パルス式電気化学検出方法
【課題】パルス式電気化学検出方法を提供する。
【解決手段】一実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも１つの検体を含む液体試料流を流入セル内の作動電極を通過して流す段階と、（ｂ）（１）第１の調整電位、（２）第２の検出及び酸化洗浄電位、及び（３）第３の還元洗浄電位であり、かつ第２の電位が第１及び第３の電位よりも高く、第１の電位が第３の電位よりも高い少なくとも３つのパルス電位を作動電極に印加する段階と、（ｃ）第２の電位を印加する期間中に作動電極からの出力を検出する段階とを含むパルス式電気化学検出方法に関する。
【解決手段】一実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも１つの検体を含む液体試料流を流入セル内の作動電極を通過して流す段階と、（ｂ）（１）第１の調整電位、（２）第２の検出及び酸化洗浄電位、及び（３）第３の還元洗浄電位であり、かつ第２の電位が第１及び第３の電位よりも高く、第１の電位が第３の電位よりも高い少なくとも３つのパルス電位を作動電極に印加する段階と、（ｃ）第２の電位を印加する期間中に作動電極からの出力を検出する段階とを含むパルス式電気化学検出方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
貴金属電極、主にＡｕ及びＰｔでの電子触媒反応に基づく電気活性官能基を有する脂肪族化合物の直接電気化学検出は公知である。電気化学検出は、液体及びイオンクロマトグラフィーにおいて広く受け入れられている検出手段である。電気化学検出器は、流入セル内の作動電極に電位を印加することにより作動する。このような検出器では、一般的に、作動電極、基準電極、及び対極である３つの電極から成るセルを使用する。一般的に、この方法は、電極表面の陽極及び陰極洗浄と共に検出作動を組み込む多段電位波形を使用する。典型的な電位波形においては、陽極検出は、第１の電位で行われ、電流サンプリングは、電位を印加する期間の終わりに行われる。電位は、次に、電極表面の酸化洗浄に向けて第２のより高い電位まで、かつ次に第１及び／又は第２の電位で形成された表面酸化物の陰極溶解による洗浄に向けて第１又は第２の電位よりも低い第３の電位までに段階的に変える。現在「パルスアンペロメトリック検出（ＰＡＤ）」として公知である電気測定検出を用いるこの方法の解析的応用は、アルコール、多価アルコール、及び炭水化物（還元及び非還元）、アミン及びアミノ酸（第１及び第２）、アミノ配糖体、及び多くの硫黄合成物（硫酸塩、スルホン酸、及びスルホンを除く）に対して明らかにされている。
【０００２】
「パルス電量検出（ＰＣＤ）」も説明されている。ＰＡＤとＰＣＤ間の重要な違いは、検出信号の測定と関係がある計器プロトコルにある。用語「パルス式電気化学検出」つまり「ＰＥＤ」は、ＰＡＤ及びＰＣＤを含む一般用語である。ＰＡＤでは、電極電流は、ある一定の期間（例えば、１６．７ｍｓ）（１／６０Ｈｚ-1で）にわたってサンプリングされるか又は平均化され、一方、ＰＣＤでは、応答が、１つの周期又は整数の連続した周期にわたって電子的に積分される。ＰＣＤは、本質的に、信号強度がより大きいために、かつ６０Ｈｚ相関ノイズ信号、すなわち、電子計器におけるノイズの支配的な形の積分が積分周期にわたってゼロのままであるために、より大きな信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を有する。
【０００３】
光度検出は、広範囲なπ結合のない脂肪族化合物に関する本質的に低い感度のために、かつ移動相の屈折率の変化を伴う基線変動のために悪影響を受ける。屈折率検出は、濃度勾配の影響を強く受け、かつ移動相組成の小さな変化に対してさえも観察される基線シフトは、検体信号を圧倒する可能性がある。
【０００４】
ＰＡＤ及びＰＣＤという方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と共に電気活性官能基を有する多くの脂肪族有機化合物の検出に向けて導入されたものである。多くのＰＡＤ／ＰＣＤ方法は、学術的及び企業の研究所の日々の仕事の一部となっている。このような方法の大部分は、作動電極の材料として金を利用する。白金作動電極の使用は、金電極の利用に遅れを取っている。多くの分析専門家は、既存の白金電極ベースの方法が金電極を使用する方法よりも使い難く、かつ再現性が低いことを見出している。
【０００５】
多くの検体は、異なる材料で製造した作動電極で検出可能である。様々な電極材料は、関連の検体を伴う試料マトリックスに応答して異なる性能を示している。例１：アルコールは、白金電極及び金電極で検出可能である。アルコールが高濃度の砂糖を有する試料内に存在する場合、白金電極は、金電極ほど過度のレベルの糖により影響を受けないので好ましい。例２：シアン化物アニオンは、銀電極又は白金電極で検出することができる。高濃度の硫化物を有する試料においては、銀電極は、影響を受けやすく、かつ高硫化物試料の非常に僅かな注入後にシアン化物に対する反応がなくなるのが観察されている。白金電極は、比較すると遙かに強固であり、高硫化物試料を何回も注入した後でさえもシアン化物に対する検出反応を供給し続ける。その結果、検体のリストの拡張に適し、かつ高Ｓ／Ｎで性能を発揮することができるより再現可能な電気化学白金ベースの方法を提供する必要性が存在する。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４、９３９、９２４号
【特許文献２】米国特許第４、０１３、４１３号
【特許文献３】米国特許第４、０２２、５７５号
【特許文献４】米国特許第４、１７７、６７７号
【特許文献５】米国特許第４、２２４、０３３号
【特許文献６】米国特許第４、２２７、９７３号
【特許文献７】米国特許第４、３１４、８２４号
【特許文献８】米国特許第４、３１５、７５４号
【特許文献９】米国特許第４、３５２、７８０号
【特許文献１０】米国特許第４、３９９、１０２号
【特許文献１１】米国特許第４、３９９、２２５号
【特許文献１２】米国特許第４、５０４、４４３号
【非特許文献１】Ｃ．Ｆ．Ｓｉｍｐｓｏｎ著「液体クロマトグラフィー技術」（１９８３年）
【非特許文献２】Ｊ．Ｈ．Ｋｎｏｘ著「高速液体クロマトグラフィー」（１９８１年）
【非特許文献３】Ｋ．Ｐｏｌｋａｒ他著「臨床分析における液体クロマトグラフィー」（１９８１年）
【非特許文献４】Ｓｋｅｇｇｓ、「Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ、Ｐａｔｈ．」、２８、３１１頁から３２２頁（１９５７年）
【発明の開示】
【０００７】
一実施形態においては、本発明は、（ａ）少なくとも１つの検体を含む液体試料流を流入セル内の作動電極を通過して流す段階と、（ｂ）（１）第１の調整及び検出電位、（２）第２の検出及び酸化洗浄電位、及び（３）第３の還元洗浄電位であり、かつ第２の電位が第１及び第３の電位よりも高く、第１の電位が第３の電位よりも高い少なくとも３つのパルス電位を作動電極に印加する段階と、（ｃ）第２の電位を印加する期間の少なくとも一部の間に作動電極からの出力を検出する段階とを含むパルス式電気化学検出方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、パルス式電気化学検出方法に関する。一実施形態においては、検出は、「パルス電量検出（ＰＣＤ）」として公知である電流積分により実行される。別の実施形態では、検出は、「パルスアンペロメトリック検出（ＰＡＤ）」として公知である電流測定法で実行される。本明細書での説明は、特記のない限り、電気化学検出としてこれらの２つの形態の検出を指す。発明の重要な態様は、例えば、ＰＣＤ又はＰＡＤによる検出のための作動電極から出力が、サイクルの最高電位を印加する期間中に検出されるということである。特定的な実施形態では、少なくとも３つの異なるパルス電位を作動電極に印加する。第１のパルスは、調整電位であり、第２のパルスは、検出及び酸化洗浄電位であり、第３のパルスは、還元洗浄電位である。好ましい実施形態では、第２の電位は、第１及び第３の電位より高く、第１の電位は、第３の電位より高い。作動電極からの出力は、第２の電位を印加する期間中に測定する。従って、電位を印加するパルス波形において最高電位中に出力信号を検出する。
