ヒト型Ｆｃレセプター発現酵母、およびそれを用いたヒト型Ｆｃレセプターの製造方法
【課題】 遺伝子工学手法を用いて天然型に近いヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩが発現可能なプラスミド、前記プラスミドを形質転換することで得られる真核生物、および前記真核生物を用いたヒト型ＦｃγＲＩの製造方法を提供すること。
【解決手段】 可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミド、前記プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母、および前記酵母を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法により、前記課題を解決することができた。
【解決手段】 可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミド、前記プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母、および前記酵母を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法により、前記課題を解決することができた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学的手法により得られた、ヒト型Ｆｃレセプターを発現する酵母、および前記酵母を用いたヒト型Ｆｃレセプターの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターはイムノグロブリン（以下Ｉｇと表記）のＦｃ領域（Ｆｃ領域とは、無傷の抗体のパパイン消化で生じ得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域をいう）に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合するＩｇのクラスによって分類されている。ＩｇＧのＦｃ領域であるγ鎖に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域であるε鎖に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域であるα鎖に結合するＦｃαレセプターなどがある。
【０００３】
ＦｃレセプターのひとつであるＦｃγレセプターは、その構造の違いによりさらに、サブタイプに分類することができ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（ＫＤ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。また、この分子は単球やマクロファージの細胞表面に存在している。
【０００４】
ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖とγ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域の境界にあるアミノ酸、システイン（Ｃｙｓ）を介した共有結合によりホモダイマーを形成している。
【０００５】
ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列および遺伝子配列（配列番号１）（非特許文献３）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、ＥｘＰＡＳｙなどの公的なデータベースにヒト型ＦｃγＲＩは、エントリーネーム（Ｅｎｔｒｙ ｎａｍｅ）ＦＣＧＲＩ＿ｈｕｍａｎ、アクセション番号（ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）Ｐ１２３１４として登録されている。また、シグナル配列、細胞外領域、細胞膜貫通領域なども公表されている。図１にヒト型ＦｃγＲＩ構造概略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載したアミノ酸番号に対応する。すなわち１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナル配列であり、１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２９２番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）までが細胞外領域であり、２９３番目のバリン（Ｖａｌ）から３７４番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通および細胞内領域とされている。
【０００６】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的な特性は、自己免疫疾患および自己免疫症候群、移植物の拒絶、および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能であるＩｇＧ結合能はＩｇＧ精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００７】
遺伝子組み換え技術を用いたＦｃγＲＩの発現は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（特許文献１）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌（特許文献２）および動物細胞（非特許文献４）を用いた発現が報告されている。しかしながら、特許文献１に記載の大腸菌を利用した発現系や特許文献２に記載のバチルス属細菌を用いた発現系では、原核生物を用いているため、真核生物由来のタンパク質でみられる複雑な翻訳後修飾が起こらない。よって、天然に存在するＦｃγＲＩとは多少異なったタンパク質が発現される。一方、非特許文献４に記載の動物細胞を用いる方法では、翻訳後修飾が起こるため、天然型のＦｃγＲＩに近いタンパク質を得ることができるが、培養コストが高い、という課題が残る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【特許文献２】特開２００９−２０１４０３号公報
【特許文献３】ＷＯ１９９６／０２３８９０号
【特許文献４】特開２０００−１３６１９９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒａｖｅｔｃｈ．Ｊ．Ｖ． ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ．Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，４５７−４９２，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，，Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．，２８，３１８−３２６，２００５
【非特許文献３】Ｊａｎｅｔ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ． ａｎｄ Ｓｅｅｄ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８−３８１，１９８９
【非特許文献４】Ｐａｅｔｚ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．，３３８，１８１１−１８１７，２００５
【非特許文献５】Ｃｈａｐｐｅｌｌ．Ｔ．Ｇ． ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ，Ｇ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０９，２６９３−２７０２，１９８９
【非特許文献６】柳澤修一、生化学、７０（４）、２８０−２８４、１９９８
【非特許文献７】Ｋｊａｅｒｕｌｆｆ．Ｓ ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎｍ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３３６，９７４−９８２，２００５
【非特許文献８】Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｈｏｏｖｅｒ ａｎｄ Ｊａｃｅｋ Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（１０），ｅ４３，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、遺伝子工学手法を用いて天然型に近いヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩが発現可能なプラスミド、前記プラスミドを形質転換することで得られる真核生物、および前記真核生物を用いたヒト型ＦｃγＲＩの製造方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題に関し鋭意検討を行なった結果、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを用いて形質転換することで得られた酵母を用いて、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させることで、翻訳後修飾（非特許文献５）がある、天然型に近いヒト型ＦｃγＲＩを、可溶化した状態で得られることを見出した。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する：
（１）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母。
【００１３】
（２）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドである、（１）に記載の酵母。
【００１４】
（３）発現プラスミドが、配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいる、（１）または（２）に記載の酵母。
【００１５】
（４）酵母がＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅである、（１）から（３）のいずれかに記載の酵母。
【００１６】
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の酵母を用いた、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【００１７】
（６）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド、および配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含んだ、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを酵母で発現させるためのプラスミド。
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本発明の酵母を取得する際に用いる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、報告されているヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドに適当な修飾を加えることで、本来なら膜タンパク質であるＦｃγＲＩを細胞外に分泌させることが可能なポリヌクレオチドである。前記適当な修飾法としては、終止コドンを細胞外領域あるいは膜貫通領域に挿入する方法、膜貫通領域を除去する方法が例示できるが、膜貫通領域を除去する方法が好ましい。前述したように配列番号１にはヒト型ＦｃγＲＩの全アミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列が示されており、前記アミノ酸中、細胞外領域はアミノ酸番号１６から２９２番目のアミノ酸配列に相当し、膜貫通領域は２９３から３１４番目のアミノ酸配列に相当する。前記細胞外領域または膜貫通領域に終止コドンを挿入することは、遺伝子工学的に可能である。また、適当な合成オリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲ法により連結することで、ヒト型ＦｃγＲＩの細胞外領域もしくは膜貫通領域に終止コドンを挿入したもの、または前記膜貫通領域を除去したポリヌクレオチドを調製してもよい。この際、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドにおけるコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）に関しては必ずしもヒトに合わせなくてもよく、例えば、酵母におけるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ、当該宿主におけるコドンの使用頻度が少ないもの）の全部または一部を、コードするアミノ酸を同一のまま、酵母の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドであってもよい。
