ファージミドを使用するヘテロ二量体受容体ライブラリー
【課題】組換え遺伝子を含む繊維状ファージの表面上でヘテロ二量体組換え遺伝子産物を発現させる新しい表面組込み技術を提供すること。
【解決手段】リガンド結合ヘテロ二量体受容体をコードするゲノムを含む繊維状ファージであって、該リガンド結合ヘテロ二量体受容体は、第１および第２のポリペプチドを含み、前記第１のポリペプチドは、カルボキシ末端繊維状ファージ膜ｃｐＩＩＩアンカードメイン又はｃｐＶＩＩＩアンカードメインに融合しており、前記第１および第２のポリペプチドは、別のポリペプチドとして独立して発現され、次いで前記リガンド結合ヘテロ二量体受容体として前記繊維状ファージ表面で再構築される、前記繊維状ファージ。
【解決手段】リガンド結合ヘテロ二量体受容体をコードするゲノムを含む繊維状ファージであって、該リガンド結合ヘテロ二量体受容体は、第１および第２のポリペプチドを含み、前記第１のポリペプチドは、カルボキシ末端繊維状ファージ膜ｃｐＩＩＩアンカードメイン又はｃｐＶＩＩＩアンカードメインに融合しており、前記第１および第２のポリペプチドは、別のポリペプチドとして独立して発現され、次いで前記リガンド結合ヘテロ二量体受容体として前記繊維状ファージ表面で再構築される、前記繊維状ファージ。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド結合へテロ二量体受容体をコードするゲノムをカプセル化する繊維状ファージ。
【請求項２】
前記受容体がエピトープ結合複合体である請求項１記載の繊維状ファージ。
【請求項３】
前記ファージが検出可能に標識された請求項１記載の繊維状ファージ。
【請求項４】
第１および第２のポリペプチドからなるリガンド結合へテロ二量体受容体であって、前記第１のポリペプチドにはアミノ末端原核分泌シグナルドメインおよびカルポキシ末端繊維状ファージ膜アンカードメインが隣接し、前記第２のポリペプチドがアミノ末端原核分泌シグナルドメインに融合したリガンド結合へテロ二量体受容体。
【請求項５】
前記受容体がエピトープ結合複合体である請求項４記載の受容体。
【請求項６】
前記第１のポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドである請求項５記載の受容体。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチドである請求項５記載の受容体。
【請求項８】
前記原核分泌シグナルがｐｅｌＢ分泌シグナルである請求項４記載の受容体。
【請求項９】
前記ｐｅｌＢ分泌シグナルが、
（ａ）配列番号：５，
（ｂ）配列番号：６および
（ｃ）配列番号：７
よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を有する請求項８記載の受容体。
【請求項１０】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＶＩＩＩ膜アンカーである請求項４記載の受容体。
【請求項１１】
前記繊維状ファージ膜アンカーが、配列番号：１７の残基２６〜残基４０の式により表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１０記載の受容体。
【請求項１２】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＩＩＩ膜アンカーである請求項４記載の受容体。
【請求項１３】
前記繊維状ファージ膜アンカーが、配列番号：１６の残基ｌ〜２１１の式により表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１１記載の受容体。
【請求項１４】
融合ポリペプチドを発現するベクターであって、前記ベクターは挿入物ＤＮＡの方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介して機能的に結合した上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列からなり、前記上流の配列は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の配列は繊維状ファージ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列は前記融合ポリペプチドの部分としての前記翻訳可能なＤＮＡ配列の発現のための一組のＤＮＡ発現シグナルに機能的に結合したベクター。
【請求項１５】
前記原核分泌シグナルがｐｅｌＢ分泌シグナルである請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
前記ｐｅｌＢ分泌シグナルが、
（ａ）配列番号：５，
（ｂ）配列番号：６および
（ｃ）配列番号：７
よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＶＩＩＩ膜アンカーである請求項１４記載のベクター。
【請求項１８】
前記繊維状ファージ膜アンカーが、配列番号：１７の残基２６〜残基４０の式により表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＩＩＩ膜アンカーである請求項１４記載のベクター。
【請求項２０】
前記繊維状ファージ膜アンカーが配列番号：１１２のヌクレオチド塩基配列を有する請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
繊維状ファージ複製開始点をさらに含む請求項１４記載のベクター。
【請求項２２】
前記一組の発現シグナルが、前記下流の翻訳可能なＤＮＡ配列とフレームの合ったプロモーター、リボソーム結合部位、および少なくとも１つの停止コドンを含む請求項１４記載のベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが配列番号：１１６の塩基１〜塩基２０８に示すヌクレオチドに示す配列を有する請求項１４記載のベクター。
【請求項２４】