【０００９】
一例として、図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃの調整電位は、波形と、本発明のために調整電位としてＥ1、検出及び酸化洗浄電位としてＥ2、及び還元洗浄電位としてＥ3とを含む米国特許第４、９３９、９２４号に例示されている。’９２４号特許で示されている方法と本発明の重要な違いは、例示する図において検出が最高電位つまりＥ2で行われることである。
【００１０】
Ｅ2である一定の積分期間を有する適切な段階的３電位波形を図２に示している。本発明の全ての電位は、基準電極Ａｇ／ＡｇＣｌ／３ＭＫＣｌに照らして記録している。
【００１１】
〔図２〕
【００１２】
第２の検出及び酸化洗浄電位よりも低く、第３の還元洗浄電位よりも高い第１の調整電位Ｅ1は、検出に向けて作動電極を調整又は活性化する役目をする。多くの場合、関連の検体は、電極調整中に電極表面に予吸着されている。一般的に、電極表面は、金属である。調整又は活性化は、電極の金属面上の水酸化物基の形成により又は金属酸化物の不完全な単層の生成により達成される。水酸化物基及び作成したばかりの少量の酸化物は、金属電極での有機化合物及び無機化合物の多くの酸化検出に必要とされる触媒状態の重要な要素である。
【００１３】
第２の又は検出及び酸化洗浄電位では、電極の表面は、一般的に、依然として触媒（基及び／又は酸化物）により覆われている。触媒は、予吸着検体の近くで酸素を利用可能にする本質的に不安定な酸素化合物である。関連の検体は、調整段階中又は検出段階中に予吸着されている。予吸着は、両方の段階にわたって広がることが多い。吸着検体が触媒部位に遭遇すると、酸化脱離が起こり、信号として検出される電子が生成される。電位Ｅ２時には、電極反応速度は、電位Ｅ１時よりも吸着速度から独立したものになる。吸着速度の独立性の増大により、検出の線形性がかなり改善される。検出信号を生成する酸化脱離と同時に、酸化物により電極表面が覆われる範囲が増大する。特に過度に長い期間がＥ２電位に選択された場合には、より安定した、より触媒的ではない酸化物が、優勢になる傾向がある。これとは対照的に、従来技術の検出（ＰＡＤ又はＰＣＤ）が電位Ｅ１時に行われ、酸化脱離の速度が、吸着速度により制御される遥かに大きな程度まで吸着速度により制御され、従って、較正プロットの線形性は、特に白金電極の場合は劣っている。
【００１４】
第３の洗浄還元電位Ｅ3では、作動電極表面は、調整期間中及び検出期間中に作成された全ての酸素種がない。酸化物の除去と同時に、過度の量の非触媒酸化物の下に捕捉される場合がある吸着検体及び／又はその酸化生成物の最終残留物も除去される。
【００１５】
本発明は、液体試料流内の検体を検出するのに用いることができる。液体試料流内の１つ又はそれよりも多くの検体を検出するフローインジェクション分析（ＦＩＡ）に適用可能である。それは、特に、クロマトグラフィーカラムのような分離媒体を通じて先に分離した液体試料流内の検体の検出に有用である。分離検体は、作動電極で検出される。
【００１６】
電位波形は、３つの電位パルスのうちの１つ又はそれよりも多くの間で一定である電位ステップ関数とすることができ、又は３つのパルスの相対電位レベルが上述のように見える限り、電位掃引関数のようなあらゆる他の形とすることができる。
【００１７】
最高電位時での検出により、ノイズレベルを最小にすることができると共に、線形較正の範囲を一部の異なる検体に向けて拡張することができる。更に、最高電位時での検出により、信号検出は、酸素還元の範囲から電極上で０．４７Ｖ辺りの過酸化水素に移動することになる。そのために、基線パルス発生及び酸素漬けを排除するか又は最小にすることができる。更に、検出中の性能に関係なく調整及び洗浄の低電位化を最適化することができる。従って、例えば、検出前に、波形電位のＥ１及びＥ３時に検体の予吸着又は表面予調整を最適化することができる。別の利点は、較正の線形性が多くの検体に対して改善するということである。更に、エーテル又はケトンのような一部の新しいカテゴリの検体を検出することができる。
【００１８】
白金電極の場合のＰＥＤ波形の電位及び時間の適切な範囲としては、以下が含まれる。
【００１９】
（表）
【００２０】
白金電極の場合のＰＥＤ波形の電位及び時間の好ましいに範囲としては、以下が含まれる。
【００２１】
（表）
【００２２】
検出期間は、ＰＥＤに対して第２の電位Ｅ２を印加する時間全体中に発生すると考えられる。しかし、Ｅ２を印加する期間の最終５％から９０％、より好ましくは、最終１０％から３０％のみにわたって検出することが好ましい。
【００２３】
少なくとも第１の調整電位、第２の検出及び酸化洗浄電位、及び第３の還元洗浄電位を含むパルス式電気化学検出に関して本発明を説明してきた。本発明は、本明細書で説明する上述の３つの電位の電位と検出の関係がある限り、これらの電位印加の前、後、又は間での更に別の電位の印加を含むシステムも包含する。
【００２４】
本発明のシステムは、特に、白金、イリジウム、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、及び鉛のような金属材料で形成した外面内の作動電極に有効である。好ましい作動材料電極は、白金である。
【００２５】
本発明の方法により特に上述の作動電極に関して上述の利点が得られる理由の１つの理論的な説明は、以下の通りである。比較的高い電位の選択により、酸素還元から過酸化水素までの電位範囲から信号生成が除去される。従って、溶離剤中の酸素濃度の突発的又は周期的変動から生じる「酸素漬け」又は基線パルス発生のようなアーチファクトが排除される。更に別の利点は、電位の最高時での信号生成酸化脱離をモニタすることによって得られる。信号生成電極反応は、もはや、低電位化と同程度に吸着速度により制御されない。従って、線形較正の範囲が拡張される。
【００２６】
本発明の電気化学検出方法は、特に、無機アニオン、アルコール、硫黄アミノ酸、チオエーテル、スルホキシド、フェノール、エーテル、アルデヒド、ケトン、アルケン、アルキン、ニトリル、アミノ酸、カルボン酸、及びその組合せのような検体に有効である。
【００２７】
米国特許第４、９３９、９２４号（’９２４号特許）に示すようなＰＣＤ及びＰＡＤの一般的な電位波形を図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃに示している。ＰＣＤ又はＰＡＤにおいては、Ｅ1の初期値は、電極表面が酸化物不足状態で存在するように選択する（不完全な酸化物単層の形成）。ｔdの遅延時間後、ｔsの期間にわたって、高速電位掃引（図１Ｂ）又は電位段階（図１Ｃ）により電位を値Ｅ1（又は、Ｅ1'、Ｅ1''、Ｅ1'''など＜Ｅ2を有するあらゆる数の電位）に前進させる。Ｅ1（又は、Ｅ1'、Ｅ1''、Ｅ1'''など）の値は、利用可能性及び／又は吸着検体の同時電気触媒酸化反応による表面の形成を引き起こすように選択する。次に、電位をＥ2に変えるか、又は保持期間ｔhにわたって初期値Ｅ1に戻し、保持期間ｔh中に、Ｅ1への電位変化中に成形された全ての酸化物は、電極表面から陰極剥離する。波形周期の総時間は、Ｅ1、Ｅ2、及びＥ3の印加時間の合計である。積分器（アナログ又はデジタルの）は、Ｅ1（又はＥ1'）印加期間中に起動させると印加期間を通して使用中のままである。積分器からの出力信号は、検出期間終了時にサンプリングされ、その値又は比例値は、記録装置に供給される。次に、それぞれ、陽極洗浄、陰極洗浄をもたらすＥ2及びＥ3のような正パルス及び負パルスを印加することができる。積分器は、Ｅ1印加終了時にリセットされる。値Ｅ1'は、可溶性及び吸着された検体の酸化反応の範囲を最大にするように選択する。しかし、最高電位は、０2発生と共に大きな陽極溶剤分解を引き起こすほど大きい正電位であるべきでない。