【００２０】
また、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、ヒト型ＦｃγＲＩの全塩基配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されているポリヌクレオチドであっても、宿主細胞から分泌され、かつ、ヒト型ＦｃγＲＩの活性を保持するものは前記ポリヌクレオチドを有しているものとみなすことができる。ヌクレオチドの置換としては、あるアミノ酸をコードするヌクレオチドから別のアミノ酸をコードするヌクレオチドへの変換を例示することができる。なお、前記ポリヌクレオチドはヒト型ＦｃγＲＩのｃＤＮＡなどを出発材料として作製してもよいし、人工的に合成してもよい。
【００２１】
さらに、前記ポリヌクレオチドには、発現した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの簡便な精製を目的としたタグ配列を付加させてもよい。タグ配列とはヒト型ＦｃγＲＩに限らず、遺伝子工学に多用されるオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であり、ポリヒスチジンタグ、Ｃ−ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグを例示することができる。タグ配列の付加は、発現させるヒト型ＦｃγＲＩ活性を損なわなければ、前記ポリヌクレオチドの５’末端側、３’末端側いずれに付加してもよい。
【００２２】
本発明においては、宿主として工業生産で通常用いられている真核生物である、酵母を使用する。酵母には、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などを例示できるが、中でもポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が宿主として好ましい。また、前記酵母を変異処理することにより誘導される酵母変異株も本発明における宿主として使用可能である。変異処理はニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチルといった変異処理剤、紫外線、放射線など、当業者で通常用いられる方法で行なえばよい。
【００２３】
本発明の酵母を取得する際に用いる可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを発現させる、すなわち可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現し得る複製可能な発現プラスミドは、前述した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチドおよび酵母中でプラスミドＤＮＡを複製するための複製起点または染色体に組み込まれるためのポリヌクレオチドを含み、かつ、選定された宿主を形質転換できるものであればよい。
【００２４】
前記ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチドとしては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デビドロゲナーゼプロモーター（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、カラクドキナーゼプロモーター（ＧＡＬ１）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ１プロモーター（ＴＥＦ１）、細胞壁タンパク質遺伝子プロモーター（ＳＥＤ１）、インベルターゼプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーターなどが例示でき、宿主である酵母との関係において適宜選定すればよい。
【００２５】
また必要に応じ、分泌シグナルをコードするポリヌクレオチドが発現プラスミドに含まれていてもよい。分泌シグナルとしては、α−ｆａｃｔｏｒ、Ｐ−ｆａｃｔｏｒ（特許文献３）、α−アグルチニン、酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ５タンパク質）、β−グルカナーゼ、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、セルラーゼ、Ｐ３（非特許文献６）、カルボキシぺプチターゼＹ（非特許文献７）、インベルターゼ（特許文献４）のシグナル配列が例示でき、宿主との関係において適宜選定すればよい。特に、配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドが発現プラスミドに含まれていると、発現した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩが酵母細胞外に分泌されるため、その後のヒト型ＦｃγＲＩの分離精製操作を容易に行なえる点で好ましい。
【００２６】
さらに、前記発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換する操作にあたり、前記発現プラスミドが導入された酵母と導入されなかった酵母との選別を可能にするために、発現プラスミドには、ウラシル、アデニン、ロイシンなどの栄養要求性に対する耐性を酵母に付与するためのポリヌクレオチドや、シクロヘキシミド耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ耐性遺伝子などの薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのポリヌクレオチドを含んでいるのが好ましい。
【００２７】
プラスミドを酵母に導入する方法としては、当業者が通常用いられる方法が使用でき、具体的には、プロトプラスト法、エレクトロポーレーション法、酢酸リチウム法などが例示できる。前記導入方法により得られた形質転換体を培養するための培地は、ＹＰＤ培地などの栄養培地やＭＭ培地などの最少培地といった酵母を培養するための公知の培地や、前記培地にグルコースやカザミノ酸などを添加した培地を例示することができる。形質転換体の培養は、通常１６から４２℃、好ましくは２５から３７℃で、８から１６８時間、好ましくは４８から９６時間行なう。また、振盪培養と静置培養のいずれも可能であり、必要に応じて撹拌や通気を加えてもよい。
【００２８】
本発明の酵母の培養液から、ヒト型ＦｃγＲＩを取得するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。ヒト型ＦｃγＲＩが酵母細胞外に分泌する場合は、培養液を遠心分離などによって酵母と分離することでヒト型ＦｃγＲＩを含んだ溶液を得ることができる。ヒト型ＦｃγＲＩが酵母内に発現する場合には、遠心分離などで集菌して得られた酵母を酵素処理剤やガラスビーズなどにより菌体破砕することでヒト型ＦｃγＲＩを含んだ溶液を得ることができる。
【００２９】
前記ヒト型ＦｃγＲＩを含んだ溶液中からヒト型ＦｃγＲＩを分離精製するためには通常の生理活性タンパク回収法によって分離精製することができる。前記タンパク質回収方法としては、液体クロマトグラフィーやカラムクロマトグラフィーを例示することができる。クロマトグラフィーの種類にも特に制限はなく、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの中から、適宜選択して使用すればよい。一例として、前記発現したヒト型ＦｃγＲＩのＮ末端側またはＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されている場合、金属キレートカラムを用いて簡便にヒト型ＦｃγＲＩを精製することができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明で提供される、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを用いて形質転換して得られた、ヒト型ＦｃγＲＩを発現可能な酵母を用いて、ヒト型ＦｃγＲＩの生産を行ない、当該タンパク質を分離回収することにより、翻訳後修飾がある、天然型に近いヒト型ＦｃγＲＩを、可溶化した状態で大量に製造することが可能である。
【００３１】
さらに、発現プラスミドとして配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいると、発現したヒト型ＦｃγＲＩが酵母細胞外へ分泌されるため、その後のヒト型ＦｃγＲＩの分離精製操作が容易となる。
【００３２】
本発明の酵母を用いて製造したヒト型ＦｃγＲＩは、個体発生および免疫機構の研究、さらにはそれらの成果に基づく治療診断薬などの開発に大きな意義を持つ。また、抗ＦｃγＲＩ抗体を作製するための免疫源、さらにはＦｃγＲＩの免疫化学測定方法の標準物質として用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒトＦｃγＲＩ構造の概略を示した図。
【図２】ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲのプラスミドマップを示した図。
【図３】ｐＡＵＲ−ｈＦｃＲを導入した形質転換ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の細胞内発現を確認したＥＬＩＳＡの結果を示した図。縦軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を示している。横軸のＡＰはアプライした試料（この場合培養上清）を、ＦＴはカラム通過画分を、Ｆｒ１からＦｒ４は各溶出画分を、それぞれ示している。図中のＹ−ＰＥＲ、超音波およびビーズ、Ｙ−ＰＥＲは細胞破砕の方法を示している。
【図４】本発明の酵母で得られたヒト型ＦｃγＲＩがヒトＩｇＧ濃度依存的に結合することを確認したＥＬＩＳＡの結果を示した図。縦軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を、横軸はヒトＩｇＧの希釈系列を、それぞれ示している。図中のＰｏｍｂｅは実施例３で得られたヒト型ＦｃγＲＩを、ＣＨＯは組換えＣＨＯ細胞で得られたヒト型ＦｃγＲＩを、それぞれ示している。
【図５】本発明の酵母で得られたヒト型ＦｃγＲＩのヒトＩｇＧサブクラスへの結合性を確認したＥＬＩＳＡの結果を示した図。縦軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を、横軸はヒトＩｇＧのサブクラスを、それぞれ示している。図中のＰｏｍｂｅは実施例３で得られたヒト型ＦｃγＲＩを、ＣＨＯは組換えＣＨＯ細胞で得られたヒト型ＦｃγＲＩを、それぞれ示している。
【図６】ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲのプラスミドマップを示した図。
【図７】ｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲのプラスミドマップを示した図。
【図８】ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲまたはｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲを導入した形質転換ポンベの培養上清のＥＬＩＳＡの結果を示した図。縦軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を示している。横軸のＡＰはアプライ試料（この場合培養上清）、ＦＴはカラム通過画分、Ｆｒ１から４は各溶出画分を、それぞれ示している。図中のｃｏｎｔｒｏｌはｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲ形質転換ポンベの培養上清を、Ｐ１−１およびＰ７−２はｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ形質転換ポンベの培養上清を、Ｉｎｖｅ４はｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ形質転換ポンベの培養上清を、それぞれ示している。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３５】
