本発明は、ペプチドまたはポリペプチドを、血清において見いだされるプロテアーゼなどのプロテアーゼによる分解に対して耐性であるペプチド及びポリペプチドのライブラリーまたはレパートリー（例えば、表示系）から選択し、単離し、および／または回収するための方法に関する。一般的に、この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供すること、ライブラリーまたはレパートリーをプロテアーゼとともにプロテアーゼの活性に適した条件下でインキュベートすること、ならびにプロテアーゼによる分解に対して耐性であり、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離し、および／または回収することを含む。選択されたペプチドおよびポリペプチドは、例えばヒトにおける疾患を治療するための治療薬としての有用性がある。

【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ポリペプチドおよびペプチドは、次第に工業用途および医療用、治療用および診断用作用物質としての使用をはじめとする様々な用途において重要な作用物質になってきた。しかしながら、多くの治療用ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、天然に存在するプロテアーゼによるin vivo分解を特に受けやすい。さらに、炎症状態（例えばＣＯＰＤ）および癌などのある生理学的状態において、組織、器官または動物中（例えば、肺中、腫瘍中又は腫瘍に隣接して）に存在するプロテアーゼの量は増大し得る。プロテアーゼのこの増大は、内因性タンパク質の、ならびに疾患を治療するために投与される治療用ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の分解および不活性化を加速し得る。したがって、in vivo使用（例えば、ヒトなどの哺乳動物において、疾患を治療し、診断し、または予防するに際しての使用）への可能性を有するいくつかの作用物質は、それらがプロテアーゼにより迅速に分解され、不活性化されるため、限定された効力を有するに過ぎなかった。
【０００２】
プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、いくつかの利点を提供する。例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、プロテアーゼ感受性作用物質より長くin vivo活性のままであり、したがって、生物学的作用を生じるのに十分な時間の間、依然として機能的である。プロテアーゼ分解に対して耐性であり、望ましい生物学的活性も有するポリペプチドを選択する改善された方法が必要である。
【０００３】
グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１は、強力なグルコース依存性インスリン分泌促進作用およびグルカゴン分泌抑制作用、膵臓β細胞に対する栄養作用、ならびに胃腸管分泌および運動に対する阻害作用を有するインクレチンホルモンであり、これらの作用は組み合わさって、血漿グルコースを低下させ、血糖値変動を減少させる。ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１受容体のアゴニストである。さらに、満腹感を高めることができることにより、ＧＬＰ−１は食物摂取を減らし、これによって体重増加を制限し、体重減少をもたらす場合さえもある。まとめると、これらの作用により、ＧＬＰ−１に対して、特にその血糖降下作用のグルコース依存性により重度の低血糖症のリスクを最小限に抑えられるはずなので、抗糖尿病薬に非常に望ましいと考えられる独自の特性が付与される。しかしながら、その薬物動態／薬力学プロファイルは、天然のＧＬＰ−１が治療上有用でないようものである。したがって、ＧＬＰ−１は連続投与される場合に最も有効であるので、単回皮下注射は短時間型効果を有する。ＧＬＰ−１はin vivoで酵素分解を非常に受けやすく、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断は、迅速に起こり、非インスリン分泌促進代謝産物を生じるので、おそらくは最も重要である。ＧＬＰ−１の治療可能性を、その代謝的安定性および薬物動態／薬力学プロファイルに影響を及ぼす因子に対する知識に基づいて利用する方法は、したがって、鋭意研究の焦点になっている。
【０００４】
ペプチダーゼを阻害すること、または依然として生物学的活性を維持しつつ、その分解を遅らせるような方法でＧＬＰ−１を修飾することを試みる多大な研究がなされてきた。ＷＯ ０５／０２７９７８は、長期型作用を有するＧＬＰ−１誘導体を記載している（そして、本発明において使用できるＧＬＰ−１誘導体および類似体の例として参照することによって本明細書で援用される）。ＷＯ ０２／４６２２７には、ＧＬＰ−１または類似体に融合したポリペプチド（例えば、アルブミン）を含む異種融合タンパク質が開示されている（これらの類似体の開示は、本発明において使用できるＧＬＰ−１類似体の例として参照することにより本明細書で援用される）。ＷＯ ０５／００３２９６、ＷＯ ０３／０６００７１、ＷＯ ０３／０５９９３４には、ホルモンの半減期を増大させるためにＧＬＰ−１がアルブミンと融合しているアミノ融合タンパク質が開示されている。
【０００５】
しかしながら、これらの試みにもかかわらず、長期作用型ＧＬＰ−１はまだ産生されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択するための方法、および標的リガンドと高い親和性で結合するペプチドまたはポリペプチドを選択するための方法に関する。本発明はさらに、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーの製造方法に関する。
【０００７】
一態様では、本発明は、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択するための方法である。この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供すること、レパートリーおよびプロテアーゼをプロテアーゼの活性に適した条件下でインキュベートすること、そして、望ましい生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを回収し、それによってプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが選択される
ことを含む。
【０００８】
一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーは表示系（display system）で発現され、このプロテアーゼは、表示系または発現宿主で発現されるプロテアーゼである。例えば、一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーは、細菌細胞において発現され、プロテアーゼは細菌に対して内因性のプロテアーゼである。適切には、レパートリー発現の条件は、細菌プロテアーゼなどの内因性プロテアーゼの発現および活性を最大にする。プロテアーゼ発現および活性は、例えば、細菌におけるレパートリーのタンパク質発現の時間および／温度を増加させることによって最大になる。例えばインキュベーション時間は１時間から一晩（例えば１２時間から２４時間まで）またはそれ以上（例えば２４時間から４８時間まで、またはそれ以上）であってよい。一実施形態では、温度は３０〜３７℃またはそれ以上であってよい。加えて、プロテアーゼ発現は、様々な細菌株の使用および／または培地成分の変更によって増強することができる。細菌培養物の密度も変わり得る。別の実施形態では、表示系を、プロテアーゼ発現を増強するための遺伝子組換えによって変更することができる。
【０００９】
一実施形態では、レパートリーは、バクテリオファージ表示系として提供され、この場合、バクテリオファージレパートリーは、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＴＢ１細胞、ＴＣ１細胞または大腸菌ＨＢ２１５１株由来の細胞などの大腸菌細胞において発現および／または増幅される。したがって、この実施形態では、細菌プロテアーゼは、大腸菌細胞において内因的に発現されたプロテアーゼである。一実施形態では、細菌プロテアーゼは、細菌ペリプラズムにおいて発現されるプロテアーゼであってよい。一実施形態では、プロテアーゼ発現は、ファージ産生、分泌の間であってよいし、または細菌上清中であってもよい。
【００１０】
したがって、本発明の一実施形態では、バクテリオファージライブラリーを選択する工程；前記ライブラリーを細菌において細菌プロテアーゼの活性に適した条件下で発現する工程；前記発現されたライブラリーを、標的リガンドとともにインキュベートし、これによってプロテアーゼ耐性標的結合ペプチドが選択される工程を含む方法が提供される。場合によって、標的リガンドとの前記インキュベーションは、さらなるプロテアーゼの存在を含む。
【００１１】
別の実施形態では、表示系はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）などの酵母表示系であり、プロテアーゼは酵母細胞において発現される内因性プロテアーゼである。
【００１２】
一実施形態では、本発明の方法は、レパートリーとさらなるプロテアーゼとを前記さらなるプロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせること、そして所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを回収し、これにより，プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択することをさらに含む。一実施形態では、プロテアーゼを溶液中でレパートリーと組み合わせる（すなわち、プロテアーゼは支持体上に固定されていない）。適切には、さらなるプロテアーゼは、血清、喀痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液又は涙の１つ以上において見いだされる。
【００１３】
別の態様では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択するために方法が提供される。この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供すること、このレパートリーおよび第１のプロテアーゼをプロテアーゼの活性に適した条件下でインキュベートすることを含み、このレパートリーを第２のプロテアーゼとプロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせること、そして所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを回収し、これによりプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択することをさらに含む。この態様の一実施形態では、第１のプロテアーゼはレパートリー表示系に対して内因性のプロテアーゼであり、第２のプロテアーゼは、血清、喀痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液または涙において見いだされるプロテアーゼから選択される。しかしながら、「第１」および「第２」プロテアーゼ工程は任意の順序で実施できると理解される。加えて、任意のこのような工程を複数回繰り返すことは本発明の方法に包含され得ると理解される。
【００１４】
本発明の任意の態様の一実施形態では、前記さらなるプロテアーゼすなわち第２のプロテアーゼ活性の前記条件は、（ｉ）約１０μｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌプロテアーゼ、（ｉｉ）約２０℃〜約４０℃および（ｉｉｉ）少なくとも約３０分間である。一実施形態では、これらのストリンジェントな条件により、高親和性および／または改善されたＴｍを有するペプチドまたはポリペプチドの選択が可能になる。このような場合、ペプチドおよびポリペプチドは単量体形態で高親和性を表示し得る。
【００１５】
一実施形態では、任意の態様による本発明の方法において、プロテアーゼの活性に適した前記条件について、約１０〜約１００μｇ／ｍｌのプロテアーゼを使用する。プロテアーゼの活性に適した前記条件に関して、約３０℃〜約３７℃の温度（例えば、約３７℃またはほぼ室温）を用いることができる。一実施形態では、レパートリーおよびプロテアーゼ少なくとも約１時間（例えば、約１時間、約２時間、一晩、例えば１８〜２４時間）組み合わせることができる。本発明の方法において、レパートリーおよびプロテアーゼを、一実施形態では、少なくとも約３０分間インキュベートする。一実施形態では、プロテアーゼを約１００μｇ／ｍｌで使用し、合したレパートリーおよびプロテアーゼを約３７℃で少なくとも約１時間インキュベートする。
【００１６】
本発明の任意の態様の一実施形態では、プロテアーゼ、例えばトリプシンのポリペプチドまたは可変ドメインに対する比（モル／モルに基づいて）は、８，０００〜８０，０００ プロテアーゼ：可変ドメインである。一実施形態では、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）のポリペプチドまたは可変ドメインに対する比（重量／重量、例えばマイクログラム／マイクログラム基準）は、１６，０００〜１６０，０００ プロテアーゼ：可変ドメインである。一実施形態では、プロテアーゼを少なくとも１００または１０００μｇ／ｍｌプロテアーゼの濃度で使用する。
【００１７】
以下のうちの１つ以上などの任意の所望のプロテアーゼを本発明の任意の態様による方法において使用できる：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンＧ）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ１、プロテイナーゼ２、プロテイナーゼ３）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ９、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、セパラーゼおよびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）。特定の実施形態では、プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。プロテアーゼは、生物学的抽出物、生物学的ホモジネートまたは生物学的調製物、例えばin vitroの全細胞によっても提供され得る。所望により、この方法は、プロテアーゼ阻害剤をレパートリーとプロテアーゼとの組み合わせにインキュベーションが完了した後に添加することをさらに含む。
【００１８】
本発明の方法のいずれかの一実施形態では、プロテアーゼは、レパートリーと組み合わせた場合に溶液中にある。
【００１９】
本発明の任意の態様の一実施形態では、所望の生物学的活性は、例えば標的リガンドまたは一般的リガンド（generic ligand）などのリガンドとの結合活性である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを結合活性に基づいて回収する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬなどの一般的リガンドを結合することに基づいて回収することができる。結合活性は、標的リガンドに対する特異的結合でもあり得る。標的リガンドの例としては、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＣＥＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ５６、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エキソダス−２、ＦＡＰα、ＦＧＦ−酸性、ＦＧＦ−塩基性、線維芽細胞増殖因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、ヒト血清アルブミン、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１受容体１型、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト増殖因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ミュラー管抑制物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄前駆細胞阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュルツリン、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、１−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、血清アルブミン、ｖＷＦ、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドアルファ）、ＭＭＰ１２、ＰＤＫ１、ＩｇＥ、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＡＬＫ５、ＥＧＦＲ、ＦｃＥＲ１、ＴＧＦｂ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１８、ＣＥＡ、ＣＲ８、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、キマーゼ、ＦＧＦ、フリン（Ｆｕｒｉｎ）、エンドセリン−１、エオタキシン類（例えば、エオタキシン、エオタキシン−２、エオタキシン−３）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ、ＩｇＥ、ＩＦＮａ、Ｉ−３０９、インテグリン、Ｌ−セレクチン、ＭＩＦ、ＭＩＰ４、ＭＤＣ、ＭＣＰ−１、ＭＭＰ、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、ＯＸ−４０、ＰＡＲＣ、ＰＤ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＦ、ＳＤＦ−１、ｓｉｇｌｅｃ８、ＴＡＲＣ、ＴＧＦｂ、トロンビン、Ｔｉｍ−１、ＴＮＦ、ＴＲＡＮＣＥ、トリプターゼ、ＶＥＧＦ、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ、α４β７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、アルファｖベータ６、アルファｖベータ８、ｃＭＥＴ、ＣＤ８、ｖＷＦ、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドアルファ）、ＭＭＰ１２、ＰＤＫ１、およびＩｇＥが挙げられる。別の実施形態では、標的リガンドはＧＬＰ−１受容体、またはその一部である。例えば、本発明の任意の態様による方法において、リガンドは、ＧＬＰ−１受容体細胞外ドメインであってよい。
【００２１】
本発明の任意の態様の特定の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドはパニング（panning）によって回収される。
【００２２】
本発明の方法のいずれかの一実施形態では、プロテアーゼの存在下で、レパートリーの１つ以上の成員がリガンドに対する結合に基づいて選択される場合、レパートリーをリガンド（標的リガンド；一般的リガンド）に暴露する。
【００２３】
本発明の任意の方法のいくつかの実施形態では、レパートリーは表示系を含む。例えば、表示系は、バクテリオファージ表示(display)、リボソーム表示、乳濁液コンパートメント化および表示、酵母表示、ピューロマイシン表示、細菌表示、プラスミド上の表示、または共有表示であり得る。好ましい表示系は、核酸のコード機能とこの核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴とを連結する。特定の実施形態では、表示系は複製可能な遺伝子パッケージを含む。
【００２４】
本発明の任意の方法のいくつかの実施形態では、表示系はバクテリオファージ表示を含む。例えば、バクテリオファージは、ｆｄ、Ｍ１３、ラムダ、ＭＳ２またはＴ７であり得る。特定の実施形態では、バクテリオファージ表示系は多価である。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドはｐＩＩＩ融合タンパク質として表示される。
【００２５】
本発明の任意の方法の一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリー（例えば、可変ドメイン）は、バクテリオファージ上で、例えば１０^６〜１０^１３、例えば１０^８〜１０^１２複製単位（感染性ビリオン）のファージライブラリーサイズで提示される。一実施形態では、レパートリーは、第２の、すなわちさらなるプロテアーゼとともにインキュベートされる場合、バクテリオファージ上で表示される。
【００２６】
本発明の任意の態様の他の実施形態では、当該方法は、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅することをさらに含む。特定の実施形態では、核酸は、ファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。
【００２７】
本発明の任意の態様の一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーは、大腸菌などの細菌細胞において増幅され、発現されるバクテリオファージ上で表示される。この実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーは細菌細胞において発現される場合、細菌プロテアーゼに暴露される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、レパートリーは、免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーである。特定の実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは重鎖可変ドメインである。さらに特定の実施形態では、重鎖可変ドメインはヒト重鎖可変ドメインである。他の実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは軽鎖可変ドメインである。特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインはヒト軽鎖可変ドメインである。
【００２９】
別の態様では、本発明は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーから、高い親和性で標的リガンドと結合するペプチドまたはポリペプチドを選択するための方法である。この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供すること、このレパートリーとプロテアーゼをプロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせること、そして標的リガンドと結合するペプチドまたはポリペプチドを回収することを含む。
【００３０】
所望の生物学的活性が結合活性である、本発明の前記方法によると、結合するリガンド（標的リガンド；一般的リガンド）はプロテアーゼと同じではない。
【００３１】
別の態様では、本発明は、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーの製造方法である。この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供すること、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼとをプロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせること、そして所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収することを含み、これによりプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーが製造される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドを結合活性に基づいて回収する。例えば、複数のペプチドまたはポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＬなどの一般的リガンドを結合することに基づいて回収することができる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、標的リガンドを結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）を含むプロテアーゼ耐性ポリペプチドをレパートリーから選択するための方法である。一実施形態では、この方法は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドのレパートリーを含むファージ表示系を提供すること、ファージ表示系と、エラスターゼ、ロイコザイムおよびトリプシンからなる群から選択されるプロテアーゼとをプロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせること、そして標的リガンドを結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを表示するファージを回収することを含む。適切には、この態様の一実施形態では、当該方法は、内因性プロテアーゼの発現に適した条件下でのインキュベーションをさらに含む。例えば、内因性プロテアーゼは、表示系によって発現されるプロテアーゼである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼを１００μｇ／ｍｌで使用し、合したファージ表示系とプロテアーゼとを約３７℃で一晩インキュベートする。
【００３５】
いくつかの実施形態では、標的リガンドを結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを表示するファージを、前記標的に対する結合によって回収する。他の実施形態では、標的リガンドを結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを表示するファージをパニングによって回収する。
【００３６】
本発明はまた、本明細書中に記載される方法によって選択可能であるかまたは選択される単離されたプロテアーゼ耐性ペプチドもしくはポリペプチドに関する。特定の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載するようなＧＬＰ−１ペプチドなどのＧＬＰ−１受容体アゴニストに関する。適切なＧＬＰ−１ペプチドおよびＧＬＰ−１ペプチド誘導体を実施例および図１に記載する。他の適切なペプチドとしては、エキセンディンならびにその相同体および誘導体などのＧＬＰ−１相同体または誘導体が挙げられる。さらなる適切な誘導体としては、ＧＬＰ−１のジペプチジルペプチダーゼＩＶ耐性誘導体が挙げられる。１つの好ましいペプチドは、アミノ酸配列ＤＭＳ７１４８（図１における配列６）によって同定される。別の好ましいペプチドは、アミノ酸配列ＤＭＳ７１６１（図１における配列１１）によって同定される。適切には、これらのＧＬＰ−１ペプチドをＡｌｂｕｄＡｂ配列と融合させる。別の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載される方法によって選択可能であるかまたは選択される単離されたプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム）耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ヒト抗体重鎖可変ドメイン、ヒト抗体軽鎖可変ドメイン）に関する。
【００３７】
有利には、本発明によるペプチドまたはポリペプチドは、発現中にタンパク質分解がなく低コスト宿主における発現に関して改善された特性を表示し得、かくしてこれらは工業的規模の製造にさらに好適となる。
【００３８】
本発明はまた、本明細書中に記載される方法によって選択可能であるかまたは選択されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン、エラスターゼ、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）をコードする単離された核酸または組換え核酸、ならびに当該核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）および宿主細胞に関する。
【００３９】
本発明はまた、本明細書中に記載される方法によって選択可能であるかまたは選択されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン、エラスターゼ−、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）を作製する方法であって、発現に適した条件下でプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドをコードする組換え核酸を含む宿主細胞を維持することを含み、これによりプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが製造される方法に関する。
【００４０】
したがって、本発明の任意の態様の文脈で、プロテアーゼは、表示系に対して内因性のプロテアーゼ、例えば細菌プロテアーゼであってもよいし、または血清、喀痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液または涙の１つ以上において見いだされる。一実施形態では、プロテアーゼは、眼および／または涙中に見出されるものである。本明細書中で議論されるように、選択されたプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、ヒトなどのほ乳類における疾患または症状の治療、予防および診断において有用性を有する。特に、ペプチドおよびポリペプチドは、ヒトなどの患者に投与された場合、プロテアーゼに遭遇する可能性がある薬剤の基礎として有用性を有する。
【００４１】
例えば、胃腸管に投与（例えば、経口、舌下、直腸投与）されると、この場合、ペプチドまたはポリペプチドは、上部胃腸管、下部胃腸管、口、胃、小腸および大腸の１つ以上においてプロテアーゼにさらされる。したがって、一実施形態は、患者における疾患または症状を治療および／または予防するために患者の胃腸管に経口、舌下または直腸投与されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを提供する。
【００４２】
例えば、一実施形態では、本発明は、関節炎（例えば、関節リウマチ）、ＩＢＤ、乾癬またはクローン病などのＴＮＦアルファ介在性症状または疾患の治療および／または予防のために、本発明の方法によって選択されるかまたは選択可能であるＴＮＦアルファアンタゴニストペプチドまたはポリペプチドの経口投与に関する。この実施形態では、アンタゴニストは抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）であってよい。別の例では、ペプチドまたはポリペプチドは、肺組織（例えば、肺または気道）に（例えば、吸入によるかまたは鼻内）投与された場合に、プロテアーゼと遭遇する可能性がある。したがって、一実施形態は、患者における疾患または症状を治療および／または予防するために、患者の肺組織に吸入によるかまたは鼻内投与されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このような症状は、ぜんそく（例えば、アレルギー性ぜんそく）、ＣＯＰＤ、インフルエンザ若しくは他の肺疾患またはＷＯ ２００６０３８０２７（参照により本明細書で援用される）に開示される症状であってよい。
【００４３】
別の例では、ペプチドまたはポリペプチドは、例えば皮下注射などの注射によるなど、非経口投与された場合に血清中でプロテアーゼに遭遇する可能性がある。したがって、一実施形態は、注射により投与され、患者における疾患または症状を治療および／または予防するためのプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このような症状は、糖尿病であってよい。一実施形態では、本発明は、糖尿病または糖尿病関連障害の治療および／または予防のために本発明の方法によって選択されるかまたは選択可能である、エキセンディンまたはその誘導体などのＧＬＰ−１またはその相同体および誘導体などのグルカゴン様ペプチド１受容体アゴニストの非経口投与を提供する。