【００２８】
’９２４号特許の図１Ｂ及び図１Ｃ中のＰＣＤ波形に対しては、Ｅ1の値及び時間は、電極の完全な酸化洗浄を行うのに十分に大きなものとすることができるので、更に別の酸化洗浄のためのＥ2までのその後の段階は必要ではないと考えられる。
【００２９】
一般的に、本発明は、他の不可逆又は可逆過程と重畳したか又は一致する関連の検体と関係がある不可逆的電気化学過程の測定に適用可能である。表面酸化物の形成中の表面酸化物触媒反応の測定は、ＰＣＤ及び／又はＰＡＤ技術の１つの例である。
【００３０】
本明細書で説明するように、本発明の最高電位ＰＣＤ又はＰＡＤ法は、特に、液体クロマトグラフィー、特に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））により分離した液体試料中の複数の化学成分の検出に適用可能である。液体試料は、通常、現像試薬としての電解液を含み、かつクロマトグラフィーカラムを通過した溶離液と混合される。カラムの充填物としては、一般的にジェル又は粒状の形態のイオン交換体又は逆位相充填物があると考えられる。この技術は、十分に開発されている。例えば、Ｃ．Ｆ．Ｓｉｍｐｓｏｎ著「液体クロマトグラフィー技術」（１９８３年）、Ｊ．Ｈ．Ｋｎｏｘ著「高速液体クロマトグラフィー」（１９８１年）、及びＫ．Ｐｏｌｋａｒ他著「臨床分析における液体クロマトグラフィー」（１９８１年）を参照されたい。
【００３１】
更に、ＰＣＤ法は、フローインジェクション分析（ＦＩＡ）の検出方法として有用である。このようなシステムは、Ｓｋｅｇｇｓ、「Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ、Ｐａｔｈ．」、２８、３１１頁から３２２頁（１９５７年）において、及び米国特許第４、０１３、４１３号、米国特許第４、０２２、５７５号、米国特許第４、１７７、６７７号、米国特許第４、２２４、０３３号、米国特許第４、２２７、９７３号、米国特許第４、３１４、８２４号、米国特許第４、３１５、７５４号、米国特許第４、３５２、７８０号、米国特許第４、３９９、１０２号、米国特許第４、３９９、２２５号、及び米国特許第４、５０４、４４３号においてに説明されている。このようなシステムにおいては、これらの試料は、例えば、液体クロマトグラフィーで分離することによってではなく、連続液体搬送流で検出器に供給する。この技術は、上述の液体のクロマトグラフィーシステムと比較すると用途が限定される。
【００３２】
本発明のパルス式電気化学検出方法は、基準電極及び作動電極を含む２電極セル、及び基準電極、作動電極、及び対極を含む３電極セルの使用に適用される。
【００３３】
実験部分
化学物質
適切な溶液は、試薬のための化学物質（「Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ」、ニュージャージー州フェアローン）及び純水（「ＮＡＮＯｐｕｒｅ ＩＩ」、「Ｂａｒｎｉｓｔｅｄ Ｃｏ．」、マサチューセッツ州ボストン）から調製することができる。
【００３４】
計装
本発明の電気化学法の適切な計装は、’９２４号特許に示されている形式のものとすることができる。
【００３５】
注入する試料容積は、０．１から２００μｌとすることができ、かつ流量は、０．０００１から５．０００ｍｌ／ｍｉｎであった。電気化学流入セルは、Ｐｔ電極（約０．００７８ｃｍ2）を有する「薄層」デザイン（「Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ」、カリフォルニア州サニーベール）のものとすることができる。メーカー支給品であるＡｇ／ＡｇＣｌ電極を全ての実験で使用した。
【００３６】
手順
図１Ｂの波形におけるＥ1からＥ1'までの電位掃引を含む図１の全てのＰＥＤ波形を直接「Ｄｉｏｎｅｘ ＥＤ５０」検出器内でプログラムするか、又はＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウエアで作成して、クロマトグラフィープログラム実行中に検出器にダウンロードすることができる。
【００３７】
検出限界及び解析的較正
検出限界を推定する２つの主な方法がある。２つの方法の第１の方法においては、基線ノイズの平均値を指定の期間にわたって判断し、関連の検体の既知の量の注入の助けを借りて濃度単位で調整する。大部分の場合、濃度又は量単位で表す基線ノイズの３倍の倍数を検出限界として指定する。２つの方法の第２の方法においては、オペレータは、既知の濃度の１つの標準液の一連（ｎ＞３）の注入の濃度又は量単位で標準偏差を判断する。次に、検出限界を計算標準偏差の倍数として表す。増倍率は、選択信頼水準から導出して統計数表から取得することができる。解析的較正は、異なる濃度の一連の標準液の注入から生成される。濃度範囲は、未知の濃度の予想範囲を超えるように選択すべきである。標準液の既知の濃度に対する解析的応答から、濃度に対する解析的応答の依存を示す較正プロットが構成される。線形較正プロットは、非線形較正プロットよりも良好な精度及び正確性を示すことは公知である。
【００３８】
酸素の影響
Ｅ１での信号積分の従来の手法を用いると、注入試料及び移動相の酸素の不揃いの濃度により、「酸素漬け」と呼ばれている実質的なアーチファクトが発生することがある。酸素漬けは、作動電極の表面での過酸化水素への溶存酸素の還元のために検出信号により引き起こされる。大部分の場合、酸素濃度は、クロマトグラフィー移動相におけるよりも試料における方が高い。酸素濃度が高くなると、その結果、負電流の値が増大する。これは、負方向の基線レベルのかなり大きな変化としてクロマトグラムで明示される。クロマトグラフィー条件によっては、結果として生じる基線外乱は、数分以上にわたって拡大する可能性がある。クロマトグラフィーピークの開始及び終了の再現可能な検出は、関連の検体により引き起こされない低い基線ノイズ及び基線規定外変動の欠如に依存する。白金電極をクロマトグラフィー検出に使用した場合、酸素漬けは、もし存在すれば、多くの場合に重要な検体（例えば、メタノール及びエタノール）と共溶出し、それらの形状に歪みを発生させる。
【００３９】
波形の比較
ＰＣＤに対する波形、例えば、図１Ｃに対する図１Ａ又は図１Ｂの選択したものの最適化は、関連の検体の影響を受ける。検出が表面酸化物の形成により妨げられる検体、例えば、アルコールに対しては、図１Ｃに示す波形が適切と考えることはできないのは、Ｅ1からＥ2への電位の段階的変化が解析的応答の停止による酸化物の迅速かつ広範囲な形成をもたらすからである。表面酸化物、例えば、硫黄合成物の形成により引き起こされる機構により検出される吸着検体は、いずれの波形によっても十分に検出されると予想される。多くの他の検体に対して当て嵌まるように、ケトン及びエーテルも、表面酸化物の形成により引き起こされる過程により検出される。図３Ｂ及び図１２のクロマトグラムは、図２の波形を使用して取得したものである。
【００４０】
本発明を例示するために、その実施の以下の非限定的な実施例を提供する。
【実施例１】
【００４１】
実施例１：新しい方法は、従来技術の方法により検出されなかった化合物の部類を検出する。
【００４２】
図３Ａは、従来技術法（０．２５Ｖでの信号積分）によりアセトン及びブタノンを検出する試みの失敗例を示している。未知の不純物、おそらくアルコール（ピーク２）のみにより、検出応答が生成される。同一波形であるが、Ｅ２＝１．１５Ｖでの信号積分を用いて（図３Ｂ）、両方のケトンが容易に検出される。
