本発明は、Ｎ末端メチオニン（又は１つ若しくはそれ以上の他のアミノ酸残基）を含有するβアミロイドタンパク質の組み換え形態のクローニング、発現及び単離並びに、治療用抗体の作製において、治療用小分子の同定において、及び診断アッセイの実施においてこの組み換えタンパク質を使用する方法に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ末端メチオニン（及び／又は１つ若しくはそれ以上の他のアミノ酸残基を）を含有するアミロイドβタンパク質の組み換え形態のクローニング、発現及び単離並びにこれらの組み換えタンパク質を用いた方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドβ（１−４２）タンパク質（Ａβ（１−４２）とも称される。）は、１−３９、１−４０、１−４１、１−４２及び１−４３の残基長にわたるタンパク質のファミリーである。１−４２形態は、アルツハイマー及びダウン症候群患者の脳内において、タンパク質、脂質、炭水化物及び塩から構成される不溶性細胞外沈着（老人斑又は神経突起斑）の中心成分である（Ｍａｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８２， ４２４５−４２４９， １９８５）。特に、アミロイドβ（１−４２）及び類似の誘導体タンパク質は、タンパク質分解プロセッシングによって、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由来する、４２アミノ酸を有するポリペプチドである。これには、ヒトバリアントに加えて、ヒト以外の生物、特に、他の哺乳動物、特にラット中に存在するアミロイドβ（１−４２）タンパク質のイソフォームも含まれる。水性環境中で重合する傾向があるこのタンパク質は、極めて異なる分子形態で存在し得る。
【０００３】
例えば、アルツハイマー病などの認知症疾患の発生又は進行と、不溶性タンパク質の沈着との単純な相関は、疑わしいことが判明している（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３０．５７２−５８０（１９９１），Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ １６，２８５−２９８（１９９５））。これに対して、シナプスの喪失及び認知知覚は、Ａβ（１−４２）の可溶性形態とよりよく相関するようである（Ｌｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５，８５３−８６２（１９９９）；ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６，８６０−８６６（１９９９））。
【０００４】
Ａβ（１−４２）の可溶性形態については、アルツハイマー病などの認知症疾患を引き起こすと推定される分子形態に関して、本質的に２つの異なる仮説が存在する。第一に、Ａβ（１−４２）前原繊維（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）の細胞毒性作用が推定されている。Ａβ（１−４２）前原繊維は、１５０から２５０ｋＤａの範囲の分子量を有するなお可溶性の、比較的高度に凝集された繊維性Ａβ（１−４２）形態であり（Ａｒｉｓｐｅ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９０，５６７（１９９３），Ｌａｓｈｕｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８，２９１（２００２））、孔形成特性のために、神経細胞の膜を通じた制御されないカルシウム流入を引き起こすようである。第二に、１５から３０ｋＤａの範囲の分子量を有するオリゴマーＡβ（１−４２）誘導体が記載されている（Ｍ．Ｐ．Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９５，６４４８−６４５３（１９９８））。アミロイド由来拡散性及び痴呆性リガンド又はＡＤＤＬ（ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｒｉｖｅｄ， ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｄｅｍｅｎｔｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）とも称されるこれらの非繊維性オリゴマー（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，５０６；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ０１／１０９００；及びＬａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ、上記）は、海馬切片中の神経細胞の長期増強の速度に対して阻害的影響を示す調製物中に見出すことができる。しかしながら、オリゴマー関する従来の研究状況は、実際に関与している種がほとんど不明であることを特徴とする。文献中の情報は、大幅に異なっている。例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，５０６は、３から１２個のサブユニットを有するＡＤＤＬを記載するのに対して、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ０１／１０９００に記載されているＡＤＤＬは、最大２４のサブユニットを有し得る（Ｌｕｈｒｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０２（４８），１７３４２−１７３４７（２００５）も参照されたい。）。
【０００５】
さらに、アルツハイマー病に関連して、Ａβ（１−４２）タンパク質のＮ末端切断形態が発生することが報告されている。早くも１９８５年に、死亡したアルツハイマー病患者の脳の沈着内に、Ａβ（１−４２）以外に、Ｎ末端切断された形態も検出された（Ｃ．Ｍａｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８２，４２４５−４２４９（１９８５））。従って、ネプリリシン（ＮＥＰ２４．１１）又はＩＤＥ（インシュリン分解酵素の略号）など、脳内に存在する特定のプロテアーゼが、Ａβ（１−４２）を分解できることも知られている（Ｄ．Ｊ． Ｓｅｌｋｏｅ，Ｎｅｕｒｏｎ ３２，１７７−１８０，（２００１））。しかしながら、アルツハイマー病の発病におけるＮ末端切断形態の重要性は、明確でない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＪＢＳ ２７８，４４５８−４４６６（２００３））。興味深いことに、散発性若しくは家族性アルツハイマー病又はダウン症候群に罹患している患者には、これらの末端切断された形態を優先的に蓄積している者がいる（Ｊ． Ｎａｓｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ ９１，８３７８−８３８２，（１９９４），Ｃ．Ｒｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０５，５３１−５３２，（２０００），Ｔ．Ｃ．Ｓａｉｄｏ ｅｔ ａｌ， Ｎｅｕｒｏｎ １４， ４５７−４６６，（１９９５））。比較的最近の研究によって（Ｓｅｒｇｅａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８５，１５８１−１５９１，（２００３））、死亡したアルツハイマー患者の脳内の全ての不溶性Ａβペプチドの６０％が、Ｎ末端切断された形態に基づいていることが示された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記に照らして、ヒトにおけるアルツハイマー病の検出に関連する研究及び得られるアッセイ、さらに重要なことには、アルツハイマー病の予防又は治療用の生物試薬及び小分子の開発における研究及び得られるアッセイの要求を満たすために、（様々な形態の）アミロイドβタンパク質の大量を生産することが確実に必要とされている。さらに、このような生産は、アルツハイマー病の発病に関連するタンパク質の特性に関するさらなる研究を可能とする。従って、このタンパク質を、十分な量で、及び自然状態類似の機能的な形態で産生する方法は、極めて高い価値を有する。
【０００７】
さらに、インビトロでの従来の研究は、ペプチドの天然切断点から生じる化学的に合成された配列に依存してきた。また、インビボでの研究は、通例、天然の切断点での切断から生じたことが自明である、生物学的に合成されたアミロイドβに依拠している。従って、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物組み換え系内で自然状態及び変異体アミロイドペプチドの大量を生産する能力を有することは、現存する生産方法より確実に好ましい。
【０００８】
本明細書に引用されている全ての特許及び公報は、参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、式［Ｘ＋Ｙ］によって表されるタンパク質に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する精製されたβ−アミロイドタンパク質（「Ｘ」は、メチオニン、バリン及びロイシンからなる群から選択される、前記タンパク質のアミノ末端に位置する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含み、並びに「Ｙ」は、自然の（ｎａｔｉｖｅ）アミロイドβタンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部を含む。）を包含する。特に、「Ｙ」は、自然状態のβアミロイドタンパク質の３９から４３の連続するアミノ酸を含み得る。「Ｙ」は、自然状態のβアミロイドタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する公知のヒト家族性変異バリアントも含む。アルツハイマー病前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の配列の番号付けに基づいて、これらのヒト家族性変異体には、Ｇｌｕ６６５Ａｓｐ（Ｐｅａｃｏｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９４ Ａｐｒ；３５（４）：４３２−８）；Ｌｙｓ／Ｍｅｔ６７０／Ａｓｎ／Ｌｅｕ（スウェーデン）（Ｍｕｌｌａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９２ Ａｕｇ；１（５）：３４５−７）；Ａｌａ６７３Ｔｈｒ（Ｐｅａｃｏｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９９３ Ｊｕｎ；４３（６）：１２５４−６）；Ｈｉｓ６７７Ａｒｇ（Ｊａｎｓｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００３ Ｊａｎ ２８；６０（２）：２３５−９）；Ａｓｐ６７８Ａｓｎ（Ｗａｋｕｔａｎｉ， ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００４ Ｊｕｌ；７５（７）：１０３９−４２）；Ａｌａ６９２Ｇｌｙ（フランドル）（Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００２ Ａｕｇ １；１６１（２）：５０７−５２０）；Ｇｌｕ６９３Ｇｌｙ（北極）Ｋａｍｉｎｏ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９２ Ｎｏｖ；５１（５）：９９８−１０１４）；Ｇｌｕ６９３Ｇｌｎ（オランダ）（Ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ， ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９０ Ｊｕｎ １；２４８（４９５９）：１１２０−２）；Ｇｌｕ６９３Ｌｙｓ（イタリア）（Ｔｓｕｂｕｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ．２００３ Ｊｕｎ ７；３６１（９３７３）：１９５７−８）；Ａｓｐ６９４Ａｓｎ（アイオワ）（Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；４９（６）：６９７−７０５）；Ａｌａ７１３Ｔｈｒ（Ｃａｒｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９２ Ｄｅｃ；２（４）：２５５−６）；Ａｌａ７１３Ｖａｌ（Ｊｏｎｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９２ Ｊｕｌ；１（４）：３０６−９）が含まれるが、これらに限定されない。上述のように、「Ｘ」は、例えば、メチオニンであり得る。
【００１０】
さらに、本発明は、式［Ｘ＋Ｙ］によって表されるタンパク質に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するβ−アミロイドタンパク質をコードする単離された核酸分子（「Ｘ」は、メチオニン、バリン及びロイシンからなる群から選択される、前記タンパク質のアミノ末端に位置する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含み、並びに「Ｙ」は、自然のアミロイドβタンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部を含む。）を含む。「Ｘ」及び「Ｙ」は、上に定義されているとおりであり得る。本発明は、単離された核酸分子を含むベクター及びこのベクターを含む宿主細胞も含む。
【００１１】
さらに、本発明は、式［Ｘ＋Ｙ］によって表されるタンパク質に対して少なくとも７０％の酸配列同一性を有する精製されたβ−アミロイドタンパク質を作製する方法（「Ｘ」は、メチオニン、バリン及びロイシンからなる群から選択される、前記タンパク質のアミノ末端に位置する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含み、並びに「Ｙ」は、自然のアミロイドタンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部を含む。）を包含する。本方法は、ａ）上記β−アミロイドタンパク質をコードする核酸分子をベクター中に形質移入する段階；及びｂ）宿主細胞による前記β−アミロイドタンパク質の発現に十分な時間及び条件下で、段階ａ）の前記ベクターを宿主細胞中に形質転換する段階を含む。宿主細胞が、原核細胞（例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）又はラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）又は真核細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞又は哺乳動物細胞）であり得る。
【００１２】
また、本発明は、上述のように、β−アミロイドタンパク質のＭｅｔ形態に結合し、及び／又はβ−アミロイドタンパク質のＭｅｔ形態に対して産生された単離された抗体を含む。前記抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体であり得る。好ましくは、抗体は、モノクローナルであり、及びヒト又はヒト化されている。本抗体は、少なくとも０．５０μＭの特異的結合定数（Ｋ_ｄ）、−３０ｋＪ／モル超の結合エンタルピー及び／又は少なくとも１つの抗体／アミロイド球状凝集体の抗体／アミロイド球状凝集体結合比を有し得る。（本抗体は、抗原の非Ｍｅｔ形態（例えば、Ａβ（１−４２）又はＡβ（１−４０））にも結合し得ることに留意することが重要である。）。
【００１３】
さらに、本発明は、アルツハイマー病の治療又は予防を必要としている患者において、アルツハイマー病を治療又は予防する方法を含む。この方法は、治療又は予防を実施するのに十分な量で、上記単離された抗体を患者に投与することを含む。抗体は、例えば、筋肉内、静脈内又は皮下など、あらゆる適切な治療経路によって投与され得る。
【００１４】
さらに、本発明は、１）反平行鎖内配置で配向された残基１９から２１及び残基３０から３２並びに２）平行鎖間配置で配向された残基３４から３８を含む単離されたＭｅｔ−β−アミロイドペプチドオリゴマーを含む。このオリゴマーは、Ｆ１９（ＮＨ）−Ｉ３２（ＮＨ）、Ｆ１９（ＮＨ）−Ｉ３２（ＨＢ）、Ｆ１９（ＮＨ）−Ｉ３２（ＨＧ＃＃）、Ａ２１（ＮＨ）−Ａ３０（ＮＨ）、Ａ２１（ＮＨ）−Ａ３０（ＨＢ＃）、Ａ２１（ＮＨ）−Ｉ３１（ＨＤ１＃）、Ａ２１（ＮＨ）−Ｉ３１（ＨＧ１＃）、Ｉ３２（ＮＨ）−Ｆ１９（ＨＤ１＃）、Ｉ３２（ＮＨ）−Ｆ１９（ＨＢ＃）及びＡ３０（ＮＨ）−Ａ２１（ＨＢ＃）からなる群から選択される原子対に対して、約１．８から６．５オングストローム内の分子内プロトン間距離を有するＡ−β（１−４２）ペプチドも含む。
【００１５】
本発明は、さらに、単離されたＭｅｔ−β−アミロイドペプチドオリゴマーを含み、該オリゴマーは、Ｇ３３（ＮＨ）−Ｇ３４（ＮＨ）、Ｍ３５（ＮＨ）−Ｖ３６（ＮＨ）、Ｇ３７（ＮＨ）−Ｇ３８（ＮＨ）、Ｇ３３（ＮＨ）−Ｖ１８（ＣγＨ_３）、Ｖ１８（ＮＨ）−Ｖ１８（ＣγＨ_３）、Ｌ３４（ＮＨ）−Ｌ３４（Ｃ_δＨ_３）、Ｍ３５（ＮＨ）−Ｖ３６（ＣγＨ_３）、Ｇ３８（ＮＨ）−Ｖ３９（（ＣγＨ_３）及びＶ３９（ＮＨ）−Ｖ３９（（ＣγＨ_３）からなる群から選択される原子対に対して、約１．８から５．５オングストローム内のペプチド鎖Ａとペプチド鎖Ｂ間の分子間プロトン間距離を有するＡ−β（１−４２）ペプチドを含む。このオリゴマーは、少なくとも残基１９から２１及び３０から３２を含む分子内反平行βシートも含み、原子対｛Ｆ１９ＣＯ，Ｉ３２Ｎ｝、（Ｉ３２ＣＯ，Ｆ１９Ｎ｝、｛Ａ２１ＣＯ，Ａ３０Ｎ｝及び｛Ａ３０ＣＯ，Ａ２１Ｎ｝が、３．３±０．５Åの距離であり、ＣＯが、骨格酸素原子を示し、及び前記残基のファイ（φ）角度が−１８０から−３０の範囲であり、及び前記残基のプサイ（ψ）角度が、約６０から１８０又は約−１８０から−１５０の範囲である。
【００１６】
さらに、本発明は、単離されたＭｅｔ−β−アミロイドオリゴマーであり、前記オリゴマーは、少なくとも２つのβ−アミロイドペプチド（標識されたＡ及びＢ）の少なくとも残基３４から３８を含む分子間平行βシートを含み、以下の原子対｛Ｇ３３ＣＯ（Ａ），Ｌ３４Ｎ（Ｂ）｝，｛Ｌ３４ＣＯ（Ｂ），Ｍ３５Ｎ（Ａ）｝，｛Ｍ３５ＣＯ（Ａ），Ｖ３６Ｎ（Ｂ）］，｛Ｖ３６ＣＯ（Ｂ），Ｇ３７Ｎ（Ａ）｝，及び｛Ｇ３７ＣＯ（Ｂ），Ｇ３８Ｎ（Ａ）｝（ＣＯは、骨格酸素原子を示す。）が、３．３±０．５Åの距離であり、及び前記残基のファイ（φ）角度が−１８０から−３０の範囲であり、及び前記残基のプサイ（ψ）角度が６０から１８０又は−１８０から−１５０の範囲である、前記単離されたβ−アミロイドオリゴマーを含む。
【００１７】
さらに、本発明は、少なくとも１つのβ−アミロイドＮ−Ｍｅｔ１−４２オリゴマーに結合する別の単離された抗体を含む。このオリゴマーは、例えば、（ａ）少なくとも残基１９から２１及び３０から３２を含む分子内反平行βシート（以下の原子対は、｛Ｆ１９ＣＯ，Ｉ３２Ｎ｝、（Ｉ３２ＣＯ，Ｆ１９Ｎ｝、｛Ａ２１ＣＯ，Ａ３０Ｎ｝及び｛Ａ３０ＣＯ，Ａ２１Ｎ｝（ＣＯは、骨格酸素原子を示す。）が、３．３±０．５Åの距離であり、及び前記残基のファイ（φ）角度が−１８０から−３０の範囲であり、及び前記残基のプサイ（ψ）角度が、６０から１８０又は−１８０から−１５０の範囲である。）並びに（ｂ）少なくとも２つのβ−アミロイドペプチド（標識されたＡ及びＢ）の少なくとも残基３４から３８を含む分子間平行β−シート（以下の原子対｛Ｇ３３ＣＯ（Ａ），Ｌ３４Ｎ（Ｂ）｝，｛Ｌ３４ＣＯ（Ｂ），Ｍ３５Ｎ（Ａ）｝，｛Ｍ３５ＣＯ（Ａ），Ｖ３６Ｎ（Ｂ）｝，｛Ｖ３６ＣＯ（Ｂ），Ｇ３７Ｎ（Ａ）｝及び｛Ｇ３７ＣＯ（Ｂ），Ｇ３８Ｎ（Ａ）｝（ＣＯは、骨格酸素原子を示す。）が、３．３±０．５Åの距離であり、及び前記残基のファイ（φ）角度が−１８０から−３０の範囲であり、及び前記残基のプサイ（ψ）角度が、６０から１８０又は−１８０から−１５０の範囲である。）からなる群から選択され得る。この抗体−オリゴマー複合体は、図２０及び２１に示されている何れかの物理的に許容される立体構造を含む少なくとも２つのＮ−Ｍｅｔ１−４２βアミロイドペプチドを含む三次元構造を有し得る。（この抗体は、抗原の非Ｍｅｔ形態に、並びにＭｅｔ及び非Ｍｅｔ形態の末端切断された部分にも結合し得る。）
【００１８】
さらに、本発明は、上記単離されたβアミロイドタンパク質の少なくとも２つを含む精製されたＭｅｔ含有球状凝集体及び精製された球状凝集体に結合する単離された抗体を含む。
【００１９】
診断的使用に関連して、本発明は、アルツハイマー病を有することが疑われている患者において、アルツハイマー病を診断する方法を含む。本方法は、ａ）患者から生物学的試料を単離する段階；ｂ）球状凝集体／抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で、単離された抗体の１つ又はそれ以上と生物学的試料を接触させる段階；及びｃ）前記試料中の球状凝集体／抗体複合体の存在を検出する段階を含み、複合体の存在が、患者中のアルツハイマー病の診断を示唆する。
【００２０】
本発明は、アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断する方法であり、ａ）前記患者から生物学的試料を単離する段階；ｂ）抗体／球状凝集体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、球状凝集体のＭｅｔ含有形態と、前記生物学的試料を接触させる段階；ｃ）結合された抗体へコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が結合するのに十分な時間及び条件下で、得られた抗体／球状凝集体複合体にコンジュゲートを添加する段階（前記コンジュゲートは、検出可能なシグナルを発生することができるシグナル生成化合物に付着された抗体を含む。）；並びにｄ）前記シグナル生成化合物によって発生されたシグナルを検出することによって、前記生物学的試料中に存在し得る抗体の存在を検出する段階を含み、前記シグナルが、前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す、前記方法も含む。
【００２１】
本発明は、アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断するさらなる方法であり、ａ）前記患者から生物学的試料を単離する段階；ｂ）抗体／精製された球状凝集体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、上記球状凝集体のＭｅｔ含有形態と、前記生物学的試料を接触させる段階；並びにｃ）前記試料中の前記抗体／精製された球状凝集体複合体の存在を検出する段階を含み、複合体の存在が、前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す、前記方法を含む。
【００２２】
さらに、本発明は、アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断する別の方法であり、ａ）前記患者から生物学的試料を単離する段階；抗抗体／抗体複合体の形成を可能とするのに十分な時間及び条件下で、前記試料中の抗体に特異的な抗抗体と、前記生物学的試料を接触させる段階；ｂ）結合された抗体へコンジュゲートが結合するのに十分な時間及び条件下で、得られた抗抗体／抗体複合体にコンジュゲートを添加する段階（前記コンジュゲートは、検出可能なシグナルを発生することができるシグナル生成化合物に付着されたＭｅｔ含有球状凝集体を含む。）；並びにｃ）前記シグナル生成化合物によって発生されたシグナルを検出する段階を含み、前記シグナルが、前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す、前記方法を含む。
【００２３】
本発明は、上記精製されたＭｅｔ−β−アミロイドタンパク質及び医薬として許容されるアジュバントを含むワクチンも含む。さらに、本発明は、精製されたＭｅｔ−β−アミロイドタンパク質に対して産生された抗体又は該タンパク質に結合する抗体及び医薬として許容されるアジュバントを含むワクチンを含む。
【００２４】
さらに、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療を必要としている患者において、アルツハイマー病を予防又は治療する方法であり、前記予防又は治療を実施するのに十分な量で、前記患者に、上記ワクチンを投与する段階を含む、前記方法も含む。
【００２５】
さらに、本発明は、アルツハイマー病の治療又は予防のための化合物を同定する方法を含む。本方法は、ａ）前記１つ又はそれ以上の化合物が前記精製された球状凝集体に結合し、又は中和するのに十分な時間及び条件下で、上記精製されたＭｅｔ含有球状凝集体に、目的の１つ又はそれ以上の化合物を曝露する段階；及びｂ）前記精製された球状凝集体に結合し、又は中和する化合物を同定する段階を含み、前記同定された化合物がアルツハイマー病の治療又は予防において使用される、前記方法を含む。
【００２６】
さらに、本発明は、患者中のアルツハイマー病の治療又は予防において有用な小分子を設計する方法を含む。本方法は、ａ）上記精製されたＭｅｔ含有球状凝集体、上記単離されたＭｅｔ含有β−アミロイドペプチドオリゴマー又は単離されたＭｅｔ含有β−アミロイドタンパク質組成物の集合などのタンパク質の三次元構造を分析する段階；ｂ）段階ａ）の前記選択されたタンパク質の表面上に１つ又はそれ以上のエピトープを同定する段階；及びｃ）段階ｂ）の同定された１つ又は複数のエピトープに結合する小分子を設計する段階（前記小分子は、アルツハイマー病の治療又は予防において使用される。）を含む。
【００２７】
本発明は、アルツハイマー病の治療又は予防において使用されるべきモノクローナル抗体を同定する方法も含む。本方法は、ａ）前記モノクローナル抗体の１つ又はそれ以上の前記球状凝集体への結合及び球状凝集体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、上記精製されたＭｅｔ含有球状凝集体をモノクローナル抗体のライブラリーに曝露する段階；ｂ）前記球状凝集体／抗体複合体の存在を同定する段階；及びｃ）前記複合体内の１つ又はそれ以上の抗体の正体を決定する段階（前記１つ又はそれ以上の抗体は、アルツハイマー病の治療又は予防において使用される。）を含む。
【００２８】
さらに、本発明は、安定化を実施するのに十分な時間（すなわち、１から２時間）及び量（すなわち、５％の水性懸濁液又は溶液）で、アルキル鎖界面活性剤又は脂質を前記試料に添加する段階を含む、Ｍｅｔ含有（又は非Ｍｅｔ含有）アミロイドβ（１−４２）オリゴマー又はその一部の試料を安定化させる方法を含む。
【００２９】
本発明は、上記単離されたアミロイドβタンパク質の少なくとも２つを含む精製されたＭｅｔ含有球状凝集体も含む。
【００３０】
さらに、本発明は、図２１に示されているタンパク質のアミノ酸残基Ｅ２２−Ｄ２３−Ｖ２４−Ｇ２５−Ｓ２６−Ｎ２７−Ｋ２８に結合する単離された抗体を包含する。本発明は、エピトープ自体も含む。この配列は、Ｋ２８の後にＧ２９をさらに含み得る。さらに、本発明は、Ａ２１の位置から始まる図２１のタンパク質の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の連続するアミノ酸を含む。さらに、このエピトープは、上記Ａβタンパク質のＭｅｔ形態の他に、Ａβ（１−４２）タンパク質及びＡβ（１−４０）の非Ｍｅｔ形態中に見出され得ることに留意すべきである。
【００３１】
さらに、本発明の小ペプチドなどの小ペプチドのイー・コリ中での発現は、微生物内に天然のプロテアーゼが存在するために、急速に分解すると予想されることに留意しなければならない。しかしながら、本発明は、アミロイドβタンパク質のメチオニン形態は、宿主細胞中で発現した際に、完全に無傷の状態を保つことを示し、産生されるタンパク質が、ＡＰＰとして知られるアミロイド前駆体タンパク質中にコードされている正確なアミノ酸配列を含有するというさらなる特徴を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、アミロイドβタンパク質の組換え形態及びその製造方法に関する。より具体的には、本発明は、式［Ｘ＋Ｙ］によって表されるアミロイドβタンパク質を含む（「Ｘ」は、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）及びロイシン（Ｌｅｕ）からなる群から選択される、前記タンパク質のアミノ酸配列のアミノ又はＮ末端に位置する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含む。）。好ましくは、「Ｘ」は、Ｍｅｔを含む。
【００３３】
さらに、「Ｙ」は、アミノ末端の「Ｘ」アミノ酸を除く、ペプチド内のアミノ酸の数を表す。特に、「Ｙ」は、３９から４３の整数を表し、及び自然状態のアミロイドβ（１−４２）アミノ酸配列の一部又は全部を表す。本アミノ酸配列は、自然の１から４２配列内の任意のアミノ酸「数」又は位置（例えば、アミノ酸１、アミノ酸５、アミノ酸１２、アミノ酸２２、アミノ酸３５など）で開始し得、自然配列内の何れかのアミン酸数又は位置で終了し得るが、但し、選択される自然のアミノ酸の総数は３８から４３の範囲である。本発明のタンパク質の他の特性には、図Ｘ−Ｙに示される抗体への結合能が含まれる。結合特性は、１）０．５０μＭ未満又は０．５０μＭに等しいＫｄ；２）−３０ｋＪ／モルより大きい好ましい結合エンタルピー（負のデルタＨ）；及び３）少なくとも１つの抗体／アミロイド球状凝集体の抗体／アミロイド結合比である。
【００３４】
本発明のアミノ酸配列又はタンパク質に加えて、本発明は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性を含み、対応し、同一であり、又は相補的であるアミノ酸配列も含む。（同じく、７０％と１００％の間の全ての整数（及びその一部）は、パーセント同一性に関して、本発明の範囲に属するとも考えられる。）
【００３５】
本発明は、本発明のタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列並びに、これらのコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性を含み、対応し、同一であり、又は相補的であるアミノ酸配列も包含することに留意すべきである。（７０％と１００％の間の全ての整数（及びその一部）は、パーセント同一性に関して、本発明の範囲に属するとも考えられる。）このような配列は、あらゆる源に由来することができ、天然源から単離され、半合成経路を介して産生され、又は新規に合成される。特に、このような配列は、実施例に記載されている源とは別の源（例えば、細菌、真菌、藻類、マウス又はヒト）から単離され又は由来し得る。
