ヒト成長ホルモン剤およびその調整方法と使用方法
【課題】 本発明の目的は、長期の貯蔵において安定であり、水性のｈＧＨ剤を提供することを課題とする。
【解決手段】 安定性があり、薬学的に許容される水性剤であって、ヒト成長ホルモン、ポリエチレングリコール、糖アルコールなどの強壮剤、追加的にキレート剤を含む水性剤を提供するものであり、ヒト成長ホルモンの水性剤調整において、１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、ｐＨ５．５からｐＨ７バッファと、５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、強壮剤と、を含める。
【解決手段】 安定性があり、薬学的に許容される水性剤であって、ヒト成長ホルモン、ポリエチレングリコール、糖アルコールなどの強壮剤、追加的にキレート剤を含む水性剤を提供するものであり、ヒト成長ホルモンの水性剤調整において、１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、ｐＨ５．５からｐＨ７バッファと、５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、強壮剤と、を含める。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含む薬剤あるいは化合物、およびそのような薬剤の調整および使用方法に関する。より詳しくは、水性剤状態での長期貯蔵の安定性を強化した薬剤に関係する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモンは、やけどや、傷治療、ジストロフィー、骨の接合、拡散した胃出血および偽関節症、そのほかの症状に有効であるとされてきた。そして、下垂体機能低下の小人症の治療に使用されているホルモンである（例えば特許文献１）。ｈＧＨの主な生物学的効果は成長を促進することである。
【０００３】
作用する器官は骨格、結合組織、筋肉、肝臓、腸および腎臓のような内臓である。成長ホルモンは細胞膜の特定受容器の相互作用によってその作用を及ぼす。組み換えＤＮＡ技術の進歩により、ヒト成長ホルモンをバクテリアなどの供給源より生産することができるようになった。
【０００４】
組み換えタンパク質は、優先的にタンパク質の分解を防ぐ構造に組み合わせられる。タンパク質破壊には、化学的、物理学的な、２つの基本的な原因がある。化学的の破壊は、タンパク質への修飾に関係し、アミド分解、酸化あるいは二硫化物交換のような反応が含まれる。物理的な破壊は、タンパク質の全面的な構造の変化に関係し、変性（すなわち、三次構造のアンフォールディング）などである。
【０００５】
タンパク質は水中で破壊されやすく、ヒト成長ホルモン剤は崩壊率を遅くするために開発されてきた（例えば、特許文献２の背景技術）。しかしながら、それらは再合成における失敗に影響を受け、投薬の精度が下がり、臨床的な使用が難しく、これにより、患者の承諾が少なくいものである。
【０００６】
液体のｈＧＨ剤は、上記の制限を解決するとされている。しかしながら、液剤状態でのｈＧＨの長期貯蔵は、ｈＧＨの界面部の相互作用による物理的な崩壊を起こしやすい。この境界部は、空気／水やガラス／水のようなものであり、ｈＧＨタンパク質の変性を起こしやすいものである。変性において、疎水性の表面は露出され、相互作用および新たなタンパク質のアンフォールディングを促進する可能性がある。これは、タンパク質集合体の生成原因になるものであり、集合体は表面から脱着されて、沈殿をするだろう。これらの相互作用が、ｈＧＨ剤の長期的な貯蔵中に、凝集や、ゆっくりした取り扱いの間に起こりうる。
【０００７】
特許文献２に記述されるように、非イオン界面活性剤はタンパク質の凝集損失を防ぐためにｈＧＨ剤に加えることができ、長期的な貯蔵の間に安定した液体の薬剤を得るものである。一般的に、非イオンの界面活性剤で、凝集を防ぎ、液体蛋白剤を安定化させるメカニズムが２つある。それは、界面活性剤のたんぱく質への吸着と、界面活性剤のタンパク質に匹敵する界面への吸着である。第１のメカニズムによってタンパク質を安定させる非イオンの界面活性剤の１例は、トゥイーンであり、これは自然のｈＧＨ分子の表面あるいはｈＧＨのフォールディング中間体に結合できるものである。いずれの場合も、界面活性剤の結合はタンパク質化学量論に対する特定界面活性剤により、薬剤に要求される界面活性剤の濃度はタンパク質濃度による。第２のメカニズムによってタンパク質を安定させる非イオンの界面活性剤は、タンパク質界面活性剤化学量論に依存しない。しかし、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より上の濃度で凝集を防ぐものである。このような非イオンの界面活性剤は、空気／液体の界面へ吸着し、タンパク質と界面への吸着を競うものである。これが、タンパク質吸着によるタンパク質の変性を防ぐ。
【０００８】
ＰＥＧは、特許文献２で定義されている非イオンの界面活性剤ではない。「ポリソルベート２０、８０などのポリソルベート、およびポリオキシマー１８４、１８８、プルロニック（登録商標）や、多価アルコールやその他のポリマーなどのポリオキシマーを含んでいる。安定した水性剤を提供するのに有効な量が使用される。」
特許文献２の記述する界面活性剤は、水可溶性の前部と疎水性の後部を備えた両親媒性の分子、あるいは疎水性・親水性のサブユニットから構成された重合体である。このモデルに適合する界面活性剤の典型的な例はトゥイーンであり、これにおいて、ＰＥＧは親水性の前部を成形し、Ｃ１１、Ｃ１７のアルキル基の鎖は疎水性の後部を形成している。ＰＥＧは、水可溶の前部および疎水性の後部を持たないという点で両親媒性の分子ではない。
ＰＥＧはポロクサマーではなく、その両方の端末の水酸基にポリオキシエチル化されるＰＰＧ（ポリプロピレングリコール）のコアから成り、対称的なブロック共重合体を示す。一般的には、（ＰＥＧ）ｘ−（ＰＰＧ）ｙ―（ＰＥＧ）ｘに一致するものである。
【０００９】
ＰＥＧはエチレンオキシド単量体のホモポリマーであり、したがってＰＥＧは疎水性・親水性のサブユニットから構成された重合体ではない。さらに、ＰＥＧは、多価アルコール（非還元砂糖、糖アルコール、砂糖酸、ラクトース、ペンタエリトリトール、水溶性のｄｅｘｔｒａｎｓおよびＦｉｃｏｌｌとして典型的に定義されるもの）ではない。したがって、ＰＥＧは、非イオンの界面活性剤として前述の特許において、記述もしくは、考慮されたものではない。
【００１０】
［ＰＥＧは非イオンの界面活性剤として機能しない］
従来の研究は、界面活性剤トゥイーンＮＢ等と同じモル比率で使用された時、ＰＥＧが攪拌による凝集の防止をしないことを実証した（非特許文献１など）。すなわち、非イオンの界面活性剤トゥイーンがタンパク質を保護するのと同じ方法において、ＰＥＧはタンパク質と結合することにより、凝集からＰＥＧがタンパク質を保護していない。
【００１１】
ＰＥＧは水の表面張力を低下させると知られているが、特許に定義されたほどの界面活性剤と考えられていない。タンパク質のような多くの剤が、水の表面張力を低下させるが、界面活性剤と考えられていない。ＰＥＧは、可溶化剤（すなわち、可溶特性の低い物質の可溶性を増加させる剤）に分類されている。また、薬学の補型剤のハンドブックは、ＰＥＧの機能的なカテゴリーは軟膏ベースであり、可塑剤、溶剤、坐薬基剤およびタブレットおよびカプセル潤滑剤としている（非特許文献２）。
【００１２】
優先的排除は、タンパク質溶液および共同溶剤（すなわち、溶液の重要な部分を含むすべての成分）が進んで相互作用しない現象であり、共同溶剤がタンパク質の表面から優先的に除外される。結果、タンパク質のまわりに水和による球体ができる。ＰＥＧは優先的な排除の共同溶剤として知られているが、ＰＥＧとタンパク質の相互作用は、タンパク質表面の化学の性質に依存する。したがって、所定のタンパク質に対するＰＥＧの影響を予言するのは難しい。いくつかのタンパク質について、ＰＥＧはタンパク質と相互に作用し、溶解温度を低下させる（非特許文献３）。タンパク質のＴｍを低下させることは「不安定化」効果であると思われる。例えば、４℃の１％のＰＥＧ−８０００水溶液での貯蔵では、ＬＤＨの活性の減少は、８日で１０％であった（非特許文献４）。ＰＥＧなしで、ＬＤＨの活性は、それ期間の間３０％減少した。予想としては、ＰＥＧは長期的な貯蔵の間にＬＤＨに単に最小の保護を与える。比べて、特許文献２は、非イオンの界面活性剤の存在が１８か月の貯蔵の後にｈＧＨの凝集が１％より少ないことを示している。
【００１３】
主に、優先的排除メカニズムにより、ＰＥＧはタンパク質の有力な沈降反応剤として有名であり、その強く急速な特性のために放射線結晶学の分野の中で広範囲に使用されている。タンパク質の溶解度は９５％まで減少することができ、５から３５％の濃度のＰＥＧ４０００の存在により、さらに減少する（非特許文献５）。従って、タンパク質溶液において共同溶解力のある優先の排除としてのＰＥＧの使用は、典型的にタンパク質沈降反応に関係している。
【００１４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む成長ホルモン（ＧＨ）剤は従来知られている。しかし、ＰＥＧを含むＧＨ剤は、すべて、射出の後にゲルを成形し、ＧＨのゆっくりした放出となるような高濃度のＰＥＧを示している。例えば、特許文献３は、皮下あるいは筋肉注射に適した、成分放出を抑制し、長く作用するＧＨを含み、その約８０％がポリエチレングリコール４００（その濃度において、ｈＧＨは沈殿している）であるＧＨ剤を示している。
【００１５】
特許文献４は、放出持続性のＧＨ剤を示しており、それは、グリセリル基のトリアセテートあるいはトリアセチンに溶かされたＰＥＧ３００からＰＥＧ６００のような非水性のポリエチレングリコール成分を含んだものである。
【００１６】
そのような持続性の放出剤は典型的に粘着性であり、注射用の大きな径の針を必要とする。人間用のｈＧＨ剤は、患者への不快を最小限にするために、理想的には小さな針で行われるべきである。牛や豚の成長率を増加させるための持続性の放出剤は、典型的に、獣医用もしくは農業用として使用されが、人間での使用はより調整管理が必要となる。
【００１７】
特許文献５において、ＰＥＧは、またＧＨの腸管外の持続した放出用ペレットかタブレット剤のための結合剤として使用される。ここにおいて、ＰＥＧがＧＨを安定させることは示されていない。実際に、特許文献５は、安定剤が、砂糖、アミノ酸、アミノ酸の重合体およびコリン塩類のような、とても極性大きい分子であると示している。
【特許文献１】米国特許第４，３４２，８３２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７６３，３９４号明細書
【特許文献３】米国特許第４，０４１，１５５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０１１，０１１号明細書
【特許文献５】米国特許第４，９１７，６８５号明細書
【非特許文献１】Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ． １９９８ Ｄｅｃ； ８７ （１２）： １５５４−９
【非特許文献２】Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９４， ｐ． ３５５
【非特許文献３】Ｌｅｅ， ＬＬ−Ｙ ａｎｄ Ｌｅｅ， ＪＣ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８７ （２６）： ７８１３−９
【非特許文献４】Ｍｉ， Ｙ， ｅｔ ａｌ， ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２００２ Ｍａｙ−Ｊｕｎ ； ５６ （３）： １１５−２３
【非特許文献５】Ａｔｈａ Ｄ． Ｈ． ａｎｄ Ｉｎｇｈａｍ Ｋ． Ｃ． ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９８１ Ｄｅｃ １０ ； ２５６ （２３） ： １２１０８−１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
物理的・化学的劣化程度において、トゥイーンまたはＰｏｌｅａｘｅｓで安定した水性のｈＧＨ剤に相当するものであるＰＥＧによって、安定した水性のｈＧＨ薬剤を提供することが本発明の目的である。
【００１９】
本発明の目的は、長期の貯蔵において安定であり、特許文献２に示された非イオン界面活性剤を含まない、水性のｈＧＨ剤を提供するものである。そして、液体のｈＧＨ剤を提供することが本発明のさらなる目的であり、ｈＧＨは共同溶剤の優先的排除によって安定化するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の１つの様相は水性ヒト成長ホルモン剤であり、これは、ヒト成長ホルモン、バッファ、強壮剤、また有効な量のポリエチレングリコール、さらに、追加的に殺菌された液体で用いることができる抗菌性剤を含む。
【００２１】
発明の更なるの様相は、ヒト成長ホルモンとポリエチレングリコールを５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの範囲の中で混合して含む水性剤で、貯蔵中におけるヒト成長ホルモンの物理的・化学的の劣化を抑制する方法である。
【００２２】
発明の第一の局面によれば、
ａ）１〜２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｂ）ｐＨ５．５からｐＨ７とするバッファ系と、
ｃ）強壮剤と、
ｄ）有効な量のポリエチレングリコールと、
を無菌の薬学的に許容される液体の中に有するヒト成長ホルモン剤を提供するものである。
【００２３】
発明の第二の局面によれば、ヒト成長ホルモンの使用方法であって、
Ａ）ヒト成長ホルモンを水性剤に調整するステップであって、
ａ）該水性剤が１から２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｂ）ｐＨ５．５から７とするバッファ系と、
ｃ）５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
ｄ）強壮剤と、