【００４３】
〔図３Ａ、図３Ｂ〕
【実施例２】
【００４４】
実施例２：酸素漬けの排除
【００４５】
従来技術の方法を用いると、多くのクロマトグラムは、「酸素漬け」（負のピーク３、下部トレース）という特徴を示している。図４を参照すると、新しい方法（上部トレース）では、酸素還元から過酸化水素までの電位範囲から遥かに離れた電位での信号積分により酸素漬けが最小にされる。たとえホルムアルデヒドのピーク高さが新しい方法により低減（４６から１５ｎＣまで）されたとしても、基線ノイズの同時の降下（０．１２５から０．０３４ｎＣまで）により、新しい方法により０．８２から０．６６μＭに検出限界が改善した。
【００４６】
〔図４〕
【実施例３】
【００４７】
実施例３：新しい方法によるパルス発生の最小化
【００４８】
図５を参照すると、従来技術の手法及び新しい方法により、亜硫酸塩アニオン（４５対４１ｎＣ）に対して類似のサイズの反応が生じる。しかし、新しい方法は、ポンプピストンによる溶離液流への酸素挿入により引き起こされる規則的な基線パルス発生が最小にされる。基線ノイズの対応する低減（０．５から０．０３ｎＣまで）により、新しい方法で検出限界が著しく改善する（０．３４から０．０２ｐｐｍまで）。
【００４９】
〔図５〕
【実施例４】
【００５０】
実施例４：低ノイズ化による感度改善
【００５１】
従来技術の方法による７つの異なるアルコールの検出を図６の下部トレースで示す（積分：Ｅ１）。図６の上部トレースは、改良型方法で取得したクロマトグラムである（積分：Ｅ２）。ピーク高さは、実はこの特定の適用例においては、改良型方法に対しては、実際には幾分低めである。しかし、信号減少は、ノイズの改善（０．３５６７から０．０２８６ｎＣまで）により補正されるものよりも大きい。ノイズの３ｘの倍数として計算した検出限界は、４倍から６倍改善する（例えば、エタノールのＬＯＤ、４倍）。
【００５２】
〔図６〕
【実施例５】
【００５３】
実施例５：線形性の改善
【００５４】
図７のプロットは、従来技術の方法によるエタノールに対する較正曲線を示す（Ｅ１での信号積分（図１の波形を参照されたい））。
【００５５】
〔図７〕
【００５６】
図８のプロットでは、エタノールのデータは、波形の最高電位での信号積分により取得した（図２の波形のＥ２を参照されたい）。
【００５７】
〔図８〕
【００５８】
較正の線形性は、波形の最高電位での信号積分によって明確に改善される。
【００５９】
図９及び図１０のプロットは、１−プロパノールの線形性の改善を示している。
【００６０】
〔図９〕
【００６１】
〔図１０〕
【実施例６】
【００６２】
実施例６：二重結合を有する化合物の検出
【００６３】
図１１は、飽和及び不飽和有機酸の検出を示している。
【００６４】
プロピオン酸は、アクリル酸と同数の炭素原子及びカルボキシルを有する。アクリル酸は、二重結合を有する点のみが異なる。２つのトレースのうちで低い方において検出信号が高いことは、白金電極でのアクリル酸の二重結合の酸化により説明可能である。
【００６５】
〔図１１〕
【実施例７】
【００６６】
実施例７：三重結合を有する化合物の検出
【００６７】
図１２は、有機化合物における三重結合の検出を示している。
【００６８】
ブタノン及び３−ブチン−２−オンは、同数の炭素原子及び同じケトン基を有する。３−ブチン−２−オンは、付加的な三重結合のみが異なる。２つのトレースのうちで低い方において検出信号が高いことは、白金電極での３−ブチン−２−オンの三重結合の酸化により説明可能である。
【００６９】
〔図１２〕
【００７０】
表１は、白金電極で現在検出可能である全ての化合物及び化合物部類のリストを示す。２つの新しい化合物部類が、電気化学検出でアクセス可能となった（エーテル及びケトン）。検出の感度は、表中に説明した全ての化合物に対して改善された。
【００７１】
（表１）
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】本発明に有用な３つ（Ａ、Ｂ、Ｃ）の代表的な電位波形の１つを示す図である。
【図１Ｂ】本発明に有用な３つ（Ａ、Ｂ、Ｃ）の代表的な電位波形の１つを示す図である。
【図１Ｃ】本発明に有用な３つ（Ａ、Ｂ、Ｃ）の代表的な電位波形の１つを示す図である。
【符号の説明】
【００７３】
Ｅ1 調整電位
Ｅ2 検出及び酸化洗浄電位
Ｅ3 還元洗浄電位
【図１】
【背景技術】
【０００１】
貴金属電極、主にＡｕ及びＰｔでの電子触媒反応に基づく電気活性官能基を有する脂肪族化合物の直接電気化学検出は公知である。電気化学検出は、液体及びイオンクロマトグラフィーにおいて広く受け入れられている検出手段である。電気化学検出器は、流入セル内の作動電極に電位を印加することにより作動する。このような検出器では、一般的に、作動電極、基準電極、及び対極である３つの電極から成るセルを使用する。一般的に、この方法は、電極表面の陽極及び陰極洗浄と共に検出作動を組み込む多段電位波形を使用する。典型的な電位波形においては、陽極検出は、第１の電位で行われ、電流サンプリングは、電位を印加する期間の終わりに行われる。電位は、次に、電極表面の酸化洗浄に向けて第２のより高い電位まで、かつ次に第１及び／又は第２の電位で形成された表面酸化物の陰極溶解による洗浄に向けて第１又は第２の電位よりも低い第３の電位までに段階的に変える。現在「パルスアンペロメトリック検出（ＰＡＤ）」として公知である電気測定検出を用いるこの方法の解析的応用は、アルコール、多価アルコール、及び炭水化物（還元及び非還元）、アミン及びアミノ酸（第１及び第２）、アミノ配糖体、及び多くの硫黄合成物（硫酸塩、スルホン酸、及びスルホンを除く）に対して明らかにされている。
【０００２】
「パルス電量検出（ＰＣＤ）」も説明されている。ＰＡＤとＰＣＤ間の重要な違いは、検出信号の測定と関係がある計器プロトコルにある。用語「パルス式電気化学検出」つまり「ＰＥＤ」は、ＰＡＤ及びＰＣＤを含む一般用語である。ＰＡＤでは、電極電流は、ある一定の期間（例えば、１６．７ｍｓ）（１／６０Ｈｚ-1で）にわたってサンプリングされるか又は平均化され、一方、ＰＣＤでは、応答が、１つの周期又は整数の連続した周期にわたって電子的に積分される。ＰＣＤは、本質的に、信号強度がより大きいために、かつ６０Ｈｚ相関ノイズ信号、すなわち、電子計器におけるノイズの支配的な形の積分が積分周期にわたってゼロのままであるために、より大きな信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を有する。
【０００３】
光度検出は、広範囲なπ結合のない脂肪族化合物に関する本質的に低い感度のために、かつ移動相の屈折率の変化を伴う基線変動のために悪影響を受ける。屈折率検出は、濃度勾配の影響を強く受け、かつ移動相組成の小さな変化に対してさえも観察される基線シフトは、検体信号を圧倒する可能性がある。
【０００４】
ＰＡＤ及びＰＣＤという方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と共に電気活性官能基を有する多くの脂肪族有機化合物の検出に向けて導入されたものである。多くのＰＡＤ／ＰＣＤ方法は、学術的及び企業の研究所の日々の仕事の一部となっている。このような方法の大部分は、作動電極の材料として金を利用する。白金作動電極の使用は、金電極の利用に遅れを取っている。多くの分析専門家は、既存の白金電極ベースの方法が金電極を使用する方法よりも使い難く、かつ再現性が低いことを見出している。
【０００５】
