パルボウイルスＢ１９の検出のための新規なプライマーおよびプローブ
【課題】生物学的試料においてパルボウイルスB19を検出することができる更なるプライマーおよびプローブを提供すること。
【解決手段】（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、（b）特定の核酸配列からなる第1のプライマー、および特定の核酸配列からなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、（c）標的核酸を増幅する工程、ならびに（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法。
【解決手段】（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、（b）特定の核酸配列からなる第1のプライマー、および特定の核酸配列からなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、（c）標的核酸を増幅する工程、ならびに（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、パルボウイルスB19の検出のための新規なプライマーおよびプローブならびにそれらを含むキットに関する。さらに、本発明は、これら新規なプライマーおよびプローブを使用できる方法、特に、均質ポリメラーゼ連鎖反応（homogeneous polymerase chain reaction）法に関する。さらに、本発明は、これら新規なプライマーおよびプローブの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
パルボウイルスB19感染症は、免疫が正常な個体では通常軽微な経過をたどるありふれた小児期の疾病であり、伝染性紅斑または第5病として知られる特徴的な発疹を生じる（非特許文献１）。感染は、慢性の溶血性疾患患者では、重度の関節痛と一過性の骨髄無形成クリーゼ(crisis)を伴う可能性がある（非特許文献２)。先天性貧血および脈管炎も記載されている（非特許文献３)。最近になって、このウイルスは、肝炎および心筋炎と関係している（非特許文献４;非特許文献５;非特許文献６)。母体が妊娠中に感染すると、このウイルスは、胎児に伝染して、水症、自然流産、または子宮内死を引き起こす（非特許文献７）。呼吸経路による伝染以外にも、汚染された血液および血液製剤を介してパルボウイルス19による感染が起こることもある（非特許文献８）。後者は、米国食品医薬品局によって認識されており、その結果、パルボウイルス19の核酸試験（NAT）は、ドナーのスクリーニングではなく、製造工程内試験（in-process testing）とされるべきだという提言となった。
【０００３】
分子診断の分野において、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による標的核酸の検出は、重要な役割を果たしている。ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、またはC型肝炎ウイルス（HCV）の存在を調べる日常業務としての血液バンクのスクリーニングは、PCRによる診断法を大規模に応用した一例である。PCRによる解析のための自動化装置は、しばしば、PCR処理過程における産物増幅のリアルタイム検出法を利用する。このような方法の鍵となるのは、レポーター基または標識を担持する修飾オリゴヌクレオチドを使用することである。一方、PCR処理によって生じたDNA増幅産物の検出は、別々の操作工程で行うことができる。これらは、電気泳動移動度について増幅断片の特徴を調べること、および/または固相支持体に付着した変性増幅産物を、ハイブリダイゼーション用プローブを用いて解析することを含みうる。
【０００４】
他方、DNA増幅産物の検出は、いわゆる「均質」アッセイ法で行うことができる。「均質」アッセイ系は、標的配列が増幅されている間にシグナルを発生させるレポーター分子または標識を含む。「均質」アッセイ系の一例は、特許文献１、特許文献２、および特許文献３において詳しく説明されているTaqMan（登録商標）系である。簡単に述べると、この方法は、2重標識されたプローブ、およびTaq DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性に基づくものである。プローブは、PCRによって増幅される標的配列に相補的であり、各重合サイクル工程では2つのプライマーの間に位置する。このプローブには、2つの蛍光標識が付着している。1つは、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）などのレポーター色素であるが、これは、もう1つの蛍光色素である6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン（TAMRA）に空間的に近接していることによるエネルギー転移によって消光される消光スペクトルを有する。各増幅サイクル過程において、プライムDNA鎖を伸長させる処理中、Taq DNAポリメラーゼは、アニールしたプローブを置換して分解するが、この後者の作用は、ポリメラーゼの天然の5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によるものである。この仕組みによって、TAMRAの消光活性からレポーター色素が切り離される。結果として、プローブの切断が増加するにつれて蛍光活性が上昇するが、それは、形成されたPCR産物の量に比例する。こうして、遊離した蛍光標識の強度を検出すると、増幅された標的配列が測定される。「均質」アッセイ系の別の例が、登録商標LightCycler装置で使用される方式（例えば特許文献４参照）によって提供されるが、それらの中には、時に、「キシング・プローブ（kissing probe）」方式と呼ばれるものもある。この場合も、原則は、供与体となる色素の発光波長が、蛍光共鳴エネルギー転移によって、受容体となる色素を励起するという特徴をもつ2つの相互作用色素に基づいている。ビオチン化配列特異的捕捉用プローブを、ストレプトアビジンで被覆した磁気粒子とともに使用して標的配列を単離することにより、自動化を拡大するために、登録商標COBAS AmpliPrep装置（ロシュ・ダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics GmbH）、ドイツ国D-68305マンハイム（D-68305 Mannheim, Germany））が最近になって導入された（非特許文献９;非特許文献１０）。最近、さらに別の用途の広いツールである、全核酸分離用（Total Nucleic Acid Isolation（TNAI））キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）が加わった。この研究用試薬は、非特許文献１１によって開発された方法に本質的には基づいたCOBAS（登録商標）AmpliPrep装置において血漿および血清から、配列特異的にではなく包括的に総核酸を単離できるようにする。
【０００５】
パルボウイルスB19のためのアッセイ系は、特許文献５（1995年）または非特許文献１２に開示されている。VP1またはVP2領域からパルボウイルスB19を検出するためのプライマーは、特許文献６に開示されている。VP1およびVP2のクローニングについては特許文献７に開示されている。パルボウイルスRA-1に対するプローブは、特許文献８に、パルボウイルスB19に対するプローブは、特許文献９に開示されている。NS1遺伝子、およびそれに対するプローブは、特許文献１０に記載されている。パルボウイルスB19のPCRによる検出については、特許文献１１に記載されている。特異的なエリスロウイルスの核酸配列が、特許文献１２に記載されている。特許文献１３には、パルボウイルスB19の診断アッセイ法についての記載がある。特許文献１４には、パルボウイルスのホスホリパーゼA2についての記載がある。パルボウイルスB19の大量測定法は、特許文献１５に記載されている。パルボウイルスB19の検査法が、特許文献１６に記載されている。DNA制御構築物が特許文献１７に記載されている。パルボウイルス様粒子が、特許文献１８に記載されている。特許文献１９には、パルボウイルスB19のPCR増幅法が記載されている。パルボウイルスB19感染症を治療する方法が特許文献２０に記載されている。自律的なパルボウイルスB19遺伝子送達媒体が特許文献２１、およびその対応米国特許および特許文献２２に記載されている。
【０００６】
パルボウイルスB19の配列は、非特許文献１３に記載されており、ゲノムの解析については、非特許文献１４および非特許文献１５に記載されている。パルボウイルスB19の検出法は、非特許文献１６,非特許文献１７,非特許文献１８,非特許文献１９および非特許文献２０、ならびに非特許文献２１に記載されている。VP1領域は、非特許文献２２および非特許文献２３によって解析されている。NS1領域は、非特許文献２４によって解析されている。さまざまなパルボウイルスB19単離株間における配列の変異性については、非特許文献２５,非特許文献２６,非特許文献２７および非特許文献２８、ならびに非特許文献２９に記載されている。
【０００７】
特許文献１２には、エリスロウイルスV19およびB19を検出するのに適した特定のプライマーおよびプローブが記載されている。特許文献２３は、TTウイルスを検出するのに役立つ核酸オリゴマーのプライマーまたはプローブを開示している。Schmidtら（非特許文献３０）は、血漿プールおよび血漿製剤中のパルボウイルスB19の検出について開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,210,015号
【特許文献２】米国特許第5,804,375号
【特許文献３】米国特許第5,487,972号
【特許文献４】米国特許第6,174,670号
【特許文献５】日本特許公開公報第147986号
【特許文献６】米国特許第6,274,307号
【特許文献７】JP特許登録第04088985号
【特許文献８】欧州特許第238 893号
【特許文献９】国際公開公報WO 01/06019号
【特許文献１０】欧州特許第783 580号
【特許文献１１】ロシア連邦特許第2146372号
【特許文献１２】国際公開公報WO 99/28439号
【特許文献１３】国際公開公報WO 03/002753号
【特許文献１４】国際公開公報WO 02/00924号
【特許文献１５】米国特許第6,183,999号
【特許文献１６】国際公開公報WO 01/14593号
【特許文献１７】国際公開公報WO 02/096925号
【特許文献１８】国際公開公報WO 91/04330号
【特許文献１９】JP特許登録第11221099号
【特許文献２０】米国特許第6,268,349号
【特許文献２１】米国特許第5,585,254号
【特許文献２２】国際公開公報WO 00/24917号
【特許文献２３】米国特許第6,395,472号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Anderson M. J.ら, Lancet 1 (1983) 1378
【非特許文献２】J. R.ら, Lancet 1 (1981) 664-665
【非特許文献３】Cohen B., BMJ 311 (1995) 1549-1552
【非特許文献４】Yoto Y.ら, Lancet 347 (1996) 868-9
【非特許文献５】Enders G.ら, Clin Infect Dis 26 (1998) 355-358
【非特許文献６】Dux S.ら, Dtsch Med Wochenschr 127 (2002)1584-1588
【非特許文献７】Enders E：胎児または新生児の風疹以外の感染症（Infections of the fetus and the neonate other than rubella）. Topley & Wilson微生物学および微生物感染症（Microbiology and Microbial Infections）Collier L.編 London, Edward Arnold, 1998, pp. 873-915
【非特許文献８】Brown K. E., Baillieres Best Pract Res Clin Haematol 13 (2000) 245-259
【非特許文献９】Jungkind D., J Clin Virol 20 (2001) 1-6
【非特許文献１０】Stelzl E.ら, J Clin Microbiol 40 (2002) 1447-1450
【非特許文献１１】Boom R.ら, J Clin Microbiol 28（1990）495-503
【非特許文献１２】Schorling, S.ら, J. Mol. Diagn. 6 (2004), 37- 41
【非特許文献１３】Shade, R.Oら, J Virol 58 (1986) 921-936
【非特許文献１４】Cotmore S. F.ら, J. Virol. 60(1986) 548-557
【非特許文献１５】Ozawa K.ら, J. Virol. 62 (1988) 2508-2511
【非特許文献１６】Sato K.ら, J Clin Microbiol 38 (2000) 1241-1243
【非特許文献１７】Cubie H. A.ら, Mol Cell Probes 9 (1995), 59-66
【非特許文献１８】Jordan J. A.ら, Mol. Diagn. 1 (1996), 321-328
【非特許文献１９】Vassias I.ら, J. Virol. Meth. 44 (1993) 329-338
【非特許文献２０】Carriere C.ら, J Virol Methods 44 (1993), 221-234
【非特許文献２１】Holloway B.ら, Nucleic Acids Res 21 (1993), 3905-3906
【非特許文献２２】Dorsch S.ら, J. Gen. Virol. (2001) 82, 191-199
【非特許文献２３】Takahashi N.ら, FEBS Lett. 450 (1999) 289-293
【非特許文献２４】HicksK. E.ら, Arch Virol. 141 (1996), 1319-1327
【非特許文献２５】Hemauer A.ら, J. Gen. Virol. (1996) 77, 1781-1785
【非特許文献２６】Umene K. および Nunoue T., J. Gen. Virol. 76 (1995) 2645-2651
【非特許文献２７】Erdman D. D.ら, J Gen Virol 77 (1996), 2767-2774
【非特許文献２８】Astellら, J. Gen. Virol. 68 (1987) 885-893
【非特許文献２９】Turton J.ら,Epidemiol Infect 105 (1990) 197-201
【非特許文献３０】Vox Sanguinis (2001) 81, 228-235
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の概要）
パルボウイルスB19は臨床上重要であるため、生物学的試料においてこのウイルスを検出することができる更なるプライマーおよびプローブに対する需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そのため、本発明は、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第1のプライマー、および、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブに接触させる工程、
（e）核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸が存在することを示す指標として検出する工程
を含む方法において、
第1のプライマーが、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、および/または
プローブが、配列番号：5の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること
を特徴とする方法を提供する。
【００１３】
本発明は、さらに、その核酸配列が、配列番号：12〜15の核酸配列、核酸配列10もしく11またはその相補配列、または核酸配列16もしくは17の相補配列から選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明の別の態様において、第1のプライマーの核酸配列が、核酸配列番号：12〜15から選択され、第2のプライマーの核酸配列が、配列番号：16または17の核酸配列の相補配列から選択される第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーが提供される。
【００１５】
本発明に係るオリゴヌクレオチドまたは1対のプライマーを、相補的な核酸とのハイブリダイゼーション反応に使用することができる。本発明の別の態様において、本発明に係るオリゴヌクレオチドまたは1対のプライマーは、プライマー、プローブ、または捕捉用プローブとして使用することができる。
【００１６】
本発明は、さらに、鋳型依存的DNAポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび本発明に係るオリゴヌクレオチドまたは1対のプライマーを含むキットを提供する。
【００１７】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：１４の核酸配列からなる第1のプライマー、および配列番号：１６の核酸配列からなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、ならびに
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法、
〔２〕(c1)プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブと接触させる工程
を工程(c)と工程(d)の間にさらに含み、
ここで、工程(d)が、標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸の存在の指標として検出する工程を含む、〔１〕記載の方法、
〔３〕プローブが、配列番号：５の核酸配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなる、〔２〕記載の方法、
〔４〕プローブが標識を担持する、〔２〕または〔３〕記載の方法、
〔５〕工程d）において、標識を担持するさらなるプローブを試料と接触させ、その結果、工程d）において第1および第2のプローブからなる1対のプローブが試料と接触する、〔４〕記載の方法、
〔６〕前記増幅工程c）が、試料を前記1対のプライマーに接触させ、標的核酸が試料中に存在する場合に増幅産物をもたらす工程を含み、前記工程d）が、該試料を1対のプローブと接触させる工程であって、該1対のプローブの構成プローブが前記増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されている工程を含み、そして、工程d）において、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出することによって、標的核酸と1対のプローブとの結合産物を検出する、ここで、蛍光共鳴エネルギー転移が存在することが、試料中に標的核酸が存在することの指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移が存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことの指標である、〔５〕記載の方法、
〔７〕該プローブが第1および第2の標識を担持する、〔２〕または〔３〕記載の方法、
〔８〕工程c）における標的核酸が鋳型依存性DNAポリメラーゼにより増幅される、〔２〕〜〔７〕いずれか記載の方法、
〔９〕工程（d）における標的核酸とプローブとの結合産物が、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエクソヌクレアーゼ加水分解により標的核酸にハイブリダイズしたプローブから遊離する第1または第2の蛍光標識の量によって検出される、〔７〕または〔８〕記載の方法、
〔１０〕該プローブが、配列番号：10の核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなる、〔２〕〜〔９〕いずれか記載の方法、
〔１１〕該プローブが配列番号：11の核酸配列またはその相補配列を有する、〔２〕〜〔１０〕いずれか記載の方法、
〔１２〕該プライマーおよび／または該プローブが、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む、〔２〕〜〔１１〕いずれか記載の方法、
〔１３〕他の標的核酸が同じ反応において検出される、〔２〕〜〔１２〕いずれか記載の方法、
〔１４〕他の標的核酸が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、西ナイルウイルスまたはヒト免疫不全ウイルス由来の核酸を含む、〔１３〕記載の方法、
〔１５〕第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーであって、第1のプライマーの核酸配列が配列番号：14であり、第2のプライマーの核酸配列が配列番号：16である、1対のプライマー、
〔１６〕相補的な核酸とのハイブリダイゼーション反応における〔１５〕記載の1対のプライマーの使用、
〔１７〕鋳型依存性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、および〔１５〕記載の1対のプライマーを含むキット
に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、生物学的試料においてパルボウイルスB19を検出することができる更なるプライマーおよびプローブが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、STS12/16のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図２】図２は、STS13/16のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図３】図３は、STS14/16のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図４】図４は、標準的なアガロースゲル電気泳動（E-Gel system, Invitrogene, Carlsbad, CA, USA）による、実施例1の実験から得られた増幅産物の解析。（レーン1： 100bpのラダーDNA；2： STS12/16：水対照；3：STS12/16：1000 IU/mLの試料；4:STS12/16： 1000 IU/mLの試料；5：STS13/16：1000 IU/mLの試料；6：STS13/16：1000 IU/mLの試料；7：STS14/16：1000 IU/mLの試料；8：STS14/16：1000 IU/mLの試料；9：空；10：100bpのラダーDNA）
【図５】図５は、STS17/18のプライマー組合せと比較した、STS14/16のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図６】図６は、標準的なアガロースゲル電気泳動（E-Gel system, Invitrogene, Carlsbad, CA, USA）による、実施例2の実験から得られた増幅産物の解析である（レーン1： 100bpのラダーDNA；2：50 IU/mLの試料：PCR陽性；3：25 IU/mLの試料：PCR陽性；4：25 IU/mLの試料：PCR陰性；5：10 IU/mLの試料：PCR陰性；6：10 IU/mLの試料：PCR陰性；7：10 IU/mLの試料：PCR陰性；8：10 IU/mLの試料：PCR陽性；9：陰性対照；PCR陰性；10: 陰性対照：PCR陰性；11：STS17/18：水対照：PCR陰性；12：100bpのラダーDNA）。