【００３６】
本発明において、ヌクレオチド配列の「断片」は、特定のヌクレオチド配列の領域に相当する、およそ、少なくとも６、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの連続する配列として定義される。
【００３７】
「同一性」という用語は、特定の比較枠又はセグメントにわたる、ヌクレオチドごとの２つの配列の関連性を指す。従って、同一性は、２つのＤＮＡセグメント（又は２つのアミノ酸配列）の同じ鎖（センス又はアンチセンスの何れか）間の、同一性、対応性又は同等性の程度として定義される。「配列同一性の％」は、特定の領域にわたり２つの最適にアラインされた配列を比較し、一致している位置の数を得るために両配列において同一の塩基又はアミノ酸はある位置の数を調べ、このような位置の数を比較しているセグメント中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることにより計算される。Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法により、及び、関連するアルゴリズムを実行するコンピュータプログラムにより（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｍａｃａｗ Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、配列の最適アラインメントを行い得る。（米国特許第５，９１２，１２０号参照）。
【００３８】
本発明において、「相補性」は、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の程度として定義される。これは、二重らせんを形成するために、適切な条件下で、一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリド形成する能力を測定することにより決定される。「相補的である」とは、規範的な塩基対形成規則に基づきある一定の配列に対して対を形成する配列として定義される。例えば、あるヌクレオチド鎖中の配列Ａ−Ｇ−Ｔは、他方の鎖のＴ−Ｃ−Ａに対して「相補的」である。
【００３９】
二重らせんにおいて、アデニンが一方の鎖に現れ、チミンが他方の鎖に現れる。同様に、グアニンが一方の鎖で見られる場合は常に、他方でシトシンが見られる。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きいほど、２つのＤＮＡセグメントの鎖間でのハイブリッド二本鎖形成能が大きくなる。
【００４０】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、一連の同一ならびに保存的アミノ酸残基が両配列において存在することとして定義される。２つのアミノ酸配列間の類似性の程度が高いほど、２つの配列の、対応性、同一性又は同等性が高くなる。（２つのアミノ酸配列の間の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、一連の正確に等しい又は不変のアミノ酸残基が両配列において存在することとして意義される。）。「相補性」、「同一性」及び「類似性」の定義は、当業者にとって周知である。
【００４１】
「によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、このポリペプチド配列又はその一部は、その核酸配列によりコードされるポリペプチド由来の、少なくとも３アミノ酸、より好ましくは少なくとも８アミノ酸及びさらにより好ましくは少なくとも１５アミノ酸のアミノ酸配列を含有する。
【００４２】
さらに、核酸分子は、核酸分子の１本鎖形態が温度及びイオン強度の適切な条件下でその他の核酸分子とアニールすることができる場合、別の核酸分子にハイブリド形成可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリド形成の「ストリンジェンシー」を定める。
【００４３】
「ハイブリド形成」という用語は、本明細書で使用する場合、当業者にとって容易に明らかになるであろうように、プローブ配列及び標的配列の性質に依存して、ストリンジェンシーの適切な条件での核酸のハイブリド形成を意味するために通常使用される。ハイブリド形成及び洗浄の条件は当技術分野で周知であり、温置時間、温度及び／又は溶液のイオン強度を変化させることによる、所望のストリンジェンシーに依存した条件の調整は容易に行われる。例えば、上述のような、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９を参照のこと（これを参照により本明細書中に組み込む。）。（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｂｅｌら編及びＴｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９８３）も参照のこと。両者とも参照により本明細書中に組み込む。）。具体的に、条件の選択は、ハイブリド形成させる配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対的Ｇ−Ｃ含量及び許容されるミスマッチの量による。低ストリンジェンシー条件は、相補性の程度がより低い鎖間の部分的ハイブリド形成が望ましい場合に好ましい。完全又はほぼ完全な相補性が望ましい場合、高ストリンジェンシー条件が好ましい。典型的な高ストリンジェンシー条件の場合、ハイブリド形成溶液は、６ｘＳ．Ｓ．Ｃ．、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液及び０．５％ＳＤＳを含有する。クローン化ＤＮＡの断片の場合、約６８℃で約３から４時間、全真核ＤＮＡの場合、約１２から約１６時間、ハイブリド形成を行う。中程度のストリンジェンシーの場合、３ｘ塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド（ｐＨ７．５で、この緩衝液の０．１Ｍ）の溶液及び５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液でのフィルタープレハイブリド形成及びハイブリド形成を利用し得る。３７℃で４時間プレハイブリド形成し、続いて３，０００，０００ｃｐｍトータルに等しい標識プローブ量と３７℃で１６時間ハイブリド形成し、次いで、２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄（室温で各1分間を４回及び６０℃にて各３０分間を４回）し得る。乾燥後、フィルムに曝露する。より低いストリンジェンシーの場合、ハイブリド形成温度を２本鎖の融解温度（Ｔ_ｍ）よりも約１２℃低くする。Ｔ_ｍは、Ｇ−Ｃ含量及び２本鎖の長さならびに溶液のイオン強度の関数として知られている。
【００４４】
「ハイブリド形成」には、２つの核酸が相補的配列を含有することが必要である。しかし、ハイブリド形成のストリンジェンシーによって、塩基間のミスマッチが起こり得る。上述のように、核酸をハイブリド形成させるのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。このような可変性は当技術分野で周知である。より具体的には、２つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴ_ｍ値が大きくなる。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、Ｔ_ｍを計算するための式がある（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照）。短い核酸のハイブリド形成の場合、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さによりその特異性が決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照）。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「単離核酸断片又は配列」は、１本鎖又は２本鎖であり、場合によっては合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含有する、ＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１以上のセグメントから構成され得る。（特定のポリヌクレオチドの「断片」とは、およそ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド及びさらにより好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの、特定のヌクレオチド配列の領域と同一又は相補的な連続配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。）。ヌクレオチド（通常、その５’−モノリン酸形態で見出される。）は、次のように１文字表記で表される：アデニル酸又はデオキシアデニル酸に対して「Ａ」（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡに対して）、シチジル酸又はデオキシシチジル酸に対して「Ｃ」、グアニル酸又はデオキシグアニル酸に対して「Ｇ」、ウリジル酸に対して「Ｕ」、デオキシチミジル酸に対して「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）に対して「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）に対して「Ｙ」、Ｇ又はＴに対して「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴに対して「Ｈ」、イノシンに対して「Ｉ」及び何れかのヌクレオチドに対して「Ｎ」。
【００４６】
「機能的に同等の断片又はサブフラグメント」及び「機能的に同価値の断片又はサブフラグメント」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、その断片又はサブフラグメントが活性酵素をコードするか否かに関わらず、遺伝子発現を変化させるか又はある種の表現型を生じさせる能力が保持されている、単離核酸断片の一部又は部分配列を指す。
【００４７】
「相同性」、「相同の」、「実質的に同様の」及び「実質的に一致する」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらは、１以上のヌクレオチド塩基の変化が、その核酸断片の、遺伝子発現介在能力又はある種の表現型生成能に影響を与えない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の、非修飾断片に対して、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない１以上のヌクレオチドの欠失又は挿入などの、本発明の核酸断片の修飾も指す。従って、当業者にとって当然のことながら、本発明は、具体的な代表的配列だけにとどまらないものを包含する。
【００４８】
「遺伝子」とは、コード配列の前にある（５’非コード配列）及び後にある（３’非コード配列）制御配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。
【００４９】
「ネイティブ遺伝子」とは、それ自身の制御配列とともに天然に見出されるような遺伝子を指す。一方、「キメラコンストラクト」とは、天然において通常は一緒に見出されない核酸断片の組み合わせを指す。従って、キメラコンストラクトは、異なる源由来の制御配列及びコード配列又は、同じ源由来であるが、天然で通常見られるものとは異なる方式で編成される制御配列及びコード配列を含み得る。（「単離された」という用語は、配列がその天然の環境から離されることを意味する。）。
【００５０】
「外来」遺伝子とは、宿主生物において通常は見られない遺伝子を指し、遺伝子移入により宿主生物に導入される遺伝子である。外来遺伝子は、非ネイティブ生物又はキメラコンストラクトに挿入されたネイティブ遺伝子を含み得る。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。
【００５１】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、又はその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、この配列は、転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性又は関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼす。制御配列には、以下に限定されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列及びポリアデニル化認識配列が含まれ得る。
【００５２】
「プロモーター」とは、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、隣接及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができ、プロモーターの生来のエレメント又はプロモーターのレベル又は組織特異性を促進するために挿入された異種エレメントであり得るＤＮＡ配列である。プロモーター配列はまた、遺伝子の転写部分内、及び／又は転写配列の下流にも位置し得る。プロモーターは、それらの全体において、ネイティブ遺伝子由来であるか、又は、天然で見られる様々なプロモーター由来の様々なエレメントからなるか、又は合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者にとって当然のことながら、異なるプロモーターは、異なる組織又は細胞型において、又は発生の異なるステージにおいて、又は異なる環境条件に反応して、遺伝子の発現を支配し得る。殆どの場合に、殆どの宿主細胞型において遺伝子発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。殆どの場合において、制御配列の正確な境界は完全に定められていないので、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認められる。
【００５３】
「イントロン」は、タンパク質配列の一部をコードしない、遺伝子中の介在配列である。従って、このような配列は、ＲＮＡに転写されるが、その後切り出され、翻訳されない。この用語はまた、切り出されたＲＮＡ配列に対しても使用される。「エクソン」は、転写され、その遺伝子由来の成熟メッセンジャーＲＮＡで見出される遺伝子配列の一部であるが、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部である必要はない。
【００５４】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡの、翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡに対する主要な転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性又は翻訳効率に影響し得る。翻訳リーダー配列の例は、（Ｔｕｒｎｅｒ、Ｒ．及びＦｏｓｔｅｒ、Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２２５）に記載されている。
【００５５】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を与え得る制御シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響を与えることを特徴とする。様々な３’非コード配列の使用については、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０（１９８９）により例示されている。
【００５６】
「ＲＮＡ転写産物」とは、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により得られる産物を指す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、これは、一次転写産物と呼ばれるか、又は一次転写産物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンがなく、細胞によりタンパク質へと翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、これから酵素逆転写酵素を用いて合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは、１本鎖であるか、又はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を用いて２本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞内又はインビトロでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写産物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的の一次転写産物又はｍＲＮＡの全てもしくは一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写産物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性とは、具体的な遺伝子転写産物の何れかの部分との（即ち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン又はコード配列での）ものであり得る。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ又は、翻訳され得ないが、細胞性プロセスにおいて影響を有するその他のＲＮＡを指す。「相補」及び「逆相補（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」という用語は、ｍＲＮＡ転写産物に関して本明細書中で交換可能に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義するものである。
【００５７】
「内在性ＲＮＡ」という用語は、天然であれ非天然であれ、本発明の組み換えコンストラクトにより形質転換される前に（即ち、組み換え手段、変異誘発などにより導入される。）、宿主のゲノムに存在する何らかの核酸配列によりコードされる何らかのＲＮＡを指す。
【００５８】
「非天然」という用語は、人工のものであり、天然で通常見られるものと一致しないことを意味する。
【００５９】
「作用可能に連結」という用語は、一方の機能が他方により制御されるような１つの核酸断片における核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現を制御可能である場合、そのプロモーターはコード配列に作用可能に連結されている（即ち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある。）。センス又はアンチセンス方向で、コード配列を制御配列に操作可能に連結することができる。別の例において、直接又は間接的に、標的ｍＲＮＡに対して５’又は標的ｍＲＮＡに対して３’に、又は標的ｍＲＮＡ内で、本発明の相補的ＲＮＡ領域を作用可能に連結することができる、又は標的ｍＲＮＡに対して、第一の相補的領域が５’であり、その相補が３’である。
【００６０】
「発現」という用語は、本明細書で使用する場合、機能的最終産物の産生を指す。遺伝子の発現は、遺伝子の転写及びｍＲＮＡの前駆体又は成熟タンパク質への翻訳を含む。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写産物の産生を指す。「共同抑制」とは、同一又は実質的に同様の外来又は内在性遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ転写産物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００６１】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド、即ち、一次転写産物において存在する何らかのプレ又はプロペプチドは除去されているものを指す。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡの転写の一次産物を指し、即ち、プレ及びプロペプチドはまだ存在するものである。プレ及びプロペプチドは、限定されないが、細胞内局在シグナルであり得る。
【００６２】
「安定な形質転換」とは、結果として遺伝的に安定な遺伝形質が得られる、宿主生物のゲノムへの核酸断片の移入を指す。一方、「一時的形質転換」とは、結果として統合又は安定な遺伝なく遺伝子発現が起こる、宿主生物の核又はＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の移入を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」生物と呼ばれる。「形質転換」という用語は、本明細書で使用する場合、安定的形質転換及び一時的形質転換の両方を指す。
【００６３】
本明細書中で使用される標準的組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９（本明細書中で以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と呼ぶ。）においてより詳細に記載されている。
【００６４】
「組み換え」という用語は、例えば、化学合成による、又は遺伝子操作技術による核酸の単離セグメントの操作による、２つの異なった個別の配列のセグメントの人工的組み合わせを指す。
【００６５】
「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の繰り返しサイクルからなる、大量の特定ＤＮＡセグメントの合成のための技術である（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）。通常、２本鎖ＤＮＡを加熱変性させ、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングさせ、次いで中間温度で伸長させる。これらの連続的な３段階の１セットをサイクルと呼ぶ。
【００６６】
ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、短時間で鋳型の複製を繰り返すことによってＤＮＡを数百倍に増幅するために使用される強力な技術である。（Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら、欧州特許出願第５０，４２４号；欧州特許出願第８４，７９６号；欧州特許出願第２５８，０１７号；欧州特許出願第２３７，３６２号；Ｍｕｌｌｉｓ、欧州特許出願第２０１，１８４号；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈ、米国特許第４，５８２，７８８号；及びＳａｉｋｉら、米国特許第４，６８３，１９４号）。このプロセスは、ＤＮＡ合成を開始させるために、特異的なインビトロ合成オリゴヌクレオチドのセットを利用する。これらのプライマーの設計は、分析するＤＮＡ配列に依存する。高温で鋳型を融解させ、プライマーを鋳型内の相補的配列にアニーリングさせ、次いでＤＮＡポリメラーゼにより鋳型を複製する、多くのサイクル（通常２０−５０）により、この技術を行う。
【００６７】
ＰＣＲ産物は、アガロースゲルにおいて分離し、次いで臭化エチジウム染色し、ＵＶ透光で可視化することにより、分析される。あるいは、産物に標識を組み込むために、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに添加することができる。この場合、Ｘ線フィルムにゲルを曝露することにより、ＰＣＲの産物を可視化する。放射性標識ＰＣＲ産物のさらなる長所は、個々の増幅産物のレベルを定量できることである。
【００６８】
「組み換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」及び「組み換え発現コンストラクトという用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、当業者にとって周知の標準的方法を用いて細胞のゲノムに挿入することができる遺伝物質の機能的単位を指す。このようなコンストラクトは、それ自身か、又はベクターと組み合わせて使用され得る。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者にとって周知のように、宿主植物を形質転換するために使用するであろう方法に依存する。例えば、プラスミドを使用することができる。当業者は、首尾よく形質転換し、選択し、本発明の単離核酸断片の何れかを含有する宿主細胞を増殖させるために、ベクターに存在しなければならない遺伝的エレメントを十分認識している。当業者はまた、異なる独立の形質転換事象の結果、異なるレベル及びパターンの発現が得られること（Ｊｏｎｅｓら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６）及び、従って、所望の発現レベル及びパターンを示す株を得るために複数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識する。ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析又は表現型分析により、このようなスクリーニングを行い得る。
【００６９】
目的のβアミロイドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が単離されたら、次いで、ベクター又は構築物の使用を通じて、原核又は真核宿主細胞、好ましくは、イー・コリなどの原核宿主細胞の何れかの中に導入され得る。
【００７０】
発現されたタンパク質のＮ末端をコードするヌクレオチド配列は、ベクター中にも導入されなければならない。さらに、ベクター、例えば、バクテリオファージ、コスミド又はプラスミドは、自然のアミロイドβタンパク質の関連部分をコードするヌクレオチド配列、コードされるべきＮ末端のヌクレオチド配列、及び宿主細胞中において機能的であり、タンパク質の発現を惹起することができる何れかの制御配列（例えば、プロモーター）を含み得る。制御配列（例えば、プロモーター）は、ヌクレオチド配列と作用可能に会合しており、又は作用可能に連結されている。（プロモーター又は制御配列がコード配列の転写又は発現に影響を与える場合に、プロモーター又は制御配列は、コード配列と「作用可能に連結されている」と称される。適切なプロモーターには、例えば、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｐＢＡＤ，ｔｅｔプロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター及びＰＬプロモーターが含まれ、例えば、イー・コリなどの細菌細胞中でタンパク質の発現を試みる場合に、これらの全てを使用することが可能である。宿主細胞として昆虫を使用している場合には、ポリヘドリンＰ１０、ＭＴ、Ａｃ５及びＯｐ１Ｅ２などのプロモーターが使用され得る。ウイルス中でタンパク質を発現させることを好む場合には、ｐＣＭＶ、ｐＵｂＣ及びｐＵ６をプロモーターとして使用し得る。哺乳動物細胞中で使用され得るプロモーターには、例えば、ＣＭＶ、Ｕ６、ＥＦ−Ｉ、ｐＣＭＶ−２ｘＴｅｔＯ_２、ｐＵｂＣ、ＳＶ４０、ｂ−カゼイン及びＲＳＶが含まれる。適切な酵母プロモーターには、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＡＵＧ１、ＧＡＬ１、ｎｍｔ１、ｎｍｔ４１、ｎｍｔ８１及びＴＥＦ１が含まれる。構築物中に存在する配列の選択は、所望される発現産物及び宿主細胞の性質に依存する。
【００７１】
上述のように、一旦ベクターが構築されたら、ベクターは、次いで、例えば、形質移入、形質転換及び電気穿孔などの、当業者に公知の方法によって、選択された宿主細胞中に導入され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２^ｎｄ ｅｄ．， Ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。次いで、宿主細胞は、ヌクレオチド配列の発現を可能とする適切な条件下で培養され、所望のコードされるアミロイドβタンパク質の産生をもたらし、アミロイドβタンパク質は、次いで、回収及び精製される。
【００７２】
適切な原核宿主細胞の例には、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）及びラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）などの細菌が含まれる。適切な真核宿主細胞の例には、例えば、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９、ＳＦ２１及びＨｉ５）、酵母細胞、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、哺乳動物細胞及びショウジョウバエの細胞が含まれる。
【００７３】
宿主細胞中での発現は、一過性又は安定的な様式で達成することができる。一過性発現は、宿主細胞中で機能的な発現シグナルを含有する導入された構築物から生じ得るが、該構築物は、宿主細胞中で、又は宿主細胞が増殖していない場合に、複製せず、稀にしか組み込まれない。一過性発現は、目的の遺伝子に作用可能に連結された制御可能なプロモーターの活性を誘導することによっても達成され得るが、このような誘導性の系は、しばしば、発現の低い基底レベルを示す。安定な発現は、宿主ゲノム中に組み込まれることができる、又は宿主細胞中で自律的に複製する構築物の導入によって達成することができる。目的の遺伝子の安定な発現は、発現構築物上に位置し、又は発現構築物とともに形質移入された選択可能なマーカーを使用した後、マーカーを発現している細胞に対する選択を通じて選択することができる。安定な発現が組み込みから生じる場合には、構築物の組み込みの部位は、宿主ゲノム内に無作為に生じ得、又は、宿主の遺伝子坐との組換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性を有する領域を含有する構築物の使用を通じて標的化することが可能である。構築物が内在性の遺伝子坐に標的化される場合には、転写及び翻訳制御領域の全部又は一部は、内在性の遺伝子坐によって提供され得る。
