パネト細胞群の製造方法、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象のスクリーニング方法およびパネト細胞からの分泌物の製造方法
【課題】 小腸から採取したクリプトから、生きたパネト細胞を高い構成比率で含むパネト細胞群を製造すること、前記パネト細胞群を用いてパネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象を効率よくスクリーニングすること、および前記パネト細胞群を用いてパネト細胞からの分泌物を効率よく製造することを目的としている。
【解決手段】 パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程とを有する。
【解決手段】 パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程とを有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パネト細胞群の製造方法、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象のスクリーニング方法およびパネト細胞からの分泌物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
小腸は消化管において胃と大腸との間をなす部分であり、ほ乳類では、胃に近い方から十二指腸、空腸、回腸に分けられる。小腸の内腔は腸絨毛と呼ばれる指状の突起で覆われており、腸絨毛の間にはクリプト（腸腺、リーベルキューン腺、腸陰窩、腸小窩、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｒｙｐｔ）と呼ばれる窪みが存在している。これらの構造を有する小腸の内腔は一層の腸上皮細胞で覆われている。
【０００３】
小腸の内腔は体内に取り込んだ食物を消化・吸収する場であると同時に、外界と接する場である。それ故、小腸の内腔を覆う腸上皮細胞は、栄養素を消化・吸収する機能を有する一方、細菌やウイルスなどの感染を防御する機能を有している。この腸上皮細胞には、４種類の細胞（円柱細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネト細胞）と、これらの起源と考えられている幹細胞とが存在する。
【０００４】
このうちパネト細胞はクリプトの基底部にのみ存在している。パネト細胞は大型の分泌顆粒を有しており、細菌に曝されるなどの刺激を受けると、分泌顆粒内の物質を分泌する。この分泌物には抗菌ペプチドであるα−ディフェンシン、リゾチーム、分泌型ホスホリパーゼＡ２などが含まれており、生体への感染防御に大きな貢献をしていることが知られている（非特許文献１）。
【０００５】
したがって、パネト細胞からの分泌物を感染症の予防や治療に利用するための研究開発がなされている。例えば、特許文献１には、パネト細胞からの抗微生物物質の分泌を促す物質としてイソロイシン、ロイシンまたはバリンから選択される少なくとも１種の分岐鎖必須アミノ酸を有効成分として含有する抗菌ペプチド分泌誘発剤が開示されている。また、特許文献２には、本発明者らによるパネト細胞を長期間培養して抗微生物物質を大量に生産させる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−９５９３８号公報
【特許文献２】特開２００６−２４６７６４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ Ａ．Ｊ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、第１０巻、第１２８０−１２８９頁、１９９６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、抗微生物活性を有するパネト細胞からの分泌物を利用するためには、生きたパネト細胞またはその分泌物を大量に得ることが必要である。しかしながら、分泌物は抗微生物活性を有するが故、大腸菌等の微生物を用いて大量製造することが難しい。また、特許文献２に開示された方法では多数のパネト細胞を得ることができないため、大量の分泌物を得るためには、少数のパネト細胞を長期間培養して得る必要があり、その結果、多くの時間と作業量を必要とする。さらに、特許文献２には、クリプトを構成する細胞群から、セルソーターを用いてパネト細胞を単離する旨が記載されているが、パネト細胞が特異的に分布する領域を選択しておらず、マイクロピペットを用いてパネト細胞を回収しているに過ぎない。
【０００９】
本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、小腸から採取したクリプトから、生きたパネト細胞を高い構成比率で含むパネト細胞群を製造すること、前記パネト細胞群を用いてパネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象を効率よくスクリーニングすること、および前記パネト細胞群を用いてパネト細胞からの分泌物を効率よく製造することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、小腸から採取したクリプトをコラゲナーゼで処理した後、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）または波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとし、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて細胞群を分取することにより、あるいは蛍光標識抗体を用いてパネト細胞を標識し、セルソーターを用いて細胞群を分取することにより、生きたパネト細胞を高い構成比率で含むパネト細胞群が得られること、および得られたパネト細胞群に分泌誘導因子を作用させて得た分泌物が抗微生物活性を有することを見いだし、下記の各発明を完成した。
【００１１】
（１）パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程とを有する、前記方法。
【００１２】
（２）前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）が３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０および側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）が５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０である、（１）に記載の方法。
【００１３】
（３）生きたパネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程とを有する、前記方法。
【００１４】
（４）波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）がＦＨ５１２〜５５８≧３００である、（３）に記載の方法。
【００１５】
（５）生きたパネト細胞の構成比率が９０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、界面活性剤を用いて腸上皮細胞群に含まれるパネト細胞の細胞膜を処理し、パネト細胞内のパネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体が到達し得る状態にする工程と、パネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体を結合させてパネト細胞を標識する工程と、結合させた蛍光標識抗体の蛍光をパラメーターとして、セルソーターを用いて標識したパネト細胞を含むパネト細胞群を得る工程とを有する、前記方法。
【００１６】
（６）パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、（１）から（５）のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、製造したパネト細胞群と対象とを作用させる工程と、対象を作用させたパネト細胞群の分泌物を定量する工程と、定量した結果に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程とを有する、前記方法。
【００１７】
（７）パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、（１）から（５）のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、対象を添加した培地で、製造したパネト細胞群を培養する工程と、培養後の培地成分に微生物を作用させる工程と、作用させた微生物の状態を確認する工程と、確認した状態に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程とを有する、前記方法。
【００１８】
（８）パネト細胞からの分泌物を製造する方法であって、（１）から（５）のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、製造したパネト細胞群とパネト細胞からの分泌を促進する物質および／またはパネト細胞からの分泌を促進する微生物とを作用させてパネト細胞の分泌物を得る工程とを有する、前記方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生きたパネト細胞を高い構成比率で含むパネト細胞群を得ることができる。また、前記パネト細胞群を用いて、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象を効率よくスクリーニングすることができる。さらに、前記パネト細胞群を用いてパネト細胞群からの分泌物を効率よく得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】クリプトを含む懸濁液を位相差顕微鏡で観察した結果を示す図である。図中、クリプトを矢印で示す。
【図２】前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとして、懸濁液中に含まれる全細胞を解析した結果において、分取する範囲を示した図である。図中、縦軸の値は側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）を示し、横軸の値は前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）を示す。
【図３】Ｃ群、Ｅ群およびＦ群のパネト細胞群を位相差顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図４】波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、懸濁液中に含まれる全細胞を解析した結果およびＦ群に含まれる全細胞を解析した結果である。図中、縦軸の値は細胞数を示し、横軸の値は波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）を示す。
【図５】波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、懸濁液中に含まれる全細胞を解析した結果において、分取する範囲を示した図である。図中、縦軸の値は細胞数を示し、横軸の値はＦＨ５１２〜５５８を示す。
【図６】セルソーターを用いて分取したＧ群のパネト細胞群を位相差顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図７】Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光をパラメーターとして、懸濁液中に含まれる全細胞を解析した結果において、分取する細胞群の範囲を示した図である。図中、縦軸の値は細胞数を示し、横軸の値はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光の強度（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨＡＦ４８８）を示す。
【図８】セルソーターを用いて分取したＩ群のパネト細胞群を位相差顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係るパネト細胞群の製造方法、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象のスクリーニング方法およびパネト細胞からの分泌物の製造方法について詳細に説明する。
【００２２】
本発明に係るパネト細胞群の製造方法は、生きたパネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造可能な方法であって、
（ｉ）小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程（腸上皮細胞群調製工程）
（ｉｉ）前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程（ＦＳパネト細胞群調製工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉ）の工程を有する。
【００２３】
本発明における、「パネト細胞」は、「Ｐａｎｅｔｈ ｃｅｌｌ」あるいは「パネート細胞」と表記される場合がある。また、本発明において、「パネト細胞群」とは、パネト細胞を分取することを目的として、セルソーターを用いて分取した結果、得られた細胞群をいう。したがってパネト細胞群は、必ずしもパネト細胞のみからなる細胞群に限られず、例えば、パネト細胞を含む腸上皮細胞群や、本発明に係るスクリーニング法の特徴を損なわない範囲で任意の細胞を含む細胞群であってもよい。