第２の挿入物ＤＮＡの方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介して機能的に結合した原核分泌シグナルをコードする第２の上流の翻訳可能なＤＮＡ配列をさらに含み、前記第２の翻訳可能なＤＮＡ配列が第２の融合ポリペプチドの部分としての前記第２の翻訳可能なＤＮＡ配列の発現のための一組のＤＮＡ発現シグナルに機能的に結合した請求項１４記載のベクター。
【請求項２５】
前記原核分泌シグナルが、
（ａ）配列番号：５，
（ｂ）配列番号：６および
（ｃ）配列番号：７
よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を有する請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
前記ベクターが配列番号：３の塩基３６〜塩基１１８に示すヌクレオチド配列を有する請求項２４記載のベクター。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ発現ベクターがベクターｐＣＯＭＢ８、ｐＣＯＭＢ２−８またはｐＣＫＡＢ８である請求項２４記載のベクター。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ発現ベクターがベクターｐＣＯＭＢ３、ｐＣＯＭＢ２−３、ｐＣＯＭＢ２−３′または ｐＣＫＡＢ３である請求項２４記載のベクター。
【請求項２９】
アミノ末端で原核分泌シグナルドメインに機能的に結合し、カルポキシ末端で繊維状ファージ膜アンカードメインに機能的に結合したリガンド結合受容体ポリペプチドからなるポリペプチド。
【請求項３０】
ポリペプチドが抗体可変鎖ポリペプチドである請求項２９記載のポリペプチド。
【請求項３１】
可変鎖が抗体重鎖ポリペプチドである請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３２】
それぞれのファージ粒子が請求項１４または請求項２４記載のＤＮＡ発現ベクターを含む繊維状ファージ粒子のライブラリー。
【請求項３３】
前記ライブラリーが少なくとも１０7の異なる種の前記ＤＮＡ発現ベクターを含有する請求項３２記載のライブラリー。
【請求項３４】
それぞれのファージ粒子が少なくとも １つの請求項４記載のリガンド結合へテロ二量体受容体を含有する繊維状ファージ粒子のライブラリー。
【請求項３５】
免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異誘発を誘導するプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは３′および５′末端を有し、
ａ）免疫グロブリン遺伝子の第１のフレーム構造領域に前記３′末端でハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列、
ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第２のフレーム構造領域に前記５′末端でハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列、および
ｃ）次の式：
［ＮＮＲ］ｎ
による前記３′および５′末端の間のヌクレオチド配列（式中、Ｎは独立に全ゆるヌクレオチドであり、ＲはＳ、Ｋまたはそのアナログであり、ｎは３〜約２４であり、またＳはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、前記３′および５′末端ヌクレオチド配列は約６〜５０ヌクレオチドの長さを有する）およびこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
前記３′末端がヌクレオチド配列５'−ＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２２）およびこれに相補的な配列を有する請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記５′末端がヌクレオチド配列５’−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ−３’（配列番号：１２３）およびこれに相補的な配列を有する請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記免疫グロブリンがヒトのものである請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ＣＤＲがＣＤＲ３である請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
式：５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ［ＮＮＲ］ｎＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２４）による請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
ｎが１６であり、ＲがＳ（配列番号：１２０）である請求項４０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異誘発を誘導するに際し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ部分を増幅することからなり、ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドおよびこれに相補的な配列を使用し、前記オリゴヌクレオチドは３′および５′末端を有し、
ａ）免疫グロブリン遺伝子の第１のフレーム構造領域に前記３′末端でハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列、
ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第２のフレーム構造領域に前記５′末端でハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列、および
ｃ）次の式：
［ＮＮＲ］ｎ
