ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞、及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物
本発明は、ヒト脂肪組織由来の成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物及びその製造方法に関する。本発明による皮膚美容又は形成用の組成物は、脂肪吸入術により得られる脂肪含有浮遊物を培養し、前記培養容器の表面に付着した脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収した後、ここに脂肪細胞を添加して製造することができる。本発明による組成物は、皮膚の弾力改善、シワ及び皮膚垂れの改善、形成による陥没部位の修復などの美容に有効であるだけではなく、乳房組織の形成にも有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト脂肪組織由来の成体幹細胞、繊維芽細胞、及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成外科用の組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞とは、自己複製能を有すると共に、２以上の細胞に分化する能力を有する細胞のことを言い、全能性幹細胞、多能性幹細胞(pluripotent stem cells)、多分化能性幹細胞（multipotent stem cells）に分類することができる。
【０００３】
近年、脂肪組織が多分化能性幹細胞の新規なソースであることが判明された(B. Cousin et al., BBRC, 301:1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol., 189:54, 2001; M.J. Seo et al., BBRC, 328:258, 2005)。すなわち、脂肪抽出（脂肪吸入術）により得られたヒト脂肪組織に未分化細胞群が含まれており、これがインビトロ上において脂肪細胞、骨形成原細胞（osteogenic cell）、筋原細胞及び軟骨母細胞(chondrogenic cells)への分化能を有するということが報告されている(P.A. Zuk et al., Tissue Eng., 7:211, 2001; A.M. Rodriguez et al., BBRC, 315:255, 2004)。さらに、脂肪組織由来細胞が筋肉再生能及び神経血管分化を促す能力があるということが動物モデル実験により知られている。このような脂肪組織は大量に抽出することができるというメリットがあり、従来の欠点を補完する新規な幹細胞のソースとして注目されている。
【０００４】
これまで知られている脂肪由来幹細胞としては、上皮細胞に分化可能なヒト脂肪由来成体幹細胞(M. Brzoska et al., BBRC, 330:142, 2005)、骨形成及び脂肪細胞に分化可能なヒト脂肪由来成体幹細胞(Y. Cao et al., BBRC, 332:370, 2005)、神経細胞に分化可能なヒト脂肪由来成体幹細胞(K.M. Safford et al., BBRC, 294:371, 2005)、脂肪細胞に分化可能なラット脂肪由来幹細胞(R. Ogawa et al., BBRC, 319:511, 2004)、骨形成及び軟骨形成細胞に分化可能なラット脂肪由来幹細胞(R. Ogawa et al., BBRC, 313:871, 2004)、軟骨形成細胞に分化可能なヒト脂肪由来幹細胞(H.A. Awad et al., Biomaterials, 25:3211, 2004)、神経細胞に分化可能なラット脂肪由来幹細胞(J. Fujimura et al., BBRC, 333:116, 2005)及び骨細胞、軟骨細胞、神経細胞又は筋肉細胞に分化可能な脂肪由来幹細胞（アメリカ特許第６、７７７、２３１号公報）などがある。
【０００５】
これまで、このような脂肪由来幹細胞は、主として難治病などの治療をはじめとする医学分野において利用しようとする努力が絶えずなされてきたが、美容又は形成を目的に幹細胞を利用しようとする試みは未だあまりなされていない。
【０００６】
そこで、本発明者らは、シワ改善、皮膚垂れの防止などの美容及び形成分野に幹細胞を利用するために鋭意努力した結果、脂肪吸入術により得られた脂肪含有浮遊物を培養して成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収した後、脂肪と混合した結果、美容及び形成に有効であるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【０００７】
《技術的課題》
本発明の目的は、ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する美容又は形成用の組成物及びその製造方法を提供するところにある。
【技術的解決方法】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により得られた脂肪含有浮遊物を培養容器において培養した後、前記培養容器に付着された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収するステップと、（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップと、を含む、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容外科又は形成外科用の組成物の製造方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、（ａ）ヒト脂肪組織由来ペレットをＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）含有培地において培養して脂肪由来成体幹細胞を製造した後、脂肪由来成体幹細胞と繊維芽細胞を回収するステップと、（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップと、を含む、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物の製造方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物を提供する。
【００１１】
本発明の他の特徴及び実施態様は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明によるヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞、繊維芽細胞などを含むフラスコに付着する細胞を１００倍率にて撮影した写真である。
