ハプロタイプの検出方法
【課題】分子レベルでの正しいハプロタイプ解析法を提供する。
【解決手段】第1のオリゴヌクレオチドと、該第1のオリゴヌクレオチドよりも短い第2のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成しており、該第1のオリゴヌクレオチドは、第1のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、二本鎖部分に該標的核酸の第1のSNP部が存在し、かつ該一本鎖部分に第2のSNP部が存在する。該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第1の信号が検出される二本鎖プローブを用いる。ハプロタイプ毎に該部分二本鎖プローブを用意し、解離した際に異なる信号が検出される二種類のハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブを用意し、同一ウェルに入れ、さらに検体を入れた状態で、発現強度の時間的経過を観察し、ハプロタイプを判定する。
【解決手段】第1のオリゴヌクレオチドと、該第1のオリゴヌクレオチドよりも短い第2のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成しており、該第1のオリゴヌクレオチドは、第1のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、二本鎖部分に該標的核酸の第1のSNP部が存在し、かつ該一本鎖部分に第2のSNP部が存在する。該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第1の信号が検出される二本鎖プローブを用いる。ハプロタイプ毎に該部分二本鎖プローブを用意し、解離した際に異なる信号が検出される二種類のハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブを用意し、同一ウェルに入れ、さらに検体を入れた状態で、発現強度の時間的経過を観察し、ハプロタイプを判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は精度の高いハプロタイプの検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究で疾患の発症や薬剤応答性（薬効・副作用）はスニップ（SNP）だけで説明できるのではなく、ハプロタイプに依存することが明らかになってきた。ハプロタイプとは、単一の染色体上に位置する２つまたはそれ以上の多型マーカーの対立遺伝子の組み合わせのことを言う。例えば、図１において、個体Ａのゲノムの遺伝子座１と遺伝子座２とがある場合、一方のゲノム上ではＡ−Ｔというハプロタイプを持ち、もう一方のゲノム上ではＡ−Ｇというハプロタイプを持つと言える。
【０００３】
ところで、遺伝子の解析を行う際に、通常、遺伝子座毎に１組の対立遺伝子、つまり遺伝子型が特定されるのであるが、この解析結果からだけでは正しいハプロタイプが得られるとは限らない。例えば、図２に示すように個体Ａの遺伝子座１がＡ／Ａ、遺伝子座２がＴ／Ｇという遺伝子型であることが解析された場合、一方のゲノム上のハプロタイプはＡ−Ｔであり、もう一方のゲノム上のハプロタイプはＡ−Ｇであることが分かる。しかし、個体Ｂの遺伝子座１にはＡ／Ｃ、遺伝子座２にはＴ／Ｇという遺伝子型が解析結果として得られた場合は、この解析結果から個体Ｂのハプロタイプを判定することは不可能である。つまり、個体Ｂのハプロタイプが、一方のゲノム上でＡ−Ｔ、他方のゲノム上でＣ−Ｇである場合と、一方のゲノムがＡ−Ｇ、他方のゲノムがＣ−Ｔである場合とがあり、これらのいずれかであるかは判定できない。
【０００４】
このように各遺伝子型を、シーケンサーやリアルタイムＰＣＲで解析を行ったとしても、上記に示したような理由から正確なハプロタイプを得ることが不可能な場合がある。しかしながら、近年の研究でハプロタイプの重要性が指摘されているので、それを解析する技術は必要である。
【０００５】
そのため、分子レベルで検出を行う代わりに統計学的にハプロタイプを推定する手法が注目されている。家系データが与えられたときのハプロタイプを決定する手法としては、Linkage Package（例えば、非特許文献１参照）やGENEHUNTER（例えば、非特許文献２参照）のようなソフトウェアがある。一方、家系データが存在しない場合は、Clarkのアルゴリズムやハーディ・ワインバーグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium: HWE）を仮定して遺伝子を数えることによるＥＭアルゴリズムを用いた最尤推定手法（例えば、非特許文献３）など様々なものがある。しかし、これらの方法はあくまでも推定であり、パラメーターの設定によって結果が異なってくるので、精度が高いと言い切ることはできない。つまり、統計学を利用している限り正確度が100%になることはありえない。
【０００６】
そこで、分子レベルでハプロタイプの検出を行うことが望まれ、特開2002-272482に示す解析法が発明されている。この発明は、多重型のＡＳ−ＰＣＲに基づくもので、第１の多型マーカーに対し対立遺伝子特異的な順方向プライマー、第2の多型マーカーに対し、対立遺伝子特異的な逆方向プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行うものである。そして、増幅産物を産生し、順方向および逆方向プライマーのどの対の増幅産物が生成されたかを同定することで、ハプロタイプを決定するものである。
【非特許文献１】G. M. Lathrop et al., "Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of recombination," Am. J. Hum. Genet., vol.37, pp.482-498, 1985
【非特許文献２】L. Kruglyak, M. J. Daly, M. P. Reeve-Daly and E. S. Lander, "Parametric and nonparametric linkage analysis: a unified multipoint approach," Am. J. Hum. Genet., vol.58, pp.1347-1363, 1996
【非特許文献３】M. N. Chiano and D. G. Clayton, "Fine genetic mapping using haplotype analysis and the missing problem," Ann. Hum. Genet., vol.62, pp.55-60, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記の分子レベルでのハプロタイプの検出法は、ＡＳ−ＰＣＲに基づくものである。そのため、仮にミスプライミングして一度伸長してしまうと、次のＰＣＲサイクルからはミスプライミングして伸長した増幅産物をテンプレートとして指数関数的に増幅していってしまう。したがって増幅産物を解析したとしても正しい結果が得られているとは限らなくなる。ＰＣＲのサイクル数が増加するほど、ミスプライミングでの増幅産物が増える確率が高まるので、サイクル数を少なめにする必要がある。しかし、テンプレート濃度が低い場合、サイクル数が少ないと取得対象産物も十分増やせず、結果が得られないことがある。それを防ぐために、テンプレート濃度を調整する必要があるが、これは作業工程が増えてしまい望ましくない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の標的核酸の塩基配列のハプロタイプの検出方法は、
（１）第１のオリゴヌクレオチドと、該第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的な配列を有し、
該二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第１の信号が検出される第１の標識のセットで標識されている、
第１の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（２）前記第１のハプロタイプの代わりに、第ｎハプロタイプ（ｎ≧２）までの各ハプロタイプについて、前記工程（１）と同様にして、第ｎ部分二本鎖プローブまでの各部分二本鎖プローブを用意する工程；
（３）前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの共存下で、これらの部分二本鎖プローブと試料中の標的核酸とを反応させ、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する第１及び第２の信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（４）ｎ≧３の場合に、前記ステップ（３）を、前記第１〜第ｎ部分二本鎖から選択された２つの部分二本鎖の全ての組み合わせ（ただし、前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの組み合わせを除く）においてそれぞれ個々に行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（５）各部分二本鎖の組み合わせにおいて得られた信号発現強度の時間的経過に基づいて、測定対象の標的核酸のハプロタイプを選択する工程；
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、非常に精度の高いハプロタイプの検出が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法では、まず、２以上のハプタイプ（第１〜第ｎハプロタイプ：（ｎ≧２））のそれぞれについて、部分二本鎖プローブを用意する。この部分二本鎖プローブは、以下の構成を有する。
（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有する。
（Ｂ）第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的な配列を有する。
（Ｃ）二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在する。
（Ｄ）２つのオリゴヌクレオチドの各々は、二本鎖部分が解離した場合にのみ、この部分二本鎖プローブに特有の信号を発する標識のセットで標識されている。
【００１１】
このようにして得られる複数の部分二本鎖プローブのそれぞれは各ハプロタイプに対応し、同一の反応領域での反応において、それぞれが異なる信号を発することにより、どの部分二本鎖プローブから信号が得られているかがわかるようになっている。例えば、全ての部分二本鎖プローブのそれぞれから得られる信号を異なるように設定してもよいし、後述の実施例に示すように、試料と反応させる際に２つの部分二本鎖プローブ間で異なる信号が得られるようにしてもよい。
【００１２】
次に、第１のハプロタイプ検出用の第１の部分二本鎖プローブと第２のハプロタイプ検出用の第２の部分二本鎖とを用いて試料とのハイブリダイゼーリョン反応を行い、第１の部分二本鎖プローブからの第１の信号及び第２の部分二本鎖プローブからの第２の信号の有無あるいは信号の強度の変化を測定する。更に、第１〜第ｎのハプロタイプのそれぞれに対応したｎ個の部分二本鎖プローブ（第１〜第ｎ部分二本鎖プローブ）から選択された２つの部分二本鎖プローブの組み合わせを個々に用いて測定を行う。この測定から得られた信号の有無及び信号発現強度の時間的経過に基づいて、試料中に含まれる測定対象の標的核酸のハプロタイプを決定する。