【図７】図７は、STS17/18のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1E+04 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図８】図８は、パルボウイルスB19のゲノム中の標的領域の概要図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
当技術分野の技量の範囲内である分子生物学および核酸化学の慣用の技術は文献に記載されている。例えば、Sambrook J.ら、 分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989；Gait, M. J.編, 1984; 核酸のハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）、Hames, B. D.および Higgins,S. J.編, 1984；およびシリーズ本、酵素学の方法（Methods in Enzymology）、Academic Press, Inc.を参照のこと。これら文献は、参照して本明細書に組み込まれる。上記および下記した特許、特許出願、および刊行物はすべて、参照して本明細書に組み込まれる。
【００２１】
核酸を、上記アッセイ法のいずれか1つにおいて解析する前に、さまざまな成分からなる複雑な混合物を含む生物学的試料から単離または精製する必要がある。しばしば、最初の工程として、核酸を濃縮できる方法が用いられる。細胞の内容物またはウイルス粒子を放出させるために、酵素または化学薬品で処理して、細胞壁またはウイルス粒子を溶解、分解、または変性させることができる。この方法は、一般的にリーシスと呼ばれる。その結果得られる、溶解された物質を含む溶液をライセートという。リーシスの過程でしばしば生じる問題は、目的とする成分を分解する別の酵素、例えば、核酸を分解するデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼが、リーシスの間に目的とする成分と接触する状態になることである。これらの分解酵素は、細胞の外側にも存在することもあり、または、リーシスの前には別の細胞区画の中に空間的に隔離されていたが、今や目的とする成分と接触した状態になっているという場合もある。この処理過程で放出される他の成分は、例えば、細胞にとって毒性があるため、ヒトまたは動物を治療する際に使用しようとする製品にとって問題となりうるリポ多糖類のファミリーに属するエンドトキシンなどであろう。
【００２２】
上記したこの問題に取り組むためにさまざまな手段がある。例えば、核酸を遊離させようとする場合には、グアニジウム・チオシアネート、または陰イオン性、陽イオン性、両性、もしくは非イオン性の界面活性剤などのカオトロピック剤が一般的には使用される。また、これらの酵素または不要なタンパク質を速やかに分解するプロテアーゼを使用することも有益である。しかし、これは、上記物質または酵素が、その後の工程で試薬や成分を妨害する可能性があるため、別の問題を生じる可能性もある。
【００２３】
上記したようなリーシスまたは試料調製プロセスに都合よく用いることのできる酵素は、タンパク質基質中のアミド結合を切断し、プロテアーゼまたは（互換的に）ペプチダーゼとして分類される酵素である（Walsh, 1979, 酵素反応のメカニズム（Enzymatic Reaction Mechanisms）、W. H. Freeman and Company, San Francisco、第3章参照）。先行技術において使用されてきたプロテアーゼは、例えば、アルカリ・プロテアーゼ（国際公開公報WO 98/04730号）または酸性プロテアーゼ（米国特許第5,386,024号）などである。先行技術において、核酸を単離するための試料調製を行うために広く使用されているプロテアーゼは、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）由来のプロテイナーゼK（例えば、Sambrook J.ら、分子クローニング：実験マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989参照）であるが、これは、中性pH付近で活性があり、ズブチリシンとして当業者に知られているプロテアーゼファミリーに属している。
【００２４】
リーシス工程に続く試料調製の次の工程において、目的とする成分をさらに濃縮する。目的とする非タンパク質成分が、例えば核酸である場合、通常、それらをプローブを用いたアッセイに使用する前に、複雑なリーシス混合物から抽出する。
【００２５】
核酸を抽出する方法は、いくつかある。
−配列依存的または生体特異的方法、例えば、
・アフィニティークロマトグラフィー
・固定化プローブに対するハイブリダイゼーション
−配列非依存的または物理化学的方法、例えば、
・例えばフェノール-クロロフォルムなどによる液体-液体抽出法
・例えば純粋エタノールによる沈殿
・濾紙による抽出
・セチルトリメチルアンモニウムブロミドであるミセル形成剤による抽出
・例えばアクリジン誘導体などの固定化したインターカレーター色素への結合
・シリカゲルまたは珪藻土（diatomic earths）への吸着
・カオトロピックな条件下における磁性ガラス粒子（MGP）または有機シラン粒子への吸着
【００２６】
抽出目的にとって特に興味深いのは、他の表面へも可能であるが、ガラス表面への核酸の吸着である。近年、核酸がガラス表面に結合する挙動を利用することによって、核酸を天然の環境から単離する多くの処理手順が提案されている。固定された核酸が標的である場合には、シリカ表面を有する物質に核酸を直接結合させるのが好ましい。なぜなら、他にも理由はあるが、核酸を修飾する必要がなく、天然型の核酸を結合させることもできるからである。これらの処理法は、さまざまな文書に詳細に説明されている。例えば、Vogelstein B.ら , Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-9では、アガロースゲルから取り出した核酸を、ヨウ化ナトリウム存在下で粉末化したフリントガラスに結合させる処理法が提案されている。バクテリアからのプラスミドDNAを、過塩素酸ナトリウム存在下においてガラス粉末上で精製することが、Marko M. A.ら, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387に記載されている。DE-A 37 34 442には、酢酸を用いてファージ粒子を沈殿させ、また、過塩素酸によってファージ粒子を溶解させて、1本鎖のM13ファージDNAをガラス繊維フィルター上で単離することが記載されている。ガラス繊維フィルターに結合した核酸を洗浄し、その後、メタノールを含むトリス／EDTAバッファーで溶出する。同様の処理法が、ラムダファージからDNAを精製するためにJakobi R.ら, Anal. Biochem. 175(1988) 196-201に記載されている。この処理法は、カオトロピック塩溶液においてガラス表面に核酸を選択的に結合させること、および、アガロース、タンパク質または細胞残渣などの混入物から核酸を分離することを伴う。混入物からガラス粒子を分離するために、粒子を遠心分離するか、液体をガラス繊維フィルターで濾し取ることができる。しかし、このことが、この処理法を大量の試料に利用することを妨げている制限工程である。塩およびエタノールを添加して沈殿させた後に磁性粒子を用いて核酸を固定する方がより有益であり、例えば、Alderton R. P.ら, S., Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169およびPCT GB 91/00212号に記載されている。この処理法では、核酸を磁性粒子とともに凝集させる。この凝集物を、磁場を適用して元の溶媒から分離して、洗浄工程を行う。1回の洗浄工程の後、核酸をトリスバッファーに溶解する。しかしながら、この処理法は、沈殿が核酸に対し選択的でないという点で不都合がある。それどころか、さまざまな固体および溶解された物質も同様に凝集する。その結果、この処理法は、存在するかもしれない特異的酵素反応のインヒビターを有意な量除去するために利用することはできない。磁性粒子を多孔性の特定のガラス基質中に含み、ストレプトアビジンを含む層に覆われている、磁性のある多孔性ガラスも市販されている。この製品を用いて、例えばタンパク質や核酸などの生体物質が、複雑な調製工程でビオチンに共有結合するよう修飾されていれば、それらを単離することができる。磁化できる具体的な吸着剤は、自動的な試料調製にとって非常に効率がよく適したものであることが証明された。フェリ磁性色素および強磁性色素、ならびに超常磁性色素が、この目的で使用される。最も好ましいMGP、および、磁性ガラス粒子を用いる方法は、国際公開公報WO 01/37291号に記載されており、参照して本明細書に組み込まれる。
【００２７】
標的核酸を含む核酸を天然の環境から精製または単離した後、標的核酸を検出することができる。したがって、本発明の1つの態様において、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、以下の工程
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第1のプライマー、および、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、本方法は、標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程を含まない。したがって、本発明の1つの態様において、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、以下の工程
（a）標的核酸を含んでいると推測される試料において、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第1のプライマー、および、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第2のプライマーを含む1対のプライマーの存在下、標的核酸を増幅する工程、
（b）工程（a）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む方法を提供する。
【００２９】
好ましくは、第1のプライマーは、配列番号：6または7の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーは、配列番号：8または9の核酸配列から選択された核酸配列の相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる。好ましくは、プライマーは、該核酸配列またはその相補配列の15個または18個の連続したヌクレオチドからなる。より好ましくは、第1のプライマーが、配列番号：12〜15の核酸配列からなるグループから選択された核酸配列を有し、第2のプライマーは、配列番号：16から17の核酸配列からなるグループの相補配列から選択された核酸配列を有する。これらのプライマーは、配列番号：1に記載されたアンプリコンを増幅するよう選ばれることが好ましい。
【００３０】
当技術分野において知られているように、「ヌクレオシド」は、塩基−糖を組み合わせたものである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は複素環塩基である。このような複素環塩基のもっとも一般的な２つの種類がプリンとピリミジンである。
【００３１】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む「ヌクレオシド」である。ペントフラノシル糖を含む「ヌクレオシド」では、リン酸基は、糖の2'、3'、または5'位のヒドロキシル部分に結合することができる。「ヌクレオチド」は、本明細書では、より一般的に「オリゴマー化合物」と称される「オリゴヌクレオチド」、または、より一般的に「ポリマー化合物」と称される「ポリヌクレオチド」の「モノマー単位」である。それの別の一般的表現は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）である。
【００３２】
本発明によれば、「オリゴマー化合物」は、「ヌクレオチド」のみ、または「非天然型化合物」（下記参照）でもよい「モノマー単位」からなる化合物であり、より具体的には、「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチドアナログ」）または「非天然型化合物」の単独物または混合物である。「オリゴヌクレオチド」および「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、本発明との関連では、「オリゴマー化合物」のサブグループである。
【００３３】
本発明との関連において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、「モノマー単位」としての複数の「ヌクレオチド」から形成される「ポリヌクレオチド」を意味する。すなわち、「オリゴヌクレオチド」は、「モノマー単位」を有するデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）の「オリゴマー化合物」または「ポリマー化合物」のサブグループに属する。リン酸基は、一般的に、「オリゴヌクレオチド」のヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。RNAおよびDNAの正常な結合または骨格は、3'から5'へのホスホジエステル結合である。
【００３４】
「オリゴヌクレオチド」および「修飾オリゴヌクレオチド」（下記参照）は、本発明によれば、主に当技術分野において記載され、当業者に知られているとおりに合成することができる。特異的配列のオリゴマー化合物を調製する方法は、当技術分野において既知であり、例えば、適当な配列をクローニングおよび制限酵素切断することや直接化学合成法などがある。化学合成法には、例えば、Narang S. A.ら Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98に記載されたホスホトリエステル法、Brown E. L.,ら, Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151に開示されているホスホジエステル法、Beaucageら, Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859に開示されているホスホルアミダイト法、Gareggら, Chem. Scr. 25 (1985) 280-282に開示されているH-ホスホン酸法、および米国特許第4,458,066号に開示されている固形支持体法などがある。
【００３５】
上記した通り、「標的核酸」同様、「核酸」も、当業者に知られているように「ヌクレオチド」のポリマー化合物である。本明細書においては、解析すべき試料中の「核酸」を意味するのに使用される。すなわち、試料中における存在、非存在、または量を決定すべきものである。したがって、換言すれば、「核酸」は標的であるから、「標的核酸」と標記することも可能である。例えば、血液にパルボウイルスB19が含まれているか否かを決定すべき場合、「標的核酸」は、パルボウイルスB19の核酸である。本明細書において、「核酸配列の相補的（核酸）配列」という用語は、言及された相補的（核酸）配列が、厳密に核酸配列の（逆の）相補体であることを意味する。
【００３６】
「プライマー」という用語は、本明細書において、当業者に知られている通りに使用され、「オリゴマー化合物」、主には「オリゴヌクレオチド」を意味するが、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるDNA合成を「プライム」させることができる「修飾オリゴヌクレオチド」をも意味する。すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの3'末端は、デオキシヌクレオシド3リン酸を使用し、ピロリン酸を放出する3'から5'へのホスホジエステル結合を成立させる鋳型依存性DNAポリメラーゼによって「ヌクレオチド」をさらに付着させることができる遊離3'-OH基を提供する。したがって、本発明によれば、「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」または「プローブ」の間には、目的とする機能以外に基本的な違いはない。
【００３７】
本明細書において、明らかに別段の意味を示さない限り、単数形の「a」、「an」および「the」は、単数形および複数形の両方を意味する。
【００３８】
本明細書において使用する場合、「含む(comprising)」という用語は、ある方法における列挙した工程の前に置かれている場合には、その方法が、明示的に記載された工程に追加される1つ以上の工程を含むこと、および、その追加的な1つ以上の工程を、記載された工程の前、間、および／または後に行うことができることを意味する。例えば、工程a、b、およびcを含む方法は、工程a、b、x、およびcからなる方法、工程a、b、c、およびxからなる方法、ならびに工程x、a、b、およびcからなる方法を包含する。さらに、「含む」という用語が、ある方法における工程を記載する前に置かれている場合には、その内容が明らかに別段であることを示さない限り、記載された工程を連続して行うことを必要とするものではない（但し、可能ではある）。例えば、工程a、b、およびcを含む方法は、例えば、工程a、c、およびbの順序で、工程c、b、およびaの順序で、および工程c、a、およびbの順序等で工程を行う方法を包含する。
【００３９】
増幅は、好ましくは、標的核酸を検出可能量まで特異的に増幅するポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる。これ以外に可能な増幅反応は、リガーゼ連鎖反応（LCR; Wu D. Y. および Wallace R. B., Genomics 4 (1989) 560-69; およびBarany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193）；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Barany F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16）；Gap-LCR（国際公開公報WO 90/01069号）；修復連鎖反応（Repair Chain Reaction）（欧州特許第0439182 A2号）、3SR（Kwoh D. Y.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; GuatelliJ. C.,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878；国際公開公報WO 92/08808号)、およびNASBA（米国特許第5,130,238号）である。さらに、鎖置換増幅法（SDA）、転写介在増幅法（TMA）、およびQβ増幅法がある（概説については、例えば、Whelen A. C. and Persing D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson R. D. and Myers T. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41-47を参照）。
【００４０】
適当なDNA検出法は当業者に知られており、Sambrook J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、およびAusubel F.ら: 分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）1987, J. Wiley and Sons, NYなど、標準的な教科書に記載されている。また、例えば、沈殿工程など、DNA検出工程の前に更なる精製工程を行うことも可能である。検出方法には、2本鎖DNAの中にインターカレートして、その後の蛍光を変化させるエチジウムブロマイドなどの特異的色素を結合またはインターカレートさせることが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製されたDNAは、制限酵素切断およびその後可視化した後に、場合によっては、電気泳動法によって分離することもできる。また、特異的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、その後のハイブリッド検出とを利用するプローブによるアッセイ法もある。当業者に既知である更なる工程の後、DNAの配列を決定することも可能である。好ましい鋳型依存性DNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼである。
【００４１】
したがって、本発明の好ましい態様は、決定または検出の工程が引き続き行われる上記精製法、または、増幅および決定または検出する工程が引き続き行われる精製法である。
【００４２】
本発明の別の態様において、
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブに接触させる工程、
（e）標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸が存在することを示す指標として検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法において、
第1のプライマーが、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、および/または
プローブが、配列番号：5の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること
を特徴とする方法が提供される。
【００４３】
好ましくは、該方法は、標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程を含まない。したがって、本発明の別の態様において、
（a）標的核酸を含んでいると推測される試料において、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む1対のプライマーの存在下、核酸を増幅する工程、
（b）プローブが標的核酸に結合する条件下で、工程a）の試料をプローブに接触させる工程、
（c）標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸が存在することを示す指標として検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法において、
第1のプライマーが、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、および/または
プローブが、配列番号：5の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること
を特徴とする方法を提供する。
【００４４】
「プローブ」という用語は、設計または選択により、規定された所定のストリンジェンシー下で特異的に（すなわち優先的に）「標的核酸」に自らをハイブリダイズさせることができる特異的ヌクレオチド配列を含む、合成的または生物学的に産生される核酸核酸（DNAまたはRNA）を意味する。「プローブ」は、標的核酸を「捕捉」して、検出を曖昧にするかもしれない不要な物質から標的核酸を分離できるようにすることを意味する「捕捉用プローブ」として同定することもできる。分離が行われれば、適当な処理法を用いて、捕捉された「標的核酸」の検出を行うことができる。「捕捉用プローブ」は、しばしば、すでに固相に結合されている。
【００４５】