【００２４】
ここで、本発明における「腸上皮細胞群」とは、クリプトを構成する円柱細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネト細胞、幹細胞を含む腸上皮細胞などが分離された状態で含まれる細胞群のことをいう。この分離された状態は、完全に各細胞が分離された状態はもとより、パネト細胞が単一の細胞としてある程度得られる程度に分離された状態も包含する。
【００２５】
本発明において、「パネト細胞の構成比率」とは、１つの細胞群において、細胞総数に対するパネト細胞数の割合を指す。この割合は適宜、定法に従って求めることができるが、例えば、位相差顕微鏡を用いて強拡大視野で細胞の懸濁液を観察することによって求めることができる。なお、位相差顕微鏡での観察の際、パネト細胞の有する大型の分泌顆粒は特徴的なコントラストを発生することから、パネト細胞とパネト細胞以外の細胞とは容易に識別することができる。
【００２６】
（ｉ）の腸上皮細胞群調製工程におけるクリプトの採取は、例えば、｛Ａｙａｂｅ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１巻、第１１３−１１８頁、２０００年｝に従って行うことができるが、特にこれに限定されず、クリプトがある程度の割合で含まれる組織が得られればよい。クリプトが含まれる割合は適宜、定法に従って求めることができるが、例えば、位相差顕微鏡を用いて弱拡大視野で組織を観察することによって求めることができる。なお、図１に示すとおり、クリプト基底部に存在するパネト細胞は大型の分泌顆粒を多数有しており、位相差顕微鏡での観察の際、この分泌顆粒の構造は特徴的なコントラストを発生することから、このコントラストを目印とすることにより、クリプトを容易に識別することができる。
【００２７】
（ｉ）の腸上皮細胞群調製工程において、用いるコラゲナーゼの種類、コラゲナーゼの使用量、反応温度、反応時間などは特に限定されず、パネト細胞が単一の細胞としてある程度得られる程度に、クリプトを構成する各細胞が分離されればよい。
【００２８】
本発明において用いるセルソーターは特に限定されず、例えばＪＳＡＮ（ベイバイオサイエンス社）、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（日本ＢＤ社）、ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（ベックマン・コールター社）などが用いることができるが、ＪＳＡＮ（ベイバイオサイエンス社）を用いるのが好ましい。また、セルソーターの操作は添付の使用書に従って行うことができる。
【００２９】
セルソーターで細胞を分取する際に用いるパラメーターの前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）は、レーザー光の軸に対して前方約２０度未満の小さい角度で散乱する光であり、細胞の大きさに関連して変化する。また、側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）は、レーザー光の軸に対して約９０度で散乱する光であり、サンプルの内部構造に応じて変化する。すなわち、サンプルの細胞が大きいほど、前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）の値は大きくなり、サンプルの細胞の内部密度が高いほど、側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）は大きくなる。パネト細胞は比較的大型の細胞であり、細胞内部密度が高いという特徴を有することから、（ｉｉ）のＦＳパネト細胞群調製工程において、これらをパラメーターとして細胞を分取することにより、高い構成比率でパネト細胞を含むパネト細胞群を製造することができる。
【００３０】
すなわち本発明において、パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造する場合、パネト細胞を蛍光物質により標識する必要はなく、ＦＳＣ−Ｈを３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０とし、かつ、ＳＳＣ−Ｈを５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０に設定して、セルソーターにより細胞を分取することによって、パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造することができる。
【００３１】
次に、本発明に係るパネト細胞群の製造方法の異なる態様の一つは、生きたパネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造可能な方法であって、
（ｉ）小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程（腸上皮細胞群調製工程）
（ｉｉ）波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程（ＦＬパネト細胞群調製工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉ）の工程を有する。
【００３２】
セルソーターで細胞を分取する際に用いるパラメーターの蛍光は、サンプルに励起光を照射してサンプルが発する特定の波長の光であり、サンプルが蛍光色素を有するか否かや、サンプルが有する場合のその蛍光色素の種類によって決まる。パネト細胞は大型の分泌顆粒を細胞質中に多数有しており、その分泌顆粒は波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光を発することから、（ｉｉ）のＦＬパネト細胞群調製工程において、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして細胞を分取することにより、高い構成比率でパネト細胞を含むパネト細胞群を製造することができる。
【００３３】
すなわち本発明において、パネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造する場合、パネト細胞を蛍光物質により標識する必要はなく、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）をＦＨ５１２〜５５８≧３００に設定して、セルソーターにより細胞を分取することによって、パネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造することができる。また、分取する範囲の上限値を設定することにより、さらに高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群を得ることができる。この場合の上限値としては、２０００以下とすることが好ましく、１５００以下とすることがより好ましく、１０００以下とすることがさらに好ましい。
【００３４】
また、本発明に係るパネト細胞群の製造方法においては、前方散乱光、側方散乱光および波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の３つのパラメーターを合わせて用いてもよい。その場合、例えば、前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとして腸上皮細胞群からパネト細胞群を製造した後、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとしてそのパネト細胞群から細胞を分取することにより行うことができる。また、その逆に、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして腸上皮細胞群からパネト細胞群を製造した後、前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとしてそのパネト細胞群から細胞を分取することにより行うことができる。さらにまた、前方散乱光、側方散乱光および波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の３つを同時にパラメーターとして、腸上皮細胞群からパネト細胞群を製造してもよい。
【００３５】
次に、本発明に係るパネト細胞群の製造方法の異なる態様のもう一つは、生きたパネト細胞の構成比率が９０％以上であるパネト細胞群を製造可能な方法であって、
（ｉ）小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程（腸上皮細胞群調製工程）
（ｉｉ）界面活性剤を用いて腸上皮細胞群に含まれるパネト細胞の細胞膜を処理し、パネト細胞内のパネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体が到達し得る状態にする工程（界面活性剤処理工程）
（ｉｉｉ）パネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体を結合させてパネト細胞を標識する工程（パネト細胞標識工程）
（ｉｖ）結合させた蛍光標識抗体の蛍光をパラメーターとして、セルソーターを用いて標識したパネト細胞を含むパネト細胞群を得る工程（標識パネト細胞群調製工程）
以上（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する。
【００３６】
（ｉｉ）の界面活性剤処理工程において用いる界面活性剤は特に限定されないが、パネト細胞の活性消失を抑え、かつパネト細胞内部に存在するパネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体が到達し得る程度に、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤から適宜選択して用いることができる。
【００３７】
本発明におけるパネト細胞特異的タンパク質には、例えば、α−ディフェンシン、リゾチーム、分泌型ホスホリパーゼＡ２などを挙げることができる。
【００３８】
（ｉｉｉ）のパネト細胞標識工程において用いることができる蛍光標識抗体は特に限定されないが、パネト細胞特異的タンパク質に結合してパネト細胞を標識する程度に、当業者が適宜選択可能な公知の蛍光標識抗体を用いることができる。例えば、フルオレセインイソチアネート（ＦＩＴＣ）を結合した抗リゾチーム抗体や、抗リゾチーム抗体とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を結合した抗リゾチーム抗体に対する抗体（二次抗体）とを組み合わすなどして用いることができる。
【００３９】
（ｉｖ）の標識パネト細胞群調製工程において用いるパラメーターは、パネト細胞特異的タンパク質に結合させた蛍光標識抗体の蛍光に応じて、適宜設定することができる。
【００４０】
次に、本発明に係るスクリーニング方法は、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）本発明に係るパネト細胞群の製造方法を用いてパネト細胞群を製造する工程（パネト細胞群製造工程）、
（ｉｉ）製造したパネト細胞群と対象とを作用させる工程（対象作用工程）、
（ｉｉｉ）対象を作用させたパネト細胞群の分泌物を定量する工程（分泌物定量工程）、
（ｉｖ）定量した結果に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程（定量評価工程）、
を有する。
【００４１】
（ｉｉ）の対象作用工程において、製造したパネト細胞群と対象とを作用させる方法は特に限定されず、適宜、定法に従って行うことができるが、例えば、対象をパネト細胞群を浸漬した培養液に添加する方法や、対象を溶解した生理食塩水をマイクロインジェクション法により細胞内に注入する方法などにより行うことができる。
【００４２】
（ｉｉｉ）の分泌物定量工程において、定量する方法は特に限定されず、適宜、定法に従って行うことができるが、例えば、分泌物に含まれるタンパク質の総量を定量する方法、分泌物に含まれる特定のタンパク質を定量する方法などを挙げることができる。前者の方法としては、例えば、紫外吸収法、ＢＣＡ法、ブラッドフォード法、ローリー法、ビューレット法などを挙げることができ、後者の方法としては、例えば、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法などを挙げることができる。
【００４３】
パネト細胞群の分泌物に含まれる特定のタンパク質には、例えば、α−ディフェンシン、リゾチーム、分泌型ホスホリパーゼＡ２などを挙げることができる。
【００４４】
次に、本発明に係るスクリーニング方法の異なる態様は、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）本発明に係るパネト細胞群の製造方法を用いてパネト細胞群を製造する工程（パネト細胞群製造工程）、
（ｉｉ）対象を添加した培地で、製造したパネト細胞群を培養する工程（対象添加培養工程）、
（ｉｉｉ）培養後の培地成分に微生物を作用させる工程（微生物作用工程）、
（ｉｖ）作用させた微生物の状態を確認する工程（状態確認工程）、
（ｖ）確認した状態に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程（状態評価工程）
を有する。
【００４５】
