プラスミド高生産性大腸菌クローンの遺伝子選択方法。
本発明は、形質転換クローナルサブタイプのプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ内部のＩＳ１トランスポゾン挿入性突然変異原性の頻度を測定する段階を含む、プラスミドＤＮＡ産生用大腸菌の高生産性クローンの選択方法に関する。ＩＳ１挿入性突然変異原性の増加は、低い比産生率を示すと考えられるクローナルサブタイプと相関関係を有している。本発明に開示したＰＣＲに基づく遺伝子選択アッセイは高スループット分析が可能であり、工業規模の大量のプラスミドＤＮＡを培養できる高生産性クローンの同定に要する時間を短縮する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同じ菌株のクローナルサブタイプ間のＩＳ１転位活性を比較する段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関する。該方法で相対的に低い転位活性を示すクローンは有力な高生産性クローナルサブタイプを表す。形質転換クローナルサブタイプのプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの内部のＩＳ１トランスポゾン挿入性突然変異原性の頻度を測定するＰＣＲに基づくアッセイが開示されている。これらの遺伝子選択アッセイは、高スループット分析が可能であり、大量のプラスミドＤＮＡを工業規模で培養できる高生産性クローナルサブタイプを同定するために要する時間を短縮できる。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチドワクチンおよび遺伝子治療プロトコルの双方を治療用途に応用するためには医薬品質のプラスミドＤＮＡの量産および精製が極めて重要である。従って、ＤＮＡワクチンおよび遺伝子治療という治療選択肢によって得られる筈の利点を十分に引き出して利用するためには高収率のプラスミドＤＮＡの製造および精製方法が必要である（Ｓｈａｍｌｏｕ，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７：２０７−２１８）。
【０００３】
裸のＤＮＡワクチンは十分に研究されたグラム陰性菌である大腸菌（“Ｅ．ｃｏｌｉ”）中でプラスミド分子として容易に繁殖する。しかしながら、ＤＮＡワクチン構築物による細菌の形質転換は、プラスミド含量に関して不均質なクローナルサブタイプ集団を生じる。この不均質集団からプラスミドＤＮＡを高レベルで複製し維持できる形質転換大腸菌クローンを単離するために役立つスクリーンプロセスは以前から開発されている（参照、同時係属国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１、出願日２００５年１月３１日；国際公開ＷＯ ２００５／０７８１１５として２００５年８月２５日に公開）。簡単に説明すると、化学的限定培地中の形質転換大腸菌クローンの産生率は、コロンビア血液寒天上の形態学的表現型とゆるやかな相関関係を有していた。滑らかで隆起した白色の円形コロニーを形成したクローン（“ホワイト”クローン）はフェッドバッチ発酵でプラスミドＤＮＡを増幅することができなかった。これに対して、扁平で半透明な灰色の不規則形コロニーを形成したクローン（“グレー”クローン）はプラスミドＤＮＡを高レベルで複製したと考えられる。その後、固体および液体の双方の培地中の多数の培養サイクルによって所望の形態学を安定に示す“グレー”クローンを同定するためのスクリーニングプロトコル（以後の本文中で“高生産体スクリーン”と呼ぶ）が確立した。次に、振盪フラスコ中のフェッドバッチ培養後のプラスミド含量を判定するために形態学に関して安定であったクローンを試験した。
【０００４】
高生産体スクリーンは、いくつかのＤＮＡワクチン候補の高生産性クローンの単離に成功することはできたが、このプロセスには多大な労力および時間が必要である。固体限定培地上の増殖にはサイクルあたり３日から５日の温置期間が必要であり、また、アッセイプレートとして血液寒天の使用が必要であることはこのような培養が“行き止まり”であることを意味しており、形質転換体から発酵槽シードまでクローンが無血液培地中に維持されるように平行培養しなければならない。従って、本文中に開示したようなより確実で高速のスクリーニングプロトコルの開発を最終目的として、高生産現象の特性を解明するための実験を行った。本発明は、高生産現象の遺伝子基盤を理解することによって、プラスミド高生産性大腸菌クローナルサブタイプをより迅速に同定する改良スクリーニングプロトコルを開示する。プラスミド低生産性大腸菌ＤＨ５クローン中でＩＳ１転位が増加しているという観察は、形質転換大腸菌クローンのプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ中のＩＳ１挿入性突然変異原性を測定するための様々なＰＣＲに基づくアッセイの開発に導いた。本文中に記載したように、ＩＳ１挿入性突然変異原性を低頻度で有している同じプラスミドＤＮＡを含有する同じ菌株のクローンが、有力なプラスミド高生産性クローナルサブタイプとして同定される。次に、この有力な高生産性クローナルサブタイプの比産生率を試験して、それらが実際に高プラスミドコピー数／細胞を示すことを判定し、その時点でプラスミド高生産性クローンであると同定する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、一般に、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、該クローナルサブタイプのプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの内部のＩＳ１トランスポゾン挿入性突然変異原性の頻度を測定する段階を含む。該方法において、ＩＳ１挿入性突然変異原性の増加が、低プラスミドコピー数／細胞（すなわち低い比産生率）を示すと考えられるクローナルサブタイプと相関関係を有している。重要なことは、本文中に記載したクローナルサブタイプのプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡ中のＩＳ１転位を測定するアッセイは高スループット分析が可能であり、従って医薬品質のプラスミドＤＮＡを大規模産生できる高生産性クローナルサブタイプの同定に要する時間が短縮されることである。
【０００６】
本発明は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプのＩＳ１転位活性を比較し、相対的に低い転位活性を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、（ｂ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。本発明の１つの実施態様において、クローナルサブタイプのＩＳ１転位活性は、該クローンから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定することによって判定され、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数は相対的に低いＩＳ１転位活性を示すクローンを表す。本発明の別の実施態様において、クローナルサブタイプのＩＳ１転位活性は、該クローンのゲノムＤＮＡの予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を測定することによって判定され、該予め決定された領域内部に１つ以上のＩＳ１挿入配列が存在しないクローナルサブタイプは相対的に低いＩＳ１転位活性を示すクローンを表す。
【０００７】
本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、（ｂ）該単離プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定し、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、（ｃ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。本発明によれば、プラスミドＤＮＡを内包している大腸菌（ＤＨ５株を含むが、これに限定されない。）の菌株の高生産性クローナルサブタイプは、同様に試験した同じ菌株の非選択形質転換大腸菌サブタイプに比べて高いプラスミドコピー数／細胞を示す。本発明の１つの実施態様において、単離プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数は、プラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量を測定するＱ−ＰＣＲアッセイを非限定的に含む定量的ＰＣＲ（“Ｑ−ＰＣＲ”）によって測定される。この実施態様において、プラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量は、記載のＱ−ＰＣＲアッセイの一部として測定されたＩＳ１トランスポゾンコピー数を表す。
【０００８】
本発明の１つの実施態様において、Ｑ−ＰＣＲアッセイが単離プラスミドＤＮＡサンプル中のプラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量を測定するために使用される。該アッセイは、ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入が存在しないと予め決定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列との双方を増幅する段階を含み、特定の大腸菌クローナルサブタイプのＩＳ１トランスポゾンコピー数を表すＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する。このＱ−ＰＣＲアッセイは単一反応管で第一および第二のヌクレオチド配列を同時に増幅する多重モードで行うことができ、変動性が少ない。ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列は、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）ＩＳ１ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマー、（ｉｉ）第一場所の下流のＩＳ１ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアによって標識された蛍光プローブから構成されるオリゴヌクレオチドセットとの存在下で増幅される。該プローブは第一場所と第二場所との間のＩＳ１ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。該核酸ポリメラーゼは、増幅中に蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出される。該蛍光変化はＩＳ１増幅の発生に対応する。ＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチドも、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマー、（ｉｉ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアによって標識された蛍光プローブから構成されるオリゴヌクレオチドセットとの存在下で増幅される。該プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。該核酸ポリメラーゼは、増幅中に蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出される。該蛍光変化が第二ヌクレオチド配列増幅の発生に対応する。１つの実施態様において、ＩＳ１ヌクレオチド配列と共に増幅されるプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列は、プラスミドＤＮＡのＣＭＶプロモーター内部に局在するヌクレオチド配列を非限定的に含むプラスミドＤＮＡのプロモーター配列内部に局在し、従って、ＩＳ１／ＣＭＶプラスミドコピー比が生成される。
【０００９】
同じプラスミドＤＮＡを内包している同じ菌株の少なくとも２つの細菌クローナルサブタイプ中のＩＳ１トランスポゾンコピー数の測定後、上記に定義したように、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を有していると判定されたクローナルサブタイプを“有力な”高生産性クローナルサブタイプとして同定する。次に、発酵系、好ましくは小規模発酵系で該クローナルサブタイプを培養することによって該有力な高生産性クローナルサブタイプの比産生率（すなわち、プラスミドコピー数／細胞）を試験し、同定されたこのクローンが実際に高生産性（すなわち、高プラスミドコピー数／細胞）を示すか否かを判定する。本発明の１つの実施態様において、この小規模発酵系は、栄養補給を伴う振盪フラスコ発酵系から成る（同時係属国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１に詳細に記載、これは国際公開ＷＯ２００５／０７８１１５として公開されている。）。小規模発酵系は理想的には、所望のプラスミドＤＮＡを生成するように計画した大規模生産方法の模擬発酵方式である。
【００１０】
本発明の１つの実施態様において、記載のＱ−ＰＣＲアッセイで単離プラスミドＤＮＡサンプル由来のＩＳ１トランスポゾン配列を増幅するために使用される順方向および逆方向のＰＣＲプライマーがそれぞれＩＳ１−ＱＦ（配列６）およびＩＳ１−Ｑ−Ｒ（配列７）から成り、蛍光プローブがＩＳ１−Ｑ−Ｐ２（配列８）から成る。本発明の別の実施態様において、記載のＱ−ＰＣＲアッセイで単離プラスミドＤＮＡサンプル由来の第二ヌクレオチド配列を増幅するために使用される順方向および逆方向のＰＣＲプライマーがそれぞれＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（配列４）から成り、蛍光プローブがＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（配列５）から成る。蛍光プローブはフルオロホアと消去剤分子との双方によって標識されている。
【００１１】
本発明はさらに、細菌クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量を間接に計算する段階を含む上記同様のＩＳ１定量ＰＣＲアッセイに関する。該アッセイにおいて、ＩＳ１トランスポゾンコピー数の予測量がＩＳ１／プラスミドコピー数から減算され、補正ＩＳ１／プラスミドコピー比が生成する。本発明のこの部分の１つの実施態様において、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量は、第二のＱ−ＰＣＲアッセイを使用して間接的に測定される。該アッセイは、プラスミドコピー数に基づく２３ｓ ｒＤＮＡの相対量を測定し、２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成する。この２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比をＩＳ１／プラスミドコピー比から減算すると補正ＩＳ１／プラスミドコピー比が得られる。このＱ−ＰＣＲアッセイは、２３ｓ ｒＤＮＡ配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの同じヌクレオチド配列（前出）との双方を同時に増幅する多重モードで行うことができる。本発明の１つの実施態様において、ここに記載のＱ−ＰＣＲアッセイで２３ｓ ｒＤＮＡ配列の増幅に使用される順方向および逆方向のＰＣＲプライマーはそれぞれ２３ｓ−Ｆ１Ｄ（配列１１）および２３ｓ−Ｒ１Ｄ（配列１２）から成り、蛍光プローブは２３ｓ−Ｐｆａｍ（配列１３）から成る。本発明の別の実施態様において、ＩＳ１挿入非含有と判定された配列はプラスミドＤＮＡのＣＭＶプロモーター領域に内包され、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶコピー比を与えるので、これをＩＳ１／ＣＭＶコピー比から減算して補正ＩＳ１／ＣＭＶコピー比を生成する。
【００１２】
本発明はまた、ＩＳ１挿入領域であると予め決定された細菌ゲノムＤＮＡの領域内部の１つ以上のＩＳ１トランスポゾン挿入配列の有無を検出する段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関する。該ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプは有力な高生産性クローナルサブタイプを表す。予め決定されたＩＳ１挿入領域内部に挿入されたＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出できるＰＣＲに基づくアッセイが開示されている。これらのアッセイは高スループット分析が可能である。従って本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）該クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出し、該ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、（ｂ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含み、高生産性クローナルサブタイプが高プラスミドコピー数／細胞を示す。
【００１３】
別の実施態様において、大腸菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの１つの領域内部のＩＳ１挿入性配列の有無を検出するためにＴａｑＭａｎに基づくＱ−ＰＣＲアッセイを使用する。このアッセイにおいて、ゲノムＤＮＡの該領域は、ＩＳ１挿入を受容すると予め決定されており、該ゲノムＤＮＡの約２０未満の連続ヌクレオチドの範囲である（すなわち、“ＩＳ１挿入部位”を表す）。該ＩＳ１挿入領域の内部の特異的ＩＳ１挿入の有無を検出するＱ−ＰＣＲアッセイは、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識されており、ゲノムＤＮＡの該領域にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないときにだけＩＳ１挿入領域にまたがるゲノムＤＮＡ内部の１つの場所にハイブリド形成する蛍光プローブ、（ｉｉ）蛍光プローブの上流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーおよび（ｉｉｉ）蛍光プローブの下流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーから構成されたオリゴヌクレオチドセットとの存在下で、該領域を含有するゲノムＤＮＡの一部分を増幅する。該核酸ポリメラーゼは、増幅中に蛍光プローブを消化して前記フルオロホアを前記消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化がゲノムＤＮＡの増幅およびＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在に対応する。このアッセイは多重化を必要とせず、全細胞溶解液を用いて行うことができるので、該クローンからゲノムＤＮＡを単離する必要性が削除される。ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプを有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定し、それらの比産生率を確認する試験を行う。
【００１４】
本発明の別の実施態様において、大腸菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの１つの領域内部のＩＳ１挿入性配列の有無を検出するためにＰＣＲに基づくアッセイを使用する。このアッセイでは、ゲノムＤＮＡの該領域はＩＳ１挿入を受容すると予め決定されており、この領域は該ゲノムＤＮＡの約２０以上の連続ヌクレオチドの範囲である（すなわち、“ＩＳ１挿入ホットスポット”を表す）。このＰＣＲアッセイは、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）ＩＳ１挿入領域外部（すなわち、ＩＳ１挿入ホットスポットの外部）のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する第一のＰＣＲプライマーおよび（ｉｉ）ＩＳ１トランスポゾン配列内部の１つの場所にハイブリド形成する第二のＰＣＲプライマーから構成されるオリゴヌクレオチドセットとの存在下で、ゲノムＤＮＡの１つの領域を増幅する。ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の存在は、双方のＰＣＲプライマーのハイブリド形成および増幅によるゲノムＤＮＡの該部分の指数関数的増幅という結果を与える。ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在は、第一ＰＣＲプライマーだけのハイブリド形成によるゲノムＤＮＡの１つの鎖だけの一次関数的増幅という結果を与える。ゲノムＤＮＡの指数関数的増幅はほぼ目標サイズの増幅核酸フラグメントを同定することによって目視検出する、または、二重鎖ＤＮＡに結合する核酸染料（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ）を添加することによってリアルタイムで蛍光検出できる。ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプを有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定し、それらの比産生率を確認する試験を行う。
【００１５】
本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプを生成するための、該プラスミドＤＮＡによる細菌株の形質転換に先立って細菌ゲノムからＩＳ１配列の全コピーを除去するように大腸菌宿主株を変異させる段階を含む方法に関する。本発明はさらに、すべてのＩＳ１コピーが除去された変異大腸菌宿主菌株（ＤＨ５菌株を含むが、これに限定されない。）、および、プラスミドＤＮＡを繁殖させるための該菌株の使用に関する。
【００１６】
ここに使用した“オリゴヌクレオチド”という用語は、ワトソン・クリック型塩基対合のようなモノマー対モノマー相互作用の規則的パターンによって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合できる天然または修飾されたモノマーまたは連鎖の直鎖状オリゴマーを表し、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含む。本発明ではオリゴヌクレオチドという用語がオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーの双方を含む。
【００１７】
ここに使用した“プライマー”という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれたときに相補鎖に沿った合成起点として作用できるオリゴヌクレオチドを表す。このような条件は、適当な温度の適当なバッファ中の異なる４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩とＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合誘導物質の存在を含む（“バッファ”は補因子となる成分、または、イオン強度、ｐＨなどを左右する成分を含む）。本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは例えば、精製した制限消化物中に存在するような天然産生プライマーでもよくまたは合成的に作製されてもよい。プライマーは最大増幅効率を与えるように一本鎖であるのが好ましい。
【００１８】
本発明のフルオロホアに関して本文中に使用した“固有（ｕｎｉｑｕｅ）”という用語は、各フルオロホアが特定アッセイに使用された他のすべてのフルオロホアに比べて異なる発光極大にエネルギーを放出することを意味する。固有発光極大をもつフルオロホアを使用すると、特定アッセイに使用した複数のフルオロホアのおのおのによって放出された蛍光エネルギーを同時検出できる。
【００１９】
ここに使用した“アンプリコン”という用語は、核酸ポリメラーゼと特異的プライマー対との存在下に核酸を含むサンプルのＰＣＲ増幅によって産生されるＰＣＲ反応の特異的産物を表す。
【００２０】
ここに使用した“オリゴヌクレオチドセット”または“オリゴヌクレオチドのセット”という用語は、特異的標的ヌクレオチド配列にハイブリド形成する一対のオリゴヌクレオチドプライマーと１つのオリゴヌクレオチドプローブとの組合せを表す。該オリゴヌクレオチドセットは、（ａ）標的ＤＮＡの第一場所にハイブリド形成する順方向プライマーと、（ｂ）同じ標的ＤＮＡの第一場所の下流の第二場所にハイブリド形成する逆方向プライマーとおよび（ｃ）フルオロホアと消去剤とによって標識され標的ＤＮＡのプライマー間の１つの場所にハイブリド形成する蛍光プローブとから構成される。言い換えると、オリゴヌクレオチドセットは、特異的標的ＤＮＡ配列例えばＩＳ１トランスポゾン配列に特異的なアンプリコンの合成を開始できる特異的ＰＣＲプライマーのセットとアンプリコンにハイブリド形成する蛍光プローブとから構成される。
【００２１】
オリゴヌクレオチドセット、オリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブに関して本文中に使用した“特異的にハイブリド形成する”という用語は、該オリゴヌクレオチドセット、プライマーまたはプローブが単一の標的ＤＮＡにハイブリド形成することを意味する。
【００２２】
ここに使用した“遺伝子”という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与する核酸のセグメントを意味する。これは、翻訳された配列（コード領域）、５’および３’の非翻訳配列（非コード領域）、ならびに、個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００２３】
ここに使用した“フルオロホア”という用語は、レーザー、タングステン、水銀もしくはキセノンランプまたは発光ダイオードで励起されたときに限定スペクトルをもつ光の形態でエネルギーを放出する蛍光リポーター分子を表す。フルオロホアから放出された光は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のプロセスを介して、フルオロホアの発光スペクトルに部分的に重なる励起スペクトルをもつ第二分子を励起できる。フルオロホアから別の分子への放出エネルギーの移動がフルオロホアの発光を消去する。第二分子は消去剤分子として知られる。本文中では“フルオロホア”という用語を“蛍光リポーター”という用語と互換的に使用する。
【００２４】
ここに使用した“消去剤”または“消去剤分子”という用語は、フルオロホアを含む蛍光プローブに連結されたときに、フルオロホアから放出されたエネルギーを受容しこれによってフルオロホアの発光を消去できる分子を表す。消去剤は、受容エネルギーを光として放出する蛍光剤でもよく、または、受容エネルギーを熱として放出する非蛍光剤でもよく、プローブの長さに沿ったいずれかの場所に付着できる。
【００２５】
ここに使用した“プローブ”という用語は、標的領域すなわち検出すべき領域中の配列に対するプローブの少なくとも１つの配列の相補性によって標的核酸中の配列と共に二重鎖構造を形成できるオリゴヌクレオチドを表す。“プローブ”という用語は、付着したフルオロホアおよび消去剤分子を伴うかまたは伴わない上述のオリゴヌクレオチドを含む。“蛍光プローブ”という用語は、フルオロホアと消去剤分子とを含むプローブを表す。
【００２６】
ここに使用した“ＦＡＭ”は、フルオロホア６−カルボキシフルオレセインを表す。“ＪＯＥ”はフルオロホア６−カルボキシ−４’，５’ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセインを表す。“ＴＥＴ”はフルオロホア５−テトラクロロフルオレセインを表す。“ＶＩＣ”はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発された同社が専有権をもつフルオロホアを表す。“ＴＡＭＲＡ”はフルオロホア６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミンを表す。
【００２７】
ここに使用した“ＲＦＬＰ”は制限断片長多型を表す。
【００２８】
ここに使用した“ＤＣＷ”は乾燥細胞重量を表す。
【００２９】
ここに使用した“ＯＤ２ペレット”は１ｍＬの溶液に再懸濁したときに６００ｎｍでＯＤ＝２を与える細胞集落を表す。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
プラスミドＤＮＡを産生する大腸菌の高生産性クローンの新規な選択方法がここに開示されている。本発明の発明者／出願人は、ＩＳ１転位増加が低生産性細菌クローン集団に相関関係を有することを知見し、この情報を使用して、有力なプラスミド高生産性大腸菌クローナルサブタイプを同定するための遺伝子選択アッセイを組込んだ改良スクリーニング方法を創作した。次に、該有力な高生産性クローナルサブタイプが実際に高生産性である（すなわち、高いプラスミドコピー数／細胞を示す）ことを確認するためにそれらを評価する。重要なことは、新規な選択方法の一部として本文中に記載したアッセイが高スループット分析を可能にし、従って、高生産性クローンの同定に要する時間が短縮されることである。最後に、プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプすなわち形質転換大腸菌クローンは、同じプラスミドＤＮＡを含有する同じ菌株の非選択形質転換大腸菌クローナルサブタイプに比べてより高いプラスミドコピー数／細胞を示す能力を有すると定義される。この高生産性クローナルサブタイプは、例えば治療用ポリヌクレオチドワクチンおよび／または遺伝子治療プロトコルを用途とするプラスミドＤＮＡの商業規模生産に使用できる。ここでは本発明の選択方法が大腸菌のＤＨ５株を使用して例示される。しかしながらこの例示は、本発明の範囲を大腸菌ＤＨ５株に由来の高プラスミド生産性クローンの遺伝子選択だけに限定するものではない。本発明の選択方法を使用するために大腸菌の別の菌株を調達してもよいことが当業者には理解されよう。
【００３１】
本発明は、多数のプラスミドＤＮＡワクチン候補によって形質転換された大腸菌ＤＨ５細胞が培養異質性を示すこと、鑑別培地および／または化学的限定培地で平板培養されたときに形態学的に異なる少なくとも２つのコロニー表現型を示すという以前の観察に部分的に由来する。この現象はＵ．Ｓ．暫定出願Ｎｏ．６０／５４１，８９４として２００４年２月４日に出願された同時係属出願に詳細に記載されている。該出願はすでに放棄され、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１、出願日２００５年１月３１日、に対応している（国際公開ＷＯ ２００５／０７８１１５として２００５年８月２５日に公開）。後者の記載内容は参照によって本発明に組込まれるものとする。各表現型のコロニー単離およびその後の試験が、発酵中のプラスミド増幅を増加でき臨床品質のプラスミドＤＮＡを量産できる特異的表現型クローナル単離物の発見に導いた。この発見がＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に詳細に記載された本文中で高生産体スクリーンと呼ぶ高プラスミドコピー数／細胞を示す高生産性クローナルサブタイプを同定するスクリーニング方法の開発に導いた。高生産体スクリーンは、大腸菌の有力な高生産性クローナルサブタイプを単離する第一選択段階を含み、次いで、第一段階で単離した該有力な高生産性クローナルサブタイプを発酵系好ましくは小規模発酵系で評価してどのクローナルサブタイプが実際に高生産性であるかを判定する第二選択段階を含む。すなわち、第一選択段階は可能な高生産性大腸菌クローナルサブタイプのプールを縮小し、該プールが、同様の発酵条件で増殖させた非選択形質転換大腸菌細胞に比べてより大きいプラスミドコピー数／細胞を生じる能力を示す可能性が最も高いクローナル変異体だけを含むようにする。
【００３２】
細菌クローナルサブタイプは科学文献に記載されている。キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の表現型切換は遺伝子発現差異の直接結果として生じる（Ｓｏｌｌ，Ｄ．ら，１９９５，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．７３：１０４９−１０５７）。２つの不透明特異的遺伝子（ＰＥＰ１およびＯＰ４）ならびに１つの白色特異的遺伝子（ＷＨ１１）は病原性キャンディダの白色から不透明への表現型切換に関与している。これは、キャンディダの毒性を伴い、一方比産生率が高いほうの細菌クローンを選択する場合にも同様の現象が存在する。ナイゼリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の病原性菌株でもコロニー変異体が同定された。この場合は、表現型の多様性はリポ多糖およびクラス５外膜タンパク質の菌株内異質性を伴っている（Ｐｏｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｔ．ら，１９８５，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：２０３−２０９）。大腸菌ＤＨ５の増殖および酵素活性に対するプラスミド存在の効果が、Ｍａｓｏｎ，Ｃ．Ａ．らによって記載され（１９８９，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：５４−６０）、プラスミドコピー数が炭素代謝に関与する宿主細胞酵素の発現に直接影響を与えることを示している。従って、異なる増殖特性値をもつ大腸菌クローナルサブタイプの生成は、ＤＮＡ形質転換プロセスによって誘導された変異または選択的濃縮培地中で細菌を培養することによって与えられたストレスなどを非限定的に含む様々のイベントの結果であろう。
【００３３】
形質転換大腸菌ＤＨ５細胞中で以前から観察されていた細菌異質性は主要な２つのタイプのコロニーを示す（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出に記載）。後にプラスミド高生産性クローンとして同定される可能性を少なくとも有しているクローンは、コロンビア血液寒天に平板培養し２８−３０℃で培養したときに表現型的に灰色コロニーを形成する（“グレー”クローン）。これらの“グレー”コロニーは、不規則形状、扁平および半透明である。これに比べて、形質転換大腸菌ＤＨ５細胞集団の主要成分によって形成されたコロニーは、コロンビア血液寒天に平板培養し２８−３０℃で培養したときに白色、円形で隆起し滑らかな組織を有している（“ホワイト”クローン）。これらの“ホワイト”クローンは、プラスミド低生産性大腸菌クローンであると同定された。“グレー”クローンによって形成される有力な高生産性クローナル単離物を表すコロニーは、化学的限定寒天培地で平板培養したときにプラスミド低生産性“ホワイト”コロニーから識別できない。有力な高生産性“グレー”クローンはコロンビア血液寒天（Ｃｏｌｏｍｂｉａ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ）プレートから直接精製できるが、ヒト治療用製品を製造する商業用発酵プロセスに使用される細胞と何らかの血液由来材料との接触を完全に避けることがしばしば望ましい。従って、有力な高生産性クローナルサブタイプ（“グレー”クローン）を精製するために、最終発酵プロセスに使用した最終“グレー”クローナルサブタイプがいかなる血液製品とも接触しないことを確保するためのある程度集約的な労力および時間を要する重複平板培養技術が開発された（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出、に記載）。プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の有力な高生産性クローナルサブタイプ（すなわち、“グレー”クローン）の選択後、高生産体スクリーンでこれらのクローナルサブタイプを評価し、第一選択段階で同定されたクローンが同じプラスミドで形質転換し同じ発酵条件下で増殖した同じ菌株の非選択大腸菌細胞の比産生率よりも大きい比産生率（すなわち、プラスミドコピー数／細胞）を実際に有するか否かを判定する必要がある。ＤＮＡプラスミドを内包する非選択大腸菌細胞の比産生率は、同じプラスミドＤＮＡを内包する該細菌株のクローナル単離物集団の平均産生率を計算することによって容易に決定できる。
【００３４】
当業者は、有力な高生産性細菌クローンを単離するために多くの異なる選択戦略が利用可能であることを理解されよう。ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に記載された高生産体スクリーンはいくつかのＤＮＡワクチンプログラム用プラスミドを産生する高収率クローンの選択に極めて有用であることが立証されている。従って、形態学的表現型と高生産性クローン富化集団との相関関係はこのようなクローンの選択メカニズムを提供する。高生産体スクリーンはいくつかのＤＮＡワクチン候補についての高生産性シード材料をもたらしたが、本発明の発明者／出願人は、スクリーニングプロセスの特性をより詳細に解明しおよびできれば改良するという意図で異質形質転換集団出現の背後にある理由の究明を試みた。本発明の発明者／出願人のこのような目的に沿う初期の１つの観察は、大腸菌ＤＨ５細胞の形質転換効率、すなわち、回収したプラスミド含有細胞の総数が、限定培地では複合ブロスよりも３桁も少ないことであった。従って、細胞を形質転換させ、成功した形質転換体の収率が最大になるように回収するという目的で、ＤＨ５宿主細胞を電気受容性にし、複合培地中でＤＮＡワクチンプラスミドによって形質転換し、次いで限定培地に移すという実験を行った。しかしながら、限定培地での再適応および増殖延長の後、複数のクローンから抽出したプラスミドＤＮＡの画分は大腸菌トランスポゾン配列ＩＳ１を含有することが判明した。プラスミドＤＮＡ含量を検査するために小規模発酵系で培養したとき（例えば栄養補給を伴う振盪フラスコ（“ＳＦＦ”）系、ＰＣＴ／ＵＳ２００Ｓ／００２９１１；前出、に詳細に記載）、ＩＳ１転位の増加したクローンはすべて低生産体（上記のホワイトクローン同様）であると特性決定された。従って、ＩＳ１転位増加と低生産性集団との間に相関関係が存在すると考えられる。この情報を使用して有力なプラスミド高生産性大腸菌クローンの遺伝子選択を組込んだ本発明の代替的スクリーニングプロトコルを創作した。
【００３５】
本発明は、同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株のクローナルサブタイプ間のＩＳ１転位活性を比較し、相対的に低い転位活性を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関する。相対的に低い転位活性は、同じプラスミドＤＮＡを内包する該細菌株のクローナル単離物の集団の平均転位活性を計算することによって容易に決定でき、この平均よりも低い転位活性を有すると判定されたクローナルサブタイプが相対的に低い転位活性を示すと同定する。従って本発明は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプのＩＳ１転位活性を比較し、相対的に低い転位活性を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階とおよび（ｂ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。
【００３６】
本発明のこの部分の１つの実施態様において、ＩＳ１転位活性がクローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定することによって判定され、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数は相対的に低いＩＳ１転位活性を表す。相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を有するクローンは、同じプラスミドＤＮＡを内包する該細菌株のクローナル単離物の集団の平均ＩＳ１トランスポゾンコピー数を計算することによって容易に決定でき、該平均よりも低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を有すると判定されたクローナルサブタイプが相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すと同定される。本発明の別の実施態様において、ＩＳ１転位活性は、該クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ内部の予め決定されたＩＳ１挿入領域内部の１つ以上のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を測定することによって判定され、ＩＳ１挿入配列の不在は、相対的に低いＩＳ１転位活性を表す。ＩＳ１配列挿入を受容するクローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ内部の特異的場所の正確な決定方法は後出の実施例５に詳細に記載する。
【００３７】
本発明の１つの実施態様は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、該クローナルタイプのプラスミドＤＮＡ中のＩＳ１トランスポゾン挿入性突然変異原性の相対量を測定する段階を含む。ここにおいて、ＩＳ１トランスポゾン挿入性変異原性の量が少ないことを有力な高生産性クローナルサブタイプの指標とする。従って、本発明の１つの実施態様は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、（ｂ）該単離プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定し、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階とおよび（ｃ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数は、試験したクローナル単離物の集団の平均ＩＳ１トランスポゾンコピー数を計算することによって容易に決定でき、該平均よりも低いプラスミドＩＳ１トランスポゾンコピー数を有すると判定されたクローナルサブタイプが相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を表すと同定される。あるいは、２つだけのクローナルサブタイプに由来のプラスミドＤＮＡサンプルのＩＳ１トランスポゾンコピー数を試験するならば、最も低いＩＳ１トランスポゾンコピー数をもつクローンが相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプを表す。
【００３８】
ＩＳ１は細菌挿入配列のうちで最小であることがわかっている７６８塩基対の転位性要素である（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｄ．Ｈ．Ｓａｅｄｌｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｇｉｅｒｌ，Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９６，１−２６）。ＩＳ１トランスポゾン配列の実例は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅに登録番号Ｘ５２５３４、Ｘ５２５３７およびＵ４９２７０（ＩＳ１Ａ／ＩＳ１Ｅ）；Ｘ１７３４５およびＸ５２５３５（ＩＳ１Ｂ／ＩＳ１Ｃ）；Ｘ５２５３６（ＩＳ１Ｄ）；Ｘ５２５３８（ＩＳ１Ｆ）；およびＶ００６０９（包囲配列のないＩＳ１のクリーンコピー）に見出すことができる。ＩＳ１は天然には、大腸菌ゲノム中にコピー数１０以下で見出される。野生型Ｋ−１２株では６から８コピーが同定されている（Ｄｅｏｎｉｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｆ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，２：９８２−９８９）。転位が生じると、通常は標的配列の９ｂｐの複製が挿入部位に生成される（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，１９９６，前出）。大腸菌に見出されるＩＳ１は４つの型に群別できるが、ＩＳ１Ａ／ＩＳＩＥ型（参照：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ５２５３４、Ｘ５２５３７およびＵ４９２７０）だけが染色体からプラスミドＤＮＡに転位することを示した（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｙｅｈ，１９９７，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３６：２７５−２８０）。ＩＳ１は他の挿入配列よりはるかに高い頻度で自然挿入突然変異を生じ（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，１９９６，前出）、プラスミドおよび染色体の双方のＤＮＡの突然変異の原因物質であると同定された。例えば、このような突然変異は、毒性またはストレス誘発遺伝子の発現を（全面的または部分的に）抑制する（Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，１９８１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８３：１０７−１１４；Ｎａｋａｈａｍａら，１９８６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：２６２−２６６；および、Ｔｏｂａ−Ｍｉｎｏｗａ，１９９２，Ｇｅｎｅ １２１：２５−３３）、調節要素または遠位転写リードスルーの破壊によって遺伝子発現を活性化する（Ｈａｌｌ，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５：１−５；および、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１８３：２６４６−２６５３）、宿主細胞の重金属抵抗性を増す（Ｉｔｏｈら，１９９４，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７８：４６６−４６８）、ならびに、プラスミド分泌安定性を強化する（Ｃｈｅｗら，１９８６，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３６：２７５−２８０）ことを示した。１１の非反復挿入部位がＤＮＡワクチン候補の１つのサンプル中で同定され、これらはいずれもネオマイシン耐性遺伝子ｎｐｔＩＩの翻訳領域の１００塩基対にまたはその内部に存在した（実施例３参照）。従って、ＩＳ１転位が高生産体および低生産体（すなわち、グレークローンおよびホワイトクローン）の分化に導く遺伝子突然変異を生じさせるメカニズムである可能性は極めて高い。
【００３９】
プラスミドＤＮＡ中のトランスポゾンの存在は、アガロースゲル上の高分子量バンドとして注目されたのが最初である（実施例１参照）。ＩＳ１の標準増幅反応にいわゆる“不完全一致プライマー”を使用するエンドポイントＰＣＲアッセイが使用された。これらのプライマーは、５’端から順次に９ｂｐの非一致ヌクレオチド、７または９ｂｐの完全一致ヌクレオチドから構成されていた。このようなプライマーを使用した結果として、鋳型ＤＮＡ濃度が未決の閾値レベルを上回るならばＩＳ１だけが増幅される濃度感受性アッセイが得られた。これらのアッセイは定性的結果だけを送達した。従って、トランスポゾン含量に関するいくつかのＤＮＡワクチンクローンの挙動をより十分に特性決定する意図で、ＤＮＡワクチン候補内部（すなわち、プラスミドＤＮＡ自体の内部）のＩＳ１コピーの相対量をプラスミドコピー数に基づいて測定する定量的ＰＣＲ（“Ｑ−ＰＣＲ”）アッセイを設計した。このＩＳ１／プラスミドＱ−ＰＣＲアッセイは、形質転換大腸菌クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数の測定値を表すＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する。このアッセイは、ＰＣＲ中に累積する特異的産物を検出できる蛍光発生ＴａｑＭａｎプローブテクノロジイを利用する。蛍光は、蛍光発生プローブを消化し５’端のリポーター色素を３’端の消去剤色素から分離するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって発生する。ＰＣＲ処理の進行中にリポーター色素からの蛍光は指数関数的に累積され、リアルタイムでモニターされる。蛍光振幅をサイクル数に関してグラフ化し、振幅が閾値サイクル（ＣＴ）と呼ぶユーザー規定の整定値に到達した点によって定量が確定される。次に、サンプルプレート中の鋳型の一連の既知量から作成した外部標準曲線から鋳型ＤＮＡコピー数を外挿する、または、多重モードで処理し反応ウェルに基準鋳型の定量を組込むことによって相対的コピー数を決定する。プラスミド調製物中の残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１の予測量を計算するために第二の多重Ｑ−ＰＣＲアッセイを同様にして開発した。このアッセイは、プラスミドＤＮＡコピー数に標準化した大腸菌宿主細胞２３ｓ ｒＤＮＡを定量し、２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成する。この２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比をＩＳ１／プラスミドコピー比から減算して、単離プラスミドＤＮＡサンプル中の残留ゲノムＤＮＡに起因すると予想されたＩＳ１の増幅を算入した“補正”ＩＳ１／プラスミドコピー比を生成し、プラスミドＩＳ１含量のより正確な読みを与える。これらのアッセイを使用すると、１０３−１０８コピー／μＬの範囲のプラスミドＤＮＡコピー数であるときにすべての標的の定量が直線状であり、１００％（１：１）から０．００１％（１：１０５）までの範囲のＩＳ１／プラスミドコピー比を検出できることが知見された。このアッセイは高感度であるが、結果はアガロースゲルで視認可能にするためには５−１０％のオーダのＩＳ１画分が必要であることを示唆する。