【００１３】
ｎ＝４の場合の検出方法は以下の各工程を有する。
（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、該第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
該二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第１の信号が検出されるような第１の標識のセットで標識されている第１の部分二本鎖プローブを用意する工程。
（ii）第３のオリゴヌクレオチドと、該第３のオリゴヌクレオチドよりも短い第４のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第３のオリゴヌクレオチドは、第２のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
該二本鎖部分に該第２のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第２の信号が検出されるような第２の標識のセットで標識されている第２の部分二本鎖プローブを用意する工程。
（iii）第５のオリゴヌクレオチドと、該第５のオリゴヌクレオチドよりも短い第６のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第５のオリゴヌクレオチドは、第３のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
二本鎖部分に該第３のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第３の信号が検出されるような第３の標識のセットで標識されている第３の部分二本鎖プローブを用意する工程。
（iv）第７のオリゴヌクレオチドと、該第７のオリゴヌクレオチドよりも短い第８のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成しており、
該第７のオリゴヌクレオチドは、第４のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
二本鎖部分に該標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第４の信号が検出されるような第４の標識のセットで標識されている第４の部分二本鎖プローブを用意する工程。
（ｖ）前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの共存下で、該標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する第１及び第２の信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程。
（vi）前記ステップ（ｖ）を、前記第１及び第３の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第１及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第２及び第３の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第２及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせ、及び第３及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせの各々に対して該標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する信号の発現強度の時間的経過を観察する工程。
【００１４】
以下、本発明の好ましい態様について説明する。
【００１５】
まず、部分二本鎖プローブとは、先に説明したとおり、第１のオリゴヌクレオチドと、第1のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが、部分的に二本鎖を形成しているものである。また、第１のオリゴヌクレオチドの5'末端と第2のオリゴヌクレオチドの3'末端には、二本鎖が解離した場合にのみ信号が発生するように標識化されている。またそれぞれのオリゴヌクレオチドへの標識は、ＦＲＥＴ（共鳴による励起エネルギーの移動）現象を起こすような標識の組み合わせとなっている（図３）。さらに、部分二本鎖プローブの一本鎖部分の塩基配列のＴｍ（融解温度）は、部分的に二本鎖を形成している塩基配列のＴｍよりも低くなるように設計されている。
【００１６】
部分二本鎖プローブを、二本鎖プローブの長い方のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする部分を有する標的核酸（検体：ターゲット）を含む試料に反応させる。すると、まず部分二本鎖プローブの一本鎖部分にターゲットがハイブリダイズし、次に、短い方のオリゴヌクレオチドの部分が検体に置換されることで、短い方のオリゴヌクレオチドが解離する。その結果として、部分二本鎖プローブの長い方のオリゴヌクレオチドの5'末端の標識と、短い方のオリゴヌクレオチドの3'末端の標識からなるFRETが解消されて標識の輝度が発生する（図４）。
【００１７】
この部分二本鎖プローブを用いてＳＮＰタイピングを行う場合、部分二本鎖プローブの一本鎖部分の中央付近にＳＮＰを持ってくる。図５に示すように、ＳＮＰがＡ／Ｃだった場合は、一本鎖プローブの中央付近がＡとＣの二通りの配列を持つ、部分二本鎖プローブを予め用意する。そして、それらの多型に応じた部分二本鎖プローブを異なるウェルに入れる。続いて両方のウェルに多型を調べたい検体を入れると、検体のＳＮＰ位置の配列がA／Ａだった場合、ＳＮＰ位置にＡの配列を持つ部分二本鎖プローブの入ったウェルの方が、Ｃの入ったウェルに比べて、一本鎖部分にハイブリしやすくなる。よって部分二本鎖プローブの短い方のヌクレオチドの置換が早い速度で行われる。つまり、検体に対して部分二本鎖プローブがフルマッチの場合は鎖置換速度が速く、ミスマッチの場合は鎖置換速度が遅いということとなる。したがって、各ウェルの信号の発現強度の時間的経過を観察すると、ＳＮＰ位置にＡの配列を持つ部分二本鎖プローブの入ったウェルの方から、Cのウェルよりも大きな信号が検出されることとなる（図６（a））。検体がＡ／Ｃ、Ｃ／Ｃだった場合の信号の発現強度と時間的経過については、図６（ｂ）（ｃ）にそれぞれ示す。
【００１８】
上記に示す条件で、部分二本鎖プローブを利用してハプロタイプを検出する場合は、二本鎖プローブの二本鎖部分に第1のSNP部を存在させ、二本鎖プローブの一本鎖部分に、第2のSNP部を存在させる方法を取る。部分二本鎖プローブの一本鎖部分の塩基配列のTmは、二本鎖部分の塩基配列のTmよりも低くなるように設定されている。
【００１９】
上記の特徴を持つ部分二本鎖プローブを、全ハプロタイプに対して用意する。例えば、SNP二箇所のハプロタイプの検出である場合、２2＝４通りの配列を持つ、部分二本鎖ブローブを準備する。ここで、４通りの配列を持つ部分二本鎖プローブを各ウェルに入れて、各ウェルの信号の発現強度と時間的経過について観察し、ハプロタイプを検出するという方法も考えられるが、この方法では正しい結果が得られるとは限らない。例えば、第1のSNPと第2のSNPの組み合わせが、一方のゲノム上でA-T、他方のゲノム上でC-Gである場合と、一方のゲノムがA-G、他方のゲノムがC-Tである場合（図２の個体B）は、標識の発現強度と時間的経過について観察すると、どのウェルからも同じ時間に同じ強度が出てきてしまう。したがって、どのハプロタイプであるのかが分からず、ハプロタイプの検出が正しく行えない。
【００２０】
そこで、今回の発明では上記で判定不可能であった、SNPがヘテロであるもの同士のハプロタイプの検出も行える方法を提供する。
【００２１】
ハプロタイプ用の部分二本鎖プローブに関しては、上記と同様に二本鎖プローブの二本鎖部分に第1のSNP部を存在させ、二本鎖プローブの一本鎖部分にSNPタイピングの際と同様に、第2のSNP部を存在させる方法を取る。そして全種類のハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブを用意する。なお、上記のハプロタイプの検出と異なるのは、全種類のハプロタイプに対応する二本鎖プローブから２種類の二本鎖プローブを取り出し、その2種類はFRETが解消されると異なる波長を持つ蛍光色素が発せられるように、標識化を行う。そして前記２種類のハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブを１つのウェルに入れて、その中に検体を入れる。そして、そのウェル内の標識の発現強度と時間的経過を観察し、２種類のうちのどちらのハプロタイプの標識の輝度が先に得られるかを測定する。この２種類の組み合わせは、全種類のハプロタイプから２種類を選択した全組み合わせに対して行われることになる。したがって２種類のハプロタイプの全組み合わせの標識の発現強度と時間的経過を比較することによって、検体のハプロタイプを明らかにすることができる。
【００２２】
さらに具体的に示すと、２つのSNPのハプロタイプを検出する場合、部分二本鎖プローブの、第1のSNP部と第２のSNP部の組み合わせは、全部で２2＝４通りとなる。それから４通りのハプロタイプから２通りのハプロタイプを選ぶ組み合わせは、4C2＝６通りである。つまり６ウェル用意する必要がある。それらの６個のウェルに検体を入れて、１つのウェル内でどちらのハプロタイプの標識の輝度が先に得られるかを見て、さらに６個のウェル間の結果を比較することで結果が得られる。
【００２３】
またFRETを起こさせるための標識が、第1のオリゴヌクレオチドの5'末端と第2のオリゴヌクレオチドの3'末端についている。そして標識はどちらがレポーターでどちらがクエンチャーであっても構わない。また、FRETの組み合わせは、フルオロセインとCy5、フルオロセインとLC-Red640、フルオロセインとRed705、6-FAMとTamra、HexとTamra、TetとTamraなど、またクエンチャーとしてBHQを用いてもよい。とにかくFRET現象が起きる組み合わせなら、上記に限定しない。
【００２４】
なお、標識の発現強度と時間的経過の測定方法は、リアルタイムPCR装置の検出系を利用してもよいし、蛍光顕微鏡の一定間隔毎に画像を取得できるソフトを用いてもよい。つまり、時間経過に従い、蛍光シグナルが得られるものであれば特に限定しない。以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００２５】
ハプロタイプの判定方法で、第1のSNPと第2のSNPがA/C、T/Gとなっている場合の実施例を以下に示す。
[１．部分二本鎖プローブの準備]
[１−１．部分二本鎖プローブの設計]
部分二本鎖プローブの二本鎖部分に第1のSNP部を存在させ、一本鎖部分に第2のSNP部を存在させる。今回の実施例では、第1のSNP部がA/Cであり、第2のSNP部がT/Gであるため、ハプロタイプはA-T、A-G、C-T、C-Gの４種類が存在することになる。これら４種類のハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブを設計すると、以下に示す配列となる。なお下記に下線で示した塩基配列がSNP部位に対応している。また第1のオリゴヌクレオチドが部分二本鎖プローブの長鎖側で、第2のヌクレオチドは短鎖側であり、配列は5'→3'の向きで表示されている。なお、部分二本鎖プローブの長鎖側の塩基長は40から60塩基、短鎖側の塩基長は20から40塩基が望ましい。但し、該部分二本鎖プローブの有する該一本鎖部分の塩基配列の二本鎖形成時におけるTm（融解温度）が、該二本鎖部分の塩基配列のTmより低くなくてはならない。
