ヒトインターロイキン−２受容体ガンマ鎖遺伝子からのＤＮＡ標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型及びその使用
2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有し、変異型が、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型。X連鎖重症複合型免疫不全の予防及び治療のための該変異型及び派生生成物の使用。
Notice: Undefined index: DEJ in /mnt/www/gzt_disp.php on line 298
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ少なくとも2つの置換を有し、変異型が、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列を切断でき、かつ少なくとも以下の：
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、及び／又は
(h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(i) 工程(g)及び／又は(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し、
(j) ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする
工程を含む方法により得ることができることを特徴とする、I-CreI変異型。
【請求項２】
前記方法が、(i) -2位〜+2位のヌクレオチドがヒトIL2RG遺伝子からの前記DNA標的配列の-2位〜+2位に存在するヌクレオチドと同一であり、(ii) -11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)のヌクレオチドが、ヒトIL2RG遺伝子からの前記DNA標的配列の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドと同一であり、(iii) +3位〜+11位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は-11位〜-3位(工程(h)の組み合わせ変異型)のヌクレオチドが、ヒトIL2RG遺伝子からの前記DNA標的配列の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドの逆相補配列と同一である偽パリンドローム配列を切断できる、工程(g)又は工程(h)で得られた組み合わせ変異型を選択／スクリーニングするさらなる工程を含む請求項1に記載の変異型。
【請求項３】
I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の前記置換が、44位、68位、70位、75位及び／又は77位に位置する請求項1又は2に記載の変異型。
【請求項４】
I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン内の前記置換が、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に位置する請求項1又は2に記載の変異型。
【請求項５】
前記置換が、元のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L及びVからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項６】
I-CreIの26位〜40位及び/又は44位〜77位に異なる変異を有する第1及び第2単量体の組み合わせにより得られるヘテロ二量体であり、前記へテロ二量体がヒトIL2RG遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できる請求項1〜5のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項７】
前記DNA標的が、配列番号5〜9及び116〜119の配列からなる群より選択される請求項6に記載の変異型。
【請求項８】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、及び44位、68位、70位、75位、77位に、KNSTQQ/NYSYQ及びSNSYRK/DNSNI、KHTCRS/QRDNR及びKNDYYS/QRSHY、KRANQE/YRSQI及びKNSCAS/NRSYN、KNSTQQ/RYSEY及びKNTYQS/DYSSR、KNSSRE/LRNNI及びKDSRTS/AYSYK、KNSRNQ/YRSDV及びKNSTAS/QYSRQ、KSSCQA/AYSYI及びKNTYWS/AYSYK、KNRDQS/DNSNI及びKNSTAS/AYSYKからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項7に記載の変異型。
【請求項９】
第1単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、65位、77位に、KNSRQY/RYSDT、KNSHQS/KYSEV、KNSRQS/RYSDT、KNSHQY/RYSDT、KNSHQY/KYSEV、KNSRQY/RYSEV、KNSHQY/RYSEVからなる群より選択されるアミノ酸を有し、第2単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、65位、77位に、KRTYQS/AYSER、KRSYQS/TRSER、KRSNQS/TYSER、KRSAQS/TRSER、KRSVQS/TRSER、KRSSQS/ RYSET及びKNGHQS/ TRSERからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項7に記載の変異型。
【請求項１０】
I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対する変異型の特異性を改変する1つ又は複数の置換を、I-CreIの137位〜143位に含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１１】
ヒト IL2RG遺伝子からのDNA標的配列に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改良する1つ又は複数の置換を、I-CreI配列全体に対して含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１２】
N2D、K4E、K7E、E8G、G19S、G19A、I24V、I24T、Q26R、Q31R、K34R、L39I、F43L、F43I、Q50R、R52C、F54L、K57R、V59A、D60G、V64A、G71R、S79G、E80K、E80G、K82R、F87L、T89A、K96R、K98R、K100R、N103Y、N103D、V105A、K107R、K107E、Q111R、E117G、E117K、K121R、F122Y、T127N、V129A、I132V、I132T、L135Q、K139R、T140A、T143I、T147A、D153G、S154G、S156R、E157G、K159E、K159R、K160G、S162F、S162P及びP163Lからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む請求項11に記載の変異型。
【請求項１３】
G19S、I24V、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む請求項12に記載の変異型。
【請求項１４】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、65位、77位並びに付加的な位置に：
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER +19S+59A+103Y+107R、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R又は KRTYQS/AYSER+24V (第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+80G+132V+139R (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R又はKRTYQS/AYSER+19S+59A+82R+111R+ 140A (第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+132V+139R (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+19S+59A+111R、KRTYQS/AYSER+19S+59A+103Y+107R、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R、KRTYQS/AYSER+19S+59A+82R+111R+ 140A又はKRTYQS/AYSER+24V (第2単量体)、