【図２】図２は、本発明によるヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞をＣＯＲＭ−２含有ＭＥＢＭ培地において球状培養した後に免疫染色を用いてＮｅｓｔｉｎ、Ｏｃｔ４、ＳＨ２、ＳＨ３／４が発現した結果を１００倍率にて示す写真である。
【図３】図３は、本発明によるヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞から分化された脂肪細胞を２００倍率にて示すものである（Ａ：分化された状態の位相コントラスト、Ｂ：オイルレッドＯ染色法により染色したもの）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、一つの観点において、ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物に関する。
【００１４】
本発明による組成物は、乳房組織の形成によるバスト拡大用又はシワ除去用であるが、これに制限されるものではない。例えば、微細脂肪移植術、自家脂肪移植術など顔の八字シワ及び眉間シワの除去及び弾力維持のために使用可能である。本発明による組成物に含有されるヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪は自家由来細胞であることが好ましい。
【００１５】
本発明による美容又は形成用の組成物は、ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により得られる脂肪含有浮遊物を培養して得られた脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞をその他の細胞又は組織と混合して製造することができる。
【００１６】
一つの実施態様において、皮膚美容又は形成用の組成物は、下記の過程を経て製造することができる：（ａ）ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により得られた脂肪含有浮遊物を培養容器において培養した後、前記培養容器に付着した脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収するステップと、（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。
【００１７】
さらに詳しくは、脂肪吸入術により得られる生理食塩水に浮遊された脂肪含有浮遊物を培養した後、フラスコなどの培養容器に付着した幹細胞及び繊維芽細胞を回収する直前に生理食塩水により１回洗浄して上澄み液の残余脂肪及び血球細胞などを除去し、底面に付着している幹細胞及び繊維芽細胞層をトリプシンにより処理した後に回収したり、スクラッパーにより掻き取って少量の生理食塩水に浮遊されるものを直接的に回収したり、又は、遠心分離により遠心分離された細胞層を回収して脂肪と混合して製造する。
【００１８】
本発明において、前記成体幹細胞は中胚葉由来細胞であることが好ましく、前記中胚葉由来細胞は脂肪生成性の細胞であることが好ましい。
【００１９】
本発明において、前記成体幹細胞はデキサメサソン、インドメタシン、インシュリン及びＩＢＭＸを含有するα−ＭＥＭ培地に培養して脂肪生成性の細胞に分化されることを特徴とする。
【００２０】
他の実施態様において、皮膚美容又は形成用の組成物は下記の過程を経て製造することができる：（ａ）ヒト脂肪組織由来ペレットをＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）含有培地において培養して脂肪由来成体幹細胞を製造した後、脂肪由来幹細胞と繊維芽細胞を回収するステップと、（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。
【００２１】
前記脂肪吸入術は、脂肪除去の美容又は形成手術の１技法であって、脂肪質部を切開して真空ポンプにより脂肪質を引き抜くこと、又は、注射器の圧力により引き抜くことを意味する。
【００２２】
本発明において、脂肪又は脂肪細胞としては、ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により付随して得られるものが使用可能であるが、これに制限されるものではない。本発明における脂肪は、脂肪組織を含む。
【００２３】
本発明の皮膚美容外科又は形成外科用の組成物は、脂肪を使用する場合には、脂肪組織は１ｍｌに対して１×１０４〜１×１０７個の脂肪由来幹細胞と繊維芽細胞を含有することが好ましく、脂肪細胞を使用する場合には、脂肪由来幹細胞と繊維芽細胞の合計の細胞数に対して１〜５０倍の脂肪細胞を使用することが好ましい。
【００２４】
さらに、繊維芽細胞とは、繊維性結合組織の重要な成分を構成する細胞であって、繊維細胞とも呼ばれる。組織切片にして観察すれば、平らで且つ長い外形を有し、不揃いの突起がよく見られる。細胞質は、ミトコンドリア、ゴルジ体、中心体、脂質滴などを含み、その他に特殊な分化は示さない。核は染色性が弱く、楕円形である他、リンを含有する。膠原繊維に密接している場合が多く、その形成に預かると考えられて上記のように命名されることになった。本発明において、前記繊維芽細胞は脂肪組織から幹細胞を分離する過程において一緒に分離することができる。
【００２５】
一方、上記のようにして得られたヒト脂肪組織由来幹細胞液から目的の表面抗原を発現している多分化能性幹細胞を得る方法としては、ソート機能を有するフローサイトメータを用いたＦＡＣＳ法(Int. Immunol., 10(3):275, 1998)、磁気ビーズを使用する方法、多分化能性幹細胞を特異的に認識する抗体を用いたパニング法(J. Immunol., 141(8):2797, 1998)などがある。また、大量の培養液などから多分化能性幹細胞を得る方法としては、細胞の表面に発現されて分子（以下、表面抗原と称する。）を特異的に認識する抗体を単独又は組み合わせてカラムとして使用する方法がある。
【００２６】
フローサイトメータソート方式としては、水滴荷電方式、セルキャプチャー方式などが挙げられる。いかなる方法も細胞の表面抗原を特異的に認識する抗体を蛍光により標識し、標識された抗体と抗原の結合体に対する蛍光を測定して蛍光強度を電気信号に変換することにより細胞の抗原発現量を定量することができる。また、使用する蛍光物質の種類を組み合わせることにより、複数の表面抗原を発現している細胞を分離することも可能である。ここに使用可能な蛍光物質としては、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、PE(フィコエリスリン)、APC(アロフィコシアニン)、TR(テキサスレッド)、Cy3、CyChrome、Red613、Red670、TRI-Color、QuantumRedなどがある。
