ヘパリン修飾成分を用いた第Ｘａ因子に基づくヘパリンアッセイ
【課題】 本発明は、凝固の診断に関係し、そしてサンプル中のヘパリン活性を測定する方法を提供する。
【解決手段】 この方法においてサンプルは、ヘパリン修飾成分と最初にインキュベートされ、次いでヘパリン依存性の第Ｘａ因子不活性化が測定される。
【解決手段】 この方法においてサンプルは、ヘパリン修飾成分と最初にインキュベートされ、次いでヘパリン依存性の第Ｘａ因子不活性化が測定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固障害の診断に関係し、そしてサンプル中のヘパリン活性を測定するインビトロの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、負に荷電した種々の長さのポリ硫酸化グルコサミノグリカン鎖であり、そしてインビボ及びインビトロで即時かつ濃度依存的に凝固を阻害するとりわけ最も一般に普及した抗凝固物質である。鎖長如何により、３０００ダルトンから３００００ダルトンまでの間の分子量を有するいわゆる未分画（ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）高分子量ヘパリン（ＵＦＨ、ＵＦヘパリン）と約４０００ダルトンから９０００ダルトンまでの間の分子量を有するいわゆる分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ、ＬＭＷヘパリン）との間の区別が本質的に行われる。分画ヘパリンは、酵素的切断若しくは化学的切断又はクロマトグラフィーによって未分画ヘパリンから一般に得られる。切断方法如何により、得られる産物は、物理化学的性質、例えば平均鎖長、分子量区分、硫酸化又はグリカン修飾の程度が異なり、これは、これらの産物の生物学的活性に影響を及ぼす。ヘパリン誘導体及びヘパリノイド（ｈｅｐａｒｉｎｏｉｄ）は、酵素的及び／又は化学的に修飾されたグルコサミノグリカン鎖であり、この抗凝固性質は、グリカン鎖長、硫酸化パターン及びアセチル化パターンの標的化作用を通じて又は異なるグルコサミノグリカンの混合を通じて生物工学的に修飾され得、これは例えば、ダナパロイド（ｄａｎａｐａｒｏｉｄ）ナトリウムの場合、主にヘパラン硫酸並びに少ない比率のデルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸からなるグリコサミノグリカンの混合物であることが挙げられる。
【０００３】
すべてのヘパリンの抗凝固効果は、活性化凝固因子の最も重要な血漿インヒビターであるアンチトロンビン（ＡＴ、アンチトロンビンＩＩＩ）との複合体の形成に由来する。アンチトロンビンは、セリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）群に属し、そして凝固因子トロンビン（第ＩＩａ因子、ＦＩＩａ）及び第Ｘａ因子（ＦＸａ）並びに少ない程度でまた他のセリンプロテアーゼＦＩＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン及びプラスミンを阻害する。アンチトロンビンとのヘパリンの結合は、アンチトロンビンのコンホメーション変化をもたらし、この変化は、アンチトロンビンの阻害効果を何倍も増強する。アンチトロンビンとの結合を担うヘパリン分子の結合部位は、特徴的な五糖配列からなる。この五糖の完全なる合成形態（フォンダパリヌクス（ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ））は、凝固性の医学的な阻害としてＵＦＨ又はＬＭＷＨとまさしく同様に利用される。
【０００４】
未分画ヘパリン及び分画ヘパリン、ヘパリン誘導体、ヘパリノイド並びに五糖は、それらの抗凝固効果が異なる。ＵＦＨは、トロンビン及びＦＸａを等しく阻害するのに対して、ＬＭＷＨは主にＦＸａの阻害効果を示し、トロンビンの阻害効果はわずかな程度しか示さない。五糖、例えばフォンダパリヌクスは、ＦＸａを選択的に阻害し、トロンビン阻害はまったく示さない。
【０００５】
適応症如何により、ヘパリンは予防的又は治療的に利用され、例えば、手術若しくは固定化の間のような危機的状況における血栓塞栓症の予防として、明らかな血栓塞栓性事象の治療として、又は体外治療法、例えば血液透析、心肺バイパス若しくは心臓カテーテル検査において利用される。ヘパリンの抗凝固効果は、多くの個々の影響性変数、例えば、体重又は肝機能及び腎機能の影響下におかれ、そして誤った投薬量は、出血性合併症又は血栓塞栓性合併症を誘発し得るので、すべての患者においてはＵＦＨ、及び危険にさらされる（腎不全、肥満、妊娠）患者においてはＬＭＷＨに対する治療のモニタリングが指示される。
【０００６】
ヘパリン治療をモニターし、そしてヘパリンレベルを測定する種々の方法が当該分野で公知である。
【０００７】
ヘパリンを用いた治療及び予防は、慣用の全体的な凝固試験、例えばＰＴ、ＡＰＴＴ及びトロンビン時間を利用して血液の凝固性を検査することによって第一に間接的にモニターされ得る。ヘパリン化された患者サンプルの測定された凝固時間を、規定されたヘパリン濃度の標準血漿に基づく対応する基準値と比較することはまた、患者サンプルのヘパリンレベルの定量化を可能にする。凝固時間に基づくヘパリンの測定方法の例は、例えば、特許ＵＳ４,０６７,７７７及びＥＰ ２１７ ７６８ Ｂ１に記載されている。
【０００８】
凝固時間に基づくヘパリン測定の特定の型は、ＥＰ ２５９ ４６３ Ｂ１に記載されている。この方法において、凝固時間は、患者サンプルの１つのアリコートに対して測定され、一方サンプルの第２のアリコートは、まず、サンプル中に存在するヘパリンを完全に分解するためにヘパリナーゼで処理され、次いで凝固時間が測定される。これら２つの凝固時間の差異が、サンプル中に存在するヘパリン量の尺度であり、これは、適切な検量線から読み取られ得る。しかし文献において、全体的な凝固試験は、ＬＭＷＨの測定には不適切だとみなされている。なぜならこのアンチトロンビン効果の減少は、測定結果（凝固時間、ＩＮＲ）に対する効果が線形ではなく濃度依存的であることを意味するからである（例えば、Ｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．（２００４） Ｉｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ｈｅｐａｒｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ？ Ｙｅｓ．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２；５４７〜５５０ページを参照のこと）。
