ヒトＩＬ−１３に結合特異性を有する抗体分子
ヒトＩＬ−１３の抗原決定基に特異性を有する抗体分子、該抗体分子の治療的使用、及び該抗体分子を産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１３抗体及びその断片、例えばその結合断片、それを含む組成物に関し、具体的には、喘息、アレルギー、ＣＯＰＤ、線維症、及び／又は癌を含む種々の疾患の予防及び／又は治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１３は、ＩＬ−４と２５％の配列同一性を共有する短鎖サイトカインである。ＩＬ−１３は、約１３２個のアミノ酸を含み、残基１０〜２１（ヘリックスＡ）、残基４３〜５２（ヘリックスＢ）、残基６１〜６９（ヘリックスＣ）、及び残基９２〜１１０（ヘリックスＤ）の４つのヘリックス、並びに残基３３〜３６及び残基８７〜９０の２つのβ鎖を有する二次構造を形成する。ＩＬ−１３の溶液構造は判明され、ＩＬ−４で観察されてもいる、予期されたアップ−アップ−ダウン−ダウンの４つのヘリックス束の立体構造を示す（Ｅｉｓｅｎｍｅｓｓｅｒ ２００１）。
【０００３】
ヒトＩＬ−１３は、活性化Ｔ細胞からクローニングされた１７ｋＤａの糖タンパク質であり（Ｚｕｒａｗｓｋｉ及びｄｅ Ｖｒｉｅｓ １９９４ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １５ １９−２６）、Ｔｈ２系統の活性化Ｔ細胞によって産生されるが、Ｔｈ０及びＴｈ１ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、並びに肥満細胞などのいくつかの非Ｔ細胞集団もまたＩＬ−１３を産生する（Ｚｕｒａｗｓｋｉ及びｄｅ Ｖｒｉｅｓ １９９４ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １５ １９−２６）。
【０００４】
ＩＬ−１３の機能としては以下が挙げられる：
・ヒトＢ細胞におけるＩｇＥへの免疫グロブリンアイソタイプスイッチング（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ａｖｅｒｓａら １９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０ ３７３０−４）、及び
・ヒトとマウスの両方における炎症性サイトカイン産生の抑制（ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ，Ｆｉｇｄｏｒら １９９３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１ ６３７０−８１；Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｋａｓｔｅｌｅｉｎら １９９３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１ ７１５１−６０）。
【０００５】
ＩＬ−１３は、その細胞表面受容体であるＩＬ−１３Ｒアルファ１及びＩＬ−１３Ｒアルファ２に結合する。ＩＬ−１３Ｒアルファ１は、ＩＬ−１３と低親和性（ＫＤ約１０ｎＭ）で相互作用し、続いてＩＬ−４Ｒａを動員して、高親和性（ＫＤ約０．４ｎＭ）のシグナル伝達ヘテロ二量体受容体複合体を形成する（Ａｍａｎ，Ｔａｙｅｂｉら １９９６ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１ ２９２６５−７０；Ｈｉｌｔｏｎ，Ｚｈａｎｇら １９９６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３ ４９７−５０１）。
【０００６】
ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒアルファ１複合体は、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、樹枝状細胞、好酸球、好塩基球、線維芽細胞、内皮細胞、気道上皮細胞、及び気道平滑筋細胞などの多数の細胞型上で発現される（Ｇｒａｂｅｒ，Ｇｒｅｔｅｎｅｒら １９９８ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８ ４２８６−９８；Ｍｕｒａｔａ，Ｈｕｓａｉｎら １９９８ Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０ １１０３−１０；Ａｋａｉｗａ，Ｙｕら ２００１ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １３ ７５−８４）。
【０００７】
ＩＬ−１３Ｒアルファ１／ＩＬ−４Ｒ受容体複合体の連結は、シグナル伝達性転写活性化因子（ＳＴＡＴ６）を含む様々なシグナル伝達経路、及びインスリン受容体基質−２（ＩＲＳ−２）経路の活性化をもたらす（Ｗａｎｇ，Ｍｉｃｈｉｅｌｉら １９９５ Ｂｌｏｏｄ ８６４２１８−２７；Ｔａｋｅｄａ，Ｋａｍａｎａｋａら １９９６ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７ ３２２０−２）。
【０００８】
ＩＬ−１３Ｒアルファ２鎖は単独でＩＬ−１３に対して高親和性（ＫＤ約０．２５〜０．４ｎＭ）を有し、ＩＬ−１３結合を負に制御するデコイ受容体（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｗｈｉｔｔｅｒｓら １９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１ ２３１７−２４）としても、マクロファージ及び場合によっては他の細胞型においてＡＰ−Ｉ経路を介したＴＧＦ−β合成及び線維症を誘導するシグナル伝達受容体（Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌ，Ｓｔｒｏｂｅｒら ２００６ Ｎａｔ Ｍｅｄ １２ ９９−１０６）としても機能する。
【０００９】
喘息の前臨床動物モデルにおいて実施されたいくつかの研究によれば、ＩＬ−１３は喘息において重要な役割を果たすことが示されている。これらのデータとしては、ＩＬ−１３ノックアウトマウスにおける喘息に対する抵抗性、並びに種々のマウスモデルにおけるＩＬ−１３アンタゴニスト（可溶性ＩＬ−１３受容体、抗ＩＬ−１３ ｍＡｂなど）を用いた喘息表現型の阻害などが挙げられる（ＳｅＩａ １９９９ Ｈａｒｅｆｕａｈ １３７ ３１７−９；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ及びＣｈｉａｒａｍｏｎｔｅ ２００３ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ ９ ２１−７；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ ２００４ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０２ １７５−９０）。複数の研究によれば、マウス及びモルモットの肺に組換えＩＬ−１３を薬理学的に投与すると、気道粘液の分泌過多、好酸球増加症及びＡＨＲが誘導されることが示されている（Ｇｒｕｎｉｇ，Ｗａｒｎｏｃｋら １９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２２６１−３；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｌｕｙｉｍｂａｚｉら １９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２２５８−６１；Ｋｉｂｅ，Ｉｎｏｕｅら ２００３ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６７ ５０−６；Ｖａｒｇａｆｔｉｇ及びＳｉｎｇｅｒ ２００３ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８４ Ｌ２６０−９；Ｖａｒｇａｆｔｉｇ及びＳｉｎｇｅｒ ２００３ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８ ４１０−９）。
【００１０】
ＩＬ−１３のこれらの効果は、ＩＬ−１３の恒常的又は誘導性発現のいずれかを有するトランスジェニックマウス系において再現される（Ｚｈｕ，Ｈｏｍｅｒら １９９９ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０３ ７７９−８８；Ｚｈｕ，Ｌｅｅら ２００１ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６４ Ｓ６７−７０；Ｌａｎｏｎｅ，Ｚｈｅｎｇら ２００２ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０４６３−７４）。また、遺伝子導入によるＩＬ−１３の慢性的過剰発現は、上皮下の線維症及び気腫も誘導する。ＩＬ−１３（及びＩＬ−４）シグナル伝達分子のＳＴＡＴ６を欠くマウスは、アレルゲン誘導のＡＨＲ及び粘液過剰産生を示さない（Ｋｕｐｅｒｍａｎ，Ｈｕａｎｇら ２００２ Ｎａｔ Ｍｅｄ ８ ８８５−９）。可溶性ＩＬ−１３受容体融合タンパク質（ｓＤＬ−１３Ｒアルファ２Ｆｃ）を用いた研究は、アレルゲン卵白アルブミン（ＯＶＡ）誘導の実験的気道疾患におけるこのサイトカインの極めて重要な役割を示している（Ｇｒｕｎｉｇ，Ｗａｒｎｏｃｋら １９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２２６１−３；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｌｕｙｉｍｂａｚｉら １９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２２５８−６１；Ｔａｕｂｅ，Ｄｕｅｚら ２００２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９ ６４８２−９）。
【００１１】
また、抗ＩＬ−１３治療の有効性がマウス喘息の慢性モデルで示された。粘液の分泌過多及びＡＨＲの特徴を示すことに加えて、この慢性喘息モデルは、より急性なモデルにおいては欠いている、ヒト疾患のいくつかの顕著な特徴を示す。これらには、上皮空間に位置する肺組織の好酸球増加症、及びコラーゲン沈着の増加によって測定される平滑筋線維症などが挙げられる。慢性喘息モデルは、ＯＶＡによって感作されたマウスにおいて、週１回、計４週間のＯＶＡのエアロゾル接種を繰り返すことによって誘導される。（有効性の読み出しは試験の５３日目に評価され、３６日目から）ＯＶＡ接種の最後の２週間に投与された抗ＩＬ−１３抗体は、ＡＨＲ、肺炎症、杯細胞過形成、粘液分泌過多、及び気道線維症を有意に阻害した（Ｙａｎｇ，Ｌｉら ２００５ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ）。
【００１２】
また、ＩＬ−１３アンタゴニストの治療効果は、喘息の霊長類モデルにおいてＡＨＲを阻害することも示された（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ２００５）。
【００１３】
疾患の重症度と相関する高レベルのＩＬ−１３のｍＲＮＡ及びタンパク質が喘息患者の肺において検出され、ＩＬ−１３はヒト喘息の病原に関係している（Ｈｕａｎｇ，Ｘｉａｏら １９９５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５ ２６８８−９４）。さらに、ＩＬ−１３レベルの上昇をもたらすヒトＩＬ−１３遺伝的多型が確認され、喘息及びアトピーと関連し（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，Ｍａｏら ２０００ Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ９ ５４９−５９；Ｈｏｅｒａｕｆ，Ｋｒｕｓｅら ２００２ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ４ ３７−４２；Ｖｅｒｃｅｌｌｉ ２００２ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２ ３８９−９３；Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，Ｊｅｒｋｉｃら ２００３ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１２ ７３５−９；Ｃｈｅｎ，Ｅｒｉｃｋｓｅｎら ２００４ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１４ ５５３−６０；Ｖｌａｄｉｃｈ，Ｂｒａｚｉｌｌｅら ２００５ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、上昇したＩＬ−１３レベルは、喘息患者の肺において検出されている（Ｈｕａｎｇ，Ｘｉａｏら １９９５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５ ２６８８−９４；Ａｒｉｍａ，Ｕｍｅｓｈｉｔａ−Ｓｕｙａｍａら ２００２ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０９ ９８０−７；Ｂｅｒｒｙ，Ｐａｒｋｅｒら ２００４ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１４ １１０６−９）。また、より高い血漿ＩＬ−１３レベルを生じるＩＬ−１３遺伝子の多形を有する個体は、アトピー及び喘息のリスクが高く、ＩＬ−１３と喘息の遺伝的関連性も示されている（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ ２０００ Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ １ １９−２３）。
【００１４】
多様なヒト障害におけるヒトＩＬ−１３の役割に起因して、治療戦略はＩＬ−１３活性を阻害又は相殺するように設計される。特に、ＩＬ−１３に結合して中和する抗体は、ＩＬ−１３活性を阻害する手段として探し求められている。しかしながら、ＩＬ−１３、特にヒトＩＬ−１３に結合できる適切な及び／又は改善された抗体が当該技術分野では必要とされる。特に、抗体はヒトＩＬ−１３を中和することができる。本発明は、ヒトＩＬ−１３に結合可能であり、高親和性で結合可能であり、ヒトＩＬ−１３に結合して中和可能である、結合タンパク質、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、及びそれらの断片の新規ファミリーを提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、新規なＩＬ−１３特異的抗体及び断片、例えば、そのＩＬ−１３結合断片、特に中和抗体及び断片に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】重鎖（ＣＤＲ Ｈ）のＣＤＲ１、２、３、及び軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）のＣＤＲ１、２、３の各々についてのアミノ酸配列、 ラット抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 ラット抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列を示す。
【図２】シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、 ラット抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、 ラット抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列、及び シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖についてのアミノ酸配列を示す。
【図３】シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖についてのＤＮＡ配列、 ラット抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 ラット抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列を示す。
【図４】シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び ラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列を示す。
【図５】ラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列、及びシグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列を示す。
【図６】シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列を示す。
【図７】ヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 ヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、を示す。
【図８】ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、及び シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列を示す。
【図９】ヒト化抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 ヒト化抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、を示す。
【図１０】ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、及び ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列を示す。
【図１１】ヒトＶＫ １ ２−１−（１）０２ ＪＫ４アクセプターフレームワーク及びＶＨ２ ３−１ ２−２６ ＪＨ４アクセプターフレームワークについてのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示す。
【図１２】ラットに関する軽鎖、アクセプターフレームワーク、並びにヒト化軽鎖及びさらに重鎖のアラインメントを示す。ＣＤＲは、ボールド体であり、下線が付されている。ドナー残基Ｇ４９及びＲ７１は、ボールド体であり、イタリック体であり、反転表示されている。
【図１３】アレルゲン接種後の２４時間で測定されたＢＡＬエオタキシン−３に対するＡｂ６５２の効果。データは、平均±ＳＥＭで表され、１群あたりｎ＝４〜８である。
【図１４】アレルゲン接種後の２４時間で測定されたＢＡＬ好酸球数に対するＡｂ６５２の効果。データは、研究のスクリーニング段階で測定されたＢＡＬ好酸球数に対して標準化されている。平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜８／群。
【図１５】アレルゲン接種後の１５分までに測定された最大気道抵抗に対するＡｂ６５２の効果。データは、平均±ＳＥＭとして表される。ｎ＝４〜８／群。
【図１６】アレルゲン接種後の２４時間で測定された気道抵抗に対するＡｂ６５２の効果。データは、アレルゲンに暴露される前に測定された気道抵抗に対して標準化されている。平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜８／群。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
抗体可変ドメインにおける残基は、通常、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号付けされる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、米国保健社会福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以後、「Ｋａｂａｔら（前述）」）に記載されている。特に明記しない場合は、この番号付けシステムが本明細書において使用される。
【００１８】
Ｋａｂａｔ残基表記法は、アミノ酸残基の線形番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の線形アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであっても相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても、構造成分の短縮又はそこへの挿入に対応して、厳密なＫａｂａｔ番号付けの場合よりも少ない又は多いアミノ酸を含んでもよい。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同性の残基を「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とアラインメントすることにより、所定の抗体について決定してもよい。
【００１９】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置している。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７））によると、ＣＤＲ−Ｈ１に同等なループは残基２６から残基３２に伸びる。このようにして、「ＣＤＲ−Ｈ１」は、本明細書中で使用するとき、Ｋａｂａｔ番号付けシステムとＣｈｏｔｈｉａの位相的ループ定義の組み合わせによって記載すると、残基２６〜３５を含む。
【００２０】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うと、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置される。
【００２１】
一実施形態では、抗体はアンタゴニスト抗体である。
【００２２】
本明細書中で使用するとき、用語「アンタゴニスト抗体」とは、例えば、ＩＬ−１３によるＩＬ−１３受容体への結合をブロックするか又は実質的にその結合を減少させ、したがって、この受容体の活性化を阻害することによって、ＩＬ−１３の生物学的シグナル伝達活性を阻害及び／又は中和することができる抗体を表す。
【００２３】
本発明に使用するための抗体は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いて得られてもよい。ＩＬ−１３を含有する融合ポリペプチドを含むＩＬ−１３ポリペプチド、又は該ポリペプチドを（組換え的に）発現している細胞は、ＩＬ−１３を特異的に認識する抗体を産生するために用いることができる。ＩＬ−１３ポリペプチドは、「成熟な」ポリペプチド又は生物学的に活性なその断片若しくは誘導体であってもよい。ＩＬ−１３ポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当該技術分野において周知な方法によって調製されてもよく、又は天然の生物学的供給源から回収されてもよい。本出願では、用語「ポリペプチド」には、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が含まれる。これらは、他に明記されていなければ、相互交換して用いられる。ＩＬ−１３ポリペプチドは、ある場合には、例えばアフィニティータグに融合された融合タンパク質などの巨大タンパク質の一部であってもよい。
【００２４】
ＩＬ−１３ポリペプチドに対して生じた抗体は、動物の免疫付与が必要な場合は、周知であり日常的なプロトコールを用いて動物に、好ましくは非ヒト動物に該ポリペプチドを投与することによって得ることができ、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編），Ｖｏｌ ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６を参照されたい。多数の温血動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタを免疫してもよい。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが、一般的には最も適切である。
【００２５】
本発明に使用するための抗体は、全抗体及び機能的に活性なその断片又は誘導体を含み、限定されないが、モノクローナル、ヒト化された、完全なヒト又はキメラ抗体であってもよい。
【００２６】
モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって調製されてもよく、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，７７−９６頁，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が挙げられる。
【００２７】
また、本発明に使用するための抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３−７８４８；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７によって報告されている方法によって、特異的抗体を産生するために選択される単一のリンパ球から生じさせた免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによる単一のリンパ球抗体法を用いて生じさせてもよい。
【００２８】
抗体のスクリーニングは、ＩＬ−１３への結合を測定するアッセイ、及び／又は１若しくは複数のＩＬ−１３の受容体へのＩＬ−１３の結合をブロックする能力を測定するアッセイを用いて行うことができる。結合アッセイの例としては、例えば、プレートに固相化されたＩＬ−１３の融合タンパク質を用い、ＩＬ−１３に結合した抗ＩＬ−１３抗体を検出するためのコンジュゲートされた二次抗体を使用するＥＬＩＳＡが挙げられる。ブロッキングアッセイの例としては、ＩＬ−１３Ｒに結合しているＩＬ−１３リガンドタンパク質のブロッキングを測定する、フローサイトメトリーに基づくアッセイが挙げられる。蛍光標識した二次抗体を用いて、ＩＬ−１３Ｒに結合しているＩＬ−１３リガンドタンパク質の量を検出する。
【００２９】
ヒト化抗体（ＣＤＲグラフト抗体を含む）は、非ヒト種由来の１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基を移すことが単に必要なだけであり得ることは理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、場合により、ＣＤＲに由来する非ヒト種由来の１又は複数のフレームワーク残基をさらに含んでもよい。
【００３０】
キメラ抗体は、２つの異なる種に由来する成分から構成され、その結果、その成分は、それが由来する種の特徴を保持する。一般に、キメラ抗体は、１つの種、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は類似物由来の可変領域、ヒトなどの別の種由来の定常領域を含む。
【００３１】
また、本明細書に使用するための抗体は、当該技術分野において知られている様々なファージディスプレイ法によって生じさせることができ、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１−５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７−１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２−９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ，１９９７ １８７ ９−１８）、Ｂｕｒｔｏｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１−２８０）、及びＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；並びにＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８に開示された方法が挙げられる。
【００３２】
完全なヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、全てヒト起源であるか、又はヒト起源の配列と実質的に同一であるが、必ずしも同抗体由来でなくてもよい抗体である。完全なヒト抗体の例には、例えば、上記されるファージディスプレイ法によって産生される抗体、マウス免疫グロブリン可変領域遺伝子及び任意の定常領域の遺伝子が、それらのヒト対応物によって置換された、マウスによって産生される抗体が挙げられ、例えば、一般論として、ＥＰ０５４６０７３、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４、及びＥＰ０４６３１５１に報告されている。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、重鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１について図１の配列番号１に示される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列を有するＣＤＲ、及び／又はＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を有するＣＤＲを含む、上記アンタゴニスト抗体を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、重鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも２つは、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列から選択される、上記アンタゴニスト抗体を提供する。例えば、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号１に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２に示される配列を有する重鎖を含んでもよい。或いは、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号１に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号３に示される配列を有する重鎖を含んでもよく、又は抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号３に示される配列を有する重鎖を含んでもよい。疑いを避けるために、あらゆる置き換えを含むことが理解される。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、重鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含む、上記アンタゴニスト抗体を提供する。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について図１の配列番号４に示される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列を有するＣＤＲ、及び／又はＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を有するＣＤＲを含む、上記アンタゴニスト抗体を提供する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも２つは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列から選択される、上記アンタゴニスト抗体を提供する。例えば、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号４に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号５に示される配列を有する軽鎖を含んでもよい。或いは、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号４に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６に示される配列を有する軽鎖を含んでもよく、又は抗体は、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号５に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６に示される配列を有する軽鎖を含んでもよい。疑いを避けるために、あらゆる置き換えを含むことが理解される。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を含む、上記アンタゴニスト抗体を提供する。
【００３９】
本発明の抗体分子は、適切には、それぞれ相補的軽鎖又は相補的重鎖を含む。
【００４０】
したがって、一実施形態では、本発明に係る抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及び／又はＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及び／又はＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を含む。
【００４１】
ＩＬ−１３に結合し、ＩＬ−１３活性を中和する抗体の能力が著しく変更されなければ、本発明によって提供されるＣＤＲに対して、１又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失がなされてもよいことは理解されよう。アミノ酸の置換、付加及び／又は欠失のいずれによる影響も、例えば、本明細書中に記載されている方法、特に実施例に示された方法を用いて、当業者によって容易に試験され、ＩＬ−１３結合及びＩＬ−１３／ＩＬ−１３受容体相互作用の阻害を決定することができる。
【００４２】
したがって、本発明は、ＣＤＲＨ−１（配列番号１）、ＣＤＲＨ−２（配列番号２）、ＣＤＲＨ−３（配列番号３）、ＣＤＲＬ−１（配列番号４）、ＣＤＲＬ−２（配列番号５）、及びＣＤＲＬ−３（配列番号６）から選択される１又は複数のＣＤＲを含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有する抗体であって、ＣＤＲの１又は複数における１又は複数のアミノ酸が、別のアミノ酸、例えば、以下の本明細書に定義される類似のアミノ酸で置換されている、上記抗体を提供する。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、ＣＤＲＨ−１（配列番号１）、ＣＤＲＨ−２（配列番号２又は配列番号２０）、ＣＤＲＨ−３（配列番号３）、ＣＤＲＬ−１（配列番号４）、ＣＤＲＬ−２（配列番号５）、及びＣＤＲＬ−３（配列番号６）を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有する抗体であって、例えば、１又は複数のＣＤＲにおける１又は複数のアミノ酸が、別のアミノ酸、例えば、以下の本明細書に定義される類似のアミノ酸で置換されている、上記抗体を提供する。
【００４４】
一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ−１の配列は配列番号１に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ−２は配列番号２に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、及び／又はＣＤＲＨ−３は配列番号３に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。別の実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ−１の配列は配列番号１に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ−２は配列番号２に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有し、及び／又はＣＤＲＨ−３は配列番号３に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する。
【００４５】
「同一性」とは、本明細書中で使用するとき、整列された配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを指す。「類似性」とは、本明細書中で使用するとき、整列された配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似したタイプであることを指す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンで置換されてもよい。多くの場合、互いに置換され得る他のアミノ酸には、限定されないが、
フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれる。同一性及び類似性の程度は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１，ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆ Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆ Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。
【００４６】
別の実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＬ−１の配列は配列番号４に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ−２は配列番号５に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、及び／又はＣＤＲＬ−３は配列番号６に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。別の実施形態では、本発明の抗体は軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＬ−１の配列は配列番号４に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ−２は配列番号５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有し、及び／又はＣＤＲＬ−３は配列番号６に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する。