【００２７】
フローサイトメータを用いたＦＡＣＳ法としては、以上のようにして得られた幹細胞溶液を集め、遠心分離などの方法により細胞を分離した後、直接的に抗体で染色する方法や、一回適当な培地中において培養、増殖を行った後に抗体を染色する方法を利用することができる。細胞の染色は、先ず、表面抗原を認識する１次抗体と目的細胞サンプルを混合し、氷上において３０分から１時間かけてインキュベーションする。１次抗体が蛍光で標識されている場合には、洗浄後にフローサイトメータにより分離を行う。１次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後に１次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された２次抗体と１次抗体が反応した細胞を混合し、さらに氷水中において３０分から１時間かけてインキュベーションする。洗浄後、１次抗体と２次抗体から染色された細胞をフローサイトメータにより分離する。
【００２８】
本発明によるヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪を含有する組成物は皮膚の弾力を高め、シワ、特に、顔の八字シワ及び眉間シワと皮膚垂れを改善すると共に、陥没部位を形成外科により修復することにより美容に有効である。加えて、前記ヒト脂肪組織由来成体幹細胞は脂肪生成性の細胞に分化可能であることから、本発明による組成物は乳房組織形成などにも有用である。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００３０】
実施例１：脂肪組織からの多分化能成体幹細胞の分離及び形成用の組成物の製造
製造例１
ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により付随して得られる生理食塩水に浮遊された脂肪含有浮遊物を適正量の生理食塩水により満遍なく再浮遊させて細胞培養用のフラスコ又はローラーボトルに適当量入れた後、静置培養又は回転培養を行った。静置培養の場合、少なくとも６時間から１２時間かけて静置した。その後、フラスコの表面に付着される細胞層（脂肪由来ＭＳＣ、線維芽細胞）をトリプシンにより処理して回収した（図１）。このとき、少量の生理食塩水に浮遊されたものを直接的に回収して直ちに使用するか、あるいは、細胞層の体積を低減しようとする場合、前記生理食塩水により回収した細胞層を１０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離して、沈下したペレット層だけを使用した。前記分離された細胞層には成体幹細胞と繊維芽細胞が含有されている。前記分離された細胞層を脂肪と混合して本発明による成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物を製造した。
【００３１】
製造例２
ヒト脂肪組織から多分化能性幹細胞を分離及び精製した。すなわち、分離されたヒト脂肪組織をＰＢＳにより３回に亘って洗浄した後、組織を細かく切断した後、コラゲナーゼタイプ１（１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ−ＬＧ（低グルコース）培地を用いて脂肪とＤＭＥＭを１：３の割合にて混合し、３７℃の温度下において１時間かけて分解させた。ＰＢＳにより洗浄後、１０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。上澄み液は吸入し、底面に残留しているペレットは１：１で混合した１０％ＦＢＳとＤＭＥＭ−ＬＧ（低グルコース）により洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。残留ペレットは１００μｍ網目に通させてフィルターリングして破片を除去した後、ＰＢＳにより洗浄した。その後、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸）培地にインキュベーションした。一晩経過後、未付着細胞はＰＢＳにより洗浄し、Ｋ−ＮＡＣ培地（ケラチノサイト−ＳＦＭ培地＋２ｍＭ ＮＡＣ＋０．２ｍＭアスコルビン酸＋０．０９ｍＭカルシウム＋５ｎｇ／ｍｌ ｒＥＧＦ＋５０μｇ／ｍｌ ＢＰＥ＋５μｇ／ｍｌインシュリン＋７４ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾン）を２日置きに交換しながら培養してヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞及び繊維芽細胞液を得た。前記得られた細胞に脂肪を混合して、本発明による成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容外科又は形成用の組成物を製造した。
【００３２】
実施例２：脂肪由来多分化能性幹細胞の免疫学的な特性
実施例１において得られた脂肪組織由来成体幹細胞をＰＢＳにより洗浄し、トリプシン処理した後に細胞を回収して５分間１０００ｒｐｍ、４℃の条件下において遠心分離した。上澄み液を除去した後、２％ＦＢＳ及びＰＢＳの混合液を入れて洗浄し、その後、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離を行った。上澄み液を除去した後、細胞をＰＢＳに浮遊させてサンプル数だけ１×１０５個の細胞を分注し、その後、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離を行った。次いで、上澄み液を除去し、１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ）を入れた後、よく混合して１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離した。さらに上澄み液を除去し、１００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ）を入れた後、よく混合して４℃の温度条件下において３０分間反応させた。さらに、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離した後、上澄み液を除去し、１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ）を入れた後によく混合し、各ウェルに抗体（R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody）を入れ、４℃の温度条件下において３０分間反応させた。反応後に１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離した。上澄み液を除去した後にＰＢＳにより洗浄し、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離した。さらに前記上澄み液を除去した後にＰＢＳにより洗浄し、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離する過程を繰り返し行った。上澄み液を除去した後、２００μｌのＰＢＳによく混合した後、１％パラホルムアルデヒドを入れて固定し、フローサイトメータを用いて分析した。