を薬学的に許容され、注射可能な無菌の水性のビークル内に、含むものと、
Ｂ）前述の製剤を水性液として６から１８ヶ月貯蔵して、水性の液体として貯蔵された薬剤を構成するステップと、
Ｃ）ヒト成長ホルモン治療を必要とする患者に前述の貯蔵された製剤を直接注入するステップと、を有するヒト成長ホルモンの使用方法を提供するものである。
【００２４】
発明の第三の局面によれば、ヒト成長ホルモンの使用方法であって、
Ａ）ヒト成長ホルモンを水性剤に調整するステップであって、
該水性剤が
ａ）１から２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｂ）ｐＨ５．５から７とするバッファー・システムと、
ｃ）５から５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
ｄ）２０から１００ｍｇ／ｍｌの強壮剤と、
ｅ）抗菌剤と、
を薬学的に許容され、注射可能な殺菌した水性のビークル内に、含むものと、
Ｂ）前述の製剤を水性液として、２℃から８℃において６から１８ヶ月間貯蔵して、
水性液体として貯蔵された薬剤を構成するステップと、
Ｃ）ヒト成長ホルモン治療を必要とする患者に前述の貯蔵された剤を直接注入するステップと、を有するヒト成長ホルモンの使用方法を提供する。
【００２５】
本発明の第四の局面によれば、ヒト成長ホルモンの貯蔵安定性のある水性剤を作る方法であって、
薬学的に許容されたビークルが、
ａ）１から２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｂ）ｐＨ５．５から７に調整するバッファと、
ｃ）５から５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
ｄ）２０から１００ｍｇ／ｍｌの強壮剤と、
を含み、前記水性で薬学的に許容されるビークルが、２℃から８℃で、６から１８ヶ月貯蔵可能であることを特徴とする作成方法を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
ＰＥＧによって、安定した水性のｈＧＨ薬剤を提供でき、長期の貯蔵において安定であり、水性のｈＧＨ剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
もし他の方法で定義されなかったならば、ここに使用される技術的・科学的な用語はすべて、発明が属する技術における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を持っている。本発明の実施または試験で記述されたものに類似もしくは同様のいかなる方法および材料も使用することができ、好ましい方法および材料は以下に記述される。この下に言及された発表はすべて、参照として組込まれる。
【００２８】
Ａ． 定義
用語「ヒト成長ホルモン」あるいは「ｈＧＨ」は、自然ソース抽出と精製を含む方法によって、および組み換えの細胞培養システムによって生産されたヒト成長ホルモンを示す。そのシーケンスと特性は、例えば、ＰｅａｒｌｍａｎおよびＢｅｗｌｙ（遺伝子操作による生物製造Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。１９９３； ５： １−５８）によって、述べられている。用語は同様に生物学上活発なヒト成長ホルモン等価物をカバーし、たとえば、全体のシーケンスにおいて、１以上のアミノ酸が異なるものである。更に、この適用において使用される用語は、ｈＧＨ、あるいはｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌな置き換え、削除および挿入アミノ酸変形をカバーするように意図されている。注釈の２種は、１９１のアミノ酸自生種（ｓｏｍａｔｒｏｐｉｎ）、およびＮ−端末のメチオニン（ｍｅｔ）種（ｓｏｍａｔｒｅｍ）が一般に組み換えで得られた１９２のアミノ酸である。
【００２９】
用語「長期安定」は、液体ｈＧＨ剤に関連して、液体ｈＧＨ剤が２℃から８℃で格納される場合、凝集が３から４％であり、ｈＧＨのアミド分解が１５％未満である剤のことである。１つの実施例では、液体ｈＧＨ剤は少なくとも２４か月の間、長期安定であり、また、別の具体例では、液体ｈＧＨ剤は６〜１８月の間、長期安定である。また、別の具体例では、そのような剤は少なくとも１２か月安定である。技術に熟練しているものにとって明白であるように、ｈＧＨの長期安定性は、上記の示された時間の間、薬剤を保温することにより、直接的に決定され、あるいは、長期安定はここに記述された方法によって予見されるものかもしれない。
【００３０】
用語「ＰＥＧ」あるいは「ポリエチレングリコール」は線状重合体であるＨ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨの通式を備えた賦形剤を示すために使用される。添字「ｎ」は、エチレンオキシド・ユニットの数を定義し、それはその分子量（ＭＷ）を決め、この実例の中に一定範囲のＭＷでありうる。ポリエチレングリコールは「分岐したポリエチレングリコール」例えば、３−分岐、４−分岐なども可能である。ＰＥＧは、前述された合成手段によって生産することができる
（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， ｉｎ Ｐｏｌｙ ［ｅｔｈｌｙｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ］ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９９７， ｐ． ８−９， ｎｅｗ ＰＥＧ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ）。
【００３１】
用語ｈＧＨの「薬学的に有効な量」は、投与摂生法における治療効力を提供する量に関係する。成分は、少なくとも０．１、上は約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨの量を含んで調製され、好ましくは、約１から１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１から約５ｍｇ／ｍｌまでである。下垂体機能低下の小人症に苦しむ患者への投与でのこれらの成分の使用では、例えば、これらの構成物は、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌまでｈＧＨを含んでおり、予定された治療の現在考えられている投薬摂生法に対応する。１つの実施例の中で、５つのｈＧＨ濃縮が選択されており、それらの濃度は、０．０３〜０．１０ｍｇのｈＧＨ／ｋｇ体重（ＢＷ）／日の投薬および４５ｋｇのＢＷに基づいた、０．２７ｍＬから０．９０ｍＬの注射量が可能なものである。技術に熟練している人々にとって明白であるように、患者に与えられたｈＧＨの用量は、その条件と投薬摂生法の医学的に容認された投薬量によって決定される。
【００３２】
一般的な方法
米国特許第５，０９６，８８５号明細書に記述されるようなｈＧＨ剤と異なり、本発明は、グリシンあるいは、典型的にｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔか凍結防止剤に使用される他のアミノ酸を必要としない。
【００３３】
本発明は、トゥイーンあるいは他の非イオン界面活性剤（すなわち、親水性の前部と疎水性の後部で構成されるもの）用の必要物がない。さらに、本発明は、ポロクサマー１８８あるいは他のエチレン／プロピレンブロック共同重合体のための必要物がない。
【００３４】
１つの具体例において長期安定したｈＧＨ剤にふさわしいｐＨ範囲は、５．５〜７であり、最も好ましくはｐＨ６．０である。ｐＨ７以上の液体ｈＧＨ剤は、アミド分解により増加したタンパク質劣化する。組み換えｈＧＨの等電点がｐＨ５．１に近いので、ｐＨ５．１の、あるいはその付近の液体のｈＧＨ剤は凝集によりｈＧＨの損失を起こす。等電点よりかなり少ないｐＨでは、液体のｈＧＨ剤は凝集の傾向が無い。別の具体例では、ｈＧＨ剤は４．５未満のｐＨであると思われ、より好ましくは、ｈＧＨ剤が４から４．５のｐＨ範囲であると思われる。
【００３５】
本発明の剤にふさわしいバッファは、薬学的に許容され、適切なｐＨ範囲において個々で定義される適切なｐＨ範囲において、バッファされたｐＨを提供するものである。
ｐＨ５．５〜７を得るために、適切なバッファが含められるが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、琥珀酸塩、グリシン塩、トリスあるいはヒスチジン・バッファーに制限されるものではない。濃度は、２〜５０ｍＭである。
【００３６】
有効な量のＰＥＧは、長期安定した液体ｈＧＨ剤とし、これにより、シヤーリングと表面張力がタンパク質の深刻な変性なしに明らかになる。好ましい実施例では、加えられるＰＥＧ分子のサイズは、１４５０−１００００ＭＷから４００−２００００ＭＷであり、より好ましくは３３５０−８０００ＭＷからである。ＰＥＧの濃度は、５ｍｇ／ｍＬから１００まで、好ましくは５ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬまで、さらにより好ましくは１０ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬになる。
有効な量に必要なＰＥＧの濃度は、ＰＥＧの分子量サイズに反比例する。特に、より大きな分子量のＰＥＧ分子はより低い濃度となる。
【００３７】
抗菌性剤は従来の製剤に含まれるものでよい。抗菌性剤は、含まれると、微生物の成長を妨害し、製剤が複数回使用できる製品となる。許容される抗菌性剤は０．２−０．６％（Ｗ／Ｖ）のフェノール、０．７−１％（Ｗ／Ｖ）のベンゾイルアルコール、ｍ−クレゾール、メチル−、プロピル−、ブチルパラベン、パラベンゼンの組合せである。
【００３８】
強壮剤は薬剤に加えられるものであり、糖アルコールか砂糖を含んでいる。これらは、限定されるものではないが、例えば、ブドウ糖、マンニトール、グリセリン、ソルビトールかキシリトール、ガラクトース、アラビノースあるいはラクトースである。そして、ほぼ等浸透圧になるのに必要な濃度で加えられ、それは、約１０〜１００ｍｇ／ｍｌである。本発明は、等浸透圧を得るために、ＮａＣｌまたはＫＣｌのような塩類を使用しない。
【００３９】
本発明の別の実施例は水性のヒト成長ホルモン剤であり、ヒト成長ホルモン、バッファ、強壮剤、有効量のポリエチレングリコール、キレート剤、および追加的に殺菌のための抗菌性剤をふくむものです。キレート化剤はさらにヒト成長ホルモンの潜在的な劣化を抑制するために加えられる。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のようなキレート化剤は０．０１−０．１％の濃度である。下に示されるように、従来技術で既知の他のキレート化剤も使用できる。
【００４０】
追加の剤は、薬剤に加えられる。そして、それらは、例えばキレート化剤を含んでもよく、好ましくは、ナトリウムＥＤＴＡ、カルシウム二ナトリウムＥＤＴＡ、二ナトリウムＥＤＴＡ、アスパラギン酸か、クエン酸、およびシステイン、メチオニンおよびその他同種のもののようなアンチ酸化体である。
【００４１】
実験例
Ａ． 検定方法
Ａ２８０濃度：
処理におけるｈＧＨの濃度は、薬剤製造、あるいは薬剤となっていないサンプルのｈＧＨ濃度は、１ｃｍのセルで、遠心分離された試料の２８０ｎｍを読み０．７６ｃｍ（Ｅ１ｃｍ １ｍｇ／ｍｌ，２８０ｎｍ＝０．７６）の消滅係数を使用することにより決定された。典型的なブランクの溶液は１０ｍＭリン酸ナトリウム塩、ｐＨ７．４であった。
【００４２】
ＳＥＣの濃度：
薬剤となった試料においてｈＧＨの濃度は、１−２ｍｇ／ｍＬの範囲においてピーク面積対濃度のランニング標準プロットによって決定した。ピーク面積は、室温で、０．９ｍＬ／分の流れでＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ ＨＲ１０／３０カラムでのｈＧＨ基準をランニングすることにより決定され、２８０ｎｍでモニターすることにより溶出を見た。溶出する溶剤は５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、であり、ｐＨ７．３であった。サンプルロードは全量２００μｇで、容量２００μｌのタンパク質であった。
【００４３】
ＳＥＣの純度：
薬剤となった試料において、二量体または集合体の割合は、ＳＥＣの濃度で記述されたようなクロマトグラフィーを行なうことにより決定された。二量体または集合体の割合は、ピーク面積の合計で、それぞれのピーク面積を割ることにより決定された。
【００４４】
ＡＥＸ： 薬剤においてアミド分解されたｈＧＨの割合は全量２００μｇ（容量１００μｌ）のタンパク質のロードランニングにより決定され、Ｍｏｎｏ−Ｑ ＨＲ５／５陰イオン交換カラムで、流速は１．５ｍＬ／分であり、室温で行われた。溶出する溶剤は次のとおりであった：バッファＡ＝２０ ｍＭトリス、ｐＨ ８．０およびバッファＢ＝２０ｍＭトリス、３００ＮａＣｌ ｐＨ８．０。アミド分解されたものは、１５ｍＭ ＮａＣｌ／ｍｉｎｕｔｅ勾配の使用により、本来のｈＧＨから分けられた、すなわち、０から６０％のＢで１２分間である。２８０ｎｍで溶離剤が認識された。賦形剤に含まれる薬剤のために、例えば、２８０で吸収があるフェノールのために、カラムは２０ｍＭトリスで洗浄され、ｐＨ ８．０／３０％メタノールで洗浄し、賦形剤を除いた。
【００４５】
ＲｐＨＰＬＣ： ｈＧＨの割合は混入物に関係する。
薬剤の中のアミド分解、酸化は、４０μｇのタンパク質（体積２０μｌ）のランニングにより決定された。ランニングは、ジュピターＣ４ハイｐＨ ＲＰカラム（５μ ３００Å、４．６ｘ２５０ｍｍ）で、温度４５℃流速０．５ ｍＬ／分で行った。溶離剤Ａは、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５であり、溶離剤Ｂは５０％１−プロパーノール／５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、そして、試料はイソクラクティック方法で溶出され、ここで溶出する混合物は溶離剤Ａにおける５４％の溶離剤Ｂである。溶出は２２０ｎｍで見られている。
混入物の割合は次の方程式から決定される：
