ヒト腎臓細胞株、形質転換体、及び薬物評価方法
【課題】薬物感受性が高く薬物評価系の構築に好適なヒト腎臓細胞株及び形質転換体、並びにこれらの細胞を用いた薬物評価方法を提供する。
【解決手段】本発明に係るヒト腎臓細胞株は、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２における発現量の１０倍以上である。また、本発明に係る形質転換体は、（ａ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ｂ）ＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列と相同的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがヒト腎臓細胞株に導入されたものである。
【解決手段】本発明に係るヒト腎臓細胞株は、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２における発現量の１０倍以上である。また、本発明に係る形質転換体は、（ａ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ｂ）ＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列と相同的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがヒト腎臓細胞株に導入されたものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト腎臓細胞株、形質転換体、及び薬物評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患の治療には種々の薬物が用いられるが、それらの中には体内の組織・器官に副作用を及ぼすものも少なくない。特に腎臓は薬物代謝の主要臓器であり血液中の高濃度の薬物に曝されるため、薬物療法において大きな問題になっている。このため、創薬段階で腎毒性を評価することが重要である。また、創薬段階では、毒性評価に限らず、薬物に対する感受性評価を行うことも重要である。
【０００３】
従来、このような薬物評価は、マウス、ラット等の動物や、イヌ、ブタ等の腎臓細胞株を用いた実験によるところが大きく、ヒトの組織や細胞を用いた薬物評価系は存在しなかった。しかしながら、動物とヒトとでは各部位におけるタンパク質発現が異なるため、動物を用いた実験で得られた結果がヒトにも当てはまるとは限らない。例えばバソプレッシンは、ラットやウサギでは、集合管において水や尿素の透過性を高めるとともに集合管及びヘンレの上行脚においてナトリウムの再吸収を高める働きがあるが、ヒトでは、ヘンレの上行脚におけるナトリウムの再吸収への効果は見られないことが知られている（非特許文献１を参照）。そこで、ヒト細胞を用いた薬物評価系の構築が望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｕｇｇｌｅｓ， Ｂ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｙｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．， ６０， ｐ．９１４−９２１， １９８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、現在、複数のヒト腎臓細胞株が入手可能であるが、本件発明者らの研究によると、それらは薬物感受性が不十分であり、必ずしも薬物評価系の構築に適したものではなかった。
【０００６】
また、薬物によっては患者毎に感受性のばらつきが大きいものがあるため、テーラーメード医療に向けて投薬段階で薬物感受性評価を行うことも重要となる。患者毎の薬物評価系を構築することができれば、副作用に個人差のある薬物についても、投薬治療が容易になると期待される。
【０００７】
そこで本発明は、薬物感受性が高く薬物評価系の構築に好適なヒト腎臓細胞株及び形質転換体、並びにこれらの細胞を用いた薬物評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２が薬物感受性に大きく関与しており、このＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子を高発現しているヒト腎臓細胞株や、ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子をヒト腎臓細胞株に導入した形質転換体が薬物評価系の構築に好適であることを見出した。また、このようなヒト腎臓細胞株は被験者の尿中に含まれる腎臓細胞から樹立することができ、これにより患者毎の薬物評価系を構築できることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものであり、詳細には以下のとおりである。
【０００９】
（１） 有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２における発現量の１０倍以上であるヒト腎臓細胞株。
【００１０】
（２） ヒト尿中に含まれる腎臓細胞から樹立された（１）記載のヒト腎臓細胞株。
【００１１】
（３） 受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１５６１である（１）又は（２）記載のヒト腎臓細胞株。
【００１２】
（４） 有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量を指標として細胞を選別する工程を含むヒト腎臓細胞株の製造方法。
【００１３】
（５） 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡがヒト腎臓細胞株に導入された形質転換体。
（ａ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列と相同的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１４】
（６） 被検薬物の存在下で、（１）から（３）のいずれか記載のヒト腎臓細胞株、又は（５）記載の形質転換体を培養する工程と、前記ヒト腎臓細胞株又は前記形質転換体に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含む薬物評価方法。
【００１５】
（７） 被験者の尿中に含まれる腎臓細胞を培養する工程と、前記培養後の腎臓細胞から有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量を指標として特定の腎臓細胞を選別する工程と、被検薬物の存在下で前記特定の腎臓細胞を培養する工程と、前記被験者に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含む薬物評価方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ヒト腎臓細胞株や形質転換体を用いることにより、被検薬物の腎臓に対する毒性や、腎臓に対する作用をより正確に評価することができる。また、被験者の尿中に含まれる腎臓細胞からヒト腎臓細胞株を樹立することにより、患者毎の薬物評価系を構築することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