【００７４】
トランスジェニック哺乳動物は、目的のタンパク質を発現するためにも使用され得る。より具体的には、上記構築物が一旦作製された時点で、構築物は、胚の前核中に挿入され得る。次いで、胚は、レシピエントの雌の中に移植され得る。あるいは、核移植法も使用することができる（Ｓｃｈｎｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２１３０−２１３３（１９９７））。次いで、妊娠と出産が可能となる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７５０，１７６及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７００，６７１を参照。）。宿主として使用される哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシからなる群から選択され得る。しかしながら、目的のタンパク質をコードするＤＮＡをそのゲノム中に取り込む能力を有していれば、あらゆる哺乳動物を使用し得る。
【００７５】
上述の手順に加えて、熟練者は、巨大分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作及び単離、組み換え生物の作製及びクローンのスクリーニング及び単離に対する具体的な条件及び手順を述べる標準的リソースに精通している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ、１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ、２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）を参照）。
【００７６】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）」という用語は、本明細書中で、ヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙ（Ｘ及びＹの両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ ＩＡ又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙのアミノ酸配列を指し、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの変異があるもの（ここで、数字は、Ａβペプチドの開始位置に対応し、位置Ｘ及び位置Ｙの両方を含む。）又は３個以下のさらなるアミノ酸置換（これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。）を有する配列を指す。「さらなる」アミノ酸置換とは、本明細書中で、自然には見られない規範的な配列からの何らかの逸脱である。
【００７７】
より具体的には、本明細書中で「Ａβ（１−４２）」という用語は、ヒトアミロイドβタンパク質の、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４２（１及び４２の両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ ＩＡ（アミノ酸位置１から４２に対応する。）又はその天然の変異体の何れかを指し、特に、例えば、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有する変異体（ここで、数字は、Ａβペプチドの開始位置に対応し、位置１及び位置４２の両方を含む。）又は３個以下のさらなるアミノ酸置換（これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。）を有する配列を指す。同様に、「Ａβ（１−４０）」という用語は、ここで、ヒトアミロイドβタンパク質の、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４０（１及び４０の両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４０のアミノ酸配列を指し、特に、例えば、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）及びＤ２３Ｎ（「アイオワ」）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有するもの（ここで、数字は、Ａβペプチドの開始位置に対応し、位置１及び位置４０の両方を含む。）又は３個以下のさらなるアミノ酸置換（これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。）を有する配列を指す。「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」（「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状オリゴマー」）という用語は、本明細書中で、上記で定義されるように、均一性及び個別の物理的特性を有する、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの可溶性の球状の非共有結合を指す。Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体は、陰イオン性界面活性剤と温置することにより得られるＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの安定な非原線維性のオリゴマー集合体である。単量体及び原線維とは異なり、これらの球状凝集体は、サブユニットの定められた集合体数を特徴とする（例えば、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１に記載のように、初期集合形態、ｎ＝４−６、「オリゴマーＡ」及び後期集合形態、ｎ＝１２−１４、「オリゴマーＢ」。）。球状凝集体は、３次元球状型構造を有する（「モルテングロビュール」、Ｂａｒｇｈｏｒｎら、２００５、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５、８３４−８４７参照）。これらはさらに、次の特性の１以上をさらに特徴とする：
−短縮型Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体を生じる広域プロテアーゼ（サーモリシン又はエンドプロテイナーゼＧｌｕＣなど）でのＮ−末端アミノ酸Ｘ−２３の切断可能性；
−広域プロテアーゼ及び抗体とのＣ末端アミノ酸２４−Ｙの非近接性；及び
−これらのＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体の短縮型が、球状凝集体の３次元コア構造（その球状凝集体配座におけるコアエピトープＡβ（２０−Ｙ）の近接性がより優れている。）を維持する。
【００７８】
本発明によると、及び、特に本発明の抗体の結合親和性を評価する目的のために、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、ＷＯ０４／０６７５６１（参照により、本明細書中に組み込む。）に記載のようなプロセスにより得ることができる産物を指す。前記プロセスは、天然、組み換え又は合成Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドもしくはその誘導体を折り畳み解除すること；折り畳み解除したＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド又はその誘導体を界面活性剤に少なくとも部分的に曝露し、その界面活性剤作用を低下させ、温置を続けることを含む。
【００７９】
ペプチドの折り畳み解除のために、例えばヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）などの水素結合破壊剤をタンパク質に対して作用させ得る。作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数分、例えば１０から６０分の作用時間で十分である。蒸発乾固した残渣を、好ましくは濃縮形態で、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの水性緩衝剤と混ざり合う適切な有機溶媒中で続いて溶解することにより、結果として、その後に使用できる、少なくとも部分的に折り畳み解除されたペプチド又はその誘導体の懸濁液が得られる。必要ならば、保存用懸濁液を低温、例えば約−２０℃でしばらくの間保存し得る。
【００８０】
あるいは、ペプチド又はその誘導体を僅かに酸性の、好ましくは水性の、溶液、例えば約１０ｍＭＨＣｌ水溶液中で溶解させ得る。通常数分間温置した後、不溶性成分を遠心により除去する。１０，０００ｇで数分が好都合である。これらの方法の段階を好ましくは室温、即ち２０から３０℃の範囲の温度で行う。遠心後に得られる上清は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド又はその誘導体を含有し、低温、例えば約−２０℃でしばらくの間保存し得る。
【００８１】
オリゴマー（ＷＯ０４／０６７５６１、オリゴマーＡと呼ばれる。）の中間型を与えるための、界面活性剤への続く曝露は、ペプチド又はその誘導体のオリゴマー化に関連する。このために、十分な中間体オリゴマーが生じるまで、少なくとも部分的に折り畳み解除されたペプチド又はその誘導体に対して界面活性剤を作用させる。イオン性界面活性剤、特に陰イオン性界面活性剤を用いるのが好ましい。
【００８２】
特定の実施形態によると、式（Ｉ）：
Ｒ−Ｘ
の界面活性剤が使用される（式中、基Ｒは、６から２０、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルキル又は６から２０、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルケニルであり、基Ｘは酸性基又はその塩であり、Ｘは好ましくは−ＣＯＣ⁻Ｍ^＋、−ＳＯ_３⁻Ｍ^＋の中から選択され、特に−ＯＳＯ_３⁻Ｍ^＋であり、Ｍ^＋は、水素陽イオン又は無機もしくは有機陽イオンであり、好ましくは、アルカリ金属及びアルカリ土類金属陽イオン並びにアンモニウム陽イオンから選択される。）。最も有利であるのは、特にＲが非分枝アルキルである（そのａｌｋ−ｌ−ｙｌ基を言及しなければならない。）、式（Ｉ）の界面活性剤である。特に好ましいのは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。ラウリン酸及びオレイン酸も有利に使用できる。界面活性剤ラウロイルサルコシンのナトリウム塩（サルコシルＮＬ−３０又はＧａｒｄｏｌ^（Ｒ）としても知られている。）もまた特に有利である。
【００８３】
界面活性剤作用時間は、特に、折り畳みされていないならば、オリゴマー化に供されるペプチド又はその誘導体がどの程度まで折り畳みされていないかに依存する。折り畳み解除段階に従い、ペプチド又はその誘導体が水素結合破壊剤で（即ち、特にヘキサフルオロイソプロパノールで）既に処理されているならば、作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数時間の範囲の作用時間、有利には約１から２０、特に約２から１０時間で十分である。折り畳み解除の程度が小さいか又は基本的に折り畳み解除されていないペプチド又はその誘導体が出発点である場合、同様に、作用時間が長い方が好都合である。例えばＨＦＩＰ処理に代わる手段として上記手順に従いペプチドもしくはその誘導体が前処理されているか、又は該ペプチドもしくはその誘導体がオリゴマー化に直接供されるならば、作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、約５から３０時間、特に約１０から２０時間の作用時間で十分である。温置後、不溶性成分を遠心により有利に除去する。１０，０００ｇで数分が好都合である。
【００８４】
選択すべき界面活性剤濃度は使用する界面活性剤に依存する。ＳＤＳを使用する場合、０．０１から１重量％、好ましくは、０．０５から０．５重量％の範囲、例えば、約０．２重量％の濃度が好都合である。ラウリン酸又はオレイン酸を使用する場合、例えば、０．０５から２重量％、好ましくは０．１から０．５重量％の範囲、例えば約０．５重量％の、幾分高い濃度が好都合である。
【００８５】
界面活性剤作用は、生理的範囲前後の塩濃度で起こるはずである。従って、特に５０から５００ｍＭ、好ましくは１００から２００ｍＭの範囲、より具体的には約１４０ｍＭのＮａＣｌ濃度が好都合である。
【００８６】
続く界面活性剤作用の低下及び温置の継続は、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体（ＷＯ２００４／０６７５６１において、オリゴマーＢと呼ばれる。）を与えるためのオリゴマー化にさらに関連する。前段階から得られる組成物は通常界面活性剤及び生理的範囲の塩濃度を含有するので、界面活性剤作用を低下させ、好ましくは塩濃度も低下させることが好都合である。例えば、水又は低塩濃度の緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３）で好都合に希釈することにより界面活性剤及び塩の濃度を低下させることによって、これを行い得る。約２から１０の範囲、有利には、約３から８の範囲、特に約４の、希釈係数が適切であることが分かっている。この界面活性剤作用を中和することができる物質を添加することによっても、界面活性剤作用の低下を達成し得る。これらの例には、一連の精製及び抽出手段において細胞を安定化させることができる物質のような界面活性剤を錯化することができる物質（例えば、特定のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー、特に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^（Ｒ）Ｆ６８の商標名のブロックコポリマー）が含まれる。特定の臨界ミセル濃度前後又はそれ以上の濃度の、アルコキシル化及び、特に、エトキシル化アルキルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ）Ｘシリーズのエトキシル化ｔ−オクチルフェノール、特にＴｒｉｔｏｎ^（Ｒ）Ｘ１００、３−（３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ^（Ｒ））など）又はアルコキシル化及び、特に、エトキシル化ソルビタン脂肪エステル（Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ）シリーズのもの、特にＴｗｅｅｎ^（Ｒ）２０など）も同様に使用し得る。
【００８７】
続いて、十分なＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体が産生されるまでこの溶液を温置する。作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数時間の範囲、好ましくは約１０から３０時間、特に約１５から２５時間の範囲の作用時間で十分である。次にこの溶液を濃縮し得、得られるであろう残渣を遠心により除去し得る。ここでも、１０，０００ｇで数分間が好都合であることが分かっている。遠心後に得られた上清は、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体を含有する。
【００８８】
例えば限外濾過、透析、沈殿又は遠心により、それ自体の様式で、Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体を最終的に回収することができる。変性条件下でのＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体の電気泳動による（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）分離によって２重のバンドが得られれば（例えば、Ａβ（１−４２）に対して３８／４８ｋＤａの見かけの分子量を有する。）さらに好ましく、分離前にオリゴマーのグルタルアルデヒド処理においてこれらの２本のバンドが１本にまとまれば特に好ましい。球状凝集体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果、１本のピークになる場合も好ましい（例えば、Ａβ（１−４２）に対するおよそ６０ｋＤａの分子量に対応する。）。Ａβ（１−４２）ペプチドから開始する場合、本プロセスは、特にＡβ（１−４２）球状凝集体を得るために適切である。好ましくは、この球状凝集体は、神経細胞に対して親和性を示す。好ましくは、球状凝集体は、神経調節作用も示す。
【００８９】
本発明の別の態様によると、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、基本的にＡβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットからなる球状凝集体を指し、これは、平均で１２サブユニットのうち少なくとも１１がＡβ（Ｘ−Ｙ）タイプであれば好ましく、より好ましくはこの球状凝集体の１０％未満が何らかの非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドであり、最も好ましくは、この調製物の非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値以下である。より具体的には、「Ａβ（１−４２）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Ａβ（１−４２）ユニットを含有する球状凝集体を指し；「Ａβ（１２−４２）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Ａβ（１２−４２）ユニットから実質的になる球状凝集体を指し；「Ａβ（２０−４２）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Ａβ（２０−４２）ユニットから実質的になる球状凝集体を指す。
【００９０】
「架橋Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、球状凝集体の構成単位の、架橋により、好ましくは化学的架橋により、より好ましくはアルデヒド架橋により、最も好ましくはグルタルアルデヒド架橋により、上述のようなＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体から得られる分子を指す。本発明の別の態様において、架橋球状凝集体は基本的に、その単位が、非共有結合相互作用のみによって一緒になっているのではなく、少なくとも一部が共有結合により連結されている球状凝集体である。
【００９１】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体誘導体」という用語は、本明細書中で、特に、検出を容易にする基に共有結合されることにより標識されている球状凝集体（好ましくは、フルオロフォア、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリスリン、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）蛍光タンパク質、Ｄｉｃｔｙｏｓｏｍａ蛍光タンパク質もしくは何らかの組み合わせ又はその蛍光活性誘導体；発色団；化学発光団、例えば、ルシフェラーゼ、好ましくはＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）ルシフェラーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ（発光細菌）ルシフェラーゼもしくは何らかの組み合わせ又はその化学発光活性誘導体；酵素活性基、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ又はその酵素活性誘導体；高電子密度基、例えば、金含有基などの重金属含有基；ハプテン、例えば、フェノール誘導化ハプテン；強い抗原性のある構造、例えば、抗原性があると予測されるペプチド配列、例えば、Ｋｏｌａｓｋａｒ及びＴｏｎｇａｏｎｋａｒのアルゴリズムなどにより抗原性があると予想されるペプチド配列；別の分子に対するアプタマー；キレート基、例えば、ヘキサヒスチジニル；さらに特異的なタンパク質−タンパク質相互作用に介在する天然もしくは天然由来タンパク質構造、例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎペアのメンバー；磁気群、例えば、強磁性体群；又は^１Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓもしくは^１２５Ｉ又はそれらの何らかの組み合わせを含む基などの放射活性基）；又は共有結合により、もしくは高親和性相互作用による非共有結合によりフラッグ化されている、好ましくは、不活性化、金属イオン封鎖、分解及び／又は沈降を促進する基に共有結合されている、好ましくは、インビボでの分解を促進する基（より好ましくは、ユビキチン）でフラッグ化されている球状凝集体（このフラッグ化オリゴマーがインビボでアセンブルされている場合、特に好ましい。）；又は何らかの上記の組み合わせにより修飾されている球状凝集体を指す。このような標識及びフラッグ化基及びこれらをタンパク質に結合するための方法は当技術分野で公知である。球状化の前、最中又は後に、標識及び／又はフラッグ化を行い得る。本発明の別の態様において、球状凝集体誘導体は、標識及び／又はフラッグ化反応により球状凝集体から得ることができる分子である。従って、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体誘導体」という用語は、本明細書中で、特に、球状凝集体に対して述べたように標識又はフラッグ化されたＡβ単量体を指す。
【００９２】
「より高い親和性」という用語は、本明細書中で、一方の未結合抗体及び未結合球状凝集体と、他方の抗体−球状凝集体複合体との間の平衡が、抗体−球状凝集体複合体にさらに偏っている、相互作用の程度を指す。同様に、「より小さい親和性」という用語は、本明細書中で、一方の未結合抗体及び未結合球状凝集体と、他方の抗体−球状凝集体複合体との間の平衡が、未結合抗体及び未結合球状凝集体にさらに偏っている相互作用の程度を指す。
【００９３】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体」という用語は、本明細書中で、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの単離形態、好ましくは、他のＡβペプチドとの基本的に非共有相互作用に関与していないＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの形態を指す。実際に、Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体は通常、水溶液の形態で与えられる。本発明の特に好ましい実施形態において、水性単量体溶液は、例えば本発明の抗体の結合親和性を調べるために使用する場合、０．０５％から０．２％、より好ましくは、約０．１％ＮａＯＨを含有する。別の好ましい状況において、水性単量体溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは、約０．１％ＮａＯＨを含有する。使用する場合、適切な形式で溶液を希釈することが好都合であり得る。さらに、通常、溶液調製後、２時間以内、特に１時間以内、とりわけ３０分以内に溶液を使用することが好都合である。
【００９４】
「原線維」という用語は、本明細書中で、電子顕微鏡中で原線維性構造を示す非共有結合した個々のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの集合体を含む分子構造を指し、これはコンゴレッドに結合し、次いで、偏光下で複屈性を示し、そのＸ−線回折パターンはクロス−β構造である。
【００９５】
本発明の別の態様において、原線維は、２４単位を超える、好ましくは、１００単位を超える凝集体の形成を導く、変性剤非存在下での、例えば０．１Ｍ ＨＣｌ中での、適切なＡβペプチドの自己誘導重合体凝集を含むプロセスにより得られる分子構造である。このプロセスは当技術分野で周知である。好都合に、Ａβ（Ｘ−Ｙ）原線維は、水溶液の形態で使用される。本発明の特に好ましい実施形態において、０．１％ＮＨ_４ＯＨ中でＡβペプチドを溶解し、２０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で１：４に希釈し、次いでｐＨ７．４に再調整し、３７℃にて２０時間温置し、次いで１００００ｇで１０分間遠心し、２０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で再懸濁することにより、水性原線維溶液を調製する。
【００９６】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）原線維」という用語は、本明細書中で、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットから実質的になる原線維を指し、この場合、平均でサブユニットの少なくとも９０％がＡβ（Ｘ−Ｙ）型のものであれば好ましく、サブユニットの少なくとも９８％がＡβ（Ｘ−Ｙ）型のものであればより好ましく、非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値以下であれば最も好ましい。
【００９７】
組換えアミロイドβタンパク質の使用
本発明の方法に従って作製されたタンパク質は、方法そのものと同様、多数の興味深い用途を有する。例えば、前記方法は、合成有機手段によるペプチドの精製の必要がない。さらに、大規模な組換え発現は、ペプチド合成よりずっと安価であるので、前記方法は、作製コストの大幅な節約を可能とする。
【００９８】
さらに、本発明の方法は、様々な、現在同定されたアルツハイマー家族疾患及び将来同定される全ての疾患と関連する天然のアミノ酸バリアントの何れをも容易に導入することができる。
【００９９】
また、本発明の方法は、その後、アルツハイマー病の治療用モノクローナル抗体（又は他の抗体）の作製において使用され得るさらなる材料の調製において使用するための出発材料の適切な量を調製することを可能とする。
【０１００】
さらに、前記方法は、１）ヒト免疫化をベースとした介入的治療（例えば、能動免疫のために使用され得る球状凝集体）、２）ヒト診断検査又は動物をベースとした代替生物的検査系（例えば、エピトープ（すなわち、球状凝集体又はその一部）は、疾病を診断するために、又は対症療法的治療を決定するために、ヒト又は動物モデル中で検出され得る。）、３）小分子（すなわち、非抗体又は非生物試薬）抗アルツハイマー病予防若しくは治療剤を開発するための、又は認知障害を特徴とするアルツハイマー病に関連する神経病の予防若しくは治療における大規模又は小規模なスクリーニング、４）小分子抗アルツハイマー病（又は関連疾患）の予防又は治療剤を開発するための結晶学的又はＮＭＲをベースとした、構造に基づく設計研究、５）抗体又は他のタンパク質をベースとする抗アルツハイマー病（又は関連疾患）の予防又は治療剤の開発における結晶学的又はＮＭＲをベースとした、構造を基礎とする設計研究、及び６）抗アルツハイマー病予防剤又は治療剤の開発におけるＲＮＡｉ−をベースとした設計研究で使用するための球状凝集体の調製において使用するための球状凝集体を調製することができる（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ２００４／０６７５６１；Ｂａｒｇｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００５ ９５，８３４−８４７を参照）。
（本発明において、「球状凝集体」は、非共有的に会合された小集合体を含み、各アミロイドペプチドは平衡分子間βシートと反平行分子内βシートの両方を含有する生物学的構造として定義される。球状凝集体は、準安定的、可溶性であり、その二次構造は、フィブリル形成サブユニットとは異なる（上記のとおり）。時間が経過するにつれて、球状凝集体は、記載されている立体構造「交換」経路（図１８及び２３）によって、完全に平行なβシート原繊維形態へ最終的に転化する。特に、球状凝集体相互作用に対する観察された二次構造及び可能な三次及び四次構造は、図２０、２１及び２２に図示されているとおりである［図１８中の座標も参照されたい。］。さらに、球状凝集体の物理的サイズは、その分子内及び分子間相互作用によって限定される点で、球状凝集体は、オリゴマーと区別され、これらは、オリゴマーの極めて限定された形態をもたらす。球状凝集体のサイズは、球状凝集体集合内の分子間相互作用及び分子内相互作用の両方の存在によって限定される。球状凝集体は、本明細書に定義されているサイズ範囲に従って規定された特有の二次構造との、各モノマー対モノマー平行βシート相互作用から構成される。ずっと大きなアミロイドオリゴマー（原繊維形態）は、優先的に、鎖間平行βシート二次構造を含むことが予想される。これらのより大きなオリゴマー及び原繊維形態は、アミロイド「交換」構造の速度論的開放からもたらされる（図２３）。比較により、球状凝集体は、本発明者らが定義したように、混合された鎖間平行及び鎖内反平行構造から構成されることによって、優先的に特徴付けられる。
【０１０１】
この構造は、１つの反復単位として少なくとも２つの分子からなる。反復単位は、アミロイドβタンパク質の少なくとも残基１９ないし２１及び３０ないし３２からなる２つの分子内反平行β−シート並びにアミロイドβタンパク質の少なくとも残基３４ないし３８からなる１つの分子間平行βシートを含有する（図２１）。反平行βシートは、ループによって接続された２つのβストランドによって形成されたβヘアピン構造を有する。この反平行βシートの構造は、１．８と６オングストロームの間の距離で、骨格アミド間（実線によって示されている。）及び骨格アミドとそれらの側鎖間（破線矢印線によって示されている。）（図２０）（下表１も参照されたい。）の鎖交差核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）によって定義される。
【０１０２】
【表１】

