プロテインＡ選択性を有する抗体
黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合するモノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第１１／５６２，７５９号（２００６年１１月２２日出願）の利益を主張し、この開示内容全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は、ヒトにおいて様々な化膿性（膿形成性）感染症及び中毒症の原因となるグラム陽性菌である。この菌は、表皮の病変（おでき、ものもらい及びせつ腫症）、より重篤な感染症（肺炎、乳腺炎、静脈炎、髄膜炎、及び尿路感染症など）、及び深在性の感染症（骨髄炎及び心内膜炎など）の原因となる。黄色ブドウ球菌は、手術創の院内（病院で起こる）感染及び体内に留置する医療機器に関連する感染症の主な原因である。黄色ブドウ球菌は、食品内へのエンテロトキシン放出による食中毒、及び血流中へのスーパー抗原放出による毒素性ショック症候群を引き起こす。
【０００３】
黄色ブドウ球菌は、宿主防御機能を妨げる多くの因子を産生する。そのような因子の１つがプロテインＡである。プロテインＡは、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する黄色ブドウ球菌表面タンパク質である。血清中で、黄色ブドウ球菌は、菌体表面がオプソニン作用及び食作用を阻害し、その表面上において、ある方向でＩｇＧ分子に結合する。プロテインＡを欠く黄色ブドウ球菌の変異体は、インビトロでより効率よく食菌され、感染モデルにおいて病原性が減弱している。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４、並びにマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３に高い親和性で結合する。プロテインＡは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥに中程度の親和性で結合する。それは、ヒトＩｇＧ３又はＩｇＤには結合せず、マウスＩｇＭ、ＩｇＡ又はＩｇＥにも結合しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントを包含し、そのモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体７６の黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合を阻害し、モノクローナル抗体７６が、米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される。
【０００５】
本発明はまた、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントも包含し、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１により産生されるモノクローナル抗体７６により認識される黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡの同一エピトープに結合する。
【０００６】
更に本発明に包含されるのは、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントであり、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントは更に、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖可変領域のポリペプチド配列を更に含む。
【０００７】
本発明はまた、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントも包含し、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖可変領域ポリペプチド配列を含む。
【０００８】
本発明はまた、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントも包含し、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される、モノクローナル抗体７６の重鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントは更に、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域を更に含む。
【０００９】
本発明はまた、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントも包含し、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態では、その抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、又はＦｖフラグメントである。
【００１１】
本発明はまた、１つ以上の本発明のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを有する組成物も包含する。
【００１２】
本発明はまた、１つ以上の本発明のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを有するキットも包含する。
【００１３】
更に本発明に含まれるのは、本発明のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する形質転換Ｂ細胞株である。
【００１４】
本発明はまた、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントも包含する。
【００１５】
本発明はまた、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントを含む組成物も包含する。
【００１６】
本発明はまた、培養細胞系統保存機関（the Type Culture Collection）に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１、及びその子孫も包含する。
【００１７】
本発明はまた、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域のコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドも包含する。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の重鎖のコード配列を含む。
【００１８】
本発明はまた、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドも包含する。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のコード配列を含む。
【００１９】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又は１つ以上の相補的決定領域をコードする核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチドを包含する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも包含する。
【００２１】
更に本発明に含まれるのは、本発明の発現ベクターを有する宿主細胞である。
【００２２】
本発明はまた、実質的に精製された抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する方法も包含し、その方法は、抗体ポリペプチド、又はその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で、本発明の形質転換Ｂ細胞株を増殖させる工程と、発現した抗体ポリペプチド、又はその抗原結合性フラグメントを収集する工程とを含む。
【００２３】
本発明はまた、実質的に精製された抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する方法も包含し、その方法は、抗体、又はその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で、本発明の宿主細胞を増殖させる工程と、発現した抗体、又はその抗原結合性フラグメントを収集する工程とを含む。
【００２４】
本発明はまた、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体のスクリーニング方法も包含し、その方法は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程と、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を更に選択する工程とを含む。いくつかの実施形態では、単離された黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程は、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合し続ける抗体を選択する工程を含む。いくつかの実施形態では、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択する工程は、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、無傷の黄色ブドウ球菌に結合し続ける抗体を選択する工程を含む。いくつかの実施形態では、単離された黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程には、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合し続ける抗体を選択する工程を含み、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択する工程には、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、無傷の黄色ブドウ球菌に結合し続ける抗体を選択する工程を含む。本発明はまた、これらの黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体のスクリーニング方法により選択される、抗体、又はその抗体由来の抗原結合性フラグメントも包含する。
【００２５】
本発明はまた、高い比活性で標的抗原に結合する抗体のスクリーニング方法も包含し、その方法は、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で標的抗原を持つ候補抗体に接触する工程を含み、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で標的抗原に結合し続ける候補抗体は、高い比活性で標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原は受容体結合分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子は、プロテインＡ、プロテインＧ、又はＦｃ受容体である。本発明はまた、これらの高い比活性で標的抗原に結合する抗体のスクリーニング方法により選択される、抗体、又はその抗体由来の抗原結合性フラグメントも包含する。
【００２６】
特に指定されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ」は、同じ意味で使用され、「１つ以上」を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、黄色ブドウ球菌（本明細書では、「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」又は「Ｓｔａｐｈ Ａ」とも呼ぶ）のプロテインＡに結合するモノクローナル抗体に関する。このような抗体は、例えば、生体サンプルにおける黄色ブドウ球菌の検出に有用である。更に具体的には、本発明は、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントに関し、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１により産生されるモノクローナル抗体７６の免疫学的結合特性を示す。マウスモノクローナル抗体７６は、プロテインＡで免疫されたマウスから単離されたマウスＩｇＧ２Ａ、κ抗体である。ブダペスト条約に従い、モノクローナル抗体７６を産生するハイブリドーマ３５８Ａ７６．１は、２００６年１０月１８日、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）の保管所（１０８０１、ユニバーシティー・ブルヴァード（University Boulevard）、マナッサス（Manassas）、バージニア州２０１１０−２２０９）に寄託され、特許寄託番号ＰＴＡ−７９３８（本明細書では、受入番号ＰＴＡ−７９３８とも呼ぶ）が付与された。ハイブリドーマ３５８Ａ７６．１は、本明細書は「Ｍａｂ ７６」と呼ばれる抗体を産生し、Ｍａｂ ７６は、本明細書は「Ｍａｂ７６」、「Ｍａｂ−７６」、「ＭＡｂ−７６」、「モノクローナル７６」、「モノクローナル抗体７６」、「７６」、「Ｍ７６」、又は「Ｍ ７６」とも呼ばれ、本明細書では全て米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２００６年１０月１８日に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株より産生される免疫グロブリンを意味し、同じ意味で使用される。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡの特定のエピトープと免疫反応又は結合することができる１種類の抗原結合部位のみを含む抗体分子の集団を意味する。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、典型的に黄色ブドウ球菌のプロテインＡの特定のエピトープに対して単一の結合親和性を示す。本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」又は「モノクローナル抗体（monoclonal antibodies）」は、同じ意味で使用される。
【００２９】
本発明は、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１により産生されるモノクローナル抗体を包含する。更に本発明に含まれるのは、このハイブリドーマの子孫又は類縁細胞から産生されるモノクローナル抗体及びこのハイブリドーマと同じ又は類似する細胞より産生されるモノクローナル抗体である。
【００３０】
本発明は、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６の黄色ブドウ球菌のプロテインＡへの結合を阻害するモノクローナル抗体を包含する。本発明は、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６に認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡのエピトープと同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体を包含する。モノクローナル抗体による、黄色ブドウ球菌のプロテインＡへのモノクローナル抗体Ｍａｂ ７６の結合阻害を判定する方法、及びモノクローナル抗体による、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６に認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡのエピトープと同一のエピトープへの結合を判定する方法は、免疫学の当業者には周知である。例えば、実施例５に記載されるような方法を用いてもよいが、これらには限定されない。本発明のモノクローナル抗体は、既存の種々ポリクローナル抗プロテインＡ抗血清と比べて、プロテインＡへの結合が改善されていることを示すことができる。
【００３１】
完全な抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）を有する。ＶＨ及びＶＬ領域は「相補的決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができ、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、明確に定義されている（カバット（Kabat）、Ｅ．Ａ．ら著、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、第５版、米国保健社会福祉省（U.S. Department of Health and Human Services）、ＮＩＨ出版（NIH Publication）、番号９１−３２４２、１９９１年、及びショティア（Chothia）ら著、分子細胞学雑誌（J. Mol. Biol.）１９８７年、第１９６号、９０１〜９１７頁参照）。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。
【００３２】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一の重鎖を有するモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一の軽鎖を有するモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一の重鎖及び同一の軽鎖を有するモノクローナル抗体を含む。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対するＭａｂ ７６の結合を阻害できる。このようなモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。本発明はまた、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合には実質的に影響しない重鎖及び／又は軽鎖中の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、若しくはそれ以上のアミノ酸置換を含む、このようなモノクローナル抗体も包含する。
【００３３】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一のＶＨドメインを有するモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一のＶＬドメインを有するモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一のＶＨドメイン及び同一のＶＬドメインを有するモノクローナル抗体を含む。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対するＭａｂ ７６の結合を阻害できる。このようなモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。本発明はまた、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合には実質的に影響しないＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン中の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のアミノ酸置換を含む、このようなモノクローナル抗体も包含する。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、Ｍａｂ ７６のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、若しくはＭａｂ ７６のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、及び／又はＭａｂ ７６のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、Ｍａｂ ７６のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、若しくはＭａｂ ７６のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域を有するモノクローナル抗体を含む。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対するＭａｂ ７６の結合を阻害できる。このようなモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。本発明のモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合には実質的に影響しない１つ以上のＣＤＲ領域中の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のアミノ酸置換を含む、このようなモノクローナル抗体を更に含む。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、又はハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域ののアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含む。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対するＭａｂ ７６の結合を阻害できる。このようなモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、又はハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有する抗体を含む。このような抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このような抗体は、モノクローナル抗体７６に認識される黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡの同一のエピトープに結合する通りに、黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。