による前記３′および５′末端の間のヌクレオチド配列（式中、Ｎは独立に全ゆるヌクレオチドであり、ＲはＳ、Ｋまたはそのアナログであり、ｎは３〜約２４であり、またＳはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、前記３′および５′末端ヌクレオチド配列は約６〜５０ヌクレオチドの長さを有する）からなる方法。
【請求項４３】
前記３′末端がヌクレオチド配列５′−ＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２２）およびこれに相補的な配列を有する請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記５′末端がヌクレオチド配列５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ−３′（配列番号：１２３）およびこれに相補的な配列を有する請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫グロブリンがヒトのものである請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
前記ＣＤＲがＣＤＲ３である請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
式：５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ［ＮＮＲ］ｎＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２４）による請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
ｎが１６であり、ＲがＳ（配列番号：１２０）である請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法であって、それぞれＤＮＡ分子は繊維状ファージ粒子の表面上でポリペプチドを発現させるシストロンからなり、
（ａ）連結緩衝液中で
（ｉ）ｄｓＤＮＡの形態のポリペプチド遺伝子のレパートリー（それぞれのベクターは方向性をもった連結に適合した付着末端を有する）、および
（ｉｉ）線状形態の複数のＤＮＡ発現ベクター（それぞれのベクターは（ａ）共通のリーディングフレームで前記ポリペプチドを方向性をもって受容するよう適合し、（ｂ）それぞれの上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合した上流および下流の付着末端を有し、前記上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は繊維状ファージ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列はそれぞれ上流および下流のＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する）
を組合せることにより連結混合物を形成し、
（ｂ）前記ポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に結合するのに十分な時間期間の間前記混合物を連結条件に供し、これにより前記ライブラリーを形成することからなる方法。
【請求項５０】
ジシストロン性ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法であって、それぞれのジシストロン性ＤＮＡ分子は、繊維状ファージの表面上でヘテロ二量体受容体の第１および第２のポリペプチドを発現させる第１および第２のシストロンからなり、
（ａ）連結緩衝液中で
（ｉ）線状ｄｓＤＮＡの形態の第１のポリペプチド遺伝子のレパートリー（それぞれは
方向性をもった連結に適合した付着末端を有する）、および
（ｉｉ）線状形態の複数のＤＮＡ発現ベクター（それぞれのベクターは（ａ）共通のリ
ーディングフレームで前記第１のポリペプチド遺伝子を方向性をもって受容するよ
う適合し、（ｂ）それぞれの上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結
合した上流および下流の第１の付着末端を有し、前記上流の翻訳可能なＤＮＡ配列
は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は繊維状ファー
ジ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列はそれぞれ上流および下流の
ＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する）
を組合せることにより第１の連結混合物を形成し、
（ｂ）前記第１のポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に結合し、複数の環状Ｄ
ＮＡ分子（それぞれは前記第１のポリペプチドを発現する前記第１のシストロンを
有する）を製造するのに十分な時間期間の問前記混合物を連結条件に供し、
（ｃ）前記環状ＤＮＡ分子を開裂させて前記第２の付着末端を形成するのに十分な制限
エンドヌクレアーゼ処理条件に前記複数の環状ＤＮＡ分子を処理することにより、
線状形態で複数のＤＮＡ発現ベクターを製造し（それぞれの線状ベクターは、（ｉ
）共通のリーディングフレームで第２のポリペプチド遺伝子のレパートリーの１つ
を方向性をもって受容するよう適合し、（ｉｉ）それぞれの上流および下流のＤＮ
Ａ配列に機能的に結合した第２の上流および下流の付着末端を有し、前記上流のＤ
ＮＡ配列は原核分泌シグナルをコードする翻訳可能な配列であり、前記下流のＤＮ
Ａ配列は前記リーディングフレームに少なくとも１つの停止コドンを有し、前記翻
訳可能なＤＮＡ配列はＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する）、
（ｄ）連結緩衝液中で
（ｉ）工程（ｃ）で形成した前記複数のＤＮＡ発現ベクター、および
（ｉｉ）ｄｓＤＮＡの形態の第２のポリペプチド遺伝子の前記レパートリー（それぞれ
は前記複数の線状ＤＮＡベクターへの方向性をもった連結に適合した付着末端を有
する）を組合せることにより第２の連結混合物を形成し、
（ｅ）前記第２のポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に結合し、複数の環状Ｄ