【００４０】
特定の理論に制約されないが、プラスミドＤＮＡへのＩＳ１挿入、特に、Ｖ１Ｊｎｓプラスミドで観察された（実施例３参照）ように、抗生物質耐性遺伝子内部で主として生じるこのような挿入がプラスミドコピー数に強い影響を与えたりまたはクローンの増幅特性に影響を与えたりすることは考えられない。しかしながら、プラスミドＤＮＡに挿入配列が転位するとその結果として、ＩＳ１コピー数が増加し、転位がゲノムに逆戻りする能力が増加することは考えられる。この挙動は、１つの大腸菌株のカドミウム耐性の獲得で観察された（Ｉｔｏｈら，１９９４；前出）。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）のカドミウム耐性の原因となる遺伝子をクローニングする目的で、０．８Ｋｂの挿入をもつｐＢＲ３２２を内包する耐性大腸菌形質転換体を作製した。宿主からプラスミドを除去してもカドミウム耐性は維持されていた。しかしながら、挿入はシュードモナス・プチダ由来のＤＮＡでなく大腸菌のＩＳ１であることが後になって同定された。染色体再編成も同定され、これは、プラスミドからゲノムに逆戻りしたＩＳ１の転位が表現型を変化させたという結論に導く。従って、本文中に記載するように、いかなる特定の理論にも制約されないが、ゲノムからプラスミドＤＮＡへのＩＳ１の転位およびその逆戻りがプラスミド低生産性大腸菌クローナルサブタイプ形成の一因であり得る。
【００４１】
上述のＱ−ＰＣＲは、クローンに内包されているプラスミドＤＮＡ内部のＩＳ１トランスポゾンコピー数を定量することによって細菌クローナルサブタイプ中のＩＳ１挿入性突然変異原性の増加を間接に測定するために使用される。有意な転位活性をもつプラスミドＤＮＡサンプルはすべてプラスミド低生産性クローンから単離されたものでありプラスミド高生産性クローンは低レベルのプラスミド由来ＩＳ１を含有していたという観察は、低生産性クローンがＩＳ１挿入性突然変異と相関関係を有しているという提唱理論を裏付ける。以前から記載されていた高生産体スクリーンの第一選択基準は形態学的表現型の分析を含んでいたが、これはプラスミド増幅挙動の代用品でしかない。従って、本文中に記載したように、大腸菌クローナルサブタイプはさらに、ＩＳ１転位に関する安定性に従っておよびそれらの高いプラスミド力価の保存に従って特性決定できる。プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１を測定する記載のＱ−ＰＣＲアッセイは、アガロースゲル電気泳動およびエンドポイントＰＣＲ分析の双方を凌駕するいくつかの重要な利点を提供する。第一に、アッセイが高度に特異的である。該アッセイは、ＩＳ１トランスポゾン含有サンプル、他のトランスポゾン（例えばＩＳ５）含有サンプルおよびトランスポゾン陰性サンプルを、特別設計のオリゴヌクレオチドプライマーと蛍光プローブとに依存して容易に識別できる。第二に、Ｑ−ＰＣＲテクノロジイによって提供される高レベル感度は、少なくとも１００コピー／μＬ（例えばＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆの場合０．６ｐｇ／ｍｌ）という低い濃度の標的を検出しながら鋳型ＤＮＡ濃度の６対数以上までＩＳ１転位を定量することが可能である。
【００４２】
従って本発明は、プラスミドＤＮＡを内包している大腸菌（大腸菌Ｋ−１２株を非限定的に含む。）の菌株例えばＤＨ５株の高生産性クローナルサブタイプを同定するための選択プロトコルに関する。このプロトコルは、同じプラスミドＤＮＡを内包している同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量（すなわち、ＩＳ１トランスポゾンコピー数）を測定する段階とおよび相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプを選択する段階とを含む。ここにおいて、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローンが有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定される。次に、有力な高生産性クローナルサブタイプの比産生率（すなわち、プラスミドコピー数／細胞）を評価して、それが実際に高生産性クローナルサブタイプであるか否かを判定する。このＱ−ＰＣＲに基づく遺伝子選択方法は、同じプラスミドＤＮＡを内包している同じ大腸菌の菌株の３つ以上のクローナルサブタイプの分析に使用できると考えられ、ＩＳ１トランスポゾンコピー数の数量範囲を生成する。このような場合、最も低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプの比産生率だけでなく、アッセイにかけたクローンの平均ＩＳ１トランスポゾンコピー数よりも低いクローナルサブタイプの比産生率を処理可能な数のクローナルサブタイプについて評価するという選択もある。
【００４３】
有力な高生産性クローナル単離物は発酵系、好ましくは小規模発酵系を使用して評価される。発酵系のサイズは使用すべき最終発酵プロセスのサイズにゆるやかに従属するであろう。例えば、“大規模”プラスミドＤＮＡ産生プロセス（すなわち、約１０００Ｌよりも多い発酵量を収容でき、１０，０００から１００，０００Ｌの大きさの発酵容器を含み得る標準実験用バイオリアクターよりも多い全発酵量）に使用されるクローンの同定を支援するために、一般にはこの小規模評価段階で約２５０ｍＬから約１Ｌの範囲のフラスコが使用される。小規模発酵系はまた、最終的商業用大規模発酵プロセスをシミュレートしなければならない。高生産体スクリーンを開示する同時係属出願（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出）に詳細に記載されているように、有力な高生産性クローナル単離物は、発酵中の各フラスコに連続栄養補給が付随する栄養補給型振盪フラスコ（“ＳＦＦ”）を使用する発酵系で評価できる。振盪フラスコ系は、クローナル単離物が約１０００ｍＬ以下のバフル付き振盪フラスコ、好ましくは２５０ｍＬのバフル付き振盪フラスコで培養される小規模発酵系を表す。１つの実施態様において、高プラスミドコピー数／細胞を示す高生産性クローナルサブタイプは約２０μｇ ＤＮＡ／μｇ ＤＣＷ以上の比産生率を有すると判定される。比産生率を評価するために小規模発酵で典型的に使用される代替的測定方法は、１ｍＬの溶液に再懸濁したときの６００ｎｍにＯＤ＝２を与える細胞集落を表すＯＤ２ペレットに基づく。従って別の実施態様において、高プラスミドコピー数／細胞を示す高生産性クローナルサブタイプは約１５μｇ ＤＮＡ／μｇ ＯＤ２ペレット以上の比産生率を有すると判定する。
【００４４】
上述したように、本発明はＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイのような定量的ＰＣＲ（“Ｑ−ＰＣＲ”）アッセイに関するものであり、ＤＮＡワクチン候補のプラスミドＤＮＡサンプル内部のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定するために該アッセイを使用する。該Ｑ−ＰＣＲアッセイは、ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列と、ＩＳ１挿入が存在しないと予め決定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列とを増幅することによってプラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンの相対量を測定し、大腸菌クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピーの数（すなわち、ＩＳ１トランスポゾンコピー数）を表すＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する。当業者は、ＩＳ１挿入を受容する確率の低いプラスミドＤＮＡ内部の場所を容易に同定できる（例えば、実施例３参照）。１つの実施態様においてアッセイを多重モードで行う。その結果として、第一（すなわち、ＩＳ１配列）および第二（すなわち、ＩＳ１非含有配列）のヌクレオチド配列を同一反応管で増幅することができ、変動性が小さい。ＰＣＲ産物をリアルタイムで検出でき放射能の必要性を排除する５’エキソヌクレアーゼ蛍光発生ＰＣＲに基づくアッセイ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）は当業界で記載されている。参照文献は例えば、Ｕ．Ｓ．特許５，５３８，８４８；およびＨｏｌｌａｎｄら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０である。この方法は、蛍光リポーター（フルオロホア）と消去剤とを含みＰＣＲプライマー間で標的ＤＮＡにハイブリド形成する標識プローブを利用する。フルオロホアが励起されると、フルオロホアによって蛍光シグナルが放出され、消去剤によって消去される。アンプリコンは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’への方向のエキソヌクレアーゼ活性によって検出できる。該ポリメラーゼは、ＰＣＲプライマーの伸長中に出会った二重鎖ＤＮＡを分解し、従ってプローブからフルオロホアを遊離する。その後、蛍光シグナルはもはや消去されないので、標的ＤＮＡの量に直接的に相関する蛍光シグナルが累積され、これは全自動蛍光計によってリアルタイムで検出できる。
【００４５】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応を実行する全自動蛍光計は当業界で公知であり、この特異的アッセイに適用できる。例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）製のｉＣｙｃｌｅｒおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）製のＭｘ４０００がある。本発明の１つの実施態様において、本発明の一部として記載したＱ−ＰＣＲアッセイをＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７９００ＨＴ配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で実行できる。この計器は、蛍光発光（波長に基づく）を電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラで予測空間パターンに分離するスペクトログラフを使用する。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７９００ＨＴの配列検出システムアプリケーションはＣＣＤカメラから蛍光シグナルを収集し、データ解析アルゴリズムを適用する。
【００４６】
本発明の一部として記載したＱ−ＰＣＲアッセイに使用する核酸ポリメラーゼは、５’から３’への方向のエキソヌクレアーゼ活性を有していなければならない。いくつかの適切なポリメラーゼが当業界で公知であり、例えば、Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔｂｒ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）およびＴｔｈ（Ｔｈｅｒｍｉｔｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓ）ポリメラーゼがある。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは本発明に使用するための好ましいポリメラーゼである。５’から３’への方向のエキソヌクレアーゼ活性は、ＰＣＲプライマーの伸長中に出会った二重鎖ＤＮＡの分解によって特性決定される。アンプリコンにアニーリングされた蛍光プローブは同様にして分解され、従ってオリゴヌクレオチドからフルオロホアを遊離する。フルオロホアと消去剤とが解離すると、フルオロホアによって放出された蛍光がもはや消去されないので、その結果として検出可能な蛍光変化が生じる。ＰＣＲ産物の指数関数的増殖中にアンプリコン特異的蛍光がある点まで増加したとき、配列検出アプリケーションが、複合スペクトルに多成分化アルゴリズムを適用し、その後、該蛍光は非増幅サンプルのバックグラウンド蛍光から識別できる。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７９００ＨＴ配列検出器はまた、サンプル用の閾値サイクル（ＣＴ）（蛍光が予め決定された閾値以上に増加するサイクル）を決定するソフトウェアアプリケーションを含む。ＰＣＲ陰性サンプルは、実行された全サイクル数に等しいＣＴを有しており、ＰＣＲ陽性サンプルは実行された全サイクル数よりも少ないＣＴを有している。
【００４７】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、多くの方法によって合成できる。例えば、Ｏｚａｋｉら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：５２０５−５２１４；Ａｇｒａｗａｌら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：５４１９−５４２３である。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、ＡＢＩ ３９００ ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような全自動ＤＮＡシンセサイザーで合成できる。得られるオリゴヌクレオチドのハイブリド形成効率に不利な影響を与えることがなければ、ホスホロチオエート、ホスホラミデートなどのような非天然主鎖基を生じる代替化学薬品も使用できる。
【００４８】
本発明のＰＣＲ増幅段階は当業界で公知の標準技術によって実行できる（参照：例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｕ．Ｓ．特許４，６８３，２０２；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓら，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）；これらの文献はいずれも参照によって本発明に組込まれるものとする）。ＰＣＲサイクル反復条件は典型的には、ＰＣＲ反応混合物を約８０℃から約１０５℃までの範囲の温度で約１から約１０分間加熱することによって行う初期変性段階を含む。熱変性後に典型的には約２０から約５０サイクルの範囲の複数サイクルを行う。各サイクルは通常は、初期変性段階、プライマーアニーリング段階を順次に含み、プライマー伸長段階で終了する。あるいは、各サイクルが、約８０℃から約１０５℃までの範囲の１つの温度での変性段階、次いで、約６０℃から約７５℃までの範囲のより低い温度でのプライマーアニーリング／伸長段階を含んでもよい。核酸ポリメラーゼ例えばＴａｑポリメラーゼによるプライマーの酵素伸長はその後のサイクルで鋳型として使用できる鋳型のコピーを産生する。誤ったプライミングおよび非特異的アンプリコンの生成を排除するために本発明の方法に組合せて“ホットスタート”ＰＣＲ反応を使用するとよい。このために、本発明の好ましい実施態様において、核酸ポリメラーゼがＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲサイクル反復条件が“ホットスタート”ＰＣＲ反応を含む。該ポリメラーゼは、活性化までは不活性であり、ＰＣＲサイクル反復に先立ってＰＣＲ反応成分を９５℃で約１０分間温置することによって活性化できる。同様の初期温置段階を含むＰＣＲ方法は当業界で“ホットスタート”ＰＣＲアッセイとして知られている。
【００４９】
本発明の１つの実施態様において、ここに記載したＴａｑＭａｎ Ｑ−ＰＣＲアッセイ用のオリゴヌクレオチドプローブは長さ約１５から４０ヌクレオチドの範囲である。別の実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは長さ約１５から３０ヌクレオチドの範囲である。本発明の第三の実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは長さ約１８から２８ヌクレオチドの範囲である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの正確な配列および長さは、それが結合する標的ポリヌクレオチドの種類に部分的に左右される。結合場所および長さは特定の実施態様に適したアニーリングおよびメルティング特性が得られるように変更し得る。オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は好ましくは阻止するようにまたは核酸ポリメラーゼによる伸長ができないようにする。ＤＮＡポリメラーゼはヌクレオチドを３’ヒドロキシルだけに付加できるが３’ホスフェートには付加できないので、このようなブ阻止は３’末端ヌクレオチドのリン酸化によって行うのが好都合である。
【００５０】
本発明のフルオロホアは５’端、３’端またはどちらかの末端の内側を含むプローブのいずれかの場所でプローブに付着できる。すなわち、該フルオロホアはプローブがその検出を目的として設計された標的ＤＮＡにハイブリド形成できる特異的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドのいずれかに付着できる。本発明の１つの実施態様において、フルオロホアは特異的ヌクレオチド配列の５’末端ヌクレオチドに付着され、消去剤は、特異的ヌクレオチド配列の３’末端ヌクレオチドに付着される。本発明に使用されるフルオロホアは好ましくは、連結部分を介してプローブの３’炭素または末端５’炭素に付着するように誘導体化された有機蛍光色素である。消去剤分子もまた好ましくは有機色素であり、これは蛍光性でも非蛍光性でもよい。一般に、消去剤が蛍光性であるかまたはリポーターから移動してきたエネルギーを非放射状減衰によって放出するだけであるかにかかわりなく、消去剤の吸光バンドはリポーター分子の蛍光発生バンドと実質的に重なり合っていなければならない。励起リポーター分子からエネルギーを吸収するが放射状にエネルギーを放出しない非蛍光消去剤分子を“暗消去剤”または“非蛍光消去剤”と呼ぶ。
【００５１】
いくつかのフルオロホア−消去剤の組合せが当業界で記載されている。参考文献は例えば、Ｐｅｓｃｅら，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７１）；Ｗｈｉｔｅら，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ ２０ Ｙｏｒｋ（１９７０）；などである。文献はまた、蛍光および非蛍光分子とそれらの対応光学特性を網羅したリストを与える参考書、例えばＢｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｒｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９７１）を含む。さらに文献のうちには、オリゴヌクレオチドに付加できる共通反応性基を介して共有結合するようにリポーター分子および消去剤分子を誘導体化するための広汎な指導書が存在する。参照：例えばＵ．Ｓ．特許３，９９６，３４５および４，３５１，７６０。代表的なフルオロホア−消去剤の組合せは、フルオレセインを含むキサンテン色素およびローダミン色素から選択し得る。オリゴヌクレオチドに付着する結合部位または結合性官能基として使用できるフェニル部分に置換基をもつこれらの化合物の多くの適当な形態が広く入手可能である。別のグループの蛍光化合物はアルファまたはベータ位にアミノ基を有しているナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物は、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートを含む。他の色素としては、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、アクリジン類例えば９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンズオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンズオキサジアゾール、Ｄスチルベン、ピレンなどがある。
【００５２】
本発明の１つの実施態様において、フルオロホアおよび消去剤分子はフルオレセインおよびローダミン色素から選択される。これらの色素およびオリゴヌクレオチドに付着させる適当な連結方法は当業界で公知である。参照：例えばＭａｒｓｈａｌｌ，１９７５，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．７：２９９−３０３；およびＵ．Ｓ特許５，１８８，９３４。本発明の好ましい１つの実施態様において、フルオロホアは、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社が専有権をもつフルオロホアＶＩＣ；６−カルボキシ−４’， ５’−ジクロロ−２’，７’ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；および、５−テトラクロロ−フルオレセイン（ＴＥＴ）から成るグループから選択される。本発明の別の実施態様において、消去剤分子は６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）のような蛍光性である。好ましくは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な、合成中にオリゴヌクレオチドに付着できる市販の連結性部分を使用する。
【００５３】
本発明の１つの実施態様において、ＩＳ１／プラスミドコピー比は、ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列とを増幅することによって決定される。この場合、プラスミドＤＮＡの第一および第二のヌクレオチド配列が核酸ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドセットとの存在下で個別に増幅される。第一ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、（ｉ）ＩＳ１ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）第一場所の下流のＩＳ１ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーとおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブとから構成され、該プローブは第一場所と第二場所との間のＩＳ１ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、（ｉ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーとおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブとから構成され、該プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。核酸ポリメラーゼは、増幅中に蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化が第一および／または第二のヌクレオチド配列の増幅の発生に対応する。別の実施態様において、第一および第二のヌクレオチド配列が多重モードで同時に増幅される。
【００５４】
本発明の別の実施態様において、ＩＳ１のヌクレオチド配列を増幅できる順方向および逆方向のＰＣＲプライマーは、それぞれＩＳ１−Ｑ−Ｆ（５’−ＡＧＧＣＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＣＣＣＣＡ−３’；配列６）およびＩＳ１−Ｑ−Ｒ（５’−ＡＣＧＧＴＴＧＴＴＧＣＧＣＡＣＧＴＡＴ−３’；配列７）から構成され、蛍光プローブはＩＳ１−Ｑ−Ｐ２（５’−ＣＧＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧ−３’；配列８）から構成されており、該プローブは上述のようにフルオロホアと消去剤分子とによって標識されている。１つの実施態様において、ＩＳ１−Ｑ−Ｆプローブの３’末端が消去剤分子ＴＡＭＲＡで標識され５’末端がフルオロホアＦＡＭで標識されている。本発明のこの部分の別の実施態様において、ＩＳ１ヌクレオチド配列と共に増幅されるＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列が、ＣＭＶプロモーター配列（例えばヒトＣＭＶプロモーター）を非限定的に含むプラスミドＤＮＡのプロモーター配列である。１つの実施態様において、ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列を増幅できる順方向および逆方向のＰＣＲプライマーは、それぞれＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（５’−ＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡ−３’；配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（５’−ＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴ−３’；配列４）から構成され、蛍光プローブはＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（５’−ＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧ−３’；配列５）から構成され、該プローブは、上述のようにフルオロホアと消去剤分子とによって標識されている。１つの実施態様において、ＩＳ１−Ｑ−Ｆプローブの３’末端が消去剤分子ＴＡＭＲＡで標識され５’末端がフルオロホアＶＩＣで標識されている。
【００５５】
従って本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、（ｂ）第一クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のプラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量を定量的ＰＣＲアッセイによって測定し、該アッセイでＩＳ１ヌクレオチド内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列とを増幅してＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する段階と、（ｃ）第一クローナルサブタイプのＩＳ１／プラスミドコピー比を同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも１つの第二クローナルサブタイプのＩＳ１／プラスミドコピー比に比較する段階と、（ｄ）相対的に低いＩＳ１／プラスミドコピー比を示すクローンを選択し、この相対的に低いＩＳ１／プラスミドコピー比を示すクローンを有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定する段階とおよび（ｅ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。
【００５６】
先に記載したように、第二の多重Ｑ−ＰＣＲアッセイは、試験した大腸菌クローナルサブタイプのプラスミドＤＮＡサンプル中の残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１の予測量を計算するために開発され、ＩＳ１転位活性の増加をより正確に定量することによって開示した遺伝子選択プロセスの特異性を増強できる。標準のプラスミドＤＮＡの調製において、ゲノムＤＮＡは変性タンパク質と共沈され、プラスミドＤＮＡから分離され、廃棄される。従って、細菌細胞発酵物から単離されたプラスミドＤＮＡサンプルは主としてプラスミドＤＮＡを含み、少量のゲノムＤＮＡが混入し得る。例えばＱＩＡＧＥＮカラムで精製したプラスミドＤＮＡは３．３重量％までのゲノムＤＮＡを含有するであろう（Ｖｉｌａｌｔａら，２００２，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０１：１５１−１５３）。ゲノムＤＮＡの混入は少量であろうが、本発明のＱ−ＰＣＲアッセイは高感度なのでこの残留ゲノムＤＮＡ内部に局在するＩＳ１トランスポゾンを検出できるであろう。本文中に記載のＩＳ１／プラスミドコピー比アッセイは、プラスミドＤＮＡ内部に局在するＩＳ１とゲノム／染色体ＤＮＡ内部に局在するＩＳ１とを識別できないので、ベースライン残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１の量を知るためにこの第二の多重Ｑ−ＰＣＲを開発した。従って、本発明の１つの実施態様において、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピーの予測量が定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定され、プラスミドコピー数に基づくＩＳ１コピーの相対量（すなわちＩＳ１トランスポゾンコピー数）を表す上述のＩＳ１／プラスミドコピー比が、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピーの予測量を減算することによって補正される。上述のように、ＩＳ１／プラスミドコピー比アッセイはプラスミドに基づくＩＳ１と染色体に基づくＩＳ１とを識別できないので、Ｑ−ＰＣＲアッセイは、残留ゲノムＤＮＡに起因すると思われるＩＳ１の量を補正するために、染色体ＤＮＡ中のベースラインＩＳ１と同様の量で存在すると考えられる染色体ＤＮＡの成分を測定する。例えば、大腸菌Ｋ−１２ゲノム中には６から８コピーのＩＳ１が存在し（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，１９９６；前出）、発明者／出願人によるサザンブロット実験はＤＨ５細胞中のＩＳ１コピー数が６または７であることを示した（実施例２参照）。同様に、２３ｓ ｒＤＮＡ遺伝子が大腸菌ゲノム中に７コピー／細胞で存在する（Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ａｎｄ Ｎｏｍｕｒａ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｆ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，２：１３５８−１３８５）。従って、単離プラスミドＤＮＡサンプル中の２３ｓ ｒＤＮＡコピーの定量は、開示したＱ−ＰＣＲアッセイで測定される残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピー数の適正な概数を与える。
【００５７】
従って、本発明の１つの実施態様において、上述のように、ＩＳ１／プラスミドコピー比が、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピーの予測量を減算することによって補正され、この場合、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピーの予測量がＱ−ＰＣＲアッセイで測定される。別の実施態様において、該Ｑ−ＰＣＲアッセイは、２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列とＩＳ１／プラスミドコピー比を生成するために使用したＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの同じヌクレオチド配列とを増幅することによってプラスミドコピー数に基づく２３ｓ ｒＤＮＡの相対量を測定して２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成し、これをＩＳ１／プラスミドコピー比から減算して“補正”ＩＳ１／プラスミドコピー比を与える。
【００５８】
本発明の別の実施態様において、２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比は、２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの同じヌクレオチド配列（すなわち、ＩＳ１／プラスミドコピー比を生成するときに増幅された第二ヌクレオチド配列）とを増幅することによって決定され、この場合、２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部に局在するヌクレオチド配列および第二ヌクレオチド配列が、核酸ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドセットとの存在下で個別に増幅される。２３ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、（ｉ）２３ｓ ｒＤＮＡ配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）第一場所の下流の２３ｓ ｒＤＮＡ配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーとおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブとから構成され、該プローブは第一場所と第二場所との間の２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、（ｉ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブとから構成され、該プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。核酸ポリメラーゼは、増幅中の蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出される。ここにおいて該蛍光変化は、２３ｓ ｒＤＮＡ配列および／または第二ヌクレオチド配列の増幅に対応する。別の実施態様において、該２３ｓ ｒＤＮＡ配列および第二ヌクレオチド配列が多重モードで同時に増幅される。
【００５９】
別の実施態様において、大腸菌ゲノムＤＮＡ内部の２３ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を増幅できる順方向および逆方向のＰＣＲプライマーは、それぞれ２３ｓ−Ｆ１Ｄ（５’−ＧＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＧＡＴＡＣＡＧ−３’；配列１１）および２３ｓ−Ｒ１Ｄ（５’−ＧＴＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣＡＴＣＧＡ−３’；配列１２）から構成され、蛍光プローブは、２３ｓ−Ｐｆａｍ（５’−ＣＣＣＣＧＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＧ−３’；配列１３）から構成され、該プローブは上述のようにフルオロホアおよび消去剤分子の双方によって標識されている。１つの実施態様において、２３ｓ−Ｐｆａｍプローブの３’末端が消去剤分子ＴＡＭＲＡで、５’末端がフルオロホアＦＡＭで標識されている。本発明のこの部分の別の実施態様において、２３ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列と共に増幅されるＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列が、ＣＭＶプロモーター配列（例えばヒトＣＭＶプロモーター）を非限定的に含むプラスミドＤＮＡのプロモーター配列であり、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶコピー比が生成される。
【００６０】
本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、（ｂ）第一プラスミドＤＮＡサンプル中のプラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量を定量的ＰＣＲアッセイによって測定し、該アッセイがＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列とを増幅してＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する段階と、（ｃ）該第一プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量を、プラスミドコピー数に基づく２３ｓ ｒＤＮＡの相対量を測定する定量的ＰＣＲアッセイで計算し、該アッセイが２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部に局在するゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列と段階（ｂ）の第二ヌクレオチド配列との双方を増幅して２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成する段階と、（ｄ）２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比をＩＳ１／プラスミドコピー比から減算して補正ＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する段階と、（ｅ）第一プラスミドＤＮＡサンプルから得られた補正ＩＳ１／プラスミドコピー比を第二プラスミドＤＮＡサンプルから得られた補正ＩＳ１／プラスミドコピー比に比較する段階と、（ｆ）相対的に低い補正ＩＳ１／プラスミドコピー比を示すクローンを選択し、相対的に低い補正ＩＳ１／プラスミドコピー比を示すクローンを有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定する段階とおよび（ｇ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。本発明のこの部分の１つの実施態様において、ＩＳ１トランスポゾン挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列は、プラスミドＤＮＡのプロモーター領域（ＣＭＶプロモーター領域を含むが、これに限定されない。）であり、従って例えばＩＳ１／ＣＭＶおよび／または補正ＩＳ１／ＣＭＶコピー比が生成される。
【００６１】
詳細に上述した遺伝子選択方法は、一方で、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌サブタイプ中のＩＳ１挿入性突然変異原性の程度がプラスミドＤＮＡ自体のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定することによって評価される段階を含み、本発明はさらに、クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ中のＩＳ１挿入性突然変異原性の増加を検出する段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプを選択するためのより進歩した方法に関する。高スループット分析が可能なＰＣＲに基づくアッセイは、ＩＳ１挿入を受容すると予め決定されたゲノムＤＮＡの領域（すなわち、“予め決定されたＩＳ１挿入領域”）内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出すると期待される。この予め決定された領域内部のＩＳ１トランスポゾン挿入の有無を非形質転換細菌株のゲノムＤＮＡに存在するベースラインＩＳ１トランスポゾンと混同してはならない。どちらかと言えばこの予め決定されたＩＳ１挿入領域へのＩＳ１挿入はプラスミドＤＮＡによる細菌細胞の形質転換後に生じる。後出の実施例２で参照できるように、ＲＦＬＰプロファイルは、低生産性ＤＮＡワクチンクローンと細菌ゲノムＤＮＡ内部のＩＳ１コピー数の増加との間に相関関係があることを示す。従って本発明はさらに、クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡのＩＳ１挿入領域として予め決定された領域（すなわち、“予め決定されたＩＳ１挿入領域”）内部の１つ以上のＩＳ１トランスポゾン挿入配列の有無を検出する段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関する。この方法において、ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプは高生産性クローナルサブタイプを表す。
【００６２】
この目的の本発明は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）該クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出し、該ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、（ｂ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。ＰＣＲ（定量的ＰＣＲアッセイ（“Ｑ−ＰＣＲ”）を含むが、これに限定されない。）に基づくアッセイは、ゲノムＤＮＡの該所定ＩＳ１挿入領域の内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出するために使用できる。細菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ内部のＩＳ１挿入領域の場所を決定するプロセスは後出の実施例５に詳細に記載する。
【００６３】
本発明の１つの実施態様において、大腸菌の形質転換後のＩＳ１挿入を受容すると予め決定された大腸菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの部分の内部のＩＳ１挿入性突然変異原性を検出するためにＱ−ＰＣＲアッセイを使用する。この予め決定されたＩＳ１挿入領域は該ゲノムＤＮＡの約２０未満の連続ヌクレオチドの範囲である。該ＩＳ１挿入領域が該ゲノムＤＮＡの約２０未満の連続ヌクレオチドの範囲であるとき、ここで該領域を特異的“ＩＳ１挿入部位”と呼ぶ。ＴａｑＭａｎ Ｑ−ＰＣＲアッセイは、この予め決定されたＩＳ１挿入領域（すなわち、ＩＳ１挿入部位）を含有するゲノムＤＮＡの部分の増幅を試みることによってこのＩＳ１挿入部位内部のＩＳ１挿入配列の有無を検出するように意図されている。考察アッセイの概略図を図７Ａに示す。ＩＳ１挿入部位にまたがるように設計された蛍光プローブを使用するならば予め決定されたＩＳ１挿入部位にＩＳ１挿入配列が全く挿入されていないときだけ正常な増幅およびシグナル発生が存在する。
【００６４】
従って本発明の１つの実施態様において、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識されておりゲノムＤＮＡのＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないときにだけＩＳ１挿入領域にまたがるゲノムＤＮＡ内部の１つの場所にハイブリド形成する蛍光プローブ、（ｉｉ）蛍光プローブの上流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーおよび（ｉｉｉ）蛍光プローブの下流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーから構成されたオリゴヌクレオチドセットとの存在下で、ＩＳ１トランスポゾン領域を受容することが予め決定されたゲノムＤＮＡの領域を増幅する段階を含む定量的ＰＣＲアッセイを意図する。蛍光プローブがゲノムＤＮＡにハイブリド形成したときに、核酸ポリメラーゼは、増幅中の蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出される。この蛍光変化は、ゲノムＤＮＡの増幅に対応し、したがって、ＩＳ１挿入部位がＩＳ１トランスポゾン配列を含有しないことを確証する。このように、蛍光の変化は、有力な高生産性クローナルサブタイプの同定を表し、したがって、それが実際に高生産性クローンであるか否かを確認するためにその比産生率を小規模発酵系で評価できる。あるいは、推定低生産性クローン（すなわち、予め決定されたＩＳ１挿入部位内部にＩＳ１トランスポゾンを含有するクローン）のゲノムＤＮＡに順方向および逆方向ＰＣＲプライマーだけのハイブリド形成が生じるとき、ゲノム鋳型は容易に増幅されるが、蛍光プローブはＩＳ１挿入部位にハイブリド形成できないので、蛍光シグナルは検出されない（図７Ａ）。重要なことは、このアッセイが多重化を必要としないこと、および、全細胞溶解液で行うことができるのでゲノムＤＮＡ単離の必要性が削除されることである。このアッセイに使用するＴａｑＭａｎプローブは典型的には約１５から約４０ヌクレオチドの範囲の長さなので、ゲノム特異的プローブの適正な結合を確保するためには、同定されたＩＳ１挿入部位がゲノムＤＮＡ配列の比較的狭い領域、好ましくは約２０未満のヌクレオチド内部に局在しなければならない。
【００６５】
本発明の別の実施態様において、形質転換後にＩＳ１挿入を受容することが予め決定された大腸菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの部分内部のＩＳ１挿入性突然変異原性の増加を検出するためＰＣＲに基づくアッセイを使用する。この予め決定されたＩＳ１挿入領域は該ゲノムＤＮＡの約２０以上の連続ヌクレオチドの範囲である。意図されたアッセイの概略図を図７Ｂに示す。該ＩＳ１挿入領域が該ゲノムＤＮＡの約２０ヌクレオチド以上の範囲であるならば、ここではこの領域を“ＩＳ１挿入ホットスポット”と呼ぶ。意図されたＰＣＲアッセイは、ＩＳ１挿入領域の外部（すなわち、ＩＳ１挿入ホットスポットの外部）のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する１つのＰＣＲプライマーと、ＩＳ１挿入ホットスポットの内部に局在するゲノムＤＮＡのＩＳ１トランスポゾン配列にハイブリド形成する第二のＰＣＲプライマーとを使用する。双方のプライマーのハイブリド形成は、ほぼ既知の目標鎖長のプライマー鋳型のフラグメントの指数関数的増幅を生じ、したがって、推定低生産性クローンの同定という結果を与える。あるいは、ＩＳ１挿入ホットスポット内部のＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないと、１つのプライマーだけがゲノムＤＮＡにハイブリド形成し、鋳型ＤＮＡの１つの鎖の一次関数的増幅を生じ、したがって、有力な高生産性クローナルサブタイプの同定という結果を与える。理論的にはＩＳ１挿入ホットスポット内部のＩＳ１トランスポゾン配列にハイブリド形成すると意図された第二ＰＣＲプライマーが、該挿入ホットスポット外部のＩＳ１トランスポゾン配列（すなわち、非形質転換細胞のゲノム内部に存在するベースラインＩＳ１トランスポゾン）にハイブリド形成することもあり得るが、２つのＰＣＲプライマーがハイブリド形成するゲノムＤＮＡ内部の特異的場所およびＩＳ１ホットスポットの場所を知ることによって、推定低生産性クローンから増幅されたＤＮＡの目標鎖長は、該アッセイを全細胞溶解液または精製ゲノムＤＮＡを使用して行うときに容易に概算できる。
【００６６】
従って、本発明の１つの実施態様において、（ｉ）ＩＳ１挿入領域外部（すなわち、ＩＳ１挿入ホットスポットの外部）のゲノムＤＮＡの場所にハイブリド形成する第一ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）所定ＩＳ１挿入領域のＩＳ１トランスポゾン配列内部の場所にハイブリド形成する第二ＰＣＲプライマーとから構成されるオリゴヌクレオチドセットを使用し、予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出するＰＣＲアッセイが意図されている。このアッセイでは、ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の存在は双方のＰＣＲプライマーのハイブリド形成および増幅による該ゲノムＤＮＡの指数関数的増幅という結果を与え、ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在は第一のＰＣＲプライマーだけのハイブリド形成および増幅によるゲノムＤＮＡの一本鎖だけの一次関数的増幅という結果を与える。ゲノムＤＮＡの指数関数的増幅は、ほぼ目標サイズの増幅核酸フラグメントの同定によって目視検出される、または、二重鎖増幅ＤＮＡに結合する核酸染料（例えばＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ）を添加することによってリアルタイムで蛍光的に検出できる。あるいは、蛍光発生プライマー（例えばＬＵＸＴＭプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して蛍光の指数関数的増加を測定できる。ＩＳ１挿入ホットスポット内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローンにおいても蛍光シグナルが予想されることに留意しなければならない。しかしながら、このような情況のシグナル増加は、双方のＰＣＲプライマーのハイブリド形成から生じる指数関数的増加でなく一次関数的増加であろう。アッセイはまた、ＩＳ１挿入ホットスポット内部でＩＳ１トランスポゾン配列がどちらの配向でも挿入できることを考慮しなければならない。この可能性を考慮して内部ＩＳ１プライマーを両方向で使用し、個々のプライマーでサンプル毎に個別の２つのアッセイを行うかまたは両方のプライマーを使用してクローン集団をスクリーニングすることもできる。
【００６７】
低産生現象はＩＳ１挿入性突然変異に相関関係を有するので、ＩＳ１コピーが完全に除去された大腸菌宿主株は高生産性クローンのより均一な集団を生じると見込まれる。このため、本発明はさらに、該プラスミドＤＮＡによる細菌株の形質転換に先立って細菌ゲノムＩＳ１のコピーを完全除去するために大腸菌宿主菌株を変異させる段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの生成方法に関する。本発明はさらに、ＩＳ１コピーが完全除去された突然変異大腸菌宿主菌株（変異ＤＨ５株を含むが、これに限定されない。）および、プラスミドＤＮＡを繁殖させるための該菌株の使用に関する。