- KNSHQY/RYSEV+19S+132V、KNSHQY/RYSEV+19S+71R+132V+139R又はKNSHQY/RYSEV+19S+71R+132V (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+24V (第2単量体)、及び
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R又はKNSHQY/RYSEV+ 19S+132V (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+24V+132V、KRTYQS/AYSER+24V+80K、KRTYQS/AYSER+24V+54L、KRTYQS/AYSER+24V+87L、KRTYQS/AYSER+24V+105A又はKRTYQS/AYSER+24V+105A+132V (第2単量体)
からなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項9及び11〜13のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１５】
第1単量体及び第2単量体が、以下の配列の対：配列番号38と43; 配列番号39と44; 配列番号40と配列番号45; 配列番号41と配列番号46; 配列番号42と配列番号47; 配列番号120と121、配列番号122と123、配列番号124と125、配列番号126と127、並びに配列番号67〜100、140〜142 (第1単量体)と、配列番号101〜111、128〜139、143〜148及び156〜165のいずれか(第2単量体)から選択される請求項8、9及び11〜14のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１６】
2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、請求項15で規定される配列の1つと少なくとも95%の配列同一性を有する請求項1〜14のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１７】
核局在化シグナル及び／又はタグを含む請求項1〜16のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１８】
第1単量体及び第2単量体がそれぞれD137R変異及びR51D変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項6〜17のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１９】
第1単量体がE8R又はE8K及びE61R変異をさらに含み、第2単量体がK7E及びK96E変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項6〜17のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか1項に記載の1つの変異型の2つの単量体又はコアドメイン、或いはその両方の組み合わせを含む単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２１】
ペプチドリンカーで連結された請求項8、9、14及び15のいずれか1項で規定される第1及び第2単量体を含む請求項20に記載の単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２２】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の変異型又は請求項20若しくは21に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２３】
請求項22の少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクター。
【請求項２４】
それぞれが請求項6〜19のいずれか1項に記載のヘテロ二量体変異型の単量体の1つをコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む請求項23に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
ヒトIL2RG遺伝子に導入される配列と、請求項1、6及び7のいずれか1項で規定されるI-CreI 変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトIL2RG遺伝子配列に相同な配列とを含むターゲティング構築物を含む請求項23又は24に記載のベクター。
【請求項２６】
I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトIL2RG遺伝子配列に相同な前記配列が、配列番号3の250位〜449位、991位〜1190位、1116位〜1305位、1546位〜1745位、1597位〜1796位、2108位〜2307位、2860位〜3059位、2879位〜3078位又は3041位〜3240位を含むヒトIL2RG遺伝子のフラグメントである請求項25に記載のベクター。
【請求項２７】
導入される前記配列が、ヒトIL2RG遺伝子内の変異を修復する配列である請求項25又は26に記載のベクター。
【請求項２８】
前記変異を修復する配列が、野生型ヒト共通サイトカイン受容体ガンマ鎖の一部分をコードする請求項27に記載のベクター。
【請求項２９】
I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位に接するヒトIL2RG遺伝子の配列に相同な前記配列が、請求項28で規定される野生型ヒト共通サイトカイン受容体ガンマ鎖の一部分をコードする配列を含む請求項25又は26に記載のベクター。
【請求項３０】
前記変異を修復する前記配列が、ヒトサイトカイン受容体共通ガンマ鎖ORFと、3'の転写を停止するポリアデニル化部位とを含む請求項27に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項20若しくは21に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターを含む組成物。
【請求項３２】
請求項25〜30のいずれか1項で規定されるターゲティングDNA構築物を含む請求項31に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ターゲティングDNA構築物が、組換えベクターに含まれる請求項32に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項22若しくは24で規定される少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つのベクターにより改変された宿主細胞。
【請求項３５】
請求項22若しくは24で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３６】
請求項22若しくは24で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
【請求項３７】
請求項1〜19のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項20若しくは21に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、X連鎖重症複合型免疫不全の予防用の医薬品の製造のための使用。
【請求項３８】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項20若しくは21に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、非治療目的でのゲノム工学のための使用。
【請求項３９】
前記変異型、単鎖メガヌクレアーゼ又はベクターが、請求項25〜30のいずれか1項で定義されるターゲティングDNA構築物と組み合わされている請求項37又は38に記載の使用。
【請求項４０】
X連鎖重症複合型免疫不全の動物モデルを作製するための請求項38又は39に記載の使用。
【請求項１】
2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ少なくとも2つの置換を有し、変異型が、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列を切断でき、かつ少なくとも以下の：
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、及び／又は
(h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(i) 工程(g)及び／又は(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し、