本発明に係る方法において、プローブは、好ましくは、配列番号：10の核酸配列、またはその相補配列の少なくとも12個連続したヌクレオチドからなる。好ましくは、プローブは、本発明に係る核酸配列の少なくとも15または18個連続したヌクレオチドからなる。より好ましくは、プローブは、配列番号：11の核酸配列、またはその相補配列を有する。
【００４６】
本発明に係る方法の好ましい態様において、第1のプライマーは、配列番号：6または7の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーは、配列番号：8または9の核酸配列から選択された核酸配列の相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる。本発明のより好ましい態様において、第1のプライマーは、配列番号：12〜15の核酸配列のグループから選択された核酸配列を有し、第2のプライマーは、配列番号：16から17の核酸配列のグループの相補配列から選択された核酸配列を有する。好ましくは、これらのプライマーは、配列番号：1に記載された核酸配列をもつアンプリコンを増幅できるように選ばれる。
【００４７】
本発明に係る方法は、米国特許第6,174,670号に記載されているLightCycler（登録商標）装置で使用するための方式で行ない得る。この方式は、増幅と検出を含み、後者は、1対のプローブと標的核酸の間の結合産物を検出するための蛍光検出を利用する。これらの方式は、蛍光共鳴エネルギー転移技術を適用し（例えば、米国特許第4,996,143号、第5,565,322号、第5,849,489号、および第6,162,603号参照）、また、供与体および対応する受容体である蛍光標識が、互いに一定の距離内に位置すると、可視化できるか、検出および／または定量できる2つの蛍光標識の間にエネルギー転移が起こるという事実に基づいている。本明細書において、それぞれ蛍光標識を含む2つのプローブは、少なくともそれらの一方が本発明に係るオリゴヌクレオチドであるが、標的核酸に対するプローブの相補性によって決まる特定の位置で増幅産物とハイブリダイズすることができる。本発明に係るオリゴヌクレオチドの発明に係る蛍光標識は、供与体または受容体の蛍光標識であろう。プローブが、適当な位置で増幅産物にハイブリダイズすると、FRETシグナルが発生する。蛍光解析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡装置（特定の範囲で蛍光発光を観察するために適当なダイクロイックミラーおよびフィルターを含む）、光子計数光電子増倍管装置、または蛍光光度計を用いて行うことができる。エネルギー転移を起こすための励起は、アルゴン・イオン・レーザー、高輝度水銀（Hg）アークランプ、光ファイバー光源、またはその他、所望の範囲で励起するために適当にフィルターされた高輝度光源によって行うことができる。本明細書において、供与体または対応する受容体の蛍光標識に関して用いられる場合、「対応する」は、供与体の蛍光標識の発光スペクトルと重複する励起スペクトルを有する受容体の蛍光標識を意味する。したがって、効率的な非放射性エネルギー転移が、これらの間で生じうる。好ましい蛍光標識は、供与体蛍光標識としてフルオロセイン、それにより受容体の蛍光標識はローダミンであるが、好ましいのは、米国特許第6,174,670号に記載されているようなシアニン色素であり、好適にはCy5である。
【００４８】
しばしば「レポーター基」とも称される「標識」は、通常、核酸、特に、本発明に係る「オリゴマー化合物」または「修飾オリゴヌクレオチド」、およびそれらに結合している核酸を、液体中すなわち試料中の残余の物から区別できるようにする基である（「標識」を結合している核酸も、標識された核酸結合化合物、標識されたプローブ、または単にプローブと名付けることが可能である）。本発明に係る好ましい標識は、例えば、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、およびクマリン色素などの蛍光色素である蛍光標識である。
【００４９】
本明細書において使用する場合、「蛍光共鳴エネルギー転移関係」および同様の用語は、「供与体である蛍光標識」によって標識された「オリゴヌクレオチド」と「受容体である蛍光標識」によって標識された別の「オリゴマー化合物」とが、「標的核酸」に隣り合ってハイブリダイズして、「供与体である蛍光標識」が、共鳴エネルギーを「受容体である蛍光標識」に転移することができ、「受容体である蛍光標識」が、測定可能な蛍光発光を発生させる結果になることを意味する。「供与体である蛍光標識」および「受容体である蛍光標識」が、大きすぎる距離をおいて離れている場合には、「供与体である蛍光標識」が、共鳴エネルギーを「受容体である蛍光標識」に転移して、「受容体である蛍光標識」に測定可能な蛍光を発光させることができないため、「供与体である蛍光標識」と「受容体である蛍光標識」は、蛍光共鳴エネルギー転移関係にはない。
【００５０】
本発明の好ましい態様において、プローブは標識を担持する。好ましくは、工程d）で、標識を担持するさらなるプローブを試料に接触させて、第1および第2のプローブからなる1対のプローブを、工程d）において試料と接触させる。
【００５１】
本発明の好ましい態様において、本発明に係る方法における上記増幅工程c）が、試料を上記1対のプライマーに接触させて、もし標的核酸が該試料中に存在すれば増幅産物をもたらす工程を含み、上記ハイブリダイゼーション工程d）が、該試料を1対のプローブと接触させる工程であって、該1対のプローブの構成プローブが上記増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されている工程を含み、および、工程e）において、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出することによって、標的核酸と1対のプローブとの結合産物が検出され、蛍光共鳴エネルギー転移が存在することが、試料中に標的核酸が存在することの指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移が存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことの指標である、本発明に係る方法が提供される。
【００５２】
したがって、本発明の一つの態様において、試料中におけるパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸の存在の有無を検出する方法であって、増幅工程およびハイブリダイゼーション工程を含む1回以上のサイクル工程を行う工程であって、該増幅工程が、該試料を、1つのプライマーが本発明に係るオリゴヌクレオチドであるプライマーに接触させて、該試料中に標的核酸が存在すれば増幅産物をもたらすことを含み、該ハイブリダイゼーション工程が、該試料を、1対のプローブの構成プローブが該増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されており、1つのプローブは、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよいという1対のプローブと接触させることを含む、1回以上のサイクル工程を行う工程；および、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出する工程であって、FRETが存在することが、試料中に標的核酸が存在することを示し、FRETが存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことを示すものである工程を含む方法が提供される。
【００５３】
本発明の別の好ましい態様において、試料中におけるパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、1方のプローブが、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよい、標的核酸の隣接領域にハイブリダイズする2つの核酸プローブであって、該プローブの一方が蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光標識によって標識されており、もう一方のプローブが蛍光エネルギー転移対の供与体蛍光標識によって標識されていて、この2つのプローブが標的核酸にハイブリダイズすると、受容体蛍光標識と供与体蛍光標識が互いに25ヌクレオチドの範囲内の位置に来る2つの核酸プローブの存在下において、ポリメラーゼ連鎖反応であって、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および、1つのプライマーが本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよい、標的核酸に対するプライマーを試料に加える工程、および、試料を、少なくとも変性温度と伸長温度の間を熱サイクルさせる工程を含むポリメラーゼ連鎖反応によって核酸を増幅する工程；供与体蛍光標識によって吸光される波長の光によって生体試料を励起する工程；および蛍光エネルギー転移対からの蛍光発光を検出する工程を含む方法が提供される。
【００５４】
本発明の別の好ましい態様において、試料中におけるパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、1方のプローブが、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよい、核酸の隣接領域にハイブリダイズする2つの核酸プローブであって、該プローブの一方が蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光標識によって標識されており、もう一方のプローブが蛍光エネルギー転移対の供与体蛍光標識によって標識されていて、この2つのプローブが標的核酸にハイブリダイズすると、受容体蛍光標識と供与体蛍光標識が互いに25ヌクレオチドの範囲内の位置に来る2つの核酸プローブの存在下において、ポリメラーゼ連鎖反応であって、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および、1つのプライマーが本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよい、標的核酸に対するプライマーを試料に加える工程、および、試料を、少なくとも変性温度と伸長温度の間を熱サイクルさせる工程を含むポリメラーゼ連鎖反応によって核酸を増幅する工程；供与体蛍光標識によって吸光される波長の光によって生体試料を励起する工程；および蛍光エネルギー転移対からの温度依存的発光を観察する工程を含む方法が提供される。
【００５５】
本発明に係る方法の好ましい態様において、登録商標TaqManアッセイ法で使用される方式が考えられる。この方式は、増幅と検出を含み、後者は、プローブと標的核酸の結合産物を検出するための蛍光検出を利用する。したがって、プローブは、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよいが、好ましくは蛍光標識、好ましくはフルオレセインである標識を含む。このプローブは、さらに、1つの蛍光標識の発光波長が、別の蛍光標識の吸光波長と重なる別の蛍光標識を含むことが可能である。好ましくは、プローブは、消光剤として作用し、フルオレセインであってもよい蛍光標識の蛍光発光を消光する第2の蛍光標識をさらに含む。好ましくは、消光剤は、蛍光性のローダミンまたはシアニンである。また、消光物質は、ダブシル（dabcyl）である非蛍光性の化合物または色素（「ダーククエンチャー」）でもよい。主に米国特許第5,210,015号、第5,478,972号、または第5,804,375号に記載されているように、TaqMan（登録商標）方式では、プローブを酵素によって伸長させてプローブとして使用することはできない。好ましくは、オリゴマー化合物の3'末端にあるモノマー単位は、2',3'-ジデオキシヌクレオチドまたは3'-リン酸化ヌクレオチドである。その結果、TaqMan（登録商標）アッセイ法で使用される方式では、その方法の測定工程において、ハイブリダイゼーション後における蛍光標識と第2の標識、すなわち消光物質との空間関係が、好ましくは、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、好適にはTaqポリメラーゼによるプローブのエキソヌクレアーゼによる加水分解によって変化し、エキソヌクレアーゼ加水分解の結果として標識の遊離が起こる。そのため、本発明に係る方法において、工程c）における標的核酸が、鋳型依存性DNAポリメラーゼによって増幅される。本発明に係るオリゴマー化合物と核酸との間におけるハイブリダイゼーションの程度は、ハイブリダイゼーション後にプローブから遊離する標識の量によって測定される。このように、工程（d）において、核酸にハイブリダイズしたプローブから、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ加水分解によって遊離する標識の量によってハイブリダイゼーションの程度を測定することが本発明の好ましい態様である。
【００５６】
したがって、より好ましくは、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよいプローブは、第1および第2の標識を担持する。もっとも好ましい態様において、ハイブリダイゼーションの程度、またはプローブと標的核酸との結合産物は、工程（e）において、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ加水分解によって、標的核酸にハイブリダイズしたプローブから遊離する第1または第2の蛍光標識の量によって測定される。
【００５７】
より詳細にTaqMan（登録商標）アッセイ方式に関係する本発明の非常に好ましい態様において、試料中におけるパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（a）1本鎖核酸を含む試料を、標的核酸の一領域に相補的な配列を含むプライマーまたはオリゴヌクレオチドを、第1および第2の蛍光標識を含むプローブであって、同じ標的核酸配列鎖に第2の領域の相補的な配列を含むが、上記プライマーまたはオリゴヌクレオチドによって確定される核酸配列は含まないプローブに接触させて、ハイブリダイゼーション条件の中で、第1のプライマーまたはオリゴヌクレオチドの3'末端が、プローブの5'末端よりも上流になるように、プライマーまたはオリゴヌクレオチド、およびプローブにアニールした標的核酸を含む二重鎖の混合物を作り出す工程、
（b）アニールしたプローブを切断し、標識された断片を遊離させる、ポリメラーゼの5'から3'方向ヌクレアーゼ活性を十分に可能にする条件の下で、5'から3'方向ヌクレアーゼ活性を有する工程（a）の混合物を維持する工程、ならびに
（c）標識された断片の遊離を検出および／または測定する工程
を含む方法が提供される。
【００５８】
上記方法では、核酸は、2本鎖または1本鎖の形で存在することが可能であり、2本鎖核酸は、この方法が加熱すなわち熱変性によって行われる前に、変性、すなわち1本鎖になる。
【００５９】
別の好ましい態様において、プライマーおよび／またはプローブを化学的に修飾することができる。すなわち、プライマーおよび／またはプローブは、修飾ヌクレオチドまた非ヌクレオチド化合物を含む。すると、このプローブまたはプライマーは修飾オリゴヌクレオチドとなる。
【００６０】
「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチドアナログ」）は、何らかの修飾がある点で天然型の「ヌクレオチド」と異なるが、依然として、塩基、ペントフラノシル糖、リン酸部位、塩基様、ペントフラノシル様糖、およびリン酸様部位、またはこれらをの組み合わせからなる。例えば、「標識」は、「ヌクレオチド」の塩基部位に結合し、それにより、「修飾ヌクレオチド」が得られる。「ヌクレオチド」における天然の塩基も、例えば7-デアザプリンによって置換することができ、それにより、同じように「修飾ヌクレオチド」が得られる。「修飾ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」という用語は、本出願においては同義的に使用される。「修飾ヌクレオシド」（または「ヌクレオシドアナログ」）は、「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチドアナログ」）について上記したように、何らかの修飾がある点で天然型のヌクレオシドとは異なる。
【００６１】
「非ヌクレオチド化合物」は、天然型の「ヌクレオチド」とは異なるが、本発明の意図するところでは、「ヌクレオチド」同様、依然として、「オリゴマー化合物」の「モノマー単位」となりうる。したがって、「非ヌクレオチド化合物」は、「ヌクレオチド」とともに「オリゴマー化合物」を形成することができなければならない。「非ヌクレオチド化合物」であっても、塩基様部位、ペントフラノシル様糖部位、およびリン酸様部位を含むことが可能であるが、それらのすべてが、「非ヌクレオチド化合物」の中に同時に存在するわけではない。
【００６２】
「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、「モノマー単位」として、1つ以上の「ヌクレオチド」、1つ以上の「非ヌクレオチド化合物」または「修飾ヌクレオチド」を有する、別の特異的な「オリゴマー化合物」サブグループに属する。したがって、「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）という用語は、「オリゴヌクレオチド」と実質的に類似した様式で機能する構造物を意味し、本出願全体で同義的に使用される。合成という観点から見ると、「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、例えば、リン酸骨格、リボース単位、またはヌクレオチド塩基を適当に修飾することによって、「オリゴヌクレオチド」を化学修飾して作成することができる（Uhlmannおよび Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; Verma S. およびEckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67(1998) 99-134）。代表的な修飾には、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合の代わりにヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホトリエステル結合、またはホスホルアミデート結合；天然型のプリン塩基およびピリミジン塩基の代わりにデアザまたはアザプリンおよびデアザまたはアザピリミジン、5位または6位に置換基を有するピリミジン塩基；2位、6位または8位に、または7-デアザプリンとして7位に改変された置換基を有するプリン塩基；例えば2'位に置換基を有する糖、または炭素環式もしくは非環式の糖アナログなどがある。本発明の趣旨に合致するその他の修飾は、当業者に知られている。このような「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、もっともよく表現をすれば、天然型の「オリゴヌクレオチド」（または、自然な線に沿って合成「オリゴヌクレオチド」）と機能的に同義であるが、構造的には異なるものである。より詳しくは、修飾例が、Verma S.およびEckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134または国際公開公報第02/12263号に開示されている。さらに、ヌクレオシド間のリン酸結合または糖リン酸結合に代わる基を介してヌクレオシド単位が結合されているという修飾を作出することも可能である。このような結合には、Verma S.およびEckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134に開示されている結合が挙げられる。リン酸結合以外のものを利用して、ヌクレオシド単位を結合する場合、そのような構造物も、「オリゴヌクレオシド」とされてきた。
【００６３】
別の好ましい態様は、さまざまな標的核酸、好適にはさまざまなウイルスの多重検出法に関連する。そのため、本発明の好ましい態様において、同一の反応において他の標的核酸を検出する本発明に係る方法が提供される。好ましくは、その他の標的核酸は、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヒト免疫不全ウイルス、または、例えば、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）またはクラミジア感染症などの細菌感染症の原因となる細菌性病原菌由来の核酸を含む。
【００６４】
本発明の別の態様において、オリゴヌクレオチドの核酸配列が、配列番号12から15の核酸配列から、核酸配列10もしく11またはその相補配列から、または核酸配列16もしく17の相補配列から選択されるオリゴヌクレオチドが提供される。本発明の好ましい態様において、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む本発明に係るオリゴヌクレオチドが提供される。
【００６５】
本発明の別の態様において、第1のプライマーの核酸配列が、核酸配列番号12から15より選択され、第2のプライマーの核酸配列が、核酸配列番号16または17の相補配列から選択される第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーが提供される。
【００６６】
本発明に係るオリゴヌクレオチドまたは1対のプライマーを、相補的な核酸とともにハイブリダイゼーション反応に使用することができる。本発明の別の態様において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、プライマー、プローブ、または捕捉用プローブとして使用することができる。
【００６７】
別の好ましい態様において、3'から5'方向エキソヌクレアーゼ活性をもつ鋳型依存性ポリメラーゼ、好適にはTaqポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド、または本発明に係る1対のプライマーを含む、部分からなるキットが、本発明によって意図されている。本発明の別の態様において、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド、または本発明に係る1対のプライマーを含むキットが提供される。
【００６８】
当技術分野において知られているこのようなキットは、例えば、96穴または384穴のウェル方式になっているマイクロタイタープレート、または、例えば、ドイツ国ハンブルグにあるEppendorf（Eppendorf, Hamburg, Germany）によって製造されている全く通常の反応用チューブなど、増幅処理過程で使用することができるプラスチック製品、および、本発明に係る方法を行うためのその他すべての試薬をさらに含む。
【００６９】
本発明の別の態様において、キットは、核酸を単離するための試薬をさらに含む。そのため、このキットは、核酸に親和性をもつ物質をさらに含むことができ、好ましくは、核酸に対して親和性のある物質は、シリカ表面をもつ材料を含む。好ましくは、シリカ表面をもつ材料はガラスである。最も好ましくは、核酸に対して親和性のある物質は、国際公開公報第96/41811号または第01/37291号に記載されているような磁性ガラス粒子を含む組成物である。このキットは、更にまたは付加的に、例えば、カオトロピック剤、界面活性剤、またはアルコール、またはそれらの混合物を含み、細胞を溶解させるリーシス用バッファー、および、それとは別に、不必要なタンパク質を分解するための、例えばプロテイナーゼKなどのプロテアーゼを含む。本発明に係るキットのこれらの成分は、チューブまたは保存用容器に入れて別々に提供することができる。成分の性質に応じて、これらを1つのチューブまたは保存用容器に入れて提供することも可能である。このキットは、更にまたは付加的に、DNAまたはRNAが磁性ガラス粒子に結合したときに、それらを洗浄する工程に適した洗浄用溶液を含むことが可能である。この洗浄用溶液は、上記したようにエタノールおよび／またはカオトロピック剤なしで酸性pHをもつ緩衝溶液または溶液の中にエタノールおよび／またはカオトロピック剤を含むことが可能である。しばしば、洗浄用溶液またはその他の溶液は、使用前に希釈しなければならない貯蔵溶液として提供される。このキットは、更にまたは付加的に、溶出剤または溶出用バッファー、すなわち、磁性ガラス粒子に結合したDNAもしくはRNAを溶出するための溶液もしくはバッファー（例えば10 mM Tris、1 mM EDTA、pH 8.0）、または純水を含むことができる。さらに、核酸、すなわちDNAまたはRNAの精製処理に使用することができる更なる試薬または緩衝溶液が存在してもよい。
