バイオレメディエーションのための浄化シミュレーション方法
【課題】バイオレメディエーションにおける浄化速度を予測することができる浄化シミュレーション方法を提供すること。
【解決手段】汚染土壌に含まれる油および該油の濃度を特定する第１ステップ（Ｓ１）と、
前記汚染土壌に投与する微生物および栄養塩を指定する第２ステップ（Ｓ２）と、
特定された前記油、指定された前記微生物および栄養塩の組に対応する前記微生物の増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する第３ステップ（Ｓ３）と、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、および予測時刻を指定する第４ステップ（Ｓ５）と、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記微生物の増殖に関する第１方程式および前記油の減少に関する第２方程式に適用し、前記第１方程式および第２第２方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量を計算する第５ステップ（Ｓ６、Ｓ７）とを含む。
【解決手段】汚染土壌に含まれる油および該油の濃度を特定する第１ステップ（Ｓ１）と、
前記汚染土壌に投与する微生物および栄養塩を指定する第２ステップ（Ｓ２）と、
特定された前記油、指定された前記微生物および栄養塩の組に対応する前記微生物の増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する第３ステップ（Ｓ３）と、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、および予測時刻を指定する第４ステップ（Ｓ５）と、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記微生物の増殖に関する第１方程式および前記油の減少に関する第２方程式に適用し、前記第１方程式および第２第２方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量を計算する第５ステップ（Ｓ６、Ｓ７）とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汚染土壌が、バイオレメディエーションによって浄化される状況をシミュレーションするための浄化シミュレーション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油系炭化水素による汚染土壌の浄化方法として、微生物機能（油を分解する機能）を利用したバイオレメディエーションが知られている。バイオレメディエーションは他の物理・化学的方法と比較して環境負荷（環境への影響）を抑制できる利点がある。
【０００３】
バイオレメディエーションは、汚染土壌を採取して別の場所に移動させて浄化を行う方法と、汚染の現場で実施する方法（原位置バイオレメディエーション）とに大別される（下記特許文献１参照）。原位置バイオレメディエーションでは、工期が長期にわたる（１年以上要する場合もある）ことや、高い分解活性の維持には適切な追加処理が重要であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２２００６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したように、原位置バイオレメディエーションでは、工期が長期にわたることや、高い分解活性の維持には適切な追加処理が重要であることから、浄化速度を予測することができれば非常に有効である。
【０００６】
本発明者は、石油分解菌数と油分分解率との関係を解析し、石油分解菌の最適投与条件や油分分解効率を向上させるための追加処理についての検討を試みた。しかし、適切な浄化シミュレーションモデルおよびそれに基づくシミュレーション方法を確立することはできていなかった。
【０００７】
また、本発明者は、原位置バイオレメディエーションに関しては、環境微生物および投与した微生物の挙動解析に基づいて工程管理や追加処理を行うことで、浄化工程の効率を向上させることを試みた。しかし、汚染濃度および微生物挙動の予測ができないために、追加処理を施工するタイミングが遅くなり、結果として工程が長くなっていた。
【０００８】
従って、本発明は、汚染土壌がバイオレメディエーションによって浄化される状況、特に浄化速度を予測することができる浄化シミュレーション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、以下の手段によって達成される。
【００１０】
即ち、本発明に係る第１の浄化シミュレーション方法は、
汚染土壌に含まれる油および該油の濃度を特定する第１ステップ（Ｓ１）と、
前記汚染土壌に投与する微生物および栄養塩を指定する第２ステップ（Ｓ２）と、
特定された前記油、指定された前記微生物および栄養塩の組に対応する前記微生物の増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する第３ステップ（Ｓ３）と、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、および予測時刻を指定する第４ステップ（Ｓ５）と、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記微生物の増殖に関する第１方程式および前記油の減少に関する第２方程式に適用し、前記第１方程式および第２第２方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量を計算する第５ステップ（Ｓ６、Ｓ７）とを含むことを特徴としている。
【００１１】
また、本発明に係る第２の浄化シミュレーション方法は、上記の第１の浄化シミュレーション方法において、
前記第５ステップが、
前記第１方程式および前記第２方程式に加えて土壌バクテリアの増殖に関する第３方程式を用い、
前記微生物を投与する前の土壌バクテリアの量、投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記第１〜第３方程式に適用し、前記第１〜第３方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量および前記土壌バクテリアの量を計算するステップであることを特徴としている。
【００１２】
また、本発明に係る第３の浄化シミュレーション方法は、上記の第２の浄化シミュレーション方法において、
前記第１および第３方程式が、
【００１３】
【数１】
【００１４】
で表され、前記第２方程式が、
【００１５】
【数２】
【００１６】
で表され、
μijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する増殖速度であり、
Ｍiが、石油分解菌の数または土壌バクテリアの数であり、
Ｃsjが、各油の濃度であり、
λiが、石油分解菌の死滅定数または土壌バクテリアの死滅定数であり、
Ｙijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する収率定数であることを特徴としている。
【００１７】
また、本発明に係る第４の浄化シミュレーション方法は、上記の第３の浄化シミュレーション方法において、
ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する前記増殖速度μijを、
【００１８】
【数３】
【００１９】
として、前記第１および第３方程式が、
【００２０】
【数４】
【００２１】
で表され、前記第２方程式が、
【００２２】
【数５】
【００２３】
で表され、
κijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する増殖定数であることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、微生物や栄養塩の最適投入量や投入時期を正確に決定することができる。また、浄化処理の工期を正確に予想することが可能となり、工程管理やコスト試算に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の実施の形態に係る土壌汚染の浄化シミュレーション方法を示すフローチャートである。
【図２】従来のシミュレーション方法を適用するための実験で得られた油分濃度、油分分解率、土壌バクテリア数、および石油分解菌数の経時変化を示すグラフである。
【図３】従来のシミュレーション結果を示す図である。
【図４】図３とは別の従来のシミュレーション結果を示す図である。
【図５】本発明の適用対象とした実験で得られた分解率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明に係る実施の形態を、添付した図面に基づいて説明する。図１は、本発明の実施の形態に係る浄化シミュレーション方法を示すフローチャートである。