ＮＡ分子（それぞれは前記第２のポリペプチドを発現するための前記第２のシスト
ロンを有する）を製造するのに十分な時間期間の間前記第２の混合物を連結条件に
供し、これにより前記ライブラリーを形成することからなる方法。
【請求項５１】
前記へテロ二量体受容体がエピトープ結合複合体である請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
ジシストロン性ＤＮＡ分子のライブラリーであって、それぞれが繊維状ファージの表面でヘテロ二量体受容体の第１および第２のポリペプチドを発現する第１および第２のシストロンからなり、請求項５０記載の方法によって製造される前記ライブラリー。
【請求項５３】
繊維状ファージ粒子のライブラリーの多様性を変化させるに際し、
（ａ）請求項３２記載の繊維状ファージ粒子のライブラリーを調製し、
（ｂ）ライブラリーの構成員がリガンドに結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形
成するのに十分な条件下で調製したライブラリーと予備選択したリガンドとを接触
させ、
（ｃ）前記複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成員から単離し、前記予備
選択したリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子からなるリガンド集積
ライブラリーを形成する工程からなる方法。
【請求項５４】
前記予備選択したリガンドを固体支持体に固定し、前記複合体を固相にあるものとし、前記単離が
（ｉ）固体支持体を洗浄して固体支持体から非結合ライブラリー構成員を濯ぎ、
（ｉｉ）固相結合ファージ粒子を溶出させて前記単離したファージ粒子を形成する
工程からなる請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記溶出が、前記固相結合ファージ粒子とｐＨ２〜ｐＨ６のｐＨを有する溶出緩衝液とを接触させることからなる請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記溶出が、前記固相結合ファージ粒子と前記予備選択したリガンドを含有する溶出緩衝液とを接触させることからなる請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＶＩＩＩ膜アンカーである請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＩＩＩ膜アンカーである請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
繊維状ファージ粒子のライブラリーの多様性を増加させるに際し、
（ａ）請求項３２記載の繊維状ファージ粒子のライブラリーを調製し、
（ｂ）それぞれのＤＮＡ発現ベクターに存在する免疫グロブリン可変ドメインコード
ヌクレオチド配列を変異させ、それぞれ変異した免疫グロブリン可変ドメインヌク
レオチド配列を含有するファージ粒子のライブラリーを形成する
工程からなる方法。
【請求項６０】
請求項２記載の繊維状ファーゾによりコードされるエピトープ結合複合体の親和力を成熟させるに際し、
（ａ）前記繊維状ファージのゲノムを調製し、
（ｂ）調製したゲノムに存在する免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列
を変異させ、変異した免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列を含有するフ
ァージ粒子のライブラリーを形成し、
（ｃ）ライブラリーの構成員がリガンドと結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形
成するのに十分な条件下で工程（ｂ）で形成したライブラリーと予備選択したリガ
ンドとを接触させ、
（ｄ）前記複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成員から単離し、前記予備
選択したリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子からなるリガンド集積
ライブラリーを形成する工程からなる方法。
【請求項６１】
前記変異が、エラープローン（誤りがちな）ポリメラーゼ連鎖反応に前記免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を供することからなる請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記変異が、免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列のＣＤＲを変異させる請求項３５記載の方法に前記免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を供することからなる請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
前記免疫グロブリン可変ドメインがＶHである請求項６０記載の方法。
【請求項６４】
サンプル中の予備選択したリガンドの存在を検出するに際し、
（ａ）予備選択した抗原を含有すると考えられるサンプルと前記予備選択したリガンド
に結合する請求項４記載のリガンド結合へテロ二量体受容体とを、前記リガンド結
合へテロ二量体受容体が前記リガンドに結合してリガンド−受容体複合体を形成す
るのに十分な結合条件下で混合し、
（ｂ）前記リガンド受容体複合体または前記リガンド結合へテロ二量体受容体の存在を
検出する工程からなる方法。
【請求項６５】
前記リガンド結合へテロ二量体受容体が繊維状ファージ粒子の表面上にある請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記リガンド結合へテロ二量体受容体が、ｃｐＩＩＩおよびｃｐＶＩＩＩよりなる群から選択される繊維状ファージ膜アンカーに融合した請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記検出が、前記繊維状ファージ粒子の存在、およびこれにより前記生成物の存在を検出することからなる請求項６５記載の方法。