【０００９】
第二に、ヘパリン治療又は予防は、いわゆるアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）又は発色性ヘパリンアッセイを利用してモニターされ得、このアッセイは、ヘパリン活性の正確かつ高感度な測定を可能にする。これらの方法は実質的に、ヘパリン化サンプルを外因性のＦＸａ又はトロンビン（ＦＩＩａ）及び適切な因子特異的発色性基質とインキュベートすること、並びに基質の転換からこの酵素的なＦＸａ又はトロンビン活性であるヘパリン依存性不活性化を測定することに基づく。遊離した発色性の切断産物の量は、ヘパリン活性に反比例する。既知のヘパリン含有量を含む血漿の測定値から作成された軟正曲線を利用して、患者サンプル中のヘパリン量の正確な定量化が可能である。通常の血漿形態又はそうでなければ精製形態のいずれかのさらなるアンチトロンビンの反応混合物への添加は、過剰状態を引き起こすことによって、第一に異なる患者サンプル中の異なるアンチトロンビン濃度を相殺し、そして第二に、特に低いヘパリン濃度範囲の試験の感受性を増大する効果を有する。このようなアミド分解ヘパリンアッセイの多様な変形版が市販されている。例は、特許ＥＰ ００４ ２７１ Ａ２及びＥＰ ０３４ ３２０ Ｂ１に記載されている。従来技術に従って、この型の発色性抗ＦＸａ試験は、好ましくはＬＭＷＨの測定に利用されるはずである（例えばこれに関してもＨａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．（２００４）を参照のこと）。
【００１０】
ヘパリンは、１ミリリットル当たりの国際単位（ＩＵ／ｍｌ）で通常定量化される。抽出された生物学的物質としてのヘパリンは、とりわけ生物、組織、抽出条件に大きく左右され、そして測定可能な凝固効果は、間接的にしか検出されることができないので、効果の物理化学的定義（単位）は、実用的だと証明されていない。この理由のために、適切な計量基本単位が定義されており、そして産物の測定及び公表並びに新規な基本単位として使用される。最も一般的なものは、ＷＨＯに支持され、そしてＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ（ＮＩＢＳＣ、ＵＫ）によって管理される国際単位（ＩＵ）系である（概説については、例えば、Ｍｕｌｌｏｙ，Ｂ．ら（２０００） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｓｔ ５０ ｙｅａｒｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８４、１０５２〜１０５６及びＮＩＢＳＣのホームページ、 HYPERLINK “http://www.nibsc.ac.uk” ｗｗｗ．ｎｉｂｓｃ．ａｃ．ｕｋ上の生物学的な基本単位に対する最も最近の公表を参照のこと）。
【００１１】
すでに上記の通り、異なるヘパリンによる第Ｘａ因子の酵素活性の阻害強度の差異が存在する。この理由のために、第Ｘａ因子に基づくアッセイを軟正するために、患者サンプル中で定量化されるべきヘパリンを異なる濃度で用いることによって、測定されるべき各ヘパリンに対して別個の軟正曲線を作成する必要がある。ともかくサンプル中でヘパリンの正確な測定を実施し得るために、従ってどのヘパリン産物が患者の治療に使用されるかを知る必要があり、その結果、測定値が正確な軟正曲線を用いて定量化され得る。この方法の不利な点は、異なる軟正曲線の作成が労力と物質の負担を引き起こすこと、患者に使用されるヘパリン産物に対する誤った情報の危険性が常に存在し、これにより定量化の際に誤った軟正曲線を使用し、その結果として試験結果の誤った解釈をもたらすこと、及び患者の治療に用いられる産物の情報が与えられない場合は信頼性の高いヘパリン測定が不可能であることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って本発明は、ヘパリン産物特異的な軟正曲線の生成を伴わず、そしてすべてのヘパリンに対して万能の軟正曲線を使用することを可能にするヘパリンの測定方法を提供する目的に基づいた。本発明の目的の達成は、特許請求の範囲に記載されている条項及び方法の提供からなる。
【００１３】
本発明は、液体サンプル中、特に体液サンプル、例えば血液、血漿、血清又は尿中のヘパリン、すなわちＵＦヘパリン、ＬＭＷヘパリン、ヘパリン誘導体、ヘパリノイド及び五糖を測定するインビトロの方法に関し、これにおいてヘパリン活性は、ヘパリン依存性の第Ｘａ因子の不活性化から測定される。驚くべきことに、未分画ヘパリン若しくは分画ヘパリン、ヘパリン誘導体、ヘパリノイド又は合成五糖を含むヘパリン化サンプルのヘパリン修飾成分とのインキュベーションは、異なるヘパリンのＦＸａ阻害効果の差異の相殺を導くが、残存するＦＸａ阻害効果は、サンプル中に本来存在するヘパリン含有量となお相関し、従って１つの軟正曲線による定量化が可能であることがここで見出されている（また図３を参照のこと）。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ヘパリン修飾成分は、本発明の文脈において、オリゴ糖単位をヘパリンから除去し得、そしてＦＸａに基づくヘパリンアッセイに使用されるときに、サンプル物質又は他の添加試薬の構成成分に対して不利な効果を及ぼさない物質又は物質の混合物を意味し、その結果ヘパリン依存性のＦＸａ阻害の定量的測定が、この物質の存在下でなお可能である。本発明の方法におけるヘパリン修飾成分としての使用に対する物質の適合性は、例えば、調べられる物質の存在下及び同時にこの物質の非存在下でＦＸａに基づくヘパリンアッセイを行うことによって確認され得る。この物質の存在下においてＵＦＨを含むサンプル中で測定される絶対的な抗ＦＸａ活性は、この物質の非存在下の場合よりも低いが、この物質の存在下において残存する抗ＦＸａ活性は、このサンプル中に本来存在するヘパリン活性となお相関し、従ってヘパリン活性の正確な定量化を可能にするという事実によって好適な物質が認められ得る。
【００１５】