【００６８】
大腸菌の欠失的または破壊的変異を構築するためにはＰ１ファージ形質導入、トランスポゾン媒介ランダム変異原性および普遍（ＲｅｃＡ介在）相同的組換えを含むいくつかの方法が存在する。通常各変異に選択可能マーカー例えば抗生物質耐性が必要なので、これらの方法は単一変異だけに適している。代替方法は、所望破壊部位の周囲のフランキング配列に相同なプライマーに３６−から５０−ｎｔの伸長をもつＰＣＲ産物と、ラムダ−Ｒｅｄリコンビナーゼとの使用を含む（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ ９７：６６４０−６６４５）。この場合にも選択可能マーカーをやはり使用する。しかしながら、マーカーは後で除去することができ、以後の変異サイクルにはその使用が免除される。残留“瘢痕”を除去する修正方法は、選択可能マーカーを除去するために内因性二重鎖の破壊修復プロセスを利用する（Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏら，２００２，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：６４０−６４７）。この方法は、４４のうちの２４の転位可能要素の除去を含む８．１％のゲノムサイズ短縮を伴う大腸菌のＫ−１２株を産生するために使用された。この菌株では７つのＩＳ１コピーのうちの３つが除去された。残りの４コピーの除去が菌株の生存適性またはフェッドバッチ発酵プロセスでの使用適性に有害な効果を与えない可能性は極めて高い。しかしながら、Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏらの修正方法は、二重鎖の破壊修復プロセスにＲｅｃＡを必要とするので大腸菌ＤＨ５株には適していないことに注目されたい。別の方法は、グループＩＩイントロン、いわゆる“ターゲトロン”を使用して相補的配列の１４−から１６−ｎｔ領域に基づく変異を生じさせる（Ｚｈｏｎｇら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：１６５６−１６６４）。この方法も選択可能マーカーを使用するが多重挿入ができるように後で除去できる。しかしながら、この方法は、上記の２つの方法のように標的部位の欠失を生じるのでなく破壊を生じるものである。この方法の使用では、トランスポゾンによってコードされている主要トランスポザーゼ遺伝子（ｉｎｓＡＢ）中に破壊されている７つの非機能ＩＳ１コピーを内包する菌株が与得られるであろう。
【００６９】
ここに記載の形質転換大腸菌クローンに内包されたプラスミドＤＮＡベクターは、有益なバイオ化合物をコードする（１つ以上の）遺伝子、すなわちトランスジーンを含有するいかなる染色体外ＤＮＡ分子でもよい。プラスミドは、微生物細胞（例えば大腸菌）中のその維持および繁殖と以後の動物宿主体内でのトランスジーンの発現との双方に必要な要素を含有する。細菌繁殖のためには、適格な形質転換体選択用の選択可能マーカーのようなプラスミドにコードされた複製に必要な機能に加えて複製起点が必要である。遺伝子発現のためには、プラスミドが動物体内に導入されたときにトランスジーンの一過性産生が最大になるようにプラスミドを設計しなければならない。遺伝子発現に役立つプラスミドの成分は非限定的に、真核性プロモーター、転写終結およびポリアデニル化シグナル、（１つ以上の）エンハンサー要素を含む。動物細胞での組換遺伝子発現のために選択されたプロモーターは同種でも異種でもよく、構成性でも誘導性でもよく、非限定的に、ヒトサイトメガロウイルス／前初期（ＣＭＶｌＥ）、サルウイルス／初期（ＳＶ４０）、ヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１α）およびヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）由来のプロモーターを含む。プラスミドＤＮＡは平均的な技量の当業者に公知の技術を使用して組換え操作できる。参照：例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．＆ Ｗｉｌｅｙ（１９８７）。双方の文献は参照によって本発明に組込まれるものとする。
【００７０】
本発明に関係して使用し得る方法および材料を記載および開示する目的でここに引用したすべての刊行物は参照によって組込まれる。しかしながら、本発明が、従来発明によるこのような開示のために、先行していないと認めたと解釈してはならない。
【００７１】
本発明の好ましい実施態様を添付図面に基づいて記載したが、本発明がこれらの具体的な実施態様に限定されないこと、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲または要旨を逸脱することなく当業者による本発明の様々な変更および修正が可能であることを理解されたい。
【００７２】
本発明の代表として以下の実施例を与えたが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００７３】
ＤＮＡワクチンプラスミド中のＩＳ１トランスポゾンの同定
菌株、ＤＮＡワクチンプラスミドおよび増殖培地−すべてのＤＮＡワクチン構築物の宿主菌株は大腸菌ＤＨ５［Ｆ’ｄｅｏＲ ｒｅｃｋＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−，ｍｋ＋）ｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］である。この菌株は先ずＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；以前のＧｉｂｃｏ ＢＲＬ）から購入し、限定培地ＤＭＥ−Ｐ５に適応させ、後で形質転換させるために電気受容性にした。大腸菌ＤＨ５α［Ｆ−φ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−，ｍｋ＋）ｇａｌ− ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ− ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した電気受容性細胞であった。ＨＴＶ ＤＮＡワクチンプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆの構築は国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２、２０００年１２月１５日出願（国際公開ＷＯ ０１／４３６９３、２００１年６月２１日公開）に詳細に記載されている。簡単に説明すると、ＤＮＡワクチンプラスミドは、ｐＵＣ−１９由来の細菌性複製起点と、大腸菌中の維持および選択用のネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）と、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターと、イントロンＡと、ＨＩＶ由来トランスジーンの真核性発現用のウシ成長ホルモンターミネーター／ポリアデニル化シグナルとから構成されている。形質転換は、標準プラクティスに従って電気穿孔で行った。脱水ＬＢブロスおよびＬＢ寒天はＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から購入し、製造業者の指示通りに調製した。滅菌ＳＯＣ培地（形質転換後の回収用）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。限定培地ＤＭＥ−Ｐ５は、７ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、７ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、６ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｇ／ｌのＬ−グルタミン酸、１０ｇ／ｌのグリセロールおよび０．５ｇ／ｌのＮａＣｌを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整する。滅菌後１リットルあたり８．３ｍｌのネオマイシン／サイアミン／ＭｇＳＯ４溶液および１ｍｌの微量元素溶液を添加した。１２０×のネオマイシン／サイアミン／ＭｇＳＯ４溶液は２４ｇ／ｌのサイアミン−ＨＣｌ、２４０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび９．６ｇ／ｌの硫酸ネオマイシンを含有している。１０００×の微量元素溶液を１．２ＮのＨＣｌに溶解した。これは、２７ｇ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／ｌのＺｎＣｌ２、２ｇ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．３ｇ／ｌのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび０．５ｇ／ｌのＨ３ＢＯ３を含有する。
【００７４】
結果
ＬＢ培地で調製した大腸菌ＤＨ５を１μｌのＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆで形質転換し、ＳＯＣ培地に回収した。形質転換体をＬＢ／ネオマイシン寒天で平板培養した。ランダムに選択したコロニー（ＮＬＢ−１からＮＬＢ−１０）を使用して１０ｍｌのＬＢ／ｎｅｏ液体培地に接種し、一夜増殖させた。プラスミドＤＮＡの単離用に１ミリリットルのアリコートを採取し、凍結グリセロール予製液も調製した。グリセロール予製液を接種物として使用して新しいＬＢ培養物を調製し、増殖するＬＢ培養物を使用して振盪フラスコ中の２５ｍｌのＤＭＥ−Ｐ５培地に接種した。培地シフトに適応するように培養物をＤＭＥ−Ｐ５中で３回継代させた。三回目の継代後に、１ｍｌのアリコートを採取し、ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニプレップキットでプラスミドＤＮＡを単離した。ＬＢ増殖培養物およびＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物に由来のＤＮＡサンプルを０．７％アガロースゲルに流し、プラスミド含量を確認した（それぞれ図１Ａおよび１Ｂ）。２つのゲルの比較から、ＤＭＥ−Ｐ５サンプルのいくつかは優位種に比べて高い分子量をもつ少数種を含有することが判明したが、ＬＢサンプルでは明らかでなかった（参照：ＮＬＢ−１、−３、−５、−７および−８；図１Ｂの星印の付いたレーン）。１つのサンプルＮＬＢ−８はまた、出発分子のＤＮＡの再編成および排除から形成されたと思われる低分子量の多数種を含有している。サンプルＮＬＢ−１０は主に二量体化分子として存在すると考えられる点で独特であり、これは共有結合または単なる強い物理的会合を表す。
【００７５】
異なる分子量をもつ２つの種の存在はＨＴＶ ｇａｇを含むＤＮＡワクチンプラスミドの同様の培養物中で以前から観察されていた。該培養物は長い緩徐な増殖期を伴うフェッドバッチ培養後にプラスミドＤＮＡの増殖に成功しなかった（“低生産体”または“ＬＰ”と表す）（データ示さず）。この観察後に同様のＤＮＡワクチンプラスミドのサンプル中で転位可能要素ＩＳ１が発見された。Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆのＤＭＥ−Ｐ５増殖培養プレップ中のＩＳ１挿入の可能性を検討するために、高分子量の少数種を含有する５つのＮＬＢ ＤＮＡサンプルをＭｌｕＩで制限酵素消化した。制限消化物は、１μｌのプラスミドＤＮＡ、７μｌのＨ２Ｏ、１μｌの１０×反応バッファ、１μｌの酵素から構成した。消化物を３７℃で〜１時間温置し、次いでゲルに充填するためにおのおのに２μｌの充填用バッファを添加した。ヌクレオチド配列の比較に基づいて、この酵素はＩＳ１フラグメントの内部を切断するが、Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆ配列の内部を切断しないようである。従って、高分子量バンドがＩＳ１を含有するならば、ＭｌｕＩ制限酵素消化は、アガロースゲル上のこれらのバンドが直鎖化し移動するという結果を与える筈である。ＩＳ１非含有種は非消化サンプルに対して移動しない筈である。実際、ＭｌｕＩ消化後、試験した５サンプル全部が直鎖化に符合する高分子量バンドの特徴的移動を示したが、低いバンドはシフトしなかった（図１Ｃ）。
【００７６】
オリゴヌクレオチドプライマーが、ＩＳ１含有フラグメントを増幅し、その存在を追認できる証拠を提供するように設計された。設計されたプライマーは、９ｂｐの非相補的ヌクレオチドとＩＳ１配列の末端に相補的な７または９ｂｐのヌクレオチドとの連鎖から構成されたいわゆる“不完全一致”プライマーであった。このように設計したプライマーは鋳型濃度に感受性であるという明白な効果を有していた。従って、不特定な１つの量よりも多いＩＳ１含量のサンプルだけが増幅されるであろう。ＬＢ増殖細胞およびＤＭＥ−Ｐ５増殖細胞に由来のＮＬＢ−１およびＮＬＢ−２サンプルをＰＣＲ反応の鋳型として選択した。ＬＢ増殖細胞から単離したＮＬＢ−１またはＮＬＢ−２中ではアガロースゲル上の高分子量バンドが明白でなかった。しかしながら、ＤＭＥ−Ｐ５増殖細胞から単離したＮＬＢ−１中では該バンドが明白であったがＮＬＢ−２中ではそうでなかった。ｐＵＣ１９サンプル中に高分子バンドの証拠は存在しなかった（データ示さず）。従って、これを陰性対照として加えた。おそらくＩＳ１はゲノムからプラスミドに転位すると推定できる。従って、ゲノムＤＮＡプレップが大腸菌ＤＨ５およびＤＨ５αに導入された。ゲノムＤＮＡの単離に先立って双方の菌株をＬＢ中で増殖させた。ＱＩＡＧＥＮ製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑＴＭ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬を製造業者の指示通りに使用して全量５０μｌのＰＣＲ反応を設定した。５μｌの各反応液を０．７％アガロースゲルに充填した（図２Ａ）。アガロースゲル分析に符合して、どのＮＬＢサンプルのＬＢ増殖プレップからもＩＳ１の長さに対応するフラグメントの有意な増殖はなかった（レーン２および４）。しかしながら、ＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物のＮＬＢ−１およびＮＬＢ−２のプレップの双方から６５０と８５０ｂｐとの間の移動フラグメントが増幅された（レーン３および５）。ｐＵＣ１９からもどちらのゲノムＤＮＡプレップからも増幅はなく、試験したプラスミドＤＮＡのこれらの調製物中の混入残留ゲノムＤＮＡに見出されたＩＳ１をプライマーが増幅できないことが確認された。増幅フラグメントの同一性を確認するために、２つの陽性サンプルをＭｌｕＩ制限酵素で消化した（３μｌのＰＣＲ反応、５μｌのＨ２Ｏ、１μｌの１０×反応バッファ、１μｌの酵素、３７℃で２時間温置）。この酵素はＩＳ１を１回切断して〜０．４４および〜０．３４Ｋｂのバンドを産生するはずであるが、増幅サンプルではこれらが実際に観察された（図２Ｂ）。
【００７７】
ＮＬＢ−２サンプルのＤＭＥ−Ｐ５増殖プレップ中のＩＳ１の存在は、すべてのＤＭＥ−Ｐ５増殖細胞中に挿入配列が極めて少数ではあるが有意なパーセンテージの集団でまだ存在するという可能性を高めた。この可能性を試験するために、ＬＢ−およびＤＭＥ−Ｐ５増殖細胞の双方からのＮＬＢ−３からＮＬＢ−１０サンプルを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。結果は、ＮＬＢプレップの１０個のＤＭＥ−Ｐ５増殖サンプル全部にＩＳ１フラグメントが実際に存在することを示す（図Ｃ）。ＬＢ増殖プレップからの結果はそれほど明白でない（図２Ｄ）。これらのサンプルの全部で６５０と８５０ｂｐとの間に不鮮明なバンドが存在する。しかしながら、増幅の程度は、ＩＳ１が極めて少量で存在し、プラスミドプレップの染色体混入の結果かもしれないことを示唆する。これらの不鮮明なバンドはまた、プライマーの非特異的結合から生じた伸長を表すものかもしれない。しかしながら、ＤＭＥ−Ｐ５調製物中にＩＳ１配列が存在することは明らかである。また、ＬＢからＤＭＥ−Ｐ５培地へのシフトがプラスミド集団中のＩＳ１の増加を誘導する可能性も極めて高い。
【００７８】
ＤＭＥ−Ｐ５培地で継代させたＮＬＢサンプルを次にＳＦＦ（参照：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出）アセンブリで培養してプラスミドＤＮＡ含量を検査した。１０個のサンプル全部が“低生産性”であると特性決定され、プラスミドＤＮＡ含量は０．８から２．４μｇ ＤＮＡ／ＯＤ２ペレットであった。これらの各サンプル中のＩＳ１転位可能要素の同定は、ＩＳ１の存在が低産生現象の原因ではないかという疑問を浮上させる。
【実施例２】
【００７９】
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を使用する高生産性および低生産性のゲノム中のＩＳ１含量の比較
菌株、ＤＮＡワクチンプラスミドおよび増殖培地については前出の実施例１参照。さらに、不適応の非形質転換細胞はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入しＬＢ培地に維持した。ＨＴＶ ＤＮＡワクチンプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆ（５５４０ｂｐ）の構築は国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２（前出）に詳細に記載されている。ＨＴＶ ＤＮＡワクチンプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌ（７５１６ｂｐ）の構築は国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４、出願日２０００年１２月２１日（国際公開ＷＯ ０１／４５７４８として２００１年６月２８日に公開）に詳細に記載されている。ＨＴＶ ＤＮＡワクチンプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇ（６３７５ｂｐ）の構築は国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２２９３、出願日１９９８年２月３日（国際公開ＷＯ ９８／３４６４０として１９９８年８月１３日に公開）に詳細に記載されている。
【００８０】
ＨＩＶ ＤＮＡワクチン培養物の振盪フラスコ培養およびそのＤＮＡ単離
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇのＨｌＶ ＤＮＡワクチン高生産体（−ＨＰ）および低生産体（−ＬＰ）のクローンを、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に記載された標準高生産体スクリーンを使用して従来同様に単離した。凍結グリセロール予製液の２５μｌのアリコートを使用して２５０ｍｌ振盪フラスコ中の２５ｍｌのＤＭＥ−Ｐ５に接種した。Ｋｕｅｈｎｅｒキャビネット振盪機で３７℃、２２０ＲＰＭで細胞を一夜増殖させ、中期から後期の対数増殖期に採集し、ＤＮＡ単離に使用した。Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌおよびＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆの低生産体（−ＬＰ）クローンは、適応大腸菌ＤＨ５細胞を精製プラスミドＤＮＡで最初に形質転換することによって調製した。形質転換体を回収してＤＭＥ−Ｐ５に平板培養し、振盪フラスコ増殖用の５から１０個の単個コロニーを選択した。対数増殖期の中期から後期に細胞を採取し次サイクルの接種に使用した。このようにして培養物を合計３回継代した。低生産体候補中でプラスミドＤＮＡが増幅できないことは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に記載されているように振盪フラスコ中のフェッドバッチ培養によって確認されており、各構築物あたり１つのクローンを代表的低生産体として保存した。上述したように、これらの凍結グリセロール予製液の２５μｌのアリコートをフラスコ接種に使用し、ＤＮＡ単離用培養物を採取した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して全ＤＮＡを単離した。ＤＮＡペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５に再水和した。Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して高生産性および低生産性サンプルのおのおのからプラスミドＤＮＡを単離した。
【００８１】
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析
非放射性修飾ＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰをＰＣＲによってＤＮＡに組込むために、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＩＳ１特異的プローブ（０．７Ｋｂ）を作製した。プライマーはＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手し、プラスミドｐＩＳ１を鋳型ＤＮＡとして使用した。プライマー配列は以下の通りであった：ＩＳ１−Ｆ２，５’−ＧＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＡＴＴＧ−３’（配列１）；ＩＳ１−Ｒ２，５’−ＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＣＴＴＡ−３’（配列２）。使用したＰＣＲ条件は製造業者の指示通りにした。ＤＮＡ消化用制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。各サンプルから消化した全ＤＮＡおよびプラスミド単独ＤＮＡを０．７％アガロースゲルで３４Ｖ、４℃で一夜（〜１６時間）処理した。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ Ｔｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒ（登録商標） Ｒａｐｉｄ Ｄｏｗｎｗａｒｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を製造業者のプロトコル通りに使用してＤＮＡをＮｙｔｒａｎ ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅナイロン膜に１時間転移させた。ＢｉｏＲａｄ ＧＳ Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋｅｒ（登録商標）（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用し１５０ｍＪｏｕｌｅでＵＶ照射することによってＤＮＡが膜に架橋した。一夜温置を伴うフィルターハイブリド形成プロトコルに従ってＤＩＧ標識ＩＳ１プローブをサザンブロット上の標的ＤＮＡにハイブリド形成させた（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。プローブ−標的ハイブリッドを、抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ抗体およびアルカリホスファターゼ基質ＣＳＰＤを使用するエンザイムリンクト化学発光アッセイによって可視化した（フィルターハイブリド形成プロトコル、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００８２】
結果
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイル
酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩの組合せを使用してＤＮＡワクチン構築物Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌの高生産体および低生産体クローンのＩＳ１特異的ＲＦＬＰ分析用フラグメントを作製した。高生産体クローン（ｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰ）は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に詳述された標準スクリーニング方法によって従来同様に単離され、凍結実用シードバイアルとして得られた。ＤＭＥ−Ｐ５中で増殖させた高生産体（ｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰ）および低生産体（ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰ）培養物に由来の全ＤＮＡプレップを制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩで消化し、各培養物から単離されたプラスミドＤＮＡはＡｆｌＩＩで消化した。また対照として、予めＤＭＥ−Ｐ５に適応させないＬＢ培地中で増殖させたＤＨ５細胞からゲノムＤＮＡを単離した。サザンブロットを調製し、ＤＩＧ標識ＩＳ１プローブとハイブリド形成させた（図３Ａ）。ＤＨ５（レーン２）およびｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰ（レーン４）のサンプルに６つのＩＳ１含有フラグメントが出現する。最も低い分子量のバンドは他のバンドのほぼ２倍の強度を有しており、このバンドが２つ以上のＩＳ１挿入配列を含有することを示唆する。しかしながらこのフラグメントは２Ｋｂ未満であり、２つの７６８ｂｐのＩＳ１挿入を収容できる十分な大きさではない。最も低い分子量バンドのほうが高い濃度であることは、オーバーラップするＩＳ１含有バンドを示している、または、高分子量バンドに比べて小さいフラグメントのほうがＮｙｔｒａｎ膜への転移効率が高いことを表す。従って、非形質転換ＤＨ５のＩＳ１コピー数は６から７という小さい値であろう。ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰのＩＳ１プロファイル（レーン６）は、ＤＨ５対照にもｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰサンプルにも見出されなかった２つの追加ＩＳ１陽性バンドを含有している。ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰプラスミド単独対照（レーン５）との比較に基づくと、これらの２つのうちの高いほうの分子量のバンド（７−８ｋｂ）がプラスミドＤＮＡに符合する。しかしながら低いほうの３−４ｋｂのバンドは他のサンプルでは全く観察されないので、ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰゲノム中に追加のＩＳ１挿入部位が存在することを強く示唆する。
【００８３】
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイル
酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩを使用してＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆクローンのＩＳ１挿入をプロファイリングすると（図３Ｂ）、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌクローン４で得られた結果と同様の結果が得られた。ＤＨ５対照（レーン２）およびｔｐａ−ｎｅｆ−ＨＰ（レーン４）の双方で６つのＩＳ１含有バンドが明白であり、最も小さいバンドが他のバンドよりも高い強度で存在する。ｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰサンプル中では７つのバンドが可視化され、３番目に大きいバンドは他のバンドよりも明らかに高い強度を有している（レーン６）。このクローンをプラスミド単独サンプル（レーン５）に比較すると、ＩＳ１含有プラスミドはＩＳ１を内包するゲノムＤＮＡフラグメントに極めて近接していることが示される。従って、最も高い強度のバンドは実際には、プラスミドおよびゲノムのＤＮＡフラグメントのバンドの重なり合いの結果である。しかしながら、ＤＨ５対照にもｔｐａ−ｎｅｆ−ＨＰサンプルにも見出されない３−４ｋｂのバンドが残っており、これは上記のｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰサンプルで観察された未同定バンドとほぼ同じ大きさである。これは、低生産性ゲノム中のＩＳ１挿入性突然変異の別の指標である。
【００８４】
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイル
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌおよびＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆの双方の低生産体クローンのＡｆｌＩＩ−ＡｇｅＩ ＩＳ１プロファイルが低生産体のゲノム内部の追加ＩＳ１挿入部位を示したので、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇクローンについても試験し、突然変異が３つのＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ構築物全部に存在するか否かを判定した。しかしながらこの場合の高生産体および低生産体クローンのソースはＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌおよびＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆとは違っていた。双方のクローンは何年も前に単離され、それ以来、実験用シード（ラボシードサンプル）として繁殖され、補給を伴う振盪フラスコ（ＳＦＦ）発酵ステージで高生産体スクリーンの対照として役立てられてきた（参照：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出）。従って、これらのクローンのＤＭＥ−Ｐ５接触時間はｔｐａ−ｐｏｌおよびｔｐａ−ｎｅｆクローンよりもはるかに長い。以前に評価された高生産体と同等の継代時間の凍結実用シードバイアル（実用シードサンプル）も分析のために取得した。ＲＦＬＰ結果は、双方の高生産体クローン由来の全ＤＮＡのＩＳ１プロファイルが同様であることを示すが（図３Ｃ）、ラボシードサンプルには、実用シードサンプル中の３番目に大きいフラグメント（レーン４および５）よりもやや高い位置に不鮮明バンド（レーン７および８）が存在する。このバンドは高生産体ラボシードのプラスミド単独サンプル中にも存在し（レーン６）、従ってプラスミドＤＮＡに起因すると考えられる。実用シードのプラスミド単独サンプル中では、もっと明るいバンドがかろうじて視認できる（レーン３）。このＲＦＬＰ分析はＱ−ＰＣＲ結果に符合し（参照、後出、実施例４）、限定培地中の高生産体の培養時間の延長に伴ってＩＳ１含有プラスミドの画分が増加することを示す。双方の高生産体サンプルのゲノムプロファイルは不適応ＤＨ５対照（レーン１）にも類似している。
【００８５】
上述のｔｐａ−ｐｏｌおよびｔｐａ−ｎｅｆサンプルに等価のｔｐａ−ｇａｇ低生産体は入手できなかったので、この場合にはラボシードだけを評価した（図３Ｃ）。ＲＦＬＰ結果は、ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰおよびｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰと同様に、ｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰ ＩＳ１プロファイル中にプラスミドＤＮＡに対応しない追加バンドが存在することを示す（レーン１０および１１）。しかしながらこのバンドは２−３ｋｂであり、他のクローンで観察されるものよりも小さい。ｔｐａ−ｐｏｌおよびｔｐａ−ｎｅｆと違って、ＩＳ１プローブはｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰサンプルから単離されたプラスミドＤＮＡに結合しなかった（レーン９）。高生産体スクリーンのＳＦＦステージ用低生産体対照という役割のｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰラボシードは、１ｍｇの乾燥細胞重量（ＤＣＷ）あたり＜＜１ｍｃｇのプラスミドＤＮＡを終始産生するが、ｔｐａ−ｐｏｌおよびｔｐａ−ｎｅｆの低生産体は〜２ｍｃｇプラスミドＤＮＡ／ｍｇ ＤＣＷを含有していた。後者の値はランダムに選択した低生産体でより典型的である。従って、ｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰに見出された挿入性突然変異はｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰおよびｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰに見出されたものとは違っている可能性があり、その結果として、クローンのプラスミドＤＮＡ増幅能力にいっそう大きい影響力を有しているコピー数抑制表現型が生じる。
【００８６】
ＤＭＥ−Ｐ５に適応した大腸菌ＤＨ５のＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイル
３つの異なるＤＮＡワクチン構築物の高生産体および低生産体のＩＳ１プロファイルは、全部の低生産体クローンがＩＳ１挿入性突然変異を含有するが、高生産体は不適応ＤＨ５と同様であることを示す。適応の結果としてゲノムのＩＳ１のコピー数が増加する可能性がある。これを試験するために、ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩによるゲノムＤＮＡの消化後に不適応ＤＨ５およびＤＭＥ−Ｐ５適応ＤＨ５の双方のＩＳ１プロファイルを分析した（図３Ｃ）。ＲＦＬＰ結果は、２つの大腸菌ゲノムのＩＳ１の場所に違いがないことを示す（レーン１および２）。従って、低生産体はゲノムのＩＳ１挿入性突然変異に相関関係を有しており、この挿入は形質転換段階後に生じると考えられる。
【実施例３】
【００８７】
Ｖ１Ｊｎｓプラスミド中のＩＳ１トランスポゾン組込み部位
材料および方法
ＤＭＥ−Ｐ５中で繁殖したＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆクローンＮＬＢ−５に由来のプラスミドＤＮＡは実施例１に記載の手順で得られた。挿入非含有の完全プラスミドに相補的な合計１６のオリゴヌクレオチドプライマーを順方向（８）および逆方向（８）の双方で〜７００ｂｐ増加としてアニーリングするように設計した。第二セットのプライマーはＩＳ１挿入配列の順方向端および逆方向端に特異的であった。一連のＰＣＲ反応を以下の構成に設定した：（ｉ）１６のＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆ特異的プライマーの１つと２つのＩＳ１特異的プライマーの１つ、（ｉｉ）鋳型としてクローンＮＬＢ−５プラスミドＤＮＡ、（ｉｉｉ）ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）。ＰＣＲ反応は標準プロトコルで行った。各サンプルを０．７％アガロースゲルで分析して増幅フラグメントを同定した。増幅フラグメントの存在はベクター−ＩＳ１接合を表す予備指標であるが、ミスプライミングイベント（擬陽性）の可能性は排除できない。使用したプライマーはプラスミドＤＮＡの双方のストランドおよびトランスポゾンの可能な双方の挿入方向をカバーしたので、相補的ストランド上の同じ挿入の増幅に符合する第二増幅フラグメントの存在を使用して擬陽性の可能性を削減した。確認された増幅フラグメントのサイズが予備挿入マップを与えた。次に、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングするいくつかの増幅フラグメントを選択し、その後Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して配列決定し、ＩＳ１挿入の正確な場所および配向を同定した。
【００８８】
結果
１つのＩＳ１特異的プライマーと１つのＶ１Ｊｎｓ特異的プライマーとによる一連のＰＣＲ反応を使用し、引き続いて増幅産物を配列決定し、ＮＬＢ−５クローンを使用してＩＳ１挿入場所を同定した（実施例１参照）。部分接合および完全接合の双方が分解され、配列決定によって、トランスポゾンが９ｂｐの標的複製を挿入部位に産生することが確認された。１１の非反復組込み部位が双方の配向のトランスポゾンの挿入と共に同定された。１つの挿入部位が双方の配向で観察された、全部の部位がネオマイシン耐性遺伝子ｎｐｔＩＩのコーディング領域の８５塩基対中またはその内部に存在していた。ＩＳ１挿入は、ｐＵＣ１９のａｍｐＲ遺伝子（ｂｌａ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をｐＵＣ４ＫのｎｅｏＲ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で置換することによって構築されたｐＵＣ−ｎｅｏクローンには見出されなかったので、ネオマイシン耐性遺伝子の存在だけではプラスミド分子に転位を誘発するために十分でない。
【実施例４】
【００８９】
リアルタイムＱ−ＰＣＲを使用するプラスミドコピー数に基づくＩＳ１の相対的定量
菌株、ＤＮＡワクチンプラスミドおよび増殖培地−前出の実施例１および２参照。
プラスミド標準の構築
すべての分子生物学操作は標準プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，前出）に従って行った。酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。ｐＵＣ−ｎｅｏはｐＵＣ１９のａｍｐＲ遺伝子（ｂｌａ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をｐＵＣ４ＫのｎｅｏＲ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で置換することによって構築した。トランスポゾンを含有するプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆのサンプルからＩＳ１の７６８−ｂｐ配列をＰＣＲ−増幅した。該フラグメントをｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしたＩＳ１プラスミド標準ｐＩＳ１を作製し、次いで制限酵素ＥｃｏＲＩを使用して切り出し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してｐＵＣ−ｎｅｏのＥｃｏＲＩ制限部位に結合してプラスミド標準ｐｎＩＱ１を作製した。部分的ＣＭＶプロモーターはＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆから０．７ＫｂのＳｐｅＩ−ＳｐｈＩフラグメントとして抽出し、ＸｂａＩおよびＳｐｈＩで二重消化したｐｎＩＱ１に結合させてプラスミド標準ｐｎＩＱ２を作製した。２３ｓ ｒＤＮＡのフラグメントは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録番号Ｍ２５４５８）の大腸菌Ｋ−１２配列用に設計された以下のプライマーを使用してＤＨ５ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した：２３ｓ−Ｆ１（５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＴＴＣＧＡＣＡＣ−３’：配列９）および２３ｓ−Ｒ１（５’−ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣ−３’：配列１０）。結合を促進するために２３ｓ ｒＤＮＡフラグメントの両端にＢａｍＨＩ制限部位（下線）を含ませた。０．３ＫｂのＰＣＲフラグメントをｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（プラスミドｐ２３ｓＴＡ）にクローニングし、次いでＢａｍＨＩで切り出し、ｐｎＩＱ２のＢａｍＩ部位に結合して最終プラスミド標準ｐｎＩＱ３ｖ２を作製した（図４）。このプラスミドは、完全ＩＳ１配列とＣＭＶプロモーターおよび２３ｓ ｒＤＮＡ配列の部分とを含有しており、これらのすべてがＱ−ＰＣＲアッセイの標的である。プラスミド標準のＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍのＵＶ吸光度（Ａ２６０＝１〜５０μｇ／ｍＬ）によって測定し、標準溶液を得るために１０３−１０８コピー／μＬの希釈液を調製した。
【００９０】
ＤＨ５（Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆ）の振盪フラスコ培養−前出の実施例２参照。
リアルタイム定量的ＰＣＲ−配列検出プライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ．２．０を使用して設計された。非標識プライマーはＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から購入し、蛍光標識プローブはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＴａｑＭａｎプローブは、鋳型ＤＮＡのプライマー間にアニーリングするように設計し、リポーター色素６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが専有権をもつ色素“ＶＩＣ”を５’端、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を３’に含ませた。プライマーＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（５’−ＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡ−３’；配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（５’−ＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴ−３’；配列４）とＶＩＣ−標識ＴａｑＭａｎプローブＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（５’−ＶＩＣ−ＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧ−３’−ＴＡＭＲＡ；配列５）とはＣＭＶプロモーターをマーカーとして用いてプラスミドＤＮＡを定量するように設計した。プライマーＩＳ１−Ｑ−Ｆ（５’−ＡＧＧＣＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＣＣＣＣＡ−３’；配列６）およびＩＳ１−Ｑ−Ｒ（５’−ＡＣＧＧＴＴＧＴＴＧＣＧＣＡＣＧＴＡＴ−３’；配列７）とＦＡＭ−標識ＴａｑＭａｎプローブＩＳ１−Ｑ−Ｐ２（５’−ＦＡＭ−ＣＧＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧ−３’−ＴＡＭＲＡ；配列８）とはＩＳ１を定量するように設計した。ＣＭＶおよびＩＳ１プライマー−プローブセットは、全プラスミドおよびトランスポゾンコピーを定量するために多重モードで使用した。
【００９１】
残留ゲノムＩＳ１の判定に使用する第二アッセイを進めるために、２３ｓ ｒＤＮＡを定量するプライマーおよびプローブを以下のように設計した：２３ｓ−Ｆ１Ｄ（５’−ＧＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＧＡＴＡＣＡＧ；配列１１）、２３ｓ−Ｒ１Ｄ（５’−ＧＴＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣＡＴＣＧＡ；配列１２）およびＦＡＭ−標識ＴａｑＭａｎプローブ２３ｓ−Ｐｆａｍ（５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＣＧＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＧ−ＴＡＭＲＡ；配列１３）。残留ゲノムＤＮＡアッセイでは２３ｓ ｒＤＮＡおよびＣＭＶプライマー−プローブセット（上記参照）を多重モードで使用した。
【００９２】
ＰＣＲは２０μＬ反応容量中に一定容量の１０μＬの２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および２μＬのサンプルＤＮＡ、および、種々の量のプライマーおよびプローブを使用して行った。３８４−ウェルプレートフォーマットを６つのｐｎＩＱ３ｖ２標準の１０倍希釈液と共に使用し、サンプルあたり４から６の重複を行った。サンプルの増幅および蛍光検出はＡＢＩ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で以下の熱サイクル条件で行った：５０℃で２分、９５℃で１０分、次いで、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４０サイクル。
【００９３】
リアルタイム定量的ＰＣＲの分析
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ配列検出システム（ＳＤＳ）ｖ．２．０ソフトウェアを使用してデータ解析を完了した。ＰＣＲ閾値サイクル数（ＣＴ）は、サンプルの蛍光がユーザー限定閾値限界に交差した増幅プロット上の点から計算した。絶対的定量実験では、コピー数対ＣＴの標準曲線プロットを使用して鋳型コピー数を計算した。サンプルの相対的定量は、２−ΔΔＣＴ法（Ｌｉｖａｋ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４０２−４０８）を使用して行った。簡単に説明すると、内在基準に正規化され校正サンプルｃｂに相対的なサンプルｑについて、
【００９４】
【数１】
式中、
ΔＣＴ＝ＣＴ，Ｘ−ＣＴ，Ｒ、標的分子と基準分子との閾値サイクルの差、
ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ，ｑ−ΔＣＴ，ｃｂ、
ＸＮ＝内在基準（Ｒ０）に相対的な標的の正規化量（Ｘ０／Ｒ０）、
Ｅ＝反応の増幅効率。
【００９５】
これらのコピー比アッセイで、ＩＳ１（または２３ｓ ｒＤＮＡ）は標的配列であった。ＣＭＶプロモーターは内在基準であった。全部の未知サンプルは標準物質であるプラスミド標準ｐｎＩＱ２またｐｎＩＱ３ｖ２に比較した（全標的のコピー比１：１）。この方法が正確であるためには、２つの仮定が妥当でなければならない。第一に、すべての反応の増幅効率がほぼ１００％でなければならない。Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用するプライマーおよびプローブの設計はこの要件を満たす高効率試薬を産生した。第二に、標的および内在基準の双方の効率がほぼ同等でその差が０．１以下でなければならない。
【００９６】
プラスミド定量の標的となるＣＭＶプロモーターの配列妥当性検査
完全Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆプラスミドのこれまでのスキャンでは１１の非反復ＩＳ１挿入部位が同定され、これらはいずれもネオマイシン耐性遺伝子の翻訳領域の１００塩基対中または内部に存在しＣＭＶプロモーターから＞５５０塩基対が除去されていた（実施例３）。このプロモーターがＱ−ＰＣＲ標的として（すなわち、ＩＳ１挿入非含有鋳型として）適性を有することを確認するためにＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆのこの領域のＩＳ１挿入を再度試験した。所期の増幅配列内部で挿入が生じるならば、ＣＭＶプライマーおよびプローブは結合せず、コピー数比の計算に有意な誤差が生じるであろう。トランスポゾンを含有することがわかっているＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆのサンプルを鋳型ＤＮＡとして使用し、ＣＭＶプロモーターに相補的な３つのプライマーの１つとＩＳ１の末端に特異的な２つのプライマーの１つとを用いてＰＣＲ反応を行った。挿入配列（７６８ｂｐ）よりも大きいアンプリコンはＩＳ１−プラスミド連結を含有するであろう。しかしながら、プライマーの非特異的結合が擬陽性を生じるであろう。ＣＭＶプロモーター配列に沿った多数の点でプライマーを使用することによって、相補的プライマー対が類似結果を生じないならば非特異的結合に由来の増幅フラグメントは除去できる。０．７Ｋｂよりも大きい５つのアンプリコンが得られたが、２つ以外は上記の判断基準によって非特異的結合の結果として除去された。最後の２つを配列決定し、ＩＳ１挿入がＣＭＶプロモーターの上流のネオマイシン耐性遺伝子の翻訳領域またはその近傍の部位に存在することが知見された。２つの部位の１つは過去の記録がある。従って、ＣＭＶプロモーター領域は、トランスポゾンからの妨害を懸念することなくＱ−ＰＣＲアッセイ中に蛍光プローブの標的として使用できる。
【００９７】
単一反応および多重反応用プライマー−プローブ濃度の最適化
最小量の試薬で最低閾値サイクル（ＣＴ）が得られるように双方の標的配列セット用のプライマーおよびプローブの濃度を最適化した。双方のアッセイの単一反応および多重反応用のＩＳ１、２３ｓ ｒＤＮＡおよびＣＭＶプロモーターなどのプローブ濃度は２００ｎＭに最適化された。ＣＭＶ−Ｑプライマーは１００ｎＭという最適濃度でＩＳ１／ＣＭＶおよび２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶの双方のアッセイで多重化中のスペクトル干渉を減少させることが知見された。次に、ｐＩＳ１またはｐ２３ｓＴＡとＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇ（ＣＭＶプロモーター標的）との調節比混合物に対してＣＭＶプライマー−プローブセットを用い、双方のアッセイのＩＳ１および２３ｓ ｒＤＮＡ用の目標プライマー濃度を多重反応中の１００から７００ｎＭまでの範囲で試験した。５００ｎＭのＩＳ１−Ｑは、ＩＳ１−およびＣＭＶ−単独反応から決定したコピー比に比較したときにＣＭＶ−Ｑプライマーとの多重反応中に最も正確な結果を与え、２００ｎＭの２３ｓ ｒＤＮＡプライマーは、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶ多重反応中に同等の正確度を与えた（データ示さず）。