＜ヒト腎臓細胞株＞
本発明に係るヒト腎臓細胞株は、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２における発現量の１０倍以上である。この発現量は、２０倍以上が好ましく、５０倍以上がより好ましい。ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がＨＫ−２細胞の２２３倍であるヒト腎臓細胞株（後述するＨＵＥ２３３Ａ細胞）は、２００８年３月２８日付けで、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１５６１として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター中央第６）に寄託されている。
【００１８】
有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２は、小腸、肝臓、腎臓、血液脳関門において発現が知られているが、このＯＡＴＰ１Ａ２がヒト腎臓細胞の薬物感受性に関与していることは、本件発明者らによって明らかになったことである。このような有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子を高発現しているヒト腎臓細胞株を用いることにより、ヒト腎臓に対する被検薬物の作用（毒性、感受性等）をより正確に評価することができる。
【００１９】
＜ヒト腎臓細胞株の製造方法＞
本発明に係るヒト腎臓細胞株の製造方法は、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い細胞を選別する工程を含むものである。
【００２０】
ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量を測定するには、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡやｍＲＮＡを抽出し、ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法等によって増幅産物を得ればよい。このようにして発現量を測定した後、発現量が多い細胞を選別することで、薬物感受性の高いヒト腎臓細胞株を得ることができる。
【００２１】
＜形質転換体＞
本発明に係る形質転換体は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡがヒト腎臓細胞株に導入されたものである。
（ａ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列と相同的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２２】
上記（ａ）のＤＮＡは、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子に相当する。このＳＬＣ２１Ａ３遺伝子のｍＲＮＡ配列は公知であり、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録番号ＮＭ＿１３４４３１で登録されている。また、上記（ｂ）のＤＮＡは、上記（ａ）のＤＮＡの変異体やホモログのうち、ＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするものに相当する。
【００２３】
ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、対象とするＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を採用することにより取得できるＤＮＡを意味する。例えば、コロニーやプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルタを使用し、０．７〜１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６５℃の条件下でフィルタを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等が挙げられる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．， １９８９等を参照）。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列の、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列との相同性は、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましい。
【００２４】
上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調製する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法が挙げられる。
【００２５】
本発明に係る形質転換体を得るには、上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを適当な発現ベクター（例えば、アデノウイルス系ベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築し、この発現ベクターでヒト腎臓細胞株を形質転換すればよい。
【００２６】
有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２はヒト腎臓細胞の薬物感受性に関与していることが本件発明者らによって明らかになっているため、このような形質転換体を用いることにより、ヒト腎臓に対する被検薬物の作用（毒性、感受性等）をより正確に評価することができる。
【００２７】
＜第１の薬物評価方法＞
本発明に係る第１の薬物評価方法は、被検薬物の存在下で、本発明に係るヒト腎臓細胞株、又は本発明に係る形質転換体を培養する工程と、上記ヒト腎臓細胞株又は上記形質転換体に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含むものである。
【００２８】
上記のように、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２はヒト腎臓細胞の薬物感受性に関与していることが本件発明者らによって明らかになっているため、被検薬物を本発明に係るヒト腎臓細胞株、又は本発明に係る形質転換体に接触させることにより、被検薬物の腎臓に対する毒性や、腎臓に対する作用を評価することができる。また、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２を介した薬物動態や細胞内シグナル伝達の研究を行うこともできる。