本発明の方法に好適なヘパリン修飾成分は、特に酵素である。なぜならこれらは、特異的に作用し、そして穏やかな事実上生理学的条件下で作用するので、従ってそれ自体でこの試験方法に対する不利な二次的効果を最小化又は除外し得る。グリコサミノグリカン鎖の切断及び修飾を可能にするグルクロニダーゼ群由来の酵素及びヘパリナーゼ群由来の酵素が特に好適である。グルクロニダーゼは、多様な起源、例えば大腸菌、ウシ肝臓又は軟体動物由来のヘパリン加水分解酵素であり、これは、化学修飾を伴わずにグルコサミノグリカン鎖を切断する。ヘパリンリアーゼとも呼ばれるヘパリナーゼは、微生物、例えばＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍによって天然に合成されるヘパリン特異的酵素であり、そして脱離反応機構を有し、すなわちまた切断反応において末端の糖群を化学的に修飾する。本発明の方法におけるヘパリン修飾成分としての使用に特に好適なものは、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ及びヘパリナーゼＩＩＩであり、これらは、例えばＦ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ培地から直接得られ得るか、又はそうでなければ、例えば大腸菌において組換え発現され得るかのいずれかである。ヘパリン修飾成分として同様に好適なものは、種々のヘパリナーゼ及び／又はグルクロニダーゼの混合物である。Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍから内因性ヘパリナーゼを得る方法、及び遺伝子操作による酵素の産生方法は、従来技術、例えばＵＳ ５,７１４,３７６及びＥＰ ６７０ ８９２ Ｂ１並びにこれらの中に引用される刊行物に記載されている。
【００１６】
ヘパリン修飾酵素又はヘパリン分解酵素は、完全な分解によってヘパリンを無力化するように当該分野において使用されるが、本発明の方法においてはこのヘパリン修飾成分は、サンプル中に存在するヘパリンを完全には分解せず、サンプル中に存在するヘパリンが単に修飾され、その結果アンチトロンビン活性化性質の定量化がなお可能であるような様式で利用される。この目的のために、ヘパリン修飾成分は、混合物中で好ましくは０.０５Ｕ／ｍｌ〜５.０Ｕ／ｍｌの濃度、特に好ましくは０.２５Ｕ／ｍｌ〜１.２５Ｕ／ｍｌの濃度で、ＦＸａが添加される前にサンプルとインキュベートされる。これに関して、１単位は、３０℃及びｐＨ７.０で１分間につきヘパリン（ブタ粘膜由来；約１０９ＩＵ／ｍｇ）から不飽和オリゴ糖１μｍｏｌを脱離するのに必要とされる酵素量に相当する。
【００１７】
本発明の方法において、サンプルは、第Ｘａ因子が添加される前に規定の間ヘパリン修飾成分とインキュベートされる。このサンプルは、ＦＸａの添加前に好ましくは１０秒間〜９００秒間、特に好ましくは１５秒間〜９０秒間、極めて特に好ましくは２０秒間〜６０秒間ヘパリン修飾成分とインキュベートされる。より短いインキュベーション時間及びより長いインキュベーション時間が可能であり、このインキュベーション時間を使用されるヘパリン修飾成分の濃度及び選択される反応温度に第一に釣り合わせることが必要である。通常は３７℃の反応温度が、凝固の診断において生理学的に関連したパラメーターの測定に好ましい。当業者が、認識している熱力学的効果、例えば生化学的反応の速度論に対する熱力学的効果を考慮に含める限りは、より低い反応温度又はより高い反応温度も同様に使用され得る。
【００１８】
本発明の方法の好ましい実施態様において、クエン酸血漿サンプルが、アンチトロンビンを含む試薬と最初に混合される。これは、例えば正常な血漿形態又はそうでなければ精製されたアンチトロンビンの形態をとり得る。アンチトロンビンは、好ましくは過剰に添加され、その結果、ＦＸａを阻害するのに必要な量よりも多くのアンチトロンビンが混合物中に存在する。このサンプルがアンチトロンビン試薬で前処理される場合、ヘパリン修飾成分は、好ましくはこの試薬中に存在し得る。
【００１９】
ヘパリン修飾成分とのサンプルのインキュベーション及びしかるべき場合のアンチトロンビンとのサンプルのインキュベーションの後に、反応混合物への第Ｘａ因子の添加が続く。この第Ｘａ因子は、ヒト、ウシ又はそれらの組換え変異体であり得る。特に好ましい実施態様において、このＦＸａ試薬は、硫酸デキストランをさらに含み得る。ＦＸａ試薬とは別に、サンプルに硫酸デキストランを添加することも同様に可能である。
【００２０】
添加された第Ｘａ因子が、このサンプル中に存在するヘパリンすなわち本発明に従って修飾されるヘパリン誘導体の機能として不活性化されるインキュベーション時間の後に、基質が反応混合物に添加される。第Ｘａ因子への曝露の際に色素を解放する発色性基質が好ましくは使用される。この色素は、スペクトルの可視領域で測定され得る色素、蛍光色素、又はＵＶ領域で測定され得る色素であり得る。アミド結合によってアルギニン残基のカルボキシ基に結合した色素残基を有するペプチドが好ましくは使用される。この目的に特に好適なものは、ｐ−ニトロアニリド基（ｐＮＡ）及び５−アミノ−２−ニトロ安息香酸誘導体（ＡＮＢＡ）、並びに置換によってそれらから誘導され、そしてペプチド位置が解放された後、４０５ｎｍの波長での測光法によって定量化され得る色素である。好適な基質の例は、Ｂｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ及びＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−メチルアミドである。
【００２１】
この方法は、動力学的測定又はエンドポイント（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）測定として評価され得る。動力学的方法において、この反応、すなわち残存する第Ｘａ因子の活性は、発色性基質の転換速度に基づいて、存在するヘパリン活性の尺度として定量化される。エンドポイント測定においては、この反応は、酸、例えば酢酸の添加によって所定の測定時間後に停止され、そして解放された色素量が測定される。
【００２２】
本発明の方法の好ましい実施態様において、サンプルのヘパリン活性は、すべてのヘパリン変異体に適した万能の軟正曲線によって、サンプル中に存在するヘパリンの性質とは関係なく定量化される。この評価は、規定量のヘパリンを含むキャリブレーター溶液を利用して、及び／又はこのキャリブレーター溶液の希釈を利用して生成されている基準曲線に基づいて行われる。当該分野で公知の方法とは対照的に、本発明の方法においては、この軟正に使用されるヘパリン調製物は患者サンプル中で測定されるべき調製物と同じである必要はない。本発明の方法により、任意のヘパリン、未分画ヘパリン若しくは分画ヘパリン又は五糖が軟正に使用され得、そして任意の患者サンプルのヘパリン活性が、投与される調製物とは関係なくこの生成された軟正曲線を用いて定量化され得る。例えば、ブタ粘膜由来の未分画高分子量ヘパリンであるＬｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｌｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）又は分画低分子量ヘパリンであるＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＵＳＡを用いて、すべてのヘパリン変異体に適した万能の軟正曲線を生成し得る。ＵＦヘパリン又はＬＭＷヘパリンが、等張の食塩水で１０ＩＵ／ｍｌに希釈され、そして最終的にヘパリンを含まないプール血漿、すなわち標準血漿で希釈されることが好ましく、その結果本発明の方法によって、基準曲線が治療範囲全体について生成され得る。