実施例１ 発現プラスミドの調製
（１）ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの細胞外領域（配列番号１の１番目のアミノ酸であるメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ））のＣ末端側に６個のヒスチジン（以下６Ｈｉｓと表記）を付加したＦｃγＲＩをコードするＤＮＡをＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で増幅し取得した。なお、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡの鋳型としてＨｕｍａｎ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＴＣ１１９８４１プラスミドベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）を用い、増幅用オリゴヌクレオチドとして配列番号２（３’末端側１９塩基は配列番号１の１から１９番目の塩基に相当）および配列番号３（３’末端側２０塩基は配列番号１の８４８から８６７番目の塩基の相補鎖に相当）のオリゴヌクレオチドを用いた。また、ＰＣＲ反応液の組成は表１に示す組成からなり、ＰＣＲ反応は９８℃・１０秒、５５℃・１０秒、７２℃・４５秒を３０サイクルで行なった。本実施例で増幅したポリヌクレオチドを以下ｈＦｃＲ−６Ｈｉｓとする。
【００３６】
【表１】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物（ｈＦｃＲ−６Ｈｉｓ）をＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で精製後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてポンベ用プラスミドベクターであるｐＡＵＲ２２４（タカラバイオ社製）に組み込み、ヒートショック法で大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３）５０μｇ／ｍＬの抗生物質（カルベシニリン）を添加したＬＢプレート培地（０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ＮａＣｌ、１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２％ アガロース）を用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換体を選択し、選択したうちの任意の形質転換体を５０μｇ／ｍＬの抗生物質（カルベシニリン）を含むＬＢ液体培地（０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ＮａＣｌ、１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）を用いて３７℃で一晩培養した。
（４）（３）の培養液をＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出した。本実施例で取得した、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域をクローニングしたプラスミドを以下ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲとする（図２）。
【００３７】
実施例２ ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲの塩基配列解析
ｐＡＵＲ２２４プラスミドに挿入したｈＦｃＲ−６Ｈｉｓの塩基配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）で解析した。なお、シークエンス用プライマーとして配列番号４および５に示すオリゴヌクレオチドを使用した。解析の結果、ｐＡＵＲ２２４プラスミドに挿入したｈＦｃＲ−６Ｈｉｓの塩基配列は設計通りであることを確認した。
【００３８】
実施例３ ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲ形質転換ポンベを用いたヒト型ＦｃγＲＩ発現
（１）図２に示したｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲを用いてＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた酢酸リチウム法でポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＪＹ−７４５株）を形質転換後、０．５μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ（タカラバイオ社製）を含んだＹＰＤプレート選択培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、２％ アガロース）で選択した（３０℃、３日）。
（２）（１）で選択した形質転換ポンベのうち、任意の４クローンを０．５μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ（タカラバイオ社製）を含んだＹＰＤ液体培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ）にて３０℃で振とうすることで前培養した。
（３）５００ｍＬのバッフルフラスコに１μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａを含んだ２００ｍＬのＹＰＤ液体培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ）にて３０℃で振とうすることで本培養を行ない、増殖した形質転換ポンベを遠心分離により回収した。
（４）形質転換ポンベを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に懸濁後、ガラスビーズおよび／またはＹ−ＰＥＲ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社製）で破砕し内容物を抽出した。
（５）あらかじめ１５０ｍＭ ＮａＣｌと１０％ グリセリンを含んだ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（以下、Ｂｕｆｆｅｒ Ａと表記）で平衡化したＨｉｓ−Ｔａｇカラム（Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に、２０ｍＭとなるようにイミダゾールを加えた（４）の抽出物をアプライし、Ｂｕｆｆｅｒ Ａで洗浄を行なった。その後、５００ｍＭ イミダゾールを含んだＢｕｆｆｅｒ Ａで溶出した。
（６）以下に示す方法で、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法による検出を行なった。
（６−１）ヒトイムノグロブリン（以下ヒトＩｇＧと表記）（化血研ガンマグロブリン、化学及血清療法研究所社製）を１０μｇ／ｍＬとなるよう、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で希釈後、９６穴イムノプレート（マキシソープ、Ｎｕｎｃ社製）に１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩放置した。
（６−２）プレートウォッシャー（ＡＭＷ−１９２、ＢｉｏＴｅｃ社製）を用いて、３５０μＬ／ウェルの洗浄液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で４回洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３０℃で２時間反応した。
（６−３）プレートウォッシャー（ＡＭＷ−１９２、ＢｉｏＴｅｃ社製）を用いて、３５０μＬ／ウェルの洗浄液（１５０ｍＭ ＮａＣｌと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（以下ＴＢＳＴバッファーと表記））で４回洗浄後、（５）で精製したポンベ抽出物を１００μＬ／ウェルで添加し、３０℃で１時間インキュベートした。
（６−４）プレートウォッシャー（ＡＭＷ−１９２、ＢｉｏＴｅｃ社製）を用いて、３５０μＬ／ウェルのＴＢＳＴバッファーで４回洗浄後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に１０４倍希釈のＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ−ＨＲＰ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３０℃で１時間反応した。
（６−５）再度プレートウォッシャー（ＡＭＷ−１９２、ＢｉｏＴｅｃ社製）を用いて、３５０μＬ／ウェルのＴＢＳＴバッファーで４回洗浄し、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ウェルで加え室温で数分放置後、１Ｍ リン酸溶液を５０μＬ／ウェルで加え、吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
【００３９】
結果を図３に示す。図３の結果、ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲ形質転換ポンベ抽出物をＨｉｓ−Ｔａｇ精製した試料が抗体と反応していることが確認された。よって、形質転換ポンベ内で可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現していることがわかる。
【００４０】
実施例４ 形質転換ポンベで発現させたヒト型ＦｃγＲＩの機能評価（その１）
図３に示したヒト型ＦｃγＲＩ活性が、ヒト型ＦｃγＲＩとヒトＩｇＧとの結合によるものであることを確認するために、前述したＥＬＩＳＡ法にてヒトＩｇＧの希釈によるヒトＩｇＧへの濃度依存的な結合を調べた。
【００４１】
実施例３の（６−１）で添加するヒトＩｇＧの濃度を１００μｇ／ｍＬから０．００１μｇ／ｍＬへと段階的に低くしたほかは実施例３の（６）と同様な方法でＥＬＩＳＡを行なった。結果を図４に示す。なお、図４ではＣＨＯ細胞で発現させたヒト型ＦｃγＲＩをコントロールとして使用している。ヒトＩｇＧ濃度の減少とともにＥＬＩＳＡ法での検出値が減少していることから、形質転換ポンベにより得られたヒト型ＦｃγＲＩが抗体濃度依存的すなわちヒトＩｇＧと特異的に結合していることが確認できた。
【００４２】
実施例５ 形質転換ポンベで発現させたヒトＦｃγＲＩの機能評価（その２）
実施例３で得られた形質転換ポンベにより得られたヒト型ＦｃγＲＩのヒトＩｇＧサブクラスに対する反応性を確認した。
【００４３】
実施例３の（６−１）で添加するヒトＩｇＧを４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に変更したほかは実施例３の（６）と同様な方法でＥＬＩＳＡを行なった。結果を図５に示す。なお、図５では図４と同様ＣＨＯ細胞で発現させたヒト型ＦｃγＲＩをコントロールとして使用している。形質転換ポンベにより得られたヒト型ＦｃγＲＩはＩｇＧ１とＩｇＧ３には強く結合し、ＩｇＧ２とＩｇＧ４には弱く結合していることを確認した。以上より、実施例３で得られた形質転換ポンベ抽出物を精製した試料が確かにヒト型ＦｃγＲＩであることが確認された。
【００４４】
実施例６ ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲへのシグナル遺伝子の挿入
ポンベ内で機能し、かつ異種タンパク発現の実績のあるＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体、およびインベルターゼのシグナル配列をｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲに組み込み、ヒト型ＦｃγＲＩの発現量が向上するか検討した。
（１）配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿５８８０３８の１から５７番目のアミノ酸に相当）に示すアミノ酸配列からなるＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナルをコードするＤＮＡを、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献８）により作製した。当該方法は、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。
