ヒト化抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物及びその使用
内因性λ軽鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座を含み、その各々は、抗原投与後にＢ細胞において発現されるように免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子が形成され再構成することができるが、前記遺伝子座は、前記突然変異した遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する能力が実質的に低減又は排除されるように変異している、非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用した、抗原投与に応答する重鎖及び軽鎖を含む機能性親和性成熟四量体免疫グロブリンの、様々なレパートリーの誘導及び選択のための改善された方法並びにその使用に関する。
【０００２】
特に、本発明は、内因性マウスκ及び／若しくはλ軽鎖免疫グロブリンを生成するその能力が実質的に低減されるように、又は重鎖と複合体化する軽鎖の能力が低減、排除若しくはブロックされるように遺伝子操作された、非ヒト哺乳動物、好ましくはマウスに関する。本発明の非ヒト哺乳動物はまた、機能性の内因性マウス重鎖を生成する能力が低い。従って、前記突然変異遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する非ヒト哺乳動物の能力は、実質的に低減又は排除されている。そのような哺乳動物を作製する方法、並びに、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖導入遺伝子を使用してヒト四量体抗体及びハイブリッド四量体抗体を作製するためにそのような哺乳動物を用いる方法も説明する。
【０００３】
以下の説明において、すべてのアミノ酸残基位置番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）米国公衆衛生局（ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）公報番号９１−３２４２によって案出されたナンバリングシステムに従って与えられる。
【背景技術】
【０００４】
＜抗体＞
抗体の構造は当技術分野において周知である。大部分の自然抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む四量体である。重鎖は、各重鎖に沿ってほぼ中間に位置するヒンジドメイン間のジスルフィド結合を介して相互に連結されている。軽鎖は、ヒンジドメインのＮ末端側で各々の重鎖と会合している。各々の軽鎖は、通常、ヒンジドメインに近いジスルフィド結合によってそのそれぞれの重鎖と結合している。
【０００５】
抗体分子が正常に折りたたまれた場合、各々の鎖は、より直鎖状のポリペプチド配列によって連結された多数の別個の球状のドメインに折りたたまれる。例えば、軽鎖は可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）ドメインに折りたたまれる。重鎖は、１個の可変ドメインＶＨ、第一定常ドメイン（ＣＨ１）、ヒンジドメイン及び２又は３個のさらなる定常ドメインを有する。重鎖定常ドメイン及びヒンジドメインは一体となって、抗体重鎖の定常領域として一般に公知の構造を形成する。重（ＶＨ）鎖及び軽（ＶＬ）鎖可変ドメインの相互作用は、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成をもたらす。重鎖と軽鎖の相互作用は、重鎖のＣＨ１ドメイン及び軽鎖のＣκ又はＣλドメインによって促進される。一般に、ＶＨとＶＬの両方が抗原結合のために必要であるが、重鎖二量体及びアミノ末端フラグメントは軽鎖の不在下で活性を保持することが示されている（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。一般に、循環λ軽鎖の割合は低く、おそらく血漿中の四量体免疫グロブリンとして複合体化した全軽鎖の２〜５％を占める（Ｇｏｌｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ ＮＹ）。
【０００６】
新規抗体を構築するための重鎖免疫グロブリン遺伝子のインビトロ操作は、１９８０年代に最初に記述された。初期の抗体エンジニアリング研究の多くは、広く特徴づけられた抗原に対して惹起された、再構成されたマウス免疫グロブリンμ遺伝子（ＩｇＭ）を使用した。この抗体の特徴は、無関係な軽鎖による構築と分泌が抗原結合の保持を示すので、抗原結合特異性がＶＨドメインに存することが公知であるということであった（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９８６）Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，Ａ３１７，４２５−４３２）。この系を使用して、マウス抗原特異的ＶＨ結合ドメインが、マウス抗原特異的ＶＨドメインに融合したヒトε定常エフェクター領域を含む新規抗体を誘導するために使用できることが示された。生じたハイブリッドＩｇＥは抗原特異性を保持し、ＩｇＥの予想されるエフェクター活性を示した（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１４，２６８−２７０）。重鎖操作の他の文献例は以下を含む：抗ホスホコリン活性を保持するマウスＶＨヒト／ＩｇＡ又はＩｇＧ抗体融合物をコードするハイブリッドマウス−ヒト抗体遺伝子（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＰＮＡＳ，８１，６８５１−６８５５）；マウスＶＨとヒトＩｇＧ（γ３）定常領域を含む抗癌関連抗原１７−１Ａ抗体（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ，８４，２１４−２１８）；及びヒトＩｇＧ（γ１）定常領域とマウスＶＨドメインを含む抗ヒトＴ細胞抗体（抗ＣＤ７）（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，３５８９−９７参照）。
【０００７】
正常ヒトＢ細胞は、１４番染色体上に単一の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、そこから重鎖をコードする遺伝子が再構成によって生成される。マウスでは、重鎖遺伝子座は１２番染色体上に位置する。正常な重鎖遺伝子座は、複数のＶ遺伝子セグメント、多くのＤ遺伝子セグメント及び多くのＪ遺伝子セグメントを含む。ＶＨドメインの大部分はＶ遺伝子セグメントによってコードされるが、各ＶＨドメインのＣ末端はＤ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントによってコードされる。Ｂ細胞におけるＶＤＪ再構成とそれに続く親和性成熟は、その抗原結合特異性を有する各々のＶＨドメインを生じる。単一Ｖセグメントを含む重鎖免疫グロブリンに由来する正常なＨ２Ｌ２四量体の配列分析は、抗原投与に対する応答の多様性が主としてＶＤＪ再構成と体細胞超変異の組合せから生じることを明らかにする（Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３，３７−４５）。ヒトゲノム中には５０個以上のヒトＶ遺伝子セグメントが存在し、そのうちの３９個だけが機能性である。正常な二倍体抗体産生Ｂ細胞では、各々の細胞は、単一のセットの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子座から抗体四量体（Ｈ２Ｌ２）を産生する。その他のセットの遺伝子座は、対立遺伝子排除と呼ばれるプロセスの結果として生産的には使用されない（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９７，７４３−７５０及びその中の参考文献）。
【０００８】
完全ヒト抗体（Ｈ２Ｌ２）は、現在、抗原投与に応答するトランスジェニックマウスから誘導することができる。そのようなトランスジェニックマウスは、一般に単一ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座及び別のヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む。対応する内因性マウス重鎖、κ軽鎖及び、場合によりλ軽鎖遺伝子座コード配列は、欠失又は部分的に欠失している。従って、κ軽鎖を含むヒト抗体だけが、ヒト重鎖とマウスλ軽鎖を含むマウス／ヒト抗体の低いバックグラウンドで産生される（国際公開第ＷＯ９０／０４０３６号；同第ＷＯ９３／１２２２７号；同第ＷＯ９８／２４８９３号；米国特許第５８７７３９７号、同第５８１４３１８号及び同第６１６２９６３号）。内因性重鎖及び軽鎖遺伝子発現を排除するためのすべての内因性マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子のセグメントの欠失は、完全に実現されてはいるが、特にすべてのλ軽鎖コード配列の除去が必要と考えられる場合、まだ依然として技術的に困難である。マウスλ軽鎖コード配列の除去は、λ遺伝子座のすべての機能性Ｖ及びＪ遺伝子セグメント並びにＣ１、Ｃ２及びＣ３定常領域の完全な欠失を介して達成され、サイレンシングされたλ軽鎖遺伝子座を有するマウスを生じる（欧州特許第ＥＰ１３９９５５９号参照）。
【０００９】
異なるアプローチは、マウス重鎖遺伝子をコードする遺伝子の膜エクソンの破壊によってマウスＢ細胞の発生及び免疫グロブリン分泌を制限することである。従って、内因性マウス重鎖遺伝子は、抗原投与に応答して転写され、ＶＤＪ再構成を受けるという点で機能性であるが、ＩｇＭはプレＢ細胞の表面上で絶対に発現されないので、内因性マウスκ及びλ軽鎖遺伝子が構造的に無傷であり、機能性のままであっても（Ｔｕａｉｌｌｏｎ（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３７，２２１−２３１）、さらなる発生は停止し、抗原投与に対して産生応答を生じない（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６）。
【００１０】
内因性マウス重鎖及び軽鎖遺伝子座が機能性のままである場合、任意の付加的に導入された免疫グロブリン重鎖導入遺伝子も対立遺伝子排除によって調節され、そのため一部のＢ細胞は、マウス重鎖及び軽鎖遺伝子座だけを機能性に発現し、また別のＢ細胞は、ヒト重鎖遺伝子座だけとマウス軽鎖遺伝子座を機能性に発現する（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６，８１６−８１９）。任意の単一非ヒトトランスジェニック動物において、異種抗原投与に応答して潜在的にすべての免疫グロブリン遺伝子座に由来する抗体を発現するＢ細胞の高度に多様な集団が存在する。ＨＡＴ選択（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５０，１６１−１７１）を用いる確立されたハイブリドーマ技術を使用したその後の抗原特異的抗体の選択は、ある重鎖免疫グロブリン遺伝子座を発現するハイブリドーマと別の重鎖免疫グロブリン遺伝子座を発現するハイブリドーマを区別しない。
【００１１】
免疫グロブリン重鎖導入遺伝子上に存在する調節エレメントは、コピー数に依存したやり方でＢ細胞特異的発現を確実にするために必須の組織特異的エンハンサーエレメントを含む。５’イントロンエンハンサー及び３’ＬＣＲの存在は、導入遺伝子がＢ細胞成熟のすべての段階で活性であることを確実にする（Ｇｕｇｌｉｅｌｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１６４２，１８１−１９０）。導入遺伝子座内に重鎖及び軽鎖特異的ＬＣＲを含むことは、発現がＢ細胞特異的であることのみならず、ゲノム内への組込み部位にかかわらず発現が起こることも保証する（国際公開第ＷＯ９０／１００７７号、Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，８４５−８５８及びＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，１９８，２３６−２４８））。従って、ＬＣＲが存在することを条件として、あらゆる導入遺伝子が、ゲノム内でのその位置に関わりなく機能性である。導入遺伝子上に存在するＬＣＲが部分的に欠失している場合、導入遺伝子の周囲のクロマチンはいずれかの時点で転写のために部分的にだけ開き、位置効果によるモザイク発現を導き、そのため標的組織全体にわたる導入遺伝子の発現の限られたレベルを生じさせる（Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３，２７１（５２５２）：１１２３−５；Ｍｉｌｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７（１），１０５−１４）。
【００１２】
マウスバックグラウンドでのヒト免疫グロブリンの作製のための代替的アプローチは、マウス免疫グロブリン遺伝子セグメントをヒトからの相同な遺伝子セグメントで置き換えることである。従って、マウスのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントだけをヒト相同体で置換した場合、ヒトＶＨ及びＶＬドメインとマウス定常（エフェクター）領域を含む機能性マウス／ヒトハイブリッド抗体が抗原投与後に生じる（国際公開第ＷＯ９４／０４６６７号）。すべてのマウス遺伝子セグメントをヒト相同体で置換した場合は、完全なヒト免疫グロブリンが抗原投与後に生じる（米国特許第６５９６５４１号）。このアプローチの１つの考えられる利点は、コード領域だけを交換することを条件として、生じる導入遺伝子はすべてのマウス調節エレメントを保持し、そのため抗原投与に対する最大応答を保証することである。このアプローチは、導入遺伝子の最終的な立体配置に依存して、高親和性ヒト抗体又はマウス／ヒトハイブリッド抗体の高い血清力価を提供する。実際には、しかしながら、マウスゲノム中の個々のＶ、Ｄ及びＪセグメント全部を相同組換えによって置換することは長くて骨の折れる作業である。同様に、３９個の機能性ヒトＶ、Ｄ及びＪセグメント全部と定常（エフェクター）領域を含む重鎖導入遺伝子の構築は、非常に高度な技術が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そのため、（ｉ）抗原投与に応答してＢ細胞特異的に内因性重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を発現する実質的に低い能力を有する、又は抗原投与後にＢ細胞において内因性免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖遺伝子を発現するが、機能性免疫グロブリン四量体として集合する能力を欠く免疫グロブリン重鎖及び軽鎖タンパク質をコードするマウスの簡易な作製；（ｉｉ）３９個のヒトＶ遺伝子セグメント全部を集合的に含み得るが、各々すべてのＤ及びＪ遺伝子セグメント並びに一部又は全部の定常（エフェクター）領域と組み合わせて、好ましいより小さな群のＶ遺伝子セグメントを個別に含み、その機能性発現が抗原依存性であり、最終的に対立遺伝子排除によって決定される、複数の重鎖導入遺伝子座の構築及びＢ細胞特異的発現のための簡易で再現可能な方法；（ｉｉｉ）残りの内因性マウス免疫グロブリンを発現するハイブリドーマを選択し、重鎖導入遺伝子座上に存在する完全なＶセグメントレパートリーを含む集合した免疫グロブリン四量体を発現し、分泌するハイブリドーマを選択する、あるいはある重鎖導入遺伝子座上に存在するＶ遺伝子セグメントのサブセットを発現し、別の重鎖導入遺伝子座上のものは発現しないハイブリドーマを選択する能力、を可能にする、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントの欠失又は多数の欠失に依存しない方法が当技術分野においてなおも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第一の態様によれば、内因性λ軽鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座を含み、その各々は、抗原投与後にＢ細胞において、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子が形成されて発現されるように再構成することができるが、前記遺伝子座は、前記突然変異遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する能力が実質的に低減又は排除されるように変異している、非ヒト哺乳動物が提供される。
【００１５】
非ヒト哺乳動物では、内因性λ軽鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座の少なくとも１つが、前記の内因性遺伝子座又は各々の内因性遺伝子座へのフレームシフト突然変異、ポリペプチドコード配列及び／又は１若しくはそれ以上の終止コドンの導入によって突然変異していてもよい。
【００１６】
突然変異は、好ましくは５０個未満のヌクレオチドの挿入である。
【００１７】
非ヒト哺乳動物では、内因性λ軽鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座の少なくとも１つの発現が、遺伝子座又は各々の遺伝子座におけるＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下していてもよい。
【００１８】
好ましくは、導入は内因性κ軽鎖遺伝子座においてである。
【００１９】
あるいは、導入は内因性λ軽鎖遺伝子座においてである。
【００２０】
もう１つの選択的態様では、導入は、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性λ軽鎖遺伝子座においてである。
【００２１】
導入はまた、内因性重鎖遺伝子座においてであってもよい。
【００２２】
導入は、さらなる選択的態様では、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座においてであってもよい。
【００２３】
導入は、尚さらなる選択的態様では、内因性λ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座においてであってもよい。
【００２４】
導入は、さらなる選択的態様では、内因性λ軽鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座においてであってもよい。
【００２５】
好ましくは、内因性κ軽鎖遺伝子座内に上記で定義される導入が存在し、内因性λ遺伝子座内に上記で定義される部分的又は完全なＬＣＲ欠失が存在する。
【００２６】
所望する場合、内因性重鎖遺伝子座は、重鎖遺伝子再構成、ｍＲＮＡ転写及びタンパク質合成は起こるが、Ｂ細胞活性化はブロックされるように突然変異していてもよい。
【００２７】
好ましくは、上記で定義される非ヒト哺乳動物は、１又はそれ以上の異種κ軽鎖遺伝子座及び関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子を含む。
【００２８】
非ヒト哺乳動物は、１又はそれ以上の異種λ軽鎖遺伝子座及び関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子をさらに含んでもよい。
【００２９】
上記で定義される非ヒト哺乳動物において、異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子は、優性選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００３０】
上記で定義される非ヒト哺乳動物はまた、１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座及び関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子を含んでもよい。
【００３１】
所望する場合、非ヒト哺乳動物は、２又はそれ以上の異なる異種重鎖遺伝子座及び関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する２又はそれ以上の導入遺伝子を含んでもよい。
【００３２】
非ヒト哺乳動物において、異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子又は各々の導入遺伝子は、優性選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００３３】
非ヒト哺乳動物において、各々の異種重鎖遺伝子座はＣＴＣＦ結合部位を含んでもよい。
【００３４】
好ましくは、非ヒト哺乳動物は、異種κ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子及び１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子を含む。
【００３５】
あるいは、非ヒト哺乳動物は、異種λ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子及び１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子を含んでもよい。
【００３６】
さらなる選択的態様では、非ヒト哺乳動物は、異種κ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子、λ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子及び１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子を含んでもよい。
【００３７】
好ましくは、各々の異種遺伝子座は同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）ＬＣＲを組み込んでいる。
【００３８】
各々の異種遺伝子座は、好ましくはヒト遺伝子座である。
【００３９】
しかし、各々の異種遺伝子座は、ヒト可変領域とラット又はマウス定常領域を含むハイブリッド遺伝子座のような、２以上の種に由来する可変領域と定常領域を含むハイブリッド遺伝子座であってもよい。
【００４０】
非ヒト哺乳動物は、異なる異種重鎖遺伝子座の異なる群を含有する導入遺伝子の群を含んでもよく、導入遺伝子の各々の群は異なる優性選択マーカー遺伝子を含む。
【００４１】
あるいは、非ヒト哺乳動物は、異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子及び異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子を含んでもよく、異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子は、各々異なる優性選択マーカー遺伝子を含む。
【００４２】
非ヒト哺乳動物は、好ましくはマウスなどのげっ歯動物である。
【００４３】
第二の態様によれば、本発明は、抗原特異的異種モノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）前記請求項のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物を抗原で免疫するステップと、
（ｂ）各々が免疫トランスジェニック哺乳動物のＢ細胞からのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を調製するステップと、
（ｃ）場合により、異種免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子内に存在する優性選択マーカー遺伝子を使用して、異種抗体を発現する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｄ）抗原に特異的に結合する抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと
を含む方法を提供する。
【００４４】
本発明のさらなる態様によれば、ハイブリッド抗体から哺乳動物抗体、好ましくはヒト抗体を誘導する方法であって、
（ａ）上述した方法を実施するステップと、
（ｂ）抗原に特異的に結合し、且つ、選択した種のＶＨ及びＶＬ結合ドメインを含む抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｃ）ＶＨ及びＶＬドメインをクローニングし、配列決定するステップと、
（ｄ）ＶＨ及びＶＬ結合ドメインコード配列を、同じ種からの選択した定常エフェクタードメインと共に含む選択配列を再びクローニングするステップと、
（ｅ）選択した細胞型において発現ベクターを使用して所望する種の重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする再クローニング配列を同時発現させるステップと
を含む方法が提供される。
【００４５】
本発明のなおさらなる態様によれば、哺乳動物前駆細胞において内因性重鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座、及び場合により内因性λ軽鎖遺伝子座を突然変異させ、前駆細胞から哺乳動物を作製するステップを含み、ここで、前記突然変異は、哺乳動物において、各々の遺伝子座が、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子が形成され、抗原投与後にＢ細胞において発現されるように再構成することができるが、突然変異遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する能力が実質的に低減又は排除されている、上記で定義される非ヒト哺乳動物の作製のための方法が提供される。