【００９８】
Ｑ−ＰＣＲアッセイ感度
ＩＳ１／ＣＭＶおよび２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶの双方の多重Ｑ−ＰＣＲアッセイの感度試験を行った。プラスミドＤＮＡに相対的な２３ｓ ｒＤＮＡの定量をスペクトル干渉が有意に阻害する点を決定するためには、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶ Ｑ−ＰＣＲコピー比アッセイで広い分析範囲にわたる２３ｓ ｒＤＮＡ対ＣＭＶフラグメント比を使用する必要がある。プラスミドがＣＭＶプロモーター鋳型のソースであるならば、プラスミド調製物中の残留ゲノムＤＮＡが試験できる比の範囲を限定する。従って、プラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇのＣＭＶプロモーター領域をＰＣＲ増幅し（プライマー５’−ＣＡＣＴＧＴＴＡＧＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣ−３’（配列１４）および５’−ＴＧＡＣＧＡＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＧＡＧ３’（配列１５））、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶ比を＜１．７×１０−５に減少させた。次に、増幅ＣＭＶプロモーターフラグメントをＣＭＶ鋳型として使用し１：１から１：１０５の２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶ比のサンプルを調製した。試験した全部のサンプルの単一および多重（ＣＭＶプライマー−限定）反応結果は同等であり、応答は５桁まで直線状であった（図５）。ＩＳ１／ＣＭＶの感度も同様にして、１０８コピーのＣＭＶプロモーターフラグメント／μＬに組合せた１０３−１０８コピーのｐＩＳ１／μＬの混合物を使用して試験し、すべての比のサンプルについて単一反応および多重反応の双方で同等の結果を得た。従ってアッセイは、１コピーのＣＭＶあたり１：１０５（０．００１％）コピーのＩＳ１または２３ｓ ｒＤＮＡという定量限度が適正であった。
【００９９】
Ｑ−ＰＣＲアッセイ感度対アガロースゲル電気泳動−ＩＳ１トランスポゾンは、複合培地から限定培地にシフトされ〜３０継代培養された培養物から単離したプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆの実験サンプル中で最初に観察された（実施例１参照）。これらの１０個のクローン（サンプルＮＬＢ−１からＮＬＢ−１０）に由来のプラスミドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析は、高分子量バンドの出現に基づいて少なくとも５つのクローンにトランスポゾンの存在を示した（図１Ｂの星印の付いたレーン；実施例１も参照）。１０個のＮＬＢサンプル全部をＩＳ１／ＣＭＶコピー比アッセイで分析した（表１参照）。７つのサンプルが＞１％のＩＳ１−陽性プラスミドＤＮＡを含有していた。視認できるトランスポゾンを含む５つのサンプルは＞５％のＩＳ１−陽性分子を含有していた。これらの結果は、アガロースゲルの臭化エチジウム染色で異常を可視化するためには５から１０％のオーダのプラスミドＤＮＡが変質しなければならないことを示す。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
要約
ＩＳ１／ＣＭＶ Ｑ−ＰＣＲコピー比アッセイは、ＤＮＡワクチンクローンの特性を解明するための有効なツールである。該アッセイは高度に特異的である。該アッセイは、特別設計のオリゴヌクレオチドプライマーおよび蛍光プローブを頼りにしてＩＳ１トランスポゾン含有サンプル、ＩＳ５のような他のトランスポゾン含有サンプルおよびトランスポゾン陰性サンプルを容易に識別できる。２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶコピー比アッセイの採用は特異性をいっそう強化し、ＩＳ１トランスポゾン活性の増加を正確に定量できる。Ｑ−ＰＣＲテクノロジイによって与えられる高レベル感度は、少なくとも１００コピー／μＬ（Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆの場合０．６ｐｇ／ｍｌ）という低濃度の標的を検出すると共に。鋳型ＤＮＡ濃度の６対数にわたるＩＳ１転位の定量を可能にする。
【実施例５】
【０１０２】
ゲノムＤＮＡ中のＩＳ１挿入性突然変異の同定
有力な高生産性クローンを単離する従来のスクリーニング方法は、２８から３０℃で約４８時間温置後にコロンビア血液寒天プレートに出現する“グレー”クローンと“ホワイト”クローンとの形態学的差異を基盤とする（同時係属国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１，前出参照）。線毛形成に関する遺伝子の挿入配列突然変異はコロニー形態学に影響を与えることが知られている（Ｌａ Ｒａｇｉｏｎｅら，１９９９，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７５：２４７−２５３；Ｓｔｅｎｔｅｂｊｅｒｇ−Ｏｌｓｏｎら，２０００，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８２：３１９−３２５）。さらに、ｆｉｍＡ遺伝子の調節配列の１つの領域の逆位によって生じる位相転換も線毛の発現の違いに導く（Ｓｔｅｎｔｅｂｊｅｒｇ−Ｏｌｅｓｅｎら，２０００，前出）。ＰＣＲを使用し、ｆｉｍＢＥＡオペロンおよびｃｓｇＢ遺伝子中の挿入要素の存在をナイーブＤＨ５細胞およびＤＭＥ−Ｐ５適応ＤＨ５細胞中で２８から３０℃および３７℃で試験した。適応細胞は血液寒天プレート上で２８から３０℃と３７℃との間に形態学的転換を示す。従って、線毛遺伝子の違いはこの転換に相関関係を有するものであろう。双方の細胞の３７℃の振盪フラスコ培養物と双方の温度の静止（血液寒天で増殖）培養物とから単離したゲノムＤＮＡを使用すると、ｆｉｍＡ位相転換についても挿入要素についてもサンプル間の違いは観察されなかった。それぞれ代表的な高生産体および低生産体であるｔｐａ−ｇａｇ−ｇｒａｙおよびｔｐａ−ｇａｇ−ｗｈｉｔｅのプロファイリングでも違いは観察されなかった。注目すべきは、ＩＳ１挿入が大部分のｆｉｍＥ遺伝子と上流配列とを含む増幅領域の制限消化物に基づいて同定されたことである（図６、領域Ｐ１’−Ｐ３’間）。この部位は、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な非病原性Ｋ−１２株ＭＧ１６５５またはＷ３１１０の公表された大腸菌配列に報告されていない。周囲のＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩ制限部位に基づくとこのＩＳ１挿入を含有するフラグメントは〜２．３Ｋｂまたは〜１．７Ｋｂの長さであろう。後者のフラグメント長は形質転換菌株およびプラスミド非含有菌株の双方のＲＦＬＰプロファイルの最小バンドに符合する（実施例２参照）。挿入が全部のサンプルに見出され、関連フラグメントが以後のＩＳ１特異的酵素による消化で同等のバンドを生成したので、観察されたコロニー形態学的差異の原因が挿入配列にあるとは考え難い。
【０１０３】
ｐＭＣＳ２クローニングベクターの構築
ネオマイシン耐性を与えるｐＵＣ１９−に基づくベクターを構築した（ｐＵＣ−ｎｅｏ）。ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のａｍｐＲ遺伝子（ｂｌａ）をｐＵＣ−４Ｋプラスミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から採取したｋａｎＲ／ｎｅｏＲ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）によって置換した。ｐＵＣ１９中のａｍｐＲ遺伝子は、制限酵素ＡｈｄＩ（Ｅａｍ１１０５１）およびＳｓｐＩで消化することによって除去し、ｎｅｏＲ遺伝子は制限酵素ＰｓｔＩで消化することによってｐＵＣ−４Ｋプラスミドから除去した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを使用して双方のフラグメントに平滑末端を設けた。複製機構を含有する１．８ｋｂのｐＵＣ１９フラグメントとｐＵＣ−４Ｋに由来のｎｐｔＩＩ遺伝子を含有している１．２ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製し、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたプラスミドをスクリーニングして出発ｂｌａ遺伝子と同じ配向でｎｐｔＩＩ挿入を含むプラスミドを同定し、ｐＵＣ−ｎｅｏの構築を完成した。
【０１０４】
ｐＭＣＳ２を構築するために、ＥｃｏＲＩ、ＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩ（５’から３’への方向）の制限部位を大腸菌のｈｉｓＣ遺伝子を増幅する順方向プライマーの５’端に組込んだ（ＭＣＳ２−ｈｉｓＣ−Ｆｏｒ：５’−ＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣ−３’；配列１６）。ｈｉｓＣ遺伝子はこのために任意に選択した。ＸｂａＩ、ＡｇｅＩおよびＢａｍＨＩ（５’から３’への方向）部位は同様にして逆方向プライマーに組込んだ（ＭＣＳ２−ｈｉｓＣ−Ｒｅｖ：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＣＧＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＴＣＧＡＴＡＡＡＡＡＧＡＴＡＣ−３’；配列１７）。ＰＣＲ増幅を使用し、ＡｆｌＩＩとＡｇｅＩとを含有しＢａｍＨＩ部位間にｈｉｓＣ遺伝子が介在している新しいマルチクローニング部位から成る１．１Ｋｂフラグメントを作製した。ｈｉｓＣ遺伝子は長い結合性フラグメントを与えるために含有させたものであり、ＢａｍＨＩ部位はこの遺伝子を除去してブルー／ホワイト選択用のｌａｃＺα ＯＲＦを回復するために使用した。得られたフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に結合させた。１．１ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを切り出し、ｐＵＣ−ｎｅｏに首尾よく結合させた。得られたプラスミドｐＭＣＳ２−ｈｉｓＣをＢａｍＨＩで消化してｈｉｓＣ遺伝子を除去し、最大（３．１Ｋｂ）のフラグメントをゲル抽出し再結合させてプラスミドｐＭＣＳ２を形成した。上述のように、ｐＭＣＳ２マルチクローニング部位は、ｌａｃＺα遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）を保存するように設計しブルー−ホワイト選択を維持した。ｐＭＣＳ２結合の形質転換体を、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを補充したＬＢ／ｎｅｏ寒天に回収すると、得られたコロニーはブルーであり、ｌａｃＺ ＯＲＦが保存されていることを示した。次にベクターｐＭＣＳ２を部分的配列決定して多重クローニング部位の構造を確認した。
【０１０５】
ＩＳ１挿入部位のスクリーニング
ＲＦＬＰ分析は、問題の挿入性突然変異がゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｇｌＩＩおよびＡｇｅＩで消化したときの〜３および４Ｋｂの制限フラグメントに存在することを示した（実施例２参照）。ゲノムＤＮＡの挿入性突然変異の（１つ以上の）部位を同定する戦略は、以下の段階に従って関連クローンからゲノムＤＮＡのライブラリーを収集しスクリーニングする操作から構成される。
１．ＩＳ１挿入性突然変異を示すと同定された低生産性クローンからゲノムＤＮＡを抽出する。選択した方法次第では、ゲノムＤＮＡの抽出によってプラスミドＤＮＡを含む混合物が得られるであろう。
２．ＤＮＡをＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩで消化して先に同定した３から４ＫｂのサイズのＩＳ１含有制限フラグメントを作製する。
３．制限フラグメントのプールから所望サイズのフラグメントを抽出する。これは例えばフラグメントをサイズに基づいて分離するゲル電気泳動、次いで所望範囲のフラグメントを含有するゲル部分の切り出し、および切り出したゲルからのフラグメントの単離という順序で行うとよい。プラスミドＤＮＡが出発ゲノムＤＮＡ調製物中に維持されているならば、所望のゲノムＤＮＡフラグメントを混合物から単離して、直鎖化プラスミドＤＮＡの再結合および形質転換に付随する高いバックグラウンドを除去しなければならない。
４．所望のフラグメントのプールを、制限酵素ＡｇｌＩＩおよびＡｇｅＩで直鎖化したベクターの多重クローニング部位に結合させる。ベクターｐＭＣＳ２はこの目的で作製した（上記参照）。結合させたプールを使用してコンピテント大腸菌細胞を形質転換させる。形質転換体は高速増殖および維持に好適な固体ＬＢまたは他の複合培地で繁殖させることができる。
５．得られたライブラリーのスクリーニングはいくつかの方法で行うことができる。非限定例は、（ａ）ＩＳ１特異的Ｑ−ＰＣＲアッセイの使用、および、（ｂ）ＩＳ１プラスミド接合特異的コロニーまたはプラスミドＰＣＲを含む。これらの有力なスクリーニング方法をより詳細に以下に記載する。
【０１０６】
ゲノムＤＮＡライブラリーのＩＳ１特異的ＱＰＣＲアッセイ
上述のようにゲノムＤＮＡライブラリーを構築するために作製されたベクターｐＭＣ３２は、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）を含有している。ｐＭＣ３２ベクターに結合したＩＳ１陽性ゲノムＤＮＡフラグメントから構成されるライブラリーのプラスミドはＩＳ１とｎｅｏＲとを１：１比で含有するであろう。ＩＳ１陰性プラスミドは残留ゲノムＤＮＡに由来のバックグラウンド量のＩＳ１だけを含有するであろう。ｐＭＣ３２は高コピー数プラスミドなのでゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１の画分はプラスミドＤＮＡに起因する量に比べて少ないはずである。従って、実施例４に記載したものと同様のＱ−ＰＣＲアッセイは精製プラスミドＤＮＡまたは全細胞に対して実行できる。Ｑ−ＰＣＲアッセイは以下のプライマー／プローブ配列を使用して多重モードでＩＳ１：ｎｅｏＲコピー比を判定できると考えられる。
ＩＳ１プライマー／プローブセット：
ＩＳ１−Ｑ−Ｆｏｒ：５’−ＡＧＧＣＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＣＣＣＣＡ−３’（配列１８）；
ＩＳ１−Ｑ−Ｒｅｖ：５’−ＡＣＧＧＴＴＧＴＴＧＣＧＣＡＣＧＴＡＴ−３’（配列１９）；および
ＩＳ１−Ｑ−Ｐｒｏｂｅ：５’−ＶＩＣ−ＣＧＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列２０）
ｎｅｏＲプライマー／プローブセット：
ｎｅｏ−Ｑ−Ｆｏｒ：５’−ＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＣＣＣＴＣＧＴＣＡ−３’（配列２１）；
ｎｅｏ−Ｑ−Ｒｅｖ：５’−ＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＴＣＴＧ−３’（配列２２）；および
ｎｅｏ−Ｑ−Ｐｒｏｂｅ：５’−ＦＡＭ−ＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＣＧＡＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列２３）。
【０１０７】
最初に多重最適化実験を行って、ＩＳ１およびｎｅｏの双方のプローブを２００ｎＭにしてＩＳ１−Ｑプライマーは１００ｎＭおよびｎｅｏ−Ｑプライマーは３００ｎＭという最適プライマー濃度を同定した。これらの条件は、１００ｎＭから４００ｎＭの範囲のｎｅｏ−Ｑプライマー濃度を試験しながらＩＳ１−Ｑプライマー濃度を１００ｎＭに限定することによって決定した。ＩＳ１−Ｑは多重プライマー最適化実験を通じて、特にｎｅｏ−Ｑプライマー濃度を限定したとき、ｎｅｏ−Ｑにマイナスに影響することを示した。新しく最適化した値でもＩＳ１−Ｑスペクトル干渉はまだｎｅｏ−Ｑ閾値サイクル（ＣＴ）値を０．１％ＩＳ１／ｎｅｏコピー比で７０％まで変化させるが、結果は十分にスクリーンに必要な許容差の範囲内である。
【０１０８】
ＩＳ１：プラスミド連結に特異的なコロニーおよびプラスミドＰＣＲ−全細胞および精製プラスミドＤＮＡの双方がゲノムＤＮＡを含有すると予想されるので、ＩＳ１陽性ゲノムＤＮＡフラグメントがプラスミドライブラリーに存在するか否かにかかわりなく、ＩＳ１特異的ＰＣＲは全サンプルから増幅するという結果を与えると予想される。しかしながら、１つのプラスミド特異的プライマーと１つのＩＳ１特異的プライマーとを使用するＰＣＲは、組換プラスミドがＩＳ１フラグメントを含有するときにのみシグナルを生じる。プラスミド特異的プライマーはいくつかの方法で設計できる。該プライマーは、トランスポゾンがフラグメントの対向末端の近くに存在するときに〜４Ｋｂまでの不都合に大きいアンプリコンサイズを回避するために挿入部位（すなわち、ＡｆｌＩＩ−ＡｇｅＩ認識部位）の近傍のプラスミドの領域にアニーリングできる。この場合、充分な増幅を確保するために、長い標的の増幅に有利な傾向のポリメラーゼを使用する。あるいは、異常に小さいフラグメントの増幅を避けるために、プライマーは挿入部位から除去された領域のどちらの側にもアニーリングできる。いずれの場合にも、ＩＳ１：プラスミド接合の同定にＰＣＲを使用するアッセイでは、プライマー設計の際にＩＳ１の異なる配向の可能性を考慮することが重要である。この問題の解決としては、双方の配向のトランスポゾン挿入の検出を確保するために、トランスポゾンの中央領域に相補的であるがどちらかの方向に伸長する２つのＩＳ１特異的プライマーを使用する。内部プライマーの使用も少なくとも〜３８０ｂｐの標的の増幅を確保する。このスクリーニングアッセイはＩＳ１：プラスミド連結に特異的なので、全細胞（“コロニーＰＣＲ”）または精製プラスミドＤＮＡで行うことができる。ゲノムＤＮＡに存在するＩＳ１がシグナルを返すとは考えられない。
【実施例６】
【０１０９】
高生産性クローン用のゲノムに基づく高スループットスクリーン
実施例２に開示したＲＦＬＰプロファイルは、低生産性ＤＮＡワクチンクローンとゲノムＤＮＡのＩＳ１挿入性突然変異との間の相関関係を示した。従って、高生産性クローンの高スループットスクリーンは、挿入性突然変異を内包しないクローンの選択および同定から構成されるであろう。このようなスクリーンには、例えば実施例５に記載のような突然変異／挿入部位の同定が必要であろう。その後、このスクリーニングプロセスのためにいくつかのアッセイを開発できた。
【０１１０】
ＴａｑＭａｎのＱ−ＰＣＲに基づく高スループットスクリーン
ＩＳ１突然変異を内包しない細菌クローンを同定するＴａｑＭａｎ Ｑ−ＰＣＲ高スループットアッセイの一例は、２つのプライマーと蛍光シグナル増幅用の１つの内部プローブとを必要とする（図７Ａに概略図として示す）。ＩＳ１挿入突然変異がゲノムＤＮＡ内部に同定された単一の部位に局在するならば、ＴａｑＭａｎプローブはゲノムのこの部分を認識するように設計できる。相補的プライマーを使用する増幅は、その結果として前述のようにプローブの分解に因る蛍光シグナルを蓄積するであろう（実施例４参照）。問題の部位のＩＳ１挿入の存在は結合部位を破壊し、蛍光の蓄積を阻止するであろう。従って、有力な高生産性クローンは増幅シグナルを与えるが、低生産体は系の固有ノイズに起因するバックグラウンド蛍光だけを示すであろう。アッセイは多重化を必要とせず、全細胞溶解液を使用して行うことができるので、ゲノムＤＮＡ単離の必要性が削除される。ＴａｇＭａｎプローブは典型的には約１５から約４０ヌクレオチドの範囲の様々な長さを有し得る。従って、ゲノムＤＮＡ特異的プローブの適正結合を確保するためにＩＳ１突然変異の同定ホットスポットは配列の狭い範囲、好ましくは１０ヌクレオチド以内に局在しなければならない。
【０１１１】
ＩＳ１：ゲノム連結のＰＣＲアッセイ
挿入部位がゲノムＤＮＡの極めて狭い領域に局在していないならば、ＩＳ１：ゲノムＤＮＡ連結を同定するために内部プローブを使用しないＰＣＲアッセイを使用できる。１つのプライマーはＩＳ１挿入ホットスポットから除去された短いゲノムＤＮＡにアニーリングするように設計できる。第二のプライマーはトランスポゾンにアニーリングしなければならない。挿入が存在するならば（すなわち、推定“低生産体”）、ＩＳ１：ゲノムＤＮＡ連結に対応する増幅フラグメントが産生されるであろう。目標サイズのフラグメントを同定するために得られた増幅産物を目視分析できる。あるいは、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎのような色素をアッセイに加えてリアルタイムＰＣＲ計器を使用し、対応する蛍光増加に基づいて有力な高生産性クローンを同定できる（例えば、蛍光の欠如はＩＳ１挿入の欠如−推定“高生産体”を表す指標である）。同様に、蛍光の指数関数的増加を測定するために蛍光発生ＬＵＸＴＭプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用できる。この場合、ＬＵＸＴＭプライマーに由来のシグナルは単一プライマーの伸長から発生するのでゲノム：ＩＳ１連結のないクローン中でも蛍光シグナルが予想されることに留意されたい。しかしながら、シグナル増幅フラグメントを産生する相補的プライマーが存在しないのでシグナルは指数関数的でなく一次関数的に増加する。
【０１１２】
増幅フラグメントを目視分析する必要性を回避するために、同定された挿入突然変異をゲノム中の７つの静止ＩＳ１コピーから十分に除去して擬陽性を防止しなければならない。実施例２に開示したＲＦＬＰプロファイルに基づくと、干渉を生じる突然変異に静止コピーが十分に近接していれば擬陽性は出現しない。このアッセイはまた、突然変異がどちらの配向でも挿入され得る可能性があることを考慮しなければならない。この分析は、内部ＩＳ１プライマーを双方の配向で使用することによって行うことができる。この場合、サンプル毎に２つの個別アッセイを行ってもよく、または、クローン集団を完全にスクリーニングするために２つのプライマーを同時に使用してもよい。
【実施例７】
【０１１３】
ＤＮＡワクチン産生用最適化菌株の構築
低生産性集団はＩＳ１挿入性突然変異に相関関係を有しているので、ＩＳ１コピーのない大腸菌宿主菌株が高生産性クローンのより均一な集団を生じると考えられる。従って、高生産性クローンの収率を向上させる１つの戦略は、ＩＳ１コピー全部が除去された大腸菌の１つの菌株を構築し、この菌株をＤＮＡワクチンベクターの繁殖に使用することである。Ｐ１ファージ形質導入、トランスポゾン媒介ランダム突然変異原性および普遍（ＲｅｃＡ介在）相同的組換えを含む大腸菌の欠失的または破壊的突然変異を構築するためのいくつかの方法が存在する。これらの方法は典型的には、単一突然変異には適当であるが、多重突然変異では各突然変異に各１つの選択可能マーカー例えば抗生物質耐性が必要なので適当でない。代替方法は、所望破壊部位の周囲のフランキング配列に相同なプライマーに３６−から５０−ｎｔの伸長をもつＰＣＲ産物と、ラムダ−Ｒｅｄリコンビナーゼとの使用を含む（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ ９７：６６４０−６６４５）。この場合にもやはり選択可能マーカーを使用する。しかしながら、マーカーは後で除去することができ、追加の突然変異サイクルではその使用が免除される。残留“瘢痕”を除去する修正方法は、選択可能マーカーを除去するために内在二重鎖の破壊修復プロセスを利用する（Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏら，２００２，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：６４０−６４７）。この方法は、４４のうちの２４の転位可能要素の除去を含みゲノムサイズが８．１％短縮した大腸菌のＫ−１２株を産生するために使用された。この菌株では７つのＩＳ１コピーのうちの３つが除去された。残りの４コピーの除去が菌株の生存適性またはフェッドバッチ発酵プロセスでの使用適性に有害な効果を与えない可能性は極めて高い。しかしながら、Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏらの修正方法は二重鎖の破壊修復プロセスにＲｅｃＡを必要とするので大腸菌ＤＨ５株には適していないことに注目されたい。別の方法はグループＩＩイントロン、いわゆる“ターゲトロン”を使用して相補的配列の１４−から１６−ｎｔ領域に基づく突然変異を生じさせる（Ｚｈｏｎｇら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：１６５６−１６６４）。この方法も選択可能マーカーを使用するが多重挿入ができるように後で除去できる。しかしながら、この方法は、上記の２つの方法のように標的部位の欠失を生じるのでなく破壊を生じるものである。この方法の使用は結果として、トランスポゾンによってコードされている主要トランスポザーゼ遺伝子（ｉｎｓＡＢ）中に破壊された７つの非機能ＩＳ１コピーを内包する菌株を与えるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＬＢ増殖培養物（Ａ）またはＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物（Ｂ）から単離したＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆプラスミドＤＮＡ、ＮＬＢ−１からＮＬＢ−１０（左から右に）を示す。ゲル（Ａ）中の各サンプルレーンは、１０培養物の平均ＯＤ６００が３．７に等しい１ｍｌのＱＩＡＧＥＮ培養プレップから採取した１μｌのプラスミドを含む。サンプルＮＬＢ−１０はレーン１３の分子量マーカーに添加された。ゲル（Ｂ）中の各サンプルレーンは、１０培養物の平均ＯＤ６００が１２．５に等しい１ｍｌのＱＩＡＧＥＮ培養プレップから採取した２μｌのプラスミドを含む。（Ａ）レーン１、５、９、１３および（Ｂ）レーン１、７、１３−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ １ Ｋｂ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）．ｓｃＤＮＡ−スーパーコイルドＤＮＡ。星印の付いたレーンは、視認できるＩＳｌ陽性バンドを含む。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＬＢ増殖培養物（Ａ）またはＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物（Ｂ）から単離したＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆプラスミドＤＮＡ、ＮＬＢ−１からＮＬＢ−１０（左から右に）を示す。ゲル（Ａ）中の各サンプルレーンは、１０培養物の平均ＯＤ６００が３．７に等しい１ｍｌのＱＩＡＧＥＮ培養プレップから採取した１μｌのプラスミドを含む。サンプルＮＬＢ−１０はレーン１３の分子量マーカーに添加された。ゲル（Ｂ）中の各サンプルレーンは、１０培養物の平均ＯＤ６００が１２．５に等しい１ｍｌのＱＩＡＧＥＮ培養プレップから採取した２μｌのプラスミドを含む。（Ａ）レーン１、５、９、１３および（Ｂ）レーン１、７、１３−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ １ Ｋｂ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）．ｓｃＤＮＡ−スーパーコイルドＤＮＡ。星印の付いたレーンは、視認できるＩＳｌ陽性バンドを含む。
【図１Ｃ】図１Ｃは、選択したＮＬＢサンプルのＭｌｕＩ消化を示す。レーン２、４、７、９、１２−ＮＬＢ−１、ＮＬＢ−３、ＮＬＢ−５、ＮＬＢ−７、ＮＬＢ−８；非消化。レーン３、５、８、１０、１３−ＮＬＢ−１，ＮＬＢ−３、ＮＬＢ−５、ＮＬＢ−７、ＮＬＢ−８；消化。レーン１、６、１１、１４−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ １Ｋｂ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図２Ａ】図２Ａは、選択されたサンプル由来のＩＳ１のＰＣＲ増幅を示す。レーン２−ＬＢ増殖ＮＬＢ−１。レーン３−ＤＭＥ−Ｐ５増殖ＮＬＢ−１。レーン４−ＬＢ増殖ＮＬＢ−２。レーン５−ＤＭＥ−Ｐ５増殖ＮＬＢ−２。レーン６−ＬＢ増殖ｐＵＣ１９。レーン７−ＤＨ５ゲノムＤＮＡ。レーン８−ＤＨ５αゲノムＤＮＡ。レーン１、９−ＧｉｂｃｏＢＲＬ １Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＮＬＢ−１およびＮＬＢ−２のＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物から採取したプラスミドプレップを使用したＰＣＲ反応のＭｌｕＩ消化を示す。レーン２、３−ＮＬＢ−１非消化、消化。レーン４、５−ＮＬＢ−２非消化、消化。レーン１、６−ＧｉｂｃｏＢＲＬ １Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、（Ｃ）ＤＭＥ−Ｐ５増殖または（Ｄ）ＬＢ増殖した細胞プレップを使用したＮＬＢ−３からＮＬＢ−１０まで（左から右）のＩＳ１のＰＣＲ増幅を示す。レーン１、６、１１−ＧｉｂｃｏＢＲＬ １Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図２Ｄ】図２Ｄは、（Ｃ）ＤＭＥ−Ｐ５増殖または（Ｄ）ＬＢ増殖した細胞プレップを使用したＮＬＢ−３からＮＬＢ−１０まで（左から右）のＩＳ１のＰＣＲ増幅を示す。レーン１、６、１１−ＧｉｂｃｏＢＲＬ １Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図３Ａ】図３Ａは、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩによるＶｌＪｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイルを示す。レーン１−ｐＩＳ１陽性対照。レーン２−非形質転換ＤＨ５対照。レーン３−ｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰプラスミドＤＮＡ。レーン４−ｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰ全ＤＮＡ。レーン５−ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰプラスミドＤＮＡ。レーン６−ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰ全ＤＮＡ。ＤＩＧ標識分子量マーカーは図示されていないが露光時間の延長に伴って視認可能になる。
【図３Ｂ】図３Ｂは、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩによるＶｌＪｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイルを示す。レーン１−ｐＩＳ１陽性対照。レーン２−非形質転換ＤＨ５対照。レーン３−ｔｐａ−ｎｅｆ−ＨＰプラスミドＤＮＡ。レーン４−ｔｐａ−ｎｅｆ−ＨＰ全ＤＮＡ。レーン５−ｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰプラスミドＤＮＡ。レーン６−ｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰ全ＤＮＡ。ＤＩＧ標識分子量マーカーは図示されていないが露光時間の延長に伴って視認可能になる。
【図３Ｃ】図３Ｃは、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩによる非形質転換ＤＨ５およびＶｌＪｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイルを示す。レーン１−不適応の非形質転換ＤＨ５対照。レーン２−限定培地ＤＭＥ−Ｐ５に適応した非形質転換ＤＨ５。レーン３−ｔｐａ−ｇａｇ−ＨＰ実用シードプラスミドＤＮＡ。レーン４、５−ｔｐａ−ｇａｇ−ＨＰ実用シード全ＤＮＡ。レーン６−ｔｐａ−ｇａｇ−ＨＰ実験用シードプラスミドＤＮＡ。レーン７、８−ｔｐａ−ｇａｇ−ＨＰ実験用シード全ＤＮＡ。レーン９−ｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰプラスミドＤＮＡ。レーン１０、１１−ｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰ全ＤＮＡ。ＤＩＧ標識分子量マーカーは図示されていないが露光時間の延長に伴って視認可能になる。
【図４】図４は、標準ｐｎｌＱ３ｖ２のプラスミドマップを示す。プライマーおよびプローブの結合部位が示されている。
【図５】図５は、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶコピー比アッセイの定量限度の決定を示す。（白丸）１つのプライマー−プローブセットとの反応から決定した比。（黒丸）２つのプライマー−プローブセットとの反応（多重）から決定した比。表示のコピー比を準備するためにプラスミドｐ２３ｓＴＡおよびＰＣＲ−増幅ＣＭＶプロモーターフラグメントを鋳型として使用した。１：１０５コピー比までの直線性が定量限度を確立する。
【図６】図６は、ｆｉｍＢＥＡオペロンの概略図を示す（配列詳細に関してはＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｙ １０９０２参照）。オペロンの様々な領域をＰＣＲ増幅するために使用したプライマーの場所は、公表された報告書に基づいて選択されたプライマー場所Ｐ１’、Ｐ１’−Ｒｅｖ、Ｐ３’、Ｐ３’−Ｒｅｖ、Ｐ４’およびＰ５として示す（Ｓｔｅｎｔｅｂｊｅｒｇ−Ｏｌｅｓｅｎら，２０００，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８２：３１９−３２５）。ＩＳ１挿入はプライマーＰ１’とＰ３’との間の領域で観察された。
【図７Ａ】図７Ａは、ＴａｑＭａｎに基づく有力な高生産性細菌クローンの高スループットスクリーニングアッセイの概略図である。ＩＳ１挿入領域はゲノムＤＮＡの少数のヌクレオチドの範囲である（“ＩＳ１挿入部位”）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＰＣＲに基づく有力な高生産性細菌クローンのスクリーニングアッセイの概略図である。ＩＳ１挿入領域はゲノムＤＮＡの多数の連続ヌクレオチドの範囲である（“ＩＳ１ホットスポット”）。７Ｂに示すアッセイでは、挿入の配向が双方向で可能であることを考慮して逆方向のＩＳ１−特異的プライマーを使用する第二アッセイも行わなければならない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同じ菌株のクローナルサブタイプ間のＩＳ１転位活性を比較する段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関する。該方法で相対的に低い転位活性を示すクローンは有力な高生産性クローナルサブタイプを表す。形質転換クローナルサブタイプのプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの内部のＩＳ１トランスポゾン挿入性突然変異原性の頻度を測定するＰＣＲに基づくアッセイが開示されている。これらの遺伝子選択アッセイは、高スループット分析が可能であり、大量のプラスミドＤＮＡを工業規模で培養できる高生産性クローナルサブタイプを同定するために要する時間を短縮できる。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチドワクチンおよび遺伝子治療プロトコルの双方を治療用途に応用するためには医薬品質のプラスミドＤＮＡの量産および精製が極めて重要である。従って、ＤＮＡワクチンおよび遺伝子治療という治療選択肢によって得られる筈の利点を十分に引き出して利用するためには高収率のプラスミドＤＮＡの製造および精製方法が必要である（Ｓｈａｍｌｏｕ，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７：２０７−２１８）。
【０００３】
裸のＤＮＡワクチンは十分に研究されたグラム陰性菌である大腸菌（“Ｅ．ｃｏｌｉ”）中でプラスミド分子として容易に繁殖する。しかしながら、ＤＮＡワクチン構築物による細菌の形質転換は、プラスミド含量に関して不均質なクローナルサブタイプ集団を生じる。この不均質集団からプラスミドＤＮＡを高レベルで複製し維持できる形質転換大腸菌クローンを単離するために役立つスクリーンプロセスは以前から開発されている（参照、同時係属国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１、出願日２００５年１月３１日；国際公開ＷＯ ２００５／０７８１１５として２００５年８月２５日に公開）。簡単に説明すると、化学的限定培地中の形質転換大腸菌クローンの産生率は、コロンビア血液寒天上の形態学的表現型とゆるやかな相関関係を有していた。滑らかで隆起した白色の円形コロニーを形成したクローン（“ホワイト”クローン）はフェッドバッチ発酵でプラスミドＤＮＡを増幅することができなかった。これに対して、扁平で半透明な灰色の不規則形コロニーを形成したクローン（“グレー”クローン）はプラスミドＤＮＡを高レベルで複製したと考えられる。その後、固体および液体の双方の培地中の多数の培養サイクルによって所望の形態学を安定に示す“グレー”クローンを同定するためのスクリーニングプロトコル（以後の本文中で“高生産体スクリーン”と呼ぶ）が確立した。次に、振盪フラスコ中のフェッドバッチ培養後のプラスミド含量を判定するために形態学に関して安定であったクローンを試験した。
【０００４】
高生産体スクリーンは、いくつかのＤＮＡワクチン候補の高生産性クローンの単離に成功することはできたが、このプロセスには多大な労力および時間が必要である。固体限定培地上の増殖にはサイクルあたり３日から５日の温置期間が必要であり、また、アッセイプレートとして血液寒天の使用が必要であることはこのような培養が“行き止まり”であることを意味しており、形質転換体から発酵槽シードまでクローンが無血液培地中に維持されるように平行培養しなければならない。従って、本文中に開示したようなより確実で高速のスクリーニングプロトコルの開発を最終目的として、高生産現象の特性を解明するための実験を行った。本発明は、高生産現象の遺伝子基盤を理解することによって、プラスミド高生産性大腸菌クローナルサブタイプをより迅速に同定する改良スクリーニングプロトコルを開示する。プラスミド低生産性大腸菌ＤＨ５クローン中でＩＳ１転位が増加しているという観察は、形質転換大腸菌クローンのプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ中のＩＳ１挿入性突然変異原性を測定するための様々なＰＣＲに基づくアッセイの開発に導いた。本文中に記載したように、ＩＳ１挿入性突然変異原性を低頻度で有している同じプラスミドＤＮＡを含有する同じ菌株のクローンが、有力なプラスミド高生産性クローナルサブタイプとして同定される。次に、この有力な高生産性クローナルサブタイプの比産生率を試験して、それらが実際に高プラスミドコピー数／細胞を示すことを判定し、その時点でプラスミド高生産性クローンであると同定する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、一般に、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、該クローナルサブタイプのプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの内部のＩＳ１トランスポゾン挿入性突然変異原性の頻度を測定する段階を含む。該方法において、ＩＳ１挿入性突然変異原性の増加が、低プラスミドコピー数／細胞（すなわち低い比産生率）を示すと考えられるクローナルサブタイプと相関関係を有している。重要なことは、本文中に記載したクローナルサブタイプのプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡ中のＩＳ１転位を測定するアッセイは高スループット分析が可能であり、従って医薬品質のプラスミドＤＮＡを大規模産生できる高生産性クローナルサブタイプの同定に要する時間が短縮されることである。
【０００６】
本発明は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプのＩＳ１転位活性を比較し、相対的に低い転位活性を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、（ｂ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。本発明の１つの実施態様において、クローナルサブタイプのＩＳ１転位活性は、該クローンから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定することによって判定され、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数は相対的に低いＩＳ１転位活性を示すクローンを表す。本発明の別の実施態様において、クローナルサブタイプのＩＳ１転位活性は、該クローンのゲノムＤＮＡの予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を測定することによって判定され、該予め決定された領域内部に１つ以上のＩＳ１挿入配列が存在しないクローナルサブタイプは相対的に低いＩＳ１転位活性を示すクローンを表す。
【０００７】
本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、（ｂ）該単離プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定し、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、（ｃ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。本発明によれば、プラスミドＤＮＡを内包している大腸菌（ＤＨ５株を含むが、これに限定されない。）の菌株の高生産性クローナルサブタイプは、同様に試験した同じ菌株の非選択形質転換大腸菌サブタイプに比べて高いプラスミドコピー数／細胞を示す。本発明の１つの実施態様において、単離プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数は、プラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量を測定するＱ−ＰＣＲアッセイを非限定的に含む定量的ＰＣＲ（“Ｑ−ＰＣＲ”）によって測定される。この実施態様において、プラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量は、記載のＱ−ＰＣＲアッセイの一部として測定されたＩＳ１トランスポゾンコピー数を表す。
【０００８】
本発明の１つの実施態様において、Ｑ−ＰＣＲアッセイが単離プラスミドＤＮＡサンプル中のプラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量を測定するために使用される。該アッセイは、ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入が存在しないと予め決定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列との双方を増幅する段階を含み、特定の大腸菌クローナルサブタイプのＩＳ１トランスポゾンコピー数を表すＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する。このＱ−ＰＣＲアッセイは単一反応管で第一および第二のヌクレオチド配列を同時に増幅する多重モードで行うことができ、変動性が少ない。ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列は、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）ＩＳ１ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマー、（ｉｉ）第一場所の下流のＩＳ１ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアによって標識された蛍光プローブから構成されるオリゴヌクレオチドセットとの存在下で増幅される。該プローブは第一場所と第二場所との間のＩＳ１ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。該核酸ポリメラーゼは、増幅中に蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出される。該蛍光変化はＩＳ１増幅の発生に対応する。ＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチドも、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマー、（ｉｉ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアによって標識された蛍光プローブから構成されるオリゴヌクレオチドセットとの存在下で増幅される。該プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。該核酸ポリメラーゼは、増幅中に蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出される。該蛍光変化が第二ヌクレオチド配列増幅の発生に対応する。１つの実施態様において、ＩＳ１ヌクレオチド配列と共に増幅されるプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列は、プラスミドＤＮＡのＣＭＶプロモーター内部に局在するヌクレオチド配列を非限定的に含むプラスミドＤＮＡのプロモーター配列内部に局在し、従って、ＩＳ１／ＣＭＶプラスミドコピー比が生成される。
【０００９】
同じプラスミドＤＮＡを内包している同じ菌株の少なくとも２つの細菌クローナルサブタイプ中のＩＳ１トランスポゾンコピー数の測定後、上記に定義したように、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を有していると判定されたクローナルサブタイプを“有力な”高生産性クローナルサブタイプとして同定する。次に、発酵系、好ましくは小規模発酵系で該クローナルサブタイプを培養することによって該有力な高生産性クローナルサブタイプの比産生率（すなわち、プラスミドコピー数／細胞）を試験し、同定されたこのクローンが実際に高生産性（すなわち、高プラスミドコピー数／細胞）を示すか否かを判定する。本発明の１つの実施態様において、この小規模発酵系は、栄養補給を伴う振盪フラスコ発酵系から成る（同時係属国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１に詳細に記載、これは国際公開ＷＯ２００５／０７８１１５として公開されている。）。小規模発酵系は理想的には、所望のプラスミドＤＮＡを生成するように計画した大規模生産方法の模擬発酵方式である。
【００１０】
本発明の１つの実施態様において、記載のＱ−ＰＣＲアッセイで単離プラスミドＤＮＡサンプル由来のＩＳ１トランスポゾン配列を増幅するために使用される順方向および逆方向のＰＣＲプライマーがそれぞれＩＳ１−ＱＦ（配列６）およびＩＳ１−Ｑ−Ｒ（配列７）から成り、蛍光プローブがＩＳ１−Ｑ−Ｐ２（配列８）から成る。本発明の別の実施態様において、記載のＱ−ＰＣＲアッセイで単離プラスミドＤＮＡサンプル由来の第二ヌクレオチド配列を増幅するために使用される順方向および逆方向のＰＣＲプライマーがそれぞれＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（配列４）から成り、蛍光プローブがＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（配列５）から成る。蛍光プローブはフルオロホアと消去剤分子との双方によって標識されている。
【００１１】
本発明はさらに、細菌クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量を間接に計算する段階を含む上記同様のＩＳ１定量ＰＣＲアッセイに関する。該アッセイにおいて、ＩＳ１トランスポゾンコピー数の予測量がＩＳ１／プラスミドコピー数から減算され、補正ＩＳ１／プラスミドコピー比が生成する。本発明のこの部分の１つの実施態様において、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量は、第二のＱ−ＰＣＲアッセイを使用して間接的に測定される。該アッセイは、プラスミドコピー数に基づく２３ｓ ｒＤＮＡの相対量を測定し、２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成する。この２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比をＩＳ１／プラスミドコピー比から減算すると補正ＩＳ１／プラスミドコピー比が得られる。このＱ−ＰＣＲアッセイは、２３ｓ ｒＤＮＡ配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの同じヌクレオチド配列（前出）との双方を同時に増幅する多重モードで行うことができる。本発明の１つの実施態様において、ここに記載のＱ−ＰＣＲアッセイで２３ｓ ｒＤＮＡ配列の増幅に使用される順方向および逆方向のＰＣＲプライマーはそれぞれ２３ｓ−Ｆ１Ｄ（配列１１）および２３ｓ−Ｒ１Ｄ（配列１２）から成り、蛍光プローブは２３ｓ−Ｐｆａｍ（配列１３）から成る。本発明の別の実施態様において、ＩＳ１挿入非含有と判定された配列はプラスミドＤＮＡのＣＭＶプロモーター領域に内包され、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶコピー比を与えるので、これをＩＳ１／ＣＭＶコピー比から減算して補正ＩＳ１／ＣＭＶコピー比を生成する。
