ピロール主体のポリマーへとタンパク質を取り付ける方法およびこれのセンサーを生産するための使用
本発明の狙いは、タンパク質を、導電性ポリマーへと取り付ける方法を提供することであり、これは特に、センサーまたはマルチセンサー、例えばバイオチップを生産するのに使用され得る。
この狙いおよび他の狙いも、本発明に従って、タンパク質をピロールポリマーへと取り付ける以下のステップ：
ピロールに取り付けられるべき該タンパク質をカップリングさせ、タンパク質−ピロールカップリング化合物の第１溶液を得るステップ；
該タンパク質を含有しない第２ピロール溶液を調製するステップ；
該第１溶液を該第２溶液と混合し、電気重合溶液を得るステップ；
該電気重合溶液を使用する、導電性支持体上における該ピロールとピロールへとカップリングされた該タンパク質との電気重合ステップ
を含む方法により達成される。
この狙いおよび他の狙いも、本発明に従って、タンパク質をピロールポリマーへと取り付ける以下のステップ：
ピロールに取り付けられるべき該タンパク質をカップリングさせ、タンパク質−ピロールカップリング化合物の第１溶液を得るステップ；
該タンパク質を含有しない第２ピロール溶液を調製するステップ；
該第１溶液を該第２溶液と混合し、電気重合溶液を得るステップ；
該電気重合溶液を使用する、導電性支持体上における該ピロールとピロールへとカップリングされた該タンパク質との電気重合ステップ
を含む方法により達成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロール主体のポリマーへとタンパク質を取り付ける方法に関し、この方法の、センサー、特にマルチセンサー、例えばバイオチップを生産するための使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術は、特にセンサー生産に関して、特にバイオチップの分野において、タンパク質の活性を変えてしまうことなく導電性ポリマー上において該タンパク質を不動化させること、特に、２つの異なるタンパク質を別個に不動化させることを可能にするものではなく、大きな困難を抱えている状態に留まっている。
【０００３】
事実、タンパク質、例えば、酵素、抗体、受容体、およびある種の抗原は、標的分子に対する認識部位、または、それらが他の分子により認識され得る部位を持っている。これらの部位は、それらの活性（単数または複数）に関して応答性である。例えば酵素は、それの基質に関して特異的な部位を持ち、抗体は、それに対応する抗原による認識を可能にする特異的エピトープを持ち、抗原は、それが標的とするエピトープに対して特異的な認識部位を持っている。これらの部位は一般的に、空間におけるタンパク質自体における該タンパク質の折り畳みによって形成され、この折り畳みは、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、および疎水性結合により、安定化され得る。この折り畳みおよびこの結果として形成されるこれらの部位はこれゆえに、該タンパク質にかかる単純な歪み、立体障害、または、イオン強度、ｐＨ、もしくは溶媒温度の変化により、容易に不安定化され得る。加えてこれらの部位は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、または−ＳＨ官能基のような、前記導電性ポリマーへの該タンパク質の取り付けの間に使用される試薬またはモノマーと反応し得る反応性官能基を持っており、これゆえにダメージを受け、妨害を受け、または障害を受けることが考えられる。
【０００４】
このような部位を持つタンパク質を表面へと取り付けるのに使用される方法はこれゆえに、この部位を活かすためには、できるだけ遠くにこの部位を保たねばならず、これにより、生産されるバイオセンサーはその機能を果たし、できるだけ精確、敏感、および再現性あるサンプル分析結果を提供するのである。
【０００５】
当業者にとって既知の技術では、導電性ポリマーへのタンパク質の不動化は、４つの異なる技術を使用し得る。これら４つの技術は、捕捉、後での官能基化、非共有結合によるタンパク質の不動化、および共有結合によるタンパク質の不動化である。これらの技術は添付の図面１〜４に、ダイヤグラムにより表される。これらの図面では、「Ｐ」および「Ｐａ」はそれぞれタンパク質および活性化されたタンパク質を表し、「ｍ」および「ｍａ」はそれぞれポリマーのモノマーおよび活性化されたモノマーを表し、「Ｐ−ｍ」はタンパク質−モノマーカップリング化合物を表し、「Ｍ」および「Ｍａ」はそれぞれ該ポリマーおよび活性化された該ポリマーを表す。
【０００６】
捕捉技術では、モノマーはタンパク質の存在下に、重合（化）に付される。形成時に、該ポリマーはその網目中に、このタンパク質を捕捉する。この技術は、例えば、ＦｏｕｌｄｓおよびＬｏｗｅによるＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｆａｒａｄａｙ Ｔｒａｎｓ．１９８６，８２，１２５９−１２６４に記載され、添付の図１に示される。タンパク質が不動化される前に該タンパク質を修飾せずに済むのでこの技術は有利であり、このため原理的に、該タンパク質活性をより良く保存することができる。この方法はより最近、Ｏ．Ａ．ＳａｄｉｋらによるＴａｌａｎｔａ ２００１，５５：９２９−９４１にも記載された。
【０００７】
不運なことにこの方法は、捕捉による不動化のメカニズムが原因で、選択される電極上へ、電流を介してタンパク質だけを標的とすることを可能にするものではなく、付着毎に起きる（他の）付着物の混入なしには、異なるタンパク質を幾つか付着させることを可能にするものでもない。事実、この技術では、引き続いての付着物の重合の間に、タンパク質は部分的には捕捉され、部分的には放出されることがあり、これゆえに、後からのものを混入させてしまうことがある。加えて、不動化時間は非常に長く、混入はこれらの付着の間に可能であり、これはマルチセンサー生産を困難にし、結果として、モノ（単）センサー生産に使用される。
【０００８】
更にそれは、ポリマー塊における不動化からなる技術であり、これは結果的に、以下の様々な欠点を与える：
タンパク質の活性部位への接近の減少、更には離脱。
タンパク質が、研究された溶媒のそれとは非常に異なる極性の溶媒中に封じ込められるという事実によるもの。例えば、分析されるべきサンプル。該タンパク質とその標的との間での認識が、上記の立体障害に加えて（更に）妨害される。
もし、該タンパク質とその標的との間での認識が、該タンパク質の構造の変化を要求または誘導する場合、この変化は、ポリマーの堅さにより障害されることがある。
該タンパク質のその標的との相互作用の検出は、その質量においてのみ可能であり、これは、最も汎用の光学的分析方法を可能でなくすものである。
一方それは、例えばバイオセンサー形態の電気化学的検出には、非常に適している。
【０００９】
加えてこの技術は、タンパク質を封じ込めるために、極めて分厚いポリマーを必要とする。これは、以下の欠点を持っている：
使用されるタンパク質の量が、単一の付着の場合よりも多くなければならない。
電流へ晒す時間が、より長くなくてはならない。上記のＳａｄｉｋらの文献によれば、電荷密度は２ｎＣ／ｍｍ２のオーダー、つまり、約５００ｎｍのポリマー厚である。
【００１０】
尚もう１つ別の欠点は、もしタンパク質の捕捉が完璧でなかった場合、これは結果的に、連続する重合の間、使用の間、または保管の間におけるタンパク質の量の損失に繋がり、センサー感度を低下させ、マルチセンサーの場合では混入を伴うという事実である。
【００１１】
後での官能基化の技術は、添付の図２にダイヤグラム的に表される。それは主に、ＮＨ２もしくはＳＨ基で官能基化されている支持体上への、活性エステルもしくはマレイン酸イミドにより活性化済みのタンパク質のグラフト化、あるいは逆に、活性エステルもしくはマレイン酸イミドによりそれぞれ活性化済みの支持体上への、タンパク質のリジン由来のＮＨ２基もしくはシステイン由来のＳＨ基を使用しての、官能基化されていてもよくもしくはされていなくてもよいこれらのタンパク質のグラフト化を含むものである。この方法は、例えば、Ｗ．ＳｃｈｕｈｍａｎによるＭｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １２１，１−２９（１９９５）に記載されるものである。それは、表面検出を誘導する表面グラフト化を可能にするものである。
【００１２】
このグラフト化は不運にも、含まれる官能基の弱い反応性のために、コントロールが容易でない。加えてそれは、モノセンサー生産に適するものであり、多大な困難を伴ってのみ、マルチセンサー生産を可能にする。事実、幾つかのスポットを含有するマルチセンサーを生産したい場合、この技術においては反応性が弱いので、第１スポットの全ての官能基が、例えば第２タンパク質が第２スポットへと取り付けられる時点において既に反応してしまっているわけではなく、これゆえに、該第１スポット上における該第２タンパク質の混入が見られる。これを避けるために、該タンパク質は、選択された付着物上へとのみ導入されねばならない。局在化される様式で微小滴を塗布することは効果的に可能ではあるが、それら（該微小滴）の蒸発速度は非常に速く、この反応はコントロールが難しいので、これをミニチュア化するのは困難であることが考えられる。この場合、標的化は、例えばインクジェットシステムを使用して機械的に実施されなくてはならないので、導電性タイプのポリマー支持体を使用することに対する利点はない。このような技術は、ガラス・スライド上においてタンパク質チップを生産するのに使用され、これは、Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年９月８日，２８９巻，１７６０−１７６３に記載される通りである。
【００１３】
これらのタンパク質の化学修飾の先行技術を用いない、タンパク質の非共有結合による不動化技術が、添付の図３に表される。この技術においては、ビオチン−アビジン系が使用される。Ｆａｒｍａｋｏｖｓｋｙらによる文献ＷＯ００／１１４７３が、この技術を記載している。吸着により多かれ少なかれよく不動化されるタンパク質を有する導電性ポリマーが、形成される。
【００１４】
該支持体への取り付けが非常に弱いという事実は、この電極の保管およびマルチセンサー生産に関して、ある意味においては好ましくない。
【００１５】
第４の技術は、共有結合による捕捉である。これは、添付の図４にダイヤグラムにより表される。この技術は、Ｗｏｌｏｗａｃｚ，Ｓ．Ｅ，、Ｙｏｎ Ｈｉｎ Ｂ．Ｆ．Ｙ．、およびＬｏｗｅ Ｃ．Ｒ．による先行技術Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，６４，１５４１−１５４５に記載されている。この著者は、ピロールへと共役させ、ピロールとの共重合に付す方法で、酵素、グルコースオキシダーゼ（酸化酵素）を調製した。該酵素上へとグラフト化されたピロールは、１種のポリピロール・コーティングされた該酵素を、電気重合および不動化させる。
【００１６】
該酵素は該ピロール中に捕捉され、不運にもこのことが、その外側にある溶媒および埋没したそれの活性部位へのそれのアクセスを制限してしまう。このアクセスは、ある場合においては観測され得るが、前記した刊行物中でのグルコースのような非常に小さな分子に関してのみであり、これは、該ポリピロールの網目のメッシュ中へと浸透することができるものである。事実、前記した捕捉技術の欠点はそのままで、安定性のみが向上する。
【００１７】
これゆえに、先行技術の方法の欠点、限界、短所、および不利を持たない導電性ポリマーへとタンパク質を取り付ける方法に対する、真の必要性が存在している。
【００１８】
加えてこの方法に関しては、それが先行技術の方法およびセンサーの欠点、限界、短所、および不利を持たないように、センサー生産、特にマルチセンサー生産に使用され得るようでなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の狙いは、精確には、導電性ポリマーへとタンパク質を取り付ける方法を提供することであり、これは特に、モノセンサーまたはマルチセンサー生産に使用され得、これは中でも、前記した必要性を満足するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この狙いおよび他の狙いも、本発明、ピロールポリマーにより導電性支持体へとタンパク質を取り付ける方法により達成され、これは以下のステップを含む：
取り付けられるべきタンパク質をピロールモノマーとカップリングさせ、タンパク質＋ピロールカップリング化合物の第１溶液を得るステップ；
該タンパク質へとカップリングされていないピロールモノマーの第２溶液を調製するステップ；
該第１溶液を該第２溶液と混合して、電気重合溶液を得るステップ；
該電気重合溶液を使用する、前記導電性支持体の少なくとも１つの所定の領域上において、該ピロールとピロールへとカップリングされた該タンパク質との電気重合ステップ（該電気重合は該領域上へ、１〜５００μＣ／ｍｍ２の電流量を送ることにより実施）。
【００２１】
本発明によれば、用語「ピロールモノマー」とは、ピロールのモノマーまたはピロールの重合可能な誘導体を意図するものである。本発明において使用され得る該ピロールモノマーは、バイオチップ生産方法において当業者に知られているものである。ピロール誘導体としては、例えば、メチルピロールまたは置換もしくは無置換ピロールダイマーが挙げられてよい。
【００２２】
本発明によれば、１つ以上のタンパク質が、本発明の方法により、支持体へと取り付けられ得る。当業者は、本記載に照らせば、彼らの必要性に従って、その各々が選ばれた該ピロールモノマーへとカップリングされ、該支持体の１つ以上の領域上へと付着される１つ以上のタンパク質を有する電気重合溶液をどのように調製するかを理解するであろう。
【００２３】
本発明によれば、「該支持体領域」との表現は、「ブロック」、例えばバイオチップ支持体ブロックを意味することをも意図するものである。本発明によれば、該電気重合は、例えば種々のタンパク質を用いて、幾つかの領域においてもしくは生産されたバイオチップのブロック上において同時に、または、幾つかの領域においてもしくは生産されたバイオチップのブロック上において連続して実施され得る。領域またはブロックの数の選択は、特にバイオセンサーの所望の解像度、および、所望の該バイオセンサーを用いて実施され得る同時解析の数に依存するであろう。領域またはブロックのこの数は、当業者に既知のバイオチップに関しては決めることができる。本発明の目的では、前記導電性支持体はこのため有利に、１つ以上のブロックを有するバイオチップ支持体であり得る。本発明の方法はこのため、所望されるモノセンサーまたはマルチセンサー生産を可能にする。