【００２９】
＜第２の薬物評価方法＞
本発明に係る第２の薬物評価方法は、被験者の尿中に含まれる腎臓細胞を培養する工程と、培養後の腎臓細胞から有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い特定の腎臓細胞を選別する工程と、被検薬物の存在下で上記特定の腎臓細胞を培養する工程と、被験者に対する上記被検薬物の作用を評価する工程と、を含むものである。
【００３０】
被験者の尿中に含まれる腎臓細胞を培養する際には、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに国際寄託されている受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０８６５のマウス間葉系細胞、又はその細胞を血清含有培地中で培養して得られる培養上清を培地に加えておくことが好ましい。これにより、増殖能に優れた前駆的な腎臓細胞を効率よく得ることができる。さらに、培養後の腎臓細胞から有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い特定の腎臓細胞を選別することにより薬物感受性に優れた腎臓細胞を得ることができるため、この細胞を用いることで、被験者個々人に対する薬物感受性評価や副作用評価をより正確に行うことができる。特に、この薬物評価方法では被験者の尿中から腎臓細胞を得ているため、侵襲性が低く好ましい。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００３２】
＜ヒト尿中落下細胞の初代培養＞
生体腎移植患者の尿を４℃、１０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、上清を除去した後、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭで懸濁し、再度遠心分離して上清を除去した。この懸濁、遠心分離、上清除去による細胞洗浄の操作を３回繰り返した。得られた細胞を所定の培地で懸濁し、ゼラチンコーティングした細胞培養皿にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地としては、１×１０−８Ｍ デキサメタゾン、５μｇ／ｍｌ インスリン、５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ セレン酸ナトリウム、及び２．５ｍＭ ニコチンアミドを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地と、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０８６５であるマウス間葉系細胞株を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで約２４時間培養した際の培養上清（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｆａｓｅｂ Ｊ．， １９， ｐ．１７８９−１７９７， ２００５．を参照）とを１：１で混合し、さらに１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍｌ カナマイシン硫酸を加えたものを用いた。
【００３３】
＜ヒト尿中落下細胞由来細胞株の作製＞
初代培養のヒト尿中落下細胞にＥＧＦＰ発現レトロウイルス（ｐＧＣＤＮｓａｍ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）を添加し、２４時間培養を行って感染させた。このウイルス感染は、後の解析を行いやすくするためのものである。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、同培地を加えてさらに１１日間培養を行った。その後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥がし、０．５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ 上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、５×１０−９Ｍ デキサメタゾン、２．５μｇ／ｍｌ インスリン、２．５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、２．５ｎｇ／ｍｌ セレン酸ナトリウム、１．２５ｍＭ ニコチンアミド、 １００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（３：１）培地（以下、増殖培地ともいう。）に懸濁し、新たな細胞培養皿に移して培養を続けた。
【００３４】
継代培養を繰り返してほぼ均一になった細胞株の１つ（ＨＵＥ２３３Ａ）は、敷石状形態の細胞からなる上皮様シートを形成し（図１）、また、コンフルエントになった後も培養を継続することによって細胞ドームの形成も確認された（図２）。図中のスケールバーは２００μｍである。これらのことから、この細胞株は初代培養のヒト尿中落下細胞と同様に腎臓尿細管細胞としての性質を有した細胞株であると考えられた。
【００３５】
一方、他の細胞株の１つ（ＨＵＥ２４１Ｂ）は、細胞間境界が不明瞭で、細胞同士の一部が重なり合っている部分も見られ、線維芽細胞様の形態（図示せず）であった。
【００３６】
＜ホルモン応答による細胞内ｃＡＭＰ量上昇の測定＞
細胞ドームの形成が観察されたことから、得られたＨＵＥ２３３Ａ細胞は生理機能を有した細胞であることが予想されたが、さらに詳しく調べるために、ネフロンの上皮細胞に特異的に働くホルモンに対する応答性を評価した。
【００３７】
ＨＵＥ２３３Ａ細胞をＥＧＦ含有の増殖培地でコンフルエントになるまで培養した後、ＥＧＦ不含有の増殖培地又はＭＣＳを含む培地に交換し、さらに２日間培養を続けた。１×１０−４Ｍ ３−イソブチル−１−メチル−キサンチン（シグマ）を含むＤＭＥＭに交換した後、１×１０−７Ｍ パラチロイドホルモン（ＰＴＨ；シグマ）又は１×１０−７Ｍ アルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ；シグマ）を添加してさらに１０分間、３７℃で静置した後、ｃＡＭＰ ＥＩＡシステム（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）を用いて細胞内のｃＡＭＰ濃度を測定した。結果を図３に示す。
【００３８】
図３から分かるように、ＥＧＦを含まない培地で培養した場合にはＰＴＨ添加によりその細胞内ｃＡＭＰ濃度が有意に上昇していたが、ＥＧＦを含む培地で培養した場合にはｃＡＭＰの上昇が見られなかった。これは、このＨＵＥ２３３Ａ細胞がその培地からＥＧＦを抜くことにより近位尿細管細胞様に分化したためと考えられる。一方、ＭＣＳを含む培地で培養した場合にはＡＶＰ添加に応答したｃＡＭＰ上昇が見られた。これは、このＨＵＥ２３３Ａ細胞が培地中のＭＣＳに反応して、集合管細胞様に分化したためと考えられる。このように、このＨＵＥ２３３Ａ細胞は培養条件を変えることにより、異なった種類の細胞へと分化誘導可能であった。