【００１２】
本発明はまた、ＩＳ１挿入領域であると予め決定された細菌ゲノムＤＮＡの領域内部の１つ以上のＩＳ１トランスポゾン挿入配列の有無を検出する段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関する。該ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプは有力な高生産性クローナルサブタイプを表す。予め決定されたＩＳ１挿入領域内部に挿入されたＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出できるＰＣＲに基づくアッセイが開示されている。これらのアッセイは高スループット分析が可能である。従って本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）該クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出し、該ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、（ｂ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含み、高生産性クローナルサブタイプが高プラスミドコピー数／細胞を示す。
【００１３】
別の実施態様において、大腸菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの１つの領域内部のＩＳ１挿入性配列の有無を検出するためにＴａｑＭａｎに基づくＱ−ＰＣＲアッセイを使用する。このアッセイにおいて、ゲノムＤＮＡの該領域は、ＩＳ１挿入を受容すると予め決定されており、該ゲノムＤＮＡの約２０未満の連続ヌクレオチドの範囲である（すなわち、“ＩＳ１挿入部位”を表す）。該ＩＳ１挿入領域の内部の特異的ＩＳ１挿入の有無を検出するＱ−ＰＣＲアッセイは、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識されており、ゲノムＤＮＡの該領域にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないときにだけＩＳ１挿入領域にまたがるゲノムＤＮＡ内部の１つの場所にハイブリド形成する蛍光プローブ、（ｉｉ）蛍光プローブの上流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーおよび（ｉｉｉ）蛍光プローブの下流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーから構成されたオリゴヌクレオチドセットとの存在下で、該領域を含有するゲノムＤＮＡの一部分を増幅する。該核酸ポリメラーゼは、増幅中に蛍光プローブを消化して前記フルオロホアを前記消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化がゲノムＤＮＡの増幅およびＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在に対応する。このアッセイは多重化を必要とせず、全細胞溶解液を用いて行うことができるので、該クローンからゲノムＤＮＡを単離する必要性が削除される。ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプを有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定し、それらの比産生率を確認する試験を行う。
【００１４】
本発明の別の実施態様において、大腸菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの１つの領域内部のＩＳ１挿入性配列の有無を検出するためにＰＣＲに基づくアッセイを使用する。このアッセイでは、ゲノムＤＮＡの該領域はＩＳ１挿入を受容すると予め決定されており、この領域は該ゲノムＤＮＡの約２０以上の連続ヌクレオチドの範囲である（すなわち、“ＩＳ１挿入ホットスポット”を表す）。このＰＣＲアッセイは、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）ＩＳ１挿入領域外部（すなわち、ＩＳ１挿入ホットスポットの外部）のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する第一のＰＣＲプライマーおよび（ｉｉ）ＩＳ１トランスポゾン配列内部の１つの場所にハイブリド形成する第二のＰＣＲプライマーから構成されるオリゴヌクレオチドセットとの存在下で、ゲノムＤＮＡの１つの領域を増幅する。ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の存在は、双方のＰＣＲプライマーのハイブリド形成および増幅によるゲノムＤＮＡの該部分の指数関数的増幅という結果を与える。ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在は、第一ＰＣＲプライマーだけのハイブリド形成によるゲノムＤＮＡの１つの鎖だけの一次関数的増幅という結果を与える。ゲノムＤＮＡの指数関数的増幅はほぼ目標サイズの増幅核酸フラグメントを同定することによって目視検出する、または、二重鎖ＤＮＡに結合する核酸染料（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ）を添加することによってリアルタイムで蛍光検出できる。ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプを有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定し、それらの比産生率を確認する試験を行う。
【００１５】
本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプを生成するための、該プラスミドＤＮＡによる細菌株の形質転換に先立って細菌ゲノムからＩＳ１配列の全コピーを除去するように大腸菌宿主株を変異させる段階を含む方法に関する。本発明はさらに、すべてのＩＳ１コピーが除去された変異大腸菌宿主菌株（ＤＨ５菌株を含むが、これに限定されない。）、および、プラスミドＤＮＡを繁殖させるための該菌株の使用に関する。
【００１６】
ここに使用した“オリゴヌクレオチド”という用語は、ワトソン・クリック型塩基対合のようなモノマー対モノマー相互作用の規則的パターンによって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合できる天然または修飾されたモノマーまたは連鎖の直鎖状オリゴマーを表し、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含む。本発明ではオリゴヌクレオチドという用語がオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーの双方を含む。
【００１７】
ここに使用した“プライマー”という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれたときに相補鎖に沿った合成起点として作用できるオリゴヌクレオチドを表す。このような条件は、適当な温度の適当なバッファ中の異なる４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩とＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合誘導物質の存在を含む（“バッファ”は補因子となる成分、または、イオン強度、ｐＨなどを左右する成分を含む）。本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは例えば、精製した制限消化物中に存在するような天然産生プライマーでもよくまたは合成的に作製されてもよい。プライマーは最大増幅効率を与えるように一本鎖であるのが好ましい。
【００１８】
本発明のフルオロホアに関して本文中に使用した“固有（ｕｎｉｑｕｅ）”という用語は、各フルオロホアが特定アッセイに使用された他のすべてのフルオロホアに比べて異なる発光極大にエネルギーを放出することを意味する。固有発光極大をもつフルオロホアを使用すると、特定アッセイに使用した複数のフルオロホアのおのおのによって放出された蛍光エネルギーを同時検出できる。
【００１９】
ここに使用した“アンプリコン”という用語は、核酸ポリメラーゼと特異的プライマー対との存在下に核酸を含むサンプルのＰＣＲ増幅によって産生されるＰＣＲ反応の特異的産物を表す。
【００２０】
ここに使用した“オリゴヌクレオチドセット”または“オリゴヌクレオチドのセット”という用語は、特異的標的ヌクレオチド配列にハイブリド形成する一対のオリゴヌクレオチドプライマーと１つのオリゴヌクレオチドプローブとの組合せを表す。該オリゴヌクレオチドセットは、（ａ）標的ＤＮＡの第一場所にハイブリド形成する順方向プライマーと、（ｂ）同じ標的ＤＮＡの第一場所の下流の第二場所にハイブリド形成する逆方向プライマーとおよび（ｃ）フルオロホアと消去剤とによって標識され標的ＤＮＡのプライマー間の１つの場所にハイブリド形成する蛍光プローブとから構成される。言い換えると、オリゴヌクレオチドセットは、特異的標的ＤＮＡ配列例えばＩＳ１トランスポゾン配列に特異的なアンプリコンの合成を開始できる特異的ＰＣＲプライマーのセットとアンプリコンにハイブリド形成する蛍光プローブとから構成される。
【００２１】
オリゴヌクレオチドセット、オリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブに関して本文中に使用した“特異的にハイブリド形成する”という用語は、該オリゴヌクレオチドセット、プライマーまたはプローブが単一の標的ＤＮＡにハイブリド形成することを意味する。
【００２２】
ここに使用した“遺伝子”という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与する核酸のセグメントを意味する。これは、翻訳された配列（コード領域）、５’および３’の非翻訳配列（非コード領域）、ならびに、個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００２３】
ここに使用した“フルオロホア”という用語は、レーザー、タングステン、水銀もしくはキセノンランプまたは発光ダイオードで励起されたときに限定スペクトルをもつ光の形態でエネルギーを放出する蛍光リポーター分子を表す。フルオロホアから放出された光は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のプロセスを介して、フルオロホアの発光スペクトルに部分的に重なる励起スペクトルをもつ第二分子を励起できる。フルオロホアから別の分子への放出エネルギーの移動がフルオロホアの発光を消去する。第二分子は消去剤分子として知られる。本文中では“フルオロホア”という用語を“蛍光リポーター”という用語と互換的に使用する。
【００２４】
ここに使用した“消去剤”または“消去剤分子”という用語は、フルオロホアを含む蛍光プローブに連結されたときに、フルオロホアから放出されたエネルギーを受容しこれによってフルオロホアの発光を消去できる分子を表す。消去剤は、受容エネルギーを光として放出する蛍光剤でもよく、または、受容エネルギーを熱として放出する非蛍光剤でもよく、プローブの長さに沿ったいずれかの場所に付着できる。
【００２５】
ここに使用した“プローブ”という用語は、標的領域すなわち検出すべき領域中の配列に対するプローブの少なくとも１つの配列の相補性によって標的核酸中の配列と共に二重鎖構造を形成できるオリゴヌクレオチドを表す。“プローブ”という用語は、付着したフルオロホアおよび消去剤分子を伴うかまたは伴わない上述のオリゴヌクレオチドを含む。“蛍光プローブ”という用語は、フルオロホアと消去剤分子とを含むプローブを表す。
【００２６】
ここに使用した“ＦＡＭ”は、フルオロホア６−カルボキシフルオレセインを表す。“ＪＯＥ”はフルオロホア６−カルボキシ−４’，５’ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセインを表す。“ＴＥＴ”はフルオロホア５−テトラクロロフルオレセインを表す。“ＶＩＣ”はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発された同社が専有権をもつフルオロホアを表す。“ＴＡＭＲＡ”はフルオロホア６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミンを表す。
【００２７】
ここに使用した“ＲＦＬＰ”は制限断片長多型を表す。
【００２８】
ここに使用した“ＤＣＷ”は乾燥細胞重量を表す。
【００２９】
ここに使用した“ＯＤ２ペレット”は１ｍＬの溶液に再懸濁したときに６００ｎｍでＯＤ＝２を与える細胞集落を表す。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
プラスミドＤＮＡを産生する大腸菌の高生産性クローンの新規な選択方法がここに開示されている。本発明の発明者／出願人は、ＩＳ１転位増加が低生産性細菌クローン集団に相関関係を有することを知見し、この情報を使用して、有力なプラスミド高生産性大腸菌クローナルサブタイプを同定するための遺伝子選択アッセイを組込んだ改良スクリーニング方法を創作した。次に、該有力な高生産性クローナルサブタイプが実際に高生産性である（すなわち、高いプラスミドコピー数／細胞を示す）ことを確認するためにそれらを評価する。重要なことは、新規な選択方法の一部として本文中に記載したアッセイが高スループット分析を可能にし、従って、高生産性クローンの同定に要する時間が短縮されることである。最後に、プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプすなわち形質転換大腸菌クローンは、同じプラスミドＤＮＡを含有する同じ菌株の非選択形質転換大腸菌クローナルサブタイプに比べてより高いプラスミドコピー数／細胞を示す能力を有すると定義される。この高生産性クローナルサブタイプは、例えば治療用ポリヌクレオチドワクチンおよび／または遺伝子治療プロトコルを用途とするプラスミドＤＮＡの商業規模生産に使用できる。ここでは本発明の選択方法が大腸菌のＤＨ５株を使用して例示される。しかしながらこの例示は、本発明の範囲を大腸菌ＤＨ５株に由来の高プラスミド生産性クローンの遺伝子選択だけに限定するものではない。本発明の選択方法を使用するために大腸菌の別の菌株を調達してもよいことが当業者には理解されよう。
【００３１】
本発明は、多数のプラスミドＤＮＡワクチン候補によって形質転換された大腸菌ＤＨ５細胞が培養異質性を示すこと、鑑別培地および／または化学的限定培地で平板培養されたときに形態学的に異なる少なくとも２つのコロニー表現型を示すという以前の観察に部分的に由来する。この現象はＵ．Ｓ．暫定出願Ｎｏ．６０／５４１，８９４として２００４年２月４日に出願された同時係属出願に詳細に記載されている。該出願はすでに放棄され、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１、出願日２００５年１月３１日、に対応している（国際公開ＷＯ ２００５／０７８１１５として２００５年８月２５日に公開）。後者の記載内容は参照によって本発明に組込まれるものとする。各表現型のコロニー単離およびその後の試験が、発酵中のプラスミド増幅を増加でき臨床品質のプラスミドＤＮＡを量産できる特異的表現型クローナル単離物の発見に導いた。この発見がＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に詳細に記載された本文中で高生産体スクリーンと呼ぶ高プラスミドコピー数／細胞を示す高生産性クローナルサブタイプを同定するスクリーニング方法の開発に導いた。高生産体スクリーンは、大腸菌の有力な高生産性クローナルサブタイプを単離する第一選択段階を含み、次いで、第一段階で単離した該有力な高生産性クローナルサブタイプを発酵系好ましくは小規模発酵系で評価してどのクローナルサブタイプが実際に高生産性であるかを判定する第二選択段階を含む。すなわち、第一選択段階は可能な高生産性大腸菌クローナルサブタイプのプールを縮小し、該プールが、同様の発酵条件で増殖させた非選択形質転換大腸菌細胞に比べてより大きいプラスミドコピー数／細胞を生じる能力を示す可能性が最も高いクローナル変異体だけを含むようにする。
【００３２】
細菌クローナルサブタイプは科学文献に記載されている。キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の表現型切換は遺伝子発現差異の直接結果として生じる（Ｓｏｌｌ，Ｄ．ら，１９９５，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．７３：１０４９−１０５７）。２つの不透明特異的遺伝子（ＰＥＰ１およびＯＰ４）ならびに１つの白色特異的遺伝子（ＷＨ１１）は病原性キャンディダの白色から不透明への表現型切換に関与している。これは、キャンディダの毒性を伴い、一方比産生率が高いほうの細菌クローンを選択する場合にも同様の現象が存在する。ナイゼリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の病原性菌株でもコロニー変異体が同定された。この場合は、表現型の多様性はリポ多糖およびクラス５外膜タンパク質の菌株内異質性を伴っている（Ｐｏｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｔ．ら，１９８５，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：２０３−２０９）。大腸菌ＤＨ５の増殖および酵素活性に対するプラスミド存在の効果が、Ｍａｓｏｎ，Ｃ．Ａ．らによって記載され（１９８９，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：５４−６０）、プラスミドコピー数が炭素代謝に関与する宿主細胞酵素の発現に直接影響を与えることを示している。従って、異なる増殖特性値をもつ大腸菌クローナルサブタイプの生成は、ＤＮＡ形質転換プロセスによって誘導された変異または選択的濃縮培地中で細菌を培養することによって与えられたストレスなどを非限定的に含む様々のイベントの結果であろう。
【００３３】
形質転換大腸菌ＤＨ５細胞中で以前から観察されていた細菌異質性は主要な２つのタイプのコロニーを示す（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出に記載）。後にプラスミド高生産性クローンとして同定される可能性を少なくとも有しているクローンは、コロンビア血液寒天に平板培養し２８−３０℃で培養したときに表現型的に灰色コロニーを形成する（“グレー”クローン）。これらの“グレー”コロニーは、不規則形状、扁平および半透明である。これに比べて、形質転換大腸菌ＤＨ５細胞集団の主要成分によって形成されたコロニーは、コロンビア血液寒天に平板培養し２８−３０℃で培養したときに白色、円形で隆起し滑らかな組織を有している（“ホワイト”クローン）。これらの“ホワイト”クローンは、プラスミド低生産性大腸菌クローンであると同定された。“グレー”クローンによって形成される有力な高生産性クローナル単離物を表すコロニーは、化学的限定寒天培地で平板培養したときにプラスミド低生産性“ホワイト”コロニーから識別できない。有力な高生産性“グレー”クローンはコロンビア血液寒天（Ｃｏｌｏｍｂｉａ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ）プレートから直接精製できるが、ヒト治療用製品を製造する商業用発酵プロセスに使用される細胞と何らかの血液由来材料との接触を完全に避けることがしばしば望ましい。従って、有力な高生産性クローナルサブタイプ（“グレー”クローン）を精製するために、最終発酵プロセスに使用した最終“グレー”クローナルサブタイプがいかなる血液製品とも接触しないことを確保するためのある程度集約的な労力および時間を要する重複平板培養技術が開発された（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出、に記載）。プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の有力な高生産性クローナルサブタイプ（すなわち、“グレー”クローン）の選択後、高生産体スクリーンでこれらのクローナルサブタイプを評価し、第一選択段階で同定されたクローンが同じプラスミドで形質転換し同じ発酵条件下で増殖した同じ菌株の非選択大腸菌細胞の比産生率よりも大きい比産生率（すなわち、プラスミドコピー数／細胞）を実際に有するか否かを判定する必要がある。ＤＮＡプラスミドを内包する非選択大腸菌細胞の比産生率は、同じプラスミドＤＮＡを内包する該細菌株のクローナル単離物集団の平均産生率を計算することによって容易に決定できる。
【００３４】
当業者は、有力な高生産性細菌クローンを単離するために多くの異なる選択戦略が利用可能であることを理解されよう。ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に記載された高生産体スクリーンはいくつかのＤＮＡワクチンプログラム用プラスミドを産生する高収率クローンの選択に極めて有用であることが立証されている。従って、形態学的表現型と高生産性クローン富化集団との相関関係はこのようなクローンの選択メカニズムを提供する。高生産体スクリーンはいくつかのＤＮＡワクチン候補についての高生産性シード材料をもたらしたが、本発明の発明者／出願人は、スクリーニングプロセスの特性をより詳細に解明しおよびできれば改良するという意図で異質形質転換集団出現の背後にある理由の究明を試みた。本発明の発明者／出願人のこのような目的に沿う初期の１つの観察は、大腸菌ＤＨ５細胞の形質転換効率、すなわち、回収したプラスミド含有細胞の総数が、限定培地では複合ブロスよりも３桁も少ないことであった。従って、細胞を形質転換させ、成功した形質転換体の収率が最大になるように回収するという目的で、ＤＨ５宿主細胞を電気受容性にし、複合培地中でＤＮＡワクチンプラスミドによって形質転換し、次いで限定培地に移すという実験を行った。しかしながら、限定培地での再適応および増殖延長の後、複数のクローンから抽出したプラスミドＤＮＡの画分は大腸菌トランスポゾン配列ＩＳ１を含有することが判明した。プラスミドＤＮＡ含量を検査するために小規模発酵系で培養したとき（例えば栄養補給を伴う振盪フラスコ（“ＳＦＦ”）系、ＰＣＴ／ＵＳ２００Ｓ／００２９１１；前出、に詳細に記載）、ＩＳ１転位の増加したクローンはすべて低生産体（上記のホワイトクローン同様）であると特性決定された。従って、ＩＳ１転位増加と低生産性集団との間に相関関係が存在すると考えられる。この情報を使用して有力なプラスミド高生産性大腸菌クローンの遺伝子選択を組込んだ本発明の代替的スクリーニングプロトコルを創作した。
【００３５】
本発明は、同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株のクローナルサブタイプ間のＩＳ１転位活性を比較し、相対的に低い転位活性を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関する。相対的に低い転位活性は、同じプラスミドＤＮＡを内包する該細菌株のクローナル単離物の集団の平均転位活性を計算することによって容易に決定でき、この平均よりも低い転位活性を有すると判定されたクローナルサブタイプが相対的に低い転位活性を示すと同定する。従って本発明は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプのＩＳ１転位活性を比較し、相対的に低い転位活性を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階とおよび（ｂ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。
【００３６】
本発明のこの部分の１つの実施態様において、ＩＳ１転位活性がクローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定することによって判定され、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数は相対的に低いＩＳ１転位活性を表す。相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を有するクローンは、同じプラスミドＤＮＡを内包する該細菌株のクローナル単離物の集団の平均ＩＳ１トランスポゾンコピー数を計算することによって容易に決定でき、該平均よりも低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を有すると判定されたクローナルサブタイプが相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すと同定される。本発明の別の実施態様において、ＩＳ１転位活性は、該クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ内部の予め決定されたＩＳ１挿入領域内部の１つ以上のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を測定することによって判定され、ＩＳ１挿入配列の不在は、相対的に低いＩＳ１転位活性を表す。ＩＳ１配列挿入を受容するクローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ内部の特異的場所の正確な決定方法は後出の実施例５に詳細に記載する。
【００３７】
本発明の１つの実施態様は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、該クローナルタイプのプラスミドＤＮＡ中のＩＳ１トランスポゾン挿入性突然変異原性の相対量を測定する段階を含む。ここにおいて、ＩＳ１トランスポゾン挿入性変異原性の量が少ないことを有力な高生産性クローナルサブタイプの指標とする。従って、本発明の１つの実施態様は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、（ｂ）該単離プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定し、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階とおよび（ｃ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数は、試験したクローナル単離物の集団の平均ＩＳ１トランスポゾンコピー数を計算することによって容易に決定でき、該平均よりも低いプラスミドＩＳ１トランスポゾンコピー数を有すると判定されたクローナルサブタイプが相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を表すと同定される。あるいは、２つだけのクローナルサブタイプに由来のプラスミドＤＮＡサンプルのＩＳ１トランスポゾンコピー数を試験するならば、最も低いＩＳ１トランスポゾンコピー数をもつクローンが相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプを表す。
【００３８】
ＩＳ１は細菌挿入配列のうちで最小であることがわかっている７６８塩基対の転位性要素である（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｄ．Ｈ．Ｓａｅｄｌｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｇｉｅｒｌ，Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９６，１−２６）。ＩＳ１トランスポゾン配列の実例は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅに登録番号Ｘ５２５３４、Ｘ５２５３７およびＵ４９２７０（ＩＳ１Ａ／ＩＳ１Ｅ）；Ｘ１７３４５およびＸ５２５３５（ＩＳ１Ｂ／ＩＳ１Ｃ）；Ｘ５２５３６（ＩＳ１Ｄ）；Ｘ５２５３８（ＩＳ１Ｆ）；およびＶ００６０９（包囲配列のないＩＳ１のクリーンコピー）に見出すことができる。ＩＳ１は天然には、大腸菌ゲノム中にコピー数１０以下で見出される。野生型Ｋ−１２株では６から８コピーが同定されている（Ｄｅｏｎｉｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｆ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，２：９８２−９８９）。転位が生じると、通常は標的配列の９ｂｐの複製が挿入部位に生成される（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，１９９６，前出）。大腸菌に見出されるＩＳ１は４つの型に群別できるが、ＩＳ１Ａ／ＩＳＩＥ型（参照：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ５２５３４、Ｘ５２５３７およびＵ４９２７０）だけが染色体からプラスミドＤＮＡに転位することを示した（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｙｅｈ，１９９７，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３６：２７５−２８０）。ＩＳ１は他の挿入配列よりはるかに高い頻度で自然挿入突然変異を生じ（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，１９９６，前出）、プラスミドおよび染色体の双方のＤＮＡの突然変異の原因物質であると同定された。例えば、このような突然変異は、毒性またはストレス誘発遺伝子の発現を（全面的または部分的に）抑制する（Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，１９８１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８３：１０７−１１４；Ｎａｋａｈａｍａら，１９８６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：２６２−２６６；および、Ｔｏｂａ−Ｍｉｎｏｗａ，１９９２，Ｇｅｎｅ １２１：２５−３３）、調節要素または遠位転写リードスルーの破壊によって遺伝子発現を活性化する（Ｈａｌｌ，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５：１−５；および、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１８３：２６４６−２６５３）、宿主細胞の重金属抵抗性を増す（Ｉｔｏｈら，１９９４，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７８：４６６−４６８）、ならびに、プラスミド分泌安定性を強化する（Ｃｈｅｗら，１９８６，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３６：２７５−２８０）ことを示した。１１の非反復挿入部位がＤＮＡワクチン候補の１つのサンプル中で同定され、これらはいずれもネオマイシン耐性遺伝子ｎｐｔＩＩの翻訳領域の１００塩基対にまたはその内部に存在した（実施例３参照）。従って、ＩＳ１転位が高生産体および低生産体（すなわち、グレークローンおよびホワイトクローン）の分化に導く遺伝子突然変異を生じさせるメカニズムである可能性は極めて高い。
【００３９】
プラスミドＤＮＡ中のトランスポゾンの存在は、アガロースゲル上の高分子量バンドとして注目されたのが最初である（実施例１参照）。ＩＳ１の標準増幅反応にいわゆる“不完全一致プライマー”を使用するエンドポイントＰＣＲアッセイが使用された。これらのプライマーは、５’端から順次に９ｂｐの非一致ヌクレオチド、７または９ｂｐの完全一致ヌクレオチドから構成されていた。このようなプライマーを使用した結果として、鋳型ＤＮＡ濃度が未決の閾値レベルを上回るならばＩＳ１だけが増幅される濃度感受性アッセイが得られた。これらのアッセイは定性的結果だけを送達した。従って、トランスポゾン含量に関するいくつかのＤＮＡワクチンクローンの挙動をより十分に特性決定する意図で、ＤＮＡワクチン候補内部（すなわち、プラスミドＤＮＡ自体の内部）のＩＳ１コピーの相対量をプラスミドコピー数に基づいて測定する定量的ＰＣＲ（“Ｑ−ＰＣＲ”）アッセイを設計した。このＩＳ１／プラスミドＱ−ＰＣＲアッセイは、形質転換大腸菌クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数の測定値を表すＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する。このアッセイは、ＰＣＲ中に累積する特異的産物を検出できる蛍光発生ＴａｑＭａｎプローブテクノロジイを利用する。蛍光は、蛍光発生プローブを消化し５’端のリポーター色素を３’端の消去剤色素から分離するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって発生する。ＰＣＲ処理の進行中にリポーター色素からの蛍光は指数関数的に累積され、リアルタイムでモニターされる。蛍光振幅をサイクル数に関してグラフ化し、振幅が閾値サイクル（ＣＴ）と呼ぶユーザー規定の整定値に到達した点によって定量が確定される。次に、サンプルプレート中の鋳型の一連の既知量から作成した外部標準曲線から鋳型ＤＮＡコピー数を外挿する、または、多重モードで処理し反応ウェルに基準鋳型の定量を組込むことによって相対的コピー数を決定する。プラスミド調製物中の残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１の予測量を計算するために第二の多重Ｑ−ＰＣＲアッセイを同様にして開発した。このアッセイは、プラスミドＤＮＡコピー数に標準化した大腸菌宿主細胞２３ｓ ｒＤＮＡを定量し、２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成する。この２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比をＩＳ１／プラスミドコピー比から減算して、単離プラスミドＤＮＡサンプル中の残留ゲノムＤＮＡに起因すると予想されたＩＳ１の増幅を算入した“補正”ＩＳ１／プラスミドコピー比を生成し、プラスミドＩＳ１含量のより正確な読みを与える。これらのアッセイを使用すると、１０３−１０８コピー／μＬの範囲のプラスミドＤＮＡコピー数であるときにすべての標的の定量が直線状であり、１００％（１：１）から０．００１％（１：１０５）までの範囲のＩＳ１／プラスミドコピー比を検出できることが知見された。このアッセイは高感度であるが、結果はアガロースゲルで視認可能にするためには５−１０％のオーダのＩＳ１画分が必要であることを示唆する。
【００４０】
特定の理論に制約されないが、プラスミドＤＮＡへのＩＳ１挿入、特に、Ｖ１Ｊｎｓプラスミドで観察された（実施例３参照）ように、抗生物質耐性遺伝子内部で主として生じるこのような挿入がプラスミドコピー数に強い影響を与えたりまたはクローンの増幅特性に影響を与えたりすることは考えられない。しかしながら、プラスミドＤＮＡに挿入配列が転位するとその結果として、ＩＳ１コピー数が増加し、転位がゲノムに逆戻りする能力が増加することは考えられる。この挙動は、１つの大腸菌株のカドミウム耐性の獲得で観察された（Ｉｔｏｈら，１９９４；前出）。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）のカドミウム耐性の原因となる遺伝子をクローニングする目的で、０．８Ｋｂの挿入をもつｐＢＲ３２２を内包する耐性大腸菌形質転換体を作製した。宿主からプラスミドを除去してもカドミウム耐性は維持されていた。しかしながら、挿入はシュードモナス・プチダ由来のＤＮＡでなく大腸菌のＩＳ１であることが後になって同定された。染色体再編成も同定され、これは、プラスミドからゲノムに逆戻りしたＩＳ１の転位が表現型を変化させたという結論に導く。従って、本文中に記載するように、いかなる特定の理論にも制約されないが、ゲノムからプラスミドＤＮＡへのＩＳ１の転位およびその逆戻りがプラスミド低生産性大腸菌クローナルサブタイプ形成の一因であり得る。
【００４１】
上述のＱ−ＰＣＲは、クローンに内包されているプラスミドＤＮＡ内部のＩＳ１トランスポゾンコピー数を定量することによって細菌クローナルサブタイプ中のＩＳ１挿入性突然変異原性の増加を間接に測定するために使用される。有意な転位活性をもつプラスミドＤＮＡサンプルはすべてプラスミド低生産性クローンから単離されたものでありプラスミド高生産性クローンは低レベルのプラスミド由来ＩＳ１を含有していたという観察は、低生産性クローンがＩＳ１挿入性突然変異と相関関係を有しているという提唱理論を裏付ける。以前から記載されていた高生産体スクリーンの第一選択基準は形態学的表現型の分析を含んでいたが、これはプラスミド増幅挙動の代用品でしかない。従って、本文中に記載したように、大腸菌クローナルサブタイプはさらに、ＩＳ１転位に関する安定性に従っておよびそれらの高いプラスミド力価の保存に従って特性決定できる。プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１を測定する記載のＱ−ＰＣＲアッセイは、アガロースゲル電気泳動およびエンドポイントＰＣＲ分析の双方を凌駕するいくつかの重要な利点を提供する。第一に、アッセイが高度に特異的である。該アッセイは、ＩＳ１トランスポゾン含有サンプル、他のトランスポゾン（例えばＩＳ５）含有サンプルおよびトランスポゾン陰性サンプルを、特別設計のオリゴヌクレオチドプライマーと蛍光プローブとに依存して容易に識別できる。第二に、Ｑ−ＰＣＲテクノロジイによって提供される高レベル感度は、少なくとも１００コピー／μＬ（例えばＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆの場合０．６ｐｇ／ｍｌ）という低い濃度の標的を検出しながら鋳型ＤＮＡ濃度の６対数以上までＩＳ１転位を定量することが可能である。
【００４２】
従って本発明は、プラスミドＤＮＡを内包している大腸菌（大腸菌Ｋ−１２株を非限定的に含む。）の菌株例えばＤＨ５株の高生産性クローナルサブタイプを同定するための選択プロトコルに関する。このプロトコルは、同じプラスミドＤＮＡを内包している同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量（すなわち、ＩＳ１トランスポゾンコピー数）を測定する段階とおよび相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプを選択する段階とを含む。ここにおいて、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローンが有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定される。次に、有力な高生産性クローナルサブタイプの比産生率（すなわち、プラスミドコピー数／細胞）を評価して、それが実際に高生産性クローナルサブタイプであるか否かを判定する。このＱ−ＰＣＲに基づく遺伝子選択方法は、同じプラスミドＤＮＡを内包している同じ大腸菌の菌株の３つ以上のクローナルサブタイプの分析に使用できると考えられ、ＩＳ１トランスポゾンコピー数の数量範囲を生成する。このような場合、最も低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプの比産生率だけでなく、アッセイにかけたクローンの平均ＩＳ１トランスポゾンコピー数よりも低いクローナルサブタイプの比産生率を処理可能な数のクローナルサブタイプについて評価するという選択もある。
【００４３】
有力な高生産性クローナル単離物は発酵系、好ましくは小規模発酵系を使用して評価される。発酵系のサイズは使用すべき最終発酵プロセスのサイズにゆるやかに従属するであろう。例えば、“大規模”プラスミドＤＮＡ産生プロセス（すなわち、約１０００Ｌよりも多い発酵量を収容でき、１０，０００から１００，０００Ｌの大きさの発酵容器を含み得る標準実験用バイオリアクターよりも多い全発酵量）に使用されるクローンの同定を支援するために、一般にはこの小規模評価段階で約２５０ｍＬから約１Ｌの範囲のフラスコが使用される。小規模発酵系はまた、最終的商業用大規模発酵プロセスをシミュレートしなければならない。高生産体スクリーンを開示する同時係属出願（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出）に詳細に記載されているように、有力な高生産性クローナル単離物は、発酵中の各フラスコに連続栄養補給が付随する栄養補給型振盪フラスコ（“ＳＦＦ”）を使用する発酵系で評価できる。振盪フラスコ系は、クローナル単離物が約１０００ｍＬ以下のバフル付き振盪フラスコ、好ましくは２５０ｍＬのバフル付き振盪フラスコで培養される小規模発酵系を表す。１つの実施態様において、高プラスミドコピー数／細胞を示す高生産性クローナルサブタイプは約２０μｇ ＤＮＡ／μｇ ＤＣＷ以上の比産生率を有すると判定される。比産生率を評価するために小規模発酵で典型的に使用される代替的測定方法は、１ｍＬの溶液に再懸濁したときの６００ｎｍにＯＤ＝２を与える細胞集落を表すＯＤ２ペレットに基づく。従って別の実施態様において、高プラスミドコピー数／細胞を示す高生産性クローナルサブタイプは約１５μｇ ＤＮＡ／μｇ ＯＤ２ペレット以上の比産生率を有すると判定する。
【００４４】
上述したように、本発明はＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイのような定量的ＰＣＲ（“Ｑ−ＰＣＲ”）アッセイに関するものであり、ＤＮＡワクチン候補のプラスミドＤＮＡサンプル内部のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定するために該アッセイを使用する。該Ｑ−ＰＣＲアッセイは、ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列と、ＩＳ１挿入が存在しないと予め決定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列とを増幅することによってプラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンの相対量を測定し、大腸菌クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピーの数（すなわち、ＩＳ１トランスポゾンコピー数）を表すＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する。当業者は、ＩＳ１挿入を受容する確率の低いプラスミドＤＮＡ内部の場所を容易に同定できる（例えば、実施例３参照）。１つの実施態様においてアッセイを多重モードで行う。その結果として、第一（すなわち、ＩＳ１配列）および第二（すなわち、ＩＳ１非含有配列）のヌクレオチド配列を同一反応管で増幅することができ、変動性が小さい。ＰＣＲ産物をリアルタイムで検出でき放射能の必要性を排除する５’エキソヌクレアーゼ蛍光発生ＰＣＲに基づくアッセイ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）は当業界で記載されている。参照文献は例えば、Ｕ．Ｓ．特許５，５３８，８４８；およびＨｏｌｌａｎｄら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０である。この方法は、蛍光リポーター（フルオロホア）と消去剤とを含みＰＣＲプライマー間で標的ＤＮＡにハイブリド形成する標識プローブを利用する。フルオロホアが励起されると、フルオロホアによって蛍光シグナルが放出され、消去剤によって消去される。アンプリコンは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’への方向のエキソヌクレアーゼ活性によって検出できる。該ポリメラーゼは、ＰＣＲプライマーの伸長中に出会った二重鎖ＤＮＡを分解し、従ってプローブからフルオロホアを遊離する。その後、蛍光シグナルはもはや消去されないので、標的ＤＮＡの量に直接的に相関する蛍光シグナルが累積され、これは全自動蛍光計によってリアルタイムで検出できる。
【００４５】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応を実行する全自動蛍光計は当業界で公知であり、この特異的アッセイに適用できる。例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）製のｉＣｙｃｌｅｒおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）製のＭｘ４０００がある。本発明の１つの実施態様において、本発明の一部として記載したＱ−ＰＣＲアッセイをＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７９００ＨＴ配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で実行できる。この計器は、蛍光発光（波長に基づく）を電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラで予測空間パターンに分離するスペクトログラフを使用する。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７９００ＨＴの配列検出システムアプリケーションはＣＣＤカメラから蛍光シグナルを収集し、データ解析アルゴリズムを適用する。
【００４６】
本発明の一部として記載したＱ−ＰＣＲアッセイに使用する核酸ポリメラーゼは、５’から３’への方向のエキソヌクレアーゼ活性を有していなければならない。いくつかの適切なポリメラーゼが当業界で公知であり、例えば、Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔｂｒ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）およびＴｔｈ（Ｔｈｅｒｍｉｔｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓ）ポリメラーゼがある。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは本発明に使用するための好ましいポリメラーゼである。５’から３’への方向のエキソヌクレアーゼ活性は、ＰＣＲプライマーの伸長中に出会った二重鎖ＤＮＡの分解によって特性決定される。アンプリコンにアニーリングされた蛍光プローブは同様にして分解され、従ってオリゴヌクレオチドからフルオロホアを遊離する。フルオロホアと消去剤とが解離すると、フルオロホアによって放出された蛍光がもはや消去されないので、その結果として検出可能な蛍光変化が生じる。ＰＣＲ産物の指数関数的増殖中にアンプリコン特異的蛍光がある点まで増加したとき、配列検出アプリケーションが、複合スペクトルに多成分化アルゴリズムを適用し、その後、該蛍光は非増幅サンプルのバックグラウンド蛍光から識別できる。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７９００ＨＴ配列検出器はまた、サンプル用の閾値サイクル（ＣＴ）（蛍光が予め決定された閾値以上に増加するサイクル）を決定するソフトウェアアプリケーションを含む。ＰＣＲ陰性サンプルは、実行された全サイクル数に等しいＣＴを有しており、ＰＣＲ陽性サンプルは実行された全サイクル数よりも少ないＣＴを有している。
【００４７】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、多くの方法によって合成できる。例えば、Ｏｚａｋｉら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：５２０５−５２１４；Ａｇｒａｗａｌら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：５４１９−５４２３である。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、ＡＢＩ ３９００ ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような全自動ＤＮＡシンセサイザーで合成できる。得られるオリゴヌクレオチドのハイブリド形成効率に不利な影響を与えることがなければ、ホスホロチオエート、ホスホラミデートなどのような非天然主鎖基を生じる代替化学薬品も使用できる。
【００４８】
本発明のＰＣＲ増幅段階は当業界で公知の標準技術によって実行できる（参照：例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｕ．Ｓ．特許４，６８３，２０２；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓら，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）；これらの文献はいずれも参照によって本発明に組込まれるものとする）。ＰＣＲサイクル反復条件は典型的には、ＰＣＲ反応混合物を約８０℃から約１０５℃までの範囲の温度で約１から約１０分間加熱することによって行う初期変性段階を含む。熱変性後に典型的には約２０から約５０サイクルの範囲の複数サイクルを行う。各サイクルは通常は、初期変性段階、プライマーアニーリング段階を順次に含み、プライマー伸長段階で終了する。あるいは、各サイクルが、約８０℃から約１０５℃までの範囲の１つの温度での変性段階、次いで、約６０℃から約７５℃までの範囲のより低い温度でのプライマーアニーリング／伸長段階を含んでもよい。核酸ポリメラーゼ例えばＴａｑポリメラーゼによるプライマーの酵素伸長はその後のサイクルで鋳型として使用できる鋳型のコピーを産生する。誤ったプライミングおよび非特異的アンプリコンの生成を排除するために本発明の方法に組合せて“ホットスタート”ＰＣＲ反応を使用するとよい。このために、本発明の好ましい実施態様において、核酸ポリメラーゼがＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲサイクル反復条件が“ホットスタート”ＰＣＲ反応を含む。該ポリメラーゼは、活性化までは不活性であり、ＰＣＲサイクル反復に先立ってＰＣＲ反応成分を９５℃で約１０分間温置することによって活性化できる。同様の初期温置段階を含むＰＣＲ方法は当業界で“ホットスタート”ＰＣＲアッセイとして知られている。