％混入物＝（トータルピーク面積−本来のピーク面積）／トータルピーク面積×１００）
【００４６】
ＬＣ／ＭＳ： トランケーションの割合を評価した。全てのタンパク質をＭｉｃｈｒｏｍ ＰＬＲＰ−Ｓカラムで、１００−２００ｐｍｏｌロードした。流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎで、温度は３５℃であった。
カラム溶離剤はエレクトロスプレーイオン化プローブに向けられ、マススペクトルから、分子の種類と分子の質量が決定される。割合トランケーションは次の方程式から決定される：
％トランケーション＝（トランケーション）／トータルのｈＧＨ種のピーク面積×１００
【００４７】
抗菌性試験：
発表されたガイドラインに沿って、簡略にした抗菌性試験を行った。アメリカ薬局ＵＳＰで、長期的な安定性実験が行われた。試験された有機体は大腸菌のみであった。
【００４８】
製剤処理
ｈＧＨの物理的な安定性に関係する研究のために、溶液はｈＧＨあるいはバルク液体ｈＧＨのいずれかから調製された。ｈＧＨは再構成され、バッファが１ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に交換されたものであり、バルク液体ｈＧＨは薬剤処理に必要な適当な濃度に調整されたものである。この溶液の濃度はＡ２８０で読み取ることにより決定された。
【００４９】
ｈＧＨの長期安定性（物理的・化学的安定性が調査された）に関係する研究のために、薬剤は、ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧのいずれかの存在下で、ｐＨ６．０のバルクｈＧＨ溶液を濃縮され、示されたように賦形剤を加えて、調整された。処理された保存溶液は殺菌ろ過され、１ ｍＬがグラス・バイアルに分配され、密封された。
【００５０】
一般に、
主題発明の薬剤は、安定種が処理により減少しない程度で、そして有効で安全な薬学的管理にふさわしい量において、他の成分を含んでもよい。例えば、技術に熟練している人々によく知られている他の薬学的に許容される賦形剤が、主成分の一部を構成してもよい。これらとしては、例えば、様々な充填剤、追加バッファ剤、キレート化剤、酸化防止剤、共同溶剤およびその他同種のものを含むものである。
【実施例１】
【００５１】
物理的な安定性
撹拌による凝集からタンパク質を保護する賦形剤は、一般的に、そのようなタンパク質剤の長期貯蔵による凝集を防ぐこと、水性タンパク質薬を開発する技術で一般に知られている。ｈＧＨの撹拌による凝集に対するＰＥＧの影響の測定するために、ｈＧＨは再構成され、バッファは１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に交換された。最終的な濃度が２．０、５．０、１０．０および２０ｍｇ／ｍＬとなるように、最終のｈＧＨ濃度が全量１．５ｍｌにおいて０．５ｍｇ／ｍＬとなるように、ＰＥＧ−３４００を加えて、溶液が用意された。ネガティブ対照溶液（ＰＥＧまたはポロクサマー１８８を含んでいないもの）および、ポジティブ対照液（１ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８を含んでいるもの）は、参照として試料セットに含めたものである。各溶液の三つの試料は、５分間グラス試験管の中で活発に渦動され、そして、その後、３０分間室温で保温された。試料からｈＧＨの集合体を取り除くために、遠心分離された。次に、遠心分離の後、三つの試料のｈＧＨ減量のパーセントをＡ２８０で吸光度を読むことにより測定した。
【００５２】
表１は、渦動調査 ＰＥＧ−３４００の１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、および様々な濃度の中で０．５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨを使用したものである。
【表１】
試料
Ａ２８０（３のａｖｇ）による％ｈＧＨ減量
ネガティブ参照液（ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧ）
ポジティブ参照液（１ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８）
【００５３】
表１に要約された結果は、ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧのない水性ｈＧＨ試料は、ｈＧＨの３６％の損失であったことを示す。対照的に、ポロクサマー１８８がある状態では、ｈＧＨの３％の損失だけだった。したがって、ポロクサマー１８８は、ｈＧＨの凝集を１２倍減少させる。
ＰＥＧを含む溶液の攪拌は、ｈＧＨの損失において、０〜２倍の減少となった。すなわち、３４％から１６％となった。上記の結果から、ＰＥＧが撹拌による凝集に対するｈＧＨに最小限の保護（ポロクサマー１８８の６倍はより少ない保護）を示すと思われる。ＰＥＧは、ｈＧＨの液体製剤に長期的な安定性をもたらさない。従来技術において記載したように、従来の研究は、ＰＥＧがあるタンパク質を不安定にすることを明示していた。上記の結果から、ＰＥＧがポロクサマーと比較して、ｈＧＨに、より少ない安定化を与えるように見える。
【００５４】
さらなる撹拌による凝集実験は、様々な分子量（ＭＷ）サイズのＰＥＧ分子で行なわれた。凍結乾燥されたｈＧＨは、１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０か、１０．０あるいは２０ｍｇ／ｍＬと異なるＭＷのＰＥＧのバッファに交換された。ＭＷは、４００，６００、１０００、１４５０、３４００、６０００、８０００、１２０００あるいは２００００であり、ｈＧＨの最終濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ、全量１．２５ｍｌであった。ネガティブ対照液およびポジティブ対照液は参照として試料セットに含まれるものである。ここで、負の対照液はＰＥＧまたはポロクサマー１８８を含まないものであり、ポジティブ対照液は２ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８を含んだものである。前述したように、溶液は、５分間グラス試験管の中で活発に渦動され、次に、３０分間室温で保温された。そして、試料のｈＧＨ損失のパーセントは、遠心分離とＡ２８０により、測定された。
【００５５】
【表２】
【００５６】
表２の渦動調査は０．５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨを使用しており、１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、と、ＭＷの異なる１０、２０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧである。
【００５７】
テーブル２の中で、示された結果は、ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧのない試料において、ｈＧＨの５８％が失われることを示した。ポロクサマー１８８の存在はｈＧＨの損失を７％にとどめている。低分子量ＰＥＧ（ＰＥＧ−４００あるいはＰＥＧ−６００）の添加は、ｈＧＨの損失が３４％となった。ＰＥＧの保護効果は、ＰＥＧ−３４００より大きい分子において、損失が約１６％と安定状態であるように思われる。１０ｍｇ／ｍＬあるいは２０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度用においても、保護効果に違いが見られない。しかしながら、テーブル１の中で示された前述の結果が示されたように、ＰＥＧは、撹拌による凝集に対してポロクサマーとおなじレベルの保護を示さない。ポロクサマー １８８は凝集において、８倍効果を示し、ＰＥＧは３倍の効果を示すだけである。
【００５８】
撹拌による凝集実験の結果は、ＰＥＧは長期安定性にｈＧＨに最小限の保護を与えると
要約できる。特に、ＰＥＧは、ポロクサマー１８８と比較して、３〜６倍少ない凝集に対する保護を与えることを示している。
【００５９】
前の実験の結果にもかかわらず、薬剤は、５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、３．２ｍｇ／ｍＬのフェノール、７．５ｍｇ／ｍＬのＮａＣＬ、１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ３４００および１０ｍＭのリン酸ナトリウムであって、ｐＨ６に調製されている。しかしながら、ＰＥＧが共存するそのような製剤においても、沈殿は生じる（データは示していない）。
【００６０】
しかしながら、驚くべき、予期しない結果が発見された。それは、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でｈＧＨを含んでいる薬剤において、そして、バッファおよび砂糖または糖アルコールの強壮剤がある状態において、ＰＥＧ剤は撹拌による凝集より、ｈＧＨを保護し、幾つかのケースにおいては、ポロクサマー１８８薬剤よりも良かった。典型的な例を下に示す。薬剤は、３つの調整され、それらは、１ｍＬの最終ボリュームにおいて、５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、ブドウ糖（強壮剤）、および３．２ｍｇ／ｍｌのフェノール（撹拌からの保護のために必要とされるものではなく抗生物質である）を含むものである。以上にしめした薬剤は、５分間グラス試験管の中で活発に渦動され、次に、３０分間室温で保温された。その後、遠心分離に続いき、試料におけるｈＧＨ損失パーセントをＳＥＣ濃度検定によって測定した。二量体および集合の構造の割合の増加もＳＥＣ純度検定で測定した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
表３は、渦動調査であり、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ−３４００あるいはＰＥＧ−８０００（あるいは２ｍｇ／ｍｌのポロクサマー１８８）、４３ｍｇ／ｍｌのブドウ糖および３．２ｍｇ／ｍｌのフェノールの中で５ｍｇ／ｍｌのｈＧＨを使用した。
【００６３】
ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧのないネガティブ参照剤は、７．３％のｈＧＨ、二量体および集合体の著しい増加を示した。すなわち、それぞれ３０％および１６％である。ポロクサマー１８８を含む薬剤は、ネガティブ参照剤とくらべ、１．３％のｈＧＨ、二量体および集合体の損失となった。驚いたことに、ＰＥＧを含んでいる薬剤については、ｈＧＨに損失は本質的になかった。ＰＥＧ−３４００製剤は、ポロクサマー１８８製剤で観察されたのよりも少ない二量体および集合体となった。さらに驚くことには、ＰＥＧ−８０００製剤には、二量体の構造見られず、集合体量が明らかに減少した。集合体の明らかな減少は、開始溶液中のｈＧＨ集合体の溶解によると思われる。これらの結果は、バッファと強壮剤の存在において、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のＰＥＧを加えたｈＧＨ剤は安定であり、また恐らくポロクサマー１８８薬剤より撹拌による凝集に対して安定であることを実証するものである。
【実施例２】
【００６４】
長期安定性（化学的・物理的な安定性の検査を含む）
ｈＧＨの長期安定性をＰＥＧまたはポロクサマー１８８を含んでいる薬剤と比較した。ＰＥＧ製剤は次のものを含んでいた：５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、１０のｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、４７ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−３４００および３．２ｍｇ／ｍＬのフェノール。対照剤（ポロクサマー１８８製剤）は次のものを含んでいた：５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、１０のｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、７．５ｍｇ／ｍＬのＮａＣＬ、２ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８と３．２ｍｇ／ｍＬフェノール。薬剤は、８℃か２℃の推奨される一方の貯蔵温度で、あるいは２５℃の高い貯蔵温度で、保温された。試料は様々な時間ポイントで移され、ｈＧＨは上記のような物理的・化学的の安定性が分析された。ＳＥＣによって、同様に、ＲＰ−ＨＰＬＣとＡＥＸ（化学の劣化を見るため）を用い、ｈＧＨの損失、二量体と集合体の増加割合を求めた。
【００６５】
【表４】
【００６６】
表４は、ポロクサマー１８８対ＰＥＧ製剤に関する安定性調査に関する。
ＰＥＧ製剤：５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、３．２ｍｇ／ｍｌのフェノール、４７ｍｇ／ｍＬのマンニトール、１．０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−３４００、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０。
ポロクサマー１８８製剤：５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、３．２ｍｇ／ｍＬのフェノール、７．５ｍｇ／ｍＬのＮＡＣｌ、２ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ ６．０
インキュベーション：２−８℃
【００６７】