【００２４】
本発明は驚くべきことに、ポリマーへと取り付けられたかもしくは該ポリマー上において不動化されたタンパク質の活性、例えば大きな分子に関するタンパク質の認識特性、例えば抗原のそれに対応する抗体に関する認識特性を、保存することを可能ならしめる。
【００２５】
このことは、ピロールがタンパク質のアミノ基の大部分と反応するので、先行技術では不可能であった。今や本発明の方法により、全く予想外にも、本発明者らはポリピロール＋タンパク質付着物を生成させており、ここで薄層ポリマー中においてもしくは薄層ポリマー上において不動化されたタンパク質の活性は、保存されている。加えて本発明は、更に該タンパク質の活性を保存する極薄フィルムを構築することを可能にする。
【００２６】
事実、本発明者らは、彼らがタンパク質と反応させた種々のピロールを調製しており、これは以下の実施例に示される通りである。これらの共役タンパク質は引き続いて、ピロールとの電気重合により不動化される。それなりに、そして、問題となっている現象に関する知識の欠如にもかかわらず、彼らはこの方法により、導電性基板上へと抗原タンパク質を標的化することができ、それらを特異抗体により認識させることができた。
【００２７】
本発明者らは、この認識を蛍光を用いて研究し、これは、タンパク質がその表面において本当に不動化されることを彼らが証明できるようにしたが、これは、該蛍光が、ポリピロール・マトリックス外でのみ検出され得るからである。これは、本発明による電気重合による不動化および抗体のように嵩高いことがあるもう１つ別の分子による認識をも確認できるようにした。
【００２８】
本発明者らはまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）画像化研究をも行ったが、これは、それがリアルタイムでの分析法であるという事実によるものであり、分析の観点おいて更に進展することを可能にするものである。これらの速度論的研究は、本発明の方法の利点により、タンパク質活性の保存のより良い評価を得ることを可能にするものである。更にこの分析法は、Ｐ．ＧｕｅｄｏｎらによるＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００），７２，（２４），６００３−６００９に記載のように、金層から非常に近い距離において起きる生物学的相互作用を検出することのみに関してよく知られている。この距離はしばしば、５０ｎｍ未満である。
【００２９】
これら２つの実験から、該相互作用が、ポリマー（蛍光）表面およびこの金に非常に近いところの両方において起きることが確かめられる。このことは、該ポリマーが非常に薄くなければならないことを意味するが、これは、本発明の方法による場合に該当する。
【００３０】
このため本発明によれば、電気重合は、該電気重合の間に送られる電流量を限定することにより実施される。このため結果として、より良い結果が得られている。本発明による電流量は、ポリピロール鎖長を限定することが可能である。このことはこれゆえに、固定化される場合、タンパク質活性の損失を限定するであろう。もう１つ別の可能性は、該重合が電極の直近において起き、このことが、この電極から最も遠いタンパク質の一部上での該ピロール重合を最小化させる効果を持ち、このためそれの認識活性を保存する効果を持つということであり得るであろう。本発明者らは、電場に関して反応溶媒よりもより導電性の低いタンパク質によるスクリーニングが、恐らくより存在しているものと考えている。
【００３１】
このため、該電気重合は、１〜５００μＣ／ｍｍ２、好ましくは５〜１００μＣ／ｍｍ２の電流量を前記領域上へと送ることにより、本発明の電気化学的電気重合方法により実施される（該電流量は、該領域の電気的分極により送られ得る）。この結果として、非常に有利なことに、１０ｎｍ未満であってもよい厚さを持つポリマーの形成が見られる。例としてこの重合は、該領域に適用される５００ミリ秒間で１Ｖ／ＥＣＳの電気パルスにより、本発明により実施され得る。
【００３２】
本発明によれば、取り付けられるべきタンパク質のピロールとのカップリングが、該ピロールの活性化により実施され得、次に、活性化された該ピロールの、取り付けられるべき該タンパク質へのカップリングが続く。活性化された該ピロールは例えば、そのリジンのアミノ基上において活性なピロール活性エステル、または、そのシステインの−ＳＨ基上において活性なマレイン酸イミドピロールであってもよい。これらの例は限定的なものではなく、当業者は本発明の方法をどのように他のピロール活性化に適合させるか、理解するであろう。
【００３３】
本発明によれば、該ピロール活性化は、例えばＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドまたはマレイン酸イミドを用いて実施され得る。
【００３４】
本発明によれば、このタンパク質−ピロールカップリング化合物は、有利には以下の化合物から選ばれ得る。
【００３５】
【化１】
【００３６】
本発明の特定の実施形態によれば、幾つかのタンパク質が、該ピロールポリマーへと取り付けられ得、引き続いて、前記導電性支持体の異なる（幾つかの）所定の領域上へと取り付けられ得る。例えば２つのタンパク質が、該ピロールポリマーへと取り付けられ得、引き続いて、前記導電性支持体の異なる２カ所の所定の領域上へと取り付けられ得る。
【００３７】
換言すれば、本発明のこの特定の実施形態は、その少なくとも一部が該導電性ポリマー／反応溶媒界面に位置する少なくとも２つの異なるタンパク質を含有するマルチセンサーを生産する方法からなり、このマルチセンサーは、重合可能なモノマーとタンパク質との共重合により得られるものであり、この上へは、共重合可能な同一もしくは異種のモノマーをグラフト重合させることが可能である。
【００３８】
このため、本発明の方法は有利なことに、センサーもしくはマルチセンサー、例えばバイオチップ生産に使用され得、これは、本発明の方法が、前記した先行技術の欠点を排除することを可能にするからである。生産されたセンサーは、精確、敏感、および再現性あるサンプル分析結果を提供する。
【００３９】
本発明によれば、該タンパク質は例えば、酵素、抗体、抗原、ホルモン、受容体等からなる群から選ばれ得、これは本発明に、広範な応用分野を付与する。
【００４０】
他の利点は、添付の図面を参照しながら、限定せずにその応用を示すために与えられる以下の実施例を読めば、当業者には更に明らかになるであろう。
【実施例】
【００４１】
実施例１：ピロール活性エステルの調製
Ａ）スルホ−Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（スルホ−ＮＨＳ）ピロールの合成
以下の順序にて、以下のものが２５ｍＬ丸底フラスコ中へと入れられる。
１１−（１−ピローリル）ウンデカン−１−オイック酸（２ｍｍｏｌ；５０３ｍｇ） Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（２ｍｍｏｌ；４３４ｍｇ）
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２．４ｍｍｏｌ；４９５ｍｇ）
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬが、引き続いて加えられる。濁った混合物が得られ、終夜、磁気攪拌される。
【００４２】
この反応混合物が真空下に、引き続いて濾過される。該反応の間に形成されたジシクロヘキシルウレア（ジシクロヘキシル尿素、ＤＣＵ）の沈澱が、取り除かれる。目的生成物を含有する濾液は、ロータリー・エバポレーター中でエバポレーション（留去）される。
【００４３】
得られた該生成物は、水２５ｍＬ中に取り込まれる。この溶液は、ジクロロメタン５０ｍＬを用いて３回洗浄され、残ったＤＣＣを取り除く。この水は終夜、Ｓｐｅｅｄｖａｃ（登録商標）中で引き続き取り除かれる。
【００４４】
該反応の収率は、６５％である。
【００４５】
Ｂ）マレイン酸イミド（マレイミド）ピロールの合成
マレイン酸イミド活性エステルの調製
マレイミド酸（３．７ｇ；１７．５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（２ｇ；１７．５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（３．６ｇ；１７．５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（９０ｍＬ）が終夜、磁気攪拌される。該マレイン酸イミドの該ピロールとのカップリング化学反応を、以下に示す。
【００４６】
得られた混合物が濾過され、ＤＣＵを取り除く。得られた濾液が引き続き、濃縮される。
【００４７】
白色粉末が得られる。この生成物は更に精製せずに、そのまま使用された。
【００４８】
【化２】
【００４９】
Ｘは−ＣＨ２基であり、ｎは１≦ｎ≦２０であるような整数である。
【００５０】
例えば、［Ｘ］ｎは以下の点ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）において定義されるマレイン酸イミドピロールのようなものであってよい。
【００５１】
ｉ）マレイン酸イミド−［２］−ピロール：
【００５２】
【化３】
【００５３】
マレイン酸イミド活性エステル（９２４ｍｇ；３ｍｍｏｌ）、Ｎ−アミノエチルピロール（３３０ｍｇ；３ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ１５ｍＬの混合物が、終夜攪拌される。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、この反応が完結していることを証明できる。
【００５４】
該ＤＭＦのエバポレーションの後、生成物を、シリカ・カラム・クロマトグラフィーにより精製する。その溶出は、純粋なジクロロメタンを用いて開始され、メタノール（ＭｅＯＨ）の濃度勾配を増加させながら続けられた（該生成物の溶出：９８％〜２％）。
【００５５】
得られた量は、０．４ｇである。該反応の最終収率はこれゆえに、４５％である。
【００５６】
ｉｉ）マレイン酸イミド−［６］−ピロール：
【００５７】
【化４】
【００５８】
この反応は、ＤＭＦ（１５ｍＬ）中、マレイン酸イミド活性エステル（０．９２４ｇ；３ｍｍｏｌ）およびＮ−アミノヘキシルピロール（０．４９８ｇ；３ｍｍｏｌ）を混合した後、終夜磁気攪拌されて実施された。シリカ・カラム溶出は、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９７％〜３％）混合液を用いて実施された。
【００５９】
この反応に関しては４６．４％の収率が得られ、０．５ｇであった。得られたこの生成物は、褐色の液体である。
【００６０】
ｉｉｉ）マレイン酸イミド−［１３］−ピロール：
【００６１】
【化５】
【００６２】
このプロトコールは上記のものと同一なので、マレイン酸イミド活性エステル（１．１４ｇ；３．７０ｍｍｏｌ）およびピロール−［１３］−アミン（１ｇ；３．７０ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ２０ｍＬ中混合される。シリカ・カラム溶出は、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９７％〜３％）混合液を用いて実施される。得られた生成物（褐色液体）の量は１ｇ、つまり最終収率５８％である。
【００６３】
実施例２：ストレプタビジンのカップリング
Ａ）ＮＨＳ−ピロールを使用したストレプタビジンのカップリング
上記実施例１においてのように生成された２タイプのＮＨＳ−ピロール：
ＮＨＳピローリルカプロエート
スルホ−ＮＨＳピローリルウンデカノエート
が、比較して使用される。
【００６４】
初期モル比（ＩＭＲ）＝４０、つまり１分子のタンパク質につき４０分子のＮＨＳ−ピロールを用いた手順が実施され、このゆえに、カップリング用緩衝液３００μＬ中５．５５ｎｍｏｌのストレプタビジンがいずれにせよ、ＮＨＳ−ピロール２２２ｎｍｏｌ（１．５ｍＭのＮＨＳ−ピロール溶液１４８μＬ）へと加えられる。該カップリング反応は、２時間放置される。
【００６５】
３つの反応が、並行して実施される。
第１の反応は、前記ＮＨＳピローリルカプロエートを使用する。
第２の反応は、前記スルホ−ＮＨＳピローリルウンデカノエートを使用する。
第３（最後）の反応は、カップリング用緩衝液中にストレプタビジンのみを含有するコントロールである。
【００６６】
反応後の精製は、製造元のプロトコールに従って、Ｎａｌｇｅｎｅ３０Ｋフィルター（ブランド名）を使用して、実施される。
【００６７】
各サンプル３７５μＬが各々、異なるフィルター上へと載せられ、８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離される。各フィルターが次いで、「スポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）」緩衝液２００μＬを用いて３回濯がれるが、各洗浄の間において、１５〜２０分間の遠心分離が必要である。
【００６８】
終わりに、５０μＬの３フラクション：
ストレプタビジン−ＮＨＳピローリルカプロエート
ストレプタビジン−スルホ−ＮＨＳピローリルウンデカノエート
ストレプタビジンのみ
が回収される。
【００６９】
Ｂ）ストレプタビジンへのこれらのマレイン酸イミドピロールのカップリング
ストレプタビジンはＳＨ官能基を全く持っていないので、２つの官能基を有する試薬Ｎ−コハク酸イミド−３−イル［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ）によりＳＨ官能基が作り出されるが、ＳＰＤＰはこのタンパク質のアミン官能基と反応するものである。この試薬のＳＨ官能基は引き続き、これらの試薬を使用することの利点により、ジチオトレイトールにより脱保護される。この技術は、例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｄｒｅｖｉｎ，Ｍ．，およびＡｘｅｎ，Ｒ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３，７２３−７２７に記載される。
【００７０】
上記実施例１においてのように生成された３つのマレイン酸イミドはこれゆえに：
エチルマレイン酸イミド−ピロール
トリオキサトリデカノイルマレイン酸イミド
ヘキシルマレイン酸イミド−ピロール
である。