【００４４】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、改善された融点または比較的高い融点（Ｔｍ）を提示し、向上した安定性をもたらし得る。高親和性標的結合もペプチドおよびポリペプチドの特性であり得る。これらの特性は、プロテアーゼ耐性と併せて、ペプチドおよびポリペプチドを、ヒトなどのほ乳類において薬剤として使用しやすくし、この場合、プロテアーゼは例えば胃腸管、肺組織または非経口投与に関して遭遇する可能性がある。
【００４５】
別の例では、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメインまたはアンタゴニスト）は、患者の眼に（例えば、眼内注射によるかまたは点眼液として）投与された場合、プロテアーゼと遭遇する可能性がある。したがって、一実施形態は、患者における疾患または症状（例えば眼の疾患または症状）を治療および／または予防するための、プロテアーゼ耐性ペプチド、ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アゴニストまたはアンタゴニストの患者（例えば、ヒト）に対する眼投与を提供する。投与は、眼へ、点眼液の形態で、または眼中への注射により、例えば硝子体液中に局所投与することであり得る。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、肺への送達用肺処方物を提供し、この場合、処方物は、５ミクロン未満、例えば４．５、４、３．５または３ミクロン未満の粒子サイズ範囲を有する本発明のアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド、ポリペプチドまたは可変ドメインを含む（例えば、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液中、例えばｐＨ６．５〜８．０、例えばｐＨ７〜７．５、例えばｐＨ７またはｐＨ７．５の場合）。
【００４７】
一実施形態では、本発明の処方物および組成物は、６．５〜８．０、例えば７〜７．５，例えば７、例えば７．５のｐＨで提供される。
【００４８】
本発明の任意の態様のペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）は、少なくとも５０℃、または少なくとも５５℃、または少なくとも６０℃、または少なくとも６５℃、または少なくとも７０℃のＴｍを有し得る。本発明のアゴニスト、アンタゴニスト、使用、方法、組成物、装置または処方物は、このようなペプチドまたはポリペプチドを含み得る。
【００４９】
本発明の一態様では、本発明のペプチド、ポリペプチド、可変ドメイン、アゴニスト、アンタゴニスト、組成物または処方物は、３７〜５０℃で１４日間、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液中でインキュベーション（１ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメイン濃度で）した後に実質的に安定である。一実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストまたは可変ドメインの少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％は３７℃でのこのようなインキュベーション後も凝集しないままである。一実施形態では、ペプチド、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％は、３７℃でのこのようなインキュベーション後に単量体のままである。一実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストまたは可変ドメインの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％は５０℃でのこのようなインキュベーション後に凝集しないままである。一実施形態では、ペプチド、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％は、５０℃でのこのようなインキュベーション後に単量体のままである。一実施形態では、このようなインキュベーションのいずれか１つの後に、ペプチド、ポリペプチド、可変ドメイン、アゴニスト、アンタゴニストの凝集は見られない。一実施形態では、３７℃、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液中１ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメイン濃度でインキュベーションした後に、ペプチド、ポリペプチドまたは可変ドメインのｐＩは変わらないままであるかまたは実質的に変わらない。
【００５０】
本発明の一態様では、本発明のペプチド、ポリペプチド、可変ドメイン、アゴニスト、アンタゴニスト、組成物または処方物は、４℃で７日間、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液中、ｐＨ７〜７．５（例えば、ｐＨ７またはｐＨ７．５）でインキュベーション（１００ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメイン濃度で）した後に実質的に安定である。一実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストまたは可変ドメインの少なくとも９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９または９９．５％は、このようなインキュベーション後に凝集しないままである。一実施形態では、ペプチド、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９または９９．５％はこのようなインキュベーション後に単量体のままである。一実施形態では、このようなインキュベーションのいずれか１つの後にペプチド、ポリペプチド、可変ドメイン、アゴニスト、アンタゴニストの凝集は見られない。
【００５１】
本発明の一態様では、本発明のペプチド、ポリペプチド、可変ドメイン、アゴニスト、アンタゴニスト、組成物または処方物は、例えば室温、２０℃または３７℃で１時間、例えばＰａｒｉ ＬＣ＋カップなどのジェットネブライザー中で噴霧（４０ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメインの濃度で）後に実質的に安定である。一実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストまたは可変ドメインの少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９または９９．５％はこのような噴霧後に凝集しないままである。一実施形態では、ペプチド、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９または９９．５％はこのような噴霧後に単量体のままである。一実施形態では、このような噴霧のいずれか１つの後にペプチド、ポリペプチド、可変ドメイン、アゴニスト、アンタゴニストの凝集は見られない。
【００５２】
ペプチドまたはポリペプチドは単離および／または組換え体であり得る。
【００５３】
適切には、本発明の任意の態様の一実施形態では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーから選択される。
【００５４】
本発明はまた、（例えば、治療または診断用）薬物において使用される、本明細書中に記載される方法によって選択可能であるかまたは選択されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン、エラスターゼ−、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）に関する。本発明はまた、疾患の治療用薬剤を製造するための、本明細書中に記載される方法によって選択可能であるかまたは選択されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン、エラスターゼ−、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）の使用に関する。本発明はまた、本明細書中に記載される方法によって選択可能であるかまたは選択される有効量のプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン、エラスターゼ−、またはロイコザイム耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）を、それを必要とする被験者に投与することを含む、疾患の治療法に関する。
【００５５】
本発明の任意の態様の一実施形態では、この方法は、第２のプロテアーゼと、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとを、第２のプロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせること；そして
少なくとも１つの所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを回収することをさらに含み、これにより第２のプロテアーゼに対して耐性である少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドが選択される。第１および第２のプロテアーゼは異なる。第２のプロテアーゼは前記定義のとおりであってよい。一実施形態では、第１または第２のプロテアーゼは、レパートリー表示系に対して内因性である。
【００５６】
本発明は、プロテアーゼとともに本発明の方法に適した条件下、例えば（ｉ）約１０μｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌプロテアーゼ、（ｉｉ）約２０℃〜約４０℃および（ｉｉｉ）少なくとも約３０分間の条件（例えば、１００μｇ／ｍｌプロテアーゼ、３７℃、少なくとも１時間の条件下）でインキュベートした場合、１つ以上の前記プロテアーゼに対して耐性であるペプチドまたはポリペプチドを含む、糖尿病の治療および／または予防のために患者に投与するための、単離されたＧＬＰ−１受容体アゴニストをさらに提供する。アゴニストは注射による投与のために使用することができる。
【００５７】
本発明の方法の一実施形態では、選択されたペプチドまたはポリペプチドを、第２のプロテアーゼまたは第１のプロテアーゼに対する耐性について、選択方法において使用したのとは異なる一連の条件下でさらに評価する。第２のプロテアーゼは、第１のプロテアーゼとは異なるが、それ以外は前記の任意のプロテアーゼであり得る。一実施形態では、２以上のプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを本発明の方法で選択し、続いてこれらのペプチドまたはポリペプチドのうちのどちらが選択方法において使用したものとは異なる条件下で第２プロテアーゼまたは第１プロテアーゼに対して耐性を示すかを確認するさらなる工程を行う。第２のプロテアーゼは第１のプロテアーゼと異なるが、それ以外は前記の任意のプロテアーゼであり得る。このようにして、１つ以上のペプチドまたはポリペプチドは、２以上のプロテアーゼに対して耐性になる。一実施形態では、第１または第２のプロテアーゼは、レパートリー表示系において内因的に発現されるプロテアーゼである。
【００５８】
本発明の方法の一実施形態では、プロテアーゼ耐性単量体ペプチドまたはポリペプチド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン単量体）が選択される。
【００５９】
本発明の薬剤、アゴニストおよびアンタゴニストは、前記ペプチドまたはポリペプチドと融合した抗体定常領域（例えば、Ｆｃ）を含み得る。
【００６０】
一実施形態では、本発明は、改善されたＰＫを有する薬剤を提供するためにほ乳類に投与するための薬剤の製造におけるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドの使用を提供する。改善されたＰＫは、改善されたＡＵＣ（曲線下面積）および／または改善された半減期であってよい。一実施形態では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、本発明の方法によって選択されるか、または選択可能である。一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは免疫グロブリン単一可変ドメインである。薬剤は、前記ペプチドまたはポリペプチドに融合した抗体定常領域、例えば抗体Ｆｃを含んでもよい。
【００６１】
本発明は、ほ乳類において改善されたＰＫを有する薬剤を提供するためにほ乳類（例えば、ヒト）に投与するための、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを含む薬剤を提供する。一実施形態では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、本発明の方法によって選択されるか、または選択可能である。一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは免疫グロブリン単一可変ドメインである。薬剤は、前記ペプチドまたはポリペプチドと融合した抗体定常領域（例えば、Ｆｃ）を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体１〜１０の配列を示す。
【図２】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体６〜１０のゲルを示す。
【図３】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体６〜１０（濃縮）のゲルを示す。
【図４】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体１１のゲルを示す。
【図５Ａ】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体６〜１１のＭＳ結果を示す。図５Ａ）はＤＭＳ７１４８（変異体６）を示す；（分析注釈：質量測定値は１つのジスルフィドを含む予想値と一致する（１５２４５．８８））；Ｂ）はＤＭＳ７１４９（変異体７）を示す（分析注釈：質量測定値は残基２４〜１４２（１２８６０．５６）、２６〜１４２（１２６０３．２６）および２８〜１４２（１２３９０．９７）（すべて１つのジスルフィドを含む）と一致する）。各ピークは、＋４２Ｄａである関連するピーク（おそらくはアセチル化されている）を有する）；Ｃ）はＤＭＳ７１５０（変異体８）を示す（分析注釈：質量測定値は、１つのジスルフィドを有する残基２６〜１４２と一致する（１２６０３．２６）。）；Ｄ）はＤＭＳ７１５１（変異体９）を示す（分析注釈：１２９６０を説明できない。１２８９０．５、１２６０３および１２３９１．５０はそれぞれ残基２４〜１４２、２６〜１４２および２８〜１４２と厳密に一致し、それぞれは１つのジスルフィドを有する（１２８６２．５３、１２６０５．２４および１２３９２．９４）。しかしながら、質量測定値と計算値との間には２Ｄａの差がある。）；Ｅ）はＤＭＳ７１５２（変異体１０）を示す（分析注釈：１２７９０．５および１２３２０．５はそれぞれ１つのジスルフィドを有する残基２４〜１４２および２８〜１４２と一致する（１２７９０．４２および１２３２０．８４）。）Ｆ）はＤＭＳ７１６１（変異体１１）を示す。
【図５Ｂ】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体６〜１１のＭＳ結果を示す。図５Ａ）はＤＭＳ７１４８（変異体６）を示す；（分析注釈：質量測定値は１つのジスルフィドを含む予想値と一致する（１５２４５．８８））；Ｂ）はＤＭＳ７１４９（変異体７）を示す（分析注釈：質量測定値は残基２４〜１４２（１２８６０．５６）、２６〜１４２（１２６０３．２６）および２８〜１４２（１２３９０．９７）（すべて１つのジスルフィドを含む）と一致する）。各ピークは、＋４２Ｄａである関連するピーク（おそらくはアセチル化されている）を有する）；Ｃ）はＤＭＳ７１５０（変異体８）を示す（分析注釈：質量測定値は、１つのジスルフィドを有する残基２６〜１４２と一致する（１２６０３．２６）。）；Ｄ）はＤＭＳ７１５１（変異体９）を示す（分析注釈：１２９６０を説明できない。１２８９０．５、１２６０３および１２３９１．５０はそれぞれ残基２４〜１４２、２６〜１４２および２８〜１４２と厳密に一致し、それぞれは１つのジスルフィドを有する（１２８６２．５３、１２６０５．２４および１２３９２．９４）。しかしながら、質量測定値と計算値との間には２Ｄａの差がある。）；Ｅ）はＤＭＳ７１５２（変異体１０）を示す（分析注釈：１２７９０．５および１２３２０．５はそれぞれ１つのジスルフィドを有する残基２４〜１４２および２８〜１４２と一致する（１２７９０．４２および１２３２０．８４）。）Ｆ）はＤＭＳ７１６１（変異体１１）を示す。
【図５Ｃ】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体６〜１１のＭＳ結果を示す。図５Ａ）はＤＭＳ７１４８（変異体６）を示す；（分析注釈：質量測定値は１つのジスルフィドを含む予想値と一致する（１５２４５．８８））；Ｂ）はＤＭＳ７１４９（変異体７）を示す（分析注釈：質量測定値は残基２４〜１４２（１２８６０．５６）、２６〜１４２（１２６０３．２６）および２８〜１４２（１２３９０．９７）（すべて１つのジスルフィドを含む）と一致する）。各ピークは、＋４２Ｄａである関連するピーク（おそらくはアセチル化されている）を有する）；Ｃ）はＤＭＳ７１５０（変異体８）を示す（分析注釈：質量測定値は、１つのジスルフィドを有する残基２６〜１４２と一致する（１２６０３．２６）。）；Ｄ）はＤＭＳ７１５１（変異体９）を示す（分析注釈：１２９６０を説明できない。１２８９０．５、１２６０３および１２３９１．５０はそれぞれ残基２４〜１４２、２６〜１４２および２８〜１４２と厳密に一致し、それぞれは１つのジスルフィドを有する（１２８６２．５３、１２６０５．２４および１２３９２．９４）。しかしながら、質量測定値と計算値との間には２Ｄａの差がある。）；Ｅ）はＤＭＳ７１５２（変異体１０）を示す（分析注釈：１２７９０．５および１２３２０．５はそれぞれ１つのジスルフィドを有する残基２４〜１４２および２８〜１４２と一致する（１２７９０．４２および１２３２０．８４）。）Ｆ）はＤＭＳ７１６１（変異体１１）を示す。
【図５Ｄ】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体６〜１１のＭＳ結果を示す。図５Ａ）はＤＭＳ７１４８（変異体６）を示す；（分析注釈：質量測定値は１つのジスルフィドを含む予想値と一致する（１５２４５．８８））；Ｂ）はＤＭＳ７１４９（変異体７）を示す（分析注釈：質量測定値は残基２４〜１４２（１２８６０．５６）、２６〜１４２（１２６０３．２６）および２８〜１４２（１２３９０．９７）（すべて１つのジスルフィドを含む）と一致する）。各ピークは、＋４２Ｄａである関連するピーク（おそらくはアセチル化されている）を有する）；Ｃ）はＤＭＳ７１５０（変異体８）を示す（分析注釈：質量測定値は、１つのジスルフィドを有する残基２６〜１４２と一致する（１２６０３．２６）。）；Ｄ）はＤＭＳ７１５１（変異体９）を示す（分析注釈：１２９６０を説明できない。１２８９０．５、１２６０３および１２３９１．５０はそれぞれ残基２４〜１４２、２６〜１４２および２８〜１４２と厳密に一致し、それぞれは１つのジスルフィドを有する（１２８６２．５３、１２６０５．２４および１２３９２．９４）。しかしながら、質量測定値と計算値との間には２Ｄａの差がある。）；Ｅ）はＤＭＳ７１５２（変異体１０）を示す（分析注釈：１２７９０．５および１２３２０．５はそれぞれ１つのジスルフィドを有する残基２４〜１４２および２８〜１４２と一致する（１２７９０．４２および１２３２０．８４）。）Ｆ）はＤＭＳ７１６１（変異体１１）を示す。
【図５Ｅ】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体６〜１１のＭＳ結果を示す。図５Ａ）はＤＭＳ７１４８（変異体６）を示す；（分析注釈：質量測定値は１つのジスルフィドを含む予想値と一致する（１５２４５．８８））；Ｂ）はＤＭＳ７１４９（変異体７）を示す（分析注釈：質量測定値は残基２４〜１４２（１２８６０．５６）、２６〜１４２（１２６０３．２６）および２８〜１４２（１２３９０．９７）（すべて１つのジスルフィドを含む）と一致する）。各ピークは、＋４２Ｄａである関連するピーク（おそらくはアセチル化されている）を有する）；Ｃ）はＤＭＳ７１５０（変異体８）を示す（分析注釈：質量測定値は、１つのジスルフィドを有する残基２６〜１４２と一致する（１２６０３．２６）。）；Ｄ）はＤＭＳ７１５１（変異体９）を示す（分析注釈：１２９６０を説明できない。１２８９０．５、１２６０３および１２３９１．５０はそれぞれ残基２４〜１４２、２６〜１４２および２８〜１４２と厳密に一致し、それぞれは１つのジスルフィドを有する（１２８６２．５３、１２６０５．２４および１２３９２．９４）。しかしながら、質量測定値と計算値との間には２Ｄａの差がある。）；Ｅ）はＤＭＳ７１５２（変異体１０）を示す（分析注釈：１２７９０．５および１２３２０．５はそれぞれ１つのジスルフィドを有する残基２４〜１４２および２８〜１４２と一致する（１２７９０．４２および１２３２０．８４）。）Ｆ）はＤＭＳ７１６１（変異体１１）を示す。
【図５Ｆ】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体６〜１１のＭＳ結果を示す。図５Ａ）はＤＭＳ７１４８（変異体６）を示す；（分析注釈：質量測定値は１つのジスルフィドを含む予想値と一致する（１５２４５．８８））；Ｂ）はＤＭＳ７１４９（変異体７）を示す（分析注釈：質量測定値は残基２４〜１４２（１２８６０．５６）、２６〜１４２（１２６０３．２６）および２８〜１４２（１２３９０．９７）（すべて１つのジスルフィドを含む）と一致する）。各ピークは、＋４２Ｄａである関連するピーク（おそらくはアセチル化されている）を有する）；Ｃ）はＤＭＳ７１５０（変異体８）を示す（分析注釈：質量測定値は、１つのジスルフィドを有する残基２６〜１４２と一致する（１２６０３．２６）。）；Ｄ）はＤＭＳ７１５１（変異体９）を示す（分析注釈：１２９６０を説明できない。１２８９０．５、１２６０３および１２３９１．５０はそれぞれ残基２４〜１４２、２６〜１４２および２８〜１４２と厳密に一致し、それぞれは１つのジスルフィドを有する（１２８６２．５３、１２６０５．２４および１２３９２．９４）。しかしながら、質量測定値と計算値との間には２Ｄａの差がある。）；Ｅ）はＤＭＳ７１５２（変異体１０）を示す（分析注釈：１２７９０．５および１２３２０．５はそれぞれ１つのジスルフィドを有する残基２４〜１４２および２８〜１４２と一致する（１２７９０．４２および１２３２０．８４）。）Ｆ）はＤＭＳ７１６１（変異体１１）を示す。
【図６】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体６のアッセイの結果を示す。
【図７】ＧＬＰ−１−ＡｌｂｕｄＡｂ融合変異体１１のアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
この明細書中で、明瞭且つ簡潔な明細書を書き表すよう、実施形態を参照しながら本発明を記載してきた。実施形態は、本発明を逸脱しない限り、種々に組合され、または切り離され得るよう意図されるし、そのように理解されるべきである。
【００６４】
本明細書中で用いる場合、「ペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に繋がれる約２〜約５０アミノ酸を指す。
【００６５】
本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により一緒に繋がれる少なくとも約５０アミノ酸を指す。ポリペプチドは一般的に、三次構造を含み、機能的ドメインに折りたたまれる。
【００６６】
明細書中で用いる場合、「プロテアーゼ分解に対して耐性」であるペプチドまたはポリペプチド（例えば、ドメイン抗体（ｄＡｂ））は、プロテアーゼの活性に適した条件下でプロテアーゼとともにインキュベートされる場合、プロテアーゼにより実質的に分解されない。プロテアーゼの活性に適した温度で、例えば３７または５０℃で、約１時間、プロテアーゼとともにインキュベート後に、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下のタンパク質のタンパク質が分解されるか、または実質的に全くタンパク質が分解されない場合、ポリペプチド（例えばｄＡｂ）は実質的に分解されない。タンパク質分解は、本明細書中に記載されるような任意の適切な方法を用いて、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、または機能性検定（例えばリガンド結合）により査定され得る。
【００６７】
明細書中で用いる場合、「表示系」は、ポリペプチドまたはペプチドのコレクションを、物理的、化学的または機能的特徴などの所望の特性に基づいた選択に利用可能である系を指す。表示系は、ポリペプチドまたはペプチドの適切なレパートリーであり得る（例えば、溶液中、適切な支持体上で固定）。表示系は、細胞発現系（例えば、形質転換、感染、トランスフェクトまたは形質導入細胞における核酸のライブラリーの発現および細胞表面上のコードされたポリペプチドの表示）または無細胞発現系（例えば、乳濁液コンパートメント化および表示）を用いる生化学的系でもあり得る。好ましい表示系は、核酸のコード機能と、この核酸によってコードされるポリペプチドまたはペプチドの物理的、化学的および／または機能的特徴とを連結する。このような表示系を用いる場合、所望の物理的、化学的および／または機能的特徴を有するポリペプチドまたはペプチドを選択することができ、選択されたポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を容易に単離または回収することができる。核酸のコード機能と、ポリペプチドまたはペプチドの物理的、化学的および／または機能的特徴とを連結する多数の表示系、例えば、バクテリオファージ表示（ファージ表示）、リボソーム表示、乳濁液コンパートメント化および表示、酵母表示、ピューロマイシン表示、細菌表示、プラスミド上の表示、共有表示などが当該技術分野で公知である（例えば、ＥＰ０４３６５９７（Ｄｙａｘ）、米国特許第６，１７２，１９７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，４８９，１０３号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．）を参照）。
【００６８】
本明細書中で用いる場合、「レパートリー」は、アミノ酸配列の多様性を特徴とするポリペプチドまたはペプチドのコレクションを指す。レパートリーの個々の成員は、共通の構造的特徴（例えば、共通のコア構造）および／または共通の機能的特徴（例えば、共通のリガンド（例えば、一般的リガンドもしくは標的リガンド）を結合する能力）などの共通の特性を有し得る。
【００６９】
本明細書中で用いる場合、「機能的」とは、特異的結合活性などの生物学的活性を有するポリペプチドまたはペプチドを記載する。例えば、「機能的ポリペプチド」という用語には、抗原結合部位によって標的抗原を結合する抗体またはその抗原結合断片、およびその基質と結合する酵素が含まれる。
【００７０】
本明細書中で用いる場合、「一般的リガンド」は、所定のレパートリーの機能的成員の実質的な部分（例えば、実質的に全て）を結合するリガンドを指す。一般的リガンド（例えば、共通の一般的リガンド）は、成員が共通の標的リガンドに対して結合特異性を有していなくても、所定のレパートリーの多くの成員を結合することができる。一般に、ポリペプチド上の機能的一般的リガンド結合部位の存在（一般的リガンドを結合する能力によって示される）は、ポリペプチドが正しく折りたたまれ、機能的であることを示す。一般的リガンドの適切な例としては、レパートリーの機能的成員の実質的な部分上で発現されるエピトープを結合する抗体などが挙げられる。
【００７１】
「超抗原」は、これらのタンパク質の標的リガンド結合部位と異なる部位で免疫グロブリンスーパーファミリーの成員と相互作用する一般的リガンドを指す専門用語である。ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）は、Ｔ細胞受容体と相互作用する超抗原の例である。抗体を結合する超抗原には、ＩｇＧ定常領域を結合するプロテインＧ（Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133:969(1984)）；ＩｇＧ定常領域およびＶ_Ｈドメインを結合するプロテインＡ（Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97:822(1966)）；およびＶ_Ｌドメインを結合するプロテインＬ（Bjorck, J. Immunol., 140:1194(1988)）が含まれる。
【００７２】
本明細書中で用いる場合、「標的リガンド」は、ポリペプチドまたはペプチドにより特異的にまたは選択的に結合されるリガンドを指す。例えば、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合断片である場合、標的リガンドは任意の所望の抗原またはエピトープであり得、標的リガンドは任意の所望の基質であり得る。標的抗原との結合は、機能性であるポリペプチドまたはペプチドに左右される。
【００７３】
本明細書中で用いる場合、「抗体フォーマット」は、その構造上に抗原に対する結合特異性を付与するために抗体可変ドメインが組み入れられ得る任意の適切なポリペプチド構造を指す。種々の適切な抗体フォーマット、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、Ｖ_Ｈ、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_Ｌ）、ならびに前記のいずれかの修飾バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の適切なポリマーの共有的結合により修飾されたもの）が、当該技術分野で知られている。
【００７４】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という語句は、他のＶ領域またはドメインとは関係なく、一抗原またはエピトープを特異的に結合する抗体可変ドメイン（Ｖ_Ｈ、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_Ｌ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを有するフォーマット（例えば、ホモ−またはヘテロ−多量体）中に存在し得るが、この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合のために必要でない（すなわち、この場合、免疫グロブリン単一可変ドメインは、付加的可変ドメインとは関係なく、抗原を結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、当該用語を本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくはヒト抗体可変ドメインであるが、しかし、齧歯類（例えば、ＷＯ ００／２９００４（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示）、テンジクザメおよびラクダ類Ｖ_ＨＨｄＡｂのような他の種からの単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ類Ｖ_ＨＨは、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含めた種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。
【００７５】
「ドメイン」は、タンパク質の残部とは無関係な三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般的に、ドメインはタンパク質の別個の機能的特徴の元をなし、多くの場合、残りのタンパク質および／またはドメインの機能の損失を伴わずに、他のタンパク質に付加され、除去され、または運ばれ得る。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン（例えば、１つ以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列により取り替えられる）、あるいは切頭化されているかまたはＮ−またはＣ−末端伸張を含む抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を包含する。
【００７６】