上記のテーブルにおいて得られた結果から、我々は、長期貯蔵によるｈＧＨ凝集の率がＰＥＧとポロクサマー１８８とがｈＧＨ剤において匹敵するであろうと予想した。驚くことに、貯蔵安定性試験は、ポロクサマー１８８製剤と比較して、ＰＥＧ製剤においてｈＧＨ剤の化学劣化率の減少を示した。予想通りに、８℃に２で格納された試料で１か月の間に観察された変化は小さかった。変化が小さいので、検出のより低いレベルでは検定が不正確になる。予想通りに、物理的・化学的劣化は、２５℃で格納された試料において、加速された。ｈＧＨの物理的な劣化に関して、貯蔵の１か月後に、ポロクサマー１８８製剤と比較して、３３％少ないｈＧＨ二量体および集合体がＰＥＧ製剤で検知された。同様に、ポロクサマー１８８薬剤と比較して、３３％低いレベルの化学的に劣化したｈＧＨ（アミド分解されたｈＧＨおよびＲＰ混入物）は、ＰＥＧ製剤で検知された。上記の結果は、製剤に、ＰＥＧ、バッファ、強壮剤および１ｍｇ／ｍｌ以上のｈＧＨ濃度を有することにより、長期的な貯蔵における物理的・化学的な劣化からｈＧＨを保護することを実証することとなった。推奨された貯蔵条件で安定性を示すことから、１２−２４か月の間２〜８℃でインキュベーションが必要となる。このように、高温で行われた、加速された安定性調査は、通常の貯蔵条件の製品の安定性を示すのに用いることができる（Ｃｈａｎｇ Ｂ． Ｓ． ａｎｄ Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ Ｓ， Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００２； １３： １−２５）。
【００６８】
１か月のデータからの液体製剤の長期安定性の予見
ｈＧＨ分子の化学・物理的な劣化に関して、ＰＥＧ製剤によるｈＧＨ剤の長期安定性は、２５℃で加速された安定性調査から予見された。予測の正確さを増加させるために、ポロクサマー１８８入りのｈＧＨ剤に関する２４か月の安定性調査からのデータは、参照として使用した（「２４か月の調査」）。そのような２４か月の安定性調査は次の製剤に基づく：５．０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、１０のｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２．０ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８と２．５ｍｇ／ｍＬフェノール、安定性データは５℃と２５℃で集められた。この安定性調査から得られた情報は活性化エネルギー（Ｅａ）を計算するために使用された。
【００６９】
アミド分解のレベルに関しての、上記のＰＥＧ製剤入りのｈＧＨ剤と、ポロクサマー１８８製剤入りとを、比較するために、速度定数は、アレニウス式を使用して、５℃に続いて、２５℃で速度定数が各剤について測定された。続いて、その後、５℃の速度定数のデータは、６、１２、１８および２４か月について、ｈＧＨのアミド分解形態の割合を測定するために使用された。次の表は、得られた情報を要約したものである。
【００７０】
【表５】
【００７１】
表５は、ｈＧＨのアミド分解形態の予見された割合に関する。
（１）２４か月のデータから決定されたもの。
（２）２４か月の実際のアミド分解のパーセント。
（３）アレニウス式を使用して計算されたもの。
（４）１か月のデータから計算したもの。
（５）アレニウス式から予見したもの。
（６）推定
【００７２】
１か月のデータから測定された２５℃のＰＥＧおよびポロクサマー１８８の各々の速度定数と、
２４か月の２５°Ｃにおける調査データはおなじオーダー上にある、これは、２４か月の５℃での調査で測定された速度定数は、ＰＥＧおよびポロクサマー１８８薬剤における６、１２、１８および２４か月の時間ポイントでのアミド分解の割合に妥当は予測を与えることを示唆する。表から、ＰＥＧ製剤は、ポロクサマー１８８製剤よりも、アミド分解からのよりよく保護することが、見出せる。
【００７３】
ＰＥＧ製剤を、凝集のレベルに関しての参照ポロクサマー１８８製剤と比較すると、速度定数は、アレニウス式を使用して、５℃での速度定数に続いて２５℃で各製剤について測定され（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ、１９９８ の中で述べられた原理に基づいた）。続いて、５℃の率データは２４か月後のｈＧＨの凝集の割合を決定するために使用された。次のテーブルは、得られた情報を要約したものである。
【００７４】
【表６】
【００７５】
表６は、２４か月のｈＧＨの凝集の予見された割合に関する。
（１）２４か月のデータから決定されたもの。
（２）２４か月の実際のアミド分解のパーセント。
（３）アレニウス式を使用して計算されたもの。
（４）１か月のデータから計算したもの。
（５）アレニウス式から予見したもの。
（６）推定
【００７６】
２５℃のＰＥＧおよびポロクサマー１８８薬剤の各々の速度定数は、１か月測定されたデータは補助的なポロクサマー１８８の２５℃のデータと同じオーダー上にあり、このことは、５℃で測定された速度定数は、ＰＥＧおよびポロクサマー１８８薬剤の２４か月の時間でのアミド分解割合の妥当な予見を与えるということが考えられる。ＰＥＧ製剤は、ポロクサマー１８８製剤と同じオーダーで、ｈＧＨの凝集を防ぎ、ポロクサマー製剤に匹敵する。
【００７７】
保温された試料において見られた物理的・化学的な劣化率に基づいて、少なくとも６ヶ月から１８ヶ月におけるＰＥＧ製剤入りのｈＧＨ剤の長期貯蔵安定性を示すために、推定がなされた。凝集率およびアミド分解率の推定は、ＰＥＧ製剤入りのｈＧＨは３−４％未満の凝集を示し、１５％未満アミド分解を示す。このような割合は妥当であり、必要に応じて人間の患者に投与されるｈＧＨ薬剤を得ることができる。
【実施例３】
【００７８】
保存効果
ポロクサマー１８８配合物のＰＥＧの抗菌効果を試験するために、ＵＳＰの短縮手法を用いた。すなわち、試験は大腸菌のみで行った。簡潔に、無菌条件で各配合物の６つのバイアルを組み合わせ、１つの６ｍＬの部分標本とした。それから細菌の検定された接種剤を、最終濃度を１×１０５から１×１０６ｃｆｕ／ｍＬとして製剤に加え、７日、１４日および１ヶ月の期間にわたって３７℃に保温した。それぞれの期間の後で、試料を採取しｃｆｕ数を決定する。カテゴリー１Ａの製品に要求される殺菌は７日で１ｌｏｇ以上の減少、１４日で３ｌｏｇ以上の減少、１４日から２８日では増加が見られないことである。そのため、配合物の抗微生物効果が達成され、ＰＥＧ製剤の大腸菌殺菌はポロクサマー製剤と同等となる。
【００７９】
【表７】
【００８０】
表７はＰＥＧとポロクサマー１８８配合物の抗菌効果に関する。
【実施例４】
【００８１】
キレート剤
発明者は、水性ヒト生長ホルモン剤へのキレート剤の添加が、ヒト生長ホルモンの劣化をさらに抑制するということをも発見した。前記の濃度でｈＧＨ、マンニトール、ＰＥＧ−３４００、リン酸ナトリウムおよびフェノールを含有する配合物を様々な濃度のＥＤＴＡと混合した。安定性促進の研究において、製剤を３７℃で保温した。２週間、１ヶ月および２ヶ月の時点で、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ）を含む様々な方法で試料を分析し、劣化／欠損ｈＧＨ剤のパーセント増加を計量した。表８に詳述されるように、分析を行った全ての時点において、ＥＤＴＡ濃度の増加によってｈＧＨ劣化の割合が低下している。
【００８２】
【表８】
【００８３】
表８は、ｈＧＨ安定性表示指標におけるＥＤＴＡの効果に関する。
【００８４】
上記の表５および６に要約される２５℃で加速された安定性の研究とは異なり、この実施例６で述べる３７℃での保温は、２から８℃での保管の安定性に関係が少ない。３７℃での保温は２５℃での保温よりもはるかに苛酷であり、単にキレート剤がｈＧＨの劣化を抑制するかの試験に過ぎない。
【００８５】
本発明の別実施例におけるＥＤＴＡによるｈＧＨ剤の調製において、凝集を避けるために薬剤の最終ｐＨへの注意が必要となる。ＥＤＴＡの添加によって薬剤のｐＨは低下する。本発明のＥＤＴＡによるｈＧＨ剤では、ｐＨ６．０以下のｐＨレベルにおいて凝集される。このような凝集を抑制するために、ｈＧＨの配合に用いるリン酸ＮａのｐＨを６．７まで上昇させ、これによって最終ｈＧＨ剤をｐＨ約６．４とする。本発明の実施例の一例は、
１ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、
強壮剤、
５ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ、
ｐＨを約６．４とするバッファン系、
０．１ｍｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍｌのキレート剤、および
随意の抗微生物剤、
からなるｐＨ約６．４の水性ｈＧＨ配合物である。
【００８６】
より具体的には、
５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、
約５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、
１５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−３４００、
１０ｍＭのリン酸Ｎａ、
１．９ｍＭのＥＤＴＡ、および
随意の２ｍｇ／ｍｌから６ｍｇ／ｍＬのフェノール、
からなるｐＨ約６．４の水性ｈＧＨ配合物である。
【００８７】
本発明の好ましい実施例を上に述べたが、これは様々な改良が可能であり、付録した請求項は本発明の精神及び範囲内に含まれる全ての改良の包含を意図するものであることは理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含む薬剤あるいは化合物、およびそのような薬剤の調整および使用方法に関する。より詳しくは、水性剤状態での長期貯蔵の安定性を強化した薬剤に関係する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモンは、やけどや、傷治療、ジストロフィー、骨の接合、拡散した胃出血および偽関節症、そのほかの症状に有効であるとされてきた。そして、下垂体機能低下の小人症の治療に使用されているホルモンである（例えば特許文献１）。ｈＧＨの主な生物学的効果は成長を促進することである。
【０００３】
作用する器官は骨格、結合組織、筋肉、肝臓、腸および腎臓のような内臓である。成長ホルモンは細胞膜の特定受容器の相互作用によってその作用を及ぼす。組み換えＤＮＡ技術の進歩により、ヒト成長ホルモンをバクテリアなどの供給源より生産することができるようになった。
【０００４】
組み換えタンパク質は、優先的にタンパク質の分解を防ぐ構造に組み合わせられる。タンパク質破壊には、化学的、物理学的な、２つの基本的な原因がある。化学的の破壊は、タンパク質への修飾に関係し、アミド分解、酸化あるいは二硫化物交換のような反応が含まれる。物理的な破壊は、タンパク質の全面的な構造の変化に関係し、変性（すなわち、三次構造のアンフォールディング）などである。
【０００５】
タンパク質は水中で破壊されやすく、ヒト成長ホルモン剤は崩壊率を遅くするために開発されてきた（例えば、特許文献２の背景技術）。しかしながら、それらは再合成における失敗に影響を受け、投薬の精度が下がり、臨床的な使用が難しく、これにより、患者の承諾が少なくいものである。
【０００６】
液体のｈＧＨ剤は、上記の制限を解決するとされている。しかしながら、液剤状態でのｈＧＨの長期貯蔵は、ｈＧＨの界面部の相互作用による物理的な崩壊を起こしやすい。この境界部は、空気／水やガラス／水のようなものであり、ｈＧＨタンパク質の変性を起こしやすいものである。変性において、疎水性の表面は露出され、相互作用および新たなタンパク質のアンフォールディングを促進する可能性がある。これは、タンパク質集合体の生成原因になるものであり、集合体は表面から脱着されて、沈殿をするだろう。これらの相互作用が、ｈＧＨ剤の長期的な貯蔵中に、凝集や、ゆっくりした取り扱いの間に起こりうる。
【０００７】
特許文献２に記述されるように、非イオン界面活性剤はタンパク質の凝集損失を防ぐためにｈＧＨ剤に加えることができ、長期的な貯蔵の間に安定した液体の薬剤を得るものである。一般的に、非イオンの界面活性剤で、凝集を防ぎ、液体蛋白剤を安定化させるメカニズムが２つある。それは、界面活性剤のたんぱく質への吸着と、界面活性剤のタンパク質に匹敵する界面への吸着である。第１のメカニズムによってタンパク質を安定させる非イオンの界面活性剤の１例は、トゥイーンであり、これは自然のｈＧＨ分子の表面あるいはｈＧＨのフォールディング中間体に結合できるものである。いずれの場合も、界面活性剤の結合はタンパク質化学量論に対する特定界面活性剤により、薬剤に要求される界面活性剤の濃度はタンパク質濃度による。第２のメカニズムによってタンパク質を安定させる非イオンの界面活性剤は、タンパク質界面活性剤化学量論に依存しない。しかし、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より上の濃度で凝集を防ぐものである。このような非イオンの界面活性剤は、空気／液体の界面へ吸着し、タンパク質と界面への吸着を競うものである。これが、タンパク質吸着によるタンパク質の変性を防ぐ。
【０００８】
ＰＥＧは、特許文献２で定義されている非イオンの界面活性剤ではない。「ポリソルベート２０、８０などのポリソルベート、およびポリオキシマー１８４、１８８、プルロニック（登録商標）や、多価アルコールやその他のポリマーなどのポリオキシマーを含んでいる。安定した水性剤を提供するのに有効な量が使用される。」
特許文献２の記述する界面活性剤は、水可溶性の前部と疎水性の後部を備えた両親媒性の分子、あるいは疎水性・親水性のサブユニットから構成された重合体である。このモデルに適合する界面活性剤の典型的な例はトゥイーンであり、これにおいて、ＰＥＧは親水性の前部を成形し、Ｃ１１、Ｃ１７のアルキル基の鎖は疎水性の後部を形成している。ＰＥＧは、水可溶の前部および疎水性の後部を持たないという点で両親媒性の分子ではない。
ＰＥＧはポロクサマーではなく、その両方の端末の水酸基にポリオキシエチル化されるＰＰＧ（ポリプロピレングリコール）のコアから成り、対称的なブロック共重合体を示す。一般的には、（ＰＥＧ）ｘ−（ＰＰＧ）ｙ―（ＰＥＧ）ｘに一致するものである。
【０００９】
ＰＥＧはエチレンオキシド単量体のホモポリマーであり、したがってＰＥＧは疎水性・親水性のサブユニットから構成された重合体ではない。さらに、ＰＥＧは、多価アルコール（非還元砂糖、糖アルコール、砂糖酸、ラクトース、ペンタエリトリトール、水溶性のｄｅｘｔｒａｎｓおよびＦｉｃｏｌｌとして典型的に定義されるもの）ではない。したがって、ＰＥＧは、非イオンの界面活性剤として前述の特許において、記述もしくは、考慮されたものではない。