【００７１】
ａ）脱保護された該ＳＨ官能基の生成
ストレプタビジン４．２ｎｍｏｌを、ＳＰＤＰ１５０ｎｍｏｌと反応させる。この反応は、４０分間放置される。この混合物は次いで、Ｎａｌｇｅｎｅ３０Ｋフィルターを使用して濾過され、ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（バッファー）１００μＬを用いて、３回濯がれる。
【００７２】
ジチオトレイトール６２．５ｎｍｏｌが引き続いて、得られたストレプタビジン−ＳＰＤＰ（ＳＡ−ＳＰＤＰ）へと加えられる。この反応は、４０分間放置される。濾過が前回と同様に再度実施され、濯ぎがＰＢＳ緩衝溶液を用いて実施され、反応可能な遊離のチオール官能基を有するストレプタビジン（ＳＡ−ＳＨ）を、１５０μＬの容積で回収した。
【００７３】
得られるサンプルは引き続き、５０μＬの３フラクションへと分離され、これらにマレイン酸イミド−ピロール８５ｎｍｏｌが加えられる。
【００７４】
ｂ）エチルマレイン酸イミド−ピロールの場合（ＭＷ＝３０３ｇ／ｍｏｌ）
マレイン酸イミド−ピロール２ｍｇをＤＭＦ２００μＬ中に取り込むことにより調製された２５ｎｍｏｌ／μＬマレイン酸イミド−ピロール溶液（３．４μＬ；８５ｎｍｏｌ）と、ＳＡ−ＳＨが混合される。この反応は、３０分間継続する。
【００７５】
ｃ）トリオキサトリデカノイルマレイン酸イミドの場合（ＭＷ＝４６３ｇ／ｍｏｌ）
この反応は上記のものと同様に実施され、マレイン酸イミド−ピロール１ｍｇをＤＭＦ５０μＬ中に取り込むことにより調製された３９ｎｍｏｌ／μＬマレイン酸イミド−ピロール溶液（２．２μＬ；８５ｎｍｏｌ）へと、ＳＡ−ＳＨを加えた。この反応は、３０分間継続する。
【００７６】
ｄ）ヘキシルマレイン酸イミド−ピロールの場合（ＭＷ＝３５９ｇ／ｍｏｌ）
マレイン酸イミド−ピロール３ｍｇをＤＭＦ２００μＬ中に取り込むことにより調製された５７．５ｎｍｏｌ／μＬマレイン酸イミド−ピロール溶液（１．５μＬ；８５ｎｍｏｌ）と、該ＳＡ−ＳＨが混合される。この反応は、３０分間実施される。
【００７７】
該反応後、これらの種々の反応混合物および前記コントロール溶液（ストレプタビジンのみ、試薬添加せず）が、Ｎａｌｇｅｎｅ３０Ｋフィルターを通して遠心分離され、「スポッティング」緩衝液を用いて濯がれる。最後に「スポッティング」緩衝液（５０ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７）によりその容積を整えることにより、全サンプルを５０μＬの最終容積とする。
【００７８】
実施例３：ポリピロールの電気化学的合成（「スポッティング」）：電気重合
この反応は、添付の図６に表される「スポッティング」構築を使用して実施されるが、これは更に、前記したＰ．Ｇｕｅｄｏｎらによる文献に詳細に記載される。この図では、「Ａ」および「Ｂ」がそれぞれ、前記ＮＨＳカプロエートおよび前記スルホ−ＮＨＳウンデカノエートを介してポリピロールへとカップリングされたストレプタビジンに対応し；「Ｃ」が、前記ヘキシルマレイン酸イミドを介してピロールへとカップリングされたストレプタビジンに対応し；「Ｄ」が、ストレプタビジンのみに対応する。「Ｌ」はガラス・スライドを表し；「Ａｕ」はこのガラス・スライド上に付着された金層であり（この組み合わせを以降「金スライド」と呼ぶ）；「ｓ」は電気重合溶液であり；「Ｗ」は作動電極である。「１」はピペットを指し；「３」は該ピペットのチップを指し；「７」は該金層上へと付着されたポリピロールスポットを指す。
【００７９】
この図に表されるように、該電気重合が実施される該金スライドは作動電極（Ｗ）として働き、この付着用ピペットチップ中に置かれる白金線は対向電極（Ｃｅ）として働く。この電気化学的システムは、ポテンシオスタット５へと接続される。
【００８０】
この共重合は、前の実施例において生成されたものから選ばれるＳＡ−マレイン酸イミド−ピロール溶液５μＬ、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を含む前記「スポッティング」溶液１５μＬ、および２０ｍＭピロールを含有する溶液２０μＬを用いて実施される。
【００８１】
５００ミリ秒継続し２．４Ｖまで上昇する（つまり、約０．９Ｖ／ＥＣＳ）電気パルスに引き続き、該金層上において、フィルム（薄膜）が合成される。
【００８２】
種々のスポットが全て同様に生成され、各重合間において、前記ピペットチップが水を用いて濯がれる。
【００８３】
実施例４：該スポット上へとグラフトされるタンパク質の検出からなる相（段階）
実施例３の電気化学的合成の後、該スポットを含有する領域が、接着フェルトペンを使用して生成された疎水性障壁により区切られる。該スポットは引き続いて、濯ぎ用緩衝液１ｍＬを用いて２回洗浄される。該スポットは次いで、ブロック用緩衝液１００μＬを用いてブロックされ、先に区切られた該疎水性領域内において付着されるタンパク質の非特異的な取り付けを防ぐ。前回と同じ第２回の濯ぎの後、ＰＢＳ中１０％のビオチン化Ｒ−フィコエリトリン溶液１００μＬが、付着される。
【００８４】
この反応は１０分間暗所に置かれ、次いで顕微鏡下での検出相（段階）の前に、第１回および第２回と同じ最終的な洗浄が実施される。
【００８５】
実施例５：視覚化
前記金スライド上へと付着されたサンプルは、スライドとカバー・スリップとの間に置かれ、緑色光の下に１．２倍の拡大率において、ＣＤＤカメラを備えたエピ蛍光顕微鏡を用いて観察される。該スポットの写真が撮影され、ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓソフトウェアを使用して、その蛍光強度が測定される。
【００８６】
Ａ）実施例１において生成されたＮＨＳピローリルカプロエートおよびスルホ−ＮＨＳピローリルウンデカノエートを使用したカップリング
これらのカップリングがここで、ビオチンおよびストレプタビジン（ＳＡ）からなる親和性カップリングを使用して、蛍光検出により実証される。これらのカップリングの有効性はこれゆえに、それらの蛍光強度（蛍光強度（ＩＦ）または灰色濃度）を通じて判断される。
【００８７】
４タイプのスポットが、以下のスキームに従って生成された：
ＭＲ＝反応溶媒：ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液および２０ｍＭピロール：
ＩＦ＝１０；
Ａ＝前記ＮＨＳピローリルカプロエートを介してピロールへとカップリングされたＳＡ；
ＩＦ＝２００；
ＢＡ＝前記スルホＮＨＳピローリルウンデカノエートを介してピロールへとカップリングされたＳＡ；
ＩＦ＝２４０；
Ｔ＝コントロール：ＳＡのみ＋ＭＲ：
ＩＦ＝８０；
但し、ＩＦ＝蛍光強度
ブラック（黒）＝バックグラウンド（背景）ノイズ。
【００８８】
それらはそれぞれ、添付の図７ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）に、この順序で示される。
【００８９】
ＭＲのスポットは、ポリピロールのフィルム表面における非特異的吸着をコントロールする。我々の予想によれば、それは僅かな蛍光しか呈しない。
【００９０】
このコントロールのスポットは、ピロールへとカップリングされていないストレプタビジンに対応する。それはこれゆえに、該ポリピロール上へと吸着される。このスポットは、ＳＡ−ピロールサンプルＡおよびＢのものよりも明らかに小さな蛍光強度を示す。このことは、ピロールの存在が、前記金プレート表面へのストレプタビジンの取り付けを促進することを実証する。
【００９１】
スポットＡおよびＢはそれぞれ、前記ＮＨＳピローリルカプロエートおよび前記スルホＮＨＳピローリルウンデカノエートを介してポリピロールへとカップリングされたストレプタビジンに対応する。これら２つのスポットの蛍光強度を比較すると、該ＳＡが該ＮＨＳピローリルカプロエートを介してカップリングされる場合よりも、該スルホＮＨＳピローリルウンデカノエートを介してカップリングされる場合の方が、得られるシグナルが僅かに強いことに気がつく。この違いは、正に恐らくこのＮＨＳを構成する鎖長によるものであり、該ビオチンの取り付け用部位への接近し易さの維持を可能にするであろう。
【００９２】
全体としてこのカップリングは、ストレプタビジンに関して良好な結果を与えるが、他のタイプのタンパク質に関しても可能であると結論される。
【００９３】
Ｂ）３つの異なるマレイン酸イミドを使用したカップリング
５つのタイプのスポットが、以下のスキームに従って生成された：
ＭＲ＝反応溶媒：ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液および２０ｍＭピロール；
Ｔ＝コントロール：ＭＲ＋ＳＡのみ；
Ａ＝ＭＲ＋前記トリオキサトリデカノイルマレイン酸イミドを介してピロールへとカップリングされたＳＡ；
Ｂ＝ＭＲ＋前記エチルマレイン酸イミドを介してピロールへとカップリングされたＳＡ；
Ｃ＝ＭＲ＋前記ヘキシルマレイン酸イミドを介してピロールへとカップリングされたＳＡ。
【００９４】
図８（ａ）および（ｂ）は、種々のストレプタビジン−ピロール共役体に関する蛍光強度の測定値を示す。これらのスポットは、図８（ｂ）のスキームに従って付着される。この図の参照番号は、前記されたものに対応する。
【００９５】
これらの写真に関して採られた蛍光強度の測定値は、以下の表２に要約される。
【００９６】
ＭＲ１、ＭＲ２、およびＭＲ３のスポットは、本発明者らの予想によれば、僅かな蛍光しか呈さず、このことは非特異的吸着が存在しないことを示す。
【００９７】
コントロールＴ１およびＴ２は、ピロールへとカップリングされていないＳＡに対応し、これゆえに該ポリピロール上へと吸着され、前記ＳＡ−ピロールサンプルのものよりも遙かに小さい蛍光を示す。
【００９８】
これゆえに、この分子上のピロールの存在がここでもまた、該ストレプタビジンの取り付けを促進する。
【００９９】
これら３つのスペーサー・アームに関して蛍光強度を比較すると、エチル・アーム、そして最終的にヘキシル・アームよりも、トリオキサトリデカノイル・アームに関して、より良い蛍光が得られることに気がつく。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
本研究における現状として、本発明者らは。何故１つのアームがもう１つ別のアームよりもより良いシグナルを呈するのか、確実性を持って決定することはできない。この質問に対する答えは、更なる研究および特徴付けを必要としている。この線の考えでは、例えば、これらのアームの長さおよび／またはより親水性もしくはより親水性でない性質であり得るであろうが、このカップリングの効率等でもあり得るであろう。
【０１０２】
実施例６：抗体
Ａ）抗体のＮＨＳ−ピロールとのカップリング
前記ＮＨＳピローリルカプロエートが、２つの異なるタイプの抗体：
ｉ）ウサギイムノ（免疫）グロブリンＧ
ｉｉ）抗ｈＣＧ（ｈｕｍａｎ Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン）イムノ（免疫）グロブリン
と共に、ここでは使用される。
【０１０３】
ｉ）ウサギＩｇＧ
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）１０ｍｇが、ＰＢＳ３３３μＬに取り込まれる。この手順が、ＩＭＲ４０を用いて実施される。これゆえに、この溶液１２．５μＬ（２．５ｎｍｏｌ）が、１５ｍＭのＮＨＳピローリルカプロエートＤＭＳＯ溶液６．７μＬ（１００ｎｍｏｌ）と混合された。この反応は、２時間３０分放置される。
【０１０４】
これらのサンプルは引き続き、２０分間８０００ｒｐｍにて、Ｎａｌｇｅｎｅ３０Ｋフィルターを使用して精製され、スポッティング緩衝液１００μＬを用いて３回濯がれ、各濯ぎの間には、２０分の遠心分離が必要である。
【０１０５】
最後に、これらのＩｇＧ−ピロールは、スポッティング緩衝液５０μＬ中に回収される。
【０１０６】
ｉｉ）抗ｈＣＧイムノグロブリン
２つの異なる抗ｈＣＧ抗体（ＩｇＧ）が利用でき、両者ともマウス由来であり、ＨＴ１３およびＦＢＴ１０である。以下のプロトコールは、それらの各々１つに関して同じである。
【０１０７】
抗体１ｎｍｏｌが、１５ｍＭのピローリルカプロエートＤＭＳＯ溶液６７μＬへと加えられる。得られた混合物は２時間３０分、作用するように放置される。
【０１０８】
これらのサンプルは、Ｎａｌｇｅｎｅフィルターを使用して前記と同様に濾過され、スポッティング緩衝液１００μＬを用いて３回濯がれる。抗ｈＣＧ ＩｇＧ−ピロールの２サンプルが、スポッティング緩衝液５０μＬ中に溶液状態で回収される。
【０１０９】
Ｂ）ポリピロールの電気化学的合成：スポッティング
この共重合は、考慮されるこれら２つのモデルに関して同じである。
【０１１０】
ここでそれは、いずれのＩｇＧ−ピロール溶液であっても２０μＬおよびスポッティング溶液（２０ｍＭリン酸緩衝液、２０ｍＭピロール）２０μＬを含有する溶液４０μＬを用いて実施される。
【０１１１】
Ｃ）該スポット上へとグラフトされた抗体の蛍光検出からなる相（段階）
以下の２つのモデルにおいて、該スポットは各ステップ間に、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液１ｍＬ、１％ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎを用いて２回濯がれ、全ての反応は常温において実施される。
【０１１２】
ｉ）ウサギＩｇＧ
電気化学的合成の後、該スポットは３０分間、濯ぎ用緩衝液（１０ｍＭのＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ）１００μＬを用いて濯がれ、次いでブロックされる。２回目の濯ぎの後、ビオチン化抗ヒトまたは抗ウサギＩｇＧ抗体溶液１００μＬがそれぞれ１／１００００および１／５００００に稀釈され、加えられる。この反応は、３０分間放置される。更なる濯ぎの後、濯ぎ用緩衝液中１０％のストレプタビジンＲ−フィコエリトリン溶液１００μＬが、暗所において１０分間で加えられる。その蛍光検出は、実施例４に前記した通りに実施される。
【０１１３】
ｉｉ）抗ｈＣＧイムノグロブリン
以下のプロトコールは、その濯ぎおよびブロックのステップに関して前記と同じであり、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液、１％ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ中３００ｎＭのｈＣＧ溶液１００μＬが、スポット上へと付着される。この反応は、３０分間放置される。更なる濯ぎが実施され、次いで、プレートへと取り付けられたものとは異なりウサギ由来である抗ｈＣＧ抗体溶液１００μＬが、１／２０００に稀釈され、加えられる。それは３０分間、作用するように放置される。更なる濯ぎが実施され、次いで、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ溶液１００μＬが、１／１００００に稀釈され、加えられる。
