によって前記キャビティを構成する内周壁が外側に膨出した膨出状部を構成するように形成されていることが好ましい態様であり、この態様においては、前記開口は、前記キャビティの長尺方向の両端部位にそれぞれ形成されていることが好ましい。また、上記したいずれかのハイブリダイズ装置において、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上からなることが好ましい態様である。
【００１１】
また、これらのいずれかのハイブリダイズ装置において、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有していることが好ましい。また、これらのいずれかのハイブリダイズ装置においては、前記カバー部材には、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出される露出端部を有するタブ層を備えることが好ましい。
【００１２】
本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、核酸プローブが固定された固定領域を有する基板に対して上記いずれかの核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置をセットする工程と、前記固定領域を含んで形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程と、を備える、方法が提供される。この形態においては、前記ハイブリダイズ工程は、前記基板と前記ハイブリダイズ装置とを静置して行うことが好ましい態様である。また、この形態においては、前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内の液体を攪拌することが好ましい態様である。この態様においては、前記液体の攪拌を、前記キャビティを形成した基板及びハイブリダイズ装置を動かして行ってもよい。さらに、この態様においては、前記キャビティ内にガスを存在させた状態とすることが好ましく、ガスをキャビティ内で移動させて前記液体を撹拌することが好ましい。
【００１３】
本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハイブリダイズのための液体を貯留可能に形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程、を備え、前記ハイブリダイズ工程は前記キャビティ内に存在させたガスをキャビティ内で移動させて前記液体を撹拌する工程を含むことが好ましい態様である。この態様においては、前記ハイブリダイズ工程は、前記基板を含む前記キャビティを構成する部材を動かして行ってもよい。また、この態様においては、前記ハイブリダイズ工程は、前記基板と組み合わされて前記キャビティを形成する弾性変形可能なカバー部材に外力を付加して行ってもよい。
【００１４】
さらに、本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ反応キットであって、核酸プローブが固定されるための固定領域を有する基板と、該基板の前記核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、前記キャビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、キットが提供される。このキットにおいては、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有していることが好ましい。また、前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出される露出端部を有するタブ層を備えることが好ましい。
【００１５】
さらに、本発明の他の一つの形態によれば、核酸のアレイであって、１あるいは２以上の核酸プローブが固定された固定領域を有する基板と、前記固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材と、を備え、前記キャビティ内部に露出される少なくとも一部に疎水性領域を有する、アレイが提供される。このアレイにおいては、前記カバー部材は前記基板に対して分離可能に装着されていることが好ましい態様である。また、このアレイにおいては、前記基板と前記カバー部材とは、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を介して積層されていることが好ましい。また、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有していることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のハイブリダイズ装置の一例を示す図である。
【図２】図１に示すハイブリダイズ装置の平面図と断面図とを示す図である。
【図３】空間高さを測定するための測定部位を例示する図である。
【図４】実施例１において作製するＤＮＡマイクロアレイにおけるｃＤＮＡのスポットのアレイ図である。
【図５】ハイブリダイズ装置の材質とシグナル強度との関係を示す図である。
【図６】ハイブリダイズ装置の対向領域の厚みとシグナル強度との関係を示す図である。
【図７】キャビティの空間高さの変動係数とシグナル強度の変動係数との関係を示す図である。
【図８】キャビティの空間高さの変動係数とシグナル強度の変動係数との関係を示す図である。
【図９】タブ層を有するカバー部材及びアレイを示す図である。
【図１０】キャビティの空間高さとシグナル強度の変動係数との関係を示す図である。
【図１１】実施例６におけるカバー部材及びアレイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のハイブリダイズ装置は、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成可能なカバー部材を備えている。そして、第１の形態のハイブリダイズ装置においては、前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有することを特徴としている。このハイブリダイズ装置によれば、ハイブリダイズを促進し、ハイブリダイズ産物の検出強度（シグナル強度）を高めることができる。このため、核酸プローブの固定領域全体で効率的なハイブリダイズ反応を実現でき、結果的にハイブリダイズ反応の再現性を向上させることができる。核酸のハイブリダイズ反応のための液体が貯留される微小なキャビティにおいて疎水性領域を設けることによりこのようなハイブリダイズ反応の促進効果を得られることは本発明者らの予想を超えるものであった。本発明を理論的に拘束するものではないが、本発明の上記効果はキャビティ内に疎水性領域を有することで、キャビティ内でのハイブリダイズ液の対流および被験核酸の拡散が促進され、プローブ核酸との接触確率およびハイブリダイズが促進されたことによると推論される。
【００１８】
また、本発明の第２の形態のハイブリダイズ装置は、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域の厚みが３００μｍ以上であることを特徴としている。このハイブリダイズ装置によれば、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを低減することができ、ハイブリダイゼーションの検出精度と再現性とを高めることができる。本発明を理論的に拘束するものではないが、核酸プローブの固定領域に対向する領域のカバー部材の厚みが３００μｍ以上であることにより、キャビティ内にハイブリダイズ液を貯留し加熱したときにおいても、一定の熱容量を持つことによる熱緩衝材となるため、基板上における複数位置のハイブリダイズ反応を均一に行うことができると推論される。
【００１９】
さらに、本発明の第３の形態のハイブリダイズ装置は、前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下であることを特徴としている。このハイブリダイズ装置によれば、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを低減することができ、ハイブリダイゼーションの検出精度を高めることができる。本発明を理論的に拘束するものではないが、前記キャビティの空間高さの変動係数が５０％以下であると、キャビティ内壁の表面特性および形状によるハイブリダイズ液の対流ないし被験核酸の拡散への悪影響が抑制されて基板上における複数位置のハイブリダイズ反応を均一に行うことができると推論される。
【００２０】
また、本発明の核酸ハイブリダイズ方法は、核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハイブリダイズのための液体を貯留可能に形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程、を備え、前記ハイブリダイズ工程を前記キャビティ内に存在させたガスをキャビティ内で移動させて行うことを特徴とする。このハイブリダイズ方法によれば、ハイブリダイズ反応中のハイブリダイズ効率を向上させることができる結果、ハイブリダイズ産物によるシグナル強度を増大させることができ、また、そのバラツキを低減することができる。
【００２１】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、まず、これら第１〜第３のハイブリダイズ装置について説明しつつ、これらのハイブリダイズ装置を用いたハイブリダイズ方法、ハイブリダイズキットについて、図面を適宜参照しながら説明する。図１には、本ハイブリダイズ装置の一例が基板とともに示されており、図２には、その平面図と断面図とが示されている。
【００２２】
（ハイブリダイズ装置）
ハイブリダイズ装置２は核酸のハイブリダイズ反応のための装置である。ここで、核酸とは、少なくとも一部に核酸の塩基対合によって他の核酸とハイブリダイズするものであればよい。したがって、核酸とは、天然あるいは合成のヌクレオチドのオリゴマーおよびポリマーの双方を含み、さらにゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、ペプチド核酸を含む概念である。また、ハイブリダイズ反応とは、核酸分子間における塩基の対合による相補鎖間の結合反応を意味している。
【００２３】
（基板）
本ハイブリダイズ装置２が適用される基板４は、少なくとも核酸プローブが固定される核酸固定領域６を備えている。核酸固定領域６は、それぞれ核酸プローブが固定された微小な1以上の領域（スポットともいう。）が形成された、あるいは該微小領域が形成されるために準備された領域である。なお、本発明においては、基板４に対する核酸プローブの固定方法や固定形態については特に限定することなく本出願時における公知の全ての形態を包含するものである。基板４における核酸固定領域６は、微小な三次元形状を有している場合も含め実質的に平坦であることが好ましい。また、基板４は、基板４上に直接あるいは必要に応じて多孔質体などの介在物を介して核酸固定領域６を単数あるいは２以上有することができる。基板４に２以上の核酸固定領域６を有する場合には、これらは疎水性の離隔部によって互いに隔てられていてもよい。
【００２４】
また、基板４の形状は特に限定しない。例えば、平板のほか、基板４として機能する平坦な底部を有する凹状体が挙げられる。基板４を構成する材料は、従来この種の基板に用いられている各種の材料の他各種の材料を使用できる。例えば、ガラス、二酸化ケイ素、窒化ケイ素などのシリコン系セラミックスを含むセラミックス、シリコーン、ポリメチルメタクリレート、ポリ(メタ)アクリレートなどの樹脂、金、銀、銅等の金属などを用いることができる。所望の表面特性を付与するために適当なコートが施されていてもよい。なかでも、ガラス基板、シリコーン、アクリル樹脂を使用することができる。こうした基板４の最も典型例は、ｃＤＮＡプローブ等が固定されたＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイまたはｃＤＮＡ等が固定されていない（固定されるべき）ＤＮＡマイクロアレイ用等の基板である。
【００２５】
（カバー部材）
本ハイブリダイズ装置２は、基板４に対して使用されるカバー部材１０を備えている。カバー部材１０は、基板４の核酸固定領域６を含んだハイブリダイズ反応のためのキャビティ１２を構成する。カバー部材１０は、基板４に対して装着されるものとすることもできるが、基板４を収容あるいは保持する基板保持体に対して装着された結果として、基板４との間でキャビティ１２を構成するものであってもよい。前者の例としては、平板状あるいは平坦な底部を有する凹状の基板に対して装着される形態を挙げることができ、後者の例としては、平板状の基板を載置する平坦部あるいは凹状部を備える基板保持体に対して装着される形態を挙げることができる。
【００２６】
キャビティ１２は、核酸固定領域６を含んだ空間であって、前記ハイブリダイズ反応のための液体（以下、単にハイブリダイズ液という。）を貯留可能に形成される空間である。キャビティ１２は、核酸固定領域６上において所定の空間高さ（あるいは空間の厚み）を有する空間を有していることが好ましい。すなわち、カバー部材１０は、ハイブリダイズ液が貯留されない状態であっても基板４の核酸固定領域６に対向する領域（以下、単に対向領域という。）１４を基板４からいくらかの距離離れて保持できる構成を有していることが好ましい。カバー部材１０がこうした形態を有することで、基板４に対して特別な操作を施すことなく、カバー部材１０を基板４等に対して装着するだけで、核酸固定領域６に所定の空間高さを有するキャビティ１２を形成できる。
【００２７】
キャビティ１２内には、少なくとも基板４の核酸固定領域６とカバー部材１０の対向領域１４とが露出されている他、これらの領域以外にキャビティ１２を外部と遮断するために必要な追加の面が露出されている。追加の面は、基板４あるいはカバー部材１０の一部であってもよいし、さらに別個の部材で構成されていてもよい。キャビティ１２の平面形態は特に限定しないが、突状部や角部を有しないことが好ましい。このような個所には、ハイブリダイズ液が滞留しやすいからである。なお、後述するように外側に膨出する個所であっても、該個所が、十分に小さく全体として液体の滞留が抑制されるような曲線形態などを有する側壁部分近傍に形成されていれば、滞留が抑制される。好ましい平面形態としては、図１および図２に示すような長円や円などが挙げられる。また、キャビティ１２の対向領域１４は基板４から離れる方向に対して凸状としても凹状としてもよいが、平坦であることが好ましい。平坦であると、核酸固定領域６に対しておおよそ一定の空間高さを備えるキャビティ１２を容易に構成できるからである。
【００２８】
このようなカバー部材１０は、図１に示すように、基板４が平板である場合には、対向領域１４を含む平板状体１０ａの周囲に所定高さのスペーサ８を有する形態とすることもできる。図１においては、カバー部材１０は、基板４とほぼ同じ大きさで少なくとも基板４に対向する側にはほぼ平坦な表面を有する板状体１０ａと、その周縁に基板４との間に介在されるスペーサ８とを有している。他の形態としては、それ自体が核酸固定領域６を覆う所定形状のドームを有する形態とすることもできる。このような形態のカバー部材１０は、高分子材料の成形体とすることができる。一方、基板４が凹状部の底部を核酸固定領域６とする凹状体であるとか核酸固定領域６の外周に所定高さの周縁部を有する場合、さらには基板４が基板保持体などの底部に収容される場合など、カバー部材１０を装着するのにあたり核酸固定領域６が凹状部の底部に位置されるときには、これら凹状部の周縁の縦壁部分に装着される平板状体とすることもできる。
【００２９】
スペーサ８の材料としては、例えば、アクリル樹脂、熱可塑性エラストマー、天然あるいは合成ゴム、シリコーン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、ハロゲン化ビニル、ポリカーボネートを用いることができる。
【００３０】
（疎水性領域）
本ハイブリダイズ装置２は、キャビティ１２内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域１６を有している。疎水性とは、少なくとも撥水性を示す表面特性を意味し、好ましくは、親水処理など施されていない一般的なケイ酸ソーダガラスよりも高い撥水性を有していることを意味する。撥水性は、一般に平坦な表面における水の接触角で表現することができる。本発明における疎水性領域の水の接触角は、３０°以上であることが好ましく、より好ましくは６０°以上であり、さらに好ましくは７０°以上である。最も好ましくは、９０°以上である。なお、接触角とは、液滴を水平な固体板状に置いたときに液滴が固体と接している部分の角度をいうものとする。接触角は、静的接触角や臨界値としての前進接触角あるいは後退接触角、さらには動的接触角などをも用いることができるが、液滴法によって測定した静的接触角を用いることが好ましい。
【００３１】
なお、静的接触角を測定する液滴法は、（１）接線法、（２）θ／２法および（３）３点クリック法がある。（１）の接線法は、読み取り顕微鏡等を利用してカーソルを液滴の接線に合わせて接触角を直接求める方法であり、（２）のθ／２法は、液滴の片端と頂点とを結ぶ直線と固体面との角度を２倍して接触角として求める方法であり、（３）の３点クリック法は、液滴と固体面との接点2ヶ所と頂点をコンピュータ画像上等でクリックして画像処理により求める方法である。これらの液滴法においては、上記（２）および（３）の方法にて接触角を求めることが好ましい。
【００３２】