【請求項１】
リガンド結合へテロ二量体受容体をコードするゲノムをカプセル化する繊維状ファージ。
【請求項２】
前記受容体がエピトープ結合複合体である請求項１記載の繊維状ファージ。
【請求項３】
前記ファージが検出可能に標識された請求項１記載の繊維状ファージ。
【請求項４】
第１および第２のポリペプチドからなるリガンド結合へテロ二量体受容体であって、前記第１のポリペプチドにはアミノ末端原核分泌シグナルドメインおよびカルポキシ末端繊維状ファージ膜アンカードメインが隣接し、前記第２のポリペプチドがアミノ末端原核分泌シグナルドメインに融合したリガンド結合へテロ二量体受容体。
【請求項５】
前記受容体がエピトープ結合複合体である請求項４記載の受容体。
【請求項６】
前記第１のポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドである請求項５記載の受容体。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチドである請求項５記載の受容体。
【請求項８】
前記原核分泌シグナルがｐｅｌＢ分泌シグナルである請求項４記載の受容体。
【請求項９】
前記ｐｅｌＢ分泌シグナルが、
（ａ）配列番号：５，
（ｂ）配列番号：６および
（ｃ）配列番号：７
よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を有する請求項８記載の受容体。
【請求項１０】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＶＩＩＩ膜アンカーである請求項４記載の受容体。
【請求項１１】
前記繊維状ファージ膜アンカーが、配列番号：１７の残基２６〜残基４０の式により表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１０記載の受容体。
【請求項１２】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＩＩＩ膜アンカーである請求項４記載の受容体。
【請求項１３】
前記繊維状ファージ膜アンカーが、配列番号：１６の残基ｌ〜２１１の式により表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１１記載の受容体。
【請求項１４】
融合ポリペプチドを発現するベクターであって、前記ベクターは挿入物ＤＮＡの方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介して機能的に結合した上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列からなり、前記上流の配列は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の配列は繊維状ファージ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列は前記融合ポリペプチドの部分としての前記翻訳可能なＤＮＡ配列の発現のための一組のＤＮＡ発現シグナルに機能的に結合したベクター。
【請求項１５】
前記原核分泌シグナルがｐｅｌＢ分泌シグナルである請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
前記ｐｅｌＢ分泌シグナルが、
（ａ）配列番号：５，
（ｂ）配列番号：６および
（ｃ）配列番号：７
よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＶＩＩＩ膜アンカーである請求項１４記載のベクター。
【請求項１８】
前記繊維状ファージ膜アンカーが、配列番号：１７の残基２６〜残基４０の式により表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＩＩＩ膜アンカーである請求項１４記載のベクター。
【請求項２０】
前記繊維状ファージ膜アンカーが配列番号：１１２のヌクレオチド塩基配列を有する請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
繊維状ファージ複製開始点をさらに含む請求項１４記載のベクター。
【請求項２２】
前記一組の発現シグナルが、前記下流の翻訳可能なＤＮＡ配列とフレームの合ったプロモーター、リボソーム結合部位、および少なくとも１つの停止コドンを含む請求項１４記載のベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが配列番号：１１６の塩基１〜塩基２０８に示すヌクレオチドに示す配列を有する請求項１４記載のベクター。
【請求項２４】
第２の挿入物ＤＮＡの方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介して機能的に結合した原核分泌シグナルをコードする第２の上流の翻訳可能なＤＮＡ配列をさらに含み、前記第２の翻訳可能なＤＮＡ配列が第２の融合ポリペプチドの部分としての前記第２の翻訳可能なＤＮＡ配列の発現のための一組のＤＮＡ発現シグナルに機能的に結合した請求項１４記載のベクター。
【請求項２５】
前記原核分泌シグナルが、
（ａ）配列番号：５，
（ｂ）配列番号：６および
（ｃ）配列番号：７
よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を有する請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
前記ベクターが配列番号：３の塩基３６〜塩基１１８に示すヌクレオチド配列を有する請求項２４記載のベクター。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ発現ベクターがベクターｐＣＯＭＢ８、ｐＣＯＭＢ２−８またはｐＣＫＡＢ８である請求項２４記載のベクター。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ発現ベクターがベクターｐＣＯＭＢ３、ｐＣＯＭＢ２−３、ｐＣＯＭＢ２−３′または ｐＣＫＡＢ３である請求項２４記載のベクター。