【００４７】
一実施形態では、本発明によって提供される抗体はモノクローナル抗体である。
【００４８】
一実施形態では、本発明によって提供される抗体はキメラ抗体である。
【００４９】
一実施形態では、本発明によって提供される抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６において提供されるＣＤＲ若しくはその改変体の１又は複数を含むＣＤＲグラフト抗体分子である。本明細書中で使用するとき、用語「ＣＤＲグラフト抗体分子」とは、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトされたドナー抗体（例えば、マウス又はラットモノクローナル抗体）由来の１又は複数のＣＤＲ（所望により、１又は複数の修飾されたＣＤＲを含む）を含む抗体分子を指す。概説については、Ｖａｕｇｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８を参照されたい。一実施形態では、移されている全ＣＤＲというよりはむしろ、本明細書において上記されたいずれか１つのＣＤＲ由来の特異性決定残基のほんの１又は複数が、ヒト抗体フレームワークに移されている（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照されたい）。一実施形態では、本明細書において上記された１つ又は複数のＣＤＲ由来の特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移されている。別の一実施形態では、本明細書において上記された各々のＣＤＲ由来の特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移されている。
【００５０】
ＣＤＲ又は特異性決定残基をグラフトした場合、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列は、ＣＤＲが誘導されるドナー抗体のクラス／タイプを考慮して使用されてもよく、マウス、霊長類及びヒトのフレームワーク領域が含まれる。適切には、本発明に係るＣＤＲグラフト抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域、並びに、上記される１若しくは複数のＣＤＲ又は特異性決定残基を含む可変ドメインを有する。このようにして、一実施形態では、中和ＣＤＲグラフト抗体が提供され、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む。
【００５１】
本発明において用いることができるヒトフレームワークの例としては、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭが挙げられる（Ｋａｂａｔら、上述）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に使用することができ、ＲＥＩは軽鎖に使用することができ、並びにＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖と軽鎖の両方に使用することができる。或いは、ヒト生殖系列配列を用いてもよい；http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/で利用可能である。
【００５２】
本発明に係るＣＤＲグラフト抗体では、アクセプターの重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体由来である必要はなく、所望により、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。
【００５３】
本発明のＣＤＲグラフト抗体の重鎖について適切なフレームワーク領域は、ヒト下位集団のＶＨ２配列３−１ ２−２６、並びにＪＨ４（配列番号４１）由来である。したがって、少なくとも１つの非ヒトドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲグラフト抗体であって、重鎖フレームワーク領域は、ヒト下位集団のＶＨ２配列３−１ ２−２６、並びにＪＨ４由来である、上記抗体が提供される。ヒトＪＨ４の配列は、以下の通りである：（ＹＦＤＹ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号４３）。ＹＦＤＹモチーフはＣＤＲ−Ｈ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＶ．ら，１９８１，Ｃｅｌｌ，２７，５８３−５９１）。
【００５４】
本発明のＣＤＲグラフト抗体の軽鎖について適切なフレームワーク領域は、ヒト生殖系列下位集団のＶＫ１配列２−１ １−０２、並びにＪＫ４（配列番号３９）由来である。したがって、少なくとも１つの非ヒトドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲグラフト抗体であって、軽鎖フレームワーク領域は、ヒト下位集団の配列２−１ １−０２、並びにＪＫ４由来である、上記抗体が提供される。ＪＫ４配列は、以下の通りである：（ＬＴ）ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４４）。ＬＴモチーフはＣＤＲ−Ｌ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｈｉｅｔｅｒ，ＰＡ．ら，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，１５１６−１５２２）。
【００５５】
一実施形態では、軽鎖及び／又は重鎖フレームワークは、配列番号３９〜４２に示される配列から選択される。
【００５６】
また、本発明のＣＤＲグラフト抗体では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と同じ配列を正確に有している必要はない。例えば、稀な残基は、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプについてより出現することが多い残基に変化されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域において選択された残基は、ドナー抗体と同じ位置で見られる残基に対応するように変化されてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要最小限に止めておくべきである。変化が必要とされ得るアクセプターフレームワーク領域において残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
【００５７】
適切には、本発明のＣＤＲグラフト抗体分子において、アクセプター重鎖がヒトＶＨ２配列３−１２−３６、並びにＪＨ４を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、１又は複数のドナーＣＤＲに加えて、４９位と７１位の少なくとも１つにドナー残基を含む（Ｋａｂａｔら（上述）による）（図１２を参照されたい）。
【００５８】
したがって、少なくとも、重鎖の可変ドメインの４９位と７１位の残基がドナー残基であるＣＤＲグラフト抗体が提供される。
【００５９】
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、ＣＤＲが本来誘導されている抗体由来の残基である。好ましくは、残基は、それぞれ４９位と７１位のグリシンとアルギニンである。
【００６０】
一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは配列番号３１に示される配列を含む。
【００６１】
ＩＬ−１３に結合し、ＩＬ−１３活性を中和する抗体の能力が著しく変更されなければ、本発明によって提供される抗体可変ドメインに対して、１又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失がなされてもよいことは理解されよう。アミノ酸の置換、付加及び／又は欠失のいずれによる影響も、例えば、実施例に記載されている方法を用いて、当業者によって容易に試験され、ＩＬ−１３結合及び／又はリガンド／受容体ブロックを決定することができる。
【００６２】
別の実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３１に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３１に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６３】
一実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは配列番号２３に示される配列を含む。
【００６４】
別の実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号２３に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号２３に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６５】
一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは配列番号３１に示される配列を含み、軽鎖の可変ドメインは配列番号２３に示される配列を含む。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３１に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号２３に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。適切には、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３１に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号２３に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６７】
本発明の抗体分子は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はその断片を含んでもよく、限定されないが、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されたＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価若しくは四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、二機能性抗体、三機能性抗体、四機能性抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９−２１７を参照されたい）。これらの抗体断片を作製し、産生する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照されたい）。本発明に使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’断片、並びに国際特許出願ＷＯ２００９／０４０５６２に記載されたＦａｂ−ｄＡｂ断片が含まれる。多価抗体は、複数の特異性を含んでもよく、又は単一特異的であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。
【００６８】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択されてもよい。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインが用いられてもよく、特に、抗体分子が治療用であり、抗体エフェクター機能が要求される場合、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプであってもよい。或いは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプは、抗体分子が治療目的であり、抗体エフェクター機能が要求されない場合、例えば、単にＩＬ−１３活性をブロックするために用いられてもよい。これらの定常領域ドメインの配列改変体も使用され得ることは承認されよう。例えば、２４１位のセリンが、Ａｎｇａｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（１），１０５−１０８に報告されるようにプロリンに変更されているＩｇＧ４分子を用いてもよい。また、抗体が様々な翻訳後修飾を受けてもよいことは当業者に理解されよう。これらの修飾のタイプ及び範囲は、多くの場合、抗体を発現させるために使用される宿主細胞系並びに培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸塩異性化及びアスパラギン脱アミド化のバリエーションを含んでもよい。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因した、カルボキシ末端の塩基性残基（例えば、リシン又はアルギニン）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９−１３４，１９９５に記載される通りである）。しかしながら、本発明のＡｂ６５２実施形態の重鎖又は軽鎖のいずれかにはＣ−末端リシンが存在しない。
【００６９】
一実施形態では、抗体の重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体の軽鎖はＣＬドメインのカッパ又はラムダのいずれかを含む。
【００７０】
一実施形態では、本発明によって提供される抗体は、重鎖定常領域が修飾されたヒンジ領域を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体である。したがって、本発明は、重鎖が配列番号３５に示される配列を含む又はその配列からなる抗体を提供する。
【００７１】
ＩＬ−１３に結合し、ＩＬ−１３活性を中和する抗体の能力が著しく変更されなければ、本発明によって提供される抗体可変ドメイン及び／又は定常ドメインに対して、１又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失がなされてもよいことは理解されよう。アミノ酸の置換、付加及び／又は欠失のいずれによる影響も、例えば、ＩＬ−１３結合並びにＩＬ−１３／ＩＬ−１３受容体相互作用のブロックを決定するために、本明細書に記載されている方法、特に実施例に示されている方法を用いることによって、当業者により容易に試験することができる。
【００７２】
本発明の一実施形態では、抗体は、重鎖を含み、重鎖は、配列番号３５に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。適切には、抗体は、重鎖を含み、重鎖は、配列番号３５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００７３】
一実施形態では、本発明に係る抗体分子は、配列番号２７に示される配列を含む軽鎖を含む。
【００７４】
本発明の一実施形態では、抗体は、軽鎖を含み、軽鎖は配列番号２７に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。例えば、抗体は、軽鎖を含み、軽鎖は配列番号２７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、重鎖が配列番号３５に示される配列を含み又はその配列からなり、軽鎖が配列番号２７に示される配列を含み又はその配列からなる抗体を提供する。
【００７６】
本発明の一実施形態では、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号３５に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖は、配列番号２７に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。一般に、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号３５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖は、配列番号２７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００７７】
生体分子、例えば抗体又は断片は、酸性及び／又は塩基性官能基を含み、それにより、分子に正味の正電荷又は負電荷を与える。全体の「観察された」電荷量は、実在物の絶対アミノ酸配列、３Ｄ構造における荷電基の局所環境、及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又は表面が正味の電荷を担持しないｐＨである。一実施形態では、本開示に係る抗体又は断片は、等電点（ｐＩ）が少なくとも７である。一実施形態では、抗体又は断片は、等電点が少なくとも８であり、例えば、８．５、８．６、８．７、８．８又は９である。一実施形態では、抗体のｐＩは８である。
【００７８】
本発明のＩＬ−１３抗体及び断片は、適切な等電点を有するように操作されてもよい。これは、より強固な特性、特に、適切な溶解性及び／又は安定性プロフィールを有する抗体及び／又は断片をもたらすことができる。
【００７９】
このようにして、一態様では、本発明は、初めに特定された抗体の等電点とは異なる等電点を有するように操作されたヒト化ＩＬ−１３抗体を提供する。例えば、抗体は、アミノ酸残基の置換、例えば、１又は複数の塩基性アミノ酸残基で酸性アミノ酸残基を置換することによって操作されてもよい。或いは、塩基性アミノ酸残基が付加されてもよく、又は酸性アミノ酸残基が除去され得る。或いは、分子が容認されない高いｐＩ値を有する場合、酸性アミノ酸残基は、必要に応じてｐＨを下げるように導入されてもよい。操作された抗体又は断片のｐＨは、例えば、８又はそれを超えてもよく、例えば、８．５又は９であり得る。ｐＩを操作する場合、抗体又は断片の所望の活性を保持するように注意すべきであることは重要である。このようにして、一実施形態では、操作された抗体又は断片は、「修飾されていない」抗体又は断片と同じ又は実質的に同じ活性を有する。
【００８０】
**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html及びhttp://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.htmlなどのプログラムを用いて、抗体又は断片の等電点を予測してもよい。
【００８１】
一実施形態では、本発明の抗体は、例えば、噴霧による吸入送達に適している。一例では、本発明の抗体の物理的特性、例えば結合親和性及び効力は、噴霧によって実質的に変更されない。一例では、本発明の抗体は非常に安定である。抗体安定性の１つの測定は融解温度（Ｔｍ）である。融解温度は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法、例えば、サーモフルオロ（Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ）（Ｅｒｉｃｓｓｏｎら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５７（２００６）２８９−２９８）又はＤＳＣ（示差走査熱量測定法）を用いて決定されてもよい。好ましくは、本発明によって提供される抗体は、高い融解温度（Ｔｍ）を有し、典型的には少なくとも７５℃である。一例では、本発明の抗体は、Ｔｍが少なくとも７５℃である。一例では、本発明の抗体は、Ｔｍが少なくとも８０℃である。一例では、本発明の抗体は、Ｔｍが少なくとも８３℃である。
【００８２】
また、本発明は、本発明によって提供される抗体、特に、重鎖配列（配列番号３５）及び／又は軽鎖配列（配列番号２７）を含む抗体が結合する、ヒトＩＬ−１３の特定の領域又はエピトープを提供する。
【００８３】
ヒトＩＬ−１３ポリペプチドのこの特定の領域又はエピトープは、本発明によって提供される抗体のいずれか１つと組み合わせて、当該技術分野において知られている任意の適切なエピトープマッピング法によって特定され得る。このような方法の例には、抗体によって認識されるエピトープの配列を含む抗体に特異的に結合することができる最小断片を用いて、本発明の抗体に結合させるためにＩＬ−１３由来の様々な長さのペプチドをスクリーニングすることが含まれる。ＩＬ−１３ペプチドは、合成的に産生されてもよく、又はＩＬ−１３ポリペプチドのタンパク質分解的消化によって産生されてもよい。抗体に結合するペプチドは、例えば、質量分光分析によって同定することができる。別の例では、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学を用いて、本発明の抗体によって結合されるエピトープを同定することができる。一度同定されると、本発明の抗体に結合するエピトープ断片は、必要に応じて、同エピトープに結合する追加のアンタゴニスト抗体を得るための免疫原として用いることができる。
【００８４】
本発明に係る抗体、特に、重鎖配列（配列番号３１）及び軽鎖配列（配列番号２７）を含む抗体の結合を交差ブロックする抗体は、同様に、ＩＬ−１３活性の拮抗に有用であり得る。したがって、本発明はまた、上記の抗体のいずれか１つがヒトＩＬ−１３に結合するのを交差ブロックし、及び／又はこれらの抗体のいずれか１つによってＩＬ−１３への結合が交差ブロックされる、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体を提供する。一実施形態では、このような抗体は、本明細書において上記された抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態では、交差ブロックする中和抗体は、本明細書において上記された抗体が結合するエピトープと接し、及び／又はそのエピトープと重なるエピトープに結合する。別の実施形態では、本発明のこの態様の交差ブロックする中和抗体は、本発明の抗体と同じエピトープ、或いは該エピトープと接し、及び／又は重なるエピトープには結合しない。
【００８５】
交差ブロックする抗体は、当該技術分野において任意の適切な方法を用いて、例えば、競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いることによって同定することができ、この場合、ヒトＩＬ−１３に対する交差ブロック抗体の結合は、本発明の抗体の結合を妨げ、又はその逆もある。
【００８６】
一実施形態では、重鎖が配列番号３５に示される配列を含み、軽鎖が配列番号２７に示される配列を含む抗体によるヒトＩＬ−１３への結合を交差ブロックする、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体が提供される。一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体は、配列番号３５に示される重鎖配列、及び配列番号２７に示される軽鎖配列を含む抗体の結合を、８０％を超えて、例えば８５％を超えて、例えば９０％を超えて、特に９５％を超えて阻害する。
【００８７】
選択的に又は付加して、本発明のこの態様に係るアンタゴニスト抗体は、配列番号３５に示される重鎖配列及び配列番号２７に示される軽鎖配列を含む抗体によって、ヒトＩＬ−１３への結合が交差ブロックされてもよい。したがって、配列番号３５に示される重鎖配列及び配列番号２７に示される軽鎖配列を含む抗体によってヒトＩＬ−１３への結合が交差ブロックされる、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体分子も提供される。一実施形態では、本発明のこの態様によって提供されるアンタゴニスト抗体は、配列番号３５に示される重鎖配列、及び配列番号２７に示される軽鎖配列を含む抗体によって、ヒトＩＬ−１３の結合が８０％を超えて、例えば８５％を超えて、例えば９０％を超えて、特に９５％を超えて阻害される。
【００８８】
一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体は完全にヒトである。一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体はヒト化されている。一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体は、ヒトＩＬ−１３に対する親和性が１００ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体は、ヒトＩＬ−１３に対する親和性が５０ｐＭ又はそれよりも良好である。
【００８９】
一実施形態では、交差ブロック抗体は、等電点が少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば８．５、８．６、８．７、８．８、８．９又は９．０である。
【００９０】
本発明の抗体分子は、適切には、高い結合親和性、特にピコモル濃度の親和性を有する。親和性は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いて測定されてもよく、この方法には、単離された天然の又は組換えＩＬ−１３を用いた、本明細書中の実施例に記載されているＢＩＡｃｏｒｅを含めた表面プラズモン共鳴法が挙げられる。一例としては、親和性は、本明細書中の実施例に記載されている組換えヒトＩＬ−１３を用いて測定される。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約１００ｐＭ又はそれより良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約５０ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約４０ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約３０ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約２０ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、完全にヒトであるか又はヒト化され、結合親和性が約１００ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、完全にヒトであるか又はヒト化され、結合親和性が３０ｐＭ又はそれよりも良好である。
【００９１】
本発明によって提供される抗体の親和性は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いて変更されてもよいことは理解されよう。したがって、本発明はまた、ＩＬ−１３に対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子の改変体に関する。このような改変体は、多数の親和性成熟プロトコールによって得ることができ、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、チェーンシャッフリング（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８，１９９６）、及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）が挙げられる。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）は、親和性成熟のこれらの方法を検討している。
【００９２】
一実施形態では、本発明の抗体分子は、ＩＬ−１３とＩＬ−１３受容体の相互作用をブロックし、特に、本発明の抗体分子は、ＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１の相互作用、及びＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα２の相互作用をブロックする。この相互作用をブロックする抗体の能力を決定するのに適した多数のアッセイは、本明細書中の実施例に記載されている。一実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１３に特異性を有する中和抗体を提供する。一実施形態では、アッセイに使用されるヒトＩＬ−１３受容体は、天然のヒトＩＬ−１３Ｒα１又は天然のヒトＩＬ−１３Ｒα２である。一実施形態では、アッセイに使用されるヒトＩＬ−１３受容体は、組換えヒトＩＬ−１３Ｒα１又は組換えヒトＩＬ−１３Ｒα２である。一実施形態では、アッセイに使用されるヒトＩＬ−１３は組換えヒトＩＬ−１３である。一実施形態では、中和抗体はヒト化抗体若しくは完全ヒト抗体又はその断片である。
【００９３】
所望により、本発明に使用するための抗体は、１又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートされてもよい。エフェクター分子が、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に結合できる単一部分を形成するように連結された２以上のこのような分子を含んでもよいことは承認されよう。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが望まれる場合、これは、抗体断片を直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結する、標準的な化学的又は組換えＤＮＡの手法によって調製されてもよい。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は当該技術分野において周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，第２版Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編，１９８７，６２３−５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照されたい）。具体的な化学的手法には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に記載の手法が含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されるような組換えＤＮＡ手法を用いて達成することができる。
【００９４】
エフェクター分子なる用語は、本明細書中で使用するとき、例えば、抗腫瘍薬、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成の又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート金属、ナノ粒子、及び蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出できる化合物などのレポーター基を含む。
【００９５】
エフェクター分子の例には、細胞毒素、又は細胞にとって有害（例えば致死的）である任意の薬物を含む細胞毒性剤が含まれてもよい。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。
【００９６】
また、エフェクター分子には、限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれる。
【００９７】
他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレートされた放射性核種；又は、限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を含み得る。
【００９８】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。対象となる酵素には、限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。対象となるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、限定されないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤又は抗血管新生剤、例えばアンギオスタチン又はエンドスタチン、或いはリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、又は他の増殖因子などの生物反応修飾因子、及び免疫グロブリンが挙げられる。
【００９９】
他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出トモグラフィーにおける使用のため）及び非放射性常磁性金属イオンを含む。診断としての使用のための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号全体を参照されたい。適切な酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族はストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含み、適切な蛍光物質はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンを含み、適切な発光物質はルミノールを含み、適切な生物発光物質は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み、適切な放射性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃを含む。
【０１００】
別の例において、エフェクター分子は、インビボにおける抗体の半減期の増加及び／又は抗体の免疫原性の減少及び／又は上皮バリアを越える免疫系への抗体の送達を強化できる。この型のエフェクター分子の適切な例は、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されたような、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はアルブミン結合化合物を含む。
【０１０１】
エフェクター分子がポリマーである場合、一般に、合成の又は天然に存在するポリマー、例えば、場合により置換された直鎖又は分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー、或いは分岐又は非分岐の多糖類、例えば、ホモ又はヘテロの多糖類であってよい。
【０１０２】
上記の合成ポリマーに存在してもよい特定の任意の置換基は、１又は複数のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基を含む。
【０１０３】
合成ポリマーの具体例には、場合により置換された直鎖又は分岐鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、場合により置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）及びその誘導体が挙げられる。
【０１０４】
具体的な天然に存在するポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体を含む。
【０１０５】
「誘導体」は、本明細書中で使用するとき、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択的反応基を含むものとする。反応基は、ポリマーに直接又はリンカーセグメントを介して連結されてもよい。このような基の残基が、抗体断片とポリマーとの間の連結基として、時には生成物の一部を形成することは理解されよう。
【０１０６】
ポリマーのサイズは、所望に応じて変更可能であるが、一般には、平均分子量が５００Ｄａから５００００Ｄａ、例えば５０００から４００００Ｄａ、例えば２００００から４００００Ｄａの範囲となる。ポリマーサイズは、特に、生成物の使用目的、例えば腫瘍などのある種の組織に局在する能力又は循環半減期を延長させる能力に基づいて選択できる（総説としては、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照されたい）。したがって、例えば、生成物を循環から離れて組織に浸透させようとする場合、分子量の小さいポリマー、例えば約５０００Ｄａの分子量のポリマーの使用が有利である場合がある。生成物が循環に残存する場合の適用に関しては、分子量のより大きいポリマー、例えば２００００Ｄａから４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーの使用が有利である場合がある。
【０１０７】
適したポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、或いは特にメトキシポリ（エチレングリコール）などの、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量のポリアルキレンポリマー又はその誘導体を含む。
【０１０８】
一例では、本発明において使用するための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部位に結合される。特定の一例では、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は抗体断片に位置する末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を介して結合されてもよい。このようなアミノ酸は、抗体断片中に自然に発生してもよく、又は組換えＤＮＡ法を用いて断片中に操作してもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６、ＵＳ５，６６７，４２５、ＷＯ９８／２５９７１を参照されたい）。一例において、本発明の抗体分子は修飾されたＦａｂ断片であり、修飾は抗体分子の重鎖のＣ末端への、エフェクター分子の結合を可能にする、１又は複数のアミノ酸の付加である。適切には、付加アミノ酸は、エフェクター分子が結合できる１又は複数のシステイン残基を含む、修飾されたヒンジ領域を形成する。２以上のＰＥＧ分子を結合するために複数の部位が使用できる。
【０１０９】
適切には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置した少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合されてもよい。修飾された抗体断片に結合した各ポリマーは、断片に位置したシステイン残基のイオウ原子に共有結合されてもよい。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合、又は、特にイオウ−炭素の結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばマレイミドなどのチオール選択性誘導体及びシステイン誘導体が使用されてもよい。上記のように、活性化ポリマーが、ポリマーによって修飾された抗体断片の調製において、出発物質として用いることができる。活性化ポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどの、チオール反応基を含む任意のポリマーであってもよい。このような出発物質は、市販で（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡから）得ることができる、又は市販の出発物質から、従来の化学的手法を用いて調製することができる。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ，Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）を含む。