（１）A-Tハプロタイプ：
・第1のオリゴヌクレオチド：
GTGGACTTCCAGAAAACACCATACTGCTTCGACCAGGTGATGGAGGAGGTC
・第2のオリゴヌクレオチド：
GAAGCAGTATGGTGTTTTCTGGAAGTCCAC
（２）A-Gハプロタイプ：
・第３のオリゴヌクレオチド：
GTGGACTTCCAGAAAACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTC
・第４のオリゴヌクレオチド：
GAAGCAGTATGGTGTTTTCTGGAAGTCCAC
（３）C-Tハプロタイプ：
・第５のオリゴヌクレオチド：
GTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGATGGAGGAGGTC
・第６のオリゴヌクレオチド：
GAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCAC
（４）C-Gハプロタイプ：
・第７のオリゴヌクレオチド：
GTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTC
・第８のオリゴヌクレオチド：
GAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCAC
[１−２．部分二本鎖プローブの合成]
[１−１]で設計した部分二本鎖プローブの合成を定法により行った。また第1のオリゴヌクレオチドの5'末端に、FAM（吸収波長/蛍光波長：495/520）と、HEX（吸収波長/蛍光波長：535/556）の標識化をそれぞれ行った。また、第2のオリゴヌクレオチドの3'末端にBHQというFRETの際にクエンチャーの役割を果たすものの標識化も行った。各合成オリゴヌクレオチドは、5uMとなるようにTE緩衝液中に溶解した。
[１−３．部分二本鎖プローブの調製]
合成した第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを混合し、ハプロタイプに対応した部分二本鎖プローブが作製された。よって、４種類のハプロタイプA-T、A-G、C-T、C-Gで、それぞれ第1のオリゴヌクレオチドの5'末端に異なる標識（第1の標識；FAMと第2の標識；HEX）がそれぞれついた部分二本鎖プローブができた。部分二本鎖プローブの２種類ずつの組み合わせは、４種類のハプロタイプから２つのハプロタイプを選択した組み合わせとして、4C2=6通りある。具体的には、下記に示すとおりの部分二本鎖プローブの組み合わせが存在する(図７)。
Ｉ）A-Tハプロタイプの二本鎖プローブ及びA-Gハプロタイプの二本鎖プローブ
II）A-Tハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Tハプロタイプの二本鎖プローブ
III）A-Tハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Gハプロタイプの二本鎖プローブ
IV）A-Gハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Tハプロタイプの二本鎖プローブ
V）A-Gハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Gハプロタイプの二本鎖プローブ
VI）C-Tハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Gハプロタイプの二本鎖プローブ
また、上記６種類の部分二本鎖プローブの組み合わせでウェルに入れることになるが、
同一ウェルに入る部分二本鎖プローブは、第1のオリゴヌクレオチドの5'末端の標識がハプロタイプによって異なるようにする（図８）。具体的には、下記の表に示す通り標識の組み合わせとして入れる。各ウェルに入れる場合、第1のオリゴヌクレオチドと第2のオリゴヌクレオチドを混合した各ハプロタイプの部分二本鎖プローブを、1μlずつ入れることで行った。
【００２６】
【表１】
【００２７】
のちの鎖置換反応は９６穴ウェルプレートを用いて行うので、上記の部分二本鎖プローブを下記に配置するようにウェルプレートへ入れた。
【００２８】
【表２】
【００２９】
[２．検体（ターゲット）の準備]
[２−１．検体（ターゲット）の設計]
４種類のハプロタイプに応じた検体（ターゲット）の設計を行った。検体（ターゲット）の長さは１２０bpとなるように下記配列の設計を行った。下記配列は5'→3'の方向で記載されている。またセンス鎖側の配列とアンチセンス鎖側の配列を記載した。なお下線を付した部分はハプロタイプに対応している。
（１）A-Tハプロタイプ：
・センス鎖側：
TGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAAAACACCATACTGCTTCGACCAGGTGATGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAA
・アンチセンス鎖側：
TTTGCTTCTGGTAGGGGAGCCTCAGCACCTCTGCCGCCCTCCAGGACCTCCTCCATCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTTTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCA
（２）A-Gハプロタイプ：
・センス鎖側：
TGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAAAACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAA
・アンチセンス鎖側：
TTTGCTTCTGGTAGGGGAGCCTCAGCACCTCTGCCGCCCTCCAGGACCTCCTCCCTCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTTTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCA
（３）C-Tハプロタイプ：
・センス鎖側：
TGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGATGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAA：
・アンチセンス鎖側
TTTGCTTCTGGTAGGGGAGCCTCAGCACCTCTGCCGCCCTCCAGGACCTCCTCCATCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCA：
（４）C-Gハプロタイプ：
・センス鎖側：
TGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAA
・アンチセンス鎖側：
TTTGCTTCTGGTAGGGGAGCCTCAGCACCTCTGCCGCCCTCCAGGACCTCCTCCCTCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCA
[２−２．検体（ターゲット）の合成]
[２−１]で設計した検体（ターゲット）を定法に則り合成した。各合成検体は、0.1μMとなるようにTE緩衝液中に溶解した。
[２−３．検体（ターゲット）の調製]
[２−２]で合成した検体（ターゲット）のセンス鎖側とアンチセンス鎖側の混合を行った。次に、混合した検体をさらに混合し、可能性のある検体の組み合わせを全て作製した。具体的には下記に示す組み合わせとなる。
ｉ）両方のゲノムともA-Tハプロタイプ
ii）両方のゲノムともA-Gハプロタイプ
iii）両方のゲノムともC-Tハプロタイプ
iv）両方のゲノムともC-Gハプロタイプ
v）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ、他方のゲノムがA-Gハプロタイプ
vi）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ、他方のゲノムがC-Tハプロタイプ
vii）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ
viii）一方のゲノムがA-Gハプロタイプ、他方のゲノムがC-Tハプロタイプ
ix）一方のゲノムがA-Gハプロタイプ、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ
x）一方のゲノムがC-Tハプロタイプ、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ
[２−２]で合成したセンス鎖側とアンチセンス鎖側の検体を混合したものを、各10μlずつ混合した。具体的には下記に示すような分量で混合した。
i）両方のゲノムともA-Tハプロタイプ：10μl
ii）両方のゲノムともA-Gハプロタイプ：10μl
iii）両方のゲノムともC-Tハプロタイプ：10μl
iv）両方のゲノムともC-Gハプロタイプ：10μl
v）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがA-Gハプロタイプ：5μl
vi）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Tハプロタイプ：5μl
vii）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ：5μl
viii）一方のゲノムがA-Gハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Tハプロタイプ：5μl
ix）一方のゲノムがA-Gハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ：5μl
x）一方のゲノムがC-Tハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ：5μl
[３．部分二本鎖プローブの鎖置換反応]
ハプロタイプの部分二本鎖プローブを１個のウェルに２種類ずつ入れたウェルの中へ、ハイブリ液（下記組成）を入れた。
ハイブリ液組成：
6xSSPE / 10% Form amide (6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)
続いて、[2]で用意した検体を下記に示すような配置で1μlずつ各ウェルに入れた。そして１個のウェルの反応溶液量はトータルで50μlとなった。
【００３０】
【表３】
【００３１】
その後、９２℃でディネーチャーを行い、50℃に温度を下げた後、５分間隔で輝度を測定した。ABI社のRealTimePCRを用いて蛍光シグナルの測定を行い、FAMとHEXの蛍光標識の強度を測定した。各ウェル間で、どちらのハプロタイプのシグナルが先に出たかを測定した。その結果を以下に示す。
【００３２】
例えば、まず（i）の検体（A-T、A-T）を各ウェルに入れた場合の結果を示す。
（I）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００３３】
更に以下の結果が得られる。