【請求項２９】
アミノ末端で原核分泌シグナルドメインに機能的に結合し、カルポキシ末端で繊維状ファージ膜アンカードメインに機能的に結合したリガンド結合受容体ポリペプチドからなるポリペプチド。
【請求項３０】
ポリペプチドが抗体可変鎖ポリペプチドである請求項２９記載のポリペプチド。
【請求項３１】
可変鎖が抗体重鎖ポリペプチドである請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３２】
それぞれのファージ粒子が請求項１４または請求項２４記載のＤＮＡ発現ベクターを含む繊維状ファージ粒子のライブラリー。
【請求項３３】
前記ライブラリーが少なくとも１０7の異なる種の前記ＤＮＡ発現ベクターを含有する請求項３２記載のライブラリー。
【請求項３４】
それぞれのファージ粒子が少なくとも １つの請求項４記載のリガンド結合へテロ二量体受容体を含有する繊維状ファージ粒子のライブラリー。
【請求項３５】
免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異誘発を誘導するプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは３′および５′末端を有し、
ａ）免疫グロブリン遺伝子の第１のフレーム構造領域に前記３′末端でハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列、
ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第２のフレーム構造領域に前記５′末端でハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列、および
ｃ）次の式：
［ＮＮＲ］ｎ
による前記３′および５′末端の間のヌクレオチド配列（式中、Ｎは独立に全ゆるヌクレオチドであり、ＲはＳ、Ｋまたはそのアナログであり、ｎは３〜約２４であり、またＳはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、前記３′および５′末端ヌクレオチド配列は約６〜５０ヌクレオチドの長さを有する）およびこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
前記３′末端がヌクレオチド配列５'−ＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２２）およびこれに相補的な配列を有する請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記５′末端がヌクレオチド配列５’−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ−３’（配列番号：１２３）およびこれに相補的な配列を有する請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記免疫グロブリンがヒトのものである請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ＣＤＲがＣＤＲ３である請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
式：５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ［ＮＮＲ］ｎＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２４）による請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
ｎが１６であり、ＲがＳ（配列番号：１２０）である請求項４０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異誘発を誘導するに際し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ部分を増幅することからなり、ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドおよびこれに相補的な配列を使用し、前記オリゴヌクレオチドは３′および５′末端を有し、
ａ）免疫グロブリン遺伝子の第１のフレーム構造領域に前記３′末端でハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列、
ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第２のフレーム構造領域に前記５′末端でハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列、および
ｃ）次の式：
［ＮＮＲ］ｎ
による前記３′および５′末端の間のヌクレオチド配列（式中、Ｎは独立に全ゆるヌクレオチドであり、ＲはＳ、Ｋまたはそのアナログであり、ｎは３〜約２４であり、またＳはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、前記３′および５′末端ヌクレオチド配列は約６〜５０ヌクレオチドの長さを有する）からなる方法。
【請求項４３】
前記３′末端がヌクレオチド配列５′−ＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２２）およびこれに相補的な配列を有する請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記５′末端がヌクレオチド配列５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ−３′（配列番号：１２３）およびこれに相補的な配列を有する請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫グロブリンがヒトのものである請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
前記ＣＤＲがＣＤＲ３である請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