【００２３】
本発明の方法は、手動での実施及び自動分析器での使用の両方に好適である。
【００２４】
本発明の方法は、本発明の方法を実施するために使用されるヘパリン修飾成分を阻害する物質をさらに含むサンプル中でヘパリン活性を測定することにのみ条件付きで好適である。特許文書ＷＯ ０１／４６３８５ Ａ１は、例えば、ヘパリナーゼインヒビターとして作用し、そして治療用途に好適らしい化合物、ＣＲＭ６４６−Ａ及びＣＲＭ６４６−Ｂを記載している。このヘパリン修飾効果は、使用されるヘパリン修飾成分を阻害する物質を含むサンプル中での本発明のヘパリン活性の本発明に従う測定の際に損なわれ得る。本発明の方法を利用してあらかじめ作成された軟正曲線を用いてこのようなサンプルのヘパリン含有量を定量化することは、誤った測定をおそらく大いに導くことになる。従って本発明の方法は、好ましくは、この方法において使用されるヘパリン修飾成分を阻害する物質を含まない液体サンプル中でのヘパリン活性の測定に好適である。好ましい実施態様において、このサンプルは、グルクロニダーゼインヒビターを含まず、そして／又は例えばＣＲＭ６４６−Ａ及びＣＲＭ６４６−Ｂ（ＷＯ ０１／４６３８５ Ａ１）のようなヘパリナーゼインヒビターを含まない。本発明の趣旨の範囲内のヘパリナーゼインヒビター及び／又はグルクロニダーゼインヒビターを含まないサンプルは、例えば、インビボでこのようなインヒビターを用いて治療的に処置されてもおらず、インビトロでこのようなインヒビターと混合されてもいない１つ又はそれ以上のヒト又は動物由来の体液サンプルである。
【００２５】
本発明のさらなる局面は、本発明のＦＸａに基づくヘパリンアッセイを実施するための試験キットに関し、ここでこの試験キットは、一方はヘパリン修飾成分を含み、そして他方はＦＸａを含む少なくとも２つの試薬を含む。これらの試薬は、防腐剤をさらに含み得、そして液体試薬又は凍結乾燥物のいずれかとして提供され得る。
【００２６】
ヘパリン修飾成分を含む試薬は、ＦＸａに基づくヘパリンアッセイの実施に必要とされるさらなる成分、例えばアンチトロンビン又は基質をさらに含み得る。試験設計如何により、サンプルへの個々の成分の添加の順序は異なり得る。ある場合では、検出反応は、基質の添加によって開始されることになり、そして他の場合では、ＦＸａの添加によって開始されることになる。ＦＸａを添加する前にサンプルと混合される試薬中に存在しているヘパリン修飾成分に注意を払わなければならない。本発明の試験キットの特に好ましい実施態様は、アンチトロンビンとともにヘパリン修飾成分を含む試薬を備える。
【００２７】
ヘパリン修飾成分を含む試薬及びＦＸａを含む試薬に加えて、本発明の試験キットは、例えば第Ｘａ因子の基質を含む試薬及び／又はアンチトロンビンを含む試薬のようなさらなる試薬をさらに含み得る。好ましいＦＸａ試薬は、硫酸デキストランをさらに含み得る。別の好ましい試薬は、硫酸デキストランとともに、アンチトロンビンを含み得る。
【００２８】
本発明の試験キットの試薬は、液体又は凍結乾燥形態で提供され得る。この試験キットの試薬のいくつか又はすべてが凍結乾燥物の形態である場合、この試験キットは、凍結乾燥物を溶解するのに必要な溶媒、例えば蒸留水、好適な緩衝液及び／又は標準ヒト血漿をさらに含み得る。
【００２９】
以下の実施例は、本発明の方法を例示するのに役立ち、そして限定的とみなされるべきではない。
【００３０】
〔実施例〕
実施例１
凍結乾燥され、そして再構成されたヒトのクエン酸血漿を、ＵＦヘパリンであるＬｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｌｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１ＩＵ／ｍｌ又はＬＭＷヘパリンであるＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＵＳＡ）１ＩＵ／ｍｌでスパイクした。血漿サンプル２０μｌを、ヘパリナーゼＩ（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｈｅｐｚｙｍｅ（登録商標）、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）０.５５Ｕ／ｍｌ（図１Ａ）又は１.４Ｕ／ｍｌ（図１Ｂ）をさらに含んだアンチトロンビン試薬（ＡＴ試薬；凍結乾燥され、そして再構成されたもの、１ＩＵ／ｍｌ）２０μｌと３７℃で２０秒間〜９００秒間インキュベートした。次いでこの反応混合物を、第Ｘａ因子試薬［凍結乾燥され、そしてＴＲＩＳ（６ｇ／ｌ）、ＥＤＴＡ（０.７４ｇ／ｌ）及び塩化ナトリウム（１２ｇ／ｌ）を添加することにより再構成されたヒトＦＸａ］１７０μｌと混合し、そして３７℃で１分間インキュベートした。この反応を、基質試薬（Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−メチルアミド、４ｍＭ）４０μｌの添加によって開始し、そしてＡＮＢＡの形成を、自動測定器Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）ＣＡ−１５００（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において４０５ｎｍの波長及び３７℃で検出した。ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬との血漿の種々のインキュベーション時間に対する１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を図１に示す。
【００３１】