【０１１０】
一実施形態では、抗体は、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示されている方法に従って、ＰＥＧ化された、すなわちＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））が共有結合した、修飾されたＦａｂ断片又はｄｉＦａｂである［（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ及び「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ、Ａ．２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２、５４：５３１−５４５も参照されたい］。一例では、ＰＥＧは、ヒンジ領域においてシステインに結合する。一例では、ＰＥＧ修飾されたＦａｂ断片は、修飾ヒンジ領域において単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合でき、リシン残基上の各アミン基は、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーに結合できる。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの全分子量は約４０，０００Ｄａであってもよい。
【０１１１】
一実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体分子を提供し、この抗体は、配列番号３５に示される配列を含む重鎖、及び配列番号２７に示される配列を含む軽鎖を有し、その重鎖のＣ末端に、エフェクター分子が結合した少なくとも１つのシステイン残基を含む修飾されたヒンジ領域を有する、修飾されたＦａｂ’断片である。適切には、エフェクター分子はＰＥＧであり、（ＷＯ９８／２５９７１及びＷＯ２００４０７２１１６又はＷＯ２００７／００３８９８）に記載されている方法を用いて結合される。エフェクター分子は、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されている方法を用いて抗体断片に結合されてもよい。
【０１１２】
一実施形態では、抗体又は断片はエフェクター分子と結合されない。
【０１１３】
また、本発明は、本発明の抗体分子の重鎖（単数又は複数）及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。適切には、ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的方法によって作製された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０１１４】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又は全てをコードするＤＮＡ配列は、所望に応じて決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成されてもよい。
【０１１５】
アクセプターのフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者に広く利用可能であり、それらの知られたアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【０１１６】
分子生物学の標準的技術を用いて、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製しもよい。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全に又は部分的に合成され得る。部位特異的突然変異誘発法及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を必要に応じて使用することができる。
【０１１７】
適切な配列の例は本明細書中に提供される。マウスシグナルペプチドＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦ ＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号４５）などの重鎖に適したシグナルペプチドが配列中にコードされていてもよい。本発明のアンタゴニスト抗体分子を提供するために開裂されるマウスシグナルペプチドＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬ ＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号４６）などの軽鎖に適したシグナルペプチドが配列中にコードされていてもよい。また、本発明は、配列番号３２、３４又は３６又は３８を含む、本発明の抗体の重鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。また、本発明は、配列番号２４、２６、２８又は３０を含む、本発明の抗体の軽鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。
【０１１８】
ベクターを構築できる一般的な方法、トランスフェクション法及び培養方法は、当業者に周知である。この点において、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより作成されたマニアティスのマニュアル（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ）を参照する。
【０１１９】
また、本発明の抗体をコードする１又は複数のＤＮＡ配列を含む１又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるために用いられてもよい。細菌、例えば大腸菌及び他の微生物系を使用することができ、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系もまた使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマの細胞が含まれる。
【０１２０】
また、本発明は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養するステップ、及びこの抗体分子を単離するステップを含む、本発明に係る抗体分子を産生するための方法を提供する。
【０１２１】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖のポリペプチドをコードする配列だけが宿主細胞にトランスフェクトの使用に必要とされる場合には、重鎖又は軽鎖のポリペプチドだけを含んでもよい。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の作製について、細胞系に、２つのベクターである軽鎖ポリペプチドをコードする第１ベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２ベクターをトランスフェクトしてもよい。或いは、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含むベクターである単一のベクターを用いることができる。
【０１２２】
本開示に係る抗体及び断片は、宿主細胞から良好なレベルで発現される。このようにして、抗体及び／又は断片の特性は、市販用加工に最適であり、貢献すると考えられる。
【０１２３】
本発明の抗体は病態の治療及び／又は予防に有用であるため、本発明はまた、本発明の抗体分子を、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物又は診断用組成物を提供する。したがって、薬剤を製造するための本発明の抗体の使用が提供される。組成物は、薬学的に許容される担体を通常は含む、無菌の医薬組成物の一部として通常は供給されることになる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含んでもよい。
【０１２４】
また、本発明は、本発明の抗体分子を、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と共に添加又は混合すること含む、医薬組成物又は診断用組成物を調製する方法を提供する。
【０１２５】
この抗体分子は、医薬組成物又は診断用組成物における唯一の有効成分であってもよく、又は他の抗体成分、例えば、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗Ｔ細胞抗体、抗ＩＦＮγ抗体又は抗ＬＰＳ抗体、或いはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の有効成分を伴ってもよい。他の適切な有効成分には、寛容を誘導することができる抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ４抗体が含まれる。
【０１２６】
さらなる実施形態では、本開示に係る抗体、断片又は組成物は、さらなる医薬として活性のある作用物質、例えば、コルチコステロイド（例えばプロピオン酸フルチカゾン）及び／又はベータ−２−作動薬（例えばサルブタモール、サルメテロール若しくはフォルモテロール）又は細胞成長及び増殖の阻害剤（例えばラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート）、或いは選択的にＣＤ２８及び／又はＣＤ４０阻害剤と組み合わせて使用される。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【０１２７】
医薬組成物は、適切には、治療有効量の本発明の抗体を含む。用語「治療有効量」とは、本明細書中で使用するとき、標的となる疾患若しくは状態を治療、改善又は予防するために、或いは検出可能な治療効果又は予防効果を示すために必要とされる治療薬の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデルにおいて、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかにおいて、初期に推定することができる。また、動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために用いることができる。続いて、このような情報は、ヒトにおける有用な投薬量及び投与経路を決定するために用いることができる。
【０１２８】
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の全体的な健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（単数又は複数）、治療に対する反応感受性及び耐性／応答に依存する。この量は、日常の実験によって決定でき、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。或いは、投薬量は、１日あたり１〜５００ｍｇ、例えば、１日あたり１０〜１００、２００、３００又は４００ｍｇであってもよい。好都合には、医薬組成物は、所定量の本発明の活性剤を含む単位剤形で存在してもよい。
【０１２９】
組成物は、患者に個別に投与してもよく、又は他の薬物、薬剤若しくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、連続して又は別々に）投与されてもよい。
【０１３０】
本発明の抗体分子を投与する場合の投薬量は、治療される状態の性質、存在する炎症の程度、及び抗体分子が予防的に使用されるか又は現状を治療するために使用されているかどうかに依存する。
【０１３１】
投薬の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続期間に依存する。抗体分子の半減期が短い（例えば、２〜１０時間）場合、１日に１回又は複数回の投薬が必要とされ得る。或いは、抗体分子の半減期が長い（例えば２〜１５日）場合、１日に１回、１週間に１回、若しくはさらに１又は２か月に１回の投薬だけが必要とされ得る。
【０１３２】
薬学的に許容される担体は、それ自体は組成物を摂取する個体に対して有害な抗体の産生を誘導してはならず、毒性があってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウイルス粒子などの大型の緩慢に代謝される巨大分子であってよい。
【０１３３】
薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩が使用できる。
【０１３４】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、さらに水、食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含んでもよい。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質がこのような組成物中に存在してもよい。このような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液などに処方可能にする。
【０１３５】
投与の好ましい形態は、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与に適した形態を含む。生成物が注射用又は注入用である場合、油性又は水性のビヒクルにおいて懸濁液、溶液又は乳剤の形態を取ってよく、懸濁剤、防腐剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤助剤を含んでもよい。或いは、抗体分子は、使用前に適切な滅菌の液体により再構成するために、乾燥形態であってもよい。
【０１３６】
一度処方されると、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。治療されるべき対象は動物であり得る。しかしながら、１又は複数の実施形態では、組成物はヒト対象に投与するために適合される。
【０１３７】
一実施形態では、本開示に係る製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値に類似せず、これは、製剤のｐＨが７である場合、８〜９又はそれを超えるｐＩが適切であり得るためである。望ましくは理論に束縛されずに、これは、最終的には、改善された安定性を有する最終製剤を提供することができ、例えば、抗体又は断片が溶液中に留まると考えられる。
【０１３８】
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、経皮的（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内又は直腸の経路を含む、任意の数の経路によって投与できる。皮下噴射器もまた本発明の医薬組成物の投与のために使用できる。典型的には、治療用組成物は、溶液又は懸濁液のどちらかとして、注射可能に調製できる。注射前の、液体媒体中における溶液用又は懸濁液用に適した固体形態にもまた調製できる。好ましくは、本発明の抗体分子は、皮下に、吸入により又は局所に投与される。
【０１３９】
組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内によって達成され、又は組織の間質腔に送達される。組成物はまた、対象とする特定の組織内に投与され得る。投薬処置は、単回投薬スケジュール又は複数回投薬スケジュールであってもよい。
【０１４０】
組成物中の有効成分が抗体分子であることは承認されよう。そのため、消化管における分解を受けやすい。このようにして、組成物が消化管を使用する経路によって投与されるべきである場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から一度吸収されたら抗体を放出する薬物を含む必要がある。
【０１４１】
薬学的に許容される担体の詳細な考察は、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）において利用可能である。
【０１４２】
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与用の製剤として提供される。
【０１４３】
適切な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、高圧ガスを含む計量エアロゾル、又は高圧ガスを伴わない吸入可能な溶液（例えば、噴霧可能な溶液又は懸濁液）が挙げられる。活性物質を含む、本開示に係る吸入可能な粉末は、上記の活性物質だけからなっているか、又は上記の活性物質と生理学的に許容される賦形剤との混合物からなっていてもよい。
【０１４４】
これらの吸入可能な粉末は、単糖（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えば、デキストラン）、多価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれら同士の混合物を含んでもよい。単糖又は二糖が適切には使用され、それは、ラクトース又はグルコースの使用、特に、限定されないが、それらの水和物の形態である。
【０１４５】
肺における沈着用の粒子は、１０ミクロン未満の粒径を必要とし、例えば、１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍである。有効成分（例えば、抗体又は断片）の粒径は、最も重要である。
【０１４６】
吸入可能なエアロゾルを調製するために用いることができる噴射ガスは当該技術分野において知られている。適切な噴射ガスは、炭化水素、例えばｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタン、ハロ炭化水素、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体の中から選択される。上記の噴射ガスは、単独で又はそれらの混合物で使用されてもよい。
【０１４７】
特に適切な噴射ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、及びそれらの混合物が特に適している。
【０１４８】
また、噴射ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、他の成分、例えば共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤、及びｐＨを調整するための手段を含んでもよい。これらの全ての成分は当該技術分野において知られている。
【０１４９】
本発明に係る噴射ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、最大５重量％の活性物質を含んでもよい。本発明に係るエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の活性物質を含む。
【０１５０】
或いは、肺への局所投与はまた、溶液製剤又は懸濁製剤の投与によって、例えば、噴霧器などのデバイス、例えば、圧縮器に接続された噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖａ．により製造されたＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮器に接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）を用いるものであってもよい。
【０１５１】
一実施形態では、製剤は、噴霧による送達用に単位用量を含む個別のアンプルとして提供される。
【０１５２】
一実施形態では、抗体は、再構成用に、或いは懸濁製剤として凍結乾燥形態で供給される。
【０１５３】
本発明の抗体は、溶媒に分散されて、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達させることができる。適切な生理溶液、例えば、生理食塩水、薬理学的に許容される溶媒、又は緩衝液に懸濁することができる。当該技術分野において知られている緩衝液には、水１ｍｌあたり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸２ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムが含まれていてもよく、それにより、約４．０〜５．０のｐＨを達成する。上述した通り、懸濁液は、例えば、凍結乾燥させた抗体から作製することができる。
【０１５４】
また、治療用の懸濁液又は溶液製剤は、１又は複数の賦形剤を含んでもよい。賦形剤は当該技術分野において周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液及び重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる。溶液又は懸濁液をリポソーム又は生分解性マイクロスフェアにカプセル化することができる。製剤は、一般に、無菌的な製造プロセスを用いて、実質的に無菌形態で提供される。
【０１５５】
これは、処方に使用される緩衝溶媒溶液のろ過、該無菌の緩衝溶媒溶液への抗体の無菌懸濁、及び当業者によく知られている方法による無菌容器への製剤の分注による製造及び滅菌を含んでもよい。
【０１５６】
本開示にかかる噴霧可能な製剤は、例えば、アルミホイルに包まれた単一投薬量単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供されてもよい。各バイアルは、ある体積、例えば２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中の単位用量を含む。
【０１５７】
本開示の抗体は、噴霧を介した送達に適していると考えられる。
【０１５８】
また、本発明の抗体は、遺伝子治療の使用により投与されてもよいことが予測される。これを達成するために、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列が患者に導入され、その結果、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、インサイチュで集積される。
【０１５９】
また、本発明は、炎症性疾患、例えば急性又は慢性炎症性疾患の調節に使用するための抗体分子（又はそれを含む組成物）を提供する。適切には、抗体分子（又はそれを含む組成物）は、炎症過程を減少させる、又は炎症過程を妨げるために使用され得る。一実施形態では、活性化Ｔ細胞、特に、不適切な炎症性免疫応答に関与した活性化Ｔ細胞、例えば、このような応答の近辺／位置に動員される活性化Ｔ細胞のインビボでの減少がもたらされる。
【０１６０】
活性化Ｔ細胞の減少は、本明細書で用いられる場合、処置前又は処置なしと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、又はそれを超える減少であってもよい。
【０１６１】
好都合には、本発明に係る抗体、断片又は組成物による処置により、患者のＴ細胞（不活性化Ｔ細胞）の一般レベルを減少させずに、活性化Ｔ細胞のレベルを減少させることができる。これは、より少ない副作用をもたらし、おそらくは患者におけるＴ細胞減少を妨げることができる。
【０１６２】
また、本発明は、ＩＬ−１３によって媒介されるか又はＩＬ−１３レベルの増加と関連している病的障害の治療又は予防において使用するための本発明の抗体分子を提供する。
【０１６３】
病的状態又は病的障害は、例えば、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生）、感染と関連した内毒素性ショック、関節リウマチなどの関節炎、重篤な喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症などの中枢神経系及び末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、狼瘡（例えば、全身性紅斑性狼瘡）及びギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、サルコイドーシス、強皮症、ヴェグナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵臓炎、外傷（外科）、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、心筋梗塞などの虚血性疾患及びアテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎、及び低塩酸症からなる群から選択されてもよい。
【０１６４】
また、本発明は、疼痛、特に炎症と関連している疼痛の治療又は予防に使用するための、本発明に係る抗体分子を提供する。
【０１６５】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、炎症の治療に対する抵抗、特に炎症の治療に対する肺抵抗を減少させる。
【０１６６】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、例えば、治療前のレベルと比較して、気管支組織のＩＬ−１３タンパク質レベルを減少させる。この減少は、５、１０、２０、３０、４０％又はそれを超えてもよい。
【０１６７】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、例えば、治療前のレベルと比較して、鼻洗浄液及び／又は気管支肺胞洗浄液におけるＩＬ−１３タンパク質レベルを減少させる。この減少は、５、１０、２０、３０、４０％又はそれを超えてもよい。
【０１６８】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、例えば、治療前のレベルと比較して、好酸球流入を減少させる。この減少は、例えば、１、２、３、４、５、６週間又はそれを超えて治療した場合、５、１０、２０、３０、４０％又はそれを超えてもよい。
【０１６９】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、例えば、慢性杯細胞過形成などの杯細胞過形成の治療において、杯細胞の不適切なレベルの減少に適している。この減少は、１、２、３、４、５、６週間又はそれを超えた治療後に観察されてもよい。
【０１７０】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、治療前のレベルと比較して、呼気の一酸化窒素（ＦｅＮＯ）レベルの減少に適している。呼気の一酸化窒素は、肺炎症の危険因子又はマーカーであると考えられている。
【０１７１】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、炎症反応と関連している不適切なコラーゲン沈着、特に気管支周囲のコラーゲン沈着の予防に適している。
【０１７２】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、炎症反応と関連した不適切な血管形成の予防に適している。
【０１７３】
このようにして、治療に使用するための本発明に係る抗体、及びそれを使用する治療方法が提供される。
【０１７４】
また、本明細書に使用される本発明に係る抗体は、本明細書に開示されている断片及び誘導体を指す。
【０１７５】
さらに、本発明は、ＩＬ−１３によって媒介されるか又はＩＬ−１３レベルの増加と関連している病的障害の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明に係る抗体分子、断片又は組成物の使用を提供し、例えば、本明細書中に記載の通り、特に、病的障害は関節リウマチ、喘息又はＣＯＰＤである。
【０１７６】
さらに、本発明は、本明細書に記載されている１又は複数の医学的兆候の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明に係る抗体分子、断片又は組成物の使用を提供する。
【０１７７】
本発明の抗体分子、断片又は組成物は、任意の治療に利用されてもよく、この場合、ヒト又は動物の生体におけるＩＬ−１３の効果を減少させることが望まれる。ＩＬ−１３は生体に循環していてもよく、又は生体の特定部位、例えば、炎症部位に望ましくないほど高レベルで局在して存在してもよい。
【０１７８】
一実施形態では、本発明の抗体分子又はそれを含む組成物は、例えば、本明細書に記載される炎症性疾患を制御するために使用される。
【０１７９】
また、本発明は、ＩＬ−１３によって媒介される障害に罹患しているか又はその危険性があるヒト又は動物対象を治療するための方法であって、有効量の本発明の抗体分子、又はそれを含む組成物を該対象に投与することを含む上記方法を提供する。一例では、抗体分子は吸入によって投与される。
【０１８０】
一例では、障害は、上記で示された医学的兆候のいずれかから選択される。一例では、障害は、喘息疾患、アトピー性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気道炎症に関連した状態、好酸球増加症、線維症及び過剰粘液産生、炎症状態、自己免疫状態、腫瘍又は癌、ウイルス感染及び防御性１型免疫応答の発現抑制からなる群から選択される。
【０１８１】
一実施形態では、抗体（特に、本発明に係る抗体又は断片）を精製するための方法が提供される。
【０１８２】
一実施形態では、抗体（特に、本発明に係る抗体又は断片）を精製するための方法であって、
不純物がカラムに保持され、抗体が非結合画分に維持されるように、非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを行うステップ
を含む上記方法が提供される。このステップは、例えば、ｐＨが約６〜８で行われてもよい。
【０１８３】
この方法は、例えば、ｐＨが約４〜５で実行される陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた初期捕捉ステップをさらに含んでもよい。
【０１８４】
この方法は、生成物を確保するための追加のクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）をさらに含んでもよく、方法に関連した不純物が製品流から適切に除かれる。
【０１８５】
また、精製方法は、濃縮及び透析ろ過ステップなどの１又は複数の限外ろ過ステップをさらに含んでもよい。
【０１８６】
このようにして、一実施形態では、精製されたＩＬ−１３抗体又は断片、例えば、実質的に精製された形態であり、特に、内毒素及び／又は宿主細胞のタンパク質若しくはＤＮＡを含まないか、又は実質的に含まない、ヒト化抗体又は断片、特に本発明に係る抗体又は断片が提供される。このように言及はしたが、本発明に係る抗体は、一般に、哺乳動物細胞で調製され、したがって、内毒素含量は通常問題にならない。実際には、内毒素含量はむしろ、抗体が細菌細胞で調製される場合に考慮される。
【０１８７】
上記で使用される精製された形態は、少なくとも９０％の純度を指すものとし、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれを超えて純粋である。
【０１８８】
内毒素が実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物１ｍｇあたりの内毒素含量が１ＥＵ未満であることを指すものとし、例えば、生成物１ｍｇあたり０．５又は０．１ＥＵである。
【０１８９】
宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡが実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物１ｍｇあたり宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含量が４００μｇ未満であるであることを指すものとし、例えば、必要に応じて、１ｍｇあたり１００μｇ未満、特に１ｍｇあたり２０μｇである。
【０１９０】
また、本発明の抗体分子は診断、例えば、ＩＬ−１３に関与する疾患状態のインビボでの診断及び画像化に使用されてもよい。
【０１９１】
本発明に係る抗体の特性を試験するための適切なインビボアッセイには、慢性イエダニモデル、メタコリンに対する過敏反応性、及び／又はアレルギー性肺炎症のオボアルブミンモデルが含まれる。
【０１９２】
本明細書との関連で含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとする。
【０１９３】
この場合、本発明の技術的に適切な実施形態を組み合わせてもよい。
【０１９４】
実施形態は、本明細書において、ある種の特徴／要素を含むものとして記載されている。また、本開示は、上記特徴／要素からなるか又は本質的に上記特徴／要素からなる実施形態を区別するように広げる。
【０１９５】
本発明は、添付の図面について言及する以下の実施例においてのみ、例示としてさらに説明される：
【０１９６】
図１は、重鎖（ＣＤＲ Ｈ）のＣＤＲ１、２、３、及び軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）のＣＤＲ１、２、３の各々についてのアミノ酸配列（配列番号１〜６）、
ラット抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号７）、
ラット抗体軽鎖の可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号８）、及び
シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号９）
を示す。
【０１９７】
図２は、シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号１０）、
ラット抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号１１）、
ラット抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号１２）、及び
シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖についてのアミノ酸配列（配列番号１３）
を示す。
【０１９８】
図３は、シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖についてのＤＮＡ配列（配列番号１４）、
ラット抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号１５）、
ラット抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号１６）、及び
シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号１７）
を示す。
【０１９９】
図４は、シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号１８）、及び
ラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号１９）
を示す。
【０２００】
図５は、ラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２０）、及び
シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号２１）
を示す。
【０２０１】
図６は、シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２２）を示す。
【０２０２】
図７は、ヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号２３）、
ヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２４）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号２５）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２６）、及び
ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号２７）
を示す。
【０２０３】
図８は、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２８）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号２９）、及び
シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３０）、
を示す。
【０２０４】
図９は、ヒト化抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号３１）、
ヒト化抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３２）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号３３）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３４）、及び
ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号３５）
を示す。
【０２０５】
図１０は、ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３６）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号３７）、及び
ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３８）
を示す。
【０２０６】
図１１は、ヒトＶＫ １ ２−１−（１）０２ ＪＫ４アクセプターフレームワーク（配列番号３９及び配列番号４０）及びＶＨ２ ３−１ ２−２６ ＪＨ４アクセプターフレームワークについてのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列（配列番号４１及び配列番号４２）を示す。
【０２０７】
図１２は、ラットに関する軽鎖、アクセプターフレームワーク、並びにヒト化軽鎖及びさらに重鎖のアラインメントを示す。ＣＤＲは、ボールド体であり、下線が付されている。ドナー残基Ｇ４９及びＲ７１は、ボールド体であり、イタリック体であり、反転表示されている。
【０２０８】