（１−１）下記に示すオリゴヌクレオチド（配列番号１４から２１）を用いて表２の組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ法（９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・３０秒を２５サイクル）によりポリヌクレオチドを増幅した。
【００４５】
（使用したオリゴヌクレオチド）
配列番号１４：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の１から３８番
目の塩基に相当
配列番号１５：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の１８から５３
番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号１６：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の３９から７７
番目の塩基に相当
配列番号１７：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の６２から９８
番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号１８：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の７８から１１
６番目の塩基に相当
配列番号１９：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の９９から１３
７番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号２０：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の１１７から１
５６番目の塩基に相当
配列番号２１：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の１３８から１
７１番目の塩基の相補鎖に相当
【００４６】
【表２】
（１−２）（１−１）のＰＣＲ産物を鋳型として表３の組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ法（９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・３０秒を２５サイクル）によりＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナルをコードするポリヌクレオチドを調製した。
【００４７】
（使用したオリゴヌクレオチド）
配列番号２２：３’末端側１４塩基がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３
０３０の１から１４番目の配列に相当
配列番号２３：３’末端側２０塩基がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３
０３０の１５２から１７１番目の配列の相補鎖に相当
【００４８】
【表３】
（２）配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿５８８３００の１から２２番目のアミノ酸のうち、５番目のチロシンがスレオニンとなった配列）に示すアミノ酸配列からなるインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、（１）と同様、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献８）により作製した。
（２−１）配列番号８から１１からなるオリゴヌクレオチドを用いて表４の組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ法（９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・３０秒を２５サイクル）によりポリヌクレオチドを増幅した。
【００４９】
【表４】
（２−２）（２−１）のＰＣＲ産物を鋳型として表５の組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ法（９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・３０秒を２５サイクル）によりインベルターゼシグナルをコードするポリヌクレオチドを調製した。
【００５０】
【表５】
（３）（１）および（２）で作製したポリヌクレオチドを、アガロースゲル電気泳動を用いた切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を行ない、制限酵素（ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ、タカラバイオ社製）で消化後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製して、インサートを調製した。
（４）ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲ（図２）を制限酵素（ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ、タカラバイオ社製）で消化し、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。制限消化したプラスミドベクターはＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、タカラバイオ社製）で脱リン酸化処理（３７℃で１時間）後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。
（５）（３）で調製したＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナル配列をコードするポリヌクレオチドまたはインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドと、（４）で調製したｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲとをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてそれぞれライゲーションを行ない、ヒートショック法で大腸菌ＪＭ１０９株（ＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、ニッポンジーン社製）を形質転換後、５０μｇ／ｍＬの抗生物質（カルベシニリン）を添加したＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換体を選択した。
【００５１】
本実施例で得られた、Ｐ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを以下ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ（図６）、インベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを以下ｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ（図７）とそれぞれ命名する。
【００５２】
実施例７ ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ、ｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲの塩基配列解析
ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲプラスミドに挿入したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドの配列を、実施例２と同様な方法で解析した。解析の結果、ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲプラスミドベクターに挿入したＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナルをコードするＤＮＡおよびインベルターゼシグナル遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。
【００５３】
実施例８ ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ形質転換ポンベおよびｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ形質転換ポンベを用いたヒト型ＦｃγＲＩ発現
（１）ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ（図６）またはｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ（図７）を用いてＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた酢酸リチウム法でポンベ（ＪＹ−７４５株）を形質転換後、０．２μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ（タカラバイオ社製）を含んだＹＰＤプレート選択培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、２％アガロース）で選択した。
（２）コロニーを形成した形質転換ポンベの任意のクローンを選択して、０．５μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａを含んだ２ｍＬのＹＰＤ液体培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ）で前培養を行なった。
（３）１００ｍＬのバッフルフラスコに０．５μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａを含んだＹＰＤ（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ）液体培地２０ｍＬに植菌し、３０℃で培養した。
（４）培養後、遠心分離により得た培養上清に２０ｍＭとなるようにイミダゾールを加え、あらかじめＢｕｆｆｅｒ Ａで平衡化しておいたＨｉｓＴａｇカラム（Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に培養上清をアプライした。Ｂｕｆｆｅｒ Ａで洗浄後、５００ｍＭ イミダゾールを含んだＢｕｆｆｅｒ Ａで溶出した。
【００５４】
溶出液をＥＬＩＳＡ法にて活性を測定したところ、インベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミド（ｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ、図７）を用いて形質転換したポンベの培養上清にて、ヒト型ＦｃγＲＩの活性が測定された（図８）。なお、コントロールとしてｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲを用いて形質転換したポンベも同時に測定したが活性は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母により、天然型に近いヒト型ＦｃγＲＩを可溶化した状態で得ることが可能となった。なお、酵母は工業生産にも用いられている宿主であるため、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを大量生産するのに有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学的手法により得られた、ヒト型Ｆｃレセプターを発現する酵母、および前記酵母を用いたヒト型Ｆｃレセプターの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターはイムノグロブリン（以下Ｉｇと表記）のＦｃ領域（Ｆｃ領域とは、無傷の抗体のパパイン消化で生じ得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域をいう）に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合するＩｇのクラスによって分類されている。ＩｇＧのＦｃ領域であるγ鎖に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域であるε鎖に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域であるα鎖に結合するＦｃαレセプターなどがある。