【００３９】
＜細胞傷害に応答したＮＡＧ分泌量の測定＞
ＥＧＦを含まない培地で培養したＨＵＥ２３３Ａ細胞において近位尿細管細胞様の細胞へと分化が見られたことから、この細胞を用いた薬物評価系モデルの構築を試みた。
【００４０】
ＨＵＥ２３３Ａ細胞を増殖培地（ＥＧＦ含有）でコンフルエントになるまで培養した後、ＥＧＦ不含有の増殖培地に交換してさらに２日間培養した。その後、シスプラチン、ＦＫ５０６（いずれもシグマ）、又はアクチノマイシンＤ（カルビオケム）を添加してさらに３６時間培養を行った後、Ｌ−タイプ ワコー（和光純薬工業）を用いて上清中のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）活性を測定した。ここで、シスプラチン及びＦＫ５０６はそれぞれ臨床現場で一般的に用いられる抗癌剤及び免疫抑制剤である。アクチノマイシンＤは一般的なアポトーシス誘導剤である。さらに、ヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２及びブタ近位尿細管由来細胞株ＬＬＣ−ＰＫ１についても同様の操作を行い、ＮＡＧ活性を比較する対照として用いた。シスプラチン、ＦＫ５０６、アクチノマイシンＤを用いた結果をそれぞれ図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
【００４１】
図４から分かるように、ＨＵＥ２３３Ａ細胞では、シスプラチン、ＦＫ５０６、又はアクチノマイシンＤの添加によりＮＡＧの培養上清中への分泌が見られた。また、ＮＡＧの分泌量は添加した各試薬に対して濃度依存性が見られた。一方、ＨＫ−２細胞及びＬＬＣ−ＰＫ１細胞では、ＮＡＧ分泌量の有意な上昇は見られなかった。この結果から、ＨＵＥ２３３Ａ細胞は、種々の薬物の尿細管細胞への細胞毒性を試験するための薬物評価系として応用可能であると考えられた。
【００４２】
＜マイクロアレイを用いた発現解析＞
初代培養の尿中落下細胞より樹立した上記細胞株（ＨＵＥ２３３Ａ、ＨＵＥ２４１Ｂ）、正常ヒト近位尿細管上皮細胞（ｈＲＰＴＥＣ；クロンテック）、腎癌由来細胞株（ＴＵＨＲ１４ＴＫＢ；理研ＢＲＣ）、大腸癌由来細胞株（Ｃａｃｏ２；ＡＴＣＣ）、ヒト近位尿細管由来細胞株（ＨＫ−２；ＡＴＣＣ）の各細胞をそれぞれ細胞培養皿で培養し、Ｔｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）及びＲＮｅａｓｙ（キアゲン）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡの単離を行った。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡについて、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ（アフィメトリクス）を用いて遺伝子発現量の解析・比較を行った。腎臓の各セグメントにおけるマーカー分子の遺伝子、トランスポーター遺伝子、コントロール遺伝子について発現量を測定した結果をそれぞれ表１〜表３に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
表１〜３から分かるように、ＨＵＥ２３３Ａ細胞の遺伝子発現パターンは、腎臓の各セグメントのマーカー遺伝子についてはＨＵＥ２４１Ｂ細胞やｈＲＰＴＥＣ細胞と類似していたが、細胞接着に重要な働きをするＥ−カドヘリンの発現量が優位に高く、上皮細胞としての機能が高さを裏付けていた。また、薬物輸送に関連するトランスポーター群については、ＡＢＣＢ１遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＢＣＣ１遺伝子（ＭＲＰ１）、ＡＢＣＣ３遺伝子（ＭＲＰ３）、ＡＢＣＣ４遺伝子（ＭＲＰ４）、ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子（ＯＡＴＰ１Ａ２）、ＳＬＣ２２Ａ４遺伝子（ＯＣＴＮ１）、ＳＬＣ２２Ａ５遺伝子（ＯＣＴＮ２）等を高発現しており、中でもＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量はＨＫ−２細胞の２３３倍と極めて高いことが分かった。この結果から、ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の高発現がＨＵＥ２３３Ａ細胞の高い薬物感受性に関わっていると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ヒト尿中落下細胞を培養することにより形成される上皮様シートを示す図である。
【図２】ヒト尿中落下細胞を培養することにより形成される細胞ドームを示す図である。
【図３】ＨＵＥ２３３Ａ細胞をＥＧＦ含有、ＥＧＦ不含有、ＭＣＳ含有の各培地で培養し、ＰＴＨ又はＡＶＰを添加したときの細胞中のｃＡＭＰ量を測定した結果を示す図である。
【図４】シスプラチン、ＦＫ５０６、又はアクチノマイシンＤの存在下で、ＨＵＥ２３３Ａ細胞、ＨＫ−２細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を培養したときのＮＡＧ活性を測定した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト腎臓細胞株、形質転換体、及び薬物評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患の治療には種々の薬物が用いられるが、それらの中には体内の組織・器官に副作用を及ぼすものも少なくない。特に腎臓は薬物代謝の主要臓器であり血液中の高濃度の薬物に曝されるため、薬物療法において大きな問題になっている。このため、創薬段階で腎毒性を評価することが重要である。また、創薬段階では、毒性評価に限らず、薬物に対する感受性評価を行うことも重要である。
【０００３】
従来、このような薬物評価は、マウス、ラット等の動物や、イヌ、ブタ等の腎臓細胞株を用いた実験によるところが大きく、ヒトの組織や細胞を用いた薬物評価系は存在しなかった。しかしながら、動物とヒトとでは各部位におけるタンパク質発現が異なるため、動物を用いた実験で得られた結果がヒトにも当てはまるとは限らない。例えばバソプレッシンは、ラットやウサギでは、集合管において水や尿素の透過性を高めるとともに集合管及びヘンレの上行脚においてナトリウムの再吸収を高める働きがあるが、ヒトでは、ヘンレの上行脚におけるナトリウムの再吸収への効果は見られないことが知られている（非特許文献１を参照）。そこで、ヒト細胞を用いた薬物評価系の構築が望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｕｇｇｌｅｓ， Ｂ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｙｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．， ６０， ｐ．９１４−９２１， １９８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、現在、複数のヒト腎臓細胞株が入手可能であるが、本件発明者らの研究によると、それらは薬物感受性が不十分であり、必ずしも薬物評価系の構築に適したものではなかった。
