ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）変異体
本発明は、改善された熱安定性をもつヒトインターフェロンガンマ変異体、前記変異体をコードする核酸、それらを含有する医薬組成物、及びウイルス感染及び癌の治療を目的とするそれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の改良の分野に関する。本発明は、ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の改良及び改良型ＩＦＮγを含む組成物、それをコードする核酸及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＦＮγは、１６６個のアミノ酸のサイトカインである。分子は、膜輸送及び分泌を可能にするシグナルペプチド、開裂部位及びいわゆる成熟タンパク質に対応する部分を含む。ＩＦＮγのシグナルペプチドは、最初の２３個又は最初の２０個のアミノ酸残基からなるものとして、異なる著者によりさまざまな形で報告されている。実際、文献中では、成熟配列のＮ末端におけるアミノ酸トリプレットＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（ＣＹＣ）の存在に関して疑いがもたれている。ＩＦＮγは、２つの非共有結合したサブユニットのホモ２量体として存在する。各々のサブユニットは２つのＮ−グリコシル化部位（１６６個のアミノ酸前駆体の４８及び１２０位）を有する。ＣＹＣ残基が考慮されない場合、インビボで成熟タンパク質中にジスルフィド架橋又はシステインは全く存在しない。各単量体は、Ｎ末端に最も近い最初の４つのαヘリックス（αヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）からなるコンパクトな領域、及び２つの単離されたαヘリックスから成り、第２のＩＦＮγ単量体と密な相互関係にあるＣ末端領域を伴う、６つのαヘリックスを有する。
【０００３】
ＩＦＮγは、広い活性スペクトラムをもつ多面性サイトカインの原型である。実際、インターフェロン（ＩＦＮ）には、ウイルス複製の阻害、細胞増殖の阻害及びアポトーシスの誘発などの活性がある。
【０００４】
特に、ＩＦＮγによるマクロファージ刺激は、以下の応答を誘発する：
− 食作用及び細菌死滅の増強（直接的抗菌性及び抗腫瘍性機序）；
− 抗原提示及び分離経路の刺激、マクロファージ表面におけるＩ型及びＩＩ型主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の発現；
− ＩｇＧ生産及び補体活性化を結果としてもたらす、抗体分泌プラズマ細胞へのＢリンパ球の分化；
− 細胞毒性遊離酸素ラジカル及びＮＯを生産させるＮＯシンターゼの活性化；
及び／又は
− サイトカイン及び内因性ＩＦＮの生産の増強。
ＩＦＮγは、その分化を促進し、それによって特異的免疫応答を変調させることによってＴリンパ球に対して作用する。
【０００５】
その広い活性スペクトラム（抗ウイルス性、抗増殖性及び免疫変調性）を理由として、ＩＦＮγは、多様なヒト疾患の治療向けの治療薬として開発されてきた。市販のＩＦＮγ（アクティミューン（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）及びバイオガンマ（Ｂｉｏｇａｍｍａ））は、現在２つの主な治療適応すなわち慢性肉芽腫症及び特発性肺線維症において経口プレドニゾロンと組合せて使用されている。数多くの新しい二次的治療適応が現在、特に例えばＣ型肝炎の治療におけるペグ化ＩＦＮα／リバビリンに対する付加物としてのその免疫抑制的役割のために、異なる臨床的開発段階にある。以下のものに言及することもできる：非定型抗酸菌感染症、腎臓癌；大理石骨病；全身性強皮症；慢性Ｂ型肝炎；慢性Ｃ型肝炎；乳頭腫ウイルスに起因するものを含めた異なるウイルス感染；敗血性ショック；アレルギー性皮膚炎；関節リウマチ；卵巣癌；肝線維症；ぜんそく及びリンパ腫。
【０００６】
ＩＦＮの主な副作用は用量依存性のものであり、従って投薬スケジュールと密接なつながりがある。前記副作用は累積的であり、経時的に悪化する。注射の短時間後（皮下注射の２〜８時間後）に気分のすぐれない状態、吐き気及びおう吐をひき起こし得る急性毒性に加えて、最も一般的な副作用は、インフルエンザに似た症状（悪寒、頭痛、疲労感）、注射部位における炎症反応及び肝臓アミノ基転移酵素の上昇である。最も重大な有害事象としては、うつ病、リンパ球減少症そして稀には皮下注射部位における壊死が含まれる。高用量のＩＦＮを受けた患者は、療法の開始後に糖尿病を発症する可能性がある。さらに、ＩＦＮ注射の耐容性は、時として経時的に制限され、（およそ１０〜２０％の患者において）中和抗体の発生という形で現われる。
【０００７】
組換え型ヒトＩＦＮγのインビボ半減期は２５〜３５分にすぎない。この理由から、ＩＦＮγでの効率の良い治療には、頻繁に注射をする必要がある。アクティミューン（インター・ミューン Ｉｎｃ（Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ Ｉｎｃ．）という商品名で販売されている組換え型ヒトＩＦＮγが１９９０年に使用開始された時、全てのインターフェロンの中でもＩＦＮγの熱安定性が最も低いことからなおさらに、ＩＦＮγの半減期を改善する必要性が存在するということが明らかになった。実際に、より安定したＩＦＮγであれば、注射間の間隔をさらに長くすることができ、このようにして患者の快適性が改善される。インビボ効果はタンパク質の比活性とその作用持続時間の組合せの結果としてもたらされることから、より安定したＩＦＮγは同時に、より優れたインビボ効能を可能にすることになる。従って、ＩＦＮγの安定性を改善することの経済的な利点は明白である。すなわち、より安定した分子（それが変異体であること又はそれが添加剤を含有すること又は処方が改良されたことなどのいずれか理由とする）は、現在利用可能な作用物質に置き換わり得る第２世代の薬剤の生産を可能にする。さらには、より安定したＩＦＮγがこの分子の適応症を拡げることになる、ということさえ考えられる。実際、その他の分子の中でも、ＩＦＮα及びβは、或る種の病状における基準治療であるが、ＩＦＮγはその半減期が短かすぎるために、これらの中に数えられていない。最後に、より長期的には、より安定したＩＦＮγによって異なる投与経路（特に経口形態）向けにそれを処方できるようになることが期待できるかもしれない。
【０００８】
ＩＦＮγはすでに、広範な研究の対象となっている。
【０００９】
天然ＩＦＮγ変異体
複数の天然突然変異体が記述されてきた。かかる形態の１つは、Ｎ末端ＣＹＣ配列を含有するものである。点突然変異を含有するヒトＩＦＮγの２つの天然変異体、Ｋ２９Ｑ及びＲ１６０Ｑについても同様に記述されてきた（非特許文献１）。しかしながら、これらの多型はこれまで、いかなる効果とも関連づけされたことがなかった。
【００１０】
人工的ＩＦＮγ突然変異体
特許文献１は、成熟ＩＦＮγの残基１−１２７、５−１４６及び５−１２７を含み、かつ３つの付加的なアミノ酸残基ＣＹＣを有するヒトＩＦＮγの部分的配列を伴うポリペプチドについて開示している。
【００１１】
特許文献２はＩＦＮγ前駆体の残基１１８−１５７を含むペプチドフラグメント及びその使用について開示している。
【００１２】
特許文献３は、Ｓ１５５及びＳ１６５基内の突然変異のうちの少なくとも１つ及びＲ１６０、Ｒ１６２及びＲ１６３基内の少なくとも１つの突然変異を含む１つの変型を含めた、ＣＹＣ残基無しでＩＦＮγの成熟形態の１４３個のアミノ酸を含む一連の活性ＩＦＮγ突然変異を生成し、かつ生産するための方法を提供している。前記突然変異は、特に特発性肺線維症の治療において有用であると思われる。
【００１３】
ＩＦＮγのＣ末端領域内の異なる位置で切断された数多くの変異体が記述されてきた。特許文献４は、天然タンパク質のアミノ酸３〜１２４を含む部分的ヒトＩＦＮγ配列の使用を開示している。最後の２０個のアミノ酸残基のＩＦＮγの活性及び安定性に対する重要性がこれまで議論の的となってきており、又今なお議論されている。Ｃ末端切断型ヒトＩＦＮγ変異体は、異なるサイズ（１０〜２０個の切断アミノ酸残基）の切断形態を生産したスロドフスキ（Ｓｌｏｄｏｗｓｋｉ）らによって記述されてきた（非特許文献２）。
【００１４】
特許文献５内では、著しく高い活性をもつＩＦＮγが７〜１１個のＣ末端残基を欠失させることによって生成された。その上、哺乳動物細胞によるＩＦＮγ生産が、生産宿主細胞により分泌されたエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼによる天然の切断に起因するＩＦＮγポリペプチドの不均一集団を結果としてもたらすことがわかっている。この生産の問題を解決するための１つの手法は、特許文献６内で開示されており、例えば分子のグリコシル化（Ｓ１２２Ｔ、Ｅ６１Ｎ＋Ｓ６３Ｔ）を改善する突然変異と関連づけられる全タンパク質の最初の１５５個のアミノ酸を含む切断型ＩＦＮγを生産することからなる。
【００１５】
特許文献７は、（トリプシン、Ａｓｐ−Ｎエンドプロテアーゼ、キモトリプシン及びプロリンエンドペプチターゼなど）ヒト血清中に存在するプロテアーゼに対する感受性をもつ、タンパク質分解部位の存在について、ＩＦＮγを含む数多くの治療用タンパク質の配列をコンピュータ内で分析する。上述のプロテアーゼに対する保護を与えると想定されている突然変異は次のものである：Ｌ５３Ｖ、Ｌ５３Ｉ、Ｋ５７Ｑ、Ｋ５７Ｎ、Ｋ６０Ｑ、Ｋ６０Ｎ、Ｅ６１Ｑ、Ｅ６１Ｎ、Ｅ６１Ｈ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｎ、Ｅ６２Ｈ、Ｋ７８Ｑ、Ｋ７８Ｎ、Ｋ８１Ｑ、Ｋ８１Ｎ、Ｋ８４Ｑ、Ｋ８４Ｎ、Ｄ８５Ｑ、Ｄ８５Ｎ、Ｄ８６Ｑ。
【００１６】
前記突然変異が付与するかもしれない（活性又は安定性の）改善は、これらの突然変異のいずれについてもまだ実験的に確認されていない可能性があり、従ってこれは科学的憶測のレベルにとどまっている。
【００１７】
改善された熱安定性をもつＩＦＮγ突然変異体
ＩＦＮγ（特に単量体形態）は低い安定性を有することがわかっている。このため野生型タンパク質は２つのパラメータすなわち酸性ｐＨ及び温度に対して非常に敏感になっている。これらの非生理学的条件での突然変異体の安定性の増大は生理学的条件下での安定性の類似の増大と関連づけられるであろうと予想されている。従って、測定が最も容易なパラメータである熱安定性が増大した突然変異体の探求に研究の焦点があてられてきた。
【００１８】
特許文献８は、Ｎ末端の−１位に付加されたメチオニン、ＣＹＣ残基なしの成熟配列の最初の１３２個のアミノ酸を含み、１３３番目のアミノ酸がグルタミンではなくロイシンであるＩＦＮγ変異体を開示している。ＩＦＮγの１０個のＣ末端アミノ酸の切断を伴う前記変異体は、デルタ１０Ｌ又はＣ１０Ｌと名付けられている。それは、野生型ＩＦＮγ（溶融温度５２〜５３℃）と比べて改善された生物活性とわずかに改善された熱安定性（溶融温度５５℃）を有している。
【００１９】
特許文献９は、一部のＮ及びＣ末端アミノ酸の突然変異と共役された最後の９個のＣ末端残基の切断を伴って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で生産された一連のＩＦＮγ突然変異体を開示している。前記突然変異は、全て抗ウイルス及び抗腫瘍活性を保存しながら、ジスルフィド架橋を導入し、次にこの架橋がこれらの分子に対して熱安定性特性を付与する。この特許の中では、ＣＹＣ残基は、成熟タンパク質の一部であり、このトリプレット内のシステインの変異体が生産された。
野生型（完全配列） ５０℃で１時間後に２５％の
残留活性
突然変異Ｍ１５７＋Ｄｅｌｔａ９ ５０℃で１時間後に８１％の
残留活性
突然変異Ｃ２１Ｓ−Ｍ１５７Ｃ＋Ｄｅｌｔａ９ ５０℃で１時間後に８６％の
残留活性
突然変異Ｃ２３Ｓ−Ｍ１５７Ｃ＋Ｄｅｌｔａ９ ５０℃で１時間後に９８％の
残留活性
突然変異Ｃ２１Ｓ−Ｃ２３Ｓ−Ｍ１５７Ｃ＋Ｄｅｌｔａ９ ５０℃で１時間後に
２３％の残留活性
【００２０】
特許文献１０は、単量体間及び単量体内ジスルフィド架橋を作り出し、それによってＩＦＮγホモ２量体を安定化させるべく、ＩＦＮγ構造内の特定の場所にシステイン対が取込まれている、熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体を開示している。ＩＦＮγの生物活性を保存する唯一のシステイン対は、同じ単量体のヘリックスＡ及びＤを連結するＥ３０Ｃ−Ｓ９２Ｃであり、その他の単量体間システイン対はＩＦＮγの生物活性を破壊する。この特許内で開示されている突然変異体は、同様に、Ｄｅｌｔａ１０突然変異体に対応する切断Ｃ末端をも有している。
【００２１】
重合体の付加によるＩＦＮγの修飾は、非特許文献３によって及び特許文献１１及び特許文献１２の中で報告されている。
【００２２】
特許文献１３は、（ＩＦＮγを内含する）成長ホルモン構造スーパーファミリに属するタンパク質の変異体であって、ペプチド構造の一部の可欠アミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている変異体を開示している。ＩＦＮγは、前記スーパーファミリのメンバーの一例として言及されているが、ＩＦＮγの実験的修飾は開示されていない。
【００２３】
特許文献１４は、グリコシル化部位の挿入により修飾されかつ／又はＰＥＧタイプの部分により誘導体化された新規の、ＩＦＮγ分子を開示している。前記分子は、改善された半減期及び／又は改善された生物学的利用能などの改善された特性を有している。
【００２４】
特許文献１５は、改善された安定性を有するインターフェロンのスルフォアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体を含有する医薬組成物について記述している。
【００２５】
現在、前記変異体のいずれも薬剤の形態では利用不可能である。このような理由から、改良型ＩＦＮγ、特に生理学的条件でより高い安定性をもつＩＦＮγに対する強い需要がなおも存在している。前記生理学的条件での安定性の増大は、高温での安定性の増大により評価可能である。
【特許文献１】米国特許第４，８３２，９５９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１２０，７６２号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４００５３４１号パンフレット
【特許文献４】欧州特許第０２１９７８１号明細書
【特許文献５】欧州特許第０３０６８７０号明細書
【特許文献６】米国特許第６，９５８，３８８号明細書
【特許文献７】国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９２／０８７３７号パンフレット
【特許文献９】米国特許第４，８９８，９３１号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，０４６，３０４号明細書
【特許文献１１】欧州特許第２３６９８７号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，１０９，１２０号明細書
【特許文献１３】国際公開第９９／０３８８７号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第０１／３６００１号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第０３００２１５２号パンフレット
【非特許文献１】ニシ（Ｎｉｓｈｉ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第９７号：１５３〜１５９頁、１９８５年
【非特許文献２】「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第２０２号：１１３３〜１１４０頁、１９９１年
【非特許文献３】キタ（Ｋｉｔａ）ら、「Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｌｉｖ．」第６号：１５７〜１６７頁、１９９０年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、ヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００２７】
特に本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含む、ヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントを含む医薬組成物において、変異体が第１の置換により導入された残基に付着した非ペプチド部分を含有していない医薬組成物に関する。一実施形態においては、変異体は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、配列番号２、４及び６の配列からなる群の中から選択された配列を有するポリペプチドと異なっている。特定の実施形態においては、変異体は単一の置換を有する。もう１つの実施形態においては、変異体は、Ｍ１５７Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１００Ｎからなる群の中から選択された少なくとも１つのその他の置換をさらに含む。特に変異体は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｍ１５７Ｃ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された２つの置換の組合せを含むか又は有していてよい。好ましい実施形態では、変異体は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ６２Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｅ６２Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ６２Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｄ９９Ｙ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ７４Ｇ、Ｄ９９Ｙ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１００Ｎ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｄ９９Ｙ＋Ｎ５８Ｒ、Ｄ９９Ｙ＋Ｔ９５Ｖ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ７４Ｇ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ７４Ｇ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ７４Ｇ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ７４Ｇ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｇ４１Ｓ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｇ４１Ｓ、Ｎ５８Ｒ＋Ｔ９５Ｖ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１００Ｎ、Ｎ５８Ｒ＋Ｇ４１Ｓ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ＋Ｇ４１Ｓ、Ｍ１５７Ｃ＋Ｍ１００ＮおよびＭ１５７Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有している。より好ましい実施形態においては、変異体は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有している。特に好ましい実施形態においては、変異体は組合せＳ６３＋Ｇ４１Ｓを含むか又は有している。特定の実施形態においては、変異体はＣ末端において１〜１１個のＣ末端残基の欠失を有していない。もう１つの特定の実施形態においては、変異体は１〜１１個のＣ末端残基の欠失を有している。特定の実施形態においては、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有していない。もう１つの特定の実施形態においては、変異体は、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有している。問題の非ペプチド分子はより特定的には重合体分子、好ましくはポリエチレングリコールである。特定の実施形態においては、変異体はグリコシル化されている。もう１つの特定の実施形態においては、変異体はグリコシル化されていない。特定の実施形態においては、医薬組成物は、少なくとも１つのその他の作用物質をさらに含む。少なくとも１つのその他の活性作用物質は好ましくは、抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬からなる群の中から選択される。好ましい実施形態においては、少なくとも１つのその他の活性作用物質は、Ｉ型インターフェロン、特にインターフェロンアルファ又はベータである。医薬組成物は、経口、非経口（例えば皮下、筋内、静脈内又は皮内）、舌下、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、局部（ｌｏｃａｌ）、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、眼球内又は耳介内経路による投与向けに処方されていてよい。
【００２８】
本発明は同様に、薬剤としての本発明による医薬組成物にも関する。
【００２９】
本発明は、抗ウイルス性、抗増殖性、又は免疫調節性薬剤としての同時、逐次又は分離使用のための組合せ型調製用のもう１つの活性作用物質と本発明による医薬組成物を含む製品にも関する。好ましくは、その他の活性作用物質は、抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬からなる群の中から選択される。好ましい実施形態においては、その他の活性作用物質は、Ｉ型インターフェロン、特にインターフェロンアルファ又はベータである。２つの活性作用物質は、同じ投与経路又は２つの異なる投与経路により投与することができる。特定の実施形態においては、薬剤は、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血性ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状を治療するために設計されている。
【００３０】
本発明は同様に、抗ウイルス性、抗増殖性又は免疫調節性薬剤を調製するため本発明による医薬組成物の使用にも関する。好ましい実施形態においては、薬剤は、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血性ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状の治療用である。
【００３１】
本発明は、上述の組成物中で記述されている熱安定性ＩＦＮγ変異体をコードする核酸に関する。本発明は同様に、本発明による核酸の発現カセット、本発明による核酸又は発現カセットを含むベクター、及び本発明による核酸、発現カセット又はベクターを含む宿主細胞にも関する。本発明はさらに、前述の組成物中の記述された熱安定性ＩＦＮγ変異体を生産することを目的とした、１つのかかる核酸、１つのかかる発現カセット、１つのかかるベクター又は１つのかかる細胞の使用にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、その安定性、特に熱安定性が野生型ＩＦＮγに比べて増大しているヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の変異体に関する。本発明のＩＦＮγタンパク質変異体は、指向進化により生み出される多様な突然変異の生成を、改善された熱安定性を示す変異体を直接選択するための方法と結びつけることによって得られた。改善された候補の熱変性に対する安定性ならびにその活性の保存は、生物学的試験により検証された。本発明による変異体は、現在治療用、特に慢性肉芽腫症及び特発性肺線維症の治療において用いられている組換え型ＩＦＮγの代替物を表わしている。
【００３３】
成熟ＩＦＮγタンパク質のＮ末端におけるＣＹＣアミノ酸残基の存在に関する根深い不安感及びその結果としての成熟タンパク質中のアミノ酸の付番に関する疑念を考慮して、本出願で採用した付番は、シグナルペプチド配列を含む全てのＩＦＮγ残基（内含されたＮ末端メチオニンシグナルペプチドの１からインターフェロンのＣ末端グルタミンの１１６まで付番された全てのアミノ酸−配列番号２の配列）を考慮に入れたものとする。その他の２つの形態（ＣＹＣなしの成熟形態、配列番号４、又はＣＹＣを伴う成熟形態、配列番号６）における置換の位置は、当業者により容易に決定可能である。
【００３４】
以下の用語は、置換を示すためのものである：すなわち、Ｃ２１Ｇは、配列番号２の２１位にあるシステイン残基の、グリシン残基による置換を表わす。「置換」及び「突然変異」という用語は互換性をもつ。「＋」という符号は２つの置換の組合せを表わす。
【００３５】
本発明は、表１、表２及び図２〜９に記述されている少なくとも１つの置換を含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００３６】
本発明は好ましくは、次のものからなる群のうちの１つから選択された少なくとも１つの置換を含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する：
（ａ） Ｃ２１Ｇ、Ｃ２１Ｗ、Ｙ２２Ｄ、Ｙ２２Ｔ、Ｙ２２Ｓ、Ｓ２３Ｃ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｓ４３Ｃ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｔ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｌ５１Ｉ、Ｌ５３Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｔ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｑ６９Ｆ、Ｑ６９Ｔ、Ｖ７３Ｉ、Ｓ７４Ｇ、Ｙ７６Ｄ、Ｋ７８Ｑ、Ｌ７９Ｖ、Ｆ８０Ｖ、Ｋ８１Ｉ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｖ、Ｑ８７Ｉ、Ｑ８７Ｐ、Ｓ８８Ｎ、Ｓ８８Ｑ、Ｔ９５Ａ、Ｔ９５Ｖ、Ｔ９５Ｆ、Ｉ９６Ｌ、Ｋ９７Ｉ、Ｋ９７Ｒ、Ｅ９８Ｋ、Ｄ９９Ｎ、Ｄ９９Ｃ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｉ、Ｄ９９Ｍ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｄ９９Ｗ、Ｄ９９Ｙ、Ｄ９９Ｖ、Ｍ１００Ｉ、Ｍ１００Ｖ、Ｍ１００Ｎ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｖ、Ｋ１０３Ｒ、Ｎ１０６Ｄ、Ｎ１０６Ｑ、Ｎ１０６Ｇ、Ｓ１０７Ｃ、Ｓ１０７Ｇ、Ｓ１０７Ｅ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１１０Ｈ、Ｄ１１３Ｓ、Ｅ１１６Ｃ、Ｅ１１６Ｑ、Ｅ１１６Ｈ、Ｅ１１６Ｉ、Ｅ１１６Ｖ、Ｔ１１９Ｃ、Ｔ１１９Ｉ、Ｔ１１９Ｍ、Ｔ１１９Ｖ、Ｔ１１９Ｙ、Ｔ１１９Ｐ、Ｎ１２０Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｎ１２０Ｌ、Ｎ１２０Ｔ、Ｙ１２１Ｔ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｃ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｉ、Ｓ１２２Ｌ、Ｓ１２２Ｋ、Ｓ１２２Ｐ、Ｓ１２２Ｈ、Ｖ１２３Ｔ、Ｖ１２３Ｈ、Ｖ１２３Ｐ、Ｔ１２４Ｃ、Ｔ１２４Ｈ、Ｌ１２６Ｒ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１２６Ｔ、Ｌ１２６Ｖ、Ｎ１２７Ａ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｑ、Ｎ１２７Ｅ、Ｎ１２７Ｇ、Ｎ１２７Ｉ、Ｎ１２７Ｋ、Ｎ１２７Ｆ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｗ、Ｎ１２７Ｙ、Ｖ１２８Ｉ、Ｖ１２８Ｙ、Ｑ１２９Ｒ、Ｑ１２９Ｃ、Ｑ１２９Ｈ、Ｑ１２９Ｉ、Ｑ１２９Ｙ、Ｑ１２９Ｖ、Ｒ１３０Ｑ、Ｒ１３０Ｌ、Ｒ１３０Ｋ、Ｒ１３０Ｔ、Ｋ１３１Ｍ、Ｋ１３１Ｉ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４１Ｈ、Ａ１４１Ｖ、Ｅ１４２Ｆ、Ｌ１４３Ｉ、Ｓ１４４Ｇ、Ｓ１４４Ｌ、Ｓ１４４Ｗ、Ｓ１４４Ｖ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｅ、Ａ１４７Ｆ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ｔ１４９Ｅ、Ｔ１４９Ｍ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５１Ｃ、Ｋ１５１Ｈ、Ｋ１５１Ｓ、Ｋ１５１Ｖ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｗ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６２Ｃ、Ｒ１６２Ｉ、Ｒ１６２Ｌ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｖ、Ｒ１６３Ｔ、Ｒ１６３Ｌ、Ｒ１６３Ｇ、Ａ１６４Ｇ、Ａ１６４Ｓ、Ａ１６４Ｅ及びＳ１６５Ｖ又はそれらの組合せ；或いは
（ｂ） Ｃ２１Ｇ、Ｃ２１Ｗ、Ｙ２２Ｄ、Ｙ２２Ｔ、Ｙ２２Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｓ４３Ｃ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｔ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｌ５１Ｉ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｍ１００Ｎ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１１０Ｈ、Ｔ１１９Ｙ、Ｔ１１９Ｐ、Ｙ１２１Ｔ、Ｓ１２２Ｈ、Ｓ１２２Ｐ、Ｋ１３１Ｉ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｅ、Ａ１４７Ｆ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｗ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６３Ｔ、Ｒ１６３Ｌ、Ｒ１６３Ｇ、Ａ１６４Ｅ及びＳ１６５Ｖ又はそれらの組合せ；或いは
（ｃ） Ｌ５３Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｔ、Ｑ６９Ｆ、Ｑ６９Ｔ、Ｖ７３Ｉ、Ｓ７４Ｇ、Ｋ７８Ｑ、Ｌ７９Ｖ、Ｆ８０Ｖ、Ｋ８１Ｉ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｖ、Ｑ８７Ｉ、Ｑ８７Ｐ、Ｓ８８Ｎ、Ｓ８８Ｑ、Ｔ９５Ａ、Ｔ９５Ｖ、Ｔ９５Ｆ、Ｉ９６Ｌ、Ｋ９７Ｉ、Ｋ９７Ｒ、Ｄ９９Ｎ、Ｄ９９Ｃ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｉ、Ｄ９９Ｍ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｄ９９Ｗ、Ｄ９９Ｙ、Ｄ９９Ｖ、Ｍ１００Ｉ、Ｍ１００Ｖ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｖ、Ｋ１０３Ｒ、Ｎ１０６Ｄ、Ｎ１０６Ｑ、Ｎ１０６Ｇ、Ｓ１０７Ｃ、Ｓ１０７Ｇ、Ｓ１０７Ｅ、Ｄ１１３Ｓ、Ｅ１１６Ｃ、Ｅ１１６Ｑ、Ｅ１１６Ｈ、Ｅ１１６Ｉ、Ｅ１１６Ｖ、Ｔ１１９Ｃ、Ｔ１１９Ｉ、Ｔ１１９Ｍ、Ｔ１１９Ｖ、Ｎ１２０Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｎ１２０Ｌ、Ｎ１２０Ｔ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｃ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｉ、Ｓ１２２Ｌ、Ｓ１２２Ｋ、Ｓ１２２Ｐ、Ｖ１２３Ｔ、Ｖ１２３Ｈ、Ｖ１２３Ｐ、Ｔ１２４Ｃ、Ｔ１２４Ｈ、Ｌ１２６Ｒ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１２６Ｔ、Ｌ１２６Ｖ、Ｎ１２７Ａ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｑ、Ｎ１２７Ｅ、Ｎ１２７Ｇ、Ｎ１２７Ｉ、Ｎ１２７Ｋ、Ｎ１２７Ｆ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｗ、Ｎ１２７Ｙ、Ｖ１２８Ｉ、Ｖ１２８Ｙ、Ｑ１２９Ｒ、Ｑ１２９Ｃ、Ｑ１２９Ｈ、Ｑ１２９Ｉ、Ｑ１２９Ｙ、Ｑ１２９Ｖ、Ｒ１３０Ｑ、Ｒ１３０Ｌ、Ｒ１３０Ｋ、Ｒ１３０Ｔ、Ｋ１３１Ｉ、Ｋ１３１Ｍ、Ａ１４１Ｈ、Ａ１４１Ｖ、Ｅ１４２Ｆ、Ｌ１４３Ｉ、Ｓ１４４Ｇ、Ｓ１４４Ｌ、Ｓ１４４Ｗ、Ｓ１４４Ｖ、Ｔ１４９Ｅ、Ｔ１４９Ｍ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５１Ｃ、Ｋ１５１Ｈ、Ｋ１５１Ｓ、Ｋ１５１Ｖ、Ｒ１６２Ｃ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｉ、Ｒ１６２Ｌ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｖ、Ａ１６４Ｇ、Ａ１６４Ｓ又はそれらの組合せ；或いは