【０１１４】
この反応は、３０分間放置される。濯ぎの後、その視覚化が前記の通りに実施される。
【０１１５】
Ｄ）抗体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験
そのブロックの機能性を解析することができるように、本発明者らは固定化された入射角条件を用い、時間の関数として、その反射率の変動速度を測定した。
【０１１６】
使用された機器の詳細は、前記したＰ．Ｇｕｅｄｏｎらの文献にある。
【０１１７】
図９は、緩衝液中において得られたプラズモンのグラフ表示である。
【０１１８】
本発明者らはこのため約３４．１°の条件を使用し、反射率曲線の吸収ピークの右隣にあるようにした。
【０１１９】
該プロトコールは、以下の通りであった：
ブロッキング・ステップ。１０ｍＭのＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有する溶液は、引き続いての非特異的相互作用を制限するためのものであった。
緩衝液として働くブロッキング溶媒中での入射角の関数としての反射率の測定および記録。
１／１００に稀釈されたビオチン化抗ウサギＩｇＧを用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、抗体の取り込みの前後での、同一溶媒中での濃度差を測定する。
１／１００に稀釈されたＬＣＧを用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、抗体の取り込みの前後での、同一溶媒中での濃度差を測定する。
１／２０００に稀釈されたウサギ由来抗ｈＣＧＩｇＧを用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、抗体の取り込みの前後での、同一溶媒中での濃度差を測定する。
１／１００に稀釈されたビオチン化抗ウサギＩｇＧを用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、抗体の取り込みの前後での、同一溶媒中での濃度差を測定する。
０．１Ｍグリシンおよび塩酸を含有する再生緩衝溶液（ｐＨ＝２．３）を用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、プラズモンの間のブロッキングにおける初期濃度と最終濃度とを比較する。
【０１２０】
このプレートは、第１にビオチン化抗ウサギＩｇＧを用いて、次いでｈＣＧ、ウサギ由来抗ｈＣＧ、そして最後にビオチン化抗ウサギＩｇＧを用いて視覚化される。該実験は、５時間２０分継続する。
【０１２１】
添付の図１０は、プレート上での付着速度のグラフ表示であり、２つの付着物は、ウサギＩｇＧ（ＩｇＧ１）およびＨＢＴ１０（抗ｈＣＧ抗体）からなる。
【０１２２】
この実験は、種々のタンパク質の積層体が望み通りに生じることを実証するものである。注入されるタンパク質の付着物への取り付けに対応する種々のプラトーもまた、特記される。ウサギＩｇＧからなる付着物は抗ウサギＩｇＧのみを取り込み、ｈＣＧを取り込まない。ＨＢＴ１０からなる付着物は明らかにｈＣＧを付着させ、このことは、２つのタイプのウサギ抗体間では、つまりプレートに取り付けられたウサギＩｇＧとウサギ由来の抗ｈＣＧとの間では、交差反応を与えない。
【０１２３】
実施例７：ポリマー上／中へとグラフトされたタンパク質の認識能力における、このポリマー付着物の厚さの影響
ウサギ由来抗ＩｇＧ抗体は、実施例６に与えられた方法に従って、該ポリマー中へとグラフトされる。
【０１２４】
該付着物は、同じ反応溶媒（５０ｍＭリン酸ナトリム緩衝液、ｐＨ７、２０ｍＭピロールＩｇＧ）を使用して、生成される。該付着物は、Ａ〜Ｆに関しては２つずつ、Ｇに関しては３つ生成されるが、これらは様々な時間、電気的スポッティングにより生成され、このため、変動可能な厚さのポリマーを生成させる。その合成負荷が測定され、該ポリマーの厚さがこれゆえに評価され（測定され）得る。
【０１２５】
生産されるバイオチップは引き続き、ビオチン化抗ウサギＩｇＧにより処理され、その認識が次いで、ストレプタビジン−フィコエリトリンにより検出される（実施例６参照）。得られた画像が、添付の図１１（ａ）および（ｂ）に与えられ、その定量結果（蛍光強度）が、以下の表３に与えられる。図１１（ｂ）は、写真１１（ａ）のダイヤグラム表示であり、付着の実証を可能にする。
【０１２６】
該結果は、該ポリマーが厚過ぎる場合、該抗ウサギＩｇＧ（巨大分子）を用いた認識が困難であることを示す。厚いポリマーの場合、ＷｏｌｏｗａｃｚらによりＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，６４，１５４１−１５４５に記載のもののような捕捉システムが得られる。蛍光の場合、最適厚さは１０ｎｍオーダーであり、これは多かれ少なかれ、不動化された分子の直径に対応する。それはこれゆえに、該ポリマー中に単に捕捉されるだけで済み、これは共有結合による取り付けを意味する。この同じポリマーの厚さ（１０ｎｍ未満）は更に、プラズモン共鳴（Ｐ．Ｇｕｅｄｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，（２４），６００３−６００９）による検出を最適化することを可能にする。
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
結論
該ポリマーの厚さはこれゆえに、嵩高いタンパク質を取り付ける能力、特に、嵩高いタンパク質の認識能力において、鍵となる役割を演じる。文献に記載の電気重合用の厚さまたは電荷密度はこれゆえに、比較され得る。Ｗｏｌｏｗａｃｚらは、グルコースオキシダーゼ（酸化酵素）を取り込むフィルムを提案し、その重合密度は１．４ｍＣ／ｍｍ２のオーダー（つまり、フィルム厚約２８０ｎｍ）である。この場合、該ポリマーの有孔性という利点により、それが小さな分析物であるグルコースの拡散を可能にするので、このセンサーは機能するのである。更に最近では、Ｓａｄｉｋらが前記文献中において、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）モデルにおけるイムノセンサーを提案し、このタンパク質の捕捉に使用されるポリピロールフィルムの厚さは、最小３５０ｎｍ、つまり重合電荷密度１．５ｍＣ／ｍｍ２である。
【０１２９】
先行技術は、該ポリマーの厚さがバイオセンサーの生物学的応答に影響を持っているとは記載も示唆もしていない。本発明者らはこれゆえに、このパラメータ（ポリマーの厚さ）を考慮に入れる方法を最初に提供するものであり、予期せず、先行技術の前記問題を解決することを可能にするものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、先行技術およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図２】図２は、先行技術およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図３】図３は、先行技術およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図４】図４は、先行技術およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図５】図５は、本発明の方法およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図６】図６は、本発明の方法を実施するのに使用される装置を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図７】図７ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）は、種々のストレプタビジン＋ビオチン共役体の蛍光強度測定のマイクログラフを表したものである。
【図８】図８ａ）および８ｂ）はそれぞれ、種々のストレプタビジン＋ビオチン共役体の蛍光強度測定のマイクログラフ、ならびに、該マイクログラフ上において得られるスポットのダイヤグラムを表したものである。
【図９】図９は、抗体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイの結果のグラフ表示である。
【図１０】図１０は、本発明の方法による導電性ポリマーに取り付けられたウサギイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）と抗ｈＣＧ抗体（ＨＢＴ１０）とからなるブロックの認識速度を表したものである。
【図１１】図１１は、実施例７に記載された操作条件下に得られたポリピロールフィルムの厚さの関数として測定された、蛍光強度のマイクログラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロール主体のポリマーへとタンパク質を取り付ける方法に関し、この方法の、センサー、特にマルチセンサー、例えばバイオチップを生産するための使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術は、特にセンサー生産に関して、特にバイオチップの分野において、タンパク質の活性を変えてしまうことなく導電性ポリマー上において該タンパク質を不動化させること、特に、２つの異なるタンパク質を別個に不動化させることを可能にするものではなく、大きな困難を抱えている状態に留まっている。
【０００３】
事実、タンパク質、例えば、酵素、抗体、受容体、およびある種の抗原は、標的分子に対する認識部位、または、それらが他の分子により認識され得る部位を持っている。これらの部位は、それらの活性（単数または複数）に関して応答性である。例えば酵素は、それの基質に関して特異的な部位を持ち、抗体は、それに対応する抗原による認識を可能にする特異的エピトープを持ち、抗原は、それが標的とするエピトープに対して特異的な認識部位を持っている。これらの部位は一般的に、空間におけるタンパク質自体における該タンパク質の折り畳みによって形成され、この折り畳みは、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、および疎水性結合により、安定化され得る。この折り畳みおよびこの結果として形成されるこれらの部位はこれゆえに、該タンパク質にかかる単純な歪み、立体障害、または、イオン強度、ｐＨ、もしくは溶媒温度の変化により、容易に不安定化され得る。加えてこれらの部位は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、または−ＳＨ官能基のような、前記導電性ポリマーへの該タンパク質の取り付けの間に使用される試薬またはモノマーと反応し得る反応性官能基を持っており、これゆえにダメージを受け、妨害を受け、または障害を受けることが考えられる。
【０００４】
このような部位を持つタンパク質を表面へと取り付けるのに使用される方法はこれゆえに、この部位を活かすためには、できるだけ遠くにこの部位を保たねばならず、これにより、生産されるバイオセンサーはその機能を果たし、できるだけ精確、敏感、および再現性あるサンプル分析結果を提供するのである。
【０００５】
当業者にとって既知の技術では、導電性ポリマーへのタンパク質の不動化は、４つの異なる技術を使用し得る。これら４つの技術は、捕捉、後での官能基化、非共有結合によるタンパク質の不動化、および共有結合によるタンパク質の不動化である。これらの技術は添付の図面１〜４に、ダイヤグラムにより表される。これらの図面では、「Ｐ」および「Ｐａ」はそれぞれタンパク質および活性化されたタンパク質を表し、「ｍ」および「ｍａ」はそれぞれポリマーのモノマーおよび活性化されたモノマーを表し、「Ｐ−ｍ」はタンパク質−モノマーカップリング化合物を表し、「Ｍ」および「Ｍａ」はそれぞれ該ポリマーおよび活性化された該ポリマーを表す。
【０００６】
捕捉技術では、モノマーはタンパク質の存在下に、重合（化）に付される。形成時に、該ポリマーはその網目中に、このタンパク質を捕捉する。この技術は、例えば、ＦｏｕｌｄｓおよびＬｏｗｅによるＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｆａｒａｄａｙ Ｔｒａｎｓ．１９８６，８２，１２５９−１２６４に記載され、添付の図１に示される。タンパク質が不動化される前に該タンパク質を修飾せずに済むのでこの技術は有利であり、このため原理的に、該タンパク質活性をより良く保存することができる。この方法はより最近、Ｏ．Ａ．ＳａｄｉｋらによるＴａｌａｎｔａ ２００１，５５：９２９−９４１にも記載された。
【０００７】
不運なことにこの方法は、捕捉による不動化のメカニズムが原因で、選択される電極上へ、電流を介してタンパク質だけを標的とすることを可能にするものではなく、付着毎に起きる（他の）付着物の混入なしには、異なるタンパク質を幾つか付着させることを可能にするものでもない。事実、この技術では、引き続いての付着物の重合の間に、タンパク質は部分的には捕捉され、部分的には放出されることがあり、これゆえに、後からのものを混入させてしまうことがある。加えて、不動化時間は非常に長く、混入はこれらの付着の間に可能であり、これはマルチセンサー生産を困難にし、結果として、モノ（単）センサー生産に使用される。
【０００８】
更にそれは、ポリマー塊における不動化からなる技術であり、これは結果的に、以下の様々な欠点を与える：
タンパク質の活性部位への接近の減少、更には離脱。
タンパク質が、研究された溶媒のそれとは非常に異なる極性の溶媒中に封じ込められるという事実によるもの。例えば、分析されるべきサンプル。該タンパク質とその標的との間での認識が、上記の立体障害に加えて（更に）妨害される。
もし、該タンパク質とその標的との間での認識が、該タンパク質の構造の変化を要求または誘導する場合、この変化は、ポリマーの堅さにより障害されることがある。
該タンパク質のその標的との相互作用の検出は、その質量においてのみ可能であり、これは、最も汎用の光学的分析方法を可能でなくすものである。
一方それは、例えばバイオセンサー形態の電気化学的検出には、非常に適している。
【０００９】