式：５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ［ＮＮＲ］ｎＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２４）による請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
ｎが１６であり、ＲがＳ（配列番号：１２０）である請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法であって、それぞれＤＮＡ分子は繊維状ファージ粒子の表面上でポリペプチドを発現させるシストロンからなり、
（ａ）連結緩衝液中で
（ｉ）ｄｓＤＮＡの形態のポリペプチド遺伝子のレパートリー（それぞれのベクターは方向性をもった連結に適合した付着末端を有する）、および
（ｉｉ）線状形態の複数のＤＮＡ発現ベクター（それぞれのベクターは（ａ）共通のリーディングフレームで前記ポリペプチドを方向性をもって受容するよう適合し、（ｂ）それぞれの上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合した上流および下流の付着末端を有し、前記上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は繊維状ファージ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列はそれぞれ上流および下流のＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する）
を組合せることにより連結混合物を形成し、
（ｂ）前記ポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に結合するのに十分な時間期間の間前記混合物を連結条件に供し、これにより前記ライブラリーを形成することからなる方法。
【請求項５０】
ジシストロン性ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法であって、それぞれのジシストロン性ＤＮＡ分子は、繊維状ファージの表面上でヘテロ二量体受容体の第１および第２のポリペプチドを発現させる第１および第２のシストロンからなり、
（ａ）連結緩衝液中で
（ｉ）線状ｄｓＤＮＡの形態の第１のポリペプチド遺伝子のレパートリー（それぞれは
方向性をもった連結に適合した付着末端を有する）、および
（ｉｉ）線状形態の複数のＤＮＡ発現ベクター（それぞれのベクターは（ａ）共通のリ
ーディングフレームで前記第１のポリペプチド遺伝子を方向性をもって受容するよ
う適合し、（ｂ）それぞれの上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結
合した上流および下流の第１の付着末端を有し、前記上流の翻訳可能なＤＮＡ配列
は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は繊維状ファー
ジ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列はそれぞれ上流および下流の
ＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する）
を組合せることにより第１の連結混合物を形成し、
（ｂ）前記第１のポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に結合し、複数の環状Ｄ
ＮＡ分子（それぞれは前記第１のポリペプチドを発現する前記第１のシストロンを
有する）を製造するのに十分な時間期間の問前記混合物を連結条件に供し、
（ｃ）前記環状ＤＮＡ分子を開裂させて前記第２の付着末端を形成するのに十分な制限
エンドヌクレアーゼ処理条件に前記複数の環状ＤＮＡ分子を処理することにより、
線状形態で複数のＤＮＡ発現ベクターを製造し（それぞれの線状ベクターは、（ｉ
）共通のリーディングフレームで第２のポリペプチド遺伝子のレパートリーの１つ
を方向性をもって受容するよう適合し、（ｉｉ）それぞれの上流および下流のＤＮ
Ａ配列に機能的に結合した第２の上流および下流の付着末端を有し、前記上流のＤ
ＮＡ配列は原核分泌シグナルをコードする翻訳可能な配列であり、前記下流のＤＮ
Ａ配列は前記リーディングフレームに少なくとも１つの停止コドンを有し、前記翻
訳可能なＤＮＡ配列はＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する）、
（ｄ）連結緩衝液中で
（ｉ）工程（ｃ）で形成した前記複数のＤＮＡ発現ベクター、および
（ｉｉ）ｄｓＤＮＡの形態の第２のポリペプチド遺伝子の前記レパートリー（それぞれ
は前記複数の線状ＤＮＡベクターへの方向性をもった連結に適合した付着末端を有
する）を組合せることにより第２の連結混合物を形成し、
（ｅ）前記第２のポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に結合し、複数の環状Ｄ
ＮＡ分子（それぞれは前記第２のポリペプチドを発現するための前記第２のシスト
ロンを有する）を製造するのに十分な時間期間の間前記第２の混合物を連結条件に
供し、これにより前記ライブラリーを形成することからなる方法。
【請求項５１】
前記へテロ二量体受容体がエピトープ結合複合体である請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
ジシストロン性ＤＮＡ分子のライブラリーであって、それぞれが繊維状ファージの表面でヘテロ二量体受容体の第１および第２のポリペプチドを発現する第１および第２のシストロンからなり、請求項５０記載の方法によって製造される前記ライブラリー。
【請求項５３】
繊維状ファージ粒子のライブラリーの多様性を変化させるに際し、
（ａ）請求項３２記載の繊維状ファージ粒子のライブラリーを調製し、
（ｂ）ライブラリーの構成員がリガンドに結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形
成するのに十分な条件下で調製したライブラリーと予備選択したリガンドとを接触
させ、