多くの検体は、異なる材料で製造した作動電極で検出可能である。様々な電極材料は、関連の検体を伴う試料マトリックスに応答して異なる性能を示している。例１：アルコールは、白金電極及び金電極で検出可能である。アルコールが高濃度の砂糖を有する試料内に存在する場合、白金電極は、金電極ほど過度のレベルの糖により影響を受けないので好ましい。例２：シアン化物アニオンは、銀電極又は白金電極で検出することができる。高濃度の硫化物を有する試料においては、銀電極は、影響を受けやすく、かつ高硫化物試料の非常に僅かな注入後にシアン化物に対する反応がなくなるのが観察されている。白金電極は、比較すると遙かに強固であり、高硫化物試料を何回も注入した後でさえもシアン化物に対する検出反応を供給し続ける。その結果、検体のリストの拡張に適し、かつ高Ｓ／Ｎで性能を発揮することができるより再現可能な電気化学白金ベースの方法を提供する必要性が存在する。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４、９３９、９２４号
【特許文献２】米国特許第４、０１３、４１３号
【特許文献３】米国特許第４、０２２、５７５号
【特許文献４】米国特許第４、１７７、６７７号
【特許文献５】米国特許第４、２２４、０３３号
【特許文献６】米国特許第４、２２７、９７３号
【特許文献７】米国特許第４、３１４、８２４号
【特許文献８】米国特許第４、３１５、７５４号
【特許文献９】米国特許第４、３５２、７８０号
【特許文献１０】米国特許第４、３９９、１０２号
【特許文献１１】米国特許第４、３９９、２２５号
【特許文献１２】米国特許第４、５０４、４４３号
【非特許文献１】Ｃ．Ｆ．Ｓｉｍｐｓｏｎ著「液体クロマトグラフィー技術」（１９８３年）
【非特許文献２】Ｊ．Ｈ．Ｋｎｏｘ著「高速液体クロマトグラフィー」（１９８１年）
【非特許文献３】Ｋ．Ｐｏｌｋａｒ他著「臨床分析における液体クロマトグラフィー」（１９８１年）
【非特許文献４】Ｓｋｅｇｇｓ、「Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ、Ｐａｔｈ．」、２８、３１１頁から３２２頁（１９５７年）
【発明の開示】
【０００７】
一実施形態においては、本発明は、（ａ）少なくとも１つの検体を含む液体試料流を流入セル内の作動電極を通過して流す段階と、（ｂ）（１）第１の調整及び検出電位、（２）第２の検出及び酸化洗浄電位、及び（３）第３の還元洗浄電位であり、かつ第２の電位が第１及び第３の電位よりも高く、第１の電位が第３の電位よりも高い少なくとも３つのパルス電位を作動電極に印加する段階と、（ｃ）第２の電位を印加する期間の少なくとも一部の間に作動電極からの出力を検出する段階とを含むパルス式電気化学検出方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、パルス式電気化学検出方法に関する。一実施形態においては、検出は、「パルス電量検出（ＰＣＤ）」として公知である電流積分により実行される。別の実施形態では、検出は、「パルスアンペロメトリック検出（ＰＡＤ）」として公知である電流測定法で実行される。本明細書での説明は、特記のない限り、電気化学検出としてこれらの２つの形態の検出を指す。発明の重要な態様は、例えば、ＰＣＤ又はＰＡＤによる検出のための作動電極から出力が、サイクルの最高電位を印加する期間中に検出されるということである。特定的な実施形態では、少なくとも３つの異なるパルス電位を作動電極に印加する。第１のパルスは、調整電位であり、第２のパルスは、検出及び酸化洗浄電位であり、第３のパルスは、還元洗浄電位である。好ましい実施形態では、第２の電位は、第１及び第３の電位より高く、第１の電位は、第３の電位より高い。作動電極からの出力は、第２の電位を印加する期間中に測定する。従って、電位を印加するパルス波形において最高電位中に出力信号を検出する。
【０００９】
一例として、図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃの調整電位は、波形と、本発明のために調整電位としてＥ1、検出及び酸化洗浄電位としてＥ2、及び還元洗浄電位としてＥ3とを含む米国特許第４、９３９、９２４号に例示されている。’９２４号特許で示されている方法と本発明の重要な違いは、例示する図において検出が最高電位つまりＥ2で行われることである。
【００１０】
Ｅ2である一定の積分期間を有する適切な段階的３電位波形を図２に示している。本発明の全ての電位は、基準電極Ａｇ／ＡｇＣｌ／３ＭＫＣｌに照らして記録している。
【００１１】
〔図２〕
【００１２】
第２の検出及び酸化洗浄電位よりも低く、第３の還元洗浄電位よりも高い第１の調整電位Ｅ1は、検出に向けて作動電極を調整又は活性化する役目をする。多くの場合、関連の検体は、電極調整中に電極表面に予吸着されている。一般的に、電極表面は、金属である。調整又は活性化は、電極の金属面上の水酸化物基の形成により又は金属酸化物の不完全な単層の生成により達成される。水酸化物基及び作成したばかりの少量の酸化物は、金属電極での有機化合物及び無機化合物の多くの酸化検出に必要とされる触媒状態の重要な要素である。
【００１３】
第２の又は検出及び酸化洗浄電位では、電極の表面は、一般的に、依然として触媒（基及び／又は酸化物）により覆われている。触媒は、予吸着検体の近くで酸素を利用可能にする本質的に不安定な酸素化合物である。関連の検体は、調整段階中又は検出段階中に予吸着されている。予吸着は、両方の段階にわたって広がることが多い。吸着検体が触媒部位に遭遇すると、酸化脱離が起こり、信号として検出される電子が生成される。電位Ｅ２時には、電極反応速度は、電位Ｅ１時よりも吸着速度から独立したものになる。吸着速度の独立性の増大により、検出の線形性がかなり改善される。検出信号を生成する酸化脱離と同時に、酸化物により電極表面が覆われる範囲が増大する。特に過度に長い期間がＥ２電位に選択された場合には、より安定した、より触媒的ではない酸化物が、優勢になる傾向がある。これとは対照的に、従来技術の検出（ＰＡＤ又はＰＣＤ）が電位Ｅ１時に行われ、酸化脱離の速度が、吸着速度により制御される遥かに大きな程度まで吸着速度により制御され、従って、較正プロットの線形性は、特に白金電極の場合は劣っている。
【００１４】
第３の洗浄還元電位Ｅ3では、作動電極表面は、調整期間中及び検出期間中に作成された全ての酸素種がない。酸化物の除去と同時に、過度の量の非触媒酸化物の下に捕捉される場合がある吸着検体及び／又はその酸化生成物の最終残留物も除去される。
【００１５】
本発明は、液体試料流内の検体を検出するのに用いることができる。液体試料流内の１つ又はそれよりも多くの検体を検出するフローインジェクション分析（ＦＩＡ）に適用可能である。それは、特に、クロマトグラフィーカラムのような分離媒体を通じて先に分離した液体試料流内の検体の検出に有用である。分離検体は、作動電極で検出される。
【００１６】
電位波形は、３つの電位パルスのうちの１つ又はそれよりも多くの間で一定である電位ステップ関数とすることができ、又は３つのパルスの相対電位レベルが上述のように見える限り、電位掃引関数のようなあらゆる他の形とすることができる。
【００１７】
最高電位時での検出により、ノイズレベルを最小にすることができると共に、線形較正の範囲を一部の異なる検体に向けて拡張することができる。更に、最高電位時での検出により、信号検出は、酸素還元の範囲から電極上で０．４７Ｖ辺りの過酸化水素に移動することになる。そのために、基線パルス発生及び酸素漬けを排除するか又は最小にすることができる。更に、検出中の性能に関係なく調整及び洗浄の低電位化を最適化することができる。従って、例えば、検出前に、波形電位のＥ１及びＥ３時に検体の予吸着又は表面予調整を最適化することができる。別の利点は、較正の線形性が多くの検体に対して改善するということである。更に、エーテル又はケトンのような一部の新しいカテゴリの検体を検出することができる。
【００１８】
白金電極の場合のＰＥＤ波形の電位及び時間の適切な範囲としては、以下が含まれる。
【００１９】
（表）
【００２０】