【００２７】
以下において、本浄化シミュレーション方法は、主としてコンピュータを用いて実施されることとする。コンピュータが行う処理は、実際には、コンピュータが備える演算処理手段（以下、ＣＰＵと記す）が行う。ＣＰＵは、コンピュータが備えるメモリをワーク領域として使用して、演算などの処理を行う。ＣＰＵが処理を行う前提条件は、コンピュータが備える操作手段（コンピュータ用キーボード、マウスなど）が、外部から人によって操作されて、データとして入力される。入力されたデータは、メモリの所定領域に一時記憶され、演算処理に使用される。入力されたデータや演算処理の結果は、コンピュータが備える記録部（ハードディスクなど）に適宜記録される。
【００２８】
なお、微生物の「属」（分類上の属性）を示す名称は斜体で表記されるが、本明細書では、斜体で表記せず通常の書体で表記する。
【００２９】
ステップＳ１において、浄化対象とする汚染土壌を分析し、土壌を汚染している油の種類および各油の濃度の情報を得る。得られた情報は、コンピュータに入力され、記録部に記録される。ここで、油は、石油分解菌で分解可能な油である。例えば、エンジンオイルのベースオイル（基油）である場合、実施例として後述する表１４に示した基質の中から特定される。汚染土壌に複数種類の油が含まれている場合には、それらが全て特定される。
【００３０】
ステップＳ２において、コンピュータが、投与する石油分解菌および栄養塩の指定を受け付けて、記録部に記録する。ここで、指定される石油分解菌は、ステップＳ１で特定された各油を分解可能な菌である。投与する石油分解菌および栄養塩は、それぞれ１種類に限定されず、複数種類であってもよい。なお、石油分解菌が油を分解する能力は、油に応じて異なる。
【００３１】
ステップＳ３において、コンピュータが、ステップＳ１で特定された油Ｏ、ステップＳ２で指定された石油分解菌Ｆおよび栄養塩Ｍswの組｛Ｏ，Ｆ，Ｍsw｝毎に、増殖定数、増殖速度および収率係数を、記録部から読み出す。記録部には、石油分解菌ｉ、油ｊ、栄養塩ｋに対応させて、増殖定数κijk、増殖速度μijk、収率係数Ｙijkが記録されている（ｉ、ｊ、ｋはそれぞれ、石油分解菌、油、栄養塩を区別するためのものである）。記録部への記録形式は、例えば｛ｉ，ｊ，ｋ，κijk，μijk，Ｙijk｝を一組とするテーブルである。
【００３２】
ここでは、増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙは、石油分解菌、油、栄養塩の種類に依存し、それらの投与量には依存しないと仮定した。栄養塩の中に石油と競合するような物質が含まれている場合には、増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙの値が変わる可能性がある。例えば、微生物は石油を炭素源として資化するが、４×ＭＳＷ培地中にも炭素成分（ポリペプトン、乾燥酵母エキス）が含まれているので、投入する栄養塩の量が変われば増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙの値に影響すると考えられる。しかし、本発明者はこれまでの研究により、油分分解に最適な栄養塩の投入濃度を決定しているので、栄養塩については問題ない。即ち、これまでの研究で決定した栄養塩の量を採用し、その量に対して、実験的に増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙを決定すればよい。
【００３３】
また、石油分解菌の量と、増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙの値との関係に関しては、石油分解菌が著しく過剰に存在するような土壌状態でなければ、基本的に増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙは基質の種類に依存し、石油分解菌の量には依存しない。石油分解菌が著しく過剰に存在する土壌状態では、石油分解菌が限られた基質（油）を取り合うことになり、石油分解菌の死滅量が増殖量を上回ってしまう。そのため、基質（油）の消費量と石油分解菌の増殖量の関係が分からなくなり、正確な増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙの値を算出できない可能性がある。
【００３４】
ステップＳ４において、ステップＳ３で読み出した増殖定数κijk、増殖速度μijk、収率係数Ｙijkを用いて、分解式を作成する。ここで、分解式のうち、微生物（土壌バクテリア、石油分解菌）が石油を分解して増殖することを表す式として次の式１を用い、油が微生物によって分解されて減少すること（基質濃度の低下）を表す式として次の式２を用いる。なお、本明細書において、「微生物」とは、投与される石油分解菌、土壌バクテリア、または、これらの両方を意味する。従って、例えば「微生物の数」とは、石油分解菌の数、土壌バクテリアの数、または、石油分解菌の数および土壌バクテリアの数（加算された値ではない）を意味する。
【００３５】
【数６】
【００３６】
ここで、Ｍは時刻ｔにおける微生物（土壌バクテリア、石油分解菌）の数、Ｃsは時刻ｔにおける油の濃度、κは増殖定数（石油分解菌が油を分解して増殖する程度を表す）、Ｙは収率係数（油分１mgから土壌バクテリアバイオマス（土壌微生物菌体）への変換率）、λは微生物の死滅定数である。ここで、式１、式２において、石油分解菌の増殖速度μは式３で表せると仮定している。
【００３７】
式１は、微生物の数だけ作成され、式２は、ステップＳ１で特定された油の数だけ作成される。通常、土壌バクテリアおよび１種類の石油分解菌を対象とするので、２つの式１が作成される。複数種類の石油分解菌を投与する場合には、各石油分解菌に関して式１が作成される。
【００３８】
例えば、土壌バクテリア、１種類の石油分解菌、３種類の基質（油）を対象とする場合、次のような式４〜８が作成される。
【００３９】
【数７】
【００４０】
式４は土壌バクテリアに関する式、式５は石油分解菌に関する式、式６〜８は各油に関する式である。ここで、各変数の意味は次の通りである。
Ｍ1：土壌バクテリアの数
Ｍ2：石油分解菌の数
Ｃs1：第１の油の濃度
Ｃs2：第２の油の濃度
Ｃs3：第３の油の濃度
λ1：土壌バクテリアの死滅定数
λ2：石油分解菌の死滅定数
κ11：土壌バクテリアの第１の油に対する増殖定数
κ12：土壌バクテリアの第２の油に対する増殖定数
κ13：土壌バクテリアの第３の油に対する増殖定数
κ21：石油分解菌の第１の油に対する増殖定数
κ22：石油分解菌の第２の油に対する増殖定数
κ23：石油分解菌の第３の油に対する増殖定数
Ｙ11：土壌バクテリアの第１の油に対する収率定数
Ｙ12：土壌バクテリアの第２の油に対する収率定数
Ｙ13：土壌バクテリアの第３の油に対する収率定数
Ｙ21：石油分解菌の第１の油に対する収率定数
Ｙ22：石油分解菌の第２の油に対する収率定数
Ｙ23：石油分解菌の第３の油に対する収率定数
石油分解菌は、例えばGordoniaであり、第１〜第３の油は、例えばn-Decane、n-Hexylcyclohexane、n-Hexylbenzeneである。
【００４１】
より一般的には、式１、式２は、それぞれ次の式９、式１０のように表される。
【００４２】
【数８】
【００４３】
ここで、ｉは、各石油分解菌（複数の場合もある）および土壌バクテリアを区別する（即ち特定する）添え字であり、ｊは各油を区別する（即ち特定する）添え字である。Σi、Σjはそれぞれｉ、ｊについて総和を計算することを意味する。
【００４４】
ステップＳ５において、コンピュータは、数値計算の初期条件の指定を受け付ける。初期条件は、初期（即ち投与前）の土壌バクテリア数、石油分解菌の投与量、各油の濃度、および、微生物の数を計算すべき予測時刻ｔである。ここで予測時刻ｔは１つ以上指定される。初期条件は、操作部から指定されても、ステップＳ１、Ｓ２などで記録部に記録されたものを記録部から読み出してもよい。
【００４５】
ステップＳ６において、コンピュータは、ステップＳ５で設定された予測時刻ｔを１つ設定する。
【００４６】
ステップＳ７において、ステップＳ４で作成された式１および式２を、ステップＳ５で指定された数値計算の初期条件を用いて解き、ステップＳ６で指定された予測時刻ｔにおける微生物の数を求める。式１および式２を解くには、公知の数値解析方法を使用すればよい。種々の数値解析方法が公知であるので、ここでは説明を省略する。
【００４７】
ステップＳ８において、ステップＳ５で指定された予測時刻ｔのうち、まだ計算対象とされていない予測時刻ｔがあるか否かを判断し、残っていればステップＳ６に戻り、既に計算対象とされた予測時刻ｔと重複しないように、新に予測時刻ｔを設定し、ステップＳ７を実行する。この繰り返し処理は、ステップＳ５で複数の時刻ｔが指定された場合に必要な処理であり、ステップＳ５で予測時刻ｔが１つだけしか指定されなかった場合には、行われない。