【００７０】
本発明の好ましい態様は、本発明に係る方法またはキットを、例えば国際公開公報第99/16781号に記載されているような自動化可能な方法において使用することである。自動化可能な方法とは、当該方法の工程が、人間による外部的な制御または影響を殆どまたは全く用いることなく操作できる装置または機械によって実施するのに適していることを意味する。自動化された方法とは、自動化可能な方法の工程が、人間による外部的な制御または影響を殆どまたは全く用いることなく操作できる装置または機械によって実施されることを意味する。この方法のための準備工程だけは、人の手で行う必要があるかもしれない。例えば、貯蔵容器を補充して正しい位置に置かなければならないし、試料の選択や、例えば、制御用コンピュータの操作など当業者に知られた更なる工程なども人間が行わなければならない。上記装置または機械は、例えば、自動的に液体を加え、試料を混合し、または特定の温度でインキュベーション工程を実行することができる。一般的には、このような機械または装置は、単一の工程およびコマンドが特定されているプログラムを実行するコンピュータによって制御される自動装置である。好ましい自動化法は、方法および使用される機械または装置が、試料を短時間に大量に処理するために最適化されているという意味のハイスループット方式で行われる方法である。本発明の別の態様おいて、本発明に係る方法またはキットは、いくつかの反応工程を人手によって処理しなければならないという意味の半自動化処理において使用される。本発明の好ましい態様において、本発明に係るMGPを含む懸濁液を貯蔵容器から取り出し、部分容量をさまざまな反応用容器に加える。反応用容器は、プラスチックで作られていて、最終的には、反応を行うことができる96個または384個またはそれ以上の個数のウェルを含むマイクロタイタープレート方式である反応用チューブでもよい。しかし、これらの容器は、別の材料、例えばスチールで作られていてもよい。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、本発明に係るキットは、研究、生物分析、または診断に使用される。本発明に係る好ましい態様において、本発明に係るキットまたは方法は、ハイスループット方式、すなわち非常に多数の異なった試料を非常に短時間で解析することができる自動化された方法で使用される。
【００７２】
以下の実施例、参考文献、配列表、および図面は、本発明の理解を助けるために提供するものであって、その真の範囲は、付随の特許請求の範囲に記載されている。当然ながら、本発明の趣旨を逸脱することなく、記載された処理に変更を加えることができる。
【実施例】
【００７３】
実施例−核酸検査法によるパルボウイルスB19の検出
一般：
200μLの標本投入量で、製造者の指示に従ってCOBAS AmpliPrep装置上で全核酸単離（TNAI）キット（どちらもRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany）を用いて、EDTA血漿、クエン酸血漿、およびヒト血漿の試料調製を行なった。次に、50μLの溶出液を人手によって特別のPCR用チューブ（k-チューブという）に移して、50μLのPCR反応用混合液と混ぜた。核酸の増幅および検出を、以下のPCRプロフィールを用いてCOBAS TaqMan解析装置（Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany）上で動的PCRにより行った。
【００７４】
【００７５】
実施例1
さまざまなプライマーの組み合わせの比較
NS1遺伝子の高度に保存された領域を含むTaqManプローブ（STS15）を設計した。このプローブは、配列番号11の5'-CCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATCAT-3'（Shade R.O. ら, J. Virol. 58 (1986) 921-936に記載されたヌクレオチド番号（nt）2070-2095）を有する。最近傍法（Nearest Neighbor Method）を適用した場合（OLIGO, Molecular Biology Insights, Inc, CO, USA）、このプローブの融解温度（Tm）は約80℃である。次に、以下
・Tm 59〜63℃、
・最近になって発見された新変異株を含む、公開されたエリスロウイルスの配列（Nguyen Q. T.ら, Virology 301 (2002)374-80；Servant A.ら, J. Virol. 76 (2002) 9124-34）とミスマッチが全くないか、より少ない、
・誤ったプライミングがより少ない、
・プライマーがAまたはCで終る、
の基準に適合するようプライマー配列を設計した。
【００７６】
以下の配列が適当であると見なされ、合成された。
STS12（フォワードプライマー）：5'-GTGGTGAAAGCTCTGAAGAA-3'（配列番号12）
STS13（フォワードプライマー）：5'-GAAACCCCGCGCTCTA-3'（配列番号13）
STS14（フォワードプライマー）：5'-AAACCCCGCGCTCTAGTA-3'（配列番号14）
STS17（フォワードプライマー）：5'-GAAACCCCGCGCTCTAGTAC-3'（配列番号15）
STS16（リバースプライマー）：5'-TTCCATCCATTATACCAAGC-3'（配列番号16）
STS18（リバースプライマー）：5'-CCCAACTAACAGTTCACGAA-3'（配列番号17）
【００７７】
プライマーの組み合わせSTS12/16、STS13/16、STS14/16、およびSTS17/18の性能を、プローブSTS15、および50 mMトリシンpH 8.3、100 mM酢酸カリウム、3 mM酢酸マンガン、4 % グリセロール、300μM dATP、300μM dCTP、300μM dGTP、50μM dTTP、500μM dUTP、10 Uウラシル-N-グリコシラーゼ、40 U Z05ポリメラーゼ、200 nM NTQ21-46A-アプタマー、400 nMの各プライマー、および100 nMプローブからなるPCR反応用混合液を用いて評価した。500および1000 IU/mLのパルボウイルスB19 DNAからなる試料を、COBAS AmpliPrep装置上でTNAIキットを用いて処理した。その後、50μLの対応する溶出液を、k-チューブ内で2倍の反応用混合液と混合し、増幅／検出を行うためにCOBAS TaqMan解析装置内に置いた。
【００７８】
図1から3は、STS12/16、STS13/16、およびSTS14/16というプライマーの組合せについて、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線を示す。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。これら垂直線とX軸とが交わる点がサイクル閾値（ct）値と決定され、標的配列の投入濃度と直接に比例する。ct-値が低くなるほど、開始時の標的コピーの投入量が多い。ここに示したプライマーの組み合わせSTS14/16が、ct-値が低いことから判断すると優れているように思われる。
【００７９】
図4は、アガロースゲル電気泳動による対応するアンプリコンの解析結果を示している。所定のプライマー組み合わせによるPCR反応が、非特異的配列の交差反応または増幅を全く示さないか、より少なくしか示さないことを実証している。
【００８０】
第２のリバースプライマーであるSTS18を、フォワードプライマーSTS17とともに評価し、上記の通りの反応用混合液およびPCRプロトコルを用いて、このプライマーの組み合わせをSTS14/16と比較した。試料として、500 IU/mLの標本の反復抽出物から得られた溶出液を用いた。図5は、これら2つのプライマー組み合わせを比較した結果を示している。ここから明らかなように、STS17/18が、ct-値を基準にすると誤差がより少ないとともに最も低いct-値を含むため、これを、以後の実験で使用することに決めた。
【００８１】
実施例2
プライマーSTS17、STS18、およびプローブSTS15による分析感度
感度を測定するために、パルボウイルスB19 DNAの世界保健機関による基準物質（国立生物学的製剤研究所[NIBSC]の第1回国際標準2000パルボウイルスB19 DNA 500000 IU/mL；コード番号99/800）をEDTA血漿に1000〜10 IU/mLに連続希釈したものを、200μlの標本投入量で上記抽出法を用いて12回反復して処理した。50μLの溶出液を、人手にてk-チューブに移し、50μlの活性化MMxと混合し、その後、PCRのために取り出した（詳細については、実施例1参照）。Probit解析アルゴリズムによると、感度は、ヒット率（hitrate）95％で26 IU/mLであることが分かった。表1は、この実験の結果をまとめたもので、対応する投入濃度におけるヒット率を示している。図6は、選択した増幅産物のアガロースゲル電気泳動解析の結果を示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
実施例3
異なったプライマーの組み合わせによる精密試験
STS17/18のプライマー組み合わせによる精密度を、STS15プローブとともにSTS14/16の組み合わせと比較して評価した。上記処理を行った後、異なる２日間に46回反復して1E4 IU/mLのPelispy Parvo-B19 DNA操作対照（VQC Laboratory, Alkmaar, NL）を抽出した。上記実施例1に記載したような動的PCRによって溶出液を解析した。ct-値を基準にした全体のCVは、STS17/18のプライマー組み合わせの場合には2.18％であることが分かったが、STS14/16の組み合わせでは4.89％のCVを含む（表2）。
【００８４】
【表２】
【００８５】
実施例4
異なったプライマーの組み合わせによる特異性試験
異なったプライマーの組み合わせと、パルボウイルスB19ゲノムのNS1遺伝子内に位置するプローブSTS15とで特異性を評価した。実施例1から一般的な処理法（反応混合液、PCRプロトコル）を採用した。ドイツ赤十字の献血センター（Munich, BRD）から新鮮な通常の献血の供給を受けて、上記したように抽出した。以下の表3は、この解析結果を示し、調べた組み合わせのすべてについて特異性が100％であることを示している。
【００８６】
【表３】
【００８７】
実施例5
PCRの精密さに対する反応用混合組成物の影響
この実験の目標は、反応用混合組成物が、パルボウイルスB19のNS1領域を標的とするPCR反応の精密さに対して有意な影響を及ぼすか否かを解析することであった。上記実施例4に記載した反応用混合液、および2種類の市販されている調製済み反応用混合液（COBAS TaqMan Generic DNA増幅用キット、COBAS TaqMan Generic RNA増幅用キット）に、STS17/18のプライマー組み合わせ（各最終濃度0.4μM）およびSTS15プローブ（最終濃度0.1μM）を加えた。実施例3に記載した1E4 IU/mLのPelispy Parvo-B19 DNA操作対照を、各反応用混合液あたり20回反復して抽出し、実施例1に従って解析した。図7は、CVが4.4％である市販のDNA反応用混合液、およびCVが2.3％である実験室内調製反応用混合液と比較すると、市販のRNA反応用混合液が、最も低い0.5％というCVから判断して最も優れた精密度とともに最も低いct-値を含んでいることを示している（表4）。
【００８８】
パルボウイルスB19のゲノム内の標的領域を調べた結果を図8に示す。
【表４】
【００８９】
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US 5,386,024
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US 5,487,972
US 5,565,322
US 5,585,254
US 5,804,375
US 5,849,489
US 6,103,476
US 6,162,603
US 6,174,670
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【００９０】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第1のプライマー、および、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法。
［２］第1のプライマーが、配列番号：6または7の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：8または9の核酸配列から選択された核酸配列の相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる、［１］記載の方法。
［３］第1のプライマーが、配列番号：12〜15の核酸配列の群から選択される核酸配列を有し、第2のプライマーが、配列番号：16または17の核酸配列の群の相補配列から選択される核酸配列を有する、［１］または［２］記載の方法。
［４］（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブに接触させる工程
（e）標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸が存在することを示す指標として検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法において、
第1のプライマーが、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、および/または
プローブが、配列番号：5の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、
を特徴とする、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法。
［５］プローブが標識を担持する、［４］記載の方法。
［６］工程d）において、標識を担持するさらなるプローブを試料と、工程d）において第1および第2のプローブからなる1対のプローブが試料と接触するように接触させる、［５］記載の方法。
［７］前記増幅工程c）が、試料を前記1対のプライマーに接触させて、もし標的核酸が試料中に存在すれば増幅産物をもたらす工程を含み、前記ハイブリダイゼーション工程d）が、該試料を1対のプローブと接触させる工程であって、該1対のプローブの構成プローブが前記増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されている工程を含み、
工程e）において、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出することによって、標的核酸と1対のプローブとの結合産物が検出され、蛍光共鳴エネルギー転移が存在することが、試料中に標的核酸が存在することの指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移が存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことの指標である、［６］記載の方法。
［８］該プローブが第1および第2の標識を担持する、［４］記載の方法。
［９］工程c）における標的核酸(nucleic)が鋳型依存性DNAポリメラーゼにより増幅される、［４］〜［８］いずれか記載の方法。
［１０］工程（e）における標的核酸とプローブとの結合産物が、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエクソヌクレアーゼ加水分解により、標的核酸にハイブリダイズしたプローブから遊離する第1または第2の蛍光標識の量によって検出される、［８］または［９］いずれか記載の方法。
［１１］該プローブが配列番号：10の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる、［４］〜［１０］いずれか記載の方法。
［１２］該プローブが配列番号：11の核酸配列またはその相補配列を有する、［４］〜［１１］いずれか記載の方法。
［１３］第1のプライマーが配列番号：6または7の核酸配列より選択される核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが配列番号：8または9の核酸配列より選択される核酸配列の相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる、［４］〜［１２］いずれか記載の方法。
［１４］第1のプライマーが配列番号：12〜15の核酸配列の群より選択される核酸配列を有し、第2のプライマーが配列番号：16または17の核酸配列の群の相補配列より選択される核酸配列を有する、［４］〜［１３］いずれか記載の方法。
［１５］該プライマーおよび／または該プローブが修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む、［４］〜［１４］いずれか記載の方法。
［１６］他の標的核酸が同じ反応物において検出される、［４］〜［１５］いずれか記載の方法。
［１７］他の標的核酸がA型肝炎ウィルス、B型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルス、西ナイルウィルスまたはヒト免疫不全ウィルス由来の核酸を含む、［１６］記載の方法。
［１８］核酸配列が、配列番号：12〜15の核酸配列、10、11の核酸配列もしくはその相補配列、または16もしくは17の核酸配列の相補配列より選択される、オリゴヌクレオチド。
［１９］修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む、［１９］記載のオリゴヌクレオチド。
［２０］第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーであって、第1のプライマーの核酸配列が配列番号：12〜15の核酸配列より選択され、第2のプライマーの核酸配列が16または17の核酸配列の相補配列より選択される、1対のプライマー。
［２１］相補的な核酸とのハイブリダイゼーション反応における［１８］または［１９］いずれか記載のオリゴヌクレオチドまたは［２０］記載の1対のプライマーの使用。
［２２］プライマー、プローブまたは捕捉用プローブとしての［１８］または［１９］いずれか記載のオリゴヌクレオチドの使用。
［２３］鋳型依存性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、および［１８］もしくは［１９］いずれか記載のオリゴヌクレオチドまたは［２０］記載の1対のプライマーを含むキット。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、パルボウイルスB19の検出のための新規なプライマーおよびプローブならびにそれらを含むキットに関する。さらに、本発明は、これら新規なプライマーおよびプローブを使用できる方法、特に、均質ポリメラーゼ連鎖反応（homogeneous polymerase chain reaction）法に関する。さらに、本発明は、これら新規なプライマーおよびプローブの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
パルボウイルスB19感染症は、免疫が正常な個体では通常軽微な経過をたどるありふれた小児期の疾病であり、伝染性紅斑または第5病として知られる特徴的な発疹を生じる（非特許文献１）。感染は、慢性の溶血性疾患患者では、重度の関節痛と一過性の骨髄無形成クリーゼ(crisis)を伴う可能性がある（非特許文献２)。先天性貧血および脈管炎も記載されている（非特許文献３)。最近になって、このウイルスは、肝炎および心筋炎と関係している（非特許文献４;非特許文献５;非特許文献６)。母体が妊娠中に感染すると、このウイルスは、胎児に伝染して、水症、自然流産、または子宮内死を引き起こす（非特許文献７）。呼吸経路による伝染以外にも、汚染された血液および血液製剤を介してパルボウイルス19による感染が起こることもある（非特許文献８）。後者は、米国食品医薬品局によって認識されており、その結果、パルボウイルス19の核酸試験（NAT）は、ドナーのスクリーニングではなく、製造工程内試験（in-process testing）とされるべきだという提言となった。
【０００３】
分子診断の分野において、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による標的核酸の検出は、重要な役割を果たしている。ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、またはC型肝炎ウイルス（HCV）の存在を調べる日常業務としての血液バンクのスクリーニングは、PCRによる診断法を大規模に応用した一例である。PCRによる解析のための自動化装置は、しばしば、PCR処理過程における産物増幅のリアルタイム検出法を利用する。このような方法の鍵となるのは、レポーター基または標識を担持する修飾オリゴヌクレオチドを使用することである。一方、PCR処理によって生じたDNA増幅産物の検出は、別々の操作工程で行うことができる。これらは、電気泳動移動度について増幅断片の特徴を調べること、および/または固相支持体に付着した変性増幅産物を、ハイブリダイゼーション用プローブを用いて解析することを含みうる。
【０００４】
他方、DNA増幅産物の検出は、いわゆる「均質」アッセイ法で行うことができる。「均質」アッセイ系は、標的配列が増幅されている間にシグナルを発生させるレポーター分子または標識を含む。「均質」アッセイ系の一例は、特許文献１、特許文献２、および特許文献３において詳しく説明されているTaqMan（登録商標）系である。簡単に述べると、この方法は、2重標識されたプローブ、およびTaq DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性に基づくものである。プローブは、PCRによって増幅される標的配列に相補的であり、各重合サイクル工程では2つのプライマーの間に位置する。このプローブには、2つの蛍光標識が付着している。1つは、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）などのレポーター色素であるが、これは、もう1つの蛍光色素である6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン（TAMRA）に空間的に近接していることによるエネルギー転移によって消光される消光スペクトルを有する。各増幅サイクル過程において、プライムDNA鎖を伸長させる処理中、Taq DNAポリメラーゼは、アニールしたプローブを置換して分解するが、この後者の作用は、ポリメラーゼの天然の5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によるものである。この仕組みによって、TAMRAの消光活性からレポーター色素が切り離される。結果として、プローブの切断が増加するにつれて蛍光活性が上昇するが、それは、形成されたPCR産物の量に比例する。こうして、遊離した蛍光標識の強度を検出すると、増幅された標的配列が測定される。「均質」アッセイ系の別の例が、登録商標LightCycler装置で使用される方式（例えば特許文献４参照）によって提供されるが、それらの中には、時に、「キシング・プローブ（kissing probe）」方式と呼ばれるものもある。この場合も、原則は、供与体となる色素の発光波長が、蛍光共鳴エネルギー転移によって、受容体となる色素を励起するという特徴をもつ2つの相互作用色素に基づいている。ビオチン化配列特異的捕捉用プローブを、ストレプトアビジンで被覆した磁気粒子とともに使用して標的配列を単離することにより、自動化を拡大するために、登録商標COBAS AmpliPrep装置（ロシュ・ダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics GmbH）、ドイツ国D-68305マンハイム（D-68305 Mannheim, Germany））が最近になって導入された（非特許文献９;非特許文献１０）。最近、さらに別の用途の広いツールである、全核酸分離用（Total Nucleic Acid Isolation（TNAI））キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）が加わった。この研究用試薬は、非特許文献１１によって開発された方法に本質的には基づいたCOBAS（登録商標）AmpliPrep装置において血漿および血清から、配列特異的にではなく包括的に総核酸を単離できるようにする。