疎水性領域１６は、キャビティ１２内に露出される領域の少なくとも一部に備えられていればよいが、好ましくは、カバー部材１０に備えられる。カバー部材１０に疎水性領域１６を備えることで、シグナル強度を効果的に向上させることができる。カバー部材１０においては、対向領域１４に疎水性領域１６を有していることが好ましく、さらに好ましくは、核酸固定領域６のおおよそ全体に対応する対向領域１４の全体に均一に疎水性領域１６を備えることが好ましい。疎水性領域１６は、対向領域１４において複数個分散して備えられていてもよいが、好ましくは、対向領域１４のおおよそ全体を被覆するような連続状に備えられている。さらに、カバー部材１０のキャビティ１２に露出される全領域が疎水性領域１６であってもよい。
【００３３】
疎水性領域１６は、例えば、カバー部材１０自体の材質を疎水性材料を用いることで形成することもできるし、疎水性領域１６を形成しようとする領域に対して疎水性材料および／または疎水性(撥水性)を呈する表面形態を付与することによっても形成することができる。疎水性領域１６を構成する疎水性材料としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ハロゲン化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂およびこれらの樹脂のフッ化又は塩化物を挙げることができる。また、撥水性を呈する表面形態としては、例えば、各種材料表面に化学的な修飾や機械的処理により接触角が９０°以上になるように粗面化された形態を挙げることができる。
【００３４】
キャビティ１２における核酸固定領域６とこれに対向する対向領域１４との距離、すなわち、核酸固定領域６におけるキャビティ１２の空間高さの変動係数（標準偏差／平均値×１００（％））が５０％以下であることが好ましい。核酸固定領域６において空間高さの変動係数が５０％以下であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを抑制することができる。シグナル強度のバラツキが抑制されることは、精度の高い検出が可能となるとともに、再現性の高いハイブリダイズ反応が実現できることを意味する。例えば、空間高さの変動係数が５０％以下であるとシグナル強度の変動係数を２０％以下程度に容易に抑制することができる。空間高さの変動係数はより好ましくは４０％以下であり、さらに好ましくは３０％以下であり、最も好ましくは２０％以下である。本発明者らの今回得られた知見によれば、キャビティ１２内の核酸固定領域６の空間高さの変動係数が一定以下であることは、核酸固定領域６の単位面積あたりのハイブリダイズ液量（液厚）の均一性に大きく寄与していることがわかっている。
【００３５】
また、キャビティ１２の空間の高さの平均値は、１５μｍ以上であることが好ましい。１５μｍ以上であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキがよく抑制されるからである。より好ましくは、２０μｍ以上である。キャビティ１２の空間高さを２０μｍ以上とすることで、それによって確保される核酸固定領域６における液厚により、キャビティ１２内に露出される領域の影響を抑制してハイブリダイズ液の対流ないし被験核酸の拡散を確保できる。また、空間高さの平均値の上限は、好ましくは１０００μｍ以下である。さらに、こうしたキャビティ１２が区画する基板４上の面積は、１ｍｍ2以上２０００ｍｍ2以下であることが好ましい。
【００３６】
キャビティ１２における上記空間高さの平均値および空間高さの変動係数は、例えば、以下の方法（以下、高さ−表面うねり量法という。）により測定することができる。
（１）計測部位
カバー部材１０によって形成されるキャビティ１２を分割する分割線、好ましくは、キャビティ１２の中心線あるいは等分割線の分割線上を計測部位とする。計測部位は、例えば、図３（ａ）に示すように、キャビティ１２の長手方向および短手方向のそれぞれ２等分する２本の分割線の組み合わせとすることもできる（分割線は計２本）。また、図３（ｂ）に示すように、長手方向および短手方向にそれぞれ４等分する分割線の組み合わせとすることもできる（分割線は計６本）。さらに、図３（ｃ）に示すように、長手方向に８等分する分割線と短手方向に４分割する分割線との組み合わせとすることもできる（分割線は計１０本）。
（２）周縁高さの測定と基準高さの算出
まず基準高さ（Ｈ）を求める。基準高さ（Ｈ）とは、カバー部材１０を基板４の核酸固定領域６に対向するように装着したとき形成されるキャビティ１２の外縁に対応するカバー部材１０の周縁部の核酸固定領域６を含む表面からの高さ（以下、周縁部高さという。）の平均値である。周縁部高さは、図３に示すとおり、分割線上の周縁部において計測する。分割線は、キャビティ１２を分割しているため、一つの分割線について周縁部の高さは対向する周縁部の２点を計測することになる。したがって、周縁高さの測定箇所数は、分割線の数×２となる。すべての分割線上における周縁部高さを測定し、これらから平均値を求め、これを基準高さ（Ｈ）とする。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましい周縁高さの測定個所は、４箇所以上であり、より好ましくは、２０箇所以上である。
（３）カバー部材の表面のうねり量の測定
カバー部材１０の表面のうねり量は、分割線上のカバー部材１０の対向領域１４に対応する領域の外表面（基板４と対向しない側の表面）の周縁部を基準とした表面の凹凸の変動量として測定する。うねり量としては、一つの分割線をその測定軌跡として測定し、最高値と最低値とのみを用いればよい。したがって、うねり量の測定箇所は、結果として各分割線に対して２箇所ということになり、分割線の数×２がうねり量の測定箇所数となる。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましいうねり量の測定個所は、４箇所以上であり、より好ましくは、２０箇所以上である。
（４）膜厚の測定
カバー部材１０の膜厚は、対向領域１４の膜厚を意味しており、対向領域１４の膜厚の平均値（Ｔave）を用いてもよいし、あるいは上記うねり量の最高値と最低値とをそれぞれ測定した部位の膜厚（Ｔmax、Ｔmin））を用いてもよいが、好ましくは平均値を用いる。なお、膜厚は、ノギスなどの計測装置など公知の計測装置により測定できる。
（５）空間高さの算出
これらのデータから一つの分割線上において複数の空間高さを求めることができる。一つの分割線上においては、うねり量の最高値と最低値（それぞれＭＡＸおよびＭＩＮとする）から最大の空間高さと最小の空間高さとを求めることができる。
最大空間高さ＝基準高さ（Ｈ）＋うねり量の最高値（ＭＡＸ）−膜厚（ＴaveあるいはＴmax）
最小空間高さ＝基準高さ（Ｈ）＋うねり量の最低値（ＭＩＮ）−膜厚（ＴaveあるいはＴmin）として得ることができる。
こうして、一つの分割線から最大空間高さと最小空間高さを得て、他の分割線からも同様に最大空間高さと最小空間高さとを得て、これらの平均値を、空間高さの平均値とし、標準偏差／空間高さの平均値×１００を変動係数（％）とする。
【００３７】
なお、カバー部材１０の所定位置における周縁高さは、例えば、デジタル測長機（デジマイクロ、株式会社Nikon製）によって測定することができ、カバー部材１０の表面のうねり量は、表面粗さ形状測定機（サーフコム、株式会社東京精密製）にて測定することができる。
【００３８】
さらに、キャビティ１２の容積は、必要に応じ適宜設計されるものであるが、０．１μＬ以上２０００μＬ以下であることが好ましい。より好ましくは１μＬ以上１０００μＬ以下である。
【００３９】
さらに、カバー部材１０の対向領域１４を含む部分は、外部からキャビティ１２内を視認可能な光透過性を有することが好ましいが、対向領域１４を含む部分の厚みの平均値が３００μｍ以上であることが好ましい。厚みの平均値が３００μｍ以上であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度の変動係数がよく抑制されるからである。該厚みはより好ましくは３５０μｍ以上である。なお、上限は特に限定しないが、厚いため熱容量が大きくなり過ぎて加熱時にキャビティの温度分布の不均一性が生起してしまうことを考慮すれば３０００μｍ以下であることが好ましい。
【００４０】
（その他の構造）
カバー部材１０にはハイブリダイズ液を注入するための開口２０を備えている。開口２０は２以上備えることが好ましく、少なくとも一つの開口２０は、カバー部材１０においてキャビティ１２を区画する輪郭近傍に開口していることが好ましい。かかる部位に開口されていることで、キャビティ１２に注入したハイブリダイズ液がキャビティ１２の内壁に留まりにくくキャビティ１２全体にハイブリダイズ液が容易に拡散される。より好ましくは、開口２０は、前記輪郭に沿って形成されおり、さらに好ましくは、前記開口２０によってキャビティ１２の内壁が外側に膨出した膨出部を構成するように形成されている。すなわち、図１に示すように、円形上にカバー部材１０に開口された開口２０は、平面形態が長円状のキャビティ１２の長径方向の両端に形成されるとともに、該両端部において開口２０の開口端縁の一部がキャビティ１２の両端を外側に膨出させるように形成されている。かかる開口２０からハイブリダイズ液が注入されると、開口２０の両側および反対側のいずれにもハイブリダイズ液が容易に拡散されることになる。なお、開口２０は、適当なシール材によって密閉される。
【００４１】
こうした本ハイブリダイズ装置２に用いるカバー部材１０は、実質的にカバー部材１０を構成する平板状体１０ａにシール層５を介してスペーサ８を積層することにより得ることができる。シール層５としては、平板状体１０ａとスペーサ８とを接着する接着剤層あるいは粘着剤層とすることができる。また、一つのカバー部材１０に対して、隣合う区画を遮断するような形態のスペーサ８を用いることで基板４上に複数個のキャビティ１２を形成するカバー部材１０も容易に得ることができる。
【００４２】
また、カバー部材１０は、複合体としてではなく一体の樹脂の成形体として得ることもできる。さらに、こうしたカバー部材１０の基板４あるいは基板保持体に対して装着するための部位には、接着剤や粘着剤の層を形成しておくことが好ましく、さらに、このような接着層は剥離可能なシートによって保護されていることが好ましい。したがって、本発明の別の形態として、このハイブリダイズ装置２と基板４とを備えるハイブリダイズ反応用キットも提供されることになる。このようなキットに備えられる基板４に核酸プローブなどを固定すれば有効な好ましい核酸アレイを得ることができる。なお、カバー部材１０は、基板４あるいは基板保持体に対して別個に備えられて適時に装着可能に備えられなくてもよい。カバー部材１０は、基板４あるいは基板保持体に対して接着により予め一体化されていてもよく、また、基板４等と一体の成形体として一体化されていてもよい。また、カバー部材１０は洗浄やシグナル検出のために基板４等に対し、該基板４等から分離可能に装着可能に形成されていてもよく、あるいは一体化されていてもよい。
【００４３】
カバー部材１０の対向領域１４を含む部分を弾性変形可能に形成してもよい。この部分あるいはカバー部材１０の全体を弾性変形可能な材料で形成することにより、対向領域１４にガス圧又は機械的外力を付加して変形させることでキャビティ１２内の液体を攪拌することができる。
【００４４】
また、カバー部材１０の対向領域１４のキャビティ１２に露出される側（基板４と対向される側の表面）には、凹部及び／又は凸部を備えることができる。この凹凸は、キャビティ１２内の液体を撹拌する場合に、液体の流れを複雑化して撹拌効率を向上させ、ひいてはハイブリダイズ効率を向上させることができる。こうした凹部及び／又は凸部は、カバー部材１０の対向領域１４を構成する材料で一体に備えていてもよいし、カバー部材１０の基板４に対向される側の表面にこうした凹部及び／又は凸部を備えるフィルムやシート状体を付着させることによっても形成できる。こうした凹部及び凸部の大きさは、特に限定しないで、キャビティの空間高さに応じて設定される。なお、こうした凹部及び／又は凸部に疎水性領域を備えていてもよい。
【００４５】
また、図９に示すように、カバー部材１０が基板４の固定領域６の存在する表面に積層されて一体化される場合、カバー部材１０の基板４の表面への当接部分には、カバー部材１０と基板４との積層状態を解除するためのタブ層を設けることができる。タブ層３０は、基板４とカバー部材１０とによりキャビティ１２が形成された状態において基板４及びカバー部材１０の外延から露出される露出端部を有していることが好ましい。この露出端部３２は、把持可能な程度の長さで露出されていることが好ましい。また、このタブ層３０は、少なくとも基板４との間においては剥離可能な程度に一体化されている。具体的には、タブ層３０の基板４側は剥離可能な程度の粘着性を有しているかあるいは同様の粘着程度の粘着剤層を介して基板４に一体化されている。このため、ハイブリダイゼーション後など、基板４とカバー部材１０との積層形態を解除する場合には、このタブ層３０の露出端部３２を把持して外側に引っ張ることで、タブ層３０と基板４との積層状態が崩壊し、この結果、基板４とカバー部材１０との積層状態も解除されることになる。こうした解除形態によれば、基板４に大きな負荷をかけることなく容易にカバー部材１０を除去できる。
【００４６】
タブ層３０の有する露出端部３２は、器具又は手指等によって把持可能であればよく、タブ層３０のごく一部であってもよいし、基板４とカバー部材１０との積層体の周囲にわたって備えられていてもよい。また、タブ層３０は、基板４と剥離可能な粘着性を有する材料（例えば、樹脂材料やシリコンゴムなどのゴム材料）で形成されていることが好ましい。この場合、基板４との間においては、特別な粘着剤層は必要がなくなるからである。また、タブ層３０は、カバー部材１０の一部であってもよいし、そうでなくてもよい。カバー部材１０に対しても剥離可能な程度に一体化されていてもよい。後者の場合には、結果として、基板４への負荷を一層軽減できる。
【００４７】
(核酸のハイブリダイズ方法)
このハイブリダイズ装置２を用いたハイブリダイズ反応は常法に準じて行うことができる。例えば、本ハイブリダイズ装置２あるいはカバー部材１０を用いるハイブリダイズ工程は次のようにして行うことができる。基板４としてのＤＮＡマイクロアレイに、基板４への装着側にシール層を有するカバー部材１０を該シール層を介して貼着し、開口２から所定の方法で調製したハイブリダイズ液を注入し、２つの開口２０の双方をシール材でシールして、２５℃以上８０℃以下の温度で所定時間静置する。
【００４８】
本ハイブリダイズ装置２によれば、キャビティ１２内に露出される少なくとも一部に疎水性領域１６を有するため、攪拌、振動、摩擦、噴流等を基板４に対して付与するなど、外力を加えなくても、キャビティ１２内におけるハイブリダイズ液の対流あるいは被験核酸の拡散を促進してハイブリダイズ反応を促進しその効率を向上させることができる。したがって、本ハイブリダイズ装置２あるいはカバー部材１０は、静置状態でハイブリダイズ反応を行うハイブリダイズ方法およびかかるハイブリダイズ工程を含む各種の検査方法に好ましく用いることができる。さらに、静置によっても十分なハイブリダイズ反応の促進効果を有するため、作業者の基板４やカバー部材１０の取り扱い操作の違いなどの作業者によるバラツキ要因およびハイブリダイズ時のハイブリダイズ装置２の静置場所の水平性や外力の大小などの外部環境によるバラツキ要因による影響を抑制して再現性の高いハイブリダイズ結果を得ることができる。
【００４９】
また、本ハイブリダイズ装置２およびカバー部材１０が形成するキャビティ１２においてキャビティ１２の空間高さおよびその変動係数の制御ならびに対向領域１４部分の厚みの制御することで、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを抑制して精度の高いシグナル検出が可能となる。このようなキャビティ１２の構造あるいは寸法制御によって、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキ抑制のための従来採用されていた各種の上記した手法を採用することなく簡易な構成でハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキ抑制という効果が得ることができる。なお、このようなキャビティ１２の構造あるいは寸法制御は、核酸固定領域６の単位面積当たりのハイブリダイズ液量を均一化あるいは熱緩衝効果によって得られた効果であるということもできる。
【００５０】
また、カバー部材１０の対向領域１４の基板４に対向される側に凹部及び／又は凸部を有している場合には、静置によっても、好ましい液体の対流が得られ、ハイブリダイズ反応の効率を向上させることができる。
【００５１】
ハイブリダイズ工程においては、キャビティ１２を構成する基板４及びカバー部材１０を内の液体を攪拌する撹拌工程を実施してもよい。キャビティ１２内の少なくとも一部には疎水領域１６を有するため、キャビティ１２内の水性の液体が撹拌された際に、疎水性領域１６において液体が撥液されることにより、キャビティ１２内のハイブリダイズ液の移動が促進され、この結果、より一層ハイブリダイズ効率が向上される。
【００５２】
キャビティ１２内の液体の攪拌のためには、例えば、キャビティ１２を形成した基板４やハイブリダイズ装置２を動かすことが有効である。具体的な動作としては、基板４を含んでキャビティ１２を構成する部材を、回転運動、旋回運動、シーソー運動、往復運動、転倒運動又はこれらの２種類以上の組み合わせなどの各種動作が挙げられる。他には、カバー部材１０の対向領域１４が弾性変形可能である場合には、この対向領域１４を外力により変形させることによってもキャビティ１２内の液体の攪拌が可能である。具体的には、ローラーなどの回転体を回転させつつ対向領域１４上を移動させたり、その他の押圧部材を対向領域１４上を押圧しながら移動させることが挙げられる。こうした撹拌工程は、ハイブリダイズ工程の全体を通じて実施してもよいし、断続的に又はその一部においてのみ実施してもよい。
【００５３】