【００４６】
好ましくは、前駆細胞は非ヒト胚性幹細胞である。
【００４７】
非ヒト哺乳動物は、好ましくはマウスなどのげっ歯動物である。
【００４８】
本発明はまた、非ヒト哺乳動物又は上記で定義される方法を使用して誘導される、好ましくはヒトの、抗原特異的異種機能性免疫グロブリン四量体の薬剤、診断薬又は試薬としての使用を提供する。
【００４９】
本発明者は、驚くべきことに非ヒト哺乳動物、特にマウスの生産のための簡易な方法の開発によって先行技術の制限を克服し、その内因性κ及び／又はλ軽鎖遺伝子の機能的発現は、フレームシフト又はｍＲＮＡの早期の翻訳終結を導く、好ましくはκ定常領域及び／若しくはλ定常領域内の小さな挿入事象の結果として定常領域を非機能性とすること、又は、同族の内因性ＬＣＲの一部若しくは全部を除去することのいずれかによって、実質的に低減された。これは、一部又は全部の軽鎖遺伝子コード配列の完全な又は部分的欠失による内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の機能的サイレンシングを必要とする選択的方法と対照をなす。
【００５０】
本明細書で述べる方法は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にも等しく良好に適用できる。従って、例えば、ＬＣＲの完全な又は部分的欠失は重鎖遺伝子発現の実質的な低下を生じさせる。好ましくはμＣ領域のＣＨ１ドメインへの、しかし選択的にはすべての免疫グロブリンアイソタイプ定常領域のＣＨ１領域への、フレームシフト又はｍＲＮＡの早期の翻訳終結を導く配列の導入は、軽鎖との免疫グロブリン四量体の形成を実質的に低減、排除又はブロックする。同様に、先に述べたように、プレＢ細胞の表面でのＩｇＭ発現がｍＲＮＡの早期の翻訳終結によってインビボでブロックされる場合、さらなる発生は停止し、抗原投与に対する産生応答を生じさせない（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６）。重鎖免疫グロブリン導入遺伝子の導入はＢ細胞増殖を救済し、導入遺伝子がコードする重鎖及び内因性マウス軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体が血清中を循環する。
【００５１】
従って、相互作用して機能性免疫グロブリン四量体を形成する重鎖及び軽鎖を生じる内因性軽鎖遺伝子座及び／又は重鎖遺伝子座の能力は、フレームシフト突然変異の導入後に排除又は実質的に低減され得、一般にフレーム外の終止コドンの存在によるタンパク質合成の早期の終結を伴う、無関係なタンパク質配列の合成を導く。
【００５２】
これは、機能性免疫グロブリン四量体の形成の役割を担う重鎖又は軽鎖ポリペプチド配列内又はその上流への外来性ＤＮＡの挿入又はＤＮＡの小さな欠失によって実現することができる。好ましいアプローチは新しい配列を挿入することである。アミノ酸コード配列内にフレームシフトを生じさせ、コードされるｍＲＮＡの翻訳の早期終結をもたらすように設計された有効な挿入事象は、１個のヌクレオチドの導入に限定することができる。従って、コード領域内の１又はそれ以上のヌクレオチドの挿入はフレームシフトを導き得る。あるいは、終止コドンを含む付加的なペプチド配列をコードするインフレーム配列の挿入も、トランケート型のタンパク質の合成を生じさせる（米国特許第５５９１６６９号）。標的化挿入事象はまた、すべての内因性配列が保持され、生じる融合タンパク質が免疫グロブリン四量体の形成を破壊する、又は１若しくはそれ以上のインフレーム終止コドンの存在がｍＲＮＡの翻訳の早期終結を導き、機能性免疫グロブリン四量体を形成することができないトランケート型タンパク質の合成をもたらすことを条件として、選択マーカー遺伝子及び他の機能性の導入を含み得る。
【００５３】
好ましくは、挿入事象は、免疫グロブリンκ軽鎖定常領域においてである。場合により、挿入事象は、免疫グロブリンκ及び／又はλ軽鎖定常領域においてである。実際には、挿入は、ｌｏｘ部位などの任意の組換え酵素認識部位を含み得る。これは単独でフレームシフトを導き得る。フレームシフトを確実にする付加的なヌクレオチド、又は、１若しくはそれ以上の終止コドンのためのコドンを含むことはまた、重鎖ＣＨ１ドメインと軽鎖κ及び／又はλ定常領域の相互作用を介して重鎖と軽鎖の二量体化の破壊における挿入配列の有効性を増大させ得る。挿入は１個のヌクレオチドを含むことができ、好ましくは５０個未満のヌクレオチドである。挿入は、フレームシフトだけを生じさせてもよいが、好ましくは、１又はそれ以上の終止コドンがｍＲＮＡの早期終結をもたらすように設計される。挿入は、挿入部位に隣接する腕を利用した相同組換えを用いて実施される。好ましくは、操作過程の間に選択マーカーを含め、その後切り出して、認識部位単独に加えてゲノム内にインサイチューで任意の付加的な挿入配列、例えばｌｏｘ部位を残す。
【００５４】
フレームシフト及びトランケートされたタンパク質の合成はまた、コード配列内の１又はそれ以上のヌクレオチドの欠失及び終止コドンを含む最小付加配列の含有によっても達成できることは当業者に明らかである。好ましくは、挿入又は欠失事象は重鎖及び軽鎖遺伝子の定常領域内で起こり、内因性遺伝子座の多数のＶ、Ｄ及びＪ領域内では起こらない。好ましい選択はκ軽鎖定常領域である。
【００５５】
従って、内因性免疫グロブリン遺伝子の再構成又はｍＲＮＡ転写の排除は、大規模な遺伝子欠失方法には依存しない。同じ挿入方法が、重鎖アイソタイプのＣＨ１領域内での標的化挿入事象を介して軽鎖と共に機能性四量体複合体を形成する内因性重鎖免疫グロブリンの能力を阻害するために使用できる。好ましくは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現は、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６によって記述されたのと同様の方法を用いて、内因性重鎖がＢ細胞の表面で発現されず、Ｂ細胞増殖から生じる生産的発現がブロックされるようにプレＢ細胞段階でブロックされ、一方、内因性ＩｇＭの機能性ＣＨ１と軽鎖の結合は、免疫グロブリン重鎖と機能的に相互作用することができない軽鎖定常領域をコードするκ及び／又はλ軽鎖ｍＲＮＡの翻訳を導く挿入事象によって阻害され、機能性の内因性免疫グロブリン四量体の形成を妨げる。
【００５６】
内因性免疫グロブリン四量体の機能的集合が機能的に損なわれることを条件として、関連するＶＨドメインの親和性成熟を伴うＢ細胞発現は制限され、外因性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖導入遺伝子の存在と発現に依存する。免疫グロブリン導入遺伝子は、選択した非ヒト哺乳動物宿主の対立遺伝子排除プロセスにＢ細胞特異的に関与し、抗原投与に対する産生応答、Ｂ細胞の増殖、及び循環性の、導入遺伝子がコードする抗原特異的免疫グロブリン四量体を生じさせる。
【００５７】
また、内因性λ軽鎖遺伝子発現がλ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下し、内因性κ軽鎖遺伝子発現がκ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下している非ヒト哺乳動物が提供される。本発明の１つの実施形態では、内因性κ軽鎖の発現だけ又はλ軽鎖の発現だけが、関連するＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下する。
【００５８】
内因性軽鎖遺伝子座は、再構成することができ、機能性ｍＲＮＡに転写され得るという点で機能性を保持し得るが、転写のレベルは、内因性ＬＣＲの機能性の一部又は全部の除去を介して実質的に低下する（国際公開第ＷＯ９０／１００７７号）。ＬＣＲの機能性は、マウスＥＳ細胞中のヌクレアーゼ高感受性部位を遺伝子ターゲティングすることによって、又は、ＥＳ細胞が存在しない場合は、他の哺乳動物種に由来する核移植（Ｓｏｕｌｔｅｒ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３１５−３１６）又はｉＰＳ細胞（Ｇｏｔｔｗｅｉｓｓ．ａｎｄ Ｍｉｎｇｅｒ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６，２７１−２７２参照）のいずれかを使用したクローニングによって除去される。あるいは、重鎖又は軽鎖の破壊は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術及びＤＮＡ修復などの標的突然変異誘発を介して達成できる（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ａｎｄ−ｒｎａｉ／ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ−ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【００５９】
内因性κ軽鎖遺伝子発現は、κ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低減され得、λ軽鎖遺伝子は、欠失又は挿入事象後に機能的にサイレンシングされ得る。
【００６０】
内因性λ軽鎖遺伝子発現は、λ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低減され得、κ軽鎖遺伝子は、欠失又は挿入事象後に機能的にサイレンシングされ得る。
【００６１】
内因性κ軽鎖遺伝子は、ＬＣＲの除去又は挿入事象後に機能的にサイレンシングされ得る。
【００６２】
本発明はまた、内因性κ軽鎖遺伝子発現及び内因性λ軽鎖遺伝子発現のいずれか又は両方が、κ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去及び／又はλ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下している非ヒト哺乳動物を提供する。内因性κ遺伝子は機能的にサイレンシングされ得、λ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって内因性λ遺伝子活性は実質的に低減され得る。
【００６３】
κ軽鎖遺伝子発現は、κ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低減され得、λ遺伝子発現は機能的にサイレンシングされ得る。
【００６４】
内因性κ軽鎖遺伝子発現だけが、κ軽鎖ＬＣＲの除去によって実質的に低減され得るか、又は欠失若しくは挿入事象によって機能的にサイレンシングされ得る。
【００６５】
上述したような機能的にサイレンシングされた内因性κ及び／若しくはλ軽鎖遺伝子発現又は実質的に低下した内因性κ及び／若しくはλ軽鎖遺伝子発現を有する非ヒト哺乳動物はまた、低い又は機能的にサイレンシングされた内因性重鎖遺伝子発現を有し得る。１つの実施形態によれば、本発明の非ヒト哺乳動物において、内因性重鎖遺伝子発現は、ＬＣＲを含む一部又は全部の高感受性部位の欠失後に低下するか、又は欠失若しくは挿入事象後に機能的にサイレンシングされる。好ましくは、内因性重鎖遺伝子の発現は、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６によって記述されたのと同様の方法を用いて、内因性重鎖がＢ細胞の表面で発現されず、Ｂ細胞増殖から生じる生産的発現がブロックされるようにプレＢ細胞段階でブロックされる。
【００６６】
上述した非ヒト哺乳動物は、異種重鎖及び軽鎖遺伝子座並びに、好ましくは同族のＬＣＲを含む、関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する１又はそれ以上の導入遺伝子をさらに含み得る。
【００６７】
本発明に関して、「異種」という用語は、それが位置される哺乳動物にとって内因性ではない、本明細書で述べるヌクレオチド配列又は遺伝子座を意味する。
【００６８】
非ヒト哺乳動物は、従って、異種κ軽鎖遺伝子座及び、好ましくはＬＣＲを含む、関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子、並びに／又は異種λ軽鎖遺伝子座及び、好ましくはＬＣＲを含む、関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子を含み得る。
【００６９】
同族のＬＣＲの存在はＢ細胞特異的発現のために必須ではない。遺伝子座内にそれらを含むことは、高レベルの導入遺伝子発現があらゆる組込み部位で起こり、そのうちの一部だけがＢ細胞において活発に転写されるクロマチン領域内で偶発的に起こる、ランダムな組込み事象には依存しないことを確実にする。同族のＬＣＲの使用は、抗体発現のためにスクリーニングする必要があるトランスジェニック動物の数を有意に低減し、２以上の遺伝子座の挿入を可能にして、挿入されるすべての遺伝子座が基本的に正常なレベルでＢ細胞特異的に発現されることを確実にする。従って、ＬＣＲ技術の使用は、対立遺伝子排除機構が内因性免疫グロブリン遺伝子と多数の競合する導入遺伝子を識別するという驚くべき所見と合わせて、各々の遺伝子座が、内因性遺伝子に比べてＶ遺伝子の複雑性が低く、内因性遺伝子座（１〜２Ｍｂ）に比べてインビトロで構築するのに比較的扱い易いＤＮＡの断片（＜３００Ｋｂ）を含む、１又はそれ以上の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物の構築への道を開く。例えば、３９個の機能性ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメントを２又はそれ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座にクローニングし得る。各々は異なるＶ遺伝子セグメントを含むが、共通のＤ及びＪ遺伝子セグメント並びに定常（エフェクター）領域を有する。ＬＣＲを含むことは、各々がゲノム内の組込み部位にかかわらず同じように発現されることを確実にする。従って、このようにして２又はそれ以上の小さな遺伝子座を含むことは、技術的に操作が難しい単一の大きな遺伝子セグメント中に存在する１個のより複雑な遺伝子の同じＶ遺伝子の複雑性を提供する。
【００７０】
各々の異種軽鎖遺伝子座は、ＶＬ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び軽鎖定常領域セグメントを含み得る。好ましくは、ＶＬ及びＪ遺伝子セグメント並びに軽鎖定常領域セグメントは同じ哺乳動物ソース、例えばげっ歯動物、ブタ、ウシ、ヤギ又はヒツジに由来する。好ましくは、それらはヒト起源である。
【００７１】
あるいは、異種軽鎖遺伝子座は、哺乳動物起源、好ましくはヒト起源の可変ドメインと、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヤギ及びウシなどの、しかしこれらに限定されない異なる哺乳動物に由来する定常（エフェクター）領域を含むハイブリッド遺伝子座であってもよい。宿主哺乳動物がマウスである場合、好ましくは、定常領域はげっ歯動物起源、より好ましくはマウス又はラットである。そのような異種軽鎖遺伝子座は、好ましくは１つの種だけに由来するＶＬ及びＪセグメント並びにもう１つ別の種に由来する軽鎖定常領域を含む。
【００７２】
ハイブリッドκ軽鎖導入遺伝子を企図する場合、ＶＬ及びＪ遺伝子セグメントは、好ましくは同じ種に由来し、重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを与え、好ましくはヒト起源である。κ軽鎖定常領域及び重鎖定常領域も、好ましくは同じ種に由来するが、可変ドメインを与えるものとは異なる種であり、好ましくはげっ歯動物起源、好ましくはラット又はマウスに由来する。
【００７３】
企図されるすべての軽鎖導入遺伝子の特徴は、抗原投与後、軽鎖がＢ細胞特異的に再構成されること、並びに、転写及び翻訳後、生じる軽鎖が同じＢ細胞において産生される導入遺伝子由来の重鎖免疫グロブリンと複合体化できることである。免疫グロブリン四量体の生産的発現はＢ細胞の増殖を生じさせ、導入遺伝子がコードする抗原特異的な四価免疫グロブリン複合体が、有意のレベルの内因性免疫グロブリン四量体の不在下で血清中に蓄積する。
【００７４】
内因性λ軽鎖発現が機能的に抑制されなかった場合、内因性λ軽鎖を含む低いレベルの宿主抗体又はハイブリッド抗体が検出され得る。これらは、ハイブリドーマ上清のスクリーニング後に廃棄し得る。
【００７５】
ヒトでは、３６個の機能性κＶＬ遺伝子セグメント、５個のＪＬ遺伝子セグメント及び１個のκ軽鎖定常領域（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）が存在する。好ましくは、本発明の非ヒト哺乳動物において導入遺伝子中に存在する異種κ軽鎖遺伝子座は、１又はそれ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメント、すべてのヒトＪＬ遺伝子セグメント及び１つのヒトκ軽鎖定常領域を含む。場合により、ヒトκ軽鎖定常領域は代替的な哺乳動物κ軽鎖定常領域、好ましくはラット又はマウス起源のκ軽鎖定常領域によって置換されていてもよい。
【００７６】
本発明の非ヒト哺乳動物において導入遺伝子中に存在する異種λ軽鎖遺伝子座は、好ましくはマウスλＬＣＲ、並びにヒトλ軽鎖Ｖ１及びＶ２遺伝子セグメント、ヒトλＪ１、Ｊ２、Ｊ３及びＪ４遺伝子セグメント、並びにヒトλ軽鎖Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４定常領域セグメントを含む（国際公開第ＷＯ９０／１００７７号及び同第ＷＯ２００３／０００７３７号）。場合により、ヒトλ軽鎖Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４定常領域セグメントは、代替的なλ軽鎖定常領域、好ましくはラット又はマウス起源のλ軽鎖定常領域によって置換されていてもよい。
【００７７】
本発明の非ヒト哺乳動物において導入遺伝子中に存在する異種重鎖遺伝子座は、好ましくは重鎖免疫グロブリンＬＣＲ、好ましくはマウス起源の重鎖免疫グロブリンＬＣＲ、１又はそれ以上のヒトＶ遺伝子セグメント、１又はそれ以上のＪ遺伝子セグメント、及び１又はそれ以上のＤ遺伝子セグメントを含む。好ましくは、１０又はそれ以上のヒトの異なるＶ遺伝子セグメント並びにすべてのヒトＪ及びＤ遺伝子セグメントが存在する。
【００７８】
遺伝子座はまた、１又はそれ以上のヒト定常（エフェクター）領域、好ましくはμ及びγ定常領域を含み得る。場合により、ヒト定常エフェクター領域は、他の非ヒト哺乳動物由来のエフェクター領域によって置換されていてもよい。非ヒト哺乳動物宿主がマウス又はラットである場合、好ましくは、定常（エフェクター）領域はラット又はマウスに由来する。ヒトと異なり、マウス及びラットのＢ細胞受容体複合体（ＢＣＲ）の膜貫通ドメインは１００％保存されている。従って、ラット定常（エフェクター）領域遺伝子を含む抗体遺伝子座に関してトランスジェニックであるマウスは、抗原投与後にマウス定常（エフェクター）領域遺伝子を含むものと同様に機能するはずであり、ヒト定常（エフェクター）領域遺伝子を含むものを上回り得る（Ｄｅ Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７６６，１９５−２０１）。導入遺伝子は、好ましくはマウス又はヒト起源の、重鎖、κ及びλ軽鎖ＬＣＲを含み得る。すべての哺乳動物種全体にわたって機能するＬＣＲは公知であり、導入遺伝子中のヒト又はマウスＬＣＲを置換し得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１０，４０３−８）。
【００７９】
完全ヒト抗体の作製を企図する場合、ハイブリドーマによって発現されたハイブリッド抗体に由来するクローニングされたヒト抗原特異的ＶＨ及びＶＬ結合ドメインをヒト重鎖及び軽鎖定常領域に融合することができ、そのようにして任意のクラスの完全ヒト四量体抗体を誘導することができる。
【００８０】
さらなる改良として、各々の免疫グロブリンκ及び／又はλ軽鎖遺伝子座はまた、優性選択マーカー遺伝子を含み得る。
【００８１】
遺伝子座に組み込まれた優性選択マーカー遺伝子は、同じか又は異なる作用機構を有し得る。本発明のために、遺伝子の発現が選択的又は毒性攻撃誘発の存在下で非ヒトトランスジェニック哺乳動物に由来するハイブリドーマ又は形質転換Ｂ細胞に選択上の利益を付与することを条件として、任意の優性選択マーカー遺伝子が使用できる。典型的には、優性選択マーカー遺伝子は原核生物起源であり、ピューロマイシン（Ｖａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＮＡＲ，１４，４６１７−４６２４）、ハイグロマイシン（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ，３０，１４７−１５６）及びＧ４１８（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）１５０，１−１４）などの毒性薬剤に対する耐性を付与する群から選択されるか、又はそれらの発現が毒性物質を必須アミノ酸に変換するように、例えばインドールのトリプトファンへの変換又はヒスチジノールのヒスチジンへの変換（Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，（１９８８）ＰＮＡＳ，８５，８０４７−８０５１）のように特定の栄養必要条件を不要にする遺伝子を含む。
【００８２】
本発明のこの態様の必要要件は、優性選択マーカー遺伝子が免疫グロブリン軽鎖トランスジェニック遺伝子座内に組み込まれ、所望の免疫グロブリン軽鎖対立遺伝子と同時発現されて、それによりＢ細胞特異的発現を確実にすることである。あるいは、薬剤耐性遺伝子を、ＥＳ細胞又は核移植アプローチと組み合わせた相同組換えを使用して内因性又は外因性（トランスジェニック）免疫グロブリン遺伝子座に挿入してもよい（ｔｅ Ｒｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２），ＰＮＡＳ，８９，１１，５１２８−５１３２）。
【００８３】
非ヒト哺乳動物はまた、異種重鎖遺伝子座並びに関連するＢ細胞特異的ＬＣＲ及び調節エレメントを含有する１又は複数の導入遺伝子を含み得る。各々がＬＣＲと調節エレメントを含有する２以上の異なるトランスジェニック重鎖遺伝子座が存在してもよい。
【００８４】
各々が１又はそれ以上のＶ遺伝子セグメント、１又はそれ以上のＤ遺伝子セグメント、１又はそれ以上のＪ遺伝子セグメント、及び１又はそれ以上の定常（エフェクター）領域を含む重鎖遺伝子座を、各々の遺伝子座が同族のＬＣＲを含む導入遺伝子として導入する。
【００８５】
各々の遺伝子座は、Ｂ細胞特異的発現を推進するために必要な５’及び３’調節エレメントを含む。各々の重鎖又は軽鎖遺伝子座は、抗原投与に応答して内因性遺伝子座と基本的に同様に発現され、導入遺伝子がコードする抗原特異的親和性成熟四量体免疫グロブリンのマウス血清中での循環を導く。
【００８６】
好ましくは、各々の重鎖遺伝子座は、１又は複数のＶ遺伝子セグメント、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、６０又はそれ以上のＶ遺伝子セグメントを含み、それらは任意の脊椎動物種、好ましくは非ヒト哺乳動物に由来し得る。好ましくは２０以下のＶ遺伝子セグメントが任意の単一重鎖遺伝子座上に存在する。
【００８７】
１つの実施形態では、各遺伝子座は、１つだけのＶ遺伝子セグメントを含み得る。この実施形態の１つの選択的形態では、多くのＶ遺伝子セグメントが存在し、各々のＶ遺伝子セグメントはすべての他のＶ遺伝子セグメントと異なる。この実施形態では、任意の１つの遺伝子座のＶ遺伝子セグメントはすべて同じ種の生物に由来してよく、例えばすべてのＶ遺伝子セグメントがヒト起源であってよい。あるいは、任意の１つの遺伝子座のＶ遺伝子セグメントは異なる種の生物に由来してよく、例えば一部のＶ遺伝子セグメントはヒトに由来し、その他はヒツジ、ウシ、ウサギ、ラクダ科の動物、さらにはサメに由来してもよい。第二の選択的実施形態では、各々のＶ遺伝子セグメントはその他のすべてのＶ遺伝子セグメントと同一である。存在するＶ遺伝子セグメントの数及び性質にかかわらず、各遺伝子座中の残りのＤ及びＪ遺伝子セグメントは同じであってもよく、又はその他のすべての遺伝子座におけるものと異なってもよい。
【００８８】
従って、非ヒト哺乳動物は、１つの重鎖遺伝子座の複数のコピーを含有し得ることが想定される。これは、Ｂ細胞において生産的再構成が起こる可能性を最適化し、従って抗原認識のための免疫グロブリン重鎖の最適な産生を可能にするという利点を有する。
【００８９】
もう１つの実施形態では、各々の遺伝子座は複数のＶ遺伝子セグメントを含む。
【００９０】
好ましくは、Ｖ遺伝子セグメントはヒト起源である。
【００９１】
「Ｖ遺伝子セグメント」という用語は、サメ、げっ歯動物、ラクダ科の動物及びヒトを含むがこれらに限定されない、脊椎動物に由来する任意の天然に生じるＶ遺伝子セグメントを包含する。Ｖ遺伝子セグメントは、再構成された核酸がＢ細胞において発現されたときκ又はλ免疫グロブリン軽鎖と複合体化することができる免疫グロブリン重鎖抗体を生成するために、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び重鎖定常（エフェクター）領域をコードする遺伝子セグメントと組み換えることができなければならない。
【００９２】
Ｖ遺伝子セグメントはまた、再構成された核酸がＢ細胞において発現されたときκ又はλ免疫グロブリン軽鎖と複合体化することができる免疫グロブリン重鎖抗体を生成するために、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントと組み換えることができる、天然又は操作された、ホモログ、誘導体、又はタンパク質のフラグメントをコードする任意の遺伝子配列をその範囲内に含む。Ｖ遺伝子セグメントは、例えばＴ細胞受容体遺伝子座に由来し得る。