（ｃ）前記複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成員から単離し、前記予備
選択したリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子からなるリガンド集積
ライブラリーを形成する工程からなる方法。
【請求項５４】
前記予備選択したリガンドを固体支持体に固定し、前記複合体を固相にあるものとし、前記単離が
（ｉ）固体支持体を洗浄して固体支持体から非結合ライブラリー構成員を濯ぎ、
（ｉｉ）固相結合ファージ粒子を溶出させて前記単離したファージ粒子を形成する
工程からなる請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記溶出が、前記固相結合ファージ粒子とｐＨ２〜ｐＨ６のｐＨを有する溶出緩衝液とを接触させることからなる請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記溶出が、前記固相結合ファージ粒子と前記予備選択したリガンドを含有する溶出緩衝液とを接触させることからなる請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＶＩＩＩ膜アンカーである請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＩＩＩ膜アンカーである請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
繊維状ファージ粒子のライブラリーの多様性を増加させるに際し、
（ａ）請求項３２記載の繊維状ファージ粒子のライブラリーを調製し、
（ｂ）それぞれのＤＮＡ発現ベクターに存在する免疫グロブリン可変ドメインコード
ヌクレオチド配列を変異させ、それぞれ変異した免疫グロブリン可変ドメインヌク
レオチド配列を含有するファージ粒子のライブラリーを形成する
工程からなる方法。
【請求項６０】
請求項２記載の繊維状ファーゾによりコードされるエピトープ結合複合体の親和力を成熟させるに際し、
（ａ）前記繊維状ファージのゲノムを調製し、
（ｂ）調製したゲノムに存在する免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列
を変異させ、変異した免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列を含有するフ
ァージ粒子のライブラリーを形成し、
（ｃ）ライブラリーの構成員がリガンドと結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形
成するのに十分な条件下で工程（ｂ）で形成したライブラリーと予備選択したリガ
ンドとを接触させ、
（ｄ）前記複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成員から単離し、前記予備
選択したリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子からなるリガンド集積
ライブラリーを形成する工程からなる方法。
【請求項６１】
前記変異が、エラープローン（誤りがちな）ポリメラーゼ連鎖反応に前記免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を供することからなる請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記変異が、免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列のＣＤＲを変異させる請求項３５記載の方法に前記免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を供することからなる請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
前記免疫グロブリン可変ドメインがＶHである請求項６０記載の方法。
【請求項６４】
サンプル中の予備選択したリガンドの存在を検出するに際し、
（ａ）予備選択した抗原を含有すると考えられるサンプルと前記予備選択したリガンド
に結合する請求項４記載のリガンド結合へテロ二量体受容体とを、前記リガンド結
合へテロ二量体受容体が前記リガンドに結合してリガンド−受容体複合体を形成す
るのに十分な結合条件下で混合し、
（ｂ）前記リガンド受容体複合体または前記リガンド結合へテロ二量体受容体の存在を
検出する工程からなる方法。
【請求項６５】
前記リガンド結合へテロ二量体受容体が繊維状ファージ粒子の表面上にある請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記リガンド結合へテロ二量体受容体が、ｃｐＩＩＩおよびｃｐＶＩＩＩよりなる群から選択される繊維状ファージ膜アンカーに融合した請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記検出が、前記繊維状ファージ粒子の存在、およびこれにより前記生成物の存在を検出することからなる請求項６５記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００７−２２２１７９（Ｐ２００７−２２２１７９Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３０６６５（Ｐ２００７−１３０６６５）
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【分割の表示】特願２００５−５４３０２（Ｐ２００５−５４３０２）の分割
【原出願日】平成４年４月１０日（１９９２．４．１０）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【分割の表示】特願２００５−５４３０２（Ｐ２００５−５４３０２）の分割
【原出願日】平成４年４月１０日（１９９２．４．１０）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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