「ライブラリー」という用語は、異種ポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリーは、それぞれが単一のポリペプチドまたは核酸配列を有する成員から構成される。この点で、「ライブラリー」は「レパートリー」と同義である。ライブラリー成員間の配列の差異は、ライブラリーにおいて存在する多様性の原因である。ライブラリーは、ポリペプチドもしくは核酸の単純な混合物の形態をとってもよいし、あるいは核酸のライブラリーで形質転換された、生物体もしくは細胞、例えば細菌、ウイルス、動物または植物細胞などの形態をとってもよい。好ましくは、個々の生物体または細胞は１つだけまたは限定された数のライブラリー成員を含む。有利には、当該核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、核酸を発現ベクター中に組み入れる。したがって好ましい態様では、ライブラリーは宿主生物体の集団の形態をとってもよく、各生物体は、その対応するポリペプチド成員を産生するために発現することができる核酸形態のライブラリーの１つの成員を含む１コピー以上の発現ベクターを含む。したがって宿主生物体の集団は、様々なポリペプチドの大きなレパートリーをコードする可能性がある。
【００７７】
「ユニバーサルフレームワーク」は、Ｋａｂａｔ（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９９１）によって定義される配列において保存された抗体の領域に対応するか、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、（１９８７）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９１０−９１７によって定義されるヒト生殖細胞系免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列である。本発明は、超可変領域単独における変化にもかかわらず、実質的に任意の結合特異性の誘導を許容することが判明している、１つのフレームワーク、またはこのようなフレームワークのセットの使用を提供する。
【００７８】
本明細書中で定義されるようなアミノ酸およびヌクレオチド配列アラインメント、ならびに相同性、類似性または同一性は、好ましくはデフォルトパラメーターを用いて、アルゴリズムＢＬＡＳＴ２配列を用いて、調製され、確定される（Ｔａｔｕｓｏｖａ， Ｔ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， １７４： １８７−１８８ （１９９９））。
【００７９】
本発明は、所望の生物学的活性を有するプロテアーゼ耐性ペプチドおよびポリペプチドの選択法に関する。プロテアーゼ分解に対して高度に安定で且つ耐性であり、そして所望の生物学的活性を有するポリペプチドを選択するための効率的プロセスを生じるための方法に、少なくとも２つの選択的圧力が用いられる。本明細書中で用いる場合、プロテアーゼ耐性ペプチドおよびポリペプチドは、一般的に、生物学的活性を保持する。これに対比して、プロテアーゼ感受性ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書中に記載される方法において、プロテアーゼにより切断されるかまたは消化され、したがって、それらの生物学的活性を失う。したがって、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、一般的に、それらの生物学的活性、例えば結合活性に基づいて選択される。
【００８０】
本明細書中に記載されるような方法はいくつかの利点を提供する。例えば、本明細書中で開示され、例示されるように、あるプロテアーゼ（例えばトリプシン）によるタンパク質分解性分解に対する耐性に関して選択されるペプチドまたはポリペプチドは、他のプロテアーゼ（例えばエラスターゼ、ロイコザイム）による分解に対しても耐性である。加えて、プロテアーゼ耐性は、ペプチドまたはポリペプチドの高い融点（Ｔｍ）と相関し得る。融点が高いほど、より安定なペプチドおよびポリペプチドであることを示す。プロテアーゼ分解に対する耐性は、標的リガンドに対する高親和性結合とも相関する。したがって、本明細書中に記載されるような方法は、所望の生物学的活性を有し、そしてそれらがプロテアーゼ耐性および安定性であるためin vivoでの治療的および／または診断的使用に十分適しているポリペプチドを選択し、単離し、および／または回収するための効率的な方法を提供する。
【００８１】
選択法
一態様では、本発明は、ペプチドまたはポリペプチドを、プロテアーゼ（例えば、１つ以上のプロテアーゼ）による分解に対して耐性である、ペプチド及びポリペプチドのライブラリーまたはレパートリー（例えば、表示系）から選択し、単離し、および／または回収するための方法である。好ましくは、この方法は、ポリペプチドを、プロテアーゼ（例えば、１つ以上のプロテアーゼ）による分解に対して耐性であるペプチド及びポリペプチドのライブラリーまたはレパートリー（例えば、表示系）から選択し、単離し、および／または回収するための方法である。一般的に、この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供すること、プロテアーゼ（例えば細菌プロテアーゼまたは外から添加されたプロテアーゼ、例えばトリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、喀痰）の存在下、プロテアーゼの活性に適した条件下でこのライブラリーまたはレパートリーをインキュベートすること、そしてプロテアーゼによる分解に対して耐性であり、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離し、および／または回収することを含む。プロテアーゼにより分解されるペプチドまたはポリペプチドは、一般的に、プロテアーゼの活性のために生物学的活性が減少するかまたはそれらの生物学的活性を失う。したがって、プロテアーゼ分解に対して耐性であるペプチドまたはポリペプチドを、それらの生物学的活性、例えば、結合活性（例えば、一般的リガンドの結合、特異的リガンドの結合、基質の結合）、触媒活性または他の生物学的活性などに基づいた方法を用いて、選択し、単離し、および／または回収することができる。
【００８２】
本明細書中で記載され、例示されるように、プロテアーゼ耐性ｄＡｂは、一般的にそれらの標的リガンドを高い親和性で結合する。したがって、別の態様では、本発明は、リガンド、好ましくは標的リガンドを高い親和性で結合するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離し、および／または回収するための方法である。好ましくは、この方法は、リガンド、好ましくは標的リガンドを高い親和性で結合するポリペプチドを選択し、単離し、および／または回収するための方法である。一般的に、この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供すること、ライブラリーまたはレパートリーをプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、喀痰）とプロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせること、そしてリガンド（例えば、標的リガンド）を結合するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離し、および／または回収することを含む。本明細書中に記載されるように、この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを、細菌プロテアーゼ（この場合、表示系は細菌における発現を含む）などの表示系に対して内因性であるプロテアーゼの活性に適した条件下でインキュベートすることも含み得る。ライブラリーまたはレパートリーはプロテアーゼ感受性ペプチドまたはポリペプチドが消化される条件下でプロテアーゼにさらされているので、プロテアーゼの活性は低い結合親和性を有するあまり安定でないポリペプチドを除去し得、これによって高親和性結合ペプチドまたはポリペプチドの集団が産生される。例えば、ポリペプチドの選択されたペプチドは、その標的リガンドを１μＭ以上、好ましくは約５００ｎＭ〜約０．５ｐＭの親和性（ＫＤ；表面プラズモン共鳴により確定した場合、ＫＤ＝Ｋ_ｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋ_ｏｎ（ｋａ））で結合することができる。例えば、ポリペプチドの高親和性ペプチドは、標的リガンドを約５００ｎＭ、約１００ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約１０ｐＭ、約１ｐＭまたは約０．５ｐＭの親和性で結合することができる。プロテアーゼに対して耐性であるペプチドおよびポリペプチドは、低いエントロピーおよび／または高い安定化エネルギーを有すると考えられる。したがって、プロテアーゼ耐性と高親和性結合との間の相関は、本発明の方法によって選択されたペプチドおよびポリペプチドの表面の緊密性および安定性に関連し得る。
【００８３】
ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーをプロテアーゼ（例えば、１つ以上のプロテアーゼ）とプロテアーゼのタンパク質分解活性に適した条件下で組み合わせる。プロテアーゼ、および生物学的調製物またはタンパク質分解活性を含む混合物のタンパク質分解活性に適した条件は当該技術分野で周知であるかまたは当業者が容易に確定することができる。所望により、適切な条件は、例えば、プロテアーゼ活性を様々なｐＨ条件、プロテアーゼ濃度、温度で査定することにより、および／またはライブラリーまたはレパートリーとプロテアーゼとを反応させる時間の量を変えることにより、特定または最適化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、トリプシンなどのプロテアーゼのペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対する比（モル／モルに基づいて）は、８００〜８０，０００（例えば、８，０００〜８０，０００）プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドであり、例えば１０マイクログラム／ｍｌのプロテアーゼを使用する場合、比は８００〜８０，０００ プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチド；または１００マイクログラム／ｍｌのプロテアーゼを使用する場合、比は８，０００〜８０，０００ プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態では、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）のペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対する比（重量／重量、例えばマイクログラム／マイクログラム基準）は、１，６００〜１６０，０００（例えば、１６，０００〜１６０，０００）プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドであり、例えば１０マイクログラム／ｍｌのプロテアーゼを使用する場合、比は１，６００〜１６０，０００ プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチド；または１００μｇ／ｍｌのプロテアーゼを使用する場合、比は１６，０００〜１６０，０００ プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態では、プロテアーゼを少なくとも１００または１０００μｇ／ｍｌの濃度で使用し、トリプシンなどのプロテアーゼのペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対するプロテアーゼ：ペプチド比（モル／モルに基づいて）は８，０００〜８０，０００プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態では、プロテアーゼを少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度で使用し、トリプシンなどのプロテアーゼのペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対するプロテアーゼ：ペプチド比（モル／モルに基づいて）は、８００〜８０，０００ プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態では、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）のペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対する比（重量／重量、例えばマイクログラム／マイクログラム基準）は、１６００〜１６０，０００ プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドであり、Ｃが１０μｇ／ｍｌである場合；またはＣもしくはＣ’が１００μｇ／ｍｌである場合、比は、１６，０００〜１６０，０００ プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態では、濃度（ｃまたはｃ’）は少なくとも１００または１０００μｇ／ｍｌ プロテアーゼである。個々のまたは単離されたペプチドまたはポリペプチド（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）、例えばレパートリーまたはライブラリーからすでに単離されたものを試験するために、プロテアーゼをペプチドまたはポリペプチドの適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中溶液に添加して、少なくとも約０．０１％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、約０．０１％〜約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、約０．０５％〜約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、約０．１％〜約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、約０．５％〜約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、約１％〜約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．０１％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．０２％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．０３％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．０４％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．０５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．０６％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．０７％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．０８％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．０９％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．１％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．２％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．３％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．４％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．６％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．７％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．８％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約０．９％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約１％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約２％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約３％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約４％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、または約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチドの溶液などのペプチドまたはポリペプチド／プロテアーゼ溶液を生成させることができる。混合物をプロテアーゼの活性に適した温度（例えば、室温、約３７℃）でインキュベートすることができ、時間間隔（例えば、１時間、２時間、３時間など）をあけて試料を採取することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはリガンド結合などの任意の適切な方法を用いてタンパク質分解について試料を分析することができ、結果を用いて分解の時間経過を確証することができる。
【００８４】
任意の所望のプロテアーゼを本明細書中に記載される方法において使用することができる。例えば、１つのプロテアーゼ、異なるプロテアーゼの任意の所望の組み合わせ、またはタンパク質分解活性を含む任意の生物学的調製物、生物学的抽出物、もしくは生物学的ホモジネートを用いることができる。使用されるプロテアーゼの正体がわかっている必要はない。単独または任意の所望の組み合わせで使用できるプロテアーゼの好適な例としては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンＧ）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ１、プロテイナーゼ２、プロテイナーゼ３）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ９、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、セパラーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶなどが挙げられる。タンパク質分解活性を含む適切な生物学的抽出物、ホモジネートおよび調製物としては、血清、喀痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液、涙などが挙げられる。一実施形態では、プロテアーゼは、眼および／または涙中に見出されるものである。プロテアーゼはタンパク質分解性分解が起こるために適した量で使用される。例えば、本明細書中に記載されるように、プロテアーゼは約０．０１％〜約５％（ｗ／ｗ、プロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド）で使用できる。例えば、プロテアーゼを、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含む表示系（例えば、ファージ表示系）と組み合わせる場合、プロテアーゼを、約１０μｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌまたは約３ｍｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。適切な濃度は、約１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ〜１００、９０、８０、７０、６０、５０もしくは４０μｇ／ｍｌ、または１０、２０、３０、４０もしくは５０μｇ／ｍｌ〜１００、９０、８０、７０、６０μｇ／ｍｌである。
【００８５】
プロテアーゼをペプチドまたはポリペプチドのコレクション（ライブラリーまたはレパートリー）とともに、プロテアーゼの活性に適した温度でインキュベートする。例えば、プロテアーゼおよびペプチドまたはポリペプチドのコレクションを、約２０℃〜約４０℃（例えば、室温、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃）の温度でインキュベートすることができる。プロテアーゼおよびペプチドまたはポリペプチドのコレクションを一緒に、タンパク質分解性分解が起こるために十分な時間インキュベートする。例えば、ペプチドまたはポリペプチドのコレクションを約３０分〜約２４または約４８時間プロテアーゼと一緒にインキュベートすることができる。数例では、ペプチドまたはポリペプチドのコレクションをプロテアーゼと一緒に、一晩、または少なくとも約３０分間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約４８時間、またはそれ以上インキュベートする。
【００８６】
少なくとも早期選択段階において（例えば、表示系を使用する場合）、プロテアーゼによって、プロテアーゼと一緒のインキュベーションを含まない選択と比較して、選択される所望の生物学的活性を有するクローンの数が少なくとも１０倍減少することが一般的に望ましい。特定例では、当該方法において用いられるプロテアーゼの量および条件は、回収されるクローンの数が、少なくとも約１ｌｏｇ（１０倍）、少なくとも約２ｌｏｇ（１００倍）、少なくとも約３ｌｏｇ（１０００倍）または少なくとも約４ｌｏｇ（１０，０００倍）減少するために十分である。回収されたクローンにおいて所望の減少をもたらす適切なプロテアーゼの量およびインキュベーション条件は、通常の方法および／または本明細書中で記載されるガイダンスを用いて容易に確定することができる。
【００８７】
プロテアーゼおよびペプチドまたはポリペプチドのコレクションを、任意の適切な方法を用いて組み合わせ、インキュベートすることができる（例えば、in vitro、in vivoまたはex vivo）。例えば、プロテアーゼおよびペプチドまたはポリペプチドのコレクションを、適切な容器中で組み合わせ、そしてプロテアーゼの活性に適した温度で定常状態を保持し、揺らし、振とうし、回転させるなどで組み合わせることができる。所望により、プロテアーゼおよびペプチドまたはポリペプチドのコレクションをｖｉｖｏまたはex vivo系において、ポリペプチドのコレクション（例えば、ファージ表示ライブラリーまたはレパートリー）を適切な動物（例えば、マウス）中に導入し、そしてプロテアーゼ活性に十分な時間が経過した後、ペプチドまたはポリペプチドのコレクションを回収することによって、組み合わせることができる。別の例では、器官または組織をポリペプチドのコレクション（例えば、ファージ表示ライブラリーまたはレパートリー）で灌流し、そしてプロテアーゼ活性に十分な時間が経過した後、ポリペプチドのコレクションを回収する。
【００８８】
インキュベーション後、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを、結合活性などの所望の生物学的活性に基づいて選択することができる。所望により、プロテアーゼ阻害剤を選択前に添加することができる。選択方法を実質的に妨害しない、任意の適切なプロテアーゼ阻害剤（または２つ以上のプロテアーゼ阻害剤の組み合わせ）を使用することができる。適切なプロテアーゼ阻害剤の例としては、α１−抗トリプシン、α２−マクログロブリン、アマスタチン、アンチパイン、抗トロンビンＩＩＩ、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド（ＡＥＢＳＦ）、（４−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド（ＡＰＭＳＦ）、ベスタチン、ベンズアミジン、キモスタチン、３，４−ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＩＦＰ）、Ｅ−６４、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エラスタチナール、ロイペプチン、Ｎ−エチルマレイミド、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチン、１，１０−フェナントロリン、ホスフォラミドン、セリンプロテアーゼ阻害剤、Ｎ−トシル−Ｌ−リシン−クロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、Ｎａ−トシル−Ｐｈｅ−クロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）などが挙げられる。加えて、数種のプロテアーゼの阻害剤を含む多くの調製物が市販されている（例えば、キモトリプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、膵臓抽出物およびトリプシンを阻害する、Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国インディアナ州インディアナポリス））。
【００８９】
プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、所望の生物学的活性を有するペプチドおよびポリペプチドを所望の生物学的活性を有さないペプチドおよびポリペプチドと識別し、選択することを可能にする、所望の生物学的活性選択方法を用いて選択することができる。一般的に、プロテアーゼによって消化され、切断されたペプチドまたはポリペプチドはそれらの生物学的活性を失い、一方、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは機能的なままである。したがって、生物学的活性に適したアッセイを使用して、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択することができる。例えば、一般的な結合機能（例えば、一般的リガンドの結合、特異的リガンドの結合、または基質の結合）を、適切な結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、パニング）を用いて査定することができる。例えば、プロテインＡ、プロテインＬまたは抗体などの標的リガンドまたは一般的リガンドと結合するポリペプチドを、パニングによるかまたは適切な親和性マトリックスを使用することにより、選択し、単離し、および／または回収することができる。パニングは、リガンド（例えば、一般的リガンド、標的リガンド）の溶液を適切な容器（例えば、試験管、ペトリ皿）に添加し、リガンドを容器の壁上に沈着させるかまたは被覆させることによって実施できる。過剰のリガンドを洗い流し、ポリペプチド（例えば、ファージ表示ライブラリー）を容器に添加することができ、ポリペプチドが固定リガンドに結合するために適した条件下で容器を維持する。非結合ポリペプチドを洗い流し、例えば削り落とすか、またはｐＨを下げることによるなどの任意の適切な方法を用いて結合ポリペプチドを回収することができる。
【００９０】
ファージ表示系を使用する場合、結合をファージＥＬＩＳＡにおいて試験することができる。ファージＥＬＩＳＡは、任意の適切な手順に従って実施することができる。一例では、選択の各ラウンドで産生されたファージの集団を、ＥＬＩＳＡによって、選択された標的リガンドまたは一般的リガンドに対する結合についてスクリーニングして、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを表示するファージを同定することができる。所望により、可溶性ペプチドおよびポリペプチドを、標的リガンドまたは一般的リガンドに対する結合について、例えばＣ−またはＮ−末端タグに対する試薬を用いたＥＬＩＳＡによって試験することができる（例えばＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２， ４３３−５５およびここに記載される引例を参照）。選択されたファージの多様性は、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． １９９１，前掲；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ． １９９４、前掲）、プロービング（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７， ７７６）またはベクターＤＮＡの配列決定によっても査定することができる。
【００９１】
プロテアーゼ耐性ペプチドおよびポリペプチドは、例えば、触媒活性アッセイ（例えば、タンパク質分解活性アッセイ、ホスホトランスフェラーゼアッセイ、ホスホヒドロラーゼアッセイ、ポリメラーゼ活性アッセイ）を用いて測定することができる触媒活性に基づいて選択することもできる。
【００９２】
プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、単一抗体可変ドメイン）は、サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、酵素（例えば、プロテアーゼ）、酵素の補因子、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質および炭水化物をはじめとするヒトもしくは動物タンパク質などの一般的リガンドまたは任意の所望の標的リガンドに関して結合特異性を有し得る。サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体および本明細書中に記載されるような他のタンパク質をはじめとする適切な標的抗原。このリストは網羅的なものではないと理解されるであろう。
【００９３】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、ＴＮＦＲ１、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−９、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＡＬＫ５、ＥＧＦＲ、ＦｃＥＲ１、ＴＧＦｂ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１８、ＣＥＡ、ＣＲ８、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、キマーゼ、ＦＧＦ、フリン、エンドセリン−１、エオタキシン類（例えば、エオタキシン、エオタキシン−２、エオタキシン−３）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ、ＩｇＥ、ＩＦＮａ、Ｉ−３０９、インテグリン、Ｌ−セレクチン、ＭＩＦ、ＭＩＰ４、ＭＤＣ、ＭＣＰ−１、ＭＭＰ、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、ＯＸ−４０、ＰＡＲＣ、ＰＤ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＦ、ＳＤＦ−１、ｓｉｇｌｅｃ８、ＴＡＲＣ、ＴＧＦｂ、トロンビン、Ｔｉｍ−１、ＴＮＦ、ＴＲＡＮＣＥ、トリプターゼ、ＶＥＧＦ、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ、α４β７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、アルファｖベータ６、アルファｖベータ８、ｃＭＥＴ、ＣＤ８、ｖＷＦ、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドアルファ）、ＭＭＰ１２、ＰＤＫ１、およびＩｇＥからなる群から選択される標的などの、肺組織における標的を結合する。
【００９４】
表示系（例えば、核酸のコード機能と当該核酸によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴とを連結する表示系）を本明細書中に記載されるような方法において使用する場合、選択ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅または増大させることがしばしば有利である。これにより、本明細書中に記載されるような方法または他の適切な方法を用いて、選択のさらなるラウンドのために、またはさらなるレパートリー（例えば、親和性成熟レパートリー）の調製のために十分な量の核酸および／またはペプチドまたはポリペプチドを得る効率的な方法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、表示系（例えば、核酸のコード機能とこの核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴、例えばファージ表示とを連結するもの）を使用することを含み、選択ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅または増大させることをさらに含む。核酸は、ファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応によるなど、任意の適切な方法を用いて増幅することができる。
【００９５】