【０１０３】
レジスター内（ｉｎ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ）の平行βシートは、骨格ＮＨ−ＮＨ間の分子間ＮＯＥ（破線によって示される。）及び骨格ＮＨと側鎖のメチル基間の分子間ＮＯＥ（矢印実線によって示される。）によって規定される（図２０）。
【０１０４】
分子内と分子間ＮＯＥは、異なる放射線同位体で標識された試料を用いて識別された。以下の試料を調製した。（試料Ａ）均一に［^１５Ｎ］標識されたプロトン化された試料；（試料Ｂ）^２Ｈ背景中に、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ残基の選択的に^１３Ｃ標識されたプロトン化されたメチル基を有する均一に［^１５Ｎ］標識された試料；（試料Ｃ）１つの分子が［Ｕ−^１５Ｎ，^２Ｈ］で標識され、別の分子が［Ｕ−^１４Ｎ，^２Ｈ］で標識されており、これらが１：１の比で混合されている混合された試料；（試料Ｄ）［Ｕ−^１５Ｎ，^２Ｈ］で標識されたペプチドは、ＩＶＬ残基の選択的に^１３Ｃ標識された、プロトン化されたメチル基を含有する［Ｕ−^１４Ｎ，^２Ｈ］標識されたペプチドと、１：１の比で混合されている、混合された試料。実線によって示される分子内ＮＨ−ＮＨＮＯＥ（図２０）は、３Ｄ^１５Ｎ分解されたＮＯＥＳＹスペクトル中の試料Ａ及びＢ中で観察されたが、^１５Ｎフィルターされ、及び^１５Ｎ編集された３ＤＮＯＥＳＹスペクトル中の試料Ｃでは観察されなかった。矢印破線によって示されているように（図２０）、試料Ａを使用することによって、^１５Ｎ分解された３ＤＮＯＥＳＹ中に骨格アミドとそれらの側鎖間のさらなる分子内ＮＯＥが観察された。これらのＮＯＥデータは、再度、反平行βシート構造の存在を示している。破線によって示される分子間ＮＨ−ＮＨＮＯＥ（図２０）は、^１５Ｎフィルターされ、及び^１５Ｎ編集された３ＤＮＯＥＳＹスペクトルにおいて、試料Ｃ中で観察された。これらのＮＯＥは、レジスター内平行分子間βシートを明確に確定する。１つの分子上の骨格アミド^１５ＮＨと別の分子上の^１３ＣＨ_３メチル基間のさらなる分子間ＮＯＥが、^１５Ｎ分解された^１Ｈ／^１Ｈ及び^１３Ｃ／^１ＨＮＯＥＳＹスペクトルにおいて、矢印実線によって示されているように（図２０）、試料Ｄ中に観察された。これらの分子間ＮＯＥは、同じく、ファイ（Φ）角度―１２０±５０及びプサイ（Ψ）角度１４０±５０と合致するレジスター内平行βシート構造を示している。水性^１５Ｎ標識された試料が凍結乾燥され、Ｄ_２Ｏ中に溶解されたＮＨ／ＮＤ交換実験から、βシート中の交換から保護されたアミドが、少なくとも２０分間、Ｄ_２Ｏ中の試料に対して得られる。保護されたアミドは、残基上の円によって示されている（図２０）。これらのゆっくり交換しているアミドの多くは、βシート中に位置しており、おそらく、水素結合されている。
【０１０５】
ＮＭＲデータの分析から得られたＮＯＥ由来の距離制約を用いて（表１参照）、シミュレートされたアニーリングプロトコール［Ｍ．Ｎｉｌｇｅｓ， ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２２９，３１７−３２４，１９８８］を使用することによって、プログラムＣＮＸ［Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４（Ｐｔ５），９０５−２１（１９９８）］を用いて構造を計算した。Ｇ３３は、反平行βシートと平行βシートの間の連結部に位置している。この残基の立体構造は確定されておらず、物理的に許容されるあらゆる立体構造と適合するあらゆるファイ、プサイ角度を有し得る。おそらく二量体であるこの実体の代表的な立体構造は、図２１に示されており、その座標は図２４に示されている。
【０１０６】
本発明のアミロイドβ実体の構造の１つの完全な構造座標には、図２４に示されているもの±アミノ酸（又はその保存的置換）の保存された骨格原子からの標準偏差が含まれる。
【０１０７】
平均座標位置について演算的に最も好ましい２０の構造の平行βシートアミノ酸残基３４から３８に対する標準偏差は、骨格原子（Ｃａ、Ｎ及びＣ’）については０．５１±０．２９オングストロームであり、全ての重原子については１．０４±０．３６である。より好ましくない平均座標位置は、骨格原子（Ｃａ、Ｎ及びＣ’）については０．５１±１．２９オングストロームであり、全ての重原子については１．０４±１．３６である。最も好ましくない平均座標位置は、骨格原子（Ｃａ、Ｎ及びＣ’）については０．５１±２．２９オングストロームであり、全ての重原子については１．０４±２．３６である。
【０１０８】
平均座標位置について演算的に最も好ましい２０の構造の反平行βシートアミノ酸残基１９から２１及び３０から３２に対する標準偏差は、骨格原子（Ｃａ、Ｎ及びＣ’）については０．６７±０．２３オングストロームであり、全ての重原子については１．５２±０．３６である。より好ましくない平均座標位置は、骨格原子（Ｃａ、Ｎ及びＣ’）については０．６７±１．２３オングストロームであり、全ての重原子については１．５２±１．３６である。最も好ましくない平均座標位置は、骨格原子（Ｃａ、Ｎ及びＣ’）については０．６７±２．２３オングストロームであり、全ての重原子については１．５２±２．３６オングストロームである。
【０１０９】
上記標準偏差（ｒｍｓｄ）は、実験的に測定された数値である。平行βシートと反平行βシートの間の配位は確定されていないので、構造座標全体に対するｒｍｓｄは、現在のところ決定されていない。（「標準偏差」）は、平均からの偏差の座標の算術平均の平方根であり、本明細書に記載されている構造座標からの偏差又は変動を表す様式である。）
さらに、本分野で公知の分子モデリング法は、本明細書に記載されているアミロイドβ分子（例えば、二量体）の１つ若しくはそれ以上の活性部位又は結合ポケットを同定するために使用され得る。具体的には、図２１に示されているような三次元モデルを特定するために構造座標が使用される。次いで、モデルから、例えば、分子の表面構造、表面電荷、立体配置、反応性アミノ酸の存在並びに疎水性及び親水性の領域に基づいて、活性部位の候補が計算によって可視化され、同定され、及び特徴付けられ得る。このような活性部位の候補は、次いで、様々なアミロイドβ複合体から作製されたスペクトルの化学シフト擾乱、競合的及び非競合的阻害実験を用いて、及び／又は不可欠な残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）又は活性部位の特徴を同定するためにアミロイドβ変異体の発生（ｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）及び性質決定によって、さらに精緻化され得る。（例えば、米国特許第６，９３４，６３９号を参照）
【０１１０】
活性部位と相互作用し、又は会合する因子は、アミロイドβ分子の三次元モデルから測定し、コンピュータフィッティング分析を実施することによって同定され得る。コンピュータフィッティング分析は、１）相同性モデリング又は活性部位の構造座標を用いて活性部位の候補の三次元モデルを作製し、及び２）活性部位の候補と同定された因子間の会合の程度を決定することによって、活性部位の候補と同定された因子間の「フィッティング」を評価する様々なコンピュータソフトウェアプログラムを使用する。会合の程度は、結合アッセイを用いて計算的に又は実験的に決定され得る。
【０１１１】
さらに、本発明のタンパク質、球状凝集体及びオリゴマー（及びこれらに対して誘導された抗体）は、様々な診断アッセイにおいて使用され得ることに留意すべきである。
【０１１２】
本発明の１つの診断的実施形態において、タンパク質、球状凝集体若しくはオリゴマー又はこれらの一部は、固相上に被覆されている（又は液相中に存在する。）。次いで、検査又は生物試料（例えば、全血、脳脊髄液、血清など）を固相と接触させる。抗体が試料中に存在する場合には、このような抗体は、固相上の抗原に結合し、次いで、直接法又は間接法の何れかによって検出される。直接法は、単に、複合体そのものの存在を検出し、これにより抗体の存在を検出することを含む。間接法では、コンジュゲートが、結合された抗体に添加される。コンジュゲートは、シグナル生成化合物又は標識に付着された第二の抗体を含み、第二の抗体は、結合された第一の抗体に結合する。第二の抗体が結合された第一の抗体に結合すると、シグナル生成化合物は、測定可能なシグナルを発生する。次いで、このようなシグナルは、検査試料中の第一の抗体の存在を示す。
【０１１３】
診断用免疫アッセイで使用される固相の例は、多孔及び非多孔材料、ラテックス粒子、磁性粒子、微小粒子（例えば米国特許第５，７０５，３３０号参照）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェル及びプラスチックチューブである。固相材料の選択及びコンジュゲート中に存在する抗原又は抗体を標識する方法は、必要に応じて、所望のアッセイ方式の性能特性に基づき決定される。
【０１１４】
上述のように、コンジュゲート（又は指標試薬）は、シグナル生成化合物又は標識に連結された抗体（又はおそらく、アッセイによっては抗−抗体）を含む。このシグナル生成化合物又は「標識」は、そのものが検出可能であるか、又は検出可能な産物を生成するための１以上のさらなる化合物と反応し得る。シグナル生成化合物の例には、色原体、放射性同位元素（例えば、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３Ｈ、^３５Ｓ及び^１４Ｃ）、化学発光化合物（例えばアクリジニウム）、粒子（可視性又は蛍光性）、核酸、錯化剤又は酵素などの触媒（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ）が含まれる。酵素を使用する場合（例えば、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ）、色原、蛍光又は化学発光生成基質を添加することにより、検出可能なシグナルが生じる。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光法などのその他の検出系も有用である。
【０１１５】
上記免疫アッセイにより試験され得る体液の例には、血漿、全血、乾燥全血、脳脊髄液又は組織及び細胞の水性もしくは有機−水性抽出物が含まれる。
【０１１６】
本発明の別の実施形態において、試験試料は、本発明の特異的抗体（例えば、ヒト又はヒト化されたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など）で被覆された固相（又は液相）に曝露され得る。球状凝集体、オリゴマー又はタンパク質は、上述のように、及び試料中に存在すれば、固相に結合し、次いで、上述のような直接又は間接法によって検出され得る。より具体的には、間接法は、標識又はシグナル生成化合物に付着された（結合された抗原に結合する）第二の抗体を含むコンジュゲートを添加することを含む。第二の抗体が結合された抗原に結合する場合、次いで、試験試料中のアルツハイマータンパク質（球状凝集体、オリゴマー、ペプチド又はこれらの一部など）の存在を示す検出可能なシグナルが生成される。
【０１１７】
本発明はまた、試験試料中における抗体の存在を検出するための第三の方法も包含する。この方法は次の段階を含む：（ａ）抗抗体／抗原複合体を形成させるのに十分な時間及び条件下で、抗体を含有する疑いのある試験試料を抗原（例えば、タンパク質、球状凝集体若しくはオリゴマー又はこれらの一部）に対して特異的な抗抗体と接触させる段階；（ｂ）結合された抗体に抗原を結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗抗体／抗原複合体に抗原を添加する段階（該抗原は、本明細書に定義されているタンパク質、球状凝集体、オリゴマー又はこれらの一部を含む。）；（ｃ）得られた抗抗体／抗体／抗原複合体へコンジュゲートを添加する段階（このコンジュゲートは、検出可能なシグナルを検出することができるシグナル生成化合物に付着されたモノクローナル又はポリクローナル抗体を含む組成物を含み、前記モノクローナル又はポリクローナル抗体は抗原に対して誘導されている。）及び（ｄ）シグナル生成化合物により生じたシグナルを検出することにより試験試料中に存在し得る抗体の存在を検出する段階。抗抗体に対する抗体を含む、対照又は標準物質を使用し得る。
【０１１８】
本発明はまた、本明細書中に記載の抗体の１以上又はその一部と医薬的に許容可能なアジュバント（例えば、フロイントのアジュバント又はリン酸緩衝食塩水）と、を含有するワクチンも含む。
【０１１９】
キットも本発明の範囲内に含まれる。より具体的には、本発明は、患者中の抗体の存在を測定するためのキットを含む。特に、試験試料中の抗体の存在を測定するためのキットは、ａ）本明細書中で定義されるような抗原（例えば、タンパク質、球状凝集体、オリゴマー又はこれらの一部）；及びｂ）検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に付着された抗体を含むコンジュゲートを含む。本キットは、抗原に結合する試薬を含む対照又は標準物質も含有し得る。
【０１２０】
本発明はまた、試験試料中の抗体を検出するためのキットの別の種類を含む。本キットは、ａ）目的の抗体に特異的な抗抗体及びｂ）上記で定義されるような抗原又はその一部を含み得る。抗原に結合する試薬を含む対照又は標準物質も含まれ得る。より具体的には、本キットは、ａ）抗体に特異的な抗抗体及びｂ）検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に付着された抗原を含むコンジュゲートを含み得る。同じく、本キットはまた、抗原に結合する試薬を含む標準物質の対照も含み得る。
【０１２１】
本キットはまた、各容器に前もってセットされた固相が付いた、バイアル、ボトル又はストリップなどの１つの容器及び個々のコンジュゲートを含有するその他の容器も含み得る。これらのキットはまた、洗浄、処理及び指標試薬など、本アッセイを行うのに必要とされるその他の試薬のバイアル又は容器も含有し得る。
【０１２２】
さらに、本発明は、北極（Ｅ６９３Ｇ）変異、オランダ（Ｅ６９３Ｑ）変異、イタリア変異（Ｅ６９３Ｋ）、アイオワ（Ｄ６９４Ｎ）変異及びフランドル（Ａ６９２Ｇ）変異からなる群から選択される抗原に対して、及びこれらの抗原を用いて作製されたヒト化抗体を含む。本抗体は、アミロイドβペプチドの自然のヒト配列及び前記変異された配列の少なくとも１つを認識し得る。本抗体は、治療の目的のために、このような変異を有するとして同定された患者に投与され得る。本抗体は、二重可変ドメインを有し得、自然のヒトアミロイドβ配列及び上記家族性変異体の少なくとも１つを認識し得る。本抗体は、二重特異的でもあり得る。
【０１２３】
さらに、本発明は、アルツハイマー病を有すると疑われる患者中の変異体アミロイドβペプチド配列を検出する方法を含む。本方法は、ａ）患者から生物学的試料を単離する段階；２）変異体抗原／抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で、上で直接記載されている抗体と前記生物学的試料を接触させる段階；及びｃ）変異体抗原／抗体複合体の存在を検出する段階を含み、前記複合体は、前記患者が変異体アミロイドβペプチド配列を有することを示唆し、従って、アルツハイマー病を有することを示唆する。
【０１２４】
さらに、本発明は、アミロイドペプチドの１モル当りドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又は脂肪酸の少なくとも約０．５から２．０モルを含む単離された球状凝集体を含む。最も好ましくは、ＳＤＳの約１．０モルが、球状凝集体中に存在する。本発明は、単離された球状凝集体のエピトープも含む。（このエピトープは、ペプチドとＳＤＳ（又は脂肪酸）の混合物によって形成され得る。）さらに、本発明は、エピトープに結合する単離された抗体も含む。この抗体は、アミロイドβペプチド凝集体の形成も遮断し得る。この遮断は、ペプチド二量体、ペプチド三量体、ペプチド四量体、ペプチド五量体、ペプチド六量体、ペプチド七量体、ペプチド八量体、ペプチド九量体、ペプチド十量体、ペプチド十一量体、ペプチド十二量体、ペプチド十三量体及びペプチド十四量体の段階で生じ得る。
【０１２５】
また、本発明は、アミロイドβペプチドを含む単離された球状凝集体も含む。このペプチドは、北極（Ｅ６９３Ｇ）変異、オランダ（Ｅ６９３Ｑ）変異、イタリア変異（Ｅ６９３Ｋ）、アイオワ（Ｄ６９４Ｎ）変異及びフランドル（Ａ６９２Ｇ）変異からなる群から選択された変異を有するアミノ酸配列を含む。本発明は、この球状凝集体のエピトープ（すなわち、ペプチド及びＳＤＳ（又は脂肪酸）及び球状凝集体の混合物によって形成されるエピトープ）も含むが、自然のヒトアミロイドβペプチド配列の免疫反応性エピトープとは免疫学的に異なる。
【０１２６】
さらに、本発明は、自然のヒトアミロイドペプチドのエピトープと比べて、上記エピトープに優先的に結合する単離された抗体（例えば、モノクローナル抗体）を含む。このような抗体は、家族性アルツハイマー病を有する患者の治療においても使用され得る。
【０１２７】
本発明は、（上述のような）アルツハイマー病の家族性形態の治療において使用され得、（散発性アルツハイマー病の治療の間に提示されるエピトープとは異なる）家族性変異体のエピトープに関して優先的及び選択的なエピトープ反応性を有する単離された抗体（例えば、モノクローナル抗体）も包含する。
【０１２８】
さらに、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療を必要としている患者において、アルツハイマー病を予防又は治療する方法であり、前記予防又は治療を実施するのに十分な量で、前記患者に、上記単離された抗体の何れか１つ又はそれ以上を投与する段階を含む、前記方法を含む。
【０１２９】
さらに、本発明は、アミロイドβペプチドを含む単離された球状凝集体を含む。ペプチドは、水素−重水素交換挙動に基づいて、約３３％又はそれ未満の保護又は交換を示すアミノ酸を含み、前記アミノ酸は２（Ａｓｐ）、３（Ａｌａ）、４（Ｇｌｕ）、５（Ｐｈｅ）、７（Ｈｉｓ）、８（ａｓｐ）、９（Ｓｅｒ）、１０（Ｇｌｙ）、１７（Ｌｙｓ）、２０（Ｐｈｅ）、２１（Ｐｈｅ）、２２（Ａｌａ）、２５（Ｖａｌ）、２６（Ｇｌｙ）、２９（Ｌｙｓ）及び３０（Ｇｌｙ）からなる群から選択される。単離された球状凝集体は、アミロイドβペプチドを含む。
【０１３０】
さらに、本発明は、アミロイドβペプチドを含む単離された球状凝集体を含む。前記ペプチドは、水素−重水素交換挙動に基づいて、約３３％から約６６％の保護又は交換を示すアミノ酸を含み、前記アミノ酸は、１６（Ｇｌｎ）、３１（Ａｌａ）、３２（Ｉｌｅ）、４２（Ｉｌｅ）及び４３（Ａｌａ）からなる群から選択される。
【０１３１】
また、本発明は、アミロイドβペプチドを含む単離された球状凝集体を包含する。前記ペプチドは、水素−重水素交換挙動に基づいて、約６６％又はそれ以上の保護又は交換を示すアミノ酸を含み、前記アミノ酸は、１２（Ｇｌｕ）１８（Ｌｅｕ）、１９（Ｖａｌ）、２４（Ａｓｐ）、３３（Ｉｌｅ）、３４（Ｇｌｙ）、３５（Ｌｅｕ）、３６（Ｍｅｔ）、３８（Ｇｌｙ）、３９（Ｇｌｙ）及び４０（Ｖａｌ）からなる群から選択される。
【０１３２】
ヒト家族性変異体
図２７に示されているようにＮ末端Ｍｅｔ形態として発現されたヒト家族性変異体アルツハイマーペプチドは、自然配列球状凝集体形態に対して作製された抗体との異なる（より低い）反応性を有すると想定される。例えば、自然配列球状凝集体を用いて作製された抗体Ａに結合する能力は、以下の家族性変異については低下する。北極（Ｅ６９３Ｇ）、オランダ（Ｅ６９３Ｑ）、イタリア（Ｅ６９３Ｋ）、アイオワ（Ｄ６９４Ｎ）及びフランドル（Ａ６９２Ｇ）。変異体球状凝集体形態へのこの低下した結合能は、抗体Ａエピトープのこの領域中の変化された配列／構造から得られる。これらの変異に関連するアルツハイマー病の家族性形態に罹患している患者の治療的処置における抗体のヒト化された形態の使用は、これらの領域の配列を含有する球状凝集体エピトープに対して選択的に開発された抗体を必要とする。抗体Ａ様抗体は、インビボで球状凝集体中に提示された家族性エピトープを認識する低下した能力を示すので、単独では、これらの家族性変異体に対して治療的に活性でない。
【０１３３】
本発明は、以下の非限定的な実施例の使用によって例示され得る。
【実施例１】
【０１３４】
Ａβ−アミロイドペプチドのクローニング
Ａβ−アミロイドペプチドを合成により構築した。特に、図１は、本明細書中に記載のペプチドをコードするＤＮＡ配列ならびにそのペプチドのアミノ酸配列を示す。Ａβ−アミロイドペプチドを体系化する配列及びベクターｐＥＴ２９でそれをクローニングするための所望の制限部位をカバーするプライマーを設計し、アニーリング反応において使用し、所望のＥ．コリ発現ベクターへの連結反応で使用する断片を生成させた。
【０１３５】
これらのオリゴを一緒にアニーリングさせた後、ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いた連結によりｐＥＴ２９ ＮｄｅＩ ＸｈｏＩ部位にこれらを組み込み、ｐＥＴ２９−Ａβアミロイドペプチド（１−４２）自然形態を形成させた。最終構築物をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３６】
鋳型としてｐＥＴ２９−Ａβアミロイドペプチド［１−４２］を用いて部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）によりβアミロイドペプチド［１−３９、４０、４２及び４３］を作製した。Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いた独立のＳＤＭ反応において、ＳＤＭａｍｙ−３９ｓ及びａｓ、ＳＤＭａｍｙ−４０ｓ及びａｓ、ＳＤＭａｍｙ−４１ｓ及びａｓ、ＳＤＭａｍｙ−４３ｓ及びａｓ（表２参照）のプライマーペアを使用した。新しい構築物、ｐＥＴ２９−Ａβアミロイドペプチド［１−３９］、ｐＥＴ２９−Ａβアミロイドペプチド［１−４０］、ｐＥＴ２９−Ａβアミロイドペプチド［１−４１］及びｐＥＴ２９−Ａβアミロイドペプチド［１−４３］をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３７】
得られた構築物を使用して、Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、発現をテストした。１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラオシド）で誘導後、３７℃で４時間増殖させ、ペプチドの発現を行った。クーマシー染色したＳＤＳタンパク質ゲルにおいて可視化した場合、試験発現からの不溶性分画から、予想サイズのタンパク質が得られた。
【０１３８】
【表２】