【０００５】
パルボウイルスB19のためのアッセイ系は、特許文献５（1995年）または非特許文献１２に開示されている。VP1またはVP2領域からパルボウイルスB19を検出するためのプライマーは、特許文献６に開示されている。VP1およびVP2のクローニングについては特許文献７に開示されている。パルボウイルスRA-1に対するプローブは、特許文献８に、パルボウイルスB19に対するプローブは、特許文献９に開示されている。NS1遺伝子、およびそれに対するプローブは、特許文献１０に記載されている。パルボウイルスB19のPCRによる検出については、特許文献１１に記載されている。特異的なエリスロウイルスの核酸配列が、特許文献１２に記載されている。特許文献１３には、パルボウイルスB19の診断アッセイ法についての記載がある。特許文献１４には、パルボウイルスのホスホリパーゼA2についての記載がある。パルボウイルスB19の大量測定法は、特許文献１５に記載されている。パルボウイルスB19の検査法が、特許文献１６に記載されている。DNA制御構築物が特許文献１７に記載されている。パルボウイルス様粒子が、特許文献１８に記載されている。特許文献１９には、パルボウイルスB19のPCR増幅法が記載されている。パルボウイルスB19感染症を治療する方法が特許文献２０に記載されている。自律的なパルボウイルスB19遺伝子送達媒体が特許文献２１、およびその対応米国特許および特許文献２２に記載されている。
【０００６】
パルボウイルスB19の配列は、非特許文献１３に記載されており、ゲノムの解析については、非特許文献１４および非特許文献１５に記載されている。パルボウイルスB19の検出法は、非特許文献１６,非特許文献１７,非特許文献１８,非特許文献１９および非特許文献２０、ならびに非特許文献２１に記載されている。VP1領域は、非特許文献２２および非特許文献２３によって解析されている。NS1領域は、非特許文献２４によって解析されている。さまざまなパルボウイルスB19単離株間における配列の変異性については、非特許文献２５,非特許文献２６,非特許文献２７および非特許文献２８、ならびに非特許文献２９に記載されている。
【０００７】
特許文献１２には、エリスロウイルスV19およびB19を検出するのに適した特定のプライマーおよびプローブが記載されている。特許文献２３は、TTウイルスを検出するのに役立つ核酸オリゴマーのプライマーまたはプローブを開示している。Schmidtら（非特許文献３０）は、血漿プールおよび血漿製剤中のパルボウイルスB19の検出について開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,210,015号
【特許文献２】米国特許第5,804,375号
【特許文献３】米国特許第5,487,972号
【特許文献４】米国特許第6,174,670号
【特許文献５】日本特許公開公報第147986号
【特許文献６】米国特許第6,274,307号
【特許文献７】JP特許登録第04088985号
【特許文献８】欧州特許第238 893号
【特許文献９】国際公開公報WO 01/06019号
【特許文献１０】欧州特許第783 580号
【特許文献１１】ロシア連邦特許第2146372号
【特許文献１２】国際公開公報WO 99/28439号
【特許文献１３】国際公開公報WO 03/002753号
【特許文献１４】国際公開公報WO 02/00924号
【特許文献１５】米国特許第6,183,999号
【特許文献１６】国際公開公報WO 01/14593号
【特許文献１７】国際公開公報WO 02/096925号
【特許文献１８】国際公開公報WO 91/04330号
【特許文献１９】JP特許登録第11221099号
【特許文献２０】米国特許第6,268,349号
【特許文献２１】米国特許第5,585,254号
【特許文献２２】国際公開公報WO 00/24917号
【特許文献２３】米国特許第6,395,472号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Anderson M. J.ら, Lancet 1 (1983) 1378
【非特許文献２】J. R.ら, Lancet 1 (1981) 664-665
【非特許文献３】Cohen B., BMJ 311 (1995) 1549-1552
【非特許文献４】Yoto Y.ら, Lancet 347 (1996) 868-9
【非特許文献５】Enders G.ら, Clin Infect Dis 26 (1998) 355-358
【非特許文献６】Dux S.ら, Dtsch Med Wochenschr 127 (2002)1584-1588
【非特許文献７】Enders E：胎児または新生児の風疹以外の感染症（Infections of the fetus and the neonate other than rubella）. Topley & Wilson微生物学および微生物感染症（Microbiology and Microbial Infections）Collier L.編 London, Edward Arnold, 1998, pp. 873-915
【非特許文献８】Brown K. E., Baillieres Best Pract Res Clin Haematol 13 (2000) 245-259
【非特許文献９】Jungkind D., J Clin Virol 20 (2001) 1-6
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【非特許文献１７】Cubie H. A.ら, Mol Cell Probes 9 (1995), 59-66
【非特許文献１８】Jordan J. A.ら, Mol. Diagn. 1 (1996), 321-328
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【非特許文献２０】Carriere C.ら, J Virol Methods 44 (1993), 221-234
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【非特許文献２２】Dorsch S.ら, J. Gen. Virol. (2001) 82, 191-199
【非特許文献２３】Takahashi N.ら, FEBS Lett. 450 (1999) 289-293
【非特許文献２４】HicksK. E.ら, Arch Virol. 141 (1996), 1319-1327
【非特許文献２５】Hemauer A.ら, J. Gen. Virol. (1996) 77, 1781-1785
【非特許文献２６】Umene K. および Nunoue T., J. Gen. Virol. 76 (1995) 2645-2651
【非特許文献２７】Erdman D. D.ら, J Gen Virol 77 (1996), 2767-2774
【非特許文献２８】Astellら, J. Gen. Virol. 68 (1987) 885-893
【非特許文献２９】Turton J.ら,Epidemiol Infect 105 (1990) 197-201
【非特許文献３０】Vox Sanguinis (2001) 81, 228-235
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の概要）
パルボウイルスB19は臨床上重要であるため、生物学的試料においてこのウイルスを検出することができる更なるプライマーおよびプローブに対する需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そのため、本発明は、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第1のプライマー、および、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブに接触させる工程、
（e）核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸が存在することを示す指標として検出する工程
を含む方法において、
第1のプライマーが、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、および/または
プローブが、配列番号：5の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること
を特徴とする方法を提供する。
【００１３】
本発明は、さらに、その核酸配列が、配列番号：12〜15の核酸配列、核酸配列10もしく11またはその相補配列、または核酸配列16もしくは17の相補配列から選択されるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明の別の態様において、第1のプライマーの核酸配列が、核酸配列番号：12〜15から選択され、第2のプライマーの核酸配列が、配列番号：16または17の核酸配列の相補配列から選択される第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーが提供される。
【００１５】
本発明に係るオリゴヌクレオチドまたは1対のプライマーを、相補的な核酸とのハイブリダイゼーション反応に使用することができる。本発明の別の態様において、本発明に係るオリゴヌクレオチドまたは1対のプライマーは、プライマー、プローブ、または捕捉用プローブとして使用することができる。
【００１６】
本発明は、さらに、鋳型依存的DNAポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび本発明に係るオリゴヌクレオチドまたは1対のプライマーを含むキットを提供する。
【００１７】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：１４の核酸配列からなる第1のプライマー、および配列番号：１６の核酸配列からなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、ならびに
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法、
〔２〕(c1)プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブと接触させる工程
を工程(c)と工程(d)の間にさらに含み、
ここで、工程(d)が、標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸の存在の指標として検出する工程を含む、〔１〕記載の方法、
〔３〕プローブが、配列番号：５の核酸配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなる、〔２〕記載の方法、
〔４〕プローブが標識を担持する、〔２〕または〔３〕記載の方法、
〔５〕工程d）において、標識を担持するさらなるプローブを試料と接触させ、その結果、工程d）において第1および第2のプローブからなる1対のプローブが試料と接触する、〔４〕記載の方法、
〔６〕前記増幅工程c）が、試料を前記1対のプライマーに接触させ、標的核酸が試料中に存在する場合に増幅産物をもたらす工程を含み、前記工程d）が、該試料を1対のプローブと接触させる工程であって、該1対のプローブの構成プローブが前記増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されている工程を含み、そして、工程d）において、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出することによって、標的核酸と1対のプローブとの結合産物を検出する、ここで、蛍光共鳴エネルギー転移が存在することが、試料中に標的核酸が存在することの指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移が存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことの指標である、〔５〕記載の方法、
〔７〕該プローブが第1および第2の標識を担持する、〔２〕または〔３〕記載の方法、
〔８〕工程c）における標的核酸が鋳型依存性DNAポリメラーゼにより増幅される、〔２〕〜〔７〕いずれか記載の方法、
〔９〕工程（d）における標的核酸とプローブとの結合産物が、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエクソヌクレアーゼ加水分解により標的核酸にハイブリダイズしたプローブから遊離する第1または第2の蛍光標識の量によって検出される、〔７〕または〔８〕記載の方法、
〔１０〕該プローブが、配列番号：10の核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなる、〔２〕〜〔９〕いずれか記載の方法、
〔１１〕該プローブが配列番号：11の核酸配列またはその相補配列を有する、〔２〕〜〔１０〕いずれか記載の方法、
〔１２〕該プライマーおよび／または該プローブが、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む、〔２〕〜〔１１〕いずれか記載の方法、
〔１３〕他の標的核酸が同じ反応において検出される、〔２〕〜〔１２〕いずれか記載の方法、
〔１４〕他の標的核酸が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、西ナイルウイルスまたはヒト免疫不全ウイルス由来の核酸を含む、〔１３〕記載の方法、
〔１５〕第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーであって、第1のプライマーの核酸配列が配列番号：14であり、第2のプライマーの核酸配列が配列番号：16である、1対のプライマー、
〔１６〕相補的な核酸とのハイブリダイゼーション反応における〔１５〕記載の1対のプライマーの使用、
〔１７〕鋳型依存性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、および〔１５〕記載の1対のプライマーを含むキット
に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、生物学的試料においてパルボウイルスB19を検出することができる更なるプライマーおよびプローブが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、STS12/16のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図２】図２は、STS13/16のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図３】図３は、STS14/16のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図４】図４は、標準的なアガロースゲル電気泳動（E-Gel system, Invitrogene, Carlsbad, CA, USA）による、実施例1の実験から得られた増幅産物の解析。（レーン1： 100bpのラダーDNA；2： STS12/16：水対照；3：STS12/16：1000 IU/mLの試料；4:STS12/16： 1000 IU/mLの試料；5：STS13/16：1000 IU/mLの試料；6：STS13/16：1000 IU/mLの試料；7：STS14/16：1000 IU/mLの試料；8：STS14/16：1000 IU/mLの試料；9：空；10：100bpのラダーDNA）
【図５】図５は、STS17/18のプライマー組合せと比較した、STS14/16のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図６】図６は、標準的なアガロースゲル電気泳動（E-Gel system, Invitrogene, Carlsbad, CA, USA）による、実施例2の実験から得られた増幅産物の解析である（レーン1： 100bpのラダーDNA；2：50 IU/mLの試料：PCR陽性；3：25 IU/mLの試料：PCR陽性；4：25 IU/mLの試料：PCR陰性；5：10 IU/mLの試料：PCR陰性；6：10 IU/mLの試料：PCR陰性；7：10 IU/mLの試料：PCR陰性；8：10 IU/mLの試料：PCR陽性；9：陰性対照；PCR陰性；10: 陰性対照：PCR陰性；11：STS17/18：水対照：PCR陰性；12：100bpのラダーDNA）。
【図７】図７は、STS17/18のプライマー組合せについて、STS15プローブとともに用いた場合の、1E+04 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。
【図８】図８は、パルボウイルスB19のゲノム中の標的領域の概要図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
当技術分野の技量の範囲内である分子生物学および核酸化学の慣用の技術は文献に記載されている。例えば、Sambrook J.ら、 分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989；Gait, M. J.編, 1984; 核酸のハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）、Hames, B. D.および Higgins,S. J.編, 1984；およびシリーズ本、酵素学の方法（Methods in Enzymology）、Academic Press, Inc.を参照のこと。これら文献は、参照して本明細書に組み込まれる。上記および下記した特許、特許出願、および刊行物はすべて、参照して本明細書に組み込まれる。
【００２１】
核酸を、上記アッセイ法のいずれか1つにおいて解析する前に、さまざまな成分からなる複雑な混合物を含む生物学的試料から単離または精製する必要がある。しばしば、最初の工程として、核酸を濃縮できる方法が用いられる。細胞の内容物またはウイルス粒子を放出させるために、酵素または化学薬品で処理して、細胞壁またはウイルス粒子を溶解、分解、または変性させることができる。この方法は、一般的にリーシスと呼ばれる。その結果得られる、溶解された物質を含む溶液をライセートという。リーシスの過程でしばしば生じる問題は、目的とする成分を分解する別の酵素、例えば、核酸を分解するデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼが、リーシスの間に目的とする成分と接触する状態になることである。これらの分解酵素は、細胞の外側にも存在することもあり、または、リーシスの前には別の細胞区画の中に空間的に隔離されていたが、今や目的とする成分と接触した状態になっているという場合もある。この処理過程で放出される他の成分は、例えば、細胞にとって毒性があるため、ヒトまたは動物を治療する際に使用しようとする製品にとって問題となりうるリポ多糖類のファミリーに属するエンドトキシンなどであろう。
【００２２】
上記したこの問題に取り組むためにさまざまな手段がある。例えば、核酸を遊離させようとする場合には、グアニジウム・チオシアネート、または陰イオン性、陽イオン性、両性、もしくは非イオン性の界面活性剤などのカオトロピック剤が一般的には使用される。また、これらの酵素または不要なタンパク質を速やかに分解するプロテアーゼを使用することも有益である。しかし、これは、上記物質または酵素が、その後の工程で試薬や成分を妨害する可能性があるため、別の問題を生じる可能性もある。
【００２３】
上記したようなリーシスまたは試料調製プロセスに都合よく用いることのできる酵素は、タンパク質基質中のアミド結合を切断し、プロテアーゼまたは（互換的に）ペプチダーゼとして分類される酵素である（Walsh, 1979, 酵素反応のメカニズム（Enzymatic Reaction Mechanisms）、W. H. Freeman and Company, San Francisco、第3章参照）。先行技術において使用されてきたプロテアーゼは、例えば、アルカリ・プロテアーゼ（国際公開公報WO 98/04730号）または酸性プロテアーゼ（米国特許第5,386,024号）などである。先行技術において、核酸を単離するための試料調製を行うために広く使用されているプロテアーゼは、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）由来のプロテイナーゼK（例えば、Sambrook J.ら、分子クローニング：実験マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989参照）であるが、これは、中性pH付近で活性があり、ズブチリシンとして当業者に知られているプロテアーゼファミリーに属している。
【００２４】
リーシス工程に続く試料調製の次の工程において、目的とする成分をさらに濃縮する。目的とする非タンパク質成分が、例えば核酸である場合、通常、それらをプローブを用いたアッセイに使用する前に、複雑なリーシス混合物から抽出する。
【００２５】
核酸を抽出する方法は、いくつかある。
−配列依存的または生体特異的方法、例えば、
・アフィニティークロマトグラフィー
・固定化プローブに対するハイブリダイゼーション
−配列非依存的または物理化学的方法、例えば、
・例えばフェノール-クロロフォルムなどによる液体-液体抽出法
・例えば純粋エタノールによる沈殿
・濾紙による抽出
・セチルトリメチルアンモニウムブロミドであるミセル形成剤による抽出
・例えばアクリジン誘導体などの固定化したインターカレーター色素への結合
・シリカゲルまたは珪藻土（diatomic earths）への吸着
・カオトロピックな条件下における磁性ガラス粒子（MGP）または有機シラン粒子への吸着
【００２６】