【００９３】
好ましくは、本発明の複数の重鎖遺伝子座は、３９個の機能性ヒトＶ遺伝子セグメント及びその操作された変異体の任意の数又は組合せを含む。これらは、任意の数の遺伝子座、例えば８個のＶ遺伝子セグメントを含む４つの遺伝子座に加えて７個のＶ遺伝子セグメントを含む１つの遺伝子座；４個のＶ遺伝子セグメントを含む７つの遺伝子座に加えて３個のＶ遺伝子セグメントを含む１つの遺伝子座；又は各々１個のＶ遺伝子セグメントを含む３９の遺伝子座上に存在し得る。
【００９４】
ヒトＶ遺伝子は、ＶＨ１〜ＶＨ７の７つのファミリーに分類され、各ファミリー内の個々の遺伝子に番号が付されている。各遺伝子が使用される頻度は、特定の免疫応答の様々な必要条件に依存する。例えば、ＶＨ３ファミリーの遺伝子は、細菌抗原に対して応答する場合、ＶＨ５ファミリーのものと比較して選択的に使用され得る。そのため、本発明のさらなる好ましい実施形態では、特異的抗原に対する抗体応答を生じさせるために有用であることが示されたＶ遺伝子セグメントの群は、各々が異なる優性選択マーカー遺伝子を含む別々の遺伝子座に分類される。Ｖ遺伝子セグメントは、ファミリーによって分類され得るか、又は個々の機能によって分類され得る。例えば、ＶＨ３ファミリーのＶ遺伝子が細菌抗原に対する免疫応答を生じさせるために有用であることが示された場合、これらは、細菌抗原に対する重鎖のみ抗体を生成するために特に有用な遺伝子座を作製するのに使用され得る。あるいは、ＶＨ３及びＶＨ５ファミリーからのいくつかの個別遺伝子が細菌抗原に対する免疫応答を生じさせるために有用であることが示された場合、これらは一緒に分類され、細菌抗原に対する抗体を生成するために特に有用な遺伝子座を作製するのに使用され得る。
【００９５】
本発明に関連して「免疫グロブリン重鎖遺伝子座」は、重鎖定常（エフェクター）領域をコードする１又はそれ以上の遺伝子セグメントに操作的に連結された、１又はそれ以上のＶ遺伝子セグメント、１又はそれ以上のＤ遺伝子セグメント及び１又はそれ以上のＪ遺伝子セグメントを含むＶＨドメインをコードする最小マイクロ遺伝子座に関する。好ましくは、抗体レパートリーの可変性の主要な原因は、Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの選択とＶ−Ｄ及びＤ−Ｊ結合とによって形成されるＣＤＲ３領域である。
【００９６】
本発明の利点は、再構成されたＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントにおいて得られる抗体レパートリー及び多様性を、対立遺伝子排除を利用することにより、同じトランスジェニック非ヒト哺乳動物における複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子座の使用を介して最大化できることである。遺伝子座の１つを無作為に選択して組換えを開始させ、続いて、最初の組換えが非生産的等であった場合は、生産的な組換えが遺伝子座の１つから生成されるまで次の遺伝子座を選択する、対立遺伝子排除のプロセスは、実際上組み合わせた遺伝子座内に存在するすべてのＶ遺伝子セグメントが全体的な組換えプロセスの一部となることを確実にする。
【００９７】
ＶＤＪ再構成に生産的に関与する任意の所与の免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるすべてのＶＨ遺伝子セグメントの確率を高めるために、ＣＴＣＦ部位をＶＨ遺伝子セグメントの群の間に分散させてもよい。
【００９８】
その正常な立体配置の免疫グロブリン遺伝子座は、Ｂ細胞において行われた、ＶＨ領域の方向に及びＶＨ領域を通して測定した距離測定に基づき、三次元折りたたみ構造を有すると思われる（Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ，１３３，２６５−２７９）。異なるＶＨ領域が、それらが免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ、Ｊ及び定常領域から極めて異なる距離に配置されている場合でも等しく効率的に使用され得る理由が、そのような折りたたみ又はループ構造により説明される。
【００９９】
また、多くの遺伝子座におけるループ化によって形成される折りたたみ構造は、ＣＴＣＦと呼ばれる特定のクロマチン結合タンパク質を介して媒介されることが最近明らかになった。ＣＴＣＦは、突然変異誘発実験によって明らかにされたように（Ｓｐｌｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２０，２３４９−２３５４）クロマチンループの形成に直接関与すると思われる。ごく最近、姉妹染色分体を結びつけるタンパク質複合体、コヒーシンがＣＴＣＦ結合部位に存在することが示された（Ｗｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ，４５１，７９６−８０１）。免疫グロブリンＶＨ領域からの多くのＣＴＣＦ部位を含むことは（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ，１２８，１２３１−１２４５；Ｄｅｎｇｅｒ，Ｗｏｎｇ，Ｊａｎｋｅｖｉｃｉｕｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８２，４４−４８）、トランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＶＨ領域が正しく折りたたまれ、その遺伝子座に存在するすべての異なるＶ遺伝子セグメントの効率的な利用を可能にし得る確率を高める。
【０１００】
異種重鎖遺伝子座を含む各々の導入遺伝子は、優性選択マーカーをさらに含み得る。好ましくは、優性選択マーカーは、κ又はλ軽鎖遺伝子座内に導入される優性選択マーカーとは異なる。
【０１０１】
本発明のために、遺伝子の発現が選択的又は毒性攻撃誘発の存在下で非ヒトトランスジェニック哺乳動物に由来するハイブリドーマ又は形質転換Ｂ細胞に選択上の利益を付与することを条件として、任意の優性選択マーカー遺伝子が使用できる。典型的には、優性選択マーカー遺伝子は原核生物起源であり、ピューロマイシン（Ｖａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＮＡＲ，１４，４６１７−４６２４）、ハイグロマイシン（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ，３０，１４７−１５６）及びＧ４１８（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）１５０，１−１４）などの毒性薬剤に対する耐性を付与する群から選択されるか、又はそれらの発現が毒性物質を必須アミノ酸に変換するように、例えばインドールのトリプトファンへの変換又はヒスチジノールのヒスチジンへの変換（Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ，８５，８０４７−８０５１参照）のように特定の栄養必要条件を不要にする遺伝子を含む。
【０１０２】
本発明の必要要件は、優性選択マーカー遺伝子が、使用される場合、免疫グロブリン重鎖トランスジェニック遺伝子座内に存在し、それによりＢ細胞特異的同時発現を確実にすることである。あるいは、薬剤耐性遺伝子を、ＥＳ細胞又は核移植アプローチと組み合わせた相同組換えを使用して内因性又は外因性（トランスジェニック）免疫グロブリン遺伝子座に挿入してもよい（例えばｔｅ Ｒｉｅｌｅ，Ｒｏｂａｎｕｓ Ｍａａｎｄａｇ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ（１９９２），ＰＮＡＳ，８９，１１，５１２８−５１３２）。
【０１０３】
同じ優性選択マーカー遺伝子をすべての重鎖遺伝子座内に組み込んでもよい。あるいは、異なる重鎖遺伝子座又は重鎖遺伝子座の群は、異なる優性選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【０１０４】
四量体抗体を発現する本発明のトランスジェニックマウスに由来する、ハイブリドーマ又は形質転換Ｂ細胞、好ましくは形質転換長命形質細胞（Ｓｌｉｆｋａ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，８，３６３−３７２）を、トランスジェニック軽鎖遺伝子座内の機能的優性選択マーカー遺伝子の同時発現により、内因性免疫グロブリンを発現する細胞を含まないように選択し得る。さらに、トランスジェニック重鎖遺伝子座に存在するＶセグメントの特定の群に由来する抗体を発現するハイブリドーマ又は形質転換Ｂ細胞株も、軽鎖遺伝子座内に組み込まれた優性選択マーカーと比較して、重鎖遺伝子座内の異なる優性選択マーカーの存在と同時発現により、選択し得る。例えば、κ軽鎖トランスジェニック遺伝子座以内にピューロマイシン耐性遺伝子を含むことは、κ軽鎖導入遺伝子を発現するすべての細胞の選択を可能にする。あるいは、好ましいＶ遺伝子セグメントを含む重鎖トランスジェニック遺伝子座内にＧ４１８耐性遺伝子を含むことは、好ましいＶ遺伝子セグメントを発現するすべての細胞の選択を可能にする。
【０１０５】
特に、本発明は、抗原特異的異種モノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）上述した非ヒトトランスジェニック哺乳動物を抗原で免疫するステップと、
（ｂ）免疫したトランスジェニック哺乳動物のＢ細胞由来のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を調製するステップと、
（ｃ）異種免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子内に存在する優性選択マーカー遺伝子を使用して、異種抗体を発現する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｄ）抗原に特異的に結合する抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと
を含む方法を提供する。
【０１０６】
ここで、単に例示として、以下の詳細な説明において以下の図面を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１Ａ：マウスＩｇＨ遺伝子座の３’末端。 マップはＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆ）からコピーしたものである。尺度はキロベース（ｋｂ）である。緑色の四角は機能性ＶＨセグメント；赤色及び黄色の四角は非機能性ＶＨセグメント；橙色の四角はＪＨセグメント；青色の四角は定常領域である。イントロンＩｇＨエンハンサー及び遺伝子座の３’末端のＬＣＲは示していない。 図１Ｂ：ＩｇＨを無効にする方法 上の列は、膜形態のＩｇＭをコードする２つのエクソンを含む種々のエクソンを有するマウスのＣμ領域を示す。左側は遺伝子座のＪ、Ｄ及びＶＨ領域、右側はＣδから始まるその他の定常領域である。下の列は、組換え後の正常なＭ１エクソンのアミノ酸配列の一部を示す。ＤＮＡ配列は組込み配列を示す。終止コドンは赤色、ＳｐｅＩ部位は赤色と青色である。 図１Ｃ：Ｃμを無効にするためのＥＳ細胞における組換え この図は、組換え挿入物の３’側をカバーするＰＣＲ分析によるＥＳ細胞の組換え陽性クローンのうちの２つを示す。大きい方のフラグメントは、図５Ｂで指示する位置でのＭ１エクソンへのｎｅｏ選択マーカーの挿入に対応する。 図１Ｄ：ＣμノックアウトマウスのＦＡＣＳ分析 Ｍ１エクソンを終止コドンとｎｅｏ遺伝子によって中断した後、ＥＳ細胞を胚盤胞に導入してキメラを得る。これらを同型接合に育種し、血液をＢ細胞の存在に関して分析する。上の２つのパネルは、Ｂ細胞マーカーＢ２２０及びＣＤ１９を使用した正常野生型マウスと異型接合の中断されたＭ１エクソンマウスのＦＡＣＳ分析を示す。下の２つのパネルは２匹の同型接合マウスを示し、Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋細胞、すなわち機能性Ｂ細胞は存在しない。 図１Ｅ：組換えマウスへの育種後のｎｅｏの欠失 図５Ｄのマウスを組換え酵素発現マウスと交配して、ｎｅｏ遺伝子を欠失させる。右側の２つのレーンは、親動物におけるｎｅｏ遺伝子にわたるロングレンジＰＣＲ産物を示し、左側の次の２つのレーンは、ｎｅｏの欠失と野生型対立遺伝子を有する２匹の異型接合マウスを示す。左側の次の４つのレーンは野生型マウスであるが、最も左側のレーンは、ｎｅｏ遺伝子の同型接合欠失と不活性化Ｍ１エクソンを有するマウスを示す。
【図２】図２：マウスＩｇκ遺伝子座のマップ マップはＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆ）からコピーしたものである。尺度はキロベース（ｋｂ）である。緑色の四角はＶκセグメント；橙色の四角はＪκセグメント；青色の四角は定常領域；黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列である。
【図３】図３：マウスＶκノックダウン ＬＣＲの欠失によってマウスＩｇκ遺伝子を機能的に不活性化するためのスキーム。 ｌｏｘネオマイシン耐性遺伝子カセットを、３’κ−ＬＣＲ（下の列）を置換するＥＳ細胞における相同組換えによって挿入する。ｃｒｅ組換え酵素による処理（＋ｃｒｅ）はｌｏｘ部位の間のすべての配列を除去し、κ遺伝子座内に単一ｌｏｘ部位を残す（上の列）。
【図４】図４：κ遺伝子座を不活性化するためのマウスＣκの挿入 遺伝子座（上の列）は図３と同じである。下の列は、Ｃκエクソン（上の列中の青色）の５’末端の配列を示し、塩基の上部にアミノ酸コードを記載している。起始部のＧＧ塩基対は、スプライシング後のアミノ酸Ｒをコードするスプライス受容部位に直接隣接している。中央の列は３４塩基対のｌｏｘ部位挿入物（青色及び赤色の逆方向反復配列）の挿入を示し、これは、定常領域のコドン使用頻度をフレーム外に置き、下流に終止コドンを作製する（例えば太字の（ｆａｔ ｐｒｉｎｔ）下線を付したＴＧＡ）。黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列である。
【図５】図５：マウスＣκの挿入 遺伝子座（上の列）は図３と同じである。下の列はＣκエクソン（上の列中の青色）の５’末端の配列を示し、塩基の上部にアミノ酸コードを記載している。起始部のＧＧ塩基対は、スプライシング後のアミノ酸Ｒをコードするスプライス受容部位に直接隣接している。中央の列は、ｌｏｘ配列（青色及び赤色の逆方向反復配列）及び４つの終止コドンを含む４６塩基対の挿入物の挿入を示し、これもやはり、定常領域のコドン使用頻度をフレーム外に置き、下流に終止コドンを作製する（例えば太字の下線を付したＴＧＡ）。黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列である。
【図６】図６Ａ：マウスＣκ定常領域終止コドン及びフレームシフトの挿入 遺伝子座（上の列）は図３と同じである。下の列はＣκエクソン（黒色）の配列の一部を示し、塩基の上部にアミノ酸コードを記載している。中央の列はＣκコード領域の配列の一部を示す。その上の列は、ｌｏｘ配列（青色及び赤色の逆方向反復配列）、３つの終止コドンを含む４４塩基対の挿入物の挿入を示し、これもやはり、定常領域のコドン使用頻度をフレーム外に置き、下流に終止コドン（ＴＡＡ）を作製する。黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列であり、挿入のために使用したＨｐａＩ部位を赤色で示す。 図６Ｂ：Ｃκを無効にするためのＥＳ細胞における組換え ゲルは、図１３Ａに例示する、ＥＳ細胞におけるＣκ組換えの多くのクローンの挿入部位にわたるＰＣＲ増幅の結果を示す。クローン３５１及び６２３は陽性であり、これらを胚盤胞に注入してＩｇκ陰性マウスを作製する。
【図７】図７：ヒトＩｇκ遺伝子座 マップはＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆ）からコピーしたものである。尺度はキロベース（ｋｂ）である。緑色の四角は機能性Ｖκセグメント；赤色及び黄色の四角は非機能性Ｖκセグメント；橙色の四角はＪκセグメント；青色の四角は定常領域；黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列である。
【図８】遺伝子導入のためのハイブリッドヒト／ラットＩｇκ遺伝子座の作製 遺伝子座の３’末端を、マウスκ３’エンハンサー（黄色）を含むマウス（黄色）から得る。マウス定常領域コード配列を、ラットゲノムＤＮＡからロングレンジＰＣＲによって得たその５’エンハンサーを含むラットの定常領域コード配列（赤色）で置換する。Ｖ領域とＪ領域の間の適切な間隔を維持するために、Ｖκ４−１からヒトＪκ配列までの下流ヒトセグメントをマウス（黄色）から得る。ヒトＪκセグメントを、ヒト遺伝子座のこの部分をカバーするＰＡＣ（緑色）から得る。緑色の四角は、個別に又はブロックとして（本文参照）付加したＶκセグメントである。ＰＡＣベクター中に存在するピューロマイシン耐性遺伝子を赤色で示し、黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列を示す。
【図９】図９：ＶＨ４重鎖遺伝子座のマップ ５’末端にネオマイシン選択マーカーを含むこの遺伝子座をヒト／マウスハイブリッド遺伝子座の構築のための出発物質として使用する。この遺伝子座は、国際公開第ＷＯ２００８／０３５２１６号に記載されているように構築する。尺度はキロベースである。この遺伝子座は、４つのＶＨ領域（１−４６、３−５３、３−２３、３−１１）、ヒトＤセグメントの全部、ヒトＪセグメントの全部及びＩｇＧ定常領域と３’ヒトＩｇＨ ＬＣＲを含む。
【図１０】図１０：４つのＶＨヒト／ラット定常領域ＩｇＨ遺伝子座の作製 ＶＨ４ヒト遺伝子座中に存在するＣｅｕＩ部位（図６）を使用して、ラットゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅したラット定常コード領域及びスイッチ領域を付加することによってヒト／ラット遺伝子座を作製する。同様にマウスＬＣＲ領域をマウスゲノムＤＮＡからいくつかのフラグメントとして増幅し、最初にそれらを一緒にクローニングして完全なマウスＩｇＨ ＬＣＲを作製する。４つのＶＨセグメント、ヒトＤセグメントの全部及びヒトＪセグメントの全部を含むヒトＶＨ４遺伝子座の５’末端（図６）。すべてのヒト配列は青色であり、すべてのマウス配列は明緑色、ラット配列は赤色であり、ネオマイシン耐性遺伝子は紫色で示す。
【図１１】図１１：λＬＣＲを含むＩｇλエンハンサーの欠失 λ遺伝子座エンハンサーを、エンハンサー２−４に隣接する領域に相同な配列によって隣接されたハイグロマイシン耐性遺伝子及び４−１０エンハンサーに隣接する領域に相同なセグメントによって隣接されたブラスチシンＳ耐性遺伝子を使用して、標準的な置換ベクターを用いた相同組換えによって除去する。置換は、エンハンサーを喪失したλ遺伝子座を生じさせ、発現低下を示す。ハイグロマイシン耐性遺伝子を赤色で示し、ブラスチシンＳ耐性遺伝子を橙色で示す。マウスＶλセグメントは緑色であり、Ｊセグメントは黄色、定常領域は青色である。マップはＩＭＧＴデータベースからコピーしたものである。
【図１２】図１２：遺伝子導入のためのヒト／ラットＶκ遺伝子座 遺伝子座は図８と同じであるが、付加的なヒトＶκセグメントを遺伝子座に加えた。生じた遺伝子座は、頻繁に及び中等度の頻度で使用されるヒトＶκセグメントの全部を含む。緑色の円及び緑色の線はマウスκ−エンハンサー及びイントロン；赤色の四角及び円はラットκ−定常領域及びエンハンサー：青色の四角はヒトＶＨセグメント；暗青色はピューロマイシン選択マーカーである。
【図１３】図１３Ａ：ヒト／ラットハイブリッド遺伝子座の作製 ＶＨ領域を一緒に連結して、ＳｃｅＩ部位の間にクローニングした１７個の連続するヒトＶＨ領域のコンカテマーにすることによって遺伝子座を作製する。ＤＨセグメントとＪＨセグメントの間に適切な距離を保持するために、ヒトＤＨ及びＪＨセグメント全部を含むヒト４０ｋｂフラグメントにマウススペーサー領域を付加する。これに続いてＳｃｅＩ部位を含むＶＨ６−１セグメントを付加する。次にコンカテマーをＶＨ６−１に付加する。最後に、様々なラット定常領域とマウスＬＣＲを３’側に付加する。生じる遺伝子座は、頻繁に及び中等度の頻度で使用されるヒトＶＨセグメントの全部を含む。 図１３Ｂ：ヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座の出発構築物 ゲルは、ＶＨ６−１の付加後のヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座構築の第一段階の結果を示す。右側のレーンは、クローニングしたプラスミドの２つのＮｏｔＩ消化物を示す。レーン（ＮｏｔＩ×ＭｌｕＩ）は、ベクター中で正しい方向を有するレーン１のプラスミドを示し、レーン２のプラスミドは誤った方向を有する。レーン１のプラスミドを遺伝子座の作製における次の段階に使用する。 図１３Ｃ：ＶＨセグメントのコンカテマー ゲルは、１７の異なるＶＨ領域のコンカテマーのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ消化物を示す。マーカーレーンは、ＢｓｔＥＩＩで消化したλファージＤＮＡを含む。
【図１４】図１４：トランスジェニックヒト／ラット重鎖免疫グロブリン遺伝子座 同じ動物に導入した２つの重鎖遺伝子座の一例。ある重鎖遺伝子座の別の重鎖遺伝子座に対する選択は対立遺伝子排除を介する。付加的なＶＨセグメントを遺伝子座の各々に加えることができる。あるいは、さらなる重鎖遺伝子座を使用して付加的なＶＨセグメントを導入することができる。明らかに、κ又はλ軽鎖遺伝子座に関する多様性を高めるために同じ方法が使用できる。
【図１５】図１５：ヒト／ラットλトランスジェニック軽鎖遺伝子座 ヒト／ラット遺伝子座の一例を示す。その３’末端を、マウスλ３’ＬＣＲ（黄色）を含むマウス（黄色）から得る。マウス定常領域コード配列を、ラットゲノムＤＮＡからのロングレンジＰＣＲによるラットの定常領域コード配列（赤色）で置換する。Ｖ領域とＪ領域の間に適切な間隔を維持するために、Ｖλ２−１４からヒトＪκ配列までの下流ヒトセグメントをマウス（黄色）から得る。ヒトＪλセグメントを、ヒト遺伝子座のこの部分をカバーするヒトＰＡＣ（青色）のロングレンジＰＣＲによって得る。青色の四角は、個別に又はブロックとして付加したＶλセグメントである。ＰＡＣベクター中に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子は紫色である。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
＜実施例＞
以下の実施例では、ハイブリッドヒト／ラット重鎖及び軽鎖遺伝子座を、常套的な遺伝子導入手順である受精卵への微量注入によって導入された導入遺伝子として発現するトランスジェニックマウスを作製する。卵供与マウスを、内因性マウス重鎖遺伝子及びマウス軽鎖遺伝子を発現しない又は前記遺伝子の非常に低い発現を有するように改変する。マウスには、κ及びλ鎖について２つの軽鎖遺伝子座があり、そのうちλはマウスＨ２Ｌ２抗体の約２％においてのみ使用される。実施例は、従って、ＩｇＨ遺伝子座と不活性化された内因性κ遺伝子座だけを有するマウス又はＩｇＨと不活性化されたκ遺伝子座を有し、λ遺伝子座の発現をさらに一層低下させるためにλ遺伝子座の調節配列が除去されたマウスのいずれかにおけるものである。
【０１０９】
重鎖及び軽鎖遺伝子座の構築、抗原投与後のトランスジェニックマウスの作製とスクリーニングのために使用される方法は、ＣＨ１ドメインがすべての重鎖遺伝子座で保持されることを除き、基本的に以前に記述されているとおりである（Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＰＮＡＳ，１０，１０３（４１），１５１３０−５、国際公開第ＷＯ２００６／００８５４８号、同第ＷＯ２００７／０９６７７９号、英国特許第ＧＢ０８０５２８１．３号及び英国特許第ＧＢ０８０５２８１．３号の優先権を主張して２００８年６月１１日に出願されたＰＣＴ出願）。機能性異種免疫グロブリン遺伝子座を発現する及び／又は操作された内因性遺伝子座を有する、マウス以外の哺乳動物を含む脊椎動物を誘導するための一般的な方法は、国際公開第ＷＯ２００６／０４７３６７号に記載されている。以下の実施例では、ＥＳ細胞における組換えを使用し、改変されたＥＳ細胞を使用して所望特性を有するマウスを作製する。しかし、同じ手順を誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）において実施することができ、次にそれらを使用してマウスを作製する（例えばＢｏｌａｎｄ，Ｈａｚｅｎ，Ｎａｚｏｒ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｇｉｆｆｏｒｄ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｋｕｐｒｉｙａｎｏｖ ａｎｄ Ｂａｌｄｗｉｎ（２００９），４６１，７２６０，９１−４及びその中の参考文献）。あるいは、体細胞又は体性幹細胞において改変を実施し、その後それらをｉＰＳ細胞に再プログラムして改変マウスを作製する。また、改変造血幹細胞を、Ｂ細胞を欠くレシピエントマウスに移植して、ヒト又はヒトハイブリッド抗体を作製することができる。
【実施例１】
【０１１０】