【００４９】
本発明の１つの実施態様において、ここに記載したＴａｑＭａｎ Ｑ−ＰＣＲアッセイ用のオリゴヌクレオチドプローブは長さ約１５から４０ヌクレオチドの範囲である。別の実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは長さ約１５から３０ヌクレオチドの範囲である。本発明の第三の実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは長さ約１８から２８ヌクレオチドの範囲である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの正確な配列および長さは、それが結合する標的ポリヌクレオチドの種類に部分的に左右される。結合場所および長さは特定の実施態様に適したアニーリングおよびメルティング特性が得られるように変更し得る。オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は好ましくは阻止するようにまたは核酸ポリメラーゼによる伸長ができないようにする。ＤＮＡポリメラーゼはヌクレオチドを３’ヒドロキシルだけに付加できるが３’ホスフェートには付加できないので、このようなブ阻止は３’末端ヌクレオチドのリン酸化によって行うのが好都合である。
【００５０】
本発明のフルオロホアは５’端、３’端またはどちらかの末端の内側を含むプローブのいずれかの場所でプローブに付着できる。すなわち、該フルオロホアはプローブがその検出を目的として設計された標的ＤＮＡにハイブリド形成できる特異的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドのいずれかに付着できる。本発明の１つの実施態様において、フルオロホアは特異的ヌクレオチド配列の５’末端ヌクレオチドに付着され、消去剤は、特異的ヌクレオチド配列の３’末端ヌクレオチドに付着される。本発明に使用されるフルオロホアは好ましくは、連結部分を介してプローブの３’炭素または末端５’炭素に付着するように誘導体化された有機蛍光色素である。消去剤分子もまた好ましくは有機色素であり、これは蛍光性でも非蛍光性でもよい。一般に、消去剤が蛍光性であるかまたはリポーターから移動してきたエネルギーを非放射状減衰によって放出するだけであるかにかかわりなく、消去剤の吸光バンドはリポーター分子の蛍光発生バンドと実質的に重なり合っていなければならない。励起リポーター分子からエネルギーを吸収するが放射状にエネルギーを放出しない非蛍光消去剤分子を“暗消去剤”または“非蛍光消去剤”と呼ぶ。
【００５１】
いくつかのフルオロホア−消去剤の組合せが当業界で記載されている。参考文献は例えば、Ｐｅｓｃｅら，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７１）；Ｗｈｉｔｅら，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ ２０ Ｙｏｒｋ（１９７０）；などである。文献はまた、蛍光および非蛍光分子とそれらの対応光学特性を網羅したリストを与える参考書、例えばＢｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｒｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９７１）を含む。さらに文献のうちには、オリゴヌクレオチドに付加できる共通反応性基を介して共有結合するようにリポーター分子および消去剤分子を誘導体化するための広汎な指導書が存在する。参照：例えばＵ．Ｓ．特許３，９９６，３４５および４，３５１，７６０。代表的なフルオロホア−消去剤の組合せは、フルオレセインを含むキサンテン色素およびローダミン色素から選択し得る。オリゴヌクレオチドに付着する結合部位または結合性官能基として使用できるフェニル部分に置換基をもつこれらの化合物の多くの適当な形態が広く入手可能である。別のグループの蛍光化合物はアルファまたはベータ位にアミノ基を有しているナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物は、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートを含む。他の色素としては、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、アクリジン類例えば９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンズオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンズオキサジアゾール、Ｄスチルベン、ピレンなどがある。
【００５２】
本発明の１つの実施態様において、フルオロホアおよび消去剤分子はフルオレセインおよびローダミン色素から選択される。これらの色素およびオリゴヌクレオチドに付着させる適当な連結方法は当業界で公知である。参照：例えばＭａｒｓｈａｌｌ，１９７５，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．７：２９９−３０３；およびＵ．Ｓ特許５，１８８，９３４。本発明の好ましい１つの実施態様において、フルオロホアは、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社が専有権をもつフルオロホアＶＩＣ；６−カルボキシ−４’， ５’−ジクロロ−２’，７’ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；および、５−テトラクロロ−フルオレセイン（ＴＥＴ）から成るグループから選択される。本発明の別の実施態様において、消去剤分子は６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）のような蛍光性である。好ましくは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な、合成中にオリゴヌクレオチドに付着できる市販の連結性部分を使用する。
【００５３】
本発明の１つの実施態様において、ＩＳ１／プラスミドコピー比は、ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列とを増幅することによって決定される。この場合、プラスミドＤＮＡの第一および第二のヌクレオチド配列が核酸ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドセットとの存在下で個別に増幅される。第一ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、（ｉ）ＩＳ１ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）第一場所の下流のＩＳ１ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーとおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブとから構成され、該プローブは第一場所と第二場所との間のＩＳ１ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、（ｉ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーとおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブとから構成され、該プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。核酸ポリメラーゼは、増幅中に蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化が第一および／または第二のヌクレオチド配列の増幅の発生に対応する。別の実施態様において、第一および第二のヌクレオチド配列が多重モードで同時に増幅される。
【００５４】
本発明の別の実施態様において、ＩＳ１のヌクレオチド配列を増幅できる順方向および逆方向のＰＣＲプライマーは、それぞれＩＳ１−Ｑ−Ｆ（５’−ＡＧＧＣＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＣＣＣＣＡ−３’；配列６）およびＩＳ１−Ｑ−Ｒ（５’−ＡＣＧＧＴＴＧＴＴＧＣＧＣＡＣＧＴＡＴ−３’；配列７）から構成され、蛍光プローブはＩＳ１−Ｑ−Ｐ２（５’−ＣＧＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧ−３’；配列８）から構成されており、該プローブは上述のようにフルオロホアと消去剤分子とによって標識されている。１つの実施態様において、ＩＳ１−Ｑ−Ｆプローブの３’末端が消去剤分子ＴＡＭＲＡで標識され５’末端がフルオロホアＦＡＭで標識されている。本発明のこの部分の別の実施態様において、ＩＳ１ヌクレオチド配列と共に増幅されるＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列が、ＣＭＶプロモーター配列（例えばヒトＣＭＶプロモーター）を非限定的に含むプラスミドＤＮＡのプロモーター配列である。１つの実施態様において、ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列を増幅できる順方向および逆方向のＰＣＲプライマーは、それぞれＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（５’−ＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡ−３’；配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（５’−ＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴ−３’；配列４）から構成され、蛍光プローブはＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（５’−ＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧ−３’；配列５）から構成され、該プローブは、上述のようにフルオロホアと消去剤分子とによって標識されている。１つの実施態様において、ＩＳ１−Ｑ−Ｆプローブの３’末端が消去剤分子ＴＡＭＲＡで標識され５’末端がフルオロホアＶＩＣで標識されている。
【００５５】
従って本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、（ｂ）第一クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のプラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量を定量的ＰＣＲアッセイによって測定し、該アッセイでＩＳ１ヌクレオチド内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列とを増幅してＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する段階と、（ｃ）第一クローナルサブタイプのＩＳ１／プラスミドコピー比を同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも１つの第二クローナルサブタイプのＩＳ１／プラスミドコピー比に比較する段階と、（ｄ）相対的に低いＩＳ１／プラスミドコピー比を示すクローンを選択し、この相対的に低いＩＳ１／プラスミドコピー比を示すクローンを有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定する段階とおよび（ｅ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。
【００５６】
先に記載したように、第二の多重Ｑ−ＰＣＲアッセイは、試験した大腸菌クローナルサブタイプのプラスミドＤＮＡサンプル中の残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１の予測量を計算するために開発され、ＩＳ１転位活性の増加をより正確に定量することによって開示した遺伝子選択プロセスの特異性を増強できる。標準のプラスミドＤＮＡの調製において、ゲノムＤＮＡは変性タンパク質と共沈され、プラスミドＤＮＡから分離され、廃棄される。従って、細菌細胞発酵物から単離されたプラスミドＤＮＡサンプルは主としてプラスミドＤＮＡを含み、少量のゲノムＤＮＡが混入し得る。例えばＱＩＡＧＥＮカラムで精製したプラスミドＤＮＡは３．３重量％までのゲノムＤＮＡを含有するであろう（Ｖｉｌａｌｔａら，２００２，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０１：１５１−１５３）。ゲノムＤＮＡの混入は少量であろうが、本発明のＱ−ＰＣＲアッセイは高感度なのでこの残留ゲノムＤＮＡ内部に局在するＩＳ１トランスポゾンを検出できるであろう。本文中に記載のＩＳ１／プラスミドコピー比アッセイは、プラスミドＤＮＡ内部に局在するＩＳ１とゲノム／染色体ＤＮＡ内部に局在するＩＳ１とを識別できないので、ベースライン残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１の量を知るためにこの第二の多重Ｑ−ＰＣＲを開発した。従って、本発明の１つの実施態様において、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピーの予測量が定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定され、プラスミドコピー数に基づくＩＳ１コピーの相対量（すなわちＩＳ１トランスポゾンコピー数）を表す上述のＩＳ１／プラスミドコピー比が、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピーの予測量を減算することによって補正される。上述のように、ＩＳ１／プラスミドコピー比アッセイはプラスミドに基づくＩＳ１と染色体に基づくＩＳ１とを識別できないので、Ｑ−ＰＣＲアッセイは、残留ゲノムＤＮＡに起因すると思われるＩＳ１の量を補正するために、染色体ＤＮＡ中のベースラインＩＳ１と同様の量で存在すると考えられる染色体ＤＮＡの成分を測定する。例えば、大腸菌Ｋ−１２ゲノム中には６から８コピーのＩＳ１が存在し（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，１９９６；前出）、発明者／出願人によるサザンブロット実験はＤＨ５細胞中のＩＳ１コピー数が６または７であることを示した（実施例２参照）。同様に、２３ｓ ｒＤＮＡ遺伝子が大腸菌ゲノム中に７コピー／細胞で存在する（Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ａｎｄ Ｎｏｍｕｒａ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｆ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，２：１３５８−１３８５）。従って、単離プラスミドＤＮＡサンプル中の２３ｓ ｒＤＮＡコピーの定量は、開示したＱ−ＰＣＲアッセイで測定される残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピー数の適正な概数を与える。
【００５７】
従って、本発明の１つの実施態様において、上述のように、ＩＳ１／プラスミドコピー比が、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピーの予測量を減算することによって補正され、この場合、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１コピーの予測量がＱ−ＰＣＲアッセイで測定される。別の実施態様において、該Ｑ−ＰＣＲアッセイは、２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列とＩＳ１／プラスミドコピー比を生成するために使用したＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの同じヌクレオチド配列とを増幅することによってプラスミドコピー数に基づく２３ｓ ｒＤＮＡの相対量を測定して２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成し、これをＩＳ１／プラスミドコピー比から減算して“補正”ＩＳ１／プラスミドコピー比を与える。
【００５８】
本発明の別の実施態様において、２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比は、２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの同じヌクレオチド配列（すなわち、ＩＳ１／プラスミドコピー比を生成するときに増幅された第二ヌクレオチド配列）とを増幅することによって決定され、この場合、２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部に局在するヌクレオチド配列および第二ヌクレオチド配列が、核酸ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドセットとの存在下で個別に増幅される。２３ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、（ｉ）２３ｓ ｒＤＮＡ配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）第一場所の下流の２３ｓ ｒＤＮＡ配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーとおよび（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブとから構成され、該プローブは第一場所と第二場所との間の２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、（ｉ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、（ｉｉｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブとから構成され、該プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成する。核酸ポリメラーゼは、増幅中の蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出される。ここにおいて該蛍光変化は、２３ｓ ｒＤＮＡ配列および／または第二ヌクレオチド配列の増幅に対応する。別の実施態様において、該２３ｓ ｒＤＮＡ配列および第二ヌクレオチド配列が多重モードで同時に増幅される。
【００５９】
別の実施態様において、大腸菌ゲノムＤＮＡ内部の２３ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を増幅できる順方向および逆方向のＰＣＲプライマーは、それぞれ２３ｓ−Ｆ１Ｄ（５’−ＧＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＧＡＴＡＣＡＧ−３’；配列１１）および２３ｓ−Ｒ１Ｄ（５’−ＧＴＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣＡＴＣＧＡ−３’；配列１２）から構成され、蛍光プローブは、２３ｓ−Ｐｆａｍ（５’−ＣＣＣＣＧＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＧ−３’；配列１３）から構成され、該プローブは上述のようにフルオロホアおよび消去剤分子の双方によって標識されている。１つの実施態様において、２３ｓ−Ｐｆａｍプローブの３’末端が消去剤分子ＴＡＭＲＡで、５’末端がフルオロホアＦＡＭで標識されている。本発明のこの部分の別の実施態様において、２３ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列と共に増幅されるＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列が、ＣＭＶプロモーター配列（例えばヒトＣＭＶプロモーター）を非限定的に含むプラスミドＤＮＡのプロモーター配列であり、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶコピー比が生成される。
【００６０】
本発明はさらに、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、（ｂ）第一プラスミドＤＮＡサンプル中のプラスミドコピー数に基づくＩＳ１トランスポゾンコピーの相対量を定量的ＰＣＲアッセイによって測定し、該アッセイがＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列とを増幅してＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する段階と、（ｃ）該第一プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量を、プラスミドコピー数に基づく２３ｓ ｒＤＮＡの相対量を測定する定量的ＰＣＲアッセイで計算し、該アッセイが２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部に局在するゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列と段階（ｂ）の第二ヌクレオチド配列との双方を増幅して２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成する段階と、（ｄ）２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比をＩＳ１／プラスミドコピー比から減算して補正ＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する段階と、（ｅ）第一プラスミドＤＮＡサンプルから得られた補正ＩＳ１／プラスミドコピー比を第二プラスミドＤＮＡサンプルから得られた補正ＩＳ１／プラスミドコピー比に比較する段階と、（ｆ）相対的に低い補正ＩＳ１／プラスミドコピー比を示すクローンを選択し、相対的に低い補正ＩＳ１／プラスミドコピー比を示すクローンを有力な高生産性クローナルサブタイプとして同定する段階とおよび（ｇ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて、高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。本発明のこの部分の１つの実施態様において、ＩＳ１トランスポゾン挿入非含有と判定されたプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列は、プラスミドＤＮＡのプロモーター領域（ＣＭＶプロモーター領域を含むが、これに限定されない。）であり、従って例えばＩＳ１／ＣＭＶおよび／または補正ＩＳ１／ＣＭＶコピー比が生成される。
【００６１】
詳細に上述した遺伝子選択方法は、一方で、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌サブタイプ中のＩＳ１挿入性突然変異原性の程度がプラスミドＤＮＡ自体のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定することによって評価される段階を含み、本発明はさらに、クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ中のＩＳ１挿入性突然変異原性の増加を検出する段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプを選択するためのより進歩した方法に関する。高スループット分析が可能なＰＣＲに基づくアッセイは、ＩＳ１挿入を受容すると予め決定されたゲノムＤＮＡの領域（すなわち、“予め決定されたＩＳ１挿入領域”）内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出すると期待される。この予め決定された領域内部のＩＳ１トランスポゾン挿入の有無を非形質転換細菌株のゲノムＤＮＡに存在するベースラインＩＳ１トランスポゾンと混同してはならない。どちらかと言えばこの予め決定されたＩＳ１挿入領域へのＩＳ１挿入はプラスミドＤＮＡによる細菌細胞の形質転換後に生じる。後出の実施例２で参照できるように、ＲＦＬＰプロファイルは、低生産性ＤＮＡワクチンクローンと細菌ゲノムＤＮＡ内部のＩＳ１コピー数の増加との間に相関関係があることを示す。従って本発明はさらに、クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡのＩＳ１挿入領域として予め決定された領域（すなわち、“予め決定されたＩＳ１挿入領域”）内部の１つ以上のＩＳ１トランスポゾン挿入配列の有無を検出する段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関する。この方法において、ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプは高生産性クローナルサブタイプを表す。
【００６２】
この目的の本発明は、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法に関し、この方法は、（ａ）該クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出し、該ＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、（ｂ）該有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階とを含む。ここにおいて高生産性クローナルサブタイプは高プラスミドコピー数／細胞を示す。ＰＣＲ（定量的ＰＣＲアッセイ（“Ｑ−ＰＣＲ”）を含むが、これに限定されない。）に基づくアッセイは、ゲノムＤＮＡの該所定ＩＳ１挿入領域の内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出するために使用できる。細菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ内部のＩＳ１挿入領域の場所を決定するプロセスは後出の実施例５に詳細に記載する。
【００６３】
本発明の１つの実施態様において、大腸菌の形質転換後のＩＳ１挿入を受容すると予め決定された大腸菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの部分の内部のＩＳ１挿入性突然変異原性を検出するためにＱ−ＰＣＲアッセイを使用する。この予め決定されたＩＳ１挿入領域は該ゲノムＤＮＡの約２０未満の連続ヌクレオチドの範囲である。該ＩＳ１挿入領域が該ゲノムＤＮＡの約２０未満の連続ヌクレオチドの範囲であるとき、ここで該領域を特異的“ＩＳ１挿入部位”と呼ぶ。ＴａｑＭａｎ Ｑ−ＰＣＲアッセイは、この予め決定されたＩＳ１挿入領域（すなわち、ＩＳ１挿入部位）を含有するゲノムＤＮＡの部分の増幅を試みることによってこのＩＳ１挿入部位内部のＩＳ１挿入配列の有無を検出するように意図されている。考察アッセイの概略図を図７Ａに示す。ＩＳ１挿入部位にまたがるように設計された蛍光プローブを使用するならば予め決定されたＩＳ１挿入部位にＩＳ１挿入配列が全く挿入されていないときだけ正常な増幅およびシグナル発生が存在する。
【００６４】
従って本発明の１つの実施態様において、核酸ポリメラーゼとならびに（ｉ）消去剤分子と固有発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識されておりゲノムＤＮＡのＩＳ１挿入領域内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないときにだけＩＳ１挿入領域にまたがるゲノムＤＮＡ内部の１つの場所にハイブリド形成する蛍光プローブ、（ｉｉ）蛍光プローブの上流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーおよび（ｉｉｉ）蛍光プローブの下流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーから構成されたオリゴヌクレオチドセットとの存在下で、ＩＳ１トランスポゾン領域を受容することが予め決定されたゲノムＤＮＡの領域を増幅する段階を含む定量的ＰＣＲアッセイを意図する。蛍光プローブがゲノムＤＮＡにハイブリド形成したときに、核酸ポリメラーゼは、増幅中の蛍光プローブを消化して該フルオロホアを該消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出される。この蛍光変化は、ゲノムＤＮＡの増幅に対応し、したがって、ＩＳ１挿入部位がＩＳ１トランスポゾン配列を含有しないことを確証する。このように、蛍光の変化は、有力な高生産性クローナルサブタイプの同定を表し、したがって、それが実際に高生産性クローンであるか否かを確認するためにその比産生率を小規模発酵系で評価できる。あるいは、推定低生産性クローン（すなわち、予め決定されたＩＳ１挿入部位内部にＩＳ１トランスポゾンを含有するクローン）のゲノムＤＮＡに順方向および逆方向ＰＣＲプライマーだけのハイブリド形成が生じるとき、ゲノム鋳型は容易に増幅されるが、蛍光プローブはＩＳ１挿入部位にハイブリド形成できないので、蛍光シグナルは検出されない（図７Ａ）。重要なことは、このアッセイが多重化を必要としないこと、および、全細胞溶解液で行うことができるのでゲノムＤＮＡ単離の必要性が削除されることである。このアッセイに使用するＴａｑＭａｎプローブは典型的には約１５から約４０ヌクレオチドの範囲の長さなので、ゲノム特異的プローブの適正な結合を確保するためには、同定されたＩＳ１挿入部位がゲノムＤＮＡ配列の比較的狭い領域、好ましくは約２０未満のヌクレオチド内部に局在しなければならない。
【００６５】
本発明の別の実施態様において、形質転換後にＩＳ１挿入を受容することが予め決定された大腸菌クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの部分内部のＩＳ１挿入性突然変異原性の増加を検出するためＰＣＲに基づくアッセイを使用する。この予め決定されたＩＳ１挿入領域は該ゲノムＤＮＡの約２０以上の連続ヌクレオチドの範囲である。意図されたアッセイの概略図を図７Ｂに示す。該ＩＳ１挿入領域が該ゲノムＤＮＡの約２０ヌクレオチド以上の範囲であるならば、ここではこの領域を“ＩＳ１挿入ホットスポット”と呼ぶ。意図されたＰＣＲアッセイは、ＩＳ１挿入領域の外部（すなわち、ＩＳ１挿入ホットスポットの外部）のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する１つのＰＣＲプライマーと、ＩＳ１挿入ホットスポットの内部に局在するゲノムＤＮＡのＩＳ１トランスポゾン配列にハイブリド形成する第二のＰＣＲプライマーとを使用する。双方のプライマーのハイブリド形成は、ほぼ既知の目標鎖長のプライマー鋳型のフラグメントの指数関数的増幅を生じ、したがって、推定低生産性クローンの同定という結果を与える。あるいは、ＩＳ１挿入ホットスポット内部のＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないと、１つのプライマーだけがゲノムＤＮＡにハイブリド形成し、鋳型ＤＮＡの１つの鎖の一次関数的増幅を生じ、したがって、有力な高生産性クローナルサブタイプの同定という結果を与える。理論的にはＩＳ１挿入ホットスポット内部のＩＳ１トランスポゾン配列にハイブリド形成すると意図された第二ＰＣＲプライマーが、該挿入ホットスポット外部のＩＳ１トランスポゾン配列（すなわち、非形質転換細胞のゲノム内部に存在するベースラインＩＳ１トランスポゾン）にハイブリド形成することもあり得るが、２つのＰＣＲプライマーがハイブリド形成するゲノムＤＮＡ内部の特異的場所およびＩＳ１ホットスポットの場所を知ることによって、推定低生産性クローンから増幅されたＤＮＡの目標鎖長は、該アッセイを全細胞溶解液または精製ゲノムＤＮＡを使用して行うときに容易に概算できる。
【００６６】
従って、本発明の１つの実施態様において、（ｉ）ＩＳ１挿入領域外部（すなわち、ＩＳ１挿入ホットスポットの外部）のゲノムＤＮＡの場所にハイブリド形成する第一ＰＣＲプライマーと、（ｉｉ）所定ＩＳ１挿入領域のＩＳ１トランスポゾン配列内部の場所にハイブリド形成する第二ＰＣＲプライマーとから構成されるオリゴヌクレオチドセットを使用し、予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出するＰＣＲアッセイが意図されている。このアッセイでは、ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の存在は双方のＰＣＲプライマーのハイブリド形成および増幅による該ゲノムＤＮＡの指数関数的増幅という結果を与え、ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在は第一のＰＣＲプライマーだけのハイブリド形成および増幅によるゲノムＤＮＡの一本鎖だけの一次関数的増幅という結果を与える。ゲノムＤＮＡの指数関数的増幅は、ほぼ目標サイズの増幅核酸フラグメントの同定によって目視検出される、または、二重鎖増幅ＤＮＡに結合する核酸染料（例えばＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ）を添加することによってリアルタイムで蛍光的に検出できる。あるいは、蛍光発生プライマー（例えばＬＵＸＴＭプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して蛍光の指数関数的増加を測定できる。ＩＳ１挿入ホットスポット内部にＩＳ１トランスポゾン配列が存在しないクローンにおいても蛍光シグナルが予想されることに留意しなければならない。しかしながら、このような情況のシグナル増加は、双方のＰＣＲプライマーのハイブリド形成から生じる指数関数的増加でなく一次関数的増加であろう。アッセイはまた、ＩＳ１挿入ホットスポット内部でＩＳ１トランスポゾン配列がどちらの配向でも挿入できることを考慮しなければならない。この可能性を考慮して内部ＩＳ１プライマーを両方向で使用し、個々のプライマーでサンプル毎に個別の２つのアッセイを行うかまたは両方のプライマーを使用してクローン集団をスクリーニングすることもできる。
【００６７】
低産生現象はＩＳ１挿入性突然変異に相関関係を有するので、ＩＳ１コピーが完全に除去された大腸菌宿主株は高生産性クローンのより均一な集団を生じると見込まれる。このため、本発明はさらに、該プラスミドＤＮＡによる細菌株の形質転換に先立って細菌ゲノムＩＳ１のコピーを完全除去するために大腸菌宿主菌株を変異させる段階を含む、プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの生成方法に関する。本発明はさらに、ＩＳ１コピーが完全除去された突然変異大腸菌宿主菌株（変異ＤＨ５株を含むが、これに限定されない。）および、プラスミドＤＮＡを繁殖させるための該菌株の使用に関する。
【００６８】
大腸菌の欠失的または破壊的変異を構築するためにはＰ１ファージ形質導入、トランスポゾン媒介ランダム変異原性および普遍（ＲｅｃＡ介在）相同的組換えを含むいくつかの方法が存在する。通常各変異に選択可能マーカー例えば抗生物質耐性が必要なので、これらの方法は単一変異だけに適している。代替方法は、所望破壊部位の周囲のフランキング配列に相同なプライマーに３６−から５０−ｎｔの伸長をもつＰＣＲ産物と、ラムダ−Ｒｅｄリコンビナーゼとの使用を含む（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ ９７：６６４０−６６４５）。この場合にも選択可能マーカーをやはり使用する。しかしながら、マーカーは後で除去することができ、以後の変異サイクルにはその使用が免除される。残留“瘢痕”を除去する修正方法は、選択可能マーカーを除去するために内因性二重鎖の破壊修復プロセスを利用する（Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏら，２００２，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：６４０−６４７）。この方法は、４４のうちの２４の転位可能要素の除去を含む８．１％のゲノムサイズ短縮を伴う大腸菌のＫ−１２株を産生するために使用された。この菌株では７つのＩＳ１コピーのうちの３つが除去された。残りの４コピーの除去が菌株の生存適性またはフェッドバッチ発酵プロセスでの使用適性に有害な効果を与えない可能性は極めて高い。しかしながら、Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏらの修正方法は、二重鎖の破壊修復プロセスにＲｅｃＡを必要とするので大腸菌ＤＨ５株には適していないことに注目されたい。別の方法は、グループＩＩイントロン、いわゆる“ターゲトロン”を使用して相補的配列の１４−から１６−ｎｔ領域に基づく変異を生じさせる（Ｚｈｏｎｇら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：１６５６−１６６４）。この方法も選択可能マーカーを使用するが多重挿入ができるように後で除去できる。しかしながら、この方法は、上記の２つの方法のように標的部位の欠失を生じるのでなく破壊を生じるものである。この方法の使用では、トランスポゾンによってコードされている主要トランスポザーゼ遺伝子（ｉｎｓＡＢ）中に破壊されている７つの非機能ＩＳ１コピーを内包する菌株が与得られるであろう。
【００６９】
ここに記載の形質転換大腸菌クローンに内包されたプラスミドＤＮＡベクターは、有益なバイオ化合物をコードする（１つ以上の）遺伝子、すなわちトランスジーンを含有するいかなる染色体外ＤＮＡ分子でもよい。プラスミドは、微生物細胞（例えば大腸菌）中のその維持および繁殖と以後の動物宿主体内でのトランスジーンの発現との双方に必要な要素を含有する。細菌繁殖のためには、適格な形質転換体選択用の選択可能マーカーのようなプラスミドにコードされた複製に必要な機能に加えて複製起点が必要である。遺伝子発現のためには、プラスミドが動物体内に導入されたときにトランスジーンの一過性産生が最大になるようにプラスミドを設計しなければならない。遺伝子発現に役立つプラスミドの成分は非限定的に、真核性プロモーター、転写終結およびポリアデニル化シグナル、（１つ以上の）エンハンサー要素を含む。動物細胞での組換遺伝子発現のために選択されたプロモーターは同種でも異種でもよく、構成性でも誘導性でもよく、非限定的に、ヒトサイトメガロウイルス／前初期（ＣＭＶｌＥ）、サルウイルス／初期（ＳＶ４０）、ヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１α）およびヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）由来のプロモーターを含む。プラスミドＤＮＡは平均的な技量の当業者に公知の技術を使用して組換え操作できる。参照：例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．＆ Ｗｉｌｅｙ（１９８７）。双方の文献は参照によって本発明に組込まれるものとする。
【００７０】
本発明に関係して使用し得る方法および材料を記載および開示する目的でここに引用したすべての刊行物は参照によって組込まれる。しかしながら、本発明が、従来発明によるこのような開示のために、先行していないと認めたと解釈してはならない。
【００７１】
本発明の好ましい実施態様を添付図面に基づいて記載したが、本発明がこれらの具体的な実施態様に限定されないこと、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲または要旨を逸脱することなく当業者による本発明の様々な変更および修正が可能であることを理解されたい。
【００７２】
本発明の代表として以下の実施例を与えたが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００７３】
ＤＮＡワクチンプラスミド中のＩＳ１トランスポゾンの同定
菌株、ＤＮＡワクチンプラスミドおよび増殖培地−すべてのＤＮＡワクチン構築物の宿主菌株は大腸菌ＤＨ５［Ｆ’ｄｅｏＲ ｒｅｃｋＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−，ｍｋ＋）ｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］である。この菌株は先ずＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；以前のＧｉｂｃｏ ＢＲＬ）から購入し、限定培地ＤＭＥ−Ｐ５に適応させ、後で形質転換させるために電気受容性にした。大腸菌ＤＨ５α［Ｆ−φ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−，ｍｋ＋）ｇａｌ− ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ− ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した電気受容性細胞であった。ＨＴＶ ＤＮＡワクチンプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆの構築は国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２、２０００年１２月１５日出願（国際公開ＷＯ ０１／４３６９３、２００１年６月２１日公開）に詳細に記載されている。簡単に説明すると、ＤＮＡワクチンプラスミドは、ｐＵＣ−１９由来の細菌性複製起点と、大腸菌中の維持および選択用のネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）と、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターと、イントロンＡと、ＨＩＶ由来トランスジーンの真核性発現用のウシ成長ホルモンターミネーター／ポリアデニル化シグナルとから構成されている。形質転換は、標準プラクティスに従って電気穿孔で行った。脱水ＬＢブロスおよびＬＢ寒天はＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から購入し、製造業者の指示通りに調製した。滅菌ＳＯＣ培地（形質転換後の回収用）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。限定培地ＤＭＥ−Ｐ５は、７ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、７ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、６ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｇ／ｌのＬ−グルタミン酸、１０ｇ／ｌのグリセロールおよび０．５ｇ／ｌのＮａＣｌを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整する。滅菌後１リットルあたり８．３ｍｌのネオマイシン／サイアミン／ＭｇＳＯ４溶液および１ｍｌの微量元素溶液を添加した。１２０×のネオマイシン／サイアミン／ＭｇＳＯ４溶液は２４ｇ／ｌのサイアミン−ＨＣｌ、２４０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび９．６ｇ／ｌの硫酸ネオマイシンを含有している。１０００×の微量元素溶液を１．２ＮのＨＣｌに溶解した。これは、２７ｇ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／ｌのＺｎＣｌ２、２ｇ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．３ｇ／ｌのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび０．５ｇ／ｌのＨ３ＢＯ３を含有する。
【００７４】
結果
ＬＢ培地で調製した大腸菌ＤＨ５を１μｌのＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆで形質転換し、ＳＯＣ培地に回収した。形質転換体をＬＢ／ネオマイシン寒天で平板培養した。ランダムに選択したコロニー（ＮＬＢ−１からＮＬＢ−１０）を使用して１０ｍｌのＬＢ／ｎｅｏ液体培地に接種し、一夜増殖させた。プラスミドＤＮＡの単離用に１ミリリットルのアリコートを採取し、凍結グリセロール予製液も調製した。グリセロール予製液を接種物として使用して新しいＬＢ培養物を調製し、増殖するＬＢ培養物を使用して振盪フラスコ中の２５ｍｌのＤＭＥ−Ｐ５培地に接種した。培地シフトに適応するように培養物をＤＭＥ−Ｐ５中で３回継代させた。三回目の継代後に、１ｍｌのアリコートを採取し、ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニプレップキットでプラスミドＤＮＡを単離した。ＬＢ増殖培養物およびＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物に由来のＤＮＡサンプルを０．７％アガロースゲルに流し、プラスミド含量を確認した（それぞれ図１Ａおよび１Ｂ）。２つのゲルの比較から、ＤＭＥ−Ｐ５サンプルのいくつかは優位種に比べて高い分子量をもつ少数種を含有することが判明したが、ＬＢサンプルでは明らかでなかった（参照：ＮＬＢ−１、−３、−５、−７および−８；図１Ｂの星印の付いたレーン）。１つのサンプルＮＬＢ−８はまた、出発分子のＤＮＡの再編成および排除から形成されたと思われる低分子量の多数種を含有している。サンプルＮＬＢ−１０は主に二量体化分子として存在すると考えられる点で独特であり、これは共有結合または単なる強い物理的会合を表す。
【００７５】
異なる分子量をもつ２つの種の存在はＨＴＶ ｇａｇを含むＤＮＡワクチンプラスミドの同様の培養物中で以前から観察されていた。該培養物は長い緩徐な増殖期を伴うフェッドバッチ培養後にプラスミドＤＮＡの増殖に成功しなかった（“低生産体”または“ＬＰ”と表す）（データ示さず）。この観察後に同様のＤＮＡワクチンプラスミドのサンプル中で転位可能要素ＩＳ１が発見された。Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆのＤＭＥ−Ｐ５増殖培養プレップ中のＩＳ１挿入の可能性を検討するために、高分子量の少数種を含有する５つのＮＬＢ ＤＮＡサンプルをＭｌｕＩで制限酵素消化した。制限消化物は、１μｌのプラスミドＤＮＡ、７μｌのＨ２Ｏ、１μｌの１０×反応バッファ、１μｌの酵素から構成した。消化物を３７℃で〜１時間温置し、次いでゲルに充填するためにおのおのに２μｌの充填用バッファを添加した。ヌクレオチド配列の比較に基づいて、この酵素はＩＳ１フラグメントの内部を切断するが、Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆ配列の内部を切断しないようである。従って、高分子量バンドがＩＳ１を含有するならば、ＭｌｕＩ制限酵素消化は、アガロースゲル上のこれらのバンドが直鎖化し移動するという結果を与える筈である。ＩＳ１非含有種は非消化サンプルに対して移動しない筈である。実際、ＭｌｕＩ消化後、試験した５サンプル全部が直鎖化に符合する高分子量バンドの特徴的移動を示したが、低いバンドはシフトしなかった（図１Ｃ）。
【００７６】
オリゴヌクレオチドプライマーが、ＩＳ１含有フラグメントを増幅し、その存在を追認できる証拠を提供するように設計された。設計されたプライマーは、９ｂｐの非相補的ヌクレオチドとＩＳ１配列の末端に相補的な７または９ｂｐのヌクレオチドとの連鎖から構成されたいわゆる“不完全一致”プライマーであった。このように設計したプライマーは鋳型濃度に感受性であるという明白な効果を有していた。従って、不特定な１つの量よりも多いＩＳ１含量のサンプルだけが増幅されるであろう。ＬＢ増殖細胞およびＤＭＥ−Ｐ５増殖細胞に由来のＮＬＢ−１およびＮＬＢ−２サンプルをＰＣＲ反応の鋳型として選択した。ＬＢ増殖細胞から単離したＮＬＢ−１またはＮＬＢ−２中ではアガロースゲル上の高分子量バンドが明白でなかった。しかしながら、ＤＭＥ−Ｐ５増殖細胞から単離したＮＬＢ−１中では該バンドが明白であったがＮＬＢ−２中ではそうでなかった。ｐＵＣ１９サンプル中に高分子バンドの証拠は存在しなかった（データ示さず）。従って、これを陰性対照として加えた。おそらくＩＳ１はゲノムからプラスミドに転位すると推定できる。従って、ゲノムＤＮＡプレップが大腸菌ＤＨ５およびＤＨ５αに導入された。ゲノムＤＮＡの単離に先立って双方の菌株をＬＢ中で増殖させた。ＱＩＡＧＥＮ製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑＴＭ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬を製造業者の指示通りに使用して全量５０μｌのＰＣＲ反応を設定した。５μｌの各反応液を０．７％アガロースゲルに充填した（図２Ａ）。アガロースゲル分析に符合して、どのＮＬＢサンプルのＬＢ増殖プレップからもＩＳ１の長さに対応するフラグメントの有意な増殖はなかった（レーン２および４）。しかしながら、ＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物のＮＬＢ−１およびＮＬＢ−２のプレップの双方から６５０と８５０ｂｐとの間の移動フラグメントが増幅された（レーン３および５）。ｐＵＣ１９からもどちらのゲノムＤＮＡプレップからも増幅はなく、試験したプラスミドＤＮＡのこれらの調製物中の混入残留ゲノムＤＮＡに見出されたＩＳ１をプライマーが増幅できないことが確認された。増幅フラグメントの同一性を確認するために、２つの陽性サンプルをＭｌｕＩ制限酵素で消化した（３μｌのＰＣＲ反応、５μｌのＨ２Ｏ、１μｌの１０×反応バッファ、１μｌの酵素、３７℃で２時間温置）。この酵素はＩＳ１を１回切断して〜０．４４および〜０．３４Ｋｂのバンドを産生するはずであるが、増幅サンプルではこれらが実際に観察された（図２Ｂ）。
【００７７】