図１は、ＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））及びＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））を含む血漿の混合物において、２つの異なるヘパリナーゼ活性に対応してインキュベーション時間に渡って測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。ヘパリンを含まない標準ヒト血漿（ＳＨＰ）を、コントロールとして各場合測定した。ヘパリンを含まないこの血漿は、ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬とのサンプルのインキュベーション時間の関数として吸光度変化を示さなかった。ヘパリンを含む血漿の場合、インキュベーション時間の増加とともに吸光度変化が増大した。約３００秒後、吸光度変化はプラトーに達し、これはヘパリンを含まない血漿の値よりも明らかに低かった。ヘパリナーゼとのサンプルのインキュベーションを９００秒に延長しても、調べられたヘパリンの抗ＦＸａ活性を完全に排除することはできなかった。ここで利用されるヘパリナーゼ含有量は、達したプラトーの絶対的高さをわずかな程度だけ調節した。図１Ａ（ＦＸａの添加前に混合物中でヘパリナーゼ０.２７５Ｕ／ｍｌ）及び図１Ｂ（ＦＸａの添加前に混合物中でヘパリナーゼ０.７Ｕ／ｍｌ）を比較のこと。
【００３２】
実施例２
凍結乾燥され、そして再構成されたヒトのクエン酸血漿を、Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）（図２Ａ）又はＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）（図２Ｂ）各々０.２４ＩＵ／ｍｌ、０.４８ＩＵ／ｍｌ、０.７２ＩＵ／ｍｌ、１ＩＵ／ｍｌ及び１.２ＩＵ／ｍｌでスパイクした。ＡＴ試薬（凍結乾燥され、そして再構成されたもの、１ＩＵ／ｍｌ）を、０Ｕ／ｍｌ〜５.５Ｕ／ｍｌまでの漸増濃度のヘパリナーゼＩ（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｈｅｐｚｙｍｅ（登録商標））と混合した。血漿サンプル２０μｌを、ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬２０μｌと各々混合し、そして３７℃で２０秒間インキュベートした。次いでこの反応混合物を、第Ｘａ因子試薬（実施例１を参照のこと）１７０μｌと混合し、そして３７℃で１分間インキュベートした。この反応を、基質試薬（実施例１を参照のこと）４０μｌの添加によって開始し、そしてＡＮＢＡの形成を、実施例１にすでに記載されるように自動で検出した。ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬との血漿の種々の反応混合物に対する１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を図２に示す。異なるヘパリナーゼ活性を用いた軟正曲線を、このようにシミュレートした。
【００３３】
図２は、クエン酸血漿の種々のヘパリン濃度に対応して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。異なる曲線は、ＦＸａの添加前の混合物中の異なるヘパリナーゼ活性を反映した。血漿を、図２ＡではＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））、及び図２ＢではＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））でスパイクした。これらの図は、ヘパリナーゼ含有量が増大するにつれて、ＵＦＨ及びＬＭＷＨの両方の軟正曲線は緩やかな勾配になるが、一方、等しいヘパリン含有量、すなわち等しいＬｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）又はＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）活性に関して、分解の初速度は、ＬＭＷヘパリン（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））よりもＵＦヘパリン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））の方が大きいことを示した。本実施例に示された最も高いヘパリナーゼ濃度を用いても、この軟正線は、ヘパリンの初期濃度に依存して線形の単調コースを示した。ヘパリンの抗ＦＸａ活性は、ヘパリナーゼを３７℃で２０秒間インキュベーションしても本実施例で選択された最も高いヘパリナーゼ活性により完全に排除することはできなかった。
【００３４】
実施例３
例示的な試験設計を、ＵＦＨ及びＬＭＷＨの均一な修飾能力、すなわち共通の軟正曲線の可能性を説明するためにここで選択した。
凍結乾燥され、そして再構成されたヒトのクエン酸血漿を、Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）又はＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）各々０.２４ＩＵ／ｍｌ、０.４８ＩＵ／ｍｌ、０.７２ＩＵ／ｍｌ、１.００ＩＵ／ｍｌ及び１.２０ＩＵ／ｍｌでスパイクした。ＡＴ試薬（凍結乾燥され、そして再構成されたもの、１ＩＵ／ｍｌ）を、ヘパリナーゼＩ（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｈｅｐｚｙｍｅ（登録商標））（１.４Ｕ／ｍｌ）と混合し、一方ヘパリナーゼを添加されないＡＴ試薬は、コントロールの役割をした。血漿サンプル２０μｌを、ＡＴ試薬２０μｌと各々混合し、そして３７℃で２０秒間インキュベートした。次いでこの反応混合物を、第Ｘａ因子試薬（実施例１を参照のこと）１７０μｌと混合し、そして３７℃で１分間インキュベートした。この反応を、基質試薬（実施例１を参照のこと）４０μｌの添加によって開始し、そしてＡＮＢＡの形成を、実施例１にすでに記載されるように自動で検出した。ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬との血漿の種々の反応混合物に対する１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を図３に示す。
【００３５】