（ｄ） Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖ。
【００３７】
「含む」という語は、変異体又はそのフラグメントが配列番号２、４、及び６というポリペプチド配列を基準にして指示される１つ以上の置換を有するものの、その他の修飾、特に置換、欠失又は付加をも有し得る、ということを意味するものと理解される。
【００３８】
「有する」という語は、変異体又はそのフラグメントが配列番号２、４、及び６というポリペプチド配列を基準にして指示される置換のみを含んでいることを意味するものと理解される。
【００３９】
本発明は、上述の群から選択された置換の組合せを含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。この組合せは、前記群から選択された２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換で構成され得る。その上、本発明による熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体は、前記群の中に記述されていないその他の突然変異、好ましくは置換、特に当該技術分野で周知であるいくつかのものを含み得る。一例を挙げると、既知の置換は、国際公開第９２／０８７３７号パンフレット、国際公開第９９／０３８８７号パンフレット、国際公開第０１／３６００１号パンフレット、国際公開第０２／８１５０７号パンフレット、国際公開第０３／００２１５２号パンフレット、国際公開第２００４／００５３４１号パンフレット、国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレット、米国特許第６，９５８，３８８号明細書、米国特許第４，８９８，９３１号明細書、米国特許第６，０４６，０３４号明細書及び国際公開第２００６／１２０５８０号パンフレットの中で記述されている。
【００４０】
例えば、本発明は、Ｃ２１Ｗ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１１０Ｈ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ａ１４７Ｅ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｌ１５８Ｗ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｑ及びＲ１６２Ｅ又はその組合せからなる群の中から選択された少なくとも１つの置換を含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。もう１つの例では、本発明は、Ｑ２４Ａ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ、Ｋ１０９Ｃ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ａ１４７Ｅ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ及びＲ１６２Ｄ又はその組合せからなる群の中から選択された突然変異の少なくとも１つを含む、ヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００４１】
さらに一層好ましい実施形態においては、本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群の中から選択された少なくとも１つの第１の置換を含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。好ましい一実施形態においては、変異体は、前記第１の置換により導入された残基に付着したいかなる非ペプチド部分も含まない。前記変異体は、Ｍ１５７Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１００Ｎからなる群の中から選択された少なくとも１つのその他の置換をさらに含んでいてよい。
【００４２】
もう１つの実施形態においては、本発明は、単一の置換Ｃ２３Ｓ又はＭ１５７Ｃか又はＣ２１Ｇ、Ｃ２１Ｗ、Ｙ２２Ｄ、Ｙ２２Ｔ、Ｙ２２Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｓ４３Ｃ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｔ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｌ５１Ｉ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｍ１００Ｎ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１１０Ｈ、Ｔ１１９Ｙ、Ｔ１１９Ｐ、Ｙ１２１Ｔ、Ｓ１２２Ｈ、Ｓ１２２Ｐ、Ｋ１３１Ｉ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｅ、Ａ１４７Ｆ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｗ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６３Ｔ、Ｒ１６３Ｌ、Ｒ１６３Ｇ、Ａ１６４Ｅ、Ｓ１６５Ｖ、Ｌ５３Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｔ、Ｑ６９Ｆ、Ｑ６９Ｔ、Ｖ７３Ｉ、Ｓ７４Ｇ、Ｋ７８Ｑ、Ｌ７９Ｖ、Ｆ８０Ｖ、Ｋ８１Ｉ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｖ、Ｑ８７Ｉ、Ｑ８７Ｐ、Ｓ８８Ｎ、Ｓ８８Ｑ、Ｔ９５Ａ、Ｔ９５Ｖ、Ｔ９５Ｆ、Ｉ９６Ｌ、Ｋ９７Ｉ、Ｋ９７Ｒ、Ｄ９９Ｎ、Ｄ９９Ｃ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｉ、Ｄ９９Ｍ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｄ９９Ｗ、Ｄ９９Ｙ、Ｄ９９Ｖ、Ｍ１００Ｉ、Ｍ１００Ｖ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｖ、Ｋ１０３Ｒ、Ｎ１０６Ｄ、Ｎ１０６Ｑ、Ｎ１０６Ｇ、Ｓ１０７Ｃ、Ｓ１０７Ｇ、Ｓ１０７Ｅ、Ｄ１１３Ｓ、Ｅ１１６Ｃ、Ｅ１１６Ｑ、Ｅ１１６Ｈ、Ｅ１１６Ｉ、Ｅ１１６Ｖ、Ｔ１１９Ｃ、Ｔ１１９Ｉ、Ｔ１１９Ｍ、Ｔ１１９Ｖ、Ｎ１２０Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｎ１２０Ｌ、Ｎ１２０Ｔ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｃ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｉ、Ｓ１２２Ｌ、Ｓ１２２Ｋ、Ｓ１２２Ｐ、Ｖ１２３Ｔ、Ｖ１２３Ｈ、Ｖ１２３Ｐ、Ｔ１２４Ｃ、Ｔ１２４Ｈ、Ｌ１２６Ｒ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１２６Ｔ、Ｌ１２６Ｖ、Ｎ１２７Ａ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｑ、Ｎ１２７Ｅ、Ｎ１２７Ｇ、Ｎ１２７Ｉ、Ｎ１２７Ｋ、Ｎ１２７Ｆ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｗ、Ｎ１２７Ｙ、Ｖ１２８Ｉ、Ｖ１２８Ｙ、Ｑ１２９Ｒ、Ｑ１２９Ｃ、Ｑ１２９Ｈ、Ｑ１２９Ｉ、Ｑ１２９Ｙ、Ｑ１２９Ｖ、Ｒ１３０Ｑ、Ｒ１３０Ｌ、Ｒ１３０Ｋ、Ｒ１３０Ｔ、Ｋ１３１Ｉ、Ｋ１３１Ｍ、Ａ１４１Ｈ、Ａ１４１Ｖ、Ｅ１４２Ｆ、Ｌ１４３Ｉ、Ｓ１４４Ｇ、Ｓ１４４Ｌ、Ｓ１４４Ｗ、Ｓ１４４Ｖ、Ｔ１４９Ｅ、Ｔ１４９Ｍ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５１Ｃ、Ｋ１５１Ｈ、Ｋ１５１Ｓ、Ｋ１５１Ｖ、Ｒ１６２Ｃ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｉ、Ｒ１６２Ｌ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｖ、Ａ１６４Ｇ及びＡ１６４Ｓからなる群の中から選択された１つ以上の置換と組合せた形での置換Ｃ２３Ｓ又はＭ１５７Ｃのいずれかを有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントにも関する。１つの好ましい実施形態においては、本発明は、単一の置換Ｃ２３Ｓ又はＭ１５７Ｃか又はＳ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された１つ以上の置換と組合せた形での置換Ｃ２３Ｓ又はＭ１５７Ｃのいずれかを有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。さらに一層好ましい実施形態においては、本発明は、単一の置換Ｍ１５７Ｃ又はＳ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された１つ以上の置換と組合せた形での置換Ｍ１５７Ｃのいずれかを有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００４３】
一実施形態においては、本発明は以下のものからなる群の１つの中から選択された単一の置換を有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する：
（ａ） Ｃ２１Ｇ、Ｃ２１Ｗ、Ｙ２２Ｄ、Ｙ２２Ｔ、Ｙ２２Ｓ、Ｃ２３Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｓ４３Ｃ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｔ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｌ５１Ｉ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｍ１００Ｎ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１１０Ｈ、Ｔ１１９Ｙ、Ｔ１１９Ｐ、Ｙ１２１Ｔ、Ｓ１２２Ｈ、Ｓ１２２Ｐ、Ｋ１３１Ｉ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｅ、Ａ１４７Ｆ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｌ、Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｗ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６３Ｔ、Ｒ１６３Ｌ、Ｒ１６３Ｇ、Ａ１６４Ｅ及びＳ１６５Ｖ；又は
（ｂ） Ｌ５３Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｔ、Ｑ６９Ｆ、Ｑ６９Ｔ、Ｖ７３Ｉ、Ｓ７４Ｇ、Ｋ７８Ｑ、Ｌ７９Ｖ、Ｆ８０Ｖ、Ｋ８１Ｉ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｖ、Ｑ８７Ｉ、Ｑ８７Ｐ、Ｓ８８Ｎ、Ｓ８８Ｑ、Ｔ９５Ａ、Ｔ９５Ｖ、Ｔ９５Ｆ、Ｉ９６Ｌ、Ｋ９７Ｉ、Ｋ９７Ｒ、Ｄ９９Ｎ、Ｄ９９Ｃ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｉ、Ｄ９９Ｍ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｄ９９Ｗ、Ｄ９９Ｙ、Ｄ９９Ｖ、Ｍ１００Ｉ、Ｍ１００Ｖ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｖ、Ｋ１０３Ｒ、Ｎ１０６Ｄ、Ｎ１０６Ｑ、Ｎ１０６Ｇ、Ｓ１０７Ｃ、Ｓ１０７Ｇ、Ｓ１０７Ｅ、Ｄ１１３Ｓ、Ｅ１１６Ｃ、Ｅ１１６Ｑ、Ｅ１１６Ｈ、Ｅ１１６Ｉ、Ｅ１１６Ｖ、Ｔ１１９Ｃ、Ｔ１１９Ｉ、Ｔ１１９Ｍ、Ｔ１１９Ｖ、Ｎ１２０Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｎ１２０Ｌ、Ｎ１２０Ｔ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｃ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｉ、Ｓ１２２Ｌ、Ｓ１２２Ｋ、Ｓ１２２Ｐ、Ｖ１２３Ｔ、Ｖ１２３Ｈ、Ｖ１２３Ｐ、Ｔ１２４Ｃ、Ｔ１２４Ｈ、Ｌ１２６Ｒ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１２６Ｔ、Ｌ１２６Ｖ、Ｎ１２７Ａ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｑ、Ｎ１２７Ｅ、Ｎ１２７Ｇ、Ｎ１２７Ｉ、Ｎ１２７Ｋ、Ｎ１２７Ｆ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｗ、Ｎ１２７Ｙ、Ｖ１２８Ｉ、Ｖ１２８Ｙ、Ｑ１２９Ｒ、Ｑ１２９Ｃ、Ｑ１２９Ｈ、Ｑ１２９Ｉ、Ｑ１２９Ｙ、Ｑ１２９Ｖ、Ｒ１３０Ｑ、Ｒ１３０Ｌ、Ｒ１３０Ｋ、Ｒ１３０Ｔ、Ｋ１３１Ｉ、Ｋ１３１Ｍ、Ａ１４１Ｈ、Ａ１４１Ｖ、Ｅ１４２Ｆ、Ｌ１４３Ｉ、Ｓ１４４Ｇ、Ｓ１４４Ｌ、Ｓ１４４Ｗ、Ｓ１４４Ｖ、Ｔ１４９Ｅ、Ｔ１４９Ｍ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５１Ｃ、Ｋ１５１Ｈ、Ｋ１５１Ｓ、Ｋ１５１Ｖ、Ｒ１６２Ｃ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｉ、Ｒ１６２Ｌ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｖ、Ａ１６４Ｇ及びＡ１６４Ｓ；又は
（ｃ） Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖ。
【００４４】
例えば、置換は、Ｃ２１Ｗ、Ｃ２３Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１１０Ｈ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ａ１４７Ｅ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｃ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｌ１５８Ｗ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｑ及びＲ１６２Ｅからなる群の中から選択される。特に、置換はＣ２３Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ、Ｋ１０９Ｃ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ａ１４７Ｅ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｃ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ及びＲ１６２Ｄからなる群の中から選択されてもよい。好ましくは、本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群の中から選択された単一の置換を有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００４５】
一実施形態においては、本発明は、Ｃ２１Ｇ＋Ｆ１５９Ｃ、Ａ１４７Ｅ＋Ｒ１６２Ｄ、Ｍ１００Ｎ＋Ｔ１１９Ｙ、Ｙ７６Ｄ＋Ｋ１３１Ｉ、Ｔ５０Ｙ＋Ｙ１２１Ｔ＋Ｍ１４０Ｐ、Ｐ２６Ｄ＋Ｓ１２２Ｐ、Ｙ２２Ｓ＋Ｌ１５８Ｗ＋Ｒ１６３Ｇ、Ｙ２２Ｄ＋Ｓ１２２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ＋Ａ１６４Ｅ及びＹ２２Ｔ＋Ｋ１０９Ｃ＋Ｔ１１９Ｐ＋Ａ１４７Ｆ＋Ｒ１６３Ｌからなる群の中から選択された置換の組合せを有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００４６】
もう１つの実施形態においては、本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｍ１５７Ｃ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択２つの置換の組合せ、好ましくはＳ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ６２Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｅ６２Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ６２Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｄ９９Ｙ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ７４Ｇ、Ｄ９９Ｙ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１００Ｎ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｄ９９Ｙ＋Ｎ５８Ｒ、Ｄ９９Ｙ＋Ｔ９５Ｖ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ７４Ｇ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ７４Ｇ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ７４Ｇ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ７４Ｇ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｇ４１Ｓ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｇ４１Ｓ、Ｎ５８Ｒ＋Ｔ９５Ｖ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１００Ｎ、Ｎ５８Ｒ＋Ｇ４１Ｓ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ＋Ｇ４１Ｓ、Ｍ１５７Ｃ＋Ｍ１００Ｎ及びＭ１５７Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された組合せを含むか又は有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。好ましい実施形態において、本発明は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せ、好ましくは組合せＳ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓを含むか又は有する変異体に関する。
【００４７】
配列番号１〜６は、前駆体及び成熟形態のヒトＩＦＮγのタンパク質配列及びそれらをコードする核酸配列を記述する。好ましい実施形態においては、本発明による変異体は、１６６個のアミノ酸残基の前駆体タンパク質（配列番号２）又は本発明による少なくとも１つの置換又は置換の組合せを含むＣＹＣトリペプチドを伴うか又は伴わない成熟タンパク質（それぞれ配列番号６及び４）に対応する。特に「変異体」という用語は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ配列番号２、４及び６の配列の中から選択された配列を有するポリペプチドと異なっているポリペプチドを意味する。
【００４８】
「機能的フラグメント」というのは、ヒトＩＦＮγの活性を有するヒトＩＦＮγのフラグメントを意味している。例えば、前記フラグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜１５個の残基、さらに一層好ましくは１〜１１個の残基のＣ末端欠失を伴い、ＣＹＣトリペプチドを伴うか又は伴なわないヒトＩＦＮγの前駆体又は成熟形態に対応していてよい。フラグメントは、ヒトＩＦＮγの１００、１１０、１２０、１３０又は１４０個の連続するアミノ酸残基を含んでいてよい。
【００４９】
「ヒトＩＦＮγ活性」というのは、インビトロ又はインビボで決定される、ヒトＩＦＮγレセプタに結合しヒトＩＦＮγがそのレセプタに結合した時点で誘発されたシグナルの変換をひき起こす能力を意味する。ヒトＩＦＮγ活性は、明細書中及び実施例中で以下に記述する方法によって測定することができる。
【００５０】
本発明による変異体は、野生型ヒトＩＦＮγに比べて増大した熱安定性を有する。前記増大は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０、２０又は３０％である。「熱安定性」は、熱の作用にさらされた後もその活性を保つタンパク質の能力を意味するものと理解される。例えば、タンパク質を５９℃で１０分間インキュベートすることができる。このとき、変異体の熱安定性は前記前処理の後の残留活性の百分率によって評価される。一変異体の熱安定性のこの尺度は次に、同じ条件に付された野生型ＩＦＮγを用いることによって得られる同じ値と比較される。
【００５１】
熱安定性は改善されたが活性は低い変異体を使用してもよい。好ましくは、本発明の熱安定性変異体は、野生型ヒトＩＦＮγの活性の少なくとも１０％、好ましくは野生型ヒトＩＦＮγの活性の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％に対応する活性（前処理無しの条件）を保つ。特に好ましい実施形態においては、本発明の熱安定性変異体は、野生型ヒトＩＦＮγのものと同等であるかさらにはより高いものである活性を保つ。
【００５２】
対象の変異体を選択するための興味深い要因は、残留活性の百分率を乗じた変異体の相対的活性である。
【００５３】
「非ペプチド部分」は、ヒトＩＦＮγのアミノ酸の側鎖に付着可能な非ペプチド分子を示すべく意図されている。前記分子は、重合体分子、親油性分子、炭水化物又は有機誘導体化剤であり得る。炭水化物は、例えばＮ−又はＯ−グリコシル化などによる、インビトロ又はインビボグリコシル化によってＩＦＮγに付着可能である。親油性分子は例えば、飽和又は不飽和脂肪酸、テルペン、ビタミン、ステロイド又はカロテノイドであり得る。重合体分子はポリオール、ポリアミン、多炭素環酸（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ ａｃｉｄ）又はポリアルキレンオキサイド、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。このタイプの分子は、当業者にとって周知のものである。ＰＥＧ基を含有する変異体を「ペグ化」されていると呼ぶことにする。
【００５４】
本発明によるヒトＩＦＮγは、好ましくは４８位及び１２０位でグリコシル化可能である。もう１つの実施形態においては、変異体をグリコシル化することはできない。変異体が置換Ｇ４１Ｓを含む場合、それはＮ−グリコシル化によってＮ３９位でグリコシル化可能である。他の実施形態においては、かかる変異体をこの位置でグリコシル化することはできない。
【００５５】
一実施形態においては、重合体分子を付加すること、特に重合体を付加すること（キタら、「Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｌｉｖ．」第６号：１５７〜１６７頁、１９９０年；欧州特許第２３６９８７号明細書及び米国特許第５，１０９，１２０号明細書）又はペグ化（国際公開第９９／０３８８７号パンフレット；国際公開第２００４００５３４１号パンフレット、「重合体分子の接合」を参照）により変異体を修飾することができる。本発明によるヒトＩＦＮγ変位体の好ましい実施形態においては、重合体分子は、４１、５８、６２、６３、７４、９５、９９、１００、１１６、１２２、１２６、１５７、１５８、１５９及び１６２位以外の位置に付着させられる。特に、分子は、本発明による変異体内で行なわれた置換、特にＳ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１５７Ｃからなる群の中から選択された置換によって導入される残基には付着させられない。
【００５６】
もう１つの実施形態においては、本発明による変異体は、いかなる重合体分子も含有しない。特に、それはペグ化されない。
【００５７】
ＩＦＮγのインビトロ活性は一般に、増大する量のＩＦＮγでの処理後の細胞系に対するウイルスの細胞変性効果の減少に関して測定される。ＩＦＮγに特異的なその他の生物学的試験が存在する（再考のため、ミーガー（Ｍｅａｇｅｒ）、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第２６１号、（２００２年）２１〜３６頁）。特にこれらの新しい試験は、ＩＦＮγの多面的活性の特徴の１つをより特異的に評価することを可能にする。インビボ活性の試験も存在する。
【００５８】
ＩＦＮγに対する抗ウイルス応答は、異なる共役系（使用されたウイルスに対する感応性をもつウイルス／ＩＦＮγ−応答性接着細胞系）の中で測定可能である。例としては以下の共役系が含まれる：ＶＳＶ／ＭＤＢＫ；ＶＳＶ又はＥＭＣＶ／Ａ５４９、ＶＳＶ、ＥＭＣＶ、ＳＦＶ又はシンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス／ＷＩＳＨ；ＶＳＶ又はＥＭＣＶ／ＨｅＬａ；ＶＳＶ、ＥＭＣＶ又はメンゴウイルス（Ｍｅｎｇｏｖｉｒｕｓ）／ＦＳ４、ＦＳ７１、又はＨｅｐ２；ＶＳＶ、ＥＭＣＶ、メンゴウイルス又はシンドビスウイルス／ＦＬ；ＥＭＣＶ／２Ｄ９；ここでＶＳＶは水疱性口内炎ウイルス；ＥＭＣＶ＝脳心筋炎ウイルス；ＳＦＶ＝セムリキ森林熱ウイルスである。好ましくは、使用されるウイルスは、ワクシニアウイルス又はリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）となる。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びサイトメガロウイルスを使用してもよい。
【００５９】
ＩＦＮγの活性は、ＧＡＳ（ガンマーインターフェロン活性化部位）又はＩＳＲＥ要素（インターフェロン刺激型応答要素）を含むＩＦＮγ応答性プロモータの制御下で、例えばルシフェラーゼといったリポータ遺伝子を使用することによってもテストできる。このようにして、リポータ遺伝子は、ＩＦＮγによる刺激の後に検定を受ける。ｐＧＡＳ／ルシフェラーゼ及びｐＩＳＲＥ／ルシフェラーゼベクターは市販されている（＃２１９０９１、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。好ましい実施形態においては、ＩＦＮγ活性はＰＧＡＳ／ルシフェラーゼベクターを用いた方法によって測定される。
【００６０】
全てその生物学的活性を保ちながらのＩＦＮγの熱安定性の増加により、同等の生物学的活性について、使用される治療用量の削減及びその結果としての治療の弊害の削減を可能にするより効果的な治療の開発を想定することができるようになる。こうして、これまでこのタイプの分子では想像もできなかった、ヘルペスなどのウイルス感染を削減する目的でさらに高い用量のＩＦＮγを使用する治療も可能となる。その上、本発明による変異体は、特に室温で、野生型ＩＦＮγに比べて、その保管中のより長い半減期、ひいてはより優れた保管寿命という利点も有する可能性がある。
【００６１】
従って、本発明は、本発明による熱安定性ＩＦＮγ変位体を含む医薬組成物に関する。
【００６２】
このようにして、本発明は好ましくは、特に本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含む、熱安定性ＩＦＮγ変異体又はその機能的フラグメントを含む医薬組成物において、変異体が第１の置換により導入された残基に付着した非ペプチド部分を含有していない医薬組成物に関する。一実施形態においては、変異体は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、配列番号２、４及び６の配列の中から選択された配列を有するポリペプチドと異なっている。特定の実施形態においては、この変異体は単一の置換を有する。もう１つの実施形態においては、変異体は、Ｍ１５７Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１００Ｎからなる群の中から選択された少なくとも１つのその他の置換をさらに含む。特に変異体は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｍ１５７Ｃ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された２つの置換の組合せを含むか又は有していてよい。好ましい実施形態では、変異体は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ６２Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｅ６２Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ６２Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｄ９９Ｙ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ７４Ｇ、Ｄ９９Ｙ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１００Ｎ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｄ９９Ｙ＋Ｎ５８Ｒ、Ｄ９９Ｙ＋Ｔ９５Ｖ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ７４Ｇ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ７４Ｇ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ７４Ｇ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ７４Ｇ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｇ４１Ｓ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｇ４１Ｓ、Ｎ５８Ｒ＋Ｔ９５Ｖ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１００Ｎ、Ｎ５８Ｒ＋Ｇ４１Ｓ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ＋Ｇ４１Ｓ、Ｍ１５７Ｃ＋Ｍ１００ＮおよびＭ１５７Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有している。さらに一層好ましい実施形態においては、変異体は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ及びＳ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択置換の組合せを含むか又は有している。特に一層好ましい実施形態においては、変異体は組合せＳ６３＋Ｇ４１Ｓを含むか又は有している。特定の実施形態においては、変異体はＣ末端において１〜１１個の残基の欠失を有していない。もう１つの特定の実施形態においては、変異体はＣ末端において１〜１１個の残基の欠失を有している。特定の実施形態においては、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有していない。もう１つの特定の実施形態においては、変異体は、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分をまさに含有している。当該の非ペプチド分子はより特定的には重合体分子、好ましくはポリエチレングリコールである。特定の実施形態においては、変異体はグリコシル化されている。特に変異体は、それが置換Ｇ４１Ｓを含む場合にＮ−グリコシル化によりＮ３９位においてグリコシル化され得る。