本明細書中に記載されるような方法を、所望により、他の適切な選択方法を含み得る、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを単離するためのプログラムの一部として使用することができる。これらの状況では、本明細書中に記載される方法は、プログラムの任意の所望の時点で、例えば他の選択方法が用いられる前または後に用いられ得る。本明細書中に記載されるような方法は、本明細書中で例示されるように、２ラウンド以上の選択を提供するために使用することもできる。
【００９６】
別の態様では、本発明は、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーの製造方法である。この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供すること；プロテアーゼの活性に適した条件下でペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼを組合せること；そして所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収し、それによりプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーが製造されることを包含する。好ましくは、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドは、一般的リガンドまたは標的リガンドに対する結合などの結合活性に基づいて回収される。本方法で用いるのに適しているプロテアーゼ、表示系、プロテアーゼ活性のための条件、ならびにペプチドまたはポリペプチドの選択方法は、本発明の他の方法と関連して本明細書中に記載される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含む表示系（例えば、核酸のコード機能と核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴を連結する表示系）が用いられ、そして当該方法はさらに、複数の選択ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅するかまたは増大することを包含する。核酸は、任意の適切な方法を用いて、例えばファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得る。一実施形態では、表示系はバクテリオファージ表示であり、増幅は大腸菌における発現による。この実施形態では、大腸菌におけるプロテアーゼ発現は、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドの選択のためのプロテアーゼを提供することができる。
【００９８】
特定の実施形態では、本発明は、ｄＡｂを含むプロテアーゼ耐性ポリペプチドのレパートリーの製造方法である。この方法は、ｄＡｂを含むポリペプチドのレパートリーを提供すること；プロテアーゼの活性に適した条件下でペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム）を組合せること；そして一般的リガンド（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ）または標的リガンドに対する結合特異性を有するｄＡｂを含む複数のポリペプチドを回収することを包含する。この方法を用いて、ナイーブレパートリー、あるいは所望の結合特異性に偏向されるレパートリー、例えば所望の標的リガンドに対する結合特異性を有する親ｄＡｂを基礎にした親和性成熟レパートリーを製造し得る。
【００９９】
ポリペプチド表示系
好ましくは、本発明の方法において使用するために提供されるペプチドまたはポリペプチドのレパートリーまたはライブラリーは適切な表示系を含む。表示系は、好ましくは、プロテアーゼ（例えば、１つのプロテアーゼまたはプロテアーゼとタンパク質分解活性を含む任意の生物学的抽出物、ホモジネートもしくは調製物（例えば、血清、喀痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液、涙などとの組み合わせ）による分解に対抗する。表示系およびこの表示系と表示されたポリペプチドとの間の連結は、好ましくは少なくともレパートリーの最も安定なペプチドまたはポリペプチドと同等にプロテアーゼに対して耐性である。これにより、選択され表示されたポリペプチドをコードする核酸を容易に単離および／または増幅することが可能になる。
【０１００】
一例では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを、溶液中、またはプラスチックもしくはガラス（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロアレイなどのポリペプチドアレイ）などの適切な表面に共有的にまたは非共有的に結合したペプチドまたはポリペプチドのレパートリーから選択し、単離し、および／または回収することができる。例えば、それぞれ異なるライブラリー成員（例えば、独自のペプチド配列）をアレイ中の独立したあらかじめ決められた位置に配置するような表面上のペプチドのアレイを使用できる。このようなアレイにおける各ライブラリー成員の同一性は、アレイにおけるその空間的な位置によって確定することができる。例えば標的リガンドと、反応性ライブラリー成員との間の結合相互作用が起こるアレイにおける位置を確定することができ、これによって空間的位置に基づいて反応性成員の配列が特定される。（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、ＷＯ ９０／１５０７０およびＷＯ ９２／１００９２を参照）。
【０１０１】
好ましくは、この方法は、核酸のコード機能と、当該核酸によりコードされるポリペプチドの物理的、化学的および／または機能的特徴とを連結する表示系を用いる。このような表示系は、バクテリオファージまたは細胞（細菌）などの複数の複製可能な遺伝子パッケージを含み得る。好ましくは、表示系は、バクテリオファージ表示ライブラリーなどのライブラリーを含む。バクテリオファージ表示が特に好ましい表示系である。
【０１０２】
多数の適切なバクテリオファージ表示系（例えば、一価表示および多価表示系）が記載されている（例えば、Griffiths et al、米国特許第６，５５５，３１３ Ｂ１号（参照することにより本明細書で援用される）；Johnson et al、米国特許第５，７３３，７４３号（参照することにより本明細書で援用される）；McCafferty et al、米国特許第５，９６９，１０８号（参照することにより本明細書で援用される）；Mulligan-Kehoe、米国特許第５，７０２，８９２号（参照することにより本明細書で援用される）；Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455(1994);Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189(1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133(2001)を参照。）バクテリオファージ表示系で表示されたペプチドまたはポリペプチドを、例えば線状ファージ（例えば、ｆｄ、Ｍ１３、Ｆ１）、溶菌ファージ（例えば、Ｔ４、Ｔ７、ラムダ）、またはＲＮＡファージ（例えば、ＭＳ２）などの任意の適切なバクテリオファージ上で表示することができる。
【０１０３】
一般的に、ペプチドまたはファージポリペプチドのレパートリーを表示するファージのライブラリーが、適切なファージコートタンパク質との融合タンパク質（例えば、ｆｄ ｐＩＩＩタンパク質）として、産生または提供される。融合タンパク質は、ファージコートタンパク質の先端で、または所望により内部の位置で、ペプチドまたはポリペプチドを表示する。例えば、表示されたペプチドまたはポリペプチドを、ｐＩＩＩのドメイン１に対してアミノ末端である位置で表示することができる。（ｐＩＩＩのドメイン１はＮ１とも称する。）表示されたポリペプチドを、ｐＩＩＩ（例えば、ｐＩＩＩのドメイン１のＮ−末端）に直接融合することができるか、またはリンカーを用いてｐＩＩＩに融合させることができる。所望により、融合物はタグ（例えば、ｍｙｃエピトープ、Ｈｉｓタグ）をさらに含み得る。ファージコートタンパク質との融合タンパク質として表示されたペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むライブラリーを、ファージベクターのライブラリーまたは表示されたペプチドまたはポリペプチドをコードするファージミドベクターを適切な宿主細菌中に導入し、結果として得られた細菌を培養して、ファージを産生することによるなど、任意の適切な方法を用いて産生することができる（例えば、適切なヘルパーファージを使用するか、または所望によりプラスミドを補足する）。適切には、本発明の一実施形態では、細菌におけるプロテアーゼ発現に適した条件を選択する。ファージのライブラリーを、沈降および遠心分離などの任意の適切な方法を用いて培養物から回収することができる。
【０１０４】
表示系は、任意の所望の量の多様性を含むペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含み得る。例えば、このレパートリーは、生物体、生物体群、所望の組織もしくは所望の細胞型によって発現される天然に存在するポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含み得るか、またはランダム若しくはランダム化アミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含み得る。所望により、ポリペプチドは共通のコアまたは足場を共有し得る。例えば、レパートリーまたはライブラリー中の全てのポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ、フィブロネクチンドメイン、アンチカリン、ＣＴＬＡ４、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ、セルラーゼ）、または免疫グロブリンスーパーファミリー由来のポリペプチド、例えば抗体または抗体断片（例えば、抗体可変ドメイン）から選択される足場を基礎とすることができる。このようなレパートリーまたはライブラリーにおけるポリペプチドは、ランダムまたはランダム化アミノ酸配列の所定の領域および共通のアミノ酸配列の領域を含み得る。ある実施形態では、レパートリー中の全てのまたは実質的に全てのポリペプチドは、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ）または抗体の所望の抗原結合断片（例えば、ヒトＶ_ＨまたはヒトＶ_Ｌ）などの所望のタイプのものである。好ましい実施形態では、ポリペプチド表示系は、各ポリペプチドが抗体可変ドメインを含む、ポリペプチドのレパートリーを含む。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドは、Ｖ_Ｈ、Ｖ_ＬまたはＦｖ（例えば、一本鎖Ｆｖ）を含み得る。本明細書中に記載されるように、レパートリーは、ＧＬＰ−１またはその誘導体、例えばジペプチジルペプチダーゼＩＶ耐性誘導体などの親分子を基礎とするポリペプチドのライブラリーであり得る。
【０１０５】
アミノ酸配列多様性を、任意の適切な方法を用いて、ペプチドまたはポリペプチドまたは足場の任意の所望の領域中に導入することができる。例えば、アミノ酸配列多様性は、任意の適切な突然変異誘発法（例えば、低忠実性ＰＣＲ（ｌｏｗ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ）、オリゴヌクレオチド媒介性または部位特異的突然変異誘発、ＮＮＫコドンを使用した多様化）または任意の他の適切な方法を用いて、多様化ポリペプチドをコードする核酸のライブラリーを調製することにより、抗体可変ドメインまたは疎水性ドメインの相補性決定領域などの標的領域中に導入することができる。所望により、多様化されるポリペプチドの領域をランダム化することができる。
【０１０６】
レパートリーを構成するポリペプチドのサイズは、概して自由に選択でき、均一なポリペプチドサイズは必要ではない。好ましくは、レパートリー中ポリペプチドは、少なくとも三次構造を有する（少なくとも１つのドメインを形成する）。
【０１０７】
選択／単離／回収
プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドの集団）は、任意の適切な方法を用いて、レパートリーまたはライブラリー（例えば、表示系において）から選択され、単離され、および／または回収され得る。好ましくは、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、選択可能な特徴（例えば、物理的特徴、化学的特徴、機能的特徴）に基づいて、選択されるかまたは単離される。適切な選択可能な機能的特徴としては、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドの生物学的活性、例えば一般的リガンド（例えば、超抗原）との結合、標的リガンド（例えば、抗原、エピトープ、基質）との結合、抗体との結合（例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現されるエピトープを介して）、および触媒活性が挙げられる（例えば、Tomlinson et al.、ＷＯ９９／２０７４９；ＷＯ０１／５７０６５；ＷＯ９９／５８６５５参照）。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に全てのプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが共通の選択可能な特徴を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーから、選択され、および／または単離される。例えば、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に全てのプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが、共通の一般的リガンドを結合し、共通の標的リガンドを結合し、共通の標的抗体を結合し（またはそれにより結合され）、あるいは共通の触媒活性を保有するライブラリーまたはレパートリーから選択され得る。この型の選択は、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性成熟を実施する場合、所望の生物学的活性を有する親ペプチドまたはポリペプチドに基づいているプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを調製するために特に有用である。
【０１０９】
共通の一般的リガンドとの結合に基づいた選択は、元のライブラリーまたはレパートリーの構成成分であったプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのうちの全てまたは実質的に全てを含有するペプチドまたはポリペプチドのコレクションまたは集団を生じ得る。例えば、標的リガンドまたは一般的リガンド、例えばプロテインＡ、プロテインＬまたは抗体を結合するペプチドまたはポリペプチドは、適切な親和性マトリックスをパニングするかまたは用いることにより、選択され、単離され、および／または回収され得る。パニングは、適切な容器（例えば、試験管、ペトリ皿）にリガンド（例えば、一般的リガンド、標的リガンド）の溶液を付加し、そして容器の壁上にリガンドが沈着しまたは被覆するようにさせることにより成し遂げられ得る。過剰量のリガンドは洗い落とされ、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとともにインキュベートされたレパートリー）が容器に付加されて、固定化リガンドを結合するためにペプチドまたはポリペプチドに適した条件下で容器が保持される。任意の適切な方法、例えば削り落とすか、またはｐＨを下げることにより、非結合ペプチドまたはポリペプチドは洗い落とされて、結合ペプチドまたはポリペプチドが回収され得る。
【０１１０】
適切なリガンド親和性マトリックスは、一般的に、リガンドが共有的にまたは非共有的に結合される固体支持体またはビーズ（例えば、アガロース）を含有する。親和性マトリックスは、マトリックス上のリガンドとのペプチドまたはポリペプチドの結合に適した条件下で、バッチ法、カラム法または任意の他の適切な方法を用いて、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとともにインキュベートされたレパートリー）と組合され得る。親和性マトリックスを結合しないペプチドまたはポリペプチドは洗い落とされて、結合ペプチドまたはポリペプチドが、任意の適切な方法を用いて、例えば、低ｐＨ緩衝液を用いた、低刺激性変性剤（例えば、尿素）を用いた、あるいはリガンドとの結合に関して競合するペプチドを用いた溶離により、溶離され、回収され得る。一例では、ビオチニル化標的リガンドが、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドに適した条件下でレパートリーと組合されて、標的リガンドを結合する。結合ペプチドまたはポリペプチドは、固定化アビジンまたはストレプトアビジン（例えば、ビーズ上）を用いて回収される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、一般的または標的リガンド、抗体またはその抗原結合断片である。ライブラリーまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチド中に実質的に保存されるペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴を結合する抗体または抗原結合断片は、一般的リガンドとして特に有用である。プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを単離し、選択し、および／または回収するためのリガンドとして用いるのに適した抗体および抗原結合断片は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得るし、任意の適切な方法を用いて調製され得る。
【０１１２】
ライブラリー／レパートリー
他の態様では、本発明は、プロテアーゼ耐性ペプチドおよびポリペプチドのレパートリー、プロテアーゼ耐性ペプチドおよびポリペプチドをコードするライブラリー、ならびにこのようなライブラリーおよびレパートリーの製造方法に関する。
【０１１３】
プロテアーゼ耐性ペプチドおよびポリペプチドをコードする、および／または含むライブラリーは、任意の適切な方法を用いて調製することができるか、または得ることができる。本発明のライブラリーは、目的のペプチドまたはポリペプチド（例えば、ライブラリーから選択されたペプチドもしくはポリペプチド）に基づいてプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドをコードするように設計することができるか、または本明細書中に記載される方法を用いて別のライブラリーから選択することができる。例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドで富化されたライブラリーは、適切なポリペプチド表示系を用いて調製することができる。
【０１１４】
一例では、免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｖｋ、Ｖλ）を含む表示されたポリペプチドのレパートリーを含むファージ表示ライブラリーを、本明細書中に記載されるように、プロテアーゼの活性に適した条件下でプロテアーゼと組み合わせる。プロテアーゼ耐性ポリペプチドを、結合活性（例えば、結合一般的リガンド、結合標的リガンド）などの所望の生物学的活性に基づいて回収し、これによりプロテアーゼ耐性ポリペプチドで富化されたファージ表示ライブラリーを生じる。
【０１１５】
別の例では、免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｖκ、Ｖλ）を含む表示されたポリペプチドのレパートリーを含むファージ表示ライブラリーを、まず、所望の標的抗原に対する結合特異性を有するレパートリーの成員を同定するためにスクリーニングする。所望の結合特異性を有するポリペプチドのコレクションを回収し、このコレクションを、本明細書中に記載されるように、タンパク質分解活性に適した条件下でプロテアーゼと組み合わせる。所望の標的結合特異性を有するプロテアーゼ耐性ポリペプチドのコレクションを回収し、プロテアーゼ耐性および高親和性ポリペプチドで富化されたライブラリーを生じる。本明細書中に記載されるように、この選択方法におけるプロテアーゼ耐性は、高親和性結合と相関する。
【０１１６】
所望の型のポリペプチドのレパートリーをコードするライブラリーは、任意の適切な方法を用いて容易に産生することができる。例えば、所望の型のポリペプチド（例えば、ポリメラーゼ、免疫グロブリン可変ドメイン）をコードする核酸配列を得ることができ、それぞれが１つ以上の突然変異を含む核酸のコレクションを、例えばエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系を用いて核酸を増幅することによるか、化学的突然変異誘発（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９：９５３３（１９９４））によるか、または細菌突然変異誘発（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６０：３５９（１９９６））を用いることにより、調製することができる。
【０１１７】
他の実施形態では、核酸の特定領域を多様化のために標的とすることができる。選択された位置を突然変異させるための方法も当該技術分野で周知であり、例えば、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドの使用（ＰＣＲの使用の有無は問わない）が挙げられる。例えば、合成抗体ライブラリーは、抗原結合ループに対する突然変異を標的とすることにより作製されてきた。ランダムまたは半ランダム抗体Ｈ３およびＬ３領域を生殖細胞系免疫グロブリンＶ遺伝子断片に付加して、非突然変異化フレームワーク領域を有する大きなライブラリーが産生されてきた（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）前掲；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）前掲；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）前掲；ＤｅＫｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．（１９９５）前掲）。このような多様化は、抗原結合ループの一部または全部を含むまでに拡張されている（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， ２：１００；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３：４７５；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ， ＷＯ ９７／０８３２０、前掲）。他の実施形態では、核酸の特定領域は、例えば、第１ＰＣＲの産物を「メガプライマー」として用いる二段階ＰＣＲ法によって、多様化に関して標的とされ得る。（例えば、Ｌａｎｄｔ， Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ９６：１２５−１２８（１９９０）。）標的とされた多様化は、例えば、ＳＯＥ ＰＣＲによっても成し遂げることができる（例えば、Ｈｏｒｔｏｎ， Ｒ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８（１９８９）を参照。）
【０１１８】
選択された位置での配列多様性は、多数の可能なアミノ酸（例えば、２０個全てまたはそのサブセット）をその位置に組み入れることができるようにポリペプチドの配列を特定するコーディング配列を改変することによって達成できる。ＩＵＰＡＣ命名法を用いて、最も多目的なコドンはＮＮＫであり、これは全てのアミノ酸ならびにタグ終止コドンをコードする。ＮＮＫコドンは、好ましくは、必要とされる多様性を導入するために使用される。同じ目的を達成する他のコドン、例えばさらなる終止コドンであるＴＧＡおよびＴＡＡの産生をもたらすＮＮＮコドンも使用される。このような標的化法により、標的部位における全配列スペースを調査することが可能になる。
【０１１９】
好ましいライブラリーは、免疫グロブリンスーパーファミリーの成員（例えば、抗体またはその一部）であるプロテアーゼ耐性ポリペプチドを含む。例えば、ライブラリーは、既知の主鎖形状を有するプロテアーゼ耐性抗体ポリペプチドを含み得る。（例えば、Tomlinson et al.、ＷＯ ９９／２０７４９を参照。）ライブラリーは、適切なプラスミドまたはベクターにおいて調製することができる。本明細書中で用いる場合、ベクターは、その発現および／または複製のため細胞中に異種ＤＮＡを導入するために用いられる別個の要素を指す。プラスミド（例えば、細菌プラスミド）、ウイルスまたはバクテリオファージベクター、人工染色体およびエピソームベクターをはじめとする任意の適切なベクターを用いることができる。このようなベクターは、簡単なクローニングおよび突然変異誘発に使用してもよいし、または発現ベクターを用いてライブラリーを発現させることもできる。ベクターおよびプラスミドは、通常、１つ以上のクローニング部位（例えば、ポリリンカー）、複製起点および少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を含む。発現ベクターは、例えばエンハンサー要素、プロモーター、転写終結シグナル、シグナル配列などのポリペプチドの転写および翻訳を行う要素をさらに含み得る。これらの要素は、ポリペプチドをコードするクローンされた挿入物に機能的に連結されるような方法で配置して、このような発現ベクターが発現に適した条件下（例えば、適切な宿主細胞中）で保持される場合にポリペプチドが発現され、産生されるようにすることができる。
【０１２０】
クローニングおよび発現ベクターは、一般的に、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞を複製することを可能にする核酸配列を含む。クローニングベクターにおいて典型的には、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは関係なく複製することを可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はほとんどのグラム陰性菌に適し、２ミクロンプラスミド起源は酵母に適し、様々なウイルス起源（例えばＳＶ４０、アデノウイルス）はほ乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点は、ＣＯＳ細胞などの高レベルのＤＮＡを複製できるほ乳類細胞においてこれらが使用されない限り、ほ乳類発現ベクターに必要でない。
【０１２１】
クローニングまたは発現ベクターは、選択可能なマーカーとも称する選択遺伝子を含み得る。このようなマーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、したがって、この培地中では生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、または栄養要求性欠損（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）を補完するか、または増殖培地において利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１２２】
適切な発現ベクターは、多数の構成成分、例えば、複製起点、選択可能なマーカー遺伝子、１つ以上の発現制御要素、例えば転写制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）および／または１つ以上の翻訳シグナル、シグナル配列またはリーダー配列などを含み得る。発現制御要素およびシグナルまたはリーダー配列は、もし存在するならば、ベクターまたは他の供給源によって提供され得る。例えば、抗体鎖をコードするクローンされた核酸の転写および／または翻訳制御配列を使用して、発現を行うことができる。
【０１２３】
プロモーターは、所望の宿主細胞における発現のために提供され得る。プロモーターは構成的または誘発的であり得る。例えば、プロモーターは、抗体、抗体鎖またはその一部をコードする核酸と機能的に連結させて、核酸の転写を行わせることができる。原核生物（例えば、大腸菌のβ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物（例えば、シミアン・ウイルス４０早期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ＥＧ−１ａプロモーター）宿主に関して種々の適切なプロモーターが利用可能である。
【０１２４】
加えて、発現ベクターは、典型的にはベクターを保有する宿主細胞の選択のための選択可能なマーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合は、複製起点を含む。抗生物質または薬剤耐性を付与する産物をコードする遺伝子は、一般的な選択可能なマーカーであり、原核生物（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性についてのＴｅｔ遺伝子）および真核生物細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネティシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）において使用することができる。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、種々の宿主においてメトトレキサートでの選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、多くの場合、酵母において選択可能なマーカーとして用いられる。ウイルス（例えば、バクロウイルス）またはファージベクター、ならびに宿主細胞のゲノム中に組み入れることができるベクター、例えばレトロウイルスベクターの使用も想定される。
【０１２５】
原核生物（例えば、大腸菌などの細菌細胞）またはほ乳類細胞に適した発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴベクター（例えば、ｐＥＴ−１２ａ、ｐＥＴ−３６、ｐＥＴ−３７、ｐＥＴ−３９、ｐＥＴ−４０、Ｎｏｖａｇｅｎなど）、ファージベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ ５ Ｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲＩＴ２Ｔ（プロテインＡ融合物ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＥＦ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド））、ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラ・ホーヤ））、ｐＣＤＥＦ３（Goldman, L.A., et al., Biotechniques, 21:1013-1015(1996)）、ｐＳＶＳＰＯＲＴ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）、ｐＥＦ−Ｂｏｓ（Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322(1990)）などが挙げられる。原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞ｓ（ショウジョウバエＳｃｈｎｉｅｄｅｒ Ｓ２細胞、Ｓｆ９）、酵母（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびほ乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）などの様々な発現宿主における使用に適した発現ベクターが利用可能である。
【０１２６】