図１３は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおいてアレルゲン接種後の２４時間で測定されたＢＡＬエオタキシン−３に対するＡｂ６５２の効果。データは、平均±ＳＥＭで表され、１群あたりｎ＝４〜８である。
【０２０９】
図１４は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおいてアレルゲン接種後の２４時間で測定されたＢＡＬ好酸球数に対するＡｂ６５２の効果。データは、研究のスクリーニング段階で測定されたＢＡＬ好酸球に対して標準化される。平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜８／群。
【０２１０】
図１５は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおいてアレルゲン接種後の１５分までに測定された最大気道抵抗に対するＡｂ６５２の効果。データは、平均±ＳＥＭとして表される。ｎ＝４〜８／群。
【０２１１】
図１６は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおいてアレルゲン接種後の２４時間で測定された気道抵抗に対するＡｂ６５２の効果。データは、アレルゲンに暴露される前に測定された気道抵抗に対して標準化される。平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜８／群。
【実施例】
【０２１２】
１．治療抗体の作製／選択
精製されたヒトＩＬ−１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）若しくはヒトＩＬ−１３を発現しているラット線維芽細胞（培養上清中に約１μｇ／ｍｌで発現している）のいずれか、又はある場合にはこれらの２つの組み合わせでラットを免疫した。３〜６回の注射後、動物を屠殺し、ＰＢＭＣ、脾臓、骨髄及びリンパ節を回収した。血清は、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＩＬ−１３への結合について、さらに、ＨＥＫ−２９３ ＳＴＡＴ−６レポーター細胞アッセイ（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）においてｈＩＬ−１３を中和する能力について監視された。
【０２１３】
ＳＬＡＭ培地（Ｂ細胞培地）は、Ｚｕｂｌｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５）に報告されているのと同じ方法によって調製された。要約すると、免疫された動物由来の５００〜５０００個の脾臓細胞又はＰＢＭＣは、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｌｔｄ）２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、０．１％βメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、３％活性化ウサギ脾臓細胞培養上清、及びガンマ照射されたＥＬ−４−Ｂ５マウス胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で７日間、数百の９６ウェルプレートのバッチで培養された。Ｂ細胞培養上清をスクリーニングアッセイにおいて試験し、陽性の上清をマスタープレートに集めた。培養されたＢ細胞は、ＦＣＳ中の１００μｌの１０％ＤＭＳＯに−８０℃で凍結された。
【０２１４】
ＳＬＡＭ培養上清は、ＦＭＡＴにおけるビーズ系アッセイにおいて、ｈＩＬ−１３に結合するそれらの能力について最初にスクリーニングされた。これは、ストレプトアビジンビーズ上に被覆されたビオチン化ヒトＩＬ−１３及びヤギ抗ラットＦｃ−Ｃｙ５コンジュゲートを用いた均質アッセイであった。次に、このアッセイからの陽性は、ＨＥＫ−２９３ ＩＬ−１３Ｒ−ＳＴＡＴ−６レポーター細胞アッセイ（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）に送られ、中和物を同定した。その後、Ｂｉａｃｏｒｅにおいて中和上清についてプロファイルされて、オフ速度を推定し、さらに中和の作用様式を特徴付けた。中和はｂｉｎ１又はｂｉｎ２として分類された。ｂｉｎ１は、ヒトＩＬ−１３に結合する抗体を示し、ＩＬ−１３Ｒα１の結合を妨げ、さらに結果として、結合からＩＬ−４Ｒをブロックする。ｂｉｎ２は、ＩＬ−１３Ｒα１に結合するのを可能にするが、複合体へのＩＬ−４Ｒの動員を妨げるような方法でｈＩＬ−１３に結合する抗体を示す。本発明者らは、ｂｉｎ１によって作用する抗体を選択してきた。
【０２１５】
約７５００個のＩＬ−１３特異的陽性が、合計２７×１００プレートのＳＬＡＭ実験から一次ＦＭＡＴスクリーニングにおいて同定された。８００ウェルは、ＨＥＫ−ｂｌｕｅアッセイにおいて中和を示した。１７０ウェルは所望のＢｉａｃｏｒｅプロファイルであり、即ち、ｂｉｎ１抗体は、オフ速度が＜５×１０−４ｓ−１であった。これらの１７０ウェルからの可変領域のクローニングを試み、１６０が首尾よく蛍光焦点を生じさせた。１００ウェルが、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ後に重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子対を生じさせた。これらのＶ領域遺伝子は、マウスＩｇＧ１全長抗体としてクローニングされ、ＨＥＫ−２９３一過性発現系において再度発現された。配列分析により、抗ヒトＩＬ−１３抗体の２７の独特なファミリーが存在することが示された。次に、これらの組換え抗体は、組換えｈＩＬ−１３（大腸菌由来及び哺乳動物由来）、組換えバリアントｈＩＬ−１３（Ｒ１３０Ｑ）（大腸菌由来）、天然野生型及びバリアントｈＩＬ−１３（ヒトドナー由来）、並びにカニクイザルＩＬ−１３（哺乳動物由来）をブロックするそれらの能力について、細胞系アッセイにおいて再試験された。また、組換え抗体は、バリアントヒトＩＬ−１３（Ｒ１３０Ｑ）及びカニクイザルＩＬ−１３に結合するそれらの能力についてＢｉａｃｏｒｅにおいて試験された。この特徴付けの後、５つの抗体ファミリーが本発明者らの基準、即ち、全てのヒト及びカニクイザルＩＬ−１３調製物についての有効性及び親和性における最小の減少を有する１００ｐＭを下回る抗体を満たした。
【０２１６】
５つ全てのファミリーについてヒト化を行った。中和有効性、親和性及びヒト化移植片におけるドナー含有量に基づいて、ヒト化ＣＡ１５４＿６５２（下記参照）をさらなる進行のために選択した。
【０２１７】
１．１ ヒト化
本明細書に例証されたヒト化抗体は（Ａｂ６５２）、ヒト生殖系列抗体のＶ領域フレームワークに、ラット抗体のＶ領域（配列番号７及び１５）由来のＣＤＲ（配列１から６において本明細書に開示されたＣＤＲ）をグラフトすることによって調製された。ラット抗体（ドナー）のＶ領域配列とヒト生殖系列抗体（アクセプター）のＶ領域配列とのアラインメントは、設計されたヒト化配列とともに、図１２に示される。アクセプター配列にドナーからグラフトされたＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７）．Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳ）によって定義されている通りであるが、組み合わせたＣｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義が使用される場合にはＣＤＲ−Ｈ１は除かれる（Ａｄａｉｒら（１９９１）Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＷＯ９１／０９９６７参照）。ヒトＶ領域のＶＨ２ ３−１２−２６プラスＪＨ４ Ｊ領域（V BASE、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）は、重鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選ばれた。重鎖フレームワーク残基は全て、ヒト生殖系列遺伝子由来であるが、ドナー残基グリシン（Ｇ４９）及びアルギニン（Ｒ７１）が保持される場合には、それぞれ残基４９及び７１（Ｋａｂａｔ番号付け）を除く。これらの２つのドナー残基の保持は、ヒト化抗体の完全な活性に本質的である。ヒトＶ領域ＶＫ１ ２−１−（１）０２プラスＪＫ４ Ｊ領域（V BASE、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）は、軽鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選ばれた。軽鎖フレームワーク残基は全て、ヒト生殖系列遺伝子由来である。
【０２１８】
初期Ｖ領域配列をコードする遺伝子は、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ ＧｍｂＨによる自動化合成アプローチによって設計され、構築された。多数の異なる重鎖改変体は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によるＶＨ遺伝子を改変することによって作製された。ｇＬ１遺伝子配列は、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒト軽鎖発現ベクターｐＫＨ１０．１にクローニングされ、このベクターは、ヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含む−配列番号２６及び配列番号３０を参照されたい。８つのグラフトされたＶＨ遺伝子（ｇＨ１からｇＨ８）をＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒトガンマ−４重鎖発現ベクターｐＶｈγ４Ｐ ＦＬにクローニングされ、このベクターは、ヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐを有するヒトガンマ−４重鎖定常領域をコードするＤＮＡを含む（Ａｎｇａｌら，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３，３０（１）：１０５−８）。ｇＨ２ ＶＨ遺伝子は、有効性及び生物物理学的特徴について最適な重鎖グラフトとして選ばれ（本明細書の下記に記載）、次に、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒトガンマ−１ ＦａｂベクターｐＶｈγ１Ｆ３にサブクローニングされ、このベクターは、ヒトガンマ−１ ＣＨ１ドメイン（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）をコードするＤＮＡ（配列番号３８）を含む。ＣＨＯ−Ｌ７６１ｈ細胞への得られた重鎖プラスミドと軽鎖プラスミドとのコトランスフェクションは、必要とされるＦａｂフォーマットにおけるヒト化抗体の発現をもたらした。この抗体は、本明細書においてＡｂ６５２と呼ばれる（Ａｂ６５２Ｆａｂとも呼ばれる）。
【０２１９】
抗体Ａｂ６５２を発現する安定な細胞系の生成を促進するため、重鎖と軽鎖の発現カセット及びグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）選択マーカーの両方をコードするＤＮＡを含む単一プラスミドを生成した。ＧＳ遺伝子は、ＧＳインヒビターであるメチオニンスルホキシイミンが補充された培地中で増殖を可能にすることによって組換えＣＨＯ細胞の選択を可能とする（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９２，１０（２）：１６９−１７５）。
【０２２０】
１．２ 結合親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ技術により、リアルタイムで、しかも標識を必要とせずに生体分子間の結合が監視される。相互作用物の１つは、リガンドと呼ばれ、固相化された表面上に直接固相化されるか又は捕捉され、他方は、分析物と呼ばれ、捕捉された表面全体に溶液で流れる。センサーは、分析物がリガンドに結合し、表面上で複合体を形成するため、センサー表面上での質量変化を検出する。これは、結合プロセスに対応する。リガンドからの分析物の解離は、分析物が緩衝液によって置き換わる場合に監視される。親和性ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいては、リガンドはＡｂ６５２であり、分析物はヒトＩＬ−１３である。
【０２２１】
１．３ 受容体交差ブロックアッセイ
Ｂｉａｃｏｒｅ受容体交差ブロッキングアッセイは、抗ＩＬ−１３Ｆａｂの捕捉、次に、捕捉されたリガンド全体に流れるＩＬ−１３（第一分析物として）を必要とし、センサー表面上で安定な複合体を形成する。次に、第二分析物（組換え可溶性ＩＬ−１３受容体）は、この安定な複合体全体に流される。安定な複合体への第二分析物の結合量を監視する。安定な抗体：ＩＬ−１３複合体への第二分析物の結合を許容しない抗ＩＬ−１３抗体は、サイト１競合物質として分類される。安定な抗体：ＩＬ−１３複合体への第二分析物の結合を許容するそれらの抗ＩＬ−１３抗体は、サイト２競合物質として分類される。
【０２２２】
材料
装置
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ
センサーチップ
ＣＭ５（リサーチ等級）カタログ番号：ＢＲ−１００１−１４，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ
チップを４℃で保存した。
アミンカップリングキット
カタログ番号：ＢＲ−１０００−５０，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）。蒸留水で７５ｍｇ／ｍＬにし、−７０℃にて２００μＬアリコートで保存した。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）。蒸留水で１１．５ｍｇ／ｍＬにし、−７０℃にて２００μＬアリコートで保存した。
１Ｍエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ ｐＨ８．５。−７０℃にて２００μＬアリコートで保存した。
緩衝液
泳動緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０である）。カタログ番号：ＢＲ−１００１−８８，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ．緩衝液を４℃で保存した。
固相化緩衝液：酢酸塩５．０（１０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．０である）。カタログ番号：ＢＲ−１００３−５１，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ。緩衝液を４℃で保存した。
リガンド捕捉
Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的。
Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）カタログ番号：１０９−００６−０９７。試薬を４℃で保存した。
リガンド
Ａｂ６５２（２．５１、２１．７及び３．８６ｍｇ／ｍｌ Ｆａｂ）を４℃で保存した。
抗ｈＩＬ−１３ｍＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｏｎ．カタログ番号ＭＡＢ−２１３、ロット番号ＲＬ０４）。
分析物
組換えヒトＩＬ−１３（０．２ｍｇ／ｍｌ、Ｄ．Ｌｉｇｈｔｗｏｏｄより；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｏｎ．カタログ番号２１３−ＩＬ−０５０）を−７０℃で保存し、各アッセイについて一度解凍した。
組換えヒトＩＬ−１３受容体１ ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｏｎ．カタログ番号１４６−ＩＬ−１００）。−７０℃で保存し、各アッセイについて一度解凍した。
組換えヒトＩＬ−１３受容体２ ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｏｎ．カタログ番号６１４−ＩＬ−１００）。−７０℃で保存し、各アッセイについて一度解凍した。
再生溶液
１１．６Ｍ保存溶液（ＢＤＨ，Ｐｏｏｌｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ．カタログ番号：１０１２５４Ｈ）から蒸留水を用いた希釈によって調製された４０ｍＭ ＨＣｌ。
５０ｍＭ保存溶液から蒸留水を用いて希釈によって調製された５ｍＭ ＮａＯＨ。
カタログ番号：ＢＲ−１００３−５８、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ。
主要装置
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｌａｃｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＨＰ７ ９ＮＡ。この装置は、製造業者のプロコールにしたがって維持される。
【０２２３】
１．４ Ａｂ６５２結合親和性測定
アッセイフォーマットは、固相化された抗ヒトＦ（ａｂ’）２によるＡｂ６５２の捕捉、続く、捕捉された表面全体でヒトｈＩＬ−１３の滴定であった。
ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）はＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて行われた。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は、約４０００反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルまでアミンカップリング化学を介してＣＭ５センサーチップ上に固相化された。ブランク表面は、この手法からＦ（ａｂ’）２断片を除いて、同様の方法により調製された。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０、ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）は、泳動緩衝液として使用され、流速は１０μｌ／分であった。約０．２μｇ／ｍＬでＡｂ６５２ Ｆａｂの１０μｌ注入は、固相化された抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２による捕捉のために用いられ、十分なＩＬ−１３結合を可能にしたが、物質移動に制限された結合効果を最小限にもした。ヒトＩＬ１３は、流速を３０μＬ／分にして、種々の濃度（１０ｎＭ〜０．３１ｎＭ）の捕捉されたＡｂ６５２全体で滴定された。表面は、流速を１０μＬ／分にして、４０μＭ ＨＣｌの１０μＬ注入、続く５ｍＭ ＮａＯＨの５μＬ注入によって再生された。
【０２２４】
バックグラウンド除去結合曲線は、標準的な手法に従って、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．２）を用いて分析された。動態パラメータは適合アルゴリズムから測定された。
【表１】
【０２２５】
１．５ ＩＬ−１３受容体交差ブロッキング研究
ＢＩＡｃｏｒｅ受容体交差ブロッキングアッセイは、抗ＩＬ−１３Ｆａｂの捕捉、続く、センサー表面に安定な複合体を形成するために捕捉リガンド全体に流されるＩＬ−１３（第一分析物として）を必要とする。次に、第二分析物（組換え可溶性ＩＬ−１３受容体）をこの安定な複合体上に流す。その後、安定な複合体への第二分析物の結合量を監視する。第二分析物による安定な抗体：ＩＬ−１３複合体への結合を可能にしない抗ＩＬ−１３抗体は、Ａｘｉｓ１競合物質として分類される。第二分析物による安定な抗体：ＩＬ−１３複合体への結合を可能にするそれらの抗ＩＬ−１３抗体は、Ａｘｉｓ２競合物質として分類される。
【０２２６】
全ての実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００バイオセンサーを用いて２５℃にて行われた。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を泳動緩衝液として用い、流速は１０μｌ／分（ｍｉｎ）であった。同じセンサー表面は、親和性決定のために記載したように用いられた。
【０２２７】
抗ヒトＩＬ−１３Ｆａｂの約０．２μｇ／ｍｌの１０μｌ注射は、ヤギＦ（ａｂ’）２ＩｇＧ、抗ヒトＦ（ａｂ’）２−断片特異的センサー表面による捕捉のために使用された。０．２μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＬ−１３Ｆａｂは、十分な抗ヒトＩＬ−１３結合を与えた。２５ｎＭのヒトＩＬ−１３は、捕捉された抗体全体に注入され、続いて即座に可溶性ヒトＩＬ−１３受容体を１００ｎＭで注入し、流速は１０μＬ／分であった。表面は、２回の４０ｍＭ ＨＣｌの３０μＬ注入、続く、５ｍＭ ＮａＯＨの５μＬ注入によって再生され、流速は３０μＬ／分であった。
【０２２８】
バックグラウンド除去結合曲線は、標準的な手法に従って、製造元から提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．２）を用いて分析された。
【表２】
【０２２９】
ＩＬ−１３は、２つの受容体（ＩＬ−１３Ｒα１及びＩＬ−１３Ｒα２）のいずれかと相互作用し、複合体を形成する。ｈＩＬ−１３／ｈＩＬ−１３α１複合体だけがシグナル伝達する。したがって、ＩＬ−１３依存性シグナル伝達を阻害する抗ＩＬ−１３抗体は、ｈＩＬ−１３α１との相互作用をブロックすることによってこの効果を媒介し得る。ヒトＩＬ−１３上のＡｂ６５２の相互作用部位は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて決定することができた。Ａｂ６５２は固相化された抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面によって捕捉され、次に、順にｈＩＬ−１３がＡｂ６５２によって捕捉された。捕捉されたＩＬ−１３／抗体複合体への可溶性ＩＬ−１３Ｒα１の結合を評価した。このアッセイは、ｈＩＬ−１３Ｒα１の代わりにｈＩＬ−１３Ｒα２を用いて繰り返された。Ａｂ６５２によって示されたＩＬ−１３は、ＩＬ−１３受容体のいずれかと結合することができなかったが、市販の対照抗ＩＬ−１３抗体（ｍＡｂ２１３）は、可溶性ＩＬ−１３受容体へのＩＬ−１３を示すことができた。結論として、Ａｂ６５２は、ｈＩＬ−１３受容体サブユニットの両方に結合するＩＬ−１３を阻害し、それをＡｘｉｓ１競合物質として定義する。
【表３】
【０２３０】
１．６ 細胞系有効性
ＩＬ−１３を中和するＡｂ６５２ Ｆａｂのインビトロ有効性は、ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＳＴＡＴ−６アッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）を用いて調べられた。このアッセイは、４つのＳＴＡＴ−６結合部位に融合されたＩＦＮ−β最小プロモータの調節下で、ヒトＳＴＡＴ−６を安定に発現し、分泌性胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を安定に発現するＨＥＤ２９３細胞を含む。Ａｂ６５２の中和有効性（ＩＣ５０）は、２５０ｐｇ／ｍＬでアッセイに使用されるヒトＩＬ−１３の異なるタイプを用いて評価された。中和有効性は、細菌（大腸菌）及び哺乳動物（ラット線維芽細胞）宿主細胞から生成された組換え野生型ヒトＩＬ−１３に対して評価された。中和有効性は、ヒトＴリンパ球から生成された天然の野生型及びＲ１３０Ｑバリアント ヒトＩＬ−１３に対して、及び哺乳動物細胞において生成された組換えカニクイザルＩＬ−１３に対して評価された。Ｒ１３０Ｑ ｈＩＬ−１３を精製せず、その濃縮物をｈＩＬ−１３ ＥＬＩＳＡによって決定した。カニクイザルＩＬ−１３を精製せず、２５０ｐｇ／ｍＬのｈＩＬ−１３と、アッセイにおいて同等の応答を与える濃度で使用した。さらに、ＣＡ１５４＿６５２．ｇ２ Ｆａｂの中和有効性は、ＰＡＲＩ ｅＦＬＯＷ（登録商標）メッシュ噴霧器を用いて、噴霧後に測定された。表４：ＨＥＫ ＢｌｕｅアッセイにおけるＩＬ−１３の複数形態に対するＡｂ６５２ ＦａｂのＩＣ５０値。機能性親和性の決定のため、ＩＬ−１３滴定は、Ａｂ６５２の固定濃度の存在下で行われた。シルドプロット分析は、組換えヒト野生型ＩＬ−１３及び組換えカニクイザルＩＬ−１３の中和のためのＫＤ値を決定するデータに適用された。表５：ＨＥＫ ＢｌｕｅアッセイにおけるＩＬ−１３の複数形態に対するＡｂ６５２ ＦａｂのＩＣ５０及びＫＤ値。
【表４】
【表５】
【０２３１】
全体として、これらのデータは、Ａｂ６５２ Ｆａｂが、同様に細菌及び哺乳動物供給源から生成された、組換えの天然ヒトＩＬ−１３の中和に効力のあることを示している。このアッセイにおけるカニクイザルＩＬ−１３に対するＣＡ１５４＿６５２．ｇ２の有効性は、ラット線維芽細胞からも生じさせた抗ヒトＩＬ−１３の３分の１以下である。ＣＡ１５４＿６５２．ｇ２の有効性は、ＰＡＲＩ ｅＦＬＯＷ（登録商標）噴霧器を用いた噴霧後に変化しない。
【０２３２】
１．７ Ａｂ６５２の物理的特徴付け
上記した通り、可変領域をグラフトされた８つの異なる抗体は、選択されたラット抗体由来のＣＤＲ（配列番号１〜６、図１）を用いて生じさせた。それらの８つのグラフトからのＡｂ６５２（ｇＬ１ｇＨ２）の選択は、上記に記載された有効性及び生物物理学的特徴に基づいていた。試験された、グラフトされた可変領域の全てについて生じさせたデータに基づいて、抗体６５２は以下の理由で選ばれた：
・ｈＩＬ−１３及びバリアントＩＬ−１３に対する最も高い親和性を維持していた
・最も高い融解温度、Ｔｍ（より高い安定性の指標）を有していた
・最も高いｐＨ安定性（円偏光二色性による）、即ち、低ｐＨで少ない乱れを示した
・振とう又は噴霧時に凝集なし
【０２３３】
対照的に、試験された他のグラフトのいくつかは、結合親和性の減少、不良なｐＨ安定性、及び振とう及び／又は噴霧による凝集を示した。
【０２３４】
１．７．１ 噴霧効果
Ａｂ６５２が噴霧に適しているかどうかを決定するために、ＰＡＲＩ ｅＦＬＯＷ（登録商標）噴霧器を用いた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５中の体積２．５ｍＬのＡｂ６５２溶液は、周囲温度（約２１℃）で噴霧され、冷却された回収チューブに噴霧物を濃縮することによって回収された。その後の分析は、明らかな分解を示さなかった。また、この研究は、ＰＢＳ、ｐＨ７中の溶液を用いて繰り返された。ＩｇＧ４の陽性対照を含め、噴霧中に凝集されることが見出された。噴霧された試料の分析は、存在する凝集した材料を検出するという特定の目的で、サイズ排除、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、動的光散乱及びリガンド結合によってなされた。それらの技術のいずれによっても変化はみられず、これは、Ａｂ６５２が噴霧中の損傷に耐性であることを示した。
【０２３５】
１．７．２ Ａｂ６５２の物理的特徴付けの概要
ｐＩ（等電点） ８（２測定の平均）
熱安定性 Ｔｍ８４℃
抗体を凝集／振とう又は噴霧に供した場合にＡｂ６５２の凝集は観察されなかった。
【０２３６】
２．喘息の非ヒト霊長類モデルにおけるＡｂ６５２の効果
目的
本研究の目的は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおけるＡｂ６５２の有効性を評価することであった。主要評価項目には、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）細胞カウント、ケモカインレベル、並びに肺耐性によって評価される初期及び後期肺機能変化（ＲＬ）に対する効果が含まれた。
【０２３７】
方法
Ａｂ６５２は、メッシュ噴霧器を用いて送達された。呼吸シミュレーション研究は、典型的な換気パラメータ及び研究施設で使用される管設定を用いて行われた。呼吸シミュレーション研究の結果は、噴霧器における４０．４％の材料変化が気管内チューブのレベルで送達されたことを示した。
【０２３８】
研究動物は、過去に使用された肺機能値とＢＡＬ好酸球カウントに基づいて選択された。スクリーニングセッションでは、動物は、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）（Ａ．ｓｕｕｍ）に対するそれらの正常な（未処置）応答を特徴付けるため、処置群への割り当て前に豚回虫抗原接種を受けた。このスクリーニングセッション後、動物は、スクリーニングセッションからのＢＡＬ細胞カウント及び肺機能データに基づいて、投薬群に割り当てられた。処置セッションでは、動物は、０．１、１、１０、及び６０ｍｇ／動物／日のいずれかの噴霧器の投薬レベルで、噴霧されたビヒクル（ＰＢＳ）、又は噴霧されたＡｂ６５２を受けた。投薬は、−２、−１、１、２、及び３日目に噴霧器を介して投与された。１及び２日目に、処置投与は、豚回虫接種の約３０分前に行われた。
【０２３９】
接種手法は両セッションで同一であった。各動物は１及び２日目に接種され、肺機能値（ＲＬ）は、各抗原接種の少なくとも１５分後、及び各アレルゲン接種の２４時間後に記録された。ＢＡＬ液は、肺炎症の程度を評価するために、全細胞数、形態、及び白血球百分率の評価用に１回目の接種前、及び２回目の接種の約２４時間後に回収された。ＢＡＬ上清の試料は、ケモカイン濃度の決定のために回収され、分析された。
【０２４０】
結果
噴霧されたＡｂ６５２は、低ｍｇ／日投薬でＢＡＬエオタキシン−３の増加を有意に阻害した（図１３）。噴霧されたＡｂ６５２は、スクリーニングセッションと処置セッションとの間で測定されたＢＡＬ好酸球の増加を投薬量依存的な阻害を引き起こした（図１４）。噴霧されたＡｂ６５２は、処置セッションにおける回虫接種後の最大１５分まで測定された２日目のピーク初期反応を有意に且つ投薬量依存的に阻害した（図１５）。噴霧されたＡｂ６５２は、２日目のアレルゲン接種後の２４時間で測定された後期反応を有意に且つ投薬量依存的に阻害した（図１６）。
【０２４１】
結論
カニクイザルにおける喘息の回虫モデルでの噴霧されたＡｂ６５２により生じたデータは、ＩＬ−１３誘導のアレルギー性肺炎症が、エアロゾルにおける気道に直接的に送達される中和抗ＩＬ−１３Ｆａｂ断片によって、薬理学的調節に感受性であることを示している。顕著には、Ａｂ６５２は有力であり、低ｍｇ／日投薬量で有効性を示した。
【０２４２】
本発明は単なる例示として記載され、決して限定的にする意図はなく、詳細の変更が以下の特許請求の範囲内でなし得ることは当然理解されよう。本発明の各実施形態の好ましい特徴は、変更すべきところは変更した他の実施形態それぞれについても同様である。限定するものではないが、本明細書に引用した特許及び特許出願を含む全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物が、具体的に且つ個別に、完全に説明されたように本明細書中に参照により援用されることを示唆したかのように、本明細書中に参照により援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１３抗体及びその断片、例えばその結合断片、それを含む組成物に関し、具体的には、喘息、アレルギー、ＣＯＰＤ、線維症、及び／又は癌を含む種々の疾患の予防及び／又は治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１３は、ＩＬ−４と２５％の配列同一性を共有する短鎖サイトカインである。ＩＬ−１３は、約１３２個のアミノ酸を含み、残基１０〜２１（ヘリックスＡ）、残基４３〜５２（ヘリックスＢ）、残基６１〜６９（ヘリックスＣ）、及び残基９２〜１１０（ヘリックスＤ）の４つのヘリックス、並びに残基３３〜３６及び残基８７〜９０の２つのβ鎖を有する二次構造を形成する。ＩＬ−１３の溶液構造は判明され、ＩＬ−４で観察されてもいる、予期されたアップ−アップ−ダウン−ダウンの４つのヘリックス束の立体構造を示す（Ｅｉｓｅｎｍｅｓｓｅｒ ２００１）。
【０００３】
ヒトＩＬ−１３は、活性化Ｔ細胞からクローニングされた１７ｋＤａの糖タンパク質であり（Ｚｕｒａｗｓｋｉ及びｄｅ Ｖｒｉｅｓ １９９４ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １５ １９−２６）、Ｔｈ２系統の活性化Ｔ細胞によって産生されるが、Ｔｈ０及びＴｈ１ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、並びに肥満細胞などのいくつかの非Ｔ細胞集団もまたＩＬ−１３を産生する（Ｚｕｒａｗｓｋｉ及びｄｅ Ｖｒｉｅｓ １９９４ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １５ １９−２６）。
【０００４】
ＩＬ−１３の機能としては以下が挙げられる：
・ヒトＢ細胞におけるＩｇＥへの免疫グロブリンアイソタイプスイッチング（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ａｖｅｒｓａら １９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０ ３７３０−４）、及び
・ヒトとマウスの両方における炎症性サイトカイン産生の抑制（ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ，Ｆｉｇｄｏｒら １９９３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１ ６３７０−８１；Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｋａｓｔｅｌｅｉｎら １９９３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１ ７１５１−６０）。
【０００５】
ＩＬ−１３は、その細胞表面受容体であるＩＬ−１３Ｒアルファ１及びＩＬ−１３Ｒアルファ２に結合する。ＩＬ−１３Ｒアルファ１は、ＩＬ−１３と低親和性（ＫＤ約１０ｎＭ）で相互作用し、続いてＩＬ−４Ｒａを動員して、高親和性（ＫＤ約０．４ｎＭ）のシグナル伝達ヘテロ二量体受容体複合体を形成する（Ａｍａｎ，Ｔａｙｅｂｉら １９９６ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１ ２９２６５−７０；Ｈｉｌｔｏｎ，Ｚｈａｎｇら １９９６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３ ４９７−５０１）。
【０００６】
ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒアルファ１複合体は、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、樹枝状細胞、好酸球、好塩基球、線維芽細胞、内皮細胞、気道上皮細胞、及び気道平滑筋細胞などの多数の細胞型上で発現される（Ｇｒａｂｅｒ，Ｇｒｅｔｅｎｅｒら １９９８ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８ ４２８６−９８；Ｍｕｒａｔａ，Ｈｕｓａｉｎら １９９８ Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０ １１０３−１０；Ａｋａｉｗａ，Ｙｕら ２００１ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １３ ７５−８４）。
【０００７】
ＩＬ−１３Ｒアルファ１／ＩＬ−４Ｒ受容体複合体の連結は、シグナル伝達性転写活性化因子（ＳＴＡＴ６）を含む様々なシグナル伝達経路、及びインスリン受容体基質−２（ＩＲＳ−２）経路の活性化をもたらす（Ｗａｎｇ，Ｍｉｃｈｉｅｌｉら １９９５ Ｂｌｏｏｄ ８６４２１８−２７；Ｔａｋｅｄａ，Ｋａｍａｎａｋａら １９９６ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７ ３２２０−２）。
【０００８】
ＩＬ−１３Ｒアルファ２鎖は単独でＩＬ−１３に対して高親和性（ＫＤ約０．２５〜０．４ｎＭ）を有し、ＩＬ−１３結合を負に制御するデコイ受容体（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｗｈｉｔｔｅｒｓら １９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１ ２３１７−２４）としても、マクロファージ及び場合によっては他の細胞型においてＡＰ−Ｉ経路を介したＴＧＦ−β合成及び線維症を誘導するシグナル伝達受容体（Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌ，Ｓｔｒｏｂｅｒら ２００６ Ｎａｔ Ｍｅｄ １２ ９９−１０６）としても機能する。
【０００９】
喘息の前臨床動物モデルにおいて実施されたいくつかの研究によれば、ＩＬ−１３は喘息において重要な役割を果たすことが示されている。これらのデータとしては、ＩＬ−１３ノックアウトマウスにおける喘息に対する抵抗性、並びに種々のマウスモデルにおけるＩＬ−１３アンタゴニスト（可溶性ＩＬ−１３受容体、抗ＩＬ−１３ ｍＡｂなど）を用いた喘息表現型の阻害などが挙げられる（ＳｅＩａ １９９９ Ｈａｒｅｆｕａｈ １３７ ３１７−９；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ及びＣｈｉａｒａｍｏｎｔｅ ２００３ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ ９ ２１−７；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ ２００４ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０２ １７５−９０）。複数の研究によれば、マウス及びモルモットの肺に組換えＩＬ−１３を薬理学的に投与すると、気道粘液の分泌過多、好酸球増加症及びＡＨＲが誘導されることが示されている（Ｇｒｕｎｉｇ，Ｗａｒｎｏｃｋら １９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２２６１−３；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｌｕｙｉｍｂａｚｉら １９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２２５８−６１；Ｋｉｂｅ，Ｉｎｏｕｅら ２００３ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６７ ５０−６；Ｖａｒｇａｆｔｉｇ及びＳｉｎｇｅｒ ２００３ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８４ Ｌ２６０−９；Ｖａｒｇａｆｔｉｇ及びＳｉｎｇｅｒ ２００３ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８ ４１０−９）。
【００１０】
