ヒトヘモグロビンベータ遺伝子からのＤＮＡ標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型及びその使用
2つのI-CreI単量体の一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有し、I-CreI変異型がヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型。該変異型及びその派生生成物の、ヒトベータグロビン遺伝子での変異により引き起こされる病変状態(鎌状赤血球病、ベータ-サラセミア)の予防及び治療のための使用。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有し、I-CreI変異型がヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列を切断でき、少なくとも以下の：
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、及び／又は
(h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(i) 工程(g)及び／又は(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し、
(j) ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする
工程を含む方法により得ることができることを特徴とするI-CreI変異型。
【請求項２】
I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の前記置換が、44位、68位、70位、75位及び／又は77位に位置する請求項1に記載の変異型。
【請求項３】
I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン内の前記置換が、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に位置する請求項1に記載の変異型。
【請求項４】
前記置換が、元のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L及びVからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項５】
I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる変異を有する第1及び第2単量体の会合により得られるヘテロ二量体であり、前記へテロ二量体がヒトベータグロビン遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できる請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項６】
前記DNA標的が、配列番号6〜19の配列からなる群より選択される請求項5に記載の変異型。
【請求項７】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KSSGQS/DNSNI及びKNSTAS/QRSYR、KDSRQS/QRSNI及びKNGTQS/ARGNI、KNDYCS/QRSDK及びKNDYCS/QRSNI、KNSTAS/ARHDI及びKNSHSS/YDSRY、KNGTQS/KESYV及びKHSHQS/PRHNI、KDTYQS/QYSYI及びKNDYCS/QYSRQ、KTSGQS/QHHNI及びKNSRTS/ARHDI、KHSSQS/QYSYI及びKDSRQS/QHHDI、KNWTQS/ARHDI及びKNTCQS/ARGNI、KNTYWS/NYSRV及びKNTTQS/ARSER、KQSHQS/ARSER及びKNNGYS/QRSRQからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項6に記載の変異型。
【請求項８】
第1単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KNSTSS/RYSNQ、KNTCQS/RYSNQ、KNTCQS/HYSNR、KNSCHS/RYSNQ、KNSVHS/RYSNQ、KNSTRQ/NESNR、KNETQS/DASKR、KNTCQS/DASKR、KNSCHS/DASKR、KNSCQS/DASKR、KNSSSS/KASDR、KNSSRS/DASKR、KNSTRQ/DASKR、KNSVRQ/DASKR、KNSTQS/DASKR及びKNSVHQ/DASKRからなる群より選択されるアミノ酸を有し、第2単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KNSGKS/QASNR、KTSHRS/KYSNY、KNSTRS/KYSNY、KNSGRS/KYSNY、KNSCRS/KYSNQ、KNSGKS/KYSNY、KNSGKS/QYSNR、KNSGKS/KYSNR、KNSGKS/KYSNQ、KQTYRS/KYSNI、KQTYRS/KYSNY、KQTYRS/QASNR、KQTYRS/KYSNQ、KNSRTS/QHHNI及びKTSRQS/KSSNYからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項6に記載の変異型。
【請求項９】
第1単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KNTYQS/ARSER、KNDYQS/ARSER、KNPYQS/ARSER、KNSPQS/ARSER及びKNSYQS/ARSERからなる群より選択されるアミノ酸を有し、第2単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KTSHRS/KYSDT、KNSRRS/KYSDT; KNSRRS/KYSDR、KNSRRS/KYSNQ、KNSRRS/RYSNQ、KSSHRS/KYSDT、KNSSKS/KYSNQ、KNSSKS/KYSDR、KNSRRS/KYSNQ、KSSHRS/KYSDQ、KSPHRS/KYSDT、KSSHRS/KYSNQ及びKKSSQS/KESNRからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項6に記載の変異型。
【請求項１０】
I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対する変異型の特異性を改変する1つ又は複数の置換を、I-CreIの137位〜143位に含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１１】
ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改良する1つ又は複数の置換を、I-CreI配列全体に対して含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１２】
K4E、K7R、Y12H、F16L、G19S、G19A、I24V、K34R、F43L、T49A、F54L、L58Q、D60N、D60G、V64I、Y66H、S79G、E80G、E80K、I81T、K82R、K82E、H85R、N86S、F87L、Q92R、P93A、F94L、K96R、Q99R、K100R、N103S、V105A、V105I、I109V、Q111H、E117G、D120G、K121R、K121E、V125A、V129A、Q131R、I132V、K139R、T140A、T147A、V151M、L152Q、L155P、K159R、K159E、K160E、S161P、S162P及びP163Sからなる群より選択される1つ又は複数の置換を含む請求項11に記載の変異型。
【請求項１３】
G19S、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される1つ又は複数の置換を含む請求項12に記載の変異型。
【請求項１４】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位並びに付加的な位置に：
- KNSVHQ/DASKR, 87L及び131R (第1単量体)、並びにKNSGKS/KYSNY, 19S及び117G、KQTYRS/KYSNY, 19S及び64I、KNSGKS/KYSNY, 19S及び132V、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/KYSNQ及び19S (第2単量体)、
- KNSTRQ/DASKR及び19S (第1単量体)、並びにKQTYRS/KYSNY, 105A及び152Q、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/QASNR及び87L、KQTYRS/KYSNI及び19S (第2単量体)、
- KNSVRQ/DASKR及び19S (第1単量体)、並びにKQTYRS/QASNR, 87L及び58Q、KQTYRS/KYSNY, 105A及び152Q、KNSGKS/KYSNY及び132V、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/QASNR及び87L (第2単量体)、
- KNSVHQ/DASKR及び87L (第1単量体)、並びにKNSGKS/KYSNY及び132V、KNSGKS/KYSNY, 19S及び117G、KNSGKS/KYSNY, 19S及び132V、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/KYSNI及び19S (第2単量体)
からなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項8及び11〜13のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１５】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位並びに付加的な位置に、KNTYQS/ARSER, 19S, 80K, 85R, 87L, 96R及び139R (第1単量体)、並びにKSPHRS/KYSDT及び81T又はKTSHRS/KYSDT, 66H, 82R, 86S, 99R, 132V, 139R及び140A (第2単量体)からなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項9及び11〜13のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１６】
第1単量体及び第2単量体が、以下の配列の対：それぞれ配列番号123〜135 (第1単量体)と配列番号136〜148 (第2単量体); 配列番号79 (第1単量体)と配列番号45、56、164〜177、298〜301のいずれか(第2単量体); 配列番号179〜186 (第1単量体)と配列番号57 (第2単量体); 配列番号179 (第1単量体)と配列番号197〜208、302〜306のいずれか(第2単量体); 配列番号209〜220、292〜297 (第1単量体)と配列番号164 (第2単量体); 配列番号213、214、281 (第1単量体)と配列番号277、278、279又は280 (第2単量体); 配列番号104又は114 (第1単量体)と配列番号82 (第2単量体); 配列番号105又は118 (第1単量体)と配列番号84、85、88、94及び103のいずれか(第2単量体); 配列番号113又は111 (第1単量体)と配列番号103 (第2単量体); 配列番号121 (第1単量体)と配列番号85 (第2単量体); 配列番号118 (第1単量体)と配列番号231〜255 (第2単量体); 配列番号257〜274 (第1単量体)と配列番号103 (第2単量体); 配列番号286 (第1単量体)と配列番号250、236、287、288及び289のいずれか(第2単量体); 配列番号269 (第1単量体)と配列番号290、236、237及び248のいずれか(第2単量体); 配列番号273 (第1単量体)と配列番号291、290、242、236及び237のいずれか(第2単量体); 配列番号261 (第1単量体)と配列番号242、289、287、236及び248のいずれか(第2単量体)から選択される請求項7〜15のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１７】
請求項16で規定される配列の1つと少なくとも95%の配列同一性を有する請求項1〜16のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１８】
核局在化シグナル及び／又はタグを含む請求項1〜17のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１９】
第1単量体がD137R変異をさらに含み、第2単量体がR51D変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項5〜18のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項２０】