好ましいベクターは、ポリペプチドライブラリー成員に対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、一般的および／または標的リガンドを用いた選択は、ポリペプチドライブラリー成員を発現する１つのクローンの別個の増殖および発現により実施することができる。前述のように、好ましい選択表示系はバクテリオファージ表示である。したがって、ファージまたはファージミドベクターを使用してもよい。好ましいベクターは、複製の大腸菌起源（二本鎖複製に関して）および複製のファージ起源（一本鎖ＤＮＡの産生に関して）を有するファージミドベクターである。このようなベクターの操作および発現は当該技術分野で周知である（Hoogenboom and Winter（１９９２）前掲；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）前掲）。手短に説明すると、ベクターは、ファージミドおよび、適切なリーダー配列、複数のクローニング部位、１つ以上のペプチドタグ、１つ以上のタグ終止コドンおよびファージタンパク質ｐＩＩＩを含み得る発現カセットの上流のｌａｃプロモーターに選択性を付与するためのβ−ラクタマーゼ遺伝子を含み得る。したがって、大腸菌の様々なサプレッサーおよび非サプレッサー株を用い、グルコース、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）またはヘルパーファージ、例えばＶＣＳ Ｍ１３を添加して、ベクターは発現のないプラスミドとして複製することができるか、大量のポリペプチドライブラリー成員のみを産生することができるか、またはファージを産生することができ、このファージの一部はそれらの表面上に少なくとも１コピーのポリペプチド−ｐＩＩＩ融合物を含む。
【０１２７】
本発明のライブラリーおよびレパートリーは、抗体フォーマットを含むことができる。例えば、ライブラリーおよびレパートリー中に含まれるポリペプチドは、全抗体またはその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片、別個のＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインであり得、これらはいずれも修飾されているかまたは修飾されていないかのいずれかである。ｓｃＦｖ断片、ならびに他の抗体ポリペプチドは、任意の適切な方法を用いて容易に産生することができる。多数の適切な抗体操作法は、当該技術分野で周知である。例えば、ｓｃＦｖは、２つの可変ドメインをコードする核酸を、適切なリンカーペプチド、例えば（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_３または他の適切なリンカーペプチドをコードする適切なオリゴヌクレオチドと連結することによって形成することができる。リンカーは、第１Ｖ領域のＣ−末端と第２Ｖ領域のＮ−末端とを架橋する。Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片などの他の抗体フォーマットの構築のための類似した技術を使用することができる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片をフォーマット化するために、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌポリペプチドを定常領域セグメントを組み合わせることができ、これらは再配列された遺伝子、生殖細胞系Ｃ遺伝子から単離することができるか、または抗体配列データから合成することができる。本発明のライブラリーまたはレパートリーは、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌライブラリーまたはレパートリーである得る。
【０１２８】
プロテアーゼ耐性可変ドメインを含むポリペプチドは、好ましくは標的リガンド結合部位および／または一般的リガンド結合部位を含む。ある実施形態では、一般的リガンド結合部位は、プロテインＡ、プロテインＬまたはプロテインＧなどの超抗原の結合部位である。可変ドメインは、任意の所望の可変ドメイン、例えばヒトＶＨ（例えば、Ｖ_Ｈ１ａ，Ｖ_Ｈ１ｂ，Ｖ_Ｈ２，Ｖ_Ｈ３，Ｖ_Ｈ４，Ｖ_Ｈ５，Ｖ_Ｈ６）、ヒトＶλ（例えば、ＶλＩ、ＶλＩＩ、ＶλＩＩＩ、ＶλＩＶ、ＶλＶ、ＶλＶＩもしくはＶκ１）またはヒトＶκ（例えば、Ｖκ２、Ｖκ３、Ｖκ４、Ｖκ５、Ｖκ６、Ｖκ７、Ｖκ８、Ｖκ９もしくはＶκ１０）を基礎とするものであり得る。
【０１２９】
核酸、宿主細胞およびプロテアーゼ耐性ポリペプチドの産生方法
本発明は、例えば、本明細書中に記載される方法によって選択可能であるかまたは選択される、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドをコードする単離および／または組換え核酸に関する。
【０１３０】
本明細書中で「単離された」として言及される核酸は、その元の環境（例えば、細胞中またはライブラリーなどの核酸の混合物中）における他の物質（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡなどの他の核酸）から分離された核酸である。単離された核酸は、ベクター（例えば、プラスミド）の一部として単離することができる。
【０１３１】
本明細書中で「組換え」として言及される核酸は、例えば、制限酵素、相同的組換え、ウイルスなどを用いてベクターまたは染色体中へのクローニングなどの遺伝子組換えに依存した方法をはじめとする組換えＤＮＡ法により産生された核酸、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて調製された核酸である。
【０１３２】
本発明はまた、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド、例えば本明細書中に記載される方法によって選択可能であるかまたは選択されるペプチドまたはポリペプチド、をコードする核酸を含む（１つ以上の）組換え核酸または発現構築物を含む組換え宿主細胞に関する。本発明はまた、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドの調製法であって、本発明の組換え宿主細胞をプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドの発現に適した条件下で維持することを含む方法も包含する。この方法は、所望により、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを単離するかまたは回収する工程をさらに含み得る。
【０１３３】
例えば、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子（すなわち、１つ以上の核酸分子）、またはこのような核酸分子を含む発現構築物（すなわち、１つ以上の構築物）を、適切な宿主細胞中に導入して、選択された宿主細胞に適切な任意の方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を用いて組換え宿主細胞を作製し、核酸分子を１つ以上の発現制御要素（例えば、宿主細胞ゲノム中に組み入れられた、ベクター中、細胞におけるプロセスによって作製された構築物中）と機能的に連結させる。結果として得られた組換え宿主細胞を発現に適した条件下（例えば、インデューサーの存在下、適切な動物中、適切な塩、成長因子、抗生物質、栄養補給剤などを添加した適切な培地中）で保持することができ、これによりコードされたペプチドまたはポリペプチドが産生される。所望により、コードされたペプチドまたはポリペプチドを、（例えば、動物、宿主細胞、培地、乳から）単離するかまたは回収することができる。このプロセスは、トランスジェニック動物の宿主細胞における発現を包含する（例えば、ＷＯ ９２／０３９１８、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌを参照）。
【０１３４】
本明細書中に記載される方法により選択されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドは、適切なin vitro発現系において、化学的合成、または任意の他の適切な方法によっても産生され得る。
【０１３５】
ポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニスト、およびアンタゴニスト
本明細書中で記載され、例示されるように、本発明のプロテアーゼ耐性ポリペプチド、ペプチドまたはｄＡｂは、一般的に、それらの標的リガンドを高い親和性で結合する。したがって、別の態様では、標的抗原を高い親和性で結合する本発明のポリペプチドまたはｄＡｂを選択し、単離し、および／または回収するための方法が提供される。一般的に、この方法は、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリー（例えばｄＡｂ）を提供すること、ライブラリーまたはレパートリーをプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、喀痰）とプロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせること、ならびにリガンド（例えば、標的リガンド）を結合するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離し、および／または回収することを含む。ライブラリーまたはレパートリーは、プロテアーゼ感受性ペプチドまたはポリペプチドが消化される条件下でプロテアーゼにさらされているので、プロテアーゼの活性は、低い結合親和性を有するあまり安定でないポリペプチドを除去し得、これにより高親和性結合ペプチドまたはポリペプチドのコレクションが産生される。例えば、本発明のポリペプチドまたはｄＡｂは、標的抗原を１μＭ以上、または約５００ｎＭ〜約０．５ｐＭの親和性（ＫＤ；表面プラズモン共鳴により確定した場合、ＫＤ＝Ｋ_ｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋ_ｏｎ（ｋａ））で結合することができる。例えば、本発明のポリペプチドまたはｄＡｂは、標的抗原（例えば、ＴＮＦＲ１）を約５００ｎＭ、約１００ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約１０ｐＭ、約１ｐＭまたは約０．５ｐＭの親和性で結合することができる。任意の特定の理論に縛られることなく考えると、プロテアーゼに対して耐性であるペプチドおよびポリペプチドは、より低いエントロピーおよび／またはより高い安定化エネルギーを有すると考えられる。したがって、プロテアーゼ耐性と高親和性結合との間の相関は、本明細書中に記載される方法により選択されるペプチドおよびポリペプチドおよびｄＡｂの表面の緊密性および安定性と関連づけられ得る。
【０１３６】
ポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストまたはアンタゴニストは、大腸菌で、またはピキア種（例えば、メタノール資化酵母）で発現され得る。一実施形態では、リガンドまたはｄＡｂ単量体は、大腸菌で、またはピキア種（例えば、メタノール資化酵母）で発現される場合、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌの量で分泌される。本明細書中に記載されるリガンドおよびｄＡｂ単量体は、大腸菌で、またはピキア種（例えば、メタノール資化酵母）で発現される場合に分泌可能であり得るが、しかし、それらは、大腸菌またはピキア種を用いない任意の適切な方法、例えば合成化学的方法または生物学的産生方法を用いて産生され得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストまたはアンタゴニストは、ラクダ類免疫グロブリン可変ドメイン、あるいは、例えば位置１０８、３７、４４、４５および／または４７で、ラクダ類生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリン可変ドメインに独特である１つ以上のフレームワークアミノ酸を含まない。
【０１３８】
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストは、一価または多価であり得る。いくつかの実施形態では、アゴニストまたはアンタゴニストは一価であり、本発明のポリペプチドまたはｄＡｂにより提供される結合部位である、標的抗原と相互作用する１つの結合部位を含有する。一価アゴニストまたはアンタゴニストは１つの標的抗原を結合し、受容体の活性化およびシグナル変換を起こし得る細胞の表面上の標的抗原（例えば、受容体抗原）の架橋またはクラスター化を誘導し得ない。
【０１３９】
他の実施形態では、本発明のアゴニストまたはアンタゴニストは多価である。多価アゴニストまたはアンタゴニストは、標的抗原に関する特定結合部位の２つ以上のコピーを含有するか、または標的抗原を結合する２つ以上の異なる結合部位を含有し得る（結合部位の少なくとも１つは本発明のポリペプチドまたはｄＡｂにより提供される）。例えば、本明細書中に記載されるように、アゴニストまたはアンタゴニストは、標的抗原を結合する本発明の特定のポリペプチドまたはｄＡｂの２つ以上のコピー、あるいは標的抗原を結合する本発明の２つ以上の異なるポリペプチドまたはｄＡｂを含む二量体、三量体または多量体であり得る。一実施形態では、多価アンタゴニストは細胞表面受容体抗原を結合し、標準的細胞アッセイにおいて抗原を実質的に刺激（抗原のアゴニストとして作用）しない。
【０１４０】
ある実施形態では、多価アゴニストまたはアンタゴニストは、標的抗原の所望のエピトープまたはドメインに対する２つ以上の結合部位を含む。
【０１４１】
他の実施形態では、ポリペプチドは、ＧＬＰ−１由来のペプチドなどのインスリン分泌促進剤であってよい。インスリン分泌促進剤の有効性、ＤＰＰ−ＩＶなどのプロテーゼに対する耐性、投与後の半減期およびin vivo効果を確定するために適した方法は、例えばＷＯ ２００６／０５９１０６に記載されている。
【０１４２】
他の実施形態では、多価アゴニストまたはアンタゴニストは、標的抗原の異なるエピトープと結合する本発明のポリペプチドまたはｄＡｂによって提供される２つ以上の結合部位を含む。
【０１４３】
ある実施形態では、本発明のポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストまたはアンタゴニストは、有効量が投与される場合、慢性炎症性疾患のモデルにおいて有効である。一般的に、有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇ）である。慢性炎症性疾患のモデル（ＷＯ２００６０３８０２７に記載されているものを参照）は、ヒトにおいて治療上有効であると予想されることが当業者により認められている。
【０１４４】
一般的に、本発明のリガンド（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）は、薬理学的に適切な担体と一緒に、精製形態で利用される。典型的には、これらの担体としては、水性またはアルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液、生理食塩水および／または緩衝媒質を含む何れかが挙げられ得る。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースならびに塩化ナトリウムおよび乳酸加リンガー液が挙げられる。適切な生理学的に許容可能なアジュバントは、懸濁液中にポリペプチド複合体を保持する必要がある場合、濃化剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩から選択され得る。
【０１４５】
静脈内ビヒクルには、流体および栄養素補給剤および電解質補給剤、例えばリンガーのデキストロースに基づくものが含まれる。防腐剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、酸化予防剤、キレート化剤および不活性ガスも存在し得る（Mack (1982）Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^th Edition）。種々の適切な処方物、例えば徐放性処方物が用いられ得る。
【０１４６】
本発明のリガンド（例えばアンタゴニスト）は、別々に投与される組成物として、または他の作用物質とともに用いられ得る。これらの例としては、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチナム、および抗毒素などの様々な免疫療法薬が挙げられる。製剤組成物は、本発明のリガンドとともに種々の細胞毒性薬または他の作用物質の、例えば（それらが投与前にプールされていてもいなくても）異なる標的抗原またはエピトープを用いて選択されるリガンドの組合せの「カクテル」を包含し得る。
【０１４７】
本発明の製剤組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののいずれかであってよい。免疫療法を包含するが、これに限定されない療法に関して、本発明のその選択されたリガンドは、標準的技術にしたがって任意の患者に投与することができる。
【０１４８】
投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺経路を介して、または適切には、カテーテルを用いた直接注入によるなど、任意の適切な様式によって行うことができる。投与量および頻度は、患者の年齢、性別および症状、他の薬剤の同時投与、禁忌、ならびに臨床医が考慮すべきその他のパラメーターに左右される。投与は、局所（例えば、肺投与による肺への局所送達、例えば鼻内投与）または適応があれば全身性であり得る。
【０１４９】
本発明のリガンドは、貯蔵のために凍結乾燥され、そして使用前に適切な担体中で再構成され得る。この技法は、慣用的免疫グロブリンを用いて有効であることが示されており、当該技術分野で既知の凍結乾燥および再構成技法が用いられ得る。凍結乾燥および再構成が種々の程度の抗体活性損失（例えば、慣用的免疫グロブリンに関しては、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より大きい活性損失を有する傾向がある）を引き起こし得る、そして使用レベルが上向きに調整されて補償しなければならないこともある、と当業者は理解するであろう。
【０１５０】
本発明のリガンド（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）またはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。ある治療的適用では、選択細胞の集団の、少なくとも部分的な抑制、抑圧、調整、死滅、あるいはいくつかの他の測定可能なパラメーターを成し遂げるための適切な量は、「治療的有効用量」と定義され得る。この投与量を達成するために必要とされる量は、患者自身の免疫系の疾患および全身状態の重症度に左右されるが、一般的に、体重１キログラムあたり０．００５〜５．０ｍｇのリガンド、例えばｄＡｂ、アゴニストまたはアンタゴニストの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に用いられる。予防的適用では、本発明のリガンドまたはそれらのカクテルを含有する組成物は、疾患の開始を予防、阻害または遅らせるために（例えば、緩和もしくは休止を維持するために、または急性期を予防するために）同様の投与量または若干少ない投与量で投与することもできる。疾患を治療し、抑圧し、または予防するための適切な用量投与間隔を、熟練臨床医は確定し得る。本明細書中に記載される組成物を用いて実施される治療または療法は、治療前に存在するこのような症候に比して、あるいはこのような組成物で治療されない個体（ヒトまたはモデル動物）または他の適切な対照におけるこのような症候に比して、１つ以上の症候が（例えば、臨床的査定尺度で少なくとも１０％または少なくとも１ポイント）低減される場合、「有効」とみなされる。症候は、標的にされる疾患または障害によって明白に変わるが、しかし通常の熟練臨床医または技術者により測定され得る。このような症候は、例えば、疾患または障害の１つ以上の生化学的指標のレベル（例えば、疾患、罹患細胞数等と相関する酵素または代謝産物のレベル）をモニタリングすることにより、身体的症状発現（例えば、炎症、腫瘍サイズ等）をモニタリングすることにより、または容認された臨床的査定尺度、例えば、（多発性硬化症に関する）総合障害度スケール（Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｔｕｓ Ｓｃａｌｅ）により、アーヴィン炎症性腸疾患質問票（３２ポイント査定により、腸機能、全身性症候、社会的機能および情動状態に関して生活の質を評価する−スコアは３２〜２２４の範囲であり、スコアが高いほど生活の質が良好であることを示す）、関節リウマチのＱＯＬスケール、または当該技術分野で公知の他の容認された臨床的査定尺度により測定され得る。所定の臨床的尺度で少なくとも１０％または１ポイント以上の疾患または障害症候における持続的（例えば、１日以上、またはそれ以上）軽減は、治療が「有効」であることを示す。同様に、本明細書中に記載されるような組成物を用いて実施される予防は、当該組成物で治療されない類似の個体（ヒトまたは動物モデル）におけるこのような症候に比して、１つ以上の症候の開始または重症度が遅延され、低減され、または無効にされる場合、「有効」である。
【０１５１】
本発明のリガンド（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）またはそのカクテルを含む組成物を、ほ乳類における最適の標的細胞集団の改変、不活性化、死滅または除去を助ける予防的および治療的設定で利用することができる。加えて、本明細書中に記載されるポリペプチドの選択されたレパートリーを、体外でまたはin vitroで使用して、細胞の異種コレクションから標的細胞集団を選択的に死滅させるか、激減させるか、またはその他の方法で有効に除去することができる。ほ乳類から得られる血液を体外でリガンドと組み合わせることができ、それにより、標準的技法にしたがって哺乳動物に戻すために、望ましくない細胞を殺すかまたはその他の方法で血液から除去する。
【０１５２】
本発明のリガンド（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）を含む組成物を、ほ乳類における最適の標的細胞集団の改変、不活性化、死滅または除去のための予防的および治療的設定で利用することができる。
【０１５３】
リガンド（例えば、抗標的抗原アンタゴニスト、アゴニスト、ｄＡｂ単量体）を、１つ以上のさらなる治療薬または活性剤とともに投与することができるか、または処方することができる。リガンド（例えば、ｄＡｂ）をさらなる治療薬とともに投与する場合、このリガンドは、さらなる薬剤の投与前、同時または投与後に投与することができる。一般的に、リガンドおよびさらなる薬剤は、治療的効果の重複を提供するような方法で投与される。
【０１５４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のＧＬＰ−１薬剤またはＧＬＰ−１類似体もしくは誘導体を含む製剤組成物を、このような治療を必要とする患者に対して非経口投与することができる。非経口投与は、注射器、場合によってペン型注射器を用いて、皮下、筋肉内または静脈内注射により実施することができる。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて実施することができる。さらなるオプションは、鼻または肺スプレーの形態でＧＬＰ−１薬剤またはＧＬＰ−１類似体もしくは誘導体を投与するための粉末または液体であり得る組成物である。さらなるオプションとして、本発明のＧＬＰ−１薬剤またはＧＬＰ−１類似体もしくは誘導体は、経皮（例えば、貼付剤、場合によってイオン導入貼付剤から）、または経粘膜（例えば口腔）投与することもできる。他の実施形態では、組成物は、例えば丸薬、カプセル、ドリンク（例えば、肥満治療用の減量ドリンクとして販売されているもの）として経口投与される。
【０１５５】
ＧＬＰ−１化合物の非経口投与用組成物は、例えば、ＷＯ ０３／００２１３６（参照することにより本明細書で援用される）に記載されるように調製することができる。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明は、高血糖症、１型糖尿病、２型糖尿病またはβ−細胞欠乏の治療用薬剤を調製するための本発明の化合物の使用に関する。これらの適応の具体的な実施形態では、薬剤は、インスリン分泌促進剤、およびインクレチン、グルカゴン様１ペプチド、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、ＰＹＹ、ＰＹＹペプチド、ＰＹＹ類似体、ＰＹＹ誘導体、エキセンディン−３、エキセンディン−３ペプチド、エキセンディン−３類似体、エキセンディン−３誘導体、エキセンディン−４、エキセンディン−４ペプチド、エキセンディン−４類似体、エキセンディン−４誘導体またはこれらの２つ以上の組み合わせ（例えば、ＧＬＰ−１ペプチドおよびＰＹＹペプチド）から選択される。
【０１５７】
本発明の化合物を用いた治療は、薬剤接合体または融合物の一部であっても、一部でなくてもよい、第２またはそれ以上の薬理学的に活性な物質と組み合わせることもできる。例えば、抗糖尿病薬、抗肥満薬、食欲調節剤、抗高血圧剤、糖尿病が原因であるかまたは糖尿病に関連する合併症の治療および／または予防のための薬剤ならびに肥満が原因であるかまたは肥満に関連する合併症および障害の治療および／または予防のための薬剤から選択される活性物質。本発明の文脈では、「抗糖尿病薬」という表現は、インスリン耐性ならびにインスリン耐性が病態生理学的機序である疾患の治療および／または予防用化合物を包含する。
【０１５８】
フォーマット
半減期増大は、免疫グロブリン、特に抗体、最も特定的には小サイズの抗体断片のin vivo適用に有用である。このような断片（Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）は、身体からの急速なクリアランスを蒙り得る；したがって、それらは迅速に身体のほとんどの部分に到達し得るし、産生が素早く且つ取扱いが容易である一方で、それらのin vivo適用は、in vivoでのそれらのほんの短い持続性により限定されてきた。本発明の一実施形態は、リガンドのin vivoでの半減期増大と、その結果としてのリガンドの機能的活性のより長い身体中持続時間を提供することにより、この問題を解決する。
【０１５９】
薬物動態分析およびリガンド半減期の確定のための方法は、当業者にはよく知られている。詳細は、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacistsに、ならびにPeters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)に見出され得る。“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2^nd Rev. ex edition (1982)（ｔアルファおよびｔベータ半減期ならびに曲線下面積（ＡＵＣ）のような薬物動態パラメーターを記載する）も参照され得る。
【０１６０】
半減期（ｔ1/2アルファおよびｔ1/2ベータ）およびＡＵＣは、時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から確定され得る。例えば、この曲線をモデル化するために、WinNonlin分析パッケージ（Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USAから入手可能）が用いられ得る。第一相（アルファ相）では、リガンドは主に患者における分布を受けつつあり、多少の排除を伴う。第二相（ベータ相）は、リガンドが分布されて、リガンドが患者から排泄されるので、血清濃度が減少している末期相である。ｔアルファ半減期は第一相の半減期であり、ｔベータ半減期は第二相の半減期である。したがって、一実施形態では、本発明は、１５分またはそれ以上の範囲のｔα半減期を有する本発明によるリガンドまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、その範囲の下限は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、１２時間を含めて１２時間までの範囲のｔα半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上限は、１１、１０、９、８、７、６または５時間である。適切な範囲の一例は、１〜６時間、２〜５時間または３〜４時間である。
【０１６１】
一実施形態では、本発明は、２．５時間またはそれ以上の範囲のｔβ半減期を有する本発明によるリガンド（ポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストまたはアンタゴニスト）またはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、この範囲の下限は、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、２１日を含めて２１日までの範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上限は、１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日または２０日である。一実施形態では、本発明によるリガンドまたは組成物は、１２〜６０時間の範囲のｔβ半減期を有する。さらなる一実施形態では、それは、１２〜４８時間の範囲である。さらなる一実施形態では、それは１２〜２６時間の範囲である。
【０１６２】
上記判定基準のほかに、またはそれに代替的には、本発明は、１ｍｇ・分／ｍｌまたはそれ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する本発明によるリガンドまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、この範囲の下限は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ・分／ｍｌである。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、６００ｍｇ・分／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、この範囲の上限は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ・分／ｍｌである。一実施形態では、本発明によるリガンドは、以下からなる群から選択される範囲のＡＵＣを有する：１５〜１５０ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ・分／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ・分／ｍｌおよび１５〜５０ｍｇ・分／ｍｌ。
【０１６３】
本発明のポリペプチドおよびｄＡｂならびにこれらを含むアゴニストまたはアンタゴニストは、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体またはその少なくともトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付着により、あるいは抗体ドメインとの接合により、より大きな水力学的サイズを有するようフォーマット化され得る。例えば、抗体のより大きな抗原結合断片として、または抗体としてフォーマット化された（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ’）_２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマット化された）ポリペプチドｄＡｂ、アゴニストおよびアンタゴニスト。
【０１６４】
本発明のリガンド（例えば、ｄＡｂ単量体および多量体）の水力学的サイズは、当該技術分野で周知の方法を用いて確定され得る。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、リガンドの水力学的サイズを確定し得る。リガンドの水力学的サイズを確定するための適切なゲル濾過マトリックス、例えば架橋アガロースマトリックスがよく知られており、容易に入手可能である。
【０１６５】
リガンドフォーマットのサイズ（例えば、ｄＡｂ単量体に付着されるＰＥＧ部分のサイズ）は所望の用途によって変わり得る。例えば、リガンドが循環から出て末梢組織中へ入る場合、リガンドの水力学的サイズを低く維持して、血流からの浸出を促進することが望ましい。あるいは、リガンド長時間、全身循環中に残存することが望ましい場合、リガンドのサイズは、例えばＩｇ様タンパク質としてフォーマットすることにより増大され得る。
【０１６６】
in vivoで半減期を増大する抗原またはエピトープを標的化することによる半減期延長
リガンドの水力学的サイズおよびその血清半減期は、本明細書中に記載されるように、in vivoで半減期を増大する抗原またはエピトープを結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）と本発明の標的抗原結合ポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストまたはアンタゴニストを接合するかまたは会合させることによっても増大され得る。例えば、標的抗原結合剤（例えば、ポリペプチド）は、抗血清アルブミンまたは抗新生児Ｆｃ受容体抗体または抗体断片、例えば抗ＳＡまたは抗新生児Ｆｃ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖに、あるいは抗ＳＡアフィボディまたは抗新生児Ｆｃ受容体アフィボディまたは抗ＳＡアビマー、あるいは抗ＳＡ結合ドメイン（ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥ１およびフィブロネクチン（好ましくはこれらに限定されない）からなる群から選択される足場を含む）に接合されるかまたは連結され得る（これらの結合ドメインの開示に関しては、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００４５３（２００８年２月８日出願）参照。このドメインおよびそれらの配列は、参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する）。接合することは、血清アルブミンを結合する結合ドメインと（共有的にまたは非共有的に）結合される本発明のポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストまたはアンタゴニストを含む組成物を指す