ＩＬ−１３のこれらの効果は、ＩＬ−１３の恒常的又は誘導性発現のいずれかを有するトランスジェニックマウス系において再現される（Ｚｈｕ，Ｈｏｍｅｒら １９９９ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０３ ７７９−８８；Ｚｈｕ，Ｌｅｅら ２００１ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６４ Ｓ６７−７０；Ｌａｎｏｎｅ，Ｚｈｅｎｇら ２００２ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０４６３−７４）。また、遺伝子導入によるＩＬ−１３の慢性的過剰発現は、上皮下の線維症及び気腫も誘導する。ＩＬ−１３（及びＩＬ−４）シグナル伝達分子のＳＴＡＴ６を欠くマウスは、アレルゲン誘導のＡＨＲ及び粘液過剰産生を示さない（Ｋｕｐｅｒｍａｎ，Ｈｕａｎｇら ２００２ Ｎａｔ Ｍｅｄ ８ ８８５−９）。可溶性ＩＬ−１３受容体融合タンパク質（ｓＤＬ−１３Ｒアルファ２Ｆｃ）を用いた研究は、アレルゲン卵白アルブミン（ＯＶＡ）誘導の実験的気道疾患におけるこのサイトカインの極めて重要な役割を示している（Ｇｒｕｎｉｇ，Ｗａｒｎｏｃｋら １９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２２６１−３；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｌｕｙｉｍｂａｚｉら １９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２２５８−６１；Ｔａｕｂｅ，Ｄｕｅｚら ２００２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９ ６４８２−９）。
【００１１】
また、抗ＩＬ−１３治療の有効性がマウス喘息の慢性モデルで示された。粘液の分泌過多及びＡＨＲの特徴を示すことに加えて、この慢性喘息モデルは、より急性なモデルにおいては欠いている、ヒト疾患のいくつかの顕著な特徴を示す。これらには、上皮空間に位置する肺組織の好酸球増加症、及びコラーゲン沈着の増加によって測定される平滑筋線維症などが挙げられる。慢性喘息モデルは、ＯＶＡによって感作されたマウスにおいて、週１回、計４週間のＯＶＡのエアロゾル接種を繰り返すことによって誘導される。（有効性の読み出しは試験の５３日目に評価され、３６日目から）ＯＶＡ接種の最後の２週間に投与された抗ＩＬ−１３抗体は、ＡＨＲ、肺炎症、杯細胞過形成、粘液分泌過多、及び気道線維症を有意に阻害した（Ｙａｎｇ，Ｌｉら ２００５ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ）。
【００１２】
また、ＩＬ−１３アンタゴニストの治療効果は、喘息の霊長類モデルにおいてＡＨＲを阻害することも示された（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ２００５）。
【００１３】
疾患の重症度と相関する高レベルのＩＬ−１３のｍＲＮＡ及びタンパク質が喘息患者の肺において検出され、ＩＬ−１３はヒト喘息の病原に関係している（Ｈｕａｎｇ，Ｘｉａｏら １９９５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５ ２６８８−９４）。さらに、ＩＬ−１３レベルの上昇をもたらすヒトＩＬ−１３遺伝的多型が確認され、喘息及びアトピーと関連し（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，Ｍａｏら ２０００ Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ９ ５４９−５９；Ｈｏｅｒａｕｆ，Ｋｒｕｓｅら ２００２ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ４ ３７−４２；Ｖｅｒｃｅｌｌｉ ２００２ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２ ３８９−９３；Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，Ｊｅｒｋｉｃら ２００３ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１２ ７３５−９；Ｃｈｅｎ，Ｅｒｉｃｋｓｅｎら ２００４ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１４ ５５３−６０；Ｖｌａｄｉｃｈ，Ｂｒａｚｉｌｌｅら ２００５ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、上昇したＩＬ−１３レベルは、喘息患者の肺において検出されている（Ｈｕａｎｇ，Ｘｉａｏら １９９５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５ ２６８８−９４；Ａｒｉｍａ，Ｕｍｅｓｈｉｔａ−Ｓｕｙａｍａら ２００２ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０９ ９８０−７；Ｂｅｒｒｙ，Ｐａｒｋｅｒら ２００４ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１４ １１０６−９）。また、より高い血漿ＩＬ−１３レベルを生じるＩＬ−１３遺伝子の多形を有する個体は、アトピー及び喘息のリスクが高く、ＩＬ−１３と喘息の遺伝的関連性も示されている（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ ２０００ Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ １ １９−２３）。
【００１４】
多様なヒト障害におけるヒトＩＬ−１３の役割に起因して、治療戦略はＩＬ−１３活性を阻害又は相殺するように設計される。特に、ＩＬ−１３に結合して中和する抗体は、ＩＬ−１３活性を阻害する手段として探し求められている。しかしながら、ＩＬ−１３、特にヒトＩＬ−１３に結合できる適切な及び／又は改善された抗体が当該技術分野では必要とされる。特に、抗体はヒトＩＬ−１３を中和することができる。本発明は、ヒトＩＬ−１３に結合可能であり、高親和性で結合可能であり、ヒトＩＬ−１３に結合して中和可能である、結合タンパク質、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、及びそれらの断片の新規ファミリーを提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、新規なＩＬ−１３特異的抗体及び断片、例えば、そのＩＬ−１３結合断片、特に中和抗体及び断片に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】重鎖（ＣＤＲ Ｈ）のＣＤＲ１、２、３、及び軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）のＣＤＲ１、２、３の各々についてのアミノ酸配列、 ラット抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 ラット抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列を示す。
【図２】シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、 ラット抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、 ラット抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列、及び シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖についてのアミノ酸配列を示す。
【図３】シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖についてのＤＮＡ配列、 ラット抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 ラット抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列を示す。
【図４】シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び ラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列を示す。
【図５】ラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列、及びシグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列を示す。
【図６】シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列を示す。
【図７】ヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 ヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、を示す。
【図８】ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、及び シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列を示す。
【図９】ヒト化抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 ヒト化抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列、及び ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、を示す。
【図１０】ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列、 シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列、及び ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列を示す。
【図１１】ヒトＶＫ １ ２−１−（１）０２ ＪＫ４アクセプターフレームワーク及びＶＨ２ ３−１ ２−２６ ＪＨ４アクセプターフレームワークについてのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示す。
【図１２】ラットに関する軽鎖、アクセプターフレームワーク、並びにヒト化軽鎖及びさらに重鎖のアラインメントを示す。ＣＤＲは、ボールド体であり、下線が付されている。ドナー残基Ｇ４９及びＲ７１は、ボールド体であり、イタリック体であり、反転表示されている。
【図１３】アレルゲン接種後の２４時間で測定されたＢＡＬエオタキシン−３に対するＡｂ６５２の効果。データは、平均±ＳＥＭで表され、１群あたりｎ＝４〜８である。
【図１４】アレルゲン接種後の２４時間で測定されたＢＡＬ好酸球数に対するＡｂ６５２の効果。データは、研究のスクリーニング段階で測定されたＢＡＬ好酸球数に対して標準化されている。平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜８／群。
【図１５】アレルゲン接種後の１５分までに測定された最大気道抵抗に対するＡｂ６５２の効果。データは、平均±ＳＥＭとして表される。ｎ＝４〜８／群。
【図１６】アレルゲン接種後の２４時間で測定された気道抵抗に対するＡｂ６５２の効果。データは、アレルゲンに暴露される前に測定された気道抵抗に対して標準化されている。平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜８／群。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
抗体可変ドメインにおける残基は、通常、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号付けされる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、米国保健社会福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以後、「Ｋａｂａｔら（前述）」）に記載されている。特に明記しない場合は、この番号付けシステムが本明細書において使用される。
【００１８】
Ｋａｂａｔ残基表記法は、アミノ酸残基の線形番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の線形アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであっても相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても、構造成分の短縮又はそこへの挿入に対応して、厳密なＫａｂａｔ番号付けの場合よりも少ない又は多いアミノ酸を含んでもよい。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同性の残基を「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とアラインメントすることにより、所定の抗体について決定してもよい。
【００１９】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置している。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７））によると、ＣＤＲ−Ｈ１に同等なループは残基２６から残基３２に伸びる。このようにして、「ＣＤＲ−Ｈ１」は、本明細書中で使用するとき、Ｋａｂａｔ番号付けシステムとＣｈｏｔｈｉａの位相的ループ定義の組み合わせによって記載すると、残基２６〜３５を含む。
【００２０】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うと、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置される。
【００２１】
一実施形態では、抗体はアンタゴニスト抗体である。
【００２２】
本明細書中で使用するとき、用語「アンタゴニスト抗体」とは、例えば、ＩＬ−１３によるＩＬ−１３受容体への結合をブロックするか又は実質的にその結合を減少させ、したがって、この受容体の活性化を阻害することによって、ＩＬ−１３の生物学的シグナル伝達活性を阻害及び／又は中和することができる抗体を表す。
【００２３】
本発明に使用するための抗体は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いて得られてもよい。ＩＬ−１３を含有する融合ポリペプチドを含むＩＬ−１３ポリペプチド、又は該ポリペプチドを（組換え的に）発現している細胞は、ＩＬ−１３を特異的に認識する抗体を産生するために用いることができる。ＩＬ−１３ポリペプチドは、「成熟な」ポリペプチド又は生物学的に活性なその断片若しくは誘導体であってもよい。ＩＬ−１３ポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当該技術分野において周知な方法によって調製されてもよく、又は天然の生物学的供給源から回収されてもよい。本出願では、用語「ポリペプチド」には、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が含まれる。これらは、他に明記されていなければ、相互交換して用いられる。ＩＬ−１３ポリペプチドは、ある場合には、例えばアフィニティータグに融合された融合タンパク質などの巨大タンパク質の一部であってもよい。
【００２４】
ＩＬ−１３ポリペプチドに対して生じた抗体は、動物の免疫付与が必要な場合は、周知であり日常的なプロトコールを用いて動物に、好ましくは非ヒト動物に該ポリペプチドを投与することによって得ることができ、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編），Ｖｏｌ ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６を参照されたい。多数の温血動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタを免疫してもよい。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが、一般的には最も適切である。
【００２５】
本発明に使用するための抗体は、全抗体及び機能的に活性なその断片又は誘導体を含み、限定されないが、モノクローナル、ヒト化された、完全なヒト又はキメラ抗体であってもよい。
【００２６】
モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって調製されてもよく、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，７７−９６頁，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が挙げられる。
【００２７】
また、本発明に使用するための抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３−７８４８；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７によって報告されている方法によって、特異的抗体を産生するために選択される単一のリンパ球から生じさせた免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによる単一のリンパ球抗体法を用いて生じさせてもよい。
【００２８】
抗体のスクリーニングは、ＩＬ−１３への結合を測定するアッセイ、及び／又は１若しくは複数のＩＬ−１３の受容体へのＩＬ−１３の結合をブロックする能力を測定するアッセイを用いて行うことができる。結合アッセイの例としては、例えば、プレートに固相化されたＩＬ−１３の融合タンパク質を用い、ＩＬ−１３に結合した抗ＩＬ−１３抗体を検出するためのコンジュゲートされた二次抗体を使用するＥＬＩＳＡが挙げられる。ブロッキングアッセイの例としては、ＩＬ−１３Ｒに結合しているＩＬ−１３リガンドタンパク質のブロッキングを測定する、フローサイトメトリーに基づくアッセイが挙げられる。蛍光標識した二次抗体を用いて、ＩＬ−１３Ｒに結合しているＩＬ−１３リガンドタンパク質の量を検出する。
【００２９】
ヒト化抗体（ＣＤＲグラフト抗体を含む）は、非ヒト種由来の１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基を移すことが単に必要なだけであり得ることは理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、場合により、ＣＤＲに由来する非ヒト種由来の１又は複数のフレームワーク残基をさらに含んでもよい。
【００３０】
キメラ抗体は、２つの異なる種に由来する成分から構成され、その結果、その成分は、それが由来する種の特徴を保持する。一般に、キメラ抗体は、１つの種、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は類似物由来の可変領域、ヒトなどの別の種由来の定常領域を含む。
【００３１】
また、本明細書に使用するための抗体は、当該技術分野において知られている様々なファージディスプレイ法によって生じさせることができ、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１−５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７−１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２−９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ，１９９７ １８７ ９−１８）、Ｂｕｒｔｏｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１−２８０）、及びＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；並びにＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８に開示された方法が挙げられる。
【００３２】
完全なヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、全てヒト起源であるか、又はヒト起源の配列と実質的に同一であるが、必ずしも同抗体由来でなくてもよい抗体である。完全なヒト抗体の例には、例えば、上記されるファージディスプレイ法によって産生される抗体、マウス免疫グロブリン可変領域遺伝子及び任意の定常領域の遺伝子が、それらのヒト対応物によって置換された、マウスによって産生される抗体が挙げられ、例えば、一般論として、ＥＰ０５４６０７３、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４、及びＥＰ０４６３１５１に報告されている。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、重鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１について図１の配列番号１に示される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列を有するＣＤＲ、及び／又はＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を有するＣＤＲを含む、上記アンタゴニスト抗体を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、重鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも２つは、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列から選択される、上記アンタゴニスト抗体を提供する。例えば、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号１に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２に示される配列を有する重鎖を含んでもよい。或いは、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号１に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号３に示される配列を有する重鎖を含んでもよく、又は抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号３に示される配列を有する重鎖を含んでもよい。疑いを避けるために、あらゆる置き換えを含むことが理解される。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、重鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含む、上記アンタゴニスト抗体を提供する。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について図１の配列番号４に示される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列を有するＣＤＲ、及び／又はＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を有するＣＤＲを含む、上記アンタゴニスト抗体を提供する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも２つは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列から選択される、上記アンタゴニスト抗体を提供する。例えば、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号４に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号５に示される配列を有する軽鎖を含んでもよい。或いは、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号４に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６に示される配列を有する軽鎖を含んでもよく、又は抗体は、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号５に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６に示される配列を有する軽鎖を含んでもよい。疑いを避けるために、あらゆる置き換えを含むことが理解される。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体であって、可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を含む、上記アンタゴニスト抗体を提供する。
【００３９】
本発明の抗体分子は、適切には、それぞれ相補的軽鎖又は相補的重鎖を含む。
【００４０】
したがって、一実施形態では、本発明に係る抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及び／又はＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列、及び／又はＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を含む。
【００４１】
ＩＬ−１３に結合し、ＩＬ−１３活性を中和する抗体の能力が著しく変更されなければ、本発明によって提供されるＣＤＲに対して、１又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失がなされてもよいことは理解されよう。アミノ酸の置換、付加及び／又は欠失のいずれによる影響も、例えば、本明細書中に記載されている方法、特に実施例に示された方法を用いて、当業者によって容易に試験され、ＩＬ−１３結合及びＩＬ−１３／ＩＬ−１３受容体相互作用の阻害を決定することができる。
【００４２】
したがって、本発明は、ＣＤＲＨ−１（配列番号１）、ＣＤＲＨ−２（配列番号２）、ＣＤＲＨ−３（配列番号３）、ＣＤＲＬ−１（配列番号４）、ＣＤＲＬ−２（配列番号５）、及びＣＤＲＬ−３（配列番号６）から選択される１又は複数のＣＤＲを含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有する抗体であって、ＣＤＲの１又は複数における１又は複数のアミノ酸が、別のアミノ酸、例えば、以下の本明細書に定義される類似のアミノ酸で置換されている、上記抗体を提供する。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、ＣＤＲＨ−１（配列番号１）、ＣＤＲＨ−２（配列番号２又は配列番号２０）、ＣＤＲＨ−３（配列番号３）、ＣＤＲＬ−１（配列番号４）、ＣＤＲＬ−２（配列番号５）、及びＣＤＲＬ−３（配列番号６）を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有する抗体であって、例えば、１又は複数のＣＤＲにおける１又は複数のアミノ酸が、別のアミノ酸、例えば、以下の本明細書に定義される類似のアミノ酸で置換されている、上記抗体を提供する。
【００４４】
一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ−１の配列は配列番号１に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ−２は配列番号２に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、及び／又はＣＤＲＨ−３は配列番号３に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。別の実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ−１の配列は配列番号１に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ−２は配列番号２に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有し、及び／又はＣＤＲＨ−３は配列番号３に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する。
【００４５】
「同一性」とは、本明細書中で使用するとき、整列された配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを指す。「類似性」とは、本明細書中で使用するとき、整列された配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似したタイプであることを指す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンで置換されてもよい。多くの場合、互いに置換され得る他のアミノ酸には、限定されないが、
フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれる。同一性及び類似性の程度は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１，ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆ Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆ Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。
【００４６】
別の実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＬ−１の配列は配列番号４に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ−２は配列番号５に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、及び／又はＣＤＲＬ−３は配列番号６に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。別の実施形態では、本発明の抗体は軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＬ−１の配列は配列番号４に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ−２は配列番号５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有し、及び／又はＣＤＲＬ−３は配列番号６に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する。
【００４７】
一実施形態では、本発明によって提供される抗体はモノクローナル抗体である。
【００４８】
一実施形態では、本発明によって提供される抗体はキメラ抗体である。
【００４９】
一実施形態では、本発明によって提供される抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６において提供されるＣＤＲ若しくはその改変体の１又は複数を含むＣＤＲグラフト抗体分子である。本明細書中で使用するとき、用語「ＣＤＲグラフト抗体分子」とは、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトされたドナー抗体（例えば、マウス又はラットモノクローナル抗体）由来の１又は複数のＣＤＲ（所望により、１又は複数の修飾されたＣＤＲを含む）を含む抗体分子を指す。概説については、Ｖａｕｇｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８を参照されたい。一実施形態では、移されている全ＣＤＲというよりはむしろ、本明細書において上記されたいずれか１つのＣＤＲ由来の特異性決定残基のほんの１又は複数が、ヒト抗体フレームワークに移されている（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照されたい）。一実施形態では、本明細書において上記された１つ又は複数のＣＤＲ由来の特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移されている。別の一実施形態では、本明細書において上記された各々のＣＤＲ由来の特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移されている。
【００５０】
ＣＤＲ又は特異性決定残基をグラフトした場合、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列は、ＣＤＲが誘導されるドナー抗体のクラス／タイプを考慮して使用されてもよく、マウス、霊長類及びヒトのフレームワーク領域が含まれる。適切には、本発明に係るＣＤＲグラフト抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域、並びに、上記される１若しくは複数のＣＤＲ又は特異性決定残基を含む可変ドメインを有する。このようにして、一実施形態では、中和ＣＤＲグラフト抗体が提供され、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む。
【００５１】
本発明において用いることができるヒトフレームワークの例としては、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭが挙げられる（Ｋａｂａｔら、上述）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に使用することができ、ＲＥＩは軽鎖に使用することができ、並びにＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖と軽鎖の両方に使用することができる。或いは、ヒト生殖系列配列を用いてもよい；http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/で利用可能である。
【００５２】
本発明に係るＣＤＲグラフト抗体では、アクセプターの重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体由来である必要はなく、所望により、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。
【００５３】
本発明のＣＤＲグラフト抗体の重鎖について適切なフレームワーク領域は、ヒト下位集団のＶＨ２配列３−１ ２−２６、並びにＪＨ４（配列番号４１）由来である。したがって、少なくとも１つの非ヒトドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲグラフト抗体であって、重鎖フレームワーク領域は、ヒト下位集団のＶＨ２配列３−１ ２−２６、並びにＪＨ４由来である、上記抗体が提供される。ヒトＪＨ４の配列は、以下の通りである：（ＹＦＤＹ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号４３）。ＹＦＤＹモチーフはＣＤＲ−Ｈ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＶ．ら，１９８１，Ｃｅｌｌ，２７，５８３−５９１）。
【００５４】
本発明のＣＤＲグラフト抗体の軽鎖について適切なフレームワーク領域は、ヒト生殖系列下位集団のＶＫ１配列２−１ １−０２、並びにＪＫ４（配列番号３９）由来である。したがって、少なくとも１つの非ヒトドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲグラフト抗体であって、軽鎖フレームワーク領域は、ヒト下位集団の配列２−１ １−０２、並びにＪＫ４由来である、上記抗体が提供される。ＪＫ４配列は、以下の通りである：（ＬＴ）ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４４）。ＬＴモチーフはＣＤＲ−Ｌ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｈｉｅｔｅｒ，ＰＡ．ら，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，１５１６−１５２２）。
【００５５】
一実施形態では、軽鎖及び／又は重鎖フレームワークは、配列番号３９〜４２に示される配列から選択される。
【００５６】
また、本発明のＣＤＲグラフト抗体では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と同じ配列を正確に有している必要はない。例えば、稀な残基は、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプについてより出現することが多い残基に変化されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域において選択された残基は、ドナー抗体と同じ位置で見られる残基に対応するように変化されてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要最小限に止めておくべきである。変化が必要とされ得るアクセプターフレームワーク領域において残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
【００５７】
適切には、本発明のＣＤＲグラフト抗体分子において、アクセプター重鎖がヒトＶＨ２配列３−１２−３６、並びにＪＨ４を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、１又は複数のドナーＣＤＲに加えて、４９位と７１位の少なくとも１つにドナー残基を含む（Ｋａｂａｔら（上述）による）（図１２を参照されたい）。
【００５８】
したがって、少なくとも、重鎖の可変ドメインの４９位と７１位の残基がドナー残基であるＣＤＲグラフト抗体が提供される。
【００５９】
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、ＣＤＲが本来誘導されている抗体由来の残基である。好ましくは、残基は、それぞれ４９位と７１位のグリシンとアルギニンである。
【００６０】
一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは配列番号３１に示される配列を含む。
【００６１】