第1単量体がE8R又はE8K及びE61R変異をさらに含み、第2単量体がK7E及びK96E変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項5〜18のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の1つの変異型の2つの単量体又はコアドメイン、或いはその両方の組み合わせを含む単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２２】
ペプチドリンカーで連結された請求項7、8、9、14、15及び16のいずれか1項で規定される第1及び第2単量体を含む請求項21に記載の単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２３】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の変異型又は請求項21若しくは22に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２４】
請求項23の少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクター。
【請求項２５】
それぞれが請求項5〜20のいずれか1項に記載のヘテロ二量体変異型の単量体の1つをコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む請求項24に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
ヒトベータグロビン遺伝子に導入される配列と、請求項1、5及び6のいずれか1項で規定されるI-CreI 変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトベータグロビン遺伝子配列に相同な配列とを含むターゲティング構築物を含む請求項24又は25に記載のベクター。
【請求項２７】
I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトベータグロビン遺伝子配列に相同な前記配列が、配列番号4の508位〜707位、651位〜850位、701位〜900位、1048位〜1247位、1147位〜1346位、1524位〜1723位、1599位〜1798位、1808位〜2007位、2084位〜2283位、2094位〜2293位、2245位〜2444位、2323位〜2522位及び2523位〜2722位を含むヒトベータグロビン遺伝子のフラグメントである請求項26に記載のベクター。
【請求項２８】
導入される前記配列が、ヒトベータグロビン遺伝子内の変異を修復する配列である請求項26又は27に記載のベクター。
【請求項２９】
前記変異を修復する前記配列が、野生型ヒトベータグロビンの一部分をコードする請求項28に記載のベクター。
【請求項３０】
I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトベータグロビン遺伝子配列に相同な前記配列が、請求項29で規定される野生型ヒトベータグロビンの一部分をコードする配列を含む請求項26又は27に記載のベクター。
【請求項３１】
前記変異を修復する前記配列が、ヒトベータグロビンORFと、3'の転写を停止するポリアデニル化部位とを含む請求項28に記載のベクター。
【請求項３２】
前記変異を修復する前記配列が、請求項26又は27で規定されるI-CreI変異型のゲノムDNA切断部位に接するヒトベータグロビン遺伝子の配列に相同な配列で挟まれている請求項31に記載のベクター。
【請求項３３】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項21若しくは22に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターを含む組成物。
【請求項３４】
請求項26〜32のいずれか1項で規定されるターゲティングDNA構築物を含む請求項33に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ターゲティングDNA構築物が、組換えベクターに含まれる請求項34に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項23若しくは25で規定される少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つのベクターにより改変された宿主細胞。
【請求項３７】
請求項23若しくは25で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３８】
請求項23若しくは25で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
【請求項３９】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項21若しくは22に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、ベータ-グロビン遺伝子の変異により引き起こされる病変状態を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
【請求項４０】
前記病変状態が、鎌状赤血球病及びベータ-サラセミアからなる群より選択される請求項39に記載の使用。
【請求項４１】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項21若しくは22に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、非治療目的でのゲノム工学のための使用。
【請求項４２】
前記変異型、単鎖メガヌクレアーゼ、又はベクターが請求項26〜32のいずれか1項で規定されるターゲティングDNA構築物と組み合わされている請求項41に記載の使用。
【請求項４３】
ベータグロビン遺伝子での変異により引き起こされる遺伝性ヘモグロビン障害の動物モデルを作製するための請求項41又は42に記載の使用。
【請求項１】
2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有し、I-CreI変異型がヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列を切断でき、少なくとも以下の：
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、及び／又は
(h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(i) 工程(g)及び／又は(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し、
(j) ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする
工程を含む方法により得ることができることを特徴とするI-CreI変異型。
【請求項２】
I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の前記置換が、44位、68位、70位、75位及び／又は77位に位置する請求項1に記載の変異型。
【請求項３】
I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン内の前記置換が、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に位置する請求項1に記載の変異型。
【請求項４】
前記置換が、元のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L及びVからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項５】
I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる変異を有する第1及び第2単量体の会合により得られるヘテロ二量体であり、前記へテロ二量体がヒトベータグロビン遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できる請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項６】
前記DNA標的が、配列番号6〜19の配列からなる群より選択される請求項5に記載の変異型。
【請求項７】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KSSGQS/DNSNI及びKNSTAS/QRSYR、KDSRQS/QRSNI及びKNGTQS/ARGNI、KNDYCS/QRSDK及びKNDYCS/QRSNI、KNSTAS/ARHDI及びKNSHSS/YDSRY、KNGTQS/KESYV及びKHSHQS/PRHNI、KDTYQS/QYSYI及びKNDYCS/QYSRQ、KTSGQS/QHHNI及びKNSRTS/ARHDI、KHSSQS/QYSYI及びKDSRQS/QHHDI、KNWTQS/ARHDI及びKNTCQS/ARGNI、KNTYWS/NYSRV及びKNTTQS/ARSER、KQSHQS/ARSER及びKNNGYS/QRSRQからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項6に記載の変異型。
【請求項８】
第1単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KNSTSS/RYSNQ、KNTCQS/RYSNQ、KNTCQS/HYSNR、KNSCHS/RYSNQ、KNSVHS/RYSNQ、KNSTRQ/NESNR、KNETQS/DASKR、KNTCQS/DASKR、KNSCHS/DASKR、KNSCQS/DASKR、KNSSSS/KASDR、KNSSRS/DASKR、KNSTRQ/DASKR、KNSVRQ/DASKR、KNSTQS/DASKR及びKNSVHQ/DASKRからなる群より選択されるアミノ酸を有し、第2単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KNSGKS/QASNR、KTSHRS/KYSNY、KNSTRS/KYSNY、KNSGRS/KYSNY、KNSCRS/KYSNQ、KNSGKS/KYSNY、KNSGKS/QYSNR、KNSGKS/KYSNR、KNSGKS/KYSNQ、KQTYRS/KYSNI、KQTYRS/KYSNY、KQTYRS/QASNR、KQTYRS/KYSNQ、KNSRTS/QHHNI及びKTSRQS/KSSNYからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項6に記載の変異型。
【請求項９】
第1単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KNTYQS/ARSER、KNDYQS/ARSER、KNPYQS/ARSER、KNSPQS/ARSER及びKNSYQS/ARSERからなる群より選択されるアミノ酸を有し、第2単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に、KTSHRS/KYSDT、KNSRRS/KYSDT; KNSRRS/KYSDR、KNSRRS/KYSNQ、KNSRRS/RYSNQ、KSSHRS/KYSDT、KNSSKS/KYSNQ、KNSSKS/KYSDR、KNSRRS/KYSNQ、KSSHRS/KYSDQ、KSPHRS/KYSDT、KSSHRS/KYSNQ及びKKSSQS/KESNRからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項6に記載の変異型。
【請求項１０】
I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対する変異型の特異性を改変する1つ又は複数の置換を、I-CreIの137位〜143位に含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１１】
ヒトベータグロビン遺伝子からのDNA標的配列に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改良する1つ又は複数の置換を、I-CreI配列全体に対して含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１２】
K4E、K7R、Y12H、F16L、G19S、G19A、I24V、K34R、F43L、T49A、F54L、L58Q、D60N、D60G、V64I、Y66H、S79G、E80G、E80K、I81T、K82R、K82E、H85R、N86S、F87L、Q92R、P93A、F94L、K96R、Q99R、K100R、N103S、V105A、V105I、I109V、Q111H、E117G、D120G、K121R、K121E、V125A、V129A、Q131R、I132V、K139R、T140A、T147A、V151M、L152Q、L155P、K159R、K159E、K160E、S161P、S162P及びP163Sからなる群より選択される1つ又は複数の置換を含む請求項11に記載の変異型。
【請求項１３】
G19S、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される1つ又は複数の置換を含む請求項12に記載の変異型。
【請求項１４】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位並びに付加的な位置に：