この実施例では、ＫｉｔａｍｕｒａとＲａｊｅｗｓｋｙによって公表されたのと同様の方法でＩｇＨ遺伝子座（図１Ａ）を不活性化するが、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６が述べたものよりも１アミノ酸前の位置でＣμ領域に終止コドンを導入する点が異なる。ＥＳ（又はｉＰＳ）細胞を、マウスＩｇＭ遺伝子の第一膜エクソンの２番目のコドンを終止コドンに変更した構築物でトランスフェクトした。これは、トランスフェクションのためのｎｅｏ選択を含む常套的な手順を含む。組換えの成功を観測できるようにＳｐｅＩ部位を組換え配列に含めた（図１Ｂ）。その後ＥＳ細胞をサザンブロット法によってスクリーニングし、成功した組換えクローンを確認する。これは、１０の正しい組換え体を生じた（例えば図１Ｃ）。これらのうちで、３つをマウス胚盤胞に注入してキメラを得、その後それらを育種して、ＩｇＨ突然変異に関して同型接合のマウスを得た。そのようなマウスのＢ細胞のＦＡＣＳ分析（Ｂ２２０対ＣＤ１９）は、末梢血中にＢ細胞が存在しないことを示す（図１Ｄ）。その後マウスを組換え酵素発現マウスと交配し、ｎｅｏ遺伝子を除去した（図１Ｅ）。同様に、マウスＩｇκ遺伝子座（図２）をＥＳ細胞における組換えによって不活性化又は低減させる（図２、３、４〜６）。生じたκ不活性化マウスを重鎖ＫＯマウスと交配する。３’κ遺伝子ＬＣＲを、ｌｏｘ部位によって隣接されたｎｅｏ耐性マーカーで置換することによって活性のノックダウンを達成する（図３）。ｎｅｏ遺伝子は、場合により組換え酵素での処理によって除去する。
【０１１１】
あるいは、κ対立遺伝子をＩｇＨのＫＯ細胞において直接ノックアウトすることができる。いくつかの異なる方法がκ不活性化を達成するために使用できる。κ遺伝子の活性のブロッキングは、ｌｏｘ部位によって隣接されたｎｅｏ遺伝子をＣκエクソンの５’末端に挿入するＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞における相同組換えを使用するによって（図４）、又はｌｏｘ部位によって隣接されたｎｅｏ遺伝子と終止コドンをコードする付加的な配列を挿入することによって（図５及び６Ａ）達成できる。組み換えたＥＳ細胞をｃｒｅで処理することにより、フレーム外の配列が残るか（図４）又は新しい終止コドンが付加的に含まれる（図５〜６Ａ）。図６Ｂは、図６Ａに示す構築物のトランスフェクション後のＥＳ細胞における組換え結果を示し、不活性化された１個のＣκ対立遺伝子を有する２つのＥＳ細胞クローンを生じる（合計で５つのそのようなクローンを得た）。２つのｌｏｘ部位の間の領域を除去するためにアクチン駆動組換え酵素プラスミドでの標準的な一過性トランスフェクションによって細胞を組換え酵素で処理する。その後前記細胞を使用して常套的な方法によってマウスを作製し、その子孫を育種して同型接合マウスを得る。そのようなマウスは、κ軽鎖を含む免疫グロブリン四量体の構築が実質的に損なわれた又は完全にブロックされたＢ細胞を含む。
【０１１２】
次に、ヒトＩｇκ遺伝子座の最も頻繁に使用されるＶκ遺伝子（Ｉｇデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／を使用して評価した；図７、８参照）を標準的なＰＣＲによって増幅し、ヒトＶＨセグメントに関して先に述べたように、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ部位の間にサブクローニングする。これは、Ｖκ領域の多量体化を可能にし、多量体をＸｈｏＩとＳａｌＩ部位の間に保持する。
【０１１３】
また、３’κエンハンサー、及びラット定常（Ｃκ）領域に加えてラット５’エンハンサーを含むマウスκ遺伝子座の３’末端を一緒にクローニングする（図８）。次に、Ｖκ領域とＪκ領域の間の正常な間隔を維持するためにヒトＪκ領域及びマウスＶκとＪκの間からの領域（１７ｋｂ）（図２）をクローニングする。最後に、常套的な手順によって（例えばＪａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）、前出）ピューロマイシン選択マーカーを含むＰＡＣ（図８）にヒトＶκを挿入する。
【０１１４】
示した実施例では、最も頻繁に使用されるＶκセグメント（４−１、３−１１、３−１５、３−２０及び１−３９）を多量体化し、ヒトＪ領域及びマウスエンハンサー及びラットＣκ領域を含むＰＡＣベクターに連結する。これは、ｐｕｒｏ耐性マーカー遺伝子、ヒトＶκセグメント及びラット定常（Ｃκ）領域から成るヒト−ラットハイブリッド遺伝子座を生じる（図８）。
【０１１５】
並行して、ハイブリッドヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座を構築する。やはり、出発物質に関しては多くの可能性が存在する。この実施例では、出発物質は、４つのヒトＶＨ領域、ヒトＤＨ及びＪＨセグメントの全部並びに２つのヒト定常領域とヒトＬＣＲを含むヒトＰＡＣである（図９及び英国特許出願第０９０５０２３．８号）。
【０１１６】
後者のＰＡＣは、Ｊ領域と定常領域の間に唯一のＣｅｕＩメガヌクレアーゼ部位を有する。ハイブリッド遺伝子座の構築を容易にするために、このＣｅｕＩ部位を使用してヒト３’末端配列を除去し、これらをラット定常領域及びスイッチ領域（Ｃμ、Ｃγ３、Ｃγ１及びＣγ２）で置換する。これらを、ラットゲノムＤＮＡから標準的なロングレンジＰＣＲによって増幅した。最後に、マウス重鎖ＬＣＲを付加する。この調節配列を、３つの部分に分けてマウスゲノムＤＮＡから増幅し、一緒にサブクローニングして、完全なＬＣＲを復元し、ラット定常領域の３’側に付加する（図１０）。生じたハイブリッドＩｇＨ遺伝子座は、従って、ｎｅｏ選択マーカー、ヒトＶ、Ｄ及びＪ領域並びにマウス調節配列を伴うラット定常領域を含む。
【０１１７】
ハイブリッド遺伝子座挿入物を、その後、大きなＤＮＡフラグメントとしてＰＡＣから単離し、ＩｇＨ／Ｉｇκ異型接合又は同型接合ヌルマウスに由来するマウス受精卵に注入して、ヒト／ラットハイブリッドＩｇＨ及びＩｇκ遺伝子座に関してトランスジェニックであるマウスを作製する。これはすべて常套的な方法によって実施する（例えばＪａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）、前出）。
【０１１８】
その後、ハイブリッドＩｇＨ及びハイブリッドＩｇκトランスジェニックマウスを育種して、内因性マウスＩｇＨ及びＩｇκ発現に関して同型接合ヌルであり、ヒト／ラットハイブリッドＩｇＨ及びＩｇκ発現に関して陽性であるマウスを得る。その後これらのマウスを免疫して、常套的な手順によって抗原特異的ハイブリッドヒト／ラットＨ２Ｌ２抗体を作製する。ハイブリドーマを介してモノクローナルヒト／ラットＩｇを作製する場合、ピューロマイシンとネオマイシンの二重選択は、ＩｇＨとＩｇκ遺伝子座の両方を含む骨髄腫融合物だけを選択することを確実にする。
【０１１９】
当業者は、マウス遺伝子を不活性化するための異なるベクター、異なる選択マーカー、異なる組換え位置の使用又はハイブリッド遺伝子座の実際の（常套的な）クローニング方法の変形などの、この手順に対する変形を行ってハイブリッドトランスジェニックマウスを作製し得ることを認識する。同じ手順が、任意の単一哺乳動物種に由来する免疫グロブリンＤＮＡを使用して任意の正常若しくはハイブリッド遺伝子座を作製するために、又は２若しくはそれ以上の種に由来するＤＮＡを使用して誘導されるハイブリッド遺伝子座を作製するために使用できる。
【実施例２】
【０１２０】
この実施例は、ＩｇＨ／Ｉｇκ Ｈ２Ｌ２抗体を得る高頻度が、内因性マウスＩｇλ遺伝子座の発現の頻度を低下させることによってさらに一層高められることを除き、原則として実施例１と同じである。これは、両方のＩｇλの調節領域を選択マーカーで（図１１）、この場合はハイグロマイシン耐性遺伝子とＴＫ−ＢＳＤ遺伝子で置換することによって達成できる。
【０１２１】
後者は、陽性選択、ブラスチシジンＳに対する耐性選択を可能にする（Ｋａｒｒｅｍａｎ，（１９９８）ＮＡＲ，２６，（１０），２５０８−２５１０）。マーカーのこの組合せは、調節領域を置換した場合の２つのＥＳ細胞組換えにおける陽性選択を可能にする。組換えは、実施例１で作製したＥＳ細胞において、あるいは並行して正常ＥＳ細胞において実施し、実施例１で上述したマウスに育種する。
【０１２２】
生じるトランスジェニックマウスは、ハイブリッドヒト／ラットＩｇＨ及びＩｇκ遺伝子座を含み、内因性マウスＩｇＨ及びＩｇκに関して陰性であり（又は非常に低いレベルでＣκを発現する）、非常に低いレベルでＩｇλを発現する。常套的な方法による免疫とハイブリドーマの作製後、ヒト／ラットハイブリッドＨ２Ｌ２抗体だけを発現するハイブリドーマを、ｎｅｏ（図１０）及びｐｕｒｏ（図８）選択によってトランスジェニックハイブリッド遺伝子座の発現のために選択する。
【実施例３】
【０１２３】
実施例３は、上述した実施例に類似するが、ハイブリッドＩｇκ遺伝子座を、より低い頻度で使用されるＶκセグメントの付加によって延長する（図１２；Ｖκ１−９、１−３３、２−３０、２−２８、１−２７、１−５）。あるいは、突然変異／改変Ｖκセグメント又はＶλセグメントをさらに付加することができる。さらなるセグメントの付加は、上述したのと同じＸｈｏＩ／ＳａｌＩクローニング法を使用することによって実施する。この実施例で作製されるマウスの免疫は、抗原による免疫に応答してより大きな複雑性を可能にする。ＶＬ領域の数は、他のＶκセグメントを付加することによって又は上記ＶＬセグメントのすべての組合せを使用することによってさらに変化させ得る。
【実施例４】
【０１２４】
実施例４は、上述した実施例で述べたものに類似するが、ここでは１８のＶＨセグメント及び５つのラット定常領域を使用することによってハイブリッドヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座を作製した（図１３Ａ；ヒトＶＨ６−１、１−２、４−４、２−５、３−０７、１−８、４−３９、３−１５、１−１８、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３４、３−４９、３−５３、４−５９、１−６９）。最初に、ＶＨセグメントとＤ領域の間の適切な距離を維持するためにヒト遺伝子座の中央の７０ｋｂのＤＪ領域を、マウスＩｇＨイントロンからの８ｋｂを用いて５’末端で延長する。次に人為的ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ部位を有する１０ｋｂの第一ＶＨ領域（６−１）をマウスイントロン配列の５’末端でクローニングする（図１０Ｂ）。別のプラスミドにおいて、残りのＶＨ領域全部を、上述したようにＸｈｏＩ／ＳａｌＩ ＶＨセグメントに組み入れることによって一緒にクローニングする（図１０Ｃ）。また、これらの遺伝子座により多くのＶＨセグメント又は改変／突然変異したＶＨセグメントを付加することもできる。また、ＣＴＣＦ部位を含めることもできる。示した実施例では、３つのそのような部位を使用した。それらは、上流のＣＴＣＦ部位を含むＶＨ領域のロングレンジＰＣＲによって得られる。さらに、図１０における遺伝子座と比較した場合、ラットＣαを付加した。この実施例では、特に実施例３と組み合わせて、抗原による免疫に応答してさらに一層大きな複雑性を可能にする。ＶＨ多量体をＶＨ６−１ＤＪプラスミドにクローニングし、その後ラット定常領域を付加して遺伝子座を完成させる。
【０１２５】
これらの実施例すべてにおいて、同じマウス中に存在する付加的な重鎖又は軽鎖トランスジェニック遺伝子座の一部としてＶセグメントを付加することにより、応答の複雑性がさらに一層増大される。すべての遺伝子座が対立遺伝子排除の対象であるので（国際公開第ＷＯ２００７／０９６７７９号参照）、抗原投与後に好ましい再構成だけをインビボで選択し、Ｂ細胞の増殖及び血清中の抗体の蓄積を生じさせる。図１４は、同じ動物に導入することができる２つの重鎖遺伝子座の一例を示し、各々が対立遺伝子排除を介して使用される。明らかに、トランスジェニック免疫レパートリーの複雑性を高めるためにより多くのＶＨセグメントを付加することができるか（改変されたＶＨセグメントを含む）又はより多くの遺伝子座を導入することができる。その方法はまた、他の種にも、それらの種に特異的なＶセグメントを使用して適用できる。
【実施例５】
【０１２６】
この実施例では、上記実施例で述べたヒト／ラットＩｇＨ及び／又はＩｇκ遺伝子座を保持するマウスに育種することを介してヒト／ラットＩｇλ遺伝子座を付加することにより、ヒト／ラットハイブリッド抗体の多様性をさらに一層高める。ヒト／ラットハイブリッドλ遺伝子座は、先の実施例で述べたヒト／ラットＩｇκ遺伝子座に関して説明したのと全く同様にして作製される。相違は、ＪλとＣλの領域が対で生じ、従って２つのラットＣλ領域が２つのヒトＪλ領域にクローニングされるという事実によって引き起こされる（図１５）。ＶλセグメントとＪλセグメントの間の間隔は、その位置で生じる正常マウス配列をクローニングすることによって維持される（図１１参照）。この実施例では、２つのヒトＪλ及びラットＣλのセグメントを４つのヒトＶλセグメントと一緒に使用する。合わせると、これらはヒトＩｇλ応答の８０％以上をカバーする。調節配列（ＬＣＲ、図１５）は、最適発現を確実にするためにマウスに由来し、選択マーカーを遺伝子座の５’末端に付加する。上述したように、遺伝子座を制限フラグメントとして単離し、受精卵に注入して、トランスジェニックλ遺伝子座を有するマウスを作製する。
【０１２７】
これらの実施例のすべてにおいて、異なる種に由来するＶＨ、ＶＬ、Ｄ、Ｊ及び定常領域を使用して、他の単一種抗体又はハイブリッド種抗体を作製することができる。また、ひとたび抗原特異的抗体が同定されれば、完全に常套的な方法によってＶＨＤＪ及びＶＬＪ領域を同じ種又は異なる種に由来する選択的定常領域にクローニングできることも、当業者には明白である。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用した、抗原投与に応答する重鎖及び軽鎖を含む機能性親和性成熟四量体免疫グロブリンの、様々なレパートリーの誘導及び選択のための改善された方法並びにその使用に関する。
【０００２】
特に、本発明は、内因性マウスκ及び／若しくはλ軽鎖免疫グロブリンを生成するその能力が実質的に低減されるように、又は重鎖と複合体化する軽鎖の能力が低減、排除若しくはブロックされるように遺伝子操作された、非ヒト哺乳動物、好ましくはマウスに関する。本発明の非ヒト哺乳動物はまた、機能性の内因性マウス重鎖を生成する能力が低い。従って、前記突然変異遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する非ヒト哺乳動物の能力は、実質的に低減又は排除されている。そのような哺乳動物を作製する方法、並びに、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖導入遺伝子を使用してヒト四量体抗体及びハイブリッド四量体抗体を作製するためにそのような哺乳動物を用いる方法も説明する。
【０００３】
以下の説明において、すべてのアミノ酸残基位置番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）米国公衆衛生局（ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）公報番号９１−３２４２によって案出されたナンバリングシステムに従って与えられる。
【背景技術】
【０００４】
＜抗体＞
抗体の構造は当技術分野において周知である。大部分の自然抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む四量体である。重鎖は、各重鎖に沿ってほぼ中間に位置するヒンジドメイン間のジスルフィド結合を介して相互に連結されている。軽鎖は、ヒンジドメインのＮ末端側で各々の重鎖と会合している。各々の軽鎖は、通常、ヒンジドメインに近いジスルフィド結合によってそのそれぞれの重鎖と結合している。
【０００５】
抗体分子が正常に折りたたまれた場合、各々の鎖は、より直鎖状のポリペプチド配列によって連結された多数の別個の球状のドメインに折りたたまれる。例えば、軽鎖は可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）ドメインに折りたたまれる。重鎖は、１個の可変ドメインＶＨ、第一定常ドメイン（ＣＨ１）、ヒンジドメイン及び２又は３個のさらなる定常ドメインを有する。重鎖定常ドメイン及びヒンジドメインは一体となって、抗体重鎖の定常領域として一般に公知の構造を形成する。重（ＶＨ）鎖及び軽（ＶＬ）鎖可変ドメインの相互作用は、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成をもたらす。重鎖と軽鎖の相互作用は、重鎖のＣＨ１ドメイン及び軽鎖のＣκ又はＣλドメインによって促進される。一般に、ＶＨとＶＬの両方が抗原結合のために必要であるが、重鎖二量体及びアミノ末端フラグメントは軽鎖の不在下で活性を保持することが示されている（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。一般に、循環λ軽鎖の割合は低く、おそらく血漿中の四量体免疫グロブリンとして複合体化した全軽鎖の２〜５％を占める（Ｇｏｌｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ ＮＹ）。
【０００６】
新規抗体を構築するための重鎖免疫グロブリン遺伝子のインビトロ操作は、１９８０年代に最初に記述された。初期の抗体エンジニアリング研究の多くは、広く特徴づけられた抗原に対して惹起された、再構成されたマウス免疫グロブリンμ遺伝子（ＩｇＭ）を使用した。この抗体の特徴は、無関係な軽鎖による構築と分泌が抗原結合の保持を示すので、抗原結合特異性がＶＨドメインに存することが公知であるということであった（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９８６）Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，Ａ３１７，４２５−４３２）。この系を使用して、マウス抗原特異的ＶＨ結合ドメインが、マウス抗原特異的ＶＨドメインに融合したヒトε定常エフェクター領域を含む新規抗体を誘導するために使用できることが示された。生じたハイブリッドＩｇＥは抗原特異性を保持し、ＩｇＥの予想されるエフェクター活性を示した（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１４，２６８−２７０）。重鎖操作の他の文献例は以下を含む：抗ホスホコリン活性を保持するマウスＶＨヒト／ＩｇＡ又はＩｇＧ抗体融合物をコードするハイブリッドマウス−ヒト抗体遺伝子（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＰＮＡＳ，８１，６８５１−６８５５）；マウスＶＨとヒトＩｇＧ（γ３）定常領域を含む抗癌関連抗原１７−１Ａ抗体（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ，８４，２１４−２１８）；及びヒトＩｇＧ（γ１）定常領域とマウスＶＨドメインを含む抗ヒトＴ細胞抗体（抗ＣＤ７）（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，３５８９−９７参照）。
【０００７】
正常ヒトＢ細胞は、１４番染色体上に単一の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、そこから重鎖をコードする遺伝子が再構成によって生成される。マウスでは、重鎖遺伝子座は１２番染色体上に位置する。正常な重鎖遺伝子座は、複数のＶ遺伝子セグメント、多くのＤ遺伝子セグメント及び多くのＪ遺伝子セグメントを含む。ＶＨドメインの大部分はＶ遺伝子セグメントによってコードされるが、各ＶＨドメインのＣ末端はＤ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントによってコードされる。Ｂ細胞におけるＶＤＪ再構成とそれに続く親和性成熟は、その抗原結合特異性を有する各々のＶＨドメインを生じる。単一Ｖセグメントを含む重鎖免疫グロブリンに由来する正常なＨ２Ｌ２四量体の配列分析は、抗原投与に対する応答の多様性が主としてＶＤＪ再構成と体細胞超変異の組合せから生じることを明らかにする（Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３，３７−４５）。ヒトゲノム中には５０個以上のヒトＶ遺伝子セグメントが存在し、そのうちの３９個だけが機能性である。正常な二倍体抗体産生Ｂ細胞では、各々の細胞は、単一のセットの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子座から抗体四量体（Ｈ２Ｌ２）を産生する。その他のセットの遺伝子座は、対立遺伝子排除と呼ばれるプロセスの結果として生産的には使用されない（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９７，７４３−７５０及びその中の参考文献）。
【０００８】
完全ヒト抗体（Ｈ２Ｌ２）は、現在、抗原投与に応答するトランスジェニックマウスから誘導することができる。そのようなトランスジェニックマウスは、一般に単一ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座及び別のヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む。対応する内因性マウス重鎖、κ軽鎖及び、場合によりλ軽鎖遺伝子座コード配列は、欠失又は部分的に欠失している。従って、κ軽鎖を含むヒト抗体だけが、ヒト重鎖とマウスλ軽鎖を含むマウス／ヒト抗体の低いバックグラウンドで産生される（国際公開第ＷＯ９０／０４０３６号；同第ＷＯ９３／１２２２７号；同第ＷＯ９８／２４８９３号；米国特許第５８７７３９７号、同第５８１４３１８号及び同第６１６２９６３号）。内因性重鎖及び軽鎖遺伝子発現を排除するためのすべての内因性マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子のセグメントの欠失は、完全に実現されてはいるが、特にすべてのλ軽鎖コード配列の除去が必要と考えられる場合、まだ依然として技術的に困難である。マウスλ軽鎖コード配列の除去は、λ遺伝子座のすべての機能性Ｖ及びＪ遺伝子セグメント並びにＣ１、Ｃ２及びＣ３定常領域の完全な欠失を介して達成され、サイレンシングされたλ軽鎖遺伝子座を有するマウスを生じる（欧州特許第ＥＰ１３９９５５９号参照）。
【０００９】
異なるアプローチは、マウス重鎖遺伝子をコードする遺伝子の膜エクソンの破壊によってマウスＢ細胞の発生及び免疫グロブリン分泌を制限することである。従って、内因性マウス重鎖遺伝子は、抗原投与に応答して転写され、ＶＤＪ再構成を受けるという点で機能性であるが、ＩｇＭはプレＢ細胞の表面上で絶対に発現されないので、内因性マウスκ及びλ軽鎖遺伝子が構造的に無傷であり、機能性のままであっても（Ｔｕａｉｌｌｏｎ（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３７，２２１−２３１）、さらなる発生は停止し、抗原投与に対して産生応答を生じない（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６）。
【００１０】
内因性マウス重鎖及び軽鎖遺伝子座が機能性のままである場合、任意の付加的に導入された免疫グロブリン重鎖導入遺伝子も対立遺伝子排除によって調節され、そのため一部のＢ細胞は、マウス重鎖及び軽鎖遺伝子座だけを機能性に発現し、また別のＢ細胞は、ヒト重鎖遺伝子座だけとマウス軽鎖遺伝子座を機能性に発現する（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６，８１６−８１９）。任意の単一非ヒトトランスジェニック動物において、異種抗原投与に応答して潜在的にすべての免疫グロブリン遺伝子座に由来する抗体を発現するＢ細胞の高度に多様な集団が存在する。ＨＡＴ選択（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５０，１６１−１７１）を用いる確立されたハイブリドーマ技術を使用したその後の抗原特異的抗体の選択は、ある重鎖免疫グロブリン遺伝子座を発現するハイブリドーマと別の重鎖免疫グロブリン遺伝子座を発現するハイブリドーマを区別しない。
【００１１】
免疫グロブリン重鎖導入遺伝子上に存在する調節エレメントは、コピー数に依存したやり方でＢ細胞特異的発現を確実にするために必須の組織特異的エンハンサーエレメントを含む。５’イントロンエンハンサー及び３’ＬＣＲの存在は、導入遺伝子がＢ細胞成熟のすべての段階で活性であることを確実にする（Ｇｕｇｌｉｅｌｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１６４２，１８１−１９０）。導入遺伝子座内に重鎖及び軽鎖特異的ＬＣＲを含むことは、発現がＢ細胞特異的であることのみならず、ゲノム内への組込み部位にかかわらず発現が起こることも保証する（国際公開第ＷＯ９０／１００７７号、Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，８４５−８５８及びＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，１９８，２３６−２４８））。従って、ＬＣＲが存在することを条件として、あらゆる導入遺伝子が、ゲノム内でのその位置に関わりなく機能性である。導入遺伝子上に存在するＬＣＲが部分的に欠失している場合、導入遺伝子の周囲のクロマチンはいずれかの時点で転写のために部分的にだけ開き、位置効果によるモザイク発現を導き、そのため標的組織全体にわたる導入遺伝子の発現の限られたレベルを生じさせる（Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３，２７１（５２５２）：１１２３−５；Ｍｉｌｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７（１），１０５−１４）。
【００１２】