加えてこの技術は、タンパク質を封じ込めるために、極めて分厚いポリマーを必要とする。これは、以下の欠点を持っている：
使用されるタンパク質の量が、単一の付着の場合よりも多くなければならない。
電流へ晒す時間が、より長くなくてはならない。上記のＳａｄｉｋらの文献によれば、電荷密度は２ｎＣ／ｍｍ２のオーダー、つまり、約５００ｎｍのポリマー厚である。
【００１０】
尚もう１つ別の欠点は、もしタンパク質の捕捉が完璧でなかった場合、これは結果的に、連続する重合の間、使用の間、または保管の間におけるタンパク質の量の損失に繋がり、センサー感度を低下させ、マルチセンサーの場合では混入を伴うという事実である。
【００１１】
後での官能基化の技術は、添付の図２にダイヤグラム的に表される。それは主に、ＮＨ２もしくはＳＨ基で官能基化されている支持体上への、活性エステルもしくはマレイン酸イミドにより活性化済みのタンパク質のグラフト化、あるいは逆に、活性エステルもしくはマレイン酸イミドによりそれぞれ活性化済みの支持体上への、タンパク質のリジン由来のＮＨ２基もしくはシステイン由来のＳＨ基を使用しての、官能基化されていてもよくもしくはされていなくてもよいこれらのタンパク質のグラフト化を含むものである。この方法は、例えば、Ｗ．ＳｃｈｕｈｍａｎによるＭｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １２１，１−２９（１９９５）に記載されるものである。それは、表面検出を誘導する表面グラフト化を可能にするものである。
【００１２】
このグラフト化は不運にも、含まれる官能基の弱い反応性のために、コントロールが容易でない。加えてそれは、モノセンサー生産に適するものであり、多大な困難を伴ってのみ、マルチセンサー生産を可能にする。事実、幾つかのスポットを含有するマルチセンサーを生産したい場合、この技術においては反応性が弱いので、第１スポットの全ての官能基が、例えば第２タンパク質が第２スポットへと取り付けられる時点において既に反応してしまっているわけではなく、これゆえに、該第１スポット上における該第２タンパク質の混入が見られる。これを避けるために、該タンパク質は、選択された付着物上へとのみ導入されねばならない。局在化される様式で微小滴を塗布することは効果的に可能ではあるが、それら（該微小滴）の蒸発速度は非常に速く、この反応はコントロールが難しいので、これをミニチュア化するのは困難であることが考えられる。この場合、標的化は、例えばインクジェットシステムを使用して機械的に実施されなくてはならないので、導電性タイプのポリマー支持体を使用することに対する利点はない。このような技術は、ガラス・スライド上においてタンパク質チップを生産するのに使用され、これは、Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年９月８日，２８９巻，１７６０−１７６３に記載される通りである。
【００１３】
これらのタンパク質の化学修飾の先行技術を用いない、タンパク質の非共有結合による不動化技術が、添付の図３に表される。この技術においては、ビオチン−アビジン系が使用される。Ｆａｒｍａｋｏｖｓｋｙらによる文献ＷＯ００／１１４７３が、この技術を記載している。吸着により多かれ少なかれよく不動化されるタンパク質を有する導電性ポリマーが、形成される。
【００１４】
該支持体への取り付けが非常に弱いという事実は、この電極の保管およびマルチセンサー生産に関して、ある意味においては好ましくない。
【００１５】
第４の技術は、共有結合による捕捉である。これは、添付の図４にダイヤグラムにより表される。この技術は、Ｗｏｌｏｗａｃｚ，Ｓ．Ｅ，、Ｙｏｎ Ｈｉｎ Ｂ．Ｆ．Ｙ．、およびＬｏｗｅ Ｃ．Ｒ．による先行技術Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，６４，１５４１−１５４５に記載されている。この著者は、ピロールへと共役させ、ピロールとの共重合に付す方法で、酵素、グルコースオキシダーゼ（酸化酵素）を調製した。該酵素上へとグラフト化されたピロールは、１種のポリピロール・コーティングされた該酵素を、電気重合および不動化させる。
【００１６】
該酵素は該ピロール中に捕捉され、不運にもこのことが、その外側にある溶媒および埋没したそれの活性部位へのそれのアクセスを制限してしまう。このアクセスは、ある場合においては観測され得るが、前記した刊行物中でのグルコースのような非常に小さな分子に関してのみであり、これは、該ポリピロールの網目のメッシュ中へと浸透することができるものである。事実、前記した捕捉技術の欠点はそのままで、安定性のみが向上する。
【００１７】
これゆえに、先行技術の方法の欠点、限界、短所、および不利を持たない導電性ポリマーへとタンパク質を取り付ける方法に対する、真の必要性が存在している。
【００１８】
加えてこの方法に関しては、それが先行技術の方法およびセンサーの欠点、限界、短所、および不利を持たないように、センサー生産、特にマルチセンサー生産に使用され得るようでなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の狙いは、精確には、導電性ポリマーへとタンパク質を取り付ける方法を提供することであり、これは特に、モノセンサーまたはマルチセンサー生産に使用され得、これは中でも、前記した必要性を満足するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この狙いおよび他の狙いも、本発明、ピロールポリマーにより導電性支持体へとタンパク質を取り付ける方法により達成され、これは以下のステップを含む：
取り付けられるべきタンパク質をピロールモノマーとカップリングさせ、タンパク質＋ピロールカップリング化合物の第１溶液を得るステップ；
該タンパク質へとカップリングされていないピロールモノマーの第２溶液を調製するステップ；
該第１溶液を該第２溶液と混合して、電気重合溶液を得るステップ；
該電気重合溶液を使用する、前記導電性支持体の少なくとも１つの所定の領域上において、該ピロールとピロールへとカップリングされた該タンパク質との電気重合ステップ（該電気重合は該領域上へ、１〜５００μＣ／ｍｍ２の電流量を送ることにより実施）。
【００２１】
本発明によれば、用語「ピロールモノマー」とは、ピロールのモノマーまたはピロールの重合可能な誘導体を意図するものである。本発明において使用され得る該ピロールモノマーは、バイオチップ生産方法において当業者に知られているものである。ピロール誘導体としては、例えば、メチルピロールまたは置換もしくは無置換ピロールダイマーが挙げられてよい。
【００２２】
本発明によれば、１つ以上のタンパク質が、本発明の方法により、支持体へと取り付けられ得る。当業者は、本記載に照らせば、彼らの必要性に従って、その各々が選ばれた該ピロールモノマーへとカップリングされ、該支持体の１つ以上の領域上へと付着される１つ以上のタンパク質を有する電気重合溶液をどのように調製するかを理解するであろう。
【００２３】
本発明によれば、「該支持体領域」との表現は、「ブロック」、例えばバイオチップ支持体ブロックを意味することをも意図するものである。本発明によれば、該電気重合は、例えば種々のタンパク質を用いて、幾つかの領域においてもしくは生産されたバイオチップのブロック上において同時に、または、幾つかの領域においてもしくは生産されたバイオチップのブロック上において連続して実施され得る。領域またはブロックの数の選択は、特にバイオセンサーの所望の解像度、および、所望の該バイオセンサーを用いて実施され得る同時解析の数に依存するであろう。領域またはブロックのこの数は、当業者に既知のバイオチップに関しては決めることができる。本発明の目的では、前記導電性支持体はこのため有利に、１つ以上のブロックを有するバイオチップ支持体であり得る。本発明の方法はこのため、所望されるモノセンサーまたはマルチセンサー生産を可能にする。
【００２４】
本発明は驚くべきことに、ポリマーへと取り付けられたかもしくは該ポリマー上において不動化されたタンパク質の活性、例えば大きな分子に関するタンパク質の認識特性、例えば抗原のそれに対応する抗体に関する認識特性を、保存することを可能ならしめる。
【００２５】
このことは、ピロールがタンパク質のアミノ基の大部分と反応するので、先行技術では不可能であった。今や本発明の方法により、全く予想外にも、本発明者らはポリピロール＋タンパク質付着物を生成させており、ここで薄層ポリマー中においてもしくは薄層ポリマー上において不動化されたタンパク質の活性は、保存されている。加えて本発明は、更に該タンパク質の活性を保存する極薄フィルムを構築することを可能にする。
【００２６】
事実、本発明者らは、彼らがタンパク質と反応させた種々のピロールを調製しており、これは以下の実施例に示される通りである。これらの共役タンパク質は引き続いて、ピロールとの電気重合により不動化される。それなりに、そして、問題となっている現象に関する知識の欠如にもかかわらず、彼らはこの方法により、導電性基板上へと抗原タンパク質を標的化することができ、それらを特異抗体により認識させることができた。
【００２７】
本発明者らは、この認識を蛍光を用いて研究し、これは、タンパク質がその表面において本当に不動化されることを彼らが証明できるようにしたが、これは、該蛍光が、ポリピロール・マトリックス外でのみ検出され得るからである。これは、本発明による電気重合による不動化および抗体のように嵩高いことがあるもう１つ別の分子による認識をも確認できるようにした。
【００２８】
本発明者らはまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）画像化研究をも行ったが、これは、それがリアルタイムでの分析法であるという事実によるものであり、分析の観点おいて更に進展することを可能にするものである。これらの速度論的研究は、本発明の方法の利点により、タンパク質活性の保存のより良い評価を得ることを可能にするものである。更にこの分析法は、Ｐ．ＧｕｅｄｏｎらによるＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００），７２，（２４），６００３−６００９に記載のように、金層から非常に近い距離において起きる生物学的相互作用を検出することのみに関してよく知られている。この距離はしばしば、５０ｎｍ未満である。
【００２９】
これら２つの実験から、該相互作用が、ポリマー（蛍光）表面およびこの金に非常に近いところの両方において起きることが確かめられる。このことは、該ポリマーが非常に薄くなければならないことを意味するが、これは、本発明の方法による場合に該当する。
【００３０】
このため本発明によれば、電気重合は、該電気重合の間に送られる電流量を限定することにより実施される。このため結果として、より良い結果が得られている。本発明による電流量は、ポリピロール鎖長を限定することが可能である。このことはこれゆえに、固定化される場合、タンパク質活性の損失を限定するであろう。もう１つ別の可能性は、該重合が電極の直近において起き、このことが、この電極から最も遠いタンパク質の一部上での該ピロール重合を最小化させる効果を持ち、このためそれの認識活性を保存する効果を持つということであり得るであろう。本発明者らは、電場に関して反応溶媒よりもより導電性の低いタンパク質によるスクリーニングが、恐らくより存在しているものと考えている。
【００３１】
このため、該電気重合は、１〜５００μＣ／ｍｍ２、好ましくは５〜１００μＣ／ｍｍ２の電流量を前記領域上へと送ることにより、本発明の電気化学的電気重合方法により実施される（該電流量は、該領域の電気的分極により送られ得る）。この結果として、非常に有利なことに、１０ｎｍ未満であってもよい厚さを持つポリマーの形成が見られる。例としてこの重合は、該領域に適用される５００ミリ秒間で１Ｖ／ＥＣＳの電気パルスにより、本発明により実施され得る。
【００３２】
本発明によれば、取り付けられるべきタンパク質のピロールとのカップリングが、該ピロールの活性化により実施され得、次に、活性化された該ピロールの、取り付けられるべき該タンパク質へのカップリングが続く。活性化された該ピロールは例えば、そのリジンのアミノ基上において活性なピロール活性エステル、または、そのシステインの−ＳＨ基上において活性なマレイン酸イミドピロールであってもよい。これらの例は限定的なものではなく、当業者は本発明の方法をどのように他のピロール活性化に適合させるか、理解するであろう。
【００３３】
本発明によれば、該ピロール活性化は、例えばＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドまたはマレイン酸イミドを用いて実施され得る。
【００３４】
本発明によれば、このタンパク質−ピロールカップリング化合物は、有利には以下の化合物から選ばれ得る。
【００３５】
【化１】
【００３６】
本発明の特定の実施形態によれば、幾つかのタンパク質が、該ピロールポリマーへと取り付けられ得、引き続いて、前記導電性支持体の異なる（幾つかの）所定の領域上へと取り付けられ得る。例えば２つのタンパク質が、該ピロールポリマーへと取り付けられ得、引き続いて、前記導電性支持体の異なる２カ所の所定の領域上へと取り付けられ得る。
【００３７】
換言すれば、本発明のこの特定の実施形態は、その少なくとも一部が該導電性ポリマー／反応溶媒界面に位置する少なくとも２つの異なるタンパク質を含有するマルチセンサーを生産する方法からなり、このマルチセンサーは、重合可能なモノマーとタンパク質との共重合により得られるものであり、この上へは、共重合可能な同一もしくは異種のモノマーをグラフト重合させることが可能である。
【００３８】
このため、本発明の方法は有利なことに、センサーもしくはマルチセンサー、例えばバイオチップ生産に使用され得、これは、本発明の方法が、前記した先行技術の欠点を排除することを可能にするからである。生産されたセンサーは、精確、敏感、および再現性あるサンプル分析結果を提供する。
【００３９】
本発明によれば、該タンパク質は例えば、酵素、抗体、抗原、ホルモン、受容体等からなる群から選ばれ得、これは本発明に、広範な応用分野を付与する。
【００４０】
他の利点は、添付の図面を参照しながら、限定せずにその応用を示すために与えられる以下の実施例を読めば、当業者には更に明らかになるであろう。
【実施例】
【００４１】
実施例１：ピロール活性エステルの調製
Ａ）スルホ−Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（スルホ−ＮＨＳ）ピロールの合成
以下の順序にて、以下のものが２５ｍＬ丸底フラスコ中へと入れられる。