(j) ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする
工程を含む方法により得ることができることを特徴とする、I-CreI変異型。
【請求項２】
前記方法が、(i) -2位〜+2位のヌクレオチドがヒトIL2RG遺伝子からの前記DNA標的配列の-2位〜+2位に存在するヌクレオチドと同一であり、(ii) -11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)のヌクレオチドが、ヒトIL2RG遺伝子からの前記DNA標的配列の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドと同一であり、(iii) +3位〜+11位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は-11位〜-3位(工程(h)の組み合わせ変異型)のヌクレオチドが、ヒトIL2RG遺伝子からの前記DNA標的配列の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドの逆相補配列と同一である偽パリンドローム配列を切断できる、工程(g)又は工程(h)で得られた組み合わせ変異型を選択／スクリーニングするさらなる工程を含む請求項1に記載の変異型。
【請求項３】
I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の前記置換が、44位、68位、70位、75位及び／又は77位に位置する請求項1又は2に記載の変異型。
【請求項４】
I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン内の前記置換が、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に位置する請求項1又は2に記載の変異型。
【請求項５】
前記置換が、元のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L及びVからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項６】
I-CreIの26位〜40位及び/又は44位〜77位に異なる変異を有する第1及び第2単量体の組み合わせにより得られるヘテロ二量体であり、前記へテロ二量体がヒトIL2RG遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できる請求項1〜5のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項７】
前記DNA標的が、配列番号5〜9及び116〜119の配列からなる群より選択される請求項6に記載の変異型。
【請求項８】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、及び44位、68位、70位、75位、77位に、KNSTQQ/NYSYQ及びSNSYRK/DNSNI、KHTCRS/QRDNR及びKNDYYS/QRSHY、KRANQE/YRSQI及びKNSCAS/NRSYN、KNSTQQ/RYSEY及びKNTYQS/DYSSR、KNSSRE/LRNNI及びKDSRTS/AYSYK、KNSRNQ/YRSDV及びKNSTAS/QYSRQ、KSSCQA/AYSYI及びKNTYWS/AYSYK、KNRDQS/DNSNI及びKNSTAS/AYSYKからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項7に記載の変異型。
【請求項９】
第1単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、65位、77位に、KNSRQY/RYSDT、KNSHQS/KYSEV、KNSRQS/RYSDT、KNSHQY/RYSDT、KNSHQY/KYSEV、KNSRQY/RYSEV、KNSHQY/RYSEVからなる群より選択されるアミノ酸を有し、第2単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、65位、77位に、KRTYQS/AYSER、KRSYQS/TRSER、KRSNQS/TYSER、KRSAQS/TRSER、KRSVQS/TRSER、KRSSQS/ RYSET及びKNGHQS/ TRSERからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項7に記載の変異型。
【請求項１０】
I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対する変異型の特異性を改変する1つ又は複数の置換を、I-CreIの137位〜143位に含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１１】
ヒト IL2RG遺伝子からのDNA標的配列に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改良する1つ又は複数の置換を、I-CreI配列全体に対して含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１２】
N2D、K4E、K7E、E8G、G19S、G19A、I24V、I24T、Q26R、Q31R、K34R、L39I、F43L、F43I、Q50R、R52C、F54L、K57R、V59A、D60G、V64A、G71R、S79G、E80K、E80G、K82R、F87L、T89A、K96R、K98R、K100R、N103Y、N103D、V105A、K107R、K107E、Q111R、E117G、E117K、K121R、F122Y、T127N、V129A、I132V、I132T、L135Q、K139R、T140A、T143I、T147A、D153G、S154G、S156R、E157G、K159E、K159R、K160G、S162F、S162P及びP163Lからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む請求項11に記載の変異型。
【請求項１３】
G19S、I24V、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む請求項12に記載の変異型。
【請求項１４】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、65位、77位並びに付加的な位置に：
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER +19S+59A+103Y+107R、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R又は KRTYQS/AYSER+24V (第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+80G+132V+139R (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R又はKRTYQS/AYSER+19S+59A+82R+111R+ 140A (第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+132V+139R (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+19S+59A+111R、KRTYQS/AYSER+19S+59A+103Y+107R、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R、KRTYQS/AYSER+19S+59A+82R+111R+ 140A又はKRTYQS/AYSER+24V (第2単量体)、
- KNSHQY/RYSEV+19S+132V、KNSHQY/RYSEV+19S+71R+132V+139R又はKNSHQY/RYSEV+19S+71R+132V (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+24V (第2単量体)、及び
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R又はKNSHQY/RYSEV+ 19S+132V (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+24V+132V、KRTYQS/AYSER+24V+80K、KRTYQS/AYSER+24V+54L、KRTYQS/AYSER+24V+87L、KRTYQS/AYSER+24V+105A又はKRTYQS/AYSER+24V+105A+132V (第2単量体)
からなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項9及び11〜13のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１５】