【０００３】
ＦｃレセプターのひとつであるＦｃγレセプターは、その構造の違いによりさらに、サブタイプに分類することができ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（ＫＤ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。また、この分子は単球やマクロファージの細胞表面に存在している。
【０００４】
ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖とγ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域の境界にあるアミノ酸、システイン（Ｃｙｓ）を介した共有結合によりホモダイマーを形成している。
【０００５】
ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列および遺伝子配列（配列番号１）（非特許文献３）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、ＥｘＰＡＳｙなどの公的なデータベースにヒト型ＦｃγＲＩは、エントリーネーム（Ｅｎｔｒｙ ｎａｍｅ）ＦＣＧＲＩ＿ｈｕｍａｎ、アクセション番号（ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）Ｐ１２３１４として登録されている。また、シグナル配列、細胞外領域、細胞膜貫通領域なども公表されている。図１にヒト型ＦｃγＲＩ構造概略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載したアミノ酸番号に対応する。すなわち１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナル配列であり、１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２９２番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）までが細胞外領域であり、２９３番目のバリン（Ｖａｌ）から３７４番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通および細胞内領域とされている。
【０００６】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的な特性は、自己免疫疾患および自己免疫症候群、移植物の拒絶、および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能であるＩｇＧ結合能はＩｇＧ精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００７】
遺伝子組み換え技術を用いたＦｃγＲＩの発現は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（特許文献１）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌（特許文献２）および動物細胞（非特許文献４）を用いた発現が報告されている。しかしながら、特許文献１に記載の大腸菌を利用した発現系や特許文献２に記載のバチルス属細菌を用いた発現系では、原核生物を用いているため、真核生物由来のタンパク質でみられる複雑な翻訳後修飾が起こらない。よって、天然に存在するＦｃγＲＩとは多少異なったタンパク質が発現される。一方、非特許文献４に記載の動物細胞を用いる方法では、翻訳後修飾が起こるため、天然型のＦｃγＲＩに近いタンパク質を得ることができるが、培養コストが高い、という課題が残る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【特許文献２】特開２００９−２０１４０３号公報
【特許文献３】ＷＯ１９９６／０２３８９０号
【特許文献４】特開２０００−１３６１９９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒａｖｅｔｃｈ．Ｊ．Ｖ． ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ．Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，４５７−４９２，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，，Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．，２８，３１８−３２６，２００５
【非特許文献３】Ｊａｎｅｔ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ． ａｎｄ Ｓｅｅｄ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８−３８１，１９８９
【非特許文献４】Ｐａｅｔｚ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．，３３８，１８１１−１８１７，２００５
【非特許文献５】Ｃｈａｐｐｅｌｌ．Ｔ．Ｇ． ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ，Ｇ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０９，２６９３−２７０２，１９８９
【非特許文献６】柳澤修一、生化学、７０（４）、２８０−２８４、１９９８
【非特許文献７】Ｋｊａｅｒｕｌｆｆ．Ｓ ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎｍ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３３６，９７４−９８２，２００５
【非特許文献８】Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｈｏｏｖｅｒ ａｎｄ Ｊａｃｅｋ Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（１０），ｅ４３，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、遺伝子工学手法を用いて天然型に近いヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩが発現可能なプラスミド、前記プラスミドを形質転換することで得られる真核生物、および前記真核生物を用いたヒト型ＦｃγＲＩの製造方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題に関し鋭意検討を行なった結果、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを用いて形質転換することで得られた酵母を用いて、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させることで、翻訳後修飾（非特許文献５）がある、天然型に近いヒト型ＦｃγＲＩを、可溶化した状態で得られることを見出した。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する：
（１）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母。
【００１３】
（２）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドである、（１）に記載の酵母。
【００１４】
（３）発現プラスミドが、配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいる、（１）または（２）に記載の酵母。
【００１５】
（４）酵母がＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅである、（１）から（３）のいずれかに記載の酵母。
【００１６】
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の酵母を用いた、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【００１７】
（６）可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド、および配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含んだ、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを酵母で発現させるためのプラスミド。
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本発明の酵母を取得する際に用いる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、報告されているヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドに適当な修飾を加えることで、本来なら膜タンパク質であるＦｃγＲＩを細胞外に分泌させることが可能なポリヌクレオチドである。前記適当な修飾法としては、終止コドンを細胞外領域あるいは膜貫通領域に挿入する方法、膜貫通領域を除去する方法が例示できるが、膜貫通領域を除去する方法が好ましい。前述したように配列番号１にはヒト型ＦｃγＲＩの全アミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列が示されており、前記アミノ酸中、細胞外領域はアミノ酸番号１６から２９２番目のアミノ酸配列に相当し、膜貫通領域は２９３から３１４番目のアミノ酸配列に相当する。前記細胞外領域または膜貫通領域に終止コドンを挿入することは、遺伝子工学的に可能である。また、適当な合成オリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲ法により連結することで、ヒト型ＦｃγＲＩの細胞外領域もしくは膜貫通領域に終止コドンを挿入したもの、または前記膜貫通領域を除去したポリヌクレオチドを調製してもよい。この際、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドにおけるコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）に関しては必ずしもヒトに合わせなくてもよく、例えば、酵母におけるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ、当該宿主におけるコドンの使用頻度が少ないもの）の全部または一部を、コードするアミノ酸を同一のまま、酵母の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドであってもよい。
【００２０】
また、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、ヒト型ＦｃγＲＩの全塩基配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されているポリヌクレオチドであっても、宿主細胞から分泌され、かつ、ヒト型ＦｃγＲＩの活性を保持するものは前記ポリヌクレオチドを有しているものとみなすことができる。ヌクレオチドの置換としては、あるアミノ酸をコードするヌクレオチドから別のアミノ酸をコードするヌクレオチドへの変換を例示することができる。なお、前記ポリヌクレオチドはヒト型ＦｃγＲＩのｃＤＮＡなどを出発材料として作製してもよいし、人工的に合成してもよい。
【００２１】
さらに、前記ポリヌクレオチドには、発現した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩの簡便な精製を目的としたタグ配列を付加させてもよい。タグ配列とはヒト型ＦｃγＲＩに限らず、遺伝子工学に多用されるオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であり、ポリヒスチジンタグ、Ｃ−ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグを例示することができる。タグ配列の付加は、発現させるヒト型ＦｃγＲＩ活性を損なわなければ、前記ポリヌクレオチドの５’末端側、３’末端側いずれに付加してもよい。
【００２２】