【０００６】
また、薬物によっては患者毎に感受性のばらつきが大きいものがあるため、テーラーメード医療に向けて投薬段階で薬物感受性評価を行うことも重要となる。患者毎の薬物評価系を構築することができれば、副作用に個人差のある薬物についても、投薬治療が容易になると期待される。
【０００７】
そこで本発明は、薬物感受性が高く薬物評価系の構築に好適なヒト腎臓細胞株及び形質転換体、並びにこれらの細胞を用いた薬物評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２が薬物感受性に大きく関与しており、このＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子を高発現しているヒト腎臓細胞株や、ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子をヒト腎臓細胞株に導入した形質転換体が薬物評価系の構築に好適であることを見出した。また、このようなヒト腎臓細胞株は被験者の尿中に含まれる腎臓細胞から樹立することができ、これにより患者毎の薬物評価系を構築できることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものであり、詳細には以下のとおりである。
【０００９】
（１） 有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２における発現量の１０倍以上であるヒト腎臓細胞株。
【００１０】
（２） ヒト尿中に含まれる腎臓細胞から樹立された（１）記載のヒト腎臓細胞株。
【００１１】
（３） 受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１５６１である（１）又は（２）記載のヒト腎臓細胞株。
【００１２】
（４） 有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量を指標として細胞を選別する工程を含むヒト腎臓細胞株の製造方法。
【００１３】
（５） 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡがヒト腎臓細胞株に導入された形質転換体。
（ａ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列と相同的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１４】
（６） 被検薬物の存在下で、（１）から（３）のいずれか記載のヒト腎臓細胞株、又は（５）記載の形質転換体を培養する工程と、前記ヒト腎臓細胞株又は前記形質転換体に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含む薬物評価方法。
【００１５】
（７） 被験者の尿中に含まれる腎臓細胞を培養する工程と、前記培養後の腎臓細胞から有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量を指標として特定の腎臓細胞を選別する工程と、被検薬物の存在下で前記特定の腎臓細胞を培養する工程と、前記被験者に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含む薬物評価方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ヒト腎臓細胞株や形質転換体を用いることにより、被検薬物の腎臓に対する毒性や、腎臓に対する作用をより正確に評価することができる。また、被験者の尿中に含まれる腎臓細胞からヒト腎臓細胞株を樹立することにより、患者毎の薬物評価系を構築することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
＜ヒト腎臓細胞株＞
本発明に係るヒト腎臓細胞株は、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２における発現量の１０倍以上である。この発現量は、２０倍以上が好ましく、５０倍以上がより好ましい。ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がＨＫ−２細胞の２２３倍であるヒト腎臓細胞株（後述するＨＵＥ２３３Ａ細胞）は、２００８年３月２８日付けで、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１５６１として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター中央第６）に寄託されている。
【００１８】
有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２は、小腸、肝臓、腎臓、血液脳関門において発現が知られているが、このＯＡＴＰ１Ａ２がヒト腎臓細胞の薬物感受性に関与していることは、本件発明者らによって明らかになったことである。このような有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子を高発現しているヒト腎臓細胞株を用いることにより、ヒト腎臓に対する被検薬物の作用（毒性、感受性等）をより正確に評価することができる。
【００１９】
＜ヒト腎臓細胞株の製造方法＞
本発明に係るヒト腎臓細胞株の製造方法は、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い細胞を選別する工程を含むものである。
【００２０】
ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量を測定するには、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡやｍＲＮＡを抽出し、ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法等によって増幅産物を得ればよい。このようにして発現量を測定した後、発現量が多い細胞を選別することで、薬物感受性の高いヒト腎臓細胞株を得ることができる。
【００２１】
＜形質転換体＞
本発明に係る形質転換体は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡがヒト腎臓細胞株に導入されたものである。
（ａ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列と相同的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２２】