（ｉｉ）の対象添加培養工程において用いることのできる培地は、特に限定されず、ブレットキットＣＧＭ（三光純薬社）などの市販の培地や、個々の成分の正確な組成に従った既知の培地を使用してもよく、そのような培地としては、例えば、ＰＢＳ（−）、ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ (Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ)、ＲＰＭＩ１６４０ 、ＡＩＭ−Ｖ、ＡＤＣ、ＬＰＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、Ｈａｍ’ｓＦ１２、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＢＧＪ、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｌ−１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ−１５）、ＭｃＣｏｙ５Ａ、Ｍ１９９、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒなどを挙げることができる。さらに、必要に応じて、公知の構成の培地成分や、アール平衡塩溶液、ハンクス平衡塩溶液、スピナー塩溶液などの公知の平衡塩類組成成分、抗生物質やビタミン類、ホルモン類、ｐＨ調整剤、血清、その他生物由来成分などを加えることができる。
【００４６】
（ｉｉｉ）の微生物作用工程において、培地成分に微生物を作用させる方法は特に限定されず、例えば、培養後の培地の上清にウイルスを浸漬する方法や、培養後の培地の上清を透析後、凍結乾燥したものを添加した培養液で細菌を培養する方法などを用いることができる。
【００４７】
（ｉｖ）の状態確認工程において、微生物の状態を確認する方法は特に限定されず、適宜、定法に従って行うことができるが、例えば、細菌であれば、その培養液を栄養アガープレートに播いてコロニーを計測することにより細菌の生存率を求める方法や、ウイルスであれば適当な細菌に感染させた後、プラークアッセイを行ってウイルスの感染率を求める方法などを挙げることができる。
【００４８】
次に、本発明に係る分泌物の製造方法は、パネト細胞からの分泌物を製造する方法であって、
（ｉ）本発明に係るパネト細胞群の製造方法を用いてパネト細胞群を製造する工程（パネト細胞群製造工程）
（ｉｉ）製造したパネト細胞群とパネト細胞からの分泌を促進する物質および／またはパネト細胞からの分泌を促進する微生物とを作用させてパネト細胞の分泌物を得る工程（分泌物製造工程）
を有する。
【００４９】
（ｉｉ）の分泌物製造工程で用いることのできるパネト細胞からの分泌を促進する物質および／またはパネト細胞からの分泌を促進する微生物は特に限定されず、例えば、本発明に係るパネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象のスクリーニング方法により得られた対象や、各種のグラム陰性菌やグラム陽性菌、ネズミチフス菌、細菌成分としてのリポ多糖やムラミルジペプチド、カルバコールなどを用いることができる。
【００５０】
以下、パネト細胞群の製造方法、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象のスクリーニング方法およびパネト細胞からの分泌物の製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５１】
＜実施例１＞パネト細胞群の調製
（１）クリプトを含む懸濁液の調製
ＩＣＲマウス（日本チャールズ・リバー社）から、従来法に従ってクリプトを含む小腸の組織を採取し、１ｍＬのＰＢＳ（−）に懸濁して、クリプトを含む懸濁液を調製した｛Ａｙａｂｅ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１巻、第１１３−１１８頁、２０００年｝。この懸濁液に含まれるクリプト数を血球計算盤（Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ；サンリード硝子社）を用いて数えたところ、５〜８×１０４個であった。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いて弱拡大視野で観察して、この懸濁液に含まれる組織のうちクリプトが占める割合を求めたところ、その割合は７０％以上であった。
【００５２】
（２）腸上皮細胞群の懸濁液の調製
本実施例（１）で調製したクリプトを含む懸濁液に、３００Ｕ／ｍＬとなるようコラゲナーゼ（シグマ社）を添加し、３７℃、１５分間インキュベートした後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。その後、これを１〜３ｍＬのＰＢＳ（−）に懸濁してクリプトを構成する個々の細胞からなる腸上皮細胞群の懸濁液を調製した。この懸濁液に含まれる細胞総数を血球計算盤（Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ；サンリード硝子社）を用いて数えたところ、２×１０６〜１×１０７個であった。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いて強拡大視野で観察して、この懸濁液に含まれる細胞総数に対するパネト細胞数の割合（以下、パネト細胞の構成比率）を求めたところ、その割合は約１〜４％、平均約１．５％であった。
【００５３】
（３）前方散乱光および側方散乱光を用いた無標識パネト細胞群の調製
蛍光物質などで標識されていない、生きたパネト細胞を高い構成比率で含む細胞群を得るため、パネト細胞が比較的大型の細胞であり、細胞内部密度が高いという特徴を利用して、セルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いてその調製を試みた。
【００５４】
まず、前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとし、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液を解析した。その結果を図２に示す。
【００５５】
続いて、細胞を分取する際のパラメーターとして前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）の範囲および側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）の範囲を変化させ、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液１〜３ｍＬから細胞群を分取した。設定したパラメーターの範囲の組み合わせを以下および図２に示す。
【００５６】
設定したパラメーターの範囲の組み合わせ
Ａ群；２４０≦ＦＳＣ−Ｈ≦４４０、１１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦３６０
Ｂ群；５４０≦ＦＳＣ−Ｈ≦７４５、１１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦３６０
Ｃ群；３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０、２６０≦ＳＳＣ−Ｈ≦３９０
Ｄ群；３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０、２６０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０
Ｅ群；３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０、３９０≦ＳＳＣ−Ｈ≦５１０
Ｆ群；３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０、５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０
【００５７】
分取したＡ〜Ｆの各パネト細胞群における、パネト細胞の構成比率Ｐ（％）を本実施例（２）と同様の手法により求めた。その結果を以下に示す。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いた、Ｃ群、Ｅ群およびＦ群の観察結果を図３に示す。
【００５８】
パネト細胞の構成比率Ｐ（％）
Ａ群；Ｐ＝９．３
Ｂ群；Ｐ＝７．７
Ｃ群；１０≦Ｐ＜１５
Ｄ群；Ｐ＝２６．５
Ｅ群；Ｐ＝２９．１
Ｆ群；５０≦Ｐ≦８０（平均６４）
【００５９】
上記のパネト細胞の構成比率および図３に示すように、Ａ〜Ｃ群におけるパネト細胞の構成比率Ｐ（％）の値はＰ＜１５であり、Ｄ、Ｅ群のパネト細胞の構成比率Ｐ（％）の値は、それぞれＰ＝２６．５、Ｐ＝２９．１であった。これに対し、Ｆ群のパネト細胞の構成比率Ｐ（％）の値は、５０≦Ｐ≦８０、平均Ｐ＝６４と高い値であった。
【００６０】
これらの結果より、３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０かつ５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０としてセルソーターを用いて細胞群を分取することにより、５０％以上の高い構成比率でパネト細胞を含むパネト細胞群が得られることが明らかになった。また、腸上皮細胞群におけるパネト細胞の構成比率は平均で約１．５％であることから、セルソーターを用いてこれらのパラメーターで細胞群を分取することにより、得られるパネト細胞群のパネト細胞の構成比率を、例えば初期の構成比率が１．５％である場合にはこれを数十倍にまで高められることが明らかになった。
【００６１】
（４）蛍光を用いた無標識パネト細胞群の調製
蛍光物質などで標識されていない、生きたパネト細胞をより高い構成比率で含む細胞群を得るため、本実施例（３）に記載のパネト細胞の特徴に加えて、パネト細胞が大型の分泌顆粒を細胞質中に多数有しており、その分泌顆粒が自家蛍光を発するという特徴を利用して、セルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いてその調製を試みた。
【００６２】
［４−１］波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光を用いた無標識パネト細胞群の調製
まず、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとし、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液を解析した。続いて、本実施例（３）で得たＦ群のパネト細胞群を同じパラメーターを用いて、同様に解析した。これらの結果を図４に示す。
【００６３】
図４に示すように、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光により腸上皮細胞群を解析した結果においてＦ群のパネト細胞群は、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）が最も高値となる部分に集積していることが明らかになった。
【００６４】
この結果を受けて、細胞を分取する際のパラメーターＦＨ５１２〜５５８をＦＨ５１２〜５５８≧３００として、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用い、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液１〜３ｍＬから細胞群を分取した。以下、この分取したパネト細胞群をＧ群とする。分取の際に設定したパラメーターの範囲を図５に示す。
【００６５】
分取したＧ群のパネト細胞群における、パネト細胞の構成比率Ｐ（％）を本実施例（２）と同様の手法により求めたところ、Ｐ＝３０〜７０であった。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いてＧ群を観察したところ、多くのパネト細胞が確認された。その結果を図６に示す。
【００６６】
これらの結果より、ＦＨ５１２〜５５８≧３００として、セルソーターを用いて細胞群を分取することにより、３０〜７０％の高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。また、分取する範囲の上限値を１０００〜２０００とすることによって、さらに高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。また、腸上皮細胞群におけるパネト細胞の構成比率は平均で約１．５％であることから、セルソーターを用いてこのパラメーターで細胞群を分取することにより、得られるパネト細胞群のパネト細胞の構成比率を、例えば初期の構成比率が１．５％である場合にはこれを数十倍にまで高められることが明らかになった。
【００６７】
［４−２］波長が５６５〜５９５ｎｍの蛍光を用いた無標識パネト細胞群の調製
次に、波長が５６５〜５９５ｎｍの蛍光をパラメーターとし、本実施例［４−１］と同様の手法により、腸上皮細胞群を解析して蛍光の強度が高い範囲で細胞群を分取し、パネト細胞の構成比率を求めたところ、高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。
【００６８】
［４−３］波長が６６５〜６９５ｎｍの蛍光を用いた無標識パネト細胞群の調製
続いて、波長が６６５〜６９５ｎｍの蛍光をパラメーターとし、本実施例［４−１］と同様の手法により、腸上皮細胞群を解析して蛍光の強度が高い範囲で細胞群を分取し、パネト細胞の構成比率を求めたところ、高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。
【００６９】
（５）標識パネト細胞群の調製
生きたパネト細胞をさらに高い構成比率で含む細胞群を得るため、パネト細胞特異的タンパク質に対する蛍光標識抗体でパネト細胞を標識し、蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ＦＬ）をパラメーターとして、セルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いてその調製を試みた。
【００７０】
［５−１］細胞膜の透過処理