こうしたキャビティ１２内の液体の攪拌にあたっては、キャビティ１２内にキャビティ１２内の液体と分離して存在する程度に該液体に不溶解性のガス（例えば、空気のほか、窒素などの不活性ガスなど）を存在させた状態とすることが好ましい。通常、ガスがキャビティ１２内に存在する場合、キャビティ１２が静置状態であると、ガスが定位置で保持されるため、ガスの保持部分（ガス溜り）においてはハイブリダイゼーションが進行しにくいが、ガスを存在させた上でキャビティ１２内の液体を移動させるような外力が付加されることで、キャビティ１２内の液体の移動を促進することができ、これにより、ハイブリダイズ反応を促進することができる。
【００５４】
特に、キャビティ１２の一部に疎水性領域１６を有する場合には、ガス溜りの移動にあたり、水性の液体が疎水性領域１６において撥液されることにより、ガス溜りの移動が促進され、ガス溜りの移動による撹拌効果が向上される。また、カバ−部材１０の対向領域１４の基板４に対向される側に凹部及び／又は凸部を有することにより、ガス溜りの移動範囲も変化するため、より高い撹拌効果が得られる。
【００５５】
キャビティ１２内にガスを存在させる場合、キャビティ１２内のガス溜りをキャビティ１２内における１個又は２個以上の撹拌子のようにして基板４等を動かすようにすることが好ましい。より具体的には、ガス溜りがその形態をおおよそ維持した状態でキャビティ１２内を移動するように基板４等を動かすことが好ましい。こうすることで、ハイブリダイズ反応を効果的に促進できる。ここで、ガス溜りがその形態をおおよそ維持した状態で移動するとは、撹拌工程の半分以上の範囲においてキャビティ１２内のガスが単一又は２個以上のガス溜りとして移動又は保持されることを認識できるものであればよく、例えば、基板４を激しく振とうしてキャビティ１２内の液体の全体に分散して存在することが撹拌工程の優勢となるような状態は排除される。なお、ガス溜りがキャビティ１２内の移動の際に、一時的に集合したり分離したりしてもよいし、一時的にはガスが液体全体に分散するような形態となってもよい。
【００５６】
ガス溜りがおおよそその形態を維持してキャビティ１２内を移動させるための動作形態は、好ましくは、回転運動、シーソー運動あるいはこれらの組み合わせである。こうした動作形態によれば、安定してガス溜りにキャビティ１２内を移動させることができる。例えば回転運動の場合、水平状の回転軸によって支持される縦型のローターを備える回転装置においては、回転半径（回転中心からアレイ（ハイブリダイズ装置及び基板）の重心までの距離とする。）が１２ｍｍ〜１５０ｍｍであり、回転数（ｒｐｍ）が６０ｒｐｍ以下であることが好ましい。６０ｒｐｍ以下であると、ガス溜りの形態を安定して保持できる傾向がある。より好ましくは２０ｒｐｍ以下であり、さらに好ましくは１０ｒｐｍ以下である。１０ｒｐｍ以下であると、ガスをあまり分離することなく安定してキャビティ１２内を移動させられるからである。最も好ましくは５ｒｐｍ以下である。５ｒｐｍ以下であるとガスを一時的にも分離することなく安定してキャビティ１２内を移動させられ、シグナル強度の増大とともにバラツキを良く抑えることができるからである。また、シーソー運動の場合、支点からの距離（支点からアレイ（ハイブリダイズ装置及び基板）の重心までの距離とする。）が０〜７６ｍｍであり、上下動が総角５°以上１００°以下の範囲である場合、シーソー運動（上下動で１回とする。）は、１回〜１２０回／分であることが好ましい。
【００５７】
また、ガス溜りの移動には、カバー部材１０の対向領域１４が弾性変形可能として、この対向領域１４を外力により変形させることも有効である。
【００５８】
ガスの容量はこうした促進効果が得られる範囲であればよいが、好ましくは、キャビティ１２の全容積の５０％以下である。５０％以下であれば、気泡の存在によるハイブリダイズ反応への悪影響を抑制しつつハイブリダイズ反応を行うことができる。より好ましくは、３０％以下である。３０％以下であれば、加熱時のガス膨張並びにチャンバー作製時の接着面等に残留した空気が膨張したときの影響を抑制して確実にハイブリダイズすることができる。さらに好ましくは１５％以下であり、５％であっても良好なハイブリダイズ反応を行うことができる。
【００５９】
以上のことから、本発明の別の形態として、予め１種あるいは２種以上の核酸プローブが固定された核酸固定領域を有する基板４と、前記核酸固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材１０と、を備え、前記キャビティ内部に露出される少なくとも一部に疎水性領域を有する、核酸アレイも提供される。こうした核酸アレイによれば、カバー部材１０によって効率的なハイブリダイズ反応が可能なチャンバーが予め形成されているため、一層容易かつ効率的に核酸のハイブリダイズ反応を行うことができる。カバー部材１０は、既に説明したように、基板４あるいは基板保持体に対して接着や成形等により予め一体化させておくことができる。さらに、基板４や基板保持体に対して予め一体化されたカバー部材１０は、基板４等から分離可能とされていてもよい。また、アレイは、タブ層３０を備えていてもよい。このアレイにおいては、上記したカバー部材１０や基板４における各種の態様がそのまま適用される。
【００６０】
また、以上のことから、本発明のさらに別の形態として、基板４の固定領域６を含んだキャビティ１２内においてキャビティ１２に供給されたハイブリダイズ液中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施するハイブリダイズ工程において、キャビティ１２内に存在させた不溶解性のガスをキャビティ内で移動させる、核酸のハイブリダイズ方法も提供される。なお、このハイブリダイズ方法におけるキャビティ１２は疎水性領域１６を備える必要はなく、疎水性領域１６を備えていなくても、ガス溜りの移動によってキャビティ１２内の液体を撹拌することができる。この核酸ハイブリダイズ方法における、ガス又はガス溜りの移動については、上記した各種態様をそのまま適用できる。
【００６１】
また、こうしたハイブリダイズ方法におけるキャビティ１２としては、既に説明したように、基板の固定領域６の対向する対向領域１４に凹部及び／又は凸部を有していることが好ましい。すなわち、基板４と基板４の固定領域６に対向する対向領域１４の基板４に対向される側に凹部及び／又は凸部を有するカバー部材１０によって形成されるキャビティ１２が挙げられる。こうしたキャビティ１２によれば、固定領域６に対向される凹凸によって、ガス溜りの移動範囲も変化するため、より高い撹拌効果が得られる。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
本実施例は、疎水性領域を有するハイブリダイズ装置（カバー部材）を用いたときのシグナル強度の向上を評価した例である。本実施例では、ガラス基板にｃＤＮＡが固定されたＤＮＡマイクロアレイに対して疎水性材料で形成したカバー部材をセットして相補的なｃＤＮＡハイブリダイズし、ハイブリダイズ産物のシグナル強度を評価した。対照として、カバー部材としてスライドガラスを用いた。
【００６３】
まず、ラット由来のｃＤＮＡを５０００種を準備し、図４に示すように、ポリＬ−リジンでコートしたガラス基板上にそれぞれ一定量を５０００点スポットするとともに、うち１種類の遺伝子を計９点スポットした。なお、５０００点のスポット径は約１５０μｍであり、９点のスポット径も約１５０μｍであった。こうしてｃＤＮＡをスポットしたガラス基板を８０℃で１時間加熱処理し、次いで、ブロッキング溶液（７０ｍＭ無水コハク酸、０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１−メチル−２−ピロリドン）に１５分間浸漬した後、沸騰した滅菌水中に３分間浸漬し、エタノールで脱水後、遠心乾燥し、ＤＮＡマイクロアレイとした。
【００６４】
また、ラットから取得したｍＲＮＡを前記アレイに対して１μｇ／枚用いて、細胞工学ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．７，Ｐ１０５２−１０５３（１９９９）記載の手順に従ってＣｙ３標識ｃＤＮＡを調製した。
【００６５】
一方、図２に示すように、７６．２ｍｍ×２５．４ｍｍの両面接着フィルムの一方の面に同一サイズであって片面に接着面を有するスペーサ材料（ＰＥＴ厚み１６０μｍ）の非接着面を重ね、長円状の刃で型抜きした長円状孔部（長径約５０ｍｍ×短径約２０ｍｍ）を有する積層体を形成し、この積層体の前記両面接着フィルムの他方の面に７６．２×２５．４のポリカーボネートフィルム（フィルム厚３００μｍ）を貼着してハイブリダイズ装置とした。このハイブリダイズ装置は、アレイに対して装着されることによりアレイ上を長円状に区画してキャビティを形成し、そのキャビティの長径方向に沿った両端部には、ハイブリダイズ液供給用の開口をそれぞれ有していた。本ハイブリダイズ装置は、ポリカーボネートフィルムに替えてガラスプレート（厚み３００μｍ）を用いる以外は実施例と同様に操作して対照例のハイブリダイズ装置とした。実施例および対照例のハイブリダイズ装置について次の方法でハイブリダイゼーションを実施し、次いで、シグナル強度を蛍光測定し、数値解析した。
【００６６】
ハイブリダイゼーションは、作製したアレイにハイブリダイズ装置を貼着し、一つの開口から作製した標識ｃＤＮＡ（終濃度５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）を１３０μＬ注入し、双方の開口を封止した。この状態のアレイとハイブリダイズ装置とを、４２℃で１６時間（湿度は特に調整せず）で静置状態でハイブリダイゼーションした。１６時間経過後、ハイブリダイズ装置をアレイから剥離し、アレイを（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）溶液、（１×ＳＳＣ）溶液および（０．１×ＳＳＣ）溶液の順でそれぞれの溶液内で５分間振とうして洗浄した。ついで、アレイを遠心（１０００ｒｐｍ、３分間）して乾燥させた後、スキャナーで(Scan Array ４０００、Packard BioChip Technologies社製)で蛍光を測定し、数値解析ソフト（Gene Pix Pro、Axon社製）で蛍光強度の数値化を行った。得られた数値に基づいて蛍光強度の比較を行った結果を図５に示す。
【００６７】
図５に示すように、ポリカーボネートフィルムを用いた実施例のハイブリダイズ装置を用いることで、ガラス製のハイブリダイズ装置を用いるよりも高いシグナル強度（約２．５倍）が得られることがわかった。すなわち、実施例のハイブリダイズ装置を用いることでハイブリダイズ反応の効率が向上されることがわかった。
【００６８】
（実施例２）
本実施例は、カバー部材の対向領域（基板の核酸固定領域に対向するカバー部材の領域）の厚みとシグナル強度の変動係数との関係を評価した例である。シグナル強度の変動係数はハイブリダイゼーションの良否を示す有効な指標の一つである。本実施例では、ポリカーボネートフィルムとして膜厚が３００μｍと１００μｍのものとをそれぞれ使用して２種類のハイブリダイズ装置を作製した以外は、実施例１と同様に操作して、同一遺伝子のｃＤＮＡがスポットされた９点のスポットのシグナル強度を測定し、変動係数を算出した。結果を図６に示す。
【００６９】
図６に示すように、対向領域の厚みが３００μｍであるハイブリダイズ装置を用いることで、同厚みが１００μｍを用いるよりもシグナル強度の変動係数がおおよそ半分以下となった。なお、シグナル強度の平均はほぼ同一であった。この結果から、対向領域の厚みを厚くすることで核酸固定領域の異なる位置におけるハイブリダイズ反応が均質化され、精度および再現性の良好なハイブリダイズ反応を実施できることがわかった。
【００７０】
（実施例３）
本実施例は、ハイブリダイズ装置が形成するキャビティの空間高さ（変動係数）の制御とシグナル強度の変動係数との関係を評価した例である。本実施例では、以下のように作製したハイブリダイズ装置を用いる以外は、実施例１と同様に操作して、同一遺伝子のｃＤＮＡがスポットされた９点のスポットのシグナル強度を測定し、その変動係数を算出した。ハイブリダイズ装置は、スペーサ材料として高さが１６０μｍのものを用い、このスペーサ−材料に積層されるポリカーボネートフィルム（膜厚、平均値３００μｍ）の対向領域となる部分をおおよそ３０ｍｍ×１０ｍｍ程度の範囲でアレイ側に凸状に変形させて、最終的に得られるキャビティの空間高さの最大値と最小値とから求めた変動係数が１０％〜１００％（１０％きざみで）となるように１０種類のハイブリダイズ装置を作製した。空間高さの平均値および変動係数は、既に説明した高さー表面うねり量法による測定した。分割線としては、キャビティを長手方向に８等分割するように７本の分割線をひき、短手方向に４等分割する３本の分割線をひいた上、これらの分割線上においてそれぞれ周縁高さと表面うねり量の最高値と最低値とを求めた。また、周縁高さは、デジタル測長機（デジマイクロ、株式会社Nikon製）によって測定し、表面のうねり量は、表面粗さ形状測定機（サーフコム、株式会社東京精密製）にて測定した。結果を図７に示す。
【００７１】
図７に示すように、全体としては、空間高さの変動係数が増大するにつれシグナル強度の変動係数も増大したが、空間高さの変動係数が５０％以下の範囲では、シグナル強度の変動係数は２０％以下に抑制されるとともに、シグナル強度の変動係数の増加割合もかったが、空間高さの変動係数が５０％を超えると、シグナル強度の変動係数が増大し、またその増加割合も大きくなった。以上のことから、キャビティの空間高さの変動係数は５０％以下であることが好ましいことがわかった。
【００７２】
（実施例４）
本実施例は、ハイブリダイズ装置が形成するキャビティの空間高さ（寸法）の制御とシグナル強度の変動係数との関係を評価した例である。本実施例では、以下のように作製したハイブリダイズ装置を用いる以外は、実施例１と同様に操作して、同一遺伝子のｃＤＮＡがスポットされた９点のスポットのシグナル強度を測定し、その変動係数を算出した。ハイブリダイズ装置は、スペーサ材料として高さが５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、４０μｍ、８０μｍ、１２０μｍ、１６０μｍ、１８０μｍを用いるとともに、これら各種の高さのスペーサ−材料に積層されるポリカーボネートフィルム（膜厚、平均値３００μｍ）の対向領域となる部分をおおよそ３０ｍｍ×１０ｍｍ程度の範囲でアレイ側に凸状に変形させて、最終的に得られるキャビティの空間高さの最大値と最小値とから求めた変動係数が５０％となるように９種類のハイブリダイズ装置を作製した。空間高さの平均値および変動係数の算出は、実施例３と同様に行った。結果を図８に示す。
【００７３】
図８に示すように、キャビティの空間高さが小さくなるとシグナル強度の変動係数は顕著に大きくなる一方、１５μｍ以上であれば３０％以下であり、２０μｍ以上であればほぼ安定して２０％程度であった。以上のことから、キャビティの空間高さは１５μｍ以上２００μｍ以下の範囲でシグナル強度の変動係数を抑制できることから再現性の高いハイブリダイズ反応が実現できることがわかった。
【００７４】
（実施例５）
本実施例は、ハイブリダイズ装置が形成するキャビティ内の液体を攪拌（回転式）することとシグナル強度との関係を評価した例である。本実施例は、以下のような操作及びハイブリダイズ条件を用いる以外は、実施例１と同様に行い、蛍光強度の数値化を行った。すなわち、標識ｃＤＮＡの注入量を１１０μＬとし、ハイブリダイズ温度を６０℃とし、ハイブリダイゼーションの間（１６時間）、アレイとハイブリダイズ装置とを、ハイブリダイゼーション装置（ＴＡＩＴＥＣ社製ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ（ＨＢ−１００））の回転式ユニットの回転軸に対してアレイの重心が半径約７５ｍｍの位置になるようにセットした状態で回転数を４ｒｐｍとして動かした。この回転条件によれば、ハイブリダイゼーション中、いずれのアレイのキャビティ中の空気（約２０μＬ、１５ｖｏｌ％）は、その形態をおおよそ維持した状態でキャビティ内をゆっくりと移動していた。なお、ハイブリダイゼーション中静置する以外は上記と同様に操作したものを対照例として同様に蛍光強度の数値化を行った。この結果を図１０に示す。
【００７５】
図１０に示すように、基板とハイブリダイズ装置とを回転した実施例５のシグナル強度は、対照例のシグナル強度の約５倍であった。また、ＣＶも対照例が１３％であるのに対し、実施例５は５％であった。以上のことから、基板とハイブリダイズ装置とで構成されるキャビティ内に空気（ガス）を内在させ、この空気が移動するように基板とハイブリダイズ装置とを動作（回転）させることで、ハイブリダイゼーション効率を向上させ、シグナル強度を向上させられることがわかった。シグナル強度の向上は、精度と再現性の向上に大きく寄与するため、こうした撹拌形態によれば精度と再現性の向上とを向上させることができる。
【００７６】
なお、チャンバーにおける空気量を５ｖｏｌ％、３０ｖｏｌ％及び５０ｖｏｌ％となるように標識ｃＤＮＡの注入量を６５μＬ、９０μＬ及び１１３．５μｌの３種類とした以外は、上記と同様に操作しハイブリダイズするとともに、対照例も同時に準備して蛍光強度の数値化を行った。その結果、いずれの空気量であっても、対照例の約５倍のシグナル強度を示した。以上のことから、空気量が５ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％以下の範囲において、好ましいハイブリダイゼーション効率が得られていることがわかった。
【００７７】
（実施例６）
本実施例は、ハイブリダイズ装置が形成するキャビティ内の液体を攪拌（シーソー式）することとシグナル強度との関係を評価した例である。本実施例は、図１１に示す構造のカバー部材を用いて容積４００μＬのキャビティを構成した点、及び以下のような操作及びハイブリダイズ条件を用いる以外は、実施例１と同様に行い、蛍光強度の数値化を行った。