（II）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（III）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブと第４のHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-Tのハプロタイプの第１のFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（IV）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブと第３のHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのFAMとC-TのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（V）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れると、A-GのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（VI）FAM標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-Tのハプロタイプの第３のFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００３４】
以上、６つのウェルの結果を総合すると、A-Tハプロタイプの部分二本鎖プローブからの輝度が早い段階で得られていることから、検体がA-Tであることが明らかとなった。
【００３５】
次に、（vii）の検体と（viii）の検体を（I）から（VI）の部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れた場合の結果を示す。（vii）の検体は、A-TとC-Gというハプロタイプを持ち、一方（viii）の検体は、A-GとC-Tというハプロタイプを持つ。この（vii）と（viii）の検体は、各遺伝子型を検出しても正しいハプロタイプを判定することが困難な組みあわせである。
【００３６】
（vii）の検体（A-T、C-G）についてまず以下の結果を得る。
（I）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００３７】
更に、以下の結果を得る。
（II）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（III）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMとC-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（IV）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのFAMとC-TのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（V）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度の方が先に得られる。
（VI）FAM標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００３８】
以上、６つのウェルの結果を総合すると、A-TとC-Gのハプロタイプの部分二本鎖プローブからの輝度が早い段階で得られていることから、検体が(1)A-Tと(4)C-Gであることが明らかとなった。
【００３９】
次に、（viii）の検体（A-G、C-T）についてまず以下の結果を得る。
（I）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブと(2)HEX標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００４０】
更に、以下の結果を得る。
（II）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-TのハプロタイプのHEXの蛍光輝度の方が先に得られる。
（III）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMと(4)C-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（IV）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのFAMと(3)C-TのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（V）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（VI）FAM標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００４１】
以上、６つのウェルの結果を総合すると、A-TとC-Gのハプロタイプの部分二本鎖プローブからの輝度が早い段階で得られていることから、検体がA-GとC-Tであることが明らかとなった。
【００４２】
他の検体を入れた場合の６つのウェルの反応結果についても以下の表に示した。
【００４３】
【表４】
【００４４】
以上の結果より、検体のハプロタイプが正しく判定可能なことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ハプロタイプの定義を示す図である。
【図２】ハプロタイプの例を示す図である。
【図３】部分二本鎖プローブを示す図である。
【図４】部分二本鎖プローブと鎖置換反応を示す図である。
【図５】SNPタイピング用の部分二本鎖プローブを示す図である。
【図６】部分二本鎖プローブを使用したSNPタイピングを示す図である。
【図７】ハプロタイプタイピング用の部分二本鎖プローブを示す図である。
【図８】ハプロタイプタイピング時のウェル内の部分二本鎖プローブを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は精度の高いハプロタイプの検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究で疾患の発症や薬剤応答性（薬効・副作用）はスニップ（SNP）だけで説明できるのではなく、ハプロタイプに依存することが明らかになってきた。ハプロタイプとは、単一の染色体上に位置する２つまたはそれ以上の多型マーカーの対立遺伝子の組み合わせのことを言う。例えば、図１において、個体Ａのゲノムの遺伝子座１と遺伝子座２とがある場合、一方のゲノム上ではＡ−Ｔというハプロタイプを持ち、もう一方のゲノム上ではＡ−Ｇというハプロタイプを持つと言える。
【０００３】
ところで、遺伝子の解析を行う際に、通常、遺伝子座毎に１組の対立遺伝子、つまり遺伝子型が特定されるのであるが、この解析結果からだけでは正しいハプロタイプが得られるとは限らない。例えば、図２に示すように個体Ａの遺伝子座１がＡ／Ａ、遺伝子座２がＴ／Ｇという遺伝子型であることが解析された場合、一方のゲノム上のハプロタイプはＡ−Ｔであり、もう一方のゲノム上のハプロタイプはＡ−Ｇであることが分かる。しかし、個体Ｂの遺伝子座１にはＡ／Ｃ、遺伝子座２にはＴ／Ｇという遺伝子型が解析結果として得られた場合は、この解析結果から個体Ｂのハプロタイプを判定することは不可能である。つまり、個体Ｂのハプロタイプが、一方のゲノム上でＡ−Ｔ、他方のゲノム上でＣ−Ｇである場合と、一方のゲノムがＡ−Ｇ、他方のゲノムがＣ−Ｔである場合とがあり、これらのいずれかであるかは判定できない。
【０００４】
このように各遺伝子型を、シーケンサーやリアルタイムＰＣＲで解析を行ったとしても、上記に示したような理由から正確なハプロタイプを得ることが不可能な場合がある。しかしながら、近年の研究でハプロタイプの重要性が指摘されているので、それを解析する技術は必要である。
【０００５】
そのため、分子レベルで検出を行う代わりに統計学的にハプロタイプを推定する手法が注目されている。家系データが与えられたときのハプロタイプを決定する手法としては、Linkage Package（例えば、非特許文献１参照）やGENEHUNTER（例えば、非特許文献２参照）のようなソフトウェアがある。一方、家系データが存在しない場合は、Clarkのアルゴリズムやハーディ・ワインバーグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium: HWE）を仮定して遺伝子を数えることによるＥＭアルゴリズムを用いた最尤推定手法（例えば、非特許文献３）など様々なものがある。しかし、これらの方法はあくまでも推定であり、パラメーターの設定によって結果が異なってくるので、精度が高いと言い切ることはできない。つまり、統計学を利用している限り正確度が100%になることはありえない。
【０００６】
そこで、分子レベルでハプロタイプの検出を行うことが望まれ、特開2002-272482に示す解析法が発明されている。この発明は、多重型のＡＳ−ＰＣＲに基づくもので、第１の多型マーカーに対し対立遺伝子特異的な順方向プライマー、第2の多型マーカーに対し、対立遺伝子特異的な逆方向プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行うものである。そして、増幅産物を産生し、順方向および逆方向プライマーのどの対の増幅産物が生成されたかを同定することで、ハプロタイプを決定するものである。
【非特許文献１】G. M. Lathrop et al., "Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of recombination," Am. J. Hum. Genet., vol.37, pp.482-498, 1985
【非特許文献２】L. Kruglyak, M. J. Daly, M. P. Reeve-Daly and E. S. Lander, "Parametric and nonparametric linkage analysis: a unified multipoint approach," Am. J. Hum. Genet., vol.58, pp.1347-1363, 1996
【非特許文献３】M. N. Chiano and D. G. Clayton, "Fine genetic mapping using haplotype analysis and the missing problem," Ann. Hum. Genet., vol.62, pp.55-60, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記の分子レベルでのハプロタイプの検出法は、ＡＳ−ＰＣＲに基づくものである。そのため、仮にミスプライミングして一度伸長してしまうと、次のＰＣＲサイクルからはミスプライミングして伸長した増幅産物をテンプレートとして指数関数的に増幅していってしまう。したがって増幅産物を解析したとしても正しい結果が得られているとは限らなくなる。ＰＣＲのサイクル数が増加するほど、ミスプライミングでの増幅産物が増える確率が高まるので、サイクル数を少なめにする必要がある。しかし、テンプレート濃度が低い場合、サイクル数が少ないと取得対象産物も十分増やせず、結果が得られないことがある。それを防ぐために、テンプレート濃度を調整する必要があるが、これは作業工程が増えてしまい望ましくない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の標的核酸の塩基配列のハプロタイプの検出方法は、
（１）第１のオリゴヌクレオチドと、該第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的な配列を有し、
該二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第１の信号が検出される第１の標識のセットで標識されている、