【００４８】
ステップＳ９において、ステップＳ７で得られた微生物（土壌バクテリア、石油分解菌）の数Ｍを、予測時刻ｔと対応させて記録部に記録する。
【００４９】
以上の処理によって、複数種類の油（基質）で汚染された土壌に、指定された石油分解菌および栄養塩を投与する場合の、微生物の数の時間的変化を得ることができる。微生物の数の増加は汚染土壌の浄化が進んだ（油が分解された）ことを意味し、微生物の数の増加速度は浄化速度に対応する。従って、本発明のシミュレーションによって、石油分解菌が死滅し、その数が減少すると予測される時刻に、石油分解菌を再度投入すれば浄化により有効であると言える。
【００５０】
上記のように本発明の特徴は、石油分解菌が油を分解する性能は、油の種類（基質）毎に異なる点に着目し、石油分解菌、栄養塩および油の組毎に、増殖定数、増殖速度および収率係数を設定して、上記の分解式（式１、式２）を解く点にある。よって、予め、石油分解菌、栄養塩および油の組毎に、増殖定数、増殖速度および収率係数を精度よく決定し、データベース化しておくことが望ましい。増殖定数、増殖速度および収率係数は、例えば、実施例として後述するように、上記の分解式（式１、式２）を用いて実験的に決定することができる。
【００５１】
なお、投与する予定の石油分解菌に関する既存のデータ（増殖定数、増殖速度および収率係数）が無くても、模擬的に汚染土壌（土壌を油で汚染した状態）を作製して実験することによって、投与予定の石油分解菌に関する、油毎の増殖定数、増殖速度および収率係数を求めることができる。例えば、実験室で１種類の油（特定の１種類の基質）を用いて作製した汚染土壌に、石油分解菌および栄養塩をそれぞれ所定量投与する。その後、石油分解菌の数、土壌バクテリアの数を、時間経過に応じて測定する。得られた測定値（石油分解菌の数、土壌バクテリアの数）を再現できるように、パラメータフィッティングによって増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する。そして、汚染土壌の作製に使用する油の種類（基質）を変更して、実験およびパラメータフィッティングを繰り返し、増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する。得られた増殖定数、増殖速度および収率係数を用いて、実際の汚染土壌に含まれる各油の初期の量（石油分解菌を投与する前の量）を初期値として与えて、シミュレーションを行えばよい。
【００５２】
以上、本発明の特定の実施の形態について説明したが、上記の説明は、本発明が上記した実施の形態に限定されることを意図したものではない。上記の実施の形態は種々変更、拡張されて実施されることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５３】
例えば、図１に示したフローチャートにおいて、各処理の順序を変更することも、一部の処理を削除することも、新たな処理を追加することも可能である。
【００５４】
また、上記では、増殖速度μを式３で表す場合を説明したが、増殖速度μを表す式は式３に限定されない。例えば、次の式１１（Monod式）、式１２（Teissier式）などを使用してもよい。
【００５５】
【数９】
【００５６】
ここで、Ｃsは基質濃度、μMaxは最大比増殖速度定数、κは増殖定数、Ｋsは飽和定数である。
【００５７】
これらの式で、増殖速度μを表す場合、式９及び式１０は、次の式１３及び式１４のように表される。
【００５８】
【数１０】
【００５９】
ここで、ｉ、ｊ、Σi、Σjの意味は、式９及び式１０に関して上記した意味と同じである。
【００６０】
また、汚染原因である油の分類方法は、上記に限定されない。投入予定の石油分解菌が、異なる増殖定数、増殖速度および収率係数を有するように、汚染原因である油を分類すればよい。
【００６１】
また、増殖定数、増殖速度および収率係数は、石油分解菌、栄養塩および油にのみ依存するとの前提が成り立たず、投与される石油分解菌の量、投与される栄養塩の量にも依存する場合も在り得る。従って、より正確な予測を行うには、これらをも考慮して、石油分解菌、栄養塩、油、投与する石油分解菌の量、および、投与する栄養塩の量の組毎に、増殖定数、増殖速度および収率係数を記録したデータベースを作成しておくことが望ましい。そして、データベースから、石油分解菌、栄養塩、油、投与する石油分解菌の量、および投与する栄養塩の量の組に対応する増殖定数、増殖速度および収率係数を読み出して、数値計算に適用することが望ましい。データベースに、投与する石油分解菌の量および投与する栄養塩の量に対応する増殖定数、増殖速度および収率係数が無かった場合、投与する石油分解菌の量および投与する栄養塩の量に近い値に対応する増殖定数、増殖速度および収率係数を数値解析に使用すればよい。また、投与する石油分解菌の量、および投与する栄養塩の量に近い値に対応する複数組の増殖定数、増殖速度および収率係数から、数値解析に使用する増殖定数、増殖速度および収率係数を、例えば補間によって決定してもよい。
【００６２】
以下に、実施例を示し、本発明の特徴をより明確にする。
【実施例１】
【００６３】
まず、比較実験として、本発明を適用せずに、増殖定数、増殖速度および収率係数を求め、それらの値を用いて土壌バクテリア数、油分濃度を求めた。即ち、模擬汚染土壌（ベースオイル）の浄化モデルを想定し、自動車用エンジンオイルのベースオイルで作製した模擬汚染土壌のバイオレメディエーションのデータに基づいて、石油分解菌の増殖速度や油分の浄化速度を推定した。そして、これらの推定値を用いて石油汚染土壌バイオレメディエーションの浄化速度をシミュレーションした。
【００６４】
具体的な実験条件は、次の（１）〜（６）に示す通りである。
（１）実験スケール
５００ｍｌ容量のガラス製サンプル瓶に土壌１００ｇを投入
（２）摸擬汚染土壌の作製
真砂土とシルトとを、真砂土：シルト＝３：１の比率で混合した土壌を使用
（３）処理条件
投与菌株：Rhodococcus sp. NDKK6株（以下、Rhod.とも記す）
菌体投与量：１０5〜１０9cells/g-soil
栄養成分（栄養塩）：４倍濃縮改変ＳＷ（以下、４×ＭＳＷとも記す）培地
培養条件：遮光し、室温で静置培養
（４）モニタリング
解析日：培養開始から０、３、７、および１４日目
解析項目：油分濃度（抽出溶媒としてH-997を使用した赤外吸光法を使用）、土壌バクテリア数（環境DNA（eDNA）解析法を使用）、Rhodococcus属石油分解菌数（Real-time PCR法を使用）
（５）水分調節
適宜滅菌水を添加し、含水率を１６〜１８％の範囲で一定に調節した。
（６）実験系列
次の表１に示す通り。
【００６５】
【表１】
【００６６】
系列No.１は水のみを加えた系であり、系列No.２は４×ＭＳＷ培地を加えたバイオスティミュレーションの系であり、系列No.３〜７は４×ＭＳＷ培地と共にRhodococcus sp. NDKK6株を加えたバイオオーグメンテーションの系である。なお、系列毎に２つのサンプルを作製して実験した。従って、以下に示す実験値は２回の実験の平均値である。
【００６７】
これらの系に関する実験結果として得られた油分濃度、油分分解率、土壌バクテリア数、および石油分解菌数の経時変化を次の表２〜５および図２に示す。図２において、系列No.１〜７の値を、黒正方形、黒丸、米印、白正方形、三角形、菱形、白丸で表す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
表中、「−」は検出しなかったことを意味する。
【００７３】
以上のデータに基づいて、石油分解菌の増殖速度や油分の分解速度を推定した。時間（Time）、時間の変化量（ｄｔ）、基質濃度（Ｃs）、基質濃度の変化量（ｄＣs）、土壌バクテリア数（Ｍ）、土壌バクテリア数の変化量（ｄＭ）、石油分解菌数（ＭRhod）、石油分解菌数の変化量（ｄＭRhod）を系列毎に算出した。その結果を、次の表６〜１２に示す。
【００７４】
【表６】
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
【表９】
【００７８】
【表１０】
【００７９】
【表１１】
【００８０】
【表１２】
【００８１】
以上の表６〜１２に示したデータセットを１次分解式の基本式（上記の式１、式２）に代入し、実測値との差が最小となるようにパラメータフィッティングを行い、土壌バクテリアの増殖定数κ、増殖速度μ、および収率係数Ｙを算出した。結果を表１３に示す。
【００８２】
また、real-time PCR法により定量した石油分解菌数に基づいて、Rhodococcus sp. NDKK6の増殖定数κRhod、増殖速度μRhod、および収率係数ＹRhodについても求めた。結果は表１３の右側３列に示されている。なお、NDKK6株の死滅速度を測定しなかったので、ここでは、土壌バクテリアおよび石油分解菌の死滅定数λはいずれも０．０２５day-1（即ち１日あたり２．５％が死滅する）と仮定した。