【００７８】
本実施例のハイブリダイズ装置（カバー部材１１０）は、以下のように作製した。まず、アクリル樹脂をスペーサ形状に切削加工してアクリル樹脂片１０２を作製した。一方、剥離可能な粘着層を有する片面シールを両面シールの接着層に積層しアクリル樹脂片１０２と同形状に打ち抜いてシール材１０４を作製した。また、両面シールのみをアクリル樹脂片１０２と同形状に打ち抜いたシール材１０６も作製した。次に、アクリル樹脂片１０２の片面にシール材１０４を貼着し、他の面にシール材１０６を貼着した。この積層体のシール材１０６の接着層にポリカーボネート製フィルム（厚み０．３ｍｍ、注入口加工済み）１０７を積層した。さらに、アクリル樹脂片１０２よりやや外側に膨出した輪郭を有するシリコンゴム片１０８を準備し、このシリコンゴム片１０８を、シール材１０４の剥離可能な粘着層に対して、その周縁がアクリル樹脂片１０２よりも外側にはみ出すようにして貼着し、カバー部材１１０（総厚５ｍｍ）を作製した。このカバー部材を実施例１と同様にして作製したアレイに貼り付けて、真空状態（−９８ｋＰａ）で３０分以上放置した。こうして本実施例のハイブリダイズ装置により反応用のキャビティを構築した。
【００７９】
また、標識ｃＤＮＡの注入量を２００μＬとし、ハイブリダイズ温度を６０℃とし、ハイブリダイゼーションの間（１６時間）、アレイとハイブリダイズ装置とを、ハイブリダイゼーション装置（Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｒｏｃｋｅｒ（３５／３５Ｄ））を用いて、上下動角度±２０°、上下動回数５０回／分のシーソー条件でアレイ（基板）及びハイブリダイズ装置とを動かした。アレイは、その重心がシーソーの支点に一致するようにセットした。このシーソー条件によれば、ハイブリダイゼーション中、キャビティ中の空気（約２００μＬ、５０ｖｏｌ％）は、その形態をおおよそ維持した状態でキャビティ内をゆっくりと移動していた。なお、ハイブリダイゼーション中静置する以外は上記と同様に操作したものを対照例として同様に蛍光強度の数値化を行った。
【００８０】
この結果、基板とハイブリダイズ装置とをシーソー式で動かした実施例６のシグナル強度は、対照例のシグナル強度の約５倍であった。以上のことから、基板とハイブリダイズ装置とで構成されるキャビティ内に空気（ガス）を内在させ、この空気が移動するように基板とハイブリダイズ装置とを動作（シーソー運動）させることで、ハイブリダイゼーション効率を向上させ、シグナル強度を向上させられることがわかった。シグナル強度の向上は、精度と再現性の向上に大きく寄与するため、こうした撹拌形態によれば精度と再現性の向上とを向上できる。
【００８１】
また、本実施例におけるカバー部材１１０は、タブ層として機能するシリコンゴム片１０８を有しているため、アレイに負担をかけることなくまた小さな力でカバー部材１１０を基板から分離させることができた。
【００８２】
本発明は、２００４年７月２９日に出願された日本国特許出願２００４−２２１８０７号を優先権主張の基礎としており、その内容のすべてが編入される。
【００８３】
なお、本願の原出願の特許請求の範囲に記載された請求項は以下のとおりである。本明細書においても、以下の各請求項に係る発明が開示されている。
［請求項１］
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成可能なカバー部材を備え、
前記キャビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、装置。
［請求項２］
前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項１に記載の装置。
［請求項３］
前記カバー部材は、前記核酸プローブの固定領域に対向する領域に前記疎水性領域を有している、請求項１または２に記載の装置。
［請求項４］
前記疎水性領域は、水の接触角が３０°以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
［請求項５］
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域はその厚みが３００μｍ以上である、装置。
［請求項６］
前記カバー部材は前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項５に記載の装置。
［請求項７］
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下である、装置。
［請求項８］
前記空間高さの平均値が１５μｍ以上である、請求項７に記載の装置。
［請求項９］
前記カバー部材は前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項７または８に記載の装置。
［請求項１０］
前記カバー部材は、少なくともシート体と、該シート体と前記基板との間に介在させるスペーサと、を備える、請求項１〜９のいずれかに記載の装置。
［請求項１１］
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には前記チャンバー内に液体を供給するための開口を有し、該開口はその一部によって前記キャビティを構成する内周壁が外側に膨出した膨出状部を構成するように形成されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の装置。
［請求項１２］
前記開口は、前記キャビティの長尺方向の両端部位にそれぞれ形成されている、請求項１１に記載の装置。
［請求項１３］
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上である、請求項１〜１２のいずれかに記載の装置。
［請求項１４］
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有している、請求項１〜１３のいずれかに記載の装置。
［請求項１５］
前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、請求項１〜１４のいずれかに記載の装置。
［請求項１６］
核酸のハイブリダイズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板に対して請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置をセットするセット工程と、
前記固定領域を含んで形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施するハイブリダイズ工程と、
を備える、方法。
［請求項１７］
前記ハイブリダイズ工程は、前記基板と前記ハイブリダイズ装置とを静置して行う、請求項１６に記載の方法。
［請求項１８］
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内の液体を攪拌することを含む、請求項１７に記載の方法。
［請求項１９］
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内にガスを存在させた状態で実施する工程である、請求項１８に記載の方法。
［請求項２０］
前記ハイブリダイズ工程は、前記ガスをキャビティ内で移動させて前記液体を撹拌することを含む、請求項１９に記載の方法。
［請求項２１］
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティを形成した基板及びハイブリダイズ装置を動かして行うことを含む、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
［請求項２２］
核酸のハイブリダイズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハイブリダイズのための液体を貯留可能に形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程、を備え、
前記ハイブリダイズ工程は前記キャビティ内に存在させたガスを移動させて前記液体を撹拌することを含む、方法。
［請求項２３］
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ反応キットであって、
核酸プローブが固定されるための固定領域を有する基板と、
該基板の前記核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記キャビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、キット。
［請求項２４］
前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、請求項２３に記載のキット。
［請求項２５］
核酸のアレイであって、
１あるいは２以上の核酸プローブが固定された固定領域を有する基板と、
前記固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材と、
を備え、
前記キャビティ内部に露出される少なくとも一部に疎水性領域を有する、アレイ。
［請求項２６］
前記カバー部材は前記基板に対して分離可能に装着されている、請求項２５に記載のアレイ。
［請求項２７］
前記基板と前記カバー部材とは、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を介して積層されている請求項２５又は２６に記載のアレイ。
【符号の説明】
【００８４】
２ ハイブリダイズ装置、 ４ 基板、 ５ シール層、 ６ 核酸固定領域、 ８ スペーサ、１０ カバー部材、１０ａ 平板状体、１２ キャビティ、１４ 対向領域、１６ 疎水性領域、２０ 開口、３０ タブ層、３２ 露出端部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置、ハイブリダイズ方法および核酸アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡマイクロアレイなどの核酸プローブを固定した基板における核酸ハイブリダイズ反応を行うハイブリダイズ装置としては、例えば、特許文献１，２に示されるように、基板と基板に付着される可撓性層とを備えるものが提案されている。これらのハイブリダイズ装置では、作業者によるバラツキを低減し、小さな反応空間での核酸のハイブリダイズ効率を向上させるものとして、かかる空間内の流体成分に可撓性層を介してローラーにより外力を加えて積極的に混合を行わせている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００３−５１７１５６号公報
【特許文献２】特表２００３−５１７５９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ハイブリダイズ反応の結果得られるシグナル強度などのバラツキや不安定性は主としてハイブリダイズ反応中において生じるものである。しかしながら、かかるハイブリダイズ反応の場である反応空間あるいは内部の流体成分への外力の付加という手段によっては、ハイブリダイズ反応の不安定性が増大するばかりかハイブリダイズ反応の効率の増大という目的に対しても十分な効果が得られていない。したがって、現状においても依然として、微小な反応空間におけるハイブリダイズ反応の不安定性や不均一性を解決するという要望が存在しているが、具体的解決策は見出されていない。
【０００５】
そこで、本発明の一つの目的は、再現性の良好なハイブリダイズ反応を実現可能なハイブリダイズ装置およびハイブリダイズ方法を提供することである。また、本発明の他の一つの目的は、精度（正確性）の良好なハイブリダイズ反応を実現可能なハイブリダイズ装置およびハイブリダイズ方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記した課題について検討したところ、ハイブリダイズ反応を実施するキャビティに露出される領域の表面特性やキャビティの構造等が大きくシグナル強度やそのバラツキ（変動係数）に影響していることを見出し、これらを制御することでシグナル強度を向上させ、また、そのバラツキを抑制して再現性の良好なハイブリダイズ反応を実施できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、前記キャビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、装置が提供される。この形態においては、前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有していることが好ましい態様であり、さらに、前記カバー部材は、前記核酸プローブの固定領域に対向する領域に前記疎水性領域を有していることが好ましい態様である。これらの態様において、前記疎水性領域は、水の接触角が３０°以上であることが好ましい態様である。
【０００８】
本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域の厚みが３００μｍ以上である、装置が提供される。この形態において、前記カバー部材は前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有していることが好ましい態様である。
【０００９】
本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下である、装置が提供される。この形態においては、前記空間高さは１５μｍ以上であることが好ましい態様であり、前記カバー部材は前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有していることが好ましい態様である。
【００１０】
これらのいずれかのハイブリダイズ装置において、前記カバー部材は、少なくともシート体と、該シート体と前記基板との間に介在させるスペーサと、を備える、装置が提供される。また、上記したいずれかのハイブリダイズ装置において、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には前記チャンバー内に液体を供給するための開口を有し、該開口はその一部によって前記キャビティを構成する内周壁が外側に膨出した膨出状部を構成するように形成されていることが好ましい態様であり、この態様においては、前記開口は、前記キャビティの長尺方向の両端部位にそれぞれ形成されていることが好ましい。また、上記したいずれかのハイブリダイズ装置において、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上からなることが好ましい態様である。
【００１１】
また、これらのいずれかのハイブリダイズ装置において、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有していることが好ましい。また、これらのいずれかのハイブリダイズ装置においては、前記カバー部材には、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出される露出端部を有するタブ層を備えることが好ましい。
【００１２】
本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、核酸プローブが固定された固定領域を有する基板に対して上記いずれかの核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置をセットする工程と、前記固定領域を含んで形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程と、を備える、方法が提供される。この形態においては、前記ハイブリダイズ工程は、前記基板と前記ハイブリダイズ装置とを静置して行うことが好ましい態様である。また、この形態においては、前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内の液体を攪拌することが好ましい態様である。この態様においては、前記液体の攪拌を、前記キャビティを形成した基板及びハイブリダイズ装置を動かして行ってもよい。さらに、この態様においては、前記キャビティ内にガスを存在させた状態とすることが好ましく、ガスをキャビティ内で移動させて前記液体を撹拌することが好ましい。
【００１３】
本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ方法であって、核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハイブリダイズのための液体を貯留可能に形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程、を備え、前記ハイブリダイズ工程は前記キャビティ内に存在させたガスをキャビティ内で移動させて前記液体を撹拌する工程を含むことが好ましい態様である。この態様においては、前記ハイブリダイズ工程は、前記基板を含む前記キャビティを構成する部材を動かして行ってもよい。また、この態様においては、前記ハイブリダイズ工程は、前記基板と組み合わされて前記キャビティを形成する弾性変形可能なカバー部材に外力を付加して行ってもよい。
【００１４】
さらに、本発明の他の一つの形態によれば、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ反応キットであって、核酸プローブが固定されるための固定領域を有する基板と、該基板の前記核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、前記キャビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、キットが提供される。このキットにおいては、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有していることが好ましい。また、前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出される露出端部を有するタブ層を備えることが好ましい。