ＩＬ−１３に結合し、ＩＬ−１３活性を中和する抗体の能力が著しく変更されなければ、本発明によって提供される抗体可変ドメインに対して、１又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失がなされてもよいことは理解されよう。アミノ酸の置換、付加及び／又は欠失のいずれによる影響も、例えば、実施例に記載されている方法を用いて、当業者によって容易に試験され、ＩＬ−１３結合及び／又はリガンド／受容体ブロックを決定することができる。
【００６２】
別の実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３１に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３１に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６３】
一実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは配列番号２３に示される配列を含む。
【００６４】
別の実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号２３に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号２３に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６５】
一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは配列番号３１に示される配列を含み、軽鎖の可変ドメインは配列番号２３に示される配列を含む。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３１に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号２３に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。適切には、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号３１に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号２３に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６７】
本発明の抗体分子は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はその断片を含んでもよく、限定されないが、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されたＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価若しくは四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、二機能性抗体、三機能性抗体、四機能性抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９−２１７を参照されたい）。これらの抗体断片を作製し、産生する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照されたい）。本発明に使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’断片、並びに国際特許出願ＷＯ２００９／０４０５６２に記載されたＦａｂ−ｄＡｂ断片が含まれる。多価抗体は、複数の特異性を含んでもよく、又は単一特異的であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。
【００６８】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択されてもよい。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインが用いられてもよく、特に、抗体分子が治療用であり、抗体エフェクター機能が要求される場合、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプであってもよい。或いは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプは、抗体分子が治療目的であり、抗体エフェクター機能が要求されない場合、例えば、単にＩＬ−１３活性をブロックするために用いられてもよい。これらの定常領域ドメインの配列改変体も使用され得ることは承認されよう。例えば、２４１位のセリンが、Ａｎｇａｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（１），１０５−１０８に報告されるようにプロリンに変更されているＩｇＧ４分子を用いてもよい。また、抗体が様々な翻訳後修飾を受けてもよいことは当業者に理解されよう。これらの修飾のタイプ及び範囲は、多くの場合、抗体を発現させるために使用される宿主細胞系並びに培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸塩異性化及びアスパラギン脱アミド化のバリエーションを含んでもよい。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因した、カルボキシ末端の塩基性残基（例えば、リシン又はアルギニン）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９−１３４，１９９５に記載される通りである）。しかしながら、本発明のＡｂ６５２実施形態の重鎖又は軽鎖のいずれかにはＣ−末端リシンが存在しない。
【００６９】
一実施形態では、抗体の重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体の軽鎖はＣＬドメインのカッパ又はラムダのいずれかを含む。
【００７０】
一実施形態では、本発明によって提供される抗体は、重鎖定常領域が修飾されたヒンジ領域を含む、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体である。したがって、本発明は、重鎖が配列番号３５に示される配列を含む又はその配列からなる抗体を提供する。
【００７１】
ＩＬ−１３に結合し、ＩＬ−１３活性を中和する抗体の能力が著しく変更されなければ、本発明によって提供される抗体可変ドメイン及び／又は定常ドメインに対して、１又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失がなされてもよいことは理解されよう。アミノ酸の置換、付加及び／又は欠失のいずれによる影響も、例えば、ＩＬ−１３結合並びにＩＬ−１３／ＩＬ−１３受容体相互作用のブロックを決定するために、本明細書に記載されている方法、特に実施例に示されている方法を用いることによって、当業者により容易に試験することができる。
【００７２】
本発明の一実施形態では、抗体は、重鎖を含み、重鎖は、配列番号３５に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。適切には、抗体は、重鎖を含み、重鎖は、配列番号３５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００７３】
一実施形態では、本発明に係る抗体分子は、配列番号２７に示される配列を含む軽鎖を含む。
【００７４】
本発明の一実施形態では、抗体は、軽鎖を含み、軽鎖は配列番号２７に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。例えば、抗体は、軽鎖を含み、軽鎖は配列番号２７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、重鎖が配列番号３５に示される配列を含み又はその配列からなり、軽鎖が配列番号２７に示される配列を含み又はその配列からなる抗体を提供する。
【００７６】
本発明の一実施形態では、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号３５に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖は、配列番号２７に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。一般に、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号３５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖は、配列番号２７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００７７】
生体分子、例えば抗体又は断片は、酸性及び／又は塩基性官能基を含み、それにより、分子に正味の正電荷又は負電荷を与える。全体の「観察された」電荷量は、実在物の絶対アミノ酸配列、３Ｄ構造における荷電基の局所環境、及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又は表面が正味の電荷を担持しないｐＨである。一実施形態では、本開示に係る抗体又は断片は、等電点（ｐＩ）が少なくとも７である。一実施形態では、抗体又は断片は、等電点が少なくとも８であり、例えば、８．５、８．６、８．７、８．８又は９である。一実施形態では、抗体のｐＩは８である。
【００７８】
本発明のＩＬ−１３抗体及び断片は、適切な等電点を有するように操作されてもよい。これは、より強固な特性、特に、適切な溶解性及び／又は安定性プロフィールを有する抗体及び／又は断片をもたらすことができる。
【００７９】
このようにして、一態様では、本発明は、初めに特定された抗体の等電点とは異なる等電点を有するように操作されたヒト化ＩＬ−１３抗体を提供する。例えば、抗体は、アミノ酸残基の置換、例えば、１又は複数の塩基性アミノ酸残基で酸性アミノ酸残基を置換することによって操作されてもよい。或いは、塩基性アミノ酸残基が付加されてもよく、又は酸性アミノ酸残基が除去され得る。或いは、分子が容認されない高いｐＩ値を有する場合、酸性アミノ酸残基は、必要に応じてｐＨを下げるように導入されてもよい。操作された抗体又は断片のｐＨは、例えば、８又はそれを超えてもよく、例えば、８．５又は９であり得る。ｐＩを操作する場合、抗体又は断片の所望の活性を保持するように注意すべきであることは重要である。このようにして、一実施形態では、操作された抗体又は断片は、「修飾されていない」抗体又は断片と同じ又は実質的に同じ活性を有する。
【００８０】
**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html及びhttp://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.htmlなどのプログラムを用いて、抗体又は断片の等電点を予測してもよい。
【００８１】
一実施形態では、本発明の抗体は、例えば、噴霧による吸入送達に適している。一例では、本発明の抗体の物理的特性、例えば結合親和性及び効力は、噴霧によって実質的に変更されない。一例では、本発明の抗体は非常に安定である。抗体安定性の１つの測定は融解温度（Ｔｍ）である。融解温度は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法、例えば、サーモフルオロ（Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ）（Ｅｒｉｃｓｓｏｎら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５７（２００６）２８９−２９８）又はＤＳＣ（示差走査熱量測定法）を用いて決定されてもよい。好ましくは、本発明によって提供される抗体は、高い融解温度（Ｔｍ）を有し、典型的には少なくとも７５℃である。一例では、本発明の抗体は、Ｔｍが少なくとも７５℃である。一例では、本発明の抗体は、Ｔｍが少なくとも８０℃である。一例では、本発明の抗体は、Ｔｍが少なくとも８３℃である。
【００８２】
また、本発明は、本発明によって提供される抗体、特に、重鎖配列（配列番号３５）及び／又は軽鎖配列（配列番号２７）を含む抗体が結合する、ヒトＩＬ−１３の特定の領域又はエピトープを提供する。
【００８３】
ヒトＩＬ−１３ポリペプチドのこの特定の領域又はエピトープは、本発明によって提供される抗体のいずれか１つと組み合わせて、当該技術分野において知られている任意の適切なエピトープマッピング法によって特定され得る。このような方法の例には、抗体によって認識されるエピトープの配列を含む抗体に特異的に結合することができる最小断片を用いて、本発明の抗体に結合させるためにＩＬ−１３由来の様々な長さのペプチドをスクリーニングすることが含まれる。ＩＬ−１３ペプチドは、合成的に産生されてもよく、又はＩＬ−１３ポリペプチドのタンパク質分解的消化によって産生されてもよい。抗体に結合するペプチドは、例えば、質量分光分析によって同定することができる。別の例では、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学を用いて、本発明の抗体によって結合されるエピトープを同定することができる。一度同定されると、本発明の抗体に結合するエピトープ断片は、必要に応じて、同エピトープに結合する追加のアンタゴニスト抗体を得るための免疫原として用いることができる。
【００８４】
本発明に係る抗体、特に、重鎖配列（配列番号３１）及び軽鎖配列（配列番号２７）を含む抗体の結合を交差ブロックする抗体は、同様に、ＩＬ−１３活性の拮抗に有用であり得る。したがって、本発明はまた、上記の抗体のいずれか１つがヒトＩＬ−１３に結合するのを交差ブロックし、及び／又はこれらの抗体のいずれか１つによってＩＬ−１３への結合が交差ブロックされる、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体を提供する。一実施形態では、このような抗体は、本明細書において上記された抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態では、交差ブロックする中和抗体は、本明細書において上記された抗体が結合するエピトープと接し、及び／又はそのエピトープと重なるエピトープに結合する。別の実施形態では、本発明のこの態様の交差ブロックする中和抗体は、本発明の抗体と同じエピトープ、或いは該エピトープと接し、及び／又は重なるエピトープには結合しない。
【００８５】
交差ブロックする抗体は、当該技術分野において任意の適切な方法を用いて、例えば、競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いることによって同定することができ、この場合、ヒトＩＬ−１３に対する交差ブロック抗体の結合は、本発明の抗体の結合を妨げ、又はその逆もある。
【００８６】
一実施形態では、重鎖が配列番号３５に示される配列を含み、軽鎖が配列番号２７に示される配列を含む抗体によるヒトＩＬ−１３への結合を交差ブロックする、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体が提供される。一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体は、配列番号３５に示される重鎖配列、及び配列番号２７に示される軽鎖配列を含む抗体の結合を、８０％を超えて、例えば８５％を超えて、例えば９０％を超えて、特に９５％を超えて阻害する。
【００８７】
選択的に又は付加して、本発明のこの態様に係るアンタゴニスト抗体は、配列番号３５に示される重鎖配列及び配列番号２７に示される軽鎖配列を含む抗体によって、ヒトＩＬ−１３への結合が交差ブロックされてもよい。したがって、配列番号３５に示される重鎖配列及び配列番号２７に示される軽鎖配列を含む抗体によってヒトＩＬ−１３への結合が交差ブロックされる、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体分子も提供される。一実施形態では、本発明のこの態様によって提供されるアンタゴニスト抗体は、配列番号３５に示される重鎖配列、及び配列番号２７に示される軽鎖配列を含む抗体によって、ヒトＩＬ−１３の結合が８０％を超えて、例えば８５％を超えて、例えば９０％を超えて、特に９５％を超えて阻害される。
【００８８】
一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体は完全にヒトである。一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体はヒト化されている。一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体は、ヒトＩＬ−１３に対する親和性が１００ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明によって提供される交差ブロック抗体は、ヒトＩＬ−１３に対する親和性が５０ｐＭ又はそれよりも良好である。
【００８９】
一実施形態では、交差ブロック抗体は、等電点が少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば８．５、８．６、８．７、８．８、８．９又は９．０である。
【００９０】
本発明の抗体分子は、適切には、高い結合親和性、特にピコモル濃度の親和性を有する。親和性は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いて測定されてもよく、この方法には、単離された天然の又は組換えＩＬ−１３を用いた、本明細書中の実施例に記載されているＢＩＡｃｏｒｅを含めた表面プラズモン共鳴法が挙げられる。一例としては、親和性は、本明細書中の実施例に記載されている組換えヒトＩＬ−１３を用いて測定される。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約１００ｐＭ又はそれより良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約５０ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約４０ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約３０ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約２０ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、完全にヒトであるか又はヒト化され、結合親和性が約１００ｐＭ又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、完全にヒトであるか又はヒト化され、結合親和性が３０ｐＭ又はそれよりも良好である。
【００９１】
本発明によって提供される抗体の親和性は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いて変更されてもよいことは理解されよう。したがって、本発明はまた、ＩＬ−１３に対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子の改変体に関する。このような改変体は、多数の親和性成熟プロトコールによって得ることができ、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、チェーンシャッフリング（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８，１９９６）、及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）が挙げられる。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）は、親和性成熟のこれらの方法を検討している。
【００９２】
一実施形態では、本発明の抗体分子は、ＩＬ−１３とＩＬ−１３受容体の相互作用をブロックし、特に、本発明の抗体分子は、ＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１の相互作用、及びＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα２の相互作用をブロックする。この相互作用をブロックする抗体の能力を決定するのに適した多数のアッセイは、本明細書中の実施例に記載されている。一実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１３に特異性を有する中和抗体を提供する。一実施形態では、アッセイに使用されるヒトＩＬ−１３受容体は、天然のヒトＩＬ−１３Ｒα１又は天然のヒトＩＬ−１３Ｒα２である。一実施形態では、アッセイに使用されるヒトＩＬ−１３受容体は、組換えヒトＩＬ−１３Ｒα１又は組換えヒトＩＬ−１３Ｒα２である。一実施形態では、アッセイに使用されるヒトＩＬ−１３は組換えヒトＩＬ−１３である。一実施形態では、中和抗体はヒト化抗体若しくは完全ヒト抗体又はその断片である。
【００９３】
所望により、本発明に使用するための抗体は、１又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートされてもよい。エフェクター分子が、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に結合できる単一部分を形成するように連結された２以上のこのような分子を含んでもよいことは承認されよう。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが望まれる場合、これは、抗体断片を直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結する、標準的な化学的又は組換えＤＮＡの手法によって調製されてもよい。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は当該技術分野において周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，第２版Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編，１９８７，６２３−５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照されたい）。具体的な化学的手法には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に記載の手法が含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されるような組換えＤＮＡ手法を用いて達成することができる。
【００９４】
エフェクター分子なる用語は、本明細書中で使用するとき、例えば、抗腫瘍薬、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成の又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート金属、ナノ粒子、及び蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出できる化合物などのレポーター基を含む。
【００９５】
エフェクター分子の例には、細胞毒素、又は細胞にとって有害（例えば致死的）である任意の薬物を含む細胞毒性剤が含まれてもよい。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。
【００９６】
また、エフェクター分子には、限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれる。
【００９７】
他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレートされた放射性核種；又は、限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を含み得る。
【００９８】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。対象となる酵素には、限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。対象となるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、限定されないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤又は抗血管新生剤、例えばアンギオスタチン又はエンドスタチン、或いはリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、又は他の増殖因子などの生物反応修飾因子、及び免疫グロブリンが挙げられる。
【００９９】
他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出トモグラフィーにおける使用のため）及び非放射性常磁性金属イオンを含む。診断としての使用のための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号全体を参照されたい。適切な酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族はストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含み、適切な蛍光物質はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンを含み、適切な発光物質はルミノールを含み、適切な生物発光物質は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み、適切な放射性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃを含む。
【０１００】
別の例において、エフェクター分子は、インビボにおける抗体の半減期の増加及び／又は抗体の免疫原性の減少及び／又は上皮バリアを越える免疫系への抗体の送達を強化できる。この型のエフェクター分子の適切な例は、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されたような、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はアルブミン結合化合物を含む。
【０１０１】
エフェクター分子がポリマーである場合、一般に、合成の又は天然に存在するポリマー、例えば、場合により置換された直鎖又は分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー、或いは分岐又は非分岐の多糖類、例えば、ホモ又はヘテロの多糖類であってよい。
【０１０２】
上記の合成ポリマーに存在してもよい特定の任意の置換基は、１又は複数のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基を含む。
【０１０３】
合成ポリマーの具体例には、場合により置換された直鎖又は分岐鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、場合により置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）及びその誘導体が挙げられる。
【０１０４】
具体的な天然に存在するポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体を含む。
【０１０５】
「誘導体」は、本明細書中で使用するとき、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択的反応基を含むものとする。反応基は、ポリマーに直接又はリンカーセグメントを介して連結されてもよい。このような基の残基が、抗体断片とポリマーとの間の連結基として、時には生成物の一部を形成することは理解されよう。
【０１０６】
ポリマーのサイズは、所望に応じて変更可能であるが、一般には、平均分子量が５００Ｄａから５００００Ｄａ、例えば５０００から４００００Ｄａ、例えば２００００から４００００Ｄａの範囲となる。ポリマーサイズは、特に、生成物の使用目的、例えば腫瘍などのある種の組織に局在する能力又は循環半減期を延長させる能力に基づいて選択できる（総説としては、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照されたい）。したがって、例えば、生成物を循環から離れて組織に浸透させようとする場合、分子量の小さいポリマー、例えば約５０００Ｄａの分子量のポリマーの使用が有利である場合がある。生成物が循環に残存する場合の適用に関しては、分子量のより大きいポリマー、例えば２００００Ｄａから４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーの使用が有利である場合がある。
【０１０７】
適したポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、或いは特にメトキシポリ（エチレングリコール）などの、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量のポリアルキレンポリマー又はその誘導体を含む。
【０１０８】
一例では、本発明において使用するための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部位に結合される。特定の一例では、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は抗体断片に位置する末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を介して結合されてもよい。このようなアミノ酸は、抗体断片中に自然に発生してもよく、又は組換えＤＮＡ法を用いて断片中に操作してもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６、ＵＳ５，６６７，４２５、ＷＯ９８／２５９７１を参照されたい）。一例において、本発明の抗体分子は修飾されたＦａｂ断片であり、修飾は抗体分子の重鎖のＣ末端への、エフェクター分子の結合を可能にする、１又は複数のアミノ酸の付加である。適切には、付加アミノ酸は、エフェクター分子が結合できる１又は複数のシステイン残基を含む、修飾されたヒンジ領域を形成する。２以上のＰＥＧ分子を結合するために複数の部位が使用できる。
【０１０９】
適切には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置した少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合されてもよい。修飾された抗体断片に結合した各ポリマーは、断片に位置したシステイン残基のイオウ原子に共有結合されてもよい。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合、又は、特にイオウ−炭素の結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばマレイミドなどのチオール選択性誘導体及びシステイン誘導体が使用されてもよい。上記のように、活性化ポリマーが、ポリマーによって修飾された抗体断片の調製において、出発物質として用いることができる。活性化ポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどの、チオール反応基を含む任意のポリマーであってもよい。このような出発物質は、市販で（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡから）得ることができる、又は市販の出発物質から、従来の化学的手法を用いて調製することができる。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ，Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）を含む。
【０１１０】
一実施形態では、抗体は、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示されている方法に従って、ＰＥＧ化された、すなわちＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））が共有結合した、修飾されたＦａｂ断片又はｄｉＦａｂである［（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ及び「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ、Ａ．２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２、５４：５３１−５４５も参照されたい］。一例では、ＰＥＧは、ヒンジ領域においてシステインに結合する。一例では、ＰＥＧ修飾されたＦａｂ断片は、修飾ヒンジ領域において単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合でき、リシン残基上の各アミン基は、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーに結合できる。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの全分子量は約４０，０００Ｄａであってもよい。
【０１１１】
一実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１３に特異性を有するアンタゴニスト抗体分子を提供し、この抗体は、配列番号３５に示される配列を含む重鎖、及び配列番号２７に示される配列を含む軽鎖を有し、その重鎖のＣ末端に、エフェクター分子が結合した少なくとも１つのシステイン残基を含む修飾されたヒンジ領域を有する、修飾されたＦａｂ’断片である。適切には、エフェクター分子はＰＥＧであり、（ＷＯ９８／２５９７１及びＷＯ２００４０７２１１６又はＷＯ２００７／００３８９８）に記載されている方法を用いて結合される。エフェクター分子は、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されている方法を用いて抗体断片に結合されてもよい。
【０１１２】
一実施形態では、抗体又は断片はエフェクター分子と結合されない。
【０１１３】
また、本発明は、本発明の抗体分子の重鎖（単数又は複数）及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。適切には、ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的方法によって作製された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０１１４】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又は全てをコードするＤＮＡ配列は、所望に応じて決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成されてもよい。
【０１１５】
アクセプターのフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者に広く利用可能であり、それらの知られたアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【０１１６】
分子生物学の標準的技術を用いて、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製しもよい。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全に又は部分的に合成され得る。部位特異的突然変異誘発法及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を必要に応じて使用することができる。
【０１１７】
適切な配列の例は本明細書中に提供される。マウスシグナルペプチドＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦ ＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号４５）などの重鎖に適したシグナルペプチドが配列中にコードされていてもよい。本発明のアンタゴニスト抗体分子を提供するために開裂されるマウスシグナルペプチドＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬ ＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号４６）などの軽鎖に適したシグナルペプチドが配列中にコードされていてもよい。また、本発明は、配列番号３２、３４又は３６又は３８を含む、本発明の抗体の重鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。また、本発明は、配列番号２４、２６、２８又は３０を含む、本発明の抗体の軽鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。
【０１１８】
ベクターを構築できる一般的な方法、トランスフェクション法及び培養方法は、当業者に周知である。この点において、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより作成されたマニアティスのマニュアル（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ）を参照する。
【０１１９】
また、本発明の抗体をコードする１又は複数のＤＮＡ配列を含む１又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるために用いられてもよい。細菌、例えば大腸菌及び他の微生物系を使用することができ、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系もまた使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマの細胞が含まれる。
【０１２０】
また、本発明は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養するステップ、及びこの抗体分子を単離するステップを含む、本発明に係る抗体分子を産生するための方法を提供する。
【０１２１】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖のポリペプチドをコードする配列だけが宿主細胞にトランスフェクトの使用に必要とされる場合には、重鎖又は軽鎖のポリペプチドだけを含んでもよい。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の作製について、細胞系に、２つのベクターである軽鎖ポリペプチドをコードする第１ベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２ベクターをトランスフェクトしてもよい。或いは、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含むベクターである単一のベクターを用いることができる。