上記（ａ）のＤＮＡは、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子に相当する。このＳＬＣ２１Ａ３遺伝子のｍＲＮＡ配列は公知であり、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録番号ＮＭ＿１３４４３１で登録されている。また、上記（ｂ）のＤＮＡは、上記（ａ）のＤＮＡの変異体やホモログのうち、ＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするものに相当する。
【００２３】
ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、対象とするＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を採用することにより取得できるＤＮＡを意味する。例えば、コロニーやプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルタを使用し、０．７〜１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６５℃の条件下でフィルタを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等が挙げられる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．， １９８９等を参照）。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列の、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列との相同性は、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましい。
【００２４】
上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調製する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法が挙げられる。
【００２５】
本発明に係る形質転換体を得るには、上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを適当な発現ベクター（例えば、アデノウイルス系ベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築し、この発現ベクターでヒト腎臓細胞株を形質転換すればよい。
【００２６】
有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２はヒト腎臓細胞の薬物感受性に関与していることが本件発明者らによって明らかになっているため、このような形質転換体を用いることにより、ヒト腎臓に対する被検薬物の作用（毒性、感受性等）をより正確に評価することができる。
【００２７】
＜第１の薬物評価方法＞
本発明に係る第１の薬物評価方法は、被検薬物の存在下で、本発明に係るヒト腎臓細胞株、又は本発明に係る形質転換体を培養する工程と、上記ヒト腎臓細胞株又は上記形質転換体に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含むものである。
【００２８】
上記のように、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２はヒト腎臓細胞の薬物感受性に関与していることが本件発明者らによって明らかになっているため、被検薬物を本発明に係るヒト腎臓細胞株、又は本発明に係る形質転換体に接触させることにより、被検薬物の腎臓に対する毒性や、腎臓に対する作用を評価することができる。また、有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２を介した薬物動態や細胞内シグナル伝達の研究を行うこともできる。
【００２９】
＜第２の薬物評価方法＞
本発明に係る第２の薬物評価方法は、被験者の尿中に含まれる腎臓細胞を培養する工程と、培養後の腎臓細胞から有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い特定の腎臓細胞を選別する工程と、被検薬物の存在下で上記特定の腎臓細胞を培養する工程と、被験者に対する上記被検薬物の作用を評価する工程と、を含むものである。
【００３０】
被験者の尿中に含まれる腎臓細胞を培養する際には、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに国際寄託されている受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０８６５のマウス間葉系細胞、又はその細胞を血清含有培地中で培養して得られる培養上清を培地に加えておくことが好ましい。これにより、増殖能に優れた前駆的な腎臓細胞を効率よく得ることができる。さらに、培養後の腎臓細胞から有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い特定の腎臓細胞を選別することにより薬物感受性に優れた腎臓細胞を得ることができるため、この細胞を用いることで、被験者個々人に対する薬物感受性評価や副作用評価をより正確に行うことができる。特に、この薬物評価方法では被験者の尿中から腎臓細胞を得ているため、侵襲性が低く好ましい。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００３２】
＜ヒト尿中落下細胞の初代培養＞
生体腎移植患者の尿を４℃、１０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、上清を除去した後、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭで懸濁し、再度遠心分離して上清を除去した。この懸濁、遠心分離、上清除去による細胞洗浄の操作を３回繰り返した。得られた細胞を所定の培地で懸濁し、ゼラチンコーティングした細胞培養皿にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地としては、１×１０−８Ｍ デキサメタゾン、５μｇ／ｍｌ インスリン、５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ セレン酸ナトリウム、及び２．５ｍＭ ニコチンアミドを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地と、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０８６５であるマウス間葉系細胞株を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで約２４時間培養した際の培養上清（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｆａｓｅｂ Ｊ．， １９， ｐ．１７８９−１７９７， ２００５．を参照）とを１：１で混合し、さらに１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍｌ カナマイシン硫酸を加えたものを用いた。