【００１５】
さらに、本発明の他の一つの形態によれば、核酸のアレイであって、１あるいは２以上の核酸プローブが固定された固定領域を有する基板と、前記固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材と、を備え、前記キャビティ内部に露出される少なくとも一部に疎水性領域を有する、アレイが提供される。このアレイにおいては、前記カバー部材は前記基板に対して分離可能に装着されていることが好ましい態様である。また、このアレイにおいては、前記基板と前記カバー部材とは、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を介して積層されていることが好ましい。また、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有していることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のハイブリダイズ装置の一例を示す図である。
【図２】図１に示すハイブリダイズ装置の平面図と断面図とを示す図である。
【図３】空間高さを測定するための測定部位を例示する図である。
【図４】実施例１において作製するＤＮＡマイクロアレイにおけるｃＤＮＡのスポットのアレイ図である。
【図５】ハイブリダイズ装置の材質とシグナル強度との関係を示す図である。
【図６】ハイブリダイズ装置の対向領域の厚みとシグナル強度との関係を示す図である。
【図７】キャビティの空間高さの変動係数とシグナル強度の変動係数との関係を示す図である。
【図８】キャビティの空間高さの変動係数とシグナル強度の変動係数との関係を示す図である。
【図９】タブ層を有するカバー部材及びアレイを示す図である。
【図１０】キャビティの空間高さとシグナル強度の変動係数との関係を示す図である。
【図１１】実施例６におけるカバー部材及びアレイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のハイブリダイズ装置は、核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成可能なカバー部材を備えている。そして、第１の形態のハイブリダイズ装置においては、前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有することを特徴としている。このハイブリダイズ装置によれば、ハイブリダイズを促進し、ハイブリダイズ産物の検出強度（シグナル強度）を高めることができる。このため、核酸プローブの固定領域全体で効率的なハイブリダイズ反応を実現でき、結果的にハイブリダイズ反応の再現性を向上させることができる。核酸のハイブリダイズ反応のための液体が貯留される微小なキャビティにおいて疎水性領域を設けることによりこのようなハイブリダイズ反応の促進効果を得られることは本発明者らの予想を超えるものであった。本発明を理論的に拘束するものではないが、本発明の上記効果はキャビティ内に疎水性領域を有することで、キャビティ内でのハイブリダイズ液の対流および被験核酸の拡散が促進され、プローブ核酸との接触確率およびハイブリダイズが促進されたことによると推論される。
【００１８】
また、本発明の第２の形態のハイブリダイズ装置は、前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域の厚みが３００μｍ以上であることを特徴としている。このハイブリダイズ装置によれば、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを低減することができ、ハイブリダイゼーションの検出精度と再現性とを高めることができる。本発明を理論的に拘束するものではないが、核酸プローブの固定領域に対向する領域のカバー部材の厚みが３００μｍ以上であることにより、キャビティ内にハイブリダイズ液を貯留し加熱したときにおいても、一定の熱容量を持つことによる熱緩衝材となるため、基板上における複数位置のハイブリダイズ反応を均一に行うことができると推論される。
【００１９】
さらに、本発明の第３の形態のハイブリダイズ装置は、前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下であることを特徴としている。このハイブリダイズ装置によれば、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを低減することができ、ハイブリダイゼーションの検出精度を高めることができる。本発明を理論的に拘束するものではないが、前記キャビティの空間高さの変動係数が５０％以下であると、キャビティ内壁の表面特性および形状によるハイブリダイズ液の対流ないし被験核酸の拡散への悪影響が抑制されて基板上における複数位置のハイブリダイズ反応を均一に行うことができると推論される。
【００２０】
また、本発明の核酸ハイブリダイズ方法は、核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハイブリダイズのための液体を貯留可能に形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程、を備え、前記ハイブリダイズ工程を前記キャビティ内に存在させたガスをキャビティ内で移動させて行うことを特徴とする。このハイブリダイズ方法によれば、ハイブリダイズ反応中のハイブリダイズ効率を向上させることができる結果、ハイブリダイズ産物によるシグナル強度を増大させることができ、また、そのバラツキを低減することができる。
【００２１】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、まず、これら第１〜第３のハイブリダイズ装置について説明しつつ、これらのハイブリダイズ装置を用いたハイブリダイズ方法、ハイブリダイズキットについて、図面を適宜参照しながら説明する。図１には、本ハイブリダイズ装置の一例が基板とともに示されており、図２には、その平面図と断面図とが示されている。
【００２２】
（ハイブリダイズ装置）
ハイブリダイズ装置２は核酸のハイブリダイズ反応のための装置である。ここで、核酸とは、少なくとも一部に核酸の塩基対合によって他の核酸とハイブリダイズするものであればよい。したがって、核酸とは、天然あるいは合成のヌクレオチドのオリゴマーおよびポリマーの双方を含み、さらにゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、ペプチド核酸を含む概念である。また、ハイブリダイズ反応とは、核酸分子間における塩基の対合による相補鎖間の結合反応を意味している。
【００２３】
（基板）
本ハイブリダイズ装置２が適用される基板４は、少なくとも核酸プローブが固定される核酸固定領域６を備えている。核酸固定領域６は、それぞれ核酸プローブが固定された微小な1以上の領域（スポットともいう。）が形成された、あるいは該微小領域が形成されるために準備された領域である。なお、本発明においては、基板４に対する核酸プローブの固定方法や固定形態については特に限定することなく本出願時における公知の全ての形態を包含するものである。基板４における核酸固定領域６は、微小な三次元形状を有している場合も含め実質的に平坦であることが好ましい。また、基板４は、基板４上に直接あるいは必要に応じて多孔質体などの介在物を介して核酸固定領域６を単数あるいは２以上有することができる。基板４に２以上の核酸固定領域６を有する場合には、これらは疎水性の離隔部によって互いに隔てられていてもよい。
【００２４】
また、基板４の形状は特に限定しない。例えば、平板のほか、基板４として機能する平坦な底部を有する凹状体が挙げられる。基板４を構成する材料は、従来この種の基板に用いられている各種の材料の他各種の材料を使用できる。例えば、ガラス、二酸化ケイ素、窒化ケイ素などのシリコン系セラミックスを含むセラミックス、シリコーン、ポリメチルメタクリレート、ポリ(メタ)アクリレートなどの樹脂、金、銀、銅等の金属などを用いることができる。所望の表面特性を付与するために適当なコートが施されていてもよい。なかでも、ガラス基板、シリコーン、アクリル樹脂を使用することができる。こうした基板４の最も典型例は、ｃＤＮＡプローブ等が固定されたＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイまたはｃＤＮＡ等が固定されていない（固定されるべき）ＤＮＡマイクロアレイ用等の基板である。
【００２５】
（カバー部材）
本ハイブリダイズ装置２は、基板４に対して使用されるカバー部材１０を備えている。カバー部材１０は、基板４の核酸固定領域６を含んだハイブリダイズ反応のためのキャビティ１２を構成する。カバー部材１０は、基板４に対して装着されるものとすることもできるが、基板４を収容あるいは保持する基板保持体に対して装着された結果として、基板４との間でキャビティ１２を構成するものであってもよい。前者の例としては、平板状あるいは平坦な底部を有する凹状の基板に対して装着される形態を挙げることができ、後者の例としては、平板状の基板を載置する平坦部あるいは凹状部を備える基板保持体に対して装着される形態を挙げることができる。
【００２６】
キャビティ１２は、核酸固定領域６を含んだ空間であって、前記ハイブリダイズ反応のための液体（以下、単にハイブリダイズ液という。）を貯留可能に形成される空間である。キャビティ１２は、核酸固定領域６上において所定の空間高さ（あるいは空間の厚み）を有する空間を有していることが好ましい。すなわち、カバー部材１０は、ハイブリダイズ液が貯留されない状態であっても基板４の核酸固定領域６に対向する領域（以下、単に対向領域という。）１４を基板４からいくらかの距離離れて保持できる構成を有していることが好ましい。カバー部材１０がこうした形態を有することで、基板４に対して特別な操作を施すことなく、カバー部材１０を基板４等に対して装着するだけで、核酸固定領域６に所定の空間高さを有するキャビティ１２を形成できる。
【００２７】
キャビティ１２内には、少なくとも基板４の核酸固定領域６とカバー部材１０の対向領域１４とが露出されている他、これらの領域以外にキャビティ１２を外部と遮断するために必要な追加の面が露出されている。追加の面は、基板４あるいはカバー部材１０の一部であってもよいし、さらに別個の部材で構成されていてもよい。キャビティ１２の平面形態は特に限定しないが、突状部や角部を有しないことが好ましい。このような個所には、ハイブリダイズ液が滞留しやすいからである。なお、後述するように外側に膨出する個所であっても、該個所が、十分に小さく全体として液体の滞留が抑制されるような曲線形態などを有する側壁部分近傍に形成されていれば、滞留が抑制される。好ましい平面形態としては、図１および図２に示すような長円や円などが挙げられる。また、キャビティ１２の対向領域１４は基板４から離れる方向に対して凸状としても凹状としてもよいが、平坦であることが好ましい。平坦であると、核酸固定領域６に対しておおよそ一定の空間高さを備えるキャビティ１２を容易に構成できるからである。
【００２８】
このようなカバー部材１０は、図１に示すように、基板４が平板である場合には、対向領域１４を含む平板状体１０ａの周囲に所定高さのスペーサ８を有する形態とすることもできる。図１においては、カバー部材１０は、基板４とほぼ同じ大きさで少なくとも基板４に対向する側にはほぼ平坦な表面を有する板状体１０ａと、その周縁に基板４との間に介在されるスペーサ８とを有している。他の形態としては、それ自体が核酸固定領域６を覆う所定形状のドームを有する形態とすることもできる。このような形態のカバー部材１０は、高分子材料の成形体とすることができる。一方、基板４が凹状部の底部を核酸固定領域６とする凹状体であるとか核酸固定領域６の外周に所定高さの周縁部を有する場合、さらには基板４が基板保持体などの底部に収容される場合など、カバー部材１０を装着するのにあたり核酸固定領域６が凹状部の底部に位置されるときには、これら凹状部の周縁の縦壁部分に装着される平板状体とすることもできる。
【００２９】
スペーサ８の材料としては、例えば、アクリル樹脂、熱可塑性エラストマー、天然あるいは合成ゴム、シリコーン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、ハロゲン化ビニル、ポリカーボネートを用いることができる。
【００３０】
（疎水性領域）
本ハイブリダイズ装置２は、キャビティ１２内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域１６を有している。疎水性とは、少なくとも撥水性を示す表面特性を意味し、好ましくは、親水処理など施されていない一般的なケイ酸ソーダガラスよりも高い撥水性を有していることを意味する。撥水性は、一般に平坦な表面における水の接触角で表現することができる。本発明における疎水性領域の水の接触角は、３０°以上であることが好ましく、より好ましくは６０°以上であり、さらに好ましくは７０°以上である。最も好ましくは、９０°以上である。なお、接触角とは、液滴を水平な固体板状に置いたときに液滴が固体と接している部分の角度をいうものとする。接触角は、静的接触角や臨界値としての前進接触角あるいは後退接触角、さらには動的接触角などをも用いることができるが、液滴法によって測定した静的接触角を用いることが好ましい。
【００３１】
なお、静的接触角を測定する液滴法は、（１）接線法、（２）θ／２法および（３）３点クリック法がある。（１）の接線法は、読み取り顕微鏡等を利用してカーソルを液滴の接線に合わせて接触角を直接求める方法であり、（２）のθ／２法は、液滴の片端と頂点とを結ぶ直線と固体面との角度を２倍して接触角として求める方法であり、（３）の３点クリック法は、液滴と固体面との接点2ヶ所と頂点をコンピュータ画像上等でクリックして画像処理により求める方法である。これらの液滴法においては、上記（２）および（３）の方法にて接触角を求めることが好ましい。
【００３２】
疎水性領域１６は、キャビティ１２内に露出される領域の少なくとも一部に備えられていればよいが、好ましくは、カバー部材１０に備えられる。カバー部材１０に疎水性領域１６を備えることで、シグナル強度を効果的に向上させることができる。カバー部材１０においては、対向領域１４に疎水性領域１６を有していることが好ましく、さらに好ましくは、核酸固定領域６のおおよそ全体に対応する対向領域１４の全体に均一に疎水性領域１６を備えることが好ましい。疎水性領域１６は、対向領域１４において複数個分散して備えられていてもよいが、好ましくは、対向領域１４のおおよそ全体を被覆するような連続状に備えられている。さらに、カバー部材１０のキャビティ１２に露出される全領域が疎水性領域１６であってもよい。
【００３３】
疎水性領域１６は、例えば、カバー部材１０自体の材質を疎水性材料を用いることで形成することもできるし、疎水性領域１６を形成しようとする領域に対して疎水性材料および／または疎水性(撥水性)を呈する表面形態を付与することによっても形成することができる。疎水性領域１６を構成する疎水性材料としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ハロゲン化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂およびこれらの樹脂のフッ化又は塩化物を挙げることができる。また、撥水性を呈する表面形態としては、例えば、各種材料表面に化学的な修飾や機械的処理により接触角が９０°以上になるように粗面化された形態を挙げることができる。
【００３４】
キャビティ１２における核酸固定領域６とこれに対向する対向領域１４との距離、すなわち、核酸固定領域６におけるキャビティ１２の空間高さの変動係数（標準偏差／平均値×１００（％））が５０％以下であることが好ましい。核酸固定領域６において空間高さの変動係数が５０％以下であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを抑制することができる。シグナル強度のバラツキが抑制されることは、精度の高い検出が可能となるとともに、再現性の高いハイブリダイズ反応が実現できることを意味する。例えば、空間高さの変動係数が５０％以下であるとシグナル強度の変動係数を２０％以下程度に容易に抑制することができる。空間高さの変動係数はより好ましくは４０％以下であり、さらに好ましくは３０％以下であり、最も好ましくは２０％以下である。本発明者らの今回得られた知見によれば、キャビティ１２内の核酸固定領域６の空間高さの変動係数が一定以下であることは、核酸固定領域６の単位面積あたりのハイブリダイズ液量（液厚）の均一性に大きく寄与していることがわかっている。
【００３５】
また、キャビティ１２の空間の高さの平均値は、１５μｍ以上であることが好ましい。１５μｍ以上であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキがよく抑制されるからである。より好ましくは、２０μｍ以上である。キャビティ１２の空間高さを２０μｍ以上とすることで、それによって確保される核酸固定領域６における液厚により、キャビティ１２内に露出される領域の影響を抑制してハイブリダイズ液の対流ないし被験核酸の拡散を確保できる。また、空間高さの平均値の上限は、好ましくは１０００μｍ以下である。さらに、こうしたキャビティ１２が区画する基板４上の面積は、１ｍｍ2以上２０００ｍｍ2以下であることが好ましい。
【００３６】
キャビティ１２における上記空間高さの平均値および空間高さの変動係数は、例えば、以下の方法（以下、高さ−表面うねり量法という。）により測定することができる。