ます、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液１ｍＬに、０．１％となるようＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ社）を添加して室温で５分間反応させた後、ＰＢＳ（−）ですばやく洗浄した。その後、１ｍＬのＰＢＳ（−）に懸濁することにより腸上皮細胞群に含まれるパネト細胞の細胞膜の透過処理を行った。
【００７１】
［５−２］パネト細胞の標識
続いて、５μＬの抗リゾチーム抗体（ＤＡＫＯ社）と２５μＬのＺｅｎｏｎ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを合わせて室温で５分間反応させた後、１％（Ｗ／Ｗ）のＢＳＡを含むＰＢＳ（−）を加えて２００μＬにメスアップした。これを本実施例［４−１］で細胞膜の透過処理を行った腸上皮細胞群の懸濁液１ｍＬに添加し、室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳ（−）で洗浄して腸上皮細胞群の懸濁液に含まれるパネト細胞を標識した。
【００７２】
［５−３］セルソーターを用いた標識パネト細胞群の調製
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光をパラメーターとし、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例［５−２］で標識したパネト細胞を含む腸上皮細胞群の懸濁液を解析した。その結果を図７に示す。
【００７３】
続いて、細胞を分取する際のパラメーターとしてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光の強度（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨＡＦ４８８）が低い範囲と高い範囲とを設定し、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例［５−２］で標識したパネト細胞を含む腸上皮細胞群の懸濁液１〜３ｍＬから細胞群を分取した。以下、ＦＨＡＦ４８８が低い範囲で分取したパネト細胞群をＨ群とし、ＦＨＡＦ４８８が高い範囲で分取したパネト細胞群をＩ群とする。設定したパラメーターの範囲を以下および図７に示す。
【００７４】
設定したパラメーターの範囲
Ｈ群；０．１≦ＦＨＡＦ４８８≦６．１
Ｉ群；２８≦ＦＨＡＦ４８８≦２６００
【００７５】
分取した各パネト細胞群における、パネト細胞の構成比率Ｐ（％）を本実施例（２）と同様の手法により求めた。その結果、Ｈ群でＰ＝９８以上と高い値が確認された。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いてＨ群を観察したところ、多くのパネト細胞が確認された。その結果を図８に示す。
【００７６】
これらの結果より、細胞膜の透過処理を短時間行った後、パネト細胞特異的に発現するタンパク質であるリゾチームに対する蛍光抗体でパネト細胞を標識し、２８≦ＦＨＡＦ４８８≦２６００としてセルソーターを用いて細胞群を分取することにより、９８％以上の高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。また、腸上皮細胞群におけるパネト細胞の構成比率は平均で約１．５％であることから、蛍光標識抗体およびセルソーターを用いて細胞群を分取することにより、得られるパネト細胞群のパネト細胞の構成比率を、例えば初期の構成比率が１．５％である場合にはこれを数十倍にまで高められることが明らかになった。
【００７７】
＜実施例２＞パネト細胞からの抗微生物物質の分泌誘導および抗微生物活性の確認
（１）カルバコールによる分泌誘導および分泌物の殺菌活性の確認
［１−１］カルバコールによる分泌誘導
実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群から、５×１０５個の細胞を１つの細胞群として計２つの細胞群を採取し、それぞれをＰＢＳ（−）１ｍＬに浸漬した。続いて、一方の細胞群に１０μｇ／ｍＬ、他方の細胞群に１００μｇ／ｍＬとなるよう、パネト細胞に抗微生物物質を分泌させる誘導因子であるカルバコール（ＳＩＧＭＡ社）｛Ａｙａｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻、第２号、第１１３−１１８頁、２０００年｝を添加し、３０分間培養した。その後、培養上清をそれぞれ１ｍＬ回収してメンブレンフィルター（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）により透析した後、凍結乾燥機（Ｆｒｅｅｅｚｏｎｅ；Ｌａｂｃｏｎｃｏ社）により凍結乾燥した。
【００７８】
［１−２］パネト細胞分泌物の殺菌率の測定
本実施例（１）［１−１］で調製した凍結乾燥物を、従来法に従って、ディフェンシン感受性のネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）｛Ｇｕｏ Ｌ.ら、Ｃｅｌｌ、第９５巻、第１８９−１９８頁、１９９８年｝の培地に加えて、３７℃、１時間培養した｛Ａｙａｂｅ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１巻、第１１３−１１８頁、２０００年｝。コントロールとして、本実施例（１）［１−１］で調製した凍結乾燥物を添加しない培地にて同様にネズミチフス菌を培養した。続いて、これらの培地５０μＬを、Ｔｒｉｐｔｉｃ ｓｏｙ ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ社）を用いて作成した栄養アガープレート上にそれぞれ塗布し、３７℃にて一晩培養した。その後、従来法に従って、それぞれの栄養アガープレート上の生存コロニー数を計測し｛Ａｙａｂｅ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１巻、第１１３−１１８頁、２０００年｝、コントロールの生存コロニー数に対する培養上清の凍結乾燥物添加群の生存コロニー数の割合から殺菌率を求めた。
【００７９】
その結果、１０μｇ／ｍＬのカルバコールにより分泌誘導した培養上清の凍結乾燥物を添加した培地で培養したネズミチフス菌の殺菌率は平均４０％であり、カルバコール１００μｇ／ｍＬの場合では、平均６０％であった。
【００８０】
以上の結果より、１０μｇ／ｍＬのカルバコールまたは１００μｇ／ｍＬのカルバコールにより分泌誘導した細胞群の培養上清の凍結乾燥物は、ネズミチフス菌に対する殺菌活性を有することが確認された。すなわち、実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群は、カルバコールの刺激により殺菌活性を有する分泌物を分泌することが明らかになった。
【００８１】
（２）カルバコールおよびネズミチフス菌による分泌誘導および分泌物中のリゾチーム濃度の測定
［２−１］カルバコールおよびネズミチフス菌による分泌誘導
実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群から、５×１０５個の細胞を１つの細胞群として計３つのパネト細胞群を採取し、それぞれをＰＢＳ（−）１ｍＬに浸漬した。続いて、そのうち１つの細胞群には１０μｇ／ｍＬとなるようカルバコール（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、もう１つの細胞群には１０ＣＦＵ／ｃｅｌｌとなるようネズミチフス菌を添加し、残りの１つのパネト細胞群には何も添加せずに、それぞれ培養した。カルバコール添加群では培養開始から５分後および１５分後に、ネズミチフス菌添加群では培養開始から１５分後に、コントロールでは培養開始から５分後および１５分後に、培養上清を１ｍＬずつ回収した。
【００８２】
［２−２］パネト細胞分泌物中のリゾチーム濃度の測定
本実施例［２−１］で回収した培養上清中に含まれるリゾチームの濃度を、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ＥＬＩＳＡはＡｓｓａｙＭａｘ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＡＳＳＡＹＰＲＯ社）を用いて、定法に従って行った。
【００８３】
その結果、カルバコールにより分泌誘導した培養上清中のリゾチーム濃度は５分間培養で６３０ｎｇ／ｍＬ、１５分間培養で７２０ｎｇ／ｍＬであり、ネズミチフス菌により分泌誘導した培養上清中のリゾチーム濃度は１５分間培養で８８０ｎｇ／ｍＬであった。これに対し、コントロールの培養上清中のリゾチーム濃度は５分間培養および１５分間培養で、いずれも３５０ｎｇ／ｍＬ以下であった。
【００８４】
これらの結果より、カルバコールおよびネズミチフス菌により分泌誘導した細胞群の培養上清中には、コントロールに比べて有意に高濃度のリゾチームが含まれることが確認された。すなわち、実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群は、カルバコールまたはネズミチフス菌の刺激により、リゾチームを含む分泌物を分泌することが明らかになった。
【００８５】
（３）カルバコールおよびネズミチフス菌による分泌誘導および分泌物中のα−ディフェンシンの確認
［３−１］カルバコールおよびネズミチフス菌による分泌誘導
本実施例［２−１］と同様の手法により３つのパネト細胞群を採取し、カルバコール添加群、ネズミチフス菌添加群およびコントロールとしてそれぞれ培養した。培養開始から１５分後に、それぞれの培養上清を１ｍＬずつ回収した。
【００８６】
［３−２］パネト細胞分泌物中のα−ディフェンシンの確認
本実施例［３−１］で回収した培養上清中にα−ディフェンシンが含まれるか否かを、ウエスタンブロット法を定法に従って行うことにより確認した。
【００８７】
その結果、カルバコールおよびネズミチフス菌により分泌誘導した細胞群の培養上清中には、コントロールに比べて有意に高濃度のα−ディフェンシンが含まれることが確認された。すなわち、実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群は、カルバコールまたはネズミチフス菌の刺激によりα−ディフェンシンを含む分泌物を分泌することが明らかになった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パネト細胞群の製造方法、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象のスクリーニング方法およびパネト細胞からの分泌物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
小腸は消化管において胃と大腸との間をなす部分であり、ほ乳類では、胃に近い方から十二指腸、空腸、回腸に分けられる。小腸の内腔は腸絨毛と呼ばれる指状の突起で覆われており、腸絨毛の間にはクリプト（腸腺、リーベルキューン腺、腸陰窩、腸小窩、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｒｙｐｔ）と呼ばれる窪みが存在している。これらの構造を有する小腸の内腔は一層の腸上皮細胞で覆われている。
【０００３】
小腸の内腔は体内に取り込んだ食物を消化・吸収する場であると同時に、外界と接する場である。それ故、小腸の内腔を覆う腸上皮細胞は、栄養素を消化・吸収する機能を有する一方、細菌やウイルスなどの感染を防御する機能を有している。この腸上皮細胞には、４種類の細胞（円柱細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネト細胞）と、これらの起源と考えられている幹細胞とが存在する。
【０００４】
このうちパネト細胞はクリプトの基底部にのみ存在している。パネト細胞は大型の分泌顆粒を有しており、細菌に曝されるなどの刺激を受けると、分泌顆粒内の物質を分泌する。この分泌物には抗菌ペプチドであるα−ディフェンシン、リゾチーム、分泌型ホスホリパーゼＡ２などが含まれており、生体への感染防御に大きな貢献をしていることが知られている（非特許文献１）。
【０００５】
したがって、パネト細胞からの分泌物を感染症の予防や治療に利用するための研究開発がなされている。例えば、特許文献１には、パネト細胞からの抗微生物物質の分泌を促す物質としてイソロイシン、ロイシンまたはバリンから選択される少なくとも１種の分岐鎖必須アミノ酸を有効成分として含有する抗菌ペプチド分泌誘発剤が開示されている。また、特許文献２には、本発明者らによるパネト細胞を長期間培養して抗微生物物質を大量に生産させる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−９５９３８号公報
【特許文献２】特開２００６−２４６７６４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ Ａ．Ｊ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、第１０巻、第１２８０−１２８９頁、１９９６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、抗微生物活性を有するパネト細胞からの分泌物を利用するためには、生きたパネト細胞またはその分泌物を大量に得ることが必要である。しかしながら、分泌物は抗微生物活性を有するが故、大腸菌等の微生物を用いて大量製造することが難しい。また、特許文献２に開示された方法では多数のパネト細胞を得ることができないため、大量の分泌物を得るためには、少数のパネト細胞を長期間培養して得る必要があり、その結果、多くの時間と作業量を必要とする。さらに、特許文献２には、クリプトを構成する細胞群から、セルソーターを用いてパネト細胞を単離する旨が記載されているが、パネト細胞が特異的に分布する領域を選択しておらず、マイクロピペットを用いてパネト細胞を回収しているに過ぎない。
【０００９】