マウスバックグラウンドでのヒト免疫グロブリンの作製のための代替的アプローチは、マウス免疫グロブリン遺伝子セグメントをヒトからの相同な遺伝子セグメントで置き換えることである。従って、マウスのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントだけをヒト相同体で置換した場合、ヒトＶＨ及びＶＬドメインとマウス定常（エフェクター）領域を含む機能性マウス／ヒトハイブリッド抗体が抗原投与後に生じる（国際公開第ＷＯ９４／０４６６７号）。すべてのマウス遺伝子セグメントをヒト相同体で置換した場合は、完全なヒト免疫グロブリンが抗原投与後に生じる（米国特許第６５９６５４１号）。このアプローチの１つの考えられる利点は、コード領域だけを交換することを条件として、生じる導入遺伝子はすべてのマウス調節エレメントを保持し、そのため抗原投与に対する最大応答を保証することである。このアプローチは、導入遺伝子の最終的な立体配置に依存して、高親和性ヒト抗体又はマウス／ヒトハイブリッド抗体の高い血清力価を提供する。実際には、しかしながら、マウスゲノム中の個々のＶ、Ｄ及びＪセグメント全部を相同組換えによって置換することは長くて骨の折れる作業である。同様に、３９個の機能性ヒトＶ、Ｄ及びＪセグメント全部と定常（エフェクター）領域を含む重鎖導入遺伝子の構築は、非常に高度な技術が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そのため、（ｉ）抗原投与に応答してＢ細胞特異的に内因性重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を発現する実質的に低い能力を有する、又は抗原投与後にＢ細胞において内因性免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖遺伝子を発現するが、機能性免疫グロブリン四量体として集合する能力を欠く免疫グロブリン重鎖及び軽鎖タンパク質をコードするマウスの簡易な作製；（ｉｉ）３９個のヒトＶ遺伝子セグメント全部を集合的に含み得るが、各々すべてのＤ及びＪ遺伝子セグメント並びに一部又は全部の定常（エフェクター）領域と組み合わせて、好ましいより小さな群のＶ遺伝子セグメントを個別に含み、その機能性発現が抗原依存性であり、最終的に対立遺伝子排除によって決定される、複数の重鎖導入遺伝子座の構築及びＢ細胞特異的発現のための簡易で再現可能な方法；（ｉｉｉ）残りの内因性マウス免疫グロブリンを発現するハイブリドーマを選択し、重鎖導入遺伝子座上に存在する完全なＶセグメントレパートリーを含む集合した免疫グロブリン四量体を発現し、分泌するハイブリドーマを選択する、あるいはある重鎖導入遺伝子座上に存在するＶ遺伝子セグメントのサブセットを発現し、別の重鎖導入遺伝子座上のものは発現しないハイブリドーマを選択する能力、を可能にする、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントの欠失又は多数の欠失に依存しない方法が当技術分野においてなおも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第一の態様によれば、内因性λ軽鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座を含み、その各々は、抗原投与後にＢ細胞において、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子が形成されて発現されるように再構成することができるが、前記遺伝子座は、前記突然変異遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する能力が実質的に低減又は排除されるように変異している、非ヒト哺乳動物が提供される。
【００１５】
非ヒト哺乳動物では、内因性λ軽鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座の少なくとも１つが、前記の内因性遺伝子座又は各々の内因性遺伝子座へのフレームシフト突然変異、ポリペプチドコード配列及び／又は１若しくはそれ以上の終止コドンの導入によって突然変異していてもよい。
【００１６】
突然変異は、好ましくは５０個未満のヌクレオチドの挿入である。
【００１７】
非ヒト哺乳動物では、内因性λ軽鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座の少なくとも１つの発現が、遺伝子座又は各々の遺伝子座におけるＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下していてもよい。
【００１８】
好ましくは、導入は内因性κ軽鎖遺伝子座においてである。
【００１９】
あるいは、導入は内因性λ軽鎖遺伝子座においてである。
【００２０】
もう１つの選択的態様では、導入は、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性λ軽鎖遺伝子座においてである。
【００２１】
導入はまた、内因性重鎖遺伝子座においてであってもよい。
【００２２】
導入は、さらなる選択的態様では、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座においてであってもよい。
【００２３】
導入は、尚さらなる選択的態様では、内因性λ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座においてであってもよい。
【００２４】
導入は、さらなる選択的態様では、内因性λ軽鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座及び内因性重鎖遺伝子座においてであってもよい。
【００２５】
好ましくは、内因性κ軽鎖遺伝子座内に上記で定義される導入が存在し、内因性λ遺伝子座内に上記で定義される部分的又は完全なＬＣＲ欠失が存在する。
【００２６】
所望する場合、内因性重鎖遺伝子座は、重鎖遺伝子再構成、ｍＲＮＡ転写及びタンパク質合成は起こるが、Ｂ細胞活性化はブロックされるように突然変異していてもよい。
【００２７】
好ましくは、上記で定義される非ヒト哺乳動物は、１又はそれ以上の異種κ軽鎖遺伝子座及び関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子を含む。
【００２８】
非ヒト哺乳動物は、１又はそれ以上の異種λ軽鎖遺伝子座及び関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子をさらに含んでもよい。
【００２９】
上記で定義される非ヒト哺乳動物において、異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子は、優性選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００３０】
上記で定義される非ヒト哺乳動物はまた、１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座及び関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子を含んでもよい。
【００３１】
所望する場合、非ヒト哺乳動物は、２又はそれ以上の異なる異種重鎖遺伝子座及び関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する２又はそれ以上の導入遺伝子を含んでもよい。
【００３２】
非ヒト哺乳動物において、異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子又は各々の導入遺伝子は、優性選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００３３】
非ヒト哺乳動物において、各々の異種重鎖遺伝子座はＣＴＣＦ結合部位を含んでもよい。
【００３４】
好ましくは、非ヒト哺乳動物は、異種κ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子及び１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子を含む。
【００３５】
あるいは、非ヒト哺乳動物は、異種λ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子及び１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子を含んでもよい。
【００３６】
さらなる選択的態様では、非ヒト哺乳動物は、異種κ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子、λ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子及び１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子を含んでもよい。
【００３７】
好ましくは、各々の異種遺伝子座は同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）ＬＣＲを組み込んでいる。
【００３８】
各々の異種遺伝子座は、好ましくはヒト遺伝子座である。
【００３９】
しかし、各々の異種遺伝子座は、ヒト可変領域とラット又はマウス定常領域を含むハイブリッド遺伝子座のような、２以上の種に由来する可変領域と定常領域を含むハイブリッド遺伝子座であってもよい。
【００４０】
非ヒト哺乳動物は、異なる異種重鎖遺伝子座の異なる群を含有する導入遺伝子の群を含んでもよく、導入遺伝子の各々の群は異なる優性選択マーカー遺伝子を含む。
【００４１】
あるいは、非ヒト哺乳動物は、異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子及び異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子を含んでもよく、異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子は、各々異なる優性選択マーカー遺伝子を含む。
【００４２】
非ヒト哺乳動物は、好ましくはマウスなどのげっ歯動物である。
【００４３】
第二の態様によれば、本発明は、抗原特異的異種モノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）前記請求項のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物を抗原で免疫するステップと、
（ｂ）各々が免疫トランスジェニック哺乳動物のＢ細胞からのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を調製するステップと、
（ｃ）場合により、異種免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子内に存在する優性選択マーカー遺伝子を使用して、異種抗体を発現する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｄ）抗原に特異的に結合する抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと
を含む方法を提供する。
【００４４】
本発明のさらなる態様によれば、ハイブリッド抗体から哺乳動物抗体、好ましくはヒト抗体を誘導する方法であって、
（ａ）上述した方法を実施するステップと、
（ｂ）抗原に特異的に結合し、且つ、選択した種のＶＨ及びＶＬ結合ドメインを含む抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｃ）ＶＨ及びＶＬドメインをクローニングし、配列決定するステップと、
（ｄ）ＶＨ及びＶＬ結合ドメインコード配列を、同じ種からの選択した定常エフェクタードメインと共に含む選択配列を再びクローニングするステップと、
（ｅ）選択した細胞型において発現ベクターを使用して所望する種の重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする再クローニング配列を同時発現させるステップと
を含む方法が提供される。
【００４５】
本発明のなおさらなる態様によれば、哺乳動物前駆細胞において内因性重鎖遺伝子座、内因性κ軽鎖遺伝子座、及び場合により内因性λ軽鎖遺伝子座を突然変異させ、前駆細胞から哺乳動物を作製するステップを含み、ここで、前記突然変異は、哺乳動物において、各々の遺伝子座が、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子が形成され、抗原投与後にＢ細胞において発現されるように再構成することができるが、突然変異遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する能力が実質的に低減又は排除されている、上記で定義される非ヒト哺乳動物の作製のための方法が提供される。
【００４６】
好ましくは、前駆細胞は非ヒト胚性幹細胞である。
【００４７】
非ヒト哺乳動物は、好ましくはマウスなどのげっ歯動物である。
【００４８】
本発明はまた、非ヒト哺乳動物又は上記で定義される方法を使用して誘導される、好ましくはヒトの、抗原特異的異種機能性免疫グロブリン四量体の薬剤、診断薬又は試薬としての使用を提供する。
【００４９】
本発明者は、驚くべきことに非ヒト哺乳動物、特にマウスの生産のための簡易な方法の開発によって先行技術の制限を克服し、その内因性κ及び／又はλ軽鎖遺伝子の機能的発現は、フレームシフト又はｍＲＮＡの早期の翻訳終結を導く、好ましくはκ定常領域及び／若しくはλ定常領域内の小さな挿入事象の結果として定常領域を非機能性とすること、又は、同族の内因性ＬＣＲの一部若しくは全部を除去することのいずれかによって、実質的に低減された。これは、一部又は全部の軽鎖遺伝子コード配列の完全な又は部分的欠失による内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の機能的サイレンシングを必要とする選択的方法と対照をなす。
【００５０】
本明細書で述べる方法は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にも等しく良好に適用できる。従って、例えば、ＬＣＲの完全な又は部分的欠失は重鎖遺伝子発現の実質的な低下を生じさせる。好ましくはμＣ領域のＣＨ１ドメインへの、しかし選択的にはすべての免疫グロブリンアイソタイプ定常領域のＣＨ１領域への、フレームシフト又はｍＲＮＡの早期の翻訳終結を導く配列の導入は、軽鎖との免疫グロブリン四量体の形成を実質的に低減、排除又はブロックする。同様に、先に述べたように、プレＢ細胞の表面でのＩｇＭ発現がｍＲＮＡの早期の翻訳終結によってインビボでブロックされる場合、さらなる発生は停止し、抗原投与に対する産生応答を生じさせない（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６）。重鎖免疫グロブリン導入遺伝子の導入はＢ細胞増殖を救済し、導入遺伝子がコードする重鎖及び内因性マウス軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体が血清中を循環する。
【００５１】
従って、相互作用して機能性免疫グロブリン四量体を形成する重鎖及び軽鎖を生じる内因性軽鎖遺伝子座及び／又は重鎖遺伝子座の能力は、フレームシフト突然変異の導入後に排除又は実質的に低減され得、一般にフレーム外の終止コドンの存在によるタンパク質合成の早期の終結を伴う、無関係なタンパク質配列の合成を導く。
【００５２】
これは、機能性免疫グロブリン四量体の形成の役割を担う重鎖又は軽鎖ポリペプチド配列内又はその上流への外来性ＤＮＡの挿入又はＤＮＡの小さな欠失によって実現することができる。好ましいアプローチは新しい配列を挿入することである。アミノ酸コード配列内にフレームシフトを生じさせ、コードされるｍＲＮＡの翻訳の早期終結をもたらすように設計された有効な挿入事象は、１個のヌクレオチドの導入に限定することができる。従って、コード領域内の１又はそれ以上のヌクレオチドの挿入はフレームシフトを導き得る。あるいは、終止コドンを含む付加的なペプチド配列をコードするインフレーム配列の挿入も、トランケート型のタンパク質の合成を生じさせる（米国特許第５５９１６６９号）。標的化挿入事象はまた、すべての内因性配列が保持され、生じる融合タンパク質が免疫グロブリン四量体の形成を破壊する、又は１若しくはそれ以上のインフレーム終止コドンの存在がｍＲＮＡの翻訳の早期終結を導き、機能性免疫グロブリン四量体を形成することができないトランケート型タンパク質の合成をもたらすことを条件として、選択マーカー遺伝子及び他の機能性の導入を含み得る。
【００５３】
好ましくは、挿入事象は、免疫グロブリンκ軽鎖定常領域においてである。場合により、挿入事象は、免疫グロブリンκ及び／又はλ軽鎖定常領域においてである。実際には、挿入は、ｌｏｘ部位などの任意の組換え酵素認識部位を含み得る。これは単独でフレームシフトを導き得る。フレームシフトを確実にする付加的なヌクレオチド、又は、１若しくはそれ以上の終止コドンのためのコドンを含むことはまた、重鎖ＣＨ１ドメインと軽鎖κ及び／又はλ定常領域の相互作用を介して重鎖と軽鎖の二量体化の破壊における挿入配列の有効性を増大させ得る。挿入は１個のヌクレオチドを含むことができ、好ましくは５０個未満のヌクレオチドである。挿入は、フレームシフトだけを生じさせてもよいが、好ましくは、１又はそれ以上の終止コドンがｍＲＮＡの早期終結をもたらすように設計される。挿入は、挿入部位に隣接する腕を利用した相同組換えを用いて実施される。好ましくは、操作過程の間に選択マーカーを含め、その後切り出して、認識部位単独に加えてゲノム内にインサイチューで任意の付加的な挿入配列、例えばｌｏｘ部位を残す。
【００５４】
フレームシフト及びトランケートされたタンパク質の合成はまた、コード配列内の１又はそれ以上のヌクレオチドの欠失及び終止コドンを含む最小付加配列の含有によっても達成できることは当業者に明らかである。好ましくは、挿入又は欠失事象は重鎖及び軽鎖遺伝子の定常領域内で起こり、内因性遺伝子座の多数のＶ、Ｄ及びＪ領域内では起こらない。好ましい選択はκ軽鎖定常領域である。
【００５５】
従って、内因性免疫グロブリン遺伝子の再構成又はｍＲＮＡ転写の排除は、大規模な遺伝子欠失方法には依存しない。同じ挿入方法が、重鎖アイソタイプのＣＨ１領域内での標的化挿入事象を介して軽鎖と共に機能性四量体複合体を形成する内因性重鎖免疫グロブリンの能力を阻害するために使用できる。好ましくは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現は、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６によって記述されたのと同様の方法を用いて、内因性重鎖がＢ細胞の表面で発現されず、Ｂ細胞増殖から生じる生産的発現がブロックされるようにプレＢ細胞段階でブロックされ、一方、内因性ＩｇＭの機能性ＣＨ１と軽鎖の結合は、免疫グロブリン重鎖と機能的に相互作用することができない軽鎖定常領域をコードするκ及び／又はλ軽鎖ｍＲＮＡの翻訳を導く挿入事象によって阻害され、機能性の内因性免疫グロブリン四量体の形成を妨げる。
【００５６】
内因性免疫グロブリン四量体の機能的集合が機能的に損なわれることを条件として、関連するＶＨドメインの親和性成熟を伴うＢ細胞発現は制限され、外因性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖導入遺伝子の存在と発現に依存する。免疫グロブリン導入遺伝子は、選択した非ヒト哺乳動物宿主の対立遺伝子排除プロセスにＢ細胞特異的に関与し、抗原投与に対する産生応答、Ｂ細胞の増殖、及び循環性の、導入遺伝子がコードする抗原特異的免疫グロブリン四量体を生じさせる。
【００５７】
また、内因性λ軽鎖遺伝子発現がλ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下し、内因性κ軽鎖遺伝子発現がκ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下している非ヒト哺乳動物が提供される。本発明の１つの実施形態では、内因性κ軽鎖の発現だけ又はλ軽鎖の発現だけが、関連するＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下する。
【００５８】
内因性軽鎖遺伝子座は、再構成することができ、機能性ｍＲＮＡに転写され得るという点で機能性を保持し得るが、転写のレベルは、内因性ＬＣＲの機能性の一部又は全部の除去を介して実質的に低下する（国際公開第ＷＯ９０／１００７７号）。ＬＣＲの機能性は、マウスＥＳ細胞中のヌクレアーゼ高感受性部位を遺伝子ターゲティングすることによって、又は、ＥＳ細胞が存在しない場合は、他の哺乳動物種に由来する核移植（Ｓｏｕｌｔｅｒ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３１５−３１６）又はｉＰＳ細胞（Ｇｏｔｔｗｅｉｓｓ．ａｎｄ Ｍｉｎｇｅｒ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６，２７１−２７２参照）のいずれかを使用したクローニングによって除去される。あるいは、重鎖又は軽鎖の破壊は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術及びＤＮＡ修復などの標的突然変異誘発を介して達成できる（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ａｎｄ−ｒｎａｉ／ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ−ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【００５９】
内因性κ軽鎖遺伝子発現は、κ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低減され得、λ軽鎖遺伝子は、欠失又は挿入事象後に機能的にサイレンシングされ得る。
【００６０】
内因性λ軽鎖遺伝子発現は、λ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低減され得、κ軽鎖遺伝子は、欠失又は挿入事象後に機能的にサイレンシングされ得る。
【００６１】
内因性κ軽鎖遺伝子は、ＬＣＲの除去又は挿入事象後に機能的にサイレンシングされ得る。
【００６２】
本発明はまた、内因性κ軽鎖遺伝子発現及び内因性λ軽鎖遺伝子発現のいずれか又は両方が、κ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去及び／又はλ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下している非ヒト哺乳動物を提供する。内因性κ遺伝子は機能的にサイレンシングされ得、λ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって内因性λ遺伝子活性は実質的に低減され得る。
【００６３】
κ軽鎖遺伝子発現は、κ軽鎖ＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低減され得、λ遺伝子発現は機能的にサイレンシングされ得る。
【００６４】
内因性κ軽鎖遺伝子発現だけが、κ軽鎖ＬＣＲの除去によって実質的に低減され得るか、又は欠失若しくは挿入事象によって機能的にサイレンシングされ得る。
【００６５】
上述したような機能的にサイレンシングされた内因性κ及び／若しくはλ軽鎖遺伝子発現又は実質的に低下した内因性κ及び／若しくはλ軽鎖遺伝子発現を有する非ヒト哺乳動物はまた、低い又は機能的にサイレンシングされた内因性重鎖遺伝子発現を有し得る。１つの実施形態によれば、本発明の非ヒト哺乳動物において、内因性重鎖遺伝子発現は、ＬＣＲを含む一部又は全部の高感受性部位の欠失後に低下するか、又は欠失若しくは挿入事象後に機能的にサイレンシングされる。好ましくは、内因性重鎖遺伝子の発現は、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６によって記述されたのと同様の方法を用いて、内因性重鎖がＢ細胞の表面で発現されず、Ｂ細胞増殖から生じる生産的発現がブロックされるようにプレＢ細胞段階でブロックされる。
【００６６】
上述した非ヒト哺乳動物は、異種重鎖及び軽鎖遺伝子座並びに、好ましくは同族のＬＣＲを含む、関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する１又はそれ以上の導入遺伝子をさらに含み得る。
【００６７】
本発明に関して、「異種」という用語は、それが位置される哺乳動物にとって内因性ではない、本明細書で述べるヌクレオチド配列又は遺伝子座を意味する。
【００６８】
非ヒト哺乳動物は、従って、異種κ軽鎖遺伝子座及び、好ましくはＬＣＲを含む、関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子、並びに／又は異種λ軽鎖遺伝子座及び、好ましくはＬＣＲを含む、関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子を含み得る。
【００６９】