第１の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（２）前記第１のハプロタイプの代わりに、第ｎハプロタイプ（ｎ≧２）までの各ハプロタイプについて、前記工程（１）と同様にして、第ｎ部分二本鎖プローブまでの各部分二本鎖プローブを用意する工程；
（３）前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの共存下で、これらの部分二本鎖プローブと試料中の標的核酸とを反応させ、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する第１及び第２の信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（４）ｎ≧３の場合に、前記ステップ（３）を、前記第１〜第ｎ部分二本鎖から選択された２つの部分二本鎖の全ての組み合わせ（ただし、前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの組み合わせを除く）においてそれぞれ個々に行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（５）各部分二本鎖の組み合わせにおいて得られた信号発現強度の時間的経過に基づいて、測定対象の標的核酸のハプロタイプを選択する工程；
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、非常に精度の高いハプロタイプの検出が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法では、まず、２以上のハプタイプ（第１〜第ｎハプロタイプ：（ｎ≧２））のそれぞれについて、部分二本鎖プローブを用意する。この部分二本鎖プローブは、以下の構成を有する。
（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有する。
（Ｂ）第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的な配列を有する。
（Ｃ）二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在する。
（Ｄ）２つのオリゴヌクレオチドの各々は、二本鎖部分が解離した場合にのみ、この部分二本鎖プローブに特有の信号を発する標識のセットで標識されている。
【００１１】
このようにして得られる複数の部分二本鎖プローブのそれぞれは各ハプロタイプに対応し、同一の反応領域での反応において、それぞれが異なる信号を発することにより、どの部分二本鎖プローブから信号が得られているかがわかるようになっている。例えば、全ての部分二本鎖プローブのそれぞれから得られる信号を異なるように設定してもよいし、後述の実施例に示すように、試料と反応させる際に２つの部分二本鎖プローブ間で異なる信号が得られるようにしてもよい。
【００１２】
次に、第１のハプロタイプ検出用の第１の部分二本鎖プローブと第２のハプロタイプ検出用の第２の部分二本鎖とを用いて試料とのハイブリダイゼーリョン反応を行い、第１の部分二本鎖プローブからの第１の信号及び第２の部分二本鎖プローブからの第２の信号の有無あるいは信号の強度の変化を測定する。更に、第１〜第ｎのハプロタイプのそれぞれに対応したｎ個の部分二本鎖プローブ（第１〜第ｎ部分二本鎖プローブ）から選択された２つの部分二本鎖プローブの組み合わせを個々に用いて測定を行う。この測定から得られた信号の有無及び信号発現強度の時間的経過に基づいて、試料中に含まれる測定対象の標的核酸のハプロタイプを決定する。
【００１３】
ｎ＝４の場合の検出方法は以下の各工程を有する。
（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、該第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
該二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第１の信号が検出されるような第１の標識のセットで標識されている第１の部分二本鎖プローブを用意する工程。
（ii）第３のオリゴヌクレオチドと、該第３のオリゴヌクレオチドよりも短い第４のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第３のオリゴヌクレオチドは、第２のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
該二本鎖部分に該第２のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第２の信号が検出されるような第２の標識のセットで標識されている第２の部分二本鎖プローブを用意する工程。
（iii）第５のオリゴヌクレオチドと、該第５のオリゴヌクレオチドよりも短い第６のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第５のオリゴヌクレオチドは、第３のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
二本鎖部分に該第３のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第３の信号が検出されるような第３の標識のセットで標識されている第３の部分二本鎖プローブを用意する工程。
（iv）第７のオリゴヌクレオチドと、該第７のオリゴヌクレオチドよりも短い第８のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成しており、
該第７のオリゴヌクレオチドは、第４のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
二本鎖部分に該標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第４の信号が検出されるような第４の標識のセットで標識されている第４の部分二本鎖プローブを用意する工程。
（ｖ）前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの共存下で、該標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する第１及び第２の信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程。
（vi）前記ステップ（ｖ）を、前記第１及び第３の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第１及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第２及び第３の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第２及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせ、及び第３及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせの各々に対して該標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する信号の発現強度の時間的経過を観察する工程。
【００１４】
以下、本発明の好ましい態様について説明する。
【００１５】
まず、部分二本鎖プローブとは、先に説明したとおり、第１のオリゴヌクレオチドと、第1のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが、部分的に二本鎖を形成しているものである。また、第１のオリゴヌクレオチドの5'末端と第2のオリゴヌクレオチドの3'末端には、二本鎖が解離した場合にのみ信号が発生するように標識化されている。またそれぞれのオリゴヌクレオチドへの標識は、ＦＲＥＴ（共鳴による励起エネルギーの移動）現象を起こすような標識の組み合わせとなっている（図３）。さらに、部分二本鎖プローブの一本鎖部分の塩基配列のＴｍ（融解温度）は、部分的に二本鎖を形成している塩基配列のＴｍよりも低くなるように設計されている。
【００１６】
部分二本鎖プローブを、二本鎖プローブの長い方のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする部分を有する標的核酸（検体：ターゲット）を含む試料に反応させる。すると、まず部分二本鎖プローブの一本鎖部分にターゲットがハイブリダイズし、次に、短い方のオリゴヌクレオチドの部分が検体に置換されることで、短い方のオリゴヌクレオチドが解離する。その結果として、部分二本鎖プローブの長い方のオリゴヌクレオチドの5'末端の標識と、短い方のオリゴヌクレオチドの3'末端の標識からなるFRETが解消されて標識の輝度が発生する（図４）。
【００１７】
この部分二本鎖プローブを用いてＳＮＰタイピングを行う場合、部分二本鎖プローブの一本鎖部分の中央付近にＳＮＰを持ってくる。図５に示すように、ＳＮＰがＡ／Ｃだった場合は、一本鎖プローブの中央付近がＡとＣの二通りの配列を持つ、部分二本鎖プローブを予め用意する。そして、それらの多型に応じた部分二本鎖プローブを異なるウェルに入れる。続いて両方のウェルに多型を調べたい検体を入れると、検体のＳＮＰ位置の配列がA／Ａだった場合、ＳＮＰ位置にＡの配列を持つ部分二本鎖プローブの入ったウェルの方が、Ｃの入ったウェルに比べて、一本鎖部分にハイブリしやすくなる。よって部分二本鎖プローブの短い方のヌクレオチドの置換が早い速度で行われる。つまり、検体に対して部分二本鎖プローブがフルマッチの場合は鎖置換速度が速く、ミスマッチの場合は鎖置換速度が遅いということとなる。したがって、各ウェルの信号の発現強度の時間的経過を観察すると、ＳＮＰ位置にＡの配列を持つ部分二本鎖プローブの入ったウェルの方から、Cのウェルよりも大きな信号が検出されることとなる（図６（a））。検体がＡ／Ｃ、Ｃ／Ｃだった場合の信号の発現強度と時間的経過については、図６（ｂ）（ｃ）にそれぞれ示す。
【００１８】
上記に示す条件で、部分二本鎖プローブを利用してハプロタイプを検出する場合は、二本鎖プローブの二本鎖部分に第1のSNP部を存在させ、二本鎖プローブの一本鎖部分に、第2のSNP部を存在させる方法を取る。部分二本鎖プローブの一本鎖部分の塩基配列のTmは、二本鎖部分の塩基配列のTmよりも低くなるように設定されている。
【００１９】
上記の特徴を持つ部分二本鎖プローブを、全ハプロタイプに対して用意する。例えば、SNP二箇所のハプロタイプの検出である場合、２2＝４通りの配列を持つ、部分二本鎖ブローブを準備する。ここで、４通りの配列を持つ部分二本鎖プローブを各ウェルに入れて、各ウェルの信号の発現強度と時間的経過について観察し、ハプロタイプを検出するという方法も考えられるが、この方法では正しい結果が得られるとは限らない。例えば、第1のSNPと第2のSNPの組み合わせが、一方のゲノム上でA-T、他方のゲノム上でC-Gである場合と、一方のゲノムがA-G、他方のゲノムがC-Tである場合（図２の個体B）は、標識の発現強度と時間的経過について観察すると、どのウェルからも同じ時間に同じ強度が出てきてしまう。したがって、どのハプロタイプであるのかが分からず、ハプロタイプの検出が正しく行えない。
【００２０】
そこで、今回の発明では上記で判定不可能であった、SNPがヘテロであるもの同士のハプロタイプの検出も行える方法を提供する。
【００２１】