本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、小腸から採取したクリプトから、生きたパネト細胞を高い構成比率で含むパネト細胞群を製造すること、前記パネト細胞群を用いてパネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象を効率よくスクリーニングすること、および前記パネト細胞群を用いてパネト細胞からの分泌物を効率よく製造することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、小腸から採取したクリプトをコラゲナーゼで処理した後、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）または波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとし、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて細胞群を分取することにより、あるいは蛍光標識抗体を用いてパネト細胞を標識し、セルソーターを用いて細胞群を分取することにより、生きたパネト細胞を高い構成比率で含むパネト細胞群が得られること、および得られたパネト細胞群に分泌誘導因子を作用させて得た分泌物が抗微生物活性を有することを見いだし、下記の各発明を完成した。
【００１１】
（１）パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程とを有する、前記方法。
【００１２】
（２）前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）が３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０および側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）が５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０である、（１）に記載の方法。
【００１３】
（３）生きたパネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程とを有する、前記方法。
【００１４】
（４）波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）がＦＨ５１２〜５５８≧３００である、（３）に記載の方法。
【００１５】
（５）生きたパネト細胞の構成比率が９０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、界面活性剤を用いて腸上皮細胞群に含まれるパネト細胞の細胞膜を処理し、パネト細胞内のパネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体が到達し得る状態にする工程と、パネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体を結合させてパネト細胞を標識する工程と、結合させた蛍光標識抗体の蛍光をパラメーターとして、セルソーターを用いて標識したパネト細胞を含むパネト細胞群を得る工程とを有する、前記方法。
【００１６】
（６）パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、（１）から（５）のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、製造したパネト細胞群と対象とを作用させる工程と、対象を作用させたパネト細胞群の分泌物を定量する工程と、定量した結果に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程とを有する、前記方法。
【００１７】
（７）パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、（１）から（５）のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、対象を添加した培地で、製造したパネト細胞群を培養する工程と、培養後の培地成分に微生物を作用させる工程と、作用させた微生物の状態を確認する工程と、確認した状態に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程とを有する、前記方法。
【００１８】
（８）パネト細胞からの分泌物を製造する方法であって、（１）から（５）のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、製造したパネト細胞群とパネト細胞からの分泌を促進する物質および／またはパネト細胞からの分泌を促進する微生物とを作用させてパネト細胞の分泌物を得る工程とを有する、前記方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生きたパネト細胞を高い構成比率で含むパネト細胞群を得ることができる。また、前記パネト細胞群を用いて、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象を効率よくスクリーニングすることができる。さらに、前記パネト細胞群を用いてパネト細胞群からの分泌物を効率よく得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】クリプトを含む懸濁液を位相差顕微鏡で観察した結果を示す図である。図中、クリプトを矢印で示す。
【図２】前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとして、懸濁液中に含まれる全細胞を解析した結果において、分取する範囲を示した図である。図中、縦軸の値は側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）を示し、横軸の値は前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）を示す。
【図３】Ｃ群、Ｅ群およびＦ群のパネト細胞群を位相差顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図４】波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、懸濁液中に含まれる全細胞を解析した結果およびＦ群に含まれる全細胞を解析した結果である。図中、縦軸の値は細胞数を示し、横軸の値は波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）を示す。
【図５】波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、懸濁液中に含まれる全細胞を解析した結果において、分取する範囲を示した図である。図中、縦軸の値は細胞数を示し、横軸の値はＦＨ５１２〜５５８を示す。
【図６】セルソーターを用いて分取したＧ群のパネト細胞群を位相差顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図７】Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光をパラメーターとして、懸濁液中に含まれる全細胞を解析した結果において、分取する細胞群の範囲を示した図である。図中、縦軸の値は細胞数を示し、横軸の値はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光の強度（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨＡＦ４８８）を示す。
【図８】セルソーターを用いて分取したＩ群のパネト細胞群を位相差顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係るパネト細胞群の製造方法、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象のスクリーニング方法およびパネト細胞からの分泌物の製造方法について詳細に説明する。
【００２２】
本発明に係るパネト細胞群の製造方法は、生きたパネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造可能な方法であって、
（ｉ）小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程（腸上皮細胞群調製工程）
（ｉｉ）前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程（ＦＳパネト細胞群調製工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉ）の工程を有する。
【００２３】
本発明における、「パネト細胞」は、「Ｐａｎｅｔｈ ｃｅｌｌ」あるいは「パネート細胞」と表記される場合がある。また、本発明において、「パネト細胞群」とは、パネト細胞を分取することを目的として、セルソーターを用いて分取した結果、得られた細胞群をいう。したがってパネト細胞群は、必ずしもパネト細胞のみからなる細胞群に限られず、例えば、パネト細胞を含む腸上皮細胞群や、本発明に係るスクリーニング法の特徴を損なわない範囲で任意の細胞を含む細胞群であってもよい。
【００２４】
ここで、本発明における「腸上皮細胞群」とは、クリプトを構成する円柱細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネト細胞、幹細胞を含む腸上皮細胞などが分離された状態で含まれる細胞群のことをいう。この分離された状態は、完全に各細胞が分離された状態はもとより、パネト細胞が単一の細胞としてある程度得られる程度に分離された状態も包含する。
【００２５】
本発明において、「パネト細胞の構成比率」とは、１つの細胞群において、細胞総数に対するパネト細胞数の割合を指す。この割合は適宜、定法に従って求めることができるが、例えば、位相差顕微鏡を用いて強拡大視野で細胞の懸濁液を観察することによって求めることができる。なお、位相差顕微鏡での観察の際、パネト細胞の有する大型の分泌顆粒は特徴的なコントラストを発生することから、パネト細胞とパネト細胞以外の細胞とは容易に識別することができる。
【００２６】
（ｉ）の腸上皮細胞群調製工程におけるクリプトの採取は、例えば、｛Ａｙａｂｅ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１巻、第１１３−１１８頁、２０００年｝に従って行うことができるが、特にこれに限定されず、クリプトがある程度の割合で含まれる組織が得られればよい。クリプトが含まれる割合は適宜、定法に従って求めることができるが、例えば、位相差顕微鏡を用いて弱拡大視野で組織を観察することによって求めることができる。なお、図１に示すとおり、クリプト基底部に存在するパネト細胞は大型の分泌顆粒を多数有しており、位相差顕微鏡での観察の際、この分泌顆粒の構造は特徴的なコントラストを発生することから、このコントラストを目印とすることにより、クリプトを容易に識別することができる。
【００２７】
（ｉ）の腸上皮細胞群調製工程において、用いるコラゲナーゼの種類、コラゲナーゼの使用量、反応温度、反応時間などは特に限定されず、パネト細胞が単一の細胞としてある程度得られる程度に、クリプトを構成する各細胞が分離されればよい。
【００２８】
本発明において用いるセルソーターは特に限定されず、例えばＪＳＡＮ（ベイバイオサイエンス社）、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（日本ＢＤ社）、ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（ベックマン・コールター社）などが用いることができるが、ＪＳＡＮ（ベイバイオサイエンス社）を用いるのが好ましい。また、セルソーターの操作は添付の使用書に従って行うことができる。
【００２９】
セルソーターで細胞を分取する際に用いるパラメーターの前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）は、レーザー光の軸に対して前方約２０度未満の小さい角度で散乱する光であり、細胞の大きさに関連して変化する。また、側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）は、レーザー光の軸に対して約９０度で散乱する光であり、サンプルの内部構造に応じて変化する。すなわち、サンプルの細胞が大きいほど、前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）の値は大きくなり、サンプルの細胞の内部密度が高いほど、側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）は大きくなる。パネト細胞は比較的大型の細胞であり、細胞内部密度が高いという特徴を有することから、（ｉｉ）のＦＳパネト細胞群調製工程において、これらをパラメーターとして細胞を分取することにより、高い構成比率でパネト細胞を含むパネト細胞群を製造することができる。
【００３０】
すなわち本発明において、パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造する場合、パネト細胞を蛍光物質により標識する必要はなく、ＦＳＣ−Ｈを３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０とし、かつ、ＳＳＣ−Ｈを５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０に設定して、セルソーターにより細胞を分取することによって、パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造することができる。
【００３１】