【００１０】
［ＰＥＧは非イオンの界面活性剤として機能しない］
従来の研究は、界面活性剤トゥイーンＮＢ等と同じモル比率で使用された時、ＰＥＧが攪拌による凝集の防止をしないことを実証した（非特許文献１など）。すなわち、非イオンの界面活性剤トゥイーンがタンパク質を保護するのと同じ方法において、ＰＥＧはタンパク質と結合することにより、凝集からＰＥＧがタンパク質を保護していない。
【００１１】
ＰＥＧは水の表面張力を低下させると知られているが、特許に定義されたほどの界面活性剤と考えられていない。タンパク質のような多くの剤が、水の表面張力を低下させるが、界面活性剤と考えられていない。ＰＥＧは、可溶化剤（すなわち、可溶特性の低い物質の可溶性を増加させる剤）に分類されている。また、薬学の補型剤のハンドブックは、ＰＥＧの機能的なカテゴリーは軟膏ベースであり、可塑剤、溶剤、坐薬基剤およびタブレットおよびカプセル潤滑剤としている（非特許文献２）。
【００１２】
優先的排除は、タンパク質溶液および共同溶剤（すなわち、溶液の重要な部分を含むすべての成分）が進んで相互作用しない現象であり、共同溶剤がタンパク質の表面から優先的に除外される。結果、タンパク質のまわりに水和による球体ができる。ＰＥＧは優先的な排除の共同溶剤として知られているが、ＰＥＧとタンパク質の相互作用は、タンパク質表面の化学の性質に依存する。したがって、所定のタンパク質に対するＰＥＧの影響を予言するのは難しい。いくつかのタンパク質について、ＰＥＧはタンパク質と相互に作用し、溶解温度を低下させる（非特許文献３）。タンパク質のＴｍを低下させることは「不安定化」効果であると思われる。例えば、４℃の１％のＰＥＧ−８０００水溶液での貯蔵では、ＬＤＨの活性の減少は、８日で１０％であった（非特許文献４）。ＰＥＧなしで、ＬＤＨの活性は、それ期間の間３０％減少した。予想としては、ＰＥＧは長期的な貯蔵の間にＬＤＨに単に最小の保護を与える。比べて、特許文献２は、非イオンの界面活性剤の存在が１８か月の貯蔵の後にｈＧＨの凝集が１％より少ないことを示している。
【００１３】
主に、優先的排除メカニズムにより、ＰＥＧはタンパク質の有力な沈降反応剤として有名であり、その強く急速な特性のために放射線結晶学の分野の中で広範囲に使用されている。タンパク質の溶解度は９５％まで減少することができ、５から３５％の濃度のＰＥＧ４０００の存在により、さらに減少する（非特許文献５）。従って、タンパク質溶液において共同溶解力のある優先の排除としてのＰＥＧの使用は、典型的にタンパク質沈降反応に関係している。
【００１４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む成長ホルモン（ＧＨ）剤は従来知られている。しかし、ＰＥＧを含むＧＨ剤は、すべて、射出の後にゲルを成形し、ＧＨのゆっくりした放出となるような高濃度のＰＥＧを示している。例えば、特許文献３は、皮下あるいは筋肉注射に適した、成分放出を抑制し、長く作用するＧＨを含み、その約８０％がポリエチレングリコール４００（その濃度において、ｈＧＨは沈殿している）であるＧＨ剤を示している。
【００１５】
特許文献４は、放出持続性のＧＨ剤を示しており、それは、グリセリル基のトリアセテートあるいはトリアセチンに溶かされたＰＥＧ３００からＰＥＧ６００のような非水性のポリエチレングリコール成分を含んだものである。
【００１６】
そのような持続性の放出剤は典型的に粘着性であり、注射用の大きな径の針を必要とする。人間用のｈＧＨ剤は、患者への不快を最小限にするために、理想的には小さな針で行われるべきである。牛や豚の成長率を増加させるための持続性の放出剤は、典型的に、獣医用もしくは農業用として使用されが、人間での使用はより調整管理が必要となる。
【００１７】
特許文献５において、ＰＥＧは、またＧＨの腸管外の持続した放出用ペレットかタブレット剤のための結合剤として使用される。ここにおいて、ＰＥＧがＧＨを安定させることは示されていない。実際に、特許文献５は、安定剤が、砂糖、アミノ酸、アミノ酸の重合体およびコリン塩類のような、とても極性大きい分子であると示している。
【特許文献１】米国特許第４，３４２，８３２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７６３，３９４号明細書
【特許文献３】米国特許第４，０４１，１５５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０１１，０１１号明細書
【特許文献５】米国特許第４，９１７，６８５号明細書
【非特許文献１】Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ． １９９８ Ｄｅｃ； ８７ （１２）： １５５４−９
【非特許文献２】Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９４， ｐ． ３５５
【非特許文献３】Ｌｅｅ， ＬＬ−Ｙ ａｎｄ Ｌｅｅ， ＪＣ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８７ （２６）： ７８１３−９
【非特許文献４】Ｍｉ， Ｙ， ｅｔ ａｌ， ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２００２ Ｍａｙ−Ｊｕｎ ； ５６ （３）： １１５−２３
【非特許文献５】Ａｔｈａ Ｄ． Ｈ． ａｎｄ Ｉｎｇｈａｍ Ｋ． Ｃ． ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９８１ Ｄｅｃ １０ ； ２５６ （２３） ： １２１０８−１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
物理的・化学的劣化程度において、トゥイーンまたはＰｏｌｅａｘｅｓで安定した水性のｈＧＨ剤に相当するものであるＰＥＧによって、安定した水性のｈＧＨ薬剤を提供することが本発明の目的である。
【００１９】
本発明の目的は、長期の貯蔵において安定であり、特許文献２に示された非イオン界面活性剤を含まない、水性のｈＧＨ剤を提供するものである。そして、液体のｈＧＨ剤を提供することが本発明のさらなる目的であり、ｈＧＨは共同溶剤の優先的排除によって安定化するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の１つの様相は水性ヒト成長ホルモン剤であり、これは、ヒト成長ホルモン、バッファ、強壮剤、また有効な量のポリエチレングリコール、さらに、追加的に殺菌された液体で用いることができる抗菌性剤を含む。
【００２１】
発明の更なるの様相は、ヒト成長ホルモンとポリエチレングリコールを５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの範囲の中で混合して含む水性剤で、貯蔵中におけるヒト成長ホルモンの物理的・化学的の劣化を抑制する方法である。
【００２２】
発明の第一の局面によれば、
ａ）１〜２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｂ）ｐＨ５．５からｐＨ７とするバッファ系と、
ｃ）強壮剤と、
ｄ）有効な量のポリエチレングリコールと、
を無菌の薬学的に許容される液体の中に有するヒト成長ホルモン剤を提供するものである。
【００２３】
発明の第二の局面によれば、ヒト成長ホルモンの使用方法であって、
Ａ）ヒト成長ホルモンを水性剤に調整するステップであって、
ａ）該水性剤が１から２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｂ）ｐＨ５．５から７とするバッファ系と、
ｃ）５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
ｄ）強壮剤と、
を薬学的に許容され、注射可能な無菌の水性のビークル内に、含むものと、
Ｂ）前述の製剤を水性液として６から１８ヶ月貯蔵して、水性の液体として貯蔵された薬剤を構成するステップと、
Ｃ）ヒト成長ホルモン治療を必要とする患者に前述の貯蔵された製剤を直接注入するステップと、を有するヒト成長ホルモンの使用方法を提供するものである。
【００２４】
発明の第三の局面によれば、ヒト成長ホルモンの使用方法であって、
Ａ）ヒト成長ホルモンを水性剤に調整するステップであって、
該水性剤が
ａ）１から２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｂ）ｐＨ５．５から７とするバッファー・システムと、
ｃ）５から５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
ｄ）２０から１００ｍｇ／ｍｌの強壮剤と、
ｅ）抗菌剤と、
を薬学的に許容され、注射可能な殺菌した水性のビークル内に、含むものと、
Ｂ）前述の製剤を水性液として、２℃から８℃において６から１８ヶ月間貯蔵して、
水性液体として貯蔵された薬剤を構成するステップと、
Ｃ）ヒト成長ホルモン治療を必要とする患者に前述の貯蔵された剤を直接注入するステップと、を有するヒト成長ホルモンの使用方法を提供する。
【００２５】
本発明の第四の局面によれば、ヒト成長ホルモンの貯蔵安定性のある水性剤を作る方法であって、
薬学的に許容されたビークルが、
ａ）１から２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｂ）ｐＨ５．５から７に調整するバッファと、
ｃ）５から５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
ｄ）２０から１００ｍｇ／ｍｌの強壮剤と、
を含み、前記水性で薬学的に許容されるビークルが、２℃から８℃で、６から１８ヶ月貯蔵可能であることを特徴とする作成方法を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
ＰＥＧによって、安定した水性のｈＧＨ薬剤を提供でき、長期の貯蔵において安定であり、水性のｈＧＨ剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
もし他の方法で定義されなかったならば、ここに使用される技術的・科学的な用語はすべて、発明が属する技術における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を持っている。本発明の実施または試験で記述されたものに類似もしくは同様のいかなる方法および材料も使用することができ、好ましい方法および材料は以下に記述される。この下に言及された発表はすべて、参照として組込まれる。
【００２８】
Ａ． 定義
用語「ヒト成長ホルモン」あるいは「ｈＧＨ」は、自然ソース抽出と精製を含む方法によって、および組み換えの細胞培養システムによって生産されたヒト成長ホルモンを示す。そのシーケンスと特性は、例えば、ＰｅａｒｌｍａｎおよびＢｅｗｌｙ（遺伝子操作による生物製造Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。１９９３； ５： １−５８）によって、述べられている。用語は同様に生物学上活発なヒト成長ホルモン等価物をカバーし、たとえば、全体のシーケンスにおいて、１以上のアミノ酸が異なるものである。更に、この適用において使用される用語は、ｈＧＨ、あるいはｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌな置き換え、削除および挿入アミノ酸変形をカバーするように意図されている。注釈の２種は、１９１のアミノ酸自生種（ｓｏｍａｔｒｏｐｉｎ）、およびＮ−端末のメチオニン（ｍｅｔ）種（ｓｏｍａｔｒｅｍ）が一般に組み換えで得られた１９２のアミノ酸である。
【００２９】
用語「長期安定」は、液体ｈＧＨ剤に関連して、液体ｈＧＨ剤が２℃から８℃で格納される場合、凝集が３から４％であり、ｈＧＨのアミド分解が１５％未満である剤のことである。１つの実施例では、液体ｈＧＨ剤は少なくとも２４か月の間、長期安定であり、また、別の具体例では、液体ｈＧＨ剤は６〜１８月の間、長期安定である。また、別の具体例では、そのような剤は少なくとも１２か月安定である。技術に熟練しているものにとって明白であるように、ｈＧＨの長期安定性は、上記の示された時間の間、薬剤を保温することにより、直接的に決定され、あるいは、長期安定はここに記述された方法によって予見されるものかもしれない。
【００３０】
用語「ＰＥＧ」あるいは「ポリエチレングリコール」は線状重合体であるＨ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨの通式を備えた賦形剤を示すために使用される。添字「ｎ」は、エチレンオキシド・ユニットの数を定義し、それはその分子量（ＭＷ）を決め、この実例の中に一定範囲のＭＷでありうる。ポリエチレングリコールは「分岐したポリエチレングリコール」例えば、３−分岐、４−分岐なども可能である。ＰＥＧは、前述された合成手段によって生産することができる
（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， ｉｎ Ｐｏｌｙ ［ｅｔｈｌｙｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ］ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９９７， ｐ． ８−９， ｎｅｗ ＰＥＧ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ）。
【００３１】