【００３７】
本明細書で使用するとき、２つのポリペプチド間の「配列の同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で扱うとき、任意の特定のポリペプチドは、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一かどうかにはかかわらず、当該技術分野において既知の方法、及びこれには限定されないがベストフィット（BESTFIT）プログラム（ウィスコンシン・シークエンス・アナリシス・パッケージ（Wisconsin Sequence Analysis Package）、ユニックス用バージョン８、ジェネティクス・コンピュータ・グループ社（Genetics Computer Group）、ユニバーシティ・リサーチ・パーク（University Research Park）、５７５、サイエンスドライブ（Science Drive）、マディソン（Madison）、ウィスコンシン州５３７１１）などのコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定できる。ベストフィット（BESTFIT）は、スミス（Smith）及びウォーターマン（Waterman）著、「応用数学の進歩（Advances in Applied Mathematics）」、第２巻、４８２〜４８９頁、１９８１年、の局所的相同性アルゴリズムを用い、２配列間で最も相同するセグメントを発見する。ベストフィット（BESTFIT）又は任意のその他の配列比較プログラムを用い、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と９５％同一かどうかを決定するとき、当然のことながら、同一性の割合が参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、及び相同性の相違が参照配列中の全アミノ酸数の５％まで可能となるように、パラメーターを設定する。
【００３８】
「結合親和性」又は「親和結合」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原又は抗原性エピトープ）との間の非共有結合性相互作用の強さの総和を意味する。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は解離定数（Ｋｄ）で示され、この定数は一般に、例えば、ビアコア社（BIAcore Inc.）（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway））から市販されるビアコア・バイオセンサー（BIAcore biosensor）を用いて、当該技術分野において既知の方法で決定できる。本発明の抗体を、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対する結合親和性という点で述べることができる。本発明の抗体は、解離定数ＫＤが、５×１０−６Ｍ以下、１０−６Ｍ以下、５×１０−７Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、５×１０−１３Ｍ以下、１０−１３Ｍ以下、５×１０−１４Ｍ以下、１０−１４Ｍ以下、５×１０−１５Ｍ以下、又は１０−１５Ｍ以下である結合親和性を有する抗体を含む。
【００３９】
本発明に更に含まれるものとして、抗原結合性フラグメントとも呼ばれる様々な抗体フラグメントが挙げられ、これらは、一般的には無傷の抗体の抗原結合部位を含む、完全な抗体の一部のみを含み、それにより抗原結合能が保持される。無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理によって、フラグメントを得ることができる。組換え手段によって、フラグメントを得ることもできる。抗体フラグメントの例として、例えば、タンパク質分解及び／又はジスルフィド架橋の還元により産生されるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、ｄＡＢ、及びＦ（ａｂ’）２フラグメント並びにＦａｂ発現ライブラリーから産生されるフラグメントが挙げられる。このような抗体フラグメントを、当該技術分野において周知の技術によって生成することができる。本発明の抗体は、可変領域（１つ又は複数）を単独で又はヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／又はＦｃドメインの全て又は一部と組合わせて含むことができる。用語「抗原結合性フラグメント」は、抗原に結合する、又は抗原結合（すなわち、特異結合）において無傷な抗体（すなわち、そのフラグメントを派生した無傷な抗体）と競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチドフラグメントを意味する。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体として、ヒト化抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、Ｆａｂ発現ライブラリーから産生される直鎖抗体フラグメント、ＶＬドメイン又はＶＨドメイン全体を含むフラグメント、細胞内で産生された抗体（すなわち、細胞内抗体）、及びこれらの抗原結合抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明のモノクローナル抗体は、任意のアイソタイプであることができる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってもよい。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってもよい。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ３であってもよい。本発明において、任意の重鎖は、κ又はλ型の軽鎖と対形成してもよい。
【００４２】
モノクローナル抗体は、当業者には精通される様々な手法で得ることができる。例えば、所望の抗原で免疫された動物由来の脾臓細胞を、一般に骨髄腫細胞と融合することにより不死化させる（例えば、ケーラー（Kohler）及びミルスタイン（Milstein）著、欧州免疫学雑誌（Eur. J. Immunol.）、第６号、５１１〜５１９頁、１９７６年、Ｊ．ゴッディング（J. Goding）著「モノクローナル抗体：原理と実践（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice）」、アカデミックプレス（Academic Press）、５９〜１０３頁、１９８６年、及びハーロー（Harlow）ら著、「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、７２６頁、コールド・スプリング・ハーバー出版（Cold Spring Harbor Pub.）、１９８８年を参照）。モノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の手法で、ハイブリドーマから単離及び精製することができる。モノクローナル抗体を産生する形質転換Ｂ細胞株を作るその他既知の方法を利用してもよい。本発明のモノクローナル抗体を、組み換えＤＮＡ技術により生成、例えば、ファージディスプレイ法又はコンビナトリアルな方法で生成してもよい。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９１／１７２７１号、国際公開第９２／２０７９１号、国際公開第９２／１５６７９号、国際公開第９３／０１２８８号、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／０９６９０号、又は国際公開第９０／０２８０９号を参照のこと。このような方法を、ヒトモノクローナル抗体の産生に使用できる。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「単離物」は、その本来の環境（例えば、天然物の場合は自然環境）から取り出され、それにより、その自然状態から「人の手で」変更された物質を意味する。
【００４４】
治療的に有用な抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体由来であってもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス（又は他の種の）免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から１つ以上のＣＤＲをヒト可変ドメイン内に導入し、ヒト残基をマウスの相当するフレームワーク領域に置換することにより産生される。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用により、マウス定常部の免疫原性に付随する問題の可能性を排除する。ヒト化モノクローナル抗体の作製技術は、例えば、ジョーンズ（Jones）ら著、ネイチャー（Nature）、第３２１号、５２２頁、１９８６年及びシンガー（Singer）ら著、免疫学雑誌（J. Immunol.）、第１５０号、２８４４頁、１９９３年に見られる。本発明のヒト化モノクローナル抗体の定常部は、任意のアイソタイプに属するヒト免疫グロブリンの定常部とすることができる。例えば、ヒトＩｇＧの定常部としてもよい。ヒト免疫グロブリン由来の定常部のフレームワーク領域は、特に限定されない。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体にはキメラ抗体を含む。キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分を持つ。例えば、キメラ抗体は、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物学的特異性を有するヒト抗体分子の遺伝子と継ぎ合わせることにより得られる。例えば、タケダ（Takeda）ら著、ネイチャー（Nature）、第３１４号、５４４〜５４６頁、１９８５年を参照のこと。
【００４６】
本発明は、二重特異性又は二機能性抗体を包含する。二重特異性又は二機能性抗体は、２本の異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦ（ａｂ’）フラグメントの連結などの様々な方法で産生できる。例えば、ソンシビライ（Songsivilai）及びラハマン（Lachmann）著、臨床及び実験免疫学（Clin. Exp. Immunol.）、第７９号、３１５〜３２１頁、１９９０年、及びコステルニー（Kostelny）ら著、免疫学雑誌（J. Immunol.）、第１４８号、１５４７〜１５５３頁、１９９２年を参照のこと。更に、二重特異性抗体を「ダイアボディ」（ホリガー（Holliger）ら著、米国科学アカデミー紀要（PNAS USA）、第９０号、６４４４〜６４４８頁、１９９３年）、又は「ヤヌシンズ（Janusins）」（トラウネッカー（Traunecker）ら著、欧州分子生物学機構雑誌（EMBO J.）、第１０号、ｐ．３６５５〜３６５９頁、１９９１年、及びトラウネッカー（Traunecker）ら著、国際癌雑誌増刊（Int. J. Cancer Suppl.）、第７号、５１〜５２頁、１９９２年）のように作製することもできる。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体を、動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ウマ、ニワトリ、又はターキーを含むが、これらに限定されない）による産生、化学合成、又は組換え発現させることができる。本発明のモノクローナル抗体を、当該技術分野において既知の免疫グロブリン分子の精製法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又は任意のその他の標準的なタンパク質精製技術により精製することができる。更に、本発明の抗体又はそのフラグメントを、本明細書に記載する異種ポリペプチド配列と融合し、ないしは当該技術分野において既知の別の方法で、精製を容易にすることができる。
【００４８】
本発明のモノクローナル抗体の免疫特異的結合について、本明細書に記載する方法、及び任意の好適な当該技術分野において既知の方法により評価することができる。利用可能なイムノアッセイとして、ビアコア（BIAcore）分析、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、免疫蛍光法、免疫細胞化学法、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの手法を用いた、競合的及び非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらには限定されない。このようなアッセイは慣行法であり、当該技術分野において周知である（例えば、アウスベル（Ausubel）ら編、「分子生物学カレントプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、１巻、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons, Inc.）、ニューヨーク、１９９４年、参照）。
【００４９】
本発明のモノクローナル抗体は、任意の種類の分子と抗体との共有結合により修飾又は複合化された、抗体誘導体を包含する。このような抗体誘導体として、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的開裂、又は細胞内配位子又は他のタンパク質への結合により修飾されている抗体が挙げられる。特異的な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、及びツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない、既知の手法により任意の多くの化学修飾を実施可能である。更に、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有できる。
【００５０】
更に本発明に包含されるのは、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、形質転換Ｂ細胞株、及び宿主細胞、これらハイブリドーマ、形質転換Ｂ細胞株、及び宿主細胞の子孫又は類縁細胞、並びに同じ又は類似するハイブリドーマ、形質転換Ｂ細胞株、及び宿主細胞である。
【００５１】
本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を持つヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド分子に関する。本発明はまた、本発明の抗体、又はその補体をコードするヌクレオチド配列と高い厳密性でハイブリッド形成するポリヌクレオチドも含む。本明細書で使用するとき、「厳密な条件」とは、第１のポリヌクレオチド分子が、フィルターに結合した第２のポリヌクレオチド分子と、６５℃で、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中、ハイブリッド形成し、その後、４２℃で、０．２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄しても結合し続ける性能を指す（アウスベル（Ausubel）ら編、「分子生物学カレントプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、１巻、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ社（Green Publishing Associates, Inc.）及びジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons, Inc.）、ニューヨーク、ｐ．２．１０．３、１９８９年、参照）。更に本発明に包含されるのは、本発明のモノクローナル抗体の１つ以上のＣＤＲ領域又は重鎖及び／若しくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドである。免疫グロブリン可変ドメイン及び定常部のクローニングと配列決定の一般的手法はよく知られている。例えば、オーランディ（Orlandi）ら著、米国科学アカデミー紀要（Proc. Nat’l Acad. Sci. USA）、第８６号、３８３３頁、１９８９年、を参照のこと。
【００５２】
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む組み換えベクターも包含する。ベクターを、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、又はファージ形状とすることができる。適切なＤＮＡ配列を、様々な方法でベクター内に挿入できる。一般的には、ベクター内の適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（１個所又は複数個所）に、当該技術分野において既知の方法でＤＮＡ配列を挿入する。このような方法は、当業者の目的の範囲内とみなされる。多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に周知であり、市販されている。一例として、以下のベクターを示す。細菌ベクターとして、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｓｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５が挙げられる。真核生物ベクターとして、例えば、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが挙げられる。しかし、その他の任意のプラスミド又はベクターを使用できる。
【００５３】
本発明は、上述のベクターを含む宿主細胞も包含する。宿主細胞を、哺乳類若しくは昆虫類の細胞などの高等真核細胞、又は酵母細胞などの下等真核細胞とすることができる。あるいは、宿主細胞を、細菌細胞、又は植物細胞などの原核細胞とすることができる。宿主細胞内へのベクター構造の導入を、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介するトランスフェクション、又は電気穿孔法などの任意の好適な手法で行うことができる。（デーヴィス（Davis, L.）ら著、「分子生物学基礎的実験法（Basic Methods in Molecular Biology）」、１９８６年）。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体は、適切なプロモーターの制御下において、哺乳類細胞、酵母、細菌、又はその他の細胞内で発現させることができる。無細胞翻訳系を、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いるこれらタンパク質の産生に利用することもできる。原核生物宿主及び真核生物宿主と用いるのに適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、サムブルック（Sambrook）ら著、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、１９８９年、に記載されている。
【００５５】