ハプロタイプ用の部分二本鎖プローブに関しては、上記と同様に二本鎖プローブの二本鎖部分に第1のSNP部を存在させ、二本鎖プローブの一本鎖部分にSNPタイピングの際と同様に、第2のSNP部を存在させる方法を取る。そして全種類のハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブを用意する。なお、上記のハプロタイプの検出と異なるのは、全種類のハプロタイプに対応する二本鎖プローブから２種類の二本鎖プローブを取り出し、その2種類はFRETが解消されると異なる波長を持つ蛍光色素が発せられるように、標識化を行う。そして前記２種類のハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブを１つのウェルに入れて、その中に検体を入れる。そして、そのウェル内の標識の発現強度と時間的経過を観察し、２種類のうちのどちらのハプロタイプの標識の輝度が先に得られるかを測定する。この２種類の組み合わせは、全種類のハプロタイプから２種類を選択した全組み合わせに対して行われることになる。したがって２種類のハプロタイプの全組み合わせの標識の発現強度と時間的経過を比較することによって、検体のハプロタイプを明らかにすることができる。
【００２２】
さらに具体的に示すと、２つのSNPのハプロタイプを検出する場合、部分二本鎖プローブの、第1のSNP部と第２のSNP部の組み合わせは、全部で２2＝４通りとなる。それから４通りのハプロタイプから２通りのハプロタイプを選ぶ組み合わせは、4C2＝６通りである。つまり６ウェル用意する必要がある。それらの６個のウェルに検体を入れて、１つのウェル内でどちらのハプロタイプの標識の輝度が先に得られるかを見て、さらに６個のウェル間の結果を比較することで結果が得られる。
【００２３】
またFRETを起こさせるための標識が、第1のオリゴヌクレオチドの5'末端と第2のオリゴヌクレオチドの3'末端についている。そして標識はどちらがレポーターでどちらがクエンチャーであっても構わない。また、FRETの組み合わせは、フルオロセインとCy5、フルオロセインとLC-Red640、フルオロセインとRed705、6-FAMとTamra、HexとTamra、TetとTamraなど、またクエンチャーとしてBHQを用いてもよい。とにかくFRET現象が起きる組み合わせなら、上記に限定しない。
【００２４】
なお、標識の発現強度と時間的経過の測定方法は、リアルタイムPCR装置の検出系を利用してもよいし、蛍光顕微鏡の一定間隔毎に画像を取得できるソフトを用いてもよい。つまり、時間経過に従い、蛍光シグナルが得られるものであれば特に限定しない。以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００２５】
ハプロタイプの判定方法で、第1のSNPと第2のSNPがA/C、T/Gとなっている場合の実施例を以下に示す。
[１．部分二本鎖プローブの準備]
[１−１．部分二本鎖プローブの設計]
部分二本鎖プローブの二本鎖部分に第1のSNP部を存在させ、一本鎖部分に第2のSNP部を存在させる。今回の実施例では、第1のSNP部がA/Cであり、第2のSNP部がT/Gであるため、ハプロタイプはA-T、A-G、C-T、C-Gの４種類が存在することになる。これら４種類のハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブを設計すると、以下に示す配列となる。なお下記に下線で示した塩基配列がSNP部位に対応している。また第1のオリゴヌクレオチドが部分二本鎖プローブの長鎖側で、第2のヌクレオチドは短鎖側であり、配列は5'→3'の向きで表示されている。なお、部分二本鎖プローブの長鎖側の塩基長は40から60塩基、短鎖側の塩基長は20から40塩基が望ましい。但し、該部分二本鎖プローブの有する該一本鎖部分の塩基配列の二本鎖形成時におけるTm（融解温度）が、該二本鎖部分の塩基配列のTmより低くなくてはならない。
（１）A-Tハプロタイプ：
・第1のオリゴヌクレオチド：
GTGGACTTCCAGAAAACACCATACTGCTTCGACCAGGTGATGGAGGAGGTC
・第2のオリゴヌクレオチド：
GAAGCAGTATGGTGTTTTCTGGAAGTCCAC
（２）A-Gハプロタイプ：
・第３のオリゴヌクレオチド：
GTGGACTTCCAGAAAACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTC
・第４のオリゴヌクレオチド：
GAAGCAGTATGGTGTTTTCTGGAAGTCCAC
（３）C-Tハプロタイプ：
・第５のオリゴヌクレオチド：
GTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGATGGAGGAGGTC
・第６のオリゴヌクレオチド：
GAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCAC
（４）C-Gハプロタイプ：
・第７のオリゴヌクレオチド：
GTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTC
・第８のオリゴヌクレオチド：
GAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCAC
[１−２．部分二本鎖プローブの合成]
[１−１]で設計した部分二本鎖プローブの合成を定法により行った。また第1のオリゴヌクレオチドの5'末端に、FAM（吸収波長/蛍光波長：495/520）と、HEX（吸収波長/蛍光波長：535/556）の標識化をそれぞれ行った。また、第2のオリゴヌクレオチドの3'末端にBHQというFRETの際にクエンチャーの役割を果たすものの標識化も行った。各合成オリゴヌクレオチドは、5uMとなるようにTE緩衝液中に溶解した。
[１−３．部分二本鎖プローブの調製]
合成した第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを混合し、ハプロタイプに対応した部分二本鎖プローブが作製された。よって、４種類のハプロタイプA-T、A-G、C-T、C-Gで、それぞれ第1のオリゴヌクレオチドの5'末端に異なる標識（第1の標識；FAMと第2の標識；HEX）がそれぞれついた部分二本鎖プローブができた。部分二本鎖プローブの２種類ずつの組み合わせは、４種類のハプロタイプから２つのハプロタイプを選択した組み合わせとして、4C2=6通りある。具体的には、下記に示すとおりの部分二本鎖プローブの組み合わせが存在する(図７)。
Ｉ）A-Tハプロタイプの二本鎖プローブ及びA-Gハプロタイプの二本鎖プローブ
II）A-Tハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Tハプロタイプの二本鎖プローブ
III）A-Tハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Gハプロタイプの二本鎖プローブ
IV）A-Gハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Tハプロタイプの二本鎖プローブ
V）A-Gハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Gハプロタイプの二本鎖プローブ
VI）C-Tハプロタイプの二本鎖プローブ及びC-Gハプロタイプの二本鎖プローブ
また、上記６種類の部分二本鎖プローブの組み合わせでウェルに入れることになるが、
同一ウェルに入る部分二本鎖プローブは、第1のオリゴヌクレオチドの5'末端の標識がハプロタイプによって異なるようにする（図８）。具体的には、下記の表に示す通り標識の組み合わせとして入れる。各ウェルに入れる場合、第1のオリゴヌクレオチドと第2のオリゴヌクレオチドを混合した各ハプロタイプの部分二本鎖プローブを、1μlずつ入れることで行った。
【００２６】
【表１】
【００２７】
のちの鎖置換反応は９６穴ウェルプレートを用いて行うので、上記の部分二本鎖プローブを下記に配置するようにウェルプレートへ入れた。
【００２８】
【表２】
【００２９】
[２．検体（ターゲット）の準備]
[２−１．検体（ターゲット）の設計]
４種類のハプロタイプに応じた検体（ターゲット）の設計を行った。検体（ターゲット）の長さは１２０bpとなるように下記配列の設計を行った。下記配列は5'→3'の方向で記載されている。またセンス鎖側の配列とアンチセンス鎖側の配列を記載した。なお下線を付した部分はハプロタイプに対応している。
（１）A-Tハプロタイプ：
・センス鎖側：
TGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAAAACACCATACTGCTTCGACCAGGTGATGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAA
・アンチセンス鎖側：
TTTGCTTCTGGTAGGGGAGCCTCAGCACCTCTGCCGCCCTCCAGGACCTCCTCCATCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTTTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCA
（２）A-Gハプロタイプ：
・センス鎖側：
TGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAAAACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAA
・アンチセンス鎖側：
TTTGCTTCTGGTAGGGGAGCCTCAGCACCTCTGCCGCCCTCCAGGACCTCCTCCCTCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTTTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCA
（３）C-Tハプロタイプ：
・センス鎖側：
TGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGATGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAA：
・アンチセンス鎖側
TTTGCTTCTGGTAGGGGAGCCTCAGCACCTCTGCCGCCCTCCAGGACCTCCTCCATCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCA：
（４）C-Gハプロタイプ：
・センス鎖側：
TGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAA
・アンチセンス鎖側：
TTTGCTTCTGGTAGGGGAGCCTCAGCACCTCTGCCGCCCTCCAGGACCTCCTCCCTCACCTGGTCGAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTTGCCCAGCCCGGGCA
[２−２．検体（ターゲット）の合成]
[２−１]で設計した検体（ターゲット）を定法に則り合成した。各合成検体は、0.1μMとなるようにTE緩衝液中に溶解した。
[２−３．検体（ターゲット）の調製]
[２−２]で合成した検体（ターゲット）のセンス鎖側とアンチセンス鎖側の混合を行った。次に、混合した検体をさらに混合し、可能性のある検体の組み合わせを全て作製した。具体的には下記に示す組み合わせとなる。
ｉ）両方のゲノムともA-Tハプロタイプ
ii）両方のゲノムともA-Gハプロタイプ
iii）両方のゲノムともC-Tハプロタイプ
iv）両方のゲノムともC-Gハプロタイプ
v）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ、他方のゲノムがA-Gハプロタイプ