白金電極の場合のＰＥＤ波形の電位及び時間の好ましいに範囲としては、以下が含まれる。
【００２１】
（表）
【００２２】
検出期間は、ＰＥＤに対して第２の電位Ｅ２を印加する時間全体中に発生すると考えられる。しかし、Ｅ２を印加する期間の最終５％から９０％、より好ましくは、最終１０％から３０％のみにわたって検出することが好ましい。
【００２３】
少なくとも第１の調整電位、第２の検出及び酸化洗浄電位、及び第３の還元洗浄電位を含むパルス式電気化学検出に関して本発明を説明してきた。本発明は、本明細書で説明する上述の３つの電位の電位と検出の関係がある限り、これらの電位印加の前、後、又は間での更に別の電位の印加を含むシステムも包含する。
【００２４】
本発明のシステムは、特に、白金、イリジウム、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、及び鉛のような金属材料で形成した外面内の作動電極に有効である。好ましい作動材料電極は、白金である。
【００２５】
本発明の方法により特に上述の作動電極に関して上述の利点が得られる理由の１つの理論的な説明は、以下の通りである。比較的高い電位の選択により、酸素還元から過酸化水素までの電位範囲から信号生成が除去される。従って、溶離剤中の酸素濃度の突発的又は周期的変動から生じる「酸素漬け」又は基線パルス発生のようなアーチファクトが排除される。更に別の利点は、電位の最高時での信号生成酸化脱離をモニタすることによって得られる。信号生成電極反応は、もはや、低電位化と同程度に吸着速度により制御されない。従って、線形較正の範囲が拡張される。
【００２６】
本発明の電気化学検出方法は、特に、無機アニオン、アルコール、硫黄アミノ酸、チオエーテル、スルホキシド、フェノール、エーテル、アルデヒド、ケトン、アルケン、アルキン、ニトリル、アミノ酸、カルボン酸、及びその組合せのような検体に有効である。
【００２７】
米国特許第４、９３９、９２４号（’９２４号特許）に示すようなＰＣＤ及びＰＡＤの一般的な電位波形を図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃに示している。ＰＣＤ又はＰＡＤにおいては、Ｅ1の初期値は、電極表面が酸化物不足状態で存在するように選択する（不完全な酸化物単層の形成）。ｔdの遅延時間後、ｔsの期間にわたって、高速電位掃引（図１Ｂ）又は電位段階（図１Ｃ）により電位を値Ｅ1（又は、Ｅ1'、Ｅ1''、Ｅ1'''など＜Ｅ2を有するあらゆる数の電位）に前進させる。Ｅ1（又は、Ｅ1'、Ｅ1''、Ｅ1'''など）の値は、利用可能性及び／又は吸着検体の同時電気触媒酸化反応による表面の形成を引き起こすように選択する。次に、電位をＥ2に変えるか、又は保持期間ｔhにわたって初期値Ｅ1に戻し、保持期間ｔh中に、Ｅ1への電位変化中に成形された全ての酸化物は、電極表面から陰極剥離する。波形周期の総時間は、Ｅ1、Ｅ2、及びＥ3の印加時間の合計である。積分器（アナログ又はデジタルの）は、Ｅ1（又はＥ1'）印加期間中に起動させると印加期間を通して使用中のままである。積分器からの出力信号は、検出期間終了時にサンプリングされ、その値又は比例値は、記録装置に供給される。次に、それぞれ、陽極洗浄、陰極洗浄をもたらすＥ2及びＥ3のような正パルス及び負パルスを印加することができる。積分器は、Ｅ1印加終了時にリセットされる。値Ｅ1'は、可溶性及び吸着された検体の酸化反応の範囲を最大にするように選択する。しかし、最高電位は、０2発生と共に大きな陽極溶剤分解を引き起こすほど大きい正電位であるべきでない。
【００２８】
’９２４号特許の図１Ｂ及び図１Ｃ中のＰＣＤ波形に対しては、Ｅ1の値及び時間は、電極の完全な酸化洗浄を行うのに十分に大きなものとすることができるので、更に別の酸化洗浄のためのＥ2までのその後の段階は必要ではないと考えられる。
【００２９】
一般的に、本発明は、他の不可逆又は可逆過程と重畳したか又は一致する関連の検体と関係がある不可逆的電気化学過程の測定に適用可能である。表面酸化物の形成中の表面酸化物触媒反応の測定は、ＰＣＤ及び／又はＰＡＤ技術の１つの例である。
【００３０】
本明細書で説明するように、本発明の最高電位ＰＣＤ又はＰＡＤ法は、特に、液体クロマトグラフィー、特に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））により分離した液体試料中の複数の化学成分の検出に適用可能である。液体試料は、通常、現像試薬としての電解液を含み、かつクロマトグラフィーカラムを通過した溶離液と混合される。カラムの充填物としては、一般的にジェル又は粒状の形態のイオン交換体又は逆位相充填物があると考えられる。この技術は、十分に開発されている。例えば、Ｃ．Ｆ．Ｓｉｍｐｓｏｎ著「液体クロマトグラフィー技術」（１９８３年）、Ｊ．Ｈ．Ｋｎｏｘ著「高速液体クロマトグラフィー」（１９８１年）、及びＫ．Ｐｏｌｋａｒ他著「臨床分析における液体クロマトグラフィー」（１９８１年）を参照されたい。
【００３１】
更に、ＰＣＤ法は、フローインジェクション分析（ＦＩＡ）の検出方法として有用である。このようなシステムは、Ｓｋｅｇｇｓ、「Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ、Ｐａｔｈ．」、２８、３１１頁から３２２頁（１９５７年）において、及び米国特許第４、０１３、４１３号、米国特許第４、０２２、５７５号、米国特許第４、１７７、６７７号、米国特許第４、２２４、０３３号、米国特許第４、２２７、９７３号、米国特許第４、３１４、８２４号、米国特許第４、３１５、７５４号、米国特許第４、３５２、７８０号、米国特許第４、３９９、１０２号、米国特許第４、３９９、２２５号、及び米国特許第４、５０４、４４３号においてに説明されている。このようなシステムにおいては、これらの試料は、例えば、液体クロマトグラフィーで分離することによってではなく、連続液体搬送流で検出器に供給する。この技術は、上述の液体のクロマトグラフィーシステムと比較すると用途が限定される。
【００３２】
本発明のパルス式電気化学検出方法は、基準電極及び作動電極を含む２電極セル、及び基準電極、作動電極、及び対極を含む３電極セルの使用に適用される。
【００３３】
実験部分
化学物質
適切な溶液は、試薬のための化学物質（「Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ」、ニュージャージー州フェアローン）及び純水（「ＮＡＮＯｐｕｒｅ ＩＩ」、「Ｂａｒｎｉｓｔｅｄ Ｃｏ．」、マサチューセッツ州ボストン）から調製することができる。
【００３４】
計装
本発明の電気化学法の適切な計装は、’９２４号特許に示されている形式のものとすることができる。
【００３５】
注入する試料容積は、０．１から２００μｌとすることができ、かつ流量は、０．０００１から５．０００ｍｌ／ｍｉｎであった。電気化学流入セルは、Ｐｔ電極（約０．００７８ｃｍ2）を有する「薄層」デザイン（「Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ」、カリフォルニア州サニーベール）のものとすることができる。メーカー支給品であるＡｇ／ＡｇＣｌ電極を全ての実験で使用した。
【００３６】
手順
図１Ｂの波形におけるＥ1からＥ1'までの電位掃引を含む図１の全てのＰＥＤ波形を直接「Ｄｉｏｎｅｘ ＥＤ５０」検出器内でプログラムするか、又はＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウエアで作成して、クロマトグラフィープログラム実行中に検出器にダウンロードすることができる。
【００３７】
検出限界及び解析的較正