【００３３】
【表１】
【００３４】
その結果、表１に示すように、本発明の脂肪組織由来成体幹細胞は、ＣＤ７３に対しては９１％、ＣＤ９０に対しては９７％、ＣＤ２９に対しては９６％、ＣＤ４４に対しては８３％、ＣＤ１０５に対しては８０％の陽性反応を示していた。また、他の抗原に対する免疫表現型を確認した結果、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに対していずれも陰性の免疫学的な特性を示していた。
【００３５】
実施例３：脂肪組織由来幹細胞の免疫染色分析
前記実施例１において得られた脂肪組織由来幹細胞をＰＢＳにより３回に亘って洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳにより３０分間固定した。ＰＢＳにより３回に亘って洗浄した後、０．１％トリトン−Ｘ１００を含有するＰＢＳに１０分間透過させた。ＰＢＳにより３回に亘って洗浄した後、１０％ＮＧＳにより１時間かけて反応させ、１次抗体を含有するＰＢＳで一晩、反応させた。ＰＢＳにより３回に亘って洗浄し、２次抗体により暗室中において１時間かけて反応させた。ＰＢＳにより３回に亘って洗浄した後、マウントした。
【００３６】
その結果、図２に示すように、本発明による多分化能性幹細胞球体は、未分化状態の細胞マーカーであると言えるＯｃｔ４及び中間葉幹細胞のマーカーであるＳＨ２（ＣＤ１０５）、ＳＨ３／４（ＣＤ７３）に対して陽性反応を示していた。
【００３７】
実施例４：脂肪由来多分化能性幹細胞の脂肪細胞への分化
実施例１において得られた脂肪組織由来多分化能成体幹細胞を５％ＦＢＳ、１μＭデキサメタソン、２００μＭインドメタシン、１０μｇ／ｍｌインシュリン、０．５ｍＭＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）を含有するα−ＭＥＭ培地中において２週間培養して多分化能性幹細胞の脂肪生成性の細胞への分化を誘導し、オイルレッドＯ染色法を用いて分析した。その結果、図３に示すように、本発明によるヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞が脂肪生成性の細胞に分化されていることを確認することができた。
【００３８】
実施例５：脂肪由来多分化能性幹細胞を用いた動物実験
マウスを用いて、脂肪組織由来幹細胞の脂肪体積保存能を確認した。マウスは実験群１２匹と対照群１２匹を使用し、実験群には脂肪１ｍｌと実施例１において分離された脂肪組織由来多分化能性成体幹細胞及び繊維芽細胞（５×１０５／２００μｌ生理食塩水）をマウスのうち皮下脂肪のない部位である頭部皮下に注入し、対照群には脂肪１ｍｌ＋ビヒクル（２００μｌ生理食塩水）を注入した。
【００３９】
１５日経過後、マウスの頭皮を切開して脂肪を外した後、体積を測定した。その結果、対照群においては注入した脂肪の体積が３１％に縮小されているのに対し、実施例１において製造した組成物を一緒に注入した実験群においては注入した脂肪体積の４５％が維持されていた。この結果から、本発明による脂肪組織由来幹細胞と繊維芽細胞は脂肪移植術において発生する脂肪体積の低下をかなり低減する効果があるということを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
以上詳述したように、本発明は、ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物を提供する効果がある。本発明による皮膚美容又は形成用の組成物は、皮膚の弾力を高め、シワ及び皮膚垂れを改善すると共に、陥没部位を形成により修復することにより、美容に有効であるだけではなく、前記成体幹細胞が脂肪生成性の細胞に分化可能であることから、乳房組織の形成などにも有効である。
【００４１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト脂肪組織由来の成体幹細胞、繊維芽細胞、及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成外科用の組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞とは、自己複製能を有すると共に、２以上の細胞に分化する能力を有する細胞のことを言い、全能性幹細胞、多能性幹細胞(pluripotent stem cells)、多分化能性幹細胞（multipotent stem cells）に分類することができる。
【０００３】
近年、脂肪組織が多分化能性幹細胞の新規なソースであることが判明された(B. Cousin et al., BBRC, 301:1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol., 189:54, 2001; M.J. Seo et al., BBRC, 328:258, 2005)。すなわち、脂肪抽出（脂肪吸入術）により得られたヒト脂肪組織に未分化細胞群が含まれており、これがインビトロ上において脂肪細胞、骨形成原細胞（osteogenic cell）、筋原細胞及び軟骨母細胞(chondrogenic cells)への分化能を有するということが報告されている(P.A. Zuk et al., Tissue Eng., 7:211, 2001; A.M. Rodriguez et al., BBRC, 315:255, 2004)。さらに、脂肪組織由来細胞が筋肉再生能及び神経血管分化を促す能力があるということが動物モデル実験により知られている。このような脂肪組織は大量に抽出することができるというメリットがあり、従来の欠点を補完する新規な幹細胞のソースとして注目されている。
【０００４】