vi）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ、他方のゲノムがC-Tハプロタイプ
vii）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ
viii）一方のゲノムがA-Gハプロタイプ、他方のゲノムがC-Tハプロタイプ
ix）一方のゲノムがA-Gハプロタイプ、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ
x）一方のゲノムがC-Tハプロタイプ、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ
[２−２]で合成したセンス鎖側とアンチセンス鎖側の検体を混合したものを、各10μlずつ混合した。具体的には下記に示すような分量で混合した。
i）両方のゲノムともA-Tハプロタイプ：10μl
ii）両方のゲノムともA-Gハプロタイプ：10μl
iii）両方のゲノムともC-Tハプロタイプ：10μl
iv）両方のゲノムともC-Gハプロタイプ：10μl
v）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがA-Gハプロタイプ：5μl
vi）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Tハプロタイプ：5μl
vii）一方のゲノムがA-Tハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ：5μl
viii）一方のゲノムがA-Gハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Tハプロタイプ：5μl
ix）一方のゲノムがA-Gハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ：5μl
x）一方のゲノムがC-Tハプロタイプ：5μl、他方のゲノムがC-Gハプロタイプ：5μl
[３．部分二本鎖プローブの鎖置換反応]
ハプロタイプの部分二本鎖プローブを１個のウェルに２種類ずつ入れたウェルの中へ、ハイブリ液（下記組成）を入れた。
ハイブリ液組成：
6xSSPE / 10% Form amide (6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)
続いて、[2]で用意した検体を下記に示すような配置で1μlずつ各ウェルに入れた。そして１個のウェルの反応溶液量はトータルで50μlとなった。
【００３０】
【表３】
【００３１】
その後、９２℃でディネーチャーを行い、50℃に温度を下げた後、５分間隔で輝度を測定した。ABI社のRealTimePCRを用いて蛍光シグナルの測定を行い、FAMとHEXの蛍光標識の強度を測定した。各ウェル間で、どちらのハプロタイプのシグナルが先に出たかを測定した。その結果を以下に示す。
【００３２】
例えば、まず（i）の検体（A-T、A-T）を各ウェルに入れた場合の結果を示す。
（I）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００３３】
更に以下の結果が得られる。
（II）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（III）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブと第４のHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-Tのハプロタイプの第１のFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（IV）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブと第３のHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのFAMとC-TのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（V）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れると、A-GのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（VI）FAM標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-Tのハプロタイプの第３のFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００３４】
以上、６つのウェルの結果を総合すると、A-Tハプロタイプの部分二本鎖プローブからの輝度が早い段階で得られていることから、検体がA-Tであることが明らかとなった。
【００３５】
次に、（vii）の検体と（viii）の検体を（I）から（VI）の部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れた場合の結果を示す。（vii）の検体は、A-TとC-Gというハプロタイプを持ち、一方（viii）の検体は、A-GとC-Tというハプロタイプを持つ。この（vii）と（viii）の検体は、各遺伝子型を検出しても正しいハプロタイプを判定することが困難な組みあわせである。
【００３６】
（vii）の検体（A-T、C-G）についてまず以下の結果を得る。
（I）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００３７】
更に、以下の結果を得る。
（II）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（III）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMとC-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（IV）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのFAMとC-TのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（V）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度の方が先に得られる。
（VI）FAM標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００３８】
以上、６つのウェルの結果を総合すると、A-TとC-Gのハプロタイプの部分二本鎖プローブからの輝度が早い段階で得られていることから、検体が(1)A-Tと(4)C-Gであることが明らかとなった。
【００３９】
次に、（viii）の検体（A-G、C-T）についてまず以下の結果を得る。
（I）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブと(2)HEX標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００４０】
更に、以下の結果を得る。
（II）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-TのハプロタイプのHEXの蛍光輝度の方が先に得られる。
（III）FAM標識のついたA-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-TのハプロタイプのFAMと(4)C-GのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（IV）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのFAMと(3)C-TのハプロタイプのHEXの蛍光輝度は同時に得られる。
（V）FAM標識のついたA-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、A-GのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
（VI）FAM標識のついたC-Tのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブとHEX標識のついたC-Gのハプロタイプに対応する部分二本鎖プローブの入ったウェルに入れる。そうすると、C-TのハプロタイプのFAMの蛍光輝度の方が先に得られる。
【００４１】
以上、６つのウェルの結果を総合すると、A-TとC-Gのハプロタイプの部分二本鎖プローブからの輝度が早い段階で得られていることから、検体がA-GとC-Tであることが明らかとなった。
【００４２】
他の検体を入れた場合の６つのウェルの反応結果についても以下の表に示した。
【００４３】
【表４】
【００４４】
以上の結果より、検体のハプロタイプが正しく判定可能なことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ハプロタイプの定義を示す図である。
【図２】ハプロタイプの例を示す図である。
【図３】部分二本鎖プローブを示す図である。
【図４】部分二本鎖プローブと鎖置換反応を示す図である。
【図５】SNPタイピング用の部分二本鎖プローブを示す図である。
【図６】部分二本鎖プローブを使用したSNPタイピングを示す図である。
【図７】ハプロタイプタイピング用の部分二本鎖プローブを示す図である。
【図８】ハプロタイプタイピング時のウェル内の部分二本鎖プローブを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の塩基配列のハプロタイプの検出方法であって、
（１）第１のオリゴヌクレオチドと、該第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的な配列を有し、
該二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第１の信号が検出される第１の標識のセットで標識されている、
第１の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（２）前記第１のハプロタイプの代わりに、第ｎハプロタイプ（ｎ≧２）までの各ハプロタイプについて、前記工程（１）と同様にして、第ｎ部分二本鎖プローブまでの各部分二本鎖プローブを用意する工程；
（３）前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの共存下で、これらの部分二本鎖プローブと試料中の標的核酸とを反応させ、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する第１及び第２の信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（４）ｎ≧３の場合に、前記ステップ（３）を、前記第１〜第ｎ部分二本鎖から選択された２つの部分二本鎖の全ての組み合わせ（ただし、前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの組み合わせを除く）においてそれぞれ個々に行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（５）各部分二本鎖の組み合わせにおいて得られた信号発現強度の時間的経過に基づいて、測定対象の標的核酸のハプロタイプを選択する工程；
を有することを特徴とするハプロタイプの検出方法。
【請求項２】
標的核酸の塩基配列のハプロタイプの検出方法であって、