次に、本発明に係るパネト細胞群の製造方法の異なる態様の一つは、生きたパネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造可能な方法であって、
（ｉ）小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程（腸上皮細胞群調製工程）
（ｉｉ）波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程（ＦＬパネト細胞群調製工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉ）の工程を有する。
【００３２】
セルソーターで細胞を分取する際に用いるパラメーターの蛍光は、サンプルに励起光を照射してサンプルが発する特定の波長の光であり、サンプルが蛍光色素を有するか否かや、サンプルが有する場合のその蛍光色素の種類によって決まる。パネト細胞は大型の分泌顆粒を細胞質中に多数有しており、その分泌顆粒は波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光を発することから、（ｉｉ）のＦＬパネト細胞群調製工程において、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして細胞を分取することにより、高い構成比率でパネト細胞を含むパネト細胞群を製造することができる。
【００３３】
すなわち本発明において、パネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造する場合、パネト細胞を蛍光物質により標識する必要はなく、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）をＦＨ５１２〜５５８≧３００に設定して、セルソーターにより細胞を分取することによって、パネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造することができる。また、分取する範囲の上限値を設定することにより、さらに高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群を得ることができる。この場合の上限値としては、２０００以下とすることが好ましく、１５００以下とすることがより好ましく、１０００以下とすることがさらに好ましい。
【００３４】
また、本発明に係るパネト細胞群の製造方法においては、前方散乱光、側方散乱光および波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の３つのパラメーターを合わせて用いてもよい。その場合、例えば、前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとして腸上皮細胞群からパネト細胞群を製造した後、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとしてそのパネト細胞群から細胞を分取することにより行うことができる。また、その逆に、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして腸上皮細胞群からパネト細胞群を製造した後、前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとしてそのパネト細胞群から細胞を分取することにより行うことができる。さらにまた、前方散乱光、側方散乱光および波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の３つを同時にパラメーターとして、腸上皮細胞群からパネト細胞群を製造してもよい。
【００３５】
次に、本発明に係るパネト細胞群の製造方法の異なる態様のもう一つは、生きたパネト細胞の構成比率が９０％以上であるパネト細胞群を製造可能な方法であって、
（ｉ）小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程（腸上皮細胞群調製工程）
（ｉｉ）界面活性剤を用いて腸上皮細胞群に含まれるパネト細胞の細胞膜を処理し、パネト細胞内のパネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体が到達し得る状態にする工程（界面活性剤処理工程）
（ｉｉｉ）パネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体を結合させてパネト細胞を標識する工程（パネト細胞標識工程）
（ｉｖ）結合させた蛍光標識抗体の蛍光をパラメーターとして、セルソーターを用いて標識したパネト細胞を含むパネト細胞群を得る工程（標識パネト細胞群調製工程）
以上（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する。
【００３６】
（ｉｉ）の界面活性剤処理工程において用いる界面活性剤は特に限定されないが、パネト細胞の活性消失を抑え、かつパネト細胞内部に存在するパネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体が到達し得る程度に、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤から適宜選択して用いることができる。
【００３７】
本発明におけるパネト細胞特異的タンパク質には、例えば、α−ディフェンシン、リゾチーム、分泌型ホスホリパーゼＡ２などを挙げることができる。
【００３８】
（ｉｉｉ）のパネト細胞標識工程において用いることができる蛍光標識抗体は特に限定されないが、パネト細胞特異的タンパク質に結合してパネト細胞を標識する程度に、当業者が適宜選択可能な公知の蛍光標識抗体を用いることができる。例えば、フルオレセインイソチアネート（ＦＩＴＣ）を結合した抗リゾチーム抗体や、抗リゾチーム抗体とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を結合した抗リゾチーム抗体に対する抗体（二次抗体）とを組み合わすなどして用いることができる。
【００３９】
（ｉｖ）の標識パネト細胞群調製工程において用いるパラメーターは、パネト細胞特異的タンパク質に結合させた蛍光標識抗体の蛍光に応じて、適宜設定することができる。
【００４０】
次に、本発明に係るスクリーニング方法は、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）本発明に係るパネト細胞群の製造方法を用いてパネト細胞群を製造する工程（パネト細胞群製造工程）、
（ｉｉ）製造したパネト細胞群と対象とを作用させる工程（対象作用工程）、
（ｉｉｉ）対象を作用させたパネト細胞群の分泌物を定量する工程（分泌物定量工程）、
（ｉｖ）定量した結果に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程（定量評価工程）、
を有する。
【００４１】
（ｉｉ）の対象作用工程において、製造したパネト細胞群と対象とを作用させる方法は特に限定されず、適宜、定法に従って行うことができるが、例えば、対象をパネト細胞群を浸漬した培養液に添加する方法や、対象を溶解した生理食塩水をマイクロインジェクション法により細胞内に注入する方法などにより行うことができる。
【００４２】
（ｉｉｉ）の分泌物定量工程において、定量する方法は特に限定されず、適宜、定法に従って行うことができるが、例えば、分泌物に含まれるタンパク質の総量を定量する方法、分泌物に含まれる特定のタンパク質を定量する方法などを挙げることができる。前者の方法としては、例えば、紫外吸収法、ＢＣＡ法、ブラッドフォード法、ローリー法、ビューレット法などを挙げることができ、後者の方法としては、例えば、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法などを挙げることができる。
【００４３】
パネト細胞群の分泌物に含まれる特定のタンパク質には、例えば、α−ディフェンシン、リゾチーム、分泌型ホスホリパーゼＡ２などを挙げることができる。
【００４４】
次に、本発明に係るスクリーニング方法の異なる態様は、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）本発明に係るパネト細胞群の製造方法を用いてパネト細胞群を製造する工程（パネト細胞群製造工程）、
（ｉｉ）対象を添加した培地で、製造したパネト細胞群を培養する工程（対象添加培養工程）、
（ｉｉｉ）培養後の培地成分に微生物を作用させる工程（微生物作用工程）、
（ｉｖ）作用させた微生物の状態を確認する工程（状態確認工程）、
（ｖ）確認した状態に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程（状態評価工程）
を有する。
【００４５】
（ｉｉ）の対象添加培養工程において用いることのできる培地は、特に限定されず、ブレットキットＣＧＭ（三光純薬社）などの市販の培地や、個々の成分の正確な組成に従った既知の培地を使用してもよく、そのような培地としては、例えば、ＰＢＳ（−）、ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ (Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ)、ＲＰＭＩ１６４０ 、ＡＩＭ−Ｖ、ＡＤＣ、ＬＰＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、Ｈａｍ’ｓＦ１２、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＢＧＪ、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｌ−１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ−１５）、ＭｃＣｏｙ５Ａ、Ｍ１９９、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒなどを挙げることができる。さらに、必要に応じて、公知の構成の培地成分や、アール平衡塩溶液、ハンクス平衡塩溶液、スピナー塩溶液などの公知の平衡塩類組成成分、抗生物質やビタミン類、ホルモン類、ｐＨ調整剤、血清、その他生物由来成分などを加えることができる。
【００４６】
（ｉｉｉ）の微生物作用工程において、培地成分に微生物を作用させる方法は特に限定されず、例えば、培養後の培地の上清にウイルスを浸漬する方法や、培養後の培地の上清を透析後、凍結乾燥したものを添加した培養液で細菌を培養する方法などを用いることができる。
【００４７】
（ｉｖ）の状態確認工程において、微生物の状態を確認する方法は特に限定されず、適宜、定法に従って行うことができるが、例えば、細菌であれば、その培養液を栄養アガープレートに播いてコロニーを計測することにより細菌の生存率を求める方法や、ウイルスであれば適当な細菌に感染させた後、プラークアッセイを行ってウイルスの感染率を求める方法などを挙げることができる。
【００４８】
次に、本発明に係る分泌物の製造方法は、パネト細胞からの分泌物を製造する方法であって、
（ｉ）本発明に係るパネト細胞群の製造方法を用いてパネト細胞群を製造する工程（パネト細胞群製造工程）
（ｉｉ）製造したパネト細胞群とパネト細胞からの分泌を促進する物質および／またはパネト細胞からの分泌を促進する微生物とを作用させてパネト細胞の分泌物を得る工程（分泌物製造工程）
を有する。
【００４９】
（ｉｉ）の分泌物製造工程で用いることのできるパネト細胞からの分泌を促進する物質および／またはパネト細胞からの分泌を促進する微生物は特に限定されず、例えば、本発明に係るパネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象のスクリーニング方法により得られた対象や、各種のグラム陰性菌やグラム陽性菌、ネズミチフス菌、細菌成分としてのリポ多糖やムラミルジペプチド、カルバコールなどを用いることができる。
【００５０】
以下、パネト細胞群の製造方法、パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象のスクリーニング方法およびパネト細胞からの分泌物の製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５１】
＜実施例１＞パネト細胞群の調製
（１）クリプトを含む懸濁液の調製
ＩＣＲマウス（日本チャールズ・リバー社）から、従来法に従ってクリプトを含む小腸の組織を採取し、１ｍＬのＰＢＳ（−）に懸濁して、クリプトを含む懸濁液を調製した｛Ａｙａｂｅ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１巻、第１１３−１１８頁、２０００年｝。この懸濁液に含まれるクリプト数を血球計算盤（Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ；サンリード硝子社）を用いて数えたところ、５〜８×１０４個であった。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いて弱拡大視野で観察して、この懸濁液に含まれる組織のうちクリプトが占める割合を求めたところ、その割合は７０％以上であった。
【００５２】
（２）腸上皮細胞群の懸濁液の調製
本実施例（１）で調製したクリプトを含む懸濁液に、３００Ｕ／ｍＬとなるようコラゲナーゼ（シグマ社）を添加し、３７℃、１５分間インキュベートした後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。その後、これを１〜３ｍＬのＰＢＳ（−）に懸濁してクリプトを構成する個々の細胞からなる腸上皮細胞群の懸濁液を調製した。この懸濁液に含まれる細胞総数を血球計算盤（Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ；サンリード硝子社）を用いて数えたところ、２×１０６〜１×１０７個であった。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いて強拡大視野で観察して、この懸濁液に含まれる細胞総数に対するパネト細胞数の割合（以下、パネト細胞の構成比率）を求めたところ、その割合は約１〜４％、平均約１．５％であった。