【００８３】
【表１３】
【００８４】
上記で得られたκ、μ、およびＹを、上記の式１及び式２に代入し、石油汚染土壌の浄化シミュレーションを行った。投与する石油分解菌をRhodococcus sp. NDKK6株と仮定した場合のシミュレーション結果を図３に示す。図３において、油分濃度を正方形で、土壌バクテリア数を菱形で表す。なお、初期の汚染濃度は５，０００mg/kg-soilとした。また、石油系炭化水素による実汚染土壌では多くが５．０×１０8cells/g-soil以下であるという知見が得られていることから、初期の土壌バクテリア数は５．０×１０8cells/g-soilと仮定して計算した。
【００８５】
図３から、本モデルでは、比較的短期間で浄化率が１００％（油分濃度が０）に達してしまうことが分かる。実際には、ベースオイル中にRhodococcus sp. NDKK6では分解が難しい成分が含まれていることから、油分濃度は０にはならない。このことから、本モデルでは浄化速度を適切に評価できない（浄化速度を過大評価している）ことが分かった。
【実施例２】
【００８６】
次に、上記した実施例１の結果を改善するために、本発明を適用せずに、浄化可能な炭化水素成分の割合（石油分解菌が分解可能な炭化水素成分の割合）を考慮して浄化率を求めた。具体的には、上記の実施例１で使用した自動車用エンジンオイルのベースオイルをイアトロスキャンで成分分析し、得られた結果（飽和分＝５９．４％）を使用して、実施例１と同様に再度シミュレーションを行った。即ち、Rhodococcus sp. NDKK6は全油の５９．４％を分解できると仮定した。図４は、得られた結果をグラフ化したものである。図４において、油分濃度を正方形で、土壌バクテリア数を菱形で表す。図４から分かるように、油分濃度は０にはならず、実測データ（表２及び表４に示す）をある程度再現できており、シミュレーションの精度が向上したことが分かる。しかし、原位置バイオレメディエーションに実際に適用するには、さらにシミュレーションの精度を向上させることが望ましい。
【実施例３】
【００８７】
そこで、本発明を適応した実験を行った。即ち、汚染土壌中に含まれる炭化水素の成分と含有量を分析した結果を用いて、浄化予測を行うことを想定した。本実施例３では、単一の炭化水素を基質として、各成分に対する石油分解菌の分解活性を解析した。
【００８８】
具体的な実験条件は、次の（１）〜（６）に示す通りである。
（１）実験スケール
５００m容量のガラス製サンプル瓶に土壌１００gを投入
（２）摸擬汚染土壌の作製
５号珪砂に市販の炭化水素を０．５０g添加（油分濃度＝５，０００mg/kg-soil）し、滅菌した土壌を使用
（３）処理条件
投与菌株：Gordonia sp. NDKY76A（以下、Gor.とも記す）
投与菌体量：９．７×１０7cfu/g-soil
栄養成分（栄養塩）：４×ＭＳＷ培地
培養条件：遮光し、室温で静置培養
（４）モニタリング
解析日：０、３、７、１４、２１、および２８日目
解析項目：油分濃度（クロロホルム・メタノール抽出してＧＣ（ガスクロマトグラフィー）分析した）、土壌バクテリア数（環境DNA（eDNA）解析法を使用）、Gordonia属石油分解菌数（Real-time PCR法を使用）
（５）水分調節
適宜滅菌水を添加し、含水率を一定（４％）に調節した（珪砂は保水力が非常に弱いため低い値に調節した）。
（６）実験系列
対象とした基質を、表１４に示す通り。
【００８９】
なお、系列No.１の実験は、死滅定数λを算出するために行った。珪砂には石油分解菌の生育基質となる栄養分がほとんどないので、系列No.１のような条件では増殖せずにすぐに死滅ので、その減少量から死滅定数λを決定した。
【００９０】
【表１４】
【００９１】
※1 c−アルカンおよび芳香族の炭素数は「環の炭素数 ＋ 側鎖の炭素数」で示す。
※2 ＧＣ分析の条件はInjector：250℃、Oven：75℃、1分→6℃／分→300℃、20分、Detector：300℃（FID）、試料注入量：1μl、キャリアガス：He（40ml／分）である。石油中には多種の炭化水素成分が含まれているため、一定の温度条件で分析すると多成分をうまく分離できず、定量性が低下する。そこで、分離用カラムとの親和性に加えて、沸点によっても（カラム内での）保持時間に差が出るように、カラムが設置されているオーブンの温度を徐々に高めていく条件に設定した。上記のOvenに関する表記は、７５℃で１分間保持して土壌から油分を抽出する溶媒を除去した後、６℃／分で温度を上げていき、最終的に３００℃まで到達させ、３００℃で２０分間保持したことを意味する。これは、カラム内に高沸点成分が残留し難くするため処理であり、上記の分析条件で７５〜２５０℃の炭化水素成分を分析・定量することができた。）
汚染土壌中に残存している炭化水素をクロロホルム・メタノール（３：１）混合溶液を用いて抽出し、ＧＣ分析した。微生物数を表１５に示し、得られたクロマトグラムのピーク面積から算出した分解率を図５に示す。なお、実験初期に油分分解が顕著に進んでいることから、初期の増殖量を用いて比増殖速度を算出することにしたので、表１５には、算出に使用した０〜３日目の実験値のみを示し、その後の実験値は省略している。
【００９２】
【表１５】
【００９３】
表１５の結果より、シミュレーションモデルに必要なパラメータとして、Gordoniasp. NDKY76Aの増殖定数κGor、増殖速度μGor、および収率係数ＹGorを算出した。即ち、実験を再現できるように、パラメータフィッティングによって、それらの値を求めた。その結果を表１６に示す。
【００９４】
【表１６】
【００９５】
Rhodococcus sp. NDKK6などの別の石油分解菌について、また、別の基質を含む油について、同様に実験を行うことによって、増殖定数、増殖速度、および収率係数を算出することができる。
【００９６】
従って、これらの値をデータベースとして記録しておけば、汚染土壌を分析し、汚染原因である油に含まれる炭化水素成分の構成比を調べ、使用する石油分解菌および検出された炭化水素成分の組毎に増殖定数、増殖速度、および収率係数をデータベースから読み出して、シミュレーションすることができる。そして、石油分解菌を投与した後の所定の時刻における油分解率および分解速度を推定することができる。
【００９７】
なお、表１６の値は限定的な実験から得られた結果であり、必ずしもこれらの値が適切で無い場合もあり得る。従って、種々の実験を繰り返して同様に得られた値から決定することが望ましい。
【００９８】
また、同じ石油分解菌および同じ基質に関して、別の要因を考慮し、その要因にも対応させて増殖定数、増殖速度、および収率係数を記録しておいてもよい。その場合、実際の汚染現場、汚染土壌に応じて、より適切なシミュレーションを行うことができる。考慮すべき要因（増殖定数、増殖速度、収率係数に影響する要因）には、例えば、土壌中の含水率、ｐＨ、溶存酸素濃度などの土壌特性が挙げられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汚染土壌が、バイオレメディエーションによって浄化される状況をシミュレーションするための浄化シミュレーション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油系炭化水素による汚染土壌の浄化方法として、微生物機能（油を分解する機能）を利用したバイオレメディエーションが知られている。バイオレメディエーションは他の物理・化学的方法と比較して環境負荷（環境への影響）を抑制できる利点がある。
【０００３】
バイオレメディエーションは、汚染土壌を採取して別の場所に移動させて浄化を行う方法と、汚染の現場で実施する方法（原位置バイオレメディエーション）とに大別される（下記特許文献１参照）。原位置バイオレメディエーションでは、工期が長期にわたる（１年以上要する場合もある）ことや、高い分解活性の維持には適切な追加処理が重要であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２２００６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したように、原位置バイオレメディエーションでは、工期が長期にわたることや、高い分解活性の維持には適切な追加処理が重要であることから、浄化速度を予測することができれば非常に有効である。
【０００６】
本発明者は、石油分解菌数と油分分解率との関係を解析し、石油分解菌の最適投与条件や油分分解効率を向上させるための追加処理についての検討を試みた。しかし、適切な浄化シミュレーションモデルおよびそれに基づくシミュレーション方法を確立することはできていなかった。
【０００７】
また、本発明者は、原位置バイオレメディエーションに関しては、環境微生物および投与した微生物の挙動解析に基づいて工程管理や追加処理を行うことで、浄化工程の効率を向上させることを試みた。しかし、汚染濃度および微生物挙動の予測ができないために、追加処理を施工するタイミングが遅くなり、結果として工程が長くなっていた。