同族のＬＣＲの存在はＢ細胞特異的発現のために必須ではない。遺伝子座内にそれらを含むことは、高レベルの導入遺伝子発現があらゆる組込み部位で起こり、そのうちの一部だけがＢ細胞において活発に転写されるクロマチン領域内で偶発的に起こる、ランダムな組込み事象には依存しないことを確実にする。同族のＬＣＲの使用は、抗体発現のためにスクリーニングする必要があるトランスジェニック動物の数を有意に低減し、２以上の遺伝子座の挿入を可能にして、挿入されるすべての遺伝子座が基本的に正常なレベルでＢ細胞特異的に発現されることを確実にする。従って、ＬＣＲ技術の使用は、対立遺伝子排除機構が内因性免疫グロブリン遺伝子と多数の競合する導入遺伝子を識別するという驚くべき所見と合わせて、各々の遺伝子座が、内因性遺伝子に比べてＶ遺伝子の複雑性が低く、内因性遺伝子座（１〜２Ｍｂ）に比べてインビトロで構築するのに比較的扱い易いＤＮＡの断片（＜３００Ｋｂ）を含む、１又はそれ以上の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物の構築への道を開く。例えば、３９個の機能性ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメントを２又はそれ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座にクローニングし得る。各々は異なるＶ遺伝子セグメントを含むが、共通のＤ及びＪ遺伝子セグメント並びに定常（エフェクター）領域を有する。ＬＣＲを含むことは、各々がゲノム内の組込み部位にかかわらず同じように発現されることを確実にする。従って、このようにして２又はそれ以上の小さな遺伝子座を含むことは、技術的に操作が難しい単一の大きな遺伝子セグメント中に存在する１個のより複雑な遺伝子の同じＶ遺伝子の複雑性を提供する。
【００７０】
各々の異種軽鎖遺伝子座は、ＶＬ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び軽鎖定常領域セグメントを含み得る。好ましくは、ＶＬ及びＪ遺伝子セグメント並びに軽鎖定常領域セグメントは同じ哺乳動物ソース、例えばげっ歯動物、ブタ、ウシ、ヤギ又はヒツジに由来する。好ましくは、それらはヒト起源である。
【００７１】
あるいは、異種軽鎖遺伝子座は、哺乳動物起源、好ましくはヒト起源の可変ドメインと、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヤギ及びウシなどの、しかしこれらに限定されない異なる哺乳動物に由来する定常（エフェクター）領域を含むハイブリッド遺伝子座であってもよい。宿主哺乳動物がマウスである場合、好ましくは、定常領域はげっ歯動物起源、より好ましくはマウス又はラットである。そのような異種軽鎖遺伝子座は、好ましくは１つの種だけに由来するＶＬ及びＪセグメント並びにもう１つ別の種に由来する軽鎖定常領域を含む。
【００７２】
ハイブリッドκ軽鎖導入遺伝子を企図する場合、ＶＬ及びＪ遺伝子セグメントは、好ましくは同じ種に由来し、重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを与え、好ましくはヒト起源である。κ軽鎖定常領域及び重鎖定常領域も、好ましくは同じ種に由来するが、可変ドメインを与えるものとは異なる種であり、好ましくはげっ歯動物起源、好ましくはラット又はマウスに由来する。
【００７３】
企図されるすべての軽鎖導入遺伝子の特徴は、抗原投与後、軽鎖がＢ細胞特異的に再構成されること、並びに、転写及び翻訳後、生じる軽鎖が同じＢ細胞において産生される導入遺伝子由来の重鎖免疫グロブリンと複合体化できることである。免疫グロブリン四量体の生産的発現はＢ細胞の増殖を生じさせ、導入遺伝子がコードする抗原特異的な四価免疫グロブリン複合体が、有意のレベルの内因性免疫グロブリン四量体の不在下で血清中に蓄積する。
【００７４】
内因性λ軽鎖発現が機能的に抑制されなかった場合、内因性λ軽鎖を含む低いレベルの宿主抗体又はハイブリッド抗体が検出され得る。これらは、ハイブリドーマ上清のスクリーニング後に廃棄し得る。
【００７５】
ヒトでは、３６個の機能性κＶＬ遺伝子セグメント、５個のＪＬ遺伝子セグメント及び１個のκ軽鎖定常領域（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）が存在する。好ましくは、本発明の非ヒト哺乳動物において導入遺伝子中に存在する異種κ軽鎖遺伝子座は、１又はそれ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメント、すべてのヒトＪＬ遺伝子セグメント及び１つのヒトκ軽鎖定常領域を含む。場合により、ヒトκ軽鎖定常領域は代替的な哺乳動物κ軽鎖定常領域、好ましくはラット又はマウス起源のκ軽鎖定常領域によって置換されていてもよい。
【００７６】
本発明の非ヒト哺乳動物において導入遺伝子中に存在する異種λ軽鎖遺伝子座は、好ましくはマウスλＬＣＲ、並びにヒトλ軽鎖Ｖ１及びＶ２遺伝子セグメント、ヒトλＪ１、Ｊ２、Ｊ３及びＪ４遺伝子セグメント、並びにヒトλ軽鎖Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４定常領域セグメントを含む（国際公開第ＷＯ９０／１００７７号及び同第ＷＯ２００３／０００７３７号）。場合により、ヒトλ軽鎖Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４定常領域セグメントは、代替的なλ軽鎖定常領域、好ましくはラット又はマウス起源のλ軽鎖定常領域によって置換されていてもよい。
【００７７】
本発明の非ヒト哺乳動物において導入遺伝子中に存在する異種重鎖遺伝子座は、好ましくは重鎖免疫グロブリンＬＣＲ、好ましくはマウス起源の重鎖免疫グロブリンＬＣＲ、１又はそれ以上のヒトＶ遺伝子セグメント、１又はそれ以上のＪ遺伝子セグメント、及び１又はそれ以上のＤ遺伝子セグメントを含む。好ましくは、１０又はそれ以上のヒトの異なるＶ遺伝子セグメント並びにすべてのヒトＪ及びＤ遺伝子セグメントが存在する。
【００７８】
遺伝子座はまた、１又はそれ以上のヒト定常（エフェクター）領域、好ましくはμ及びγ定常領域を含み得る。場合により、ヒト定常エフェクター領域は、他の非ヒト哺乳動物由来のエフェクター領域によって置換されていてもよい。非ヒト哺乳動物宿主がマウス又はラットである場合、好ましくは、定常（エフェクター）領域はラット又はマウスに由来する。ヒトと異なり、マウス及びラットのＢ細胞受容体複合体（ＢＣＲ）の膜貫通ドメインは１００％保存されている。従って、ラット定常（エフェクター）領域遺伝子を含む抗体遺伝子座に関してトランスジェニックであるマウスは、抗原投与後にマウス定常（エフェクター）領域遺伝子を含むものと同様に機能するはずであり、ヒト定常（エフェクター）領域遺伝子を含むものを上回り得る（Ｄｅ Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７６６，１９５−２０１）。導入遺伝子は、好ましくはマウス又はヒト起源の、重鎖、κ及びλ軽鎖ＬＣＲを含み得る。すべての哺乳動物種全体にわたって機能するＬＣＲは公知であり、導入遺伝子中のヒト又はマウスＬＣＲを置換し得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１０，４０３−８）。
【００７９】
完全ヒト抗体の作製を企図する場合、ハイブリドーマによって発現されたハイブリッド抗体に由来するクローニングされたヒト抗原特異的ＶＨ及びＶＬ結合ドメインをヒト重鎖及び軽鎖定常領域に融合することができ、そのようにして任意のクラスの完全ヒト四量体抗体を誘導することができる。
【００８０】
さらなる改良として、各々の免疫グロブリンκ及び／又はλ軽鎖遺伝子座はまた、優性選択マーカー遺伝子を含み得る。
【００８１】
遺伝子座に組み込まれた優性選択マーカー遺伝子は、同じか又は異なる作用機構を有し得る。本発明のために、遺伝子の発現が選択的又は毒性攻撃誘発の存在下で非ヒトトランスジェニック哺乳動物に由来するハイブリドーマ又は形質転換Ｂ細胞に選択上の利益を付与することを条件として、任意の優性選択マーカー遺伝子が使用できる。典型的には、優性選択マーカー遺伝子は原核生物起源であり、ピューロマイシン（Ｖａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＮＡＲ，１４，４６１７−４６２４）、ハイグロマイシン（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ，３０，１４７−１５６）及びＧ４１８（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）１５０，１−１４）などの毒性薬剤に対する耐性を付与する群から選択されるか、又はそれらの発現が毒性物質を必須アミノ酸に変換するように、例えばインドールのトリプトファンへの変換又はヒスチジノールのヒスチジンへの変換（Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，（１９８８）ＰＮＡＳ，８５，８０４７−８０５１）のように特定の栄養必要条件を不要にする遺伝子を含む。
【００８２】
本発明のこの態様の必要要件は、優性選択マーカー遺伝子が免疫グロブリン軽鎖トランスジェニック遺伝子座内に組み込まれ、所望の免疫グロブリン軽鎖対立遺伝子と同時発現されて、それによりＢ細胞特異的発現を確実にすることである。あるいは、薬剤耐性遺伝子を、ＥＳ細胞又は核移植アプローチと組み合わせた相同組換えを使用して内因性又は外因性（トランスジェニック）免疫グロブリン遺伝子座に挿入してもよい（ｔｅ Ｒｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２），ＰＮＡＳ，８９，１１，５１２８−５１３２）。
【００８３】
非ヒト哺乳動物はまた、異種重鎖遺伝子座並びに関連するＢ細胞特異的ＬＣＲ及び調節エレメントを含有する１又は複数の導入遺伝子を含み得る。各々がＬＣＲと調節エレメントを含有する２以上の異なるトランスジェニック重鎖遺伝子座が存在してもよい。
【００８４】
各々が１又はそれ以上のＶ遺伝子セグメント、１又はそれ以上のＤ遺伝子セグメント、１又はそれ以上のＪ遺伝子セグメント、及び１又はそれ以上の定常（エフェクター）領域を含む重鎖遺伝子座を、各々の遺伝子座が同族のＬＣＲを含む導入遺伝子として導入する。
【００８５】
各々の遺伝子座は、Ｂ細胞特異的発現を推進するために必要な５’及び３’調節エレメントを含む。各々の重鎖又は軽鎖遺伝子座は、抗原投与に応答して内因性遺伝子座と基本的に同様に発現され、導入遺伝子がコードする抗原特異的親和性成熟四量体免疫グロブリンのマウス血清中での循環を導く。
【００８６】
好ましくは、各々の重鎖遺伝子座は、１又は複数のＶ遺伝子セグメント、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、６０又はそれ以上のＶ遺伝子セグメントを含み、それらは任意の脊椎動物種、好ましくは非ヒト哺乳動物に由来し得る。好ましくは２０以下のＶ遺伝子セグメントが任意の単一重鎖遺伝子座上に存在する。
【００８７】
１つの実施形態では、各遺伝子座は、１つだけのＶ遺伝子セグメントを含み得る。この実施形態の１つの選択的形態では、多くのＶ遺伝子セグメントが存在し、各々のＶ遺伝子セグメントはすべての他のＶ遺伝子セグメントと異なる。この実施形態では、任意の１つの遺伝子座のＶ遺伝子セグメントはすべて同じ種の生物に由来してよく、例えばすべてのＶ遺伝子セグメントがヒト起源であってよい。あるいは、任意の１つの遺伝子座のＶ遺伝子セグメントは異なる種の生物に由来してよく、例えば一部のＶ遺伝子セグメントはヒトに由来し、その他はヒツジ、ウシ、ウサギ、ラクダ科の動物、さらにはサメに由来してもよい。第二の選択的実施形態では、各々のＶ遺伝子セグメントはその他のすべてのＶ遺伝子セグメントと同一である。存在するＶ遺伝子セグメントの数及び性質にかかわらず、各遺伝子座中の残りのＤ及びＪ遺伝子セグメントは同じであってもよく、又はその他のすべての遺伝子座におけるものと異なってもよい。
【００８８】
従って、非ヒト哺乳動物は、１つの重鎖遺伝子座の複数のコピーを含有し得ることが想定される。これは、Ｂ細胞において生産的再構成が起こる可能性を最適化し、従って抗原認識のための免疫グロブリン重鎖の最適な産生を可能にするという利点を有する。
【００８９】
もう１つの実施形態では、各々の遺伝子座は複数のＶ遺伝子セグメントを含む。
【００９０】
好ましくは、Ｖ遺伝子セグメントはヒト起源である。
【００９１】
「Ｖ遺伝子セグメント」という用語は、サメ、げっ歯動物、ラクダ科の動物及びヒトを含むがこれらに限定されない、脊椎動物に由来する任意の天然に生じるＶ遺伝子セグメントを包含する。Ｖ遺伝子セグメントは、再構成された核酸がＢ細胞において発現されたときκ又はλ免疫グロブリン軽鎖と複合体化することができる免疫グロブリン重鎖抗体を生成するために、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び重鎖定常（エフェクター）領域をコードする遺伝子セグメントと組み換えることができなければならない。
【００９２】
Ｖ遺伝子セグメントはまた、再構成された核酸がＢ細胞において発現されたときκ又はλ免疫グロブリン軽鎖と複合体化することができる免疫グロブリン重鎖抗体を生成するために、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント及び重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントと組み換えることができる、天然又は操作された、ホモログ、誘導体、又はタンパク質のフラグメントをコードする任意の遺伝子配列をその範囲内に含む。Ｖ遺伝子セグメントは、例えばＴ細胞受容体遺伝子座に由来し得る。
【００９３】
好ましくは、本発明の複数の重鎖遺伝子座は、３９個の機能性ヒトＶ遺伝子セグメント及びその操作された変異体の任意の数又は組合せを含む。これらは、任意の数の遺伝子座、例えば８個のＶ遺伝子セグメントを含む４つの遺伝子座に加えて７個のＶ遺伝子セグメントを含む１つの遺伝子座；４個のＶ遺伝子セグメントを含む７つの遺伝子座に加えて３個のＶ遺伝子セグメントを含む１つの遺伝子座；又は各々１個のＶ遺伝子セグメントを含む３９の遺伝子座上に存在し得る。
【００９４】
ヒトＶ遺伝子は、ＶＨ１〜ＶＨ７の７つのファミリーに分類され、各ファミリー内の個々の遺伝子に番号が付されている。各遺伝子が使用される頻度は、特定の免疫応答の様々な必要条件に依存する。例えば、ＶＨ３ファミリーの遺伝子は、細菌抗原に対して応答する場合、ＶＨ５ファミリーのものと比較して選択的に使用され得る。そのため、本発明のさらなる好ましい実施形態では、特異的抗原に対する抗体応答を生じさせるために有用であることが示されたＶ遺伝子セグメントの群は、各々が異なる優性選択マーカー遺伝子を含む別々の遺伝子座に分類される。Ｖ遺伝子セグメントは、ファミリーによって分類され得るか、又は個々の機能によって分類され得る。例えば、ＶＨ３ファミリーのＶ遺伝子が細菌抗原に対する免疫応答を生じさせるために有用であることが示された場合、これらは、細菌抗原に対する重鎖のみ抗体を生成するために特に有用な遺伝子座を作製するのに使用され得る。あるいは、ＶＨ３及びＶＨ５ファミリーからのいくつかの個別遺伝子が細菌抗原に対する免疫応答を生じさせるために有用であることが示された場合、これらは一緒に分類され、細菌抗原に対する抗体を生成するために特に有用な遺伝子座を作製するのに使用され得る。
【００９５】
本発明に関連して「免疫グロブリン重鎖遺伝子座」は、重鎖定常（エフェクター）領域をコードする１又はそれ以上の遺伝子セグメントに操作的に連結された、１又はそれ以上のＶ遺伝子セグメント、１又はそれ以上のＤ遺伝子セグメント及び１又はそれ以上のＪ遺伝子セグメントを含むＶＨドメインをコードする最小マイクロ遺伝子座に関する。好ましくは、抗体レパートリーの可変性の主要な原因は、Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの選択とＶ−Ｄ及びＤ−Ｊ結合とによって形成されるＣＤＲ３領域である。
【００９６】
本発明の利点は、再構成されたＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントにおいて得られる抗体レパートリー及び多様性を、対立遺伝子排除を利用することにより、同じトランスジェニック非ヒト哺乳動物における複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子座の使用を介して最大化できることである。遺伝子座の１つを無作為に選択して組換えを開始させ、続いて、最初の組換えが非生産的等であった場合は、生産的な組換えが遺伝子座の１つから生成されるまで次の遺伝子座を選択する、対立遺伝子排除のプロセスは、実際上組み合わせた遺伝子座内に存在するすべてのＶ遺伝子セグメントが全体的な組換えプロセスの一部となることを確実にする。
【００９７】
ＶＤＪ再構成に生産的に関与する任意の所与の免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるすべてのＶＨ遺伝子セグメントの確率を高めるために、ＣＴＣＦ部位をＶＨ遺伝子セグメントの群の間に分散させてもよい。
【００９８】
その正常な立体配置の免疫グロブリン遺伝子座は、Ｂ細胞において行われた、ＶＨ領域の方向に及びＶＨ領域を通して測定した距離測定に基づき、三次元折りたたみ構造を有すると思われる（Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ，１３３，２６５−２７９）。異なるＶＨ領域が、それらが免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ、Ｊ及び定常領域から極めて異なる距離に配置されている場合でも等しく効率的に使用され得る理由が、そのような折りたたみ又はループ構造により説明される。
【００９９】
また、多くの遺伝子座におけるループ化によって形成される折りたたみ構造は、ＣＴＣＦと呼ばれる特定のクロマチン結合タンパク質を介して媒介されることが最近明らかになった。ＣＴＣＦは、突然変異誘発実験によって明らかにされたように（Ｓｐｌｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２０，２３４９−２３５４）クロマチンループの形成に直接関与すると思われる。ごく最近、姉妹染色分体を結びつけるタンパク質複合体、コヒーシンがＣＴＣＦ結合部位に存在することが示された（Ｗｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ，４５１，７９６−８０１）。免疫グロブリンＶＨ領域からの多くのＣＴＣＦ部位を含むことは（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ，１２８，１２３１−１２４５；Ｄｅｎｇｅｒ，Ｗｏｎｇ，Ｊａｎｋｅｖｉｃｉｕｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８２，４４−４８）、トランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＶＨ領域が正しく折りたたまれ、その遺伝子座に存在するすべての異なるＶ遺伝子セグメントの効率的な利用を可能にし得る確率を高める。
【０１００】
異種重鎖遺伝子座を含む各々の導入遺伝子は、優性選択マーカーをさらに含み得る。好ましくは、優性選択マーカーは、κ又はλ軽鎖遺伝子座内に導入される優性選択マーカーとは異なる。
【０１０１】
本発明のために、遺伝子の発現が選択的又は毒性攻撃誘発の存在下で非ヒトトランスジェニック哺乳動物に由来するハイブリドーマ又は形質転換Ｂ細胞に選択上の利益を付与することを条件として、任意の優性選択マーカー遺伝子が使用できる。典型的には、優性選択マーカー遺伝子は原核生物起源であり、ピューロマイシン（Ｖａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＮＡＲ，１４，４６１７−４６２４）、ハイグロマイシン（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ，３０，１４７−１５６）及びＧ４１８（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）１５０，１−１４）などの毒性薬剤に対する耐性を付与する群から選択されるか、又はそれらの発現が毒性物質を必須アミノ酸に変換するように、例えばインドールのトリプトファンへの変換又はヒスチジノールのヒスチジンへの変換（Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ，８５，８０４７−８０５１参照）のように特定の栄養必要条件を不要にする遺伝子を含む。
【０１０２】
本発明の必要要件は、優性選択マーカー遺伝子が、使用される場合、免疫グロブリン重鎖トランスジェニック遺伝子座内に存在し、それによりＢ細胞特異的同時発現を確実にすることである。あるいは、薬剤耐性遺伝子を、ＥＳ細胞又は核移植アプローチと組み合わせた相同組換えを使用して内因性又は外因性（トランスジェニック）免疫グロブリン遺伝子座に挿入してもよい（例えばｔｅ Ｒｉｅｌｅ，Ｒｏｂａｎｕｓ Ｍａａｎｄａｇ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ（１９９２），ＰＮＡＳ，８９，１１，５１２８−５１３２）。
【０１０３】
同じ優性選択マーカー遺伝子をすべての重鎖遺伝子座内に組み込んでもよい。あるいは、異なる重鎖遺伝子座又は重鎖遺伝子座の群は、異なる優性選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【０１０４】
四量体抗体を発現する本発明のトランスジェニックマウスに由来する、ハイブリドーマ又は形質転換Ｂ細胞、好ましくは形質転換長命形質細胞（Ｓｌｉｆｋａ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，８，３６３−３７２）を、トランスジェニック軽鎖遺伝子座内の機能的優性選択マーカー遺伝子の同時発現により、内因性免疫グロブリンを発現する細胞を含まないように選択し得る。さらに、トランスジェニック重鎖遺伝子座に存在するＶセグメントの特定の群に由来する抗体を発現するハイブリドーマ又は形質転換Ｂ細胞株も、軽鎖遺伝子座内に組み込まれた優性選択マーカーと比較して、重鎖遺伝子座内の異なる優性選択マーカーの存在と同時発現により、選択し得る。例えば、κ軽鎖トランスジェニック遺伝子座以内にピューロマイシン耐性遺伝子を含むことは、κ軽鎖導入遺伝子を発現するすべての細胞の選択を可能にする。あるいは、好ましいＶ遺伝子セグメントを含む重鎖トランスジェニック遺伝子座内にＧ４１８耐性遺伝子を含むことは、好ましいＶ遺伝子セグメントを発現するすべての細胞の選択を可能にする。
【０１０５】
特に、本発明は、抗原特異的異種モノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）上述した非ヒトトランスジェニック哺乳動物を抗原で免疫するステップと、
（ｂ）免疫したトランスジェニック哺乳動物のＢ細胞由来のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を調製するステップと、
（ｃ）異種免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子内に存在する優性選択マーカー遺伝子を使用して、異種抗体を発現する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｄ）抗原に特異的に結合する抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと
を含む方法を提供する。
【０１０６】
ここで、単に例示として、以下の詳細な説明において以下の図面を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１Ａ：マウスＩｇＨ遺伝子座の３’末端。 マップはＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆ）からコピーしたものである。尺度はキロベース（ｋｂ）である。緑色の四角は機能性ＶＨセグメント；赤色及び黄色の四角は非機能性ＶＨセグメント；橙色の四角はＪＨセグメント；青色の四角は定常領域である。イントロンＩｇＨエンハンサー及び遺伝子座の３’末端のＬＣＲは示していない。 図１Ｂ：ＩｇＨを無効にする方法 上の列は、膜形態のＩｇＭをコードする２つのエクソンを含む種々のエクソンを有するマウスのＣμ領域を示す。左側は遺伝子座のＪ、Ｄ及びＶＨ領域、右側はＣδから始まるその他の定常領域である。下の列は、組換え後の正常なＭ１エクソンのアミノ酸配列の一部を示す。ＤＮＡ配列は組込み配列を示す。終止コドンは赤色、ＳｐｅＩ部位は赤色と青色である。 図１Ｃ：Ｃμを無効にするためのＥＳ細胞における組換え この図は、組換え挿入物の３’側をカバーするＰＣＲ分析によるＥＳ細胞の組換え陽性クローンのうちの２つを示す。大きい方のフラグメントは、図５Ｂで指示する位置でのＭ１エクソンへのｎｅｏ選択マーカーの挿入に対応する。 図１Ｄ：ＣμノックアウトマウスのＦＡＣＳ分析 Ｍ１エクソンを終止コドンとｎｅｏ遺伝子によって中断した後、ＥＳ細胞を胚盤胞に導入してキメラを得る。これらを同型接合に育種し、血液をＢ細胞の存在に関して分析する。上の２つのパネルは、Ｂ細胞マーカーＢ２２０及びＣＤ１９を使用した正常野生型マウスと異型接合の中断されたＭ１エクソンマウスのＦＡＣＳ分析を示す。下の２つのパネルは２匹の同型接合マウスを示し、Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋細胞、すなわち機能性Ｂ細胞は存在しない。 図１Ｅ：組換えマウスへの育種後のｎｅｏの欠失 図５Ｄのマウスを組換え酵素発現マウスと交配して、ｎｅｏ遺伝子を欠失させる。右側の２つのレーンは、親動物におけるｎｅｏ遺伝子にわたるロングレンジＰＣＲ産物を示し、左側の次の２つのレーンは、ｎｅｏの欠失と野生型対立遺伝子を有する２匹の異型接合マウスを示す。左側の次の４つのレーンは野生型マウスであるが、最も左側のレーンは、ｎｅｏ遺伝子の同型接合欠失と不活性化Ｍ１エクソンを有するマウスを示す。
【図２】図２：マウスＩｇκ遺伝子座のマップ マップはＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆ）からコピーしたものである。尺度はキロベース（ｋｂ）である。緑色の四角はＶκセグメント；橙色の四角はＪκセグメント；青色の四角は定常領域；黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列である。