第1単量体及び第2単量体が、以下の配列の対：配列番号38と43; 配列番号39と44; 配列番号40と配列番号45; 配列番号41と配列番号46; 配列番号42と配列番号47; 配列番号120と121、配列番号122と123、配列番号124と125、配列番号126と127、並びに配列番号67〜100、140〜142 (第1単量体)と、配列番号101〜111、128〜139、143〜148及び156〜165のいずれか(第2単量体)から選択される請求項8、9及び11〜14のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１６】
2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、請求項15で規定される配列の1つと少なくとも95%の配列同一性を有する請求項1〜14のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１７】
核局在化シグナル及び／又はタグを含む請求項1〜16のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１８】
第1単量体及び第2単量体がそれぞれD137R変異及びR51D変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項6〜17のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１９】
第1単量体がE8R又はE8K及びE61R変異をさらに含み、第2単量体がK7E及びK96E変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項6〜17のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか1項に記載の1つの変異型の2つの単量体又はコアドメイン、或いはその両方の組み合わせを含む単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２１】
ペプチドリンカーで連結された請求項8、9、14及び15のいずれか1項で規定される第1及び第2単量体を含む請求項20に記載の単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２２】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の変異型又は請求項20若しくは21に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２３】
請求項22の少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクター。
【請求項２４】
それぞれが請求項6〜19のいずれか1項に記載のヘテロ二量体変異型の単量体の1つをコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む請求項23に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
ヒトIL2RG遺伝子に導入される配列と、請求項1、6及び7のいずれか1項で規定されるI-CreI 変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトIL2RG遺伝子配列に相同な配列とを含むターゲティング構築物を含む請求項23又は24に記載のベクター。
【請求項２６】
I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトIL2RG遺伝子配列に相同な前記配列が、配列番号3の250位〜449位、991位〜1190位、1116位〜1305位、1546位〜1745位、1597位〜1796位、2108位〜2307位、2860位〜3059位、2879位〜3078位又は3041位〜3240位を含むヒトIL2RG遺伝子のフラグメントである請求項25に記載のベクター。
【請求項２７】
導入される前記配列が、ヒトIL2RG遺伝子内の変異を修復する配列である請求項25又は26に記載のベクター。
【請求項２８】
前記変異を修復する配列が、野生型ヒト共通サイトカイン受容体ガンマ鎖の一部分をコードする請求項27に記載のベクター。
【請求項２９】
I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位に接するヒトIL2RG遺伝子の配列に相同な前記配列が、請求項28で規定される野生型ヒト共通サイトカイン受容体ガンマ鎖の一部分をコードする配列を含む請求項25又は26に記載のベクター。
【請求項３０】
前記変異を修復する前記配列が、ヒトサイトカイン受容体共通ガンマ鎖ORFと、3'の転写を停止するポリアデニル化部位とを含む請求項27に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項20若しくは21に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターを含む組成物。
【請求項３２】
請求項25〜30のいずれか1項で規定されるターゲティングDNA構築物を含む請求項31に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ターゲティングDNA構築物が、組換えベクターに含まれる請求項32に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項22若しくは24で規定される少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つのベクターにより改変された宿主細胞。
【請求項３５】
請求項22若しくは24で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３６】
請求項22若しくは24で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
【請求項３７】
請求項1〜19のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項20若しくは21に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、X連鎖重症複合型免疫不全の予防用の医薬品の製造のための使用。
【請求項３８】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項20若しくは21に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、非治療目的でのゲノム工学のための使用。
【請求項３９】
前記変異型、単鎖メガヌクレアーゼ又はベクターが、請求項25〜30のいずれか1項で定義されるターゲティングDNA構築物と組み合わされている請求項37又は38に記載の使用。
【請求項４０】
X連鎖重症複合型免疫不全の動物モデルを作製するための請求項38又は39に記載の使用。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公表番号】特表２０１０−５３５４７２（Ｐ２０１０−５３５４７２Ａ）
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１８７８１（Ｐ２０１０−５１８７８１）
【出願日】平成２０年８月４日（２００８．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００２９９９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９６１４
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０８２４５２３１）
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＥＣＴＩＳ
【住所又は居所原語表記】１０２ ａｖｅｎｕｅ Ｇａｓｔｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｆ−９３２３５ Ｒｏｍａｉｎｖｉｌｌｅ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月４日（２００８．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００２９９９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９６１４
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０８２４５２３１）
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＥＣＴＩＳ
【住所又は居所原語表記】１０２ ａｖｅｎｕｅ Ｇａｓｔｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｆ−９３２３５ Ｒｏｍａｉｎｖｉｌｌｅ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]