図３は、クエン酸血漿の異なるヘパリン濃度に対して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。各場合の曲線は、ヘパリン（ＵＦＨ又はＬＭＷＨ）の組み合わせ及び選択されたヘパリナーゼ活性（従来技術に対応した基礎的試験として０Ｕ／ｍｌ、及び本明細書中に記載されている発明に対応して０.７Ｕ／ｍｌ）を記載している。図３は、Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）及びＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）の例に関してヘパリナーゼを添加しない場合のＵＦＨ及びＬＭＷＨの軟正曲線からの逸脱を示す（黒符号）。ヘパリナーゼを含むＡＴ試薬での軟正の実施は、種々のヘパリンの軟正曲線を互いに近づけさせる（白符号）。ヘパリン修飾成分の使用を通じて示される例においては、軟正曲線の勾配はより小さくなるが、測定されたシグナルと血漿中のヘパリン濃度との間に明白な線形関連がなお存在し、これにより、これらの軟正曲線に基づいて、血漿サンプル中のヘパリン濃度の正確な測定を可能にする。
【００３６】
当業者は、一般的な専門知識を通じて、試験手順の型通りの変更によって（例えば、サンプル量を変化させることによって、ＦＸａ不活性化時間を変化させることによって、反応温度、ｐＨ、イオン強度又は他のパラメーターを変化させることによって）軟正曲線の勾配を変化させ得、そしてこれを試験の要件に適応させ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】ＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））及びＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））を含む血漿の混合物において、ＦＸａの添加前に混合物中でヘパリナーゼ０.２７５Ｕ／ｍｌとしたヘパリナーゼ活性に対応してインキュベーション時間に渡って測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【図１Ｂ】ＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））及びＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））を含む血漿の混合物において、ＦＸａの添加前に混合物中でヘパリナーゼ０.７Ｕ／ｍｌとしたヘパリナーゼ活性に対応してインキュベーション時間に渡って測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【図２Ａ】クエン酸血漿の種々のヘパリン濃度（ＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））を用いた）に対応して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【図２Ｂ】クエン酸血漿の種々のヘパリン濃度（ＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））を用いた）に対応して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【図３】クエン酸血漿の異なるヘパリン濃度に対して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固障害の診断に関係し、そしてサンプル中のヘパリン活性を測定するインビトロの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、負に荷電した種々の長さのポリ硫酸化グルコサミノグリカン鎖であり、そしてインビボ及びインビトロで即時かつ濃度依存的に凝固を阻害するとりわけ最も一般に普及した抗凝固物質である。鎖長如何により、３０００ダルトンから３００００ダルトンまでの間の分子量を有するいわゆる未分画（ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）高分子量ヘパリン（ＵＦＨ、ＵＦヘパリン）と約４０００ダルトンから９０００ダルトンまでの間の分子量を有するいわゆる分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ、ＬＭＷヘパリン）との間の区別が本質的に行われる。分画ヘパリンは、酵素的切断若しくは化学的切断又はクロマトグラフィーによって未分画ヘパリンから一般に得られる。切断方法如何により、得られる産物は、物理化学的性質、例えば平均鎖長、分子量区分、硫酸化又はグリカン修飾の程度が異なり、これは、これらの産物の生物学的活性に影響を及ぼす。ヘパリン誘導体及びヘパリノイド（ｈｅｐａｒｉｎｏｉｄ）は、酵素的及び／又は化学的に修飾されたグルコサミノグリカン鎖であり、この抗凝固性質は、グリカン鎖長、硫酸化パターン及びアセチル化パターンの標的化作用を通じて又は異なるグルコサミノグリカンの混合を通じて生物工学的に修飾され得、これは例えば、ダナパロイド（ｄａｎａｐａｒｏｉｄ）ナトリウムの場合、主にヘパラン硫酸並びに少ない比率のデルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸からなるグリコサミノグリカンの混合物であることが挙げられる。
【０００３】
すべてのヘパリンの抗凝固効果は、活性化凝固因子の最も重要な血漿インヒビターであるアンチトロンビン（ＡＴ、アンチトロンビンＩＩＩ）との複合体の形成に由来する。アンチトロンビンは、セリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）群に属し、そして凝固因子トロンビン（第ＩＩａ因子、ＦＩＩａ）及び第Ｘａ因子（ＦＸａ）並びに少ない程度でまた他のセリンプロテアーゼＦＩＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン及びプラスミンを阻害する。アンチトロンビンとのヘパリンの結合は、アンチトロンビンのコンホメーション変化をもたらし、この変化は、アンチトロンビンの阻害効果を何倍も増強する。アンチトロンビンとの結合を担うヘパリン分子の結合部位は、特徴的な五糖配列からなる。この五糖の完全なる合成形態（フォンダパリヌクス（ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ））は、凝固性の医学的な阻害としてＵＦＨ又はＬＭＷＨとまさしく同様に利用される。
【０００４】
未分画ヘパリン及び分画ヘパリン、ヘパリン誘導体、ヘパリノイド並びに五糖は、それらの抗凝固効果が異なる。ＵＦＨは、トロンビン及びＦＸａを等しく阻害するのに対して、ＬＭＷＨは主にＦＸａの阻害効果を示し、トロンビンの阻害効果はわずかな程度しか示さない。五糖、例えばフォンダパリヌクスは、ＦＸａを選択的に阻害し、トロンビン阻害はまったく示さない。