これまで知られている脂肪由来幹細胞としては、上皮細胞に分化可能なヒト脂肪由来成体幹細胞(M. Brzoska et al., BBRC, 330:142, 2005)、骨形成及び脂肪細胞に分化可能なヒト脂肪由来成体幹細胞(Y. Cao et al., BBRC, 332:370, 2005)、神経細胞に分化可能なヒト脂肪由来成体幹細胞(K.M. Safford et al., BBRC, 294:371, 2005)、脂肪細胞に分化可能なラット脂肪由来幹細胞(R. Ogawa et al., BBRC, 319:511, 2004)、骨形成及び軟骨形成細胞に分化可能なラット脂肪由来幹細胞(R. Ogawa et al., BBRC, 313:871, 2004)、軟骨形成細胞に分化可能なヒト脂肪由来幹細胞(H.A. Awad et al., Biomaterials, 25:3211, 2004)、神経細胞に分化可能なラット脂肪由来幹細胞(J. Fujimura et al., BBRC, 333:116, 2005)及び骨細胞、軟骨細胞、神経細胞又は筋肉細胞に分化可能な脂肪由来幹細胞（アメリカ特許第６、７７７、２３１号公報）などがある。
【０００５】
これまで、このような脂肪由来幹細胞は、主として難治病などの治療をはじめとする医学分野において利用しようとする努力が絶えずなされてきたが、美容又は形成を目的に幹細胞を利用しようとする試みは未だあまりなされていない。
【０００６】
そこで、本発明者らは、シワ改善、皮膚垂れの防止などの美容及び形成分野に幹細胞を利用するために鋭意努力した結果、脂肪吸入術により得られた脂肪含有浮遊物を培養して成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収した後、脂肪と混合した結果、美容及び形成に有効であるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【０００７】
《技術的課題》
本発明の目的は、ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する美容又は形成用の組成物及びその製造方法を提供するところにある。
【技術的解決方法】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により得られた脂肪含有浮遊物を培養容器において培養した後、前記培養容器に付着された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収するステップと、（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップと、を含む、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容外科又は形成外科用の組成物の製造方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、（ａ）ヒト脂肪組織由来ペレットをＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）含有培地において培養して脂肪由来成体幹細胞を製造した後、脂肪由来成体幹細胞と繊維芽細胞を回収するステップと、（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップと、を含む、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物の製造方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物を提供する。
【００１１】
本発明の他の特徴及び実施態様は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明によるヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞、繊維芽細胞などを含むフラスコに付着する細胞を１００倍率にて撮影した写真である。
【図２】図２は、本発明によるヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞をＣＯＲＭ−２含有ＭＥＢＭ培地において球状培養した後に免疫染色を用いてＮｅｓｔｉｎ、Ｏｃｔ４、ＳＨ２、ＳＨ３／４が発現した結果を１００倍率にて示す写真である。
【図３】図３は、本発明によるヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞から分化された脂肪細胞を２００倍率にて示すものである（Ａ：分化された状態の位相コントラスト、Ｂ：オイルレッドＯ染色法により染色したもの）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、一つの観点において、ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物に関する。
【００１４】
本発明による組成物は、乳房組織の形成によるバスト拡大用又はシワ除去用であるが、これに制限されるものではない。例えば、微細脂肪移植術、自家脂肪移植術など顔の八字シワ及び眉間シワの除去及び弾力維持のために使用可能である。本発明による組成物に含有されるヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪は自家由来細胞であることが好ましい。
【００１５】
本発明による美容又は形成用の組成物は、ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により得られる脂肪含有浮遊物を培養して得られた脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞をその他の細胞又は組織と混合して製造することができる。
【００１６】
一つの実施態様において、皮膚美容又は形成用の組成物は、下記の過程を経て製造することができる：（ａ）ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により得られた脂肪含有浮遊物を培養容器において培養した後、前記培養容器に付着した脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収するステップと、（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。
【００１７】
さらに詳しくは、脂肪吸入術により得られる生理食塩水に浮遊された脂肪含有浮遊物を培養した後、フラスコなどの培養容器に付着した幹細胞及び繊維芽細胞を回収する直前に生理食塩水により１回洗浄して上澄み液の残余脂肪及び血球細胞などを除去し、底面に付着している幹細胞及び繊維芽細胞層をトリプシンにより処理した後に回収したり、スクラッパーにより掻き取って少量の生理食塩水に浮遊されるものを直接的に回収したり、又は、遠心分離により遠心分離された細胞層を回収して脂肪と混合して製造する。
【００１８】
本発明において、前記成体幹細胞は中胚葉由来細胞であることが好ましく、前記中胚葉由来細胞は脂肪生成性の細胞であることが好ましい。