【００５３】
（３）前方散乱光および側方散乱光を用いた無標識パネト細胞群の調製
蛍光物質などで標識されていない、生きたパネト細胞を高い構成比率で含む細胞群を得るため、パネト細胞が比較的大型の細胞であり、細胞内部密度が高いという特徴を利用して、セルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いてその調製を試みた。
【００５４】
まず、前方散乱光および側方散乱光をパラメーターとし、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液を解析した。その結果を図２に示す。
【００５５】
続いて、細胞を分取する際のパラメーターとして前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）の範囲および側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）の範囲を変化させ、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液１〜３ｍＬから細胞群を分取した。設定したパラメーターの範囲の組み合わせを以下および図２に示す。
【００５６】
設定したパラメーターの範囲の組み合わせ
Ａ群；２４０≦ＦＳＣ−Ｈ≦４４０、１１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦３６０
Ｂ群；５４０≦ＦＳＣ−Ｈ≦７４５、１１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦３６０
Ｃ群；３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０、２６０≦ＳＳＣ−Ｈ≦３９０
Ｄ群；３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０、２６０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０
Ｅ群；３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０、３９０≦ＳＳＣ−Ｈ≦５１０
Ｆ群；３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０、５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０
【００５７】
分取したＡ〜Ｆの各パネト細胞群における、パネト細胞の構成比率Ｐ（％）を本実施例（２）と同様の手法により求めた。その結果を以下に示す。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いた、Ｃ群、Ｅ群およびＦ群の観察結果を図３に示す。
【００５８】
パネト細胞の構成比率Ｐ（％）
Ａ群；Ｐ＝９．３
Ｂ群；Ｐ＝７．７
Ｃ群；１０≦Ｐ＜１５
Ｄ群；Ｐ＝２６．５
Ｅ群；Ｐ＝２９．１
Ｆ群；５０≦Ｐ≦８０（平均６４）
【００５９】
上記のパネト細胞の構成比率および図３に示すように、Ａ〜Ｃ群におけるパネト細胞の構成比率Ｐ（％）の値はＰ＜１５であり、Ｄ、Ｅ群のパネト細胞の構成比率Ｐ（％）の値は、それぞれＰ＝２６．５、Ｐ＝２９．１であった。これに対し、Ｆ群のパネト細胞の構成比率Ｐ（％）の値は、５０≦Ｐ≦８０、平均Ｐ＝６４と高い値であった。
【００６０】
これらの結果より、３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０かつ５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０としてセルソーターを用いて細胞群を分取することにより、５０％以上の高い構成比率でパネト細胞を含むパネト細胞群が得られることが明らかになった。また、腸上皮細胞群におけるパネト細胞の構成比率は平均で約１．５％であることから、セルソーターを用いてこれらのパラメーターで細胞群を分取することにより、得られるパネト細胞群のパネト細胞の構成比率を、例えば初期の構成比率が１．５％である場合にはこれを数十倍にまで高められることが明らかになった。
【００６１】
（４）蛍光を用いた無標識パネト細胞群の調製
蛍光物質などで標識されていない、生きたパネト細胞をより高い構成比率で含む細胞群を得るため、本実施例（３）に記載のパネト細胞の特徴に加えて、パネト細胞が大型の分泌顆粒を細胞質中に多数有しており、その分泌顆粒が自家蛍光を発するという特徴を利用して、セルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いてその調製を試みた。
【００６２】
［４−１］波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光を用いた無標識パネト細胞群の調製
まず、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとし、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液を解析した。続いて、本実施例（３）で得たＦ群のパネト細胞群を同じパラメーターを用いて、同様に解析した。これらの結果を図４に示す。
【００６３】
図４に示すように、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光により腸上皮細胞群を解析した結果においてＦ群のパネト細胞群は、波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）が最も高値となる部分に集積していることが明らかになった。
【００６４】
この結果を受けて、細胞を分取する際のパラメーターＦＨ５１２〜５５８をＦＨ５１２〜５５８≧３００として、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用い、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液１〜３ｍＬから細胞群を分取した。以下、この分取したパネト細胞群をＧ群とする。分取の際に設定したパラメーターの範囲を図５に示す。
【００６５】
分取したＧ群のパネト細胞群における、パネト細胞の構成比率Ｐ（％）を本実施例（２）と同様の手法により求めたところ、Ｐ＝３０〜７０であった。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いてＧ群を観察したところ、多くのパネト細胞が確認された。その結果を図６に示す。
【００６６】
これらの結果より、ＦＨ５１２〜５５８≧３００として、セルソーターを用いて細胞群を分取することにより、３０〜７０％の高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。また、分取する範囲の上限値を１０００〜２０００とすることによって、さらに高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。また、腸上皮細胞群におけるパネト細胞の構成比率は平均で約１．５％であることから、セルソーターを用いてこのパラメーターで細胞群を分取することにより、得られるパネト細胞群のパネト細胞の構成比率を、例えば初期の構成比率が１．５％である場合にはこれを数十倍にまで高められることが明らかになった。
【００６７】
［４−２］波長が５６５〜５９５ｎｍの蛍光を用いた無標識パネト細胞群の調製
次に、波長が５６５〜５９５ｎｍの蛍光をパラメーターとし、本実施例［４−１］と同様の手法により、腸上皮細胞群を解析して蛍光の強度が高い範囲で細胞群を分取し、パネト細胞の構成比率を求めたところ、高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。
【００６８】
［４−３］波長が６６５〜６９５ｎｍの蛍光を用いた無標識パネト細胞群の調製
続いて、波長が６６５〜６９５ｎｍの蛍光をパラメーターとし、本実施例［４−１］と同様の手法により、腸上皮細胞群を解析して蛍光の強度が高い範囲で細胞群を分取し、パネト細胞の構成比率を求めたところ、高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。
【００６９】
（５）標識パネト細胞群の調製
生きたパネト細胞をさらに高い構成比率で含む細胞群を得るため、パネト細胞特異的タンパク質に対する蛍光標識抗体でパネト細胞を標識し、蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ＦＬ）をパラメーターとして、セルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いてその調製を試みた。
【００７０】
［５−１］細胞膜の透過処理
ます、本実施例（２）で調製した腸上皮細胞群の懸濁液１ｍＬに、０．１％となるようＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ社）を添加して室温で５分間反応させた後、ＰＢＳ（−）ですばやく洗浄した。その後、１ｍＬのＰＢＳ（−）に懸濁することにより腸上皮細胞群に含まれるパネト細胞の細胞膜の透過処理を行った。
【００７１】
［５−２］パネト細胞の標識
続いて、５μＬの抗リゾチーム抗体（ＤＡＫＯ社）と２５μＬのＺｅｎｏｎ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを合わせて室温で５分間反応させた後、１％（Ｗ／Ｗ）のＢＳＡを含むＰＢＳ（−）を加えて２００μＬにメスアップした。これを本実施例［４−１］で細胞膜の透過処理を行った腸上皮細胞群の懸濁液１ｍＬに添加し、室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳ（−）で洗浄して腸上皮細胞群の懸濁液に含まれるパネト細胞を標識した。
【００７２】
［５−３］セルソーターを用いた標識パネト細胞群の調製
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光をパラメーターとし、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例［５−２］で標識したパネト細胞を含む腸上皮細胞群の懸濁液を解析した。その結果を図７に示す。
【００７３】
続いて、細胞を分取する際のパラメーターとしてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光の強度（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨＡＦ４８８）が低い範囲と高い範囲とを設定し、添付のプロトコールに従ってセルソーター（ＪＳＡＮ；ベイバイオサイエンス社）を用いて、本実施例［５−２］で標識したパネト細胞を含む腸上皮細胞群の懸濁液１〜３ｍＬから細胞群を分取した。以下、ＦＨＡＦ４８８が低い範囲で分取したパネト細胞群をＨ群とし、ＦＨＡＦ４８８が高い範囲で分取したパネト細胞群をＩ群とする。設定したパラメーターの範囲を以下および図７に示す。
【００７４】
設定したパラメーターの範囲
Ｈ群；０．１≦ＦＨＡＦ４８８≦６．１
Ｉ群；２８≦ＦＨＡＦ４８８≦２６００
【００７５】
分取した各パネト細胞群における、パネト細胞の構成比率Ｐ（％）を本実施例（２）と同様の手法により求めた。その結果、Ｈ群でＰ＝９８以上と高い値が確認された。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いてＨ群を観察したところ、多くのパネト細胞が確認された。その結果を図８に示す。
【００７６】
これらの結果より、細胞膜の透過処理を短時間行った後、パネト細胞特異的に発現するタンパク質であるリゾチームに対する蛍光抗体でパネト細胞を標識し、２８≦ＦＨＡＦ４８８≦２６００としてセルソーターを用いて細胞群を分取することにより、９８％以上の高い構成比率でパネト細胞を含む細胞群が得られることが明らかになった。また、腸上皮細胞群におけるパネト細胞の構成比率は平均で約１．５％であることから、蛍光標識抗体およびセルソーターを用いて細胞群を分取することにより、得られるパネト細胞群のパネト細胞の構成比率を、例えば初期の構成比率が１．５％である場合にはこれを数十倍にまで高められることが明らかになった。
【００７７】
＜実施例２＞パネト細胞からの抗微生物物質の分泌誘導および抗微生物活性の確認
（１）カルバコールによる分泌誘導および分泌物の殺菌活性の確認
［１−１］カルバコールによる分泌誘導
実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群から、５×１０５個の細胞を１つの細胞群として計２つの細胞群を採取し、それぞれをＰＢＳ（−）１ｍＬに浸漬した。続いて、一方の細胞群に１０μｇ／ｍＬ、他方の細胞群に１００μｇ／ｍＬとなるよう、パネト細胞に抗微生物物質を分泌させる誘導因子であるカルバコール（ＳＩＧＭＡ社）｛Ａｙａｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻、第２号、第１１３−１１８頁、２０００年｝を添加し、３０分間培養した。その後、培養上清をそれぞれ１ｍＬ回収してメンブレンフィルター（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）により透析した後、凍結乾燥機（Ｆｒｅｅｅｚｏｎｅ；Ｌａｂｃｏｎｃｏ社）により凍結乾燥した。
【００７８】
［１−２］パネト細胞分泌物の殺菌率の測定