本発明においては、宿主として工業生産で通常用いられている真核生物である、酵母を使用する。酵母には、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などを例示できるが、中でもポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が宿主として好ましい。また、前記酵母を変異処理することにより誘導される酵母変異株も本発明における宿主として使用可能である。変異処理はニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチルといった変異処理剤、紫外線、放射線など、当業者で通常用いられる方法で行なえばよい。
【００２３】
本発明の酵母を取得する際に用いる可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを発現させる、すなわち可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現し得る複製可能な発現プラスミドは、前述した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチドおよび酵母中でプラスミドＤＮＡを複製するための複製起点または染色体に組み込まれるためのポリヌクレオチドを含み、かつ、選定された宿主を形質転換できるものであればよい。
【００２４】
前記ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチドとしては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デビドロゲナーゼプロモーター（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、カラクドキナーゼプロモーター（ＧＡＬ１）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ１プロモーター（ＴＥＦ１）、細胞壁タンパク質遺伝子プロモーター（ＳＥＤ１）、インベルターゼプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーターなどが例示でき、宿主である酵母との関係において適宜選定すればよい。
【００２５】
また必要に応じ、分泌シグナルをコードするポリヌクレオチドが発現プラスミドに含まれていてもよい。分泌シグナルとしては、α−ｆａｃｔｏｒ、Ｐ−ｆａｃｔｏｒ（特許文献３）、α−アグルチニン、酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ５タンパク質）、β−グルカナーゼ、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、セルラーゼ、Ｐ３（非特許文献６）、カルボキシぺプチターゼＹ（非特許文献７）、インベルターゼ（特許文献４）のシグナル配列が例示でき、宿主との関係において適宜選定すればよい。特に、配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドが発現プラスミドに含まれていると、発現した可溶性ヒト型ＦｃγＲＩが酵母細胞外に分泌されるため、その後のヒト型ＦｃγＲＩの分離精製操作を容易に行なえる点で好ましい。
【００２６】
さらに、前記発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換する操作にあたり、前記発現プラスミドが導入された酵母と導入されなかった酵母との選別を可能にするために、発現プラスミドには、ウラシル、アデニン、ロイシンなどの栄養要求性に対する耐性を酵母に付与するためのポリヌクレオチドや、シクロヘキシミド耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ耐性遺伝子などの薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのポリヌクレオチドを含んでいるのが好ましい。
【００２７】
プラスミドを酵母に導入する方法としては、当業者が通常用いられる方法が使用でき、具体的には、プロトプラスト法、エレクトロポーレーション法、酢酸リチウム法などが例示できる。前記導入方法により得られた形質転換体を培養するための培地は、ＹＰＤ培地などの栄養培地やＭＭ培地などの最少培地といった酵母を培養するための公知の培地や、前記培地にグルコースやカザミノ酸などを添加した培地を例示することができる。形質転換体の培養は、通常１６から４２℃、好ましくは２５から３７℃で、８から１６８時間、好ましくは４８から９６時間行なう。また、振盪培養と静置培養のいずれも可能であり、必要に応じて撹拌や通気を加えてもよい。
【００２８】
本発明の酵母の培養液から、ヒト型ＦｃγＲＩを取得するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。ヒト型ＦｃγＲＩが酵母細胞外に分泌する場合は、培養液を遠心分離などによって酵母と分離することでヒト型ＦｃγＲＩを含んだ溶液を得ることができる。ヒト型ＦｃγＲＩが酵母内に発現する場合には、遠心分離などで集菌して得られた酵母を酵素処理剤やガラスビーズなどにより菌体破砕することでヒト型ＦｃγＲＩを含んだ溶液を得ることができる。
【００２９】
前記ヒト型ＦｃγＲＩを含んだ溶液中からヒト型ＦｃγＲＩを分離精製するためには通常の生理活性タンパク回収法によって分離精製することができる。前記タンパク質回収方法としては、液体クロマトグラフィーやカラムクロマトグラフィーを例示することができる。クロマトグラフィーの種類にも特に制限はなく、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの中から、適宜選択して使用すればよい。一例として、前記発現したヒト型ＦｃγＲＩのＮ末端側またはＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されている場合、金属キレートカラムを用いて簡便にヒト型ＦｃγＲＩを精製することができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明で提供される、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを用いて形質転換して得られた、ヒト型ＦｃγＲＩを発現可能な酵母を用いて、ヒト型ＦｃγＲＩの生産を行ない、当該タンパク質を分離回収することにより、翻訳後修飾がある、天然型に近いヒト型ＦｃγＲＩを、可溶化した状態で大量に製造することが可能である。
【００３１】
さらに、発現プラスミドとして配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいると、発現したヒト型ＦｃγＲＩが酵母細胞外へ分泌されるため、その後のヒト型ＦｃγＲＩの分離精製操作が容易となる。
【００３２】
本発明の酵母を用いて製造したヒト型ＦｃγＲＩは、個体発生および免疫機構の研究、さらにはそれらの成果に基づく治療診断薬などの開発に大きな意義を持つ。また、抗ＦｃγＲＩ抗体を作製するための免疫源、さらにはＦｃγＲＩの免疫化学測定方法の標準物質として用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒトＦｃγＲＩ構造の概略を示した図。
【図２】ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲのプラスミドマップを示した図。
【図３】ｐＡＵＲ−ｈＦｃＲを導入した形質転換ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の細胞内発現を確認したＥＬＩＳＡの結果を示した図。縦軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を示している。横軸のＡＰはアプライした試料（この場合培養上清）を、ＦＴはカラム通過画分を、Ｆｒ１からＦｒ４は各溶出画分を、それぞれ示している。図中のＹ−ＰＥＲ、超音波およびビーズ、Ｙ−ＰＥＲは細胞破砕の方法を示している。
【図４】本発明の酵母で得られたヒト型ＦｃγＲＩがヒトＩｇＧ濃度依存的に結合することを確認したＥＬＩＳＡの結果を示した図。縦軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を、横軸はヒトＩｇＧの希釈系列を、それぞれ示している。図中のＰｏｍｂｅは実施例３で得られたヒト型ＦｃγＲＩを、ＣＨＯは組換えＣＨＯ細胞で得られたヒト型ＦｃγＲＩを、それぞれ示している。
【図５】本発明の酵母で得られたヒト型ＦｃγＲＩのヒトＩｇＧサブクラスへの結合性を確認したＥＬＩＳＡの結果を示した図。縦軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を、横軸はヒトＩｇＧのサブクラスを、それぞれ示している。図中のＰｏｍｂｅは実施例３で得られたヒト型ＦｃγＲＩを、ＣＨＯは組換えＣＨＯ細胞で得られたヒト型ＦｃγＲＩを、それぞれ示している。
【図６】ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲのプラスミドマップを示した図。
【図７】ｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲのプラスミドマップを示した図。
【図８】ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲまたはｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲを導入した形質転換ポンベの培養上清のＥＬＩＳＡの結果を示した図。縦軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を示している。横軸のＡＰはアプライ試料（この場合培養上清）、ＦＴはカラム通過画分、Ｆｒ１から４は各溶出画分を、それぞれ示している。図中のｃｏｎｔｒｏｌはｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲ形質転換ポンベの培養上清を、Ｐ１−１およびＰ７−２はｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ形質転換ポンベの培養上清を、Ｉｎｖｅ４はｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ形質転換ポンベの培養上清を、それぞれ示している。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３５】
実施例１ 発現プラスミドの調製
（１）ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの細胞外領域（配列番号１の１番目のアミノ酸であるメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ））のＣ末端側に６個のヒスチジン（以下６Ｈｉｓと表記）を付加したＦｃγＲＩをコードするＤＮＡをＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で増幅し取得した。なお、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡの鋳型としてＨｕｍａｎ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＴＣ１１９８４１プラスミドベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）を用い、増幅用オリゴヌクレオチドとして配列番号２（３’末端側１９塩基は配列番号１の１から１９番目の塩基に相当）および配列番号３（３’末端側２０塩基は配列番号１の８４８から８６７番目の塩基の相補鎖に相当）のオリゴヌクレオチドを用いた。また、ＰＣＲ反応液の組成は表１に示す組成からなり、ＰＣＲ反応は９８℃・１０秒、５５℃・１０秒、７２℃・４５秒を３０サイクルで行なった。本実施例で増幅したポリヌクレオチドを以下ｈＦｃＲ−６Ｈｉｓとする。
【００３６】