【０１６７】
in vivoでの血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、例えば、トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経薬学的因子融合タンパク質（米国特許第５，９７７，３０７号（この教示は参照により本明細書中で援用される）参照）、脳毛細管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）受容体、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子Ｘ、α１−抗トリプシンおよびＨＮＦ １αが挙げられる。血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、アルファ−１糖タンパク質（オロソムコイド；ＡＡＧ）、アルファ−１抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、アルファ−１マイクログロブリン（プロテインＨＣ；ＡＩＭ）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）、アポリポプロテインＡ−１（アポＡ−１）、アポリポプロテインＢ（アポＢ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、補体成分Ｃ３（Ｃ３）、補体成分Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ ＩＮＨ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン（ＦＥＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミオグロビン（Ｍｙｏ）、プレアルブミン（トランスチレチン；ＰＡＬ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）およびリウマチ因子（ＲＦ）も挙げられる。
【０１６８】
細胞外マトリックスからの適切なタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチンが挙げられる。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要タンパク質である。約１５の型のコラーゲン分子が一般に知られており、身体の異なる部分に見出され、例えば、Ｉ型コラーゲン（身体コラーゲンの９０％を占める）は骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内部器官に見出され、あるいはＩＩ型コラーゲンは軟骨、椎骨円板、脊索および眼の硝子体液中に見出される。
【０１６９】
血液からの適切なタンパク質としては、例えば、血漿タンパク質（例えば、フィブリン、α−２マクログロビン、血清アルブミン、フィブリノーゲン（例えば、フィブリノーゲンＡ、フィブリノーゲンＢ）、血清アミロイドプロテインＡ、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ−２−マイクログロブリン）、酵素および酵素阻害剤（例えば、プラスミノーゲン、ライソザイム、シスタチンＣ、アルファ−１−アンチトリプシンおよび膵臓トリプシン阻害剤）、免疫系のタンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリン軽鎖（カッパ／ラムダ））、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α−１マイクログロブリン）、デフェンシン（例えば、ベータ−デフェンシン１、好中球デフェンシン１、好中球デフェンシン２および好中球デフェンシン３）等が挙げられる。
【０１７０】
血液脳関門または神経組織で見出される適切なタンパク質としては、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体等が挙げられる
【０１７１】
in vivoでの血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、腎臓に限局されるタンパク質（例えば、ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン、有機陰イオン輸送体Ｋ１、ヘイマン抗原）、肝臓に限局されるタンパク質（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｇ２５０）、肺に限局されるタンパク質（例えば分泌成分。ＩｇＡを結合する）、心臓に限局されるタンパク質（例えばＨＳＰ２７。拡張心筋症と関連する）、皮膚に限局されるタンパク質（例えばケラチン）、骨特異的タンパク質、例えば形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（これは、骨形成活性を実証するタンパク質の形質転換増殖因子βスーパーファミリーのサブセットである（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８））、腫瘍特異的タンパク質（例えば、栄養芽細胞抗原、ヘルセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、カテプシンＢ。これは肝臓および脾臓中に見出され得る））も挙げられる。
【０１７２】
適切な疾患特異的タンパク質としては、例えば、活性化Ｔ細胞上でのみ発現される抗原、例えば、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ；Nature 402, 304-309 (1999)参照）、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体ファミリーの一成員。活性化Ｔ細胞上で発現され、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）産生細胞中で特異的に上方調節される；Immunol. 165(1): 263-70 (2000)参照）が挙げられる。適切な疾患特異的タンパク質としては、例えば、メタロプロテアーゼ（関節炎／癌と関連）、例えばＣＧ６５１２ショウジョウバエ、ヒト・パラプレジン、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、ネズミｆｔｓＨ；ならびに血管形成増殖因子、例えば、酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮細胞増殖因子／血管浸透性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦα）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、アンギオゲニン、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（Ｐ１ＧＦ）、ミドカイン血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）およびフラクタルカインも挙げられる。
【０１７３】
in vivoでの血清半減期を拡大する適切なポリペプチドとしては、ストレスタンパク質、例えば熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）も挙げられる。ＨＳＰは、細胞内に普通に見出される。それらが細胞外に見出される場合、それは、細胞が死んでおり、その内容物を外に出した、ということの指標である。このプログラムされない細胞死（壊死）は、外傷、疾患または損傷の結果として、細胞外ＨＳＰが免疫系からの応答を誘発した場合に起こる。細胞外ＨＳＰとの結合は、疾患部位への本発明の組成物の局在化を生じ得る。
【０１７４】
Ｆｃ輸送に関与する適切なタンパク質としては、例えば、ブラムベル受容体（ＦｃＲＢとしても知られている）が挙げられる。このＦｃ受容体は２つの機能を有し、この両方が送達のために潜在的に有用である。この機能は、（１）胎盤を横断する母親から子供へのＩｇＧの輸送、（２）ＩｇＧを分解から防護し、それによりその血清半減期を延長することである。受容体はエンドソームからＩｇＧを再循環させる、と考えられる（Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7): 632-6 (1997)参照）。
【０１７５】
血清アルブミンを結合するｄＡｂ（ＡｌｂｕｄＡｂｓ（商標））
本発明は、一実施形態において、標的抗原と結合するポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗標的抗原ｄＡｂ（第一ｄＡｂ）を含む二重特異的リガンド）、ならびに血清アルブミン（ＳＡ）を結合する第二ｄＡｂを提供し、上記の第二ｄＡｂは、表面プラズモン共鳴により確定した場合に、１ｎＭ〜１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、３００、４００または５００μＭ（すなわち、×１０^−９〜５×１０^−４）、または１００ｎＭ〜１０μＭ、または１〜５μＭ、または３〜７０ｎＭまたは１０ｎＭ〜１、２、３、４または５μＭ、例えば３０〜７０ｎＭ（表面プラズモン共鳴により確定した場合）のＫ_Ｄで、ＳＡを結合する。一実施形態では、第一ｄＡｂ（またはｄＡｂ単量体）は、表面プラズモン共鳴により確定した場合、約１、５０、７０、１００、１５０、２００、３００ｎＭ、あるいは１、２または３μＭのＫ_Ｄで、ＳＡ（例えばＨＳＡ）を結合する。一実施形態では、標的抗原に対する、第一抗ＳＡ ｄＡｂおよび第二ｄＡｂを含む二重特異性リガンドに関して、その標的に対する第二ｄＡｂの親和性（例えば、ＢｉａＣｏｒｅを用いて、表面プラズモン共鳴により測定した場合のＫ_Ｄおよび／またはＫ_off）は、ＳＡに対する第一ｄＡｂの親和性の１〜１０００００倍（例えば、１００〜１０００００、または１０００〜１０００００、または１００００〜１０００００倍）である。一実施形態では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。例えば、第一ｄＡｂは約１０μＭの親和性でその標的を結合するが、一方、第二ｄＡｂは１００ｐＭの親和性でその標的を結合する。一実施形態では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。一実施形態では、第一ｄＡｂは、約５０、例えば７０、１００、１５０または２００ｎＭのＫ_ＤでＳＡ（例えばＨＳＡ）を結合する。二重特異性リガンドの詳細は、ＷＯ０３００２６０９、ＷＯ０４００３０１９およびＷＯ０４０５８８２１に見出される。
【０１７６】
本発明のリガンドは、一実施形態では、表面プラズモン共鳴により確定した場合に、１ｎＭ〜１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、３００、４００または５００μＭ（すなわち、×１０^−９〜５×１０^−４）、または１００ｎＭ〜１０μＭ、または１〜５μＭ、または３〜７０ｎＭまたは１０ｎＭ〜１、２、３、４または５μＭ、例えば３０〜７０ｎＭ（表面プラズモン共鳴により確定した場合）のＫ_Ｄで、血清アルブミン（ＳＡ）を結合するｄＡｂを含み得る。一実施形態では、第一ｄＡｂ（またはｄＡｂ単量体）は、表面プラズモン共鳴により確定した場合、約１、５０、７０、１００、１５０、２００、３００ｎＭ、あるいは１、２または３μＭのＫ_Ｄで、ＳＡ（例えばＨＳＡ）を結合する。一実施形態では、第一および第二ｄＡｂは、リンカー、例えば１〜４アミノ酸、または１〜３アミノ酸、あるいは３より多くのアミノ酸、あるいは４より多い、５、６、７、８、９、１０、１５または２０アミノ酸を有するリンカーにより連結される。一実施形態では、より長いリンカー（３アミノ酸より長い）を用いて、効力（アゴニストまたはアンタゴニスト中のｄＡｂの一方または両方のＫ_Ｄ）を増強する。一実施形態では、リンカーは螺旋状リンカーである。
【０１７７】
リガンド、アゴニストおよびアンタゴニストの特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンを結合し、アルブミンとの結合に関して、以下の群から選択されるｄＡｂと競合する：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６（これらの配列の開示に関してはＷＯ０４００３０１９参照（配列およびそれらの核酸相手は参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する））、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（これらの配列の開示に関しては、ＷＯ２００７０８０３９２参照。これらの配列およびそれらの核酸相手は参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する。この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）、ｄＡｂ １０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０（ＤＯＭ７ｒ２０）、ｄＡｂ７ｒ２１（ＤＯＭ７ｒ２１）、ｄＡｂ７ｒ２２（ＤＯＭ７ｒ２２）、ｄＡｂ７ｒ２３（ＤＯＭ７ｒ２３）、ｄＡｂ７ｒ２４（ＤＯＭ７ｒ２４）、ｄＡｂ７ｒ２５（ＤＯＭ７ｒ２５）、ｄＡｂ７ｒ２６（ＤＯＭ７ｒ２６）、ｄＡｂ７ｒ２７（ＤＯＭ７ｒ２７）、ｄＡｂ７ｒ２８（ＤＯＭ７ｒ２８）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ３１（ＤＯＭ７ｒ３１）、ｄＡｂ７ｒ３２（ＤＯＭ７ｒ３２）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｈ２２（ＤＯＭ７ｈ２２）、ｄＡｂ７ｈ２３（ＤＯＭ７ｈ２３）、ｄＡｂ７ｈ２４（ＤＯＭ７ｈ２４）、ｄＡｂ７ｈ２５（ＤＯＭ７ｈ２５）、ｄＡｂ７ｈ２６（ＤＯＭ７ｈ２６）、ｄＡｂ７ｈ２７（ＤＯＭ７ｈ２７）、ｄＡｂ７ｈ３０（ＤＯＭ７ｈ３０）、ｄＡｂ７ｈ３１（ＤＯＭ７ｈ３１）、ｄＡｂ２（ｄＡｂｓ ４、７、４１）、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２（ｄＡｂ７ｍ１２）、ｄＡｂ１３（ｄＡｂ １５）、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６（ｄＡｂ２１、ｄＡｂ７ｍ１６）、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５（ｄＡｂ２６、ｄＡｂ７ｍ２６）、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０（ｄＡｂ３５）、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８（ｄＡｂ５４）、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６（ｄＡｂｓ ４７、５２および５６）、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１（ＤＯＭ ７ｒ１）、ｄＡｂ７ｒ３（ＤＯＭ７ｒ３）、ｄＡｂ７ｒ４（ＤＯＭ７ｒ４）、ｄＡｂ７ｒ５（ＤＯＭ７ｒ５）、ｄＡｂ７ｒ７（ＤＯＭ７ｒ７）、ｄＡｂ７ｒ８（ＤＯＭ７ｒ８）、ｄＡｂ７ｒ１３（ＤＯＭ７ｒ１３）、ｄＡｂ７ｒ１４（ＤＯＭ７ｒ１４）、ｄＡｂ７ｒ１５（ＤＯＭ７ｒ１５）、ｄＡｂ７ｒ１６（ＤＯＭ７ｒ１６）、ｄＡｂ７ｒ１７（ＤＯＭ７ｒ１７）、ｄＡｂ７ｒ１８（ＤＯＭ７ｒ１８）、ｄＡｂ７ｒ１９（ＤＯＭ７ｒ１９）、ｄＡｂ７ｈ１（ＤＯＭ７ｈ１）、ｄＡｂ７ｈ２（ＤＯＭ７ｈ２）、ｄＡｂ７ｈ６（ＤＯＭ７ｈ６）、ｄＡｂ７ｈ７（ＤＯＭ７ｈ７）、ｄＡｂ７ｈ８（ＤＯＭ７ｈ８）、ｄＡｂ７ｈ９（ＤＯＭ７ｈ９）、ｄＡｂ７ｈ１０（ＤＯＭ７ｈ１０）、ｄＡｂ７ｈ１１（ＤＯＭ７ｈ１１）、ｄＡｂ７ｈ１２（ＤＯＭ７ｈ１２）、ｄＡｂ７ｈ１３（ＤＯＭ７ｈ１３）、ｄＡｂ７ｈ１４（ＤＯＭ７ｈ１４）、ｄＡｂ７ｐ１（ＤＯＭ７ｐ１）およびｄＡｂ７ｐ２（ＤＯＭ７ｐ２）（これらの配列の開示に関してＷＯ ２００８０９６１５８を参照。これらの配列およびそれらの核酸相手は参照により本明細書中に組み入れられ、本文の開示の一部を構成する）。代替的名称は、ｄＡｂの後の括弧内に示されており、例えばｄＡｂ８はｄＡｂ１０である代替的名称を有し、すなわちｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）である。
【０１７８】
ある実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンを結合し、以下の群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ １０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０、ｄＡｂ７ｒ２１、ｄＡｂ７ｒ２２、ｄＡｂ７ｒ２３、ｄＡｂ７ｒ２４、ｄＡｂ７ｒ２５、ｄＡｂ７ｒ２６、ｄＡｂ７ｒ２７、ｄＡｂ７ｒ２８、ｄＡｂ７ｒ２９、ｄＡｂ７ｒ３０、ｄＡｂ７ｒ３１、ｄＡｂ７ｒ３２、ｄＡｂ７ｒ３３、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、ｄＡｂ７ｈ２４、ｄＡｂ７ｈ２５、ｄＡｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１、ｄＡｂ７ｒ３、ｄＡｂ７ｒ４、ｄＡｂ７ｒ５、ｄＡｂ７ｒ７、ｄＡｂ７ｒ８、ｄＡｂ７ｒ１３、ｄＡｂ７ｒ１４、ｄＡｂ７ｒ１５、ｄＡｂ７ｒ１６、ｄＡｂ７ｒ１７、ｄＡｂ７ｒ１８、ｄＡｂ７ｒ１９、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、ｄＡｂ７ｈ１４、ｄＡｂ７ｐ１およびｄＡｂ７ｐ２。
【０１７９】
例えば、ヒト血清アルブミンを結合するｄＡｂは、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、ｄＡｂ７ｈ２４、ｄＡｂ７ｈ２５、ｄＡｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４
と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１８０】
ある実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンを結合し、以下の群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、ｄＡｂ７ｈ２４、ｄＡｂ７ｈ２５、ｄＡｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０１８１】
さらに特定の実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンを結合し、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶ_κｄＡｂである：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）（この段落における配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２に出ていたものである）、
ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０１８２】
さらに特定の実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンを結合し、ｄＡｂ７ｈ３０およびｄＡｂ７ｈ３１から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨｄＡｂである。
【０１８３】
さらに特定の実施形態では、ｄＡｂはｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４である。
【０１８４】
他の実施形態では、ｄＡｂ、リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストは、ヒト血清アルブミンを結合し、前記のアミノ酸配列のいずれかのＣＤＲのうちの１、２または３つ、例えばｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４のＣＤＲのうちの１、２または３つを含む。
【０１８５】
血清アルブミンを結合する適切なラクダ類ＶＨＨとしては、ＷＯ ２００４／０４１８６２（Ablynx N.V.）に、ならびにＷＯ２００７０８０３９２（このＶＨＨ配列およびそれらの核酸相手は、参照により本明細書中に組み入れられ、そして本文の開示の一部を構成する）に開示されたもの、例えば、配列Ａ（配列番号５１８）、配列Ｂ（配列番号５１９）、配列Ｃ（配列番号５２０）、配列Ｄ（配列番号５２１）、配列Ｅ（配列番号５２２）、配列Ｆ（配列番号５２３）、配列Ｇ（配列番号５２４）、配列Ｈ（配列番号５２５）、配列Ｉ（配列番号５２６）、配列Ｊ（配列番号５２７）、配列Ｋ（配列番号５２８）、配列Ｌ（配列番号５２９）、配列Ｍ（配列番号５３０）、配列Ｎ（配列番号５３１）、配列Ｏ（配列番号５３２）、配列Ｐ（配列番号５３３）、配列Ｑ（配列番号５３４）が挙げられ、これらの配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ ２００４／０４１８６２（Ablynx N.V.）に列挙されたものと対応する。ある実施形態では、ラクダ類ＶＨＨは、ヒト血清アルブミンを結合し、ＷＯ２００７０８０３９２に開示されたＡＬＢ１と、または配列番号５１８〜５３４（これらの配列番号は、ＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ ２００４／０４１８６２に列挙されたものと対応する）のいずれか１つと、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、リガンド，アゴニストまたはアンタゴニストは、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）との結合に関して本明細書中に開示される任意の抗血清アルブミンｄＡｂと競合する抗血清アルブミンｄＡｂを含む。
【０１８７】
別の実施形態では、アゴニスト、アンタゴニストまたはリガンドは、標的抗原（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）に対して特異的な結合部分を含み、２００８年２月８日に出願された同時係属出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００４５３（結合部分、（例えば種々のライブラリーからの）それらの産生および選択法およびそれらの配列の開示は、参照することにより本明細書中に本文の開示の一部として組み入れられる）に記載されるように、この結合部分は非免疫グロブリン配列を含む。
【０１８８】
半減期延長部分（例えばアルブミン）との接合
一実施形態では、一実施形態では、（１つ以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにその断片および類似体）は、本発明の標的抗原−結合ポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストまたはアンタゴニストと接合されるかまたは会合される。標的抗原−結合フォーマットに用いるための適切なアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体の例は、ＷＯ ２００５０７７０４２（この開示内容は参照により本明細書中に組み入れられて、本文の開示の一部を構成する）に記載されている。特に、以下のアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体が、本発明に用いられ得る：
・配列番号１（ＷＯ ２００５０７７０４２に開示。この配列は、参照により本開示中に明白に組み入れられる）；
・配列番号１（ＷＯ ２００５０７７０４２に開示。この配列は、参照により本開示中に明白に組み入れられる）；
・ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸１〜３８７を含むかまたはそれからなるアルブミン断片または変異体；
・（ａ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸５４〜６１；（ｂ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸７６〜８９；（ｃ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸９２〜ｌ００；（ｄ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸１７０〜１７６；（ｅ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸２４７〜２５２；（ｆ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸２６６〜２７７；（ｇ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸２８０〜２８８；（ｈ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸３６２〜３６８；（ｉ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸４３９〜４４７；（ｊ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸４６２〜４７５；（ｋ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸４７８〜４８６；および（ｌ）ＷＯ ２００５０７７０４２における配列番号１のアミノ酸５６０〜５６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアルブミンあるいはその断片または変異体。
【０１８９】
標的抗原結合フォーマットに用いるための適切なアルブミン、断片および類似体は、ＷＯ ０３０７６５６７（この開示内容は参照により本明細書中に組み入れられて、本文の開示の一部を構成する）に記載されている。特に、以下のアルブミン、断片または変異体が本発明に用いられ得る：
・ＷＯ ０３０７６５６７に、例えば図３に記載されているようなヒト血清アルブミン（この配列情報は、参照により本開示中に明白に組み入れられる）；
・６６，５００の式分子量を有する５８５アミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖からなるヒト血清アルブミン（ＨＡ）（Meloun, et al., FEBS Letters 58: 136 (1975)；Behrens, et al., Fed. Proc. 34: 591 (1975)；Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9: 6102-6114 (1981)；Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261: 6747 (1986)参照）；
・Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37: 219 (1973)に記載されたようなアルブミンの多型性変異体または類似体または断片；
・ＥＰ ３２２０９４に記載されたようなアルブミン断片または変異体、例えばＨＡ（１〜３７３）、ＨＡ（１〜３８８）、ＨＡ（１〜３８９）、ＨＡ（１〜３６９）およびＨＡ（１〜４１９）ならびに１〜３６９および１〜４１９間の断片；
・ＥＰ ３９９６６６に記載されたようなアルブミン断片または変異体、例えばＨＡ（１〜１７７）およびＨＡ（１〜２００）ならびにＨＡ（１〜Ｘ）間の断片（ここで、Ｘは１７８から１９９までの任意の数である）。
【０１９０】
（１つ以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにその断片および類似体）が本発明の標的抗原−結合ポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストおよびアンタゴニストをフォーマットするために用いられる場合、それは、任意の適切な方法を用いて、例えば標的抗原−結合部分（例えば、抗ＴＮＦＲ１ｄＡｂ）との直接融合により、例えば融合タンパク質をコードする単一ヌクレオチド構築物を用いることにより（ここで、上記融合タンパク質は、標的抗原結合部分に対してＮ−またはＣ−末端に位置する半減期延長部分を有する単一ポリペプチド鎖としてコードされる）、接合され得る。代替的には、接合は、部分間にペプチドリンカー、例えばＷＯ ０３０７６５６７またはＷＯ ２００４００３０１９に記載されたようナペプチドリンカー（これらのリンカー開示は、参照により本発明の開示中に組み入れられて、本発明に用いるための例を提供する）を用いることにより、達成され得る。一実施形態では、接合は、本明細書中に記載されるような螺旋状リンカーなどの螺旋状リンカーを介するものであり得る。また、この目的に有用な他のリンカーは、グリシン−セリンリッチなリンカーなどを包含すると理解される。一実施形態では、リンカーはプロテアーゼ耐性リンカーであってよい。典型的には、in vivoで血清半減期を拡大するポリペプチドは、in vivoで天然に生じる、そして生物体（例えばヒト）から望ましくない物質を除去する内因性機序による分解または除去を阻止する。例えば、in vivoで血清半減期を拡大するポリペプチドは、細胞外マトリックスからのタンパク質、血中に見出されるタンパク質、血液脳関門に、または神経組織中に見出されるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚または骨に限局されるタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、あるいはＦｃ輸送に関与するタンパク質から選択され得る。
【０１９１】
本開示全体にわたって記載される本明細書の実施形態では、本発明のアゴニスト、アンタゴニストまたはリガンドにおいて抗標的抗原「ｄＡｂ」を使用するかわりに、熟練者が標的抗原（例えば、適切なタンパク質足場または骨格、例えばアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインまたはＥＧＦドメイン上にグラフトされたＣＤＲ）を結合する本発明のｄＡｂのＣＤＲの１つ以上または３つ全てを含むポリペプチドまたはドメインを使用できることが想定される。全体としての開示は、ｄＡｂのかわりにこのようなドメインを使用してアゴニストまたはアンタゴニストの開示を提供すると解釈されるべきである。この点に関しては、ＷＯ２００８０９６１５８（その開示は参照により組み込まれる）を参照。
【０１９２】
一実施形態では、したがって、本発明のアゴニストまたはアンタゴニストは、適切なフォーマットにおいてこのようなｄＡｂの標的抗原または相補性決定領域に対して結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインまたはドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む。アゴニストまたはアンタゴニストは、このようなｄＡｂからなるか、または本質的にこのようなｄＡｂからなるポリペプチドであり得る。アゴニストまたはアンタゴニストは、適切なフォーマット、例えば抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ様フォーマット、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２）、または別の標的タンパク質、抗原もしくはエピトープ（例えば、血清アルブミン）を結合する第二ｄＡを含む二重特異的リガンドにおいてｄＡｂ（またはｄＡｂのＣＤＲ）を含むポリペプチドであり得る。
【０１９３】