抽出目的にとって特に興味深いのは、他の表面へも可能であるが、ガラス表面への核酸の吸着である。近年、核酸がガラス表面に結合する挙動を利用することによって、核酸を天然の環境から単離する多くの処理手順が提案されている。固定された核酸が標的である場合には、シリカ表面を有する物質に核酸を直接結合させるのが好ましい。なぜなら、他にも理由はあるが、核酸を修飾する必要がなく、天然型の核酸を結合させることもできるからである。これらの処理法は、さまざまな文書に詳細に説明されている。例えば、Vogelstein B.ら , Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-9では、アガロースゲルから取り出した核酸を、ヨウ化ナトリウム存在下で粉末化したフリントガラスに結合させる処理法が提案されている。バクテリアからのプラスミドDNAを、過塩素酸ナトリウム存在下においてガラス粉末上で精製することが、Marko M. A.ら, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387に記載されている。DE-A 37 34 442には、酢酸を用いてファージ粒子を沈殿させ、また、過塩素酸によってファージ粒子を溶解させて、1本鎖のM13ファージDNAをガラス繊維フィルター上で単離することが記載されている。ガラス繊維フィルターに結合した核酸を洗浄し、その後、メタノールを含むトリス／EDTAバッファーで溶出する。同様の処理法が、ラムダファージからDNAを精製するためにJakobi R.ら, Anal. Biochem. 175(1988) 196-201に記載されている。この処理法は、カオトロピック塩溶液においてガラス表面に核酸を選択的に結合させること、および、アガロース、タンパク質または細胞残渣などの混入物から核酸を分離することを伴う。混入物からガラス粒子を分離するために、粒子を遠心分離するか、液体をガラス繊維フィルターで濾し取ることができる。しかし、このことが、この処理法を大量の試料に利用することを妨げている制限工程である。塩およびエタノールを添加して沈殿させた後に磁性粒子を用いて核酸を固定する方がより有益であり、例えば、Alderton R. P.ら, S., Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169およびPCT GB 91/00212号に記載されている。この処理法では、核酸を磁性粒子とともに凝集させる。この凝集物を、磁場を適用して元の溶媒から分離して、洗浄工程を行う。1回の洗浄工程の後、核酸をトリスバッファーに溶解する。しかしながら、この処理法は、沈殿が核酸に対し選択的でないという点で不都合がある。それどころか、さまざまな固体および溶解された物質も同様に凝集する。その結果、この処理法は、存在するかもしれない特異的酵素反応のインヒビターを有意な量除去するために利用することはできない。磁性粒子を多孔性の特定のガラス基質中に含み、ストレプトアビジンを含む層に覆われている、磁性のある多孔性ガラスも市販されている。この製品を用いて、例えばタンパク質や核酸などの生体物質が、複雑な調製工程でビオチンに共有結合するよう修飾されていれば、それらを単離することができる。磁化できる具体的な吸着剤は、自動的な試料調製にとって非常に効率がよく適したものであることが証明された。フェリ磁性色素および強磁性色素、ならびに超常磁性色素が、この目的で使用される。最も好ましいMGP、および、磁性ガラス粒子を用いる方法は、国際公開公報WO 01/37291号に記載されており、参照して本明細書に組み込まれる。
【００２７】
標的核酸を含む核酸を天然の環境から精製または単離した後、標的核酸を検出することができる。したがって、本発明の1つの態様において、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、以下の工程
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第1のプライマー、および、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、本方法は、標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程を含まない。したがって、本発明の1つの態様において、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、以下の工程
（a）標的核酸を含んでいると推測される試料において、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第1のプライマー、および、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第2のプライマーを含む1対のプライマーの存在下、標的核酸を増幅する工程、
（b）工程（a）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む方法を提供する。
【００２９】
好ましくは、第1のプライマーは、配列番号：6または7の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーは、配列番号：8または9の核酸配列から選択された核酸配列の相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる。好ましくは、プライマーは、該核酸配列またはその相補配列の15個または18個の連続したヌクレオチドからなる。より好ましくは、第1のプライマーが、配列番号：12〜15の核酸配列からなるグループから選択された核酸配列を有し、第2のプライマーは、配列番号：16から17の核酸配列からなるグループの相補配列から選択された核酸配列を有する。これらのプライマーは、配列番号：1に記載されたアンプリコンを増幅するよう選ばれることが好ましい。
【００３０】
当技術分野において知られているように、「ヌクレオシド」は、塩基−糖を組み合わせたものである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は複素環塩基である。このような複素環塩基のもっとも一般的な２つの種類がプリンとピリミジンである。
【００３１】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む「ヌクレオシド」である。ペントフラノシル糖を含む「ヌクレオシド」では、リン酸基は、糖の2'、3'、または5'位のヒドロキシル部分に結合することができる。「ヌクレオチド」は、本明細書では、より一般的に「オリゴマー化合物」と称される「オリゴヌクレオチド」、または、より一般的に「ポリマー化合物」と称される「ポリヌクレオチド」の「モノマー単位」である。それの別の一般的表現は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）である。
【００３２】
本発明によれば、「オリゴマー化合物」は、「ヌクレオチド」のみ、または「非天然型化合物」（下記参照）でもよい「モノマー単位」からなる化合物であり、より具体的には、「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチドアナログ」）または「非天然型化合物」の単独物または混合物である。「オリゴヌクレオチド」および「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、本発明との関連では、「オリゴマー化合物」のサブグループである。
【００３３】
本発明との関連において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、「モノマー単位」としての複数の「ヌクレオチド」から形成される「ポリヌクレオチド」を意味する。すなわち、「オリゴヌクレオチド」は、「モノマー単位」を有するデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）の「オリゴマー化合物」または「ポリマー化合物」のサブグループに属する。リン酸基は、一般的に、「オリゴヌクレオチド」のヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。RNAおよびDNAの正常な結合または骨格は、3'から5'へのホスホジエステル結合である。
【００３４】
「オリゴヌクレオチド」および「修飾オリゴヌクレオチド」（下記参照）は、本発明によれば、主に当技術分野において記載され、当業者に知られているとおりに合成することができる。特異的配列のオリゴマー化合物を調製する方法は、当技術分野において既知であり、例えば、適当な配列をクローニングおよび制限酵素切断することや直接化学合成法などがある。化学合成法には、例えば、Narang S. A.ら Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98に記載されたホスホトリエステル法、Brown E. L.,ら, Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151に開示されているホスホジエステル法、Beaucageら, Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859に開示されているホスホルアミダイト法、Gareggら, Chem. Scr. 25 (1985) 280-282に開示されているH-ホスホン酸法、および米国特許第4,458,066号に開示されている固形支持体法などがある。
【００３５】
上記した通り、「標的核酸」同様、「核酸」も、当業者に知られているように「ヌクレオチド」のポリマー化合物である。本明細書においては、解析すべき試料中の「核酸」を意味するのに使用される。すなわち、試料中における存在、非存在、または量を決定すべきものである。したがって、換言すれば、「核酸」は標的であるから、「標的核酸」と標記することも可能である。例えば、血液にパルボウイルスB19が含まれているか否かを決定すべき場合、「標的核酸」は、パルボウイルスB19の核酸である。本明細書において、「核酸配列の相補的（核酸）配列」という用語は、言及された相補的（核酸）配列が、厳密に核酸配列の（逆の）相補体であることを意味する。
【００３６】
「プライマー」という用語は、本明細書において、当業者に知られている通りに使用され、「オリゴマー化合物」、主には「オリゴヌクレオチド」を意味するが、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるDNA合成を「プライム」させることができる「修飾オリゴヌクレオチド」をも意味する。すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの3'末端は、デオキシヌクレオシド3リン酸を使用し、ピロリン酸を放出する3'から5'へのホスホジエステル結合を成立させる鋳型依存性DNAポリメラーゼによって「ヌクレオチド」をさらに付着させることができる遊離3'-OH基を提供する。したがって、本発明によれば、「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」または「プローブ」の間には、目的とする機能以外に基本的な違いはない。
【００３７】
本明細書において、明らかに別段の意味を示さない限り、単数形の「a」、「an」および「the」は、単数形および複数形の両方を意味する。
【００３８】
本明細書において使用する場合、「含む(comprising)」という用語は、ある方法における列挙した工程の前に置かれている場合には、その方法が、明示的に記載された工程に追加される1つ以上の工程を含むこと、および、その追加的な1つ以上の工程を、記載された工程の前、間、および／または後に行うことができることを意味する。例えば、工程a、b、およびcを含む方法は、工程a、b、x、およびcからなる方法、工程a、b、c、およびxからなる方法、ならびに工程x、a、b、およびcからなる方法を包含する。さらに、「含む」という用語が、ある方法における工程を記載する前に置かれている場合には、その内容が明らかに別段であることを示さない限り、記載された工程を連続して行うことを必要とするものではない（但し、可能ではある）。例えば、工程a、b、およびcを含む方法は、例えば、工程a、c、およびbの順序で、工程c、b、およびaの順序で、および工程c、a、およびbの順序等で工程を行う方法を包含する。
【００３９】
増幅は、好ましくは、標的核酸を検出可能量まで特異的に増幅するポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる。これ以外に可能な増幅反応は、リガーゼ連鎖反応（LCR; Wu D. Y. および Wallace R. B., Genomics 4 (1989) 560-69; およびBarany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193）；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Barany F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16）；Gap-LCR（国際公開公報WO 90/01069号）；修復連鎖反応（Repair Chain Reaction）（欧州特許第0439182 A2号）、3SR（Kwoh D. Y.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; GuatelliJ. C.,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878；国際公開公報WO 92/08808号)、およびNASBA（米国特許第5,130,238号）である。さらに、鎖置換増幅法（SDA）、転写介在増幅法（TMA）、およびQβ増幅法がある（概説については、例えば、Whelen A. C. and Persing D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson R. D. and Myers T. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41-47を参照）。
【００４０】
適当なDNA検出法は当業者に知られており、Sambrook J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、およびAusubel F.ら: 分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）1987, J. Wiley and Sons, NYなど、標準的な教科書に記載されている。また、例えば、沈殿工程など、DNA検出工程の前に更なる精製工程を行うことも可能である。検出方法には、2本鎖DNAの中にインターカレートして、その後の蛍光を変化させるエチジウムブロマイドなどの特異的色素を結合またはインターカレートさせることが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製されたDNAは、制限酵素切断およびその後可視化した後に、場合によっては、電気泳動法によって分離することもできる。また、特異的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、その後のハイブリッド検出とを利用するプローブによるアッセイ法もある。当業者に既知である更なる工程の後、DNAの配列を決定することも可能である。好ましい鋳型依存性DNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼである。
【００４１】
したがって、本発明の好ましい態様は、決定または検出の工程が引き続き行われる上記精製法、または、増幅および決定または検出する工程が引き続き行われる精製法である。
【００４２】
本発明の別の態様において、
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブに接触させる工程、
（e）標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸が存在することを示す指標として検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法において、
第1のプライマーが、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、および/または
プローブが、配列番号：5の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること
を特徴とする方法が提供される。
【００４３】
好ましくは、該方法は、標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程を含まない。したがって、本発明の別の態様において、
（a）標的核酸を含んでいると推測される試料において、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む1対のプライマーの存在下、核酸を増幅する工程、
（b）プローブが標的核酸に結合する条件下で、工程a）の試料をプローブに接触させる工程、
（c）標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸が存在することを示す指標として検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法において、
第1のプライマーが、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、および/または
プローブが、配列番号：5の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること
を特徴とする方法を提供する。
【００４４】
「プローブ」という用語は、設計または選択により、規定された所定のストリンジェンシー下で特異的に（すなわち優先的に）「標的核酸」に自らをハイブリダイズさせることができる特異的ヌクレオチド配列を含む、合成的または生物学的に産生される核酸核酸（DNAまたはRNA）を意味する。「プローブ」は、標的核酸を「捕捉」して、検出を曖昧にするかもしれない不要な物質から標的核酸を分離できるようにすることを意味する「捕捉用プローブ」として同定することもできる。分離が行われれば、適当な処理法を用いて、捕捉された「標的核酸」の検出を行うことができる。「捕捉用プローブ」は、しばしば、すでに固相に結合されている。
【００４５】
本発明に係る方法において、プローブは、好ましくは、配列番号：10の核酸配列、またはその相補配列の少なくとも12個連続したヌクレオチドからなる。好ましくは、プローブは、本発明に係る核酸配列の少なくとも15または18個連続したヌクレオチドからなる。より好ましくは、プローブは、配列番号：11の核酸配列、またはその相補配列を有する。
【００４６】
本発明に係る方法の好ましい態様において、第1のプライマーは、配列番号：6または7の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーは、配列番号：8または9の核酸配列から選択された核酸配列の相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる。本発明のより好ましい態様において、第1のプライマーは、配列番号：12〜15の核酸配列のグループから選択された核酸配列を有し、第2のプライマーは、配列番号：16から17の核酸配列のグループの相補配列から選択された核酸配列を有する。好ましくは、これらのプライマーは、配列番号：1に記載された核酸配列をもつアンプリコンを増幅できるように選ばれる。
【００４７】
本発明に係る方法は、米国特許第6,174,670号に記載されているLightCycler（登録商標）装置で使用するための方式で行ない得る。この方式は、増幅と検出を含み、後者は、1対のプローブと標的核酸の間の結合産物を検出するための蛍光検出を利用する。これらの方式は、蛍光共鳴エネルギー転移技術を適用し（例えば、米国特許第4,996,143号、第5,565,322号、第5,849,489号、および第6,162,603号参照）、また、供与体および対応する受容体である蛍光標識が、互いに一定の距離内に位置すると、可視化できるか、検出および／または定量できる2つの蛍光標識の間にエネルギー転移が起こるという事実に基づいている。本明細書において、それぞれ蛍光標識を含む2つのプローブは、少なくともそれらの一方が本発明に係るオリゴヌクレオチドであるが、標的核酸に対するプローブの相補性によって決まる特定の位置で増幅産物とハイブリダイズすることができる。本発明に係るオリゴヌクレオチドの発明に係る蛍光標識は、供与体または受容体の蛍光標識であろう。プローブが、適当な位置で増幅産物にハイブリダイズすると、FRETシグナルが発生する。蛍光解析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡装置（特定の範囲で蛍光発光を観察するために適当なダイクロイックミラーおよびフィルターを含む）、光子計数光電子増倍管装置、または蛍光光度計を用いて行うことができる。エネルギー転移を起こすための励起は、アルゴン・イオン・レーザー、高輝度水銀（Hg）アークランプ、光ファイバー光源、またはその他、所望の範囲で励起するために適当にフィルターされた高輝度光源によって行うことができる。本明細書において、供与体または対応する受容体の蛍光標識に関して用いられる場合、「対応する」は、供与体の蛍光標識の発光スペクトルと重複する励起スペクトルを有する受容体の蛍光標識を意味する。したがって、効率的な非放射性エネルギー転移が、これらの間で生じうる。好ましい蛍光標識は、供与体蛍光標識としてフルオロセイン、それにより受容体の蛍光標識はローダミンであるが、好ましいのは、米国特許第6,174,670号に記載されているようなシアニン色素であり、好適にはCy5である。
【００４８】
しばしば「レポーター基」とも称される「標識」は、通常、核酸、特に、本発明に係る「オリゴマー化合物」または「修飾オリゴヌクレオチド」、およびそれらに結合している核酸を、液体中すなわち試料中の残余の物から区別できるようにする基である（「標識」を結合している核酸も、標識された核酸結合化合物、標識されたプローブ、または単にプローブと名付けることが可能である）。本発明に係る好ましい標識は、例えば、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、およびクマリン色素などの蛍光色素である蛍光標識である。
【００４９】
本明細書において使用する場合、「蛍光共鳴エネルギー転移関係」および同様の用語は、「供与体である蛍光標識」によって標識された「オリゴヌクレオチド」と「受容体である蛍光標識」によって標識された別の「オリゴマー化合物」とが、「標的核酸」に隣り合ってハイブリダイズして、「供与体である蛍光標識」が、共鳴エネルギーを「受容体である蛍光標識」に転移することができ、「受容体である蛍光標識」が、測定可能な蛍光発光を発生させる結果になることを意味する。「供与体である蛍光標識」および「受容体である蛍光標識」が、大きすぎる距離をおいて離れている場合には、「供与体である蛍光標識」が、共鳴エネルギーを「受容体である蛍光標識」に転移して、「受容体である蛍光標識」に測定可能な蛍光を発光させることができないため、「供与体である蛍光標識」と「受容体である蛍光標識」は、蛍光共鳴エネルギー転移関係にはない。
【００５０】
本発明の好ましい態様において、プローブは標識を担持する。好ましくは、工程d）で、標識を担持するさらなるプローブを試料に接触させて、第1および第2のプローブからなる1対のプローブを、工程d）において試料と接触させる。
【００５１】
本発明の好ましい態様において、本発明に係る方法における上記増幅工程c）が、試料を上記1対のプライマーに接触させて、もし標的核酸が該試料中に存在すれば増幅産物をもたらす工程を含み、上記ハイブリダイゼーション工程d）が、該試料を1対のプローブと接触させる工程であって、該1対のプローブの構成プローブが上記増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されている工程を含み、および、工程e）において、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出することによって、標的核酸と1対のプローブとの結合産物が検出され、蛍光共鳴エネルギー転移が存在することが、試料中に標的核酸が存在することの指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移が存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことの指標である、本発明に係る方法が提供される。
【００５２】