【０００５】
適応症如何により、ヘパリンは予防的又は治療的に利用され、例えば、手術若しくは固定化の間のような危機的状況における血栓塞栓症の予防として、明らかな血栓塞栓性事象の治療として、又は体外治療法、例えば血液透析、心肺バイパス若しくは心臓カテーテル検査において利用される。ヘパリンの抗凝固効果は、多くの個々の影響性変数、例えば、体重又は肝機能及び腎機能の影響下におかれ、そして誤った投薬量は、出血性合併症又は血栓塞栓性合併症を誘発し得るので、すべての患者においてはＵＦＨ、及び危険にさらされる（腎不全、肥満、妊娠）患者においてはＬＭＷＨに対する治療のモニタリングが指示される。
【０００６】
ヘパリン治療をモニターし、そしてヘパリンレベルを測定する種々の方法が当該分野で公知である。
【０００７】
ヘパリンを用いた治療及び予防は、慣用の全体的な凝固試験、例えばＰＴ、ＡＰＴＴ及びトロンビン時間を利用して血液の凝固性を検査することによって第一に間接的にモニターされ得る。ヘパリン化された患者サンプルの測定された凝固時間を、規定されたヘパリン濃度の標準血漿に基づく対応する基準値と比較することはまた、患者サンプルのヘパリンレベルの定量化を可能にする。凝固時間に基づくヘパリンの測定方法の例は、例えば、特許ＵＳ４,０６７,７７７及びＥＰ ２１７ ７６８ Ｂ１に記載されている。
【０００８】
凝固時間に基づくヘパリン測定の特定の型は、ＥＰ ２５９ ４６３ Ｂ１に記載されている。この方法において、凝固時間は、患者サンプルの１つのアリコートに対して測定され、一方サンプルの第２のアリコートは、まず、サンプル中に存在するヘパリンを完全に分解するためにヘパリナーゼで処理され、次いで凝固時間が測定される。これら２つの凝固時間の差異が、サンプル中に存在するヘパリン量の尺度であり、これは、適切な検量線から読み取られ得る。しかし文献において、全体的な凝固試験は、ＬＭＷＨの測定には不適切だとみなされている。なぜならこのアンチトロンビン効果の減少は、測定結果（凝固時間、ＩＮＲ）に対する効果が線形ではなく濃度依存的であることを意味するからである（例えば、Ｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．（２００４） Ｉｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ｈｅｐａｒｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ？ Ｙｅｓ．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２；５４７〜５５０ページを参照のこと）。
【０００９】
第二に、ヘパリン治療又は予防は、いわゆるアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）又は発色性ヘパリンアッセイを利用してモニターされ得、このアッセイは、ヘパリン活性の正確かつ高感度な測定を可能にする。これらの方法は実質的に、ヘパリン化サンプルを外因性のＦＸａ又はトロンビン（ＦＩＩａ）及び適切な因子特異的発色性基質とインキュベートすること、並びに基質の転換からこの酵素的なＦＸａ又はトロンビン活性であるヘパリン依存性不活性化を測定することに基づく。遊離した発色性の切断産物の量は、ヘパリン活性に反比例する。既知のヘパリン含有量を含む血漿の測定値から作成された軟正曲線を利用して、患者サンプル中のヘパリン量の正確な定量化が可能である。通常の血漿形態又はそうでなければ精製形態のいずれかのさらなるアンチトロンビンの反応混合物への添加は、過剰状態を引き起こすことによって、第一に異なる患者サンプル中の異なるアンチトロンビン濃度を相殺し、そして第二に、特に低いヘパリン濃度範囲の試験の感受性を増大する効果を有する。このようなアミド分解ヘパリンアッセイの多様な変形版が市販されている。例は、特許ＥＰ ００４ ２７１ Ａ２及びＥＰ ０３４ ３２０ Ｂ１に記載されている。従来技術に従って、この型の発色性抗ＦＸａ試験は、好ましくはＬＭＷＨの測定に利用されるはずである（例えばこれに関してもＨａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．（２００４）を参照のこと）。
【００１０】
ヘパリンは、１ミリリットル当たりの国際単位（ＩＵ／ｍｌ）で通常定量化される。抽出された生物学的物質としてのヘパリンは、とりわけ生物、組織、抽出条件に大きく左右され、そして測定可能な凝固効果は、間接的にしか検出されることができないので、効果の物理化学的定義（単位）は、実用的だと証明されていない。この理由のために、適切な計量基本単位が定義されており、そして産物の測定及び公表並びに新規な基本単位として使用される。最も一般的なものは、ＷＨＯに支持され、そしてＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ（ＮＩＢＳＣ、ＵＫ）によって管理される国際単位（ＩＵ）系である（概説については、例えば、Ｍｕｌｌｏｙ，Ｂ．ら（２０００） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｓｔ ５０ ｙｅａｒｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８４、１０５２〜１０５６及びＮＩＢＳＣのホームページ、 HYPERLINK “http://www.nibsc.ac.uk” ｗｗｗ．ｎｉｂｓｃ．ａｃ．ｕｋ上の生物学的な基本単位に対する最も最近の公表を参照のこと）。
【００１１】
すでに上記の通り、異なるヘパリンによる第Ｘａ因子の酵素活性の阻害強度の差異が存在する。この理由のために、第Ｘａ因子に基づくアッセイを軟正するために、患者サンプル中で定量化されるべきヘパリンを異なる濃度で用いることによって、測定されるべき各ヘパリンに対して別個の軟正曲線を作成する必要がある。ともかくサンプル中でヘパリンの正確な測定を実施し得るために、従ってどのヘパリン産物が患者の治療に使用されるかを知る必要があり、その結果、測定値が正確な軟正曲線を用いて定量化され得る。この方法の不利な点は、異なる軟正曲線の作成が労力と物質の負担を引き起こすこと、患者に使用されるヘパリン産物に対する誤った情報の危険性が常に存在し、これにより定量化の際に誤った軟正曲線を使用し、その結果として試験結果の誤った解釈をもたらすこと、及び患者の治療に用いられる産物の情報が与えられない場合は信頼性の高いヘパリン測定が不可能であることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って本発明は、ヘパリン産物特異的な軟正曲線の生成を伴わず、そしてすべてのヘパリンに対して万能の軟正曲線を使用することを可能にするヘパリンの測定方法を提供する目的に基づいた。本発明の目的の達成は、特許請求の範囲に記載されている条項及び方法の提供からなる。