【００１９】
本発明において、前記成体幹細胞はデキサメサソン、インドメタシン、インシュリン及びＩＢＭＸを含有するα−ＭＥＭ培地に培養して脂肪生成性の細胞に分化されることを特徴とする。
【００２０】
他の実施態様において、皮膚美容又は形成用の組成物は下記の過程を経て製造することができる：（ａ）ヒト脂肪組織由来ペレットをＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）含有培地において培養して脂肪由来成体幹細胞を製造した後、脂肪由来幹細胞と繊維芽細胞を回収するステップと、（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。
【００２１】
前記脂肪吸入術は、脂肪除去の美容又は形成手術の１技法であって、脂肪質部を切開して真空ポンプにより脂肪質を引き抜くこと、又は、注射器の圧力により引き抜くことを意味する。
【００２２】
本発明において、脂肪又は脂肪細胞としては、ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により付随して得られるものが使用可能であるが、これに制限されるものではない。本発明における脂肪は、脂肪組織を含む。
【００２３】
本発明の皮膚美容外科又は形成外科用の組成物は、脂肪を使用する場合には、脂肪組織は１ｍｌに対して１×１０４〜１×１０７個の脂肪由来幹細胞と繊維芽細胞を含有することが好ましく、脂肪細胞を使用する場合には、脂肪由来幹細胞と繊維芽細胞の合計の細胞数に対して１〜５０倍の脂肪細胞を使用することが好ましい。
【００２４】
さらに、繊維芽細胞とは、繊維性結合組織の重要な成分を構成する細胞であって、繊維細胞とも呼ばれる。組織切片にして観察すれば、平らで且つ長い外形を有し、不揃いの突起がよく見られる。細胞質は、ミトコンドリア、ゴルジ体、中心体、脂質滴などを含み、その他に特殊な分化は示さない。核は染色性が弱く、楕円形である他、リンを含有する。膠原繊維に密接している場合が多く、その形成に預かると考えられて上記のように命名されることになった。本発明において、前記繊維芽細胞は脂肪組織から幹細胞を分離する過程において一緒に分離することができる。
【００２５】
一方、上記のようにして得られたヒト脂肪組織由来幹細胞液から目的の表面抗原を発現している多分化能性幹細胞を得る方法としては、ソート機能を有するフローサイトメータを用いたＦＡＣＳ法(Int. Immunol., 10(3):275, 1998)、磁気ビーズを使用する方法、多分化能性幹細胞を特異的に認識する抗体を用いたパニング法(J. Immunol., 141(8):2797, 1998)などがある。また、大量の培養液などから多分化能性幹細胞を得る方法としては、細胞の表面に発現されて分子（以下、表面抗原と称する。）を特異的に認識する抗体を単独又は組み合わせてカラムとして使用する方法がある。
【００２６】
フローサイトメータソート方式としては、水滴荷電方式、セルキャプチャー方式などが挙げられる。いかなる方法も細胞の表面抗原を特異的に認識する抗体を蛍光により標識し、標識された抗体と抗原の結合体に対する蛍光を測定して蛍光強度を電気信号に変換することにより細胞の抗原発現量を定量することができる。また、使用する蛍光物質の種類を組み合わせることにより、複数の表面抗原を発現している細胞を分離することも可能である。ここに使用可能な蛍光物質としては、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、PE(フィコエリスリン)、APC(アロフィコシアニン)、TR(テキサスレッド)、Cy3、CyChrome、Red613、Red670、TRI-Color、QuantumRedなどがある。
【００２７】
フローサイトメータを用いたＦＡＣＳ法としては、以上のようにして得られた幹細胞溶液を集め、遠心分離などの方法により細胞を分離した後、直接的に抗体で染色する方法や、一回適当な培地中において培養、増殖を行った後に抗体を染色する方法を利用することができる。細胞の染色は、先ず、表面抗原を認識する１次抗体と目的細胞サンプルを混合し、氷上において３０分から１時間かけてインキュベーションする。１次抗体が蛍光で標識されている場合には、洗浄後にフローサイトメータにより分離を行う。１次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後に１次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された２次抗体と１次抗体が反応した細胞を混合し、さらに氷水中において３０分から１時間かけてインキュベーションする。洗浄後、１次抗体と２次抗体から染色された細胞をフローサイトメータにより分離する。
【００２８】
本発明によるヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪を含有する組成物は皮膚の弾力を高め、シワ、特に、顔の八字シワ及び眉間シワと皮膚垂れを改善すると共に、陥没部位を形成外科により修復することにより美容に有効である。加えて、前記ヒト脂肪組織由来成体幹細胞は脂肪生成性の細胞に分化可能であることから、本発明による組成物は乳房組織形成などにも有用である。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００３０】
実施例１：脂肪組織からの多分化能成体幹細胞の分離及び形成用の組成物の製造
製造例１
ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により付随して得られる生理食塩水に浮遊された脂肪含有浮遊物を適正量の生理食塩水により満遍なく再浮遊させて細胞培養用のフラスコ又はローラーボトルに適当量入れた後、静置培養又は回転培養を行った。静置培養の場合、少なくとも６時間から１２時間かけて静置した。その後、フラスコの表面に付着される細胞層（脂肪由来ＭＳＣ、線維芽細胞）をトリプシンにより処理して回収した（図１）。このとき、少量の生理食塩水に浮遊されたものを直接的に回収して直ちに使用するか、あるいは、細胞層の体積を低減しようとする場合、前記生理食塩水により回収した細胞層を１０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離して、沈下したペレット層だけを使用した。前記分離された細胞層には成体幹細胞と繊維芽細胞が含有されている。前記分離された細胞層を脂肪と混合して本発明による成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物を製造した。
【００３１】
製造例２