【００６３】
本発明による医薬組成物は、薬学的に許容できる支持体又は賦形剤をさらに含み得る。前記支持体及び賦形剤は、当業者にとって周知のものである（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ａ．Ｒ．ジェンナーロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０年］；「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓ．フロクジャー（Ｆｒｏｋｊａｅｒ）及びＬ．ホヴガード（Ｈｏｖｇａａｒｄ）編、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００年］；及び「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ａ．キッブ（Ｋｉｂｂｅ）編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０００年］）。
【００６４】
本発明による医薬組成物は、さまざまな形態で、特に液体、ゲル、凍結乾燥、粉末、圧縮固体その他の形態で処方可能である。
【００６５】
本発明はさらに、薬剤としての本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体又は本発明による組成物にも関する。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口（例えば皮内、筋内、静脈内、皮下）、舌下、局所、局部、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、眼球内、耳介内投与に適し、それ向けに処方されており、前記活性作用物質は１投薬量単位の形で投与することができる。
【００６７】
医薬組成物の一例は、非経口投与向け溶液である。組成物は即時に使用するのに適した液体形態であってもよいが、かかる非経口形態を凍結した形態又は凍結乾燥した形態で提供してもよい。この場合、組成物は使用に先立ち解凍されるか又はもどされることになる。凍結乾燥の場合、組成物は注射用滅菌水又は無菌生理食塩溶液などの薬学的に許容できる希釈剤の添加によって調製されることになる。
【００６８】
単位剤形は、例えば錠剤、カプセル、ゲル、顆粒、粉末、経口又は注射用溶液又は懸濁液、経皮パッチ、舌下、口腔、気管内、眼球内、鼻腔内、耳介内形態、吸入、局所、経皮、皮下、筋内又は静脈内形態、直腸投与形態又はインプラントであってよい。
【００６９】
局所投与向けの処方物としては、クリーム、ゲル、軟こう、ローション又は滴剤がある。前記薬学処方物は、関連分野の従来の方法に従って調製される。好ましい実施形態においては、医薬組成物は液体である。
【００７０】
前記単位剤形は、薬学処方物に応じて、体重１ｋｇあたり０．００１〜１００μｇの活性成分の連日投与を可能にするように投薬される。それよりも高いか又は低い投薬量強度が適切である特殊なケースも考えられる。前記投薬量は、本発明の範囲から逸脱するものではない。標準的実践に従うと、各患者のための適切な用量は、投与方法、患者の体重及び応答性に従って医師によって決定される。
【００７１】
好ましい実施形態においては、ＩＦＮγは経口経路、好ましくは皮下注射により投与される。例えば、ＩＦＮγの通常の注射用量は、体表面積が０．５ｍ２超である場合には１〜１００μｇ／ｍ２の間に含まれ、体表面積が０．５ｍ２以下の場合には体重１ｋｇあたり０．０１〜１０μｇの間に含まれる。
【００７２】
ＩＦＮγは、広い活性スペクトラムをもつ多面性サイトカインの原型である。事実、インターフェロン（ＩＦＮ）には、ウイルス複製の阻害、細胞増殖の阻害及びアポトーシスの誘発などの活性がある。
【００７３】
特に、ＩＦＮγによるマクロファージ刺激は、以下の応答を誘発する：
− 食作用及び細菌死滅の増強（直接的抗菌性及び抗腫瘍性機序）；
− 抗原提示及び分離経路の刺激、マクロファージ表面におけるＩ型及びＩＩ型主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の発現；
− 免疫グロブリンＩｇＧ生産及び補体活性化を結果としてもたらす、抗体分泌プラズマ細胞へのＢリンパ球の分化；
− 細胞毒性酸素遊離ラジカル及びＮＯを生産させるＮＯシンターゼの活性化；
及び／又は
− サイトカイン及び内因性ＩＦＮの生産の増強。
【００７４】
ＩＦＮγは、その分化を促進し、それによって特異的免疫応答を変調させることによってＴリンパ球に対して作用する。
【００７５】
ＩＦＮγの薬学的特性の中でも、追求され臨床段階で開発された主要な効果は、主として免疫調節面であり、抗ウイルス治療用分子の面は今までのところさほど大規模に開発されていない。
【００７６】
その広い活性スペクトラム（抗ウイルス性、抗増殖性及び免疫変調性）を理由として、ＩＦＮγは、多様なヒト疾患の治療における治療薬として開発されてきた。市販のＩＦＮγ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ及びＢｉｏｇａｍｍａ）は、特に２つの主要な治療適応すなわち慢性肉芽腫症及び特発性肺線維症において経口プレドニゾロンと組合せて使用されている。主要な治療適応に加えて、数多くの新規な二次的適応が現在、特に例えばＣ型肝炎の治療におけるペグ化ＩＦＮγ／リバビリンに対する付加物としてのその免疫抑制的役割のために、異なる臨床的開発段階（ＩＩ及びＩＩＩ）にある。非定型抗酸菌感染症、腎臓癌；大理石骨病；全身性強皮症；慢性Ｂ型肝炎；慢性Ｃ型肝炎；敗血性ショック；アレルギー性皮膚炎；関節リウマチ；卵巣癌；肝線維症；ぜんそく；及びリンパ腫に言及することもできる。
【００７７】
ＩＦＮγは同様に、さまざまなウイルス感染の治療においても有用であり、ヒト乳頭腫ウイルス感染及びＢ型及びＣ型肝炎ウイルス感染に対抗する活性を示す。
【００７８】
その上、高用量のＩＦＮγに付随する毒性の問題が、より安定した分子、ひいてはインビボでより強い効果を有する分子により軽減又は解決されたとすると、新規の適応性におけるＩＦＮγの使用、特にヘルペス（ＨＳＶ）Ｉ型及びＩＩ型ウイルス感染を治療するための使用を再度考慮してもよいと思われる。
【００７９】
従って、本発明は、抗ウイルス性、抗増殖性又は免疫調節性薬剤を調製するための本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体又は本発明による医薬組成物の使用に関する。例えば前記薬剤は、炎症性疾患、癌、感染症、骨疾患、自己免疫疾患などを治療するように設計される。好ましい実施形態においては、本薬剤は、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血症ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状を治療するように設計される。変形実施形態においては、本薬剤は、痒痛、神経皮膚炎、Ｉ型糖尿病、血管狭窄症、基底細胞上皮腫、癌又はリンパ腫例えば卵巣癌、腎臓癌、白血病例えばＢ又はＴ細胞増殖性障害、慢性骨髄性白血病及び関連する症候群、乳癌、肺癌、黒色腫、結腸直腸癌、脳腫瘍、胸膜癌、胃癌、膵癌、ウイルス感染例えばＢ型又はＣ型肝炎ウイルスに起因するもの、クローン病、乾癬、多発性硬化症及び筋萎縮性側湾硬化症からなる群の中から選択された病状を治療するように設計されている。
【００８０】
本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体は、もう１つの活性作用物質、例えば抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬及びその組合せからなる群の中から選択される活性作用物質と組合せた状態で使用してよい。付加的な活性作用物質は、本発明によるＩＦＮγの投与の前、又はそれと同時に又はその後に投与してよい。さらに、これを同じ投与経路で投与してもよいし、又２つの異なる投与経路で投与してもよい。このようにして本発明は、上述の病状の１つを治療するための同時、逐次又は分離使用向けに設計された複合製剤を目的とした、好ましくは上述のリストから選択されたもう１つの活性作用物質と、本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体又は医薬組成物を含む製品に関する。
【００８１】
抗体との組合せは、癌を治療するために有用である。実際、ＩＦＮγはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞細胞毒性）により抗体の効果を増大させることができる。抗体は好ましくは、癌細胞上で曝露された抗原に対抗して導かれる。抗体はポリクローナル、モノクローナル、ヒト化又はキメラ抗体であってよい。好ましくは、抗体はモノクローナルでかつヒト化されたものである。例えば、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞リンパ増殖性障害の場合、抗原はＣＤ２０であり得る。前記抗体はリツキシマブであり得る。
【００８２】
グルココルチコイドとの組合せは、特発性肺線維症などの肺胞性疾患を治療するために有用である。適切なグルココルチコイドの例としては、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン及びその薬学的に許容できる塩が含まれる。本発明の好ましい実施形態は、本発明によるＩＦＮγとプレドニゾロンの組合せの使用に関する。
【００８３】
抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬との組合せは、特に痒疹又は神経皮膚炎などの皮膚疾患を治療するために特に有用である。
【００８４】
抗アレルギー薬、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疾調節剤、又はサイトカインとの組合せは、特にぜん息を治療するために有用である。
【００８５】
本発明はさらに、必要としている患者における抗ウイルス性、抗増殖性又は免疫調節性治療方法において、この患者に対し治療上有効な量の本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体又は医薬組成物を投与する段階を含む方法に関する、好ましくは、治療方法は、上述の病状を治療するように設計されている。任意には、この方法は、好ましくは以上で列挙したものの中から選択されるもう１つの活性作用物質を投与する段階をさらに含んでいてよい。治療上有効な量は、疾病の症状を軽減又は除去する、又は疾病の進行を管理するか又は遅延させるのに必要な量である。患者は好ましくはヒトである。
【００８６】
本発明は、本発明によるヒトＩＦＮγの熱安定性変異体をコードする核酸に関する。本発明は同様に、本発明による核酸のための発現カセットにも関する。本発明はさらに、本発明による核酸又は発現カセットを含むベクターにも関する。このベクターはプラスミド及びウイルスベクターから選択されてよい。
【００８７】
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、又はｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、その２つの混合物であってよい。それは１本鎖又は２重鎖又はこれら２つの混合であってよい。これは、例えば修飾された結合、修飾されたプリン又はピリミジン塩基又は修飾された糖を含む、修飾されたヌクレオチドを含んでいてよい。これは、化学的合成、組換え、突然変異誘発などを含む、当業者にとって既知のあらゆる方法により調製してもよい。
【００８８】
発現カセットは、本発明による熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の発現のために必要な全ての構成要素、特に宿主細胞内での転写及び翻訳に必要な構成要素を含む。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってよい。特に、発現カセットは、プロモータ及びターミネータ、任意には増幅因子を含む。プロモータは、原核性又は真核性であってよい。好ましい原核プロモータは以下の通りである：Ｌａｃｌ、Ｌａｃｚ、ｐＬａｃｔ、Ｐｔａｃ、ｐＡＰＡ、ｐＢＡＤ、バクテリオファージＴ３又はＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモータ、ポリヘドリンプロモータ、ファージラムダのＰＲ又はＰＬプロモータ。好ましい真核プロモータの例は以下の通りである：ＣＭＶ早期プロモータ、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ、ＳＶ４０早期又は後期プロモータ、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモータ及び一部のレトロウイルスのＬＴＲ領域。一般に、適切なプロモータを選択するために、当業者は有利にもサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９年）の研究又はフラー（Ｆｕｌｌｅｒ）ら（１９９６年：「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」）で記述されている技術を参照することができる。
【００８９】
本発明は、本発明による熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体をコードする核酸又は発現カセットを含有するベクターに関する。ベクターは好ましくは発現ベクターである、すなわち、宿主細胞内での変異体の発現のために必要な構成要素を含んでいる。宿主細胞は原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は真核生物であり得る。真核生物は、下等真核生物例えば酵母（例えばＳ．セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は真菌（例えばコウジカビ属（ゲヌス・アスペルギルス（ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））又は高等真核生物例えば昆虫細胞（例えばＳｆ９又はＳｆ２１）、哺乳動物細胞又は植物細胞であってよい。細胞は哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ（グリーンモンキー細胞系）〔例えばＣＯＳ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ（米国特許第４，８８９，８０３号明細書；米国特許第５，０４７，３３５号明細書、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）〕、マウス細胞又はヒト細胞であってよい。特定の実施形態においては、細胞は非ヒト及び非胚細胞である。ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のｐＴｉプラスミドなどであってよい。ベクターは、好ましくは、複製起点、多重クローニング部位及び選択遺伝子からなる群の中から選択された１つ以上の要素を含んでいてよい。好ましい実施形態においては、ベクターはプラスミドである。原核生物ベクターの制限されない例は、以下の通りである：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＢＲ３２２及びｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＥＴ（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））。真核生物ベクターの制限されない例は、以下の通りである：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＰＩＣＺ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＣＩ−ｎｅｏ（ストラタジーン）、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア）；及びｐＱＥ−３０（ＱＬＡｅｘｐｒｅｓｓ）。ウイルスベクターの制限されない例としては、アデノウイルス活性作用物質Ｖ、ＨＳＶ、レンチウイルスなどが含まれる。好ましくは、発現ベクターはプラスミド又はウイルスベクターである。
【００９０】
本発明によるＩＦＮγをコードする配列は、シグナルペプチドを含んでいてもいなくてもよい。含まれていない場合には、メチオニンが任意にＮ末端に付加されてよい。もう１つの変形形態においては、非相同シグナルペプチドを導入することができる。前記非相同シグナルペプチドは、大腸菌といった原核生物又は真核生物、特に哺乳動物、昆虫又は酵母細菌の誘導体であってよい。
【００９１】
本発明は、細胞を形質転換又はトランスフェクトするための、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターの使用に関する。本発明は、熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体をコードする核酸、発現カセット又はベクターを含む宿主細胞、及び本発明による熱安定性組換え型ヒトＩＦＮγ変異体を生産するためのその使用に関する。「宿主細胞」という用語は、この細胞の培養又は成長の結果もたらされる娘細胞を包含する。特定の実施形態においては、細胞は非ヒト細胞であってかつ非胚細胞である。本発明は同様に、本発明による熱安定性組換え型ヒトＩＦＮγ変異体を生産するための方法において、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット又は発現ベクターで細胞を形質転換又はトランスフェクトする段階；トランスフェクション／形質転換を受けた細胞を培養する段階；及び細胞により生産された熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体を回収する段階を含む方法にも関する。１変形実施形態においては、本発明による熱安定性組換え型ヒトＩＦＮγ変異体を生産するための方法は、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む細胞を提供する段階；トランスフェクション／形質転換を受けた細胞を培養する段階；及び細胞により生産された熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体を回収する段階を含む。特に、細胞は、この変異体をコードする核酸により一過性の又は安定した形で形質転換／トランスフェクションを受けてよい。前記核酸は、エピソーム又はクロモソーム形態で細胞内に含有されていてよい。組換え型タンパク質を生産するための方法は、当業者にとって周知のものである。例としては、大腸菌中での生産については、米国特許第５，００４，６８９号明細書、欧州特許第４４６，５８２号明細書、ワング（Ｗａｎｇ）ら（「Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．」Ｂ２４：１０７６〜１０８４頁、１９９４年及び「Ｎａｔｕｒｅ」、第２９５号、５０３頁）、そして哺乳動物細胞内での生産についてはジェームス（ＪＡＭＥＳ）ら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６年）第５号：３３１〜３４０頁）内で記述されている特定的方法が含まれる。
【００９２】
本発明はさらに、本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体をコードする核酸、本発明による発現カセット、ベクター又は宿主細胞を含む医薬組成物特に上述の疾患を治療するように設計された薬剤を調製することを目的としたその使用にも関係し得る。本発明は同様に、治療上有効な量でかかる組成物を投与する段階を含む、それを必要とする患者の治療方法にも関する。
【００９３】
本明細書中に列挙された全ての参考文献は本出願の参照文献リスト中に記されている。本発明のその他の面及び利点は、当然のことながら制限的なものとしてではなくあくまでも例示をするために提供されている以下の実施例の中でより明確になるだろう。
【実施例】
【００９４】
熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の選択
発明者らは、仏国特許出願第０５０５９３５号明細書の中に記述されているＴＨＲと呼ばれる熱安定性タンパク質変異体を直接選択するための方法を開発した。
【００９５】
前記方法は、増大した熱安定性をもつヒトＩＦＮγ変異体とカナマイシン耐性タンパク質変異体との間の融合タンパク質を調製することに基づいている（カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼのこの２重突然変異体については、リアオ（Ｌｉａｏ）、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」、１９９３年、第１５号、２８６〜９２頁の中で記述されている）。ヒトＩＦＮγ変異体のライブラリは、仏国特許第２８１３３１４号明細書中で記述されているＭａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ（登録商標）の方法によって調製され、テルモス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌株ＨＢ２７の中で高温で形質転換された。前記ライブラリからの形質転換されたクローンは、（野生型ＩＦＮγ）−ＫＮＴアーゼ融合タンパク質の生産がもはや細胞成長を可能にしない増大するカナマイシン濃度で選択された。理論的には、前記条件下で得られたクローンには、２００５年６月１０日に出願された仏国特許出願第０５０５９３５号明細書中で記されている通り、高温での増大した安定性が付随する。選択されたクローン上に担持された突然変異は、表１内に列挙されている。この第１の選択において単離された異なる突然変異体は、再び個別に形質転換され、その耐性レベルは野生型構成体と比較された。このようにして、つねに野生型よりは大きい様々な耐性度を付与する２１の突然変異体が確認された（表２）。
【００９６】
ＩＦＮγ点突然変異体の系統的生成
さらに、発現クローンｐＯＲＦ／ＩＦＮγから出発して、（基準として配列番号６を用いて）いわゆる野生型ＩＦＮγ位置との関係において１つそしてただ１つだけのアミノ酸差異を有する一連の大きなＩＦＮγ点突然変異が生成された。
【００９７】
ＩＦＮγ変異体の機能分析
この選択方法により選択されるか又はＩＦＮγの全ての位置で系統的に生成されたヒトＩＦＮγ変異体を、ＣＯＳ７動物細胞の中で一過的に発現させた。これらのタンパク質を培養上清中で分泌させた。前記変異体の活性の安定性及び保存性を評価するために、ＣＯＳ７細胞培養上清を５９℃で１０分間熱変性に付した。次にこれらのタンパク質（変性又は未変性）を、ルシフェラーゼリポータ遺伝子を含有するトランスフェクションを受けたＨｅＬａ細胞に対し作用させた。１６時間の刺激後、各々の突然変異及び各々の条件について、ＩＦＮγ活性に対応するホタルルシフェラーゼシグナルを測定した。研究中のタンパク質についての熱変性後の残留活性を計算した（残留活性＝変性活性／未変性活性×１００）後で、それから、未変性タンパク質によって誘発された活性を、前記同じ変性タンパク質によって誘発された活性と比較した。未変性変異体の基底活性も、突然変異を受けていないＩＦＮγのものと比較した。
【００９８】
実験の詳細：
分子生物学：
プラスミド構成体
ＴＨＲ系：使用したベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＴ．サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）複製起源、大腸菌中で形質変換体を選択するためのアンピシリン耐性遺伝子、大腸菌及びＴ．サーモフィラスの両方において活性であるプロモータ（ｐｓｌｐＡプロモータ）の制御下で熱安定性ＫＮＴアーゼをコードする遺伝子を含んでいた。図１を参照のこと。（１４６個のアミノ酸を含有する成熟形態についてコードする、配列番号５）ＩＦＮγヌクレオチド配列を、ＫＮＴアーゼのＮ末端側でベクターのＮｃｏＩとＮｏｔＩ部位との間でクローニングさせた。ＩＦＮγ−ＫＮＴアーゼ融合を、ペプチド配列ＡＡＡＧＳＳＧＳＩ（配列番号８）でリンカーペプチドにより分離させ、ヌクレオチド配列ＧＣＧ−ＧＣＣ−ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＧＧＴ−ＴＣＣ−ＡＴＣ（配列番号７）によりコードした。
【００９９】
真核細胞発現系：哺乳動物細胞内でＩＦＮγを発現させるために、ｐＯＲＦ／ＩＦＮγ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））を使用し、この中でハイブリッドプロモータＥＦ−１α−ＨＬＴＶ及び強ＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む発現カセット内にＩＦＮγをクローニングした。
【０１００】
基準ＩＦＮγ突然変異体の生産
文献中で記述された複数の熱安定性突然変異体を構築し、正の対照として使用した。これらは、次のものについてコードする：
− タンパク質ＩＦＮγＥ３０Ｃ／Ｓ９２Ｃ：ジスルフィド架橋を伴う突然変異体（溶融温度（ｍｔ）＋１５℃、ワシューツァ（Ｗａｓｃｈｕｔｇａ）ら、１９９６年）、
− タンパク質ＩＦＮγデルタ１０（タンパク質のＣ末端における最後の１０個のアミノ酸の欠失、改善された活性及び安定性、溶融温度＋７．５℃及び４倍に増大した抗ウイルス活性、スロドヴスキ（Ｓｌｏｄｏｗｓｋｉ）ら、１９９１年）。
【０１０１】
前記突然変異体を、仏国特許第２８１３３１４号明細書中で記述されているＭａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（登録商標）法によりｐＮＣＫ−ＩＦＮγ及びＰＯＲＦ−ＩＮＦγ中で生産させた。
【０１０２】
ＴＨＲ法により選択されたＩＦＮγ突然変異体のｐＯＲＦ−ＩＦＮγ内の生産
ＴＨＲ法により選択されたクローンの配列上で同定された突然変異に対応する単一の及び多数の突然変異を、仏国特許第２８１３３１４号明細書中で記述されたＭａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（登録商標）法によりｐＯＲＦ−ＩＦＮγ内に導入した。
【０１０３】
ｐＯＲＦ／ＩＦＮγ内の単一のＩＦＮγの系統的生成
全ての単一ＩＦＮγ変異体の系統的生成（すなわち、遺伝子コード中の他の１９個のアミノ酸による成熟野生型タンパク質のアミノ酸の置換）を仏国特許第２８１３３１４号明細書中で記述されている通りのＭａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（登録商標）法によりｐＯＲＦ／ＩＦＮγ中で実施した。
【０１０４】
ＴＨＲ法による熱安定性突然変異の選択
Ｍａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（登録商標）により、ｐＮＣＫベクター中にクローニングされたＩＦＮγ変異体のライブラリを生産した。全ての位置（２１から１６６まで）で全ダイバーシチを導入した。その後ライブラリをサーマス・サーモフィラス菌株ＨＢ２７中で高温（７０℃）で形質転換し、２０又は４０μｇ／ｍｌのカナマイシン上（（野生型ＩＦＮγ）−ＫＮＴアーゼが細胞増殖を可能にしない条件）で選択した。選択培地上で成長したクローンを配列決定することにより同定された突然変異は、表１に列挙されている。この一次選択において単離した異なる突然変異体を次に個別に再度形質転換し、その耐性レベルを野生型構成体のものと比較した。このようにして、野生型よりもつねに大きいものの変動する耐性度を付与する２１の突然変異体を確認した（表２）。
【０１０５】
ＩＦＮγ突然変異体の安定性及び活性の機能的検証
全ての細胞培養試薬はインビトロジェン社由来のものであった。ＨｅＬａ細胞（ヒト類上皮癌細胞）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカグリーンモンキーＳＶ４０形質転換細胞）及びＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）を、それぞれダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）及びイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で標準培養条件（湿潤ＣＯ２５〜８％雰囲気内で３７℃）下で成長させた。全ての培地は供給業者の推奨事項に従って調製され、Ｌ−グルタミン類似体（グルタマックス）を含有していた。実験に応じて、培養及びトランスフェクション段階については１０％の最終濃度で、かつ生産段階についてはより低い百分率の濃度で、除補体したウシ胎存血清（ＦＣＳ）を、そして抗生物質（ＨｅＬａ及びＣＯＳ７細胞については１００単位／ｍｌのペニシリンと０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンそしてＣＨＯ細胞については５０単位／ｍｌのペニシリン及び０．０５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を、培地に補足した。ＳＶ４０早期プロモータの制御下でベータガラクトシダーゼを発現するｐＳＶ−ベータガル（商標）ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して、全てのトランスフェクション効率を正規化した。
【０１０６】
ＣＯＳ７哺乳動物細胞中のヒトＩＦＮγ突然変異体の発現
天然又は突然変異体ｐＯＲＦ／ＩＦＮγ構成体でのＣＯＳ７細胞のトランスフェクションのために、細胞が９０％の集密性に達した時点で細胞をトリプシン処理し、次に（表面接着後に約２５％の集密性を得るため）１／４の比で再度播腫した。細胞が７０〜８０％の集密性に達した時点で１ウェルあたり３０，０００〜６０，０００個の細胞を用いて、２４ウェルのマイクロタイタープレート中でＣＯＳ７細胞をトランスフェクトした。５というＪｅｔＰＥＩ／ＤＮＡ比で室温にて３０分間およそ５０ｎｇのＤＮＡ及びＪｅｔＰＥＩ（ポリプラス（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）トランスフェクション）を用いて、トランスフェクションを実施した。２４時間のトランスフェクションの後、培地（５００μｌのＩＭＤＭ＋ＦＣＳ＋抗生物質）を交換した。トランスフェクションからＴ＝２４時間後に、（約０．５−１μｇ／ｍｌの発現レベルで）ＩＦＮγを含有する上清を回収し、等分し、ＩＦＮγ活性検定の間−２０℃で保管した。
【０１０７】
ＣＨＯ哺乳動物細胞中でのヒトＩＦＮγ突然変異体の発現
天然又は突然変異体ｐＯＲＦ／ＩＦＮγ構成体でのＣＨＯ細胞のトランスフェクションのために、細胞が８０％の集密性に達した時点で細胞をトリプシン処理し、次に（表面接着後に約３３％の集密性を得るため）１／３の比で再度播腫した。細胞が７０％の集密性に達した時点でＴ７５フラスコ中で１フラスコあたり４・１０６個の細胞を用いて、細胞をトランスフェクトした。５というＪｅｔＰＥＩ／ＤＮＡ比で室温にて３０分間およそ８ｎｇのＤＮＡ及びＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓトランスフェクション）を用いて、トランスフェクションを実施した。２４時間のトランスフェクションの後、培地（１０ｍｌのＩＭＤＭ＋２．５％のＦＣＳ＋抗生物質）を除去した。細胞を１×ＰＢＳで簡単に洗浄し、培地をＩＭＤＭ＋構成物質で置換し、付加的なＦＳＣは加えなかった。トランスフェクションからＴ＝４８時間後に、（約０．５−１μｇ／ｍｌの発現レベルで）ＩＦＮγを含有する上清を回収し、等分し、ＩＦＮγ活性検定の間−２０℃で保管した。