更に本発明に包含されるのは、本発明のモノクローナル抗体由来の１つ以上の超可変領域を発現するファージディスプレイライブラリー、及びこのようなファージディスプレイライブラリーから得られるクローンである。ファージディスプレイライブラリーは、抗体由来分子の産生に用いられる。抗体の抗原結合可変ドメインをコードする遺伝子部分を、バクテリオファージのコートタンパク質をコードする遺伝子に融合する。このような遺伝子融合体を含むバクテリオファージを用いて細菌に感染させると、生じたファージ粒子は、抗原結合ドメインがバクテリオファージ外部に提示される状態で、抗体融合タンパク質を発現する外殻を有する。ファージディスプレイライブラリーを、例えば、ニューイングランド・バイオラボ社（New England Biolabs Inc.）（マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ipswich））から市販されるＰｈ．Ｄ．（商標）−７ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（カタログ番号Ｅ８１００Ｓ）又はＰｈ．Ｄ．（商標）−１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（カタログ番号Ｅ８１１０Ｓ）を用いて調製できる。スミス（Smith）及びペトレンコ（Petrenko）著、「化学総説（Chem. Rev.）」、９７、３９１〜４１０頁、１９９７年も参照のこと。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体を、当該技術分野において周知の手法により、直接的又は間接的に検出可能なマーカーに結合してもよい。検出可能なマーカーは、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段により検出可能な剤である。有用な検出可能なマーカーとして、蛍光染料、化学発光化合物、放射性同位元素、高電子密度試薬、酵素、着色粒子、ビオチン、又はジゴキシゲニン（dioxigenin）が挙げられるがこれらには限定されない。多くの場合、検出可能なマーカーは、放射活性、蛍光、色、又は酵素活性などの測定可能な信号を発する。検出可能な剤を結合した抗体を、診断又は治療目的で用いてもよい。検出可能な剤の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、放射性物質、様々な陽電子放出断層撮影法を用いる陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、直接的に、又は例えば、当該技術分野において既知のリンカーなどの仲介物を介して間接的に、当該技術分野において既知の手法を用いて抗体に共役又は結合できる。例えば、診断利用のための抗体への金属イオンの結合について記載される、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光性物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド及びフィリコエリトリンが挙げられ、発光性物質の例として、ルミノールが挙げられる。生物発光性物質の例として、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、及び好適な放射性物質の例として、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、及び９７Ｒｕが挙げられる。このような治療用部分を抗体に結合する手法は周知である。
【００５７】
更に本発明に包含されるのは、本明細書に記載される１つ以上の単離されたモノクローナル抗体を含む組成物である。組成物はまた、例えば、ｐＨを許容範囲に保つのに役立つ緩衝剤、又は微生物の増殖を抑制する防腐剤を含んでもよい。組成物は、例えば、キャリア、賦形剤、安定剤、キレート化剤、塩、又は抗菌剤を含んでもよい。許容可能なキャリア、賦形剤、安定剤、キレート化剤、塩、防腐剤、緩衝剤、若しくは抗菌剤として、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤、アジ化ナトリウム、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなどの防腐剤、ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは非特異的免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドン（olyvinylpyrrolidone）などの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンなどの単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、並びに／又はツイン（TWEEN）、プルロニック（PLURONICS）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらには限定されない。本明細書で使用するとき、組成物は、動物をプロテインＡ又は黄色ブドウ球菌で免疫することにより得られるポリクローナル抗血清ではない。
【００５８】
本発明のモノクローナル抗体を、インビトロ及びインビボにおける診断的及び治療的方法の両方で用いることができる。更に本発明に包含されるのは、そのようなインビトロ及びインビボの診断的及び治療的方法である。
【００５９】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を含むキットも提供する。キットは、１つ以上の本発明のモノクローナル抗体で満たされる、１つ以上の容器を含むことができる。更に、緩衝液及び溶液など、本発明の実施に必要なその他の試薬を含むことができるキットを含んでもよい。このような容器（１つ又は複数）に任意に付属するものとして、注意事項や説明書が挙げられる。本明細書で使用するとき、「梱包材料」という用語は、キットの内容物を収容するのに用いる１つ以上の物理的構造体を意味する。梱包材料は、周知の方法で組み立てられ、好ましくは、無菌の、汚染物質を含まない環境を提供する。本明細書で使用するとき、「包装」という用語は、ポリペプチドを定められた期限内維持することができる、ガラス、プラスチック、紙、金属箔などの固体マトリックス又は固体材料を意味する。
【００６０】
本発明は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程と、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択する工程の両方により、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体のスクリーニング方法を包含する。これらの選択工程を、任意の順序で行ってもよい。例えば、１つの方法として、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択し、その後に無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択してもよい。あるいは、１つの方法として、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択し、その後に黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択してもよい。追加的な選択又はスクリーニング工程を含んでもよい。単離された黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体の選択工程及び無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体の選択工程を、免疫学の技術分野における当業者が利用可能な様々な任意の条件下で行ってもよい。例えば、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合し続ける抗体の選択工程及び／又は無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体の選択工程を、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で行ってもよい。約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液と同様のｐＨ及びイオン強度を有するその他の緩衝液を使用してもよい。
【００６１】
本発明は、高い比活性で標的抗原に結合する抗体のスクリーニング方法を包含し、その方法は、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で標的抗原を持つ候補抗体に接触する工程を含み、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で標的抗原に結合し続ける候補抗体は、高い比活性で標的抗原に結合する。約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液と同様のｐＨ及びイオン強度を有するその他の緩衝液を使用してもよい。追加的な選択又はスクリーニング工程を含んでよい。場合によっては、標的抗原は受容体結合分子であってもよい。場合によっては、標的抗原は、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子であってもよい。そのような、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子の例として、プロテインＡ、プロテインＧ、並びに免疫グロブリンＦｃ部分及びＦｃ受容体に結合するその他の細菌タンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。Ｆｃ受容体は、マクロファージ、好中球、肥満細胞等の造血細胞上の受容体であり、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する。Ｆｃ受容体の例として、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ−Ａ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ２（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ１（ＣＤ３２）、ＦｃεＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃαＲＩＦｃａＲＩが挙げられる。
【００６２】
本発明を以下の実施例によって例示する。特定の実施例、材料、量、及び手順が本明細書で記載された本発明の範囲及び趣旨により広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
抗プロテインＡモノクローナル抗体の産生
免疫手順
この手順では、５匹の雌のスイス・ウェブスター（Swiss Webster）マウス（２．６月齢）を用いた。免疫抗原として用いたプロテインＡ抗原は、インビトロジェン社（Invitrogen, Inc.）（カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad））の関連会社であるザイメッド・ラボラトリーズ（Zymed Laboratories）から入手した。スクリーニングプロセスでは、各追加免疫２週間後にマウスから採血し、以下に記載する手順に従って、非プール試料の抗プロテインＡ抗体を確認した。表１に免疫処理手順を示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
融合手順
融合用に選択されたマウスを、上記免疫で用いた抗原と同用量で追加免疫した。上記表１に示されるように、脾臓摘出及び細胞融合の前４日間にわたり、追加免疫を行った。
【００６６】
融合日に、選択したマウスを屠殺し、脾臓を無菌的に摘出した。ピンセットを用いて脾臓を細分化し、ふるいで漉した。細胞を、ＩＭＤＭ培地（Ｌ−グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むイスコフ（Iscove）改変ＤＭＥＭ、セルグロ（Cellgro）カタログ番号１０−０１６−ＣＭ、メディアテック社（Mediatech, Inc.）（バージニア州ハーンドン（Herndon）））を用いて２回洗浄し、血球計数器を用いてカウントした。マウス骨髄腫細胞株Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３を、対数増殖期で静置培養から取り出した。細胞をＩＭＤＭで２回洗浄し、血球計数器を用いてカウントした。骨髄腫細胞及び脾臓細胞を１：５の割合で混合し、遠心分離した。上清を捨てた。試験管の底部を軽くたたいて、細胞沈殿物を穏やかに再懸濁した。１ｍＬのＰＥＧ（ＭＷ １５００）５０％溶液を、３０秒間かけて（１滴ずつ）加えた。ピペットを用いて、沈殿物を３０秒間穏やかに混合した。生じた細胞懸濁液を、更に３０秒間静置した。１ミリリットル（ｍＬ）のＩＭＤＭを１分間かけて加え、続いて、２ｍＬのＩＭＤＭを２分間かけて１滴ずつ加えた。２分間の直後に、更に５ｍＬのＩＭＤＭを加えた。生じた細胞懸濁液を５分間静置した。
【００６７】
細胞懸濁液を室温、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿物をＨＡＴ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．６％２−メルカプトエタノール（０．０４％溶液）、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、及び１０％オリジェン（Origen）成長因子を含有するＩＭＤＭ）に再懸濁した。細胞を、ミリリットルあたり１×１０６個となるように再懸濁した。細胞懸濁液を、９６穴プレートにプレーティングした。２００マイクロリットル（又は約２×１０５個）を各ウェルに添加した。９６穴プレートを、１００％湿度７％ＣＯ２雰囲気下３７℃でインキュベートした。
【００６８】
融合７日後、培地を除去し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．６％２−メルカプトエタノール保存液（０．０４％）、ヒポキサンチン、及びチミジンを含有するＩＭＤＭと交換した。
【００６９】
ハイブリドーマ増殖手順
融合１４日後、生育中のハイブリドーマコロニーを有するウェルより上清を採取した。各ウェルの上清の容量は約１５０〜２００マイクロリットルであった。この上清を、血清のスクリーニングに用いたものと同様の試験法（以下に記載）を用いて特異抗体に関して試験した。
【００７０】
陽性のハイブリドーマコロニーを９６穴プレートから２４穴プレートに移し、２０％ＦＢＳ、１０％オリジェン（Origen）クローニング因子、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び０．６％２−メルカプトエタノール保存液（０．０４％）を含有するＩＭＤＭ １．８ｍＬを各ウェルに添加した。９６穴プレートについて上述した方法で、２４穴プレートをインキュベートした。５日後、２４穴プレートの上清について特異抗体の存在確認試験を行った。
【００７１】
陽性のウェルの細胞を、Ｔ−２５及びＴ−７５フラスコ（コーニングフラスコ（Corning Flask）、コーニング（Corning）社、ニューヨーク）内で増殖させた。Ｔ−７５フラスコの細胞を５本のバイアル瓶（各１ｍＬ）にとり、液体窒素で凍結した。陽性のウェルの細胞を限界希釈によりクローニング、すなわち、ハイブリドーマ細胞をウェルあたり０．２５個の細胞密度で９６穴プレートにプレーティングした。生育中のコロニーを、ハイブリドーマの最初の選択に用いたものと同様の試験法を用いて１０〜１４日後に試験した。サブクローン細胞を２４穴プレートで増殖させ、続いてＴ−２５、Ｔ−７５及びＴ−１６２フラスコで増殖させた。サブクローン細胞のバイアル瓶を上記方法で凍結した。
【００７２】
（実施例２）
抗プロテインＡ抗体のスクリーニングアッセイ
第１段階−プロテインＡへの結合
特に明記しない限り全ての手順を室温で行った。プロテインＡ及びヤギ抗マウス抗体（γ鎖特異的、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合）は、ザイメッド・ラボラトリーズ（Zymed Laboratories）（インビトロジェン社（Invitrogen, Inc.）（カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad）））から入手した。西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素活性の基質色素であるＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidene））は、ネオジェン社（Neogen Corporation）（ミシガン州ランシング（Lansing））から入手した。
【００７３】
特に記載のない限り、ＥＬＩＳＡアッセイにおける洗浄手順は全て、１回あたりの洗浄あたり２００マイクロリットル（μＬ）の３回の連続洗浄を含み、洗浄は全てＰＢＳＴ（０．０５％ｗ／ｖツイン（Tween）２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４））で行った。
【００７４】
標的抗原（プロテインＡ１μｇ／ｍＬ炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）懸濁液、１００μＬ）で、ＥＬＩＳＡプレート（イムロン（Immulon）２、ダイネックス・テクノロジーズ社（Dynex Technologies, Inc.）（バージニア州シャンティリー（Chantilly）））の各ウェルを、３７℃で１時間コーティングした。コーティング工程後、ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％ｗ／ｖツイン（TWEEN）２０を含有するリン酸緩衝生理食塩液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４））で２回洗浄した。
【００７５】
標的抗原によるウェルコーティングの最後の洗浄液を捨てた後、ＥＬＩＳＡプレートの非特異的タンパク質結合部位がブロックされた。２％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴ（ブロット（blotto）溶液）２００マイクロリットルを各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ブロット溶液を捨てた。抗体溶液（１００μＬ／ウェル、酢酸緩衝液（０．１Ｍ酢酸及び０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）で希釈）を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１〜２時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。
【００７６】
ヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ複合体をブロット溶液で適当に希釈した溶液１００マイクロリットルを各ウェルに添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートした。インキュベート後、複合体溶液を除去し、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、１００μＬのＴＭＢ（Ｋブルー（Kblue）、ネオジェン（Neogen）カタログ番号３００１９９）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１〜１０分間放置して青色の発色を観察した。各ウェルの比ＨＲＰ酵素活性を、６５０ｎｍの光源波長の吸光度によりプレートリーダーで測定した。スクリーニングした１０００個超のハイブリドーマ細胞株のうち、プロテインＡ結合活性が最も高い抗体を産生する８個の細胞株を、更なるスクリーニング用に選択した。
【００７７】
第２段階−黄色ブドウ球菌細胞への結合
より高い親和性のプロテインＡ結合抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の無傷細胞への結合能を試験した。本実施例で用いた菌株、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）及び表皮ブドウ球菌（ＡＴＣＣ １２２２８）は、米国培養細胞系統保存機関（バージニア州マナッサス（Manassass））から入手した。抗原の結合、ウェルの洗浄、非特異性タンパク質結合部位のブロッキング、及び抗原結合モノクローナル抗体の検出に用いた試薬と手順は、本実施例で用いた抗原が洗浄され、実施例５で用いたプロテインＡ抗原ではなく、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌の無傷細胞全体を用いた以外は、実施例５で記載する方法であった。
【００７８】
抗原調製に用いる細菌培養液を、トリプティックソイ培地中、３７℃で一晩増殖させた。細胞懸濁液を、４℃で１０分間、１０，６００ｋｘｇで懸濁液を遠心分離することによって、３回洗浄し、上清をデカントし、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５にペレットを再懸濁した。最後の洗浄後、１０７、１０６、及び１０５コロニー形成単位／ｍＬの適切な細胞密度となるよう、重炭酸ナトリウム緩衝液で細胞を懸濁した。これらの懸濁液を９６穴プレートのコーティング用抗原として用いた。それぞれ１．０、０．１、及び０．０１ｍｇ／ｍＬの精製プロテインＡを含有する対照液で、各プレートの別々のウェルをコーティングした。