１１−（１−ピローリル）ウンデカン−１−オイック酸（２ｍｍｏｌ；５０３ｍｇ） Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（２ｍｍｏｌ；４３４ｍｇ）
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２．４ｍｍｏｌ；４９５ｍｇ）
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬが、引き続いて加えられる。濁った混合物が得られ、終夜、磁気攪拌される。
【００４２】
この反応混合物が真空下に、引き続いて濾過される。該反応の間に形成されたジシクロヘキシルウレア（ジシクロヘキシル尿素、ＤＣＵ）の沈澱が、取り除かれる。目的生成物を含有する濾液は、ロータリー・エバポレーター中でエバポレーション（留去）される。
【００４３】
得られた該生成物は、水２５ｍＬ中に取り込まれる。この溶液は、ジクロロメタン５０ｍＬを用いて３回洗浄され、残ったＤＣＣを取り除く。この水は終夜、Ｓｐｅｅｄｖａｃ（登録商標）中で引き続き取り除かれる。
【００４４】
該反応の収率は、６５％である。
【００４５】
Ｂ）マレイン酸イミド（マレイミド）ピロールの合成
マレイン酸イミド活性エステルの調製
マレイミド酸（３．７ｇ；１７．５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（２ｇ；１７．５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（３．６ｇ；１７．５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（９０ｍＬ）が終夜、磁気攪拌される。該マレイン酸イミドの該ピロールとのカップリング化学反応を、以下に示す。
【００４６】
得られた混合物が濾過され、ＤＣＵを取り除く。得られた濾液が引き続き、濃縮される。
【００４７】
白色粉末が得られる。この生成物は更に精製せずに、そのまま使用された。
【００４８】
【化２】
【００４９】
Ｘは−ＣＨ２基であり、ｎは１≦ｎ≦２０であるような整数である。
【００５０】
例えば、［Ｘ］ｎは以下の点ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）において定義されるマレイン酸イミドピロールのようなものであってよい。
【００５１】
ｉ）マレイン酸イミド−［２］−ピロール：
【００５２】
【化３】
【００５３】
マレイン酸イミド活性エステル（９２４ｍｇ；３ｍｍｏｌ）、Ｎ−アミノエチルピロール（３３０ｍｇ；３ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ１５ｍＬの混合物が、終夜攪拌される。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、この反応が完結していることを証明できる。
【００５４】
該ＤＭＦのエバポレーションの後、生成物を、シリカ・カラム・クロマトグラフィーにより精製する。その溶出は、純粋なジクロロメタンを用いて開始され、メタノール（ＭｅＯＨ）の濃度勾配を増加させながら続けられた（該生成物の溶出：９８％〜２％）。
【００５５】
得られた量は、０．４ｇである。該反応の最終収率はこれゆえに、４５％である。
【００５６】
ｉｉ）マレイン酸イミド−［６］−ピロール：
【００５７】
【化４】
【００５８】
この反応は、ＤＭＦ（１５ｍＬ）中、マレイン酸イミド活性エステル（０．９２４ｇ；３ｍｍｏｌ）およびＮ−アミノヘキシルピロール（０．４９８ｇ；３ｍｍｏｌ）を混合した後、終夜磁気攪拌されて実施された。シリカ・カラム溶出は、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９７％〜３％）混合液を用いて実施された。
【００５９】
この反応に関しては４６．４％の収率が得られ、０．５ｇであった。得られたこの生成物は、褐色の液体である。
【００６０】
ｉｉｉ）マレイン酸イミド−［１３］−ピロール：
【００６１】
【化５】
【００６２】
このプロトコールは上記のものと同一なので、マレイン酸イミド活性エステル（１．１４ｇ；３．７０ｍｍｏｌ）およびピロール−［１３］−アミン（１ｇ；３．７０ｍｍｏｌ）が、ＤＭＦ２０ｍＬ中混合される。シリカ・カラム溶出は、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９７％〜３％）混合液を用いて実施される。得られた生成物（褐色液体）の量は１ｇ、つまり最終収率５８％である。
【００６３】
実施例２：ストレプタビジンのカップリング
Ａ）ＮＨＳ−ピロールを使用したストレプタビジンのカップリング
上記実施例１においてのように生成された２タイプのＮＨＳ−ピロール：
ＮＨＳピローリルカプロエート
スルホ−ＮＨＳピローリルウンデカノエート
が、比較して使用される。
【００６４】
初期モル比（ＩＭＲ）＝４０、つまり１分子のタンパク質につき４０分子のＮＨＳ−ピロールを用いた手順が実施され、このゆえに、カップリング用緩衝液３００μＬ中５．５５ｎｍｏｌのストレプタビジンがいずれにせよ、ＮＨＳ−ピロール２２２ｎｍｏｌ（１．５ｍＭのＮＨＳ−ピロール溶液１４８μＬ）へと加えられる。該カップリング反応は、２時間放置される。
【００６５】
３つの反応が、並行して実施される。
第１の反応は、前記ＮＨＳピローリルカプロエートを使用する。
第２の反応は、前記スルホ−ＮＨＳピローリルウンデカノエートを使用する。
第３（最後）の反応は、カップリング用緩衝液中にストレプタビジンのみを含有するコントロールである。
【００６６】
反応後の精製は、製造元のプロトコールに従って、Ｎａｌｇｅｎｅ３０Ｋフィルター（ブランド名）を使用して、実施される。
【００６７】
各サンプル３７５μＬが各々、異なるフィルター上へと載せられ、８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離される。各フィルターが次いで、「スポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）」緩衝液２００μＬを用いて３回濯がれるが、各洗浄の間において、１５〜２０分間の遠心分離が必要である。
【００６８】
終わりに、５０μＬの３フラクション：
ストレプタビジン−ＮＨＳピローリルカプロエート
ストレプタビジン−スルホ−ＮＨＳピローリルウンデカノエート
ストレプタビジンのみ
が回収される。
【００６９】
Ｂ）ストレプタビジンへのこれらのマレイン酸イミドピロールのカップリング
ストレプタビジンはＳＨ官能基を全く持っていないので、２つの官能基を有する試薬Ｎ−コハク酸イミド−３−イル［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ）によりＳＨ官能基が作り出されるが、ＳＰＤＰはこのタンパク質のアミン官能基と反応するものである。この試薬のＳＨ官能基は引き続き、これらの試薬を使用することの利点により、ジチオトレイトールにより脱保護される。この技術は、例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｄｒｅｖｉｎ，Ｍ．，およびＡｘｅｎ，Ｒ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３，７２３−７２７に記載される。
【００７０】
上記実施例１においてのように生成された３つのマレイン酸イミドはこれゆえに：
エチルマレイン酸イミド−ピロール
トリオキサトリデカノイルマレイン酸イミド
ヘキシルマレイン酸イミド−ピロール
である。
【００７１】
ａ）脱保護された該ＳＨ官能基の生成
ストレプタビジン４．２ｎｍｏｌを、ＳＰＤＰ１５０ｎｍｏｌと反応させる。この反応は、４０分間放置される。この混合物は次いで、Ｎａｌｇｅｎｅ３０Ｋフィルターを使用して濾過され、ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（バッファー）１００μＬを用いて、３回濯がれる。
【００７２】
ジチオトレイトール６２．５ｎｍｏｌが引き続いて、得られたストレプタビジン−ＳＰＤＰ（ＳＡ−ＳＰＤＰ）へと加えられる。この反応は、４０分間放置される。濾過が前回と同様に再度実施され、濯ぎがＰＢＳ緩衝溶液を用いて実施され、反応可能な遊離のチオール官能基を有するストレプタビジン（ＳＡ−ＳＨ）を、１５０μＬの容積で回収した。
【００７３】
得られるサンプルは引き続き、５０μＬの３フラクションへと分離され、これらにマレイン酸イミド−ピロール８５ｎｍｏｌが加えられる。
【００７４】
ｂ）エチルマレイン酸イミド−ピロールの場合（ＭＷ＝３０３ｇ／ｍｏｌ）
マレイン酸イミド−ピロール２ｍｇをＤＭＦ２００μＬ中に取り込むことにより調製された２５ｎｍｏｌ／μＬマレイン酸イミド−ピロール溶液（３．４μＬ；８５ｎｍｏｌ）と、ＳＡ−ＳＨが混合される。この反応は、３０分間継続する。
【００７５】
ｃ）トリオキサトリデカノイルマレイン酸イミドの場合（ＭＷ＝４６３ｇ／ｍｏｌ）
この反応は上記のものと同様に実施され、マレイン酸イミド−ピロール１ｍｇをＤＭＦ５０μＬ中に取り込むことにより調製された３９ｎｍｏｌ／μＬマレイン酸イミド−ピロール溶液（２．２μＬ；８５ｎｍｏｌ）へと、ＳＡ−ＳＨを加えた。この反応は、３０分間継続する。
【００７６】
ｄ）ヘキシルマレイン酸イミド−ピロールの場合（ＭＷ＝３５９ｇ／ｍｏｌ）
マレイン酸イミド−ピロール３ｍｇをＤＭＦ２００μＬ中に取り込むことにより調製された５７．５ｎｍｏｌ／μＬマレイン酸イミド−ピロール溶液（１．５μＬ；８５ｎｍｏｌ）と、該ＳＡ−ＳＨが混合される。この反応は、３０分間実施される。
【００７７】
該反応後、これらの種々の反応混合物および前記コントロール溶液（ストレプタビジンのみ、試薬添加せず）が、Ｎａｌｇｅｎｅ３０Ｋフィルターを通して遠心分離され、「スポッティング」緩衝液を用いて濯がれる。最後に「スポッティング」緩衝液（５０ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７）によりその容積を整えることにより、全サンプルを５０μＬの最終容積とする。
【００７８】
実施例３：ポリピロールの電気化学的合成（「スポッティング」）：電気重合
この反応は、添付の図６に表される「スポッティング」構築を使用して実施されるが、これは更に、前記したＰ．Ｇｕｅｄｏｎらによる文献に詳細に記載される。この図では、「Ａ」および「Ｂ」がそれぞれ、前記ＮＨＳカプロエートおよび前記スルホ−ＮＨＳウンデカノエートを介してポリピロールへとカップリングされたストレプタビジンに対応し；「Ｃ」が、前記ヘキシルマレイン酸イミドを介してピロールへとカップリングされたストレプタビジンに対応し；「Ｄ」が、ストレプタビジンのみに対応する。「Ｌ」はガラス・スライドを表し；「Ａｕ」はこのガラス・スライド上に付着された金層であり（この組み合わせを以降「金スライド」と呼ぶ）；「ｓ」は電気重合溶液であり；「Ｗ」は作動電極である。「１」はピペットを指し；「３」は該ピペットのチップを指し；「７」は該金層上へと付着されたポリピロールスポットを指す。
【００７９】
この図に表されるように、該電気重合が実施される該金スライドは作動電極（Ｗ）として働き、この付着用ピペットチップ中に置かれる白金線は対向電極（Ｃｅ）として働く。この電気化学的システムは、ポテンシオスタット５へと接続される。
【００８０】
この共重合は、前の実施例において生成されたものから選ばれるＳＡ−マレイン酸イミド−ピロール溶液５μＬ、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液を含む前記「スポッティング」溶液１５μＬ、および２０ｍＭピロールを含有する溶液２０μＬを用いて実施される。
【００８１】
５００ミリ秒継続し２．４Ｖまで上昇する（つまり、約０．９Ｖ／ＥＣＳ）電気パルスに引き続き、該金層上において、フィルム（薄膜）が合成される。
【００８２】
種々のスポットが全て同様に生成され、各重合間において、前記ピペットチップが水を用いて濯がれる。
【００８３】
実施例４：該スポット上へとグラフトされるタンパク質の検出からなる相（段階）
実施例３の電気化学的合成の後、該スポットを含有する領域が、接着フェルトペンを使用して生成された疎水性障壁により区切られる。該スポットは引き続いて、濯ぎ用緩衝液１ｍＬを用いて２回洗浄される。該スポットは次いで、ブロック用緩衝液１００μＬを用いてブロックされ、先に区切られた該疎水性領域内において付着されるタンパク質の非特異的な取り付けを防ぐ。前回と同じ第２回の濯ぎの後、ＰＢＳ中１０％のビオチン化Ｒ−フィコエリトリン溶液１００μＬが、付着される。
【００８４】
この反応は１０分間暗所に置かれ、次いで顕微鏡下での検出相（段階）の前に、第１回および第２回と同じ最終的な洗浄が実施される。
【００８５】
実施例５：視覚化
前記金スライド上へと付着されたサンプルは、スライドとカバー・スリップとの間に置かれ、緑色光の下に１．２倍の拡大率において、ＣＤＤカメラを備えたエピ蛍光顕微鏡を用いて観察される。該スポットの写真が撮影され、ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓソフトウェアを使用して、その蛍光強度が測定される。
【００８６】
Ａ）実施例１において生成されたＮＨＳピローリルカプロエートおよびスルホ−ＮＨＳピローリルウンデカノエートを使用したカップリング
これらのカップリングがここで、ビオチンおよびストレプタビジン（ＳＡ）からなる親和性カップリングを使用して、蛍光検出により実証される。これらのカップリングの有効性はこれゆえに、それらの蛍光強度（蛍光強度（ＩＦ）または灰色濃度）を通じて判断される。
【００８７】
４タイプのスポットが、以下のスキームに従って生成された：
ＭＲ＝反応溶媒：ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液および２０ｍＭピロール：
ＩＦ＝１０；
Ａ＝前記ＮＨＳピローリルカプロエートを介してピロールへとカップリングされたＳＡ；
ＩＦ＝２００；
ＢＡ＝前記スルホＮＨＳピローリルウンデカノエートを介してピロールへとカップリングされたＳＡ；
ＩＦ＝２４０；
Ｔ＝コントロール：ＳＡのみ＋ＭＲ：
ＩＦ＝８０；
但し、ＩＦ＝蛍光強度
ブラック（黒）＝バックグラウンド（背景）ノイズ。
【００８８】
それらはそれぞれ、添付の図７ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）に、この順序で示される。
【００８９】