用語ｈＧＨの「薬学的に有効な量」は、投与摂生法における治療効力を提供する量に関係する。成分は、少なくとも０．１、上は約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨの量を含んで調製され、好ましくは、約１から１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１から約５ｍｇ／ｍｌまでである。下垂体機能低下の小人症に苦しむ患者への投与でのこれらの成分の使用では、例えば、これらの構成物は、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌまでｈＧＨを含んでおり、予定された治療の現在考えられている投薬摂生法に対応する。１つの実施例の中で、５つのｈＧＨ濃縮が選択されており、それらの濃度は、０．０３〜０．１０ｍｇのｈＧＨ／ｋｇ体重（ＢＷ）／日の投薬および４５ｋｇのＢＷに基づいた、０．２７ｍＬから０．９０ｍＬの注射量が可能なものである。技術に熟練している人々にとって明白であるように、患者に与えられたｈＧＨの用量は、その条件と投薬摂生法の医学的に容認された投薬量によって決定される。
【００３２】
一般的な方法
米国特許第５，０９６，８８５号明細書に記述されるようなｈＧＨ剤と異なり、本発明は、グリシンあるいは、典型的にｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔか凍結防止剤に使用される他のアミノ酸を必要としない。
【００３３】
本発明は、トゥイーンあるいは他の非イオン界面活性剤（すなわち、親水性の前部と疎水性の後部で構成されるもの）用の必要物がない。さらに、本発明は、ポロクサマー１８８あるいは他のエチレン／プロピレンブロック共同重合体のための必要物がない。
【００３４】
１つの具体例において長期安定したｈＧＨ剤にふさわしいｐＨ範囲は、５．５〜７であり、最も好ましくはｐＨ６．０である。ｐＨ７以上の液体ｈＧＨ剤は、アミド分解により増加したタンパク質劣化する。組み換えｈＧＨの等電点がｐＨ５．１に近いので、ｐＨ５．１の、あるいはその付近の液体のｈＧＨ剤は凝集によりｈＧＨの損失を起こす。等電点よりかなり少ないｐＨでは、液体のｈＧＨ剤は凝集の傾向が無い。別の具体例では、ｈＧＨ剤は４．５未満のｐＨであると思われ、より好ましくは、ｈＧＨ剤が４から４．５のｐＨ範囲であると思われる。
【００３５】
本発明の剤にふさわしいバッファは、薬学的に許容され、適切なｐＨ範囲において個々で定義される適切なｐＨ範囲において、バッファされたｐＨを提供するものである。
ｐＨ５．５〜７を得るために、適切なバッファが含められるが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、琥珀酸塩、グリシン塩、トリスあるいはヒスチジン・バッファーに制限されるものではない。濃度は、２〜５０ｍＭである。
【００３６】
有効な量のＰＥＧは、長期安定した液体ｈＧＨ剤とし、これにより、シヤーリングと表面張力がタンパク質の深刻な変性なしに明らかになる。好ましい実施例では、加えられるＰＥＧ分子のサイズは、１４５０−１００００ＭＷから４００−２００００ＭＷであり、より好ましくは３３５０−８０００ＭＷからである。ＰＥＧの濃度は、５ｍｇ／ｍＬから１００まで、好ましくは５ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬまで、さらにより好ましくは１０ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬになる。
有効な量に必要なＰＥＧの濃度は、ＰＥＧの分子量サイズに反比例する。特に、より大きな分子量のＰＥＧ分子はより低い濃度となる。
【００３７】
抗菌性剤は従来の製剤に含まれるものでよい。抗菌性剤は、含まれると、微生物の成長を妨害し、製剤が複数回使用できる製品となる。許容される抗菌性剤は０．２−０．６％（Ｗ／Ｖ）のフェノール、０．７−１％（Ｗ／Ｖ）のベンゾイルアルコール、ｍ−クレゾール、メチル−、プロピル−、ブチルパラベン、パラベンゼンの組合せである。
【００３８】
強壮剤は薬剤に加えられるものであり、糖アルコールか砂糖を含んでいる。これらは、限定されるものではないが、例えば、ブドウ糖、マンニトール、グリセリン、ソルビトールかキシリトール、ガラクトース、アラビノースあるいはラクトースである。そして、ほぼ等浸透圧になるのに必要な濃度で加えられ、それは、約１０〜１００ｍｇ／ｍｌである。本発明は、等浸透圧を得るために、ＮａＣｌまたはＫＣｌのような塩類を使用しない。
【００３９】
本発明の別の実施例は水性のヒト成長ホルモン剤であり、ヒト成長ホルモン、バッファ、強壮剤、有効量のポリエチレングリコール、キレート剤、および追加的に殺菌のための抗菌性剤をふくむものです。キレート化剤はさらにヒト成長ホルモンの潜在的な劣化を抑制するために加えられる。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のようなキレート化剤は０．０１−０．１％の濃度である。下に示されるように、従来技術で既知の他のキレート化剤も使用できる。
【００４０】
追加の剤は、薬剤に加えられる。そして、それらは、例えばキレート化剤を含んでもよく、好ましくは、ナトリウムＥＤＴＡ、カルシウム二ナトリウムＥＤＴＡ、二ナトリウムＥＤＴＡ、アスパラギン酸か、クエン酸、およびシステイン、メチオニンおよびその他同種のもののようなアンチ酸化体である。
【００４１】
実験例
Ａ． 検定方法
Ａ２８０濃度：
処理におけるｈＧＨの濃度は、薬剤製造、あるいは薬剤となっていないサンプルのｈＧＨ濃度は、１ｃｍのセルで、遠心分離された試料の２８０ｎｍを読み０．７６ｃｍ（Ｅ１ｃｍ １ｍｇ／ｍｌ，２８０ｎｍ＝０．７６）の消滅係数を使用することにより決定された。典型的なブランクの溶液は１０ｍＭリン酸ナトリウム塩、ｐＨ７．４であった。
【００４２】
ＳＥＣの濃度：
薬剤となった試料においてｈＧＨの濃度は、１−２ｍｇ／ｍＬの範囲においてピーク面積対濃度のランニング標準プロットによって決定した。ピーク面積は、室温で、０．９ｍＬ／分の流れでＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ ＨＲ１０／３０カラムでのｈＧＨ基準をランニングすることにより決定され、２８０ｎｍでモニターすることにより溶出を見た。溶出する溶剤は５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、であり、ｐＨ７．３であった。サンプルロードは全量２００μｇで、容量２００μｌのタンパク質であった。
【００４３】
ＳＥＣの純度：
薬剤となった試料において、二量体または集合体の割合は、ＳＥＣの濃度で記述されたようなクロマトグラフィーを行なうことにより決定された。二量体または集合体の割合は、ピーク面積の合計で、それぞれのピーク面積を割ることにより決定された。
【００４４】
ＡＥＸ： 薬剤においてアミド分解されたｈＧＨの割合は全量２００μｇ（容量１００μｌ）のタンパク質のロードランニングにより決定され、Ｍｏｎｏ−Ｑ ＨＲ５／５陰イオン交換カラムで、流速は１．５ｍＬ／分であり、室温で行われた。溶出する溶剤は次のとおりであった：バッファＡ＝２０ ｍＭトリス、ｐＨ ８．０およびバッファＢ＝２０ｍＭトリス、３００ＮａＣｌ ｐＨ８．０。アミド分解されたものは、１５ｍＭ ＮａＣｌ／ｍｉｎｕｔｅ勾配の使用により、本来のｈＧＨから分けられた、すなわち、０から６０％のＢで１２分間である。２８０ｎｍで溶離剤が認識された。賦形剤に含まれる薬剤のために、例えば、２８０で吸収があるフェノールのために、カラムは２０ｍＭトリスで洗浄され、ｐＨ ８．０／３０％メタノールで洗浄し、賦形剤を除いた。
【００４５】
ＲｐＨＰＬＣ： ｈＧＨの割合は混入物に関係する。
薬剤の中のアミド分解、酸化は、４０μｇのタンパク質（体積２０μｌ）のランニングにより決定された。ランニングは、ジュピターＣ４ハイｐＨ ＲＰカラム（５μ ３００Å、４．６ｘ２５０ｍｍ）で、温度４５℃流速０．５ ｍＬ／分で行った。溶離剤Ａは、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５であり、溶離剤Ｂは５０％１−プロパーノール／５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、そして、試料はイソクラクティック方法で溶出され、ここで溶出する混合物は溶離剤Ａにおける５４％の溶離剤Ｂである。溶出は２２０ｎｍで見られている。
混入物の割合は次の方程式から決定される：
％混入物＝（トータルピーク面積−本来のピーク面積）／トータルピーク面積×１００）
【００４６】
ＬＣ／ＭＳ： トランケーションの割合を評価した。全てのタンパク質をＭｉｃｈｒｏｍ ＰＬＲＰ−Ｓカラムで、１００−２００ｐｍｏｌロードした。流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎで、温度は３５℃であった。
カラム溶離剤はエレクトロスプレーイオン化プローブに向けられ、マススペクトルから、分子の種類と分子の質量が決定される。割合トランケーションは次の方程式から決定される：
％トランケーション＝（トランケーション）／トータルのｈＧＨ種のピーク面積×１００
【００４７】
抗菌性試験：
発表されたガイドラインに沿って、簡略にした抗菌性試験を行った。アメリカ薬局ＵＳＰで、長期的な安定性実験が行われた。試験された有機体は大腸菌のみであった。
【００４８】
製剤処理
ｈＧＨの物理的な安定性に関係する研究のために、溶液はｈＧＨあるいはバルク液体ｈＧＨのいずれかから調製された。ｈＧＨは再構成され、バッファが１ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に交換されたものであり、バルク液体ｈＧＨは薬剤処理に必要な適当な濃度に調整されたものである。この溶液の濃度はＡ２８０で読み取ることにより決定された。
【００４９】
ｈＧＨの長期安定性（物理的・化学的安定性が調査された）に関係する研究のために、薬剤は、ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧのいずれかの存在下で、ｐＨ６．０のバルクｈＧＨ溶液を濃縮され、示されたように賦形剤を加えて、調整された。処理された保存溶液は殺菌ろ過され、１ ｍＬがグラス・バイアルに分配され、密封された。
【００５０】
一般に、
主題発明の薬剤は、安定種が処理により減少しない程度で、そして有効で安全な薬学的管理にふさわしい量において、他の成分を含んでもよい。例えば、技術に熟練している人々によく知られている他の薬学的に許容される賦形剤が、主成分の一部を構成してもよい。これらとしては、例えば、様々な充填剤、追加バッファ剤、キレート化剤、酸化防止剤、共同溶剤およびその他同種のものを含むものである。
【実施例１】
【００５１】
物理的な安定性
撹拌による凝集からタンパク質を保護する賦形剤は、一般的に、そのようなタンパク質剤の長期貯蔵による凝集を防ぐこと、水性タンパク質薬を開発する技術で一般に知られている。ｈＧＨの撹拌による凝集に対するＰＥＧの影響の測定するために、ｈＧＨは再構成され、バッファは１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に交換された。最終的な濃度が２．０、５．０、１０．０および２０ｍｇ／ｍＬとなるように、最終のｈＧＨ濃度が全量１．５ｍｌにおいて０．５ｍｇ／ｍＬとなるように、ＰＥＧ−３４００を加えて、溶液が用意された。ネガティブ対照溶液（ＰＥＧまたはポロクサマー１８８を含んでいないもの）および、ポジティブ対照液（１ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８を含んでいるもの）は、参照として試料セットに含めたものである。各溶液の三つの試料は、５分間グラス試験管の中で活発に渦動され、そして、その後、３０分間室温で保温された。試料からｈＧＨの集合体を取り除くために、遠心分離された。次に、遠心分離の後、三つの試料のｈＧＨ減量のパーセントをＡ２８０で吸光度を読むことにより測定した。
【００５２】
表１は、渦動調査 ＰＥＧ−３４００の１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、および様々な濃度の中で０．５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨを使用したものである。
【表１】
試料
Ａ２８０（３のａｖｇ）による％ｈＧＨ減量
ネガティブ参照液（ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧ）
ポジティブ参照液（１ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８）
【００５３】
表１に要約された結果は、ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧのない水性ｈＧＨ試料は、ｈＧＨの３６％の損失であったことを示す。対照的に、ポロクサマー１８８がある状態では、ｈＧＨの３％の損失だけだった。したがって、ポロクサマー１８８は、ｈＧＨの凝集を１２倍減少させる。
ＰＥＧを含む溶液の攪拌は、ｈＧＨの損失において、０〜２倍の減少となった。すなわち、３４％から１６％となった。上記の結果から、ＰＥＧが撹拌による凝集に対するｈＧＨに最小限の保護（ポロクサマー１８８の６倍はより少ない保護）を示すと思われる。ＰＥＧは、ｈＧＨの液体製剤に長期的な安定性をもたらさない。従来技術において記載したように、従来の研究は、ＰＥＧがあるタンパク質を不安定にすることを明示していた。上記の結果から、ＰＥＧがポロクサマーと比較して、ｈＧＨに、より少ない安定化を与えるように見える。
【００５４】
さらなる撹拌による凝集実験は、様々な分子量（ＭＷ）サイズのＰＥＧ分子で行なわれた。凍結乾燥されたｈＧＨは、１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０か、１０．０あるいは２０ｍｇ／ｍＬと異なるＭＷのＰＥＧのバッファに交換された。ＭＷは、４００，６００、１０００、１４５０、３４００、６０００、８０００、１２０００あるいは２００００であり、ｈＧＨの最終濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ、全量１．２５ｍｌであった。ネガティブ対照液およびポジティブ対照液は参照として試料セットに含まれるものである。ここで、負の対照液はＰＥＧまたはポロクサマー１８８を含まないものであり、ポジティブ対照液は２ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８を含んだものである。前述したように、溶液は、５分間グラス試験管の中で活発に渦動され、次に、３０分間室温で保温された。そして、試料のｈＧＨ損失のパーセントは、遠心分離とＡ２８０により、測定された。