検出限界を推定する２つの主な方法がある。２つの方法の第１の方法においては、基線ノイズの平均値を指定の期間にわたって判断し、関連の検体の既知の量の注入の助けを借りて濃度単位で調整する。大部分の場合、濃度又は量単位で表す基線ノイズの３倍の倍数を検出限界として指定する。２つの方法の第２の方法においては、オペレータは、既知の濃度の１つの標準液の一連（ｎ＞３）の注入の濃度又は量単位で標準偏差を判断する。次に、検出限界を計算標準偏差の倍数として表す。増倍率は、選択信頼水準から導出して統計数表から取得することができる。解析的較正は、異なる濃度の一連の標準液の注入から生成される。濃度範囲は、未知の濃度の予想範囲を超えるように選択すべきである。標準液の既知の濃度に対する解析的応答から、濃度に対する解析的応答の依存を示す較正プロットが構成される。線形較正プロットは、非線形較正プロットよりも良好な精度及び正確性を示すことは公知である。
【００３８】
酸素の影響
Ｅ１での信号積分の従来の手法を用いると、注入試料及び移動相の酸素の不揃いの濃度により、「酸素漬け」と呼ばれている実質的なアーチファクトが発生することがある。酸素漬けは、作動電極の表面での過酸化水素への溶存酸素の還元のために検出信号により引き起こされる。大部分の場合、酸素濃度は、クロマトグラフィー移動相におけるよりも試料における方が高い。酸素濃度が高くなると、その結果、負電流の値が増大する。これは、負方向の基線レベルのかなり大きな変化としてクロマトグラムで明示される。クロマトグラフィー条件によっては、結果として生じる基線外乱は、数分以上にわたって拡大する可能性がある。クロマトグラフィーピークの開始及び終了の再現可能な検出は、関連の検体により引き起こされない低い基線ノイズ及び基線規定外変動の欠如に依存する。白金電極をクロマトグラフィー検出に使用した場合、酸素漬けは、もし存在すれば、多くの場合に重要な検体（例えば、メタノール及びエタノール）と共溶出し、それらの形状に歪みを発生させる。
【００３９】
波形の比較
ＰＣＤに対する波形、例えば、図１Ｃに対する図１Ａ又は図１Ｂの選択したものの最適化は、関連の検体の影響を受ける。検出が表面酸化物の形成により妨げられる検体、例えば、アルコールに対しては、図１Ｃに示す波形が適切と考えることはできないのは、Ｅ1からＥ2への電位の段階的変化が解析的応答の停止による酸化物の迅速かつ広範囲な形成をもたらすからである。表面酸化物、例えば、硫黄合成物の形成により引き起こされる機構により検出される吸着検体は、いずれの波形によっても十分に検出されると予想される。多くの他の検体に対して当て嵌まるように、ケトン及びエーテルも、表面酸化物の形成により引き起こされる過程により検出される。図３Ｂ及び図１２のクロマトグラムは、図２の波形を使用して取得したものである。
【００４０】
本発明を例示するために、その実施の以下の非限定的な実施例を提供する。
【実施例１】
【００４１】
実施例１：新しい方法は、従来技術の方法により検出されなかった化合物の部類を検出する。
【００４２】
図３Ａは、従来技術法（０．２５Ｖでの信号積分）によりアセトン及びブタノンを検出する試みの失敗例を示している。未知の不純物、おそらくアルコール（ピーク２）のみにより、検出応答が生成される。同一波形であるが、Ｅ２＝１．１５Ｖでの信号積分を用いて（図３Ｂ）、両方のケトンが容易に検出される。
【００４３】
〔図３Ａ、図３Ｂ〕
【実施例２】
【００４４】
実施例２：酸素漬けの排除
【００４５】
従来技術の方法を用いると、多くのクロマトグラムは、「酸素漬け」（負のピーク３、下部トレース）という特徴を示している。図４を参照すると、新しい方法（上部トレース）では、酸素還元から過酸化水素までの電位範囲から遥かに離れた電位での信号積分により酸素漬けが最小にされる。たとえホルムアルデヒドのピーク高さが新しい方法により低減（４６から１５ｎＣまで）されたとしても、基線ノイズの同時の降下（０．１２５から０．０３４ｎＣまで）により、新しい方法により０．８２から０．６６μＭに検出限界が改善した。
【００４６】
〔図４〕
【実施例３】
【００４７】
実施例３：新しい方法によるパルス発生の最小化
【００４８】
図５を参照すると、従来技術の手法及び新しい方法により、亜硫酸塩アニオン（４５対４１ｎＣ）に対して類似のサイズの反応が生じる。しかし、新しい方法は、ポンプピストンによる溶離液流への酸素挿入により引き起こされる規則的な基線パルス発生が最小にされる。基線ノイズの対応する低減（０．５から０．０３ｎＣまで）により、新しい方法で検出限界が著しく改善する（０．３４から０．０２ｐｐｍまで）。
【００４９】
〔図５〕
【実施例４】
【００５０】
実施例４：低ノイズ化による感度改善
【００５１】
従来技術の方法による７つの異なるアルコールの検出を図６の下部トレースで示す（積分：Ｅ１）。図６の上部トレースは、改良型方法で取得したクロマトグラムである（積分：Ｅ２）。ピーク高さは、実はこの特定の適用例においては、改良型方法に対しては、実際には幾分低めである。しかし、信号減少は、ノイズの改善（０．３５６７から０．０２８６ｎＣまで）により補正されるものよりも大きい。ノイズの３ｘの倍数として計算した検出限界は、４倍から６倍改善する（例えば、エタノールのＬＯＤ、４倍）。
【００５２】
〔図６〕
【実施例５】
【００５３】
実施例５：線形性の改善
【００５４】
図７のプロットは、従来技術の方法によるエタノールに対する較正曲線を示す（Ｅ１での信号積分（図１の波形を参照されたい））。
【００５５】
〔図７〕
【００５６】
図８のプロットでは、エタノールのデータは、波形の最高電位での信号積分により取得した（図２の波形のＥ２を参照されたい）。
【００５７】
〔図８〕
【００５８】
較正の線形性は、波形の最高電位での信号積分によって明確に改善される。
【００５９】
図９及び図１０のプロットは、１−プロパノールの線形性の改善を示している。
【００６０】
〔図９〕
【００６１】
〔図１０〕
【実施例６】
【００６２】
実施例６：二重結合を有する化合物の検出
【００６３】
図１１は、飽和及び不飽和有機酸の検出を示している。
【００６４】
プロピオン酸は、アクリル酸と同数の炭素原子及びカルボキシルを有する。アクリル酸は、二重結合を有する点のみが異なる。２つのトレースのうちで低い方において検出信号が高いことは、白金電極でのアクリル酸の二重結合の酸化により説明可能である。
【００６５】
〔図１１〕
【実施例７】
【００６６】
実施例７：三重結合を有する化合物の検出
【００６７】
図１２は、有機化合物における三重結合の検出を示している。
【００６８】
ブタノン及び３−ブチン−２−オンは、同数の炭素原子及び同じケトン基を有する。３−ブチン−２−オンは、付加的な三重結合のみが異なる。２つのトレースのうちで低い方において検出信号が高いことは、白金電極での３−ブチン−２−オンの三重結合の酸化により説明可能である。
【００６９】
〔図１２〕
【００７０】
表１は、白金電極で現在検出可能である全ての化合物及び化合物部類のリストを示す。２つの新しい化合物部類が、電気化学検出でアクセス可能となった（エーテル及びケトン）。検出の感度は、表中に説明した全ての化合物に対して改善された。
【００７１】
（表１）
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】本発明に有用な３つ（Ａ、Ｂ、Ｃ）の代表的な電位波形の１つを示す図である。
【図１Ｂ】本発明に有用な３つ（Ａ、Ｂ、Ｃ）の代表的な電位波形の１つを示す図である。
【図１Ｃ】本発明に有用な３つ（Ａ、Ｂ、Ｃ）の代表的な電位波形の１つを示す図である。
【符号の説明】
【００７３】
Ｅ1 調整電位
Ｅ2 検出及び酸化洗浄電位
Ｅ3 還元洗浄電位
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの検体を含む液体試料流を流入セル内の作動電極を通過して流す段階、