【０１０８】
野生型及び変異体ヒトＩＦＮγの定量化
ＩＦＮγの総量を決定するための基準ＥＬＩＳＡキットは、クリニサイエンシーズ（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ）（＃８８−７３１６−８６）製であった。もう１つの市販のＥＬＩＳＡキット（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）＃ＫＨＣ４０２１）で前記同じタンパク質を定量化することにより、このＥＬＩＳＡキット内で使用される抗体が、非突然変異体天然分子と我々の変異体を同じ要領で認識することが確認された。
【０１０９】
一次活性試験
ＩＦＮγがＨｅＬａ細胞上のＩＦＮγレセプタを特異的に活性化することが先に示された。ＨｅＬａ細胞中のＪａｋ／Ｓｔａｔ１経路のＩＦＮγ媒介型刺激は、結果として、特にＧＡＳ（ガンマ活性化部位）配列を含むプロモータの制御下で遺伝子を転写活性化する。このようにして、複数のＧＡＳ部位（ストラタジーンからのプラスミドｐＧＡＳ／ルシフェラーゼ）を含有するプロモータの下流側でルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼ）がクローニングされるリポータ遺伝子系でＨｅＬａ細胞をトランスフェクトすることによってＩＦＮγ変異体の活性を測定し比較することが可能である。
【０１１０】
ｐＧＡＳ／ルシフェラーゼでのＨｅＬａ細胞の一過性トランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、それらが９０％の集密性に達した時点でトリプシン処理し、その後１／３の比率で再播種した。５０〜８０％の集密性でのＨｅＬａ細胞のトランスフェクションを、供給業者のプロトコルに従って、９６ウェルのマイクロタイタープレート内で実施した。１ウェルにつき２０，０００の細胞を、５というＪｅｔＰＥＩ／ＤＮＡ比でおよそ１５０ｎｇのｐＧＡＳ／ルシフェラーゼＤＮＡ及びＪｅｔＰＥＩでトランスフェクトし、次に３０秒間ボルテックスし３０分間室温に放置した。その後、プレートの各ウェル内にＤＮＡ／ＪｅｔＰＥ１混合物を２０マイクロリットルを等分し、このようにトランスフェクトされた細胞を２４時間３７℃で５％のＣＯ２雰囲気中で培養した。
【０１１１】
熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の一次スクリーニング
ＩＦＮγ変異体（未変性タンパク質）／（野生型タンパク質）の合計基底活性の測定：
ＩＦＮγを含有するＣＯＳ７細胞上清を１対１００で希釈し、１０μｌのこれらの希釈物を、ｐＧＡＳ／ルシフェラーゼでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞に添加した。プレートを５％ＣＯ２雰囲気下において３７℃で１６時間インキュベートして、ホタルルシフェラーゼの細胞質発現を可能にし、その後細胞ペレットを回収し凍結させた。５０マイクロリットルのＧｌｏ溶解緩衝液（商標）（プロメガ）を添加して細胞を溶解させた（ＩＦＮγによる特異的刺激に応えて生産されたルシフェラーゼを放出するべく室温で攪拌しながら１０分間）。Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（商標）試薬（プロメガ）を添加することによって活性を測定し、蓄積されたルシフェラーゼの数量を照度計（ＦＬＸ×８００、バイオテックインストルメント（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ））上で計数した。粗ＩＦＮγ活性は、ＲＬＵ（相対ルシフェラーゼ単位）で発現される。各変異体（未変性）の合計活性（野生型タンパク質との関係における）を、５つの異なる実験（最低でデュプリケート）からのデータの平均として、最低２つの独立したトランスフェクションからの培養上清について、計算した。エラーバーは、標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）により計算した。合計活性データを提示するための１つの方法は、各トランスフェクションについて同じ条件で発現された非突然変異体ＩＦＮγの基底活性の百分率として各変異体の基底活性を報告することにある。
【０１１２】
ルシフェラーゼリポータ遺伝子を用いた熱変性後の変異体の残留活性の測定
リポータ遺伝子を用いた一次活性試験について先に記述した通り、場合に応じて１０分間５９℃での熱変性処理に付されたか又は未処理で放置されたＩＦＮγを含有するＣＯＳ７細胞上清の１／１００希釈物１０μｌで細胞を刺激した後、ルシフェラーゼの数量を測定した。熱変性の後残留する各変異体の活性の画分を表現する１つの方法は、変性前の同じ変異体の基底活性の百分率として定義づけされる各変異体が保っている残留活性を計算することにある。変性前の合計活性との関係における残留活性を、５つの異なる実験（最低デュプリケート）からのデータの平均として、かつ最低２つの独立したトランスフェクションからの培養上清について計算した。エラーバーは、標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）のための公式を用いて計算した。
【０１１３】
ＩＦＮγ変異体のための改善指数の測定（熱安定性及び／又は活性の改善）
問題のＩＦＮγ変異体が改善された熱安定性を示すと同時に少なくとも部分的にタンパク質の固有活性を保ったということを確認した時点で、前処理後の変異体の残留活性にその活性（前処理なし）を乗じた積を計算することができた。この指数から、熱安定性の利得及び相対的活性損失を知り、ひいてはタンパク質の予想されるインビボ効果を知ることができる。非突然変異体ＩＦＮγについて３７そして文献のデルタ１０突然変異体について約７６の指数という値は、基準タンパク質を用いて得られたものである。
【０１１４】
一次スクリーニングの完了時点で、図２〜６に示されているように、突然変異を受けていないヒトＩＦＮγと比べ改善された熱安定性及び／又は活性をもつ一連のヒトＩＦＮγ変異体が同定された。
【０１１５】
熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の２次スクリーニング−インビトロ半減期の測定
一次スクリーニングにおいて同定された大部分の熱安定性ＩＦＮγ変異体の固有の安定性の改善を比較する目的で、５９℃での熱変性時間の関数としてＩＦＮγ変異体の活性の変動を追跡するべく２次スクリーニングを実践した。このようにして、５９℃で５０％だけ初期ＩＦＮγ活性を低減させるのに必要な変性時間に対応する、本明細書で「インビトロ半減期」と呼ばれる５９℃での半減期が決定された。この半減期は、特に以下のパラメータ全てを制御することによって決定された。すなわち１０００ｐｇ／ｍｌの同じＩＦＮγ出発濃度、変性すべき最終試料内の０．１５％に調整された同等の血清ＦＣＳ濃度、及び１０分毎に試料を採取して３０分間の５９℃の変性温度。
【０１１６】
ＣＨＯ細胞上清内のＩＦＮγ濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。その後これらの異なるＩＦＮγ変異体群をＩＭＤＭ培地＋０．１５％ＦＣＳ中で１０００ｐｇ／ｍｌまで希釈させた。０、１０、２０及び３０分間５９℃で熱変性前処理を受けるように希釈物を等分した。前処理した希釈物１０マイクロリットルを、先に記述した通りのｐＧＡＳ／ルシフェラーゼでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞から１００μｌ／培地に添加した。５％ＣＯ２雰囲気中に３７℃で１６時間置いた後、細胞ペレットを溶解させ、ルシフェラーゼを先に記述した通りに定量化した。
【０１１７】
データを提示する１つの方法は、ＩＦＮγ変異体による形質導入経路の特異的刺激に対応する粗活性を報告することであり、この粗活性はＲＬＵ（相対ルシフェラーゼ単位）で表現される。各変異体の熱変性後に保たれている活性の画分（残留活性とも呼ばれる）を提示するもう１つの方法は、各変性時間について、変性前の同じ変異体の基底活性との関係において保たれた残留活性の百分率を計算することである。これらの計算はトランスフェクションを受けていない細胞からシグナルを差引いた後に行なわれた。
【０１１８】
このようにして決定された各変異体の半減期を次に野生型ＩＦＮγのものと比較した。半減期（Ｔ１／２）は分単位で表現され、以下の公式を用いて計算される：
Ｔ１／２＝ｌｎ（２）／（ｋ 不活性化）
なお式中ｋ 不活性化というのは、不活性段階の速度定数である。
【０１１９】
前記定数は以下の公式に従って各時点の瞬間的不活性化速度の平均に基づいて計算される：
Ｌｎ Ａ（ｔ）＝ｌｎ ｂ−ｔ＊ （ｋ 不活性化）
なお式中、Ａ（＋）は、時点ｔにおけるＩＦＮγ活性であり、ｂは定数である。
【０１２０】
従って、要約すると、図７に提示され表３でまとめられている本明細書で計算された「インビトロ」半減期は、各ＩＦＮγ変異体の最大活性の半分が保存されていた時間に対応する。
【０１２１】
表３中に提示されているもう１つのパラメータは、同じ条件下で生産された非突然変異体野生型分子との関係における各変異体の半減期の改善比率である。このパラメータの値が高ければ高いほど、非突然変異体ヒトＩＦＮγのものと比べた変異体の「インビトロ」半減期の改善は大きくなる。
【０１２２】
このようにして、この２次スクリーニングの完了時点で、図７及び表３に要約されているように２００〜１．４倍の率でそのインビトロ半減期の顕著な改善を示す１６のＩＦＮγ突然変異体が単離された。
【０１２３】
マウスにおける熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の薬物動態パラメータの測定
熱安定性ＩＦＮγ変異体のこれらの記述的な薬物動態研究は、生物学的半減期又は最終半減期（「インビボ半減期」とも呼ばれる）、ならびに異なる投与経路（静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）注射）についての曲線下面積を決定することを目的としていた。これらのデータは次に、哺乳動物細胞内で生産された野生型ＩＦＮγについて得られたデータ、及び市販の分子、換言すると偽「アクティミューン」の特徴を示す大腸菌内で生産された標準的組換え型ＩＦＮγの場合に得られるデータと比較された。
【０１２４】
生物学的半減期の測定は数多くの方法で実施された：すなわち、ルーテンフランツ（Ｒｕｔｅｎｆｒａｎｚ）ら、（「Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．」１９９０年、第１０巻、３３７〜３４１頁）により記述されている１つの方法は、週令８週のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける静脈内及び筋内注射を使用した。
【０１２５】
半減期は、抗ウイルス活性試験によって直接、マウス血清（水疱性口内炎ウイルスつまりＶＶＳに感染したＨｅｐ２細胞）について測定された。この実施例では、マウス血清中のＩＦＮγレベルを検出するための代替案としてＥＬＩＳＡを使用した。
【０１２６】
クルース（Ｃｒｏｏｓ）及びロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）（「Ｊ．Ｐｈａｒｍ．」、１９９３年、第４５巻、６０６６０９頁）により記述されているもう１つの方法は、放射性標識を用い、皮下注射の後の雌のスプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの組織中のその吸収及び血清中のそのレベルを追跡した。血液及び組織標本を、それらが含有する放射性標識されたＩＦＮγの量について分析した。
【０１２７】
ＩＦＮの薬物動態パラメータを決定するためのＥＬＩＳＡ方法の使用は、ロスタン（Ｒｏｓｔａｉｎｇ）ら、（１９９８年）、「Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．」第９号（１２）：２３４４〜４８頁により皮下投与の後、及びメリムスキ（Ｍｅｒｉｍｓｋｙ）ら、（１９９１年）、「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」第２７号（５）］によって筋内投与の後のＩＦＮアルファについて記述されてきた。
【０１２８】
野生型及び突然変異体ＩＦＮγを、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞中で発現させた。培養上清を１０分間４０００ｒｐｍで２度目に遠心分離し、次にＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＥＳ０．２２μｍフィルタ上でろ過した。５０００ダルトンのカットオフでビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）ろ過ユニット（サートリアス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））上での遠心分離によって、ろ過された上清を濃縮した。次にＩＦＮγ濃度を、先に適合させた希釈物を用いることによって試料について決定した。
【０１２９】
野生型及び突然変異体ＩＦＮγを次の２つの要領で投与した：
− Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾静脈内への１０μｇ／ｍｌのＩＦＮγ溶液１００μｌの注入；
− 又は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃内への６．７μｇ／ｍｌのＩＦＮγ溶液１００μｌの皮下注入。
【０１３０】
これらの実験では、体重２０〜３０グラムで週令８週目のＣ５７ＢＬ／６Ｊを使用した。動物を、２４．１℃の一定温度、５５％の一定湿度でかつ昼夜１２時間サイクルで一週間室内にて順応させた。
【０１３１】
対象の分子の投与後異なる時点で血液試料を収集した。３、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８及び１９２時間目に後眼窩試料を採取し、２１６時間という最終時点で死後心臓試料を採取した。
【０１３２】
室温で２０分間血液を凝固させることそして２０℃で２０分間５０００ｇでの遠心分離の上清に対応する画分を回収することによって血清を調製した。次に、血清を単離し先に記述したＥＬＩＳＡ検定によるＩＦＮγ活性の測定まで−８０℃で保管した。
【０１３３】
各々のマウス血清においてＥＬＩＳＡにより検出されたＩＦＮγの数量を追跡することによって、血漿ＩＦＮγ濃度を経時的に測定した。各々の後眼窩試料について、３匹のマウスからの少なくとも３つの異なる血清の平均としてＩＦＮγを定量化した。これらの異なる薬物動態実験を、異なるトランスフェクション由来のＩＦＮγを用いて少なくとも２回、各々の変異体について実施した。次に経時的な血清中のＩＦＮγ濃度を報告した。パラメータ〔Ｔ１／２ｉ．ｖ．、ＡＵＣｉ．ｖ．，〕〔Ｔ１／２ｓｃ及びＡＵＣｓｃ〕を、それぞれ「静脈内ボーラス非コンパーメント」及び「脈管外ボーラス」薬物動態分析モデルを用いて、Ｋｉｎｅｔｉｃａソフトウェア（Ｖｓ４．４．１．サーモエレクトロン（株）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｃ．））を利用して計算した。
【０１３４】
表４及び５に提示されているもう１つのパラメータは、同じ条件で生産された非突然変異体野生型分子のそれぞれのパラメータとの関係における、及びかかるデータが入手可能である場合には細菌組換え型ヒトＩＦＮγのそれぞれのパラメータとの関係における、各変異体についての半減期又は曲線下面積の改善比率である。これらの比率が高くなればなるほど、非突然変異体ヒトＩＦＮγのものと比べた変異体における改善が大きくなる。
【０１３５】
これらの実験結果及びその分析は、静脈内注射の場合は図８及び表４に、そして皮下注射については図９及び表５で提示されている。
【０１３６】
突然変異Ｓ６３Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びその組合せが、ＣＨＯにおいて生産された組換え型ヒトＩＦＮγのもの及び細菌内で生産された組換え型ヒトＩＦＮγのものに比べたこれらの変異体のインビボ半減期の顕著な改善を結果としてもたらしたということがわかる。皮下投与の後、２重突然変異体は、ＣＨＯ細胞内で生産された組換え型ヒトＩＦＮγのものと比べたこれらの薬物動態パラメータの顕著な改善を再び示した。
【０１３７】
【表１】
【０１３８】
【表２】
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
【表５】
【０１４２】
表１：テルモス・テルモフィラス中でＩＦＮγライブラリの一次選択において同定された突然変異体。数字は、１６６残基前駆体内の突然変異の位置に対応する。
表２：テルモス・テルモフィラスの中で２次選択試験により検証された突然変異体。数字は、１６６−残基前駆体内の突然変異の位置に対応する。
表３：５９℃での熱変性研究における熱安定性ＩＦＮγ変異体についての「インビトロ」半減期計算及び、ＣＨＯ中で生産された野生型ＩＦＮγの半減期と比べた、変異体半減期の改善比の計算のまとめ。
表４：静脈内注射研究中の熱安定性ＩＦＮγ変異体についての熱除去半減期計算及びＣＨＯ中で生産された野生型ＩＦＮγの半減期に比べた変異体半減期の改善比の計算のまとめ。非コンパートメントＩＶボーラスモデルを用いたＫｉｎｅｔｉｃａ Ｖｓ ４．４ソフトウェアを利用して、最終除去半減期（Ｔ１／２、静脈内）を計算した。
表５：皮下注射研究中の合計曲線下面積（ＡＵＣｔｏｔ．ｓ．ｃ．）及び除去半減期（Ｔ１／２ｓ．ｃ．）のまとめ。ＣＨＯ中で生産された野生型ＩＦＮγの総ＡＵＣ及び半減期と比べた変異体の総ＡＵＣ及び半減期の改善比の計算。これらのパラメータは、Ｋｉｎｅｔｉｃａ Ｖｓ ４．４ソフトウェアを利用して計算された。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】突然変異体ライブラリを生成するため及びテルモス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中でのその選定のために用いられるｐＮＣＫベクター。
【図２】テルモス・テルモフィラスにより選択されたＩＦＮγ単一突然変異体のための機能分析データ：すなわち、熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型と比べた相対的合計活性）／１００によって定義づけられる改善指数（図版Ｃ）。
【図３】テルモス・テルモフィラスにより選択された２重及び多重位置に由来するＩＦＮγ単一突然変異体についての機能分析データ：すなわち熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型と比べた相対的合計活性）／１００により定義づけられる改善指数（図版Ｃ）。
【図４】安定性及び／又は活性が改善された、系統的に生成されたＩＦＮγ単一点突然変異体の機能分析データの第１の部分−熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型に比べた相対的合計活性）／１００により定義づけされる改善指数（図版Ｃ）。
【図５】安定性及び／又は活性が改善された、系統的に生成されたＩＦＮγ単一点突然変異体の機能分析データの第２の部分−熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型に比べた相対的合計活性）／１００により定義づけされる改善指数（図版Ｃ）。
【図６】安定性及び／又は活性が改善された、系統的に生成されたＩＦＮγ単一点突然変異体の機能分析データの第３の部分−熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型に比べた相対的合計活性）／１００により定義づけされる改善指数（図版Ｃ）。
【図７】調整されたＦＣＳ濃度の存在下５９℃での熱変性動態研究においてインビトロ半減期を測定することによるヒトＩＦＮγタンパク質変異体の熱安定性評価。測定は、５９℃での変性時間の関数として保存されたＩＦＮγの量を追跡することからなる。これらのデータは、これらの条件下でこれらの分子の「インビトロ半減期」を計算するために使用された。半減期計算は、表３中に提示されている。
【図８】静脈内投与後の熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の薬物動態プロファイル。ＩＦＮγレベルは、１００μｌの１０μｇ／ｍｌ溶液を静脈内注射した後Ｃ５７ＢＬ／６マウスから収集した血清についてＥＬＩＳＡにより監視された。
【図９】皮下投与後の熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の薬物動態プロファイルの例。ＩＦＮγ血漿濃度は、１００μｌの６．７μｇ／ｍｌ溶液の皮下注射の後Ｃ５７ＢＬ／６マウスから収集した血清についてＥＬＩＳＡにより定量化された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の改良の分野に関する。本発明は、ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の改良及び改良型ＩＦＮγを含む組成物、それをコードする核酸及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＦＮγは、１６６個のアミノ酸のサイトカインである。分子は、膜輸送及び分泌を可能にするシグナルペプチド、開裂部位及びいわゆる成熟タンパク質に対応する部分を含む。ＩＦＮγのシグナルペプチドは、最初の２３個又は最初の２０個のアミノ酸残基からなるものとして、異なる著者によりさまざまな形で報告されている。実際、文献中では、成熟配列のＮ末端におけるアミノ酸トリプレットＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（ＣＹＣ）の存在に関して疑いがもたれている。ＩＦＮγは、２つの非共有結合したサブユニットのホモ２量体として存在する。各々のサブユニットは２つのＮ−グリコシル化部位（１６６個のアミノ酸前駆体の４８及び１２０位）を有する。ＣＹＣ残基が考慮されない場合、インビボで成熟タンパク質中にジスルフィド架橋又はシステインは全く存在しない。各単量体は、Ｎ末端に最も近い最初の４つのαヘリックス（αヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）からなるコンパクトな領域、及び２つの単離されたαヘリックスから成り、第２のＩＦＮγ単量体と密な相互関係にあるＣ末端領域を伴う、６つのαヘリックスを有する。
【０００３】
ＩＦＮγは、広い活性スペクトラムをもつ多面性サイトカインの原型である。実際、インターフェロン（ＩＦＮ）には、ウイルス複製の阻害、細胞増殖の阻害及びアポトーシスの誘発などの活性がある。
【０００４】
特に、ＩＦＮγによるマクロファージ刺激は、以下の応答を誘発する：
− 食作用及び細菌死滅の増強（直接的抗菌性及び抗腫瘍性機序）；
− 抗原提示及び分離経路の刺激、マクロファージ表面におけるＩ型及びＩＩ型主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の発現；
− ＩｇＧ生産及び補体活性化を結果としてもたらす、抗体分泌プラズマ細胞へのＢリンパ球の分化；
− 細胞毒性遊離酸素ラジカル及びＮＯを生産させるＮＯシンターゼの活性化；
及び／又は
− サイトカイン及び内因性ＩＦＮの生産の増強。
ＩＦＮγは、その分化を促進し、それによって特異的免疫応答を変調させることによってＴリンパ球に対して作用する。
【０００５】
その広い活性スペクトラム（抗ウイルス性、抗増殖性及び免疫変調性）を理由として、ＩＦＮγは、多様なヒト疾患の治療向けの治療薬として開発されてきた。市販のＩＦＮγ（アクティミューン（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）及びバイオガンマ（Ｂｉｏｇａｍｍａ））は、現在２つの主な治療適応すなわち慢性肉芽腫症及び特発性肺線維症において経口プレドニゾロンと組合せて使用されている。数多くの新しい二次的治療適応が現在、特に例えばＣ型肝炎の治療におけるペグ化ＩＦＮα／リバビリンに対する付加物としてのその免疫抑制的役割のために、異なる臨床的開発段階にある。以下のものに言及することもできる：非定型抗酸菌感染症、腎臓癌；大理石骨病；全身性強皮症；慢性Ｂ型肝炎；慢性Ｃ型肝炎；乳頭腫ウイルスに起因するものを含めた異なるウイルス感染；敗血性ショック；アレルギー性皮膚炎；関節リウマチ；卵巣癌；肝線維症；ぜんそく及びリンパ腫。
【０００６】
ＩＦＮの主な副作用は用量依存性のものであり、従って投薬スケジュールと密接なつながりがある。前記副作用は累積的であり、経時的に悪化する。注射の短時間後（皮下注射の２〜８時間後）に気分のすぐれない状態、吐き気及びおう吐をひき起こし得る急性毒性に加えて、最も一般的な副作用は、インフルエンザに似た症状（悪寒、頭痛、疲労感）、注射部位における炎症反応及び肝臓アミノ基転移酵素の上昇である。最も重大な有害事象としては、うつ病、リンパ球減少症そして稀には皮下注射部位における壊死が含まれる。高用量のＩＦＮを受けた患者は、療法の開始後に糖尿病を発症する可能性がある。さらに、ＩＦＮ注射の耐容性は、時として経時的に制限され、（およそ１０〜２０％の患者において）中和抗体の発生という形で現われる。
【０００７】
組換え型ヒトＩＦＮγのインビボ半減期は２５〜３５分にすぎない。この理由から、ＩＦＮγでの効率の良い治療には、頻繁に注射をする必要がある。アクティミューン（インター・ミューン Ｉｎｃ（Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ Ｉｎｃ．）という商品名で販売されている組換え型ヒトＩＦＮγが１９９０年に使用開始された時、全てのインターフェロンの中でもＩＦＮγの熱安定性が最も低いことからなおさらに、ＩＦＮγの半減期を改善する必要性が存在するということが明らかになった。実際に、より安定したＩＦＮγであれば、注射間の間隔をさらに長くすることができ、このようにして患者の快適性が改善される。インビボ効果はタンパク質の比活性とその作用持続時間の組合せの結果としてもたらされることから、より安定したＩＦＮγは同時に、より優れたインビボ効能を可能にすることになる。従って、ＩＦＮγの安定性を改善することの経済的な利点は明白である。すなわち、より安定した分子（それが変異体であること又はそれが添加剤を含有すること又は処方が改良されたことなどのいずれか理由とする）は、現在利用可能な作用物質に置き換わり得る第２世代の薬剤の生産を可能にする。さらには、より安定したＩＦＮγがこの分子の適応症を拡げることになる、ということさえ考えられる。実際、その他の分子の中でも、ＩＦＮα及びβは、或る種の病状における基準治療であるが、ＩＦＮγはその半減期が短かすぎるために、これらの中に数えられていない。最後に、より長期的には、より安定したＩＦＮγによって異なる投与経路（特に経口形態）向けにそれを処方できるようになることが期待できるかもしれない。
【０００８】
ＩＦＮγはすでに、広範な研究の対象となっている。
【０００９】
天然ＩＦＮγ変異体
複数の天然突然変異体が記述されてきた。かかる形態の１つは、Ｎ末端ＣＹＣ配列を含有するものである。点突然変異を含有するヒトＩＦＮγの２つの天然変異体、Ｋ２９Ｑ及びＲ１６０Ｑについても同様に記述されてきた（非特許文献１）。しかしながら、これらの多型はこれまで、いかなる効果とも関連づけされたことがなかった。
【００１０】
人工的ＩＦＮγ突然変異体
特許文献１は、成熟ＩＦＮγの残基１−１２７、５−１４６及び５−１２７を含み、かつ３つの付加的なアミノ酸残基ＣＹＣを有するヒトＩＦＮγの部分的配列を伴うポリペプチドについて開示している。
【００１１】
特許文献２はＩＦＮγ前駆体の残基１１８−１５７を含むペプチドフラグメント及びその使用について開示している。
【００１２】
特許文献３は、Ｓ１５５及びＳ１６５基内の突然変異のうちの少なくとも１つ及びＲ１６０、Ｒ１６２及びＲ１６３基内の少なくとも１つの突然変異を含む１つの変型を含めた、ＣＹＣ残基無しでＩＦＮγの成熟形態の１４３個のアミノ酸を含む一連の活性ＩＦＮγ突然変異を生成し、かつ生産するための方法を提供している。前記突然変異は、特に特発性肺線維症の治療において有用であると思われる。
【００１３】
ＩＦＮγのＣ末端領域内の異なる位置で切断された数多くの変異体が記述されてきた。特許文献４は、天然タンパク質のアミノ酸３〜１２４を含む部分的ヒトＩＦＮγ配列の使用を開示している。最後の２０個のアミノ酸残基のＩＦＮγの活性及び安定性に対する重要性がこれまで議論の的となってきており、又今なお議論されている。Ｃ末端切断型ヒトＩＦＮγ変異体は、異なるサイズ（１０〜２０個の切断アミノ酸残基）の切断形態を生産したスロドフスキ（Ｓｌｏｄｏｗｓｋｉ）らによって記述されてきた（非特許文献２）。
【００１４】
特許文献５内では、著しく高い活性をもつＩＦＮγが７〜１１個のＣ末端残基を欠失させることによって生成された。その上、哺乳動物細胞によるＩＦＮγ生産が、生産宿主細胞により分泌されたエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼによる天然の切断に起因するＩＦＮγポリペプチドの不均一集団を結果としてもたらすことがわかっている。この生産の問題を解決するための１つの手法は、特許文献６内で開示されており、例えば分子のグリコシル化（Ｓ１２２Ｔ、Ｅ６１Ｎ＋Ｓ６３Ｔ）を改善する突然変異と関連づけられる全タンパク質の最初の１５５個のアミノ酸を含む切断型ＩＦＮγを生産することからなる。
【００１５】
特許文献７は、（トリプシン、Ａｓｐ−Ｎエンドプロテアーゼ、キモトリプシン及びプロリンエンドペプチターゼなど）ヒト血清中に存在するプロテアーゼに対する感受性をもつ、タンパク質分解部位の存在について、ＩＦＮγを含む数多くの治療用タンパク質の配列をコンピュータ内で分析する。上述のプロテアーゼに対する保護を与えると想定されている突然変異は次のものである：Ｌ５３Ｖ、Ｌ５３Ｉ、Ｋ５７Ｑ、Ｋ５７Ｎ、Ｋ６０Ｑ、Ｋ６０Ｎ、Ｅ６１Ｑ、Ｅ６１Ｎ、Ｅ６１Ｈ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｎ、Ｅ６２Ｈ、Ｋ７８Ｑ、Ｋ７８Ｎ、Ｋ８１Ｑ、Ｋ８１Ｎ、Ｋ８４Ｑ、Ｋ８４Ｎ、Ｄ８５Ｑ、Ｄ８５Ｎ、Ｄ８６Ｑ。
【００１６】
前記突然変異が付与するかもしれない（活性又は安定性の）改善は、これらの突然変異のいずれについてもまだ実験的に確認されていない可能性があり、従ってこれは科学的憶測のレベルにとどまっている。
【００１７】
改善された熱安定性をもつＩＦＮγ突然変異体
ＩＦＮγ（特に単量体形態）は低い安定性を有することがわかっている。このため野生型タンパク質は２つのパラメータすなわち酸性ｐＨ及び温度に対して非常に敏感になっている。これらの非生理学的条件での突然変異体の安定性の増大は生理学的条件下での安定性の類似の増大と関連づけられるであろうと予想されている。従って、測定が最も容易なパラメータである熱安定性が増大した突然変異体の探求に研究の焦点があてられてきた。
【００１８】
特許文献８は、Ｎ末端の−１位に付加されたメチオニン、ＣＹＣ残基なしの成熟配列の最初の１３２個のアミノ酸を含み、１３３番目のアミノ酸がグルタミンではなくロイシンであるＩＦＮγ変異体を開示している。ＩＦＮγの１０個のＣ末端アミノ酸の切断を伴う前記変異体は、デルタ１０Ｌ又はＣ１０Ｌと名付けられている。それは、野生型ＩＦＮγ（溶融温度５２〜５３℃）と比べて改善された生物活性とわずかに改善された熱安定性（溶融温度５５℃）を有している。
【００１９】
特許文献９は、一部のＮ及びＣ末端アミノ酸の突然変異と共役された最後の９個のＣ末端残基の切断を伴って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で生産された一連のＩＦＮγ突然変異体を開示している。前記突然変異は、全て抗ウイルス及び抗腫瘍活性を保存しながら、ジスルフィド架橋を導入し、次にこの架橋がこれらの分子に対して熱安定性特性を付与する。この特許の中では、ＣＹＣ残基は、成熟タンパク質の一部であり、このトリプレット内のシステインの変異体が生産された。
野生型（完全配列） ５０℃で１時間後に２５％の
残留活性
突然変異Ｍ１５７＋Ｄｅｌｔａ９ ５０℃で１時間後に８１％の
残留活性
突然変異Ｃ２１Ｓ−Ｍ１５７Ｃ＋Ｄｅｌｔａ９ ５０℃で１時間後に８６％の
残留活性
突然変異Ｃ２３Ｓ−Ｍ１５７Ｃ＋Ｄｅｌｔａ９ ５０℃で１時間後に９８％の
残留活性
突然変異Ｃ２１Ｓ−Ｃ２３Ｓ−Ｍ１５７Ｃ＋Ｄｅｌｔａ９ ５０℃で１時間後に
２３％の残留活性
【００２０】
特許文献１０は、単量体間及び単量体内ジスルフィド架橋を作り出し、それによってＩＦＮγホモ２量体を安定化させるべく、ＩＦＮγ構造内の特定の場所にシステイン対が取込まれている、熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体を開示している。ＩＦＮγの生物活性を保存する唯一のシステイン対は、同じ単量体のヘリックスＡ及びＤを連結するＥ３０Ｃ−Ｓ９２Ｃであり、その他の単量体間システイン対はＩＦＮγの生物活性を破壊する。この特許内で開示されている突然変異体は、同様に、Ｄｅｌｔａ１０突然変異体に対応する切断Ｃ末端をも有している。