（１）計測部位
カバー部材１０によって形成されるキャビティ１２を分割する分割線、好ましくは、キャビティ１２の中心線あるいは等分割線の分割線上を計測部位とする。計測部位は、例えば、図３（ａ）に示すように、キャビティ１２の長手方向および短手方向のそれぞれ２等分する２本の分割線の組み合わせとすることもできる（分割線は計２本）。また、図３（ｂ）に示すように、長手方向および短手方向にそれぞれ４等分する分割線の組み合わせとすることもできる（分割線は計６本）。さらに、図３（ｃ）に示すように、長手方向に８等分する分割線と短手方向に４分割する分割線との組み合わせとすることもできる（分割線は計１０本）。
（２）周縁高さの測定と基準高さの算出
まず基準高さ（Ｈ）を求める。基準高さ（Ｈ）とは、カバー部材１０を基板４の核酸固定領域６に対向するように装着したとき形成されるキャビティ１２の外縁に対応するカバー部材１０の周縁部の核酸固定領域６を含む表面からの高さ（以下、周縁部高さという。）の平均値である。周縁部高さは、図３に示すとおり、分割線上の周縁部において計測する。分割線は、キャビティ１２を分割しているため、一つの分割線について周縁部の高さは対向する周縁部の２点を計測することになる。したがって、周縁高さの測定箇所数は、分割線の数×２となる。すべての分割線上における周縁部高さを測定し、これらから平均値を求め、これを基準高さ（Ｈ）とする。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましい周縁高さの測定個所は、４箇所以上であり、より好ましくは、２０箇所以上である。
（３）カバー部材の表面のうねり量の測定
カバー部材１０の表面のうねり量は、分割線上のカバー部材１０の対向領域１４に対応する領域の外表面（基板４と対向しない側の表面）の周縁部を基準とした表面の凹凸の変動量として測定する。うねり量としては、一つの分割線をその測定軌跡として測定し、最高値と最低値とのみを用いればよい。したがって、うねり量の測定箇所は、結果として各分割線に対して２箇所ということになり、分割線の数×２がうねり量の測定箇所数となる。なお、空間高さの平均値および変動係数を得るのに好ましいうねり量の測定個所は、４箇所以上であり、より好ましくは、２０箇所以上である。
（４）膜厚の測定
カバー部材１０の膜厚は、対向領域１４の膜厚を意味しており、対向領域１４の膜厚の平均値（Ｔave）を用いてもよいし、あるいは上記うねり量の最高値と最低値とをそれぞれ測定した部位の膜厚（Ｔmax、Ｔmin））を用いてもよいが、好ましくは平均値を用いる。なお、膜厚は、ノギスなどの計測装置など公知の計測装置により測定できる。
（５）空間高さの算出
これらのデータから一つの分割線上において複数の空間高さを求めることができる。一つの分割線上においては、うねり量の最高値と最低値（それぞれＭＡＸおよびＭＩＮとする）から最大の空間高さと最小の空間高さとを求めることができる。
最大空間高さ＝基準高さ（Ｈ）＋うねり量の最高値（ＭＡＸ）−膜厚（ＴaveあるいはＴmax）
最小空間高さ＝基準高さ（Ｈ）＋うねり量の最低値（ＭＩＮ）−膜厚（ＴaveあるいはＴmin）として得ることができる。
こうして、一つの分割線から最大空間高さと最小空間高さを得て、他の分割線からも同様に最大空間高さと最小空間高さとを得て、これらの平均値を、空間高さの平均値とし、標準偏差／空間高さの平均値×１００を変動係数（％）とする。
【００３７】
なお、カバー部材１０の所定位置における周縁高さは、例えば、デジタル測長機（デジマイクロ、株式会社Nikon製）によって測定することができ、カバー部材１０の表面のうねり量は、表面粗さ形状測定機（サーフコム、株式会社東京精密製）にて測定することができる。
【００３８】
さらに、キャビティ１２の容積は、必要に応じ適宜設計されるものであるが、０．１μＬ以上２０００μＬ以下であることが好ましい。より好ましくは１μＬ以上１０００μＬ以下である。
【００３９】
さらに、カバー部材１０の対向領域１４を含む部分は、外部からキャビティ１２内を視認可能な光透過性を有することが好ましいが、対向領域１４を含む部分の厚みの平均値が３００μｍ以上であることが好ましい。厚みの平均値が３００μｍ以上であると、ハイブリダイズ産物のシグナル強度の変動係数がよく抑制されるからである。該厚みはより好ましくは３５０μｍ以上である。なお、上限は特に限定しないが、厚いため熱容量が大きくなり過ぎて加熱時にキャビティの温度分布の不均一性が生起してしまうことを考慮すれば３０００μｍ以下であることが好ましい。
【００４０】
（その他の構造）
カバー部材１０にはハイブリダイズ液を注入するための開口２０を備えている。開口２０は２以上備えることが好ましく、少なくとも一つの開口２０は、カバー部材１０においてキャビティ１２を区画する輪郭近傍に開口していることが好ましい。かかる部位に開口されていることで、キャビティ１２に注入したハイブリダイズ液がキャビティ１２の内壁に留まりにくくキャビティ１２全体にハイブリダイズ液が容易に拡散される。より好ましくは、開口２０は、前記輪郭に沿って形成されおり、さらに好ましくは、前記開口２０によってキャビティ１２の内壁が外側に膨出した膨出部を構成するように形成されている。すなわち、図１に示すように、円形上にカバー部材１０に開口された開口２０は、平面形態が長円状のキャビティ１２の長径方向の両端に形成されるとともに、該両端部において開口２０の開口端縁の一部がキャビティ１２の両端を外側に膨出させるように形成されている。かかる開口２０からハイブリダイズ液が注入されると、開口２０の両側および反対側のいずれにもハイブリダイズ液が容易に拡散されることになる。なお、開口２０は、適当なシール材によって密閉される。
【００４１】
こうした本ハイブリダイズ装置２に用いるカバー部材１０は、実質的にカバー部材１０を構成する平板状体１０ａにシール層５を介してスペーサ８を積層することにより得ることができる。シール層５としては、平板状体１０ａとスペーサ８とを接着する接着剤層あるいは粘着剤層とすることができる。また、一つのカバー部材１０に対して、隣合う区画を遮断するような形態のスペーサ８を用いることで基板４上に複数個のキャビティ１２を形成するカバー部材１０も容易に得ることができる。
【００４２】
また、カバー部材１０は、複合体としてではなく一体の樹脂の成形体として得ることもできる。さらに、こうしたカバー部材１０の基板４あるいは基板保持体に対して装着するための部位には、接着剤や粘着剤の層を形成しておくことが好ましく、さらに、このような接着層は剥離可能なシートによって保護されていることが好ましい。したがって、本発明の別の形態として、このハイブリダイズ装置２と基板４とを備えるハイブリダイズ反応用キットも提供されることになる。このようなキットに備えられる基板４に核酸プローブなどを固定すれば有効な好ましい核酸アレイを得ることができる。なお、カバー部材１０は、基板４あるいは基板保持体に対して別個に備えられて適時に装着可能に備えられなくてもよい。カバー部材１０は、基板４あるいは基板保持体に対して接着により予め一体化されていてもよく、また、基板４等と一体の成形体として一体化されていてもよい。また、カバー部材１０は洗浄やシグナル検出のために基板４等に対し、該基板４等から分離可能に装着可能に形成されていてもよく、あるいは一体化されていてもよい。
【００４３】
カバー部材１０の対向領域１４を含む部分を弾性変形可能に形成してもよい。この部分あるいはカバー部材１０の全体を弾性変形可能な材料で形成することにより、対向領域１４にガス圧又は機械的外力を付加して変形させることでキャビティ１２内の液体を攪拌することができる。
【００４４】
また、カバー部材１０の対向領域１４のキャビティ１２に露出される側（基板４と対向される側の表面）には、凹部及び／又は凸部を備えることができる。この凹凸は、キャビティ１２内の液体を撹拌する場合に、液体の流れを複雑化して撹拌効率を向上させ、ひいてはハイブリダイズ効率を向上させることができる。こうした凹部及び／又は凸部は、カバー部材１０の対向領域１４を構成する材料で一体に備えていてもよいし、カバー部材１０の基板４に対向される側の表面にこうした凹部及び／又は凸部を備えるフィルムやシート状体を付着させることによっても形成できる。こうした凹部及び凸部の大きさは、特に限定しないで、キャビティの空間高さに応じて設定される。なお、こうした凹部及び／又は凸部に疎水性領域を備えていてもよい。
【００４５】
また、図９に示すように、カバー部材１０が基板４の固定領域６の存在する表面に積層されて一体化される場合、カバー部材１０の基板４の表面への当接部分には、カバー部材１０と基板４との積層状態を解除するためのタブ層を設けることができる。タブ層３０は、基板４とカバー部材１０とによりキャビティ１２が形成された状態において基板４及びカバー部材１０の外延から露出される露出端部を有していることが好ましい。この露出端部３２は、把持可能な程度の長さで露出されていることが好ましい。また、このタブ層３０は、少なくとも基板４との間においては剥離可能な程度に一体化されている。具体的には、タブ層３０の基板４側は剥離可能な程度の粘着性を有しているかあるいは同様の粘着程度の粘着剤層を介して基板４に一体化されている。このため、ハイブリダイゼーション後など、基板４とカバー部材１０との積層形態を解除する場合には、このタブ層３０の露出端部３２を把持して外側に引っ張ることで、タブ層３０と基板４との積層状態が崩壊し、この結果、基板４とカバー部材１０との積層状態も解除されることになる。こうした解除形態によれば、基板４に大きな負荷をかけることなく容易にカバー部材１０を除去できる。
【００４６】
タブ層３０の有する露出端部３２は、器具又は手指等によって把持可能であればよく、タブ層３０のごく一部であってもよいし、基板４とカバー部材１０との積層体の周囲にわたって備えられていてもよい。また、タブ層３０は、基板４と剥離可能な粘着性を有する材料（例えば、樹脂材料やシリコンゴムなどのゴム材料）で形成されていることが好ましい。この場合、基板４との間においては、特別な粘着剤層は必要がなくなるからである。また、タブ層３０は、カバー部材１０の一部であってもよいし、そうでなくてもよい。カバー部材１０に対しても剥離可能な程度に一体化されていてもよい。後者の場合には、結果として、基板４への負荷を一層軽減できる。
【００４７】
(核酸のハイブリダイズ方法)
このハイブリダイズ装置２を用いたハイブリダイズ反応は常法に準じて行うことができる。例えば、本ハイブリダイズ装置２あるいはカバー部材１０を用いるハイブリダイズ工程は次のようにして行うことができる。基板４としてのＤＮＡマイクロアレイに、基板４への装着側にシール層を有するカバー部材１０を該シール層を介して貼着し、開口２から所定の方法で調製したハイブリダイズ液を注入し、２つの開口２０の双方をシール材でシールして、２５℃以上８０℃以下の温度で所定時間静置する。
【００４８】
本ハイブリダイズ装置２によれば、キャビティ１２内に露出される少なくとも一部に疎水性領域１６を有するため、攪拌、振動、摩擦、噴流等を基板４に対して付与するなど、外力を加えなくても、キャビティ１２内におけるハイブリダイズ液の対流あるいは被験核酸の拡散を促進してハイブリダイズ反応を促進しその効率を向上させることができる。したがって、本ハイブリダイズ装置２あるいはカバー部材１０は、静置状態でハイブリダイズ反応を行うハイブリダイズ方法およびかかるハイブリダイズ工程を含む各種の検査方法に好ましく用いることができる。さらに、静置によっても十分なハイブリダイズ反応の促進効果を有するため、作業者の基板４やカバー部材１０の取り扱い操作の違いなどの作業者によるバラツキ要因およびハイブリダイズ時のハイブリダイズ装置２の静置場所の水平性や外力の大小などの外部環境によるバラツキ要因による影響を抑制して再現性の高いハイブリダイズ結果を得ることができる。
【００４９】
また、本ハイブリダイズ装置２およびカバー部材１０が形成するキャビティ１２においてキャビティ１２の空間高さおよびその変動係数の制御ならびに対向領域１４部分の厚みの制御することで、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキを抑制して精度の高いシグナル検出が可能となる。このようなキャビティ１２の構造あるいは寸法制御によって、ハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキ抑制のための従来採用されていた各種の上記した手法を採用することなく簡易な構成でハイブリダイズ産物のシグナル強度のバラツキ抑制という効果が得ることができる。なお、このようなキャビティ１２の構造あるいは寸法制御は、核酸固定領域６の単位面積当たりのハイブリダイズ液量を均一化あるいは熱緩衝効果によって得られた効果であるということもできる。
【００５０】
また、カバー部材１０の対向領域１４の基板４に対向される側に凹部及び／又は凸部を有している場合には、静置によっても、好ましい液体の対流が得られ、ハイブリダイズ反応の効率を向上させることができる。
【００５１】
ハイブリダイズ工程においては、キャビティ１２を構成する基板４及びカバー部材１０を内の液体を攪拌する撹拌工程を実施してもよい。キャビティ１２内の少なくとも一部には疎水領域１６を有するため、キャビティ１２内の水性の液体が撹拌された際に、疎水性領域１６において液体が撥液されることにより、キャビティ１２内のハイブリダイズ液の移動が促進され、この結果、より一層ハイブリダイズ効率が向上される。
【００５２】
キャビティ１２内の液体の攪拌のためには、例えば、キャビティ１２を形成した基板４やハイブリダイズ装置２を動かすことが有効である。具体的な動作としては、基板４を含んでキャビティ１２を構成する部材を、回転運動、旋回運動、シーソー運動、往復運動、転倒運動又はこれらの２種類以上の組み合わせなどの各種動作が挙げられる。他には、カバー部材１０の対向領域１４が弾性変形可能である場合には、この対向領域１４を外力により変形させることによってもキャビティ１２内の液体の攪拌が可能である。具体的には、ローラーなどの回転体を回転させつつ対向領域１４上を移動させたり、その他の押圧部材を対向領域１４上を押圧しながら移動させることが挙げられる。こうした撹拌工程は、ハイブリダイズ工程の全体を通じて実施してもよいし、断続的に又はその一部においてのみ実施してもよい。
【００５３】
こうしたキャビティ１２内の液体の攪拌にあたっては、キャビティ１２内にキャビティ１２内の液体と分離して存在する程度に該液体に不溶解性のガス（例えば、空気のほか、窒素などの不活性ガスなど）を存在させた状態とすることが好ましい。通常、ガスがキャビティ１２内に存在する場合、キャビティ１２が静置状態であると、ガスが定位置で保持されるため、ガスの保持部分（ガス溜り）においてはハイブリダイゼーションが進行しにくいが、ガスを存在させた上でキャビティ１２内の液体を移動させるような外力が付加されることで、キャビティ１２内の液体の移動を促進することができ、これにより、ハイブリダイズ反応を促進することができる。
【００５４】
特に、キャビティ１２の一部に疎水性領域１６を有する場合には、ガス溜りの移動にあたり、水性の液体が疎水性領域１６において撥液されることにより、ガス溜りの移動が促進され、ガス溜りの移動による撹拌効果が向上される。また、カバ−部材１０の対向領域１４の基板４に対向される側に凹部及び／又は凸部を有することにより、ガス溜りの移動範囲も変化するため、より高い撹拌効果が得られる。
【００５５】
キャビティ１２内にガスを存在させる場合、キャビティ１２内のガス溜りをキャビティ１２内における１個又は２個以上の撹拌子のようにして基板４等を動かすようにすることが好ましい。より具体的には、ガス溜りがその形態をおおよそ維持した状態でキャビティ１２内を移動するように基板４等を動かすことが好ましい。こうすることで、ハイブリダイズ反応を効果的に促進できる。ここで、ガス溜りがその形態をおおよそ維持した状態で移動するとは、撹拌工程の半分以上の範囲においてキャビティ１２内のガスが単一又は２個以上のガス溜りとして移動又は保持されることを認識できるものであればよく、例えば、基板４を激しく振とうしてキャビティ１２内の液体の全体に分散して存在することが撹拌工程の優勢となるような状態は排除される。なお、ガス溜りがキャビティ１２内の移動の際に、一時的に集合したり分離したりしてもよいし、一時的にはガスが液体全体に分散するような形態となってもよい。
【００５６】
ガス溜りがおおよそその形態を維持してキャビティ１２内を移動させるための動作形態は、好ましくは、回転運動、シーソー運動あるいはこれらの組み合わせである。こうした動作形態によれば、安定してガス溜りにキャビティ１２内を移動させることができる。例えば回転運動の場合、水平状の回転軸によって支持される縦型のローターを備える回転装置においては、回転半径（回転中心からアレイ（ハイブリダイズ装置及び基板）の重心までの距離とする。）が１２ｍｍ〜１５０ｍｍであり、回転数（ｒｐｍ）が６０ｒｐｍ以下であることが好ましい。６０ｒｐｍ以下であると、ガス溜りの形態を安定して保持できる傾向がある。より好ましくは２０ｒｐｍ以下であり、さらに好ましくは１０ｒｐｍ以下である。１０ｒｐｍ以下であると、ガスをあまり分離することなく安定してキャビティ１２内を移動させられるからである。最も好ましくは５ｒｐｍ以下である。５ｒｐｍ以下であるとガスを一時的にも分離することなく安定してキャビティ１２内を移動させられ、シグナル強度の増大とともにバラツキを良く抑えることができるからである。また、シーソー運動の場合、支点からの距離（支点からアレイ（ハイブリダイズ装置及び基板）の重心までの距離とする。）が０〜７６ｍｍであり、上下動が総角５°以上１００°以下の範囲である場合、シーソー運動（上下動で１回とする。）は、１回〜１２０回／分であることが好ましい。
【００５７】
また、ガス溜りの移動には、カバー部材１０の対向領域１４が弾性変形可能として、この対向領域１４を外力により変形させることも有効である。
【００５８】