【実施例２】
【０１３９】
発酵及びβアミロイドの発現
１）Ａ−β［１−３９］：
［非標識物質の産生］
発現プラスミドをＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢに平板接種した。３７℃で一晩温置した後、プレート上に現れた形質転換体を使用して、５０ｍｇ／Ｌでカナマイシンを添加した１５０ｍＬのＭ９前培養に接種した。前培養物を往復振盪器（１８５ｒｐｍ）に置き、３０℃で温置した。培養物のＯＤ_{６００ｎｍ}が０．４６８に到達したら、培地１８Ｌを含有するＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）Ｍｉｃｒｏｓ発酵装置に前培養物全てを移した。この発酵用培地は、以下のものから構成された（１Ｌあたり）：１１．３２ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、３ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ ＮａＣｌ、１ｍＬ １％ＤＦ−６０消泡剤、１．５ｇＮＨ_４Ｃｌ、３．５５ｇグルコース、２ｍＬ １Ｍ ＭｇＳＯ_４、０．１ｍＬ １Ｍ ＣａＣｌ_２、０．０２ｍＬ ＦｅＳＯ_４（４０ｍｇ／ｍＬ）、２ｍＬカナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）及び０．６３３ｍＬ微量元素溶液［５Ｎ ＨＣｌ中１Ｌあたり：１０ｇ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ；１０ｇ ＡｌＣｌ_３・Ｈ_２Ｏ；４ｇ ＣｏＣｌ_２；２ｇ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；２ｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ；１ｇ ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；０．５ｇ Ｈ_３ＢＯ_４］。最初に温度を３０℃に調節した。発酵装置に空気を２ｖｖｍで噴霧し、ＤＯ_２濃度が４５％以下に低下した際に撹拌速度を上昇させる縦続調整ループを通じて４５％空気飽和度を超えるように溶解酸素濃度［ＤＯ_２］を維持した。４Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４及び４Ｎ ＫＯＨの自動添加を通じて、運転中、ｐＨを７．０に調整した。ＯＤ_{６００ｎｍ}が２．０になったら温度設定を４１℃に変更し、１ｍＭＩＰＴＧを添加することによりＡ−βの発現を誘導した。３０％グルコース溶液を供給することによって、発現フェーズ全体にわたり０ｇ／Ｌより上にグルコース濃度を維持した。誘導３時間後に細胞を回収した。
【０１４０】
２）Ａ−β（１−４０）：
［^１５Ｎ標識物質の作製］
発現プラスミドをＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢに平板接種した。３７℃で一晩温置した後、プレート上に現れた形質転換体を使用して、５０ｍｇ／Ｌでカナマイシンを添加した１５０ｍＬの^１５Ｎ−Ｍ９前培養に接種した。往復振盪器（１８５ｒｐｍ）上に前培養物を置き、３０℃で温置した。培養液のＯＤ_{６００ｎｍ}が０．５１０に到達したら、培地１８Ｌを含有するＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）Ｍｉｃｒｏｓ発酵装置に前培養物７５ｍＬを移した。この発酵用培地は、以下のものから構成された（１Ｌあたり）：１１．３２ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ ＮａＣｌ、１ｍＬ １％ＤＦ−６０消泡剤、１．５ｇ ^１５Ｎ−ＮＨ_４Ｃｌ、３．５５ｇグルコース、２ｍＬ １Ｍ ＭｇＳＯ_４、０．１ｍＬ １Ｍ ＣａＣｌ_２、０．０２ｍＬ ＦｅＳＯ_４（４０ｍｇ／ｍＬ）、２ｍＬカナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）及び０．６３３ｍＬ微量元素溶液［５Ｎ ＨＣｌ中１Ｌあたり：１０ｇ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ；１０ｇ ＡｌＣｌ_３・Η_２Ｏ；４ｇ ＣｏＣｌ_２；２ｇ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；２ｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ；１ｇ ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；０．５ｇ Ｈ_３ＢＯ_４］。最初に温度を３０℃に調節した。発酵装置に空気を２ｖｖｍで噴霧し、ＤＯ_２濃度が４５％以下に低下した際に撹拌速度を上昇させる縦続調整ループを通じて４５％空気飽和度を超えるように溶解酸素濃度［ＤＯ_２］を維持した。４Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４及び４Ｎ ＫＯＨの自動添加を通じて、運転中、ｐＨを７．０に調整した。ＯＤ_{６００ｎｍ}が１．５になったら温度設定を４１℃に変更し、１ｍＭＩＰＴＧを添加することによりＡ−βの発現を誘導した。３０％グルコース溶液を供給することによって、発現フェーズ全体にわたり０ｇ／Ｌより上にグルコース濃度を維持した。誘導３時間後に細胞を回収した。
【０１４１】
３）Ａ−β（１-４１）：
［^１５Ｎ標識物質の作製］
発現プラスミドをＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢに平板接種した。３７℃で一晩温置した後、プレート上に現れた形質転換体を使用して、５０ｍｇ／Ｌでカナマイシンを添加した１５０ｍＬの^１５Ｎ−Ｍ９前培養に接種した。往復振盪器（１８５ｒｐｍ）上に前培養物を置き、３０℃で温置した。培養液のＯＤ_{６００ｎｍ}が０．４２４に到達したら、培地１８Ｌを含有するＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）Ｍｉｃｒｏｓ発酵装置に前培養物全てを移した。この発酵用培地は、以下のものから構成された（１Ｌあたり）：１１．３２ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ ＮａＣｌ、１ｍＬ １％ＤＦ−６０消泡剤、１．５ｇ ^１５Ｎ−ＮＨ_４Ｃｌ、３．５５ｇグルコース、２ｍＬ １Ｍ ＭｇＳＯ_４、０．１ｍＬ １Ｍ ＣａＣｌ_２、０．０２ｍＬ ＦｅＳＯ_４（４０ｍｇ／ｍＬ）、２ｍＬカナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）及び０．６３３ｍＬ微量元素溶液［５Ｎ ＨＣｌ中１Ｌあたり：１０ｇ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ；１０ｇ ＡｌＣｌ_３・Η_２Ｏ；４ｇ ＣｏＣｌ_２；２ｇ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；２ｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ；１ｇ ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；０．５ｇ Ｈ_３ＢＯ_４］。最初に温度を３０℃に調節した。発酵装置に空気を２ｖｖｍで噴霧し、ＤＯ_２濃度が４５％以下に低下した際に撹拌速度を上昇させる縦続調整ループを通じて４５％空気飽和度を超えるように溶解酸素濃度［ＤＯ_２］を維持した。４Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４及び４Ｎ ＫＯＨの自動添加を通じて、運転中、ｐＨを７．０に調整した。ＯＤ_{６００ｎｍ}が１．８になったら温度設定を４１℃に変更し、１ｍＭＩＰＴＧを添加することによりＡ−βの発現を誘導した。３０％グルコース溶液を供給することによって、発現フェーズ全体にわたり０ｇ／Ｌより上にグルコース濃度を維持した。誘導３時間後に細胞を回収した。
【０１４２】
４）Ａ−β（１-４２）：
［^１５Ｎ標識物質の作製］
発現プラスミドをＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢに平板接種した。３７℃で一晩温置した後、プレート上に現れた形質転換体を使用して、５０ｍｇ／Ｌでカナマイシンを添加した１５０ｍＬの^１５Ｎ−Ｍ９前培養に接種した。往復振盪器（１８５ｒｐｍ）上に前培養物を置き、３０℃で温置した。培養液のＯＤ_{６００ｎｍ}が０．５２０に到達したら、培地１８Ｌを含有するＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）Ｍｉｃｒｏｓ発酵装置に前培養物７５ｍＬを移した。この発酵用培地は、以下のものから構成された（１Ｌあたり）：１１．３２ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ ＮａＣｌ、１ｍＬ １％ＤＦ−６０消泡剤、１．５ｇ Ｎ^１５−ＮＨ_４Ｃｌ、３．５５ｇグルコース、２ｍＬ １Ｍ ＭｇＳＯ_４、０．１ｍＬ １Ｍ ＣａＣｌ_２、０．０２ｍＬ ＦｅＳＯ_４（４０ｍｇ／ｍＬ）、２ｍＬカナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ）及び０．６３３ｍＬ微量元素溶液［５Ｎ ＨＣｌ中１Ｌあたり：１０ｇ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ；１０ｇ ＡｌＣｌ_３・Η_２Ｏ；４ｇ ＣｏＣｌ_２；２ｇ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；２ｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ；１ｇ ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；０．５ｇ Ｈ_３ＢＯ_４］。最初に温度を３０℃に調節した。発酵装置に空気を２ｖｖｍで噴霧し、ＤＯ_２濃度が４５％以下に低下した際に撹拌速度を上昇させる縦続調整ループを通じて４５％空気飽和度を超えるように溶解酸素濃度［ＤＯ_２］を維持した。４Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４及び４Ｎ ＫＯＨの自動添加を通じて、運転中、ｐＨを７．０に調整した。ＯＤ_{６００ｎｍ}が１．５になったら温度設定を４１℃に変更し、１ｍＭＩＰＴＧを添加することによりＡ−βの発現を誘導した。３０％グルコース溶液を供給することによって、発現フェーズ全体にわたり０ｇ／Ｌより上にグルコース濃度を維持した。誘導３時間後に細胞を回収した。
【０１４３】
５）Ａ−β（１-４２）：
［非標識物質の作製］
発現プラスミドをＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢに平板接種した。３７℃で一晩温置した後、プレート上に現れた形質転換体を使用して、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１Ｌを含有する６個のフェーンバッハフラスコに接種した。３０℃の往復振盪器（１８５ｒｐｍ）にこのフラスコを移した。培養液のＯＤ_{６００ｎｍ}が０．４５に到達したら、１ｍＭＩＰＴＧを添加することによりＡ−βの発現を誘導し、４１℃の往復振盪器にこのフラスコを移した。誘導３時間後に細胞を回収した。
【０１４４】
６）Ａ−β（１−４３）：
［非標識物質の作製］
発現プラスミドをＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢに平板接種した。３７℃で一晩温置した後、プレート上に現れた形質転換体を使用して、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１Ｌを含有する１４個のフェーンバッハフラスコに接種した。３７℃の往復振盪器（１８５ｒｐｍ）にフラスコを移した。培養液のＯＤ_{６００ｎｍ}が０．４４に到達したら、１ｍＭＩＰＴＧを添加することによりＡ−βの発現を誘導し、４１℃の往復振盪器にフラスコを移した。誘導３時間後に細胞を回収した。
【実施例３】
【０１４５】
組み換え発現させたβ−アミロイドの精製
組み換えヒトアミロイドの精製に対して展開した全般的な概要を図３で示し、下記で述べる。
【０１４６】
出発試料：
全単離試料のための出発物質はＥ．コリ細胞培養の回収物から得られた−８０℃凍結細胞ペーストであった。細胞培養物は、複数の１Ｌフラスコでの増殖由来か、又は３５Ｌの大きさの発酵装置由来のものであった。培地は、様々に標識されたＡ−β試料を調製するために使用されるさらなる標識を含むか又は含まない、非標識物質を産生させるための富栄養培地又は最小培地から構成され得る。様々な培地とともにフラスコ又は発酵装置の何れかを使用し得る。
【０１４７】
処理１：細胞溶解液及び封入体調製
凍結細胞ペーストをボトルから取り出し、室温に置いてある撹拌プレート上に置いたビーカー中の冷細胞溶解緩衝液５−１０体積に添加した。細胞溶解緩衝液は、１００ｍＭＴｒｉｓ最終ｐＨ７．５から７．８（４℃）から構成された。発酵装置由来の細胞ペーストの場合、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を細胞溶解緩衝液に添加した。細胞溶解液０．１μＬ／ｍＬの濃度になるまでベンゾナーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加した。ペレットが均一に再懸濁されるまで凍結細胞ペーストを撹拌した。これは通常、４５分から６０分以内に完了した。必要に応じて、このプロセスを促進するために組織均質化により懸濁液を短時間均質化した。冷却コイルを氷下に維持しながら、Ｍ−１１０Ｌマイクロ流動化装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＰＡ）を用いて、又は冷Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ（ＳＬＭ Ａｍｎｉｃｏ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を用いて、細胞溶解を行った。約１５℃の細胞溶解物質を２５０ｍＬナルゲン（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）遠心ボトル又は５０ｍＬ 丸底ポリカーボネート遠心管に入れ、ＪＬＡ１６．２５ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）で２３０００ｘＧで４℃にて３０分間遠心した。上清をデカントし、試料を取り、捨てた。
【０１４８】
処理２：封入体及びペレット洗浄
ｐＨ７．５から７．８の冷５０ｍＭトリス緩衝液を添加し、上記で得られたペレットを洗浄した。組織ホモジェナイザ―を用いて物質を再懸濁し、上記のようにＪＬＡ１６．２５ローターで２３０００ｘＧで遠心した。封入体物質に対してこのようなトリス洗浄を全部で３回行った。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために上清試料を各時間で回収した。
【０１４９】
処理３：水洗浄
Ｔｒｉｓ緩衝液洗浄に次いで、最後に水で１回洗浄した。これは、試料の凍結乾燥前にＴｒｉｓ緩衝液をほぼ除去するために行った。この段階において、物質全てを１本のボトルへと一度に合わせた。最後に再懸濁試料を上記のようにＪＬＡ１６．２５ローターで２３０００ｘＧで遠心した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために上清試料を回収し、その後捨てた。
【０１５０】
遠心からのペレットを水（ＮＭＲ用試料）又は０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水の何れかで再懸濁した。一度に大量の物質を処理する発酵装置に後者を添加した。水のみから凍結乾燥した物質は非常に静電気が強く、大量に取り扱うことは非常に困難であり、一方、トリフルオロ酢酸の添加により凍結乾燥物質が後に非常に容易かつ安全に扱うことができるようになることに注目した。凍結（シェリング）プロセス中に凍結乾燥機フラスコの壁面に容易に広がる薄いスラリーが得られるように再懸濁試料の最終体積を調整した。
【０１５１】
処理４：凍結乾燥
再懸濁試料をシェル凍結し、凍結乾燥機に入れ、一晩又はこのプロセスを完了するために必要に応じてより長時間、凍結乾燥した。少量の試料を５０ｍＬコニカルポリエチレンチューブ中で凍結乾燥し、そこから移す必要がないようにした。
【０１５２】
処理５：抽出
使用した抽出溶媒は、Ｖ−Ａ）ＤＭＳＯ；Ｖ−Ｂ）へプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）及びＶ−Ｃ）トリフルオロ酢酸であった。フルオロ酸を用いた経路は、ニートＴＦＡ中でＡ−β１−４２又は１−４０の溶解度が高いことに基づく［Ｊａｏら（１９９７）、「Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｙ Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｔｈｅ Ａｍｙｌｏｉｄ β−ｐｅｐｔｉｄｅ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、Ｖ４、ｐｐ２４０−２５２］。構造の目的に対するＡ−β調製の第一段階としてニートＴＦＡが使用されてきた。ニートＴＦＡは、ペプチドからの前の構造の全ての過程を消し、可溶性を非常に高める。
【０１５３】
処理５Ａ：ＤＭＳＯ抽出
ＤＭＳＯは、凍結乾燥封入体試料からペプチドを抽出するために最もよく使用される溶媒である。発酵装置から、出発細胞ペーストの量に依存して、このような凍結乾燥物質１０−２０ｇを得た。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）３００ｍＬを温撹拌プレート上の６００ｍＬガラスビーカー中で３７℃に加温した。粉塵を生じさせずに慎重に凍結乾燥物質をＤＭＳＯに添加した。移した後、組織ホモジェナイザーを用いて懸濁液を均質化した。さらに１５分間撹拌を続けた。全プロセスを４５分以内に終了した。ビーカーにガラスプレートで蓋をした。撹拌及び加熱を停止し、ドラフト中のベンチで一晩物質を静置した。試料の温度は常に３７℃を超えないようにした。総体積は約３５０ｍＬであり、翌朝、２個の２５０ｍＬナルゲンボトルで２５℃にて３０分間、ＪＬＡ１６．２５ローターで２３０００ｘＧで遠心した。ＤＭＳＯ上清を６００ｍＬガラスビーカーにデカントした。さらなる５０ｍＬ ＤＭＳＯを各ボトルに添加し、均質化し、前のように遠心した。２つの試料を集め、それにより全部で約４００ｍＬとなった。以前の実験でＳＤＳ ＰＡＧＥにより基本的に全てのペプチドはこの手順により抽出されていることが分かっていたので、ペレットを捨てた。
【０１５４】
ＮＭＲ試料は、通常、５から１０グラムの細胞ペーストを含有した。（水から）凍結乾燥した封入体物質が５０ｍＬコニカルポリプロピレンチューブに入っていた。ＤＭＳＯ ２５ｍＬをこのチューブに添加し、試料を短時間均質化して、懸濁液に戻した。室温にて、ベンチ上で通常は約４時間静置したが、場合によっては、都合がよいので、一晩温置した。再懸濁したペレットをポリカーボネート遠心管に移し、ＪＬＡ１６．２５ローターで２５℃にて３０分間、２３０００ｘＧで遠心した。ペレットは少量であり、捨てた。上清を５０ｍＬコニカルチューブにデカントした。いくつかのこのような試料を平行してこの段階に持ち込む場合、時にはこれをクロマトグラフィーまで−２０℃で凍結した。
【０１５５】
処理６：クロマトグラフィーのための調製
逆相カラム平衡化溶出物、１０％アセトニトリル（１％水酸化アンモニウムを含有する水中）へのＤＭＳＯの透析により、クロマトグラフィーのための調製を行った（処理６Ａ、下記）。
【０１５６】
試料体積がカラム体積と比べて小さい限り（通常、カラム体積の１０％未満）、逆相カラムにＤＭＳＯ抽出物を直接添加することもできる（処理６Ｂ、下記）。分析スケールカラムでこれを行った。ＮＭＲ試料の場合、ＤＭＳＯ試料２５ｍＬを０．１％水酸化アンモニウムで２５０ｍＬに希釈し、カラムに直接添加した。
【０１５７】
処理６Ａ：透析又は希釈
約１．５Ｌを保持するのに十分長い６０００−８０００カットオフ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）にＤＭＳＯ抽出物を慎重に注いだ。濃アンモニア（０．１％ｖ／ｖ）１０ｍＬを添加した１５％アセトニトリル１０Ｌに対してこれを透析した。ベンチ上でこれを４時間透析した。透析プロセスを加速するために、定期的に透析膜を取り出し、濃厚なＤＭＳＯを再分配した。４時間終了時に、新しい同じ緩衝液１０Ｌに膜を入れ、このプロセスをさらに２時間続けた。透析終了時に、試料を取り、２５℃にて３０分間、２３０００ｘＧで遠心した。基本的にペレットはなかった。透析終了時に、３５０−４００ｍＬ ＤＭＳＯ抽出物の体積は２倍になった。全試料を２Ｌシリンダーに移し、総体積が２０００ｍＬとなるまで０．１％アンモニア水で２倍に希釈した。試料が確実に逆相カラムに結合するように希釈を行った（処理６Ａ）。
【０１５８】
処理６Ａ：クロマトグラフィー
２．２ｘ２５ｃｍ（９５ｍＬ）ステンレスカラムにＰｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ（Ａｍｈｅｒｓｔ、ＭＡ）からの１５−２０ミクロン、３００Ａ、ＰＬＰＲ−Ｓ逆相レジンを手作業で充填した。これは、７５％アセトニトリル＋０．１％アンモニア（７５％Ｂ）から循環させて、１０％Ｂに平衡化されていた。Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ５００ポンプ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にカラムを連結し、１０００分にわたり、室温にてベンチ上で一晩、カラムに１４００ｍＬをポンプで通した。翌朝、約２５０ｍＬの１０％Ｂを用いてＰ５００ポンプでカラムを洗浄し、次に、Ｂｅｃｋｍａｎ ＨＰＬＣ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）に連結した。２８０ｎｍの吸収がベースラインになるまで１０％Ｂで洗浄を続け、次いで１０％Ｂから３０％Ｂまで２００分間にわたり勾配を開始した（０．１％勾配）。フルスケールの吸収を１吸収単位に維持し、流速を５ｍＬ／分に維持した。物質を手動で回収した。約５０分画を回収した。これらの体積は様々であるが、殆どが約１０ｍＬであった。３０％Ｂでカラムを溶出し続け、溶出液を回収した。痕跡に基づき、これを後に捨てた。各分画１００μＬをスピードバックに入れ、乾燥させ、ＩＸ試料緩衝液１００μＬをチューブに添加した。試料をＳＤＳ ＰＡＧＥに添加し、分画を４℃で一晩保存した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ後、今回の操作からの不純物が次回の操作に混入する可能性があるので、再生を試みずにＰＬＰＲＳ逆相物質を捨てることとした。
【０１５９】
翌朝、ゲルからの結果により、プールした。Ａｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＣＡ）上の３５００カットオフ膜でセルを撹拌しながら物質を濃縮し、約４時間で３５０から５０ｍＬに濃縮した。試料は全て溶液中であった。次に、これを一晩凍結乾燥した。翌朝、重量測定フード中の前もって重量測定した２本の５０ｍＬコニカルポリプロピレンチューブに慎重にこれを移した。移した総重量は凍結乾燥物質２５０ｍｇ＋３３０ｍｇ（総重量５８０ｍｇ）であった。これを−２０℃で保存した。全プロセスを５労働日未満で行った。下記は精製テーブルである（表３）。
【０１６０】
【表３】