【００７９】
ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼは、ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immunoresearch）（ペンシルバニア州ウェストグルーブ（West Grove））から入手し、使用前に０．５μｇ／ｍＬの使用濃度に希釈した。アルカリホスファターゼの基質色素であるｐＮＰＰは、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ（Gaithersberg））から入手した。抗プロテインＡモノクローナル抗体ＳＰＡ−２７及び対応するビオチン結合誘導体は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）（ミズーリ州セントルイス（St. Louis））から入手した。
【００８０】
細菌懸濁液及びプロテインＡ対照液を９６ウェルプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで５回洗浄した。非特異性タンパク質結合部位を、２００μＬのブロット溶液（２％ｗ／ｖ脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ）を添加することによりブロッキングし、プレートを４℃で一晩放置した。続いてプレートをＰＢＳＴで洗浄した。
【００８１】
未標識のモノクローナル抗体溶液を、５０μｇタンパク質／ｍＬ酢酸緩衝液（５００μＭ ＮａＣｌ／１００μＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５）まで希釈した。これらの溶液を用い、２倍ずつの段階希釈（０．７８μｇタンパク質／ｍＬまで）で抗体の酢酸緩衝液溶液を調製した。陽性対照として用いるため、ビオチン結合ＳＰＡ−２７抗体を酢酸緩衝液で６．２５ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【００８２】
未標識抗体の各希釈液１００マイクロリットルを２つのウェル（ウェルあたり未標識抗体が１つのみ）に移し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。続いてプレートを５回洗浄した。希釈したビオチン結合抗体１００マイクロリットルをウェルに添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。
【００８３】
ウェルの洗浄後、ブロット溶液で希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルの洗浄後、１００μＬの５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ二ナトリウム及びプレートをプレートリーダーに定置し、波長４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００８４】
結合アッセイのため、ハイブリドーマの上清を酢酸ナトリウム緩衝液（５００μＭ ＮａＣｌ／１００μＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５）で１：５０、１：５００、及び１：５０００に希釈した。結合反応の後、固定化細菌に結合した抗体の量を、アルカリホスファターゼ結合抗体と、実施例５に記載した検出試薬を用いて測定した。この結果、Ｍａｂ ７６は、このスクリーニングにおける他のクローンの平均結合親和性よりも、約３倍高い黄色ブドウ球菌細胞への結合親和性を有することが示された。
【００８５】
（実施例３）
モノクローナル抗体アイソタイプの決定
市販のキットを用い、抗体アイソタイプとサブクラスを同定した。アイソストリップ（ISOSTRIP）マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）（インディアナ州インディアナポリス（Indianapolis）））を製造業者の説明書に従って使用した。その結果、Ｍａｂ ７６がＩｇＧ２ａ抗体に分類されることが示された。更に、モノクローナル抗体の軽鎖アイソタイプがκアイソタイプであることが示された。
【００８６】
（実施例４）
ウエスタンブロット分析
本実施例では、実質的に精製されたプロテインＡをＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、続いてモノクローナル抗体７６でウエスタンブロッティングを行い、モノクローナル抗体のプロテインＡへの結合を証明した。プロテインＡは、ザイメッド・ラボラトリーズ（Zymed Laboratories）から入手し、０．１μｇ／レーンの量でゲルに注入した。既知のタンパク質分子量マーカー混合液をゲル中の１つのレーンで泳動させた。ノベックス・ニューページ（Novex NuPage）４〜１２％プレキャストＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルは、インビトロジェン社（Invitrogen, Inc.）から入手し、電気泳動及びウエスタンブロッティングの手順は、製造業者の説明書に従った。二次プローブとしてのアフィニティ精製済みアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体、及びアルカリホスファターゼ活性検出の基質色素を含有するウエスタンブリーズ（WesternBreeze）色素生産性ウエスタンブロット免疫検出キット（インビトロジェン社（Invitrogen, Inc.））を用い、製造業者の説明書に従ってウエスタンブロットを行った。ゲルから膜にタンパク質を転写した後、膜の個々のレーンを、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６及びモノクローナル抗体ＳＰＡ−２７（シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）（ミズーリ州セントルイス（St. Louis）））でプローブした。続いて、二次プローブを用い、膜に結合したプロテインＡへの一次抗体の結合を検出した。これらの結果より、両モノクローナル抗体が、約５０キロダルトン（ｋＤ）の大きさの類似するタンパク質を検出することが示された。
【００８７】
（実施例５）
エピトープブロッキング分析
本実施例では、Ｍａｂ ７６のプロテインＡ結合エピトープがＭａｂ ＳＰＡ−２７の結合エピトープと異なることを示す。プロテインＡは、ザイメッド・ラボラトリーズ（Zymed Laboratories）から入手した。抗プロテインＡモノクローナル抗体ＳＰＡ−２７及び対応するビオチン結合誘導体は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）（ミズーリ州セントルイス（St. Louis））から入手した。ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼは、ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immunoresearch）（ペンシルバニア州ウェストグルーブ（West Grove））から入手し、使用前に０．５μｇ／ｍＬの使用時濃度に希釈した。アルカリホスファターゼの基質色素であるｐＮＰＰは、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ（Gaithersberg））から入手した。
【００８８】
特に記載しない限り、ＥＬＩＳＡアッセイにおける洗浄手順は全て、１回あたり２００マイクロリットルの容量で３回連続洗浄し、洗浄は全てＰＢＳＴ（０．０５％ｗ／ｖツイン（TWEEN）２０を含有するリン酸緩衝生理食塩液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４））で行った。
【００８９】
プロテインＡを０．０１６μｇ／ｍＬ ＰＢＳ、ｐＨ７．２に希釈し、９６穴プレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで５回（１回あたり２００μＬ）洗浄した。非特異的タンパク質結合部位を、２００μＬのブロット溶液（実施例２参照）（０．０５％ｗ／ｖツイン（Tween）２０、２％ｗ／ｖ脱脂粉乳を含むＰＢＳ）を添加することによりブロッキングし、プレートを４℃で一晩放置した。続いてプレートを上記のように洗浄した。
【００９０】
未標識のモノクローナル抗体溶液を、５０μｇタンパク質／ｍＬ酢酸緩衝液（５００μＭ ＮａＣｌ／１００μＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５）まで希釈した。これらの溶液を用い、２倍ずつの段階希釈（０．７８μｇタンパク質／ｍＬまで）で抗体の酢酸緩衝液溶液を調製した。ビオチン結合ＳＰＡ−２７抗体を酢酸緩衝液で６．２５μｇ／ｍＬまで希釈した。
【００９１】
未標識抗体の各希釈液１００マイクロリットルを２つのウェル（ウェルあたり未標識抗体、すなわちＭａｂ７６又はＳＰＡ−２７のいずれかが１つのみ）に移し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。続いてプレートを上記のように５回洗浄した。希釈したビオチン結合抗体１００マイクロリットルをウェルに添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。
【００９２】
ウェルの洗浄後、ブロット溶液で希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルの洗浄後、ｐＮＰＰ基質溶液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で１０分間放置した。５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ二ナトリウム１００μＬを添加することによりアルカリホスファターゼ反応を停止させ、プレートをプレートリーダーに置き、波長４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００９３】
結果より、未標識のＳＰＡ−２７抗体濃度が約１２．５μｇ／ｍＬを超えるとき、標識ＳＰＡ−２７抗体の結合が顕著に低下することが示された。ビオチン結合ＳＰＡ−２７モノクローナル抗体のプロテインＡへの結合は、未標識ＳＰＡ−２７モノクローナル抗体の結合により阻害されることを示す。
【００９４】
対照的に、５０μｇ／ｍＬまでの濃度のＭａｂ ７６は、標識ＳＰＡ−２７抗体のプロテインＡでコーティングしたウェルへの結合を顕著に低下させなかった。これらの結果は、ビオチン結合ＳＰＡ−２７モノクローナル抗体のプロテインＡへの結合は、Ｍａｂ ７６の結合により阻害されないことを示す。したがって、これらの結果は、Ｍａｂ ７６モノクローナル抗体は、ＳＰＡ−２７モノクローナル抗体が認識するエピトープとは異なるプロテインＡ分子上の結合エピトープを認識することを示す。
【００９５】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び出版物、並びに電子的に存在するもの（例えば、ジェンバンク（GenBank）及びリファレンス・シーケンス（RefSeq）などに登録されているヌクレオチド配列、並びにスイスポート（SwissProt）、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどに登録されているアミノ酸配列、並びにジェンバンク（GenBank）及びリファレンス・シーケンス（RefSeq）の注釈つきコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参考として組み込まれる。前述の説明及び実施例は理解を明確化するためにのみ提示した。それらから無用の限定を解するべきでない。本発明は、示され記載された厳密な詳細事項に限定されるべきでない。当業者に対して明らかな変形が特許請求の範囲において規定された本発明の範囲に含まれるからである。
【００９６】
全ての見出しは読者の利便性のためであって、特記しない場合は、見出しの後に続く文面の意味を制限するために用いているのではない。
【００９７】
本明細書に開示される、別個の工程を含む任意の方法において、任意の可能な順序で工程を実施してもよい。更に、２つ以上の工程の任意の組合わせを適宜同時に実施してもよい。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第１１／５６２，７５９号（２００６年１１月２２日出願）の利益を主張し、この開示内容全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は、ヒトにおいて様々な化膿性（膿形成性）感染症及び中毒症の原因となるグラム陽性菌である。この菌は、表皮の病変（おでき、ものもらい及びせつ腫症）、より重篤な感染症（肺炎、乳腺炎、静脈炎、髄膜炎、及び尿路感染症など）、及び深在性の感染症（骨髄炎及び心内膜炎など）の原因となる。黄色ブドウ球菌は、手術創の院内（病院で起こる）感染及び体内に留置する医療機器に関連する感染症の主な原因である。黄色ブドウ球菌は、食品内へのエンテロトキシン放出による食中毒、及び血流中へのスーパー抗原放出による毒素性ショック症候群を引き起こす。
【０００３】
黄色ブドウ球菌は、宿主防御機能を妨げる多くの因子を産生する。そのような因子の１つがプロテインＡである。プロテインＡは、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する黄色ブドウ球菌表面タンパク質である。血清中で、黄色ブドウ球菌は、菌体表面がオプソニン作用及び食作用を阻害し、その表面上において、ある方向でＩｇＧ分子に結合する。プロテインＡを欠く黄色ブドウ球菌の変異体は、インビトロでより効率よく食菌され、感染モデルにおいて病原性が減弱している。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４、並びにマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３に高い親和性で結合する。プロテインＡは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥに中程度の親和性で結合する。それは、ヒトＩｇＧ３又はＩｇＤには結合せず、マウスＩｇＭ、ＩｇＡ又はＩｇＥにも結合しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントを包含し、そのモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体７６の黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合を阻害し、モノクローナル抗体７６が、米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される。
【０００５】
本発明はまた、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントも包含し、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１により産生されるモノクローナル抗体７６により認識される黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡの同一エピトープに結合する。
【０００６】
更に本発明に包含されるのは、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントであり、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントは更に、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖可変領域のポリペプチド配列を更に含む。
【０００７】
本発明はまた、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントも包含し、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖可変領域ポリペプチド配列を含む。
【０００８】
本発明はまた、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントも包含し、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される、モノクローナル抗体７６の重鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントは更に、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域を更に含む。
【０００９】
本発明はまた、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントも包含し、そのモノクローナル抗体は、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態では、その抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、又はＦｖフラグメントである。
【００１１】
本発明はまた、１つ以上の本発明のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを有する組成物も包含する。
【００１２】
本発明はまた、１つ以上の本発明のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを有するキットも包含する。
【００１３】
更に本発明に含まれるのは、本発明のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する形質転換Ｂ細胞株である。
【００１４】
本発明はまた、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントも包含する。
【００１５】
本発明はまた、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントを含む組成物も包含する。
【００１６】
本発明はまた、培養細胞系統保存機関（the Type Culture Collection）に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１、及びその子孫も包含する。
【００１７】
本発明はまた、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域のコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドも包含する。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の重鎖のコード配列を含む。
【００１８】
本発明はまた、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドも包含する。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のコード配列を含む。
【００１９】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又は１つ以上の相補的決定領域をコードする核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチドを包含する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも包含する。
【００２１】
更に本発明に含まれるのは、本発明の発現ベクターを有する宿主細胞である。
【００２２】
本発明はまた、実質的に精製された抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する方法も包含し、その方法は、抗体ポリペプチド、又はその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で、本発明の形質転換Ｂ細胞株を増殖させる工程と、発現した抗体ポリペプチド、又はその抗原結合性フラグメントを収集する工程とを含む。
【００２３】
本発明はまた、実質的に精製された抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する方法も包含し、その方法は、抗体、又はその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で、本発明の宿主細胞を増殖させる工程と、発現した抗体、又はその抗原結合性フラグメントを収集する工程とを含む。
【００２４】