【０１２２】
本開示に係る抗体及び断片は、宿主細胞から良好なレベルで発現される。このようにして、抗体及び／又は断片の特性は、市販用加工に最適であり、貢献すると考えられる。
【０１２３】
本発明の抗体は病態の治療及び／又は予防に有用であるため、本発明はまた、本発明の抗体分子を、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物又は診断用組成物を提供する。したがって、薬剤を製造するための本発明の抗体の使用が提供される。組成物は、薬学的に許容される担体を通常は含む、無菌の医薬組成物の一部として通常は供給されることになる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含んでもよい。
【０１２４】
また、本発明は、本発明の抗体分子を、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と共に添加又は混合すること含む、医薬組成物又は診断用組成物を調製する方法を提供する。
【０１２５】
この抗体分子は、医薬組成物又は診断用組成物における唯一の有効成分であってもよく、又は他の抗体成分、例えば、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗Ｔ細胞抗体、抗ＩＦＮγ抗体又は抗ＬＰＳ抗体、或いはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の有効成分を伴ってもよい。他の適切な有効成分には、寛容を誘導することができる抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ４抗体が含まれる。
【０１２６】
さらなる実施形態では、本開示に係る抗体、断片又は組成物は、さらなる医薬として活性のある作用物質、例えば、コルチコステロイド（例えばプロピオン酸フルチカゾン）及び／又はベータ−２−作動薬（例えばサルブタモール、サルメテロール若しくはフォルモテロール）又は細胞成長及び増殖の阻害剤（例えばラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート）、或いは選択的にＣＤ２８及び／又はＣＤ４０阻害剤と組み合わせて使用される。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【０１２７】
医薬組成物は、適切には、治療有効量の本発明の抗体を含む。用語「治療有効量」とは、本明細書中で使用するとき、標的となる疾患若しくは状態を治療、改善又は予防するために、或いは検出可能な治療効果又は予防効果を示すために必要とされる治療薬の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデルにおいて、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかにおいて、初期に推定することができる。また、動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために用いることができる。続いて、このような情報は、ヒトにおける有用な投薬量及び投与経路を決定するために用いることができる。
【０１２８】
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の全体的な健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（単数又は複数）、治療に対する反応感受性及び耐性／応答に依存する。この量は、日常の実験によって決定でき、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。或いは、投薬量は、１日あたり１〜５００ｍｇ、例えば、１日あたり１０〜１００、２００、３００又は４００ｍｇであってもよい。好都合には、医薬組成物は、所定量の本発明の活性剤を含む単位剤形で存在してもよい。
【０１２９】
組成物は、患者に個別に投与してもよく、又は他の薬物、薬剤若しくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、連続して又は別々に）投与されてもよい。
【０１３０】
本発明の抗体分子を投与する場合の投薬量は、治療される状態の性質、存在する炎症の程度、及び抗体分子が予防的に使用されるか又は現状を治療するために使用されているかどうかに依存する。
【０１３１】
投薬の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続期間に依存する。抗体分子の半減期が短い（例えば、２〜１０時間）場合、１日に１回又は複数回の投薬が必要とされ得る。或いは、抗体分子の半減期が長い（例えば２〜１５日）場合、１日に１回、１週間に１回、若しくはさらに１又は２か月に１回の投薬だけが必要とされ得る。
【０１３２】
薬学的に許容される担体は、それ自体は組成物を摂取する個体に対して有害な抗体の産生を誘導してはならず、毒性があってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウイルス粒子などの大型の緩慢に代謝される巨大分子であってよい。
【０１３３】
薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩が使用できる。
【０１３４】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、さらに水、食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含んでもよい。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質がこのような組成物中に存在してもよい。このような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液などに処方可能にする。
【０１３５】
投与の好ましい形態は、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与に適した形態を含む。生成物が注射用又は注入用である場合、油性又は水性のビヒクルにおいて懸濁液、溶液又は乳剤の形態を取ってよく、懸濁剤、防腐剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤助剤を含んでもよい。或いは、抗体分子は、使用前に適切な滅菌の液体により再構成するために、乾燥形態であってもよい。
【０１３６】
一度処方されると、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。治療されるべき対象は動物であり得る。しかしながら、１又は複数の実施形態では、組成物はヒト対象に投与するために適合される。
【０１３７】
一実施形態では、本開示に係る製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値に類似せず、これは、製剤のｐＨが７である場合、８〜９又はそれを超えるｐＩが適切であり得るためである。望ましくは理論に束縛されずに、これは、最終的には、改善された安定性を有する最終製剤を提供することができ、例えば、抗体又は断片が溶液中に留まると考えられる。
【０１３８】
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、経皮的（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内又は直腸の経路を含む、任意の数の経路によって投与できる。皮下噴射器もまた本発明の医薬組成物の投与のために使用できる。典型的には、治療用組成物は、溶液又は懸濁液のどちらかとして、注射可能に調製できる。注射前の、液体媒体中における溶液用又は懸濁液用に適した固体形態にもまた調製できる。好ましくは、本発明の抗体分子は、皮下に、吸入により又は局所に投与される。
【０１３９】
組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内によって達成され、又は組織の間質腔に送達される。組成物はまた、対象とする特定の組織内に投与され得る。投薬処置は、単回投薬スケジュール又は複数回投薬スケジュールであってもよい。
【０１４０】
組成物中の有効成分が抗体分子であることは承認されよう。そのため、消化管における分解を受けやすい。このようにして、組成物が消化管を使用する経路によって投与されるべきである場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から一度吸収されたら抗体を放出する薬物を含む必要がある。
【０１４１】
薬学的に許容される担体の詳細な考察は、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）において利用可能である。
【０１４２】
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与用の製剤として提供される。
【０１４３】
適切な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、高圧ガスを含む計量エアロゾル、又は高圧ガスを伴わない吸入可能な溶液（例えば、噴霧可能な溶液又は懸濁液）が挙げられる。活性物質を含む、本開示に係る吸入可能な粉末は、上記の活性物質だけからなっているか、又は上記の活性物質と生理学的に許容される賦形剤との混合物からなっていてもよい。
【０１４４】
これらの吸入可能な粉末は、単糖（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えば、デキストラン）、多価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれら同士の混合物を含んでもよい。単糖又は二糖が適切には使用され、それは、ラクトース又はグルコースの使用、特に、限定されないが、それらの水和物の形態である。
【０１４５】
肺における沈着用の粒子は、１０ミクロン未満の粒径を必要とし、例えば、１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍである。有効成分（例えば、抗体又は断片）の粒径は、最も重要である。
【０１４６】
吸入可能なエアロゾルを調製するために用いることができる噴射ガスは当該技術分野において知られている。適切な噴射ガスは、炭化水素、例えばｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタン、ハロ炭化水素、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体の中から選択される。上記の噴射ガスは、単独で又はそれらの混合物で使用されてもよい。
【０１４７】
特に適切な噴射ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、及びそれらの混合物が特に適している。
【０１４８】
また、噴射ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、他の成分、例えば共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤、及びｐＨを調整するための手段を含んでもよい。これらの全ての成分は当該技術分野において知られている。
【０１４９】
本発明に係る噴射ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、最大５重量％の活性物質を含んでもよい。本発明に係るエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の活性物質を含む。
【０１５０】
或いは、肺への局所投与はまた、溶液製剤又は懸濁製剤の投与によって、例えば、噴霧器などのデバイス、例えば、圧縮器に接続された噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖａ．により製造されたＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮器に接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）を用いるものであってもよい。
【０１５１】
一実施形態では、製剤は、噴霧による送達用に単位用量を含む個別のアンプルとして提供される。
【０１５２】
一実施形態では、抗体は、再構成用に、或いは懸濁製剤として凍結乾燥形態で供給される。
【０１５３】
本発明の抗体は、溶媒に分散されて、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達させることができる。適切な生理溶液、例えば、生理食塩水、薬理学的に許容される溶媒、又は緩衝液に懸濁することができる。当該技術分野において知られている緩衝液には、水１ｍｌあたり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸２ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムが含まれていてもよく、それにより、約４．０〜５．０のｐＨを達成する。上述した通り、懸濁液は、例えば、凍結乾燥させた抗体から作製することができる。
【０１５４】
また、治療用の懸濁液又は溶液製剤は、１又は複数の賦形剤を含んでもよい。賦形剤は当該技術分野において周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液及び重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる。溶液又は懸濁液をリポソーム又は生分解性マイクロスフェアにカプセル化することができる。製剤は、一般に、無菌的な製造プロセスを用いて、実質的に無菌形態で提供される。
【０１５５】
これは、処方に使用される緩衝溶媒溶液のろ過、該無菌の緩衝溶媒溶液への抗体の無菌懸濁、及び当業者によく知られている方法による無菌容器への製剤の分注による製造及び滅菌を含んでもよい。
【０１５６】
本開示にかかる噴霧可能な製剤は、例えば、アルミホイルに包まれた単一投薬量単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供されてもよい。各バイアルは、ある体積、例えば２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中の単位用量を含む。
【０１５７】
本開示の抗体は、噴霧を介した送達に適していると考えられる。
【０１５８】
また、本発明の抗体は、遺伝子治療の使用により投与されてもよいことが予測される。これを達成するために、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列が患者に導入され、その結果、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、インサイチュで集積される。
【０１５９】
また、本発明は、炎症性疾患、例えば急性又は慢性炎症性疾患の調節に使用するための抗体分子（又はそれを含む組成物）を提供する。適切には、抗体分子（又はそれを含む組成物）は、炎症過程を減少させる、又は炎症過程を妨げるために使用され得る。一実施形態では、活性化Ｔ細胞、特に、不適切な炎症性免疫応答に関与した活性化Ｔ細胞、例えば、このような応答の近辺／位置に動員される活性化Ｔ細胞のインビボでの減少がもたらされる。
【０１６０】
活性化Ｔ細胞の減少は、本明細書で用いられる場合、処置前又は処置なしと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、又はそれを超える減少であってもよい。
【０１６１】
好都合には、本発明に係る抗体、断片又は組成物による処置により、患者のＴ細胞（不活性化Ｔ細胞）の一般レベルを減少させずに、活性化Ｔ細胞のレベルを減少させることができる。これは、より少ない副作用をもたらし、おそらくは患者におけるＴ細胞減少を妨げることができる。
【０１６２】
また、本発明は、ＩＬ−１３によって媒介されるか又はＩＬ−１３レベルの増加と関連している病的障害の治療又は予防において使用するための本発明の抗体分子を提供する。
【０１６３】
病的状態又は病的障害は、例えば、感染（ウイルス、細菌、真菌及び寄生）、感染と関連した内毒素性ショック、関節リウマチなどの関節炎、重篤な喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症などの中枢神経系及び末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、狼瘡（例えば、全身性紅斑性狼瘡）及びギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、サルコイドーシス、強皮症、ヴェグナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵臓炎、外傷（外科）、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、心筋梗塞などの虚血性疾患及びアテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎、及び低塩酸症からなる群から選択されてもよい。
【０１６４】
また、本発明は、疼痛、特に炎症と関連している疼痛の治療又は予防に使用するための、本発明に係る抗体分子を提供する。
【０１６５】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、炎症の治療に対する抵抗、特に炎症の治療に対する肺抵抗を減少させる。
【０１６６】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、例えば、治療前のレベルと比較して、気管支組織のＩＬ−１３タンパク質レベルを減少させる。この減少は、５、１０、２０、３０、４０％又はそれを超えてもよい。
【０１６７】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、例えば、治療前のレベルと比較して、鼻洗浄液及び／又は気管支肺胞洗浄液におけるＩＬ−１３タンパク質レベルを減少させる。この減少は、５、１０、２０、３０、４０％又はそれを超えてもよい。
【０１６８】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、例えば、治療前のレベルと比較して、好酸球流入を減少させる。この減少は、例えば、１、２、３、４、５、６週間又はそれを超えて治療した場合、５、１０、２０、３０、４０％又はそれを超えてもよい。
【０１６９】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、例えば、慢性杯細胞過形成などの杯細胞過形成の治療において、杯細胞の不適切なレベルの減少に適している。この減少は、１、２、３、４、５、６週間又はそれを超えた治療後に観察されてもよい。
【０１７０】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、治療前のレベルと比較して、呼気の一酸化窒素（ＦｅＮＯ）レベルの減少に適している。呼気の一酸化窒素は、肺炎症の危険因子又はマーカーであると考えられている。
【０１７１】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、炎症反応と関連している不適切なコラーゲン沈着、特に気管支周囲のコラーゲン沈着の予防に適している。
【０１７２】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、炎症反応と関連した不適切な血管形成の予防に適している。
【０１７３】
このようにして、治療に使用するための本発明に係る抗体、及びそれを使用する治療方法が提供される。
【０１７４】
また、本明細書に使用される本発明に係る抗体は、本明細書に開示されている断片及び誘導体を指す。
【０１７５】
さらに、本発明は、ＩＬ−１３によって媒介されるか又はＩＬ−１３レベルの増加と関連している病的障害の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明に係る抗体分子、断片又は組成物の使用を提供し、例えば、本明細書中に記載の通り、特に、病的障害は関節リウマチ、喘息又はＣＯＰＤである。
【０１７６】
さらに、本発明は、本明細書に記載されている１又は複数の医学的兆候の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明に係る抗体分子、断片又は組成物の使用を提供する。
【０１７７】
本発明の抗体分子、断片又は組成物は、任意の治療に利用されてもよく、この場合、ヒト又は動物の生体におけるＩＬ−１３の効果を減少させることが望まれる。ＩＬ−１３は生体に循環していてもよく、又は生体の特定部位、例えば、炎症部位に望ましくないほど高レベルで局在して存在してもよい。
【０１７８】
一実施形態では、本発明の抗体分子又はそれを含む組成物は、例えば、本明細書に記載される炎症性疾患を制御するために使用される。
【０１７９】
また、本発明は、ＩＬ−１３によって媒介される障害に罹患しているか又はその危険性があるヒト又は動物対象を治療するための方法であって、有効量の本発明の抗体分子、又はそれを含む組成物を該対象に投与することを含む上記方法を提供する。一例では、抗体分子は吸入によって投与される。
【０１８０】
一例では、障害は、上記で示された医学的兆候のいずれかから選択される。一例では、障害は、喘息疾患、アトピー性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気道炎症に関連した状態、好酸球増加症、線維症及び過剰粘液産生、炎症状態、自己免疫状態、腫瘍又は癌、ウイルス感染及び防御性１型免疫応答の発現抑制からなる群から選択される。
【０１８１】
一実施形態では、抗体（特に、本発明に係る抗体又は断片）を精製するための方法が提供される。
【０１８２】
一実施形態では、抗体（特に、本発明に係る抗体又は断片）を精製するための方法であって、
不純物がカラムに保持され、抗体が非結合画分に維持されるように、非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを行うステップ
を含む上記方法が提供される。このステップは、例えば、ｐＨが約６〜８で行われてもよい。
【０１８３】
この方法は、例えば、ｐＨが約４〜５で実行される陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた初期捕捉ステップをさらに含んでもよい。
【０１８４】
この方法は、生成物を確保するための追加のクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）をさらに含んでもよく、方法に関連した不純物が製品流から適切に除かれる。
【０１８５】
また、精製方法は、濃縮及び透析ろ過ステップなどの１又は複数の限外ろ過ステップをさらに含んでもよい。
【０１８６】
このようにして、一実施形態では、精製されたＩＬ−１３抗体又は断片、例えば、実質的に精製された形態であり、特に、内毒素及び／又は宿主細胞のタンパク質若しくはＤＮＡを含まないか、又は実質的に含まない、ヒト化抗体又は断片、特に本発明に係る抗体又は断片が提供される。このように言及はしたが、本発明に係る抗体は、一般に、哺乳動物細胞で調製され、したがって、内毒素含量は通常問題にならない。実際には、内毒素含量はむしろ、抗体が細菌細胞で調製される場合に考慮される。
【０１８７】
上記で使用される精製された形態は、少なくとも９０％の純度を指すものとし、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれを超えて純粋である。
【０１８８】
内毒素が実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物１ｍｇあたりの内毒素含量が１ＥＵ未満であることを指すものとし、例えば、生成物１ｍｇあたり０．５又は０．１ＥＵである。
【０１８９】
宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡが実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物１ｍｇあたり宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含量が４００μｇ未満であるであることを指すものとし、例えば、必要に応じて、１ｍｇあたり１００μｇ未満、特に１ｍｇあたり２０μｇである。
【０１９０】
また、本発明の抗体分子は診断、例えば、ＩＬ−１３に関与する疾患状態のインビボでの診断及び画像化に使用されてもよい。
【０１９１】
本発明に係る抗体の特性を試験するための適切なインビボアッセイには、慢性イエダニモデル、メタコリンに対する過敏反応性、及び／又はアレルギー性肺炎症のオボアルブミンモデルが含まれる。
【０１９２】
本明細書との関連で含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとする。
【０１９３】
この場合、本発明の技術的に適切な実施形態を組み合わせてもよい。
【０１９４】
実施形態は、本明細書において、ある種の特徴／要素を含むものとして記載されている。また、本開示は、上記特徴／要素からなるか又は本質的に上記特徴／要素からなる実施形態を区別するように広げる。
【０１９５】
本発明は、添付の図面について言及する以下の実施例においてのみ、例示としてさらに説明される：
【０１９６】
図１は、重鎖（ＣＤＲ Ｈ）のＣＤＲ１、２、３、及び軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）のＣＤＲ１、２、３の各々についてのアミノ酸配列（配列番号１〜６）、
ラット抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号７）、
ラット抗体軽鎖の可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号８）、及び
シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号９）
を示す。
【０１９７】
図２は、シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号１０）、
ラット抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号１１）、
ラット抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号１２）、及び
シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖についてのアミノ酸配列（配列番号１３）
を示す。
【０１９８】
図３は、シグナル配列を有するラット抗体の軽鎖についてのＤＮＡ配列（配列番号１４）、
ラット抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号１５）、
ラット抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号１６）、及び
シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号１７）
を示す。
【０１９９】
図４は、シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号１８）、及び
ラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号１９）
を示す。
【０２００】
図５は、ラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２０）、及び
シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号２１）
を示す。
【０２０１】
図６は、シグナル配列を有するラット抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２２）を示す。
【０２０２】
図７は、ヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号２３）、
ヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２４）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号２５）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２６）、及び
ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号２７）
を示す。
【０２０３】
図８は、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号２８）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号２９）、及び
シグナル配列を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３０）、
を示す。
【０２０４】
図９は、ヒト化抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号３１）、
ヒト化抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３２）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（配列番号３３）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３４）、及び
ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号３５）
を示す。
【０２０５】
図１０は、ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３６）、
シグナル配列を有するヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのアミノ酸配列（配列番号３７）、及び
ヒト化抗体の重鎖可変領域及び定常領域についてのＤＮＡ配列（配列番号３８）
を示す。
【０２０６】
図１１は、ヒトＶＫ １ ２−１−（１）０２ ＪＫ４アクセプターフレームワーク（配列番号３９及び配列番号４０）及びＶＨ２ ３−１ ２−２６ ＪＨ４アクセプターフレームワークについてのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列（配列番号４１及び配列番号４２）を示す。
【０２０７】
図１２は、ラットに関する軽鎖、アクセプターフレームワーク、並びにヒト化軽鎖及びさらに重鎖のアラインメントを示す。ＣＤＲは、ボールド体であり、下線が付されている。ドナー残基Ｇ４９及びＲ７１は、ボールド体であり、イタリック体であり、反転表示されている。
【０２０８】
図１３は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおいてアレルゲン接種後の２４時間で測定されたＢＡＬエオタキシン−３に対するＡｂ６５２の効果。データは、平均±ＳＥＭで表され、１群あたりｎ＝４〜８である。
【０２０９】
図１４は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおいてアレルゲン接種後の２４時間で測定されたＢＡＬ好酸球数に対するＡｂ６５２の効果。データは、研究のスクリーニング段階で測定されたＢＡＬ好酸球に対して標準化される。平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜８／群。
【０２１０】
図１５は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおいてアレルゲン接種後の１５分までに測定された最大気道抵抗に対するＡｂ６５２の効果。データは、平均±ＳＥＭとして表される。ｎ＝４〜８／群。
【０２１１】
図１６は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおいてアレルゲン接種後の２４時間で測定された気道抵抗に対するＡｂ６５２の効果。データは、アレルゲンに暴露される前に測定された気道抵抗に対して標準化される。平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜８／群。
【実施例】
【０２１２】
１．治療抗体の作製／選択
精製されたヒトＩＬ−１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）若しくはヒトＩＬ−１３を発現しているラット線維芽細胞（培養上清中に約１μｇ／ｍｌで発現している）のいずれか、又はある場合にはこれらの２つの組み合わせでラットを免疫した。３〜６回の注射後、動物を屠殺し、ＰＢＭＣ、脾臓、骨髄及びリンパ節を回収した。血清は、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＩＬ−１３への結合について、さらに、ＨＥＫ−２９３ ＳＴＡＴ−６レポーター細胞アッセイ（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）においてｈＩＬ−１３を中和する能力について監視された。
【０２１３】
ＳＬＡＭ培地（Ｂ細胞培地）は、Ｚｕｂｌｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５）に報告されているのと同じ方法によって調製された。要約すると、免疫された動物由来の５００〜５０００個の脾臓細胞又はＰＢＭＣは、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｌｔｄ）２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、０．１％βメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、３％活性化ウサギ脾臓細胞培養上清、及びガンマ照射されたＥＬ−４−Ｂ５マウス胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で７日間、数百の９６ウェルプレートのバッチで培養された。Ｂ細胞培養上清をスクリーニングアッセイにおいて試験し、陽性の上清をマスタープレートに集めた。培養されたＢ細胞は、ＦＣＳ中の１００μｌの１０％ＤＭＳＯに−８０℃で凍結された。
【０２１４】
ＳＬＡＭ培養上清は、ＦＭＡＴにおけるビーズ系アッセイにおいて、ｈＩＬ−１３に結合するそれらの能力について最初にスクリーニングされた。これは、ストレプトアビジンビーズ上に被覆されたビオチン化ヒトＩＬ−１３及びヤギ抗ラットＦｃ−Ｃｙ５コンジュゲートを用いた均質アッセイであった。次に、このアッセイからの陽性は、ＨＥＫ−２９３ ＩＬ−１３Ｒ−ＳＴＡＴ−６レポーター細胞アッセイ（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）に送られ、中和物を同定した。その後、Ｂｉａｃｏｒｅにおいて中和上清についてプロファイルされて、オフ速度を推定し、さらに中和の作用様式を特徴付けた。中和はｂｉｎ１又はｂｉｎ２として分類された。ｂｉｎ１は、ヒトＩＬ−１３に結合する抗体を示し、ＩＬ−１３Ｒα１の結合を妨げ、さらに結果として、結合からＩＬ−４Ｒをブロックする。ｂｉｎ２は、ＩＬ−１３Ｒα１に結合するのを可能にするが、複合体へのＩＬ−４Ｒの動員を妨げるような方法でｈＩＬ−１３に結合する抗体を示す。本発明者らは、ｂｉｎ１によって作用する抗体を選択してきた。
【０２１５】
約７５００個のＩＬ−１３特異的陽性が、合計２７×１００プレートのＳＬＡＭ実験から一次ＦＭＡＴスクリーニングにおいて同定された。８００ウェルは、ＨＥＫ−ｂｌｕｅアッセイにおいて中和を示した。１７０ウェルは所望のＢｉａｃｏｒｅプロファイルであり、即ち、ｂｉｎ１抗体は、オフ速度が＜５×１０−４ｓ−１であった。これらの１７０ウェルからの可変領域のクローニングを試み、１６０が首尾よく蛍光焦点を生じさせた。１００ウェルが、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ後に重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子対を生じさせた。これらのＶ領域遺伝子は、マウスＩｇＧ１全長抗体としてクローニングされ、ＨＥＫ−２９３一過性発現系において再度発現された。配列分析により、抗ヒトＩＬ−１３抗体の２７の独特なファミリーが存在することが示された。次に、これらの組換え抗体は、組換えｈＩＬ−１３（大腸菌由来及び哺乳動物由来）、組換えバリアントｈＩＬ−１３（Ｒ１３０Ｑ）（大腸菌由来）、天然野生型及びバリアントｈＩＬ−１３（ヒトドナー由来）、並びにカニクイザルＩＬ−１３（哺乳動物由来）をブロックするそれらの能力について、細胞系アッセイにおいて再試験された。また、組換え抗体は、バリアントヒトＩＬ−１３（Ｒ１３０Ｑ）及びカニクイザルＩＬ−１３に結合するそれらの能力についてＢｉａｃｏｒｅにおいて試験された。この特徴付けの後、５つの抗体ファミリーが本発明者らの基準、即ち、全てのヒト及びカニクイザルＩＬ−１３調製物についての有効性及び親和性における最小の減少を有する１００ｐＭを下回る抗体を満たした。
【０２１６】
５つ全てのファミリーについてヒト化を行った。中和有効性、親和性及びヒト化移植片におけるドナー含有量に基づいて、ヒト化ＣＡ１５４＿６５２（下記参照）をさらなる進行のために選択した。
【０２１７】
１．１ ヒト化
本明細書に例証されたヒト化抗体は（Ａｂ６５２）、ヒト生殖系列抗体のＶ領域フレームワークに、ラット抗体のＶ領域（配列番号７及び１５）由来のＣＤＲ（配列１から６において本明細書に開示されたＣＤＲ）をグラフトすることによって調製された。ラット抗体（ドナー）のＶ領域配列とヒト生殖系列抗体（アクセプター）のＶ領域配列とのアラインメントは、設計されたヒト化配列とともに、図１２に示される。アクセプター配列にドナーからグラフトされたＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７）．Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳ）によって定義されている通りであるが、組み合わせたＣｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義が使用される場合にはＣＤＲ−Ｈ１は除かれる（Ａｄａｉｒら（１９９１）Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＷＯ９１／０９９６７参照）。ヒトＶ領域のＶＨ２ ３−１２−２６プラスＪＨ４ Ｊ領域（V BASE、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）は、重鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選ばれた。重鎖フレームワーク残基は全て、ヒト生殖系列遺伝子由来であるが、ドナー残基グリシン（Ｇ４９）及びアルギニン（Ｒ７１）が保持される場合には、それぞれ残基４９及び７１（Ｋａｂａｔ番号付け）を除く。これらの２つのドナー残基の保持は、ヒト化抗体の完全な活性に本質的である。ヒトＶ領域ＶＫ１ ２−１−（１）０２プラスＪＫ４ Ｊ領域（V BASE、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）は、軽鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選ばれた。軽鎖フレームワーク残基は全て、ヒト生殖系列遺伝子由来である。