【００３３】
＜ヒト尿中落下細胞由来細胞株の作製＞
初代培養のヒト尿中落下細胞にＥＧＦＰ発現レトロウイルス（ｐＧＣＤＮｓａｍ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）を添加し、２４時間培養を行って感染させた。このウイルス感染は、後の解析を行いやすくするためのものである。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、同培地を加えてさらに１１日間培養を行った。その後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥がし、０．５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ 上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、５×１０−９Ｍ デキサメタゾン、２．５μｇ／ｍｌ インスリン、２．５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、２．５ｎｇ／ｍｌ セレン酸ナトリウム、１．２５ｍＭ ニコチンアミド、 １００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（３：１）培地（以下、増殖培地ともいう。）に懸濁し、新たな細胞培養皿に移して培養を続けた。
【００３４】
継代培養を繰り返してほぼ均一になった細胞株の１つ（ＨＵＥ２３３Ａ）は、敷石状形態の細胞からなる上皮様シートを形成し（図１）、また、コンフルエントになった後も培養を継続することによって細胞ドームの形成も確認された（図２）。図中のスケールバーは２００μｍである。これらのことから、この細胞株は初代培養のヒト尿中落下細胞と同様に腎臓尿細管細胞としての性質を有した細胞株であると考えられた。
【００３５】
一方、他の細胞株の１つ（ＨＵＥ２４１Ｂ）は、細胞間境界が不明瞭で、細胞同士の一部が重なり合っている部分も見られ、線維芽細胞様の形態（図示せず）であった。
【００３６】
＜ホルモン応答による細胞内ｃＡＭＰ量上昇の測定＞
細胞ドームの形成が観察されたことから、得られたＨＵＥ２３３Ａ細胞は生理機能を有した細胞であることが予想されたが、さらに詳しく調べるために、ネフロンの上皮細胞に特異的に働くホルモンに対する応答性を評価した。
【００３７】
ＨＵＥ２３３Ａ細胞をＥＧＦ含有の増殖培地でコンフルエントになるまで培養した後、ＥＧＦ不含有の増殖培地又はＭＣＳを含む培地に交換し、さらに２日間培養を続けた。１×１０−４Ｍ ３−イソブチル−１−メチル−キサンチン（シグマ）を含むＤＭＥＭに交換した後、１×１０−７Ｍ パラチロイドホルモン（ＰＴＨ；シグマ）又は１×１０−７Ｍ アルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ；シグマ）を添加してさらに１０分間、３７℃で静置した後、ｃＡＭＰ ＥＩＡシステム（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）を用いて細胞内のｃＡＭＰ濃度を測定した。結果を図３に示す。
【００３８】
図３から分かるように、ＥＧＦを含まない培地で培養した場合にはＰＴＨ添加によりその細胞内ｃＡＭＰ濃度が有意に上昇していたが、ＥＧＦを含む培地で培養した場合にはｃＡＭＰの上昇が見られなかった。これは、このＨＵＥ２３３Ａ細胞がその培地からＥＧＦを抜くことにより近位尿細管細胞様に分化したためと考えられる。一方、ＭＣＳを含む培地で培養した場合にはＡＶＰ添加に応答したｃＡＭＰ上昇が見られた。これは、このＨＵＥ２３３Ａ細胞が培地中のＭＣＳに反応して、集合管細胞様に分化したためと考えられる。このように、このＨＵＥ２３３Ａ細胞は培養条件を変えることにより、異なった種類の細胞へと分化誘導可能であった。
【００３９】
＜細胞傷害に応答したＮＡＧ分泌量の測定＞
ＥＧＦを含まない培地で培養したＨＵＥ２３３Ａ細胞において近位尿細管細胞様の細胞へと分化が見られたことから、この細胞を用いた薬物評価系モデルの構築を試みた。
【００４０】
ＨＵＥ２３３Ａ細胞を増殖培地（ＥＧＦ含有）でコンフルエントになるまで培養した後、ＥＧＦ不含有の増殖培地に交換してさらに２日間培養した。その後、シスプラチン、ＦＫ５０６（いずれもシグマ）、又はアクチノマイシンＤ（カルビオケム）を添加してさらに３６時間培養を行った後、Ｌ−タイプ ワコー（和光純薬工業）を用いて上清中のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）活性を測定した。ここで、シスプラチン及びＦＫ５０６はそれぞれ臨床現場で一般的に用いられる抗癌剤及び免疫抑制剤である。アクチノマイシンＤは一般的なアポトーシス誘導剤である。さらに、ヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２及びブタ近位尿細管由来細胞株ＬＬＣ−ＰＫ１についても同様の操作を行い、ＮＡＧ活性を比較する対照として用いた。シスプラチン、ＦＫ５０６、アクチノマイシンＤを用いた結果をそれぞれ図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
【００４１】
図４から分かるように、ＨＵＥ２３３Ａ細胞では、シスプラチン、ＦＫ５０６、又はアクチノマイシンＤの添加によりＮＡＧの培養上清中への分泌が見られた。また、ＮＡＧの分泌量は添加した各試薬に対して濃度依存性が見られた。一方、ＨＫ−２細胞及びＬＬＣ−ＰＫ１細胞では、ＮＡＧ分泌量の有意な上昇は見られなかった。この結果から、ＨＵＥ２３３Ａ細胞は、種々の薬物の尿細管細胞への細胞毒性を試験するための薬物評価系として応用可能であると考えられた。
【００４２】
＜マイクロアレイを用いた発現解析＞
初代培養の尿中落下細胞より樹立した上記細胞株（ＨＵＥ２３３Ａ、ＨＵＥ２４１Ｂ）、正常ヒト近位尿細管上皮細胞（ｈＲＰＴＥＣ；クロンテック）、腎癌由来細胞株（ＴＵＨＲ１４ＴＫＢ；理研ＢＲＣ）、大腸癌由来細胞株（Ｃａｃｏ２；ＡＴＣＣ）、ヒト近位尿細管由来細胞株（ＨＫ−２；ＡＴＣＣ）の各細胞をそれぞれ細胞培養皿で培養し、Ｔｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）及びＲＮｅａｓｙ（キアゲン）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡの単離を行った。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡについて、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ（アフィメトリクス）を用いて遺伝子発現量の解析・比較を行った。腎臓の各セグメントにおけるマーカー分子の遺伝子、トランスポーター遺伝子、コントロール遺伝子について発現量を測定した結果をそれぞれ表１〜表３に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