- KNSVHQ/DASKR, 87L及び131R (第1単量体)、並びにKNSGKS/KYSNY, 19S及び117G、KQTYRS/KYSNY, 19S及び64I、KNSGKS/KYSNY, 19S及び132V、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/KYSNQ及び19S (第2単量体)、
- KNSTRQ/DASKR及び19S (第1単量体)、並びにKQTYRS/KYSNY, 105A及び152Q、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/QASNR及び87L、KQTYRS/KYSNI及び19S (第2単量体)、
- KNSVRQ/DASKR及び19S (第1単量体)、並びにKQTYRS/QASNR, 87L及び58Q、KQTYRS/KYSNY, 105A及び152Q、KNSGKS/KYSNY及び132V、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/QASNR及び87L (第2単量体)、
- KNSVHQ/DASKR及び87L (第1単量体)、並びにKNSGKS/KYSNY及び132V、KNSGKS/KYSNY, 19S及び117G、KNSGKS/KYSNY, 19S及び132V、KQTYRS/KYSNY及び54L、KQTYRS/KYSNI及び19S (第2単量体)
からなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項8及び11〜13のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１５】
第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位並びに付加的な位置に、KNTYQS/ARSER, 19S, 80K, 85R, 87L, 96R及び139R (第1単量体)、並びにKSPHRS/KYSDT及び81T又はKTSHRS/KYSDT, 66H, 82R, 86S, 99R, 132V, 139R及び140A (第2単量体)からなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項9及び11〜13のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１６】
第1単量体及び第2単量体が、以下の配列の対：それぞれ配列番号123〜135 (第1単量体)と配列番号136〜148 (第2単量体); 配列番号79 (第1単量体)と配列番号45、56、164〜177、298〜301のいずれか(第2単量体); 配列番号179〜186 (第1単量体)と配列番号57 (第2単量体); 配列番号179 (第1単量体)と配列番号197〜208、302〜306のいずれか(第2単量体); 配列番号209〜220、292〜297 (第1単量体)と配列番号164 (第2単量体); 配列番号213、214、281 (第1単量体)と配列番号277、278、279又は280 (第2単量体); 配列番号104又は114 (第1単量体)と配列番号82 (第2単量体); 配列番号105又は118 (第1単量体)と配列番号84、85、88、94及び103のいずれか(第2単量体); 配列番号113又は111 (第1単量体)と配列番号103 (第2単量体); 配列番号121 (第1単量体)と配列番号85 (第2単量体); 配列番号118 (第1単量体)と配列番号231〜255 (第2単量体); 配列番号257〜274 (第1単量体)と配列番号103 (第2単量体); 配列番号286 (第1単量体)と配列番号250、236、287、288及び289のいずれか(第2単量体); 配列番号269 (第1単量体)と配列番号290、236、237及び248のいずれか(第2単量体); 配列番号273 (第1単量体)と配列番号291、290、242、236及び237のいずれか(第2単量体); 配列番号261 (第1単量体)と配列番号242、289、287、236及び248のいずれか(第2単量体)から選択される請求項7〜15のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１７】
請求項16で規定される配列の1つと少なくとも95%の配列同一性を有する請求項1〜16のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１８】
核局在化シグナル及び／又はタグを含む請求項1〜17のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１９】
第1単量体がD137R変異をさらに含み、第2単量体がR51D変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項5〜18のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項２０】
第1単量体がE8R又はE8K及びE61R変異をさらに含み、第2単量体がK7E及びK96E変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項5〜18のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の1つの変異型の2つの単量体又はコアドメイン、或いはその両方の組み合わせを含む単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２２】
ペプチドリンカーで連結された請求項7、8、9、14、15及び16のいずれか1項で規定される第1及び第2単量体を含む請求項21に記載の単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２３】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の変異型又は請求項21若しくは22に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２４】
請求項23の少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクター。
【請求項２５】
それぞれが請求項5〜20のいずれか1項に記載のヘテロ二量体変異型の単量体の1つをコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む請求項24に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