本発明はまた、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体のスクリーニング方法も包含し、その方法は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程と、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を更に選択する工程とを含む。いくつかの実施形態では、単離された黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程は、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合し続ける抗体を選択する工程を含む。いくつかの実施形態では、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択する工程は、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、無傷の黄色ブドウ球菌に結合し続ける抗体を選択する工程を含む。いくつかの実施形態では、単離された黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程には、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合し続ける抗体を選択する工程を含み、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択する工程には、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、無傷の黄色ブドウ球菌に結合し続ける抗体を選択する工程を含む。本発明はまた、これらの黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体のスクリーニング方法により選択される、抗体、又はその抗体由来の抗原結合性フラグメントも包含する。
【００２５】
本発明はまた、高い比活性で標的抗原に結合する抗体のスクリーニング方法も包含し、その方法は、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で標的抗原を持つ候補抗体に接触する工程を含み、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で標的抗原に結合し続ける候補抗体は、高い比活性で標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原は受容体結合分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子は、プロテインＡ、プロテインＧ、又はＦｃ受容体である。本発明はまた、これらの高い比活性で標的抗原に結合する抗体のスクリーニング方法により選択される、抗体、又はその抗体由来の抗原結合性フラグメントも包含する。
【００２６】
特に指定されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ」は、同じ意味で使用され、「１つ以上」を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、黄色ブドウ球菌（本明細書では、「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」又は「Ｓｔａｐｈ Ａ」とも呼ぶ）のプロテインＡに結合するモノクローナル抗体に関する。このような抗体は、例えば、生体サンプルにおける黄色ブドウ球菌の検出に有用である。更に具体的には、本発明は、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントに関し、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１により産生されるモノクローナル抗体７６の免疫学的結合特性を示す。マウスモノクローナル抗体７６は、プロテインＡで免疫されたマウスから単離されたマウスＩｇＧ２Ａ、κ抗体である。ブダペスト条約に従い、モノクローナル抗体７６を産生するハイブリドーマ３５８Ａ７６．１は、２００６年１０月１８日、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）の保管所（１０８０１、ユニバーシティー・ブルヴァード（University Boulevard）、マナッサス（Manassas）、バージニア州２０１１０−２２０９）に寄託され、特許寄託番号ＰＴＡ−７９３８（本明細書では、受入番号ＰＴＡ−７９３８とも呼ぶ）が付与された。ハイブリドーマ３５８Ａ７６．１は、本明細書は「Ｍａｂ ７６」と呼ばれる抗体を産生し、Ｍａｂ ７６は、本明細書は「Ｍａｂ７６」、「Ｍａｂ−７６」、「ＭＡｂ−７６」、「モノクローナル７６」、「モノクローナル抗体７６」、「７６」、「Ｍ７６」、又は「Ｍ ７６」とも呼ばれ、本明細書では全て米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２００６年１０月１８日に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株より産生される免疫グロブリンを意味し、同じ意味で使用される。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡの特定のエピトープと免疫反応又は結合することができる１種類の抗原結合部位のみを含む抗体分子の集団を意味する。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、典型的に黄色ブドウ球菌のプロテインＡの特定のエピトープに対して単一の結合親和性を示す。本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」又は「モノクローナル抗体（monoclonal antibodies）」は、同じ意味で使用される。
【００２９】
本発明は、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１により産生されるモノクローナル抗体を包含する。更に本発明に含まれるのは、このハイブリドーマの子孫又は類縁細胞から産生されるモノクローナル抗体及びこのハイブリドーマと同じ又は類似する細胞より産生されるモノクローナル抗体である。
【００３０】
本発明は、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６の黄色ブドウ球菌のプロテインＡへの結合を阻害するモノクローナル抗体を包含する。本発明は、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６に認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡのエピトープと同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体を包含する。モノクローナル抗体による、黄色ブドウ球菌のプロテインＡへのモノクローナル抗体Ｍａｂ ７６の結合阻害を判定する方法、及びモノクローナル抗体による、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６に認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡのエピトープと同一のエピトープへの結合を判定する方法は、免疫学の当業者には周知である。例えば、実施例５に記載されるような方法を用いてもよいが、これらには限定されない。本発明のモノクローナル抗体は、既存の種々ポリクローナル抗プロテインＡ抗血清と比べて、プロテインＡへの結合が改善されていることを示すことができる。
【００３１】
完全な抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）を有する。ＶＨ及びＶＬ領域は「相補的決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができ、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、明確に定義されている（カバット（Kabat）、Ｅ．Ａ．ら著、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、第５版、米国保健社会福祉省（U.S. Department of Health and Human Services）、ＮＩＨ出版（NIH Publication）、番号９１−３２４２、１９９１年、及びショティア（Chothia）ら著、分子細胞学雑誌（J. Mol. Biol.）１９８７年、第１９６号、９０１〜９１７頁参照）。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。
【００３２】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一の重鎖を有するモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一の軽鎖を有するモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一の重鎖及び同一の軽鎖を有するモノクローナル抗体を含む。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対するＭａｂ ７６の結合を阻害できる。このようなモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。本発明はまた、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合には実質的に影響しない重鎖及び／又は軽鎖中の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、若しくはそれ以上のアミノ酸置換を含む、このようなモノクローナル抗体も包含する。
【００３３】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一のＶＨドメインを有するモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一のＶＬドメインを有するモノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６と同一のＶＨドメイン及び同一のＶＬドメインを有するモノクローナル抗体を含む。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対するＭａｂ ７６の結合を阻害できる。このようなモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。本発明はまた、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合には実質的に影響しないＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン中の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のアミノ酸置換を含む、このようなモノクローナル抗体も包含する。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、Ｍａｂ ７６のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、若しくはＭａｂ ７６のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、及び／又はＭａｂ ７６のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、Ｍａｂ ７６のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、若しくはＭａｂ ７６のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域を有するモノクローナル抗体を含む。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対するＭａｂ ７６の結合を阻害できる。このようなモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。本発明のモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合には実質的に影響しない１つ以上のＣＤＲ領域中の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のアミノ酸置換を含む、このようなモノクローナル抗体を更に含む。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、又はハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域ののアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含む。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このようなモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対するＭａｂ ７６の結合を阻害できる。このようなモノクローナル抗体は、Ｍａｂ ７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、又はハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有する抗体を含む。このような抗体は、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに結合できる。このような抗体は、モノクローナル抗体７６に認識される黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡの同一のエピトープに結合する通りに、黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合できる。
【００３７】
本明細書で使用するとき、２つのポリペプチド間の「配列の同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で扱うとき、任意の特定のポリペプチドは、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一かどうかにはかかわらず、当該技術分野において既知の方法、及びこれには限定されないがベストフィット（BESTFIT）プログラム（ウィスコンシン・シークエンス・アナリシス・パッケージ（Wisconsin Sequence Analysis Package）、ユニックス用バージョン８、ジェネティクス・コンピュータ・グループ社（Genetics Computer Group）、ユニバーシティ・リサーチ・パーク（University Research Park）、５７５、サイエンスドライブ（Science Drive）、マディソン（Madison）、ウィスコンシン州５３７１１）などのコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定できる。ベストフィット（BESTFIT）は、スミス（Smith）及びウォーターマン（Waterman）著、「応用数学の進歩（Advances in Applied Mathematics）」、第２巻、４８２〜４８９頁、１９８１年、の局所的相同性アルゴリズムを用い、２配列間で最も相同するセグメントを発見する。ベストフィット（BESTFIT）又は任意のその他の配列比較プログラムを用い、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と９５％同一かどうかを決定するとき、当然のことながら、同一性の割合が参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、及び相同性の相違が参照配列中の全アミノ酸数の５％まで可能となるように、パラメーターを設定する。
【００３８】
「結合親和性」又は「親和結合」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原又は抗原性エピトープ）との間の非共有結合性相互作用の強さの総和を意味する。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は解離定数（Ｋｄ）で示され、この定数は一般に、例えば、ビアコア社（BIAcore Inc.）（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway））から市販されるビアコア・バイオセンサー（BIAcore biosensor）を用いて、当該技術分野において既知の方法で決定できる。本発明の抗体を、黄色ブドウ球菌のプロテインＡに対する結合親和性という点で述べることができる。本発明の抗体は、解離定数ＫＤが、５×１０−６Ｍ以下、１０−６Ｍ以下、５×１０−７Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、５×１０−１３Ｍ以下、１０−１３Ｍ以下、５×１０−１４Ｍ以下、１０−１４Ｍ以下、５×１０−１５Ｍ以下、又は１０−１５Ｍ以下である結合親和性を有する抗体を含む。
【００３９】
本発明に更に含まれるものとして、抗原結合性フラグメントとも呼ばれる様々な抗体フラグメントが挙げられ、これらは、一般的には無傷の抗体の抗原結合部位を含む、完全な抗体の一部のみを含み、それにより抗原結合能が保持される。無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理によって、フラグメントを得ることができる。組換え手段によって、フラグメントを得ることもできる。抗体フラグメントの例として、例えば、タンパク質分解及び／又はジスルフィド架橋の還元により産生されるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、ｄＡＢ、及びＦ（ａｂ’）２フラグメント並びにＦａｂ発現ライブラリーから産生されるフラグメントが挙げられる。このような抗体フラグメントを、当該技術分野において周知の技術によって生成することができる。本発明の抗体は、可変領域（１つ又は複数）を単独で又はヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／又はＦｃドメインの全て又は一部と組合わせて含むことができる。用語「抗原結合性フラグメント」は、抗原に結合する、又は抗原結合（すなわち、特異結合）において無傷な抗体（すなわち、そのフラグメントを派生した無傷な抗体）と競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチドフラグメントを意味する。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体として、ヒト化抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、Ｆａｂ発現ライブラリーから産生される直鎖抗体フラグメント、ＶＬドメイン又はＶＨドメイン全体を含むフラグメント、細胞内で産生された抗体（すなわち、細胞内抗体）、及びこれらの抗原結合抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明のモノクローナル抗体は、任意のアイソタイプであることができる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってもよい。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってもよい。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ３であってもよい。本発明において、任意の重鎖は、κ又はλ型の軽鎖と対形成してもよい。
【００４２】
モノクローナル抗体は、当業者には精通される様々な手法で得ることができる。例えば、所望の抗原で免疫された動物由来の脾臓細胞を、一般に骨髄腫細胞と融合することにより不死化させる（例えば、ケーラー（Kohler）及びミルスタイン（Milstein）著、欧州免疫学雑誌（Eur. J. Immunol.）、第６号、５１１〜５１９頁、１９７６年、Ｊ．ゴッディング（J. Goding）著「モノクローナル抗体：原理と実践（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice）」、アカデミックプレス（Academic Press）、５９〜１０３頁、１９８６年、及びハーロー（Harlow）ら著、「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、７２６頁、コールド・スプリング・ハーバー出版（Cold Spring Harbor Pub.）、１９８８年を参照）。モノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の手法で、ハイブリドーマから単離及び精製することができる。モノクローナル抗体を産生する形質転換Ｂ細胞株を作るその他既知の方法を利用してもよい。本発明のモノクローナル抗体を、組み換えＤＮＡ技術により生成、例えば、ファージディスプレイ法又はコンビナトリアルな方法で生成してもよい。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９１／１７２７１号、国際公開第９２／２０７９１号、国際公開第９２／１５６７９号、国際公開第９３／０１２８８号、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／０９６９０号、又は国際公開第９０／０２８０９号を参照のこと。このような方法を、ヒトモノクローナル抗体の産生に使用できる。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「単離物」は、その本来の環境（例えば、天然物の場合は自然環境）から取り出され、それにより、その自然状態から「人の手で」変更された物質を意味する。