【図３】図３：マウスＶκノックダウン ＬＣＲの欠失によってマウスＩｇκ遺伝子を機能的に不活性化するためのスキーム。 ｌｏｘネオマイシン耐性遺伝子カセットを、３’κ−ＬＣＲ（下の列）を置換するＥＳ細胞における相同組換えによって挿入する。ｃｒｅ組換え酵素による処理（＋ｃｒｅ）はｌｏｘ部位の間のすべての配列を除去し、κ遺伝子座内に単一ｌｏｘ部位を残す（上の列）。
【図４】図４：κ遺伝子座を不活性化するためのマウスＣκの挿入 遺伝子座（上の列）は図３と同じである。下の列は、Ｃκエクソン（上の列中の青色）の５’末端の配列を示し、塩基の上部にアミノ酸コードを記載している。起始部のＧＧ塩基対は、スプライシング後のアミノ酸Ｒをコードするスプライス受容部位に直接隣接している。中央の列は３４塩基対のｌｏｘ部位挿入物（青色及び赤色の逆方向反復配列）の挿入を示し、これは、定常領域のコドン使用頻度をフレーム外に置き、下流に終止コドンを作製する（例えば太字の（ｆａｔ ｐｒｉｎｔ）下線を付したＴＧＡ）。黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列である。
【図５】図５：マウスＣκの挿入 遺伝子座（上の列）は図３と同じである。下の列はＣκエクソン（上の列中の青色）の５’末端の配列を示し、塩基の上部にアミノ酸コードを記載している。起始部のＧＧ塩基対は、スプライシング後のアミノ酸Ｒをコードするスプライス受容部位に直接隣接している。中央の列は、ｌｏｘ配列（青色及び赤色の逆方向反復配列）及び４つの終止コドンを含む４６塩基対の挿入物の挿入を示し、これもやはり、定常領域のコドン使用頻度をフレーム外に置き、下流に終止コドンを作製する（例えば太字の下線を付したＴＧＡ）。黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列である。
【図６】図６Ａ：マウスＣκ定常領域終止コドン及びフレームシフトの挿入 遺伝子座（上の列）は図３と同じである。下の列はＣκエクソン（黒色）の配列の一部を示し、塩基の上部にアミノ酸コードを記載している。中央の列はＣκコード領域の配列の一部を示す。その上の列は、ｌｏｘ配列（青色及び赤色の逆方向反復配列）、３つの終止コドンを含む４４塩基対の挿入物の挿入を示し、これもやはり、定常領域のコドン使用頻度をフレーム外に置き、下流に終止コドン（ＴＡＡ）を作製する。黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列であり、挿入のために使用したＨｐａＩ部位を赤色で示す。 図６Ｂ：Ｃκを無効にするためのＥＳ細胞における組換え ゲルは、図１３Ａに例示する、ＥＳ細胞におけるＣκ組換えの多くのクローンの挿入部位にわたるＰＣＲ増幅の結果を示す。クローン３５１及び６２３は陽性であり、これらを胚盤胞に注入してＩｇκ陰性マウスを作製する。
【図７】図７：ヒトＩｇκ遺伝子座 マップはＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆ）からコピーしたものである。尺度はキロベース（ｋｂ）である。緑色の四角は機能性Ｖκセグメント；赤色及び黄色の四角は非機能性Ｖκセグメント；橙色の四角はＪκセグメント；青色の四角は定常領域；黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列である。
【図８】遺伝子導入のためのハイブリッドヒト／ラットＩｇκ遺伝子座の作製 遺伝子座の３’末端を、マウスκ３’エンハンサー（黄色）を含むマウス（黄色）から得る。マウス定常領域コード配列を、ラットゲノムＤＮＡからロングレンジＰＣＲによって得たその５’エンハンサーを含むラットの定常領域コード配列（赤色）で置換する。Ｖ領域とＪ領域の間の適切な間隔を維持するために、Ｖκ４−１からヒトＪκ配列までの下流ヒトセグメントをマウス（黄色）から得る。ヒトＪκセグメントを、ヒト遺伝子座のこの部分をカバーするＰＡＣ（緑色）から得る。緑色の四角は、個別に又はブロックとして（本文参照）付加したＶκセグメントである。ＰＡＣベクター中に存在するピューロマイシン耐性遺伝子を赤色で示し、黒い円はκ−エンハンサー及び赤い円はκ−ＬＣＲ配列を示す。
【図９】図９：ＶＨ４重鎖遺伝子座のマップ ５’末端にネオマイシン選択マーカーを含むこの遺伝子座をヒト／マウスハイブリッド遺伝子座の構築のための出発物質として使用する。この遺伝子座は、国際公開第ＷＯ２００８／０３５２１６号に記載されているように構築する。尺度はキロベースである。この遺伝子座は、４つのＶＨ領域（１−４６、３−５３、３−２３、３−１１）、ヒトＤセグメントの全部、ヒトＪセグメントの全部及びＩｇＧ定常領域と３’ヒトＩｇＨ ＬＣＲを含む。
【図１０】図１０：４つのＶＨヒト／ラット定常領域ＩｇＨ遺伝子座の作製 ＶＨ４ヒト遺伝子座中に存在するＣｅｕＩ部位（図６）を使用して、ラットゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅したラット定常コード領域及びスイッチ領域を付加することによってヒト／ラット遺伝子座を作製する。同様にマウスＬＣＲ領域をマウスゲノムＤＮＡからいくつかのフラグメントとして増幅し、最初にそれらを一緒にクローニングして完全なマウスＩｇＨ ＬＣＲを作製する。４つのＶＨセグメント、ヒトＤセグメントの全部及びヒトＪセグメントの全部を含むヒトＶＨ４遺伝子座の５’末端（図６）。すべてのヒト配列は青色であり、すべてのマウス配列は明緑色、ラット配列は赤色であり、ネオマイシン耐性遺伝子は紫色で示す。
【図１１】図１１：λＬＣＲを含むＩｇλエンハンサーの欠失 λ遺伝子座エンハンサーを、エンハンサー２−４に隣接する領域に相同な配列によって隣接されたハイグロマイシン耐性遺伝子及び４−１０エンハンサーに隣接する領域に相同なセグメントによって隣接されたブラスチシンＳ耐性遺伝子を使用して、標準的な置換ベクターを用いた相同組換えによって除去する。置換は、エンハンサーを喪失したλ遺伝子座を生じさせ、発現低下を示す。ハイグロマイシン耐性遺伝子を赤色で示し、ブラスチシンＳ耐性遺伝子を橙色で示す。マウスＶλセグメントは緑色であり、Ｊセグメントは黄色、定常領域は青色である。マップはＩＭＧＴデータベースからコピーしたものである。
【図１２】図１２：遺伝子導入のためのヒト／ラットＶκ遺伝子座 遺伝子座は図８と同じであるが、付加的なヒトＶκセグメントを遺伝子座に加えた。生じた遺伝子座は、頻繁に及び中等度の頻度で使用されるヒトＶκセグメントの全部を含む。緑色の円及び緑色の線はマウスκ−エンハンサー及びイントロン；赤色の四角及び円はラットκ−定常領域及びエンハンサー：青色の四角はヒトＶＨセグメント；暗青色はピューロマイシン選択マーカーである。
【図１３】図１３Ａ：ヒト／ラットハイブリッド遺伝子座の作製 ＶＨ領域を一緒に連結して、ＳｃｅＩ部位の間にクローニングした１７個の連続するヒトＶＨ領域のコンカテマーにすることによって遺伝子座を作製する。ＤＨセグメントとＪＨセグメントの間に適切な距離を保持するために、ヒトＤＨ及びＪＨセグメント全部を含むヒト４０ｋｂフラグメントにマウススペーサー領域を付加する。これに続いてＳｃｅＩ部位を含むＶＨ６−１セグメントを付加する。次にコンカテマーをＶＨ６−１に付加する。最後に、様々なラット定常領域とマウスＬＣＲを３’側に付加する。生じる遺伝子座は、頻繁に及び中等度の頻度で使用されるヒトＶＨセグメントの全部を含む。 図１３Ｂ：ヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座の出発構築物 ゲルは、ＶＨ６−１の付加後のヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座構築の第一段階の結果を示す。右側のレーンは、クローニングしたプラスミドの２つのＮｏｔＩ消化物を示す。レーン（ＮｏｔＩ×ＭｌｕＩ）は、ベクター中で正しい方向を有するレーン１のプラスミドを示し、レーン２のプラスミドは誤った方向を有する。レーン１のプラスミドを遺伝子座の作製における次の段階に使用する。 図１３Ｃ：ＶＨセグメントのコンカテマー ゲルは、１７の異なるＶＨ領域のコンカテマーのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ消化物を示す。マーカーレーンは、ＢｓｔＥＩＩで消化したλファージＤＮＡを含む。
【図１４】図１４：トランスジェニックヒト／ラット重鎖免疫グロブリン遺伝子座 同じ動物に導入した２つの重鎖遺伝子座の一例。ある重鎖遺伝子座の別の重鎖遺伝子座に対する選択は対立遺伝子排除を介する。付加的なＶＨセグメントを遺伝子座の各々に加えることができる。あるいは、さらなる重鎖遺伝子座を使用して付加的なＶＨセグメントを導入することができる。明らかに、κ又はλ軽鎖遺伝子座に関する多様性を高めるために同じ方法が使用できる。
【図１５】図１５：ヒト／ラットλトランスジェニック軽鎖遺伝子座 ヒト／ラット遺伝子座の一例を示す。その３’末端を、マウスλ３’ＬＣＲ（黄色）を含むマウス（黄色）から得る。マウス定常領域コード配列を、ラットゲノムＤＮＡからのロングレンジＰＣＲによるラットの定常領域コード配列（赤色）で置換する。Ｖ領域とＪ領域の間に適切な間隔を維持するために、Ｖλ２−１４からヒトＪκ配列までの下流ヒトセグメントをマウス（黄色）から得る。ヒトＪλセグメントを、ヒト遺伝子座のこの部分をカバーするヒトＰＡＣ（青色）のロングレンジＰＣＲによって得る。青色の四角は、個別に又はブロックとして付加したＶλセグメントである。ＰＡＣベクター中に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子は紫色である。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
＜実施例＞
以下の実施例では、ハイブリッドヒト／ラット重鎖及び軽鎖遺伝子座を、常套的な遺伝子導入手順である受精卵への微量注入によって導入された導入遺伝子として発現するトランスジェニックマウスを作製する。卵供与マウスを、内因性マウス重鎖遺伝子及びマウス軽鎖遺伝子を発現しない又は前記遺伝子の非常に低い発現を有するように改変する。マウスには、κ及びλ鎖について２つの軽鎖遺伝子座があり、そのうちλはマウスＨ２Ｌ２抗体の約２％においてのみ使用される。実施例は、従って、ＩｇＨ遺伝子座と不活性化された内因性κ遺伝子座だけを有するマウス又はＩｇＨと不活性化されたκ遺伝子座を有し、λ遺伝子座の発現をさらに一層低下させるためにλ遺伝子座の調節配列が除去されたマウスのいずれかにおけるものである。
【０１０９】
重鎖及び軽鎖遺伝子座の構築、抗原投与後のトランスジェニックマウスの作製とスクリーニングのために使用される方法は、ＣＨ１ドメインがすべての重鎖遺伝子座で保持されることを除き、基本的に以前に記述されているとおりである（Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＰＮＡＳ，１０，１０３（４１），１５１３０−５、国際公開第ＷＯ２００６／００８５４８号、同第ＷＯ２００７／０９６７７９号、英国特許第ＧＢ０８０５２８１．３号及び英国特許第ＧＢ０８０５２８１．３号の優先権を主張して２００８年６月１１日に出願されたＰＣＴ出願）。機能性異種免疫グロブリン遺伝子座を発現する及び／又は操作された内因性遺伝子座を有する、マウス以外の哺乳動物を含む脊椎動物を誘導するための一般的な方法は、国際公開第ＷＯ２００６／０４７３６７号に記載されている。以下の実施例では、ＥＳ細胞における組換えを使用し、改変されたＥＳ細胞を使用して所望特性を有するマウスを作製する。しかし、同じ手順を誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）において実施することができ、次にそれらを使用してマウスを作製する（例えばＢｏｌａｎｄ，Ｈａｚｅｎ，Ｎａｚｏｒ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｇｉｆｆｏｒｄ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｋｕｐｒｉｙａｎｏｖ ａｎｄ Ｂａｌｄｗｉｎ（２００９），４６１，７２６０，９１−４及びその中の参考文献）。あるいは、体細胞又は体性幹細胞において改変を実施し、その後それらをｉＰＳ細胞に再プログラムして改変マウスを作製する。また、改変造血幹細胞を、Ｂ細胞を欠くレシピエントマウスに移植して、ヒト又はヒトハイブリッド抗体を作製することができる。
【実施例１】
【０１１０】
この実施例では、ＫｉｔａｍｕｒａとＲａｊｅｗｓｋｙによって公表されたのと同様の方法でＩｇＨ遺伝子座（図１Ａ）を不活性化するが、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−４２６が述べたものよりも１アミノ酸前の位置でＣμ領域に終止コドンを導入する点が異なる。ＥＳ（又はｉＰＳ）細胞を、マウスＩｇＭ遺伝子の第一膜エクソンの２番目のコドンを終止コドンに変更した構築物でトランスフェクトした。これは、トランスフェクションのためのｎｅｏ選択を含む常套的な手順を含む。組換えの成功を観測できるようにＳｐｅＩ部位を組換え配列に含めた（図１Ｂ）。その後ＥＳ細胞をサザンブロット法によってスクリーニングし、成功した組換えクローンを確認する。これは、１０の正しい組換え体を生じた（例えば図１Ｃ）。これらのうちで、３つをマウス胚盤胞に注入してキメラを得、その後それらを育種して、ＩｇＨ突然変異に関して同型接合のマウスを得た。そのようなマウスのＢ細胞のＦＡＣＳ分析（Ｂ２２０対ＣＤ１９）は、末梢血中にＢ細胞が存在しないことを示す（図１Ｄ）。その後マウスを組換え酵素発現マウスと交配し、ｎｅｏ遺伝子を除去した（図１Ｅ）。同様に、マウスＩｇκ遺伝子座（図２）をＥＳ細胞における組換えによって不活性化又は低減させる（図２、３、４〜６）。生じたκ不活性化マウスを重鎖ＫＯマウスと交配する。３’κ遺伝子ＬＣＲを、ｌｏｘ部位によって隣接されたｎｅｏ耐性マーカーで置換することによって活性のノックダウンを達成する（図３）。ｎｅｏ遺伝子は、場合により組換え酵素での処理によって除去する。
【０１１１】
あるいは、κ対立遺伝子をＩｇＨのＫＯ細胞において直接ノックアウトすることができる。いくつかの異なる方法がκ不活性化を達成するために使用できる。κ遺伝子の活性のブロッキングは、ｌｏｘ部位によって隣接されたｎｅｏ遺伝子をＣκエクソンの５’末端に挿入するＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞における相同組換えを使用するによって（図４）、又はｌｏｘ部位によって隣接されたｎｅｏ遺伝子と終止コドンをコードする付加的な配列を挿入することによって（図５及び６Ａ）達成できる。組み換えたＥＳ細胞をｃｒｅで処理することにより、フレーム外の配列が残るか（図４）又は新しい終止コドンが付加的に含まれる（図５〜６Ａ）。図６Ｂは、図６Ａに示す構築物のトランスフェクション後のＥＳ細胞における組換え結果を示し、不活性化された１個のＣκ対立遺伝子を有する２つのＥＳ細胞クローンを生じる（合計で５つのそのようなクローンを得た）。２つのｌｏｘ部位の間の領域を除去するためにアクチン駆動組換え酵素プラスミドでの標準的な一過性トランスフェクションによって細胞を組換え酵素で処理する。その後前記細胞を使用して常套的な方法によってマウスを作製し、その子孫を育種して同型接合マウスを得る。そのようなマウスは、κ軽鎖を含む免疫グロブリン四量体の構築が実質的に損なわれた又は完全にブロックされたＢ細胞を含む。
【０１１２】
次に、ヒトＩｇκ遺伝子座の最も頻繁に使用されるＶκ遺伝子（Ｉｇデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／を使用して評価した；図７、８参照）を標準的なＰＣＲによって増幅し、ヒトＶＨセグメントに関して先に述べたように、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ部位の間にサブクローニングする。これは、Ｖκ領域の多量体化を可能にし、多量体をＸｈｏＩとＳａｌＩ部位の間に保持する。
【０１１３】
また、３’κエンハンサー、及びラット定常（Ｃκ）領域に加えてラット５’エンハンサーを含むマウスκ遺伝子座の３’末端を一緒にクローニングする（図８）。次に、Ｖκ領域とＪκ領域の間の正常な間隔を維持するためにヒトＪκ領域及びマウスＶκとＪκの間からの領域（１７ｋｂ）（図２）をクローニングする。最後に、常套的な手順によって（例えばＪａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）、前出）ピューロマイシン選択マーカーを含むＰＡＣ（図８）にヒトＶκを挿入する。
【０１１４】
示した実施例では、最も頻繁に使用されるＶκセグメント（４−１、３−１１、３−１５、３−２０及び１−３９）を多量体化し、ヒトＪ領域及びマウスエンハンサー及びラットＣκ領域を含むＰＡＣベクターに連結する。これは、ｐｕｒｏ耐性マーカー遺伝子、ヒトＶκセグメント及びラット定常（Ｃκ）領域から成るヒト−ラットハイブリッド遺伝子座を生じる（図８）。
【０１１５】
並行して、ハイブリッドヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座を構築する。やはり、出発物質に関しては多くの可能性が存在する。この実施例では、出発物質は、４つのヒトＶＨ領域、ヒトＤＨ及びＪＨセグメントの全部並びに２つのヒト定常領域とヒトＬＣＲを含むヒトＰＡＣである（図９及び英国特許出願第０９０５０２３．８号）。
【０１１６】
後者のＰＡＣは、Ｊ領域と定常領域の間に唯一のＣｅｕＩメガヌクレアーゼ部位を有する。ハイブリッド遺伝子座の構築を容易にするために、このＣｅｕＩ部位を使用してヒト３’末端配列を除去し、これらをラット定常領域及びスイッチ領域（Ｃμ、Ｃγ３、Ｃγ１及びＣγ２）で置換する。これらを、ラットゲノムＤＮＡから標準的なロングレンジＰＣＲによって増幅した。最後に、マウス重鎖ＬＣＲを付加する。この調節配列を、３つの部分に分けてマウスゲノムＤＮＡから増幅し、一緒にサブクローニングして、完全なＬＣＲを復元し、ラット定常領域の３’側に付加する（図１０）。生じたハイブリッドＩｇＨ遺伝子座は、従って、ｎｅｏ選択マーカー、ヒトＶ、Ｄ及びＪ領域並びにマウス調節配列を伴うラット定常領域を含む。
【０１１７】
ハイブリッド遺伝子座挿入物を、その後、大きなＤＮＡフラグメントとしてＰＡＣから単離し、ＩｇＨ／Ｉｇκ異型接合又は同型接合ヌルマウスに由来するマウス受精卵に注入して、ヒト／ラットハイブリッドＩｇＨ及びＩｇκ遺伝子座に関してトランスジェニックであるマウスを作製する。これはすべて常套的な方法によって実施する（例えばＪａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）、前出）。
【０１１８】
その後、ハイブリッドＩｇＨ及びハイブリッドＩｇκトランスジェニックマウスを育種して、内因性マウスＩｇＨ及びＩｇκ発現に関して同型接合ヌルであり、ヒト／ラットハイブリッドＩｇＨ及びＩｇκ発現に関して陽性であるマウスを得る。その後これらのマウスを免疫して、常套的な手順によって抗原特異的ハイブリッドヒト／ラットＨ２Ｌ２抗体を作製する。ハイブリドーマを介してモノクローナルヒト／ラットＩｇを作製する場合、ピューロマイシンとネオマイシンの二重選択は、ＩｇＨとＩｇκ遺伝子座の両方を含む骨髄腫融合物だけを選択することを確実にする。
【０１１９】
当業者は、マウス遺伝子を不活性化するための異なるベクター、異なる選択マーカー、異なる組換え位置の使用又はハイブリッド遺伝子座の実際の（常套的な）クローニング方法の変形などの、この手順に対する変形を行ってハイブリッドトランスジェニックマウスを作製し得ることを認識する。同じ手順が、任意の単一哺乳動物種に由来する免疫グロブリンＤＮＡを使用して任意の正常若しくはハイブリッド遺伝子座を作製するために、又は２若しくはそれ以上の種に由来するＤＮＡを使用して誘導されるハイブリッド遺伝子座を作製するために使用できる。
【実施例２】
【０１２０】
この実施例は、ＩｇＨ／Ｉｇκ Ｈ２Ｌ２抗体を得る高頻度が、内因性マウスＩｇλ遺伝子座の発現の頻度を低下させることによってさらに一層高められることを除き、原則として実施例１と同じである。これは、両方のＩｇλの調節領域を選択マーカーで（図１１）、この場合はハイグロマイシン耐性遺伝子とＴＫ−ＢＳＤ遺伝子で置換することによって達成できる。
【０１２１】
後者は、陽性選択、ブラスチシジンＳに対する耐性選択を可能にする（Ｋａｒｒｅｍａｎ，（１９９８）ＮＡＲ，２６，（１０），２５０８−２５１０）。マーカーのこの組合せは、調節領域を置換した場合の２つのＥＳ細胞組換えにおける陽性選択を可能にする。組換えは、実施例１で作製したＥＳ細胞において、あるいは並行して正常ＥＳ細胞において実施し、実施例１で上述したマウスに育種する。
【０１２２】
生じるトランスジェニックマウスは、ハイブリッドヒト／ラットＩｇＨ及びＩｇκ遺伝子座を含み、内因性マウスＩｇＨ及びＩｇκに関して陰性であり（又は非常に低いレベルでＣκを発現する）、非常に低いレベルでＩｇλを発現する。常套的な方法による免疫とハイブリドーマの作製後、ヒト／ラットハイブリッドＨ２Ｌ２抗体だけを発現するハイブリドーマを、ｎｅｏ（図１０）及びｐｕｒｏ（図８）選択によってトランスジェニックハイブリッド遺伝子座の発現のために選択する。
【実施例３】
【０１２３】
実施例３は、上述した実施例に類似するが、ハイブリッドＩｇκ遺伝子座を、より低い頻度で使用されるＶκセグメントの付加によって延長する（図１２；Ｖκ１−９、１−３３、２−３０、２−２８、１−２７、１−５）。あるいは、突然変異／改変Ｖκセグメント又はＶλセグメントをさらに付加することができる。さらなるセグメントの付加は、上述したのと同じＸｈｏＩ／ＳａｌＩクローニング法を使用することによって実施する。この実施例で作製されるマウスの免疫は、抗原による免疫に応答してより大きな複雑性を可能にする。ＶＬ領域の数は、他のＶκセグメントを付加することによって又は上記ＶＬセグメントのすべての組合せを使用することによってさらに変化させ得る。
【実施例４】
【０１２４】
実施例４は、上述した実施例で述べたものに類似するが、ここでは１８のＶＨセグメント及び５つのラット定常領域を使用することによってハイブリッドヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座を作製した（図１３Ａ；ヒトＶＨ６−１、１−２、４−４、２−５、３−０７、１−８、４−３９、３−１５、１−１８、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３４、３−４９、３−５３、４−５９、１−６９）。最初に、ＶＨセグメントとＤ領域の間の適切な距離を維持するためにヒト遺伝子座の中央の７０ｋｂのＤＪ領域を、マウスＩｇＨイントロンからの８ｋｂを用いて５’末端で延長する。次に人為的ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ部位を有する１０ｋｂの第一ＶＨ領域（６−１）をマウスイントロン配列の５’末端でクローニングする（図１０Ｂ）。別のプラスミドにおいて、残りのＶＨ領域全部を、上述したようにＸｈｏＩ／ＳａｌＩ ＶＨセグメントに組み入れることによって一緒にクローニングする（図１０Ｃ）。また、これらの遺伝子座により多くのＶＨセグメント又は改変／突然変異したＶＨセグメントを付加することもできる。また、ＣＴＣＦ部位を含めることもできる。示した実施例では、３つのそのような部位を使用した。それらは、上流のＣＴＣＦ部位を含むＶＨ領域のロングレンジＰＣＲによって得られる。さらに、図１０における遺伝子座と比較した場合、ラットＣαを付加した。この実施例では、特に実施例３と組み合わせて、抗原による免疫に応答してさらに一層大きな複雑性を可能にする。ＶＨ多量体をＶＨ６−１ＤＪプラスミドにクローニングし、その後ラット定常領域を付加して遺伝子座を完成させる。
【０１２５】
これらの実施例すべてにおいて、同じマウス中に存在する付加的な重鎖又は軽鎖トランスジェニック遺伝子座の一部としてＶセグメントを付加することにより、応答の複雑性がさらに一層増大される。すべての遺伝子座が対立遺伝子排除の対象であるので（国際公開第ＷＯ２００７／０９６７７９号参照）、抗原投与後に好ましい再構成だけをインビボで選択し、Ｂ細胞の増殖及び血清中の抗体の蓄積を生じさせる。図１４は、同じ動物に導入することができる２つの重鎖遺伝子座の一例を示し、各々が対立遺伝子排除を介して使用される。明らかに、トランスジェニック免疫レパートリーの複雑性を高めるためにより多くのＶＨセグメントを付加することができるか（改変されたＶＨセグメントを含む）又はより多くの遺伝子座を導入することができる。その方法はまた、他の種にも、それらの種に特異的なＶセグメントを使用して適用できる。
【実施例５】
【０１２６】
この実施例では、上記実施例で述べたヒト／ラットＩｇＨ及び／又はＩｇκ遺伝子座を保持するマウスに育種することを介してヒト／ラットＩｇλ遺伝子座を付加することにより、ヒト／ラットハイブリッド抗体の多様性をさらに一層高める。ヒト／ラットハイブリッドλ遺伝子座は、先の実施例で述べたヒト／ラットＩｇκ遺伝子座に関して説明したのと全く同様にして作製される。相違は、ＪλとＣλの領域が対で生じ、従って２つのラットＣλ領域が２つのヒトＪλ領域にクローニングされるという事実によって引き起こされる（図１５）。ＶλセグメントとＪλセグメントの間の間隔は、その位置で生じる正常マウス配列をクローニングすることによって維持される（図１１参照）。この実施例では、２つのヒトＪλ及びラットＣλのセグメントを４つのヒトＶλセグメントと一緒に使用する。合わせると、これらはヒトＩｇλ応答の８０％以上をカバーする。調節配列（ＬＣＲ、図１５）は、最適発現を確実にするためにマウスに由来し、選択マーカーを遺伝子座の５’末端に付加する。上述したように、遺伝子座を制限フラグメントとして単離し、受精卵に注入して、トランスジェニックλ遺伝子座を有するマウスを作製する。
【０１２７】