【０００８】
従って、本発明は、汚染土壌がバイオレメディエーションによって浄化される状況、特に浄化速度を予測することができる浄化シミュレーション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、以下の手段によって達成される。
【００１０】
即ち、本発明に係る第１の浄化シミュレーション方法は、
汚染土壌に含まれる油および該油の濃度を特定する第１ステップ（Ｓ１）と、
前記汚染土壌に投与する微生物および栄養塩を指定する第２ステップ（Ｓ２）と、
特定された前記油、指定された前記微生物および栄養塩の組に対応する前記微生物の増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する第３ステップ（Ｓ３）と、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、および予測時刻を指定する第４ステップ（Ｓ５）と、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記微生物の増殖に関する第１方程式および前記油の減少に関する第２方程式に適用し、前記第１方程式および第２第２方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量を計算する第５ステップ（Ｓ６、Ｓ７）とを含むことを特徴としている。
【００１１】
また、本発明に係る第２の浄化シミュレーション方法は、上記の第１の浄化シミュレーション方法において、
前記第５ステップが、
前記第１方程式および前記第２方程式に加えて土壌バクテリアの増殖に関する第３方程式を用い、
前記微生物を投与する前の土壌バクテリアの量、投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記第１〜第３方程式に適用し、前記第１〜第３方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量および前記土壌バクテリアの量を計算するステップであることを特徴としている。
【００１２】
また、本発明に係る第３の浄化シミュレーション方法は、上記の第２の浄化シミュレーション方法において、
前記第１および第３方程式が、
【００１３】
【数１】
【００１４】
で表され、前記第２方程式が、
【００１５】
【数２】
【００１６】
で表され、
μijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する増殖速度であり、
Ｍiが、石油分解菌の数または土壌バクテリアの数であり、
Ｃsjが、各油の濃度であり、
λiが、石油分解菌の死滅定数または土壌バクテリアの死滅定数であり、
Ｙijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する収率定数であることを特徴としている。
【００１７】
また、本発明に係る第４の浄化シミュレーション方法は、上記の第３の浄化シミュレーション方法において、
ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する前記増殖速度μijを、
【００１８】
【数３】
【００１９】
として、前記第１および第３方程式が、
【００２０】
【数４】
【００２１】
で表され、前記第２方程式が、
【００２２】
【数５】
【００２３】
で表され、
κijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する増殖定数であることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、微生物や栄養塩の最適投入量や投入時期を正確に決定することができる。また、浄化処理の工期を正確に予想することが可能となり、工程管理やコスト試算に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の実施の形態に係る土壌汚染の浄化シミュレーション方法を示すフローチャートである。
【図２】従来のシミュレーション方法を適用するための実験で得られた油分濃度、油分分解率、土壌バクテリア数、および石油分解菌数の経時変化を示すグラフである。
【図３】従来のシミュレーション結果を示す図である。
【図４】図３とは別の従来のシミュレーション結果を示す図である。
【図５】本発明の適用対象とした実験で得られた分解率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明に係る実施の形態を、添付した図面に基づいて説明する。図１は、本発明の実施の形態に係る浄化シミュレーション方法を示すフローチャートである。
【００２７】
以下において、本浄化シミュレーション方法は、主としてコンピュータを用いて実施されることとする。コンピュータが行う処理は、実際には、コンピュータが備える演算処理手段（以下、ＣＰＵと記す）が行う。ＣＰＵは、コンピュータが備えるメモリをワーク領域として使用して、演算などの処理を行う。ＣＰＵが処理を行う前提条件は、コンピュータが備える操作手段（コンピュータ用キーボード、マウスなど）が、外部から人によって操作されて、データとして入力される。入力されたデータは、メモリの所定領域に一時記憶され、演算処理に使用される。入力されたデータや演算処理の結果は、コンピュータが備える記録部（ハードディスクなど）に適宜記録される。
【００２８】
なお、微生物の「属」（分類上の属性）を示す名称は斜体で表記されるが、本明細書では、斜体で表記せず通常の書体で表記する。
【００２９】
ステップＳ１において、浄化対象とする汚染土壌を分析し、土壌を汚染している油の種類および各油の濃度の情報を得る。得られた情報は、コンピュータに入力され、記録部に記録される。ここで、油は、石油分解菌で分解可能な油である。例えば、エンジンオイルのベースオイル（基油）である場合、実施例として後述する表１４に示した基質の中から特定される。汚染土壌に複数種類の油が含まれている場合には、それらが全て特定される。
【００３０】
ステップＳ２において、コンピュータが、投与する石油分解菌および栄養塩の指定を受け付けて、記録部に記録する。ここで、指定される石油分解菌は、ステップＳ１で特定された各油を分解可能な菌である。投与する石油分解菌および栄養塩は、それぞれ１種類に限定されず、複数種類であってもよい。なお、石油分解菌が油を分解する能力は、油に応じて異なる。
【００３１】
ステップＳ３において、コンピュータが、ステップＳ１で特定された油Ｏ、ステップＳ２で指定された石油分解菌Ｆおよび栄養塩Ｍswの組｛Ｏ，Ｆ，Ｍsw｝毎に、増殖定数、増殖速度および収率係数を、記録部から読み出す。記録部には、石油分解菌ｉ、油ｊ、栄養塩ｋに対応させて、増殖定数κijk、増殖速度μijk、収率係数Ｙijkが記録されている（ｉ、ｊ、ｋはそれぞれ、石油分解菌、油、栄養塩を区別するためのものである）。記録部への記録形式は、例えば｛ｉ，ｊ，ｋ，κijk，μijk，Ｙijk｝を一組とするテーブルである。
【００３２】
ここでは、増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙは、石油分解菌、油、栄養塩の種類に依存し、それらの投与量には依存しないと仮定した。栄養塩の中に石油と競合するような物質が含まれている場合には、増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙの値が変わる可能性がある。例えば、微生物は石油を炭素源として資化するが、４×ＭＳＷ培地中にも炭素成分（ポリペプトン、乾燥酵母エキス）が含まれているので、投入する栄養塩の量が変われば増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙの値に影響すると考えられる。しかし、本発明者はこれまでの研究により、油分分解に最適な栄養塩の投入濃度を決定しているので、栄養塩については問題ない。即ち、これまでの研究で決定した栄養塩の量を採用し、その量に対して、実験的に増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙを決定すればよい。
【００３３】
また、石油分解菌の量と、増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙの値との関係に関しては、石油分解菌が著しく過剰に存在するような土壌状態でなければ、基本的に増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙは基質の種類に依存し、石油分解菌の量には依存しない。石油分解菌が著しく過剰に存在する土壌状態では、石油分解菌が限られた基質（油）を取り合うことになり、石油分解菌の死滅量が増殖量を上回ってしまう。そのため、基質（油）の消費量と石油分解菌の増殖量の関係が分からなくなり、正確な増殖定数κ、増殖速度μ、収率係数Ｙの値を算出できない可能性がある。