したがって、本発明の一つの態様において、試料中におけるパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸の存在の有無を検出する方法であって、増幅工程およびハイブリダイゼーション工程を含む1回以上のサイクル工程を行う工程であって、該増幅工程が、該試料を、1つのプライマーが本発明に係るオリゴヌクレオチドであるプライマーに接触させて、該試料中に標的核酸が存在すれば増幅産物をもたらすことを含み、該ハイブリダイゼーション工程が、該試料を、1対のプローブの構成プローブが該増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されており、1つのプローブは、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよいという1対のプローブと接触させることを含む、1回以上のサイクル工程を行う工程；および、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出する工程であって、FRETが存在することが、試料中に標的核酸が存在することを示し、FRETが存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことを示すものである工程を含む方法が提供される。
【００５３】
本発明の別の好ましい態様において、試料中におけるパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、1方のプローブが、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよい、標的核酸の隣接領域にハイブリダイズする2つの核酸プローブであって、該プローブの一方が蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光標識によって標識されており、もう一方のプローブが蛍光エネルギー転移対の供与体蛍光標識によって標識されていて、この2つのプローブが標的核酸にハイブリダイズすると、受容体蛍光標識と供与体蛍光標識が互いに25ヌクレオチドの範囲内の位置に来る2つの核酸プローブの存在下において、ポリメラーゼ連鎖反応であって、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および、1つのプライマーが本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよい、標的核酸に対するプライマーを試料に加える工程、および、試料を、少なくとも変性温度と伸長温度の間を熱サイクルさせる工程を含むポリメラーゼ連鎖反応によって核酸を増幅する工程；供与体蛍光標識によって吸光される波長の光によって生体試料を励起する工程；および蛍光エネルギー転移対からの蛍光発光を検出する工程を含む方法が提供される。
【００５４】
本発明の別の好ましい態様において、試料中におけるパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、1方のプローブが、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよい、核酸の隣接領域にハイブリダイズする2つの核酸プローブであって、該プローブの一方が蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光標識によって標識されており、もう一方のプローブが蛍光エネルギー転移対の供与体蛍光標識によって標識されていて、この2つのプローブが標的核酸にハイブリダイズすると、受容体蛍光標識と供与体蛍光標識が互いに25ヌクレオチドの範囲内の位置に来る2つの核酸プローブの存在下において、ポリメラーゼ連鎖反応であって、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および、1つのプライマーが本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよい、標的核酸に対するプライマーを試料に加える工程、および、試料を、少なくとも変性温度と伸長温度の間を熱サイクルさせる工程を含むポリメラーゼ連鎖反応によって核酸を増幅する工程；供与体蛍光標識によって吸光される波長の光によって生体試料を励起する工程；および蛍光エネルギー転移対からの温度依存的発光を観察する工程を含む方法が提供される。
【００５５】
本発明に係る方法の好ましい態様において、登録商標TaqManアッセイ法で使用される方式が考えられる。この方式は、増幅と検出を含み、後者は、プローブと標的核酸の結合産物を検出するための蛍光検出を利用する。したがって、プローブは、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよいが、好ましくは蛍光標識、好ましくはフルオレセインである標識を含む。このプローブは、さらに、1つの蛍光標識の発光波長が、別の蛍光標識の吸光波長と重なる別の蛍光標識を含むことが可能である。好ましくは、プローブは、消光剤として作用し、フルオレセインであってもよい蛍光標識の蛍光発光を消光する第2の蛍光標識をさらに含む。好ましくは、消光剤は、蛍光性のローダミンまたはシアニンである。また、消光物質は、ダブシル（dabcyl）である非蛍光性の化合物または色素（「ダーククエンチャー」）でもよい。主に米国特許第5,210,015号、第5,478,972号、または第5,804,375号に記載されているように、TaqMan（登録商標）方式では、プローブを酵素によって伸長させてプローブとして使用することはできない。好ましくは、オリゴマー化合物の3'末端にあるモノマー単位は、2',3'-ジデオキシヌクレオチドまたは3'-リン酸化ヌクレオチドである。その結果、TaqMan（登録商標）アッセイ法で使用される方式では、その方法の測定工程において、ハイブリダイゼーション後における蛍光標識と第2の標識、すなわち消光物質との空間関係が、好ましくは、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、好適にはTaqポリメラーゼによるプローブのエキソヌクレアーゼによる加水分解によって変化し、エキソヌクレアーゼ加水分解の結果として標識の遊離が起こる。そのため、本発明に係る方法において、工程c）における標的核酸が、鋳型依存性DNAポリメラーゼによって増幅される。本発明に係るオリゴマー化合物と核酸との間におけるハイブリダイゼーションの程度は、ハイブリダイゼーション後にプローブから遊離する標識の量によって測定される。このように、工程（d）において、核酸にハイブリダイズしたプローブから、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ加水分解によって遊離する標識の量によってハイブリダイゼーションの程度を測定することが本発明の好ましい態様である。
【００５６】
したがって、より好ましくは、本発明に係るオリゴヌクレオチドであってもよいプローブは、第1および第2の標識を担持する。もっとも好ましい態様において、ハイブリダイゼーションの程度、またはプローブと標的核酸との結合産物は、工程（e）において、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ加水分解によって、標的核酸にハイブリダイズしたプローブから遊離する第1または第2の蛍光標識の量によって測定される。
【００５７】
より詳細にTaqMan（登録商標）アッセイ方式に関係する本発明の非常に好ましい態様において、試料中におけるパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（a）1本鎖核酸を含む試料を、標的核酸の一領域に相補的な配列を含むプライマーまたはオリゴヌクレオチドを、第1および第2の蛍光標識を含むプローブであって、同じ標的核酸配列鎖に第2の領域の相補的な配列を含むが、上記プライマーまたはオリゴヌクレオチドによって確定される核酸配列は含まないプローブに接触させて、ハイブリダイゼーション条件の中で、第1のプライマーまたはオリゴヌクレオチドの3'末端が、プローブの5'末端よりも上流になるように、プライマーまたはオリゴヌクレオチド、およびプローブにアニールした標的核酸を含む二重鎖の混合物を作り出す工程、
（b）アニールしたプローブを切断し、標識された断片を遊離させる、ポリメラーゼの5'から3'方向ヌクレアーゼ活性を十分に可能にする条件の下で、5'から3'方向ヌクレアーゼ活性を有する工程（a）の混合物を維持する工程、ならびに
（c）標識された断片の遊離を検出および／または測定する工程
を含む方法が提供される。
【００５８】
上記方法では、核酸は、2本鎖または1本鎖の形で存在することが可能であり、2本鎖核酸は、この方法が加熱すなわち熱変性によって行われる前に、変性、すなわち1本鎖になる。
【００５９】
別の好ましい態様において、プライマーおよび／またはプローブを化学的に修飾することができる。すなわち、プライマーおよび／またはプローブは、修飾ヌクレオチドまた非ヌクレオチド化合物を含む。すると、このプローブまたはプライマーは修飾オリゴヌクレオチドとなる。
【００６０】
「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチドアナログ」）は、何らかの修飾がある点で天然型の「ヌクレオチド」と異なるが、依然として、塩基、ペントフラノシル糖、リン酸部位、塩基様、ペントフラノシル様糖、およびリン酸様部位、またはこれらをの組み合わせからなる。例えば、「標識」は、「ヌクレオチド」の塩基部位に結合し、それにより、「修飾ヌクレオチド」が得られる。「ヌクレオチド」における天然の塩基も、例えば7-デアザプリンによって置換することができ、それにより、同じように「修飾ヌクレオチド」が得られる。「修飾ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」という用語は、本出願においては同義的に使用される。「修飾ヌクレオシド」（または「ヌクレオシドアナログ」）は、「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチドアナログ」）について上記したように、何らかの修飾がある点で天然型のヌクレオシドとは異なる。
【００６１】
「非ヌクレオチド化合物」は、天然型の「ヌクレオチド」とは異なるが、本発明の意図するところでは、「ヌクレオチド」同様、依然として、「オリゴマー化合物」の「モノマー単位」となりうる。したがって、「非ヌクレオチド化合物」は、「ヌクレオチド」とともに「オリゴマー化合物」を形成することができなければならない。「非ヌクレオチド化合物」であっても、塩基様部位、ペントフラノシル様糖部位、およびリン酸様部位を含むことが可能であるが、それらのすべてが、「非ヌクレオチド化合物」の中に同時に存在するわけではない。
【００６２】
「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、「モノマー単位」として、1つ以上の「ヌクレオチド」、1つ以上の「非ヌクレオチド化合物」または「修飾ヌクレオチド」を有する、別の特異的な「オリゴマー化合物」サブグループに属する。したがって、「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）という用語は、「オリゴヌクレオチド」と実質的に類似した様式で機能する構造物を意味し、本出願全体で同義的に使用される。合成という観点から見ると、「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、例えば、リン酸骨格、リボース単位、またはヌクレオチド塩基を適当に修飾することによって、「オリゴヌクレオチド」を化学修飾して作成することができる（Uhlmannおよび Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; Verma S. およびEckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67(1998) 99-134）。代表的な修飾には、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合の代わりにヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホトリエステル結合、またはホスホルアミデート結合；天然型のプリン塩基およびピリミジン塩基の代わりにデアザまたはアザプリンおよびデアザまたはアザピリミジン、5位または6位に置換基を有するピリミジン塩基；2位、6位または8位に、または7-デアザプリンとして7位に改変された置換基を有するプリン塩基；例えば2'位に置換基を有する糖、または炭素環式もしくは非環式の糖アナログなどがある。本発明の趣旨に合致するその他の修飾は、当業者に知られている。このような「修飾オリゴヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、もっともよく表現をすれば、天然型の「オリゴヌクレオチド」（または、自然な線に沿って合成「オリゴヌクレオチド」）と機能的に同義であるが、構造的には異なるものである。より詳しくは、修飾例が、Verma S.およびEckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134または国際公開公報第02/12263号に開示されている。さらに、ヌクレオシド間のリン酸結合または糖リン酸結合に代わる基を介してヌクレオシド単位が結合されているという修飾を作出することも可能である。このような結合には、Verma S.およびEckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134に開示されている結合が挙げられる。リン酸結合以外のものを利用して、ヌクレオシド単位を結合する場合、そのような構造物も、「オリゴヌクレオシド」とされてきた。
【００６３】
別の好ましい態様は、さまざまな標的核酸、好適にはさまざまなウイルスの多重検出法に関連する。そのため、本発明の好ましい態様において、同一の反応において他の標的核酸を検出する本発明に係る方法が提供される。好ましくは、その他の標的核酸は、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヒト免疫不全ウイルス、または、例えば、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）またはクラミジア感染症などの細菌感染症の原因となる細菌性病原菌由来の核酸を含む。
【００６４】
本発明の別の態様において、オリゴヌクレオチドの核酸配列が、配列番号12から15の核酸配列から、核酸配列10もしく11またはその相補配列から、または核酸配列16もしく17の相補配列から選択されるオリゴヌクレオチドが提供される。本発明の好ましい態様において、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む本発明に係るオリゴヌクレオチドが提供される。
【００６５】
本発明の別の態様において、第1のプライマーの核酸配列が、核酸配列番号12から15より選択され、第2のプライマーの核酸配列が、核酸配列番号16または17の相補配列から選択される第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーが提供される。
【００６６】
本発明に係るオリゴヌクレオチドまたは1対のプライマーを、相補的な核酸とともにハイブリダイゼーション反応に使用することができる。本発明の別の態様において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、プライマー、プローブ、または捕捉用プローブとして使用することができる。
【００６７】
別の好ましい態様において、3'から5'方向エキソヌクレアーゼ活性をもつ鋳型依存性ポリメラーゼ、好適にはTaqポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド、または本発明に係る1対のプライマーを含む、部分からなるキットが、本発明によって意図されている。本発明の別の態様において、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド、または本発明に係る1対のプライマーを含むキットが提供される。
【００６８】
当技術分野において知られているこのようなキットは、例えば、96穴または384穴のウェル方式になっているマイクロタイタープレート、または、例えば、ドイツ国ハンブルグにあるEppendorf（Eppendorf, Hamburg, Germany）によって製造されている全く通常の反応用チューブなど、増幅処理過程で使用することができるプラスチック製品、および、本発明に係る方法を行うためのその他すべての試薬をさらに含む。
【００６９】
本発明の別の態様において、キットは、核酸を単離するための試薬をさらに含む。そのため、このキットは、核酸に親和性をもつ物質をさらに含むことができ、好ましくは、核酸に対して親和性のある物質は、シリカ表面をもつ材料を含む。好ましくは、シリカ表面をもつ材料はガラスである。最も好ましくは、核酸に対して親和性のある物質は、国際公開公報第96/41811号または第01/37291号に記載されているような磁性ガラス粒子を含む組成物である。このキットは、更にまたは付加的に、例えば、カオトロピック剤、界面活性剤、またはアルコール、またはそれらの混合物を含み、細胞を溶解させるリーシス用バッファー、および、それとは別に、不必要なタンパク質を分解するための、例えばプロテイナーゼKなどのプロテアーゼを含む。本発明に係るキットのこれらの成分は、チューブまたは保存用容器に入れて別々に提供することができる。成分の性質に応じて、これらを1つのチューブまたは保存用容器に入れて提供することも可能である。このキットは、更にまたは付加的に、DNAまたはRNAが磁性ガラス粒子に結合したときに、それらを洗浄する工程に適した洗浄用溶液を含むことが可能である。この洗浄用溶液は、上記したようにエタノールおよび／またはカオトロピック剤なしで酸性pHをもつ緩衝溶液または溶液の中にエタノールおよび／またはカオトロピック剤を含むことが可能である。しばしば、洗浄用溶液またはその他の溶液は、使用前に希釈しなければならない貯蔵溶液として提供される。このキットは、更にまたは付加的に、溶出剤または溶出用バッファー、すなわち、磁性ガラス粒子に結合したDNAもしくはRNAを溶出するための溶液もしくはバッファー（例えば10 mM Tris、1 mM EDTA、pH 8.0）、または純水を含むことができる。さらに、核酸、すなわちDNAまたはRNAの精製処理に使用することができる更なる試薬または緩衝溶液が存在してもよい。
【００７０】
本発明の好ましい態様は、本発明に係る方法またはキットを、例えば国際公開公報第99/16781号に記載されているような自動化可能な方法において使用することである。自動化可能な方法とは、当該方法の工程が、人間による外部的な制御または影響を殆どまたは全く用いることなく操作できる装置または機械によって実施するのに適していることを意味する。自動化された方法とは、自動化可能な方法の工程が、人間による外部的な制御または影響を殆どまたは全く用いることなく操作できる装置または機械によって実施されることを意味する。この方法のための準備工程だけは、人の手で行う必要があるかもしれない。例えば、貯蔵容器を補充して正しい位置に置かなければならないし、試料の選択や、例えば、制御用コンピュータの操作など当業者に知られた更なる工程なども人間が行わなければならない。上記装置または機械は、例えば、自動的に液体を加え、試料を混合し、または特定の温度でインキュベーション工程を実行することができる。一般的には、このような機械または装置は、単一の工程およびコマンドが特定されているプログラムを実行するコンピュータによって制御される自動装置である。好ましい自動化法は、方法および使用される機械または装置が、試料を短時間に大量に処理するために最適化されているという意味のハイスループット方式で行われる方法である。本発明の別の態様おいて、本発明に係る方法またはキットは、いくつかの反応工程を人手によって処理しなければならないという意味の半自動化処理において使用される。本発明の好ましい態様において、本発明に係るMGPを含む懸濁液を貯蔵容器から取り出し、部分容量をさまざまな反応用容器に加える。反応用容器は、プラスチックで作られていて、最終的には、反応を行うことができる96個または384個またはそれ以上の個数のウェルを含むマイクロタイタープレート方式である反応用チューブでもよい。しかし、これらの容器は、別の材料、例えばスチールで作られていてもよい。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、本発明に係るキットは、研究、生物分析、または診断に使用される。本発明に係る好ましい態様において、本発明に係るキットまたは方法は、ハイスループット方式、すなわち非常に多数の異なった試料を非常に短時間で解析することができる自動化された方法で使用される。
【００７２】
以下の実施例、参考文献、配列表、および図面は、本発明の理解を助けるために提供するものであって、その真の範囲は、付随の特許請求の範囲に記載されている。当然ながら、本発明の趣旨を逸脱することなく、記載された処理に変更を加えることができる。
【実施例】
【００７３】
実施例−核酸検査法によるパルボウイルスB19の検出
一般：
200μLの標本投入量で、製造者の指示に従ってCOBAS AmpliPrep装置上で全核酸単離（TNAI）キット（どちらもRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany）を用いて、EDTA血漿、クエン酸血漿、およびヒト血漿の試料調製を行なった。次に、50μLの溶出液を人手によって特別のPCR用チューブ（k-チューブという）に移して、50μLのPCR反応用混合液と混ぜた。核酸の増幅および検出を、以下のPCRプロフィールを用いてCOBAS TaqMan解析装置（Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany）上で動的PCRにより行った。
【００７４】
【００７５】
実施例1
さまざまなプライマーの組み合わせの比較
NS1遺伝子の高度に保存された領域を含むTaqManプローブ（STS15）を設計した。このプローブは、配列番号11の5'-CCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATCAT-3'（Shade R.O. ら, J. Virol. 58 (1986) 921-936に記載されたヌクレオチド番号（nt）2070-2095）を有する。最近傍法（Nearest Neighbor Method）を適用した場合（OLIGO, Molecular Biology Insights, Inc, CO, USA）、このプローブの融解温度（Tm）は約80℃である。次に、以下
・Tm 59〜63℃、
・最近になって発見された新変異株を含む、公開されたエリスロウイルスの配列（Nguyen Q. T.ら, Virology 301 (2002)374-80；Servant A.ら, J. Virol. 76 (2002) 9124-34）とミスマッチが全くないか、より少ない、
・誤ったプライミングがより少ない、
・プライマーがAまたはCで終る、
の基準に適合するようプライマー配列を設計した。
【００７６】
以下の配列が適当であると見なされ、合成された。
STS12（フォワードプライマー）：5'-GTGGTGAAAGCTCTGAAGAA-3'（配列番号12）
STS13（フォワードプライマー）：5'-GAAACCCCGCGCTCTA-3'（配列番号13）
STS14（フォワードプライマー）：5'-AAACCCCGCGCTCTAGTA-3'（配列番号14）
STS17（フォワードプライマー）：5'-GAAACCCCGCGCTCTAGTAC-3'（配列番号15）
STS16（リバースプライマー）：5'-TTCCATCCATTATACCAAGC-3'（配列番号16）
STS18（リバースプライマー）：5'-CCCAACTAACAGTTCACGAA-3'（配列番号17）
【００７７】