本実施例（１）［１−１］で調製した凍結乾燥物を、従来法に従って、ディフェンシン感受性のネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）｛Ｇｕｏ Ｌ.ら、Ｃｅｌｌ、第９５巻、第１８９−１９８頁、１９９８年｝の培地に加えて、３７℃、１時間培養した｛Ａｙａｂｅ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１巻、第１１３−１１８頁、２０００年｝。コントロールとして、本実施例（１）［１−１］で調製した凍結乾燥物を添加しない培地にて同様にネズミチフス菌を培養した。続いて、これらの培地５０μＬを、Ｔｒｉｐｔｉｃ ｓｏｙ ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ社）を用いて作成した栄養アガープレート上にそれぞれ塗布し、３７℃にて一晩培養した。その後、従来法に従って、それぞれの栄養アガープレート上の生存コロニー数を計測し｛Ａｙａｂｅ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１巻、第１１３−１１８頁、２０００年｝、コントロールの生存コロニー数に対する培養上清の凍結乾燥物添加群の生存コロニー数の割合から殺菌率を求めた。
【００７９】
その結果、１０μｇ／ｍＬのカルバコールにより分泌誘導した培養上清の凍結乾燥物を添加した培地で培養したネズミチフス菌の殺菌率は平均４０％であり、カルバコール１００μｇ／ｍＬの場合では、平均６０％であった。
【００８０】
以上の結果より、１０μｇ／ｍＬのカルバコールまたは１００μｇ／ｍＬのカルバコールにより分泌誘導した細胞群の培養上清の凍結乾燥物は、ネズミチフス菌に対する殺菌活性を有することが確認された。すなわち、実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群は、カルバコールの刺激により殺菌活性を有する分泌物を分泌することが明らかになった。
【００８１】
（２）カルバコールおよびネズミチフス菌による分泌誘導および分泌物中のリゾチーム濃度の測定
［２−１］カルバコールおよびネズミチフス菌による分泌誘導
実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群から、５×１０５個の細胞を１つの細胞群として計３つのパネト細胞群を採取し、それぞれをＰＢＳ（−）１ｍＬに浸漬した。続いて、そのうち１つの細胞群には１０μｇ／ｍＬとなるようカルバコール（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、もう１つの細胞群には１０ＣＦＵ／ｃｅｌｌとなるようネズミチフス菌を添加し、残りの１つのパネト細胞群には何も添加せずに、それぞれ培養した。カルバコール添加群では培養開始から５分後および１５分後に、ネズミチフス菌添加群では培養開始から１５分後に、コントロールでは培養開始から５分後および１５分後に、培養上清を１ｍＬずつ回収した。
【００８２】
［２−２］パネト細胞分泌物中のリゾチーム濃度の測定
本実施例［２−１］で回収した培養上清中に含まれるリゾチームの濃度を、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ＥＬＩＳＡはＡｓｓａｙＭａｘ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＡＳＳＡＹＰＲＯ社）を用いて、定法に従って行った。
【００８３】
その結果、カルバコールにより分泌誘導した培養上清中のリゾチーム濃度は５分間培養で６３０ｎｇ／ｍＬ、１５分間培養で７２０ｎｇ／ｍＬであり、ネズミチフス菌により分泌誘導した培養上清中のリゾチーム濃度は１５分間培養で８８０ｎｇ／ｍＬであった。これに対し、コントロールの培養上清中のリゾチーム濃度は５分間培養および１５分間培養で、いずれも３５０ｎｇ／ｍＬ以下であった。
【００８４】
これらの結果より、カルバコールおよびネズミチフス菌により分泌誘導した細胞群の培養上清中には、コントロールに比べて有意に高濃度のリゾチームが含まれることが確認された。すなわち、実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群は、カルバコールまたはネズミチフス菌の刺激により、リゾチームを含む分泌物を分泌することが明らかになった。
【００８５】
（３）カルバコールおよびネズミチフス菌による分泌誘導および分泌物中のα−ディフェンシンの確認
［３−１］カルバコールおよびネズミチフス菌による分泌誘導
本実施例［２−１］と同様の手法により３つのパネト細胞群を採取し、カルバコール添加群、ネズミチフス菌添加群およびコントロールとしてそれぞれ培養した。培養開始から１５分後に、それぞれの培養上清を１ｍＬずつ回収した。
【００８６】
［３−２］パネト細胞分泌物中のα−ディフェンシンの確認
本実施例［３−１］で回収した培養上清中にα−ディフェンシンが含まれるか否かを、ウエスタンブロット法を定法に従って行うことにより確認した。
【００８７】
その結果、カルバコールおよびネズミチフス菌により分泌誘導した細胞群の培養上清中には、コントロールに比べて有意に高濃度のα−ディフェンシンが含まれることが確認された。すなわち、実施例１（３）で得たＦ群のパネト細胞群は、カルバコールまたはネズミチフス菌の刺激によりα−ディフェンシンを含む分泌物を分泌することが明らかになった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、
小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、
前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程と
を有する、前記方法。
【請求項２】
前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）が３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０および側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）が５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、
小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、
波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程と
を有する、前記方法。
【請求項４】
波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）がＦＨ５１２〜５５８≧３００である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
パネト細胞の構成比率が９０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、
小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、
界面活性剤を用いて腸上皮細胞群に含まれるパネト細胞の細胞膜を処理し、パネト細胞内のパネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体が到達し得る状態にする工程と、
パネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体を結合させてパネト細胞を標識する工程と、
結合させた蛍光標識抗体の蛍光をパラメーターとして、セルソーターを用いて標識したパネト細胞を含むパネト細胞群を得る工程と
を有する、前記方法。
【請求項６】
パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、
請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、
製造したパネト細胞群と対象とを作用させる工程と、
対象を作用させたパネト細胞群の分泌物を定量する工程と、
定量した結果に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程と
を有する、前記方法。
【請求項７】
パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、
請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、
対象を添加した培地で、製造したパネト細胞群を培養する工程と、
培養後の培地成分に微生物を作用させる工程と、
作用させた微生物の状態を確認する工程と、
確認した状態に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程と
を有する、前記方法。
【請求項８】
パネト細胞からの分泌物を製造する方法であって、
請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、
製造したパネト細胞群とパネト細胞からの分泌を促進する物質および／またはパネト細胞からの分泌を促進する微生物とを作用させてパネト細胞の分泌物を得る工程と
を有する、前記方法。
【請求項１】
パネト細胞の構成比率が５０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、
小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、
前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）および側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程と
を有する、前記方法。
【請求項２】
前方散乱光の強度（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＳＣ−Ｈ）が３９０≦ＦＳＣ−Ｈ≦９３０および側方散乱光の強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ−ｈｅｉｇｈｔ；ＳＳＣ−Ｈ）が５１０≦ＳＳＣ−Ｈ≦６６０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パネト細胞の構成比率が３０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、
小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、
波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光をパラメーターとして、パネト細胞を蛍光物質により標識せずにセルソーターを用いて腸上皮細胞群からパネト細胞群を得る工程と
を有する、前記方法。
【請求項４】
波長が５１２〜５５８ｎｍの蛍光の強度（５１２〜５５８ｎｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １−ｈｅｉｇｈｔ；ＦＨ５１２〜５５８）がＦＨ５１２〜５５８≧３００である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
パネト細胞の構成比率が９０％以上であるパネト細胞群を製造する方法であって、
小腸から採取されたクリプトからコラゲナーゼを用いてパネト細胞を含む腸上皮細胞群を調製する工程と、
界面活性剤を用いて腸上皮細胞群に含まれるパネト細胞の細胞膜を処理し、パネト細胞内のパネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体が到達し得る状態にする工程と、
パネト細胞特異的タンパク質に蛍光標識抗体を結合させてパネト細胞を標識する工程と、
結合させた蛍光標識抗体の蛍光をパラメーターとして、セルソーターを用いて標識したパネト細胞を含むパネト細胞群を得る工程と
を有する、前記方法。
【請求項６】
パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、
請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、
製造したパネト細胞群と対象とを作用させる工程と、
対象を作用させたパネト細胞群の分泌物を定量する工程と、
定量した結果に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程と
を有する、前記方法。
【請求項７】
パネト細胞の抗微生物物質の分泌を促進する対象をスクリーニングする方法であって、
請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、
対象を添加した培地で、製造したパネト細胞群を培養する工程と、
培養後の培地成分に微生物を作用させる工程と、
作用させた微生物の状態を確認する工程と、
確認した状態に基づき対象がパネト細胞の抗微生物物質の分泌促進能を有するか否かを評価する工程と
を有する、前記方法。
【請求項８】
パネト細胞からの分泌物を製造する方法であって、
請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法を用いてパネト細胞群を製造する工程と、
製造したパネト細胞群とパネト細胞からの分泌を促進する物質および／またはパネト細胞からの分泌を促進する微生物とを作用させてパネト細胞の分泌物を得る工程と
を有する、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−７８３１８（Ｐ２０１１−７８３１８Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３０９０４（Ｐ２００９−２３０９０４）
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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