（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、該第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
該二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第１の信号が検出されるような第１の標識のセットで標識されている第１の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（ii）第３のオリゴヌクレオチドと、該第３のオリゴヌクレオチドよりも短い第４のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第３のオリゴヌクレオチドは、第２のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
該二本鎖部分に該第２のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第２の信号が検出されるような第２の標識のセットで標識されている第２の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（iii）第５のオリゴヌクレオチドと、該第５のオリゴヌクレオチドよりも短い第６のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第５のオリゴヌクレオチドは、第３のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
二本鎖部分に該第３のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第３の信号が検出されるような第３の標識のセットで標識されている第３の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（iv）第７のオリゴヌクレオチドと、該第７のオリゴヌクレオチドよりも短い第８のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成しており、
該第７のオリゴヌクレオチドは、第４のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
二本鎖部分に該標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第４の信号が検出されるような第４の標識のセットで標識されている第４の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（ｖ）前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの共存下で、該標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する第１及び第２の信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（vi）前記ステップ（ｖ）を、前記第１及び第３の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第１及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第２及び第３の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第２及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせ、及び第３及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせの各々に対して該標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する信号の発現強度の時間的経過を観察する工程、
を有することを特徴とするハプロタイプの検出方法。
【請求項３】
該部分二本鎖プローブの有する該一本鎖部分の塩基配列の二本鎖形成時におけるTm（融解温度）は、該二本鎖部分の塩基配列のTmよりも低い請求項１に記載のハプロタイプの検出方法。
【請求項４】
該部分二本鎖の部分が解離した場合にのみ信号が検出される標識のセットが、FRET（共鳴による励起エネルギーの移動）現象を利用しているものである請求項１〜３のいずれかに記載のハプロタイプの検出方法。
【請求項１】
標的核酸の塩基配列のハプロタイプの検出方法であって、
（１）第１のオリゴヌクレオチドと、該第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的な配列を有し、
該二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第１の信号が検出される第１の標識のセットで標識されている、
第１の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（２）前記第１のハプロタイプの代わりに、第ｎハプロタイプ（ｎ≧２）までの各ハプロタイプについて、前記工程（１）と同様にして、第ｎ部分二本鎖プローブまでの各部分二本鎖プローブを用意する工程；
（３）前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの共存下で、これらの部分二本鎖プローブと試料中の標的核酸とを反応させ、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する第１及び第２の信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（４）ｎ≧３の場合に、前記ステップ（３）を、前記第１〜第ｎ部分二本鎖から選択された２つの部分二本鎖の全ての組み合わせ（ただし、前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの組み合わせを除く）においてそれぞれ個々に行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（５）各部分二本鎖の組み合わせにおいて得られた信号発現強度の時間的経過に基づいて、測定対象の標的核酸のハプロタイプを選択する工程；
を有することを特徴とするハプロタイプの検出方法。
【請求項２】
標的核酸の塩基配列のハプロタイプの検出方法であって、
（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、該第１のオリゴヌクレオチドよりも短い第２のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第１のオリゴヌクレオチドは、第１のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
該二本鎖部分に該第１のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第１の信号が検出されるような第１の標識のセットで標識されている第１の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（ii）第３のオリゴヌクレオチドと、該第３のオリゴヌクレオチドよりも短い第４のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第３のオリゴヌクレオチドは、第２のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
該二本鎖部分に該第２のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該二本鎖部分が解離した場合にのみ、第２の信号が検出されるような第２の標識のセットで標識されている第２の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（iii）第５のオリゴヌクレオチドと、該第５のオリゴヌクレオチドよりも短い第６のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成することにより、二本鎖部分と一本鎖部分を有し、
該第５のオリゴヌクレオチドは、第３のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
二本鎖部分に該第３のハプロタイプを有する標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第３の信号が検出されるような第３の標識のセットで標識されている第３の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（iv）第７のオリゴヌクレオチドと、該第７のオリゴヌクレオチドよりも短い第８のオリゴヌクレオチドとが部分的に二本鎖を形成しており、
該第７のオリゴヌクレオチドは、第４のハプロタイプを有する標的核酸の塩基配列に対して相補的であり、
二本鎖部分に該標的核酸の第１のＳＮＰ部が存在し、且つ該一本鎖部分に第２のＳＮＰ部が存在し、
該２つのオリゴヌクレオチドの各々は、該部分二本鎖が解離した場合にのみ、第４の信号が検出されるような第４の標識のセットで標識されている第４の部分二本鎖プローブを用意する工程；
（ｖ）前記第１及び第２の部分二本鎖プローブの共存下で、該標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する第１及び第２の信号の有無及び信号強度の時間的経過を測定する工程；
（vi）前記ステップ（ｖ）を、前記第１及び第３の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第１及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第２及び第３の部分二本鎖プローブの組み合わせ、第２及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせ、及び第３及び第４の部分二本鎖プローブの組み合わせの各々に対して該標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行い、各部分二本鎖プローブを構成するオリゴヌクレオチドによる部分二本鎖の開裂に起因する信号の発現強度の時間的経過を観察する工程、
を有することを特徴とするハプロタイプの検出方法。
【請求項３】
該部分二本鎖プローブの有する該一本鎖部分の塩基配列の二本鎖形成時におけるTm（融解温度）は、該二本鎖部分の塩基配列のTmよりも低い請求項１に記載のハプロタイプの検出方法。
【請求項４】
該部分二本鎖の部分が解離した場合にのみ信号が検出される標識のセットが、FRET（共鳴による励起エネルギーの移動）現象を利用しているものである請求項１〜３のいずれかに記載のハプロタイプの検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−１２５０３５（Ｐ２００９−１２５０３５Ａ）
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３０５６５３（Ｐ２００７−３０５６５３）
【出願日】平成１９年１１月２７日（２００７．１１．２７）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２７日（２００７．１１．２７）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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