本発明のポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストおよびアンタゴニストは、ＩｇＧ様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片）、単一可変ドメイン（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ）、ｄＡｂ、および前記のいずれかの修飾バージョン（例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール）または他の適切なポリマーの共有的結合により修飾される）などの当該技術分野で公知の種々の適切な抗体フォーマットとしてフォーマット化され得る。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＩｇＧ様フォーマットであるリガンド（例えば、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト）を提供する。このようなフォーマットは、ＩｇＧ分子の慣用的な４つの鎖構造（２つの重鎖と２つの軽鎖）を有し、この構造では、１つ以上の可変領域（Ｖ_ＨおよびまたはＶ_Ｌ）が本発明のｄＡｂで置換されている一実施形態では、可変領域（２つのＶ_Ｈ領域および２つのＶ_Ｌ領域）のそれぞれは、ｄＡｂまたは単一可変ドメインで置換され、その少なくとも１つは、本発明による抗標的抗原ｄＡｂである。ＩｇＧ様フォーマット中に含まれるｄＡｂまたは単一可変ドメインは、同じ特異性または異なる特異性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ様フォーマットは四価であり、１つ（抗標的抗原のみ）、２つ（例えば、抗標的抗原と抗ＳＡ）、３つまたは４つの特異性を有し得る。例えば、ＩｇＧ様フォーマットは、一特異的であり得、同じ特異性を有する４つのｄＡｂを含む；二特異的であり、同じ特異性を有する３つのｄＡｂおよび異なる特異性を有する別のｄＡｂを含む；二特異的であり、同じ特異性を有する２つのｄＡｂおよび共通であるが異なる特異性を有する２つのｄＡｂを含む；三特異的であり、同じ特異性を有する第１および第２ｄＡｂ、異なる特異性を有する第３ｄＡｂならびに第１、第２、および第３のｄＡｂと異なる特異性を有する第４のｄＡｂを含む；または四特異的であり、それぞれ異なる特異性を有する第４のｄＡｂを含む。ＩｇＧ様フォーマットの抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦ_Ｖ）を調製することができる。一実施形態では、ＩｇＧ様フォーマットまたはその抗原結合断片は標的抗原を架橋しない。例えば、フォーマットは、標的抗原に対して一価であり得る。相補性活性化および／または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機能が望ましい場合、リガンドはＩｇＧ１様フォーマットであり得る。所望によりＩｇＧ様フォーマットは、変異定常領域（変異体ＩｇＧ重鎖定常領域）を含み得、Ｆｃ受容体に対する結合および／または補体を固定する能力を最小限に抑えることができる。（例えばWinter et al., GB 2,209,757 B;Morrison et al., WO 89/07142;Morgan et al., WO 94/29351, December 22, 1994を参照）。
【０１９５】
本発明のリガンド（ポリペプチド、ｄＡｂ、アゴニストおよびアンタゴニスト）は、第二免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第一免疫グロブリン単一可変ドメインを含有する融合タンパク質としてフォーマットされ得る。所望により、このようなフォーマットは、半減期延長部分をさらに含み得る。例えば、リガンドは、血清アルブミンを結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第二免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合される第一免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る。
【０１９６】
一般的に、標的に対する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインの配向は、リガンドがリンカーを含んでいてもいなくても、設計選択の問題である。しかしながら、いくつかの配向は、リンカーがあってもなくても、他の配向より良好な結合特性を提供する。全ての配向（例えば、ｄＡｂ１−リンカー−ｄＡｂ２；ｄＡｂ２−リンカー−ｄＡｂ１）が本発明に包含され、所望の結合特性を提供する配向を含有するリガンドは、スクリーニングにより容易に同定され得る。
【０１９７】
本発明によるｄＡｂは、ｄＡｂ単量体、二量体および三量体を含めて、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの一方または両方を、任意にヒンジ領域を含む抗体Ｆｃ領域と連結され得る。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域に連結されるリガンドをコードするベクターを用いて、このようなポリペプチドを調製し得る。本発明はさらに、前記ｄＡｂ単量体の二量体、三量体およびポリマーを提供する。
【実施例】
【０１９８】
実施例１
研究の目的
この研究の目的は、ＤＰＰ ＩＶ耐性ＧＬＰ−１（本明細書では、＊ＧＬＰ−１と称する）を含むＧＬＰ−１変異体由来のライブラリーに関してファージ選択を実施し、あわせてファージの種々のプロテアーゼ（発現宿主中に天然に存在するものを包含する）での処理を実施することにより、ＧＬＰ−１ ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）融合物のプロテアーゼ耐性変異体を得ることであった。本明細書中に記載されるように、ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）は、血清アルブミンを特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【０１９９】
ＧＬＰ−１受容体
グルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）は、７つの膜貫通Ｇタンパク質共役受容体のファミリーＢ１に属する。受容体とその天然のアゴニストリガンドＧＬＰ−１との間の結合相互作用は、受容体（ＥＣＤ ＧＬＰ−１Ｒ）の細胞外Ｎ−末端ドメインに対するリガンド結合と、それに続く膜貫通部分のコアとの相互作用によって開始される（Al-Sabah et al, 2003;FEBS Lett;553(3): 342-6）。単離されたＮ−末端ドメインに対するＧＬＰ−１結合は、膜貫通コアが除去される場合は保持されるが、親和性は減少することが示されている（Lopez de Maturana et al, 2003;J. Biol. Chem;278(12): 10195-200）。膜貫通ドメインを有する受容体の可溶化洗剤を含まない水溶液中への溶解度は低いため、溶液におけるファージ選択に全受容体を使用することは望ましくないので、単離された細胞外ドメインをファージ捕捉のために使用して、実験を簡略化し、ファージ表示分子のＥＣＤ ＧＬＰ−１Ｒに対する親和性を増強した。
【０２００】
ＥＣＤ ＧＬＰ−１ＲのＨｉｓ標識されたＦｃ単量体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下のとおりである：
ヌクレオチド配列（配列番号１）：
ＡＴＧＧＣＣＧＧＣＧ ＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣ ＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴ ＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣ ＴＧＣＴＣＧＧＧＡＴ ＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧ ＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣ ＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧ ＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧ ＴＣＣＣＴＣＴＧＧＧ ＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡ ＧＡＡＡＴＧＧＣＧＡ ＧＡＡＴＡＣＣＧＡＣ ＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡ ＧＣＧＣＴＣＣＣＴＧ ＡＣＴＧＡＧＧＡＴＣ ＣＡＣＣＴＣＣＴＧＣ ＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧ ＴＴＣＴＧＣＡＡＣＣ ＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡ ＴＧＡＡＴＡＣＧＣＣ ＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧ ＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣ ＡＧＧＣＴＣＧＴＴＣ ＧＴＧＡＡＴＧＴＣＡ ＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧ ＧＴＡＣＣＴＧＣＣＣ ＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡ ＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡ ＧＧＧＣＣＡＣＧＴＧ ＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴ ＧＣＡＣＡＧＣＴＧＡ ＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧ ＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧ ＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧ
ＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧ ＡＧＧＧＡＣＴＴＧＴ ＣＧＧＡＧＴＧＣＧＡ ＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧ ＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡ ＧＡＡＧＣＴＣＣＣＣ ＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧ ＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣ ＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡ ＧＣＣＣＡＡＡＴＣＧ ＧＣＣＧＡＣＡＡＡＡ ＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣ ＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡ ＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧ ＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧ ＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡ ＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴ ＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡ ＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣ ＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡ ＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣ ＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣ ＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧ ＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴ ＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡ ＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧ ＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡ ＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧ ＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧ ＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡ ＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡ ＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧ ＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡ ＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧ ＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧ
ＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴ ＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧ ＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴ ＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧ ＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣ ＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧ ＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡ ＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡ ＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧ ＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴ ＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣ ＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣ ＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣ ＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣ ＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣ ＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡ ＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣ ＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧ ＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣ ＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣ ＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴ ＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡ ＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧ ＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡ ＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡ ＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣ ＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡ ＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣ ＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣ ＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴ ＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴ ＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧ ＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧ ＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧ ＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧ
ＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴ ＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣ ＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴ ＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣ ＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡ ＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧ ＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣ ＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧ ＴＡＡＡＣＡＴＣＡＣ ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣ ＡＣＴＧＡ
アミノ酸配列（配列番号２）：
ＭＡＧＡＰＧＰＬＲＬ ＡＬＬＬＬＧＭＶＧＲ ＡＧＰＲＰＱＧＡＴＶ ＳＬＷＥＴＶＱＫＷＲ ＥＹＲＲＱＣＱＲＳＬ ＴＥＤＰＰＰＡＴＤＬ ＦＣＮＲＴＦＤＥＹＡ ＣＷＰＤＧＥＰＧＳＦ ＶＮＶＳＣＰＷＹＬＰ ＷＡＳＳＶＰＱＧＨＶ ＹＲＦＣＴＡＥＧＬＷ ＬＱＫＤＮＳＳＬＰＷ ＲＤＬＳＥＣＥＥＳＫ ＲＧＥＲＳＳＰＥＥＱ ＬＬＦＬＫＬＥＰＫＳ ＡＤＫＴＨＴＳＰＰＳ ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ
ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ ＳＬＳＬＳＰＧＫＨＨ ＨＨＨＨ
【０２０１】
ＧＬＰ−１Ｒ ＥＣＤも、プロテインＡアガロース上でのタンパク質の初期生成を可能にする、ＩｇＧ Ｆｃタグを用いて発現させた。ファージ選択の間、可溶性受容体をその後、プロテインＡ被覆ビーズを用いて捕捉することができた。
【０２０２】
ファージ選択の試験
ＧＬＰ−１受容体の細胞外ドメインをファージ表示ライブラリー選択に使用できることを検証するために試験を実施した。
【０２０３】
ファージベクター
線状ファージ（ｆｄ）表示ベクターであるｐＤＯＭ３４（ｐＤＯＭ４の誘導体）を使用し、これはｍｙｃタグを有するｆｄベクターに基づくものであり、ここでは、タンパク質配列を制限部位間でクローニングして、タンパク質−遺伝子ＩＩＩ融合物を提供することができる。（ＷＯ ２００７／０８５８１５に記載されるようなｐＤＯＭ４は、遺伝子ＩＩＩシグナルペプチド配列が表面タンパク質に固定された酵母糖脂質（ＧＡＳ）シグナルペプチドと置換されたＦｄファージベクターの誘導体である（ＷＯ ２００５／０９３０７４）。これは、リーダー配列と遺伝子ＩＩＩとの間にｃ−ｍｙｃタグも含み、これにより遺伝子ＩＩＩはフレーム中に戻される）。
【０２０４】
ｐＤＯＭ３４をもたらすｐＤＯＭ４の修飾は以下のものを包含する：
１）ｐＤＯＭ４の７４７６ｎｔ位置でのＮｃｏＩ部位のノックアウト
２）ｃｐＩＩＩのＮ’末端に融合したＭｙｃタグの削除
３）シグナルペプチド直後のクローニングを促進するためのＮｃｏＩ制限部位の導入。
【０２０５】
ライブラリーレパートリーをコードする遺伝子をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片としてクローニングした。
【０２０６】
ベクターを大腸菌ＭａｃｈＩ細胞中で増殖させ、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、スーパーコイル状のフラクションを、標準的技法を用いた塩化セシウム勾配超遠心法によって単離した（Sambrook and Maniatis 1989）。ベクターをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ酵素で、続いてＰｓｔＩで切断して、セルフライゲーション率を減少させた。フェノール／クロロホルム抽出後、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ ＴＥ−１０００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上で、ＮｃｏＩとＮｏｔＩ部位との間の必要とされない「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」ＤＮＡ断片から精製した。精製後、ベクターＤＮＡを使用して、多様化ＤＡＴ−Ｘ ＤＮＡ断片に対するライゲーションを試験した。
【０２０７】
ＤＡＴ−Ｘライブラリー構築
１８のレパートリーをＤＰＰ ＩＶ耐性ＧＬＰ−１を含むＤＡＴ−Ｘ親分子に基づいて構築し、これをさらに＊ＧＬＰ−１と呼ぶ。
【０２０８】
＊ＧＬＰ−１（７−３７）：
アミノ酸配列
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号３）
ヌクレオチド配列：
ＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＡＡＧＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡ（配列番号４）
【０２０９】
ＤＡＴ−Ｘ親分子は、血清アルブミンを結合するＤＯＭ７ｈ−１４（ドメイン抗体（ｄＡｂ）との融合物（ａｌｂｕｄａｂ；ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）））をさらに含む。
ＤＯＭ７ｈ−１４：
アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＷＩＧＳＱＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＭＷＲＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＧＡＡＬＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号５）
ヌクレオチド配列：
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴＧＧＣＧＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＣＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＴＡＣＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＧＧＣＧＴＴＧＣＣＴＡＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧ（配列番号６）
【０２１０】
ＤＡＴ−Ｘ親分子中の＊ＧＬＰ−１およびＤＯＭ７ｈ−１４は、螺旋状リンカーにより結合される：
螺旋状リンカー
アミノ酸配列：
ＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＬＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＬＡＡ（配列番号７）
ヌクレオチド配列：
ＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＧＣＣＧＣＡ（配列番号８）
【０２１１】
＊ＧＬＰ−１の全配列（受容体結合に重要であることが知られている部位を除く（例えば、Sarrauste de Menthiere et al. Eur J Med Chem. 2004 Jun;39(6):473-80;Neidigh et al. Biochemistry. 2001 Nov 6;40(44):13188-200;Hjorth et al. J Biol Chem. 1994 Dec 2;269(48):30121-4およびGallwitz et al. Regul Pept. 1996 May 7;63(1):17-22)に記載のとおり）を網羅するために、１７のレパートリーを、５０マイクロリットルの反応体積においてＰｈｕｓｉｏｎ高忠実度ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いたアセンブリーＰＣＲプロトコルを用いて構築した。１つのライブラリーあたり４つのランダム化ヌクレオチドを、一次ＰＣＲにおいてプライマーにより導入し、次いでビオチニル化プライマーを用いてアセンブリーを実施した。Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ビオチニル化プライマーおよび５０μｌの反応について５〜５０ｐｇのテンプレートを用いたエラープローンＰＣＲによって、＊ＧＬＰ−１内にランダム突然変異が導入された。＊ＧＬＰ−１ヌクレオチド配列が短いために、エラープローンＰＣＲを２回実施して、突然変異率を増大させた。
【０２１２】
ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化した後、挿入物をストレプトアビジン被覆ビーズを用いて未消化生成物から精製した。試験ライゲーションを実施し、この場合、消化された生成物をｐＤＯＭ３４中に対応する部位でライゲートした。
【０２１３】
試験ライゲーションクローンのシーケンシングによって、全ライブラリーにおいて予想される多様化が確認され、したがって、ライブラリーのフルスケールのライゲーションおよび形質転換を続いて行った。合計体積５００マイクロリットルで、１マイクログラムの消化されたベクターおよび挿入物をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）と１：２の比で用いて、ライゲーションを実施した。各ライブラリーを２ショット（１０マイクロリットル／１００マイクロリットルのエレクトロコンピテント大腸菌ＴＢ１細胞および回収後に、１００ｍｌの培地）で１時間、３７℃にて撹拌しながら形質転換し、ライブラリーを、２ＸＴＹ Ｔｅｔ寒天を含む大きな（２２ｃｍ）正方形のプレート上に蒔いた。プレートを一晩増殖させ、次いでストック調製のために、１５％のグリセロールを含む５ｍｌの２ｘＴＹ中に削り落とした。ライブラリーサイズは、１０^７〜１０^８形質転換体の範囲であった。
【０２１４】
ファージライブラリー調製のために、１００マイクロリットルのグリセロールストックを、抗生物質を含む２００ミリリットルの２ｘＴＹ培地中に接種して、接種直後の培養物の最終密度がＯＤ_６００＝０．１を越えないようにすることにより、ライブラリー培養を開始した。ライブラリーを一晩、約１８時間、３７℃で撹拌しながら培養した。培養物を遠心分離によってペレット化し、ファージライブラリーを、ＰＥＧを用いた二重沈降によって調製し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。
【０２１５】
選択されていないライブラリーからのいくつかのクローンをシーケンシングのためにランダムに選択して、ライブラリー構築の成功を確認し、初回のパニングをファージライブラリー調製後に実施した。
【０２１６】
パニング、グリセロールストック調製およびファージ増幅の方法は、特に記載しない限り下記の通りである。
【０２１７】
ＧＬＰ−１受容体の細胞外ドメインをパニングに使用した。１００マイクロリットルのファージライブラリーを、１００ｎＭのＧＬＰ−１Ｒを含む２％Ｍａｒｖｅｌｌ ＰＢＳとともにインキュベートした。インキュベーションは、室温で１時間実施し、次いでファージをあらかじめブロックした（２％ Ｍａｒｖｅｌｌ ＰＢＳ、１時間、室温）プロテインＡダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ）と組み合わせた。１時間、回転するホイール上で室温にてインキュベーションした後、ビーズを、ＫｉｎｇＦｉｓＨＥＲ精製系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中で８回、０．１％のＴｗｅｅｎ ＰＢＳ（ＫｉｎｇＦｉｓＨＥＲロボットは、洗浄液から洗浄液へとビーズを移すために磁気プローブを用いることにより、洗浄プロセスを自動化する）を用いて洗浄し、特異的ファージを５００マイクロリットルの０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）中で溶離することにより回収した。１００マイクロリットルの１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で中和した後、対数期の大腸菌ＴＧ１細胞の感染のためにファージを４５分間３７℃で使用した。感染細胞を寒天Ｔｅｔプレート上に蒔き、これを一晩３７℃で増殖させた。ライブラリーの力価，インプットアウトプットおよびライブラリーサイズを下記表に提示する。
【０２１８】
【表１】

【０２１９】
初回の選択により、全てのライブラリーについて妥当なアウトプットが得られた。
【０２２０】
１５％グリセロールを含む２ｍｌの２ＸＴＹ培地を含む寒天プレートからコロニーを削り落とすことにより、グリセロールストックを調製し、低温バイアル中に等分した。
【０２２１】
以下の選択をプールされたファージに関して実施した。１８ライブラリー全てからの第一選択から得られたアウトプットを含む大腸菌グリセロールの複合培養によって増幅されたファージを得た。それぞれのパニングされたライブラリーグリセロールストック５０マイクロリットルを、抗生物質を含む１リットルの２ｘＴＹ培地中に接種することによって、培養を開始した。培養物を２つの２ｌのシェーカーフラスコ中に、それぞれ０．５リットルに分割し、一晩、３７℃にて２５０ｒｐｍで撹拌しながら培養した。ＰＥＧを用いて１回沈降させることにより１８〜２０時間の培養後にファージを調製し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。
【０２２２】
プロテアーゼを用いたＤＡＴ−Ｘファージ表示ライブラリー選択
第一選択アウトプットから得られた増幅されたファージを、一定濃度のＧＬＰ−１Ｒ（１００ｎＭ）を用いたさらなる選択に使用した。さらに、トリプシンを用いた選択前に、初回選択アウトプットから得られたファージのバッチを、ＡｌｂｕｄＡｂ配列中にＲ１０８Ｗ突然変異を有するようにサブクローニングした。この突然変異により、ＶカッパＡｌｂｕｄＡｂクローンは、ファージ上に表示された場合にトリプシン処理に対する耐性が高くる。これは、ドメイン抗体をｐＩＩＩタンパク質に連結させるｄＡｂのカルボキシ末端のアルギニン残基がトリプシン感受性であるからである。この部位での突然変異は、トリプシン切断部位を除去し、プロテアーゼ選択の標的ペプチドの所望の領域に対する標的化を改善する。したがって、ファージの２つのバッチ（ＡｌｂｕｄＡｂ中にＲ１０８Ｗ突然変異を有するかまたは有さないもの）を第二選択ラウンドで直ちに使用した。
【０２２３】
ファージを種々の濃度のプロテアーゼトリプシンまたはキモトリプシンで処理するか、または未処理のまま放置した後、受容体とともに１時間室温でインキュベーションした。第二の選択力価（φ／ｍｌ）を下記表に提示する。
【０２２４】
【表２】

【０２２５】
各選択から得られたファージアウトプット（０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）を、５０マイクロリットルのグリセロールストックを５０ミリリットルの２ｘＴＹ（Ｔｅｔを含む）中に接種し、２０時間３７℃で撹拌しながら一晩培養することによって増幅した。精製されたファージを、同じインキュベーション条件を用いて第三選択ラウンドに使用した。