【００４４】
治療的に有用な抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体由来であってもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス（又は他の種の）免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から１つ以上のＣＤＲをヒト可変ドメイン内に導入し、ヒト残基をマウスの相当するフレームワーク領域に置換することにより産生される。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用により、マウス定常部の免疫原性に付随する問題の可能性を排除する。ヒト化モノクローナル抗体の作製技術は、例えば、ジョーンズ（Jones）ら著、ネイチャー（Nature）、第３２１号、５２２頁、１９８６年及びシンガー（Singer）ら著、免疫学雑誌（J. Immunol.）、第１５０号、２８４４頁、１９９３年に見られる。本発明のヒト化モノクローナル抗体の定常部は、任意のアイソタイプに属するヒト免疫グロブリンの定常部とすることができる。例えば、ヒトＩｇＧの定常部としてもよい。ヒト免疫グロブリン由来の定常部のフレームワーク領域は、特に限定されない。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体にはキメラ抗体を含む。キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分を持つ。例えば、キメラ抗体は、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物学的特異性を有するヒト抗体分子の遺伝子と継ぎ合わせることにより得られる。例えば、タケダ（Takeda）ら著、ネイチャー（Nature）、第３１４号、５４４〜５４６頁、１９８５年を参照のこと。
【００４６】
本発明は、二重特異性又は二機能性抗体を包含する。二重特異性又は二機能性抗体は、２本の異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦ（ａｂ’）フラグメントの連結などの様々な方法で産生できる。例えば、ソンシビライ（Songsivilai）及びラハマン（Lachmann）著、臨床及び実験免疫学（Clin. Exp. Immunol.）、第７９号、３１５〜３２１頁、１９９０年、及びコステルニー（Kostelny）ら著、免疫学雑誌（J. Immunol.）、第１４８号、１５４７〜１５５３頁、１９９２年を参照のこと。更に、二重特異性抗体を「ダイアボディ」（ホリガー（Holliger）ら著、米国科学アカデミー紀要（PNAS USA）、第９０号、６４４４〜６４４８頁、１９９３年）、又は「ヤヌシンズ（Janusins）」（トラウネッカー（Traunecker）ら著、欧州分子生物学機構雑誌（EMBO J.）、第１０号、ｐ．３６５５〜３６５９頁、１９９１年、及びトラウネッカー（Traunecker）ら著、国際癌雑誌増刊（Int. J. Cancer Suppl.）、第７号、５１〜５２頁、１９９２年）のように作製することもできる。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体を、動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ウマ、ニワトリ、又はターキーを含むが、これらに限定されない）による産生、化学合成、又は組換え発現させることができる。本発明のモノクローナル抗体を、当該技術分野において既知の免疫グロブリン分子の精製法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又は任意のその他の標準的なタンパク質精製技術により精製することができる。更に、本発明の抗体又はそのフラグメントを、本明細書に記載する異種ポリペプチド配列と融合し、ないしは当該技術分野において既知の別の方法で、精製を容易にすることができる。
【００４８】
本発明のモノクローナル抗体の免疫特異的結合について、本明細書に記載する方法、及び任意の好適な当該技術分野において既知の方法により評価することができる。利用可能なイムノアッセイとして、ビアコア（BIAcore）分析、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、免疫蛍光法、免疫細胞化学法、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの手法を用いた、競合的及び非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらには限定されない。このようなアッセイは慣行法であり、当該技術分野において周知である（例えば、アウスベル（Ausubel）ら編、「分子生物学カレントプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、１巻、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons, Inc.）、ニューヨーク、１９９４年、参照）。
【００４９】
本発明のモノクローナル抗体は、任意の種類の分子と抗体との共有結合により修飾又は複合化された、抗体誘導体を包含する。このような抗体誘導体として、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的開裂、又は細胞内配位子又は他のタンパク質への結合により修飾されている抗体が挙げられる。特異的な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、及びツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない、既知の手法により任意の多くの化学修飾を実施可能である。更に、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有できる。
【００５０】
更に本発明に包含されるのは、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、形質転換Ｂ細胞株、及び宿主細胞、これらハイブリドーマ、形質転換Ｂ細胞株、及び宿主細胞の子孫又は類縁細胞、並びに同じ又は類似するハイブリドーマ、形質転換Ｂ細胞株、及び宿主細胞である。
【００５１】
本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を持つヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド分子に関する。本発明はまた、本発明の抗体、又はその補体をコードするヌクレオチド配列と高い厳密性でハイブリッド形成するポリヌクレオチドも含む。本明細書で使用するとき、「厳密な条件」とは、第１のポリヌクレオチド分子が、フィルターに結合した第２のポリヌクレオチド分子と、６５℃で、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中、ハイブリッド形成し、その後、４２℃で、０．２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄しても結合し続ける性能を指す（アウスベル（Ausubel）ら編、「分子生物学カレントプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、１巻、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ社（Green Publishing Associates, Inc.）及びジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons, Inc.）、ニューヨーク、ｐ．２．１０．３、１９８９年、参照）。更に本発明に包含されるのは、本発明のモノクローナル抗体の１つ以上のＣＤＲ領域又は重鎖及び／若しくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドである。免疫グロブリン可変ドメイン及び定常部のクローニングと配列決定の一般的手法はよく知られている。例えば、オーランディ（Orlandi）ら著、米国科学アカデミー紀要（Proc. Nat’l Acad. Sci. USA）、第８６号、３８３３頁、１９８９年、を参照のこと。
【００５２】
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む組み換えベクターも包含する。ベクターを、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、又はファージ形状とすることができる。適切なＤＮＡ配列を、様々な方法でベクター内に挿入できる。一般的には、ベクター内の適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（１個所又は複数個所）に、当該技術分野において既知の方法でＤＮＡ配列を挿入する。このような方法は、当業者の目的の範囲内とみなされる。多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に周知であり、市販されている。一例として、以下のベクターを示す。細菌ベクターとして、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｓｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５が挙げられる。真核生物ベクターとして、例えば、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが挙げられる。しかし、その他の任意のプラスミド又はベクターを使用できる。
【００５３】
本発明は、上述のベクターを含む宿主細胞も包含する。宿主細胞を、哺乳類若しくは昆虫類の細胞などの高等真核細胞、又は酵母細胞などの下等真核細胞とすることができる。あるいは、宿主細胞を、細菌細胞、又は植物細胞などの原核細胞とすることができる。宿主細胞内へのベクター構造の導入を、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介するトランスフェクション、又は電気穿孔法などの任意の好適な手法で行うことができる。（デーヴィス（Davis, L.）ら著、「分子生物学基礎的実験法（Basic Methods in Molecular Biology）」、１９８６年）。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体は、適切なプロモーターの制御下において、哺乳類細胞、酵母、細菌、又はその他の細胞内で発現させることができる。無細胞翻訳系を、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いるこれらタンパク質の産生に利用することもできる。原核生物宿主及び真核生物宿主と用いるのに適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、サムブルック（Sambrook）ら著、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、１９８９年、に記載されている。
【００５５】
更に本発明に包含されるのは、本発明のモノクローナル抗体由来の１つ以上の超可変領域を発現するファージディスプレイライブラリー、及びこのようなファージディスプレイライブラリーから得られるクローンである。ファージディスプレイライブラリーは、抗体由来分子の産生に用いられる。抗体の抗原結合可変ドメインをコードする遺伝子部分を、バクテリオファージのコートタンパク質をコードする遺伝子に融合する。このような遺伝子融合体を含むバクテリオファージを用いて細菌に感染させると、生じたファージ粒子は、抗原結合ドメインがバクテリオファージ外部に提示される状態で、抗体融合タンパク質を発現する外殻を有する。ファージディスプレイライブラリーを、例えば、ニューイングランド・バイオラボ社（New England Biolabs Inc.）（マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ipswich））から市販されるＰｈ．Ｄ．（商標）−７ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（カタログ番号Ｅ８１００Ｓ）又はＰｈ．Ｄ．（商標）−１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（カタログ番号Ｅ８１１０Ｓ）を用いて調製できる。スミス（Smith）及びペトレンコ（Petrenko）著、「化学総説（Chem. Rev.）」、９７、３９１〜４１０頁、１９９７年も参照のこと。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体を、当該技術分野において周知の手法により、直接的又は間接的に検出可能なマーカーに結合してもよい。検出可能なマーカーは、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段により検出可能な剤である。有用な検出可能なマーカーとして、蛍光染料、化学発光化合物、放射性同位元素、高電子密度試薬、酵素、着色粒子、ビオチン、又はジゴキシゲニン（dioxigenin）が挙げられるがこれらには限定されない。多くの場合、検出可能なマーカーは、放射活性、蛍光、色、又は酵素活性などの測定可能な信号を発する。検出可能な剤を結合した抗体を、診断又は治療目的で用いてもよい。検出可能な剤の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、放射性物質、様々な陽電子放出断層撮影法を用いる陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、直接的に、又は例えば、当該技術分野において既知のリンカーなどの仲介物を介して間接的に、当該技術分野において既知の手法を用いて抗体に共役又は結合できる。例えば、診断利用のための抗体への金属イオンの結合について記載される、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光性物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド及びフィリコエリトリンが挙げられ、発光性物質の例として、ルミノールが挙げられる。生物発光性物質の例として、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、及び好適な放射性物質の例として、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、及び９７Ｒｕが挙げられる。このような治療用部分を抗体に結合する手法は周知である。
【００５７】
更に本発明に包含されるのは、本明細書に記載される１つ以上の単離されたモノクローナル抗体を含む組成物である。組成物はまた、例えば、ｐＨを許容範囲に保つのに役立つ緩衝剤、又は微生物の増殖を抑制する防腐剤を含んでもよい。組成物は、例えば、キャリア、賦形剤、安定剤、キレート化剤、塩、又は抗菌剤を含んでもよい。許容可能なキャリア、賦形剤、安定剤、キレート化剤、塩、防腐剤、緩衝剤、若しくは抗菌剤として、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤、アジ化ナトリウム、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなどの防腐剤、ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは非特異的免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドン（olyvinylpyrrolidone）などの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンなどの単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、並びに／又はツイン（TWEEN）、プルロニック（PLURONICS）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらには限定されない。本明細書で使用するとき、組成物は、動物をプロテインＡ又は黄色ブドウ球菌で免疫することにより得られるポリクローナル抗血清ではない。
【００５８】
本発明のモノクローナル抗体を、インビトロ及びインビボにおける診断的及び治療的方法の両方で用いることができる。更に本発明に包含されるのは、そのようなインビトロ及びインビボの診断的及び治療的方法である。
【００５９】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を含むキットも提供する。キットは、１つ以上の本発明のモノクローナル抗体で満たされる、１つ以上の容器を含むことができる。更に、緩衝液及び溶液など、本発明の実施に必要なその他の試薬を含むことができるキットを含んでもよい。このような容器（１つ又は複数）に任意に付属するものとして、注意事項や説明書が挙げられる。本明細書で使用するとき、「梱包材料」という用語は、キットの内容物を収容するのに用いる１つ以上の物理的構造体を意味する。梱包材料は、周知の方法で組み立てられ、好ましくは、無菌の、汚染物質を含まない環境を提供する。本明細書で使用するとき、「包装」という用語は、ポリペプチドを定められた期限内維持することができる、ガラス、プラスチック、紙、金属箔などの固体マトリックス又は固体材料を意味する。
【００６０】
本発明は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程と、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択する工程の両方により、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体のスクリーニング方法を包含する。これらの選択工程を、任意の順序で行ってもよい。例えば、１つの方法として、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択し、その後に無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択してもよい。あるいは、１つの方法として、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択し、その後に黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択してもよい。追加的な選択又はスクリーニング工程を含んでもよい。単離された黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体の選択工程及び無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体の選択工程を、免疫学の技術分野における当業者が利用可能な様々な任意の条件下で行ってもよい。例えば、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合し続ける抗体の選択工程及び／又は無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体の選択工程を、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で行ってもよい。約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液と同様のｐＨ及びイオン強度を有するその他の緩衝液を使用してもよい。
【００６１】
本発明は、高い比活性で標的抗原に結合する抗体のスクリーニング方法を包含し、その方法は、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で標的抗原を持つ候補抗体に接触する工程を含み、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で標的抗原に結合し続ける候補抗体は、高い比活性で標的抗原に結合する。約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを有する約ｐＨ４の緩衝液と同様のｐＨ及びイオン強度を有するその他の緩衝液を使用してもよい。追加的な選択又はスクリーニング工程を含んでよい。場合によっては、標的抗原は受容体結合分子であってもよい。場合によっては、標的抗原は、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子であってもよい。そのような、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子の例として、プロテインＡ、プロテインＧ、並びに免疫グロブリンＦｃ部分及びＦｃ受容体に結合するその他の細菌タンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。Ｆｃ受容体は、マクロファージ、好中球、肥満細胞等の造血細胞上の受容体であり、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する。Ｆｃ受容体の例として、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ−Ａ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ２（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ１（ＣＤ３２）、ＦｃεＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃαＲＩＦｃａＲＩが挙げられる。
【００６２】
本発明を以下の実施例によって例示する。特定の実施例、材料、量、及び手順が本明細書で記載された本発明の範囲及び趣旨により広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
抗プロテインＡモノクローナル抗体の産生
免疫手順
この手順では、５匹の雌のスイス・ウェブスター（Swiss Webster）マウス（２．６月齢）を用いた。免疫抗原として用いたプロテインＡ抗原は、インビトロジェン社（Invitrogen, Inc.）（カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad））の関連会社であるザイメッド・ラボラトリーズ（Zymed Laboratories）から入手した。スクリーニングプロセスでは、各追加免疫２週間後にマウスから採血し、以下に記載する手順に従って、非プール試料の抗プロテインＡ抗体を確認した。表１に免疫処理手順を示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
融合手順
融合用に選択されたマウスを、上記免疫で用いた抗原と同用量で追加免疫した。上記表１に示されるように、脾臓摘出及び細胞融合の前４日間にわたり、追加免疫を行った。
【００６６】
融合日に、選択したマウスを屠殺し、脾臓を無菌的に摘出した。ピンセットを用いて脾臓を細分化し、ふるいで漉した。細胞を、ＩＭＤＭ培地（Ｌ−グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むイスコフ（Iscove）改変ＤＭＥＭ、セルグロ（Cellgro）カタログ番号１０−０１６−ＣＭ、メディアテック社（Mediatech, Inc.）（バージニア州ハーンドン（Herndon）））を用いて２回洗浄し、血球計数器を用いてカウントした。マウス骨髄腫細胞株Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３を、対数増殖期で静置培養から取り出した。細胞をＩＭＤＭで２回洗浄し、血球計数器を用いてカウントした。骨髄腫細胞及び脾臓細胞を１：５の割合で混合し、遠心分離した。上清を捨てた。試験管の底部を軽くたたいて、細胞沈殿物を穏やかに再懸濁した。１ｍＬのＰＥＧ（ＭＷ １５００）５０％溶液を、３０秒間かけて（１滴ずつ）加えた。ピペットを用いて、沈殿物を３０秒間穏やかに混合した。生じた細胞懸濁液を、更に３０秒間静置した。１ミリリットル（ｍＬ）のＩＭＤＭを１分間かけて加え、続いて、２ｍＬのＩＭＤＭを２分間かけて１滴ずつ加えた。２分間の直後に、更に５ｍＬのＩＭＤＭを加えた。生じた細胞懸濁液を５分間静置した。
【００６７】
細胞懸濁液を室温、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿物をＨＡＴ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．６％２−メルカプトエタノール（０．０４％溶液）、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、及び１０％オリジェン（Origen）成長因子を含有するＩＭＤＭ）に再懸濁した。細胞を、ミリリットルあたり１×１０６個となるように再懸濁した。細胞懸濁液を、９６穴プレートにプレーティングした。２００マイクロリットル（又は約２×１０５個）を各ウェルに添加した。９６穴プレートを、１００％湿度７％ＣＯ２雰囲気下３７℃でインキュベートした。
【００６８】
融合７日後、培地を除去し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．６％２−メルカプトエタノール保存液（０．０４％）、ヒポキサンチン、及びチミジンを含有するＩＭＤＭと交換した。
【００６９】
ハイブリドーマ増殖手順
融合１４日後、生育中のハイブリドーマコロニーを有するウェルより上清を採取した。各ウェルの上清の容量は約１５０〜２００マイクロリットルであった。この上清を、血清のスクリーニングに用いたものと同様の試験法（以下に記載）を用いて特異抗体に関して試験した。
【００７０】
陽性のハイブリドーマコロニーを９６穴プレートから２４穴プレートに移し、２０％ＦＢＳ、１０％オリジェン（Origen）クローニング因子、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び０．６％２−メルカプトエタノール保存液（０．０４％）を含有するＩＭＤＭ １．８ｍＬを各ウェルに添加した。９６穴プレートについて上述した方法で、２４穴プレートをインキュベートした。５日後、２４穴プレートの上清について特異抗体の存在確認試験を行った。
【００７１】
陽性のウェルの細胞を、Ｔ−２５及びＴ−７５フラスコ（コーニングフラスコ（Corning Flask）、コーニング（Corning）社、ニューヨーク）内で増殖させた。Ｔ−７５フラスコの細胞を５本のバイアル瓶（各１ｍＬ）にとり、液体窒素で凍結した。陽性のウェルの細胞を限界希釈によりクローニング、すなわち、ハイブリドーマ細胞をウェルあたり０．２５個の細胞密度で９６穴プレートにプレーティングした。生育中のコロニーを、ハイブリドーマの最初の選択に用いたものと同様の試験法を用いて１０〜１４日後に試験した。サブクローン細胞を２４穴プレートで増殖させ、続いてＴ−２５、Ｔ−７５及びＴ−１６２フラスコで増殖させた。サブクローン細胞のバイアル瓶を上記方法で凍結した。
【００７２】
（実施例２）
抗プロテインＡ抗体のスクリーニングアッセイ
第１段階−プロテインＡへの結合
特に明記しない限り全ての手順を室温で行った。プロテインＡ及びヤギ抗マウス抗体（γ鎖特異的、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合）は、ザイメッド・ラボラトリーズ（Zymed Laboratories）（インビトロジェン社（Invitrogen, Inc.）（カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad）））から入手した。西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素活性の基質色素であるＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidene））は、ネオジェン社（Neogen Corporation）（ミシガン州ランシング（Lansing））から入手した。
【００７３】
特に記載のない限り、ＥＬＩＳＡアッセイにおける洗浄手順は全て、１回あたりの洗浄あたり２００マイクロリットル（μＬ）の３回の連続洗浄を含み、洗浄は全てＰＢＳＴ（０．０５％ｗ／ｖツイン（Tween）２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４））で行った。
【００７４】
標的抗原（プロテインＡ１μｇ／ｍＬ炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）懸濁液、１００μＬ）で、ＥＬＩＳＡプレート（イムロン（Immulon）２、ダイネックス・テクノロジーズ社（Dynex Technologies, Inc.）（バージニア州シャンティリー（Chantilly）））の各ウェルを、３７℃で１時間コーティングした。コーティング工程後、ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％ｗ／ｖツイン（TWEEN）２０を含有するリン酸緩衝生理食塩液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４））で２回洗浄した。
【００７５】
標的抗原によるウェルコーティングの最後の洗浄液を捨てた後、ＥＬＩＳＡプレートの非特異的タンパク質結合部位がブロックされた。２％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳＴ（ブロット（blotto）溶液）２００マイクロリットルを各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ブロット溶液を捨てた。抗体溶液（１００μＬ／ウェル、酢酸緩衝液（０．１Ｍ酢酸及び０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）で希釈）を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１〜２時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。
【００７６】
ヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ複合体をブロット溶液で適当に希釈した溶液１００マイクロリットルを各ウェルに添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートした。インキュベート後、複合体溶液を除去し、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。最後の洗浄液を除去した後、１００μＬのＴＭＢ（Ｋブルー（Kblue）、ネオジェン（Neogen）カタログ番号３００１９９）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１〜１０分間放置して青色の発色を観察した。各ウェルの比ＨＲＰ酵素活性を、６５０ｎｍの光源波長の吸光度によりプレートリーダーで測定した。スクリーニングした１０００個超のハイブリドーマ細胞株のうち、プロテインＡ結合活性が最も高い抗体を産生する８個の細胞株を、更なるスクリーニング用に選択した。
【００７７】
第２段階−黄色ブドウ球菌細胞への結合
より高い親和性のプロテインＡ結合抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の無傷細胞への結合能を試験した。本実施例で用いた菌株、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）及び表皮ブドウ球菌（ＡＴＣＣ １２２２８）は、米国培養細胞系統保存機関（バージニア州マナッサス（Manassass））から入手した。抗原の結合、ウェルの洗浄、非特異性タンパク質結合部位のブロッキング、及び抗原結合モノクローナル抗体の検出に用いた試薬と手順は、本実施例で用いた抗原が洗浄され、実施例５で用いたプロテインＡ抗原ではなく、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌の無傷細胞全体を用いた以外は、実施例５で記載する方法であった。
【００７８】
抗原調製に用いる細菌培養液を、トリプティックソイ培地中、３７℃で一晩増殖させた。細胞懸濁液を、４℃で１０分間、１０，６００ｋｘｇで懸濁液を遠心分離することによって、３回洗浄し、上清をデカントし、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５にペレットを再懸濁した。最後の洗浄後、１０７、１０６、及び１０５コロニー形成単位／ｍＬの適切な細胞密度となるよう、重炭酸ナトリウム緩衝液で細胞を懸濁した。これらの懸濁液を９６穴プレートのコーティング用抗原として用いた。それぞれ１．０、０．１、及び０．０１ｍｇ／ｍＬの精製プロテインＡを含有する対照液で、各プレートの別々のウェルをコーティングした。
【００７９】
ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼは、ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immunoresearch）（ペンシルバニア州ウェストグルーブ（West Grove））から入手し、使用前に０．５μｇ／ｍＬの使用濃度に希釈した。アルカリホスファターゼの基質色素であるｐＮＰＰは、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ（Gaithersberg））から入手した。抗プロテインＡモノクローナル抗体ＳＰＡ−２７及び対応するビオチン結合誘導体は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）（ミズーリ州セントルイス（St. Louis））から入手した。
【００８０】
細菌懸濁液及びプロテインＡ対照液を９６ウェルプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで５回洗浄した。非特異性タンパク質結合部位を、２００μＬのブロット溶液（２％ｗ／ｖ脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ）を添加することによりブロッキングし、プレートを４℃で一晩放置した。続いてプレートをＰＢＳＴで洗浄した。
【００８１】
未標識のモノクローナル抗体溶液を、５０μｇタンパク質／ｍＬ酢酸緩衝液（５００μＭ ＮａＣｌ／１００μＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５）まで希釈した。これらの溶液を用い、２倍ずつの段階希釈（０．７８μｇタンパク質／ｍＬまで）で抗体の酢酸緩衝液溶液を調製した。陽性対照として用いるため、ビオチン結合ＳＰＡ−２７抗体を酢酸緩衝液で６．２５ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【００８２】
未標識抗体の各希釈液１００マイクロリットルを２つのウェル（ウェルあたり未標識抗体が１つのみ）に移し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。続いてプレートを５回洗浄した。希釈したビオチン結合抗体１００マイクロリットルをウェルに添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。
【００８３】
ウェルの洗浄後、ブロット溶液で希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルの洗浄後、１００μＬの５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ二ナトリウム及びプレートをプレートリーダーに定置し、波長４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００８４】
結合アッセイのため、ハイブリドーマの上清を酢酸ナトリウム緩衝液（５００μＭ ＮａＣｌ／１００μＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５）で１：５０、１：５００、及び１：５０００に希釈した。結合反応の後、固定化細菌に結合した抗体の量を、アルカリホスファターゼ結合抗体と、実施例５に記載した検出試薬を用いて測定した。この結果、Ｍａｂ ７６は、このスクリーニングにおける他のクローンの平均結合親和性よりも、約３倍高い黄色ブドウ球菌細胞への結合親和性を有することが示された。
【００８５】
（実施例３）
モノクローナル抗体アイソタイプの決定
市販のキットを用い、抗体アイソタイプとサブクラスを同定した。アイソストリップ（ISOSTRIP）マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）（インディアナ州インディアナポリス（Indianapolis）））を製造業者の説明書に従って使用した。その結果、Ｍａｂ ７６がＩｇＧ２ａ抗体に分類されることが示された。更に、モノクローナル抗体の軽鎖アイソタイプがκアイソタイプであることが示された。
【００８６】
（実施例４）
ウエスタンブロット分析
本実施例では、実質的に精製されたプロテインＡをＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、続いてモノクローナル抗体７６でウエスタンブロッティングを行い、モノクローナル抗体のプロテインＡへの結合を証明した。プロテインＡは、ザイメッド・ラボラトリーズ（Zymed Laboratories）から入手し、０．１μｇ／レーンの量でゲルに注入した。既知のタンパク質分子量マーカー混合液をゲル中の１つのレーンで泳動させた。ノベックス・ニューページ（Novex NuPage）４〜１２％プレキャストＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルは、インビトロジェン社（Invitrogen, Inc.）から入手し、電気泳動及びウエスタンブロッティングの手順は、製造業者の説明書に従った。二次プローブとしてのアフィニティ精製済みアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体、及びアルカリホスファターゼ活性検出の基質色素を含有するウエスタンブリーズ（WesternBreeze）色素生産性ウエスタンブロット免疫検出キット（インビトロジェン社（Invitrogen, Inc.））を用い、製造業者の説明書に従ってウエスタンブロットを行った。ゲルから膜にタンパク質を転写した後、膜の個々のレーンを、モノクローナル抗体Ｍａｂ ７６及びモノクローナル抗体ＳＰＡ−２７（シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）（ミズーリ州セントルイス（St. Louis）））でプローブした。続いて、二次プローブを用い、膜に結合したプロテインＡへの一次抗体の結合を検出した。これらの結果より、両モノクローナル抗体が、約５０キロダルトン（ｋＤ）の大きさの類似するタンパク質を検出することが示された。
【００８７】
（実施例５）
エピトープブロッキング分析
本実施例では、Ｍａｂ ７６のプロテインＡ結合エピトープがＭａｂ ＳＰＡ−２７の結合エピトープと異なることを示す。プロテインＡは、ザイメッド・ラボラトリーズ（Zymed Laboratories）から入手した。抗プロテインＡモノクローナル抗体ＳＰＡ−２７及び対応するビオチン結合誘導体は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）（ミズーリ州セントルイス（St. Louis））から入手した。ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼは、ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immunoresearch）（ペンシルバニア州ウェストグルーブ（West Grove））から入手し、使用前に０．５μｇ／ｍＬの使用時濃度に希釈した。アルカリホスファターゼの基質色素であるｐＮＰＰは、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ（Gaithersberg））から入手した。
【００８８】
特に記載しない限り、ＥＬＩＳＡアッセイにおける洗浄手順は全て、１回あたり２００マイクロリットルの容量で３回連続洗浄し、洗浄は全てＰＢＳＴ（０．０５％ｗ／ｖツイン（TWEEN）２０を含有するリン酸緩衝生理食塩液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４））で行った。
【００８９】
プロテインＡを０．０１６μｇ／ｍＬ ＰＢＳ、ｐＨ７．２に希釈し、９６穴プレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで５回（１回あたり２００μＬ）洗浄した。非特異的タンパク質結合部位を、２００μＬのブロット溶液（実施例２参照）（０．０５％ｗ／ｖツイン（Tween）２０、２％ｗ／ｖ脱脂粉乳を含むＰＢＳ）を添加することによりブロッキングし、プレートを４℃で一晩放置した。続いてプレートを上記のように洗浄した。
【００９０】
未標識のモノクローナル抗体溶液を、５０μｇタンパク質／ｍＬ酢酸緩衝液（５００μＭ ＮａＣｌ／１００μＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５）まで希釈した。これらの溶液を用い、２倍ずつの段階希釈（０．７８μｇタンパク質／ｍＬまで）で抗体の酢酸緩衝液溶液を調製した。ビオチン結合ＳＰＡ−２７抗体を酢酸緩衝液で６．２５μｇ／ｍＬまで希釈した。
【００９１】