【００３４】
ステップＳ４において、ステップＳ３で読み出した増殖定数κijk、増殖速度μijk、収率係数Ｙijkを用いて、分解式を作成する。ここで、分解式のうち、微生物（土壌バクテリア、石油分解菌）が石油を分解して増殖することを表す式として次の式１を用い、油が微生物によって分解されて減少すること（基質濃度の低下）を表す式として次の式２を用いる。なお、本明細書において、「微生物」とは、投与される石油分解菌、土壌バクテリア、または、これらの両方を意味する。従って、例えば「微生物の数」とは、石油分解菌の数、土壌バクテリアの数、または、石油分解菌の数および土壌バクテリアの数（加算された値ではない）を意味する。
【００３５】
【数６】
【００３６】
ここで、Ｍは時刻ｔにおける微生物（土壌バクテリア、石油分解菌）の数、Ｃsは時刻ｔにおける油の濃度、κは増殖定数（石油分解菌が油を分解して増殖する程度を表す）、Ｙは収率係数（油分１mgから土壌バクテリアバイオマス（土壌微生物菌体）への変換率）、λは微生物の死滅定数である。ここで、式１、式２において、石油分解菌の増殖速度μは式３で表せると仮定している。
【００３７】
式１は、微生物の数だけ作成され、式２は、ステップＳ１で特定された油の数だけ作成される。通常、土壌バクテリアおよび１種類の石油分解菌を対象とするので、２つの式１が作成される。複数種類の石油分解菌を投与する場合には、各石油分解菌に関して式１が作成される。
【００３８】
例えば、土壌バクテリア、１種類の石油分解菌、３種類の基質（油）を対象とする場合、次のような式４〜８が作成される。
【００３９】
【数７】
【００４０】
式４は土壌バクテリアに関する式、式５は石油分解菌に関する式、式６〜８は各油に関する式である。ここで、各変数の意味は次の通りである。
Ｍ1：土壌バクテリアの数
Ｍ2：石油分解菌の数
Ｃs1：第１の油の濃度
Ｃs2：第２の油の濃度
Ｃs3：第３の油の濃度
λ1：土壌バクテリアの死滅定数
λ2：石油分解菌の死滅定数
κ11：土壌バクテリアの第１の油に対する増殖定数
κ12：土壌バクテリアの第２の油に対する増殖定数
κ13：土壌バクテリアの第３の油に対する増殖定数
κ21：石油分解菌の第１の油に対する増殖定数
κ22：石油分解菌の第２の油に対する増殖定数
κ23：石油分解菌の第３の油に対する増殖定数
Ｙ11：土壌バクテリアの第１の油に対する収率定数
Ｙ12：土壌バクテリアの第２の油に対する収率定数
Ｙ13：土壌バクテリアの第３の油に対する収率定数
Ｙ21：石油分解菌の第１の油に対する収率定数
Ｙ22：石油分解菌の第２の油に対する収率定数
Ｙ23：石油分解菌の第３の油に対する収率定数
石油分解菌は、例えばGordoniaであり、第１〜第３の油は、例えばn-Decane、n-Hexylcyclohexane、n-Hexylbenzeneである。
【００４１】
より一般的には、式１、式２は、それぞれ次の式９、式１０のように表される。
【００４２】
【数８】
【００４３】
ここで、ｉは、各石油分解菌（複数の場合もある）および土壌バクテリアを区別する（即ち特定する）添え字であり、ｊは各油を区別する（即ち特定する）添え字である。Σi、Σjはそれぞれｉ、ｊについて総和を計算することを意味する。
【００４４】
ステップＳ５において、コンピュータは、数値計算の初期条件の指定を受け付ける。初期条件は、初期（即ち投与前）の土壌バクテリア数、石油分解菌の投与量、各油の濃度、および、微生物の数を計算すべき予測時刻ｔである。ここで予測時刻ｔは１つ以上指定される。初期条件は、操作部から指定されても、ステップＳ１、Ｓ２などで記録部に記録されたものを記録部から読み出してもよい。
【００４５】
ステップＳ６において、コンピュータは、ステップＳ５で設定された予測時刻ｔを１つ設定する。
【００４６】
ステップＳ７において、ステップＳ４で作成された式１および式２を、ステップＳ５で指定された数値計算の初期条件を用いて解き、ステップＳ６で指定された予測時刻ｔにおける微生物の数を求める。式１および式２を解くには、公知の数値解析方法を使用すればよい。種々の数値解析方法が公知であるので、ここでは説明を省略する。
【００４７】
ステップＳ８において、ステップＳ５で指定された予測時刻ｔのうち、まだ計算対象とされていない予測時刻ｔがあるか否かを判断し、残っていればステップＳ６に戻り、既に計算対象とされた予測時刻ｔと重複しないように、新に予測時刻ｔを設定し、ステップＳ７を実行する。この繰り返し処理は、ステップＳ５で複数の時刻ｔが指定された場合に必要な処理であり、ステップＳ５で予測時刻ｔが１つだけしか指定されなかった場合には、行われない。
【００４８】
ステップＳ９において、ステップＳ７で得られた微生物（土壌バクテリア、石油分解菌）の数Ｍを、予測時刻ｔと対応させて記録部に記録する。
【００４９】
以上の処理によって、複数種類の油（基質）で汚染された土壌に、指定された石油分解菌および栄養塩を投与する場合の、微生物の数の時間的変化を得ることができる。微生物の数の増加は汚染土壌の浄化が進んだ（油が分解された）ことを意味し、微生物の数の増加速度は浄化速度に対応する。従って、本発明のシミュレーションによって、石油分解菌が死滅し、その数が減少すると予測される時刻に、石油分解菌を再度投入すれば浄化により有効であると言える。
【００５０】
上記のように本発明の特徴は、石油分解菌が油を分解する性能は、油の種類（基質）毎に異なる点に着目し、石油分解菌、栄養塩および油の組毎に、増殖定数、増殖速度および収率係数を設定して、上記の分解式（式１、式２）を解く点にある。よって、予め、石油分解菌、栄養塩および油の組毎に、増殖定数、増殖速度および収率係数を精度よく決定し、データベース化しておくことが望ましい。増殖定数、増殖速度および収率係数は、例えば、実施例として後述するように、上記の分解式（式１、式２）を用いて実験的に決定することができる。
【００５１】
なお、投与する予定の石油分解菌に関する既存のデータ（増殖定数、増殖速度および収率係数）が無くても、模擬的に汚染土壌（土壌を油で汚染した状態）を作製して実験することによって、投与予定の石油分解菌に関する、油毎の増殖定数、増殖速度および収率係数を求めることができる。例えば、実験室で１種類の油（特定の１種類の基質）を用いて作製した汚染土壌に、石油分解菌および栄養塩をそれぞれ所定量投与する。その後、石油分解菌の数、土壌バクテリアの数を、時間経過に応じて測定する。得られた測定値（石油分解菌の数、土壌バクテリアの数）を再現できるように、パラメータフィッティングによって増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する。そして、汚染土壌の作製に使用する油の種類（基質）を変更して、実験およびパラメータフィッティングを繰り返し、増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する。得られた増殖定数、増殖速度および収率係数を用いて、実際の汚染土壌に含まれる各油の初期の量（石油分解菌を投与する前の量）を初期値として与えて、シミュレーションを行えばよい。
【００５２】
以上、本発明の特定の実施の形態について説明したが、上記の説明は、本発明が上記した実施の形態に限定されることを意図したものではない。上記の実施の形態は種々変更、拡張されて実施されることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５３】
例えば、図１に示したフローチャートにおいて、各処理の順序を変更することも、一部の処理を削除することも、新たな処理を追加することも可能である。
【００５４】
また、上記では、増殖速度μを式３で表す場合を説明したが、増殖速度μを表す式は式３に限定されない。例えば、次の式１１（Monod式）、式１２（Teissier式）などを使用してもよい。
【００５５】
【数９】
【００５６】
ここで、Ｃsは基質濃度、μMaxは最大比増殖速度定数、κは増殖定数、Ｋsは飽和定数である。
【００５７】
これらの式で、増殖速度μを表す場合、式９及び式１０は、次の式１３及び式１４のように表される。
【００５８】
【数１０】
【００５９】
ここで、ｉ、ｊ、Σi、Σjの意味は、式９及び式１０に関して上記した意味と同じである。
【００６０】
また、汚染原因である油の分類方法は、上記に限定されない。投入予定の石油分解菌が、異なる増殖定数、増殖速度および収率係数を有するように、汚染原因である油を分類すればよい。
【００６１】