ガスの容量はこうした促進効果が得られる範囲であればよいが、好ましくは、キャビティ１２の全容積の５０％以下である。５０％以下であれば、気泡の存在によるハイブリダイズ反応への悪影響を抑制しつつハイブリダイズ反応を行うことができる。より好ましくは、３０％以下である。３０％以下であれば、加熱時のガス膨張並びにチャンバー作製時の接着面等に残留した空気が膨張したときの影響を抑制して確実にハイブリダイズすることができる。さらに好ましくは１５％以下であり、５％であっても良好なハイブリダイズ反応を行うことができる。
【００５９】
以上のことから、本発明の別の形態として、予め１種あるいは２種以上の核酸プローブが固定された核酸固定領域を有する基板４と、前記核酸固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材１０と、を備え、前記キャビティ内部に露出される少なくとも一部に疎水性領域を有する、核酸アレイも提供される。こうした核酸アレイによれば、カバー部材１０によって効率的なハイブリダイズ反応が可能なチャンバーが予め形成されているため、一層容易かつ効率的に核酸のハイブリダイズ反応を行うことができる。カバー部材１０は、既に説明したように、基板４あるいは基板保持体に対して接着や成形等により予め一体化させておくことができる。さらに、基板４や基板保持体に対して予め一体化されたカバー部材１０は、基板４等から分離可能とされていてもよい。また、アレイは、タブ層３０を備えていてもよい。このアレイにおいては、上記したカバー部材１０や基板４における各種の態様がそのまま適用される。
【００６０】
また、以上のことから、本発明のさらに別の形態として、基板４の固定領域６を含んだキャビティ１２内においてキャビティ１２に供給されたハイブリダイズ液中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施するハイブリダイズ工程において、キャビティ１２内に存在させた不溶解性のガスをキャビティ内で移動させる、核酸のハイブリダイズ方法も提供される。なお、このハイブリダイズ方法におけるキャビティ１２は疎水性領域１６を備える必要はなく、疎水性領域１６を備えていなくても、ガス溜りの移動によってキャビティ１２内の液体を撹拌することができる。この核酸ハイブリダイズ方法における、ガス又はガス溜りの移動については、上記した各種態様をそのまま適用できる。
【００６１】
また、こうしたハイブリダイズ方法におけるキャビティ１２としては、既に説明したように、基板の固定領域６の対向する対向領域１４に凹部及び／又は凸部を有していることが好ましい。すなわち、基板４と基板４の固定領域６に対向する対向領域１４の基板４に対向される側に凹部及び／又は凸部を有するカバー部材１０によって形成されるキャビティ１２が挙げられる。こうしたキャビティ１２によれば、固定領域６に対向される凹凸によって、ガス溜りの移動範囲も変化するため、より高い撹拌効果が得られる。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
本実施例は、疎水性領域を有するハイブリダイズ装置（カバー部材）を用いたときのシグナル強度の向上を評価した例である。本実施例では、ガラス基板にｃＤＮＡが固定されたＤＮＡマイクロアレイに対して疎水性材料で形成したカバー部材をセットして相補的なｃＤＮＡハイブリダイズし、ハイブリダイズ産物のシグナル強度を評価した。対照として、カバー部材としてスライドガラスを用いた。
【００６３】
まず、ラット由来のｃＤＮＡを５０００種を準備し、図４に示すように、ポリＬ−リジンでコートしたガラス基板上にそれぞれ一定量を５０００点スポットするとともに、うち１種類の遺伝子を計９点スポットした。なお、５０００点のスポット径は約１５０μｍであり、９点のスポット径も約１５０μｍであった。こうしてｃＤＮＡをスポットしたガラス基板を８０℃で１時間加熱処理し、次いで、ブロッキング溶液（７０ｍＭ無水コハク酸、０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１−メチル−２−ピロリドン）に１５分間浸漬した後、沸騰した滅菌水中に３分間浸漬し、エタノールで脱水後、遠心乾燥し、ＤＮＡマイクロアレイとした。
【００６４】
また、ラットから取得したｍＲＮＡを前記アレイに対して１μｇ／枚用いて、細胞工学ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．７，Ｐ１０５２−１０５３（１９９９）記載の手順に従ってＣｙ３標識ｃＤＮＡを調製した。
【００６５】
一方、図２に示すように、７６．２ｍｍ×２５．４ｍｍの両面接着フィルムの一方の面に同一サイズであって片面に接着面を有するスペーサ材料（ＰＥＴ厚み１６０μｍ）の非接着面を重ね、長円状の刃で型抜きした長円状孔部（長径約５０ｍｍ×短径約２０ｍｍ）を有する積層体を形成し、この積層体の前記両面接着フィルムの他方の面に７６．２×２５．４のポリカーボネートフィルム（フィルム厚３００μｍ）を貼着してハイブリダイズ装置とした。このハイブリダイズ装置は、アレイに対して装着されることによりアレイ上を長円状に区画してキャビティを形成し、そのキャビティの長径方向に沿った両端部には、ハイブリダイズ液供給用の開口をそれぞれ有していた。本ハイブリダイズ装置は、ポリカーボネートフィルムに替えてガラスプレート（厚み３００μｍ）を用いる以外は実施例と同様に操作して対照例のハイブリダイズ装置とした。実施例および対照例のハイブリダイズ装置について次の方法でハイブリダイゼーションを実施し、次いで、シグナル強度を蛍光測定し、数値解析した。
【００６６】
ハイブリダイゼーションは、作製したアレイにハイブリダイズ装置を貼着し、一つの開口から作製した標識ｃＤＮＡ（終濃度５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）を１３０μＬ注入し、双方の開口を封止した。この状態のアレイとハイブリダイズ装置とを、４２℃で１６時間（湿度は特に調整せず）で静置状態でハイブリダイゼーションした。１６時間経過後、ハイブリダイズ装置をアレイから剥離し、アレイを（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）溶液、（１×ＳＳＣ）溶液および（０．１×ＳＳＣ）溶液の順でそれぞれの溶液内で５分間振とうして洗浄した。ついで、アレイを遠心（１０００ｒｐｍ、３分間）して乾燥させた後、スキャナーで(Scan Array ４０００、Packard BioChip Technologies社製)で蛍光を測定し、数値解析ソフト（Gene Pix Pro、Axon社製）で蛍光強度の数値化を行った。得られた数値に基づいて蛍光強度の比較を行った結果を図５に示す。
【００６７】
図５に示すように、ポリカーボネートフィルムを用いた実施例のハイブリダイズ装置を用いることで、ガラス製のハイブリダイズ装置を用いるよりも高いシグナル強度（約２．５倍）が得られることがわかった。すなわち、実施例のハイブリダイズ装置を用いることでハイブリダイズ反応の効率が向上されることがわかった。
【００６８】
（実施例２）
本実施例は、カバー部材の対向領域（基板の核酸固定領域に対向するカバー部材の領域）の厚みとシグナル強度の変動係数との関係を評価した例である。シグナル強度の変動係数はハイブリダイゼーションの良否を示す有効な指標の一つである。本実施例では、ポリカーボネートフィルムとして膜厚が３００μｍと１００μｍのものとをそれぞれ使用して２種類のハイブリダイズ装置を作製した以外は、実施例１と同様に操作して、同一遺伝子のｃＤＮＡがスポットされた９点のスポットのシグナル強度を測定し、変動係数を算出した。結果を図６に示す。
【００６９】
図６に示すように、対向領域の厚みが３００μｍであるハイブリダイズ装置を用いることで、同厚みが１００μｍを用いるよりもシグナル強度の変動係数がおおよそ半分以下となった。なお、シグナル強度の平均はほぼ同一であった。この結果から、対向領域の厚みを厚くすることで核酸固定領域の異なる位置におけるハイブリダイズ反応が均質化され、精度および再現性の良好なハイブリダイズ反応を実施できることがわかった。
【００７０】
（実施例３）
本実施例は、ハイブリダイズ装置が形成するキャビティの空間高さ（変動係数）の制御とシグナル強度の変動係数との関係を評価した例である。本実施例では、以下のように作製したハイブリダイズ装置を用いる以外は、実施例１と同様に操作して、同一遺伝子のｃＤＮＡがスポットされた９点のスポットのシグナル強度を測定し、その変動係数を算出した。ハイブリダイズ装置は、スペーサ材料として高さが１６０μｍのものを用い、このスペーサ−材料に積層されるポリカーボネートフィルム（膜厚、平均値３００μｍ）の対向領域となる部分をおおよそ３０ｍｍ×１０ｍｍ程度の範囲でアレイ側に凸状に変形させて、最終的に得られるキャビティの空間高さの最大値と最小値とから求めた変動係数が１０％〜１００％（１０％きざみで）となるように１０種類のハイブリダイズ装置を作製した。空間高さの平均値および変動係数は、既に説明した高さー表面うねり量法による測定した。分割線としては、キャビティを長手方向に８等分割するように７本の分割線をひき、短手方向に４等分割する３本の分割線をひいた上、これらの分割線上においてそれぞれ周縁高さと表面うねり量の最高値と最低値とを求めた。また、周縁高さは、デジタル測長機（デジマイクロ、株式会社Nikon製）によって測定し、表面のうねり量は、表面粗さ形状測定機（サーフコム、株式会社東京精密製）にて測定した。結果を図７に示す。
【００７１】
図７に示すように、全体としては、空間高さの変動係数が増大するにつれシグナル強度の変動係数も増大したが、空間高さの変動係数が５０％以下の範囲では、シグナル強度の変動係数は２０％以下に抑制されるとともに、シグナル強度の変動係数の増加割合もかったが、空間高さの変動係数が５０％を超えると、シグナル強度の変動係数が増大し、またその増加割合も大きくなった。以上のことから、キャビティの空間高さの変動係数は５０％以下であることが好ましいことがわかった。
【００７２】
（実施例４）
本実施例は、ハイブリダイズ装置が形成するキャビティの空間高さ（寸法）の制御とシグナル強度の変動係数との関係を評価した例である。本実施例では、以下のように作製したハイブリダイズ装置を用いる以外は、実施例１と同様に操作して、同一遺伝子のｃＤＮＡがスポットされた９点のスポットのシグナル強度を測定し、その変動係数を算出した。ハイブリダイズ装置は、スペーサ材料として高さが５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、４０μｍ、８０μｍ、１２０μｍ、１６０μｍ、１８０μｍを用いるとともに、これら各種の高さのスペーサ−材料に積層されるポリカーボネートフィルム（膜厚、平均値３００μｍ）の対向領域となる部分をおおよそ３０ｍｍ×１０ｍｍ程度の範囲でアレイ側に凸状に変形させて、最終的に得られるキャビティの空間高さの最大値と最小値とから求めた変動係数が５０％となるように９種類のハイブリダイズ装置を作製した。空間高さの平均値および変動係数の算出は、実施例３と同様に行った。結果を図８に示す。
【００７３】
図８に示すように、キャビティの空間高さが小さくなるとシグナル強度の変動係数は顕著に大きくなる一方、１５μｍ以上であれば３０％以下であり、２０μｍ以上であればほぼ安定して２０％程度であった。以上のことから、キャビティの空間高さは１５μｍ以上２００μｍ以下の範囲でシグナル強度の変動係数を抑制できることから再現性の高いハイブリダイズ反応が実現できることがわかった。
【００７４】
（実施例５）
本実施例は、ハイブリダイズ装置が形成するキャビティ内の液体を攪拌（回転式）することとシグナル強度との関係を評価した例である。本実施例は、以下のような操作及びハイブリダイズ条件を用いる以外は、実施例１と同様に行い、蛍光強度の数値化を行った。すなわち、標識ｃＤＮＡの注入量を１１０μＬとし、ハイブリダイズ温度を６０℃とし、ハイブリダイゼーションの間（１６時間）、アレイとハイブリダイズ装置とを、ハイブリダイゼーション装置（ＴＡＩＴＥＣ社製ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ（ＨＢ−１００））の回転式ユニットの回転軸に対してアレイの重心が半径約７５ｍｍの位置になるようにセットした状態で回転数を４ｒｐｍとして動かした。この回転条件によれば、ハイブリダイゼーション中、いずれのアレイのキャビティ中の空気（約２０μＬ、１５ｖｏｌ％）は、その形態をおおよそ維持した状態でキャビティ内をゆっくりと移動していた。なお、ハイブリダイゼーション中静置する以外は上記と同様に操作したものを対照例として同様に蛍光強度の数値化を行った。この結果を図１０に示す。
【００７５】
図１０に示すように、基板とハイブリダイズ装置とを回転した実施例５のシグナル強度は、対照例のシグナル強度の約５倍であった。また、ＣＶも対照例が１３％であるのに対し、実施例５は５％であった。以上のことから、基板とハイブリダイズ装置とで構成されるキャビティ内に空気（ガス）を内在させ、この空気が移動するように基板とハイブリダイズ装置とを動作（回転）させることで、ハイブリダイゼーション効率を向上させ、シグナル強度を向上させられることがわかった。シグナル強度の向上は、精度と再現性の向上に大きく寄与するため、こうした撹拌形態によれば精度と再現性の向上とを向上させることができる。
【００７６】
なお、チャンバーにおける空気量を５ｖｏｌ％、３０ｖｏｌ％及び５０ｖｏｌ％となるように標識ｃＤＮＡの注入量を６５μＬ、９０μＬ及び１１３．５μｌの３種類とした以外は、上記と同様に操作しハイブリダイズするとともに、対照例も同時に準備して蛍光強度の数値化を行った。その結果、いずれの空気量であっても、対照例の約５倍のシグナル強度を示した。以上のことから、空気量が５ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％以下の範囲において、好ましいハイブリダイゼーション効率が得られていることがわかった。
【００７７】
（実施例６）
本実施例は、ハイブリダイズ装置が形成するキャビティ内の液体を攪拌（シーソー式）することとシグナル強度との関係を評価した例である。本実施例は、図１１に示す構造のカバー部材を用いて容積４００μＬのキャビティを構成した点、及び以下のような操作及びハイブリダイズ条件を用いる以外は、実施例１と同様に行い、蛍光強度の数値化を行った。
【００７８】
本実施例のハイブリダイズ装置（カバー部材１１０）は、以下のように作製した。まず、アクリル樹脂をスペーサ形状に切削加工してアクリル樹脂片１０２を作製した。一方、剥離可能な粘着層を有する片面シールを両面シールの接着層に積層しアクリル樹脂片１０２と同形状に打ち抜いてシール材１０４を作製した。また、両面シールのみをアクリル樹脂片１０２と同形状に打ち抜いたシール材１０６も作製した。次に、アクリル樹脂片１０２の片面にシール材１０４を貼着し、他の面にシール材１０６を貼着した。この積層体のシール材１０６の接着層にポリカーボネート製フィルム（厚み０．３ｍｍ、注入口加工済み）１０７を積層した。さらに、アクリル樹脂片１０２よりやや外側に膨出した輪郭を有するシリコンゴム片１０８を準備し、このシリコンゴム片１０８を、シール材１０４の剥離可能な粘着層に対して、その周縁がアクリル樹脂片１０２よりも外側にはみ出すようにして貼着し、カバー部材１１０（総厚５ｍｍ）を作製した。このカバー部材を実施例１と同様にして作製したアレイに貼り付けて、真空状態（−９８ｋＰａ）で３０分以上放置した。こうして本実施例のハイブリダイズ装置により反応用のキャビティを構築した。
【００７９】
また、標識ｃＤＮＡの注入量を２００μＬとし、ハイブリダイズ温度を６０℃とし、ハイブリダイゼーションの間（１６時間）、アレイとハイブリダイズ装置とを、ハイブリダイゼーション装置（Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｒｏｃｋｅｒ（３５／３５Ｄ））を用いて、上下動角度±２０°、上下動回数５０回／分のシーソー条件でアレイ（基板）及びハイブリダイズ装置とを動かした。アレイは、その重心がシーソーの支点に一致するようにセットした。このシーソー条件によれば、ハイブリダイゼーション中、キャビティ中の空気（約２００μＬ、５０ｖｏｌ％）は、その形態をおおよそ維持した状態でキャビティ内をゆっくりと移動していた。なお、ハイブリダイゼーション中静置する以外は上記と同様に操作したものを対照例として同様に蛍光強度の数値化を行った。
【００８０】
この結果、基板とハイブリダイズ装置とをシーソー式で動かした実施例６のシグナル強度は、対照例のシグナル強度の約５倍であった。以上のことから、基板とハイブリダイズ装置とで構成されるキャビティ内に空気（ガス）を内在させ、この空気が移動するように基板とハイブリダイズ装置とを動作（シーソー運動）させることで、ハイブリダイゼーション効率を向上させ、シグナル強度を向上させられることがわかった。シグナル強度の向上は、精度と再現性の向上に大きく寄与するため、こうした撹拌形態によれば精度と再現性の向上とを向上できる。
【００８１】
また、本実施例におけるカバー部材１１０は、タブ層として機能するシリコンゴム片１０８を有しているため、アレイに負担をかけることなくまた小さな力でカバー部材１１０を基板から分離させることができた。
【００８２】
本発明は、２００４年７月２９日に出願された日本国特許出願２００４−２２１８０７号を優先権主張の基礎としており、その内容のすべてが編入される。
【００８３】
なお、本願の原出願の特許請求の範囲に記載された請求項は以下のとおりである。本明細書においても、以下の各請求項に係る発明が開示されている。
［請求項１］
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成可能なカバー部材を備え、
前記キャビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、装置。
［請求項２］