未標識抗体の各希釈液１００マイクロリットルを２つのウェル（ウェルあたり未標識抗体、すなわちＭａｂ７６又はＳＰＡ−２７のいずれかが１つのみ）に移し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。続いてプレートを上記のように５回洗浄した。希釈したビオチン結合抗体１００マイクロリットルをウェルに添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。
【００９２】
ウェルの洗浄後、ブロット溶液で希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルの洗浄後、ｐＮＰＰ基質溶液１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で１０分間放置した。５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ二ナトリウム１００μＬを添加することによりアルカリホスファターゼ反応を停止させ、プレートをプレートリーダーに置き、波長４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【００９３】
結果より、未標識のＳＰＡ−２７抗体濃度が約１２．５μｇ／ｍＬを超えるとき、標識ＳＰＡ−２７抗体の結合が顕著に低下することが示された。ビオチン結合ＳＰＡ−２７モノクローナル抗体のプロテインＡへの結合は、未標識ＳＰＡ−２７モノクローナル抗体の結合により阻害されることを示す。
【００９４】
対照的に、５０μｇ／ｍＬまでの濃度のＭａｂ ７６は、標識ＳＰＡ−２７抗体のプロテインＡでコーティングしたウェルへの結合を顕著に低下させなかった。これらの結果は、ビオチン結合ＳＰＡ−２７モノクローナル抗体のプロテインＡへの結合は、Ｍａｂ ７６の結合により阻害されないことを示す。したがって、これらの結果は、Ｍａｂ ７６モノクローナル抗体は、ＳＰＡ−２７モノクローナル抗体が認識するエピトープとは異なるプロテインＡ分子上の結合エピトープを認識することを示す。
【００９５】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び出版物、並びに電子的に存在するもの（例えば、ジェンバンク（GenBank）及びリファレンス・シーケンス（RefSeq）などに登録されているヌクレオチド配列、並びにスイスポート（SwissProt）、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどに登録されているアミノ酸配列、並びにジェンバンク（GenBank）及びリファレンス・シーケンス（RefSeq）の注釈つきコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参考として組み込まれる。前述の説明及び実施例は理解を明確化するためにのみ提示した。それらから無用の限定を解するべきでない。本発明は、示され記載された厳密な詳細事項に限定されるべきでない。当業者に対して明らかな変形が特許請求の範囲において規定された本発明の範囲に含まれるからである。
【００９６】
全ての見出しは読者の利便性のためであって、特記しない場合は、見出しの後に続く文面の意味を制限するために用いているのではない。
【００９７】
本明細書に開示される、別個の工程を含む任意の方法において、任意の可能な順序で工程を実施してもよい。更に、２つ以上の工程の任意の組合わせを適宜同時に実施してもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントであって、前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体７６の黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合を阻害し、モノクローナル抗体７６が米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６によって認識される黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡの同一エピトープに結合する、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体が、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖可変領域のポリペプチド配列を更に含む、請求項４に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖可変領域のポリペプチド配列を含む、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の重鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を更に含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
前記抗体の抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、及びＦｖフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体の抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
請求項１に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、キット。
【請求項１２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する、形質転換Ｂ細胞株。
【請求項１３】
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメント。
【請求項１４】
請求項１４に記載のモノクローナル抗体を含む、組成物。
【請求項１５】
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株、及びその継代株。
【請求項１６】
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の重鎖可変領域のコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記単離されたポリヌクレオチドが、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の重鎖のコード配列を含む、請求項１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の軽鎖可変領域のコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記単離されたポリヌクレオチドが、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の軽鎖可変領域のコード配列を含む、請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又は１つ以上の相補的決定領域をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１７に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
実質的に精製された抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する方法であって、抗体ポリペプチド、又はその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で請求項１２に記載の形質転換Ｂ細胞株を増殖させる工程と、発現した抗体ポリペプチド、又はその抗原結合性フラグメントを収集する工程とを含む、方法。
【請求項２４】
実質的に精製された抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する方法であって、抗体、又はその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を増殖させる工程と、発現した抗体、又はその抗原結合性フラグメントを収集する工程とを含む、方法。
【請求項２５】
黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体のスクリーニング方法であって、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程と、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を更に選択する工程とを含む、方法。
【請求項２６】
単離された黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程が、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合し続ける抗体を選択する工程を含み、及び／又は、
無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択する工程が、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、無傷の黄色ブドウ球菌に結合し続ける抗体を選択する工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５又は請求項２６に記載の方法に従って選択される抗体。
【請求項２８】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
請求項２７又は請求項２８に記載の抗体由来の抗原結合性フラグメント。
【請求項３０】
請求項２７又は請求項２８に記載の抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、組成物。
【請求項３１】
請求項２７又は請求項２８に記載の抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、キット。
【請求項３２】
高い比活性で標的抗原に結合する抗体のスクリーニング方法であって、
約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、標的抗原と候補抗体を接触させる工程を含み、
約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、前記標的抗原に結合し続ける候補抗体が、高い比活性で前記標的抗原に結合する、方法。
【請求項３３】
前記標的抗原が、受容体結合分子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的抗原が、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の位置で免疫グロブリンに結合する分子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子が、プロテインＡ、プロテインＧ、及びＦｃ受容体からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法に従って選択される、高い比活性の抗体。
【請求項３７】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項３６に記載の高い比活性の抗体。
【請求項３８】
請求項３６又は請求項３７に記載の抗体由来の抗原結合性フラグメント。
【請求項３９】
請求項３６又は請求項３７に記載の抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、組成物。
【請求項４０】
請求項３６又は請求項３７に記載の抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、キット。
【請求項１】
モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメントであって、前記モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体７６の黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡへの結合を阻害し、モノクローナル抗体７６が米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６によって認識される黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡの同一エピトープに結合する、モノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体が、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖可変領域のポリペプチド配列を更に含む、請求項４に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖可変領域のポリペプチド配列を含む、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の重鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を更に含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体７６の軽鎖の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
前記抗体の抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、及びＦｖフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体の抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
請求項１に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、キット。
【請求項１２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する、形質転換Ｂ細胞株。
【請求項１３】
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生されるモノクローナル抗体、及びその抗原結合性フラグメント。
【請求項１４】
請求項１４に記載のモノクローナル抗体を含む、組成物。
【請求項１５】
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株、及びその継代株。
【請求項１６】
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の重鎖可変領域のコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記単離されたポリヌクレオチドが、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の重鎖のコード配列を含む、請求項１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の軽鎖可変領域のコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記単離されたポリヌクレオチドが、米国培養細胞系統保存機関に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１より産生される抗体の軽鎖可変領域のコード配列を含む、請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又は１つ以上の相補的決定領域をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１７に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
実質的に精製された抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する方法であって、抗体ポリペプチド、又はその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で請求項１２に記載の形質転換Ｂ細胞株を増殖させる工程と、発現した抗体ポリペプチド、又はその抗原結合性フラグメントを収集する工程とを含む、方法。
【請求項２４】
実質的に精製された抗体、又はその抗原結合性フラグメントを産生する方法であって、抗体、又はその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を増殖させる工程と、発現した抗体、又はその抗原結合性フラグメントを収集する工程とを含む、方法。
【請求項２５】
黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体のスクリーニング方法であって、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程と、無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を更に選択する工程とを含む、方法。
【請求項２６】
単離された黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合する抗体を選択する工程が、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡに結合し続ける抗体を選択する工程を含み、及び／又は、
無傷の黄色ブドウ球菌に結合する抗体を選択する工程が、約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、無傷の黄色ブドウ球菌に結合し続ける抗体を選択する工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５又は請求項２６に記載の方法に従って選択される抗体。
【請求項２８】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
請求項２７又は請求項２８に記載の抗体由来の抗原結合性フラグメント。
【請求項３０】
請求項２７又は請求項２８に記載の抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、組成物。
【請求項３１】
請求項２７又は請求項２８に記載の抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、キット。
【請求項３２】
高い比活性で標的抗原に結合する抗体のスクリーニング方法であって、
約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、標的抗原と候補抗体を接触させる工程を含み、
約０．１Ｍの酢酸及び約０．５ＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ４の緩衝液の存在下で、前記標的抗原に結合し続ける候補抗体が、高い比活性で前記標的抗原に結合する、方法。
【請求項３３】
前記標的抗原が、受容体結合分子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的抗原が、免疫グロブリンの抗体結合部位以外の位置で免疫グロブリンに結合する分子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫グロブリンの抗体結合部位以外の場所で免疫グロブリンに結合する分子が、プロテインＡ、プロテインＧ、及びＦｃ受容体からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法に従って選択される、高い比活性の抗体。
【請求項３７】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項３６に記載の高い比活性の抗体。
【請求項３８】
請求項３６又は請求項３７に記載の抗体由来の抗原結合性フラグメント。
【請求項３９】
請求項３６又は請求項３７に記載の抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、組成物。
【請求項４０】
請求項３６又は請求項３７に記載の抗体、又はその抗原結合性フラグメントを含む、キット。
【公表番号】特表２０１０−５０９９３７（Ｐ２０１０−５０９９３７Ａ）
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３８４５１（Ｐ２００９−５３８４５１）
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８４７３６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４０５７０
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８４７３６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４０５７０
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
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