ヒトベータグロビン遺伝子に導入される配列と、請求項1、5及び6のいずれか1項で規定されるI-CreI 変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトベータグロビン遺伝子配列に相同な配列とを含むターゲティング構築物を含む請求項24又は25に記載のベクター。
【請求項２７】
I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトベータグロビン遺伝子配列に相同な前記配列が、配列番号4の508位〜707位、651位〜850位、701位〜900位、1048位〜1247位、1147位〜1346位、1524位〜1723位、1599位〜1798位、1808位〜2007位、2084位〜2283位、2094位〜2293位、2245位〜2444位、2323位〜2522位及び2523位〜2722位を含むヒトベータグロビン遺伝子のフラグメントである請求項26に記載のベクター。
【請求項２８】
導入される前記配列が、ヒトベータグロビン遺伝子内の変異を修復する配列である請求項26又は27に記載のベクター。
【請求項２９】
前記変異を修復する前記配列が、野生型ヒトベータグロビンの一部分をコードする請求項28に記載のベクター。
【請求項３０】
I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトベータグロビン遺伝子配列に相同な前記配列が、請求項29で規定される野生型ヒトベータグロビンの一部分をコードする配列を含む請求項26又は27に記載のベクター。
【請求項３１】
前記変異を修復する前記配列が、ヒトベータグロビンORFと、3'の転写を停止するポリアデニル化部位とを含む請求項28に記載のベクター。
【請求項３２】
前記変異を修復する前記配列が、請求項26又は27で規定されるI-CreI変異型のゲノムDNA切断部位に接するヒトベータグロビン遺伝子の配列に相同な配列で挟まれている請求項31に記載のベクター。
【請求項３３】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項21若しくは22に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターを含む組成物。
【請求項３４】
請求項26〜32のいずれか1項で規定されるターゲティングDNA構築物を含む請求項33に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ターゲティングDNA構築物が、組換えベクターに含まれる請求項34に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項23若しくは25で規定される少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つのベクターにより改変された宿主細胞。
【請求項３７】
請求項23若しくは25で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３８】
請求項23若しくは25で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
【請求項３９】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項21若しくは22に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、ベータ-グロビン遺伝子の変異により引き起こされる病変状態を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
【請求項４０】
前記病変状態が、鎌状赤血球病及びベータ-サラセミアからなる群より選択される請求項39に記載の使用。
【請求項４１】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項21若しくは22に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、非治療目的でのゲノム工学のための使用。
【請求項４２】
前記変異型、単鎖メガヌクレアーゼ、又はベクターが請求項26〜32のいずれか1項で規定されるターゲティングDNA構築物と組み合わされている請求項41に記載の使用。
【請求項４３】
ベータグロビン遺伝子での変異により引き起こされる遺伝性ヘモグロビン障害の動物モデルを作製するための請求項41又は42に記載の使用。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公表番号】特表２０１０−５３４０７０（Ｐ２０１０−５３４０７０Ａ）
【公表日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１７５０８（Ｐ２０１０−５１７５０８）
【出願日】平成２０年７月２３日（２００８．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００２６４３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１３６２２
【国際公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【出願人】（５０８２４５２３１）
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＥＣＴＩＳ
【住所又は居所原語表記】１０２ ａｖｅｎｕｅ Ｇａｓｔｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｆ−９３２３５ Ｒｏｍａｉｎｖｉｌｌｅ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２３日（２００８．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００２６４３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１３６２２
【国際公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【出願人】（５０８２４５２３１）
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＥＣＴＩＳ
【住所又は居所原語表記】１０２ ａｖｅｎｕｅ Ｇａｓｔｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｆ−９３２３５ Ｒｏｍａｉｎｖｉｌｌｅ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
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