ヒト脂肪組織から多分化能性幹細胞を分離及び精製した。すなわち、分離されたヒト脂肪組織をＰＢＳにより３回に亘って洗浄した後、組織を細かく切断した後、コラゲナーゼタイプ１（１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ−ＬＧ（低グルコース）培地を用いて脂肪とＤＭＥＭを１：３の割合にて混合し、３７℃の温度下において１時間かけて分解させた。ＰＢＳにより洗浄後、１０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。上澄み液は吸入し、底面に残留しているペレットは１：１で混合した１０％ＦＢＳとＤＭＥＭ−ＬＧ（低グルコース）により洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。残留ペレットは１００μｍ網目に通させてフィルターリングして破片を除去した後、ＰＢＳにより洗浄した。その後、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸）培地にインキュベーションした。一晩経過後、未付着細胞はＰＢＳにより洗浄し、Ｋ−ＮＡＣ培地（ケラチノサイト−ＳＦＭ培地＋２ｍＭ ＮＡＣ＋０．２ｍＭアスコルビン酸＋０．０９ｍＭカルシウム＋５ｎｇ／ｍｌ ｒＥＧＦ＋５０μｇ／ｍｌ ＢＰＥ＋５μｇ／ｍｌインシュリン＋７４ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾン）を２日置きに交換しながら培養してヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞及び繊維芽細胞液を得た。前記得られた細胞に脂肪を混合して、本発明による成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容外科又は形成用の組成物を製造した。
【００３２】
実施例２：脂肪由来多分化能性幹細胞の免疫学的な特性
実施例１において得られた脂肪組織由来成体幹細胞をＰＢＳにより洗浄し、トリプシン処理した後に細胞を回収して５分間１０００ｒｐｍ、４℃の条件下において遠心分離した。上澄み液を除去した後、２％ＦＢＳ及びＰＢＳの混合液を入れて洗浄し、その後、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離を行った。上澄み液を除去した後、細胞をＰＢＳに浮遊させてサンプル数だけ１×１０５個の細胞を分注し、その後、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離を行った。次いで、上澄み液を除去し、１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ）を入れた後、よく混合して１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離した。さらに上澄み液を除去し、１００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ）を入れた後、よく混合して４℃の温度条件下において３０分間反応させた。さらに、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離した後、上澄み液を除去し、１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ）を入れた後によく混合し、各ウェルに抗体（R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody）を入れ、４℃の温度条件下において３０分間反応させた。反応後に１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離した。上澄み液を除去した後にＰＢＳにより洗浄し、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離した。さらに前記上澄み液を除去した後にＰＢＳにより洗浄し、１０００ｒｐｍ、５分間及び４℃の条件下において遠心分離する過程を繰り返し行った。上澄み液を除去した後、２００μｌのＰＢＳによく混合した後、１％パラホルムアルデヒドを入れて固定し、フローサイトメータを用いて分析した。
【００３３】
【表１】
【００３４】
その結果、表１に示すように、本発明の脂肪組織由来成体幹細胞は、ＣＤ７３に対しては９１％、ＣＤ９０に対しては９７％、ＣＤ２９に対しては９６％、ＣＤ４４に対しては８３％、ＣＤ１０５に対しては８０％の陽性反応を示していた。また、他の抗原に対する免疫表現型を確認した結果、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに対していずれも陰性の免疫学的な特性を示していた。
【００３５】
実施例３：脂肪組織由来幹細胞の免疫染色分析
前記実施例１において得られた脂肪組織由来幹細胞をＰＢＳにより３回に亘って洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳにより３０分間固定した。ＰＢＳにより３回に亘って洗浄した後、０．１％トリトン−Ｘ１００を含有するＰＢＳに１０分間透過させた。ＰＢＳにより３回に亘って洗浄した後、１０％ＮＧＳにより１時間かけて反応させ、１次抗体を含有するＰＢＳで一晩、反応させた。ＰＢＳにより３回に亘って洗浄し、２次抗体により暗室中において１時間かけて反応させた。ＰＢＳにより３回に亘って洗浄した後、マウントした。
【００３６】
その結果、図２に示すように、本発明による多分化能性幹細胞球体は、未分化状態の細胞マーカーであると言えるＯｃｔ４及び中間葉幹細胞のマーカーであるＳＨ２（ＣＤ１０５）、ＳＨ３／４（ＣＤ７３）に対して陽性反応を示していた。
【００３７】
実施例４：脂肪由来多分化能性幹細胞の脂肪細胞への分化
実施例１において得られた脂肪組織由来多分化能成体幹細胞を５％ＦＢＳ、１μＭデキサメタソン、２００μＭインドメタシン、１０μｇ／ｍｌインシュリン、０．５ｍＭＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）を含有するα−ＭＥＭ培地中において２週間培養して多分化能性幹細胞の脂肪生成性の細胞への分化を誘導し、オイルレッドＯ染色法を用いて分析した。その結果、図３に示すように、本発明によるヒト脂肪組織由来多分化能性幹細胞が脂肪生成性の細胞に分化されていることを確認することができた。
【００３８】
実施例５：脂肪由来多分化能性幹細胞を用いた動物実験
マウスを用いて、脂肪組織由来幹細胞の脂肪体積保存能を確認した。マウスは実験群１２匹と対照群１２匹を使用し、実験群には脂肪１ｍｌと実施例１において分離された脂肪組織由来多分化能性成体幹細胞及び繊維芽細胞（５×１０５／２００μｌ生理食塩水）をマウスのうち皮下脂肪のない部位である頭部皮下に注入し、対照群には脂肪１ｍｌ＋ビヒクル（２００μｌ生理食塩水）を注入した。