【表１】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物（ｈＦｃＲ−６Ｈｉｓ）をＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で精製後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてポンベ用プラスミドベクターであるｐＡＵＲ２２４（タカラバイオ社製）に組み込み、ヒートショック法で大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３）５０μｇ／ｍＬの抗生物質（カルベシニリン）を添加したＬＢプレート培地（０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ＮａＣｌ、１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２％ アガロース）を用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換体を選択し、選択したうちの任意の形質転換体を５０μｇ／ｍＬの抗生物質（カルベシニリン）を含むＬＢ液体培地（０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ＮａＣｌ、１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）を用いて３７℃で一晩培養した。
（４）（３）の培養液をＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出した。本実施例で取得した、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域をクローニングしたプラスミドを以下ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲとする（図２）。
【００３７】
実施例２ ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲの塩基配列解析
ｐＡＵＲ２２４プラスミドに挿入したｈＦｃＲ−６Ｈｉｓの塩基配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）で解析した。なお、シークエンス用プライマーとして配列番号４および５に示すオリゴヌクレオチドを使用した。解析の結果、ｐＡＵＲ２２４プラスミドに挿入したｈＦｃＲ−６Ｈｉｓの塩基配列は設計通りであることを確認した。
【００３８】
実施例３ ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲ形質転換ポンベを用いたヒト型ＦｃγＲＩ発現
（１）図２に示したｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲを用いてＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた酢酸リチウム法でポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＪＹ−７４５株）を形質転換後、０．５μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ（タカラバイオ社製）を含んだＹＰＤプレート選択培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、２％ アガロース）で選択した（３０℃、３日）。
（２）（１）で選択した形質転換ポンベのうち、任意の４クローンを０．５μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ（タカラバイオ社製）を含んだＹＰＤ液体培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ）にて３０℃で振とうすることで前培養した。
（３）５００ｍＬのバッフルフラスコに１μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａを含んだ２００ｍＬのＹＰＤ液体培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ）にて３０℃で振とうすることで本培養を行ない、増殖した形質転換ポンベを遠心分離により回収した。
（４）形質転換ポンベを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に懸濁後、ガラスビーズおよび／またはＹ−ＰＥＲ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ社製）で破砕し内容物を抽出した。
（５）あらかじめ１５０ｍＭ ＮａＣｌと１０％ グリセリンを含んだ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（以下、Ｂｕｆｆｅｒ Ａと表記）で平衡化したＨｉｓ−Ｔａｇカラム（Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に、２０ｍＭとなるようにイミダゾールを加えた（４）の抽出物をアプライし、Ｂｕｆｆｅｒ Ａで洗浄を行なった。その後、５００ｍＭ イミダゾールを含んだＢｕｆｆｅｒ Ａで溶出した。
（６）以下に示す方法で、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法による検出を行なった。
（６−１）ヒトイムノグロブリン（以下ヒトＩｇＧと表記）（化血研ガンマグロブリン、化学及血清療法研究所社製）を１０μｇ／ｍＬとなるよう、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で希釈後、９６穴イムノプレート（マキシソープ、Ｎｕｎｃ社製）に１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩放置した。
（６−２）プレートウォッシャー（ＡＭＷ−１９２、ＢｉｏＴｅｃ社製）を用いて、３５０μＬ／ウェルの洗浄液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で４回洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３０℃で２時間反応した。
（６−３）プレートウォッシャー（ＡＭＷ−１９２、ＢｉｏＴｅｃ社製）を用いて、３５０μＬ／ウェルの洗浄液（１５０ｍＭ ＮａＣｌと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（以下ＴＢＳＴバッファーと表記））で４回洗浄後、（５）で精製したポンベ抽出物を１００μＬ／ウェルで添加し、３０℃で１時間インキュベートした。
（６−４）プレートウォッシャー（ＡＭＷ−１９２、ＢｉｏＴｅｃ社製）を用いて、３５０μＬ／ウェルのＴＢＳＴバッファーで４回洗浄後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に１０４倍希釈のＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ−ＨＲＰ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、３０℃で１時間反応した。
（６−５）再度プレートウォッシャー（ＡＭＷ−１９２、ＢｉｏＴｅｃ社製）を用いて、３５０μＬ／ウェルのＴＢＳＴバッファーで４回洗浄し、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ウェルで加え室温で数分放置後、１Ｍ リン酸溶液を５０μＬ／ウェルで加え、吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
【００３９】
結果を図３に示す。図３の結果、ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲ形質転換ポンベ抽出物をＨｉｓ−Ｔａｇ精製した試料が抗体と反応していることが確認された。よって、形質転換ポンベ内で可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを発現していることがわかる。
【００４０】
実施例４ 形質転換ポンベで発現させたヒト型ＦｃγＲＩの機能評価（その１）
図３に示したヒト型ＦｃγＲＩ活性が、ヒト型ＦｃγＲＩとヒトＩｇＧとの結合によるものであることを確認するために、前述したＥＬＩＳＡ法にてヒトＩｇＧの希釈によるヒトＩｇＧへの濃度依存的な結合を調べた。
【００４１】
実施例３の（６−１）で添加するヒトＩｇＧの濃度を１００μｇ／ｍＬから０．００１μｇ／ｍＬへと段階的に低くしたほかは実施例３の（６）と同様な方法でＥＬＩＳＡを行なった。結果を図４に示す。なお、図４ではＣＨＯ細胞で発現させたヒト型ＦｃγＲＩをコントロールとして使用している。ヒトＩｇＧ濃度の減少とともにＥＬＩＳＡ法での検出値が減少していることから、形質転換ポンベにより得られたヒト型ＦｃγＲＩが抗体濃度依存的すなわちヒトＩｇＧと特異的に結合していることが確認できた。
【００４２】
実施例５ 形質転換ポンベで発現させたヒトＦｃγＲＩの機能評価（その２）
実施例３で得られた形質転換ポンベにより得られたヒト型ＦｃγＲＩのヒトＩｇＧサブクラスに対する反応性を確認した。
【００４３】
実施例３の（６−１）で添加するヒトＩｇＧを４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に変更したほかは実施例３の（６）と同様な方法でＥＬＩＳＡを行なった。結果を図５に示す。なお、図５では図４と同様ＣＨＯ細胞で発現させたヒト型ＦｃγＲＩをコントロールとして使用している。形質転換ポンベにより得られたヒト型ＦｃγＲＩはＩｇＧ１とＩｇＧ３には強く結合し、ＩｇＧ２とＩｇＧ４には弱く結合していることを確認した。以上より、実施例３で得られた形質転換ポンベ抽出物を精製した試料が確かにヒト型ＦｃγＲＩであることが確認された。
【００４４】
実施例６ ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲへのシグナル遺伝子の挿入
ポンベ内で機能し、かつ異種タンパク発現の実績のあるＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体、およびインベルターゼのシグナル配列をｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲに組み込み、ヒト型ＦｃγＲＩの発現量が向上するか検討した。
（１）配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿５８８０３８の１から５７番目のアミノ酸に相当）に示すアミノ酸配列からなるＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナルをコードするＤＮＡを、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献８）により作製した。当該方法は、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。
（１−１）下記に示すオリゴヌクレオチド（配列番号１４から２１）を用いて表２の組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ法（９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・３０秒を２５サイクル）によりポリヌクレオチドを増幅した。
【００４５】
（使用したオリゴヌクレオチド）
配列番号１４：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の１から３８番
目の塩基に相当
配列番号１５：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の１８から５３
番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号１６：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の３９から７７
番目の塩基に相当
配列番号１７：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の６２から９８
番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号１８：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の７８から１１
６番目の塩基に相当
配列番号１９：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の９９から１３
７番目の塩基の相補鎖に相当
配列番号２０：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の１１７から１
５６番目の塩基に相当
配列番号２１：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３０３０の１３８から１
７１番目の塩基の相補鎖に相当
【００４６】
【表２】