ＮＬＢ−２サンプルのＤＭＥ−Ｐ５増殖プレップ中のＩＳ１の存在は、すべてのＤＭＥ−Ｐ５増殖細胞中に挿入配列が極めて少数ではあるが有意なパーセンテージの集団でまだ存在するという可能性を高めた。この可能性を試験するために、ＬＢ−およびＤＭＥ−Ｐ５増殖細胞の双方からのＮＬＢ−３からＮＬＢ−１０サンプルを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。結果は、ＮＬＢプレップの１０個のＤＭＥ−Ｐ５増殖サンプル全部にＩＳ１フラグメントが実際に存在することを示す（図Ｃ）。ＬＢ増殖プレップからの結果はそれほど明白でない（図２Ｄ）。これらのサンプルの全部で６５０と８５０ｂｐとの間に不鮮明なバンドが存在する。しかしながら、増幅の程度は、ＩＳ１が極めて少量で存在し、プラスミドプレップの染色体混入の結果かもしれないことを示唆する。これらの不鮮明なバンドはまた、プライマーの非特異的結合から生じた伸長を表すものかもしれない。しかしながら、ＤＭＥ−Ｐ５調製物中にＩＳ１配列が存在することは明らかである。また、ＬＢからＤＭＥ−Ｐ５培地へのシフトがプラスミド集団中のＩＳ１の増加を誘導する可能性も極めて高い。
【００７８】
ＤＭＥ−Ｐ５培地で継代させたＮＬＢサンプルを次にＳＦＦ（参照：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出）アセンブリで培養してプラスミドＤＮＡ含量を検査した。１０個のサンプル全部が“低生産性”であると特性決定され、プラスミドＤＮＡ含量は０．８から２．４μｇ ＤＮＡ／ＯＤ２ペレットであった。これらの各サンプル中のＩＳ１転位可能要素の同定は、ＩＳ１の存在が低産生現象の原因ではないかという疑問を浮上させる。
【実施例２】
【００７９】
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を使用する高生産性および低生産性のゲノム中のＩＳ１含量の比較
菌株、ＤＮＡワクチンプラスミドおよび増殖培地については前出の実施例１参照。さらに、不適応の非形質転換細胞はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入しＬＢ培地に維持した。ＨＴＶ ＤＮＡワクチンプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆ（５５４０ｂｐ）の構築は国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２（前出）に詳細に記載されている。ＨＴＶ ＤＮＡワクチンプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌ（７５１６ｂｐ）の構築は国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４、出願日２０００年１２月２１日（国際公開ＷＯ ０１／４５７４８として２００１年６月２８日に公開）に詳細に記載されている。ＨＴＶ ＤＮＡワクチンプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇ（６３７５ｂｐ）の構築は国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２２９３、出願日１９９８年２月３日（国際公開ＷＯ ９８／３４６４０として１９９８年８月１３日に公開）に詳細に記載されている。
【００８０】
ＨＩＶ ＤＮＡワクチン培養物の振盪フラスコ培養およびそのＤＮＡ単離
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇのＨｌＶ ＤＮＡワクチン高生産体（−ＨＰ）および低生産体（−ＬＰ）のクローンを、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に記載された標準高生産体スクリーンを使用して従来同様に単離した。凍結グリセロール予製液の２５μｌのアリコートを使用して２５０ｍｌ振盪フラスコ中の２５ｍｌのＤＭＥ−Ｐ５に接種した。Ｋｕｅｈｎｅｒキャビネット振盪機で３７℃、２２０ＲＰＭで細胞を一夜増殖させ、中期から後期の対数増殖期に採集し、ＤＮＡ単離に使用した。Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌおよびＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆの低生産体（−ＬＰ）クローンは、適応大腸菌ＤＨ５細胞を精製プラスミドＤＮＡで最初に形質転換することによって調製した。形質転換体を回収してＤＭＥ−Ｐ５に平板培養し、振盪フラスコ増殖用の５から１０個の単個コロニーを選択した。対数増殖期の中期から後期に細胞を採取し次サイクルの接種に使用した。このようにして培養物を合計３回継代した。低生産体候補中でプラスミドＤＮＡが増幅できないことは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に記載されているように振盪フラスコ中のフェッドバッチ培養によって確認されており、各構築物あたり１つのクローンを代表的低生産体として保存した。上述したように、これらの凍結グリセロール予製液の２５μｌのアリコートをフラスコ接種に使用し、ＤＮＡ単離用培養物を採取した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して全ＤＮＡを単離した。ＤＮＡペレットを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５に再水和した。Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して高生産性および低生産性サンプルのおのおのからプラスミドＤＮＡを単離した。
【００８１】
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析
非放射性修飾ＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰをＰＣＲによってＤＮＡに組込むために、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＩＳ１特異的プローブ（０．７Ｋｂ）を作製した。プライマーはＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から入手し、プラスミドｐＩＳ１を鋳型ＤＮＡとして使用した。プライマー配列は以下の通りであった：ＩＳ１−Ｆ２，５’−ＧＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＡＴＴＧ−３’（配列１）；ＩＳ１−Ｒ２，５’−ＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＣＴＴＡ−３’（配列２）。使用したＰＣＲ条件は製造業者の指示通りにした。ＤＮＡ消化用制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。各サンプルから消化した全ＤＮＡおよびプラスミド単独ＤＮＡを０．７％アガロースゲルで３４Ｖ、４℃で一夜（〜１６時間）処理した。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ Ｔｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒ（登録商標） Ｒａｐｉｄ Ｄｏｗｎｗａｒｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を製造業者のプロトコル通りに使用してＤＮＡをＮｙｔｒａｎ ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅナイロン膜に１時間転移させた。ＢｉｏＲａｄ ＧＳ Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋｅｒ（登録商標）（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用し１５０ｍＪｏｕｌｅでＵＶ照射することによってＤＮＡが膜に架橋した。一夜温置を伴うフィルターハイブリド形成プロトコルに従ってＤＩＧ標識ＩＳ１プローブをサザンブロット上の標的ＤＮＡにハイブリド形成させた（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。プローブ−標的ハイブリッドを、抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ抗体およびアルカリホスファターゼ基質ＣＳＰＤを使用するエンザイムリンクト化学発光アッセイによって可視化した（フィルターハイブリド形成プロトコル、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００８２】
結果
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイル
酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩの組合せを使用してＤＮＡワクチン構築物Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌの高生産体および低生産体クローンのＩＳ１特異的ＲＦＬＰ分析用フラグメントを作製した。高生産体クローン（ｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰ）は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１（前出）に詳述された標準スクリーニング方法によって従来同様に単離され、凍結実用シードバイアルとして得られた。ＤＭＥ−Ｐ５中で増殖させた高生産体（ｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰ）および低生産体（ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰ）培養物に由来の全ＤＮＡプレップを制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩで消化し、各培養物から単離されたプラスミドＤＮＡはＡｆｌＩＩで消化した。また対照として、予めＤＭＥ−Ｐ５に適応させないＬＢ培地中で増殖させたＤＨ５細胞からゲノムＤＮＡを単離した。サザンブロットを調製し、ＤＩＧ標識ＩＳ１プローブとハイブリド形成させた（図３Ａ）。ＤＨ５（レーン２）およびｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰ（レーン４）のサンプルに６つのＩＳ１含有フラグメントが出現する。最も低い分子量のバンドは他のバンドのほぼ２倍の強度を有しており、このバンドが２つ以上のＩＳ１挿入配列を含有することを示唆する。しかしながらこのフラグメントは２Ｋｂ未満であり、２つの７６８ｂｐのＩＳ１挿入を収容できる十分な大きさではない。最も低い分子量バンドのほうが高い濃度であることは、オーバーラップするＩＳ１含有バンドを示している、または、高分子量バンドに比べて小さいフラグメントのほうがＮｙｔｒａｎ膜への転移効率が高いことを表す。従って、非形質転換ＤＨ５のＩＳ１コピー数は６から７という小さい値であろう。ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰのＩＳ１プロファイル（レーン６）は、ＤＨ５対照にもｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰサンプルにも見出されなかった２つの追加ＩＳ１陽性バンドを含有している。ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰプラスミド単独対照（レーン５）との比較に基づくと、これらの２つのうちの高いほうの分子量のバンド（７−８ｋｂ）がプラスミドＤＮＡに符合する。しかしながら低いほうの３−４ｋｂのバンドは他のサンプルでは全く観察されないので、ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰゲノム中に追加のＩＳ１挿入部位が存在することを強く示唆する。
【００８３】
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイル
酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩを使用してＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆクローンのＩＳ１挿入をプロファイリングすると（図３Ｂ）、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌクローン４で得られた結果と同様の結果が得られた。ＤＨ５対照（レーン２）およびｔｐａ−ｎｅｆ−ＨＰ（レーン４）の双方で６つのＩＳ１含有バンドが明白であり、最も小さいバンドが他のバンドよりも高い強度で存在する。ｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰサンプル中では７つのバンドが可視化され、３番目に大きいバンドは他のバンドよりも明らかに高い強度を有している（レーン６）。このクローンをプラスミド単独サンプル（レーン５）に比較すると、ＩＳ１含有プラスミドはＩＳ１を内包するゲノムＤＮＡフラグメントに極めて近接していることが示される。従って、最も高い強度のバンドは実際には、プラスミドおよびゲノムのＤＮＡフラグメントのバンドの重なり合いの結果である。しかしながら、ＤＨ５対照にもｔｐａ−ｎｅｆ−ＨＰサンプルにも見出されない３−４ｋｂのバンドが残っており、これは上記のｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰサンプルで観察された未同定バンドとほぼ同じ大きさである。これは、低生産性ゲノム中のＩＳ１挿入性突然変異の別の指標である。
【００８４】
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイル
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌおよびＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆの双方の低生産体クローンのＡｆｌＩＩ−ＡｇｅＩ ＩＳ１プロファイルが低生産体のゲノム内部の追加ＩＳ１挿入部位を示したので、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇクローンについても試験し、突然変異が３つのＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ構築物全部に存在するか否かを判定した。しかしながらこの場合の高生産体および低生産体クローンのソースはＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌおよびＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆとは違っていた。双方のクローンは何年も前に単離され、それ以来、実験用シード（ラボシードサンプル）として繁殖され、補給を伴う振盪フラスコ（ＳＦＦ）発酵ステージで高生産体スクリーンの対照として役立てられてきた（参照：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１；前出）。従って、これらのクローンのＤＭＥ−Ｐ５接触時間はｔｐａ−ｐｏｌおよびｔｐａ−ｎｅｆクローンよりもはるかに長い。以前に評価された高生産体と同等の継代時間の凍結実用シードバイアル（実用シードサンプル）も分析のために取得した。ＲＦＬＰ結果は、双方の高生産体クローン由来の全ＤＮＡのＩＳ１プロファイルが同様であることを示すが（図３Ｃ）、ラボシードサンプルには、実用シードサンプル中の３番目に大きいフラグメント（レーン４および５）よりもやや高い位置に不鮮明バンド（レーン７および８）が存在する。このバンドは高生産体ラボシードのプラスミド単独サンプル中にも存在し（レーン６）、従ってプラスミドＤＮＡに起因すると考えられる。実用シードのプラスミド単独サンプル中では、もっと明るいバンドがかろうじて視認できる（レーン３）。このＲＦＬＰ分析はＱ−ＰＣＲ結果に符合し（参照、後出、実施例４）、限定培地中の高生産体の培養時間の延長に伴ってＩＳ１含有プラスミドの画分が増加することを示す。双方の高生産体サンプルのゲノムプロファイルは不適応ＤＨ５対照（レーン１）にも類似している。
【００８５】
上述のｔｐａ−ｐｏｌおよびｔｐａ−ｎｅｆサンプルに等価のｔｐａ−ｇａｇ低生産体は入手できなかったので、この場合にはラボシードだけを評価した（図３Ｃ）。ＲＦＬＰ結果は、ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰおよびｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰと同様に、ｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰ ＩＳ１プロファイル中にプラスミドＤＮＡに対応しない追加バンドが存在することを示す（レーン１０および１１）。しかしながらこのバンドは２−３ｋｂであり、他のクローンで観察されるものよりも小さい。ｔｐａ−ｐｏｌおよびｔｐａ−ｎｅｆと違って、ＩＳ１プローブはｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰサンプルから単離されたプラスミドＤＮＡに結合しなかった（レーン９）。高生産体スクリーンのＳＦＦステージ用低生産体対照という役割のｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰラボシードは、１ｍｇの乾燥細胞重量（ＤＣＷ）あたり＜＜１ｍｃｇのプラスミドＤＮＡを終始産生するが、ｔｐａ−ｐｏｌおよびｔｐａ−ｎｅｆの低生産体は〜２ｍｃｇプラスミドＤＮＡ／ｍｇ ＤＣＷを含有していた。後者の値はランダムに選択した低生産体でより典型的である。従って、ｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰに見出された挿入性突然変異はｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰおよびｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰに見出されたものとは違っている可能性があり、その結果として、クローンのプラスミドＤＮＡ増幅能力にいっそう大きい影響力を有しているコピー数抑制表現型が生じる。
【００８６】
ＤＭＥ−Ｐ５に適応した大腸菌ＤＨ５のＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイル
３つの異なるＤＮＡワクチン構築物の高生産体および低生産体のＩＳ１プロファイルは、全部の低生産体クローンがＩＳ１挿入性突然変異を含有するが、高生産体は不適応ＤＨ５と同様であることを示す。適応の結果としてゲノムのＩＳ１のコピー数が増加する可能性がある。これを試験するために、ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩによるゲノムＤＮＡの消化後に不適応ＤＨ５およびＤＭＥ−Ｐ５適応ＤＨ５の双方のＩＳ１プロファイルを分析した（図３Ｃ）。ＲＦＬＰ結果は、２つの大腸菌ゲノムのＩＳ１の場所に違いがないことを示す（レーン１および２）。従って、低生産体はゲノムのＩＳ１挿入性突然変異に相関関係を有しており、この挿入は形質転換段階後に生じると考えられる。
【実施例３】
【００８７】
Ｖ１Ｊｎｓプラスミド中のＩＳ１トランスポゾン組込み部位
材料および方法
ＤＭＥ−Ｐ５中で繁殖したＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆクローンＮＬＢ−５に由来のプラスミドＤＮＡは実施例１に記載の手順で得られた。挿入非含有の完全プラスミドに相補的な合計１６のオリゴヌクレオチドプライマーを順方向（８）および逆方向（８）の双方で〜７００ｂｐ増加としてアニーリングするように設計した。第二セットのプライマーはＩＳ１挿入配列の順方向端および逆方向端に特異的であった。一連のＰＣＲ反応を以下の構成に設定した：（ｉ）１６のＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆ特異的プライマーの１つと２つのＩＳ１特異的プライマーの１つ、（ｉｉ）鋳型としてクローンＮＬＢ−５プラスミドＤＮＡ、（ｉｉｉ）ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）。ＰＣＲ反応は標準プロトコルで行った。各サンプルを０．７％アガロースゲルで分析して増幅フラグメントを同定した。増幅フラグメントの存在はベクター−ＩＳ１接合を表す予備指標であるが、ミスプライミングイベント（擬陽性）の可能性は排除できない。使用したプライマーはプラスミドＤＮＡの双方のストランドおよびトランスポゾンの可能な双方の挿入方向をカバーしたので、相補的ストランド上の同じ挿入の増幅に符合する第二増幅フラグメントの存在を使用して擬陽性の可能性を削減した。確認された増幅フラグメントのサイズが予備挿入マップを与えた。次に、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングするいくつかの増幅フラグメントを選択し、その後Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して配列決定し、ＩＳ１挿入の正確な場所および配向を同定した。
【００８８】
結果
１つのＩＳ１特異的プライマーと１つのＶ１Ｊｎｓ特異的プライマーとによる一連のＰＣＲ反応を使用し、引き続いて増幅産物を配列決定し、ＮＬＢ−５クローンを使用してＩＳ１挿入場所を同定した（実施例１参照）。部分接合および完全接合の双方が分解され、配列決定によって、トランスポゾンが９ｂｐの標的複製を挿入部位に産生することが確認された。１１の非反復組込み部位が双方の配向のトランスポゾンの挿入と共に同定された。１つの挿入部位が双方の配向で観察された、全部の部位がネオマイシン耐性遺伝子ｎｐｔＩＩのコーディング領域の８５塩基対中またはその内部に存在していた。ＩＳ１挿入は、ｐＵＣ１９のａｍｐＲ遺伝子（ｂｌａ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をｐＵＣ４ＫのｎｅｏＲ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で置換することによって構築されたｐＵＣ−ｎｅｏクローンには見出されなかったので、ネオマイシン耐性遺伝子の存在だけではプラスミド分子に転位を誘発するために十分でない。
【実施例４】
【００８９】
リアルタイムＱ−ＰＣＲを使用するプラスミドコピー数に基づくＩＳ１の相対的定量
菌株、ＤＮＡワクチンプラスミドおよび増殖培地−前出の実施例１および２参照。
プラスミド標準の構築
すべての分子生物学操作は標準プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，前出）に従って行った。酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。ｐＵＣ−ｎｅｏはｐＵＣ１９のａｍｐＲ遺伝子（ｂｌａ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をｐＵＣ４ＫのｎｅｏＲ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で置換することによって構築した。トランスポゾンを含有するプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆのサンプルからＩＳ１の７６８−ｂｐ配列をＰＣＲ−増幅した。該フラグメントをｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしたＩＳ１プラスミド標準ｐＩＳ１を作製し、次いで制限酵素ＥｃｏＲＩを使用して切り出し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してｐＵＣ−ｎｅｏのＥｃｏＲＩ制限部位に結合してプラスミド標準ｐｎＩＱ１を作製した。部分的ＣＭＶプロモーターはＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆから０．７ＫｂのＳｐｅＩ−ＳｐｈＩフラグメントとして抽出し、ＸｂａＩおよびＳｐｈＩで二重消化したｐｎＩＱ１に結合させてプラスミド標準ｐｎＩＱ２を作製した。２３ｓ ｒＤＮＡのフラグメントは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録番号Ｍ２５４５８）の大腸菌Ｋ−１２配列用に設計された以下のプライマーを使用してＤＨ５ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した：２３ｓ−Ｆ１（５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＴＴＣＧＡＣＡＣ−３’：配列９）および２３ｓ−Ｒ１（５’−ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣ−３’：配列１０）。結合を促進するために２３ｓ ｒＤＮＡフラグメントの両端にＢａｍＨＩ制限部位（下線）を含ませた。０．３ＫｂのＰＣＲフラグメントをｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（プラスミドｐ２３ｓＴＡ）にクローニングし、次いでＢａｍＨＩで切り出し、ｐｎＩＱ２のＢａｍＩ部位に結合して最終プラスミド標準ｐｎＩＱ３ｖ２を作製した（図４）。このプラスミドは、完全ＩＳ１配列とＣＭＶプロモーターおよび２３ｓ ｒＤＮＡ配列の部分とを含有しており、これらのすべてがＱ−ＰＣＲアッセイの標的である。プラスミド標準のＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍのＵＶ吸光度（Ａ２６０＝１〜５０μｇ／ｍＬ）によって測定し、標準溶液を得るために１０３−１０８コピー／μＬの希釈液を調製した。
【００９０】
ＤＨ５（Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆ）の振盪フラスコ培養−前出の実施例２参照。
リアルタイム定量的ＰＣＲ−配列検出プライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ．２．０を使用して設計された。非標識プライマーはＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から購入し、蛍光標識プローブはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＴａｑＭａｎプローブは、鋳型ＤＮＡのプライマー間にアニーリングするように設計し、リポーター色素６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが専有権をもつ色素“ＶＩＣ”を５’端、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を３’に含ませた。プライマーＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（５’−ＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡ−３’；配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（５’−ＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴ−３’；配列４）とＶＩＣ−標識ＴａｑＭａｎプローブＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（５’−ＶＩＣ−ＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧ−３’−ＴＡＭＲＡ；配列５）とはＣＭＶプロモーターをマーカーとして用いてプラスミドＤＮＡを定量するように設計した。プライマーＩＳ１−Ｑ−Ｆ（５’−ＡＧＧＣＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＣＣＣＣＡ−３’；配列６）およびＩＳ１−Ｑ−Ｒ（５’−ＡＣＧＧＴＴＧＴＴＧＣＧＣＡＣＧＴＡＴ−３’；配列７）とＦＡＭ−標識ＴａｑＭａｎプローブＩＳ１−Ｑ−Ｐ２（５’−ＦＡＭ−ＣＧＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧ−３’−ＴＡＭＲＡ；配列８）とはＩＳ１を定量するように設計した。ＣＭＶおよびＩＳ１プライマー−プローブセットは、全プラスミドおよびトランスポゾンコピーを定量するために多重モードで使用した。
【００９１】
残留ゲノムＩＳ１の判定に使用する第二アッセイを進めるために、２３ｓ ｒＤＮＡを定量するプライマーおよびプローブを以下のように設計した：２３ｓ−Ｆ１Ｄ（５’−ＧＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＧＡＴＡＣＡＧ；配列１１）、２３ｓ−Ｒ１Ｄ（５’−ＧＴＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣＡＴＣＧＡ；配列１２）およびＦＡＭ−標識ＴａｑＭａｎプローブ２３ｓ−Ｐｆａｍ（５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＣＧＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＧ−ＴＡＭＲＡ；配列１３）。残留ゲノムＤＮＡアッセイでは２３ｓ ｒＤＮＡおよびＣＭＶプライマー−プローブセット（上記参照）を多重モードで使用した。
【００９２】
ＰＣＲは２０μＬ反応容量中に一定容量の１０μＬの２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および２μＬのサンプルＤＮＡ、および、種々の量のプライマーおよびプローブを使用して行った。３８４−ウェルプレートフォーマットを６つのｐｎＩＱ３ｖ２標準の１０倍希釈液と共に使用し、サンプルあたり４から６の重複を行った。サンプルの増幅および蛍光検出はＡＢＩ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で以下の熱サイクル条件で行った：５０℃で２分、９５℃で１０分、次いで、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４０サイクル。
【００９３】
リアルタイム定量的ＰＣＲの分析
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ配列検出システム（ＳＤＳ）ｖ．２．０ソフトウェアを使用してデータ解析を完了した。ＰＣＲ閾値サイクル数（ＣＴ）は、サンプルの蛍光がユーザー限定閾値限界に交差した増幅プロット上の点から計算した。絶対的定量実験では、コピー数対ＣＴの標準曲線プロットを使用して鋳型コピー数を計算した。サンプルの相対的定量は、２−ΔΔＣＴ法（Ｌｉｖａｋ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４０２−４０８）を使用して行った。簡単に説明すると、内在基準に正規化され校正サンプルｃｂに相対的なサンプルｑについて、
【００９４】
【数１】
式中、
ΔＣＴ＝ＣＴ，Ｘ−ＣＴ，Ｒ、標的分子と基準分子との閾値サイクルの差、
ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ，ｑ−ΔＣＴ，ｃｂ、
ＸＮ＝内在基準（Ｒ０）に相対的な標的の正規化量（Ｘ０／Ｒ０）、
Ｅ＝反応の増幅効率。
【００９５】
これらのコピー比アッセイで、ＩＳ１（または２３ｓ ｒＤＮＡ）は標的配列であった。ＣＭＶプロモーターは内在基準であった。全部の未知サンプルは標準物質であるプラスミド標準ｐｎＩＱ２またｐｎＩＱ３ｖ２に比較した（全標的のコピー比１：１）。この方法が正確であるためには、２つの仮定が妥当でなければならない。第一に、すべての反応の増幅効率がほぼ１００％でなければならない。Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用するプライマーおよびプローブの設計はこの要件を満たす高効率試薬を産生した。第二に、標的および内在基準の双方の効率がほぼ同等でその差が０．１以下でなければならない。
【００９６】
プラスミド定量の標的となるＣＭＶプロモーターの配列妥当性検査
完全Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆプラスミドのこれまでのスキャンでは１１の非反復ＩＳ１挿入部位が同定され、これらはいずれもネオマイシン耐性遺伝子の翻訳領域の１００塩基対中または内部に存在しＣＭＶプロモーターから＞５５０塩基対が除去されていた（実施例３）。このプロモーターがＱ−ＰＣＲ標的として（すなわち、ＩＳ１挿入非含有鋳型として）適性を有することを確認するためにＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆのこの領域のＩＳ１挿入を再度試験した。所期の増幅配列内部で挿入が生じるならば、ＣＭＶプライマーおよびプローブは結合せず、コピー数比の計算に有意な誤差が生じるであろう。トランスポゾンを含有することがわかっているＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆのサンプルを鋳型ＤＮＡとして使用し、ＣＭＶプロモーターに相補的な３つのプライマーの１つとＩＳ１の末端に特異的な２つのプライマーの１つとを用いてＰＣＲ反応を行った。挿入配列（７６８ｂｐ）よりも大きいアンプリコンはＩＳ１−プラスミド連結を含有するであろう。しかしながら、プライマーの非特異的結合が擬陽性を生じるであろう。ＣＭＶプロモーター配列に沿った多数の点でプライマーを使用することによって、相補的プライマー対が類似結果を生じないならば非特異的結合に由来の増幅フラグメントは除去できる。０．７Ｋｂよりも大きい５つのアンプリコンが得られたが、２つ以外は上記の判断基準によって非特異的結合の結果として除去された。最後の２つを配列決定し、ＩＳ１挿入がＣＭＶプロモーターの上流のネオマイシン耐性遺伝子の翻訳領域またはその近傍の部位に存在することが知見された。２つの部位の１つは過去の記録がある。従って、ＣＭＶプロモーター領域は、トランスポゾンからの妨害を懸念することなくＱ−ＰＣＲアッセイ中に蛍光プローブの標的として使用できる。
【００９７】
単一反応および多重反応用プライマー−プローブ濃度の最適化
最小量の試薬で最低閾値サイクル（ＣＴ）が得られるように双方の標的配列セット用のプライマーおよびプローブの濃度を最適化した。双方のアッセイの単一反応および多重反応用のＩＳ１、２３ｓ ｒＤＮＡおよびＣＭＶプロモーターなどのプローブ濃度は２００ｎＭに最適化された。ＣＭＶ−Ｑプライマーは１００ｎＭという最適濃度でＩＳ１／ＣＭＶおよび２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶの双方のアッセイで多重化中のスペクトル干渉を減少させることが知見された。次に、ｐＩＳ１またはｐ２３ｓＴＡとＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇ（ＣＭＶプロモーター標的）との調節比混合物に対してＣＭＶプライマー−プローブセットを用い、双方のアッセイのＩＳ１および２３ｓ ｒＤＮＡ用の目標プライマー濃度を多重反応中の１００から７００ｎＭまでの範囲で試験した。５００ｎＭのＩＳ１−Ｑは、ＩＳ１−およびＣＭＶ−単独反応から決定したコピー比に比較したときにＣＭＶ−Ｑプライマーとの多重反応中に最も正確な結果を与え、２００ｎＭの２３ｓ ｒＤＮＡプライマーは、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶ多重反応中に同等の正確度を与えた（データ示さず）。
【００９８】
Ｑ−ＰＣＲアッセイ感度
ＩＳ１／ＣＭＶおよび２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶの双方の多重Ｑ−ＰＣＲアッセイの感度試験を行った。プラスミドＤＮＡに相対的な２３ｓ ｒＤＮＡの定量をスペクトル干渉が有意に阻害する点を決定するためには、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶ Ｑ−ＰＣＲコピー比アッセイで広い分析範囲にわたる２３ｓ ｒＤＮＡ対ＣＭＶフラグメント比を使用する必要がある。プラスミドがＣＭＶプロモーター鋳型のソースであるならば、プラスミド調製物中の残留ゲノムＤＮＡが試験できる比の範囲を限定する。従って、プラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇのＣＭＶプロモーター領域をＰＣＲ増幅し（プライマー５’−ＣＡＣＴＧＴＴＡＧＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣ−３’（配列１４）および５’−ＴＧＡＣＧＡＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＧＡＧ３’（配列１５））、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶ比を＜１．７×１０−５に減少させた。次に、増幅ＣＭＶプロモーターフラグメントをＣＭＶ鋳型として使用し１：１から１：１０５の２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶ比のサンプルを調製した。試験した全部のサンプルの単一および多重（ＣＭＶプライマー−限定）反応結果は同等であり、応答は５桁まで直線状であった（図５）。ＩＳ１／ＣＭＶの感度も同様にして、１０８コピーのＣＭＶプロモーターフラグメント／μＬに組合せた１０３−１０８コピーのｐＩＳ１／μＬの混合物を使用して試験し、すべての比のサンプルについて単一反応および多重反応の双方で同等の結果を得た。従ってアッセイは、１コピーのＣＭＶあたり１：１０５（０．００１％）コピーのＩＳ１または２３ｓ ｒＤＮＡという定量限度が適正であった。
【００９９】
Ｑ−ＰＣＲアッセイ感度対アガロースゲル電気泳動−ＩＳ１トランスポゾンは、複合培地から限定培地にシフトされ〜３０継代培養された培養物から単離したプラスミドＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆの実験サンプル中で最初に観察された（実施例１参照）。これらの１０個のクローン（サンプルＮＬＢ−１からＮＬＢ−１０）に由来のプラスミドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析は、高分子量バンドの出現に基づいて少なくとも５つのクローンにトランスポゾンの存在を示した（図１Ｂの星印の付いたレーン；実施例１も参照）。１０個のＮＬＢサンプル全部をＩＳ１／ＣＭＶコピー比アッセイで分析した（表１参照）。７つのサンプルが＞１％のＩＳ１−陽性プラスミドＤＮＡを含有していた。視認できるトランスポゾンを含む５つのサンプルは＞５％のＩＳ１−陽性分子を含有していた。これらの結果は、アガロースゲルの臭化エチジウム染色で異常を可視化するためには５から１０％のオーダのプラスミドＤＮＡが変質しなければならないことを示す。
【０１００】
【表１】
【０１０１】
要約
ＩＳ１／ＣＭＶ Ｑ−ＰＣＲコピー比アッセイは、ＤＮＡワクチンクローンの特性を解明するための有効なツールである。該アッセイは高度に特異的である。該アッセイは、特別設計のオリゴヌクレオチドプライマーおよび蛍光プローブを頼りにしてＩＳ１トランスポゾン含有サンプル、ＩＳ５のような他のトランスポゾン含有サンプルおよびトランスポゾン陰性サンプルを容易に識別できる。２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶコピー比アッセイの採用は特異性をいっそう強化し、ＩＳ１トランスポゾン活性の増加を正確に定量できる。Ｑ−ＰＣＲテクノロジイによって与えられる高レベル感度は、少なくとも１００コピー／μＬ（Ｖ１Ｊｎｓ−ｎｅｆの場合０．６ｐｇ／ｍｌ）という低濃度の標的を検出すると共に。鋳型ＤＮＡ濃度の６対数にわたるＩＳ１転位の定量を可能にする。
【実施例５】
【０１０２】
ゲノムＤＮＡ中のＩＳ１挿入性突然変異の同定
有力な高生産性クローンを単離する従来のスクリーニング方法は、２８から３０℃で約４８時間温置後にコロンビア血液寒天プレートに出現する“グレー”クローンと“ホワイト”クローンとの形態学的差異を基盤とする（同時係属国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２９１１，前出参照）。線毛形成に関する遺伝子の挿入配列突然変異はコロニー形態学に影響を与えることが知られている（Ｌａ Ｒａｇｉｏｎｅら，１９９９，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７５：２４７−２５３；Ｓｔｅｎｔｅｂｊｅｒｇ−Ｏｌｓｏｎら，２０００，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８２：３１９−３２５）。さらに、ｆｉｍＡ遺伝子の調節配列の１つの領域の逆位によって生じる位相転換も線毛の発現の違いに導く（Ｓｔｅｎｔｅｂｊｅｒｇ−Ｏｌｅｓｅｎら，２０００，前出）。ＰＣＲを使用し、ｆｉｍＢＥＡオペロンおよびｃｓｇＢ遺伝子中の挿入要素の存在をナイーブＤＨ５細胞およびＤＭＥ−Ｐ５適応ＤＨ５細胞中で２８から３０℃および３７℃で試験した。適応細胞は血液寒天プレート上で２８から３０℃と３７℃との間に形態学的転換を示す。従って、線毛遺伝子の違いはこの転換に相関関係を有するものであろう。双方の細胞の３７℃の振盪フラスコ培養物と双方の温度の静止（血液寒天で増殖）培養物とから単離したゲノムＤＮＡを使用すると、ｆｉｍＡ位相転換についても挿入要素についてもサンプル間の違いは観察されなかった。それぞれ代表的な高生産体および低生産体であるｔｐａ−ｇａｇ−ｇｒａｙおよびｔｐａ−ｇａｇ−ｗｈｉｔｅのプロファイリングでも違いは観察されなかった。注目すべきは、ＩＳ１挿入が大部分のｆｉｍＥ遺伝子と上流配列とを含む増幅領域の制限消化物に基づいて同定されたことである（図６、領域Ｐ１’−Ｐ３’間）。この部位は、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な非病原性Ｋ−１２株ＭＧ１６５５またはＷ３１１０の公表された大腸菌配列に報告されていない。周囲のＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩ制限部位に基づくとこのＩＳ１挿入を含有するフラグメントは〜２．３Ｋｂまたは〜１．７Ｋｂの長さであろう。後者のフラグメント長は形質転換菌株およびプラスミド非含有菌株の双方のＲＦＬＰプロファイルの最小バンドに符合する（実施例２参照）。挿入が全部のサンプルに見出され、関連フラグメントが以後のＩＳ１特異的酵素による消化で同等のバンドを生成したので、観察されたコロニー形態学的差異の原因が挿入配列にあるとは考え難い。
【０１０３】
ｐＭＣＳ２クローニングベクターの構築
ネオマイシン耐性を与えるｐＵＣ１９−に基づくベクターを構築した（ｐＵＣ−ｎｅｏ）。ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のａｍｐＲ遺伝子（ｂｌａ）をｐＵＣ−４Ｋプラスミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から採取したｋａｎＲ／ｎｅｏＲ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）によって置換した。ｐＵＣ１９中のａｍｐＲ遺伝子は、制限酵素ＡｈｄＩ（Ｅａｍ１１０５１）およびＳｓｐＩで消化することによって除去し、ｎｅｏＲ遺伝子は制限酵素ＰｓｔＩで消化することによってｐＵＣ−４Ｋプラスミドから除去した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを使用して双方のフラグメントに平滑末端を設けた。複製機構を含有する１．８ｋｂのｐＵＣ１９フラグメントとｐＵＣ−４Ｋに由来のｎｐｔＩＩ遺伝子を含有している１．２ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製し、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたプラスミドをスクリーニングして出発ｂｌａ遺伝子と同じ配向でｎｐｔＩＩ挿入を含むプラスミドを同定し、ｐＵＣ−ｎｅｏの構築を完成した。
【０１０４】
ｐＭＣＳ２を構築するために、ＥｃｏＲＩ、ＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩ（５’から３’への方向）の制限部位を大腸菌のｈｉｓＣ遺伝子を増幅する順方向プライマーの５’端に組込んだ（ＭＣＳ２−ｈｉｓＣ−Ｆｏｒ：５’−ＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣ−３’；配列１６）。ｈｉｓＣ遺伝子はこのために任意に選択した。ＸｂａＩ、ＡｇｅＩおよびＢａｍＨＩ（５’から３’への方向）部位は同様にして逆方向プライマーに組込んだ（ＭＣＳ２−ｈｉｓＣ−Ｒｅｖ：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＣＧＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＴＣＧＡＴＡＡＡＡＡＧＡＴＡＣ−３’；配列１７）。ＰＣＲ増幅を使用し、ＡｆｌＩＩとＡｇｅＩとを含有しＢａｍＨＩ部位間にｈｉｓＣ遺伝子が介在している新しいマルチクローニング部位から成る１．１Ｋｂフラグメントを作製した。ｈｉｓＣ遺伝子は長い結合性フラグメントを与えるために含有させたものであり、ＢａｍＨＩ部位はこの遺伝子を除去してブルー／ホワイト選択用のｌａｃＺα ＯＲＦを回復するために使用した。得られたフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に結合させた。１．１ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを切り出し、ｐＵＣ−ｎｅｏに首尾よく結合させた。得られたプラスミドｐＭＣＳ２−ｈｉｓＣをＢａｍＨＩで消化してｈｉｓＣ遺伝子を除去し、最大（３．１Ｋｂ）のフラグメントをゲル抽出し再結合させてプラスミドｐＭＣＳ２を形成した。上述のように、ｐＭＣＳ２マルチクローニング部位は、ｌａｃＺα遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）を保存するように設計しブルー−ホワイト選択を維持した。ｐＭＣＳ２結合の形質転換体を、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを補充したＬＢ／ｎｅｏ寒天に回収すると、得られたコロニーはブルーであり、ｌａｃＺ ＯＲＦが保存されていることを示した。次にベクターｐＭＣＳ２を部分的配列決定して多重クローニング部位の構造を確認した。
【０１０５】
ＩＳ１挿入部位のスクリーニング
ＲＦＬＰ分析は、問題の挿入性突然変異がゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｇｌＩＩおよびＡｇｅＩで消化したときの〜３および４Ｋｂの制限フラグメントに存在することを示した（実施例２参照）。ゲノムＤＮＡの挿入性突然変異の（１つ以上の）部位を同定する戦略は、以下の段階に従って関連クローンからゲノムＤＮＡのライブラリーを収集しスクリーニングする操作から構成される。
１．ＩＳ１挿入性突然変異を示すと同定された低生産性クローンからゲノムＤＮＡを抽出する。選択した方法次第では、ゲノムＤＮＡの抽出によってプラスミドＤＮＡを含む混合物が得られるであろう。
２．ＤＮＡをＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩで消化して先に同定した３から４ＫｂのサイズのＩＳ１含有制限フラグメントを作製する。
３．制限フラグメントのプールから所望サイズのフラグメントを抽出する。これは例えばフラグメントをサイズに基づいて分離するゲル電気泳動、次いで所望範囲のフラグメントを含有するゲル部分の切り出し、および切り出したゲルからのフラグメントの単離という順序で行うとよい。プラスミドＤＮＡが出発ゲノムＤＮＡ調製物中に維持されているならば、所望のゲノムＤＮＡフラグメントを混合物から単離して、直鎖化プラスミドＤＮＡの再結合および形質転換に付随する高いバックグラウンドを除去しなければならない。
４．所望のフラグメントのプールを、制限酵素ＡｇｌＩＩおよびＡｇｅＩで直鎖化したベクターの多重クローニング部位に結合させる。ベクターｐＭＣＳ２はこの目的で作製した（上記参照）。結合させたプールを使用してコンピテント大腸菌細胞を形質転換させる。形質転換体は高速増殖および維持に好適な固体ＬＢまたは他の複合培地で繁殖させることができる。
５．得られたライブラリーのスクリーニングはいくつかの方法で行うことができる。非限定例は、（ａ）ＩＳ１特異的Ｑ−ＰＣＲアッセイの使用、および、（ｂ）ＩＳ１プラスミド接合特異的コロニーまたはプラスミドＰＣＲを含む。これらの有力なスクリーニング方法をより詳細に以下に記載する。
【０１０６】
ゲノムＤＮＡライブラリーのＩＳ１特異的ＱＰＣＲアッセイ
上述のようにゲノムＤＮＡライブラリーを構築するために作製されたベクターｐＭＣ３２は、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）を含有している。ｐＭＣ３２ベクターに結合したＩＳ１陽性ゲノムＤＮＡフラグメントから構成されるライブラリーのプラスミドはＩＳ１とｎｅｏＲとを１：１比で含有するであろう。ＩＳ１陰性プラスミドは残留ゲノムＤＮＡに由来のバックグラウンド量のＩＳ１だけを含有するであろう。ｐＭＣ３２は高コピー数プラスミドなのでゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１の画分はプラスミドＤＮＡに起因する量に比べて少ないはずである。従って、実施例４に記載したものと同様のＱ−ＰＣＲアッセイは精製プラスミドＤＮＡまたは全細胞に対して実行できる。Ｑ−ＰＣＲアッセイは以下のプライマー／プローブ配列を使用して多重モードでＩＳ１：ｎｅｏＲコピー比を判定できると考えられる。
ＩＳ１プライマー／プローブセット：
ＩＳ１−Ｑ−Ｆｏｒ：５’−ＡＧＧＣＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＣＣＣＣＡ−３’（配列１８）；
ＩＳ１−Ｑ−Ｒｅｖ：５’−ＡＣＧＧＴＴＧＴＴＧＣＧＣＡＣＧＴＡＴ−３’（配列１９）；および
ＩＳ１−Ｑ−Ｐｒｏｂｅ：５’−ＶＩＣ−ＣＧＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列２０）