【００５５】
【表２】
【００５６】
表２の渦動調査は０．５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨを使用しており、１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、と、ＭＷの異なる１０、２０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧである。
【００５７】
テーブル２の中で、示された結果は、ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧのない試料において、ｈＧＨの５８％が失われることを示した。ポロクサマー１８８の存在はｈＧＨの損失を７％にとどめている。低分子量ＰＥＧ（ＰＥＧ−４００あるいはＰＥＧ−６００）の添加は、ｈＧＨの損失が３４％となった。ＰＥＧの保護効果は、ＰＥＧ−３４００より大きい分子において、損失が約１６％と安定状態であるように思われる。１０ｍｇ／ｍＬあるいは２０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度用においても、保護効果に違いが見られない。しかしながら、テーブル１の中で示された前述の結果が示されたように、ＰＥＧは、撹拌による凝集に対してポロクサマーとおなじレベルの保護を示さない。ポロクサマー １８８は凝集において、８倍効果を示し、ＰＥＧは３倍の効果を示すだけである。
【００５８】
撹拌による凝集実験の結果は、ＰＥＧは長期安定性にｈＧＨに最小限の保護を与えると
要約できる。特に、ＰＥＧは、ポロクサマー１８８と比較して、３〜６倍少ない凝集に対する保護を与えることを示している。
【００５９】
前の実験の結果にもかかわらず、薬剤は、５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、３．２ｍｇ／ｍＬのフェノール、７．５ｍｇ／ｍＬのＮａＣＬ、１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ３４００および１０ｍＭのリン酸ナトリウムであって、ｐＨ６に調製されている。しかしながら、ＰＥＧが共存するそのような製剤においても、沈殿は生じる（データは示していない）。
【００６０】
しかしながら、驚くべき、予期しない結果が発見された。それは、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でｈＧＨを含んでいる薬剤において、そして、バッファおよび砂糖または糖アルコールの強壮剤がある状態において、ＰＥＧ剤は撹拌による凝集より、ｈＧＨを保護し、幾つかのケースにおいては、ポロクサマー１８８薬剤よりも良かった。典型的な例を下に示す。薬剤は、３つの調整され、それらは、１ｍＬの最終ボリュームにおいて、５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、ブドウ糖（強壮剤）、および３．２ｍｇ／ｍｌのフェノール（撹拌からの保護のために必要とされるものではなく抗生物質である）を含むものである。以上にしめした薬剤は、５分間グラス試験管の中で活発に渦動され、次に、３０分間室温で保温された。その後、遠心分離に続いき、試料におけるｈＧＨ損失パーセントをＳＥＣ濃度検定によって測定した。二量体および集合の構造の割合の増加もＳＥＣ純度検定で測定した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
表３は、渦動調査であり、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ−３４００あるいはＰＥＧ−８０００（あるいは２ｍｇ／ｍｌのポロクサマー１８８）、４３ｍｇ／ｍｌのブドウ糖および３．２ｍｇ／ｍｌのフェノールの中で５ｍｇ／ｍｌのｈＧＨを使用した。
【００６３】
ポロクサマー１８８あるいはＰＥＧのないネガティブ参照剤は、７．３％のｈＧＨ、二量体および集合体の著しい増加を示した。すなわち、それぞれ３０％および１６％である。ポロクサマー１８８を含む薬剤は、ネガティブ参照剤とくらべ、１．３％のｈＧＨ、二量体および集合体の損失となった。驚いたことに、ＰＥＧを含んでいる薬剤については、ｈＧＨに損失は本質的になかった。ＰＥＧ−３４００製剤は、ポロクサマー１８８製剤で観察されたのよりも少ない二量体および集合体となった。さらに驚くことには、ＰＥＧ−８０００製剤には、二量体の構造見られず、集合体量が明らかに減少した。集合体の明らかな減少は、開始溶液中のｈＧＨ集合体の溶解によると思われる。これらの結果は、バッファと強壮剤の存在において、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のＰＥＧを加えたｈＧＨ剤は安定であり、また恐らくポロクサマー１８８薬剤より撹拌による凝集に対して安定であることを実証するものである。
【実施例２】
【００６４】
長期安定性（化学的・物理的な安定性の検査を含む）
ｈＧＨの長期安定性をＰＥＧまたはポロクサマー１８８を含んでいる薬剤と比較した。ＰＥＧ製剤は次のものを含んでいた：５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、１０のｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、４７ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−３４００および３．２ｍｇ／ｍＬのフェノール。対照剤（ポロクサマー１８８製剤）は次のものを含んでいた：５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、１０のｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、７．５ｍｇ／ｍＬのＮａＣＬ、２ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８と３．２ｍｇ／ｍＬフェノール。薬剤は、８℃か２℃の推奨される一方の貯蔵温度で、あるいは２５℃の高い貯蔵温度で、保温された。試料は様々な時間ポイントで移され、ｈＧＨは上記のような物理的・化学的の安定性が分析された。ＳＥＣによって、同様に、ＲＰ−ＨＰＬＣとＡＥＸ（化学の劣化を見るため）を用い、ｈＧＨの損失、二量体と集合体の増加割合を求めた。
【００６５】
【表４】
【００６６】
表４は、ポロクサマー１８８対ＰＥＧ製剤に関する安定性調査に関する。
ＰＥＧ製剤：５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、３．２ｍｇ／ｍｌのフェノール、４７ｍｇ／ｍＬのマンニトール、１．０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−３４００、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０。
ポロクサマー１８８製剤：５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、３．２ｍｇ／ｍＬのフェノール、７．５ｍｇ／ｍＬのＮＡＣｌ、２ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ ６．０
インキュベーション：２−８℃
【００６７】
上記のテーブルにおいて得られた結果から、我々は、長期貯蔵によるｈＧＨ凝集の率がＰＥＧとポロクサマー１８８とがｈＧＨ剤において匹敵するであろうと予想した。驚くことに、貯蔵安定性試験は、ポロクサマー１８８製剤と比較して、ＰＥＧ製剤においてｈＧＨ剤の化学劣化率の減少を示した。予想通りに、８℃に２で格納された試料で１か月の間に観察された変化は小さかった。変化が小さいので、検出のより低いレベルでは検定が不正確になる。予想通りに、物理的・化学的劣化は、２５℃で格納された試料において、加速された。ｈＧＨの物理的な劣化に関して、貯蔵の１か月後に、ポロクサマー１８８製剤と比較して、３３％少ないｈＧＨ二量体および集合体がＰＥＧ製剤で検知された。同様に、ポロクサマー１８８薬剤と比較して、３３％低いレベルの化学的に劣化したｈＧＨ（アミド分解されたｈＧＨおよびＲＰ混入物）は、ＰＥＧ製剤で検知された。上記の結果は、製剤に、ＰＥＧ、バッファ、強壮剤および１ｍｇ／ｍｌ以上のｈＧＨ濃度を有することにより、長期的な貯蔵における物理的・化学的な劣化からｈＧＨを保護することを実証することとなった。推奨された貯蔵条件で安定性を示すことから、１２−２４か月の間２〜８℃でインキュベーションが必要となる。このように、高温で行われた、加速された安定性調査は、通常の貯蔵条件の製品の安定性を示すのに用いることができる（Ｃｈａｎｇ Ｂ． Ｓ． ａｎｄ Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ Ｓ， Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００２； １３： １−２５）。
【００６８】
１か月のデータからの液体製剤の長期安定性の予見
ｈＧＨ分子の化学・物理的な劣化に関して、ＰＥＧ製剤によるｈＧＨ剤の長期安定性は、２５℃で加速された安定性調査から予見された。予測の正確さを増加させるために、ポロクサマー１８８入りのｈＧＨ剤に関する２４か月の安定性調査からのデータは、参照として使用した（「２４か月の調査」）。そのような２４か月の安定性調査は次の製剤に基づく：５．０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、１０のｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２．０ｍｇ／ｍＬのポロクサマー１８８と２．５ｍｇ／ｍＬフェノール、安定性データは５℃と２５℃で集められた。この安定性調査から得られた情報は活性化エネルギー（Ｅａ）を計算するために使用された。
【００６９】
アミド分解のレベルに関しての、上記のＰＥＧ製剤入りのｈＧＨ剤と、ポロクサマー１８８製剤入りとを、比較するために、速度定数は、アレニウス式を使用して、５℃に続いて、２５℃で速度定数が各剤について測定された。続いて、その後、５℃の速度定数のデータは、６、１２、１８および２４か月について、ｈＧＨのアミド分解形態の割合を測定するために使用された。次の表は、得られた情報を要約したものである。
【００７０】
【表５】
【００７１】
表５は、ｈＧＨのアミド分解形態の予見された割合に関する。
（１）２４か月のデータから決定されたもの。
（２）２４か月の実際のアミド分解のパーセント。
（３）アレニウス式を使用して計算されたもの。
（４）１か月のデータから計算したもの。
（５）アレニウス式から予見したもの。
（６）推定
【００７２】
１か月のデータから測定された２５℃のＰＥＧおよびポロクサマー１８８の各々の速度定数と、
２４か月の２５°Ｃにおける調査データはおなじオーダー上にある、これは、２４か月の５℃での調査で測定された速度定数は、ＰＥＧおよびポロクサマー１８８薬剤における６、１２、１８および２４か月の時間ポイントでのアミド分解の割合に妥当は予測を与えることを示唆する。表から、ＰＥＧ製剤は、ポロクサマー１８８製剤よりも、アミド分解からのよりよく保護することが、見出せる。
【００７３】
ＰＥＧ製剤を、凝集のレベルに関しての参照ポロクサマー１８８製剤と比較すると、速度定数は、アレニウス式を使用して、５℃での速度定数に続いて２５℃で各製剤について測定され（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ、１９９８ の中で述べられた原理に基づいた）。続いて、５℃の率データは２４か月後のｈＧＨの凝集の割合を決定するために使用された。次のテーブルは、得られた情報を要約したものである。
【００７４】
【表６】
【００７５】
表６は、２４か月のｈＧＨの凝集の予見された割合に関する。
（１）２４か月のデータから決定されたもの。
（２）２４か月の実際のアミド分解のパーセント。
（３）アレニウス式を使用して計算されたもの。
（４）１か月のデータから計算したもの。
（５）アレニウス式から予見したもの。
（６）推定
【００７６】
２５℃のＰＥＧおよびポロクサマー１８８薬剤の各々の速度定数は、１か月測定されたデータは補助的なポロクサマー１８８の２５℃のデータと同じオーダー上にあり、このことは、５℃で測定された速度定数は、ＰＥＧおよびポロクサマー１８８薬剤の２４か月の時間でのアミド分解割合の妥当な予見を与えるということが考えられる。ＰＥＧ製剤は、ポロクサマー１８８製剤と同じオーダーで、ｈＧＨの凝集を防ぎ、ポロクサマー製剤に匹敵する。
【００７７】
保温された試料において見られた物理的・化学的な劣化率に基づいて、少なくとも６ヶ月から１８ヶ月におけるＰＥＧ製剤入りのｈＧＨ剤の長期貯蔵安定性を示すために、推定がなされた。凝集率およびアミド分解率の推定は、ＰＥＧ製剤入りのｈＧＨは３−４％未満の凝集を示し、１５％未満アミド分解を示す。このような割合は妥当であり、必要に応じて人間の患者に投与されるｈＧＨ薬剤を得ることができる。
【実施例３】
【００７８】
保存効果
ポロクサマー１８８配合物のＰＥＧの抗菌効果を試験するために、ＵＳＰの短縮手法を用いた。すなわち、試験は大腸菌のみで行った。簡潔に、無菌条件で各配合物の６つのバイアルを組み合わせ、１つの６ｍＬの部分標本とした。それから細菌の検定された接種剤を、最終濃度を１×１０５から１×１０６ｃｆｕ／ｍＬとして製剤に加え、７日、１４日および１ヶ月の期間にわたって３７℃に保温した。それぞれの期間の後で、試料を採取しｃｆｕ数を決定する。カテゴリー１Ａの製品に要求される殺菌は７日で１ｌｏｇ以上の減少、１４日で３ｌｏｇ以上の減少、１４日から２８日では増加が見られないことである。そのため、配合物の抗微生物効果が達成され、ＰＥＧ製剤の大腸菌殺菌はポロクサマー製剤と同等となる。
【００７９】
【表７】
【００８０】
表７はＰＥＧとポロクサマー１８８配合物の抗菌効果に関する。
【実施例４】
【００８１】
キレート剤