ＭＲのスポットは、ポリピロールのフィルム表面における非特異的吸着をコントロールする。我々の予想によれば、それは僅かな蛍光しか呈しない。
【００９０】
このコントロールのスポットは、ピロールへとカップリングされていないストレプタビジンに対応する。それはこれゆえに、該ポリピロール上へと吸着される。このスポットは、ＳＡ−ピロールサンプルＡおよびＢのものよりも明らかに小さな蛍光強度を示す。このことは、ピロールの存在が、前記金プレート表面へのストレプタビジンの取り付けを促進することを実証する。
【００９１】
スポットＡおよびＢはそれぞれ、前記ＮＨＳピローリルカプロエートおよび前記スルホＮＨＳピローリルウンデカノエートを介してポリピロールへとカップリングされたストレプタビジンに対応する。これら２つのスポットの蛍光強度を比較すると、該ＳＡが該ＮＨＳピローリルカプロエートを介してカップリングされる場合よりも、該スルホＮＨＳピローリルウンデカノエートを介してカップリングされる場合の方が、得られるシグナルが僅かに強いことに気がつく。この違いは、正に恐らくこのＮＨＳを構成する鎖長によるものであり、該ビオチンの取り付け用部位への接近し易さの維持を可能にするであろう。
【００９２】
全体としてこのカップリングは、ストレプタビジンに関して良好な結果を与えるが、他のタイプのタンパク質に関しても可能であると結論される。
【００９３】
Ｂ）３つの異なるマレイン酸イミドを使用したカップリング
５つのタイプのスポットが、以下のスキームに従って生成された：
ＭＲ＝反応溶媒：ｐＨ７の５０ｍＭリン酸緩衝液および２０ｍＭピロール；
Ｔ＝コントロール：ＭＲ＋ＳＡのみ；
Ａ＝ＭＲ＋前記トリオキサトリデカノイルマレイン酸イミドを介してピロールへとカップリングされたＳＡ；
Ｂ＝ＭＲ＋前記エチルマレイン酸イミドを介してピロールへとカップリングされたＳＡ；
Ｃ＝ＭＲ＋前記ヘキシルマレイン酸イミドを介してピロールへとカップリングされたＳＡ。
【００９４】
図８（ａ）および（ｂ）は、種々のストレプタビジン−ピロール共役体に関する蛍光強度の測定値を示す。これらのスポットは、図８（ｂ）のスキームに従って付着される。この図の参照番号は、前記されたものに対応する。
【００９５】
これらの写真に関して採られた蛍光強度の測定値は、以下の表２に要約される。
【００９６】
ＭＲ１、ＭＲ２、およびＭＲ３のスポットは、本発明者らの予想によれば、僅かな蛍光しか呈さず、このことは非特異的吸着が存在しないことを示す。
【００９７】
コントロールＴ１およびＴ２は、ピロールへとカップリングされていないＳＡに対応し、これゆえに該ポリピロール上へと吸着され、前記ＳＡ−ピロールサンプルのものよりも遙かに小さい蛍光を示す。
【００９８】
これゆえに、この分子上のピロールの存在がここでもまた、該ストレプタビジンの取り付けを促進する。
【００９９】
これら３つのスペーサー・アームに関して蛍光強度を比較すると、エチル・アーム、そして最終的にヘキシル・アームよりも、トリオキサトリデカノイル・アームに関して、より良い蛍光が得られることに気がつく。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
本研究における現状として、本発明者らは。何故１つのアームがもう１つ別のアームよりもより良いシグナルを呈するのか、確実性を持って決定することはできない。この質問に対する答えは、更なる研究および特徴付けを必要としている。この線の考えでは、例えば、これらのアームの長さおよび／またはより親水性もしくはより親水性でない性質であり得るであろうが、このカップリングの効率等でもあり得るであろう。
【０１０２】
実施例６：抗体
Ａ）抗体のＮＨＳ−ピロールとのカップリング
前記ＮＨＳピローリルカプロエートが、２つの異なるタイプの抗体：
ｉ）ウサギイムノ（免疫）グロブリンＧ
ｉｉ）抗ｈＣＧ（ｈｕｍａｎ Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン）イムノ（免疫）グロブリン
と共に、ここでは使用される。
【０１０３】
ｉ）ウサギＩｇＧ
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）１０ｍｇが、ＰＢＳ３３３μＬに取り込まれる。この手順が、ＩＭＲ４０を用いて実施される。これゆえに、この溶液１２．５μＬ（２．５ｎｍｏｌ）が、１５ｍＭのＮＨＳピローリルカプロエートＤＭＳＯ溶液６．７μＬ（１００ｎｍｏｌ）と混合された。この反応は、２時間３０分放置される。
【０１０４】
これらのサンプルは引き続き、２０分間８０００ｒｐｍにて、Ｎａｌｇｅｎｅ３０Ｋフィルターを使用して精製され、スポッティング緩衝液１００μＬを用いて３回濯がれ、各濯ぎの間には、２０分の遠心分離が必要である。
【０１０５】
最後に、これらのＩｇＧ−ピロールは、スポッティング緩衝液５０μＬ中に回収される。
【０１０６】
ｉｉ）抗ｈＣＧイムノグロブリン
２つの異なる抗ｈＣＧ抗体（ＩｇＧ）が利用でき、両者ともマウス由来であり、ＨＴ１３およびＦＢＴ１０である。以下のプロトコールは、それらの各々１つに関して同じである。
【０１０７】
抗体１ｎｍｏｌが、１５ｍＭのピローリルカプロエートＤＭＳＯ溶液６７μＬへと加えられる。得られた混合物は２時間３０分、作用するように放置される。
【０１０８】
これらのサンプルは、Ｎａｌｇｅｎｅフィルターを使用して前記と同様に濾過され、スポッティング緩衝液１００μＬを用いて３回濯がれる。抗ｈＣＧ ＩｇＧ−ピロールの２サンプルが、スポッティング緩衝液５０μＬ中に溶液状態で回収される。
【０１０９】
Ｂ）ポリピロールの電気化学的合成：スポッティング
この共重合は、考慮されるこれら２つのモデルに関して同じである。
【０１１０】
ここでそれは、いずれのＩｇＧ−ピロール溶液であっても２０μＬおよびスポッティング溶液（２０ｍＭリン酸緩衝液、２０ｍＭピロール）２０μＬを含有する溶液４０μＬを用いて実施される。
【０１１１】
Ｃ）該スポット上へとグラフトされた抗体の蛍光検出からなる相（段階）
以下の２つのモデルにおいて、該スポットは各ステップ間に、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液１ｍＬ、１％ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎを用いて２回濯がれ、全ての反応は常温において実施される。
【０１１２】
ｉ）ウサギＩｇＧ
電気化学的合成の後、該スポットは３０分間、濯ぎ用緩衝液（１０ｍＭのＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ）１００μＬを用いて濯がれ、次いでブロックされる。２回目の濯ぎの後、ビオチン化抗ヒトまたは抗ウサギＩｇＧ抗体溶液１００μＬがそれぞれ１／１００００および１／５００００に稀釈され、加えられる。この反応は、３０分間放置される。更なる濯ぎの後、濯ぎ用緩衝液中１０％のストレプタビジンＲ−フィコエリトリン溶液１００μＬが、暗所において１０分間で加えられる。その蛍光検出は、実施例４に前記した通りに実施される。
【０１１３】
ｉｉ）抗ｈＣＧイムノグロブリン
以下のプロトコールは、その濯ぎおよびブロックのステップに関して前記と同じであり、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液、１％ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ中３００ｎＭのｈＣＧ溶液１００μＬが、スポット上へと付着される。この反応は、３０分間放置される。更なる濯ぎが実施され、次いで、プレートへと取り付けられたものとは異なりウサギ由来である抗ｈＣＧ抗体溶液１００μＬが、１／２０００に稀釈され、加えられる。それは３０分間、作用するように放置される。更なる濯ぎが実施され、次いで、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ溶液１００μＬが、１／１００００に稀釈され、加えられる。
【０１１４】
この反応は、３０分間放置される。濯ぎの後、その視覚化が前記の通りに実施される。
【０１１５】
Ｄ）抗体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験
そのブロックの機能性を解析することができるように、本発明者らは固定化された入射角条件を用い、時間の関数として、その反射率の変動速度を測定した。
【０１１６】
使用された機器の詳細は、前記したＰ．Ｇｕｅｄｏｎらの文献にある。
【０１１７】
図９は、緩衝液中において得られたプラズモンのグラフ表示である。
【０１１８】
本発明者らはこのため約３４．１°の条件を使用し、反射率曲線の吸収ピークの右隣にあるようにした。
【０１１９】
該プロトコールは、以下の通りであった：
ブロッキング・ステップ。１０ｍＭのＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有する溶液は、引き続いての非特異的相互作用を制限するためのものであった。
緩衝液として働くブロッキング溶媒中での入射角の関数としての反射率の測定および記録。
１／１００に稀釈されたビオチン化抗ウサギＩｇＧを用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、抗体の取り込みの前後での、同一溶媒中での濃度差を測定する。
１／１００に稀釈されたＬＣＧを用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、抗体の取り込みの前後での、同一溶媒中での濃度差を測定する。
１／２０００に稀釈されたウサギ由来抗ｈＣＧＩｇＧを用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、抗体の取り込みの前後での、同一溶媒中での濃度差を測定する。
１／１００に稀釈されたビオチン化抗ウサギＩｇＧを用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、抗体の取り込みの前後での、同一溶媒中での濃度差を測定する。
０．１Ｍグリシンおよび塩酸を含有する再生緩衝溶液（ｐＨ＝２．３）を用いるステップ。
ブロッキングへと戻り、プラズモンの間のブロッキングにおける初期濃度と最終濃度とを比較する。
【０１２０】
このプレートは、第１にビオチン化抗ウサギＩｇＧを用いて、次いでｈＣＧ、ウサギ由来抗ｈＣＧ、そして最後にビオチン化抗ウサギＩｇＧを用いて視覚化される。該実験は、５時間２０分継続する。
【０１２１】
添付の図１０は、プレート上での付着速度のグラフ表示であり、２つの付着物は、ウサギＩｇＧ（ＩｇＧ１）およびＨＢＴ１０（抗ｈＣＧ抗体）からなる。
【０１２２】
この実験は、種々のタンパク質の積層体が望み通りに生じることを実証するものである。注入されるタンパク質の付着物への取り付けに対応する種々のプラトーもまた、特記される。ウサギＩｇＧからなる付着物は抗ウサギＩｇＧのみを取り込み、ｈＣＧを取り込まない。ＨＢＴ１０からなる付着物は明らかにｈＣＧを付着させ、このことは、２つのタイプのウサギ抗体間では、つまりプレートに取り付けられたウサギＩｇＧとウサギ由来の抗ｈＣＧとの間では、交差反応を与えない。
【０１２３】
実施例７：ポリマー上／中へとグラフトされたタンパク質の認識能力における、このポリマー付着物の厚さの影響
ウサギ由来抗ＩｇＧ抗体は、実施例６に与えられた方法に従って、該ポリマー中へとグラフトされる。
【０１２４】
該付着物は、同じ反応溶媒（５０ｍＭリン酸ナトリム緩衝液、ｐＨ７、２０ｍＭピロールＩｇＧ）を使用して、生成される。該付着物は、Ａ〜Ｆに関しては２つずつ、Ｇに関しては３つ生成されるが、これらは様々な時間、電気的スポッティングにより生成され、このため、変動可能な厚さのポリマーを生成させる。その合成負荷が測定され、該ポリマーの厚さがこれゆえに評価され（測定され）得る。
【０１２５】
生産されるバイオチップは引き続き、ビオチン化抗ウサギＩｇＧにより処理され、その認識が次いで、ストレプタビジン−フィコエリトリンにより検出される（実施例６参照）。得られた画像が、添付の図１１（ａ）および（ｂ）に与えられ、その定量結果（蛍光強度）が、以下の表３に与えられる。図１１（ｂ）は、写真１１（ａ）のダイヤグラム表示であり、付着の実証を可能にする。
【０１２６】
該結果は、該ポリマーが厚過ぎる場合、該抗ウサギＩｇＧ（巨大分子）を用いた認識が困難であることを示す。厚いポリマーの場合、ＷｏｌｏｗａｃｚらによりＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，６４，１５４１−１５４５に記載のもののような捕捉システムが得られる。蛍光の場合、最適厚さは１０ｎｍオーダーであり、これは多かれ少なかれ、不動化された分子の直径に対応する。それはこれゆえに、該ポリマー中に単に捕捉されるだけで済み、これは共有結合による取り付けを意味する。この同じポリマーの厚さ（１０ｎｍ未満）は更に、プラズモン共鳴（Ｐ．Ｇｕｅｄｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，（２４），６００３−６００９）による検出を最適化することを可能にする。
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
結論
該ポリマーの厚さはこれゆえに、嵩高いタンパク質を取り付ける能力、特に、嵩高いタンパク質の認識能力において、鍵となる役割を演じる。文献に記載の電気重合用の厚さまたは電荷密度はこれゆえに、比較され得る。Ｗｏｌｏｗａｃｚらは、グルコースオキシダーゼ（酸化酵素）を取り込むフィルムを提案し、その重合密度は１．４ｍＣ／ｍｍ２のオーダー（つまり、フィルム厚約２８０ｎｍ）である。この場合、該ポリマーの有孔性という利点により、それが小さな分析物であるグルコースの拡散を可能にするので、このセンサーは機能するのである。更に最近では、Ｓａｄｉｋらが前記文献中において、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）モデルにおけるイムノセンサーを提案し、このタンパク質の捕捉に使用されるポリピロールフィルムの厚さは、最小３５０ｎｍ、つまり重合電荷密度１．５ｍＣ／ｍｍ２である。
【０１２９】