これらの実施例のすべてにおいて、異なる種に由来するＶＨ、ＶＬ、Ｄ、Ｊ及び定常領域を使用して、他の単一種抗体又はハイブリッド種抗体を作製することができる。また、ひとたび抗原特異的抗体が同定されれば、完全に常套的な方法によってＶＨＤＪ及びＶＬＪ領域を同じ種又は異なる種に由来する選択的定常領域にクローニングできることも、当業者には明白である。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性λ軽鎖遺伝子座と、内因性κ軽鎖遺伝子座と、内因性重鎖遺伝子座とを含む非ヒト哺乳動物であって、その各々は、抗原投与後にＢ細胞において、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子が形成されて発現されるように再構成することができるが、前記遺伝子座は、前記突然変異した遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する能力が実質的に低減又は排除されるように突然変異している、非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記内因性λ軽鎖遺伝子座、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び前記内因性重鎖遺伝子座の少なくとも１つが、前記内因性遺伝子座又は各々の内因性遺伝子座へのフレームシフト突然変異、ポリペプチドコード配列、及び／又は１若しくはそれ以上の終止コドンの導入によって突然変異している、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記突然変異が５０個未満のヌクレオチドの挿入である、請求項２に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記内因性λ軽鎖遺伝子座、前記内因性κ軽鎖遺伝子座、及び前記内因性重鎖遺伝子座の少なくとも１つの発現が、前記遺伝子座又は各々の遺伝子座におけるＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下している、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
前記導入が、前記内因性κ軽鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
前記導入が、前記内因性λ軽鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
前記導入が、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び前記内因性λ軽鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
前記導入が、前記内因性重鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
前記導入が、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び前記内因性重鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
前記導入が、前記内因性λ軽鎖遺伝子座及び前記内因性重鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
前記導入が、前記内因性λ軽鎖遺伝子座、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び前記内因性重鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
前記内因性κ軽鎖遺伝子座内に請求項２又は請求項３で定義される導入が存在し、前記内因性λ遺伝子座内に請求項４で定義される部分的又は完全なＬＣＲ欠失が存在する、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
前記内因性重鎖遺伝子座が、重鎖遺伝子再構成、ｍＲＮＡ転写及びタンパク質合成は起こる一方で、Ｂ細胞活性化はブロックされるように突然変異されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
１又はそれ以上の異種κ軽鎖遺伝子座と、関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子とを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】
１又はそれ以上の異種λ軽鎖遺伝子座と、関連するＢ細胞特異的調節エレメントとを含有する導入遺伝子を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１６】
異種軽鎖遺伝子座を含有する前記導入遺伝子が優性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１４又は請求項１５に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１７】
１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座と、関連するＢ細胞特異的調節エレメントとを含有する導入遺伝子を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１８】
２又はそれ以上の異なる異種重鎖遺伝子座と、関連するＢ細胞特異的調節エレメントとを含有する２又はそれ以上の導入遺伝子を含む、請求項１７に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１９】
異種重鎖遺伝子座を含有する前記導入遺伝子又は各々の導入遺伝子が優性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１７又は請求項１８に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２０】
各々の異種重鎖遺伝子座がＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２１】
異種κ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座とを含有する導入遺伝子を含む、請求項１４及び１６〜１９のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
異種λ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座とを含有する導入遺伝子を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２３】
異種κ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、異種λ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座とを含有する導入遺伝子を含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２４】
各々の異種遺伝子座が同族のＬＣＲを組み込んでいる、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２５】
各々の異種遺伝子座がヒト遺伝子座である、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２６】
各々の異種遺伝子座が、２以上の種に由来する可変領域と定常領域を含むハイブリッド遺伝子座である、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２７】
各々の異種遺伝子座が、ヒト可変領域とラット又はマウス定常領域を含むハイブリッド遺伝子座である、請求項２６に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２８】
異なる異種重鎖遺伝子座の異なる群を含有する導入遺伝子の群を含み、導入遺伝子の各々の群が異なる優性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２９】
異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子とを含み、異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子が各々異なる優性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３０】
げっ歯動物である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３１】
マウスである、請求項３０に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３２】
抗原特異的異種モノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜３１のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物を前記抗原で免疫するステップと、
（ｂ）前記免疫トランスジェニック哺乳動物のＢ細胞由来のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を調製するステップと、
（ｃ）場合により、前記異種免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子座を含有する前記導入遺伝子内に存在する前記優性選択マーカー遺伝子を使用して、前記異種抗体を発現する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｄ）前記抗原に特異的に結合する抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
ハイブリッド抗体から哺乳動物抗体、好ましくはヒト抗体を誘導する方法であって、
（ａ）請求項３２に記載の方法を実施するステップと、
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、且つ、選択した種のＶＨ及びＶＬ結合ドメインを含む抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｃ）前記ＶＨ及びＶＬドメインをクローニングし、配列決定するステップと、
（ｄ）前記ＶＨ及びＶＬ結合ドメインをコードする配列を、同じ種からの選択した定常エフェクタードメインと共に含む選択された配列を、再びクローニングするステップと、
（ｅ）選択した細胞型において発現ベクターを使用して所望する種の重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする前記再クローニング配列を同時発現させるステップと
を含む方法。
【請求項３４】
哺乳動物前駆細胞において前記内因性重鎖遺伝子座、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び場合により前記内因性λ軽鎖遺伝子座を突然変異させ、前記前駆細胞から哺乳動物を作製することを含み、前記突然変異が、前記哺乳動物において、各々の遺伝子座は、抗原投与後にＢ細胞において、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子が形成されて発現されるように再構成することができるが、前記突然変異遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する能力が実質的に低減又は排除されている、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物の作製のための方法。
【請求項３５】
前記前駆細胞が非ヒト胚性幹細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１４〜３１のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項３２若しくは請求項３３に記載の方法を使用して誘導される、好ましくはヒトの、抗原特異的異種機能性免疫グロブリン四量体の薬剤、診断薬、又は試薬としての使用。
【請求項１】
内因性λ軽鎖遺伝子座と、内因性κ軽鎖遺伝子座と、内因性重鎖遺伝子座とを含む非ヒト哺乳動物であって、その各々は、抗原投与後にＢ細胞において、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子が形成されて発現されるように再構成することができるが、前記遺伝子座は、前記突然変異した遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する能力が実質的に低減又は排除されるように突然変異している、非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記内因性λ軽鎖遺伝子座、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び前記内因性重鎖遺伝子座の少なくとも１つが、前記内因性遺伝子座又は各々の内因性遺伝子座へのフレームシフト突然変異、ポリペプチドコード配列、及び／又は１若しくはそれ以上の終止コドンの導入によって突然変異している、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記突然変異が５０個未満のヌクレオチドの挿入である、請求項２に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記内因性λ軽鎖遺伝子座、前記内因性κ軽鎖遺伝子座、及び前記内因性重鎖遺伝子座の少なくとも１つの発現が、前記遺伝子座又は各々の遺伝子座におけるＬＣＲの一部又は全部の除去によって実質的に低下している、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
前記導入が、前記内因性κ軽鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
前記導入が、前記内因性λ軽鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
前記導入が、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び前記内因性λ軽鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
前記導入が、前記内因性重鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
前記導入が、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び前記内因性重鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
前記導入が、前記内因性λ軽鎖遺伝子座及び前記内因性重鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
前記導入が、前記内因性λ軽鎖遺伝子座、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び前記内因性重鎖遺伝子座においてである、請求項２又は請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
前記内因性κ軽鎖遺伝子座内に請求項２又は請求項３で定義される導入が存在し、前記内因性λ遺伝子座内に請求項４で定義される部分的又は完全なＬＣＲ欠失が存在する、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
前記内因性重鎖遺伝子座が、重鎖遺伝子再構成、ｍＲＮＡ転写及びタンパク質合成は起こる一方で、Ｂ細胞活性化はブロックされるように突然変異されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
１又はそれ以上の異種κ軽鎖遺伝子座と、関連するＢ細胞特異的調節エレメントを含有する導入遺伝子とを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】
１又はそれ以上の異種λ軽鎖遺伝子座と、関連するＢ細胞特異的調節エレメントとを含有する導入遺伝子を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１６】
異種軽鎖遺伝子座を含有する前記導入遺伝子が優性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１４又は請求項１５に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１７】
１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座と、関連するＢ細胞特異的調節エレメントとを含有する導入遺伝子を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１８】
２又はそれ以上の異なる異種重鎖遺伝子座と、関連するＢ細胞特異的調節エレメントとを含有する２又はそれ以上の導入遺伝子を含む、請求項１７に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１９】
異種重鎖遺伝子座を含有する前記導入遺伝子又は各々の導入遺伝子が優性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１７又は請求項１８に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２０】
各々の異種重鎖遺伝子座がＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２１】
異種κ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座とを含有する導入遺伝子を含む、請求項１４及び１６〜１９のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
異種λ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座とを含有する導入遺伝子を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２３】
異種κ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、異種λ軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、１又はそれ以上の異種重鎖遺伝子座とを含有する導入遺伝子を含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２４】
各々の異種遺伝子座が同族のＬＣＲを組み込んでいる、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２５】
各々の異種遺伝子座がヒト遺伝子座である、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２６】
各々の異種遺伝子座が、２以上の種に由来する可変領域と定常領域を含むハイブリッド遺伝子座である、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２７】
各々の異種遺伝子座が、ヒト可変領域とラット又はマウス定常領域を含むハイブリッド遺伝子座である、請求項２６に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２８】
異なる異種重鎖遺伝子座の異なる群を含有する導入遺伝子の群を含み、導入遺伝子の各々の群が異なる優性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２９】
異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と、異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子とを含み、異種軽鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子と異種重鎖遺伝子座を含有する導入遺伝子が各々異なる優性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３０】
げっ歯動物である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３１】
マウスである、請求項３０に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３２】
抗原特異的異種モノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜３１のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物を前記抗原で免疫するステップと、
（ｂ）前記免疫トランスジェニック哺乳動物のＢ細胞由来のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を調製するステップと、
（ｃ）場合により、前記異種免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子座を含有する前記導入遺伝子内に存在する前記優性選択マーカー遺伝子を使用して、前記異種抗体を発現する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｄ）前記抗原に特異的に結合する抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
ハイブリッド抗体から哺乳動物抗体、好ましくはヒト抗体を誘導する方法であって、
（ａ）請求項３２に記載の方法を実施するステップと、
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、且つ、選択した種のＶＨ及びＶＬ結合ドメインを含む抗体を産生する少なくとも１つのハイブリドーマ又は不死化Ｂ細胞株を選択するステップと、
（ｃ）前記ＶＨ及びＶＬドメインをクローニングし、配列決定するステップと、
（ｄ）前記ＶＨ及びＶＬ結合ドメインをコードする配列を、同じ種からの選択した定常エフェクタードメインと共に含む選択された配列を、再びクローニングするステップと、
（ｅ）選択した細胞型において発現ベクターを使用して所望する種の重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする前記再クローニング配列を同時発現させるステップと
を含む方法。
【請求項３４】
哺乳動物前駆細胞において前記内因性重鎖遺伝子座、前記内因性κ軽鎖遺伝子座及び場合により前記内因性λ軽鎖遺伝子座を突然変異させ、前記前駆細胞から哺乳動物を作製することを含み、前記突然変異が、前記哺乳動物において、各々の遺伝子座は、抗原投与後にＢ細胞において、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子が形成されて発現されるように再構成することができるが、前記突然変異遺伝子座から生成される再構成された重鎖及び軽鎖を含む機能性免疫グロブリン四量体を形成する能力が実質的に低減又は排除されている、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物の作製のための方法。
【請求項３５】
前記前駆細胞が非ヒト胚性幹細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１４〜３１のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項３２若しくは請求項３３に記載の方法を使用して誘導される、好ましくはヒトの、抗原特異的異種機能性免疫グロブリン四量体の薬剤、診断薬、又は試薬としての使用。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４】
【図１５】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１２−５１２６４７（Ｐ２０１２−５１２６４７Ａ）
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４１５７８（Ｐ２０１１−５４１５７８）
【出願日】平成２１年１１月３０日（２００９．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２７８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７０２６３
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５０７０２１７３５）エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム (6)
【出願人】（５０７０２１９９７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月３０日（２００９．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２７８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７０２６３
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５０７０２１７３５）エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム (6)
【出願人】（５０７０２１９９７）
【Ｆターム（参考）】
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