前記カバー部材の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項１に記載の装置。
［請求項３］
前記カバー部材は、前記核酸プローブの固定領域に対向する領域に前記疎水性領域を有している、請求項１または２に記載の装置。
［請求項４］
前記疎水性領域は、水の接触角が３０°以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
［請求項５］
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域はその厚みが３００μｍ以上である、装置。
［請求項６］
前記カバー部材は前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項５に記載の装置。
［請求項７］
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下である、装置。
［請求項８］
前記空間高さの平均値が１５μｍ以上である、請求項７に記載の装置。
［請求項９］
前記カバー部材は前記キャビティ内に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、請求項７または８に記載の装置。
［請求項１０］
前記カバー部材は、少なくともシート体と、該シート体と前記基板との間に介在させるスペーサと、を備える、請求項１〜９のいずれかに記載の装置。
［請求項１１］
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には前記チャンバー内に液体を供給するための開口を有し、該開口はその一部によって前記キャビティを構成する内周壁が外側に膨出した膨出状部を構成するように形成されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の装置。
［請求項１２］
前記開口は、前記キャビティの長尺方向の両端部位にそれぞれ形成されている、請求項１１に記載の装置。
［請求項１３］
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上である、請求項１〜１２のいずれかに記載の装置。
［請求項１４］
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有している、請求項１〜１３のいずれかに記載の装置。
［請求項１５］
前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、請求項１〜１４のいずれかに記載の装置。
［請求項１６］
核酸のハイブリダイズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板に対して請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置をセットするセット工程と、
前記固定領域を含んで形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施するハイブリダイズ工程と、
を備える、方法。
［請求項１７］
前記ハイブリダイズ工程は、前記基板と前記ハイブリダイズ装置とを静置して行う、請求項１６に記載の方法。
［請求項１８］
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内の液体を攪拌することを含む、請求項１７に記載の方法。
［請求項１９］
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内にガスを存在させた状態で実施する工程である、請求項１８に記載の方法。
［請求項２０］
前記ハイブリダイズ工程は、前記ガスをキャビティ内で移動させて前記液体を撹拌することを含む、請求項１９に記載の方法。
［請求項２１］
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティを形成した基板及びハイブリダイズ装置を動かして行うことを含む、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
［請求項２２］
核酸のハイブリダイズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハイブリダイズのための液体を貯留可能に形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程、を備え、
前記ハイブリダイズ工程は前記キャビティ内に存在させたガスを移動させて前記液体を撹拌することを含む、方法。
［請求項２３］
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ反応キットであって、
核酸プローブが固定されるための固定領域を有する基板と、
該基板の前記核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記キャビティの内部に露出される領域の少なくとも一部に疎水性領域を有している、キット。
［請求項２４］
前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、請求項２３に記載のキット。
［請求項２５］
核酸のアレイであって、
１あるいは２以上の核酸プローブが固定された固定領域を有する基板と、
前記固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材と、
を備え、
前記キャビティ内部に露出される少なくとも一部に疎水性領域を有する、アレイ。
［請求項２６］
前記カバー部材は前記基板に対して分離可能に装着されている、請求項２５に記載のアレイ。
［請求項２７］
前記基板と前記カバー部材とは、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を介して積層されている請求項２５又は２６に記載のアレイ。
【符号の説明】
【００８４】
２ ハイブリダイズ装置、 ４ 基板、 ５ シール層、 ６ 核酸固定領域、 ８ スペーサ、１０ カバー部材、１０ａ 平板状体、１２ キャビティ、１４ 対向領域、１６ 疎水性領域、２０ 開口、３０ タブ層、３２ 露出端部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域はその厚みが３００μｍ以上である、装置。
【請求項２】
前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記空間高さの平均値が１５μｍ以上である、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記カバー部材は、少なくともシート体と、該シート体と前記基板との間に介在させるスペーサと、を備える、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には前記チャンバー内に液体を供給するための開口を有し、該開口はその一部によって前記キャビティを構成する内周壁が外側に膨出した膨出状部を構成するように形成されている、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
前記開口は、前記キャビティの長尺方向の両端部位にそれぞれ形成されている、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上である、請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有している、請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、請求項１〜８のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板に対して請求項１〜９のいずれかに記載の核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置をセットするセット工程と、
前記固定領域を含んで形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施するハイブリダイズ工程と、
を備える、方法。
【請求項１１】
前記ハイブリダイズ工程は、前記基板と前記ハイブリダイズ装置とを静置して行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内の液体を攪拌することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内にガスを存在させた状態で実施する工程である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイズ工程は、前記ガスをキャビティ内で移動させて前記液体を撹拌することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティを形成した基板及びハイブリダイズ装置を動かして行うことを含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ反応キットであって、
核酸プローブが固定されるための固定領域を有する基板と、
該基板の前記核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域はその厚みが３００μｍ以上である、キット。
【請求項１７】
前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
核酸のアレイであって、
１あるいは２以上の核酸プローブが固定された固定領域を有する基板と、
前記固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材と、
を備え、
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域はその厚みが３００μｍ以上である、アレイ。
【請求項１９】
前記カバー部材は前記基板に対して分離可能に装着されている、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２０】
前記基板と前記カバー部材とは、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を介して積層されている請求項１８又は１９に記載のアレイ。
【請求項２１】
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下である、装置。
【請求項２２】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハイブリダイズのための液体を貯留可能に形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程、を備え、
前記ハイブリダイズ工程は前記キャビティ内に存在させたガスを移動させて前記液体を撹拌することを含む、方法。
【請求項１】
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域はその厚みが３００μｍ以上である、装置。
【請求項２】
前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記空間高さの平均値が１５μｍ以上である、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記カバー部材は、少なくともシート体と、該シート体と前記基板との間に介在させるスペーサと、を備える、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には前記チャンバー内に液体を供給するための開口を有し、該開口はその一部によって前記キャビティを構成する内周壁が外側に膨出した膨出状部を構成するように形成されている、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
前記開口は、前記キャビティの長尺方向の両端部位にそれぞれ形成されている、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域を形成する材料は、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂ならびにこれらのフッ化物およびポリハロゲン化ビニルからなる群から選択される１種あるいは２種以上である、請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域には、凹部及び／又は凸部を有している、請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、請求項１〜８のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板に対して請求項１〜９のいずれかに記載の核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置をセットするセット工程と、
前記固定領域を含んで形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施するハイブリダイズ工程と、
を備える、方法。
【請求項１１】
前記ハイブリダイズ工程は、前記基板と前記ハイブリダイズ装置とを静置して行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内の液体を攪拌することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティ内にガスを存在させた状態で実施する工程である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイズ工程は、前記ガスをキャビティ内で移動させて前記液体を撹拌することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハイブリダイズ工程は、前記キャビティを形成した基板及びハイブリダイズ装置を動かして行うことを含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ反応キットであって、
核酸プローブが固定されるための固定領域を有する基板と、
該基板の前記核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域はその厚みが３００μｍ以上である、キット。
【請求項１７】
前記カバー部材は、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を備える、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
核酸のアレイであって、
１あるいは２以上の核酸プローブが固定された固定領域を有する基板と、
前記固定領域を含んで核酸ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材と、
を備え、
前記カバー部材の前記核酸プローブの固定領域に対向する領域はその厚みが３００μｍ以上である、アレイ。
【請求項１９】
前記カバー部材は前記基板に対して分離可能に装着されている、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２０】
前記基板と前記カバー部材とは、前記基板に剥離可能に一体化され、前記基板及び前記カバー部材の外延から露出され把持可能な露出端部を有するタブ層を介して積層されている請求項１８又は１９に記載のアレイ。
【請求項２１】
核酸のハイブリダイズ反応のためのハイブリダイズ装置であって、
核酸プローブが固定される基板の該核酸プローブの固定領域を含んで前記ハイブリダイズ反応のための液体を貯留可能なキャビティを形成するカバー部材を備え、
前記キャビティ内の前記核酸プローブの固定領域における空間高さの変動係数が５０％以下である、装置。
【請求項２２】
核酸のハイブリダイズ方法であって、
核酸プローブが固定された固定領域を有する基板の前記固定領域を含んでハイブリダイズのための液体を貯留可能に形成されたキャビティ内において該キャビティに供給された被験核酸を含有する液体中の該被験核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイズ反応を実施する工程、を備え、
前記ハイブリダイズ工程は前記キャビティ内に存在させたガスを移動させて前記液体を撹拌することを含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図９】
【図１１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図９】
【図１１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−１０４３８０（Ｐ２０１０−１０４３８０Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２３０２（Ｐ２０１０−２２３０２）
【出願日】平成２２年２月３日（２０１０．２．３）
【分割の表示】特願２００６−５２７９００（Ｐ２００６−５２７９００）の分割
【原出願日】平成１７年７月２９日（２００５．７．２９）
【出願人】（０００００４０６４）日本碍子株式会社 (2,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月３日（２０１０．２．３）
【分割の表示】特願２００６−５２７９００（Ｐ２００６−５２７９００）の分割
【原出願日】平成１７年７月２９日（２００５．７．２９）
【出願人】（０００００４０６４）日本碍子株式会社 (2,325)
【Ｆターム（参考）】
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