先行技術は、該ポリマーの厚さがバイオセンサーの生物学的応答に影響を持っているとは記載も示唆もしていない。本発明者らはこれゆえに、このパラメータ（ポリマーの厚さ）を考慮に入れる方法を最初に提供するものであり、予期せず、先行技術の前記問題を解決することを可能にするものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、先行技術およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図２】図２は、先行技術およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図３】図３は、先行技術およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図４】図４は、先行技術およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図５】図５は、本発明の方法およびその結果（右側）を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図６】図６は、本発明の方法を実施するのに使用される装置を、ダイヤグラムにより表したものである。
【図７】図７ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）は、種々のストレプタビジン＋ビオチン共役体の蛍光強度測定のマイクログラフを表したものである。
【図８】図８ａ）および８ｂ）はそれぞれ、種々のストレプタビジン＋ビオチン共役体の蛍光強度測定のマイクログラフ、ならびに、該マイクログラフ上において得られるスポットのダイヤグラムを表したものである。
【図９】図９は、抗体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイの結果のグラフ表示である。
【図１０】図１０は、本発明の方法による導電性ポリマーに取り付けられたウサギイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）と抗ｈＣＧ抗体（ＨＢＴ１０）とからなるブロックの認識速度を表したものである。
【図１１】図１１は、実施例７に記載された操作条件下に得られたポリピロールフィルムの厚さの関数として測定された、蛍光強度のマイクログラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロールポリマーにより、タンパク質を、導電性支持体へと取り付ける方法であって、以下のステップ：
ピロールモノマーへと取り付けられる該タンパク質をカップリングさせ、タンパク質−ピロールカップリング化合物の第１溶液を得るステップ；
該タンパク質にカップリングされていないピロールモノマーの第２溶液を調製し；
該第１溶液を該第２溶液と混合し、電気重合溶液を得るステップ；
該電気重合溶液を使用して、該導電性支持体の少なくとも１つの与えられた領域上において、該ピロールとピロールへとカップリングされた該タンパク質との電気重合を実施し、ここで該電気重合が、該領域上へと１〜５００μＣ／ｍｍ２の電流量を送ることにより実施されるステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記電気重合が、前記領域上へと５〜１００μＣ／ｍｍ２の電流量を送ることにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電気重合が実施される少なくとも１つの前記導電性領域が、少なくとも１ブロックのバイオセンサー支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ピロールへと取り付けられる前記タンパク質のカップリングが、該ピロールの活性化、およびその後の、取り付けられる該タンパク質への活性化された該ピロールのカップリングにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ピロールの活性化が、Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドまたはマレイン酸イミドにより実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質−ピロールカップリング化合物が以下の化合物から選ばれる、請求項４に記載の方法。
【化１】
【請求項７】
２つのタンパク質が前記ピロールポリマーへと取り付けられ、引き続いて、前記導電性支持体の２つの異なる与えられた領域上において取り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、酵素、抗体、抗原、ホルモン、および受容体からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
モノセンサーまたはマルチセンサーを生産するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１０】
バイオチップを生産するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロールポリマーにより、タンパク質を、導電性支持体へと取り付ける方法であって、以下のステップ：
取り付けられるべき該タンパク質をピロールモノマーとカップリングさせ、タンパク質−ピロールカップリング化合物の第１溶液を得るステップ；
該タンパク質にカップリングされていないピロールモノマーの第２溶液を調製するステップ；
該第１溶液を該第２溶液と混合し、電気重合溶液を得るステップ；
該電気重合溶液を使用して、該導電性支持体の少なくとも１つの与えられた領域上において、該ピロールとピロールへとカップリングされた該タンパク質との電気重合を実施し、ここで該電気重合が、１０００ミリ秒未満の合成時間、５０μＣ／ｍｍ２未満の電荷を用いて実施され、１０ｎｍ以下の厚さを持つコポリマーフィルムを得るステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記電気重合が実施される少なくとも１つの前記導電性領域が、少なくとも１ブロックのバイオセンサー支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ピロールへと取り付けられる前記タンパク質のカップリングが、該ピロールの活性化、およびその後の、取り付けられる該タンパク質への活性化された該ピロールのカップリングにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ピロールの活性化が、Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドまたはマレイン酸イミドにより実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質−ピロールカップリング化合物が以下の化合物から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【化１】
【請求項６】
２つのタンパク質が前記ピロールポリマーへと取り付けられ、引き続いて、前記導電性支持体の２つの異なる与えられた領域上において取り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、酵素、抗体、抗原、ホルモン、および受容体からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
モノセンサーまたはマルチセンサーを生産するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項９】
バイオチップを生産するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１】
ピロールポリマーにより、タンパク質を、導電性支持体へと取り付ける方法であって、以下のステップ：
ピロールモノマーへと取り付けられる該タンパク質をカップリングさせ、タンパク質−ピロールカップリング化合物の第１溶液を得るステップ；
該タンパク質にカップリングされていないピロールモノマーの第２溶液を調製し；
該第１溶液を該第２溶液と混合し、電気重合溶液を得るステップ；
該電気重合溶液を使用して、該導電性支持体の少なくとも１つの与えられた領域上において、該ピロールとピロールへとカップリングされた該タンパク質との電気重合を実施し、ここで該電気重合が、該領域上へと１〜５００μＣ／ｍｍ２の電流量を送ることにより実施されるステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記電気重合が、前記領域上へと５〜１００μＣ／ｍｍ２の電流量を送ることにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電気重合が実施される少なくとも１つの前記導電性領域が、少なくとも１ブロックのバイオセンサー支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ピロールへと取り付けられる前記タンパク質のカップリングが、該ピロールの活性化、およびその後の、取り付けられる該タンパク質への活性化された該ピロールのカップリングにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ピロールの活性化が、Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドまたはマレイン酸イミドにより実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質−ピロールカップリング化合物が以下の化合物から選ばれる、請求項４に記載の方法。
【化１】
【請求項７】
２つのタンパク質が前記ピロールポリマーへと取り付けられ、引き続いて、前記導電性支持体の２つの異なる与えられた領域上において取り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、酵素、抗体、抗原、ホルモン、および受容体からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
モノセンサーまたはマルチセンサーを生産するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１０】
バイオチップを生産するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロールポリマーにより、タンパク質を、導電性支持体へと取り付ける方法であって、以下のステップ：
取り付けられるべき該タンパク質をピロールモノマーとカップリングさせ、タンパク質−ピロールカップリング化合物の第１溶液を得るステップ；
該タンパク質にカップリングされていないピロールモノマーの第２溶液を調製するステップ；
該第１溶液を該第２溶液と混合し、電気重合溶液を得るステップ；
該電気重合溶液を使用して、該導電性支持体の少なくとも１つの与えられた領域上において、該ピロールとピロールへとカップリングされた該タンパク質との電気重合を実施し、ここで該電気重合が、１０００ミリ秒未満の合成時間、５０μＣ／ｍｍ２未満の電荷を用いて実施され、１０ｎｍ以下の厚さを持つコポリマーフィルムを得るステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記電気重合が実施される少なくとも１つの前記導電性領域が、少なくとも１ブロックのバイオセンサー支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ピロールへと取り付けられる前記タンパク質のカップリングが、該ピロールの活性化、およびその後の、取り付けられる該タンパク質への活性化された該ピロールのカップリングにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ピロールの活性化が、Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドまたはマレイン酸イミドにより実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質−ピロールカップリング化合物が以下の化合物から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【化１】
【請求項６】
２つのタンパク質が前記ピロールポリマーへと取り付けられ、引き続いて、前記導電性支持体の２つの異なる与えられた領域上において取り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、酵素、抗体、抗原、ホルモン、および受容体からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
モノセンサーまたはマルチセンサーを生産するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項９】
バイオチップを生産するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５０７４９７（Ｐ２００６−５０７４９７Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５４６２３（Ｐ２００４−５５４６２３）
【出願日】平成１５年１１月２０日（２００３．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／０５０１２７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８９７２
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５００３４８６９７）コミッサリア ア レネルジー アトミーク (21)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ´ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月２０日（２００３．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／０５０１２７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８９７２
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５００３４８６９７）コミッサリア ア レネルジー アトミーク (21)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ´ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]