【０１６１】
処理６Ｂ：直接添加
濃アンモニア（１％ｖ／ｖ）１０μＬを含有するＤＭＳＯ １ｍＬを固形物２０ｍｇに添加した。物質を短時間超音波破砕して固形物を再懸濁し、次いで遠心した。ＤＭＳＯ中の可溶性物質０．５／１ｍＬを３ｕ分析用０．４６ｘ２５ｃｍ ＰＬＰＲ−Ｓカラムに添加した（段階２．１）。ＳＤＳ ＰＡＧＥで判定したところ、純粋なＡ−βが３０％前後で溶出した。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで、既に形成された球状凝集体の特徴的パターンが観察された。この物質を凍結乾燥し、図８で概説する球状凝集体形成プロトコールに供し、図９で見られるＳＤＳ ＰＡＧＥでのバンドパターンを得た。
【０１６２】
２回目の試行で、ＤＭＳＯ（アンモニア添加なし）中の１０ｍｇ／ｍＬを調製した。この試料の０．５ｍＬを分析用カラムに直接注入した。この場合、ｐＨ変更をカラム上で行った。予想される％Ｂでペプチドは溶出し、（ＳＤＳ ＰＡＧＥにより判定されるように）プールを作製し、凍結乾燥し、球状体形成プロトコールに供し、従来どおり有効な球状凝集体を調製した。ＮＭＲ試料の場合、ＤＭＳＯ試料２５ｍＬを０．１％水酸化アンモニウムで２５０ｍＬに希釈し、カラムに直接添加した。
【０１６３】
処理５Ｂ、５Ｃ：酸性抽出経路
へプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）及びトリフルオロ酢酸により抽出を行うこともできた。
【０１６４】
処理７Ａ１、７Ａ２、７Ａ３：クロマトグラフィーのための調製
温撹拌プレート上の６００ｍＬガラスビーカーに無水ＨＦＢＡ３００ｍＬを入れた。ドラフト中で激しく撹拌しながら凍結乾燥ＩＢ試料（〜１０ｇ）をＨＦＢＡに添加した。形成された凝集塊は何れも、必要に応じて、組織ホモジェナイザー及びプローブソニケーターで分解した。この物質を約４０℃に加熱し、冷まし、ベンチ上で一晩、照明なしで静置した。翌朝、ＨＦＢＡで溶解したＩＢ試料（これは殆ど溶液状であった。）をロータリーエバポレーターに入れ、浴槽温度を約４０℃にして、ＨＰＢＡをほぼ全て除去した。フラスコの壁周辺の固形物が乾燥しないように注意した。（この物質が粘性のあるシロップのようにふるまう場合、１，１，１，３，３，３，ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）約５０ｍＬをフラスコに添加した。温め、フラスコを回転させ、組織ホモジェナイザー及び／又はソニケータープローブを用いることにより、このシロップ状物質をＨＦＩＰ中の溶液になるようにした。）。全てが溶解している場合、試料が粘性のあるシロップ状の稠度になるまで、ＨＦＩＰをエバポレーターで除去した。ＨＦＩＰのさらなる５０ｍＬ一定分量を添加し、このプロセスを繰り返した。試料がシロップ状の稠度である場合、５０ｍＬ ＤＭＳＯをフラスコに添加した。試料は茶褐色となり、少し加熱することによりＤＭＳＯ中で溶液となった。これを室温にて一晩静置した。翌朝、透明な上清とともに、沈殿物が底に沈降していた。試料を遠心し、ペレットを捨てた。
【０１６５】
処理８：酢酸水への抽出物の添加
室温にて急速に撹拌しながら、３０％酢酸水の２体積にこの抽出物の１体積をゆっくりと添加した。室温にて３０分間撹拌し続け、次いで試料を遠心して少量の不溶性物質を除去した。その間に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０の５ｘ９０ｃｍ（〜１８００ｍＬ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を３０％酢酸中で充填し、使用するまで低温室で保存した。〜３３％ＤＭＳＯ中の試料１５０−２００ｍＬをＧ５０に添加し、試料が凍結しないように注意した。１．５ｍＬ／分で約１．２カラム体積分、３０％酢酸を用いて試料を溶出した。３つのピークが得られた。最初の（即ちボイド）ピークを捨てた。第二のピークにはほぼ純粋なＡ−βが含有されていた。第三のピークには若干Ａ−βが含有されていたが、抽出溶媒も含まれており、これも捨てた。２番目のピークを凍結乾燥し、温めながら少量のＤＭＳＯ、〜１０−２０ｍＬ中で溶解させた。
【０１６６】
処理９Ａ：酸性逆相クロマトグラフィー
試料を遠心して不溶性物質を沈降させ、２０％Ｂ（０．１％ＴＦＡを含有する２０％アセトニトリル）中で平衡化したＶｙｄａｃ ＴＰ２１４ Ｃ４逆相カラム（Ｇｒａｃｅ−Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）に添加した。シリカベースのＣ４カラム上でＴＦＡ系において約６０％ＢでＡ−βが溶出した。プールを凍結乾燥し、１０ｍＬ ＤＭＳＯ中で溶解させた。
【０１６７】
処理９Ｂ：塩基性逆相クロマトグラフィー
次に、処理５Ａ経路に記載のＰＬＰＲ−Ｓ逆相システムにＤＭＳＯ試料を添加し、純粋なＡ−βを得て、それをアンモニウム塩形態に変換し、次いで凍結乾燥した。
【０１６８】
最終組成の証明：
これらの方法の何れかにより調製された精製アミロイドβペプチドは、４６４５から４６４８Ｄａの観測質量を示した（図４）。これは、利用したＤＮＡ発現配列から予想されたＮ−末端メチオニンの存在と一致した。クローニングされたその他のアミロイドβ型も、使用した個々の発現配列の発現に基づく予想質量を示した。
【実施例４】
【０１６９】
組み換えβ−アミロイドからの球状凝集体の調製
標準的手順：スケールアップの際には増倍率を使用する。
【０１７０】
段階１：２本の１．６ｍＬ エピチューブ（２ｘ５００μＬずつ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈａｍｅｒｉｃａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）中、２ｘ３ｍｇ ヒトアミロイドβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｏｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）＋２ｘ５００μＬ ＨＦＩＰ（ヘキサフルオロイソプロパノール）（６ｍｇ／ｍＬ懸濁液）；３７℃にて１．５時間振盪（透明な溶液を回収）；
段階２：スピードバックで１．５時間乾燥；
段階３：ＤＭＳＯ各１３２μＬずつ２つで乾燥物を再懸濁し、水浴中で２０秒間超音波破砕し、プレート撹拌器上で穏やかに１０分間振盪；
段階４：さらなる使用のために−２０℃で保存。これから、ＤＭＳＯ中５ｍＭのアミロイドβ（１−４２）保存懸濁液が得られる。
【０１７１】
第１日終了
段階５：１５ｍＬファルコンチューブ中に６９０μＬ ２０ｍＭリン酸Ｎａ；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４緩衝液を満たす；
段階６：ＤＭＳＯ中６０μＬ ５ｍＭアミロイドβ（１−４２）保存懸濁液を添加（４００μＭアミロイドβ（１−４２））；
段階７：７５μＬ ２％ＳＤＳ（水中）を添加（０．２％ＳＤＳ）；
段階８：３７℃で６−８時間温置；
段階９：２４７５μＬの水を添加し、３．３ｍＬの最終体積まで水で４倍希釈（１３２／６０ｘ３．３＝７．２６ｍＬ）
段階１０：３７℃で１８−２０時間温置、
【０１７２】
第２日、第２夜終了
段階１１ａ：３０００ｘＧで１０分間遠心；
段階１１ｂ：段階１１ａ後に架橋（架橋したい場合、濃縮前に）、又は、
段階１２：３０ｋＤａ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＣＡ）により１ｍＬまで上清を濃縮；
段階１３：１２−１５ｋＤａカットオフチューブで、ＰＢＳ／４（ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水、１ｍＭＫＣｌ、１５４ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭリン酸、ｐＨ７．４；ＰＢＳ／４＝最終的にｐＨ７．４の、蒸留水で１：４希釈したＰＢＳ）中で４℃にて試料を一晩透析し、エッペンドルフチューブで１０，０００ｘＧで１０分間、濃縮液を遠心し（透明なペレット）、２５０μＬずつ分注し、−２０℃で凍結。Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｓｕｐ−１２、ＳＤＳ ＰＡＧＥを実施。
【０１７３】
第３日終了
１度に十分なペプチドを操作する限り、収率は通常高い。
【０１７４】
代替／代用法：
段階１２：ＹＭ１０膜を用いて撹拌セル（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＣＡ）において濃縮を行うことができる；
段階１３：透析の代わりにＰＢＳ／４に対して平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムを使用することができる。
【０１７５】
Ｂｒａｄｆｏｒｄの代わりに、計算した吸光度を用いる。
【実施例５】
【０１７６】
組み換えβアミロイド及びこれから調製された球状凝集体の特徴
異なる研究場所で調製されたモノクローナル抗体を用いた合成及び組み換え由来のアミロイドを比較するＥＬＩＳＡ
図５は、イー・コリ中で産生されたＭｅｔ−Ａβ１−４２ペプチドを用いて作製されたＡβ球状凝集体の直接的ＥＬＩＳＡである。球状凝集体エピトープのディスプレイは、濃度依存的様式で、球状凝集体特異的抗体Ａの結合によって示された。抗体Ａの２つの異なるロットを検査し、異なる大陸の別個の施設で作製した（ＬＵ＝Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ；ＡＰ＝ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ）。抗体Ｂは、完全長Ａβ１−４２ペプチドを用いて作製された球状凝集体に認識することができず、従って、球状凝集体に結合しない。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡ 完全長及び末端切断された組み換えアミロイド球状凝集体中に提示された球状凝集体エピトープの比較による同定
図６に示されているＥＬＩＳＡデータは、組み換えヒトアミロイドペプチドＭｅｔ１−４２から構成される完全長球状凝集体を検出する場合には、マウスモノクローナル抗体Ａ、Ｃ、Ｄ及びＢ間の区別を示す（図２）。図は、抗体Ａが、抗体Ｃ及びＤより低い濃度でこれらの球状凝集体を認識し（より強固に結合する）、抗体Ｃ及びＤは、１０Ｆ１１モノクローナル抗体より強固に結合することを示している。比較によって、図７に示されているＥＬＩＳＡデータは、タンパク分解酵素サーモリシンで末端切断されており、（主として）残基２０から残基４２までのアミロイド配列から構成される球状凝集体を認識する全ての抗体を示している（図２参照）。このＥＬＩＳＡデータは、これらの抗体が、ほぼ同一の親和性を有する末端切断された球状凝集体を認識することを示している。図６及び７は、合わせて、抗体Ａが、（ＮＭＲによって得られた構造データによって以下に記載されているように）球状凝集体エピトープに対して高度に選択的であることを示している。抗体Ｃ、Ｄ及びＢは、アミロイドの短縮化された２０−４２配列形態（図２）を好む程度が異なる。末端切断されたアミロイドに対する選択性の最も大きな差は、抗体Ｂによって示されている。エピトープ相互作用のこれらの差に基づいて、抗体Ｃ又はＤ抗体と同様のエピトープ結合特性を有する抗体がより好ましく、抗体Ａのエピトープ結合特性を有する抗体は、２０から４２（又は２０から４３）アミロイド配列範囲内に含有された球状凝集体エピトープへの結合に対して最も好ましい。
【０１７８】
合成アミロイドβ及びＡＰＰの９つの異なる調製物に対する一連のｍＡｂ（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）のドットブロット分析を行った（データは、示さず。）。図５、６及び７に図示されているＥＬＩＳＡの結果を確認する他に、これらのドットブロットは、以下に示されたＮＭＲ構造データとともに、反応性エピトープの最も好ましい実施形態、特に、βアミロイド立体構造スイッチの「閉鎖された」形態を確立するための基礎も成す（図３）。この閉鎖された形態では、エピトープは露出されており、免疫反応に対して利用可能である。「開放」形態では、アミロイド原繊維は、急速に凝集して、より大きい完全に平行なシート構造を形成し、従って、もはや異なるエピトープとして利用できない。原繊維形態は、ほとんど専ら、モノクローナル抗体Ｃと反応するのに対して、モノクローナル抗体Ａはグルタルジアルデヒド架橋及び末端切断されたアミロイド２０−４２を有する、又は有しない球状凝集体と反応する。モノクローナル抗体Ｄ及びＢは、サーモリシンで末端切断された又はサーモリシン及びＥｎｄｏＧｌｕＣの両者で末端切断された配列１２−４２と反応する（データは図示せず。）。
【０１７９】
ＥＬＩＳＡ材料：マイクロタイタープレートは、Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ， Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｂ Ｓｕｒｆａｃｅ、平底（カタログ番号４３９４５４）であった。コンジュゲート（二次抗体）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得たロバ抗マウスＨＲＰＯコンジュゲート（カタログ番号７１５−０３５−１５０）であった。ＨＲＰＯ基質は、３，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン液体基質（ＴＭＢ）、Ｓｉｇｍａ（カタログ番号Ｔ４４４４）であった。無脂肪乾燥ミルク（ＮＦＤＭ）は、ＢｉｏＲａｄ（カタログ番号１７０−６４０４）から入手した。全ての他の化学物質は、一般的な入手先から得た。
【０１８０】
緩衝液及び溶液：ＰＢＳＴ緩衝液：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて作製されたＳｉｇｍａＰＢＳ。０．５％ＢＳＡを有するＰＢＳＴは、１００ｍＬＰＢＳＴ中に０．５ｇＢＳＡを溶解することによって作製した。ブロッキング溶液は、ＰＢＳＴ中の３％ＮＦＤＭであった。コンジュゲート希釈剤は、ＰＢＳＴ中の１％ＮＦＤＭであった。コーティング緩衝液は、１００ｍＭＮａＨＣＯ_３ｐＨ８．２であった。ＨＲＰＯ停止溶液は、２ＭＨ_２ＳＯ_４であった。
【０１８１】
ＥＬＩＳＡプレートコーティング：検査すべきアミロイド球状凝集体は、１．０μｇ／ｍＬになるように、コーティング緩衝液中に希釈した。コートされるべき各ウェルに、１００μＬを添加した。プレート密閉フィルムで、ウェルを密閉し、４℃で一晩放置した。
【０１８２】
プレートのブロッキング：ウェルから、コーティング溶液を取り出した。ＰＢＳＴ１５０μＬで、ウェルを２から３回洗浄した（場合によって実施する。）。ブロッキング溶液３００μＬを添加した（ＰＢＳＴ中の３％ＮＦＤＭ）。次いで、プレート密閉フィルムでウェルを被覆し、撹拌しながら、室温で約２時間温置した。
【０１８３】
ＥＬＩＳＡ一次抗体：ウェルから、ブロッキング溶液を取り出した。ＰＢＳＴ１５０μＬで、２から３回洗浄した（場合によって実施する。）。一次抗体溶液１００μＬを添加した。完全長ｍｅｔ＋Ａβ１−４２球状凝集体に対して、抗体５Ｆ７０．０４から１００μｇ／ｍＬの溶液を使用した。０．５％ＢＳＡを有するＰＢＳＴを用いて、抗体を希釈し、プレート密閉フィルムで被覆し、撹拌しながら、室温で約２から３時間温置した。
【０１８４】
ＥＬＩＳＡ二次抗体（ＨＲＰＯコンジュゲート）：ウェルから、一次抗体溶液を取り出し、ＰＢＳＴ１５０μＬで２から３回洗浄し（必須）、１％ＮＦＤＭを有するＰＢＳＴ中に１：５０００で希釈された二次抗体（ＨＲＰＯコンジュゲート）溶液２００μＬを添加した。プレート密閉フィルムでウェルを被覆し、撹拌しながら、室温で約１時間温置した。
【０１８５】
基質の展開：ウェルから、コンジュゲート溶液を取り出し、ＰＢＳＴ２００μＬで２から３回洗浄した（必須）。次いで、ＨＲＰＯ基質溶液１００μＬを、各ウェルに添加した。次いで、観察しながら、呈色を行った（すなわち、青）。（反応は、通常、室温で５から１０分間行われる。各ウェルに、停止溶液５０μＬを添加すると、色は、青から黄色に変化した。マイクロタイタープレートリーダーを用いて、Ａ５０ｎｍでウェルを読み取った。停止溶液の添加から３０分以内に読み取ることが推奨される。
【０１８６】
球状凝集体のサーモリシンによる末端切断：約２０ｍＬ中の球状凝集体９ｍｇに、ＰＢＳ中の４ｍｇ／ｍＬサーモリシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）４５μＬ（サーモリシン１８０μｇ又は９０００μＬ／１８０μＬは、約１対５０（ｖ／ｖ）の希釈に等しい。）を添加した。室温で一晩、反応を進行させた。翌朝、反応混合物は、肉眼で見て透明であった。サーモリシン反応を停止させるために、０．５ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加した。分析用の最終生成物を調製するために、以下のようにクロマトグラフィーを行った。水酸化アンモニウムを用いて、末端切断された球状凝集体１ｍＬをｐＨ１０になるように調整した。次いで、ＳＤＳ（ｐｏｌｙｍｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｍｈｅｒｓｔ ＭＡ．）を除去するために、これを７ｍｍポリマー逆相カラムにかけて、１％／分の勾配で溶出した。主な溶出された画分は、精製された末端切断された（２０−４２）球状凝集体を含有した。
【０１８７】
ドットブロット材料、操作及び試料の調製：様々な濃度（１００ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ及び０．１ｐｍｏｌ）で、Ｈａｍｉｌｔａｎシリンジを介して、約２から５ｍｍのスポット中に、ニトロセルロースペーパーシート（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔａｌｏｇ１６２−０１１３）Ｐｕｒｅ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（０．４５μｍ，ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．， ２０００ Ａｌｆｒｅｄ Ｎｏｂｅｌ Ｄｒｉｖｅ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上の抗原として、様々な合成アミロイドβ種及びアルツハイマー前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の一群をドット状に添加し、空気の流れによって乾燥させた。（レーン１−１０）。
【０１８８】
検出試薬：ＮＢＴ／ＢＣＩＰ錠剤（カタログ番号１６９７４７１）Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｎｎｅｎｗａｌｄ ２，８２３７２ Ｐｅｎｚｂｅｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ。
アルブミン、ウシ：ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（カタログＡ−７８８８）（ＢＳＡ）Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ ６３１７８。
ブロッキング：ＴＢＳ中の５％スキムミルク粉末
緩衝溶液：ＴＢＳ、２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ−ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ；ＴＴＢＳ、２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ＰＢＳ、２０ｍＭホスファート、ｐＨ７．４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ。
抗体Ｉ：ＴＢＳ中の１％スキムミルク粉末中の０．２μｇ／ｍＬ抗体（２０ｍＬ／膜＝＞４μｇＡｂ）
抗体ＩＩ：ＴＢＳ操作中の１％スキムミルク粉末中の抗マウス−ＡＰの１：５０００希釈（２０ｍＬ／膜＝＞４μＬＡｂ）
【０１８９】
手順
１）約１ｃｍの距離でドット状に添加された１μＬの抗原希釈（１から５）。
２）室温で１０分間乾燥させる。
３）ブロッキング：ＴＢＳ中の５％スキムミルク粉末３０ｍＬを添加し、室温によって１．５時間温置することによって膜をブロックする。
４）洗浄：容器を傾けてブロッキング溶液を移し、室温によって、１０分間、２０ｍＬＴＴＢＳで膜を洗浄する。
５）抗体Ｉ：０．２μｇ／ｍＬになるように、ＴＢＳ中の１％スキムミルク粉末中に一次抗体を希釈する。膜当り２０ｍＬを使用する。室温で一晩温置する。
６）洗浄：１０分間、２０ｍＬＴＴＢＳで２回、１０分間、２０ｍＬＴＢＳで１回。
７）抗体ＩＩ：１：５０００になるように、ＴＢＳ中の１％スキムミルク粉末中に二次抗体を希釈する。膜当り２０ｍＬを使用する。室温で１時間温置する。
８）洗浄：１０分間、２０ｍＬＴＴＢＳで２回、１０分間、２０ｍＬＴＢＳで１回。
９）展開：水２０ｍＬ中にＮＢＴ／ＢＣＩＰ１錠を溶解する。容器を傾けて洗浄溶液を移し、展開溶液とともに、約１０分間、膜を覆う。
封鎖（Ｂｌｏｃｋ ｕｐ）：水で洗浄する。
【０１９０】
各試料は、以下のように調製した。
【０１９１】
アミロイドβ（１−４２）球状凝集体は、「Ｓ． Ｂａｒｇｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．ＪｏＮ．２００５，９５，８３４−８４７」に従って調製した。ＨＦＩＰ中のアミロイドβ（１−４２）は、以下のように調製した。１ｍｇ／ｍＬアミロイドβ（１−４２）を、３７℃で１．５時間、ＨＦＩＰ中に溶解した。ｓｐｅｅｄ ｖａｃ中で乾燥させた。乾燥された材料を、ＤＭＳＯ中に再懸濁した。０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を加えたＰＢＳ中に希釈し、２０℃で１時間撹拌した。３０００ｇで２０分間遠心した。１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を加えたＰＢＳ中にペレットを再懸濁し、２０秒間音波処理し、水中に１：６．７希釈し、２０℃で１時間撹拌した。次いで、２０分、３０００ｇで試料を遠心し、容器を傾けて上清を移し、−８０℃で保存した。
【０１９２】
アミロイドβ（２０−４２）球状凝集体は、上述のように、アミロイドβ（１−４２）球状凝集体から調製した。
【０１９３】
架橋されたアミロイドβ（１−４２）球状凝集体は、以下のように、アミロイドβ（１−４２）球状凝集体から調製した。１ｍｇ／ｍＬアミロイドβ（１−４２）球状凝集体を、室温で２時間、１ｍＭグルタルアルデヒドで処理した後、室温で３０分間、５ｍＭエタノールアミン処理を行った。
【０１９４】
ＡＤＤＬは、「Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９５，６４４８−６４５３，１９９８」に従って調製した。
【０１９５】
末端切断されたアミロイドβ（１２−４２）球状凝集体は、以下のように調製した。２０℃で２０時間、アミロイドβ（１−４２）球状凝集体を、１／９３（ｖ／ｖ）ＥｎｄｏＧｌｕＣプロテイナーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を処理し、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＩＦＰ）の過剰で反応を停止し、次いで、３０ｋＤ分子量カットオフｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐを用いてこれを濃縮し、透析液が０．１％ＳＤＳ含量となるように調整して、１／４ＰＢＳに対して透析し、透析後に、−８０℃で保存した。
【０１９６】
ＨＦＩＰ中のアミロイドβ（１−４０）は、以下のように調製した。１ｍｇ／ｍＬアミロイドβ（１−４０）を、３７℃で１時間、ＨＦＩＰ中に溶解した。ｓｐｅｅｄｖａｃ中で乾燥させ、乾燥した材料を、ＤＭＳＯ中に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０１９７】
０．１％ＮＨ_４ＯＨ中のアミロイドβ（１−４０）を以下のように調製した。０．１％ＮＨ_４ＯＨ中に、１ｍｇ／ｍＬアミロイドβ（１−４２）を溶解し、−８０℃で保存した。
【０１９８】
アミロイドβ（１−４２）原繊維は、以下のように調製した。０．１％ＮＨ_４ＯＨ中に、１ｍｇ／ｍＬアミロイドβ（１−４２）を溶解し、ＰＢＳ中に１：４希釈し、ｐＨ７．４になるように、ｐＨをＨＣｌで調整し、３７℃で２０時間温置し、１００００×Ｇで１０分遠心し、ＰＢＳ中にペレットを再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０１９９】
ＡＰＰ（第一のドット：１ｐｍｏｌ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯによって供給された。
【０２００】
予想されなかった構造的特徴及び生物物理学的特徴：
ａ）水力学的特徴
図１０は、組み換えＭｅｔＡ−β１−４２から調製された球状凝集体の水力学的分析（沈降速度及び動的光散乱（ＤＬＳ；ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）の結果を図示している。上のパネルは、上記のように調製され、２．５ｍＭリン酸ナトリウム、０．６５ｍＭＫＣｌ、３４．５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で遠心された組み換えＭｅｔ−Ａβ球状凝集体に対する一連の代表的な沈降速度特性を示している。矢印によって記されているように、走査時間は右方向に増加し、特性は、ＢｅｃｋｍａｎＸＬＩ分析用超遠心によって作製されたＳ字形状の一連の各走査を含む。上のパネル中のｘ軸は、遠心の中心からのｃｍであり、ｙ軸は、干渉縞の相対変位である。下のパネルは、Ｓｃｈｕｃｋ（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０００， ７８：１６０６−１６１９）に従って、ＳＥＤＦＩＴを用いて計算された、全分析時間にわたる完全な沈降分布（上のパネル）のＣ特性を図示している。動的光散乱から得られたＣ分析及び個別の結果が、図面中に要約されている。それらは、球状凝集体が、約１４Ｍｅｔ−Ａ−β単量体（１４×４６４５）＝６５０３０Ｄａを含む球状凝集体に対応する約６３ｋＤａの分子量を有することを示している。
【０２０１】
ｂ）分析的超遠心、沈降速度実験のための実験用プロトコール：
サファイアウィンドウを用いて、標準的な２区画セル中に試料を加えた。４穴又は８穴ローターの何れかを用いて、全ての試料を調べた。条件は以下のとおりであった。温度：２０℃、ローター速度：４２，０００ｒｐｍ、干渉データを収集した。０．００３ｃｍの放射状ステップサイズを用いた連続モードにおいて、２８０ｎｍの吸光度データを収集した。ステップごとに１つのデータポイントを集めた（シグナルの平均化は行わない。）。典型的には、９時間以下の期間にわたって、２００又はそれ以下の走査を収集した。
【０２０２】
ｃ）データのフィッティング：
データのフィッティングを行うために、２つの相補的な方法を使用した。試料の全体的な不均一性を理解するために、ＳＥＤＦＩＴｖ８．９（Ｓｃｈｕｃｋ，２０００）で実行されるとおりに、連続的Ｓ分布分析（Ｃ分析、図７）を実施した。放射状及び時間非依存性ノイズの両方のフィッティングを行い、最大エントロピーアルゴリズムを用いてデータから除去した。プログラムＳＶＥＤＢＥＲＧ（Ｐｈｉｌｏ，Ｊ．Ｓ．，１９９７，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，７２：４３５−４４４）を用いて、改変されたＦｕｊｉｔａ−ＭａｃＣｏｓｈａｍ関数に、生の移動境界特性（図６、上のパネル）をフィッティングさせた。これによって、沈降係数（Ｓ）及び拡散係数（Ｄ）をともに測定することが可能となり、従って、モデルによって指定された種の分子量（Ｍｒ）の計算が可能となる。この分析では、走査は視覚的に検査され、適切な走査のみを使用した。走査を選ぶための基準には、メニスカスからの十分なクリアランス及び十分なプラトー領域が残存していること（すなわち、極端に沈降しないこと）が含まれた。モデルは、単一の種及び複数の種（最大３）を含んだ。
【０２０３】
ｄ）フィッティングからの結果：
Ｃ分析：Ｃ分析は、主に、約４のＳを有する単一の種を示唆し、より高次の凝集体の若干量も存在した。このより大きな種のピークは若干広く、分割されていない複数の種が存在し得ることを示唆する。摩擦係数ｆ／ｆ_ｏは、全般的に（全ての種）、ｆ／ｆ_ｏ＝１．５４にフィットし、存在するオリゴマーが単純な球体でないことを示唆する。
【０２０４】
ＳＶＥＤＢＥＲＧ分析：単一種を用いてデータのフィッティングを行うことは可能であったが、潜在的な追加の種を付加すると、よりよいフィッティングが得られた。フィッティングの改善は、残差の全体的な変動がより少ないこと、及び適合度パラメータが３８％低下したことによって判断した。主成分（種の逆重畳に基づくと、材料の９２％）については、フィッティングは、Ｓ_２０，ｗ＝４．１及びＳ_２０，ｗ＝５．５の値を与える。これらの値を用いて、約６８ｋＤａのＭｒを得、約１４ペプチド単位のオリゴマーを示唆していた。ｆ／ｆ_０＝１．４２の形状係数が得られ、同じく、より扁長な球体を示唆した。より大きなＳ値の幅広い分布によって、非主要成分が示され、これらは、分離されていないより高次の多数の凝集体の少量（１０％未満）から構成される可能性があることを示唆している。結果を視覚的に明瞭にすることができる相補的な分析アプローチは、球状凝集体集合中のオリゴマーの特定数に相当する分子量の固定された値にモデルをフィッティングさせることである。次いで、これらのフィッティングから得られた残余誤差の二乗の合計を、球状凝集体サイズの想定可能な各増分に対してプロットする。この分析は、２成分フィッティングに対して、図２１に示されている（主成分は球状凝集体であり、非主成分はより高次の種である。）。このプロットでは、提唱されている凝集体の分子量を（Ｍｒ＝４６４５の増分として）固定することによって、主成分Ａβペプチドのオリゴマー状態を１０から１８に固定し、ＳＶＥＤＢＥＲＧ中でフィッティングを行った。各強制的フィッティングに対する球状凝集体当りのペプチドの数に対して、得られた適合度パラメータ（二乗の合計）をプロットした。最小値（最も低いフィッティング誤差）は、球状凝集体当り約１４ペプチドのオリゴマー状態とともに生じる。
【０２０５】
総合すると、沈降分析は、約３．６ｎｍの球体相当半径を示唆するのに対して、ＤＬＳは、約３．９ｎｍの値を示唆する。ＤＬＳ研究は、ＡＰＤ検出器を装着したレーザー光散乱システム（ＡＬＶ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。レーザー波長は、クリプトンイオンレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＣＡ）の６４７ｎｍ線であり、４０と１５０度の間の散乱角度が選択された。試料は、２０℃の槽調節された温度で測定された。複数の成分に対する相関関数の分析は、正則化を用いて行った（ラプラス反転アルゴリズム（例えば、ＳＰＩＥ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｖｏｌ．１４３０“Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｅｄ．Ｋ．Ｓ．Ｓｃｈｍｉｔｚ，ＩＳＢＮ：０−８１９４−０５２０−５，２６６ｐａｇｅｓを参照されたい。）。１５８度の散乱角度を用いた後方散乱ＡＰＤ検出を行いながら、ＤＬＳ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＤｙｎａＰｒｏ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｗｙａｔｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡ）を用いて、さらなるＤＬＳ測定を実施した。ダイオードレーザは、８１９．７ｎｍの発光を有する。温度は、モニターされているが、調節されていない（Ｔ約２５Ｃ）。
【０２０６】
ｅ）球状凝集体の原子間力顕微鏡：
図１４は、球状凝集体（上のパネル）及び金ナノ球体（下のパネル）の代表的なＡＦＭ走査を図示している。Ｘ及びＹ軸のサイズは等しく、長さ２５０ｎｍのマーカーが、それぞれに対して示されている。同一の設定条件下で、各試料を走査し、各事例において、球状凝集体及びナノ球体は、３から５ｎｍの高さに及ぶようである（Ｚ軸）。Ｚ軸の絶対的な較正は、溝を２０ｎｍの深さに設定して、ＮＩＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３Ｄ参照標準を用いて行った。標準物質は、Ｖｅｅｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ ＮＹの一部門であるＮａｎｏｄｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した。この標準物質からの反復した高さ測定（Ｎ＝１０）によって、０．２２８ｎｍの標準偏差で、１９．９０９ｎｍの平均高が明らかとなった。Ｖｅｅｃｏ／Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓは、ゼロから２０ｎｍの範囲まで、高さ測定の較正が線形であることを保障している。球状凝集体の高さ範囲内でのＡＦＭの性能を測定し、Ｘ及びＹ次元での測定に対する、ＡＦＭ先端部の側方への歪みを推定するために、ＡＦＭによって、コロイド状金ナノ球体（平均直径５ｎｍ）を測定した。金ナノ球体は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， カタログ番号Ｇ−１４０２，ｌｏｔ１０３Ｋ９１８５１）から購入し、Ｓｉｇｍａの技術専門家は、粒子は、３．５から６．５ｎｍのサイズ範囲を示すはずであると述べた。タッピングモードＡＦＭで典型的に使用される力では、金ナノ球体は、ＡＦＭ画像化ツールの先端によって圧縮されないので、これらの球体を使用した。比較すると、アミロイド凝集体は、ＡＦＭによって画像化されたときに、僅かに歪むことが以前に示されている（Ｓｔｉｎｅ ｅｔ．ａｌ．， １９９６）。製造業者（Ｖｅｅｃｏ／Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）は、ＡＦＭ先端部の曲率半径が１０ｎｍであることを明記している（Ｖｅｅｃｏ ｍｏｄｅｌ ＃ ＴＥＳＰ、先端部は、実際に、ＮａｎｏＷｏｒｌｄ ＡＧ， Ｎｅｕｃｈａｔｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって製造された；ｔｙｐｅ：ＮＣＨ−Ｗ， Ｕｎｉｔ Ｎｏ．：１２５４３Ｌ３２０、バネ定数２８−５４Ｎ／ｍ）。画像測定に基づくと、金ナノ球体（実際には３から５ｎｍ）は直径約１５ｎｍであるように見受けられ、４から７の側方画像ゆがみ係数が示唆された。上の図の単一の画像化された球状凝集体は、約２３ｎｍ、すなわち、側方のゆがみを除去すれば、約３．２から４．２ｎｍを測定した。これらの大きさは、水力学的及び光散乱分析から測定された球体相当半径と一致した（上記）。