【００３９】
１５日経過後、マウスの頭皮を切開して脂肪を外した後、体積を測定した。その結果、対照群においては注入した脂肪の体積が３１％に縮小されているのに対し、実施例１において製造した組成物を一緒に注入した実験群においては注入した脂肪体積の４５％が維持されていた。この結果から、本発明による脂肪組織由来幹細胞と繊維芽細胞は脂肪移植術において発生する脂肪体積の低下をかなり低減する効果があるということを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
以上詳述したように、本発明は、ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、繊維芽細胞及び脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物を提供する効果がある。本発明による皮膚美容又は形成用の組成物は、皮膚の弾力を高め、シワ及び皮膚垂れを改善すると共に、陥没部位を形成により修復することにより、美容に有効であるだけではなく、前記成体幹細胞が脂肪生成性の細胞に分化可能であることから、乳房組織の形成などにも有効である。
【００４１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物。
【請求項２】
前記組成物は、乳房組織の形成用又はシワ除去用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
次のステップを含む、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物の製造方法：
（ａ）ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により得られた脂肪含有浮遊物を培養容器において培養した後、前記培養容器に付着された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収するステップと、
（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。
【請求項４】
前記成体幹細胞は、中胚葉由来細胞であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記成体幹細胞はデキサメサソン、インドメタシン、インシュリン及びＩＢＭＸを含有するα−ＭＥＭ培地で培養して脂肪細胞に分化されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
次のステップを含む、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物の製造方法：
（ａ）ヒト脂肪組織由来ペレットをＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）含有培地において培養して脂肪由来成体幹細胞を製造した後、脂肪由来成体幹細胞と繊維芽細胞を回収するステップと、
（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。
【請求項１】
(i)ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物。
【請求項２】
前記組成物は、乳房組織の形成用又はシワ除去用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
次のステップを含む、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物の製造方法：
（ａ）ヒト脂肪組織の脂肪吸入術により得られた脂肪含有浮遊物を培養容器において培養した後、前記培養容器に付着された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を回収するステップと、
（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞含有細胞層を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。
【請求項４】
前記成体幹細胞は、中胚葉由来細胞であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記成体幹細胞はデキサメサソン、インドメタシン、インシュリン及びＩＢＭＸを含有するα−ＭＥＭ培地で培養して脂肪細胞に分化されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
次のステップを含む、（i）ヒト脂肪組織由来成体幹細胞、（ii）繊維芽細胞及び（iii）脂肪又は脂肪細胞を含有する皮膚美容又は形成用の組成物の製造方法：
（ａ）ヒト脂肪組織由来ペレットをＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）含有培地において培養して脂肪由来成体幹細胞を製造した後、脂肪由来成体幹細胞と繊維芽細胞を回収するステップと、
（ｂ）前記回収された脂肪由来成体幹細胞及び繊維芽細胞を脂肪又は脂肪細胞と混合するステップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５３９５４６（Ｐ２００９−５３９５４６Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１５２９８（Ｐ２００９−５１５２９８）
【出願日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２６４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４５４３８
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０８２５２８５９）アールエヌエル バイオ カンパニー，リミティッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２６４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４５４３８
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０８２５２８５９）アールエヌエル バイオ カンパニー，リミティッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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