【０２１８】
初期Ｖ領域配列をコードする遺伝子は、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ ＧｍｂＨによる自動化合成アプローチによって設計され、構築された。多数の異なる重鎖改変体は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によるＶＨ遺伝子を改変することによって作製された。ｇＬ１遺伝子配列は、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒト軽鎖発現ベクターｐＫＨ１０．１にクローニングされ、このベクターは、ヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含む−配列番号２６及び配列番号３０を参照されたい。８つのグラフトされたＶＨ遺伝子（ｇＨ１からｇＨ８）をＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒトガンマ−４重鎖発現ベクターｐＶｈγ４Ｐ ＦＬにクローニングされ、このベクターは、ヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐを有するヒトガンマ−４重鎖定常領域をコードするＤＮＡを含む（Ａｎｇａｌら，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３，３０（１）：１０５−８）。ｇＨ２ ＶＨ遺伝子は、有効性及び生物物理学的特徴について最適な重鎖グラフトとして選ばれ（本明細書の下記に記載）、次に、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒトガンマ−１ ＦａｂベクターｐＶｈγ１Ｆ３にサブクローニングされ、このベクターは、ヒトガンマ−１ ＣＨ１ドメイン（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）をコードするＤＮＡ（配列番号３８）を含む。ＣＨＯ−Ｌ７６１ｈ細胞への得られた重鎖プラスミドと軽鎖プラスミドとのコトランスフェクションは、必要とされるＦａｂフォーマットにおけるヒト化抗体の発現をもたらした。この抗体は、本明細書においてＡｂ６５２と呼ばれる（Ａｂ６５２Ｆａｂとも呼ばれる）。
【０２１９】
抗体Ａｂ６５２を発現する安定な細胞系の生成を促進するため、重鎖と軽鎖の発現カセット及びグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）選択マーカーの両方をコードするＤＮＡを含む単一プラスミドを生成した。ＧＳ遺伝子は、ＧＳインヒビターであるメチオニンスルホキシイミンが補充された培地中で増殖を可能にすることによって組換えＣＨＯ細胞の選択を可能とする（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９２，１０（２）：１６９−１７５）。
【０２２０】
１．２ 結合親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ技術により、リアルタイムで、しかも標識を必要とせずに生体分子間の結合が監視される。相互作用物の１つは、リガンドと呼ばれ、固相化された表面上に直接固相化されるか又は捕捉され、他方は、分析物と呼ばれ、捕捉された表面全体に溶液で流れる。センサーは、分析物がリガンドに結合し、表面上で複合体を形成するため、センサー表面上での質量変化を検出する。これは、結合プロセスに対応する。リガンドからの分析物の解離は、分析物が緩衝液によって置き換わる場合に監視される。親和性ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいては、リガンドはＡｂ６５２であり、分析物はヒトＩＬ−１３である。
【０２２１】
１．３ 受容体交差ブロックアッセイ
Ｂｉａｃｏｒｅ受容体交差ブロッキングアッセイは、抗ＩＬ−１３Ｆａｂの捕捉、次に、捕捉されたリガンド全体に流れるＩＬ−１３（第一分析物として）を必要とし、センサー表面上で安定な複合体を形成する。次に、第二分析物（組換え可溶性ＩＬ−１３受容体）は、この安定な複合体全体に流される。安定な複合体への第二分析物の結合量を監視する。安定な抗体：ＩＬ−１３複合体への第二分析物の結合を許容しない抗ＩＬ−１３抗体は、サイト１競合物質として分類される。安定な抗体：ＩＬ−１３複合体への第二分析物の結合を許容するそれらの抗ＩＬ−１３抗体は、サイト２競合物質として分類される。
【０２２２】
材料
装置
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ
センサーチップ
ＣＭ５（リサーチ等級）カタログ番号：ＢＲ−１００１−１４，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ
チップを４℃で保存した。
アミンカップリングキット
カタログ番号：ＢＲ−１０００−５０，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）。蒸留水で７５ｍｇ／ｍＬにし、−７０℃にて２００μＬアリコートで保存した。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）。蒸留水で１１．５ｍｇ／ｍＬにし、−７０℃にて２００μＬアリコートで保存した。
１Ｍエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ ｐＨ８．５。−７０℃にて２００μＬアリコートで保存した。
緩衝液
泳動緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０である）。カタログ番号：ＢＲ−１００１−８８，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ．緩衝液を４℃で保存した。
固相化緩衝液：酢酸塩５．０（１０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．０である）。カタログ番号：ＢＲ−１００３−５１，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ。緩衝液を４℃で保存した。
リガンド捕捉
Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的。
Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）カタログ番号：１０９−００６−０９７。試薬を４℃で保存した。
リガンド
Ａｂ６５２（２．５１、２１．７及び３．８６ｍｇ／ｍｌ Ｆａｂ）を４℃で保存した。
抗ｈＩＬ−１３ｍＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｏｎ．カタログ番号ＭＡＢ−２１３、ロット番号ＲＬ０４）。
分析物
組換えヒトＩＬ−１３（０．２ｍｇ／ｍｌ、Ｄ．Ｌｉｇｈｔｗｏｏｄより；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｏｎ．カタログ番号２１３−ＩＬ−０５０）を−７０℃で保存し、各アッセイについて一度解凍した。
組換えヒトＩＬ−１３受容体１ ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｏｎ．カタログ番号１４６−ＩＬ−１００）。−７０℃で保存し、各アッセイについて一度解凍した。
組換えヒトＩＬ−１３受容体２ ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｏｘｏｎ．カタログ番号６１４−ＩＬ−１００）。−７０℃で保存し、各アッセイについて一度解凍した。
再生溶液
１１．６Ｍ保存溶液（ＢＤＨ，Ｐｏｏｌｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ．カタログ番号：１０１２５４Ｈ）から蒸留水を用いた希釈によって調製された４０ｍＭ ＨＣｌ。
５０ｍＭ保存溶液から蒸留水を用いて希釈によって調製された５ｍＭ ＮａＯＨ。
カタログ番号：ＢＲ−１００３−５８、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ。
主要装置
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｌａｃｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＨＰ７ ９ＮＡ。この装置は、製造業者のプロコールにしたがって維持される。
【０２２３】
１．４ Ａｂ６５２結合親和性測定
アッセイフォーマットは、固相化された抗ヒトＦ（ａｂ’）２によるＡｂ６５２の捕捉、続く、捕捉された表面全体でヒトｈＩＬ−１３の滴定であった。
ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）はＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて行われた。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は、約４０００反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルまでアミンカップリング化学を介してＣＭ５センサーチップ上に固相化された。ブランク表面は、この手法からＦ（ａｂ’）２断片を除いて、同様の方法により調製された。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０、ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）は、泳動緩衝液として使用され、流速は１０μｌ／分であった。約０．２μｇ／ｍＬでＡｂ６５２ Ｆａｂの１０μｌ注入は、固相化された抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２による捕捉のために用いられ、十分なＩＬ−１３結合を可能にしたが、物質移動に制限された結合効果を最小限にもした。ヒトＩＬ１３は、流速を３０μＬ／分にして、種々の濃度（１０ｎＭ〜０．３１ｎＭ）の捕捉されたＡｂ６５２全体で滴定された。表面は、流速を１０μＬ／分にして、４０μＭ ＨＣｌの１０μＬ注入、続く５ｍＭ ＮａＯＨの５μＬ注入によって再生された。
【０２２４】
バックグラウンド除去結合曲線は、標準的な手法に従って、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．２）を用いて分析された。動態パラメータは適合アルゴリズムから測定された。
【表１】
【０２２５】
１．５ ＩＬ−１３受容体交差ブロッキング研究
ＢＩＡｃｏｒｅ受容体交差ブロッキングアッセイは、抗ＩＬ−１３Ｆａｂの捕捉、続く、センサー表面に安定な複合体を形成するために捕捉リガンド全体に流されるＩＬ−１３（第一分析物として）を必要とする。次に、第二分析物（組換え可溶性ＩＬ−１３受容体）をこの安定な複合体上に流す。その後、安定な複合体への第二分析物の結合量を監視する。第二分析物による安定な抗体：ＩＬ−１３複合体への結合を可能にしない抗ＩＬ−１３抗体は、Ａｘｉｓ１競合物質として分類される。第二分析物による安定な抗体：ＩＬ−１３複合体への結合を可能にするそれらの抗ＩＬ−１３抗体は、Ａｘｉｓ２競合物質として分類される。
【０２２６】
全ての実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００バイオセンサーを用いて２５℃にて行われた。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を泳動緩衝液として用い、流速は１０μｌ／分（ｍｉｎ）であった。同じセンサー表面は、親和性決定のために記載したように用いられた。
【０２２７】
抗ヒトＩＬ−１３Ｆａｂの約０．２μｇ／ｍｌの１０μｌ注射は、ヤギＦ（ａｂ’）２ＩｇＧ、抗ヒトＦ（ａｂ’）２−断片特異的センサー表面による捕捉のために使用された。０．２μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＬ−１３Ｆａｂは、十分な抗ヒトＩＬ−１３結合を与えた。２５ｎＭのヒトＩＬ−１３は、捕捉された抗体全体に注入され、続いて即座に可溶性ヒトＩＬ−１３受容体を１００ｎＭで注入し、流速は１０μＬ／分であった。表面は、２回の４０ｍＭ ＨＣｌの３０μＬ注入、続く、５ｍＭ ＮａＯＨの５μＬ注入によって再生され、流速は３０μＬ／分であった。
【０２２８】
バックグラウンド除去結合曲線は、標準的な手法に従って、製造元から提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．２）を用いて分析された。
【表２】
【０２２９】
ＩＬ−１３は、２つの受容体（ＩＬ−１３Ｒα１及びＩＬ−１３Ｒα２）のいずれかと相互作用し、複合体を形成する。ｈＩＬ−１３／ｈＩＬ−１３α１複合体だけがシグナル伝達する。したがって、ＩＬ−１３依存性シグナル伝達を阻害する抗ＩＬ−１３抗体は、ｈＩＬ−１３α１との相互作用をブロックすることによってこの効果を媒介し得る。ヒトＩＬ−１３上のＡｂ６５２の相互作用部位は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて決定することができた。Ａｂ６５２は固相化された抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面によって捕捉され、次に、順にｈＩＬ−１３がＡｂ６５２によって捕捉された。捕捉されたＩＬ−１３／抗体複合体への可溶性ＩＬ−１３Ｒα１の結合を評価した。このアッセイは、ｈＩＬ−１３Ｒα１の代わりにｈＩＬ−１３Ｒα２を用いて繰り返された。Ａｂ６５２によって示されたＩＬ−１３は、ＩＬ−１３受容体のいずれかと結合することができなかったが、市販の対照抗ＩＬ−１３抗体（ｍＡｂ２１３）は、可溶性ＩＬ−１３受容体へのＩＬ−１３を示すことができた。結論として、Ａｂ６５２は、ｈＩＬ−１３受容体サブユニットの両方に結合するＩＬ−１３を阻害し、それをＡｘｉｓ１競合物質として定義する。
【表３】
【０２３０】
１．６ 細胞系有効性
ＩＬ−１３を中和するＡｂ６５２ Ｆａｂのインビトロ有効性は、ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＳＴＡＴ−６アッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）を用いて調べられた。このアッセイは、４つのＳＴＡＴ−６結合部位に融合されたＩＦＮ−β最小プロモータの調節下で、ヒトＳＴＡＴ−６を安定に発現し、分泌性胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を安定に発現するＨＥＤ２９３細胞を含む。Ａｂ６５２の中和有効性（ＩＣ５０）は、２５０ｐｇ／ｍＬでアッセイに使用されるヒトＩＬ−１３の異なるタイプを用いて評価された。中和有効性は、細菌（大腸菌）及び哺乳動物（ラット線維芽細胞）宿主細胞から生成された組換え野生型ヒトＩＬ−１３に対して評価された。中和有効性は、ヒトＴリンパ球から生成された天然の野生型及びＲ１３０Ｑバリアント ヒトＩＬ−１３に対して、及び哺乳動物細胞において生成された組換えカニクイザルＩＬ−１３に対して評価された。Ｒ１３０Ｑ ｈＩＬ−１３を精製せず、その濃縮物をｈＩＬ−１３ ＥＬＩＳＡによって決定した。カニクイザルＩＬ−１３を精製せず、２５０ｐｇ／ｍＬのｈＩＬ−１３と、アッセイにおいて同等の応答を与える濃度で使用した。さらに、ＣＡ１５４＿６５２．ｇ２ Ｆａｂの中和有効性は、ＰＡＲＩ ｅＦＬＯＷ（登録商標）メッシュ噴霧器を用いて、噴霧後に測定された。表４：ＨＥＫ ＢｌｕｅアッセイにおけるＩＬ−１３の複数形態に対するＡｂ６５２ ＦａｂのＩＣ５０値。機能性親和性の決定のため、ＩＬ−１３滴定は、Ａｂ６５２の固定濃度の存在下で行われた。シルドプロット分析は、組換えヒト野生型ＩＬ−１３及び組換えカニクイザルＩＬ−１３の中和のためのＫＤ値を決定するデータに適用された。表５：ＨＥＫ ＢｌｕｅアッセイにおけるＩＬ−１３の複数形態に対するＡｂ６５２ ＦａｂのＩＣ５０及びＫＤ値。
【表４】
【表５】
【０２３１】
全体として、これらのデータは、Ａｂ６５２ Ｆａｂが、同様に細菌及び哺乳動物供給源から生成された、組換えの天然ヒトＩＬ−１３の中和に効力のあることを示している。このアッセイにおけるカニクイザルＩＬ−１３に対するＣＡ１５４＿６５２．ｇ２の有効性は、ラット線維芽細胞からも生じさせた抗ヒトＩＬ−１３の３分の１以下である。ＣＡ１５４＿６５２．ｇ２の有効性は、ＰＡＲＩ ｅＦＬＯＷ（登録商標）噴霧器を用いた噴霧後に変化しない。
【０２３２】
１．７ Ａｂ６５２の物理的特徴付け
上記した通り、可変領域をグラフトされた８つの異なる抗体は、選択されたラット抗体由来のＣＤＲ（配列番号１〜６、図１）を用いて生じさせた。それらの８つのグラフトからのＡｂ６５２（ｇＬ１ｇＨ２）の選択は、上記に記載された有効性及び生物物理学的特徴に基づいていた。試験された、グラフトされた可変領域の全てについて生じさせたデータに基づいて、抗体６５２は以下の理由で選ばれた：
・ｈＩＬ−１３及びバリアントＩＬ−１３に対する最も高い親和性を維持していた
・最も高い融解温度、Ｔｍ（より高い安定性の指標）を有していた
・最も高いｐＨ安定性（円偏光二色性による）、即ち、低ｐＨで少ない乱れを示した
・振とう又は噴霧時に凝集なし
【０２３３】
対照的に、試験された他のグラフトのいくつかは、結合親和性の減少、不良なｐＨ安定性、及び振とう及び／又は噴霧による凝集を示した。
【０２３４】
１．７．１ 噴霧効果
Ａｂ６５２が噴霧に適しているかどうかを決定するために、ＰＡＲＩ ｅＦＬＯＷ（登録商標）噴霧器を用いた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５中の体積２．５ｍＬのＡｂ６５２溶液は、周囲温度（約２１℃）で噴霧され、冷却された回収チューブに噴霧物を濃縮することによって回収された。その後の分析は、明らかな分解を示さなかった。また、この研究は、ＰＢＳ、ｐＨ７中の溶液を用いて繰り返された。ＩｇＧ４の陽性対照を含め、噴霧中に凝集されることが見出された。噴霧された試料の分析は、存在する凝集した材料を検出するという特定の目的で、サイズ排除、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、動的光散乱及びリガンド結合によってなされた。それらの技術のいずれによっても変化はみられず、これは、Ａｂ６５２が噴霧中の損傷に耐性であることを示した。
【０２３５】
１．７．２ Ａｂ６５２の物理的特徴付けの概要
ｐＩ（等電点） ８（２測定の平均）
熱安定性 Ｔｍ８４℃
抗体を凝集／振とう又は噴霧に供した場合にＡｂ６５２の凝集は観察されなかった。
【０２３６】
２．喘息の非ヒト霊長類モデルにおけるＡｂ６５２の効果
目的
本研究の目的は、喘息の非ヒト霊長類モデルにおけるＡｂ６５２の有効性を評価することであった。主要評価項目には、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）細胞カウント、ケモカインレベル、並びに肺耐性によって評価される初期及び後期肺機能変化（ＲＬ）に対する効果が含まれた。
【０２３７】
方法
Ａｂ６５２は、メッシュ噴霧器を用いて送達された。呼吸シミュレーション研究は、典型的な換気パラメータ及び研究施設で使用される管設定を用いて行われた。呼吸シミュレーション研究の結果は、噴霧器における４０．４％の材料変化が気管内チューブのレベルで送達されたことを示した。
【０２３８】
研究動物は、過去に使用された肺機能値とＢＡＬ好酸球カウントに基づいて選択された。スクリーニングセッションでは、動物は、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）（Ａ．ｓｕｕｍ）に対するそれらの正常な（未処置）応答を特徴付けるため、処置群への割り当て前に豚回虫抗原接種を受けた。このスクリーニングセッション後、動物は、スクリーニングセッションからのＢＡＬ細胞カウント及び肺機能データに基づいて、投薬群に割り当てられた。処置セッションでは、動物は、０．１、１、１０、及び６０ｍｇ／動物／日のいずれかの噴霧器の投薬レベルで、噴霧されたビヒクル（ＰＢＳ）、又は噴霧されたＡｂ６５２を受けた。投薬は、−２、−１、１、２、及び３日目に噴霧器を介して投与された。１及び２日目に、処置投与は、豚回虫接種の約３０分前に行われた。
【０２３９】
接種手法は両セッションで同一であった。各動物は１及び２日目に接種され、肺機能値（ＲＬ）は、各抗原接種の少なくとも１５分後、及び各アレルゲン接種の２４時間後に記録された。ＢＡＬ液は、肺炎症の程度を評価するために、全細胞数、形態、及び白血球百分率の評価用に１回目の接種前、及び２回目の接種の約２４時間後に回収された。ＢＡＬ上清の試料は、ケモカイン濃度の決定のために回収され、分析された。
【０２４０】
結果
噴霧されたＡｂ６５２は、低ｍｇ／日投薬でＢＡＬエオタキシン−３の増加を有意に阻害した（図１３）。噴霧されたＡｂ６５２は、スクリーニングセッションと処置セッションとの間で測定されたＢＡＬ好酸球の増加を投薬量依存的な阻害を引き起こした（図１４）。噴霧されたＡｂ６５２は、処置セッションにおける回虫接種後の最大１５分まで測定された２日目のピーク初期反応を有意に且つ投薬量依存的に阻害した（図１５）。噴霧されたＡｂ６５２は、２日目のアレルゲン接種後の２４時間で測定された後期反応を有意に且つ投薬量依存的に阻害した（図１６）。
【０２４１】
結論
カニクイザルにおける喘息の回虫モデルでの噴霧されたＡｂ６５２により生じたデータは、ＩＬ−１３誘導のアレルギー性肺炎症が、エアロゾルにおける気道に直接的に送達される中和抗ＩＬ−１３Ｆａｂ断片によって、薬理学的調節に感受性であることを示している。顕著には、Ａｂ６５２は有力であり、低ｍｇ／日投薬量で有効性を示した。
【０２４２】
本発明は単なる例示として記載され、決して限定的にする意図はなく、詳細の変更が以下の特許請求の範囲内でなし得ることは当然理解されよう。本発明の各実施形態の好ましい特徴は、変更すべきところは変更した他の実施形態それぞれについても同様である。限定するものではないが、本明細書に引用した特許及び特許出願を含む全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物が、具体的に且つ個別に、完全に説明されたように本明細書中に参照により援用されることを示唆したかのように、本明細書中に参照により援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、上記アンタゴニスト抗体。
【請求項２】
前記重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含む、請求項１に記載のアンタゴニスト抗体。
【請求項３】
軽鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む上記アンタゴニスト抗体。
【請求項４】
軽鎖をさらに含み、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、請求項１又は請求項２に記載のアンタゴニスト抗体。
【請求項５】
前記軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２についての配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を含む、請求項３又は請求項４に記載のアンタゴニスト抗体。
【請求項６】
ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ−１の配列は配列番号１に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ−２の配列は配列番号２に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ−３の配列は配列番号３に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する上記アンタゴニスト抗体。
【請求項７】
軽鎖をさらに含み、軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＬ−１の配列は配列番号４に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ−２の配列は配列番号５に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ−３の配列は配列番号６に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する、請求項６に記載のアンタゴニスト抗体。
【請求項８】
前記重鎖が配列番号３１に示される配列を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記軽鎖が配列番号２３に示される配列を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体分子が、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はその断片、例えば、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ又はｓｃＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の中和抗体分子。
【請求項１１】
配列番号３１に示される配列を含む重鎖、及び配列番号２３に示される配列を含む軽鎖を有する、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体。
【請求項１２】
軽鎖の可変ドメインが請求項１１に記載の抗体の軽鎖可変ドメインと少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、重鎖の可変ドメインが請求項１１に記載の抗体の重鎖可変ドメインと少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体。
【請求項１３】
配列番号３５に示される配列を含む重鎖、及び配列番号２７に示される配列を含む軽鎖を有する、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体。
【請求項１４】
重鎖及び軽鎖が、請求項１３に記載の抗体の対応する重鎖及び軽鎖と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する、ヒトＩＬ−１３に結合する中和抗体。
【請求項１５】
エフェクター分子又はレポーター分子が結合している、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の中和抗体分子。
【請求項１６】
３０ｐＭ又はそれより良好である、単離されたヒトＩＬ−１３に対する結合親和性を有するアンタゴニスト抗体。
【請求項１７】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体の重鎖（単数又は複数）及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項１８】
請求項１７に記載の１又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項１９】
前記ベクターが配列番号３６及び配列番号２８に示される配列を含む、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の１又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗体を単離することを含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体を産生するための方法。
【請求項２２】
請求項１から１９までのいずれか一項に記載の抗体を、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項２３】
他の有効成分をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＩＬ−１３によって媒介されるか又はＩＬ−１３レベルの増加と関連している病的障害の治療又は予防において使用するための、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項２２又は請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＩＬ−１３によって媒介されるか又はＩＬ−１３レベルの増加と関連している病的障害の治療又は予防するための薬剤の製造における、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２６】
ＩＬ−１３によって媒介される病的障害に罹患しているか又はその危険性があるヒト対象を治療するための方法であって、有効量の抗ＩＬ−１３抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を吸入によって対象に投与することを含む上記方法。
【請求項２７】
前記抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片が請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記病的障害が、喘息疾患、アトピー性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気道炎症に関連した状態、好酸球増加症、線維症及び過剰粘液産生、炎症状態、自己免疫状態、腫瘍又は癌、ウイルス感染及び防御性１型免疫応答の発現抑制からなる群から選択される、請求項２４から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
重鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、上記アンタゴニスト抗体。
【請求項２】
前記重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１に示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３に示される配列を含む、請求項１に記載のアンタゴニスト抗体。
【請求項３】
軽鎖を含む、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む上記アンタゴニスト抗体。
【請求項４】
軽鎖をさらに含み、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５に示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、請求項１又は請求項２に記載のアンタゴニスト抗体。
【請求項５】
前記軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４に示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２についての配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６に示される配列を含む、請求項３又は請求項４に記載のアンタゴニスト抗体。
【請求項６】
ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ−１の配列は配列番号１に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ−２の配列は配列番号２に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ−３の配列は配列番号３に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する上記アンタゴニスト抗体。
【請求項７】
軽鎖をさらに含み、軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＬ−１の配列は配列番号４に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ−２の配列は配列番号５に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ−３の配列は配列番号６に示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する、請求項６に記載のアンタゴニスト抗体。
【請求項８】
前記重鎖が配列番号３１に示される配列を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記軽鎖が配列番号２３に示される配列を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体分子が、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はその断片、例えば、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ又はｓｃＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の中和抗体分子。
【請求項１１】
配列番号３１に示される配列を含む重鎖、及び配列番号２３に示される配列を含む軽鎖を有する、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体。
【請求項１２】
軽鎖の可変ドメインが請求項１１に記載の抗体の軽鎖可変ドメインと少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、重鎖の可変ドメインが請求項１１に記載の抗体の重鎖可変ドメインと少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体。
【請求項１３】
配列番号３５に示される配列を含む重鎖、及び配列番号２７に示される配列を含む軽鎖を有する、ヒトＩＬ−１３に結合するアンタゴニスト抗体。
【請求項１４】
重鎖及び軽鎖が、請求項１３に記載の抗体の対応する重鎖及び軽鎖と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する、ヒトＩＬ−１３に結合する中和抗体。
【請求項１５】
エフェクター分子又はレポーター分子が結合している、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の中和抗体分子。
【請求項１６】
３０ｐＭ又はそれより良好である、単離されたヒトＩＬ−１３に対する結合親和性を有するアンタゴニスト抗体。
【請求項１７】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体の重鎖（単数又は複数）及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項１８】
請求項１７に記載の１又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項１９】
前記ベクターが配列番号３６及び配列番号２８に示される配列を含む、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の１又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗体を単離することを含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体を産生するための方法。
【請求項２２】
請求項１から１９までのいずれか一項に記載の抗体を、１又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項２３】
他の有効成分をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＩＬ−１３によって媒介されるか又はＩＬ−１３レベルの増加と関連している病的障害の治療又は予防において使用するための、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項２２又は請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＩＬ−１３によって媒介されるか又はＩＬ−１３レベルの増加と関連している病的障害の治療又は予防するための薬剤の製造における、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２６】
ＩＬ−１３によって媒介される病的障害に罹患しているか又はその危険性があるヒト対象を治療するための方法であって、有効量の抗ＩＬ−１３抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を吸入によって対象に投与することを含む上記方法。
【請求項２７】
前記抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片が請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記病的障害が、喘息疾患、アトピー性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気道炎症に関連した状態、好酸球増加症、線維症及び過剰粘液産生、炎症状態、自己免疫状態、腫瘍又は癌、ウイルス感染及び防御性１型免疫応答の発現抑制からなる群から選択される、請求項２４から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１２−５２００６７（Ｐ２０１２−５２００６７Ａ）
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５３５０９（Ｐ２０１１−５５３５０９）
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０００４３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０３２７４
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０００４３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０３２７４
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
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