【０２０７】
Ｂａｒｎｓｔｅａｄ ＮＡＮＯｐｕｒｅウォーターシステム（ＡＰＳ Ｗａｔｅｒ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ｖａｎ Ｎｕｙｓ， ＣＡ）から得た水を用いて、０．０２９ｍｇ／ｍＬの濃度になるように試料を希釈した。使用前に水の伝導率をモニターし、使用した水は全て、１８．０ＭΩ⁻ｃｍの最小伝導率を有していた。堆積の前に、１４０００ｒｐｍで１０分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｃ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）上で試料を遠心した。直径１／２”の切断された直後の雲母ディスク（Ｒｕｂｙ Ｒｅｄ Ｍｉｃａ Ｓｈｅｅｔｓ， Ｃａｔ．＃７１８５０， Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｔ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＰＡ）上に、試料２０μＬを堆積した。湿った紙タオルを入れた閉じたペトリ皿中に各試料を配置し、７分間温置させた。次いで、ＮＡＮＯｐｕｒｅ水（５から２００μＬ分取試料）１ｍＬで各試料を濯ぎ、穏やかに流れている空気流の下で乾燥させた。
【０２０８】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は、Ｖｅｅｃｏ／Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＩＩａ（Ｖｅｅｃｏ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ）上で行った。タッピングモードＡＦＭは、ＴＥＳＰ先端部（ｆ_０約２８０ｋＨｚ）を使用して行った。高さ及び振幅両モードで、４ｎｍ、２ｎｍ及び１ｎｍでの画像を収集した。「高さモード」画像の切片分析を用いて、各球状凝集体の高さを測定した（Ｓｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．，１５，１９３−２０３を参照されたい。）。
【０２０９】
図１２、１３及び１４は、ＳＤＳなし（図１２）、０．０５％ＳＤＳ（図１３）及び０．２％ＳＤＳ（図１４）で可視化された、球状凝集体の代表的なＡＦＭ画像を図示している。Ｍｅｔ−Ａβペプチドのこれらの濃度で（３０μｇ／ｍＬ単量体濃度又はそれ以上）、ＳＤＳの存在下において、ペプチドは大きい密な原繊維凝集体を急速に（数十分）形成する傾向は大幅に低減され、これらのより高次の原繊維凝集体の形成に対して、ペプチドはＳＤＳによって安定化される。総合すると、ＳＤＳ処理を通じて球状凝集体を作製することは、より大きな原繊維形態への急速な凝集に対して、球状凝集体を安定化させる。ＳＤＳのドデシル硫酸鎖上のサルファート部分は、ペプチドの球状凝集体集合物に結合された、負に帯電したサルファート基間の電荷−電荷反発によって、より大きな種への凝集を遮断するように作用すると考えられる。ＳＤＳ濃度は、球状凝集体を調製する過程で低下されるので（図８）、透析後には、残留量が残るに過ぎない。この操作によって得られたペプチドの球状凝集体集合体の独特の構造／立体構造（図２０から２４）は、（自然の立体構造のために）、これにより、何十万又は何百万ダルトンもの分子量を有する巨大な原繊維凝集体を形成する急速な凝集が妨げられる。これらの安定化された球状凝集体は、ヒト自己抗体及びマウスモノクローナル抗体の両方と反応する特有のエピトープ領域（アミロイド原繊維上のエピトープとは異なる。）を提示する（図５から７）。生物学的には、アミロイドペプチドのインビボでの生成は、細胞膜の天然環境中で生じる（図２３）。この状況では、アミロイドペプチドは、細胞膜に常に曝露され、細胞膜内に包埋されることさえある。この膜が両親媒性生物脂質の二重層から構成されていることは、一般的な生物学的知識である。従って、球状凝集体を作製するために使用されるＳＤＳは、細胞脂質膜の天然の両親媒性環境を模倣していると予測される。この両親媒性環境では、アミロイドは、先述のエピトープ領域を提示する（曝露する）球状凝集体構造へ自己集合する。
【０２１０】
インビトロでこのプロセスによって得られた球状凝集体は、適切な治療用（遮断）モノクローナル抗体の選択及び設計で使用するためのエピトープとして提示されるペプチド二次構造を決定する上で有用である（図１７から２４）。これらの球状凝集体は、アルツハイマー病に対する能動免疫のためのワクチンの候補を作製する上でも使用される。さらに、これらの球状凝集体は、球状凝集体形成を遮断し、又は他の細胞実体との球状凝集体の相互作用を変化させ、これにより、疾病の進行を低下又は停止させることができる小分子剤（薬物）の送達用ツール分子としての有用性も有する。さらに、安定化された球状凝集体は、疾病の傾向を予測し、治療剤の効力をモニターするための診断検査法の作製のためにも使用され得る。公知の天然脂肪酸又は界面活性剤など、単独の又は組み合わせた、ＳＤＳ以外の両親媒性因子も、インビトロで球状凝集体を調製する上で有用であると予想される。球状凝集体を調製する上で有用と予測される化学因子の一部のリストには、以下の種の１つ又はそれ以上が含まれる。
【０２１１】
オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、１１，１４−エイコサジエン酸、１３−ドコセナミド、１３−エピ−１２−オキソフィトジエン酸、１３（Ｚ）−ドコセン酸、１７−オクタデシン酸、１−アラキドノイルグリセロール、１−アラキドノイルグリセロール−ｄ５、２−アラキドノイルグリセロール、２−アラキドノイルグリセロール−ｄ５、２−アラキドニルグリセロールエーテル、２−フルオロパルミチン酸、２−ヒドロキシミリスチン酸、２−リノレオイルグリセロール、３−チアテトラデカン酸、４，５−デヒドロドコサヘキサエン酸、５，６−デヒドロアラキドン酸、７，７−ジメチル−５，８−エイコサジエン酸、８，１１−エイコサジイン酸、９，１２−オクタデカジイン酸、９−オクタデセナミドアドレン酸、α−リノレン酸、α−リノレノイルエタノールアミドアラキドン酸、アラキドン酸−ｄ８、アラキドン酸メチルエステルアラキドン酸（過酸化物なし）、アラキドン酸（ナトリウム塩）、アラキドノイルエタノールアミド、アラキドノイルエタノールアミド−ｄ８、アラキドノイルグリシン、アラキドノイルｍ−ニトロアニリン、アラキドノイルｐ−ニトロアニリン、アラキドニルトリフルオロメチルケトン、シス−パリナリン酸、共役リノール酸（１０Ｅ、１２Ｚ）、共役リノール酸（９Ｅ、１１Ｅ）、共役リノール酸（９Ｚ、１１Ｅ）、デカノイルｍ−ニトロアニリン、デカノイルｐ−ニトロアニリン、ジホモ−γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸エチルエステル、ジホモ−γ−リノレン酸メチルエステル、ジホモ−γ−リノレノイルエタノールアミド、ドコサヘキサエン酸、ドコサヘキサエン酸−ｄ５、ドコサペンタエン酸、ドコサテトラエノイルエタノールアミド、ドコサトリエン酸、エイコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸（過酸化物なし）、エイコテトライン酸、エイコサトリエン酸（１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ）、エイコサトリエン酸（５Ｚ、８Ｚ、１１Ｚ）、エイコサトリイン酸、エライジン酸、γ−リノレン酸、ラウリン酸、リノエライジン酸、リノール酸、リノール酸−ｄ４、リノール酸（過酸化物なし）、リノレオイルエタノールアミド、ミード酸エタノールアミド、メチルα−リノレニルフルオロホスホナート、メチルアラキドニルフルオロホスホナート、メチルγ−リノレナート、メチルγ−リノレニルフルオロホスホナート、Ｎ−オレオイルグリシン、Ｎ−オレオイルタウリン、Ｎ−パルミトイルタウリン、Ｎ−ステアロイルタウリン、オレイン酸、オレイン酸−２，６−ジイソプロピルアニリド、オレオイルエタノールアミド、オレイルアニリド、オレイルトリフルオロメチルケトン、ω−３アラキドン酸、ω−３アラキドン酸−ｄ８、パルミチン酸、パルミトイルエタノールアミド、パルミチルトリフルオロメチルケトン、フィタン酸、ステアリドン酸、ステアリドン酸メチルエステル、ステアロイルエタノールアミド、トラウマト酸、ウンベリフェリルアラキドナート、１−ブタンスルホン酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、（ドデシル硫酸ナトリウム）ドデシル硫酸リチウム、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、２−ヒドロキシ−３−スルホプロピルドデカノアート、Ｎ−ラウリルサルコシンジオクチルスルスクシナート、ＤＯＳＳ、ジ−２−エチルヘキシルスルホスクシナート及びナトリウム塩。
【０２１２】
ｆ）球状凝集体の等温滴定熱量測定：
図１５は、組み換えＭｅｔＡ−β１−４２から調製された球状凝集体へのモノクローナル抗体Ａの結合から得られた結果を示している。結合は、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）によって直接測定された。この例では、熱量測定装置のセルは、（単量体単位を基礎として）８６μＭの濃度で、アミロイドβを含有した。これは、１３２μＭのＡ抗体で滴定された。何れも、ｐＨ７．４の３５ｍＭＮａＣｌを加えた５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に存在した。フィッティングによって決定された解離定数（結合のＫｄ）は４９０ｎＭ（又は０．４６μＭ）であり、結合の観察されたエンタルピーは、−４７．５ｋＪ／モルであり、結合の見かけの化学量論は、６．３アミロイドβ分子／抗体分子であった。水力学的分析（図１３及び２１）と総合すると、これは、球状凝集体単位当り約２個の抗原結合部位を示唆する。
【０２１３】
ｇ）ＮＭＲ特性：
試料の調製：同位体は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＩｓｏｔｅｃから購入した。ＮＭＲ研究用に調製された標識された全ての試料に対して、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉａ［Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９］を使用した。Ｎ−Ｍｅｔ１−４２ペプチドを、ｐＥＴ２９ａベクター中にクローニングし、Ｅ．コリ株ＢＬ２１中に発現した（ＤＥ３）。ＯＤが１．０に達するまで、震盪フラスコ中において、細胞を３６℃で増殖させ、次いで、４２℃で２時間発現させた。Ｈ_２Ｏ培地中の１ｇ／Ｌ^１５ＮＨ_４Ｃｌ及び３ｇ／Ｌグルコースとともに、均一に［^１５Ｎ］標識された試料を増殖させた。Ｄ_２Ｏ培地中の１ｇ／Ｌ^１５ＮＨ_４Ｃｌ及び３ｇ／ＬＤ−グルコース−ｄ_１２とともに、均一に［^１５Ｎ，^２Ｈ］標識された試料を増殖させた。Ｄ_２Ｏ培地中の１ｇ／Ｌ^１４ＮＨ_４Ｃｌ及び３ｇ／ＬＤ−グルコース−ｄ_１２とともに、均一に［^１４Ｎ，^２Ｈ］標識された試料を増殖させた。１００％Ｄ_２Ｏ培地中の１ｇ／Ｌ^１４ＮＨ_４Ｃｌ及び３ｇ／Ｌ［^１３Ｃ，^２Ｈ］−グルコース−ｄ_１２とともに、均一に［^１５Ｎ，^２Ｈ，^１３Ｃ］標識された試料を増殖させた。１００％Ｄ_２Ｏ、Ｄ−グルコース−ｄ_１２（３ｇ／Ｌ）及び^１５ＮＨ_４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ）を含有する培地中で細胞を増殖させ、３−^１３Ｃ−α−ケトブチラート（５０ｍｇ／Ｌ、イソロイシンメチル基を標識するため）、及び３，３−^１３Ｃ_２−α−ケトイソバレラート（１００ｍｇ／Ｌ、バリン及びロイシンメチル基を同時に標識するため）を培地に補充することによって、^２Ｈバックグラウンド中に、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ残基の選択的に^１３Ｃ標識された、プロトン化されたメチル基を有する均一に［^１５Ｎ］標識された試料を調製した。発現されたペプチドは、実施例３で上述されているように精製した。Ｂａｒｇｈｏｒｎらの公表されたプロトコール（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００５ ９５，８３４−８４７）を使用することによって、ＮＭＲ試料を調製し、約１．５％ＳＤＳ−ｄ_２５及びｐＨ７．４の１×リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＧＩＢＣＯ）を含有する緩衝液中に、１６ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるように濃縮した。混合された試料を調製する場合、試料調製のためのプロトコールに供する前に、異なる標識スキームを有する精製されたペプチドを１：１の比率で混合した。
【０２１４】
ＮＭＲ分光法：ＢｒｕｋｅｒＤＲＸ６００又はＤＲＸ８００ＮＭＲ分光光度計上で、２５℃で、ＮＭＲスペクトルを収集した。均一に［^１５Ｎ，^２Ｈ，^１３Ｃ］標識された試料を用いた三重共鳴実験（ＨＮＣＡ，ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ，ＨＮ（ＣＡ）ＣＢ，ＨＮ（ＣＯＣＡ）ＣＢ）［Ｔ．Ｙａｍａｚａｋｉ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，１１６５５−１１６６６，（１９９４）］を用いて、骨格の^１Ｈ、^１５Ｎ及び^１３Ｃ共鳴を割り当てた。^１Ｈ_α及び側鎖シグナル共鳴は、均一に^１５Ｎ標識された試料を用いて、^１５Ｎ編集されたＮＯＥＳＹスペクトルから割り当てた［Ｓ．Ｗ．Ｆｅｓｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．７８，５８８−５９３，（１９８８）；Ｇ．Ｍ．Ｃｌｏｒｅ， ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３９，３４９−３６３，（１９９４）］。骨格アミドＮＨ−ＮＨＮＯＥは、^２Ｈ骨格中のＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ残基の選択的に^１３Ｃ標識された、プロトン化されたメチル基を有する均一に［^１５Ｎ］標識された試料を使用することによって、３Ｄ^１５Ｎ分解されたＮＯＥＳＹ実験から割り当てた。^１５Ｎフィルターされ、及び^１５Ｎ編集された３ＤＮＯＥＳＹ実験は、［Ｕ−^１５Ｎ_，^２Ｈ］標識され、及び［Ｕ−^１４Ｎ、^２Ｈ］標識された試料が、１：１の比で混合されている混合された試料を使用することによって、以前に記載されているように実施した［Ｍ．Ｉｋｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，２４３３−２４４０，（１９９２）；Ｇ．Ｗ．Ｖｕｉｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，９２０６−９２１０，（１９９４）］。ＩＶＬ残基の選択的に^１３Ｃ標識された、プロトン化されたメチル基を含有する、［Ｕ−^１５Ｎ，^２Ｈ］標識されたペプチドは、［Ｕ−^１４Ｎ，^２Ｈ］標識されたペプチドと、１：１の比で混合されている別個の混合された試料を、^１５Ｎフィルターされ、及び^１５Ｎ編集された３ＤＮＯＥＳＹ実験において使用した。これらの実験において使用されるＮＯＥＳＹ混合時間は、８０から４００ｍ秒の範囲にわたった。
【０２１５】
構造計算：βアミロイドペプチドＮ−ｍｅｔ１−４２の反復単位の構造は、プログラムＣＮＸ［Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４（Ｐｔ５），９０５−２１，（１９９８）］を使用するシミュレートされたアニーリングプロトコール［Ｍ．Ｎｉｌｇｅｓ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２９，３１７−３２４，（１９８８）］を用いて計算された。ＮＭＲデータの分析から得られる計１７８の距離制限を、構造計算中に含めた。さらに、Ｃ_α及びＣβ化学シフトの分析に基づいて、構造計算中にβシート領域中の４４のφ角度制限を含めた［Ｇ．Ｃｏｒｎｉｌｅｓｃｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ １３，２８９−３０２，（１９９９）］。
【０２１６】
結論として、アミロイドβペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２（Ａβ１−４２と称される。）の適切な球状凝集体を調製し、ＮＭＲによって研究した。９０％Ｈ_２Ｏ／１０％Ｄ_２Ｏ溶液中の^１５Ｎ標識されたＡβ１−４２の^１５Ｎ／^１Ｈヘテロ核単一量子相関分光法（ＨＳＱＣ；ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）スペクトル（図２３Ａ）は、スペクトル中のクロスピークが十分に分散されており、溶液中の折り畳まれていないペプチドの化学シフトに比べて低磁場の方向に大きくシフトしていることを明確に示している。１００％Ｄ_２Ｏ溶液中への交換後、低磁場方向にシフトされたアミドは、１日後に、Ｄ_２Ｏ中になお明確に観察され（図１６Ｂ）、これらのアミドプロトンが、溶媒から遮蔽されており、おそらく、水素結合されていることを示唆している。これらの結果は、Ａβ１−４２の観察可能な形態は、溶液中で高度に構造化されていることを示している。
【０２１７】
さらに、Ａβ１−４２の均一に^２Ｈ、^１５Ｎ及び^１３Ｃ標識された形態に対して、形態一連のＮＭＲ三重共鳴骨格実験を収集した。^１５Ｎ／^１ＨＨＳＱＣスペクトル中のシフトされたクロスピークの多くは、各骨格アミドに割り当てられた。Ｃα及びＣβ共鳴の割り当てられた化学シフトに基づいて、２つのβ鎖は、Ｎ−ＭｅｔＡβ１−４２の残基１７−２３及び２８−３９に対して存在することが見出された（図１７及び２０）。異なる同位体標識された試料を使用することによって、^１５Ｎフィルターされ、及び^１５Ｎ編集された３ＤＮＯＥＳＹ実験において、観察された分子内ＮＯＥと分子間ＮＯＥが識別された。データ分析及び構造計算は、観察可能なＮ−ＭｅｔＡβ１−４２の構造は、混合された平行／反平行βシートを含有することを示す（図２０、２１及び２４）を示す。Ｎ−ＭｅｔＡβ１−４２に対するこれらの溶液ＮＭＲ研究は、球状凝集体経路中のペプチドの折り畳みは、Ｓｃｉａｒｒｅｔｔａら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ２００５，４４，６００３−６０１４）によって記載されているように、原繊維経路のフィブリロマー（ｆｉｂｒｉｌｏｍｅｒ）構造とは異なる構造を呈することを示唆している。最小反復鎖内及び鎖間相互作用は、本明細書で観察及び記載されているものである。
【実施例６】
【０２１８】
ハイブリドーマ細胞株の開発の例
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え及びファージディスプレー技術又はこれらの組み合わせの使用など、本分野で公知の多様な技術を用いて調製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、本分野において公知であり、例えば、「Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２ｎｄ ｅｄ． １９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ＣｅＩｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８１）」（前記参考文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。）に教示されているものなど、ハイブリドーマ技術を用いて作製することが可能である。本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通じて産生された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、あらゆる真核、原核又はファージクローンなど、単一のクローンに由来する抗体を表し、産生方法によらない。
【０２１９】
本明細書に記載されている１つのモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体Ａ）を作製するために使用される具体的なプロトコールは、以下のとおりである。
【０２２０】
マウスの免疫化：ＣＦＡ中の抗原５０μｇで、Ｂａｌｂ／ｃ及びＡ／Ｊマウス（６から８週齢）を皮下免疫した。計３回の強化免疫のために、Ｉｍｍｕｎｅａｓｙ^ＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）中の抗原５０μｇで、３週ごとに、動物に強化免疫を行った。融合の４日前に、抗原１０μｇを静脈内からマウスに強化免疫した。
【０２２１】
細胞融合及びハイブリドーマスクリーニング：標準的な技術を用いて、５：１の比率で、免疫化された動物から得た脾細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合した。融合から７ないし１０日後に、巨視的コロニーが観察された時点で、Ａβ２０−４２への抗体に対するＥＬＩＳＡによって、ＳＮを検査した。ＥＬＩＳＡ陽性ウェルから得た細胞の規模を増大させ、限界希釈によってクローニングした。
【０２２２】
抗体イソタイプの測定：抗Ａβ２０−４２Ｍａｂのイソタイプは、ＺｙｍｅｄＥＩＡイソタイプ決定キットを用いて決定した。
【０２２３】
モノクローナル抗体のスケールアップ及び精製：５％の低ＩｇＧを含有する培地中に、ハイブリドーマを拡大させた。ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）。上清を採集し、濃縮した。プロテインＡクロマトグラフィーを用いてＭａｂを精製し、ＰＢＳ中に透析した。
【０２２４】
血清の力価：Ａβ２０−４２で、１０匹のマウスを免疫化した。１：５０００−１０，０００のＥＬＩＳＡ力価（１／２ＭａｘＯＤ４５０ｎｍ）で、全てのマウスを抗体陽転させた。
【０２２５】
本明細書に記載されているモノクローナル抗体Ａ、Ｂ及びＤは、アミロイドβタンパク質の非Ｍｅｔ形態を用いて作製されていた。本明細書に記載されているモノクローナル抗体Ｃは、アミロイドβタンパク質の非Ｍｅｔ１−４２形態を用いて作製された。
【実施例７】
【０２２６】
Ｃ^１４−ＳＤＳを用いた、Ａβ球状凝集体へのＳＤＳの結合
０．０５％ＳＤＳ段階で、Ａβ球状凝集体の１３．５ｍＬは、０．６２ｍＬに濃縮された。この濃縮された材料０．３ｍＬを、１０ｍＬのＥｃｏｎｏＰａｃＤＧ１０カラムにかけた。手で０．２５ｍＬ画分を集めた。図Ｘの挿入図は、遊離の単量体ＳＤＳが溶出する領域を、延長されたｙ軸とともに示している。ペプチド（黒四角）及びＳＤＳ（黒丸）の濃度並びにペプチドに対するＳＤＳの比（白三角）が示されている。球状凝集体のピークにわたるＳＤＳ／ペプチドの比（画分１４及び１５）は、ペプチドの１分子当りＳＤＳ約０．５から約１．５分子の間である。クロマトグラフィー分離は、サイズ排除クロマトグラフィーに供された際に、ＳＤＳがＡβペプチドと分離していることを示している。結果は、図２５に示されている。
【０２２７】
放射線標識された界面活性剤及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いた、タンパク質−界面活性剤凝集体中に結合された界面活性剤の量の測定は、文献において十分に確立されている。Ｔｒａｎｆｏｒｄと共同研究者は、ウシ血清アルブミン（Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８：４９２６−４９３２）、ＳＤＳ中の数個のタンパク質（Ｔａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９７４），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２３６９−２３７６）などの様々なタンパク質の研究においてこれを使用し、界面活性剤溶液中の膜タンパク質の性質決定のための一般的方法として引用されている（Ｔａｎｆｏｒｄ ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，（１９７６），ＢＢＡ，４５７：１３３−１７０）。Ｍｏｌｌｅｒと共同研究者らは、この方法を用いて、膜タンパク質への界面活性剤の結合の研究も行った（Ｍｏｌｌｅｒ ａｎｄ ｌｅＭａｉｒｅ，（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５８：１８６５９−１８６７２）。ＬｅＭａｉｒｅ及び共同研究者も、特にＣａ^２＋依存性ＡＴＰアーゼとともに、この方法を広く使用してきた（Ｒｉｖａｓ ｅｔａｌ．，（１９８２），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２３：１９４−２００）。主として、Ｈｕｍｍｅｌ ａｎｄ Ｄｒｙｅｒ（（１９６２），ＢＢＡ，６３：５３０−５３２）によって最初に記載されたタンパク質−リガンド相互作用の研究に関する初期の仕事に基づいて、Ｈｅｌｅｎｉｕｓ及びＳｉｍｍｎｓは、特にタンパク質界面活性剤相互作用を調べるために、この方法を改変した（（１９７２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７：３６５６−３６６１））。サイズ排除クロマトグラフィーカラム上で、界面活性剤がタンパク質とともに同時移動することは、タンパク質と界面活性剤間の間の物理的相互作用の証拠である。Ｈｅｌｅｎｉｕｓ及びＳｉｍｍｏｎｓ（同書）に従って、「タンパク質に結合された界面活性剤の量は、タンパク質とともに同時溶出した放射性界面活性剤の量から測定することができた。」
【０２２８】
この技術は、一つには、リガンド（球状凝集体の場合にはＳＤＳ）を含みながら、クロマトグラフィーゲルがタンパク質を効率的に排除するという要件に基づいている（Ａｎｄｒｅｕ，（１９８５），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１１７：３４６−３５４）。これらの実験において、本発明者らは、界面活性剤分子が単量体として溶液中で挙動するように、ＳＤＳのＣＭＣ（臨界ミセル濃度）未満で作業を行っている。単量体として、それらは、使用されているＤＧ１０などの脱塩樹脂の孔中に分配されるのに対して、Ａβ球状凝集体は排除される。従って、樹脂は、Ａβ球状凝集体及びこれらに結合された全てのＳＤＳから遊離のＳＤＳを効率的に分離することが可能である。Ａβ球状凝集体とともに同時移動することが見出されたＳＤＳは、結合されたと記述することができる。本方法の古典的な使用では、サイズ排除カラムは、ＳＤＳのバックグラウンドレベル中で平衡化される。次いで、タンパク質溶出に随伴していれば、このバックグラウンドレベルを上回って界面活性剤レベルが上昇するにつれて、タンパク質へのＳＤＳの結合が観察される。
【０２２９】
ここでは、緩衝液中に競合する界面活性剤が一切存在しない状態で、ＳＤＳ結合を検査した。クロマトグラフィーの間にＡβ球状凝集体から分配解離し得る何れかのＳＤＳを置換するための遊離のＳＤＳが即座に供給されないので、この方法は、結合されたＳＤＳをより厳格に探査する。しかしながら、クロマトグラフィーの間に（ゲルクロマトグラフィーマトリックス中に）分配するＳＤＳは、（球状凝集体に結合されているので）溶出しているＡβ球状凝集体から完全には分離されないので、溶出している球状凝集体ピークにわたって、ＳＤＳに対するペプチドの見かけの化学両論比の変化をもたらす。
【実施例８】
【０２３０】
アミロイドβペプチドの球状凝集体及び原繊維形態の骨格アミド保護の比較
球状凝集体骨格アミド交換実験：
液体窒素中で水性緩衝液中の球状凝集体試料を瞬間凍結し、一晩凍結乾燥させた。これらの凍結乾燥された試料の幾つかは、−７０℃で保存され、基準試料としての役割を果たす（Ｄ_２Ｏ中に存在しない。）。次いで、凍結乾燥された試料の残りを、Ｄ_２Ｏ中に溶解した。交換可能なＨ／Ｄ交換が生じる、４℃での様々な時間の後に、Ｈ／Ｄ交換を停止させるために液体窒素中でこれらの試料を瞬間凍結し、凍結乾燥した。次いで、０．０７％重水素化されたジクロロ酢酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＭＡ）を含有するＤＭＳＯ−ｄ_６４８０μＬ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）中にこれらの交換された試料及び交換されていない（基準）試料を溶解してから３分後以内に、一次元及び二次元^１５Ｎ／^１ＨＨＳＱＣスペクトルを収集した。酸性化されたＤＭＳＯ−ｄ_６中に球状凝集体を溶解すると、多量体球状凝集体は単量体へ転化される。［Ｕ−^１５Ｎ，^１３Ｃ］標識された試料を用いて、一連の骨格実験（Ｔ．Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，１１６５５−１１６６６）を収集することによって、この酸性化されたＤＭＳＯ−ｄ_６溶媒中のアミロイドβペプチドのこの単量体形態の^１５Ｎ／^１ＨＨＳＱＣスペクトルの割り当てを行う。これらの割り当てを用いて、アミロイドβペプチドの各残基のピーク強度を分析し、それらの骨格アミド保護係数を得る。保護係数は、Ｄ_２Ｏ交換に供されていない試料の強度に対する、Ｄ_２Ｏ中での交換後における試料の観察されたクロスピーク強度の比として定義される。これらの交換実験では、０．５ｍＭの単量体濃度を使用した。保護係数の計算において使用されたピーク強度は、１ＤＮＭＲスペクトルの脂肪族ＣＨ_３領域強度に基づいて較正した。
【０２３１】
前球状凝集体（初期調製段階ペプチド）骨格アミド交換実験：約１．５％ＳＤＳ−ｄ_２５及びｐＨ７．４の１×リン酸緩衝化生理的食塩水（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する緩衝液中の^１５Ｎ標識された試料を凍結乾燥させた後、次いで、乾燥された試料をＤ_２Ｏ中に溶解し、一連の^１５Ｎ／^１ＨＨＳＱＣスペクトルを集めた。これらの実験では、遅い交換アミドが検出された。
【０２３２】
実験は、Ｍｅｔ−アミロイドβを用いて行ったが、文献データ（以下参照）とのグラフ的比較を容易にするために、Ｎ末端Ｍｅｔ残基は、図のパネルから除外されている（図２６参照）。保護係数は、Ｄ_２Ｏ交換に供されていない試料の強度に対する、Ｄ_２Ｏ中での交換後の試料に対する^１５Ｎ／^１ＨＨＳＱＣスペクトル中の観察されたクロスピーク強度の比として定義される。球状凝集体については、骨格アミド保護実験に対して２つのデータの組を収集し、それらの平均及び標準偏差を報告するために使用した。現在の実験で使用されるＤＭＳＯ／酸溶媒中で、本質的に速い逆交換速度を示したので、球状凝集体中の残基Ｄ１、Ｄ７、Ｓ８及びＨ１４は除外した。残基対（Ｅ１１及びＤ２３）、（Ｖ１８及びＶ３６）及び（Ｉ１３及びＩ４１）に対するスペクトルの重複のために（パネルＢにおいて、星によって記されている。）、骨格アミドのこれらの対に対する平均保護係数のみを報告ことができる。その結果、各残基が示し得る最高及び最低の保護係数を推測し（８０％の最大保護係数を仮定）、これらの限界の標準偏差を使用することによって、これらの重複された残基に対して示された不明確さが得られた。パネルＢ中に示されている球状凝集体のアミド保護は、Ｄ_２Ｏ中での５日間の交換に供された試料に対するものである。パネルＣ中の原繊維骨格アミド保護は、Ｄ_２Ｏ中での温置の２０分（黒い棒）及び１２０分（薄い灰色の棒）後に、Ｏｌｏｆｓｓｏｎら（（２００６），ＪＢＣ２８１，４７７−４８３）から採用した。さらに、パネルＡは、前球状凝集体に対する骨格の割り当て及びアミド交換データを示している。割り当てられた残基及び割り当てられていない残基は、それぞれ、＋及び−の符号によって示されている。遅い、中程度の及び速い交換速度を示した初期調製段階（前球状凝集体）に特徴的なペプチドの骨格アミドが、それぞれ、配列の下に、黒丸、半黒丸及び白丸によって示されている。中央及びＣ末端残基（パネルＣ）の両方に対して遅いアミド交換速度が観察された原繊維形態とは異なり、前球状凝集体（パネルＡ）及び球状凝集体（パネルＢ）中のＣ末端１２残基に対しては、遅い交換速度が主に観察される。従って、この比較は、アミロイドβペプチドの前球状凝集体（パネルＡ）及び球状凝集体（パネルＢ）形態は、極めて似たアミド交換速度を示し、両形態が類似のコア構造を採っていることと合致することを示している。これに対して、前球状凝集体及び球状凝集体形態は何れも、原繊維形態のペプチドの中央領域とは明瞭に異なるＮＨ／ＮＤ交換速度を示し、これらは、原繊維形態とは異なる構造コアを有することを示唆している。
【０２３３】
【表４】