（１−２）（１−１）のＰＣＲ産物を鋳型として表３の組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ法（９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・３０秒を２５サイクル）によりＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナルをコードするポリヌクレオチドを調製した。
【００４７】
（使用したオリゴヌクレオチド）
配列番号２２：３’末端側１４塩基がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３
０３０の１から１４番目の配列に相当
配列番号２３：３’末端側２０塩基がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２３
０３０の１５２から１７１番目の配列の相補鎖に相当
【００４８】
【表３】
（２）配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿５８８３００の１から２２番目のアミノ酸のうち、５番目のチロシンがスレオニンとなった配列）に示すアミノ酸配列からなるインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、（１）と同様、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献８）により作製した。
（２−１）配列番号８から１１からなるオリゴヌクレオチドを用いて表４の組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ法（９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・３０秒を２５サイクル）によりポリヌクレオチドを増幅した。
【００４９】
【表４】
（２−２）（２−１）のＰＣＲ産物を鋳型として表５の組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ法（９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・３０秒を２５サイクル）によりインベルターゼシグナルをコードするポリヌクレオチドを調製した。
【００５０】
【表５】
（３）（１）および（２）で作製したポリヌクレオチドを、アガロースゲル電気泳動を用いた切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を行ない、制限酵素（ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ、タカラバイオ社製）で消化後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製して、インサートを調製した。
（４）ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲ（図２）を制限酵素（ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ、タカラバイオ社製）で消化し、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。制限消化したプラスミドベクターはＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、タカラバイオ社製）で脱リン酸化処理（３７℃で１時間）後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。
（５）（３）で調製したＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナル配列をコードするポリヌクレオチドまたはインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドと、（４）で調製したｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲとをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてそれぞれライゲーションを行ない、ヒートショック法で大腸菌ＪＭ１０９株（ＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、ニッポンジーン社製）を形質転換後、５０μｇ／ｍＬの抗生物質（カルベシニリン）を添加したＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換体を選択した。
【００５１】
本実施例で得られた、Ｐ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを以下ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ（図６）、インベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを以下ｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ（図７）とそれぞれ命名する。
【００５２】
実施例７ ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ、ｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲの塩基配列解析
ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲプラスミドに挿入したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドの配列を、実施例２と同様な方法で解析した。解析の結果、ｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲプラスミドベクターに挿入したＰ−ｆａｃｔｏｒ前躯体シグナルをコードするＤＮＡおよびインベルターゼシグナル遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。
【００５３】
実施例８ ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ形質転換ポンベおよびｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ形質転換ポンベを用いたヒト型ＦｃγＲＩ発現
（１）ｐＡＵＲ２２４−Ｐ−ｈＦｃＲ（図６）またはｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ（図７）を用いてＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた酢酸リチウム法でポンベ（ＪＹ−７４５株）を形質転換後、０．２μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ（タカラバイオ社製）を含んだＹＰＤプレート選択培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、２％アガロース）で選択した。
（２）コロニーを形成した形質転換ポンベの任意のクローンを選択して、０．５μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａを含んだ２ｍＬのＹＰＤ液体培地（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ）で前培養を行なった。
（３）１００ｍＬのバッフルフラスコに０．５μｇ／ｍＬのＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａを含んだＹＰＤ（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ）液体培地２０ｍＬに植菌し、３０℃で培養した。
（４）培養後、遠心分離により得た培養上清に２０ｍＭとなるようにイミダゾールを加え、あらかじめＢｕｆｆｅｒ Ａで平衡化しておいたＨｉｓＴａｇカラム（Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に培養上清をアプライした。Ｂｕｆｆｅｒ Ａで洗浄後、５００ｍＭ イミダゾールを含んだＢｕｆｆｅｒ Ａで溶出した。
【００５４】
溶出液をＥＬＩＳＡ法にて活性を測定したところ、インベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミド（ｐＡＵＲ２２４−Ｉ−ｈＦｃＲ、図７）を用いて形質転換したポンベの培養上清にて、ヒト型ＦｃγＲＩの活性が測定された（図８）。なお、コントロールとしてｐＡＵＲ２２４−ｈＦｃＲを用いて形質転換したポンベも同時に測定したが活性は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母により、天然型に近いヒト型ＦｃγＲＩを可溶化した状態で得ることが可能となった。なお、酵母は工業生産にも用いられている宿主であるため、可溶性ヒト型ＦｃγＲＩを大量生産するのに有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母。
【請求項２】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
発現プラスミドが、配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１または２に記載の酵母。
【請求項４】
酵母がＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅである、請求項１から３のいずれかに記載の酵母。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の酵母を用いた、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【請求項６】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド、および配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含んだ、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを酵母で発現させるためのプラスミド。
【請求項１】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで酵母を形質転換して得られる、可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母。
【請求項２】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
発現プラスミドが、配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１または２に記載の酵母。
【請求項４】
酵母がＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅである、請求項１から３のいずれかに記載の酵母。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の酵母を用いた、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【請求項６】
可溶性ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド、および配列番号７に記載のインベルターゼのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含んだ、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを酵母で発現させるためのプラスミド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−７２２４６（Ｐ２０１１−７２２４６Ａ）
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２６６１３（Ｐ２００９−２２６６１３）
【出願日】平成２１年９月３０日（２００９．９．３０）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月３０日（２００９．９．３０）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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