発明者は、水性ヒト生長ホルモン剤へのキレート剤の添加が、ヒト生長ホルモンの劣化をさらに抑制するということをも発見した。前記の濃度でｈＧＨ、マンニトール、ＰＥＧ−３４００、リン酸ナトリウムおよびフェノールを含有する配合物を様々な濃度のＥＤＴＡと混合した。安定性促進の研究において、製剤を３７℃で保温した。２週間、１ヶ月および２ヶ月の時点で、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ）を含む様々な方法で試料を分析し、劣化／欠損ｈＧＨ剤のパーセント増加を計量した。表８に詳述されるように、分析を行った全ての時点において、ＥＤＴＡ濃度の増加によってｈＧＨ劣化の割合が低下している。
【００８２】
【表８】
【００８３】
表８は、ｈＧＨ安定性表示指標におけるＥＤＴＡの効果に関する。
【００８４】
上記の表５および６に要約される２５℃で加速された安定性の研究とは異なり、この実施例６で述べる３７℃での保温は、２から８℃での保管の安定性に関係が少ない。３７℃での保温は２５℃での保温よりもはるかに苛酷であり、単にキレート剤がｈＧＨの劣化を抑制するかの試験に過ぎない。
【００８５】
本発明の別実施例におけるＥＤＴＡによるｈＧＨ剤の調製において、凝集を避けるために薬剤の最終ｐＨへの注意が必要となる。ＥＤＴＡの添加によって薬剤のｐＨは低下する。本発明のＥＤＴＡによるｈＧＨ剤では、ｐＨ６．０以下のｐＨレベルにおいて凝集される。このような凝集を抑制するために、ｈＧＨの配合に用いるリン酸ＮａのｐＨを６．７まで上昇させ、これによって最終ｈＧＨ剤をｐＨ約６．４とする。本発明の実施例の一例は、
１ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、
強壮剤、
５ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ、
ｐＨを約６．４とするバッファン系、
０．１ｍｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍｌのキレート剤、および
随意の抗微生物剤、
からなるｐＨ約６．４の水性ｈＧＨ配合物である。
【００８６】
より具体的には、
５ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ、
約５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、
１５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−３４００、
１０ｍＭのリン酸Ｎａ、
１．９ｍＭのＥＤＴＡ、および
随意の２ｍｇ／ｍｌから６ｍｇ／ｍＬのフェノール、
からなるｐＨ約６．４の水性ｈＧＨ配合物である。
【００８７】
本発明の好ましい実施例を上に述べたが、これは様々な改良が可能であり、付録した請求項は本発明の精神及び範囲内に含まれる全ての改良の包含を意図するものであることは理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１〜２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｐＨ５．５からｐＨ７とするバッファ系と、
強壮剤と、
有効な量のポリエチレングリコールと、
を無菌の薬学的に許容される液体の中に有することを特徴とするヒト成長ホルモン剤。
【請求項２】
ポリエチレングリコールがＰＥＧ１４５０から２００００であることを特徴とする請求項１に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項３】
ポリエチレングリコールが５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項２に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項４】
長期冷蔵安定性が６〜１８ヶ月であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項５】
抗菌性剤を含むことを特徴とする請求項４に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項６】
ポリエチレングリコールがＰＥＧ１４５０から２００００であることを特徴とする請求項５に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項７】
ポリエチレングリコールが５〜５０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項６に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項８】
バッファ系がｐＨ６を提供することを特徴とする請求項４に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項９】
強壮剤がマンニトールであることを特徴とする請求項８に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項１０】
キレート剤を含むことを特徴とする請求項４に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項１１】
バッファ系がｐＨ６．４を提供することを特徴とする請求項１０に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項１２】
抗菌性剤を有することを特徴とする請求項１１に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項１３】
ヒト成長ホルモンの使用方法であって、
Ａ）ヒト成長ホルモンを水性剤に調整するステップであって、
該水性剤が１から２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｐＨ５．５から７とするバッファー・システムと、
５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
強壮剤と、を
薬剤として許容され、注射可能な無菌の水性のビークル内に、
含むものと、
Ｂ）前述の製剤を水性液として６から１８ヶ月貯蔵して、
水性液として貯蔵された薬剤を構成するステップと、
Ｃ）ヒト成長ホルモン治療を必要とする患者に前述の貯蔵された製剤を直接注入するステップと、
を有することを特徴とするヒト成長ホルモンの使用方法
【請求項１４】
ヒト成長ホルモンの使用方法であって、
Ａ）ヒト成長ホルモンを水性剤に調整するステップであって、
該水性剤が１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｐＨ５．５から７とするバッファ系と、
５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
２０ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの強壮剤と、
抗菌剤と、
を薬剤として許容され、注射可能な水性のビークル内に、
含むものと、
Ｂ）前述の製剤を水性液として６から１８ヶ月貯蔵して、
水性液として貯蔵された薬剤を構成するステップと、
Ｃ）ヒト成長ホルモン治療を必要とする患者に前述の貯蔵された製剤を直接注入するステップと、
を有することを特徴とするヒト成長ホルモンの使用方法
【請求項１５】
貯蔵安定性のある水性のヒト成長ホルモン剤の調整方法であって、
ヒト成長ホルモンの、水性で薬剤として許容されるビークルへの混合を有し、
該水性で薬剤として許容されるビークルが、
１から２０のヒト成長ホルモンと、
ｐＨ５．５からｐＨ７とするバッファと、
５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
２０から１００ｍｇ／ｍｌの強壮剤と、
を含み、
２℃から８℃で、６から１８ヶ月貯蔵可能であること
を特徴とする作成方法。
【請求項１】
１〜２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｐＨ５．５からｐＨ７とするバッファ系と、
強壮剤と、
有効な量のポリエチレングリコールと、
を無菌の薬学的に許容される液体の中に有することを特徴とするヒト成長ホルモン剤。
【請求項２】
ポリエチレングリコールがＰＥＧ１４５０から２００００であることを特徴とする請求項１に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項３】
ポリエチレングリコールが５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項２に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項４】
長期冷蔵安定性が６〜１８ヶ月であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項５】
抗菌性剤を含むことを特徴とする請求項４に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項６】
ポリエチレングリコールがＰＥＧ１４５０から２００００であることを特徴とする請求項５に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項７】
ポリエチレングリコールが５〜５０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項６に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項８】
バッファ系がｐＨ６を提供することを特徴とする請求項４に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項９】
強壮剤がマンニトールであることを特徴とする請求項８に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項１０】
キレート剤を含むことを特徴とする請求項４に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項１１】
バッファ系がｐＨ６．４を提供することを特徴とする請求項１０に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項１２】
抗菌性剤を有することを特徴とする請求項１１に記載のヒト成長ホルモン剤。
【請求項１３】
ヒト成長ホルモンの使用方法であって、
Ａ）ヒト成長ホルモンを水性剤に調整するステップであって、
該水性剤が１から２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｐＨ５．５から７とするバッファー・システムと、
５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
強壮剤と、を
薬剤として許容され、注射可能な無菌の水性のビークル内に、
含むものと、
Ｂ）前述の製剤を水性液として６から１８ヶ月貯蔵して、
水性液として貯蔵された薬剤を構成するステップと、
Ｃ）ヒト成長ホルモン治療を必要とする患者に前述の貯蔵された製剤を直接注入するステップと、
を有することを特徴とするヒト成長ホルモンの使用方法
【請求項１４】
ヒト成長ホルモンの使用方法であって、
Ａ）ヒト成長ホルモンを水性剤に調整するステップであって、
該水性剤が１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと、
ｐＨ５．５から７とするバッファ系と、
５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
２０ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの強壮剤と、
抗菌剤と、
を薬剤として許容され、注射可能な水性のビークル内に、
含むものと、
Ｂ）前述の製剤を水性液として６から１８ヶ月貯蔵して、
水性液として貯蔵された薬剤を構成するステップと、
Ｃ）ヒト成長ホルモン治療を必要とする患者に前述の貯蔵された製剤を直接注入するステップと、
を有することを特徴とするヒト成長ホルモンの使用方法
【請求項１５】
貯蔵安定性のある水性のヒト成長ホルモン剤の調整方法であって、
ヒト成長ホルモンの、水性で薬剤として許容されるビークルへの混合を有し、
該水性で薬剤として許容されるビークルが、
１から２０のヒト成長ホルモンと、
ｐＨ５．５からｐＨ７とするバッファと、
５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコールと、
２０から１００ｍｇ／ｍｌの強壮剤と、
を含み、
２℃から８℃で、６から１８ヶ月貯蔵可能であること
を特徴とする作成方法。
【公表番号】特表２００７−５０６６８３（Ｐ２００７−５０６６８３Ａ）
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２７２４０（Ｐ２００６−５２７２４０）
【出願日】平成１６年９月２７日（２００４．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００１６９８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２７９６０
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０６１００２８８）カンジェーン コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２７日（２００４．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００１６９８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２７９６０
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０６１００２８８）カンジェーン コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
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