ｎｅｏＲプライマー／プローブセット：
ｎｅｏ−Ｑ−Ｆｏｒ：５’−ＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＣＣＣＴＣＧＴＣＡ−３’（配列２１）；
ｎｅｏ−Ｑ−Ｒｅｖ：５’−ＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＴＣＴＧ−３’（配列２２）；および
ｎｅｏ−Ｑ−Ｐｒｏｂｅ：５’−ＦＡＭ−ＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＣＧＡＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列２３）。
【０１０７】
最初に多重最適化実験を行って、ＩＳ１およびｎｅｏの双方のプローブを２００ｎＭにしてＩＳ１−Ｑプライマーは１００ｎＭおよびｎｅｏ−Ｑプライマーは３００ｎＭという最適プライマー濃度を同定した。これらの条件は、１００ｎＭから４００ｎＭの範囲のｎｅｏ−Ｑプライマー濃度を試験しながらＩＳ１−Ｑプライマー濃度を１００ｎＭに限定することによって決定した。ＩＳ１−Ｑは多重プライマー最適化実験を通じて、特にｎｅｏ−Ｑプライマー濃度を限定したとき、ｎｅｏ−Ｑにマイナスに影響することを示した。新しく最適化した値でもＩＳ１−Ｑスペクトル干渉はまだｎｅｏ−Ｑ閾値サイクル（ＣＴ）値を０．１％ＩＳ１／ｎｅｏコピー比で７０％まで変化させるが、結果は十分にスクリーンに必要な許容差の範囲内である。
【０１０８】
ＩＳ１：プラスミド連結に特異的なコロニーおよびプラスミドＰＣＲ−全細胞および精製プラスミドＤＮＡの双方がゲノムＤＮＡを含有すると予想されるので、ＩＳ１陽性ゲノムＤＮＡフラグメントがプラスミドライブラリーに存在するか否かにかかわりなく、ＩＳ１特異的ＰＣＲは全サンプルから増幅するという結果を与えると予想される。しかしながら、１つのプラスミド特異的プライマーと１つのＩＳ１特異的プライマーとを使用するＰＣＲは、組換プラスミドがＩＳ１フラグメントを含有するときにのみシグナルを生じる。プラスミド特異的プライマーはいくつかの方法で設計できる。該プライマーは、トランスポゾンがフラグメントの対向末端の近くに存在するときに〜４Ｋｂまでの不都合に大きいアンプリコンサイズを回避するために挿入部位（すなわち、ＡｆｌＩＩ−ＡｇｅＩ認識部位）の近傍のプラスミドの領域にアニーリングできる。この場合、充分な増幅を確保するために、長い標的の増幅に有利な傾向のポリメラーゼを使用する。あるいは、異常に小さいフラグメントの増幅を避けるために、プライマーは挿入部位から除去された領域のどちらの側にもアニーリングできる。いずれの場合にも、ＩＳ１：プラスミド接合の同定にＰＣＲを使用するアッセイでは、プライマー設計の際にＩＳ１の異なる配向の可能性を考慮することが重要である。この問題の解決としては、双方の配向のトランスポゾン挿入の検出を確保するために、トランスポゾンの中央領域に相補的であるがどちらかの方向に伸長する２つのＩＳ１特異的プライマーを使用する。内部プライマーの使用も少なくとも〜３８０ｂｐの標的の増幅を確保する。このスクリーニングアッセイはＩＳ１：プラスミド連結に特異的なので、全細胞（“コロニーＰＣＲ”）または精製プラスミドＤＮＡで行うことができる。ゲノムＤＮＡに存在するＩＳ１がシグナルを返すとは考えられない。
【実施例６】
【０１０９】
高生産性クローン用のゲノムに基づく高スループットスクリーン
実施例２に開示したＲＦＬＰプロファイルは、低生産性ＤＮＡワクチンクローンとゲノムＤＮＡのＩＳ１挿入性突然変異との間の相関関係を示した。従って、高生産性クローンの高スループットスクリーンは、挿入性突然変異を内包しないクローンの選択および同定から構成されるであろう。このようなスクリーンには、例えば実施例５に記載のような突然変異／挿入部位の同定が必要であろう。その後、このスクリーニングプロセスのためにいくつかのアッセイを開発できた。
【０１１０】
ＴａｑＭａｎのＱ−ＰＣＲに基づく高スループットスクリーン
ＩＳ１突然変異を内包しない細菌クローンを同定するＴａｑＭａｎ Ｑ−ＰＣＲ高スループットアッセイの一例は、２つのプライマーと蛍光シグナル増幅用の１つの内部プローブとを必要とする（図７Ａに概略図として示す）。ＩＳ１挿入突然変異がゲノムＤＮＡ内部に同定された単一の部位に局在するならば、ＴａｑＭａｎプローブはゲノムのこの部分を認識するように設計できる。相補的プライマーを使用する増幅は、その結果として前述のようにプローブの分解に因る蛍光シグナルを蓄積するであろう（実施例４参照）。問題の部位のＩＳ１挿入の存在は結合部位を破壊し、蛍光の蓄積を阻止するであろう。従って、有力な高生産性クローンは増幅シグナルを与えるが、低生産体は系の固有ノイズに起因するバックグラウンド蛍光だけを示すであろう。アッセイは多重化を必要とせず、全細胞溶解液を使用して行うことができるので、ゲノムＤＮＡ単離の必要性が削除される。ＴａｇＭａｎプローブは典型的には約１５から約４０ヌクレオチドの範囲の様々な長さを有し得る。従って、ゲノムＤＮＡ特異的プローブの適正結合を確保するためにＩＳ１突然変異の同定ホットスポットは配列の狭い範囲、好ましくは１０ヌクレオチド以内に局在しなければならない。
【０１１１】
ＩＳ１：ゲノム連結のＰＣＲアッセイ
挿入部位がゲノムＤＮＡの極めて狭い領域に局在していないならば、ＩＳ１：ゲノムＤＮＡ連結を同定するために内部プローブを使用しないＰＣＲアッセイを使用できる。１つのプライマーはＩＳ１挿入ホットスポットから除去された短いゲノムＤＮＡにアニーリングするように設計できる。第二のプライマーはトランスポゾンにアニーリングしなければならない。挿入が存在するならば（すなわち、推定“低生産体”）、ＩＳ１：ゲノムＤＮＡ連結に対応する増幅フラグメントが産生されるであろう。目標サイズのフラグメントを同定するために得られた増幅産物を目視分析できる。あるいは、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎのような色素をアッセイに加えてリアルタイムＰＣＲ計器を使用し、対応する蛍光増加に基づいて有力な高生産性クローンを同定できる（例えば、蛍光の欠如はＩＳ１挿入の欠如−推定“高生産体”を表す指標である）。同様に、蛍光の指数関数的増加を測定するために蛍光発生ＬＵＸＴＭプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用できる。この場合、ＬＵＸＴＭプライマーに由来のシグナルは単一プライマーの伸長から発生するのでゲノム：ＩＳ１連結のないクローン中でも蛍光シグナルが予想されることに留意されたい。しかしながら、シグナル増幅フラグメントを産生する相補的プライマーが存在しないのでシグナルは指数関数的でなく一次関数的に増加する。
【０１１２】
増幅フラグメントを目視分析する必要性を回避するために、同定された挿入突然変異をゲノム中の７つの静止ＩＳ１コピーから十分に除去して擬陽性を防止しなければならない。実施例２に開示したＲＦＬＰプロファイルに基づくと、干渉を生じる突然変異に静止コピーが十分に近接していれば擬陽性は出現しない。このアッセイはまた、突然変異がどちらの配向でも挿入され得る可能性があることを考慮しなければならない。この分析は、内部ＩＳ１プライマーを双方の配向で使用することによって行うことができる。この場合、サンプル毎に２つの個別アッセイを行ってもよく、または、クローン集団を完全にスクリーニングするために２つのプライマーを同時に使用してもよい。
【実施例７】
【０１１３】
ＤＮＡワクチン産生用最適化菌株の構築
低生産性集団はＩＳ１挿入性突然変異に相関関係を有しているので、ＩＳ１コピーのない大腸菌宿主菌株が高生産性クローンのより均一な集団を生じると考えられる。従って、高生産性クローンの収率を向上させる１つの戦略は、ＩＳ１コピー全部が除去された大腸菌の１つの菌株を構築し、この菌株をＤＮＡワクチンベクターの繁殖に使用することである。Ｐ１ファージ形質導入、トランスポゾン媒介ランダム突然変異原性および普遍（ＲｅｃＡ介在）相同的組換えを含む大腸菌の欠失的または破壊的突然変異を構築するためのいくつかの方法が存在する。これらの方法は典型的には、単一突然変異には適当であるが、多重突然変異では各突然変異に各１つの選択可能マーカー例えば抗生物質耐性が必要なので適当でない。代替方法は、所望破壊部位の周囲のフランキング配列に相同なプライマーに３６−から５０−ｎｔの伸長をもつＰＣＲ産物と、ラムダ−Ｒｅｄリコンビナーゼとの使用を含む（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，２０００，ＰＮＡＳ ９７：６６４０−６６４５）。この場合にもやはり選択可能マーカーを使用する。しかしながら、マーカーは後で除去することができ、追加の突然変異サイクルではその使用が免除される。残留“瘢痕”を除去する修正方法は、選択可能マーカーを除去するために内在二重鎖の破壊修復プロセスを利用する（Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏら，２００２，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：６４０−６４７）。この方法は、４４のうちの２４の転位可能要素の除去を含みゲノムサイズが８．１％短縮した大腸菌のＫ−１２株を産生するために使用された。この菌株では７つのＩＳ１コピーのうちの３つが除去された。残りの４コピーの除去が菌株の生存適性またはフェッドバッチ発酵プロセスでの使用適性に有害な効果を与えない可能性は極めて高い。しかしながら、Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏらの修正方法は二重鎖の破壊修復プロセスにＲｅｃＡを必要とするので大腸菌ＤＨ５株には適していないことに注目されたい。別の方法はグループＩＩイントロン、いわゆる“ターゲトロン”を使用して相補的配列の１４−から１６−ｎｔ領域に基づく突然変異を生じさせる（Ｚｈｏｎｇら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：１６５６−１６６４）。この方法も選択可能マーカーを使用するが多重挿入ができるように後で除去できる。しかしながら、この方法は、上記の２つの方法のように標的部位の欠失を生じるのでなく破壊を生じるものである。この方法の使用は結果として、トランスポゾンによってコードされている主要トランスポザーゼ遺伝子（ｉｎｓＡＢ）中に破壊された７つの非機能ＩＳ１コピーを内包する菌株を与えるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＬＢ増殖培養物（Ａ）またはＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物（Ｂ）から単離したＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆプラスミドＤＮＡ、ＮＬＢ−１からＮＬＢ−１０（左から右に）を示す。ゲル（Ａ）中の各サンプルレーンは、１０培養物の平均ＯＤ６００が３．７に等しい１ｍｌのＱＩＡＧＥＮ培養プレップから採取した１μｌのプラスミドを含む。サンプルＮＬＢ−１０はレーン１３の分子量マーカーに添加された。ゲル（Ｂ）中の各サンプルレーンは、１０培養物の平均ＯＤ６００が１２．５に等しい１ｍｌのＱＩＡＧＥＮ培養プレップから採取した２μｌのプラスミドを含む。（Ａ）レーン１、５、９、１３および（Ｂ）レーン１、７、１３−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ １ Ｋｂ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）．ｓｃＤＮＡ−スーパーコイルドＤＮＡ。星印の付いたレーンは、視認できるＩＳｌ陽性バンドを含む。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＬＢ増殖培養物（Ａ）またはＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物（Ｂ）から単離したＶ１Ｊｎｓ−ｎｅｆプラスミドＤＮＡ、ＮＬＢ−１からＮＬＢ−１０（左から右に）を示す。ゲル（Ａ）中の各サンプルレーンは、１０培養物の平均ＯＤ６００が３．７に等しい１ｍｌのＱＩＡＧＥＮ培養プレップから採取した１μｌのプラスミドを含む。サンプルＮＬＢ−１０はレーン１３の分子量マーカーに添加された。ゲル（Ｂ）中の各サンプルレーンは、１０培養物の平均ＯＤ６００が１２．５に等しい１ｍｌのＱＩＡＧＥＮ培養プレップから採取した２μｌのプラスミドを含む。（Ａ）レーン１、５、９、１３および（Ｂ）レーン１、７、１３−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ １ Ｋｂ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）．ｓｃＤＮＡ−スーパーコイルドＤＮＡ。星印の付いたレーンは、視認できるＩＳｌ陽性バンドを含む。
【図１Ｃ】図１Ｃは、選択したＮＬＢサンプルのＭｌｕＩ消化を示す。レーン２、４、７、９、１２−ＮＬＢ−１、ＮＬＢ−３、ＮＬＢ−５、ＮＬＢ−７、ＮＬＢ−８；非消化。レーン３、５、８、１０、１３−ＮＬＢ−１，ＮＬＢ−３、ＮＬＢ−５、ＮＬＢ−７、ＮＬＢ−８；消化。レーン１、６、１１、１４−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ １Ｋｂ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図２Ａ】図２Ａは、選択されたサンプル由来のＩＳ１のＰＣＲ増幅を示す。レーン２−ＬＢ増殖ＮＬＢ−１。レーン３−ＤＭＥ−Ｐ５増殖ＮＬＢ−１。レーン４−ＬＢ増殖ＮＬＢ−２。レーン５−ＤＭＥ−Ｐ５増殖ＮＬＢ−２。レーン６−ＬＢ増殖ｐＵＣ１９。レーン７−ＤＨ５ゲノムＤＮＡ。レーン８−ＤＨ５αゲノムＤＮＡ。レーン１、９−ＧｉｂｃｏＢＲＬ １Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＮＬＢ−１およびＮＬＢ−２のＤＭＥ−Ｐ５増殖培養物から採取したプラスミドプレップを使用したＰＣＲ反応のＭｌｕＩ消化を示す。レーン２、３−ＮＬＢ−１非消化、消化。レーン４、５−ＮＬＢ−２非消化、消化。レーン１、６−ＧｉｂｃｏＢＲＬ １Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、（Ｃ）ＤＭＥ−Ｐ５増殖または（Ｄ）ＬＢ増殖した細胞プレップを使用したＮＬＢ−３からＮＬＢ−１０まで（左から右）のＩＳ１のＰＣＲ増幅を示す。レーン１、６、１１−ＧｉｂｃｏＢＲＬ １Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図２Ｄ】図２Ｄは、（Ｃ）ＤＭＥ−Ｐ５増殖または（Ｄ）ＬＢ増殖した細胞プレップを使用したＮＬＢ−３からＮＬＢ−１０まで（左から右）のＩＳ１のＰＣＲ増幅を示す。レーン１、６、１１−ＧｉｂｃｏＢＲＬ １Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（０．５μｌ）。
【図３Ａ】図３Ａは、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩによるＶｌＪｎｓ−ｔｐａ−ｐｏｌクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイルを示す。レーン１−ｐＩＳ１陽性対照。レーン２−非形質転換ＤＨ５対照。レーン３−ｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰプラスミドＤＮＡ。レーン４−ｔｐａ−ｐｏｌ−ＨＰ全ＤＮＡ。レーン５−ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰプラスミドＤＮＡ。レーン６−ｔｐａ−ｐｏｌ−ＬＰ全ＤＮＡ。ＤＩＧ標識分子量マーカーは図示されていないが露光時間の延長に伴って視認可能になる。
【図３Ｂ】図３Ｂは、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩによるＶｌＪｎｓ−ｔｐａ−ｎｅｆクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイルを示す。レーン１−ｐＩＳ１陽性対照。レーン２−非形質転換ＤＨ５対照。レーン３−ｔｐａ−ｎｅｆ−ＨＰプラスミドＤＮＡ。レーン４−ｔｐａ−ｎｅｆ−ＨＰ全ＤＮＡ。レーン５−ｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰプラスミドＤＮＡ。レーン６−ｔｐａ−ｎｅｆ−ＬＰ全ＤＮＡ。ＤＩＧ標識分子量マーカーは図示されていないが露光時間の延長に伴って視認可能になる。
【図３Ｃ】図３Ｃは、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩによる非形質転換ＤＨ５およびＶｌＪｎｓ−ｔｐａ−ｇａｇクローンのＩＳ１ ＲＦＬＰプロファイルを示す。レーン１−不適応の非形質転換ＤＨ５対照。レーン２−限定培地ＤＭＥ−Ｐ５に適応した非形質転換ＤＨ５。レーン３−ｔｐａ−ｇａｇ−ＨＰ実用シードプラスミドＤＮＡ。レーン４、５−ｔｐａ−ｇａｇ−ＨＰ実用シード全ＤＮＡ。レーン６−ｔｐａ−ｇａｇ−ＨＰ実験用シードプラスミドＤＮＡ。レーン７、８−ｔｐａ−ｇａｇ−ＨＰ実験用シード全ＤＮＡ。レーン９−ｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰプラスミドＤＮＡ。レーン１０、１１−ｔｐａ−ｇａｇ−ＬＰ全ＤＮＡ。ＤＩＧ標識分子量マーカーは図示されていないが露光時間の延長に伴って視認可能になる。
【図４】図４は、標準ｐｎｌＱ３ｖ２のプラスミドマップを示す。プライマーおよびプローブの結合部位が示されている。
【図５】図５は、２３ｓ ｒＤＮＡ／ＣＭＶコピー比アッセイの定量限度の決定を示す。（白丸）１つのプライマー−プローブセットとの反応から決定した比。（黒丸）２つのプライマー−プローブセットとの反応（多重）から決定した比。表示のコピー比を準備するためにプラスミドｐ２３ｓＴＡおよびＰＣＲ−増幅ＣＭＶプロモーターフラグメントを鋳型として使用した。１：１０５コピー比までの直線性が定量限度を確立する。
【図６】図６は、ｆｉｍＢＥＡオペロンの概略図を示す（配列詳細に関してはＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｙ １０９０２参照）。オペロンの様々な領域をＰＣＲ増幅するために使用したプライマーの場所は、公表された報告書に基づいて選択されたプライマー場所Ｐ１’、Ｐ１’−Ｒｅｖ、Ｐ３’、Ｐ３’−Ｒｅｖ、Ｐ４’およびＰ５として示す（Ｓｔｅｎｔｅｂｊｅｒｇ−Ｏｌｅｓｅｎら，２０００，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８２：３１９−３２５）。ＩＳ１挿入はプライマーＰ１’とＰ３’との間の領域で観察された。
【図７Ａ】図７Ａは、ＴａｑＭａｎに基づく有力な高生産性細菌クローンの高スループットスクリーニングアッセイの概略図である。ＩＳ１挿入領域はゲノムＤＮＡの少数のヌクレオチドの範囲である（“ＩＳ１挿入部位”）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＰＣＲに基づく有力な高生産性細菌クローンのスクリーニングアッセイの概略図である。ＩＳ１挿入領域はゲノムＤＮＡの多数の連続ヌクレオチドの範囲である（“ＩＳ１ホットスポット”）。７Ｂに示すアッセイでは、挿入の配向が双方向で可能であることを考慮して逆方向のＩＳ１−特異的プライマーを使用する第二アッセイも行わなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプのＩＳ１転位活性を比較し、相対的に低い転位活性を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、および
（ｂ）前記有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階と
を含んでおり、高生産性クローナルサブタイプが高プラスミドコピー数／細胞を示す
プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法。
【請求項２】
ＩＳ１転位活性が、前記クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定することによって判定され、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数は相対的に低いＩＳ１転位活性の指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＳ１転位活性が、前記クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ内部の予め決定されたＩＳ１挿入領域中のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を測定することによって判定され、ＩＳ１挿入配列の不在は相対的に低いＩＳ１転位活性の指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、
（ｂ）前記単離プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定し、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、および
（ｃ）前記有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階と
を含み、高生産性クローナルサブタイプが高プラスミドコピー数／細胞を示す
プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法。
【請求項５】
ＩＳ１トランスポゾンコピー数が定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
定量的ＰＣＲアッセイが、ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入は存在しないと判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列との双方を増幅することによってプラスミドコピー数に基づくＩＳ１の相対量を測定し、ＩＳ１トランスポゾンコピー数を表すＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＩＳ１／プラスミドコピー比が、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量を減算することによって補正される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量が、第二の定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第二の定量的ＰＣＲアッセイが、２３ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列内部に局在する残留ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列とＩＳ１／プラスミドコピー比を生成するために使用したＩＳ１挿入は存在しないと判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列との双方を増幅することによってプラスミドコピー数に基づく２３ｓ ｒＤＮＡの相対量を測定して、２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成し、これをＩＳ１プラスミドコピー比から減算して補正ＩＳ１／プラスミドコピー比が算出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プラスミドＤＮＡの第一および第二のヌクレオチド配列が核酸ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドセットとの存在下で個別に増幅され、
第一ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、
（ｉ）ＩＳ１ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、
（ｉｉ）第一場所の下流のＩＳ１ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、および
（ｉｉｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブと
から構成され、前記プローブは第一場所と第二場所との間のＩＳ１ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成し、
第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、
（ｉ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマー、
（ｉｉ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、および
（ｉｉｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブと
から構成され、前記プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成し、
前記核酸ポリメラーゼは増幅中に蛍光プローブを消化して前記フルオロホアを前記消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化が第一および／または第二のヌクレオチド配列の増幅の発生に対応する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
第一および第二のヌクレオチド配列が多重モードで増幅される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第一ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットが、それぞれ順方向および逆方向のＰＣＲプライマーＩＳ１−ＱＦ（配列６）およびＩＳ１−Ｑ−Ｒ（配列７）と蛍光プローブＩＳ１−Ｑ−Ｐ２（配列８）とから構成されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットが、それぞれ順方向および逆方向のＰＣＲプライマーＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（配列４）と蛍光プローブＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（配列５）とから構成されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部に局在するヌクレオチド配列および第二ヌクレオチド配列が核酸ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドセットとの存在下で個別に増幅され、
第一ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、
（ｉ）２３ｓ ｒＤＮＡ配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、
（ｉｉ）第一場所の下流の２３ｓ ｒＤＮＡ配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、および
（ｉｉｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブと
から構成され、前記プローブは第一場所と第二場所との間の２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部の１つの場所にハイブリド形成し、
第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、
（ｉｖ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、
（ｖ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、および
（ｖｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブと
から構成され、前記プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成し、
前記核酸ポリメラーゼは増幅中の蛍光プローブを消化して前記フルオロホアを前記消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化が２３ｓ ｒＤＮＡ配列および／または第二ヌクレオチド配列の増幅の発生に対応する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
２３ｓ ｒＤＮＡ配列および第二ヌクレオチド配列が多重モードで増幅される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２３ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットが、それぞれ順方向および逆方向のＰＣＲプライマー２３ｓ−Ｆ１Ｄ（配列１１）および２３ｓ−Ｒ１Ｄ（配列１２）と蛍光プローブ２３ｓ−Ｐｆａｍ（配列１３）とから構成されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットが、それぞれ順方向および逆方向のＰＣＲプライマーＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（配列４）と蛍光プローブＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（配列５）とから構成されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）前記クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出し、前記ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の欠如したクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、および
（ｂ）前記有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階と
を含み、高生産性クローナルサブタイプが高プラスミドコピー数／細胞を示す
プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法。
【請求項１９】
前記ＩＳ１挿入領域がゲノムＤＮＡの約２０未満の連続ヌクレオチドの範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＣＲアッセイがゲノムＤＮＡの前記ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列を検出するために使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
定量的ＰＣＲアッセイが、核酸ポリメラーゼと、ならびに
（ｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブ、
（ｉｉ）蛍光プローブの上流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマー、および
（ｉｉｉ）蛍光プローブの下流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマー
から構成されたオリゴヌクレオチドセットと
の存在下で、ＩＳ１挿入領域を含有するゲノムＤＮＡの一部分を増幅する段階を含み、
前記核酸ポリメラーゼは増幅中に蛍光プローブを消化して前記フルオロホアを前記消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化がゲノムＤＮＡの増幅およびＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在に対応する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記定量的ＰＣＲアッセイが全細胞溶解液に行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＳ１挿入領域がゲノムＤＮＡの約２０以上の連続ヌクレオチドの範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＣＲアッセイが、ゲノムＤＮＡの前記ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出するために使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＲアッセイが、核酸ポリメラーゼと、ならびに
（ｉ）ＩＳ１挿入領域外部のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する第一のＰＣＲプライマー、および
（ｉｉ）ＩＳ１挿入領域内部に挿入されたＩＳ１トランスポゾン配列内部の１つの場所にハイブリド形成する第二のＰＣＲプライマー
から構成されているオリゴヌクレオチドセットと
の存在下で、ゲノムＤＮＡの一部分を増幅する段階を含み、
ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の存在は双方のＰＣＲプライマーのハイブリド形成によるゲノムＤＮＡの前記部分の指数関数的増幅という結果を与え、ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在は第一のＰＣＲプライマーだけのハイブリド形成によるゲノムＤＮＡの前記部分の一本鎖だけの一次関数的増幅という結果を与える、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ゲノムＤＮＡの前記部分の増幅が、ほぼ目標サイズの増幅核酸フラグメントを同定することによって目視検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ゲノムＤＮＡの前記部分の増幅が、二重鎖ＤＮＡに結合する核酸染料を添加することによってリアルタイムで蛍光的に検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプのＩＳ１転位活性を比較し、相対的に低い転位活性を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、および
（ｂ）前記有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階と
を含んでおり、高生産性クローナルサブタイプが高プラスミドコピー数／細胞を示す
プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法。
【請求項２】
ＩＳ１転位活性が、前記クローナルサブタイプから単離したプラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定することによって判定され、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数は相対的に低いＩＳ１転位活性の指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＳ１転位活性が、前記クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡ内部の予め決定されたＩＳ１挿入領域中のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を測定することによって判定され、ＩＳ１挿入配列の不在は相対的に低いＩＳ１転位活性の指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）同じプラスミドＤＮＡを内包する同じ菌株の少なくとも２つのクローナルサブタイプからプラスミドＤＮＡを単離する段階と、
（ｂ）前記単離プラスミドＤＮＡサンプル中のＩＳ１トランスポゾンコピー数を測定し、相対的に低いＩＳ１トランスポゾンコピー数を示すクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、および
（ｃ）前記有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階と
を含み、高生産性クローナルサブタイプが高プラスミドコピー数／細胞を示す
プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法。
【請求項５】
ＩＳ１トランスポゾンコピー数が定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
定量的ＰＣＲアッセイが、ＩＳ１ヌクレオチド配列内部に局在するプラスミドＤＮＡの第一ヌクレオチド配列とＩＳ１挿入は存在しないと判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列との双方を増幅することによってプラスミドコピー数に基づくＩＳ１の相対量を測定し、ＩＳ１トランスポゾンコピー数を表すＩＳ１／プラスミドコピー比を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＩＳ１／プラスミドコピー比が、プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量を減算することによって補正される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
プラスミドＤＮＡサンプル中に存在する残留ゲノムＤＮＡに起因するＩＳ１トランスポゾンコピーの予測量が、第二の定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第二の定量的ＰＣＲアッセイが、２３ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列内部に局在する残留ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列とＩＳ１／プラスミドコピー比を生成するために使用したＩＳ１挿入は存在しないと判定されたプラスミドＤＮＡの第二ヌクレオチド配列との双方を増幅することによってプラスミドコピー数に基づく２３ｓ ｒＤＮＡの相対量を測定して、２３ｓ ｒＤＮＡ／プラスミドコピー比を生成し、これをＩＳ１プラスミドコピー比から減算して補正ＩＳ１／プラスミドコピー比が算出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プラスミドＤＮＡの第一および第二のヌクレオチド配列が核酸ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドセットとの存在下で個別に増幅され、
第一ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、
（ｉ）ＩＳ１ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、
（ｉｉ）第一場所の下流のＩＳ１ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、および
（ｉｉｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブと
から構成され、前記プローブは第一場所と第二場所との間のＩＳ１ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成し、
第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、
（ｉ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマー、
（ｉｉ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、および
（ｉｉｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブと
から構成され、前記プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成し、
前記核酸ポリメラーゼは増幅中に蛍光プローブを消化して前記フルオロホアを前記消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化が第一および／または第二のヌクレオチド配列の増幅の発生に対応する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
第一および第二のヌクレオチド配列が多重モードで増幅される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第一ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットが、それぞれ順方向および逆方向のＰＣＲプライマーＩＳ１−ＱＦ（配列６）およびＩＳ１−Ｑ−Ｒ（配列７）と蛍光プローブＩＳ１−Ｑ−Ｐ２（配列８）とから構成されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットが、それぞれ順方向および逆方向のＰＣＲプライマーＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（配列４）と蛍光プローブＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（配列５）とから構成されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部に局在するヌクレオチド配列および第二ヌクレオチド配列が核酸ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドセットとの存在下で個別に増幅され、
第一ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、
（ｉ）２３ｓ ｒＤＮＡ配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、
（ｉｉ）第一場所の下流の２３ｓ ｒＤＮＡ配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、および
（ｉｉｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブと
から構成され、前記プローブは第一場所と第二場所との間の２３ｓ ｒＤＮＡ配列内部の１つの場所にハイブリド形成し、
第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットは、
（ｉｖ）第二ヌクレオチド配列の第一場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマーと、
（ｖ）第一場所の下流の第二ヌクレオチド配列の第二場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマーと、および
（ｖｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブと
から構成され、前記プローブは第一場所と第二場所との間の第二ヌクレオチド配列内部の１つの場所にハイブリド形成し、
前記核酸ポリメラーゼは増幅中の蛍光プローブを消化して前記フルオロホアを前記消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化が２３ｓ ｒＤＮＡ配列および／または第二ヌクレオチド配列の増幅の発生に対応する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
２３ｓ ｒＤＮＡ配列および第二ヌクレオチド配列が多重モードで増幅される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２３ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットが、それぞれ順方向および逆方向のＰＣＲプライマー２３ｓ−Ｆ１Ｄ（配列１１）および２３ｓ−Ｒ１Ｄ（配列１２）と蛍光プローブ２３ｓ−Ｐｆａｍ（配列１３）とから構成されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
第二ヌクレオチド配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドセットが、それぞれ順方向および逆方向のＰＣＲプライマーＣＭＶ−Ｑ−Ｆ（配列３）およびＣＭＶ−Ｑ−Ｒ（配列４）と蛍光プローブＣＭＶ−Ｑ−Ｐ２（配列５）とから構成されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）前記クローナルサブタイプのゲノムＤＮＡの予め決定されたＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出し、前記ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の欠如したクローナルサブタイプが有力な高生産性クローナルサブタイプを表す段階と、および
（ｂ）前記有力な高生産性クローナルサブタイプの産生率を試験する段階と
を含み、高生産性クローナルサブタイプが高プラスミドコピー数／細胞を示す
プラスミドＤＮＡを内包する大腸菌の１つの菌株の高生産性クローナルサブタイプの選択方法。
【請求項１９】
前記ＩＳ１挿入領域がゲノムＤＮＡの約２０未満の連続ヌクレオチドの範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＣＲアッセイがゲノムＤＮＡの前記ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列を検出するために使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
定量的ＰＣＲアッセイが、核酸ポリメラーゼと、ならびに
（ｉ）消去剤分子と固有の発光極大にエネルギーを放出するフルオロホアとによって標識された蛍光プローブ、
（ｉｉ）蛍光プローブの上流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する順方向ＰＣＲプライマー、および
（ｉｉｉ）蛍光プローブの下流のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する逆方向ＰＣＲプライマー
から構成されたオリゴヌクレオチドセットと
の存在下で、ＩＳ１挿入領域を含有するゲノムＤＮＡの一部分を増幅する段階を含み、
前記核酸ポリメラーゼは増幅中に蛍光プローブを消化して前記フルオロホアを前記消去剤分子から解離させ、フルオロホアと消去剤分子とが解離したときの蛍光変化が検出され、該蛍光変化がゲノムＤＮＡの増幅およびＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在に対応する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記定量的ＰＣＲアッセイが全細胞溶解液に行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＳ１挿入領域がゲノムＤＮＡの約２０以上の連続ヌクレオチドの範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＣＲアッセイが、ゲノムＤＮＡの前記ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の有無を検出するために使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＲアッセイが、核酸ポリメラーゼと、ならびに
（ｉ）ＩＳ１挿入領域外部のゲノムＤＮＡの１つの場所にハイブリド形成する第一のＰＣＲプライマー、および
（ｉｉ）ＩＳ１挿入領域内部に挿入されたＩＳ１トランスポゾン配列内部の１つの場所にハイブリド形成する第二のＰＣＲプライマー
から構成されているオリゴヌクレオチドセットと
の存在下で、ゲノムＤＮＡの一部分を増幅する段階を含み、
ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の存在は双方のＰＣＲプライマーのハイブリド形成によるゲノムＤＮＡの前記部分の指数関数的増幅という結果を与え、ＩＳ１挿入領域内部のＩＳ１トランスポゾン配列の不在は第一のＰＣＲプライマーだけのハイブリド形成によるゲノムＤＮＡの前記部分の一本鎖だけの一次関数的増幅という結果を与える、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ゲノムＤＮＡの前記部分の増幅が、ほぼ目標サイズの増幅核酸フラグメントを同定することによって目視検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ゲノムＤＮＡの前記部分の増幅が、二重鎖ＤＮＡに結合する核酸染料を添加することによってリアルタイムで蛍光的に検出される、請求項２５に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５２９８７５（Ｐ２００９−５２９８７５Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５００４２８（Ｐ２００９−５００４２８）
【出願日】平成１９年３月１３日（２００７．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００６２８７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０９０１３
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１３日（２００７．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００６２８７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０９０１３
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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