【００２１】
重合体の付加によるＩＦＮγの修飾は、非特許文献３によって及び特許文献１１及び特許文献１２の中で報告されている。
【００２２】
特許文献１３は、（ＩＦＮγを内含する）成長ホルモン構造スーパーファミリに属するタンパク質の変異体であって、ペプチド構造の一部の可欠アミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている変異体を開示している。ＩＦＮγは、前記スーパーファミリのメンバーの一例として言及されているが、ＩＦＮγの実験的修飾は開示されていない。
【００２３】
特許文献１４は、グリコシル化部位の挿入により修飾されかつ／又はＰＥＧタイプの部分により誘導体化された新規の、ＩＦＮγ分子を開示している。前記分子は、改善された半減期及び／又は改善された生物学的利用能などの改善された特性を有している。
【００２４】
特許文献１５は、改善された安定性を有するインターフェロンのスルフォアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体を含有する医薬組成物について記述している。
【００２５】
現在、前記変異体のいずれも薬剤の形態では利用不可能である。このような理由から、改良型ＩＦＮγ、特に生理学的条件でより高い安定性をもつＩＦＮγに対する強い需要がなおも存在している。前記生理学的条件での安定性の増大は、高温での安定性の増大により評価可能である。
【特許文献１】米国特許第４，８３２，９５９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１２０，７６２号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４００５３４１号パンフレット
【特許文献４】欧州特許第０２１９７８１号明細書
【特許文献５】欧州特許第０３０６８７０号明細書
【特許文献６】米国特許第６，９５８，３８８号明細書
【特許文献７】国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９２／０８７３７号パンフレット
【特許文献９】米国特許第４，８９８，９３１号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，０４６，３０４号明細書
【特許文献１１】欧州特許第２３６９８７号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，１０９，１２０号明細書
【特許文献１３】国際公開第９９／０３８８７号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第０１／３６００１号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第０３００２１５２号パンフレット
【非特許文献１】ニシ（Ｎｉｓｈｉ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第９７号：１５３〜１５９頁、１９８５年
【非特許文献２】「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第２０２号：１１３３〜１１４０頁、１９９１年
【非特許文献３】キタ（Ｋｉｔａ）ら、「Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｌｉｖ．」第６号：１５７〜１６７頁、１９９０年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、ヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００２７】
特に本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含む、ヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントを含む医薬組成物において、変異体が第１の置換により導入された残基に付着した非ペプチド部分を含有していない医薬組成物に関する。一実施形態においては、変異体は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、配列番号２、４及び６の配列からなる群の中から選択された配列を有するポリペプチドと異なっている。特定の実施形態においては、変異体は単一の置換を有する。もう１つの実施形態においては、変異体は、Ｍ１５７Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１００Ｎからなる群の中から選択された少なくとも１つのその他の置換をさらに含む。特に変異体は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｍ１５７Ｃ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された２つの置換の組合せを含むか又は有していてよい。好ましい実施形態では、変異体は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ６２Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｅ６２Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ６２Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｄ９９Ｙ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ７４Ｇ、Ｄ９９Ｙ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１００Ｎ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｄ９９Ｙ＋Ｎ５８Ｒ、Ｄ９９Ｙ＋Ｔ９５Ｖ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ７４Ｇ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ７４Ｇ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ７４Ｇ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ７４Ｇ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｇ４１Ｓ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｇ４１Ｓ、Ｎ５８Ｒ＋Ｔ９５Ｖ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１００Ｎ、Ｎ５８Ｒ＋Ｇ４１Ｓ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ＋Ｇ４１Ｓ、Ｍ１５７Ｃ＋Ｍ１００ＮおよびＭ１５７Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有している。より好ましい実施形態においては、変異体は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有している。特に好ましい実施形態においては、変異体は組合せＳ６３＋Ｇ４１Ｓを含むか又は有している。特定の実施形態においては、変異体はＣ末端において１〜１１個のＣ末端残基の欠失を有していない。もう１つの特定の実施形態においては、変異体は１〜１１個のＣ末端残基の欠失を有している。特定の実施形態においては、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有していない。もう１つの特定の実施形態においては、変異体は、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有している。問題の非ペプチド分子はより特定的には重合体分子、好ましくはポリエチレングリコールである。特定の実施形態においては、変異体はグリコシル化されている。もう１つの特定の実施形態においては、変異体はグリコシル化されていない。特定の実施形態においては、医薬組成物は、少なくとも１つのその他の作用物質をさらに含む。少なくとも１つのその他の活性作用物質は好ましくは、抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬からなる群の中から選択される。好ましい実施形態においては、少なくとも１つのその他の活性作用物質は、Ｉ型インターフェロン、特にインターフェロンアルファ又はベータである。医薬組成物は、経口、非経口（例えば皮下、筋内、静脈内又は皮内）、舌下、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、局部（ｌｏｃａｌ）、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、眼球内又は耳介内経路による投与向けに処方されていてよい。
【００２８】
本発明は同様に、薬剤としての本発明による医薬組成物にも関する。
【００２９】
本発明は、抗ウイルス性、抗増殖性、又は免疫調節性薬剤としての同時、逐次又は分離使用のための組合せ型調製用のもう１つの活性作用物質と本発明による医薬組成物を含む製品にも関する。好ましくは、その他の活性作用物質は、抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬からなる群の中から選択される。好ましい実施形態においては、その他の活性作用物質は、Ｉ型インターフェロン、特にインターフェロンアルファ又はベータである。２つの活性作用物質は、同じ投与経路又は２つの異なる投与経路により投与することができる。特定の実施形態においては、薬剤は、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血性ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状を治療するために設計されている。
【００３０】
本発明は同様に、抗ウイルス性、抗増殖性又は免疫調節性薬剤を調製するため本発明による医薬組成物の使用にも関する。好ましい実施形態においては、薬剤は、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血性ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状の治療用である。
【００３１】
本発明は、上述の組成物中で記述されている熱安定性ＩＦＮγ変異体をコードする核酸に関する。本発明は同様に、本発明による核酸の発現カセット、本発明による核酸又は発現カセットを含むベクター、及び本発明による核酸、発現カセット又はベクターを含む宿主細胞にも関する。本発明はさらに、前述の組成物中の記述された熱安定性ＩＦＮγ変異体を生産することを目的とした、１つのかかる核酸、１つのかかる発現カセット、１つのかかるベクター又は１つのかかる細胞の使用にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、その安定性、特に熱安定性が野生型ＩＦＮγに比べて増大しているヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の変異体に関する。本発明のＩＦＮγタンパク質変異体は、指向進化により生み出される多様な突然変異の生成を、改善された熱安定性を示す変異体を直接選択するための方法と結びつけることによって得られた。改善された候補の熱変性に対する安定性ならびにその活性の保存は、生物学的試験により検証された。本発明による変異体は、現在治療用、特に慢性肉芽腫症及び特発性肺線維症の治療において用いられている組換え型ＩＦＮγの代替物を表わしている。
【００３３】
成熟ＩＦＮγタンパク質のＮ末端におけるＣＹＣアミノ酸残基の存在に関する根深い不安感及びその結果としての成熟タンパク質中のアミノ酸の付番に関する疑念を考慮して、本出願で採用した付番は、シグナルペプチド配列を含む全てのＩＦＮγ残基（内含されたＮ末端メチオニンシグナルペプチドの１からインターフェロンのＣ末端グルタミンの１１６まで付番された全てのアミノ酸−配列番号２の配列）を考慮に入れたものとする。その他の２つの形態（ＣＹＣなしの成熟形態、配列番号４、又はＣＹＣを伴う成熟形態、配列番号６）における置換の位置は、当業者により容易に決定可能である。
【００３４】
以下の用語は、置換を示すためのものである：すなわち、Ｃ２１Ｇは、配列番号２の２１位にあるシステイン残基の、グリシン残基による置換を表わす。「置換」及び「突然変異」という用語は互換性をもつ。「＋」という符号は２つの置換の組合せを表わす。
【００３５】
本発明は、表１、表２及び図２〜９に記述されている少なくとも１つの置換を含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００３６】
本発明は好ましくは、次のものからなる群のうちの１つから選択された少なくとも１つの置換を含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する：
（ａ） Ｃ２１Ｇ、Ｃ２１Ｗ、Ｙ２２Ｄ、Ｙ２２Ｔ、Ｙ２２Ｓ、Ｓ２３Ｃ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｓ４３Ｃ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｔ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｌ５１Ｉ、Ｌ５３Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｔ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｑ６９Ｆ、Ｑ６９Ｔ、Ｖ７３Ｉ、Ｓ７４Ｇ、Ｙ７６Ｄ、Ｋ７８Ｑ、Ｌ７９Ｖ、Ｆ８０Ｖ、Ｋ８１Ｉ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｖ、Ｑ８７Ｉ、Ｑ８７Ｐ、Ｓ８８Ｎ、Ｓ８８Ｑ、Ｔ９５Ａ、Ｔ９５Ｖ、Ｔ９５Ｆ、Ｉ９６Ｌ、Ｋ９７Ｉ、Ｋ９７Ｒ、Ｅ９８Ｋ、Ｄ９９Ｎ、Ｄ９９Ｃ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｉ、Ｄ９９Ｍ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｄ９９Ｗ、Ｄ９９Ｙ、Ｄ９９Ｖ、Ｍ１００Ｉ、Ｍ１００Ｖ、Ｍ１００Ｎ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｖ、Ｋ１０３Ｒ、Ｎ１０６Ｄ、Ｎ１０６Ｑ、Ｎ１０６Ｇ、Ｓ１０７Ｃ、Ｓ１０７Ｇ、Ｓ１０７Ｅ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１１０Ｈ、Ｄ１１３Ｓ、Ｅ１１６Ｃ、Ｅ１１６Ｑ、Ｅ１１６Ｈ、Ｅ１１６Ｉ、Ｅ１１６Ｖ、Ｔ１１９Ｃ、Ｔ１１９Ｉ、Ｔ１１９Ｍ、Ｔ１１９Ｖ、Ｔ１１９Ｙ、Ｔ１１９Ｐ、Ｎ１２０Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｎ１２０Ｌ、Ｎ１２０Ｔ、Ｙ１２１Ｔ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｃ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｉ、Ｓ１２２Ｌ、Ｓ１２２Ｋ、Ｓ１２２Ｐ、Ｓ１２２Ｈ、Ｖ１２３Ｔ、Ｖ１２３Ｈ、Ｖ１２３Ｐ、Ｔ１２４Ｃ、Ｔ１２４Ｈ、Ｌ１２６Ｒ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１２６Ｔ、Ｌ１２６Ｖ、Ｎ１２７Ａ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｑ、Ｎ１２７Ｅ、Ｎ１２７Ｇ、Ｎ１２７Ｉ、Ｎ１２７Ｋ、Ｎ１２７Ｆ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｗ、Ｎ１２７Ｙ、Ｖ１２８Ｉ、Ｖ１２８Ｙ、Ｑ１２９Ｒ、Ｑ１２９Ｃ、Ｑ１２９Ｈ、Ｑ１２９Ｉ、Ｑ１２９Ｙ、Ｑ１２９Ｖ、Ｒ１３０Ｑ、Ｒ１３０Ｌ、Ｒ１３０Ｋ、Ｒ１３０Ｔ、Ｋ１３１Ｍ、Ｋ１３１Ｉ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４１Ｈ、Ａ１４１Ｖ、Ｅ１４２Ｆ、Ｌ１４３Ｉ、Ｓ１４４Ｇ、Ｓ１４４Ｌ、Ｓ１４４Ｗ、Ｓ１４４Ｖ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｅ、Ａ１４７Ｆ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ｔ１４９Ｅ、Ｔ１４９Ｍ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５１Ｃ、Ｋ１５１Ｈ、Ｋ１５１Ｓ、Ｋ１５１Ｖ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｗ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６２Ｃ、Ｒ１６２Ｉ、Ｒ１６２Ｌ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｖ、Ｒ１６３Ｔ、Ｒ１６３Ｌ、Ｒ１６３Ｇ、Ａ１６４Ｇ、Ａ１６４Ｓ、Ａ１６４Ｅ及びＳ１６５Ｖ又はそれらの組合せ；或いは
（ｂ） Ｃ２１Ｇ、Ｃ２１Ｗ、Ｙ２２Ｄ、Ｙ２２Ｔ、Ｙ２２Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｓ４３Ｃ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｔ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｌ５１Ｉ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｍ１００Ｎ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１１０Ｈ、Ｔ１１９Ｙ、Ｔ１１９Ｐ、Ｙ１２１Ｔ、Ｓ１２２Ｈ、Ｓ１２２Ｐ、Ｋ１３１Ｉ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｅ、Ａ１４７Ｆ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｗ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６３Ｔ、Ｒ１６３Ｌ、Ｒ１６３Ｇ、Ａ１６４Ｅ及びＳ１６５Ｖ又はそれらの組合せ；或いは
（ｃ） Ｌ５３Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｔ、Ｑ６９Ｆ、Ｑ６９Ｔ、Ｖ７３Ｉ、Ｓ７４Ｇ、Ｋ７８Ｑ、Ｌ７９Ｖ、Ｆ８０Ｖ、Ｋ８１Ｉ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｖ、Ｑ８７Ｉ、Ｑ８７Ｐ、Ｓ８８Ｎ、Ｓ８８Ｑ、Ｔ９５Ａ、Ｔ９５Ｖ、Ｔ９５Ｆ、Ｉ９６Ｌ、Ｋ９７Ｉ、Ｋ９７Ｒ、Ｄ９９Ｎ、Ｄ９９Ｃ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｉ、Ｄ９９Ｍ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｄ９９Ｗ、Ｄ９９Ｙ、Ｄ９９Ｖ、Ｍ１００Ｉ、Ｍ１００Ｖ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｖ、Ｋ１０３Ｒ、Ｎ１０６Ｄ、Ｎ１０６Ｑ、Ｎ１０６Ｇ、Ｓ１０７Ｃ、Ｓ１０７Ｇ、Ｓ１０７Ｅ、Ｄ１１３Ｓ、Ｅ１１６Ｃ、Ｅ１１６Ｑ、Ｅ１１６Ｈ、Ｅ１１６Ｉ、Ｅ１１６Ｖ、Ｔ１１９Ｃ、Ｔ１１９Ｉ、Ｔ１１９Ｍ、Ｔ１１９Ｖ、Ｎ１２０Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｎ１２０Ｌ、Ｎ１２０Ｔ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｃ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｉ、Ｓ１２２Ｌ、Ｓ１２２Ｋ、Ｓ１２２Ｐ、Ｖ１２３Ｔ、Ｖ１２３Ｈ、Ｖ１２３Ｐ、Ｔ１２４Ｃ、Ｔ１２４Ｈ、Ｌ１２６Ｒ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１２６Ｔ、Ｌ１２６Ｖ、Ｎ１２７Ａ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｑ、Ｎ１２７Ｅ、Ｎ１２７Ｇ、Ｎ１２７Ｉ、Ｎ１２７Ｋ、Ｎ１２７Ｆ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｗ、Ｎ１２７Ｙ、Ｖ１２８Ｉ、Ｖ１２８Ｙ、Ｑ１２９Ｒ、Ｑ１２９Ｃ、Ｑ１２９Ｈ、Ｑ１２９Ｉ、Ｑ１２９Ｙ、Ｑ１２９Ｖ、Ｒ１３０Ｑ、Ｒ１３０Ｌ、Ｒ１３０Ｋ、Ｒ１３０Ｔ、Ｋ１３１Ｉ、Ｋ１３１Ｍ、Ａ１４１Ｈ、Ａ１４１Ｖ、Ｅ１４２Ｆ、Ｌ１４３Ｉ、Ｓ１４４Ｇ、Ｓ１４４Ｌ、Ｓ１４４Ｗ、Ｓ１４４Ｖ、Ｔ１４９Ｅ、Ｔ１４９Ｍ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５１Ｃ、Ｋ１５１Ｈ、Ｋ１５１Ｓ、Ｋ１５１Ｖ、Ｒ１６２Ｃ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｉ、Ｒ１６２Ｌ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｖ、Ａ１６４Ｇ、Ａ１６４Ｓ又はそれらの組合せ；或いは
（ｄ） Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖ。
【００３７】
「含む」という語は、変異体又はそのフラグメントが配列番号２、４、及び６というポリペプチド配列を基準にして指示される１つ以上の置換を有するものの、その他の修飾、特に置換、欠失又は付加をも有し得る、ということを意味するものと理解される。
【００３８】
「有する」という語は、変異体又はそのフラグメントが配列番号２、４、及び６というポリペプチド配列を基準にして指示される置換のみを含んでいることを意味するものと理解される。
【００３９】
本発明は、上述の群から選択された置換の組合せを含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。この組合せは、前記群から選択された２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換で構成され得る。その上、本発明による熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体は、前記群の中に記述されていないその他の突然変異、好ましくは置換、特に当該技術分野で周知であるいくつかのものを含み得る。一例を挙げると、既知の置換は、国際公開第９２／０８７３７号パンフレット、国際公開第９９／０３８８７号パンフレット、国際公開第０１／３６００１号パンフレット、国際公開第０２／８１５０７号パンフレット、国際公開第０３／００２１５２号パンフレット、国際公開第２００４／００５３４１号パンフレット、国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレット、米国特許第６，９５８，３８８号明細書、米国特許第４，８９８，９３１号明細書、米国特許第６，０４６，０３４号明細書及び国際公開第２００６／１２０５８０号パンフレットの中で記述されている。
【００４０】
例えば、本発明は、Ｃ２１Ｗ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１１０Ｈ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ａ１４７Ｅ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｌ１５８Ｗ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｑ及びＲ１６２Ｅ又はその組合せからなる群の中から選択された少なくとも１つの置換を含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。もう１つの例では、本発明は、Ｑ２４Ａ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ、Ｋ１０９Ｃ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ａ１４７Ｅ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ及びＲ１６２Ｄ又はその組合せからなる群の中から選択された突然変異の少なくとも１つを含む、ヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００４１】
さらに一層好ましい実施形態においては、本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群の中から選択された少なくとも１つの第１の置換を含むヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。好ましい一実施形態においては、変異体は、前記第１の置換により導入された残基に付着したいかなる非ペプチド部分も含まない。前記変異体は、Ｍ１５７Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１００Ｎからなる群の中から選択された少なくとも１つのその他の置換をさらに含んでいてよい。
【００４２】
もう１つの実施形態においては、本発明は、単一の置換Ｃ２３Ｓ又はＭ１５７Ｃか又はＣ２１Ｇ、Ｃ２１Ｗ、Ｙ２２Ｄ、Ｙ２２Ｔ、Ｙ２２Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｓ４３Ｃ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｔ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｌ５１Ｉ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｍ１００Ｎ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１１０Ｈ、Ｔ１１９Ｙ、Ｔ１１９Ｐ、Ｙ１２１Ｔ、Ｓ１２２Ｈ、Ｓ１２２Ｐ、Ｋ１３１Ｉ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｅ、Ａ１４７Ｆ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｗ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６３Ｔ、Ｒ１６３Ｌ、Ｒ１６３Ｇ、Ａ１６４Ｅ、Ｓ１６５Ｖ、Ｌ５３Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｔ、Ｑ６９Ｆ、Ｑ６９Ｔ、Ｖ７３Ｉ、Ｓ７４Ｇ、Ｋ７８Ｑ、Ｌ７９Ｖ、Ｆ８０Ｖ、Ｋ８１Ｉ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｖ、Ｑ８７Ｉ、Ｑ８７Ｐ、Ｓ８８Ｎ、Ｓ８８Ｑ、Ｔ９５Ａ、Ｔ９５Ｖ、Ｔ９５Ｆ、Ｉ９６Ｌ、Ｋ９７Ｉ、Ｋ９７Ｒ、Ｄ９９Ｎ、Ｄ９９Ｃ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｉ、Ｄ９９Ｍ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｄ９９Ｗ、Ｄ９９Ｙ、Ｄ９９Ｖ、Ｍ１００Ｉ、Ｍ１００Ｖ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｖ、Ｋ１０３Ｒ、Ｎ１０６Ｄ、Ｎ１０６Ｑ、Ｎ１０６Ｇ、Ｓ１０７Ｃ、Ｓ１０７Ｇ、Ｓ１０７Ｅ、Ｄ１１３Ｓ、Ｅ１１６Ｃ、Ｅ１１６Ｑ、Ｅ１１６Ｈ、Ｅ１１６Ｉ、Ｅ１１６Ｖ、Ｔ１１９Ｃ、Ｔ１１９Ｉ、Ｔ１１９Ｍ、Ｔ１１９Ｖ、Ｎ１２０Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｎ１２０Ｌ、Ｎ１２０Ｔ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｃ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｉ、Ｓ１２２Ｌ、Ｓ１２２Ｋ、Ｓ１２２Ｐ、Ｖ１２３Ｔ、Ｖ１２３Ｈ、Ｖ１２３Ｐ、Ｔ１２４Ｃ、Ｔ１２４Ｈ、Ｌ１２６Ｒ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１２６Ｔ、Ｌ１２６Ｖ、Ｎ１２７Ａ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｑ、Ｎ１２７Ｅ、Ｎ１２７Ｇ、Ｎ１２７Ｉ、Ｎ１２７Ｋ、Ｎ１２７Ｆ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｗ、Ｎ１２７Ｙ、Ｖ１２８Ｉ、Ｖ１２８Ｙ、Ｑ１２９Ｒ、Ｑ１２９Ｃ、Ｑ１２９Ｈ、Ｑ１２９Ｉ、Ｑ１２９Ｙ、Ｑ１２９Ｖ、Ｒ１３０Ｑ、Ｒ１３０Ｌ、Ｒ１３０Ｋ、Ｒ１３０Ｔ、Ｋ１３１Ｉ、Ｋ１３１Ｍ、Ａ１４１Ｈ、Ａ１４１Ｖ、Ｅ１４２Ｆ、Ｌ１４３Ｉ、Ｓ１４４Ｇ、Ｓ１４４Ｌ、Ｓ１４４Ｗ、Ｓ１４４Ｖ、Ｔ１４９Ｅ、Ｔ１４９Ｍ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５１Ｃ、Ｋ１５１Ｈ、Ｋ１５１Ｓ、Ｋ１５１Ｖ、Ｒ１６２Ｃ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｉ、Ｒ１６２Ｌ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｖ、Ａ１６４Ｇ及びＡ１６４Ｓからなる群の中から選択された１つ以上の置換と組合せた形での置換Ｃ２３Ｓ又はＭ１５７Ｃのいずれかを有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントにも関する。１つの好ましい実施形態においては、本発明は、単一の置換Ｃ２３Ｓ又はＭ１５７Ｃか又はＳ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された１つ以上の置換と組合せた形での置換Ｃ２３Ｓ又はＭ１５７Ｃのいずれかを有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。さらに一層好ましい実施形態においては、本発明は、単一の置換Ｍ１５７Ｃ又はＳ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された１つ以上の置換と組合せた形での置換Ｍ１５７Ｃのいずれかを有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００４３】
一実施形態においては、本発明は以下のものからなる群の１つの中から選択された単一の置換を有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する：
（ａ） Ｃ２１Ｇ、Ｃ２１Ｗ、Ｙ２２Ｄ、Ｙ２２Ｔ、Ｙ２２Ｓ、Ｃ２３Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｓ４３Ｃ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｔ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｌ５１Ｉ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｍ１００Ｎ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１１０Ｈ、Ｔ１１９Ｙ、Ｔ１１９Ｐ、Ｙ１２１Ｔ、Ｓ１２２Ｈ、Ｓ１２２Ｐ、Ｋ１３１Ｉ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｅ、Ａ１４７Ｆ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｌ、Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｗ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ、Ｒ１６３Ｔ、Ｒ１６３Ｌ、Ｒ１６３Ｇ、Ａ１６４Ｅ及びＳ１６５Ｖ；又は