プライマーの組み合わせSTS12/16、STS13/16、STS14/16、およびSTS17/18の性能を、プローブSTS15、および50 mMトリシンpH 8.3、100 mM酢酸カリウム、3 mM酢酸マンガン、4 % グリセロール、300μM dATP、300μM dCTP、300μM dGTP、50μM dTTP、500μM dUTP、10 Uウラシル-N-グリコシラーゼ、40 U Z05ポリメラーゼ、200 nM NTQ21-46A-アプタマー、400 nMの各プライマー、および100 nMプローブからなるPCR反応用混合液を用いて評価した。500および1000 IU/mLのパルボウイルスB19 DNAからなる試料を、COBAS AmpliPrep装置上でTNAIキットを用いて処理した。その後、50μLの対応する溶出液を、k-チューブ内で2倍の反応用混合液と混合し、増幅／検出を行うためにCOBAS TaqMan解析装置内に置いた。
【００７８】
図1から3は、STS12/16、STS13/16、およびSTS14/16というプライマーの組合せについて、1000 IU/mLの試料から得られた溶出液に基づく動的PCR増幅曲線を示す。垂直線は、増幅曲線が閾値と交差した時、すなわち、明確かつ特異的なシグナルを初めて検出できた時を示す。これら垂直線とX軸とが交わる点がサイクル閾値（ct）値と決定され、標的配列の投入濃度と直接に比例する。ct-値が低くなるほど、開始時の標的コピーの投入量が多い。ここに示したプライマーの組み合わせSTS14/16が、ct-値が低いことから判断すると優れているように思われる。
【００７９】
図4は、アガロースゲル電気泳動による対応するアンプリコンの解析結果を示している。所定のプライマー組み合わせによるPCR反応が、非特異的配列の交差反応または増幅を全く示さないか、より少なくしか示さないことを実証している。
【００８０】
第２のリバースプライマーであるSTS18を、フォワードプライマーSTS17とともに評価し、上記の通りの反応用混合液およびPCRプロトコルを用いて、このプライマーの組み合わせをSTS14/16と比較した。試料として、500 IU/mLの標本の反復抽出物から得られた溶出液を用いた。図5は、これら2つのプライマー組み合わせを比較した結果を示している。ここから明らかなように、STS17/18が、ct-値を基準にすると誤差がより少ないとともに最も低いct-値を含むため、これを、以後の実験で使用することに決めた。
【００８１】
実施例2
プライマーSTS17、STS18、およびプローブSTS15による分析感度
感度を測定するために、パルボウイルスB19 DNAの世界保健機関による基準物質（国立生物学的製剤研究所[NIBSC]の第1回国際標準2000パルボウイルスB19 DNA 500000 IU/mL；コード番号99/800）をEDTA血漿に1000〜10 IU/mLに連続希釈したものを、200μlの標本投入量で上記抽出法を用いて12回反復して処理した。50μLの溶出液を、人手にてk-チューブに移し、50μlの活性化MMxと混合し、その後、PCRのために取り出した（詳細については、実施例1参照）。Probit解析アルゴリズムによると、感度は、ヒット率（hitrate）95％で26 IU/mLであることが分かった。表1は、この実験の結果をまとめたもので、対応する投入濃度におけるヒット率を示している。図6は、選択した増幅産物のアガロースゲル電気泳動解析の結果を示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
実施例3
異なったプライマーの組み合わせによる精密試験
STS17/18のプライマー組み合わせによる精密度を、STS15プローブとともにSTS14/16の組み合わせと比較して評価した。上記処理を行った後、異なる２日間に46回反復して1E4 IU/mLのPelispy Parvo-B19 DNA操作対照（VQC Laboratory, Alkmaar, NL）を抽出した。上記実施例1に記載したような動的PCRによって溶出液を解析した。ct-値を基準にした全体のCVは、STS17/18のプライマー組み合わせの場合には2.18％であることが分かったが、STS14/16の組み合わせでは4.89％のCVを含む（表2）。
【００８４】
【表２】
【００８５】
実施例4
異なったプライマーの組み合わせによる特異性試験
異なったプライマーの組み合わせと、パルボウイルスB19ゲノムのNS1遺伝子内に位置するプローブSTS15とで特異性を評価した。実施例1から一般的な処理法（反応混合液、PCRプロトコル）を採用した。ドイツ赤十字の献血センター（Munich, BRD）から新鮮な通常の献血の供給を受けて、上記したように抽出した。以下の表3は、この解析結果を示し、調べた組み合わせのすべてについて特異性が100％であることを示している。
【００８６】
【表３】
【００８７】
実施例5
PCRの精密さに対する反応用混合組成物の影響
この実験の目標は、反応用混合組成物が、パルボウイルスB19のNS1領域を標的とするPCR反応の精密さに対して有意な影響を及ぼすか否かを解析することであった。上記実施例4に記載した反応用混合液、および2種類の市販されている調製済み反応用混合液（COBAS TaqMan Generic DNA増幅用キット、COBAS TaqMan Generic RNA増幅用キット）に、STS17/18のプライマー組み合わせ（各最終濃度0.4μM）およびSTS15プローブ（最終濃度0.1μM）を加えた。実施例3に記載した1E4 IU/mLのPelispy Parvo-B19 DNA操作対照を、各反応用混合液あたり20回反復して抽出し、実施例1に従って解析した。図7は、CVが4.4％である市販のDNA反応用混合液、およびCVが2.3％である実験室内調製反応用混合液と比較すると、市販のRNA反応用混合液が、最も低い0.5％というCVから判断して最も優れた精密度とともに最も低いct-値を含んでいることを示している（表4）。
【００８８】
パルボウイルスB19のゲノム内の標的領域を調べた結果を図8に示す。
【表４】
【００８９】
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【００９０】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第1のプライマー、および、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法。
［２］第1のプライマーが、配列番号：6または7の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：8または9の核酸配列から選択された核酸配列の相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる、［１］記載の方法。
［３］第1のプライマーが、配列番号：12〜15の核酸配列の群から選択される核酸配列を有し、第2のプライマーが、配列番号：16または17の核酸配列の群の相補配列から選択される核酸配列を有する、［１］または［２］記載の方法。
［４］（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、
（d）プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブに接触させる工程
（e）標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸が存在することを示す指標として検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法において、
第1のプライマーが、配列番号：2の核酸配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが、配列番号：3または4の核酸配列の相補配列から選択された核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、および/または
プローブが、配列番号：5の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなること、
を特徴とする、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法。
［５］プローブが標識を担持する、［４］記載の方法。
［６］工程d）において、標識を担持するさらなるプローブを試料と、工程d）において第1および第2のプローブからなる1対のプローブが試料と接触するように接触させる、［５］記載の方法。
［７］前記増幅工程c）が、試料を前記1対のプライマーに接触させて、もし標的核酸が試料中に存在すれば増幅産物をもたらす工程を含み、前記ハイブリダイゼーション工程d）が、該試料を1対のプローブと接触させる工程であって、該1対のプローブの構成プローブが前記増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されている工程を含み、
工程e）において、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出することによって、標的核酸と1対のプローブとの結合産物が検出され、蛍光共鳴エネルギー転移が存在することが、試料中に標的核酸が存在することの指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移が存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことの指標である、［６］記載の方法。
［８］該プローブが第1および第2の標識を担持する、［４］記載の方法。
［９］工程c）における標的核酸(nucleic)が鋳型依存性DNAポリメラーゼにより増幅される、［４］〜［８］いずれか記載の方法。
［１０］工程（e）における標的核酸とプローブとの結合産物が、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエクソヌクレアーゼ加水分解により、標的核酸にハイブリダイズしたプローブから遊離する第1または第2の蛍光標識の量によって検出される、［８］または［９］いずれか記載の方法。
［１１］該プローブが配列番号：10の核酸配列またはその相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる、［４］〜［１０］いずれか記載の方法。
［１２］該プローブが配列番号：11の核酸配列またはその相補配列を有する、［４］〜［１１］いずれか記載の方法。
［１３］第1のプライマーが配列番号：6または7の核酸配列より選択される核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなり、第2のプライマーが配列番号：8または9の核酸配列より選択される核酸配列の相補配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドからなる、［４］〜［１２］いずれか記載の方法。
［１４］第1のプライマーが配列番号：12〜15の核酸配列の群より選択される核酸配列を有し、第2のプライマーが配列番号：16または17の核酸配列の群の相補配列より選択される核酸配列を有する、［４］〜［１３］いずれか記載の方法。
［１５］該プライマーおよび／または該プローブが修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む、［４］〜［１４］いずれか記載の方法。
［１６］他の標的核酸が同じ反応物において検出される、［４］〜［１５］いずれか記載の方法。
［１７］他の標的核酸がA型肝炎ウィルス、B型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルス、西ナイルウィルスまたはヒト免疫不全ウィルス由来の核酸を含む、［１６］記載の方法。
［１８］核酸配列が、配列番号：12〜15の核酸配列、10、11の核酸配列もしくはその相補配列、または16もしくは17の核酸配列の相補配列より選択される、オリゴヌクレオチド。
［１９］修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む、［１９］記載のオリゴヌクレオチド。
［２０］第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーであって、第1のプライマーの核酸配列が配列番号：12〜15の核酸配列より選択され、第2のプライマーの核酸配列が16または17の核酸配列の相補配列より選択される、1対のプライマー。
［２１］相補的な核酸とのハイブリダイゼーション反応における［１８］または［１９］いずれか記載のオリゴヌクレオチドまたは［２０］記載の1対のプライマーの使用。
［２２］プライマー、プローブまたは捕捉用プローブとしての［１８］または［１９］いずれか記載のオリゴヌクレオチドの使用。
［２３］鋳型依存性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、および［１８］もしくは［１９］いずれか記載のオリゴヌクレオチドまたは［２０］記載の1対のプライマーを含むキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：１４の核酸配列からなる第1のプライマー、および配列番号：１６の核酸配列からなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、ならびに
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法。
【請求項２】
(c1)プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブと接触させる工程
を工程(c)と工程(d)の間にさらに含み、
ここで、工程(d)が、標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸の存在の指標として検出する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プローブが、配列番号：５の核酸配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
プローブが標識を担持する、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
工程d）において、標識を担持するさらなるプローブを試料と接触させ、その結果、工程d）において第1および第2のプローブからなる1対のプローブが試料と接触する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記増幅工程c）が、試料を前記1対のプライマーに接触させ、標的核酸が試料中に存在する場合に増幅産物をもたらす工程を含み、前記工程d）が、該試料を1対のプローブと接触させる工程であって、該1対のプローブの構成プローブが前記増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されている工程を含み、そして、工程d）において、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出することによって、標的核酸と1対のプローブとの結合産物を検出する、ここで、蛍光共鳴エネルギー転移が存在することが、試料中に標的核酸が存在することの指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移が存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことの指標である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該プローブが第1および第2の標識を担持する、請求項２または３記載の方法。
【請求項８】
工程c）における標的核酸が鋳型依存性DNAポリメラーゼにより増幅される、請求項２〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
工程（d）における標的核酸とプローブとの結合産物が、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエクソヌクレアーゼ加水分解により標的核酸にハイブリダイズしたプローブから遊離する第1または第2の蛍光標識の量によって検出される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
該プローブが、配列番号：10の核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなる、請求項２〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
該プローブが配列番号：11の核酸配列またはその相補配列を有する、請求項２〜１０いずれか記載の方法。
【請求項１２】
該プライマーおよび／または該プローブが、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む、請求項２〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
他の標的核酸が同じ反応において検出される、請求項２〜１２いずれか記載の方法。
【請求項１４】
他の標的核酸が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、西ナイルウイルスまたはヒト免疫不全ウイルス由来の核酸を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーであって、第1のプライマーの核酸配列が配列番号：14であり、第2のプライマーの核酸配列が配列番号：16である、1対のプライマー。
【請求項１６】
相補的な核酸とのハイブリダイゼーション反応における請求項１５記載の1対のプライマーの使用。
【請求項１７】
鋳型依存性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、および請求項１５記載の1対のプライマーを含むキット。
【請求項１】
（a）標的核酸を含むと推測される試料を提供する工程、
（b）配列番号：１４の核酸配列からなる第1のプライマー、および配列番号：１６の核酸配列からなる第2のプライマーを含む1対のプライマーを提供する工程、
（c）標的核酸を増幅する工程、ならびに
（d）工程（c）の増幅された標的核酸を検出する工程
を含む、試料中のパルボウイルスB19の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法。
【請求項２】
(c1)プローブが標的核酸に結合する条件下で、試料をプローブと接触させる工程
を工程(c)と工程(d)の間にさらに含み、
ここで、工程(d)が、標的核酸とプローブとの結合産物を、標的核酸の存在の指標として検出する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プローブが、配列番号：５の核酸配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
プローブが標識を担持する、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
工程d）において、標識を担持するさらなるプローブを試料と接触させ、その結果、工程d）において第1および第2のプローブからなる1対のプローブが試料と接触する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記増幅工程c）が、試料を前記1対のプライマーに接触させ、標的核酸が試料中に存在する場合に増幅産物をもたらす工程を含み、前記工程d）が、該試料を1対のプローブと接触させる工程であって、該1対のプローブの構成プローブが前記増幅産物に互いに5ヌクレオチド以下の範囲内でハイブリダイズし、該1対のプローブの第1のプローブが、供与体蛍光標識によって標識されており、該1対のプローブの第2のプローブが、対応する受容体蛍光標識によって標識されている工程を含み、そして、工程d）において、該第1のプローブの該供与体蛍光標識と該第2のプローブの該受容体蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の有無を検出することによって、標的核酸と1対のプローブとの結合産物を検出する、ここで、蛍光共鳴エネルギー転移が存在することが、試料中に標的核酸が存在することの指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移が存在しないことが、試料中に標的核酸が存在しないことの指標である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該プローブが第1および第2の標識を担持する、請求項２または３記載の方法。
【請求項８】
工程c）における標的核酸が鋳型依存性DNAポリメラーゼにより増幅される、請求項２〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
工程（d）における標的核酸とプローブとの結合産物が、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエクソヌクレアーゼ加水分解により標的核酸にハイブリダイズしたプローブから遊離する第1または第2の蛍光標識の量によって検出される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
該プローブが、配列番号：10の核酸配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドまたはその相補配列からなる、請求項２〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
該プローブが配列番号：11の核酸配列またはその相補配列を有する、請求項２〜１０いずれか記載の方法。
【請求項１２】
該プライマーおよび／または該プローブが、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む、請求項２〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
他の標的核酸が同じ反応において検出される、請求項２〜１２いずれか記載の方法。
【請求項１４】
他の標的核酸が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、西ナイルウイルスまたはヒト免疫不全ウイルス由来の核酸を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
第1および第2のプライマーを含む1対のプライマーであって、第1のプライマーの核酸配列が配列番号：14であり、第2のプライマーの核酸配列が配列番号：16である、1対のプライマー。
【請求項１６】
相補的な核酸とのハイブリダイゼーション反応における請求項１５記載の1対のプライマーの使用。
【請求項１７】
鋳型依存性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、および請求項１５記載の1対のプライマーを含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２７９３７０（Ｐ２０１０−２７９３７０Ａ）
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５９６５３（Ｐ２０１０−１５９６５３）
【出願日】平成２２年７月１４日（２０１０．７．１４）
【分割の表示】特願２００６−５５１８２２（Ｐ２００６−５５１８２２）の分割
【原出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１４日（２０１０．７．１４）
【分割の表示】特願２００６−５５１８２２（Ｐ２００６−５５１８２２）の分割
【原出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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