【０２２６】
第三選択力価（φ／ｍｌ）を下記表に提示する。
【０２２７】
【表３】

【表４】

【０２２８】
クローンの多様性は、クローンの代表的なセットのコロニーシーケンシングによって検証されるように、第三ラウンド後ですでに減少しているので、選択アウトプットから得られる若干のクローンを以下で詳細に記載するように可溶性タンパク質として発現させた。
【０２２９】
ＤＡＴ−Ｘファージ表示ライブラリー選択アウトプット
いくつかの＊ＧＬＰ−１変異体を、後述のような別のリンカーを用いてＡｌｂｕｄＡｂｂｕｔとの融合物としてクローニングするために選択し、発現し、精製し、ＧＬＰ−１受容体アッセイにおいて分析した。それらのアミノ酸配列を配列１〜１０に記載する（図１を参照）。１つの＊ＧＬＰ−１配列変異体（７）がキモトリプシンおよびトリプシン処理の両方での選択から得られるアウトプット中に大量に存在し、融合物はＤＭＳ７１４９と呼ばれ、キモトリプシンを使用する場合にはアウトプット中に２つ存在し（ＤＭＳ７１５０（８）および５１（９））、１つは、天然のプロテアーゼがファージ発現および分泌中に細胞において作用し、トリプシンまたはキモトリプシンでの前処理を使用しない場合にアウトプット中で観察され（ＤＭＳ７１４８（６））、１つをクローニングして、トリプシン切断部位のノックアウトを作製した（ＤＭＳ７１５２（１０））。
【０２３０】
アミノ酸配列１〜４を（図１を参照）有するタンパク質を分析し、これはＧＬＰ−１および対照ＤＡＴ−Ｘ変異体と比して低い有効性を示した。Ｅｄｍａｎシーケンシングによって、タンパク質は誤ってプロセッシングされたことが示唆された。
【０２３１】
アミノ酸配列：ＰＳＳ（配列番号９）およびヌクレオチド配列：ＣＣＡＡＧＣＴＣＧ（配列番号１０）を有する別のリンカーによりＤＯＭ７ｈ−１４に連結された＊ＧＬＰ−１を含むＤＡＴ−Ｙクローン中に突然変異を導入することにより、クローニングを実施した。
【０２３２】
選択された突然変異を一次ＰＣＲにおいてプライマーにより＊ＧＬＰ−１配列に導入し、アセンブリーＰＣＲにおいて、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ消化部位を融合配列のそれぞれ５’および３’末端上に導入した。
【０２３３】
アセンブリーＰＣＲをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。
【０２３４】
発現ベクターｐＤＯＭ３５をクローニング用に調製した。ベクターｐＤＯＭ３５は、以下の修飾を有するｐＥＴ１２ａの誘導体である：
・ＯｍｐＴシグナルペプチドの最後の３つの残基がＳＦＡからＡＷＡに変わり、これにより、大腸菌のシグナルペプチダーゼによる正しい部位でのプロセッシングが改善される。
・ＮｃｏＩ部位をシグナルペプチド直後のクローニングを促進するために導入した
・「スタッファー」はＮｃｏＩとＢａｍＨＩ部位との間に存在する。
【０２３５】
ｐＤＯＭ３５をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、カットアセンブリーＰＣＲを、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してベクター中にライゲートした。２マイクロリットルのライゲーションをＭａｃｈＩ細胞の形質転換に使用し、回収後に、細胞を、カルベニシリンを含む寒天プレート上に蒔き、一晩増殖させた。コロニーを配列決定し、正しい配列を含むものをプラスミド増殖およびその単離に使用した（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をプラスミドＤＮＡで形質転換し、結果として得られるコロニーを発現培養の接種のために使用した。
【０２３６】
Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）自己誘導溶液（１ミリリットルの溶液１（カタログ番号７１２９８）、２．５ミリリットルの溶液２（カタログ番号７１２９９）、５０マイクロリットルの溶液３（カタログ番号７１３０４）、Ｎｏｖａｇｅｎ）および１００マイクログラム／ミリリットルのカルベニシリンを添加した２ｘＴＹ培地の５０ミリリットルの培養物を接種することにより発現を実施した。培養を一晩３７℃で実施し、次いで培養上清を３７００ｘｇで４５分間遠心分離することにより清澄化した。発現されたタンパク質をプロテインＬストリームライン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８−４０５８−０３、プロテインＬ結合）を用いて清澄化された上清から精製し、プロテインＬから０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）を用いて溶離し、次いで０．２体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いて中和した。
【０２３７】
ＤＭＳ７１４８由来の＊ＧＬＰ−１変異体タンパク質も高い親和性のＡｌｂｕｄＡｂ、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０との融合ＤＭＳ７１６１（配列１１）としてクローニングし、前述のように、別のＰＳＳリンカーによりｐＤＯＭ３５中に結合させた。
ＤＯＭ７ｈ−１４−１０
アミノ酸配列（配列番号２２）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＷＩＧＳＱＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＭＷＲＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＧＬＲＨＰＫＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
ヌクレオチド配列（配列番号２３）：
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴＧＧＣＧＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＣＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＴＡＣＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＣＡＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧ
【０２３８】
ＤＭＳ７１６１の配列を含むプラスミドＤＮＡ ｐＤＯＭ３５をＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した後、グルコースを含む最小培地中にコロニーを削り落とし、グリセロールを最終濃度約１５％で添加することによって、グリセロールストックを増殖させたコロニーから調製した。ＤＭＳ７１６１の発現は、酵母抽出物中に最終濃度１０ｇ／リットル（ＤＭＳ７１６１ Ｂ）になるように添加された５０ミリリットルの最小培地（ＤＭＳ７１６１ Ａ）中にグリセロールを接種することによって開始して、ＯＤ６００＝０．０２４の開始培養密度を得た。培養物を３０℃で約１．４のＯＤ６００まで増殖させ、次いで０．１ｍＭのイソプロピル−ベータ−ｄ−チオガラクトシドを添加することによって誘発させた。培養をさらに２４時間２３℃で継続し、その後、培養上清を３７００ｘｇで４５分間遠心分離することにより清澄化した。発現されたタンパク質を次に清澄化された上清からプロテインＬを用いて精製し、プロテインＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号．２８−４０５８−０３、プロテインＬ結合）から０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．０）を用いて溶離し、次いで０．２体積の１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いて中和した。
【０２３９】
ＤＭＳ７１４８−５２の品質管理
タンパク質ＤＭＳ７１４８−５２を発現させ、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化し、ＤＭＳ７１４８およびＤＭＳ７１６１クローンを予想されるサイズで移動する物質の大部分を用いて大腸菌中で十分に発現させた（図２、３および４）。質量分析法（図５Ａ））およびＥｄｍａｎシーケンシング分析により、配列の統合性を確認した。他のタンパク質の全てを２５−トリプトファンのアミノおよびカルボキシル部位で分解し（それぞれ生成物２４−１４２および２６−１４２）、この場合、ＤＭＳ７１４８はＷ２５−Ｄ突然変異を含み、アスパラギン酸は大腸菌細胞において作用する天然のプロテアーゼの切断部位を形成しなかった（図５Ａ）〜Ｆ））。分解生成物２８〜１４２は残りのクローンにおいて観察された。
【０２４０】
タンパク質ＤＭＳ７１４８を以下のプロトコルにしたがってＧＬＰ−１受容体結合アッセイにおいて活性について分析した：
【０２４１】
バックグラウンド：ＧＬＰ−１Ｒは、ＣＨＯ細胞上で発現される７ＴＭＧ−タンパク質結合受容体である。ＧＬＰ−１またはこのような類似体による受容体の活性化は、受容体と結合したアデニレートシクラーゼによるＡＴＰのｃＡＭＰへの変換につながる。ＣＨＯ細胞は６ＣＲＥ／ｌｕｃレポーター遺伝子で安定にトランスフェクトされる。受容体のＧＬＰ−１活性化後にｃＡＭＰの産生に際して、プロモーター遺伝子（６コピーのｃＡＭＰ応答要素−６ＣＲＥを含む）はルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を引き起こす。これは次にルシフェリンとの反応を触媒して、光を生じ、この光は照度計で測定できる。
【０２４２】
プロトコル：ＣＨＯ ６ＣＲＥ ＧＬＰ１Ｒ細胞（ルシフェラーゼレポーター遺伝子を支配する６ｃＡＭＰ応答要素およびヒトＧＬＰ−１受容体で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ Ｋ１細胞）を懸濁液培地中２×１０^５細胞／ｍＬで播種した。懸濁液培養を４８時間維持した。細胞を次いで１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬグルタミン（２．５×１０^５細胞／ｍｌ）中に希釈し、１０ｕｌ／ウェルの分析される化合物を含む３８４ウェルプレート中に分配する。アッセイ対照を添加した後、プレートをインキュベーターに３時間、３７℃および５％ＣＯ_２で戻した。インキュベーション後、ｓｔｅａｄｙ ｇｌｏ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を粘着性プレートシールで密封されたキットおよびプレート（Ｗｅｂｅｒ Ｍａｒｋｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、カタログ番号６０７７８０）に記載されているようにウェルに添加した。プレートをリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ）に設置し、５分間プレインキュベートし、蛍光を読み取り、結果をプロットした。化合物を適合される濃度応答曲線の範囲で分析し、これからｐＣ５０を計算した。
【０２４３】
タンパク質ＤＭＳ７１４８は活性であるが、ＧＬＰ−１ペプチドよりも活性が低いことが判明した（図６および下記にまとめる）。
【表５】

【０２４４】
ＤＭＳ７１６１を、次のプロトコルにしたがってＧＬＰ−１アッセイにおいて活性について分析した：
方法：
ＣＨＯ ６ＣＲＥ ＧＬＰ１Ｒ細胞を、３７℃の水浴中にバイアルを半分浸漬することにより急速に解凍し、バイアルの内容物を、５０ｍｌファルコンチューブに移し、１０ｍｌのＲＰＭＩ（無フェノール赤）アッセイ培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ７５０９）＋２ｍＭＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０）＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０８８７）をバイアルごとに添加した。計数し、１２００ｒｐｍで５分遠心分離した後、細胞を適切な体積のＲＰＭＩアッセイ培地中に再懸濁させ、１×１０^６細胞／ｍｌとし、５０μｌを白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒの９６ウェル組織培養プレート、白色滅菌、カタログ番号３９１７）の各ウェル中に分配した。細胞を３７Ｃ／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、細胞をインキュベーターから取り出し、５０μｌのあらかじめ調製した対照／試料をウェルに添加し、プレートをインキュベーターに３時間、３７℃、５％ＣＯ_２で戻した。
【０２４５】
ＧＬＰ−１（７−３６）対照の調製（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ８１４）
Ｖ底９６ウェルプレート中、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＧＬＰ−１（７−３６）を１８μｌのＲＰＭＩアッセイ培地に添加して、３０μＭ溶液を得る。２μｌの３０μＭ溶液を２９８μｌのＲＰＭＩアッセイ培地に添加して、２００ｎＭ溶液を得る（１００ｎＭのアッセイにおける最終濃度について）。対照を１：１０にプレートに連続希釈（１５μｌの対照＋１３５μｌのＲＰＭＩアッセイ培地）して、８点の曲線を作製する。
【０２４６】
エキセンディン−４対照の調製（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ７１４４）
【０２４７】
Ｖ底９６ウェルプレート中、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ）エキセンディン−４を１９８μｌのＲＰＭＩアッセイ培地に添加して、２．３９μＭ溶液を得る。２μｌの２．３９μＭ溶液を２３７μｌのＲＰＭＩアッセイ培地に添加して、２０ｎＭ溶液（１０ｎＭのアッセイ中最終濃度について）を得る。対照を１：１０でプレートに連続希釈（１５μｌの対照＋１３５μｌのＲＰＭＩアッセイ培地）して、８点曲線を作製する。
【０２４８】
未知試料の調製
未知試料の調製のために対照の調製のための同じガイドラインを使用する。最高濃度を必要とされる最終アッセイ濃度の２倍にし、１：１０でプレートに希釈する。
【０２４９】
ルシフェラーゼの調製（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２６２０）
必要な数のＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアリコートを冷凍庫から取り出し、室温にて暗所で解凍する。１つのアッセイプレートには１つの５ｍｌバイアルで十分である。
【０２５０】
インキュベーション時間後、５０μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を全ウェルに添加し、プレートを室温で３分間インキュベートして、細胞溶解を起こさせた。発光（１秒あたりの計測数）を、Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーを用いて読み取り、０．１秒間、各ウェルを読み取った。細胞のみを含むバックグラウンドウェルのＣＰＳを他の全てのウェルから差し引いた。対照ウェル（ＧＬＰ−１（７−３６）またはエキセンディン−４）は、最高濃度で最大刺激を示すはずである。未知試料の濃度効果曲線を適合させ、これからＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍまたはＥｘｃｅｌＦｉｔソフトウェアを用いてＥＣ５０を計算する。
【０２５１】
ＤＭＳ７１６１は、図７に示し、以下でまとめるように、有効であり、１．６〜３．４ｎＭのＥＣ５０である。
【０２５２】
【表６】

【０２５３】
ＤＭＳ７１６１はＤＭＳ７１４８として活性であることが判明した。
【０２５４】
まとめ
プロテアーゼに対して自然に非常に感受性であり、大腸菌における発現中に分解する多様化ペプチド融合物のファージ選択によって、本発明者等は天然の細菌プロテアーゼに対して耐性である＊ＧＬＰ−１変異体−融合物を同定することができ、これは大腸菌において発現可能である。このクローンにおいてノックアウトされたプロテアーゼ部位は、トリプシンおよびキモトリプシンによって認識されるものに類似しているが、この配列はさらなるトリプシンまたはキモトリプシン処理での選択から得られるアウトプット中に存在しなかった。
【表７】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーからプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドを選択するための方法であって、
ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供すること、
レパートリーおよびプロテアーゼをプロテアーゼの活性に適した条件下でインキュベートすること、ならびに
所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを回収し、これによりプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが選択されること
を含む、方法。
【請求項２】
レパートリーが表示系において発現され、プロテアーゼが表示系に対して内因性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
表示系が細菌であり、プロテアーゼが細菌において発現されたプロテアーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
パートリーと、さらなるプロテアーゼとを、前記さらなるプロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記条件が、（ｉ）約１０μｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの前記さらなるプロテアーゼ、（ｉｉ）約２０℃〜約４０℃、および（ｉｉｉ）少なくとも約３０分間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記条件に関して、（ｉ）が約１０〜約１００μｇ／ｍｌの前記さらなるプロテアーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記条件に関して、（ｉｉ）が約３０〜約３７℃である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記条件に関して、（ｉｉｉ）が少なくとも約１時間である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記さらなるプロテアーゼが、血清、喀痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液または涙において見られるプロテアーゼから選択されるものである、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロテアーゼまたはさらなるプロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンＧ）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ１、プロテイナーゼ２、プロテイナーゼ３）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ９、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、セパラーゼ、およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）からなる群の一または二以上を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼまたはさらなるプロテアーゼがトリプシンまたはキモトリプシンである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
プロテアーゼが、生物学的抽出物、生物学的ホモジネート、または生物学的調製物によって提供される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的抽出物、生物学的ホモジネート、または生物学的調製物が、血清、喀痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液、および涙からなる群から選択されるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記所望の生物学的活性が結合活性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合活性が一般的リガンドを結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記一般的リガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合活性が標的リガンドに対する特異的結合である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的リガンドがＧＬＰ−１受容体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをパニングによって回収する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記レパートリーが表示系を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記表示系が、バクテリオファージ表示、リボソーム表示、乳濁液コンパートメント化および表示、酵母表示、ピューロマイシン表示、細菌表示、プラスミド上の表示、ならびに共有表示からなる群から選択されるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記表示系が、核酸のコード機能と、核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴とを連結する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記表示系が複製可能な遺伝子パッケージを含む、請求項２０、２１、または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記表示系がバクテリオファージ表示を含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
バクテリオファージ表示系が多価である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記バクテリオファージが、ｆｄ、Ｍ１３、ラムダ、ＭＳ２、およびＴ７からなる群から選択されるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
ペプチドまたはポリペプチドがｐＩＩＩ融合タンパク質として表示される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ペプチドまたはポリペプチドがｐＩＩＩのドメイン１に対してアミノ末端である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸がファージ増幅、細胞増殖、またはポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されるものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記レパートリーが免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが重鎖可変ドメインである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記重鎖可変ドメインがヒトまたはヒト化重鎖可変ドメインである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記軽鎖可変ドメインがヒトまたはヒト化軽鎖可変ドメインである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
標的リガンドを高親和性で結合するペプチドまたはポリペプチドを、ペプチドまたはポリペプチドの前記レパートリーから選択するための、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
プロテアーゼを約１００μｇ／ｍｌで使用し、組み合わせたレパートリーおよびプロテアーゼを約３７℃で少なくとも約１時間インキュベートする、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
それぞれの前記ポリペプチドが標的を結合するペプチドであり、
レパートリーがペプチドのレパートリーを表示するファージ表示系によって提供され、
インキュベートする工程において、ファージが、細菌プロテアーゼ（第１プロテアーゼ）発現に適した条件下で細菌において発現され、
組み合わせる工程において、ファージ表示系が、第２のプロテアーゼの活性に適した条件下でトリプシンおよびキモトリプシンから選択される第２のプロテアーゼと組み合わされ、および
回収する工程において、前記標的リガンドを結合するペプチドを含むポリペプチドを表示するファージを回収する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法を実施することを含む、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーの製造方法であって、前記回収する工程において、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収し、それによりプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーが製造される、方法。
【請求項４０】
プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーがナイーブレパートリーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第３プロテアーゼと、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーと、第３プロテアーゼの活性に適した条件下で組み合わせること、および
少なくとも一つの所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを回収し、それにより第３プロテアーゼに対して耐性である少なくとも一つのペプチドまたはポリペプチドが選択されることをさらに含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
第３のプロテアーゼが請求項１〜４１のいずれか一項に定義されたとおりである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記レパートリーにおける、プロテアーゼのペプチドまたはポリペプチドに対する比（モル／モルに基づいて）が８，０００〜８０，０００（プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチド）である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記レパートリーにおいてプロテアーゼのペプチドまたはポリペプチドに対する比（重量／重量に基づく）が１，６００〜１６０，０００（プロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチド）である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法によって選択可能であるかまたは選択される、単離されたプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法によって選択可能であるかまたは選択される、単離されたプロテアーゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４７】
糖尿病を治療および／または予防するために患者に投与するための、（ｉ）約１０μｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼ、（ｉｉ）約２０℃〜約４０℃、および（ｉｉｉ）少なくとも約３０分間の条件下（例えば、１００μｇ／ｍｌのプロテアーゼ、３７℃で少なくとも１時間の条件下）で、プロテアーゼとともにインキュベートする場合に、トリプシンおよびキモトリプシンから選択される一以上のプロテアーゼに対して耐性である、単離されたＧＬＰ−１受容体アゴニスト。
【請求項４８】
患者に対して注射により投与するための、請求項４７に記載のアゴニスト。
【請求項４９】
請求項４５もしくは４６に記載のプロテアーゼ耐性ペプチド、ポリペプチド、もしくは可変ドメインまたは請求項４７もしくは４８に記載のアゴニストをコードする単離された核酸。
【請求項５０】
請求項４５もしくは４６に記載のプロテアーゼ耐性ペプチド、ポリペプチド、もしくは可変ドメインまたは請求項４７もしくは４８に記載のアゴニストをコードする、組換え核酸。
【請求項５１】
請求項４９または５０に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項５２】
請求項５１に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項５３】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法によって選択可能であるかまたは選択されるプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドあるいは請求項４７〜４８のいずれか一項に記載のアゴニストの製造方法であって、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストをコードする組換え核酸を含む宿主細胞を、発現に適した条件下で維持することを含み、これによってプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストが製造される、方法。
【請求項５４】
薬物に使用するための、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法によって選択可能であるかまたは選択される、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項５５】
疾患を治療および／または予防するための薬剤を製造するための、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法によって選択可能であるかまたは選択される、プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項５６】
疾患の治療方法であって、有効量の、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法によって選択可能であるかまたは選択されるプロテアーゼ耐性ペプチド、ポリペプチド、または可変ドメインを、それを必要とする被験者に対して投与することを含む、方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図５Ｆ】

【図６】


【図４】

【図７】

【公表番号】特表２０１２−５１０８０３（Ｐ２０１２−５１０８０３Ａ）
【公表日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３９０３４（Ｐ２０１１−５３９０３４）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６６３９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６３８１８
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ　グループ　リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ　ＧＲＯＵＰ　ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ　Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ　Ａｖｅｎｕｅ　Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ　ＵＢ６　０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ　Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】