また、増殖定数、増殖速度および収率係数は、石油分解菌、栄養塩および油にのみ依存するとの前提が成り立たず、投与される石油分解菌の量、投与される栄養塩の量にも依存する場合も在り得る。従って、より正確な予測を行うには、これらをも考慮して、石油分解菌、栄養塩、油、投与する石油分解菌の量、および、投与する栄養塩の量の組毎に、増殖定数、増殖速度および収率係数を記録したデータベースを作成しておくことが望ましい。そして、データベースから、石油分解菌、栄養塩、油、投与する石油分解菌の量、および投与する栄養塩の量の組に対応する増殖定数、増殖速度および収率係数を読み出して、数値計算に適用することが望ましい。データベースに、投与する石油分解菌の量および投与する栄養塩の量に対応する増殖定数、増殖速度および収率係数が無かった場合、投与する石油分解菌の量および投与する栄養塩の量に近い値に対応する増殖定数、増殖速度および収率係数を数値解析に使用すればよい。また、投与する石油分解菌の量、および投与する栄養塩の量に近い値に対応する複数組の増殖定数、増殖速度および収率係数から、数値解析に使用する増殖定数、増殖速度および収率係数を、例えば補間によって決定してもよい。
【００６２】
以下に、実施例を示し、本発明の特徴をより明確にする。
【実施例１】
【００６３】
まず、比較実験として、本発明を適用せずに、増殖定数、増殖速度および収率係数を求め、それらの値を用いて土壌バクテリア数、油分濃度を求めた。即ち、模擬汚染土壌（ベースオイル）の浄化モデルを想定し、自動車用エンジンオイルのベースオイルで作製した模擬汚染土壌のバイオレメディエーションのデータに基づいて、石油分解菌の増殖速度や油分の浄化速度を推定した。そして、これらの推定値を用いて石油汚染土壌バイオレメディエーションの浄化速度をシミュレーションした。
【００６４】
具体的な実験条件は、次の（１）〜（６）に示す通りである。
（１）実験スケール
５００ｍｌ容量のガラス製サンプル瓶に土壌１００ｇを投入
（２）摸擬汚染土壌の作製
真砂土とシルトとを、真砂土：シルト＝３：１の比率で混合した土壌を使用
（３）処理条件
投与菌株：Rhodococcus sp. NDKK6株（以下、Rhod.とも記す）
菌体投与量：１０5〜１０9cells/g-soil
栄養成分（栄養塩）：４倍濃縮改変ＳＷ（以下、４×ＭＳＷとも記す）培地
培養条件：遮光し、室温で静置培養
（４）モニタリング
解析日：培養開始から０、３、７、および１４日目
解析項目：油分濃度（抽出溶媒としてH-997を使用した赤外吸光法を使用）、土壌バクテリア数（環境DNA（eDNA）解析法を使用）、Rhodococcus属石油分解菌数（Real-time PCR法を使用）
（５）水分調節
適宜滅菌水を添加し、含水率を１６〜１８％の範囲で一定に調節した。
（６）実験系列
次の表１に示す通り。
【００６５】
【表１】
【００６６】
系列No.１は水のみを加えた系であり、系列No.２は４×ＭＳＷ培地を加えたバイオスティミュレーションの系であり、系列No.３〜７は４×ＭＳＷ培地と共にRhodococcus sp. NDKK6株を加えたバイオオーグメンテーションの系である。なお、系列毎に２つのサンプルを作製して実験した。従って、以下に示す実験値は２回の実験の平均値である。
【００６７】
これらの系に関する実験結果として得られた油分濃度、油分分解率、土壌バクテリア数、および石油分解菌数の経時変化を次の表２〜５および図２に示す。図２において、系列No.１〜７の値を、黒正方形、黒丸、米印、白正方形、三角形、菱形、白丸で表す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
表中、「−」は検出しなかったことを意味する。
【００７３】
以上のデータに基づいて、石油分解菌の増殖速度や油分の分解速度を推定した。時間（Time）、時間の変化量（ｄｔ）、基質濃度（Ｃs）、基質濃度の変化量（ｄＣs）、土壌バクテリア数（Ｍ）、土壌バクテリア数の変化量（ｄＭ）、石油分解菌数（ＭRhod）、石油分解菌数の変化量（ｄＭRhod）を系列毎に算出した。その結果を、次の表６〜１２に示す。
【００７４】
【表６】
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
【表９】
【００７８】
【表１０】
【００７９】
【表１１】
【００８０】
【表１２】
【００８１】
以上の表６〜１２に示したデータセットを１次分解式の基本式（上記の式１、式２）に代入し、実測値との差が最小となるようにパラメータフィッティングを行い、土壌バクテリアの増殖定数κ、増殖速度μ、および収率係数Ｙを算出した。結果を表１３に示す。
【００８２】
また、real-time PCR法により定量した石油分解菌数に基づいて、Rhodococcus sp. NDKK6の増殖定数κRhod、増殖速度μRhod、および収率係数ＹRhodについても求めた。結果は表１３の右側３列に示されている。なお、NDKK6株の死滅速度を測定しなかったので、ここでは、土壌バクテリアおよび石油分解菌の死滅定数λはいずれも０．０２５day-1（即ち１日あたり２．５％が死滅する）と仮定した。
【００８３】
【表１３】
【００８４】
上記で得られたκ、μ、およびＹを、上記の式１及び式２に代入し、石油汚染土壌の浄化シミュレーションを行った。投与する石油分解菌をRhodococcus sp. NDKK6株と仮定した場合のシミュレーション結果を図３に示す。図３において、油分濃度を正方形で、土壌バクテリア数を菱形で表す。なお、初期の汚染濃度は５，０００mg/kg-soilとした。また、石油系炭化水素による実汚染土壌では多くが５．０×１０8cells/g-soil以下であるという知見が得られていることから、初期の土壌バクテリア数は５．０×１０8cells/g-soilと仮定して計算した。
【００８５】
図３から、本モデルでは、比較的短期間で浄化率が１００％（油分濃度が０）に達してしまうことが分かる。実際には、ベースオイル中にRhodococcus sp. NDKK6では分解が難しい成分が含まれていることから、油分濃度は０にはならない。このことから、本モデルでは浄化速度を適切に評価できない（浄化速度を過大評価している）ことが分かった。
【実施例２】
【００８６】
次に、上記した実施例１の結果を改善するために、本発明を適用せずに、浄化可能な炭化水素成分の割合（石油分解菌が分解可能な炭化水素成分の割合）を考慮して浄化率を求めた。具体的には、上記の実施例１で使用した自動車用エンジンオイルのベースオイルをイアトロスキャンで成分分析し、得られた結果（飽和分＝５９．４％）を使用して、実施例１と同様に再度シミュレーションを行った。即ち、Rhodococcus sp. NDKK6は全油の５９．４％を分解できると仮定した。図４は、得られた結果をグラフ化したものである。図４において、油分濃度を正方形で、土壌バクテリア数を菱形で表す。図４から分かるように、油分濃度は０にはならず、実測データ（表２及び表４に示す）をある程度再現できており、シミュレーションの精度が向上したことが分かる。しかし、原位置バイオレメディエーションに実際に適用するには、さらにシミュレーションの精度を向上させることが望ましい。
【実施例３】
【００８７】
そこで、本発明を適応した実験を行った。即ち、汚染土壌中に含まれる炭化水素の成分と含有量を分析した結果を用いて、浄化予測を行うことを想定した。本実施例３では、単一の炭化水素を基質として、各成分に対する石油分解菌の分解活性を解析した。
【００８８】
具体的な実験条件は、次の（１）〜（６）に示す通りである。
（１）実験スケール
５００m容量のガラス製サンプル瓶に土壌１００gを投入
（２）摸擬汚染土壌の作製
５号珪砂に市販の炭化水素を０．５０g添加（油分濃度＝５，０００mg/kg-soil）し、滅菌した土壌を使用
（３）処理条件
投与菌株：Gordonia sp. NDKY76A（以下、Gor.とも記す）
投与菌体量：９．７×１０7cfu/g-soil
栄養成分（栄養塩）：４×ＭＳＷ培地
培養条件：遮光し、室温で静置培養
（４）モニタリング
解析日：０、３、７、１４、２１、および２８日目
解析項目：油分濃度（クロロホルム・メタノール抽出してＧＣ（ガスクロマトグラフィー）分析した）、土壌バクテリア数（環境DNA（eDNA）解析法を使用）、Gordonia属石油分解菌数（Real-time PCR法を使用）
（５）水分調節
適宜滅菌水を添加し、含水率を一定（４％）に調節した（珪砂は保水力が非常に弱いため低い値に調節した）。
（６）実験系列
対象とした基質を、表１４に示す通り。
【００８９】
なお、系列No.１の実験は、死滅定数λを算出するために行った。珪砂には石油分解菌の生育基質となる栄養分がほとんどないので、系列No.１のような条件では増殖せずにすぐに死滅ので、その減少量から死滅定数λを決定した。
【００９０】
【表１４】
【００９１】
※1 c−アルカンおよび芳香族の炭素数は「環の炭素数 ＋ 側鎖の炭素数」で示す。
※2 ＧＣ分析の条件はInjector：250℃、Oven：75℃、1分→6℃／分→300℃、20分、Detector：300℃（FID）、試料注入量：1μl、キャリアガス：He（40ml／分）である。石油中には多種の炭化水素成分が含まれているため、一定の温度条件で分析すると多成分をうまく分離できず、定量性が低下する。そこで、分離用カラムとの親和性に加えて、沸点によっても（カラム内での）保持時間に差が出るように、カラムが設置されているオーブンの温度を徐々に高めていく条件に設定した。上記のOvenに関する表記は、７５℃で１分間保持して土壌から油分を抽出する溶媒を除去した後、６℃／分で温度を上げていき、最終的に３００℃まで到達させ、３００℃で２０分間保持したことを意味する。これは、カラム内に高沸点成分が残留し難くするため処理であり、上記の分析条件で７５〜２５０℃の炭化水素成分を分析・定量することができた。）