（ｂ） Ｌ５３Ｉ、Ｇ５４Ｑ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｔ、Ｑ６９Ｆ、Ｑ６９Ｔ、Ｖ７３Ｉ、Ｓ７４Ｇ、Ｋ７８Ｑ、Ｌ７９Ｖ、Ｆ８０Ｖ、Ｋ８１Ｉ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｖ、Ｑ８７Ｉ、Ｑ８７Ｐ、Ｓ８８Ｎ、Ｓ８８Ｑ、Ｔ９５Ａ、Ｔ９５Ｖ、Ｔ９５Ｆ、Ｉ９６Ｌ、Ｋ９７Ｉ、Ｋ９７Ｒ、Ｄ９９Ｎ、Ｄ９９Ｃ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｉ、Ｄ９９Ｍ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｄ９９Ｗ、Ｄ９９Ｙ、Ｄ９９Ｖ、Ｍ１００Ｉ、Ｍ１００Ｖ、Ｎ１０１Ｇ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｖ、Ｋ１０３Ｒ、Ｎ１０６Ｄ、Ｎ１０６Ｑ、Ｎ１０６Ｇ、Ｓ１０７Ｃ、Ｓ１０７Ｇ、Ｓ１０７Ｅ、Ｄ１１３Ｓ、Ｅ１１６Ｃ、Ｅ１１６Ｑ、Ｅ１１６Ｈ、Ｅ１１６Ｉ、Ｅ１１６Ｖ、Ｔ１１９Ｃ、Ｔ１１９Ｉ、Ｔ１１９Ｍ、Ｔ１１９Ｖ、Ｎ１２０Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｎ１２０Ｌ、Ｎ１２０Ｔ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｃ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｉ、Ｓ１２２Ｌ、Ｓ１２２Ｋ、Ｓ１２２Ｐ、Ｖ１２３Ｔ、Ｖ１２３Ｈ、Ｖ１２３Ｐ、Ｔ１２４Ｃ、Ｔ１２４Ｈ、Ｌ１２６Ｒ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１２６Ｔ、Ｌ１２６Ｖ、Ｎ１２７Ａ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｑ、Ｎ１２７Ｅ、Ｎ１２７Ｇ、Ｎ１２７Ｉ、Ｎ１２７Ｋ、Ｎ１２７Ｆ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｗ、Ｎ１２７Ｙ、Ｖ１２８Ｉ、Ｖ１２８Ｙ、Ｑ１２９Ｒ、Ｑ１２９Ｃ、Ｑ１２９Ｈ、Ｑ１２９Ｉ、Ｑ１２９Ｙ、Ｑ１２９Ｖ、Ｒ１３０Ｑ、Ｒ１３０Ｌ、Ｒ１３０Ｋ、Ｒ１３０Ｔ、Ｋ１３１Ｉ、Ｋ１３１Ｍ、Ａ１４１Ｈ、Ａ１４１Ｖ、Ｅ１４２Ｆ、Ｌ１４３Ｉ、Ｓ１４４Ｇ、Ｓ１４４Ｌ、Ｓ１４４Ｗ、Ｓ１４４Ｖ、Ｔ１４９Ｅ、Ｔ１４９Ｍ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５１Ｃ、Ｋ１５１Ｈ、Ｋ１５１Ｓ、Ｋ１５１Ｖ、Ｒ１６２Ｃ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｉ、Ｒ１６２Ｌ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｖ、Ａ１６４Ｇ及びＡ１６４Ｓ；又は
（ｃ） Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖ。
【００４４】
例えば、置換は、Ｃ２１Ｗ、Ｃ２３Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｄ２５Ｖ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｗ５９Ｆ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｒ、Ｓ６３Ｃ、Ｙ７６Ｄ、Ｅ９８Ｋ、Ｋ１０９Ｃ、Ｋ１０９Ｌ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１１０Ｈ、Ｅ１３５Ｖ、Ｍ１４０Ｐ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ａ１４７Ｅ、Ｍ１５７Ｗ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｃ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｃ、Ｌ１５８Ｉ、Ｌ１５８Ｗ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｄ、Ｒ１６２Ｑ及びＲ１６２Ｅからなる群の中から選択される。特に、置換はＣ２３Ｓ、Ｑ２４Ａ、Ｐ２６Ｄ、Ｖ２８Ｃ、Ｇ４１Ｉ、Ｇ４１Ｓ、Ｈ４２Ｄ、Ｇ４９Ｋ、Ｔ５０Ｙ、Ｌ５１Ｈ、Ｋ５７Ｓ、Ｎ５８Ｒ、Ｎ５８Ｃ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｙ、Ｋ６０Ｈ、Ｋ６０Ｒ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ、Ｋ１０９Ｃ、Ａ１４６Ｋ、Ａ１４６Ｍ、Ａ１４７Ｒ、Ａ１４７Ｇ、Ａ１４７Ｌ、Ａ１４７Ｍ、Ａ１４７Ｐ、Ａ１４７Ｓ、Ａ１４７Ｅ、Ｍ１５７Ｑ、Ｍ１５７Ｃ、Ｍ１５７Ｌ、Ｌ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｃ、Ｆ１５９Ｖ、Ｒ１６０Ａ、Ｒ１６２Ｅ、Ｒ１６２Ｑ及びＲ１６２Ｄからなる群の中から選択されてもよい。好ましくは、本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群の中から選択された単一の置換を有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００４５】
一実施形態においては、本発明は、Ｃ２１Ｇ＋Ｆ１５９Ｃ、Ａ１４７Ｅ＋Ｒ１６２Ｄ、Ｍ１００Ｎ＋Ｔ１１９Ｙ、Ｙ７６Ｄ＋Ｋ１３１Ｉ、Ｔ５０Ｙ＋Ｙ１２１Ｔ＋Ｍ１４０Ｐ、Ｐ２６Ｄ＋Ｓ１２２Ｐ、Ｙ２２Ｓ＋Ｌ１５８Ｗ＋Ｒ１６３Ｇ、Ｙ２２Ｄ＋Ｓ１２２Ｈ、Ｒ１６２Ｑ＋Ａ１６４Ｅ及びＹ２２Ｔ＋Ｋ１０９Ｃ＋Ｔ１１９Ｐ＋Ａ１４７Ｆ＋Ｒ１６３Ｌからなる群の中から選択された置換の組合せを有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。
【００４６】
もう１つの実施形態においては、本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｍ１５７Ｃ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択２つの置換の組合せ、好ましくはＳ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ６２Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｅ６２Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ６２Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｄ９９Ｙ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ７４Ｇ、Ｄ９９Ｙ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１００Ｎ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｄ９９Ｙ＋Ｎ５８Ｒ、Ｄ９９Ｙ＋Ｔ９５Ｖ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ７４Ｇ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ７４Ｇ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ７４Ｇ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ７４Ｇ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｇ４１Ｓ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｇ４１Ｓ、Ｎ５８Ｒ＋Ｔ９５Ｖ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１００Ｎ、Ｎ５８Ｒ＋Ｇ４１Ｓ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ＋Ｇ４１Ｓ、Ｍ１５７Ｃ＋Ｍ１００Ｎ及びＭ１５７Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された組合せを含むか又は有するヒトＩＦＮγの熱安定性変異体又はその機能的フラグメントに関する。好ましい実施形態において、本発明は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せ、好ましくは組合せＳ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓを含むか又は有する変異体に関する。
【００４７】
配列番号１〜６は、前駆体及び成熟形態のヒトＩＦＮγのタンパク質配列及びそれらをコードする核酸配列を記述する。好ましい実施形態においては、本発明による変異体は、１６６個のアミノ酸残基の前駆体タンパク質（配列番号２）又は本発明による少なくとも１つの置換又は置換の組合せを含むＣＹＣトリペプチドを伴うか又は伴わない成熟タンパク質（それぞれ配列番号６及び４）に対応する。特に「変異体」という用語は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ配列番号２、４及び６の配列の中から選択された配列を有するポリペプチドと異なっているポリペプチドを意味する。
【００４８】
「機能的フラグメント」というのは、ヒトＩＦＮγの活性を有するヒトＩＦＮγのフラグメントを意味している。例えば、前記フラグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜１５個の残基、さらに一層好ましくは１〜１１個の残基のＣ末端欠失を伴い、ＣＹＣトリペプチドを伴うか又は伴なわないヒトＩＦＮγの前駆体又は成熟形態に対応していてよい。フラグメントは、ヒトＩＦＮγの１００、１１０、１２０、１３０又は１４０個の連続するアミノ酸残基を含んでいてよい。
【００４９】
「ヒトＩＦＮγ活性」というのは、インビトロ又はインビボで決定される、ヒトＩＦＮγレセプタに結合しヒトＩＦＮγがそのレセプタに結合した時点で誘発されたシグナルの変換をひき起こす能力を意味する。ヒトＩＦＮγ活性は、明細書中及び実施例中で以下に記述する方法によって測定することができる。
【００５０】
本発明による変異体は、野生型ヒトＩＦＮγに比べて増大した熱安定性を有する。前記増大は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０、２０又は３０％である。「熱安定性」は、熱の作用にさらされた後もその活性を保つタンパク質の能力を意味するものと理解される。例えば、タンパク質を５９℃で１０分間インキュベートすることができる。このとき、変異体の熱安定性は前記前処理の後の残留活性の百分率によって評価される。一変異体の熱安定性のこの尺度は次に、同じ条件に付された野生型ＩＦＮγを用いることによって得られる同じ値と比較される。
【００５１】
熱安定性は改善されたが活性は低い変異体を使用してもよい。好ましくは、本発明の熱安定性変異体は、野生型ヒトＩＦＮγの活性の少なくとも１０％、好ましくは野生型ヒトＩＦＮγの活性の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％に対応する活性（前処理無しの条件）を保つ。特に好ましい実施形態においては、本発明の熱安定性変異体は、野生型ヒトＩＦＮγのものと同等であるかさらにはより高いものである活性を保つ。
【００５２】
対象の変異体を選択するための興味深い要因は、残留活性の百分率を乗じた変異体の相対的活性である。
【００５３】
「非ペプチド部分」は、ヒトＩＦＮγのアミノ酸の側鎖に付着可能な非ペプチド分子を示すべく意図されている。前記分子は、重合体分子、親油性分子、炭水化物又は有機誘導体化剤であり得る。炭水化物は、例えばＮ−又はＯ−グリコシル化などによる、インビトロ又はインビボグリコシル化によってＩＦＮγに付着可能である。親油性分子は例えば、飽和又は不飽和脂肪酸、テルペン、ビタミン、ステロイド又はカロテノイドであり得る。重合体分子はポリオール、ポリアミン、多炭素環酸（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ ａｃｉｄ）又はポリアルキレンオキサイド、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。このタイプの分子は、当業者にとって周知のものである。ＰＥＧ基を含有する変異体を「ペグ化」されていると呼ぶことにする。
【００５４】
本発明によるヒトＩＦＮγは、好ましくは４８位及び１２０位でグリコシル化可能である。もう１つの実施形態においては、変異体をグリコシル化することはできない。変異体が置換Ｇ４１Ｓを含む場合、それはＮ−グリコシル化によってＮ３９位でグリコシル化可能である。他の実施形態においては、かかる変異体をこの位置でグリコシル化することはできない。
【００５５】
一実施形態においては、重合体分子を付加すること、特に重合体を付加すること（キタら、「Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｌｉｖ．」第６号：１５７〜１６７頁、１９９０年；欧州特許第２３６９８７号明細書及び米国特許第５，１０９，１２０号明細書）又はペグ化（国際公開第９９／０３８８７号パンフレット；国際公開第２００４００５３４１号パンフレット、「重合体分子の接合」を参照）により変異体を修飾することができる。本発明によるヒトＩＦＮγ変位体の好ましい実施形態においては、重合体分子は、４１、５８、６２、６３、７４、９５、９９、１００、１１６、１２２、１２６、１５７、１５８、１５９及び１６２位以外の位置に付着させられる。特に、分子は、本発明による変異体内で行なわれた置換、特にＳ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１５７Ｃからなる群の中から選択された置換によって導入される残基には付着させられない。
【００５６】
もう１つの実施形態においては、本発明による変異体は、いかなる重合体分子も含有しない。特に、それはペグ化されない。
【００５７】
ＩＦＮγのインビトロ活性は一般に、増大する量のＩＦＮγでの処理後の細胞系に対するウイルスの細胞変性効果の減少に関して測定される。ＩＦＮγに特異的なその他の生物学的試験が存在する（再考のため、ミーガー（Ｍｅａｇｅｒ）、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第２６１号、（２００２年）２１〜３６頁）。特にこれらの新しい試験は、ＩＦＮγの多面的活性の特徴の１つをより特異的に評価することを可能にする。インビボ活性の試験も存在する。
【００５８】
ＩＦＮγに対する抗ウイルス応答は、異なる共役系（使用されたウイルスに対する感応性をもつウイルス／ＩＦＮγ−応答性接着細胞系）の中で測定可能である。例としては以下の共役系が含まれる：ＶＳＶ／ＭＤＢＫ；ＶＳＶ又はＥＭＣＶ／Ａ５４９、ＶＳＶ、ＥＭＣＶ、ＳＦＶ又はシンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス／ＷＩＳＨ；ＶＳＶ又はＥＭＣＶ／ＨｅＬａ；ＶＳＶ、ＥＭＣＶ又はメンゴウイルス（Ｍｅｎｇｏｖｉｒｕｓ）／ＦＳ４、ＦＳ７１、又はＨｅｐ２；ＶＳＶ、ＥＭＣＶ、メンゴウイルス又はシンドビスウイルス／ＦＬ；ＥＭＣＶ／２Ｄ９；ここでＶＳＶは水疱性口内炎ウイルス；ＥＭＣＶ＝脳心筋炎ウイルス；ＳＦＶ＝セムリキ森林熱ウイルスである。好ましくは、使用されるウイルスは、ワクシニアウイルス又はリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）となる。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びサイトメガロウイルスを使用してもよい。
【００５９】
ＩＦＮγの活性は、ＧＡＳ（ガンマーインターフェロン活性化部位）又はＩＳＲＥ要素（インターフェロン刺激型応答要素）を含むＩＦＮγ応答性プロモータの制御下で、例えばルシフェラーゼといったリポータ遺伝子を使用することによってもテストできる。このようにして、リポータ遺伝子は、ＩＦＮγによる刺激の後に検定を受ける。ｐＧＡＳ／ルシフェラーゼ及びｐＩＳＲＥ／ルシフェラーゼベクターは市販されている（＃２１９０９１、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。好ましい実施形態においては、ＩＦＮγ活性はＰＧＡＳ／ルシフェラーゼベクターを用いた方法によって測定される。
【００６０】
全てその生物学的活性を保ちながらのＩＦＮγの熱安定性の増加により、同等の生物学的活性について、使用される治療用量の削減及びその結果としての治療の弊害の削減を可能にするより効果的な治療の開発を想定することができるようになる。こうして、これまでこのタイプの分子では想像もできなかった、ヘルペスなどのウイルス感染を削減する目的でさらに高い用量のＩＦＮγを使用する治療も可能となる。その上、本発明による変異体は、特に室温で、野生型ＩＦＮγに比べて、その保管中のより長い半減期、ひいてはより優れた保管寿命という利点も有する可能性がある。
【００６１】
従って、本発明は、本発明による熱安定性ＩＦＮγ変位体を含む医薬組成物に関する。
【００６２】
このようにして、本発明は好ましくは、特に本発明は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含む、熱安定性ＩＦＮγ変異体又はその機能的フラグメントを含む医薬組成物において、変異体が第１の置換により導入された残基に付着した非ペプチド部分を含有していない医薬組成物に関する。一実施形態においては、変異体は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、配列番号２、４及び６の配列の中から選択された配列を有するポリペプチドと異なっている。特定の実施形態においては、この変異体は単一の置換を有する。もう１つの実施形態においては、変異体は、Ｍ１５７Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１００Ｎからなる群の中から選択された少なくとも１つのその他の置換をさらに含む。特に変異体は、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｍ１５７Ｃ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された２つの置換の組合せを含むか又は有していてよい。好ましい実施形態では、変異体は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ６２Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｅ６２Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ６２Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｄ９９Ｙ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ７４Ｇ、Ｄ９９Ｙ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１００Ｎ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｄ９９Ｙ＋Ｎ５８Ｒ、Ｄ９９Ｙ＋Ｔ９５Ｖ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ７４Ｇ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ７４Ｇ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ７４Ｇ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ７４Ｇ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｇ４１Ｓ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｇ４１Ｓ、Ｎ５８Ｒ＋Ｔ９５Ｖ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１００Ｎ、Ｎ５８Ｒ＋Ｇ４１Ｓ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ＋Ｇ４１Ｓ、Ｍ１５７Ｃ＋Ｍ１００ＮおよびＭ１５７Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有している。さらに一層好ましい実施形態においては、変異体は、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ及びＳ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択置換の組合せを含むか又は有している。特に一層好ましい実施形態においては、変異体は組合せＳ６３＋Ｇ４１Ｓを含むか又は有している。特定の実施形態においては、変異体はＣ末端において１〜１１個の残基の欠失を有していない。もう１つの特定の実施形態においては、変異体はＣ末端において１〜１１個の残基の欠失を有している。特定の実施形態においては、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有していない。もう１つの特定の実施形態においては、変異体は、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分をまさに含有している。当該の非ペプチド分子はより特定的には重合体分子、好ましくはポリエチレングリコールである。特定の実施形態においては、変異体はグリコシル化されている。特に変異体は、それが置換Ｇ４１Ｓを含む場合にＮ−グリコシル化によりＮ３９位においてグリコシル化され得る。
【００６３】
本発明による医薬組成物は、薬学的に許容できる支持体又は賦形剤をさらに含み得る。前記支持体及び賦形剤は、当業者にとって周知のものである（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ａ．Ｒ．ジェンナーロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０年］；「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓ．フロクジャー（Ｆｒｏｋｊａｅｒ）及びＬ．ホヴガード（Ｈｏｖｇａａｒｄ）編、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００年］；及び「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ａ．キッブ（Ｋｉｂｂｅ）編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０００年］）。
【００６４】
本発明による医薬組成物は、さまざまな形態で、特に液体、ゲル、凍結乾燥、粉末、圧縮固体その他の形態で処方可能である。
【００６５】
本発明はさらに、薬剤としての本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体又は本発明による組成物にも関する。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口（例えば皮内、筋内、静脈内、皮下）、舌下、局所、局部、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、眼球内、耳介内投与に適し、それ向けに処方されており、前記活性作用物質は１投薬量単位の形で投与することができる。
【００６７】
医薬組成物の一例は、非経口投与向け溶液である。組成物は即時に使用するのに適した液体形態であってもよいが、かかる非経口形態を凍結した形態又は凍結乾燥した形態で提供してもよい。この場合、組成物は使用に先立ち解凍されるか又はもどされることになる。凍結乾燥の場合、組成物は注射用滅菌水又は無菌生理食塩溶液などの薬学的に許容できる希釈剤の添加によって調製されることになる。
【００６８】
単位剤形は、例えば錠剤、カプセル、ゲル、顆粒、粉末、経口又は注射用溶液又は懸濁液、経皮パッチ、舌下、口腔、気管内、眼球内、鼻腔内、耳介内形態、吸入、局所、経皮、皮下、筋内又は静脈内形態、直腸投与形態又はインプラントであってよい。
【００６９】
局所投与向けの処方物としては、クリーム、ゲル、軟こう、ローション又は滴剤がある。前記薬学処方物は、関連分野の従来の方法に従って調製される。好ましい実施形態においては、医薬組成物は液体である。
【００７０】
前記単位剤形は、薬学処方物に応じて、体重１ｋｇあたり０．００１〜１００μｇの活性成分の連日投与を可能にするように投薬される。それよりも高いか又は低い投薬量強度が適切である特殊なケースも考えられる。前記投薬量は、本発明の範囲から逸脱するものではない。標準的実践に従うと、各患者のための適切な用量は、投与方法、患者の体重及び応答性に従って医師によって決定される。
【００７１】
好ましい実施形態においては、ＩＦＮγは経口経路、好ましくは皮下注射により投与される。例えば、ＩＦＮγの通常の注射用量は、体表面積が０．５ｍ２超である場合には１〜１００μｇ／ｍ２の間に含まれ、体表面積が０．５ｍ２以下の場合には体重１ｋｇあたり０．０１〜１０μｇの間に含まれる。
【００７２】
ＩＦＮγは、広い活性スペクトラムをもつ多面性サイトカインの原型である。事実、インターフェロン（ＩＦＮ）には、ウイルス複製の阻害、細胞増殖の阻害及びアポトーシスの誘発などの活性がある。
【００７３】
特に、ＩＦＮγによるマクロファージ刺激は、以下の応答を誘発する：
− 食作用及び細菌死滅の増強（直接的抗菌性及び抗腫瘍性機序）；
− 抗原提示及び分離経路の刺激、マクロファージ表面におけるＩ型及びＩＩ型主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の発現；
− 免疫グロブリンＩｇＧ生産及び補体活性化を結果としてもたらす、抗体分泌プラズマ細胞へのＢリンパ球の分化；
− 細胞毒性酸素遊離ラジカル及びＮＯを生産させるＮＯシンターゼの活性化；
及び／又は
− サイトカイン及び内因性ＩＦＮの生産の増強。
【００７４】
ＩＦＮγは、その分化を促進し、それによって特異的免疫応答を変調させることによってＴリンパ球に対して作用する。
【００７５】
ＩＦＮγの薬学的特性の中でも、追求され臨床段階で開発された主要な効果は、主として免疫調節面であり、抗ウイルス治療用分子の面は今までのところさほど大規模に開発されていない。
【００７６】
その広い活性スペクトラム（抗ウイルス性、抗増殖性及び免疫変調性）を理由として、ＩＦＮγは、多様なヒト疾患の治療における治療薬として開発されてきた。市販のＩＦＮγ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ及びＢｉｏｇａｍｍａ）は、特に２つの主要な治療適応すなわち慢性肉芽腫症及び特発性肺線維症において経口プレドニゾロンと組合せて使用されている。主要な治療適応に加えて、数多くの新規な二次的適応が現在、特に例えばＣ型肝炎の治療におけるペグ化ＩＦＮγ／リバビリンに対する付加物としてのその免疫抑制的役割のために、異なる臨床的開発段階（ＩＩ及びＩＩＩ）にある。非定型抗酸菌感染症、腎臓癌；大理石骨病；全身性強皮症；慢性Ｂ型肝炎；慢性Ｃ型肝炎；敗血性ショック；アレルギー性皮膚炎；関節リウマチ；卵巣癌；肝線維症；ぜんそく；及びリンパ腫に言及することもできる。
【００７７】
ＩＦＮγは同様に、さまざまなウイルス感染の治療においても有用であり、ヒト乳頭腫ウイルス感染及びＢ型及びＣ型肝炎ウイルス感染に対抗する活性を示す。
【００７８】
その上、高用量のＩＦＮγに付随する毒性の問題が、より安定した分子、ひいてはインビボでより強い効果を有する分子により軽減又は解決されたとすると、新規の適応性におけるＩＦＮγの使用、特にヘルペス（ＨＳＶ）Ｉ型及びＩＩ型ウイルス感染を治療するための使用を再度考慮してもよいと思われる。
【００７９】
従って、本発明は、抗ウイルス性、抗増殖性又は免疫調節性薬剤を調製するための本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体又は本発明による医薬組成物の使用に関する。例えば前記薬剤は、炎症性疾患、癌、感染症、骨疾患、自己免疫疾患などを治療するように設計される。好ましい実施形態においては、本薬剤は、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血症ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状を治療するように設計される。変形実施形態においては、本薬剤は、痒痛、神経皮膚炎、Ｉ型糖尿病、血管狭窄症、基底細胞上皮腫、癌又はリンパ腫例えば卵巣癌、腎臓癌、白血病例えばＢ又はＴ細胞増殖性障害、慢性骨髄性白血病及び関連する症候群、乳癌、肺癌、黒色腫、結腸直腸癌、脳腫瘍、胸膜癌、胃癌、膵癌、ウイルス感染例えばＢ型又はＣ型肝炎ウイルスに起因するもの、クローン病、乾癬、多発性硬化症及び筋萎縮性側湾硬化症からなる群の中から選択された病状を治療するように設計されている。
【００８０】
本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体は、もう１つの活性作用物質、例えば抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬及びその組合せからなる群の中から選択される活性作用物質と組合せた状態で使用してよい。付加的な活性作用物質は、本発明によるＩＦＮγの投与の前、又はそれと同時に又はその後に投与してよい。さらに、これを同じ投与経路で投与してもよいし、又２つの異なる投与経路で投与してもよい。このようにして本発明は、上述の病状の１つを治療するための同時、逐次又は分離使用向けに設計された複合製剤を目的とした、好ましくは上述のリストから選択されたもう１つの活性作用物質と、本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体又は医薬組成物を含む製品に関する。
【００８１】
抗体との組合せは、癌を治療するために有用である。実際、ＩＦＮγはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞細胞毒性）により抗体の効果を増大させることができる。抗体は好ましくは、癌細胞上で曝露された抗原に対抗して導かれる。抗体はポリクローナル、モノクローナル、ヒト化又はキメラ抗体であってよい。好ましくは、抗体はモノクローナルでかつヒト化されたものである。例えば、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞リンパ増殖性障害の場合、抗原はＣＤ２０であり得る。前記抗体はリツキシマブであり得る。
【００８２】
グルココルチコイドとの組合せは、特発性肺線維症などの肺胞性疾患を治療するために有用である。適切なグルココルチコイドの例としては、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン及びその薬学的に許容できる塩が含まれる。本発明の好ましい実施形態は、本発明によるＩＦＮγとプレドニゾロンの組合せの使用に関する。
【００８３】
抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬との組合せは、特に痒疹又は神経皮膚炎などの皮膚疾患を治療するために特に有用である。
【００８４】
抗アレルギー薬、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疾調節剤、又はサイトカインとの組合せは、特にぜん息を治療するために有用である。
【００８５】
本発明はさらに、必要としている患者における抗ウイルス性、抗増殖性又は免疫調節性治療方法において、この患者に対し治療上有効な量の本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体又は医薬組成物を投与する段階を含む方法に関する、好ましくは、治療方法は、上述の病状を治療するように設計されている。任意には、この方法は、好ましくは以上で列挙したものの中から選択されるもう１つの活性作用物質を投与する段階をさらに含んでいてよい。治療上有効な量は、疾病の症状を軽減又は除去する、又は疾病の進行を管理するか又は遅延させるのに必要な量である。患者は好ましくはヒトである。
【００８６】