（ｂ）（１）第１の調整電位、（２）第２の検出及び酸化洗浄電位、及び（３）第３の還元洗浄電位であり、かつ該第２の電位が該第１及び第３の電位よりも高く、該第１の電位が該第３の電位よりも高い少なくとも３つのパルス電位を前記作動電極に印加する段階、及び
（ｃ）前記第２の電位を印加する期間の少なくとも一部の間に前記作動電極からの出力を検出する段階、
を含むことを特徴とするパルス式電気化学検出方法。
【請求項２】
前記作動電極は、白金、イリジウム、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、及び鉛から成る群から選択された材料で形成された外面を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記作動材料外面は、白金であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記出力は、前記第１又は第３の電位を印加する期間中には検出されないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記流入セルは、基準電極及び作動電極を含む２電極セルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記流入セルは、３電極セルであリ、該３つの電極の１つは、基準電極であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記液体試料流は、少なくとも１つの検体を含み、
分離媒体を通して前記液体試料流を流し、前記検体を分離して該液体試料内に分離検体を形成する段階と、該分離検体を検出する段階とを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記分離は、液体クロマトグラフィーによって実行されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検体は、無機アニオン、アルコール、硫黄アミノ酸、チオエーテル、スルホキシド、フェノール、エーテル、アルデヒド、ケトン、アルケン、アルキン、ニトリル、アミノ酸、及びカルボン酸から成る群から選択された１つ又はそれよりも多くの化合物を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出する段階は、電流積分によって実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出する段階は、電流測定的に実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記作動電極の前記外面は、前記第２の電位の印加中は表面酸化物を含み、前記第３の電位の印加中は酸化物のない状態にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の電位は、少なくとも部分的に電位掃引関数で印加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の電位は、少なくとも部分的に電位ステップ関数で印加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの検体を含む液体試料流を流入セル内の作動電極を通過して流す段階、
（ｂ）（１）第１の調整電位、（２）第２の検出及び酸化洗浄電位、及び（３）第３の還元洗浄電位であり、かつ該第２の電位が該第１及び第３の電位よりも高く、該第１の電位が該第３の電位よりも高い少なくとも３つのパルス電位を前記作動電極に印加する段階、及び
（ｃ）前記第２の電位を印加する期間の少なくとも一部の間に前記作動電極からの出力を検出する段階、
を含むことを特徴とするパルス式電気化学検出方法。
【請求項２】
前記作動電極は、白金、イリジウム、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、及び鉛から成る群から選択された材料で形成された外面を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記作動材料外面は、白金であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記出力は、前記第１又は第３の電位を印加する期間中には検出されないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記流入セルは、基準電極及び作動電極を含む２電極セルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記流入セルは、３電極セルであリ、該３つの電極の１つは、基準電極であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記液体試料流は、少なくとも１つの検体を含み、
分離媒体を通して前記液体試料流を流し、前記検体を分離して該液体試料内に分離検体を形成する段階と、該分離検体を検出する段階とを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記分離は、液体クロマトグラフィーによって実行されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検体は、無機アニオン、アルコール、硫黄アミノ酸、チオエーテル、スルホキシド、フェノール、エーテル、アルデヒド、ケトン、アルケン、アルキン、ニトリル、アミノ酸、及びカルボン酸から成る群から選択された１つ又はそれよりも多くの化合物を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出する段階は、電流積分によって実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出する段階は、電流測定的に実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記作動電極の前記外面は、前記第２の電位の印加中は表面酸化物を含み、前記第３の電位の印加中は酸化物のない状態にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の電位は、少なくとも部分的に電位掃引関数で印加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の電位は、少なくとも部分的に電位ステップ関数で印加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【公表番号】特表２００９−５３３６９０（Ｐ２００９−５３３６９０Ａ）
【公表日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０５６０８（Ｐ２００９−５０５６０８）
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６６４６５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２１２６７
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５９１０２５３５８）ダイオネックス コーポレイション (38)
【公表日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６６４６５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２１２６７
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５９１０２５３５８）ダイオネックス コーポレイション (38)
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