【０２３４】
上記寄託は、ブダペスト条約の規定に基づいて行われ、２００５年１２月１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９によって受領された。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１Ａ】βアミロイドペプチドをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を示している（配列番号１）。クローニングに使用されたヌクレオチド制限部位が示されており、これらは設計されたプライマー中には含まれなかった。開始Ｍｅｔ（ＡＴＧ）及び停止コドン（ＴＧＡ）が示されている。
【図１Ｂ】アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のインビボでのプロセッシングに由来する自然のアミロイドβ（１−４２）タンパク質のアミノ酸配列を示している（配列番号２）。
【図２】天然のＮ末端メチオニンを含有するアミロイドβペプチド又はタンパク質の様々な形態を示しており、天然配列（公知の変異バリアントを含む。）残基４０から４４にまで及んでいる（配列番号３＝１−３９、配列番号４＝１−４０、配列番号５＝１−４１、配列番号６＝１−４２及び配列番号＝１−４３）。
【図３Ａ】組み換えアミロイドβに対する精製スキームを表している。
【図３Ｂ】組み換えアミロイドβに対する精製スキームを表している。
【図４】組み換えＭｅｔアミロイドβ１−４２のＭＡＬＤＩ質量スペクトルを表している。ペプチドの理論的分子量は、４６４５Ｄａである。観察された値は、４６４８Ｄａである。３Ｄａの相違は、装置の精度限界内である。
【図５】組み換えアミロイド（配列：Ｍｅｔ−Ａβ１−４２）から調製された球状凝集体に対するマウスモノクローナル抗体Ｂを上回るマウスモノクローナル抗体Ａの選択性を示すＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図６】組み換えアミロイド（配列：Ｍｅｔ−Ａβ１−４２）から調製された球状凝集体への、マウスモノクローナル抗体Ａ、マウスモノクローナル抗体Ｂ、マウスモノクローナル抗体Ｃ及びマウスモノクローナル抗体の結合を比較するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図７】組み換えアミロイド（配列：Ｍｅｔ−Ａβ１−４２）から調製された配列残基２０−４２になるように末端切断された球状凝集体への、マウスモノクローナル抗体Ａ、マウスモノクローナル抗体Ｂ、マウスモノクローナル抗体Ｃ及びマウスモノクローナル抗体Ｄの結合を比較するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
【図８】合成アミロイドペプチド又は組み換え完全長アミロイドペプチドの何れかを用いて球状凝集体を調製するために使用した段階を要約している。
【図９】様々なゲル負荷量での、合成Ｂａｃｈｅｍペプチド（１−４２）又は組み換えＭｅｔＡ−β（Ｍｅｔ１−４２）から調製された球状凝集体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを（分子量標準とともに）図示している。
【図１０】組み換えＭｅｔＡ−β１−４２から調製された球状凝集体の水力学的分析（沈降速度及び動的光散乱（ＤＬＳ；ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）の結果を図示している。
【図１１】組み換えＭｅｔＡ−β１−４２から調製された球状凝集体又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入された金ナノ球体の代表的な原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を図示している。エッジ画像データのみ、最も鋭い形体が、より明るい。画像が暗くなるほど、形体は、雲母チップ基材表面の表面に近くなる。
【図１２】ＳＤＳなし（図１５）、０．０５％ＳＤＳ（図１６）及び０．２％ＳＤＳ（図１７）で可視化された、球状凝集体の代表的なＡＦＭ画像（３０μｇ／ｍＬ単量体アミロイド濃度）を図示している。各図面において、左：高さ画像、右：エッジ画像。各画像において、最も高い（左）及び最も鋭い（右）形体（それぞれ）が、より明るい。画像が暗くなるほど、形体は、雲母チップ基材表面の表面に近くなる。
【図１３】ＳＤＳなし（図１５）、０．０５％ＳＤＳ（図１６）及び０．２％ＳＤＳ（図１７）で可視化された、球状凝集体の代表的なＡＦＭ画像（３０μｇ／ｍＬ単量体アミロイド濃度）を図示している。各図面において、左：高さ画像、右：エッジ画像。各画像において、最も高い（左）及び最も鋭い（右）形体（それぞれ）が、より明るい。画像が暗くなるほど、形体は、雲母チップ基材表面の表面に近くなる。
【図１４】ＳＤＳなし（図１５）、０．０５％ＳＤＳ（図１６）及び０．２％ＳＤＳ（図１７）で可視化された、球状凝集体の代表的なＡＦＭ画像（３０μｇ／ｍＬ単量体アミロイド濃度）を図示している。各図面において、左：高さ画像、右：エッジ画像。各画像において、最も高い（左）及び最も鋭い（右）形体（それぞれ）が、より明るい。画像が暗くなるほど、形体は、雲母チップ基材表面の表面に近くなる。
【図１５】組み換えＭｅｔＡ−β１−４２から調製された球状凝集体へのモノクローナル抗体Ａの結合から得られた結果を示している。結合は、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）によって直接測定された。この例では、熱量測定装置のセルは、（単量体単位を基礎として）８６μＭの濃度で、アミロイドβを含有した。これは、１３２μＭのＡ抗体で滴定された。何れも、ｐＨ７．４の３５ｍＭＮａＣｌを加えた５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に存在した。フィッティングによって決定された解離定数（結合のＫｄ）は４９０ｎＭ（又は０．４６μＭ）であり、結合の観察されたエンタルピーは、−４７．５ｋＪ／モルであり、結合の見かけの化学量論は、６．３アミロイドβ分子／抗体分子であった。水力学的分析と総合すると、これは、球状凝集体単位当り完全長抗体に対して約２個の結合部位を示唆する。
【図１６Ａ】９０％Ｈ_２Ｏ／１０％Ｄ_２Ｏ溶液中の^１５Ｎ標識されたＮ−ＭｅｔＡβ１−４２（パネルＡ）及び１００％Ｄ_２Ｏ溶液中への交換から１日後（パネルＢ）の^１５Ｎ／^１Ｈヘテロ核単一量子相関分光法（ＨＳＱＣ；ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）スペクトルを図示している。
【図１６Ｂ】９０％Ｈ_２Ｏ／１０％Ｄ_２Ｏ溶液中の^１５Ｎ標識されたＮ−ＭｅｔＡβ１−４２（パネルＡ）及び１００％Ｄ_２Ｏ溶液中への交換から１日後（パネルＢ）の^１５Ｎ／^１Ｈヘテロ核単一量子相関分光法（ＨＳＱＣ；ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）スペクトルを図示している。
【図１７Ａ】Ｎ−ｍｅｔアミロイドβペプチド１−４２の配列を表している。ＮＭＲによって同定された２つのβ鎖が、枠内に表示されている（配列番号８）。
【図１７Ｂ】ＮＭＲデータの鎖間ＮＯＥの分析から同定されたＡβ１−４２の反平行βシートを表している（（配列番号９）（ａａｓ２８−３９）；配列番号１０（ａａｓ１７−２３））。
【図１８】固体状ＮＭＲ及び本明細書に記載されている球状凝集体の観察された混合平行／反平行構造経路に基づいて、以前に提案された平行βシート原繊維構造経路（Ｓｃｉａｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５，４４：６００３−６０１４）間の著しい構造的な相違を図示している。
【図１９】僅かにより大きな（４から５ｎｍ）完全な球状凝集体と混合されたＳＤＳ（約１．５％）中の溶液状ＮＭＲによって観察されると考えられる最も小さな観察された球状凝集体種（１−２ｎｍ高）のＡＦＭ画像を図示する。エッジ画像データのみ、最も鋭い形体が、より明るい。画像が暗くなるほど、形体は、雲母チップ基材表面の表面に近くなる。
【図２０】Ｎ−ＭｅｔＡβ１−４２試料に対して得られたＮＭＲデータを要約する。破線は、混合された試料（１：１の比で混合された、［Ｕ−^１５Ｎ_，^２Ｈ］標識及び［Ｕ−^１４Ｎ，^２Ｈ］標識された試料）を使用することによって、^１５Ｎフィルターされた及び^１５Ｎ編集された３ＤＮＯＥＳＹ実験において観察された分子間ＮＨ−ＮＨＮＯＥを示している。実線矢印の線は、混合された試料（［Ｕ−^１５Ｎ，^２Ｈ］標識された試料を、ＩＶＬ残基の^１３Ｃ標識された、プロトン化されたメチル基を選択的に含有する［Ｕ−^１４Ｎ，^２Ｈ］標識された試料と１：１の比で混合した。）を使用することによって、^１５Ｎ分解された３ＤＮＯＥＳＹ実験中で観察された側鎖のＮＨからメチル基（矢印の先）までのＮＯＥを示している。実線は、^２Ｈ背景中にＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ残基の選択的に^１３Ｃ標識された、プロトン化されたメメチル基とともに均一に^１５Ｎ標識された試料を使用することによって、^１５Ｎ分割された３ＤＮＯＥＳＹ実験で観察された分子内ＮＨ−ＮＨＮＯＥを示している。矢印破線は、［Ｕ−^１５Ｎ］標識された試料を使用することによって、^１５Ｎ分割された３ＤＮＯＥＳＹ実験において観察された骨格アミド及びそれらの側鎖間の分子内ＮＯＥを示している。ＮＨ／ＮＤ交換実験において遅い交換を示す骨格アミドが、丸によって示されている。
【図２１】ＮＭＲデータと合致するＮ−Ｍｅｔ−β−アミロイドペプチド１−４２の反復単位の構造モデルを図示している。プログラムＣＮＸ（Ｂｒｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４（Ｐｔ ５），９０５−２１（１９９８））及び本明細書中のＮＭＲデータの分析から得られたＮＯＥに由来する距離制約を用い、シミュレートされたアニーリングプロトコールを使用して構造を計算した。リボンプロットで示されている残基は、黒い色の残基に対応する。
【図２２】溶液中で、観察された三量体、四量体又は五量体中間体形態を生じ得る球状凝集体中のアミロイドペプチド相互作用の３つの「仮定的な」より高次の配置を図示している（図１２、ＳＤＳゲル）。本明細書に記載されているように、より高次の凝集物も存在し、水力学的に観察される。これらの配置は、分子間凝集及び平行アミロイドペプチドβシートの原繊維の最終的な形成に対する駆動力としての、Ｃ末端平行シート領域（図２０参照）に沿った分子間相互作用の存在に基づいている。これは、アミロイドペプチドの他の可能な配置を限定するものではなく、又はそれらが存在しないことを示唆するものではない。
【図２３】Ｍｅｔ−Ａ−β１−４２試料の模式図並びに原子間力及び電子顕微鏡を図示しており、インビトロで見られる鎖内及び鎖間βシート相互作用の混合物からのアミロイド立体構造交換変換を支持する（図２０及び図２１参照）。球状凝集体は、上記のように、ＳＤＳ又は脂肪酸の存在下で形成され、上記のように、ＳＤＳ又は脂肪酸が実際にその中に存在する。本図面中に示されているように、ＳＤＳが図示されている。球状凝集体構造を取り囲んでいるＳＤＳの正確な配向は、今後解明しなければならない。鎖内反平行βシート相互作用が開放し、アミロイド原繊維形態の蓄積をもたらす完全に平行なシートを形成するときに、交換が起こる。反パラレル領域が「開放」した後に産生されたペプチドの生じた原繊維及び凝集形態が、本図面中のＡＦＭ及びＴＥＭ画像で観察される。下方のＴＥＭ画像は、代表的なスライスを示しており、サイズは、ｙ＝約２６０ｎｍ、ｘ＝約３７２ｎｍである。観察された原繊維の幅は、約６ｎｍである。精製されたＭｅｔ１−４２球状凝集体の試料は、以前に記載したとおりに調製した。Ｍｅｔ１−４２は、０．０３ｍｇ／ｍＬの最終濃度であり、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって、３３７，５００倍の増幅係数で画像化するために、２％酢酸ウラニルで染色した。下方のＡＭＦ画像は、代表的なスライスを示しており、サイズは、ｙ＝２５０ｎｍ、ｘ＝５００ｎｍである。画像は、観察された種の分散された場を示している。Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の試料は、以前に記載したとおりに調製した。Ｍｅｔ１−４２は、１．１ｍｇ／ｍＬの当初濃度であり、４℃で２週間以上温置し、ナノ純水中に２０：１で希釈した（最終０．０５５ｍｇ／ｍＬ）。切断された直後の雲母チップ上に２０μＬを堆積し、５から８分間温置した後、雲母チップを６００μＬナノ純水のリンス及びＡＦＭ走査を行った。球状凝集体に対して選択的な抗体は、図Ｘ及びＹに図示されているように、混合された分子内反平行βシート（概ね残基１８から３３）と平行βシート（概ね残基３４から３９）を有するペプチド中に作製されたエピトープに選択的に結合する。インビトロで球状凝集体の形成をもたらす１つ又は複数の機序は、インビボで観察される機序とは異なり得る。
【図２４Ａ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｂ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｃ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｄ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｅ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｆ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｇ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｈ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｉ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｊ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｋ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｌ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｍ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｎ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｏ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｐ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｑ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｒ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｓ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｔ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２４Ｕ】本発明の観察された球状凝集体のβアミロイド成分の配位を図示している。配位は、βアミロイドペプチドＮ−Ｍｅｔ１−４２球状凝集体の二量体成分のモデルに対するものである。１つの分子の配列番号は１５から４２であるのに対して、別の分子に対する配列番号は１１５から１４２である。
【図２５】アミロイドβペプチドの球状凝集体（パネルＢ）及び原繊維（パネルＣ）形態の骨格アミド保護の比較を示している。
【図２６Ａ】Ｃ^１４−ＳＤＳを用いた、ＳＤＳのＡβ球状凝集体への結合を示している。
【図２６Ｂ】Ｃ^１４−ＳＤＳを用いた、ＳＤＳのＡβ球状凝集体への結合を示している。
【図２６Ｃ】Ｃ^１４−ＳＤＳを用いた、ＳＤＳのＡβ球状凝集体への結合を示している。
【図２７】Ｎ末端Ｍｅｔ形態として発現されたヒト家族性変異体アルツハイマーペプチドを示している。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［Ｘ＋Ｙ］によって表されるタンパク質に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する精製されたβ−アミロイドタンパク質（「Ｘ」は、メチオニン、バリン及びロイシンからなる群から選択される、前記タンパク質のアミノ末端に位置する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含み、並びに「Ｙ」は、自然のアミロイドβタンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部を含む。）。
【請求項２】
「Ｙ」が、前記自然のβ−アミロイドタンパク質の３９から４３個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の精製されたβ−アミロイドタンパク質。
【請求項３】
「Ｙ」が、Ｇｌｕ６６５Ａｓｐ、Ｌｙｓ／Ｍｅｔ６７０／Ａｓｎ／Ｌｅｕ、Ａｌａ６７３Ｔｈｒ、Ｈｉｓ６７７Ａｒｇ、Ａｓｐ６７８Ａｓｎ、Ａｌａ６９２Ｇｌｙ、Ｇｌｕ６９３Ｇｌｙ、Ｇｌｕ６９３Ｇｌｎ、Ａｓｐ６９４Ａｓｎ、Ａｌａ７１３Ｔｈｒ及びＡｌａ７１３Ｖａｌからなる群から選択される変異体を含む、請求項２に記載の精製されたβ−アミロイドタンパク質。
【請求項４】
「Ｘ」がメチオニンである、請求項２又は請求項３に記載の精製されたβ−アミロイドタンパク質。
【請求項５】
式［Ｘ＋Ｙ］によって表されるタンパク質に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するβ−アミロイドタンパク質をコードする単離された核酸分子（「Ｘ」は、メチオニン、バリン及びロイシンからなる群から選択される、前記タンパク質のアミノ末端に位置する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含み、並びに「Ｙ」は、自然のアミロイドβタンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部を含む。）。
【請求項６】
請求項５に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
ａ．請求項１に記載の前記β−アミロイドタンパク質をコードする核酸分子をベクター中に形質移入する段階；及び
ｂ．前記宿主細胞による前記β−アミロイドタンパク質の発現に十分な時間及び条件下で、段階ａ）の前記ベクターを宿主細胞中に形質転換する段階を含む、
式［Ｘ＋Ｙ］によって表されるタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する精製されたβ−アミロイドタンパク質を作製する方法（「Ｘ」は、メチオニン、バリン及びロイシンからなる群から選択される、前記タンパク質のアミノ末端に位置する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含み、並びに「Ｙ」は、自然のβ−アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部を含む。）。
【請求項９】
前記宿主細胞が原核生物又は真核生物である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記原核宿主細胞が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）及びラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記真核細胞が、昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の前記β−アミロイドタンパク質に結合する単離された抗体。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナル又はポリクローナルである、請求項１２に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナルであり、及びヒトのもの又はヒト化されているものである、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、少なくとも０．５０μＭの特異的結合定数（Ｋ_ｄ）を有する、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、−３０ｋＪ／モルを超える結合エンタルピーを有する、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、少なくとも１つの抗体／アミロイド球状凝集体の抗体対アミロイド球状凝集体結合比を有する、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項１８】
アルツハイマー病の治療又は予防を必要としている患者において、アルツハイマー病を治療又は予防する方法であり、前記治療又は予防を実施するのに十分な量で、前記患者に、請求項１２に記載の前記単離された抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記単離された抗体が、筋肉内、静脈内及び皮下からなる群から選択される経路を介して投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
単離されたβ−アミロイドペプチドオリゴマーであり、１）反平行鎖内配置に配向された残基１９から２１及び残基３０から３２並びに２）平行鎖間配置で配向された残基３４から３８を含み、前記オリゴマーは、Ｆ１９（ＮＨ）−Ｉ３２（ＮＨ）、Ｆ１９（ＮＨ）−Ｉ３２（ＨＢ）、Ｆ１９（ＮＨ）−Ｉ３２（ＨＧ＃＃）、Ａ２１（ＮＨ）−Ａ３０（ＮＨ）、Ａ２１（ＮＨ）−Ａ３０（ＨＢ＃）、Ａ２１（ＮＨ）−Ｉ３１（ＨＤ１＃）、Ａ２１（ＮＨ）−Ｉ３１（ＨＧ１＃）、Ｉ３２（ＮＨ）−Ｆ１９（ＨＤ１＃）、Ｉ３２（ＮＨ）−Ｆ１９（ＨＢ＃）及びＡ３０（ＮＨ）−Ａ２１（ＨＢ＃）からなる群から選択される原子対に対して、約１．８から６．５オングストローム内の分子内プロトン間距離を有するＡ−β（１−４２）ペプチドを含む、前記単離されたβ−アミロイドペプチドオリゴマー。
【請求項２１】
単離されたβ−アミロイドペプチドオリゴマーであり、Ｇ３３（ＮＨ）−Ｇ３４（ＮＨ）、Ｍ３５（ＮＨ）−Ｖ３６（ＮＨ）、Ｇ３７（ＮＨ）−Ｇ３８（ＮＨ）、Ｇ３３（ＮＨ）−Ｖ１８（ＣγＨ_３）、Ｖ１８（ＮＨ）−Ｖ１８（ＣγＨ_３）、Ｌ３４（ＮＨ）−Ｌ３４（Ｃ_δＨ_３）、Ｍ３５（ＮＨ）−Ｖ３６（ＣγＨ_３）、Ｇ３８（ＮＨ）−Ｖ３９（ＣγＨ_３）及びＶ３９（ＮＨ）−Ｖ３９（（ＣγＨ_３）からなる群から選択される原子対に対して、約１．８から６．５オングストローム内のペプチド鎖Ａとペプチド鎖Ｂ間の分子間プロトン間距離を有するＡ−β（１−４２）ペプチドを含み、前記オリゴマーは、少なくとも残基１９から２１及び３０から３２を含む分子内反平行β−シートを含み、並びに原子対｛Ｆ１９ＣＯ，Ｉ３２Ｎ｝、｛Ｉ３２ＣＯ，Ｆ１９Ｎ｝、｛Ａ２１ＣＯ，Ａ３０Ｎ｝及び｛Ａ３０ＣＯ，Ａ２１Ｎ｝は、３．３±０．５オングストロームの距離であり、ＣＯは、骨格酸素原子を示し、前記残基のファイ（φ）角度は−１８０から−３０の範囲であり、及び前記残基のプサイ（ψ）角度は、約６０から１８０又は約−１８０から−１５０の範囲である、前記単離されたβ−アミロイドペプチドオリゴマー。
【請求項２２】
単離されたβ−アミロイドオリゴマーであり、前記オリゴマーは、少なくとも２つのβ−アミロイドペプチド（標識されたＡ及びＢ）の少なくとも残基３４から３８を含む分子間平行βシートを含み、以下の原子対｛Ｇ３３ＣＯ（Ａ），Ｌ３４Ｎ（Ｂ）｝、｛Ｌ３４ＣＯ（Ｂ），Ｍ３５Ｎ（Ａ）｝、｛Ｍ３５ＣＯ（Ａ），Ｖ３６Ｎ（Ｂ）］、｛Ｖ３６ＣＯ（Ｂ），Ｇ３７Ｎ（Ａ）｝及び｛Ｇ３７ＣＯ（Ｂ），Ｇ３８Ｎ（Ａ）｝（ＣＯは、骨格酸素原子を示す。）が、３．３±０．５Åの距離であり、及び前記残基のファイ（φ）角度が−１８０から−３０の範囲であり、及び前記残基のプサイ（ψ）角度が、６０から１８０又は−１８０から−１５０の範囲である、前記単離されたβ−アミロイドオリゴマー。
【請求項２３】
少なくとも１つのβ−アミロイドＮ−Ｍｅｔ１−４２オリゴマーに結合する単離された抗体であり、前記オリゴマーは、
（ａ）少なくとも残基１９から２１及び３０から３２を含む分子内反平行βシート（以下の原子対は、｛Ｆ１９ＣＯ，Ｉ３２Ｎ｝、（Ｉ３２ＣＯ，Ｆ１９Ｎ｝、｛Ａ２１ＣＯ，Ａ３０Ｎ｝及び｛Ａ３０ＣＯ，Ａ２１Ｎ｝（ＣＯは、骨格酸素原子を示す。）が、３．３±０．５Åの距離であり、及び前記残基のファイ（φ）角度が−１８０から−３０の範囲であり、及び前記残基のプサイ（ψ）角度が、６０から１８０又は−１８０から−１５０の範囲である。）並びに
（ｂ）少なくとも２つのβ−アミロイドペプチド（標識されたＡ及びＢ）の少なくとも残基３４から３８を含む分子間平行βシートを含む分子間平行β−シート（以下の原子対｛Ｇ３３ＣＯ（Ａ），Ｌ３４Ｎ（Ｂ）｝，｛Ｌ３４ＣＯ（Ｂ），Ｍ３５Ｎ（Ａ）｝，｛Ｍ３５ＣＯ（Ａ），Ｖ３６Ｎ（Ｂ）｝，｛Ｖ３６ＣＯ（Ｂ），Ｇ３７Ｎ（Ａ）｝及び｛Ｇ３７ＣＯ（Ｂ），Ｇ３８Ｎ（Ａ）｝（ＣＯは、骨格酸素原子を示す。）が、３．３±０．５Åの距離であり、及び前記残基のファイ（φ）角度が−１８０から−３０の範囲であり、及び前記残基のプサイ（ψ）角度が、６０から１８０又は−１８０から−１５０の範囲である。）
からなる群から選択される、前記単離された抗体。
【請求項２４】
少なくとも２つのＮ−Ｍｅｔ１−４２βアミロイドペプチドの三次元構造が、図Ｘ及びＹに示されている何れかの物理的に許容される立体構造を含む、請求項２３に記載の単離された抗体。
【請求項２５】
請求項１に記載の前記単離されたβ−アミロイドタンパク質の少なくとも２つを含む精製された球状凝集体。
【請求項２６】
請求項２５に記載の前記精製された球状凝集体に結合する単離された抗体。
【請求項２７】
アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断する方法であり、
ａ．前記患者から生物学的試料を単離する段階；
ｂ．球状凝集体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、請求項１２又は請求項２６に記載の前記単離された抗体と、前記生物学的試料を接触させる段階；並びに
ｃ．前記試料中の前記球状凝集体／抗体複合体の存在を検出する段階を含み、前記複合体の存在が、前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す、前記方法。
【請求項２８】
アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断する方法であり、
ａ．前記患者から生物学的試料を単離する段階；
ｂ．抗体／球状凝集体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、請求項２５に記載の前記球状凝集体と、前記生物学的試料を接触させる段階；
ｃ．結合された抗体へコンジュゲートが結合するのに十分な時間及び条件下で、得られた抗体／球状凝集体にコンジュゲートを添加する段階（前記コンジュゲートは、検出可能なシグナルを発生することができるシグナル生成化合物に付着された抗体を含む。）；並びに
ｄ．前記シグナル生成化合物によって発生されたシグナルを検出することによって、前記生物学的試料中に存在し得る抗体の存在を検出する段階を含み、前記シグナルが、前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す、前記方法。
【請求項２９】
アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断する方法であり、
ａ．前記患者から生物学的試料を単離する段階；
ｂ．抗体／精製された球状凝集体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、請求項２５に記載の前記球状凝集体と、前記生物学的試料を接触させる段階；及び
ｃ．前記試料中の前記抗体／精製された球状凝集体複合体の存在を検出する段階；
を含み、前記複合体の存在が、前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す、前記方法。
【請求項３０】
アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断する方法であり、
ａ．前記患者から生物学的試料を単離する段階；
ｂ．抗抗体／抗体複合体の形成を可能とするのに十分な時間及び条件下で、前記試料中の抗体に対して特異的な抗抗体と、前記生物学的試料を接触させる段階；
ｃ．結合された抗体へコンジュゲートが結合するのに十分な時間及び条件下で、得られた抗抗体／抗体複合体にコンジュゲートを添加する段階（前記コンジュゲートは、検出可能なシグナルを発生することができるシグナル生成化合物に付着された請求項３１に記載の前記球状凝集体を含む。）；並びに
ｄ．前記シグナル生成化合物によって発生されたシグナルを検出する段階を含み、前記シグナルが、前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す、前記方法。
【請求項３１】
請求項１２又は請求項２６に記載の前記単離された抗体を含む組成物。
【請求項３２】
請求項１又は請求項２５に記載の前記精製されたβ−アミロイドタンパク質及び医薬として許容されるアジュバントを含むワクチン。
【請求項３３】
アルツハイマー病の予防又は治療を必要としている患者において、アルツハイマー病を予防又は治療する方法であり、前記予防又は治療を実施するのに十分な量で、前記患者に、請求項３１に記載の前記組成物を投与する段階を含む、前記方法。
【請求項３４】
アルツハイマー病の予防又は治療を必要としている患者において、アルツハイマー病を予防又は治療する方法であり、前記予防又は治療を実施するのに十分な量で、前記患者に、請求項３２に記載の前記ワクチンを投与する段階を含む、前記方法。
【請求項３５】
アルツハイマー病の治療又は予防のための化合物を同定する方法であり、
ａ）前記１つ又はそれ以上の化合物が前記精製された球状凝集体に結合し、又は中和するのに時間及び条件下で、請求項３１に記載の前記精製された球状凝集体に、目的の１つ又はそれ以上の化合物を曝露する段階；及び
ｂ）前記精製された球状凝集体に結合し、又は中和する化合物を同定する段階を含み、
前記同定された化合物がアルツハイマー病の治療又は予防において使用される、前記方法。
【請求項３６】
患者中のアルツハイマー病の治療又は予防において有用な小分子を診断する方法であり、
ａ）請求項２５に記載の前記精製された球状凝集体、請求項２５に記載の前記単離されたβ−アミロイドペプチドオリゴマー及び請求項２５に記載の前記単離されたオリゴマーの集合からなる群から選択されるタンパク質の三次元構造を分析する段階；
ｂ）段階ａ）の前記選択されたタンパク質の表面上に１つ又はそれ以上のエピトープを同定する段階；及び
ｃ）段階ｂ）の同定されたエピトープの前記１つ又はそれ以上に結合する小分子を設計する段階（前記小分子は、アルツハイマー病の治療又は予防において使用される。）を含む、前記方法。
【請求項３７】
アルツハイマー病の治療又は予防において使用されるべきモノクローナル抗体を同定する方法であり、
ａ）前記モノクローナル抗体の１つ又はそれ以上の前記球状凝集体への結合及び球状凝集体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、請求項２５に記載の前記精製された球状凝集体をモノクローナル抗体のライブラリーに曝露する段階；
ｂ）前記球状凝集体／抗体複合体の存在を同定する段階；
ｃ）前記複合体内の１つ又はそれ以上の抗体の正体を決定する段階（前記１つ又はそれ以上の抗体は、アルツハイマー病の治療又は予防において使用される。）、前記方法。
【請求項３８】
前記安定化を実施するのに十分な時間及び量で、アルキル鎖界面活性剤又は脂質を前記試料に添加する段階を含む、Ｍｅｔ−アミロイドβ（１−４２）オリゴマー又はその一部の試料を安定化させる方法。
【請求項３９】
請求項２６に記載の前記単離された抗体、及び医薬として許容されるアジュバントを含むワクチン。
【請求項４０】
図２７の連続するアミノ酸残基Ｅ２２−Ｄ２３−Ｖ２４−Ｇ２５−Ｓ２６−Ｎ２７−Ｋ２８（配列番号２５）を含むエピトープ。
【請求項４１】
請求項４０に記載の前記エピトープに結合する単離された抗体。
【請求項４２】
北極（Ｅ６９３Ｇ）変異、オランダ（Ｅ６９３Ｑ）変異、イタリア変異（Ｅ６９３Ｋ）、アイオワ（Ｄ６９４Ｎ）変異及びフランドル（Ａ６９２Ｇ）変異からなる群から選択される抗原に対して作製されたヒト化抗体。
【請求項４３】
前記抗体が、アミロイドβペプチドの自然のヒト配列及び前記変異された配列の少なくとも１つを認識する、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項４４】
アルツハイマー病を有すると疑われる患者中の変異体アミロイドβペプチドを検出する方法であり、
ａ）前記患者から生物学的試料を単離する段階；
ｂ）変異体抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、請求項４２に記載の前記抗体と、前記生物学的試料を接触させる段階；及び
ｃ）前記変異体抗原／抗体複合体の存在を検出する段階を含み、
前記複合体が、前記患者が変異体アミロイドβペプチド配列を有すること、従って、アルツハイマー病を有することを示す、前記方法。
【請求項４５】
アミロイドペプチドの１モル当りドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又は脂肪酸の少なくとも約０．５から２．０モルを含む単離された球状凝集体。
【請求項４６】
請求項４５に記載の前記単離された球状凝集体のエピトープ。
【請求項４７】
請求項４６に記載の前記エピトープに結合する単離された抗体。
【請求項４８】
アミロイドβペプチド凝集の形成を遮断する、請求項４７に記載の単離された抗体。
【請求項４９】
アミロイドβペプチドを含む単離された球状凝集体であり、前記ペプチドは北極（Ｅ６９３Ｇ）変異、オランダ（Ｅ６９３Ｑ）変異、イタリア変異（Ｅ６９３Ｋ）、アイオワ（Ｄ６９４Ｎ）変異及びフランドル（Ａ６９２Ｇ）変異からなる群から選択される変異を有するアミノ酸配列を含む、前記球状凝集体。
【請求項５０】
前記自然のヒトアミロイドペプチドのエピトープと比べて、請求項４６に記載の前記エピトープに優先的に結合する単離された抗体。
【請求項５１】
アルツハイマー病の予防又は治療を必要としている患者において、アルツハイマー病を予防又は治療する方法であり、前記予防又は治療を実施するのに十分な量で、前記患者に、請求項５０に記載の前記単離された抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項５２】
アミロイドβペプチドを含む単離された球状凝集体であり、前記ペプチドは、水素−重水素交換挙動に基づいて、約３３％又はそれ未満の保護又は交換を示すアミノ酸を含み、前記アミノ酸は、２（Ａｓｐ）、３（Ａｌａ）、４（Ｇｌｕ）、５（Ｐｈｅ）、７（Ｈｉｓ）、８（ａｓｐ）、９（Ｓｅｒ）、１０（Ｇｌｙ）、１７（Ｌｙｓ）、２０（Ｐｈｅ）、２１（Ｐｈｅ）、２２（Ａｌａ）、２５（Ｖａｌ）、２６（Ｇｌｙ）、２９（Ｌｙｓ）及び３０（Ｇｌｙ）からなる群から選択される、前記球状凝集体。
【請求項５３】
アミロイドβペプチドを含む単離された球状凝集体であり、前記ペプチドは、水素−重水素交換挙動に基づいて、約３３％から約６６％の保護又は交換を示すアミノ酸を含み、前記アミノ酸は、１６（Ｇｌｎ）、３１（Ａｌａ）、３２（Ｉｌｅ）、４２（Ｉｌｅ）及び４３（Ａｌａ）からなる群から選択される、前記球状凝集体。
【請求項５４】
アミロイドβペプチドを含む単離された球状凝集体であり、前記ペプチドは、水素−重水素交換挙動に基づいて、約６６％又はそれ以上の保護又は交換を示すアミノ酸を含み、前記アミノ酸は１２（Ｇｌｕ）、１８（Ｌｅｕ）、１９（Ｖａｌ）、２４（Ａｓｐ）、３３（Ｉｌｅ）、３４（Ｇｌｙ）、３５（Ｌｅｕ）、３６（Ｍｅｔ）、３８（Ｇｌｙ）、３９（Ｇｌｙ）及び４０（Ｖａｌ）からなる群から選択される、前記球状凝集体。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２４Ｃ】

【図２４Ｄ】

【図２４Ｅ】

【図２４Ｆ】

【図２４Ｇ】

【図２４Ｈ】

【図２４Ｉ】

【図２４Ｊ】

【図２４Ｋ】

【図２４Ｌ】

【図２４Ｍ】

【図２４Ｎ】

【図２４Ｏ】

【図２４Ｐ】

【図２４Ｑ】

【図２４Ｒ】

【図２４Ｓ】

【図２４Ｔ】

【図２４Ｕ】

【図２５】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２６Ｃ】

【図２７】

【公表番号】特表２００９−５１８０１０（Ｐ２００９−５１８０１０Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３４９８（Ｐ２００８−５４３４９８）
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６０４３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６４９１７
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【出願人】（５０２１０４２２８）アボット　ゲーエムベーハー　ウント　カンパニー　カーゲー (89)
【Ｆターム（参考）】