汚染土壌中に残存している炭化水素をクロロホルム・メタノール（３：１）混合溶液を用いて抽出し、ＧＣ分析した。微生物数を表１５に示し、得られたクロマトグラムのピーク面積から算出した分解率を図５に示す。なお、実験初期に油分分解が顕著に進んでいることから、初期の増殖量を用いて比増殖速度を算出することにしたので、表１５には、算出に使用した０〜３日目の実験値のみを示し、その後の実験値は省略している。
【００９２】
【表１５】
【００９３】
表１５の結果より、シミュレーションモデルに必要なパラメータとして、Gordoniasp. NDKY76Aの増殖定数κGor、増殖速度μGor、および収率係数ＹGorを算出した。即ち、実験を再現できるように、パラメータフィッティングによって、それらの値を求めた。その結果を表１６に示す。
【００９４】
【表１６】
【００９５】
Rhodococcus sp. NDKK6などの別の石油分解菌について、また、別の基質を含む油について、同様に実験を行うことによって、増殖定数、増殖速度、および収率係数を算出することができる。
【００９６】
従って、これらの値をデータベースとして記録しておけば、汚染土壌を分析し、汚染原因である油に含まれる炭化水素成分の構成比を調べ、使用する石油分解菌および検出された炭化水素成分の組毎に増殖定数、増殖速度、および収率係数をデータベースから読み出して、シミュレーションすることができる。そして、石油分解菌を投与した後の所定の時刻における油分解率および分解速度を推定することができる。
【００９７】
なお、表１６の値は限定的な実験から得られた結果であり、必ずしもこれらの値が適切で無い場合もあり得る。従って、種々の実験を繰り返して同様に得られた値から決定することが望ましい。
【００９８】
また、同じ石油分解菌および同じ基質に関して、別の要因を考慮し、その要因にも対応させて増殖定数、増殖速度、および収率係数を記録しておいてもよい。その場合、実際の汚染現場、汚染土壌に応じて、より適切なシミュレーションを行うことができる。考慮すべき要因（増殖定数、増殖速度、収率係数に影響する要因）には、例えば、土壌中の含水率、ｐＨ、溶存酸素濃度などの土壌特性が挙げられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
汚染土壌に含まれる油および該油の濃度を特定する第１ステップと、
前記汚染土壌に投与する微生物および栄養塩を指定する第２ステップと、
特定された前記油、指定された前記微生物および栄養塩の組に対応する前記微生物の増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する第３ステップと、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、および予測時刻を指定する第４ステップと、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記微生物の増殖に関する第１方程式および前記油の減少に関する第２方程式に適用し、前記第１方程式および第２第２方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量を計算する第５ステップとを含むことを特徴とする汚染土壌の浄化シミュレーション方法。
【請求項２】
前記第５ステップが、
前記第１方程式および前記第２方程式に加えて土壌バクテリアの増殖に関する第３方程式を用い、
前記微生物を投与する前の土壌バクテリアの量、投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記第１〜第３方程式に適用し、前記第１〜第３方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量および前記土壌バクテリアの量を計算するステップであることを特徴とする請求項１に記載の汚染土壌の浄化シミュレーション方法。
【請求項３】
前記第１および第３方程式が、
【数１】
で表され、前記第２方程式が、
【数２】
で表され、
μijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する増殖速度であり、
Ｍiが、石油分解菌の数または土壌バクテリアの数であり、
Ｃsjが、各油の濃度であり、
λiが、石油分解菌の死滅定数または土壌バクテリアの死滅定数であり、
Ｙijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する収率定数であることを特徴とする請求項２に記載の汚染土壌の浄化シミュレーション方法。
【請求項４】
ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する前記増殖速度μijを、
【数３】
として、前記第１および第３方程式が、
【数４】
で表され、前記第２方程式が、
【数５】
で表され、
κijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する増殖定数であることを特徴とする請求項３に記載の汚染土壌の浄化シミュレーション方法。
【請求項１】
汚染土壌に含まれる油および該油の濃度を特定する第１ステップと、
前記汚染土壌に投与する微生物および栄養塩を指定する第２ステップと、
特定された前記油、指定された前記微生物および栄養塩の組に対応する前記微生物の増殖定数、増殖速度および収率係数を決定する第３ステップと、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、および予測時刻を指定する第４ステップと、
投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記微生物の増殖に関する第１方程式および前記油の減少に関する第２方程式に適用し、前記第１方程式および第２第２方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量を計算する第５ステップとを含むことを特徴とする汚染土壌の浄化シミュレーション方法。
【請求項２】
前記第５ステップが、
前記第１方程式および前記第２方程式に加えて土壌バクテリアの増殖に関する第３方程式を用い、
前記微生物を投与する前の土壌バクテリアの量、投与する前記微生物の量、前記油の濃度、前記増殖定数、前記増殖速度および前記収率係数を、前記第１〜第３方程式に適用し、前記第１〜第３方程式を数値計算によって解き、前記予測時刻における前記微生物の量および前記土壌バクテリアの量を計算するステップであることを特徴とする請求項１に記載の汚染土壌の浄化シミュレーション方法。
【請求項３】
前記第１および第３方程式が、
【数１】
で表され、前記第２方程式が、
【数２】
で表され、
μijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する増殖速度であり、
Ｍiが、石油分解菌の数または土壌バクテリアの数であり、
Ｃsjが、各油の濃度であり、
λiが、石油分解菌の死滅定数または土壌バクテリアの死滅定数であり、
Ｙijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する収率定数であることを特徴とする請求項２に記載の汚染土壌の浄化シミュレーション方法。
【請求項４】
ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する前記増殖速度μijを、
【数３】
として、前記第１および第３方程式が、
【数４】
で表され、前記第２方程式が、
【数５】
で表され、
κijが、ｉで特定される石油分解菌または土壌バクテリアの、ｊで特定される油に対する増殖定数であることを特徴とする請求項３に記載の汚染土壌の浄化シミュレーション方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２１４２７４（Ｐ２０１０−２１４２７４Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６２５１５（Ｐ２００９−６２５１５）
【出願日】平成２１年３月１６日（２００９．３．１６）
【出願人】（５９３００６６３０）学校法人立命館 (359)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１６日（２００９．３．１６）
【出願人】（５９３００６６３０）学校法人立命館 (359)
【Ｆターム（参考）】
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