本発明は、本発明によるヒトＩＦＮγの熱安定性変異体をコードする核酸に関する。本発明は同様に、本発明による核酸のための発現カセットにも関する。本発明はさらに、本発明による核酸又は発現カセットを含むベクターにも関する。このベクターはプラスミド及びウイルスベクターから選択されてよい。
【００８７】
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、又はｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、その２つの混合物であってよい。それは１本鎖又は２重鎖又はこれら２つの混合であってよい。これは、例えば修飾された結合、修飾されたプリン又はピリミジン塩基又は修飾された糖を含む、修飾されたヌクレオチドを含んでいてよい。これは、化学的合成、組換え、突然変異誘発などを含む、当業者にとって既知のあらゆる方法により調製してもよい。
【００８８】
発現カセットは、本発明による熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の発現のために必要な全ての構成要素、特に宿主細胞内での転写及び翻訳に必要な構成要素を含む。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってよい。特に、発現カセットは、プロモータ及びターミネータ、任意には増幅因子を含む。プロモータは、原核性又は真核性であってよい。好ましい原核プロモータは以下の通りである：Ｌａｃｌ、Ｌａｃｚ、ｐＬａｃｔ、Ｐｔａｃ、ｐＡＰＡ、ｐＢＡＤ、バクテリオファージＴ３又はＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモータ、ポリヘドリンプロモータ、ファージラムダのＰＲ又はＰＬプロモータ。好ましい真核プロモータの例は以下の通りである：ＣＭＶ早期プロモータ、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ、ＳＶ４０早期又は後期プロモータ、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモータ及び一部のレトロウイルスのＬＴＲ領域。一般に、適切なプロモータを選択するために、当業者は有利にもサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９年）の研究又はフラー（Ｆｕｌｌｅｒ）ら（１９９６年：「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」）で記述されている技術を参照することができる。
【００８９】
本発明は、本発明による熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体をコードする核酸又は発現カセットを含有するベクターに関する。ベクターは好ましくは発現ベクターである、すなわち、宿主細胞内での変異体の発現のために必要な構成要素を含んでいる。宿主細胞は原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は真核生物であり得る。真核生物は、下等真核生物例えば酵母（例えばＳ．セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は真菌（例えばコウジカビ属（ゲヌス・アスペルギルス（ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））又は高等真核生物例えば昆虫細胞（例えばＳｆ９又はＳｆ２１）、哺乳動物細胞又は植物細胞であってよい。細胞は哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ（グリーンモンキー細胞系）〔例えばＣＯＳ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ（米国特許第４，８８９，８０３号明細書；米国特許第５，０４７，３３５号明細書、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）〕、マウス細胞又はヒト細胞であってよい。特定の実施形態においては、細胞は非ヒト及び非胚細胞である。ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のｐＴｉプラスミドなどであってよい。ベクターは、好ましくは、複製起点、多重クローニング部位及び選択遺伝子からなる群の中から選択された１つ以上の要素を含んでいてよい。好ましい実施形態においては、ベクターはプラスミドである。原核生物ベクターの制限されない例は、以下の通りである：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＢＲ３２２及びｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＥＴ（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））。真核生物ベクターの制限されない例は、以下の通りである：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＰＩＣＺ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＣＩ−ｎｅｏ（ストラタジーン）、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア）；及びｐＱＥ−３０（ＱＬＡｅｘｐｒｅｓｓ）。ウイルスベクターの制限されない例としては、アデノウイルス活性作用物質Ｖ、ＨＳＶ、レンチウイルスなどが含まれる。好ましくは、発現ベクターはプラスミド又はウイルスベクターである。
【００９０】
本発明によるＩＦＮγをコードする配列は、シグナルペプチドを含んでいてもいなくてもよい。含まれていない場合には、メチオニンが任意にＮ末端に付加されてよい。もう１つの変形形態においては、非相同シグナルペプチドを導入することができる。前記非相同シグナルペプチドは、大腸菌といった原核生物又は真核生物、特に哺乳動物、昆虫又は酵母細菌の誘導体であってよい。
【００９１】
本発明は、細胞を形質転換又はトランスフェクトするための、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターの使用に関する。本発明は、熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体をコードする核酸、発現カセット又はベクターを含む宿主細胞、及び本発明による熱安定性組換え型ヒトＩＦＮγ変異体を生産するためのその使用に関する。「宿主細胞」という用語は、この細胞の培養又は成長の結果もたらされる娘細胞を包含する。特定の実施形態においては、細胞は非ヒト細胞であってかつ非胚細胞である。本発明は同様に、本発明による熱安定性組換え型ヒトＩＦＮγ変異体を生産するための方法において、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット又は発現ベクターで細胞を形質転換又はトランスフェクトする段階；トランスフェクション／形質転換を受けた細胞を培養する段階；及び細胞により生産された熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体を回収する段階を含む方法にも関する。１変形実施形態においては、本発明による熱安定性組換え型ヒトＩＦＮγ変異体を生産するための方法は、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む細胞を提供する段階；トランスフェクション／形質転換を受けた細胞を培養する段階；及び細胞により生産された熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体を回収する段階を含む。特に、細胞は、この変異体をコードする核酸により一過性の又は安定した形で形質転換／トランスフェクションを受けてよい。前記核酸は、エピソーム又はクロモソーム形態で細胞内に含有されていてよい。組換え型タンパク質を生産するための方法は、当業者にとって周知のものである。例としては、大腸菌中での生産については、米国特許第５，００４，６８９号明細書、欧州特許第４４６，５８２号明細書、ワング（Ｗａｎｇ）ら（「Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．」Ｂ２４：１０７６〜１０８４頁、１９９４年及び「Ｎａｔｕｒｅ」、第２９５号、５０３頁）、そして哺乳動物細胞内での生産についてはジェームス（ＪＡＭＥＳ）ら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６年）第５号：３３１〜３４０頁）内で記述されている特定的方法が含まれる。
【００９２】
本発明はさらに、本発明による熱安定性ＩＦＮγ変異体をコードする核酸、本発明による発現カセット、ベクター又は宿主細胞を含む医薬組成物特に上述の疾患を治療するように設計された薬剤を調製することを目的としたその使用にも関係し得る。本発明は同様に、治療上有効な量でかかる組成物を投与する段階を含む、それを必要とする患者の治療方法にも関する。
【００９３】
本明細書中に列挙された全ての参考文献は本出願の参照文献リスト中に記されている。本発明のその他の面及び利点は、当然のことながら制限的なものとしてではなくあくまでも例示をするために提供されている以下の実施例の中でより明確になるだろう。
【実施例】
【００９４】
熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の選択
発明者らは、仏国特許出願第０５０５９３５号明細書の中に記述されているＴＨＲと呼ばれる熱安定性タンパク質変異体を直接選択するための方法を開発した。
【００９５】
前記方法は、増大した熱安定性をもつヒトＩＦＮγ変異体とカナマイシン耐性タンパク質変異体との間の融合タンパク質を調製することに基づいている（カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼのこの２重突然変異体については、リアオ（Ｌｉａｏ）、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」、１９９３年、第１５号、２８６〜９２頁の中で記述されている）。ヒトＩＦＮγ変異体のライブラリは、仏国特許第２８１３３１４号明細書中で記述されているＭａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ（登録商標）の方法によって調製され、テルモス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌株ＨＢ２７の中で高温で形質転換された。前記ライブラリからの形質転換されたクローンは、（野生型ＩＦＮγ）−ＫＮＴアーゼ融合タンパク質の生産がもはや細胞成長を可能にしない増大するカナマイシン濃度で選択された。理論的には、前記条件下で得られたクローンには、２００５年６月１０日に出願された仏国特許出願第０５０５９３５号明細書中で記されている通り、高温での増大した安定性が付随する。選択されたクローン上に担持された突然変異は、表１内に列挙されている。この第１の選択において単離された異なる突然変異体は、再び個別に形質転換され、その耐性レベルは野生型構成体と比較された。このようにして、つねに野生型よりは大きい様々な耐性度を付与する２１の突然変異体が確認された（表２）。
【００９６】
ＩＦＮγ点突然変異体の系統的生成
さらに、発現クローンｐＯＲＦ／ＩＦＮγから出発して、（基準として配列番号６を用いて）いわゆる野生型ＩＦＮγ位置との関係において１つそしてただ１つだけのアミノ酸差異を有する一連の大きなＩＦＮγ点突然変異が生成された。
【００９７】
ＩＦＮγ変異体の機能分析
この選択方法により選択されるか又はＩＦＮγの全ての位置で系統的に生成されたヒトＩＦＮγ変異体を、ＣＯＳ７動物細胞の中で一過的に発現させた。これらのタンパク質を培養上清中で分泌させた。前記変異体の活性の安定性及び保存性を評価するために、ＣＯＳ７細胞培養上清を５９℃で１０分間熱変性に付した。次にこれらのタンパク質（変性又は未変性）を、ルシフェラーゼリポータ遺伝子を含有するトランスフェクションを受けたＨｅＬａ細胞に対し作用させた。１６時間の刺激後、各々の突然変異及び各々の条件について、ＩＦＮγ活性に対応するホタルルシフェラーゼシグナルを測定した。研究中のタンパク質についての熱変性後の残留活性を計算した（残留活性＝変性活性／未変性活性×１００）後で、それから、未変性タンパク質によって誘発された活性を、前記同じ変性タンパク質によって誘発された活性と比較した。未変性変異体の基底活性も、突然変異を受けていないＩＦＮγのものと比較した。
【００９８】
実験の詳細：
分子生物学：
プラスミド構成体
ＴＨＲ系：使用したベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＴ．サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）複製起源、大腸菌中で形質変換体を選択するためのアンピシリン耐性遺伝子、大腸菌及びＴ．サーモフィラスの両方において活性であるプロモータ（ｐｓｌｐＡプロモータ）の制御下で熱安定性ＫＮＴアーゼをコードする遺伝子を含んでいた。図１を参照のこと。（１４６個のアミノ酸を含有する成熟形態についてコードする、配列番号５）ＩＦＮγヌクレオチド配列を、ＫＮＴアーゼのＮ末端側でベクターのＮｃｏＩとＮｏｔＩ部位との間でクローニングさせた。ＩＦＮγ−ＫＮＴアーゼ融合を、ペプチド配列ＡＡＡＧＳＳＧＳＩ（配列番号８）でリンカーペプチドにより分離させ、ヌクレオチド配列ＧＣＧ−ＧＣＣ−ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＧＧＴ−ＴＣＣ−ＡＴＣ（配列番号７）によりコードした。
【００９９】
真核細胞発現系：哺乳動物細胞内でＩＦＮγを発現させるために、ｐＯＲＦ／ＩＦＮγ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））を使用し、この中でハイブリッドプロモータＥＦ−１α−ＨＬＴＶ及び強ＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む発現カセット内にＩＦＮγをクローニングした。
【０１００】
基準ＩＦＮγ突然変異体の生産
文献中で記述された複数の熱安定性突然変異体を構築し、正の対照として使用した。これらは、次のものについてコードする：
− タンパク質ＩＦＮγＥ３０Ｃ／Ｓ９２Ｃ：ジスルフィド架橋を伴う突然変異体（溶融温度（ｍｔ）＋１５℃、ワシューツァ（Ｗａｓｃｈｕｔｇａ）ら、１９９６年）、
− タンパク質ＩＦＮγデルタ１０（タンパク質のＣ末端における最後の１０個のアミノ酸の欠失、改善された活性及び安定性、溶融温度＋７．５℃及び４倍に増大した抗ウイルス活性、スロドヴスキ（Ｓｌｏｄｏｗｓｋｉ）ら、１９９１年）。
【０１０１】
前記突然変異体を、仏国特許第２８１３３１４号明細書中で記述されているＭａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（登録商標）法によりｐＮＣＫ−ＩＦＮγ及びＰＯＲＦ−ＩＮＦγ中で生産させた。
【０１０２】
ＴＨＲ法により選択されたＩＦＮγ突然変異体のｐＯＲＦ−ＩＦＮγ内の生産
ＴＨＲ法により選択されたクローンの配列上で同定された突然変異に対応する単一の及び多数の突然変異を、仏国特許第２８１３３１４号明細書中で記述されたＭａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（登録商標）法によりｐＯＲＦ−ＩＦＮγ内に導入した。
【０１０３】
ｐＯＲＦ／ＩＦＮγ内の単一のＩＦＮγの系統的生成
全ての単一ＩＦＮγ変異体の系統的生成（すなわち、遺伝子コード中の他の１９個のアミノ酸による成熟野生型タンパク質のアミノ酸の置換）を仏国特許第２８１３３１４号明細書中で記述されている通りのＭａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（登録商標）法によりｐＯＲＦ／ＩＦＮγ中で実施した。
【０１０４】
ＴＨＲ法による熱安定性突然変異の選択
Ｍａｓｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（登録商標）により、ｐＮＣＫベクター中にクローニングされたＩＦＮγ変異体のライブラリを生産した。全ての位置（２１から１６６まで）で全ダイバーシチを導入した。その後ライブラリをサーマス・サーモフィラス菌株ＨＢ２７中で高温（７０℃）で形質転換し、２０又は４０μｇ／ｍｌのカナマイシン上（（野生型ＩＦＮγ）−ＫＮＴアーゼが細胞増殖を可能にしない条件）で選択した。選択培地上で成長したクローンを配列決定することにより同定された突然変異は、表１に列挙されている。この一次選択において単離した異なる突然変異体を次に個別に再度形質転換し、その耐性レベルを野生型構成体のものと比較した。このようにして、野生型よりもつねに大きいものの変動する耐性度を付与する２１の突然変異体を確認した（表２）。
【０１０５】
ＩＦＮγ突然変異体の安定性及び活性の機能的検証
全ての細胞培養試薬はインビトロジェン社由来のものであった。ＨｅＬａ細胞（ヒト類上皮癌細胞）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカグリーンモンキーＳＶ４０形質転換細胞）及びＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）を、それぞれダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）及びイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で標準培養条件（湿潤ＣＯ２５〜８％雰囲気内で３７℃）下で成長させた。全ての培地は供給業者の推奨事項に従って調製され、Ｌ−グルタミン類似体（グルタマックス）を含有していた。実験に応じて、培養及びトランスフェクション段階については１０％の最終濃度で、かつ生産段階についてはより低い百分率の濃度で、除補体したウシ胎存血清（ＦＣＳ）を、そして抗生物質（ＨｅＬａ及びＣＯＳ７細胞については１００単位／ｍｌのペニシリンと０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンそしてＣＨＯ細胞については５０単位／ｍｌのペニシリン及び０．０５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を、培地に補足した。ＳＶ４０早期プロモータの制御下でベータガラクトシダーゼを発現するｐＳＶ−ベータガル（商標）ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して、全てのトランスフェクション効率を正規化した。
【０１０６】
ＣＯＳ７哺乳動物細胞中のヒトＩＦＮγ突然変異体の発現
天然又は突然変異体ｐＯＲＦ／ＩＦＮγ構成体でのＣＯＳ７細胞のトランスフェクションのために、細胞が９０％の集密性に達した時点で細胞をトリプシン処理し、次に（表面接着後に約２５％の集密性を得るため）１／４の比で再度播腫した。細胞が７０〜８０％の集密性に達した時点で１ウェルあたり３０，０００〜６０，０００個の細胞を用いて、２４ウェルのマイクロタイタープレート中でＣＯＳ７細胞をトランスフェクトした。５というＪｅｔＰＥＩ／ＤＮＡ比で室温にて３０分間およそ５０ｎｇのＤＮＡ及びＪｅｔＰＥＩ（ポリプラス（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）トランスフェクション）を用いて、トランスフェクションを実施した。２４時間のトランスフェクションの後、培地（５００μｌのＩＭＤＭ＋ＦＣＳ＋抗生物質）を交換した。トランスフェクションからＴ＝２４時間後に、（約０．５−１μｇ／ｍｌの発現レベルで）ＩＦＮγを含有する上清を回収し、等分し、ＩＦＮγ活性検定の間−２０℃で保管した。
【０１０７】
ＣＨＯ哺乳動物細胞中でのヒトＩＦＮγ突然変異体の発現
天然又は突然変異体ｐＯＲＦ／ＩＦＮγ構成体でのＣＨＯ細胞のトランスフェクションのために、細胞が８０％の集密性に達した時点で細胞をトリプシン処理し、次に（表面接着後に約３３％の集密性を得るため）１／３の比で再度播腫した。細胞が７０％の集密性に達した時点でＴ７５フラスコ中で１フラスコあたり４・１０６個の細胞を用いて、細胞をトランスフェクトした。５というＪｅｔＰＥＩ／ＤＮＡ比で室温にて３０分間およそ８ｎｇのＤＮＡ及びＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓトランスフェクション）を用いて、トランスフェクションを実施した。２４時間のトランスフェクションの後、培地（１０ｍｌのＩＭＤＭ＋２．５％のＦＣＳ＋抗生物質）を除去した。細胞を１×ＰＢＳで簡単に洗浄し、培地をＩＭＤＭ＋構成物質で置換し、付加的なＦＳＣは加えなかった。トランスフェクションからＴ＝４８時間後に、（約０．５−１μｇ／ｍｌの発現レベルで）ＩＦＮγを含有する上清を回収し、等分し、ＩＦＮγ活性検定の間−２０℃で保管した。
【０１０８】
野生型及び変異体ヒトＩＦＮγの定量化
ＩＦＮγの総量を決定するための基準ＥＬＩＳＡキットは、クリニサイエンシーズ（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ）（＃８８−７３１６−８６）製であった。もう１つの市販のＥＬＩＳＡキット（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）＃ＫＨＣ４０２１）で前記同じタンパク質を定量化することにより、このＥＬＩＳＡキット内で使用される抗体が、非突然変異体天然分子と我々の変異体を同じ要領で認識することが確認された。
【０１０９】
一次活性試験
ＩＦＮγがＨｅＬａ細胞上のＩＦＮγレセプタを特異的に活性化することが先に示された。ＨｅＬａ細胞中のＪａｋ／Ｓｔａｔ１経路のＩＦＮγ媒介型刺激は、結果として、特にＧＡＳ（ガンマ活性化部位）配列を含むプロモータの制御下で遺伝子を転写活性化する。このようにして、複数のＧＡＳ部位（ストラタジーンからのプラスミドｐＧＡＳ／ルシフェラーゼ）を含有するプロモータの下流側でルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼ）がクローニングされるリポータ遺伝子系でＨｅＬａ細胞をトランスフェクトすることによってＩＦＮγ変異体の活性を測定し比較することが可能である。
【０１１０】
ｐＧＡＳ／ルシフェラーゼでのＨｅＬａ細胞の一過性トランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、それらが９０％の集密性に達した時点でトリプシン処理し、その後１／３の比率で再播種した。５０〜８０％の集密性でのＨｅＬａ細胞のトランスフェクションを、供給業者のプロトコルに従って、９６ウェルのマイクロタイタープレート内で実施した。１ウェルにつき２０，０００の細胞を、５というＪｅｔＰＥＩ／ＤＮＡ比でおよそ１５０ｎｇのｐＧＡＳ／ルシフェラーゼＤＮＡ及びＪｅｔＰＥＩでトランスフェクトし、次に３０秒間ボルテックスし３０分間室温に放置した。その後、プレートの各ウェル内にＤＮＡ／ＪｅｔＰＥ１混合物を２０マイクロリットルを等分し、このようにトランスフェクトされた細胞を２４時間３７℃で５％のＣＯ２雰囲気中で培養した。
【０１１１】
熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の一次スクリーニング
ＩＦＮγ変異体（未変性タンパク質）／（野生型タンパク質）の合計基底活性の測定：
ＩＦＮγを含有するＣＯＳ７細胞上清を１対１００で希釈し、１０μｌのこれらの希釈物を、ｐＧＡＳ／ルシフェラーゼでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞に添加した。プレートを５％ＣＯ２雰囲気下において３７℃で１６時間インキュベートして、ホタルルシフェラーゼの細胞質発現を可能にし、その後細胞ペレットを回収し凍結させた。５０マイクロリットルのＧｌｏ溶解緩衝液（商標）（プロメガ）を添加して細胞を溶解させた（ＩＦＮγによる特異的刺激に応えて生産されたルシフェラーゼを放出するべく室温で攪拌しながら１０分間）。Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（商標）試薬（プロメガ）を添加することによって活性を測定し、蓄積されたルシフェラーゼの数量を照度計（ＦＬＸ×８００、バイオテックインストルメント（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ））上で計数した。粗ＩＦＮγ活性は、ＲＬＵ（相対ルシフェラーゼ単位）で発現される。各変異体（未変性）の合計活性（野生型タンパク質との関係における）を、５つの異なる実験（最低でデュプリケート）からのデータの平均として、最低２つの独立したトランスフェクションからの培養上清について、計算した。エラーバーは、標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）により計算した。合計活性データを提示するための１つの方法は、各トランスフェクションについて同じ条件で発現された非突然変異体ＩＦＮγの基底活性の百分率として各変異体の基底活性を報告することにある。
【０１１２】
ルシフェラーゼリポータ遺伝子を用いた熱変性後の変異体の残留活性の測定
リポータ遺伝子を用いた一次活性試験について先に記述した通り、場合に応じて１０分間５９℃での熱変性処理に付されたか又は未処理で放置されたＩＦＮγを含有するＣＯＳ７細胞上清の１／１００希釈物１０μｌで細胞を刺激した後、ルシフェラーゼの数量を測定した。熱変性の後残留する各変異体の活性の画分を表現する１つの方法は、変性前の同じ変異体の基底活性の百分率として定義づけされる各変異体が保っている残留活性を計算することにある。変性前の合計活性との関係における残留活性を、５つの異なる実験（最低デュプリケート）からのデータの平均として、かつ最低２つの独立したトランスフェクションからの培養上清について計算した。エラーバーは、標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）のための公式を用いて計算した。
【０１１３】
ＩＦＮγ変異体のための改善指数の測定（熱安定性及び／又は活性の改善）
問題のＩＦＮγ変異体が改善された熱安定性を示すと同時に少なくとも部分的にタンパク質の固有活性を保ったということを確認した時点で、前処理後の変異体の残留活性にその活性（前処理なし）を乗じた積を計算することができた。この指数から、熱安定性の利得及び相対的活性損失を知り、ひいてはタンパク質の予想されるインビボ効果を知ることができる。非突然変異体ＩＦＮγについて３７そして文献のデルタ１０突然変異体について約７６の指数という値は、基準タンパク質を用いて得られたものである。
【０１１４】
一次スクリーニングの完了時点で、図２〜６に示されているように、突然変異を受けていないヒトＩＦＮγと比べ改善された熱安定性及び／又は活性をもつ一連のヒトＩＦＮγ変異体が同定された。
【０１１５】
熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の２次スクリーニング−インビトロ半減期の測定
一次スクリーニングにおいて同定された大部分の熱安定性ＩＦＮγ変異体の固有の安定性の改善を比較する目的で、５９℃での熱変性時間の関数としてＩＦＮγ変異体の活性の変動を追跡するべく２次スクリーニングを実践した。このようにして、５９℃で５０％だけ初期ＩＦＮγ活性を低減させるのに必要な変性時間に対応する、本明細書で「インビトロ半減期」と呼ばれる５９℃での半減期が決定された。この半減期は、特に以下のパラメータ全てを制御することによって決定された。すなわち１０００ｐｇ／ｍｌの同じＩＦＮγ出発濃度、変性すべき最終試料内の０．１５％に調整された同等の血清ＦＣＳ濃度、及び１０分毎に試料を採取して３０分間の５９℃の変性温度。
【０１１６】
ＣＨＯ細胞上清内のＩＦＮγ濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。その後これらの異なるＩＦＮγ変異体群をＩＭＤＭ培地＋０．１５％ＦＣＳ中で１０００ｐｇ／ｍｌまで希釈させた。０、１０、２０及び３０分間５９℃で熱変性前処理を受けるように希釈物を等分した。前処理した希釈物１０マイクロリットルを、先に記述した通りのｐＧＡＳ／ルシフェラーゼでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞から１００μｌ／培地に添加した。５％ＣＯ２雰囲気中に３７℃で１６時間置いた後、細胞ペレットを溶解させ、ルシフェラーゼを先に記述した通りに定量化した。
【０１１７】
データを提示する１つの方法は、ＩＦＮγ変異体による形質導入経路の特異的刺激に対応する粗活性を報告することであり、この粗活性はＲＬＵ（相対ルシフェラーゼ単位）で表現される。各変異体の熱変性後に保たれている活性の画分（残留活性とも呼ばれる）を提示するもう１つの方法は、各変性時間について、変性前の同じ変異体の基底活性との関係において保たれた残留活性の百分率を計算することである。これらの計算はトランスフェクションを受けていない細胞からシグナルを差引いた後に行なわれた。
【０１１８】
このようにして決定された各変異体の半減期を次に野生型ＩＦＮγのものと比較した。半減期（Ｔ１／２）は分単位で表現され、以下の公式を用いて計算される：
Ｔ１／２＝ｌｎ（２）／（ｋ 不活性化）
なお式中ｋ 不活性化というのは、不活性段階の速度定数である。
【０１１９】
前記定数は以下の公式に従って各時点の瞬間的不活性化速度の平均に基づいて計算される：
Ｌｎ Ａ（ｔ）＝ｌｎ ｂ−ｔ＊ （ｋ 不活性化）
なお式中、Ａ（＋）は、時点ｔにおけるＩＦＮγ活性であり、ｂは定数である。
【０１２０】
従って、要約すると、図７に提示され表３でまとめられている本明細書で計算された「インビトロ」半減期は、各ＩＦＮγ変異体の最大活性の半分が保存されていた時間に対応する。
【０１２１】
表３中に提示されているもう１つのパラメータは、同じ条件下で生産された非突然変異体野生型分子との関係における各変異体の半減期の改善比率である。このパラメータの値が高ければ高いほど、非突然変異体ヒトＩＦＮγのものと比べた変異体の「インビトロ」半減期の改善は大きくなる。
【０１２２】
このようにして、この２次スクリーニングの完了時点で、図７及び表３に要約されているように２００〜１．４倍の率でそのインビトロ半減期の顕著な改善を示す１６のＩＦＮγ突然変異体が単離された。
【０１２３】
マウスにおける熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の薬物動態パラメータの測定
熱安定性ＩＦＮγ変異体のこれらの記述的な薬物動態研究は、生物学的半減期又は最終半減期（「インビボ半減期」とも呼ばれる）、ならびに異なる投与経路（静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）注射）についての曲線下面積を決定することを目的としていた。これらのデータは次に、哺乳動物細胞内で生産された野生型ＩＦＮγについて得られたデータ、及び市販の分子、換言すると偽「アクティミューン」の特徴を示す大腸菌内で生産された標準的組換え型ＩＦＮγの場合に得られるデータと比較された。
【０１２４】
生物学的半減期の測定は数多くの方法で実施された：すなわち、ルーテンフランツ（Ｒｕｔｅｎｆｒａｎｚ）ら、（「Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．」１９９０年、第１０巻、３３７〜３４１頁）により記述されている１つの方法は、週令８週のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける静脈内及び筋内注射を使用した。
【０１２５】
半減期は、抗ウイルス活性試験によって直接、マウス血清（水疱性口内炎ウイルスつまりＶＶＳに感染したＨｅｐ２細胞）について測定された。この実施例では、マウス血清中のＩＦＮγレベルを検出するための代替案としてＥＬＩＳＡを使用した。
【０１２６】
クルース（Ｃｒｏｏｓ）及びロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）（「Ｊ．Ｐｈａｒｍ．」、１９９３年、第４５巻、６０６６０９頁）により記述されているもう１つの方法は、放射性標識を用い、皮下注射の後の雌のスプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの組織中のその吸収及び血清中のそのレベルを追跡した。血液及び組織標本を、それらが含有する放射性標識されたＩＦＮγの量について分析した。
【０１２７】