表１〜３から分かるように、ＨＵＥ２３３Ａ細胞の遺伝子発現パターンは、腎臓の各セグメントのマーカー遺伝子についてはＨＵＥ２４１Ｂ細胞やｈＲＰＴＥＣ細胞と類似していたが、細胞接着に重要な働きをするＥ−カドヘリンの発現量が優位に高く、上皮細胞としての機能が高さを裏付けていた。また、薬物輸送に関連するトランスポーター群については、ＡＢＣＢ１遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＢＣＣ１遺伝子（ＭＲＰ１）、ＡＢＣＣ３遺伝子（ＭＲＰ３）、ＡＢＣＣ４遺伝子（ＭＲＰ４）、ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子（ＯＡＴＰ１Ａ２）、ＳＬＣ２２Ａ４遺伝子（ＯＣＴＮ１）、ＳＬＣ２２Ａ５遺伝子（ＯＣＴＮ２）等を高発現しており、中でもＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量はＨＫ−２細胞の２３３倍と極めて高いことが分かった。この結果から、ＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の高発現がＨＵＥ２３３Ａ細胞の高い薬物感受性に関わっていると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ヒト尿中落下細胞を培養することにより形成される上皮様シートを示す図である。
【図２】ヒト尿中落下細胞を培養することにより形成される細胞ドームを示す図である。
【図３】ＨＵＥ２３３Ａ細胞をＥＧＦ含有、ＥＧＦ不含有、ＭＣＳ含有の各培地で培養し、ＰＴＨ又はＡＶＰを添加したときの細胞中のｃＡＭＰ量を測定した結果を示す図である。
【図４】シスプラチン、ＦＫ５０６、又はアクチノマイシンＤの存在下で、ＨＵＥ２３３Ａ細胞、ＨＫ−２細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を培養したときのＮＡＧ活性を測定した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２における発現量の１０倍以上であるヒト腎臓細胞株。
【請求項２】
ヒト尿中に含まれる腎臓細胞から樹立された請求項１記載のヒト腎臓細胞株。
【請求項３】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１５６１である請求項１又は２記載のヒト腎臓細胞株。
【請求項４】
有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い細胞を選別する工程を含むヒト腎臓細胞株の製造方法。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡがヒト腎臓細胞株に導入された形質転換体。
（ａ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列と相同的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
被検薬物の存在下で、請求項１から３のいずれか記載のヒト腎臓細胞株、又は請求項５記載の形質転換体を培養する工程と、
前記ヒト腎臓細胞株又は前記形質転換体に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含む薬物評価方法。
【請求項７】
被験者の尿中に含まれる腎臓細胞を培養する工程と、
前記培養後の腎臓細胞から有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い特定の腎臓細胞を選別する工程と、
被検薬物の存在下で前記特定の腎臓細胞を培養する工程と、
前記被験者に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含む薬物評価方法。
【請求項１】
有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現量がヒト近位尿細管由来細胞株ＨＫ−２における発現量の１０倍以上であるヒト腎臓細胞株。
【請求項２】
ヒト尿中に含まれる腎臓細胞から樹立された請求項１記載のヒト腎臓細胞株。
【請求項３】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１５６１である請求項１又は２記載のヒト腎臓細胞株。
【請求項４】
有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い細胞を選別する工程を含むヒト腎臓細胞株の製造方法。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡがヒト腎臓細胞株に導入された形質転換体。
（ａ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードする塩基配列と相同的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＡＴＰ１Ａ２の生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
被検薬物の存在下で、請求項１から３のいずれか記載のヒト腎臓細胞株、又は請求項５記載の形質転換体を培養する工程と、
前記ヒト腎臓細胞株又は前記形質転換体に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含む薬物評価方法。
【請求項７】
被験者の尿中に含まれる腎臓細胞を培養する工程と、
前記培養後の腎臓細胞から有機アニオントランスポーターＯＡＴＰ１Ａ２をコードするＳＬＣ２１Ａ３遺伝子の発現が高い特定の腎臓細胞を選別する工程と、
被検薬物の存在下で前記特定の腎臓細胞を培養する工程と、
前記被験者に対する前記被検薬物の作用を評価する工程と、を含む薬物評価方法。
【図３】
【図４】
【図１】
【図２】
【図４】
【図１】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２６１３１５（Ｐ２００９−２６１３１５Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１４４９５（Ｐ２００８−１１４４９５）
【出願日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、文部科学省、科学技術試験研究「再生医療の実現化プロジェクト」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、文部科学省、科学技術試験研究「再生医療の実現化プロジェクト」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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