ＩＦＮの薬物動態パラメータを決定するためのＥＬＩＳＡ方法の使用は、ロスタン（Ｒｏｓｔａｉｎｇ）ら、（１９９８年）、「Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．」第９号（１２）：２３４４〜４８頁により皮下投与の後、及びメリムスキ（Ｍｅｒｉｍｓｋｙ）ら、（１９９１年）、「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」第２７号（５）］によって筋内投与の後のＩＦＮアルファについて記述されてきた。
【０１２８】
野生型及び突然変異体ＩＦＮγを、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞中で発現させた。培養上清を１０分間４０００ｒｐｍで２度目に遠心分離し、次にＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＥＳ０．２２μｍフィルタ上でろ過した。５０００ダルトンのカットオフでビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）ろ過ユニット（サートリアス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））上での遠心分離によって、ろ過された上清を濃縮した。次にＩＦＮγ濃度を、先に適合させた希釈物を用いることによって試料について決定した。
【０１２９】
野生型及び突然変異体ＩＦＮγを次の２つの要領で投与した：
− Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾静脈内への１０μｇ／ｍｌのＩＦＮγ溶液１００μｌの注入；
− 又は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胃内への６．７μｇ／ｍｌのＩＦＮγ溶液１００μｌの皮下注入。
【０１３０】
これらの実験では、体重２０〜３０グラムで週令８週目のＣ５７ＢＬ／６Ｊを使用した。動物を、２４．１℃の一定温度、５５％の一定湿度でかつ昼夜１２時間サイクルで一週間室内にて順応させた。
【０１３１】
対象の分子の投与後異なる時点で血液試料を収集した。３、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８及び１９２時間目に後眼窩試料を採取し、２１６時間という最終時点で死後心臓試料を採取した。
【０１３２】
室温で２０分間血液を凝固させることそして２０℃で２０分間５０００ｇでの遠心分離の上清に対応する画分を回収することによって血清を調製した。次に、血清を単離し先に記述したＥＬＩＳＡ検定によるＩＦＮγ活性の測定まで−８０℃で保管した。
【０１３３】
各々のマウス血清においてＥＬＩＳＡにより検出されたＩＦＮγの数量を追跡することによって、血漿ＩＦＮγ濃度を経時的に測定した。各々の後眼窩試料について、３匹のマウスからの少なくとも３つの異なる血清の平均としてＩＦＮγを定量化した。これらの異なる薬物動態実験を、異なるトランスフェクション由来のＩＦＮγを用いて少なくとも２回、各々の変異体について実施した。次に経時的な血清中のＩＦＮγ濃度を報告した。パラメータ〔Ｔ１／２ｉ．ｖ．、ＡＵＣｉ．ｖ．，〕〔Ｔ１／２ｓｃ及びＡＵＣｓｃ〕を、それぞれ「静脈内ボーラス非コンパーメント」及び「脈管外ボーラス」薬物動態分析モデルを用いて、Ｋｉｎｅｔｉｃａソフトウェア（Ｖｓ４．４．１．サーモエレクトロン（株）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｃ．））を利用して計算した。
【０１３４】
表４及び５に提示されているもう１つのパラメータは、同じ条件で生産された非突然変異体野生型分子のそれぞれのパラメータとの関係における、及びかかるデータが入手可能である場合には細菌組換え型ヒトＩＦＮγのそれぞれのパラメータとの関係における、各変異体についての半減期又は曲線下面積の改善比率である。これらの比率が高くなればなるほど、非突然変異体ヒトＩＦＮγのものと比べた変異体における改善が大きくなる。
【０１３５】
これらの実験結果及びその分析は、静脈内注射の場合は図８及び表４に、そして皮下注射については図９及び表５で提示されている。
【０１３６】
突然変異Ｓ６３Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びその組合せが、ＣＨＯにおいて生産された組換え型ヒトＩＦＮγのもの及び細菌内で生産された組換え型ヒトＩＦＮγのものに比べたこれらの変異体のインビボ半減期の顕著な改善を結果としてもたらしたということがわかる。皮下投与の後、２重突然変異体は、ＣＨＯ細胞内で生産された組換え型ヒトＩＦＮγのものと比べたこれらの薬物動態パラメータの顕著な改善を再び示した。
【０１３７】
【表１】
【０１３８】
【表２】
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
【表５】
【０１４２】
表１：テルモス・テルモフィラス中でＩＦＮγライブラリの一次選択において同定された突然変異体。数字は、１６６残基前駆体内の突然変異の位置に対応する。
表２：テルモス・テルモフィラスの中で２次選択試験により検証された突然変異体。数字は、１６６−残基前駆体内の突然変異の位置に対応する。
表３：５９℃での熱変性研究における熱安定性ＩＦＮγ変異体についての「インビトロ」半減期計算及び、ＣＨＯ中で生産された野生型ＩＦＮγの半減期と比べた、変異体半減期の改善比の計算のまとめ。
表４：静脈内注射研究中の熱安定性ＩＦＮγ変異体についての熱除去半減期計算及びＣＨＯ中で生産された野生型ＩＦＮγの半減期に比べた変異体半減期の改善比の計算のまとめ。非コンパートメントＩＶボーラスモデルを用いたＫｉｎｅｔｉｃａ Ｖｓ ４．４ソフトウェアを利用して、最終除去半減期（Ｔ１／２、静脈内）を計算した。
表５：皮下注射研究中の合計曲線下面積（ＡＵＣｔｏｔ．ｓ．ｃ．）及び除去半減期（Ｔ１／２ｓ．ｃ．）のまとめ。ＣＨＯ中で生産された野生型ＩＦＮγの総ＡＵＣ及び半減期と比べた変異体の総ＡＵＣ及び半減期の改善比の計算。これらのパラメータは、Ｋｉｎｅｔｉｃａ Ｖｓ ４．４ソフトウェアを利用して計算された。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】突然変異体ライブラリを生成するため及びテルモス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中でのその選定のために用いられるｐＮＣＫベクター。
【図２】テルモス・テルモフィラスにより選択されたＩＦＮγ単一突然変異体のための機能分析データ：すなわち、熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型と比べた相対的合計活性）／１００によって定義づけられる改善指数（図版Ｃ）。
【図３】テルモス・テルモフィラスにより選択された２重及び多重位置に由来するＩＦＮγ単一突然変異体についての機能分析データ：すなわち熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型と比べた相対的合計活性）／１００により定義づけられる改善指数（図版Ｃ）。
【図４】安定性及び／又は活性が改善された、系統的に生成されたＩＦＮγ単一点突然変異体の機能分析データの第１の部分−熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型に比べた相対的合計活性）／１００により定義づけされる改善指数（図版Ｃ）。
【図５】安定性及び／又は活性が改善された、系統的に生成されたＩＦＮγ単一点突然変異体の機能分析データの第２の部分−熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型に比べた相対的合計活性）／１００により定義づけされる改善指数（図版Ｃ）。
【図６】安定性及び／又は活性が改善された、系統的に生成されたＩＦＮγ単一点突然変異体の機能分析データの第３の部分−熱安定性分析（残留活性％、図版Ａ）、野生型タンパク質と比べた相対的合計活性（図版Ｂ）及び積（残留活性×野生型に比べた相対的合計活性）／１００により定義づけされる改善指数（図版Ｃ）。
【図７】調整されたＦＣＳ濃度の存在下５９℃での熱変性動態研究においてインビトロ半減期を測定することによるヒトＩＦＮγタンパク質変異体の熱安定性評価。測定は、５９℃での変性時間の関数として保存されたＩＦＮγの量を追跡することからなる。これらのデータは、これらの条件下でこれらの分子の「インビトロ半減期」を計算するために使用された。半減期計算は、表３中に提示されている。
【図８】静脈内投与後の熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の薬物動態プロファイル。ＩＦＮγレベルは、１００μｌの１０μｇ／ｍｌ溶液を静脈内注射した後Ｃ５７ＢＬ／６マウスから収集した血清についてＥＬＩＳＡにより監視された。
【図９】皮下投与後の熱安定性ヒトＩＦＮγ変異体の薬物動態プロファイルの例。ＩＦＮγ血漿濃度は、１００μｌの６．７μｇ／ｍｌ溶液の皮下注射の後Ｃ５７ＢＬ／６マウスから収集した血清についてＥＬＩＳＡにより定量化された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群から選択された少なくとも１つの第１の置換を含む、ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の熱安定性変異体又はその機能的フラグメントを含む医薬組成物であって、前記指示された位置が配列番号２の位置に対応し、前記変異体が第１の置換により導入された残基に付着した非ペプチド部分を含有していない、医薬組成物。
【請求項２】
前記変異体が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、配列番号２、４及び６の配列の中から選択された配列を有するポリペプチドと異なっている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記変異体が単一の置換を有する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記変異体が、Ｍ１５７Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１００Ｎからなる群の中から選択された少なくとも１つのその他の置換をさらに含み、指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記変異体が、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｍ１５７Ｃ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された２つの置換の組合せを含むか又は有しており、前記指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記変異体が、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ６２Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｅ６２Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ６２Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｄ９９Ｙ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ７４Ｇ、Ｄ９９Ｙ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１００Ｎ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｄ９９Ｙ＋Ｎ５８Ｒ、Ｄ９９Ｙ＋Ｔ９５Ｖ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ７４Ｇ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ７４Ｇ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ７４Ｇ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ７４Ｇ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｇ４１Ｓ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｇ４１Ｓ、Ｎ５８Ｒ＋Ｔ９５Ｖ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１００Ｎ、Ｎ５８Ｒ＋Ｇ４１Ｓ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ＋Ｇ４１Ｓ、Ｍ１５７Ｃ＋Ｍ１００ＮおよびＭ１５７Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有しており、前記指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記変異体が、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有しており、前記指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記変異体が組合せＳ６３＋Ｇ４１Ｓを含むか又は有しており前記指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記変異体がＣ末端において１〜１１個の残基の欠失を有していない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記変異体がＣ末端において１〜１１個の残基の欠失を有している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記変異体が、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有していない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記変異体が、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記非ペプチド分子が重合体分子、好ましくはポリエチレングリコールである、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記変異体がグリコシル化されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記変異体がグリコシル化されていない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つのその他の作用物質をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのその他の活性作用物質が、抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬からなる群の中から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのその他の活性作用物質がインターフェロンアルファ又はベータである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
経口、非経口（例えば皮下、筋内、静脈内又は皮内）、舌下、局所、局部、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、眼球内又は耳介内投与向けに処方されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
薬剤としての請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
抗ウイルス性、抗増殖性、又は免疫調節性薬剤としての同時、逐次又は分離使用のために設計された複合製剤用のもう１つの活性作用物質と請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む製品。
【請求項２２】
前記その他の活性作用物質が、抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬からなる群の中から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記その他の活性作用物質がインターフェロンアルファ又はベータである、請求項２２に記載の製品。
【請求項２４】
前記２つの活性作用物質が同じ投与経路又は２つの異なる投与経路により投与されている、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２５】
前記薬剤が、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血性ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状を治療するために設計されている、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２６】
抗ウイルス性、抗増殖性又は免疫調節性薬剤を調製するための請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２７】
前記薬剤が、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血性ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状を治療するために設計されている、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の熱安定性ＩＦＮγ変異体をコードする核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の核酸の発現カセット。
【請求項３０】
請求項２８に記載の核酸又は請求項２９に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項３１】
請求項２８に記載の核酸、請求項２９に記載の発現カセット又は請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の熱安定性ＩＦＮγ変異体を生産することを目的とした、請求項２８に記載の核酸、請求項２９に記載の発現カセット、請求項３０に記載のベクター又は請求項３１に記載の細胞の使用。
【請求項１】
Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ及びＴ９５Ｖからなる群から選択された少なくとも１つの第１の置換を含む、ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の熱安定性変異体又はその機能的フラグメントを含む医薬組成物であって、前記指示された位置が配列番号２の位置に対応し、前記変異体が第１の置換により導入された残基に付着した非ペプチド部分を含有していない、医薬組成物。
【請求項２】
前記変異体が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の残基分だけ、配列番号２、４及び６の配列の中から選択された配列を有するポリペプチドと異なっている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記変異体が単一の置換を有する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記変異体が、Ｍ１５７Ｃ、Ｇ４１Ｓ及びＭ１００Ｎからなる群の中から選択された少なくとも１つのその他の置換をさらに含み、指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記変異体が、Ｓ６３Ｃ、Ｅ６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ、Ｄ９９Ｙ、Ｅ１１６Ｃ、Ｌ１５８Ｃ、Ｓ７４Ｇ、Ｒ１６２Ｃ、Ｓ１２２Ｄ、Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ、Ｎ５８Ｒ、Ｔ９５Ｖ、Ｍ１５７Ｃ及びＧ４１Ｓからなる群の中から選択された２つの置換の組合せを含むか又は有しており、前記指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記変異体が、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ６２Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｅ６２Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ６２Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｆ１５９Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｄ９９Ｙ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ７４Ｇ、Ｄ９９Ｙ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１００Ｎ、Ｄ９９Ｙ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｄ９９Ｙ＋Ｎ５８Ｒ、Ｄ９９Ｙ＋Ｔ９５Ｖ、Ｄ９９Ｙ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｄ９９Ｙ＋Ｇ４１Ｓ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｅ１１６Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１５８Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ７４Ｇ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ７４Ｇ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ７４Ｇ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ７４Ｇ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ７４Ｇ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ７４Ｇ＋Ｇ４１Ｓ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｒ１６２Ｃ＋Ｇ４１Ｓ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ１２２Ｄ＋Ｇ４１Ｓ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｎ５８Ｒ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｔ９５Ｖ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｍ１００Ｎ、Ｌ１２６Ｐ＋Ｇ４１Ｓ、Ｎ５８Ｒ＋Ｔ９５Ｖ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｎ５８Ｒ＋Ｍ１００Ｎ、Ｎ５８Ｒ＋Ｇ４１Ｓ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｔ９５Ｖ＋Ｍ１００Ｎ、Ｔ９５Ｖ＋Ｇ４１Ｓ、Ｍ１５７Ｃ＋Ｍ１００ＮおよびＭ１５７Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有しており、前記指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記変異体が、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｆ１５９Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｄ９９Ｙ、Ｓ６３Ｃ＋Ｅ１１６Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１５８Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ７４Ｇ、Ｓ６３Ｃ＋Ｒ１６２Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｓ１２２Ｄ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１００Ｎ、Ｓ６３Ｃ＋Ｌ１２６Ｐ、Ｓ６３Ｃ＋Ｎ５８Ｒ、Ｓ６３Ｃ＋Ｔ９５Ｖ、Ｓ６３Ｃ＋Ｍ１５７Ｃ、Ｓ６３Ｃ＋Ｇ４１Ｓからなる群の中から選択された置換の組合せを含むか又は有しており、前記指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記変異体が組合せＳ６３＋Ｇ４１Ｓを含むか又は有しており前記指示された位置が配列番号２の位置に対応する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記変異体がＣ末端において１〜１１個の残基の欠失を有していない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記変異体がＣ末端において１〜１１個の残基の欠失を有している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記変異体が、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有していない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記変異体が、重合体分子、親油性分子及び有機誘導体化剤からなる群の中から選択された非ペプチド部分を含有している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記非ペプチド分子が重合体分子、好ましくはポリエチレングリコールである、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記変異体がグリコシル化されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記変異体がグリコシル化されていない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つのその他の作用物質をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのその他の活性作用物質が、抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬からなる群の中から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのその他の活性作用物質がインターフェロンアルファ又はベータである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
経口、非経口（例えば皮下、筋内、静脈内又は皮内）、舌下、局所、局部、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、眼球内又は耳介内投与向けに処方されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
薬剤としての請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
抗ウイルス性、抗増殖性、又は免疫調節性薬剤としての同時、逐次又は分離使用のために設計された複合製剤用のもう１つの活性作用物質と請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む製品。
【請求項２２】
前記その他の活性作用物質が、抗体、抗腫瘍薬又は化学療法剤、グルココルチコイド、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ホルモン、抗アレルギー薬、ワクチン、気管支拡張剤、ステロイド、ベータアドレナリン作動薬、免疫調節剤、サイトカイン例えばインターフェロンアルファ又はベータ、インターロイキン１又は２、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ヒドロキシウレア、アルキル化剤、葉酸拮抗薬、核酸代謝拮抗物質、紡鐘体毒、抗生物質、ヌクオレチド類似体、レチノイド、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、フマル酸及びその塩、鎮痛剤、鎮痙薬及びカルシウム拮抗薬からなる群の中から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記その他の活性作用物質がインターフェロンアルファ又はベータである、請求項２２に記載の製品。
【請求項２４】
前記２つの活性作用物質が同じ投与経路又は２つの異なる投与経路により投与されている、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２５】
前記薬剤が、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血性ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状を治療するために設計されている、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２６】
抗ウイルス性、抗増殖性又は免疫調節性薬剤を調製するための請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２７】
前記薬剤が、ぜん息、慢性家族性肉芽腫症、特発性肺線維症、非定型抗酸菌感染症、腎臓癌、大理石骨病、全身性強皮症、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎、敗血性ショック、アレルギー性皮膚炎及び関節リウマチからなる群の中から選択された病状を治療するために設計されている、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の熱安定性ＩＦＮγ変異体をコードする核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の核酸の発現カセット。
【請求項３０】
請求項２８に記載の核酸又は請求項２９に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項３１】
請求項２８に記載の核酸、請求項２９に記載の発現カセット又は請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の熱安定性ＩＦＮγ変異体を生産することを目的とした、請求項２８に記載の核酸、請求項２９に記載の発現カセット、請求項３０に記載のベクター又は請求項３１に記載の細胞の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５２９０２７（Ｐ２００９−５２９０２７Ａ）
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５７８０１（Ｐ２００８−５５７８０１）
【出願日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０１９４９
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５０８２７０８３１）
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＴＨＯＤＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０１９４９
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５０８２７０８３１）
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＴＨＯＤＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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