【００１３】
本発明は、液体サンプル中、特に体液サンプル、例えば血液、血漿、血清又は尿中のヘパリン、すなわちＵＦヘパリン、ＬＭＷヘパリン、ヘパリン誘導体、ヘパリノイド及び五糖を測定するインビトロの方法に関し、これにおいてヘパリン活性は、ヘパリン依存性の第Ｘａ因子の不活性化から測定される。驚くべきことに、未分画ヘパリン若しくは分画ヘパリン、ヘパリン誘導体、ヘパリノイド又は合成五糖を含むヘパリン化サンプルのヘパリン修飾成分とのインキュベーションは、異なるヘパリンのＦＸａ阻害効果の差異の相殺を導くが、残存するＦＸａ阻害効果は、サンプル中に本来存在するヘパリン含有量となお相関し、従って１つの軟正曲線による定量化が可能であることがここで見出されている（また図３を参照のこと）。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ヘパリン修飾成分は、本発明の文脈において、オリゴ糖単位をヘパリンから除去し得、そしてＦＸａに基づくヘパリンアッセイに使用されるときに、サンプル物質又は他の添加試薬の構成成分に対して不利な効果を及ぼさない物質又は物質の混合物を意味し、その結果ヘパリン依存性のＦＸａ阻害の定量的測定が、この物質の存在下でなお可能である。本発明の方法におけるヘパリン修飾成分としての使用に対する物質の適合性は、例えば、調べられる物質の存在下及び同時にこの物質の非存在下でＦＸａに基づくヘパリンアッセイを行うことによって確認され得る。この物質の存在下においてＵＦＨを含むサンプル中で測定される絶対的な抗ＦＸａ活性は、この物質の非存在下の場合よりも低いが、この物質の存在下において残存する抗ＦＸａ活性は、このサンプル中に本来存在するヘパリン活性となお相関し、従ってヘパリン活性の正確な定量化を可能にするという事実によって好適な物質が認められ得る。
【００１５】
本発明の方法に好適なヘパリン修飾成分は、特に酵素である。なぜならこれらは、特異的に作用し、そして穏やかな事実上生理学的条件下で作用するので、従ってそれ自体でこの試験方法に対する不利な二次的効果を最小化又は除外し得る。グリコサミノグリカン鎖の切断及び修飾を可能にするグルクロニダーゼ群由来の酵素及びヘパリナーゼ群由来の酵素が特に好適である。グルクロニダーゼは、多様な起源、例えば大腸菌、ウシ肝臓又は軟体動物由来のヘパリン加水分解酵素であり、これは、化学修飾を伴わずにグルコサミノグリカン鎖を切断する。ヘパリンリアーゼとも呼ばれるヘパリナーゼは、微生物、例えばＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍによって天然に合成されるヘパリン特異的酵素であり、そして脱離反応機構を有し、すなわちまた切断反応において末端の糖群を化学的に修飾する。本発明の方法におけるヘパリン修飾成分としての使用に特に好適なものは、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ及びヘパリナーゼＩＩＩであり、これらは、例えばＦ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ培地から直接得られ得るか、又はそうでなければ、例えば大腸菌において組換え発現され得るかのいずれかである。ヘパリン修飾成分として同様に好適なものは、種々のヘパリナーゼ及び／又はグルクロニダーゼの混合物である。Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍから内因性ヘパリナーゼを得る方法、及び遺伝子操作による酵素の産生方法は、従来技術、例えばＵＳ ５,７１４,３７６及びＥＰ ６７０ ８９２ Ｂ１並びにこれらの中に引用される刊行物に記載されている。
【００１６】
ヘパリン修飾酵素又はヘパリン分解酵素は、完全な分解によってヘパリンを無力化するように当該分野において使用されるが、本発明の方法においてはこのヘパリン修飾成分は、サンプル中に存在するヘパリンを完全には分解せず、サンプル中に存在するヘパリンが単に修飾され、その結果アンチトロンビン活性化性質の定量化がなお可能であるような様式で利用される。この目的のために、ヘパリン修飾成分は、混合物中で好ましくは０.０５Ｕ／ｍｌ〜５.０Ｕ／ｍｌの濃度、特に好ましくは０.２５Ｕ／ｍｌ〜１.２５Ｕ／ｍｌの濃度で、ＦＸａが添加される前にサンプルとインキュベートされる。これに関して、１単位は、３０℃及びｐＨ７.０で１分間につきヘパリン（ブタ粘膜由来；約１０９ＩＵ／ｍｇ）から不飽和オリゴ糖１μｍｏｌを脱離するのに必要とされる酵素量に相当する。
【００１７】
本発明の方法において、サンプルは、第Ｘａ因子が添加される前に規定の間ヘパリン修飾成分とインキュベートされる。このサンプルは、ＦＸａの添加前に好ましくは１０秒間〜９００秒間、特に好ましくは１５秒間〜９０秒間、極めて特に好ましくは２０秒間〜６０秒間ヘパリン修飾成分とインキュベートされる。より短いインキュベーション時間及びより長いインキュベーション時間が可能であり、このインキュベーション時間を使用されるヘパリン修飾成分の濃度及び選択される反応温度に第一に釣り合わせることが必要である。通常は３７℃の反応温度が、凝固の診断において生理学的に関連したパラメーターの測定に好ましい。当業者が、認識している熱力学的効果、例えば生化学的反応の速度論に対する熱力学的効果を考慮に含める限りは、より低い反応温度又はより高い反応温度も同様に使用され得る。
【００１８】
本発明の方法の好ましい実施態様において、クエン酸血漿サンプルが、アンチトロンビンを含む試薬と最初に混合される。これは、例えば正常な血漿形態又はそうでなければ精製されたアンチトロンビンの形態をとり得る。アンチトロンビンは、好ましくは過剰に添加され、その結果、ＦＸａを阻害するのに必要な量よりも多くのアンチトロンビンが混合物中に存在する。このサンプルがアンチトロンビン試薬で前処理される場合、ヘパリン修飾成分は、好ましくはこの試薬中に存在し得る。
【００１９】
ヘパリン修飾成分とのサンプルのインキュベーション及びしかるべき場合のアンチトロンビンとのサンプルのインキュベーションの後に、反応混合物への第Ｘａ因子の添加が続く。この第Ｘａ因子は、ヒト、ウシ又はそれらの組換え変異体であり得る。特に好ましい実施態様において、このＦＸａ試薬は、硫酸デキストランをさらに含み得る。ＦＸａ試薬とは別に、サンプルに硫酸デキストランを添加することも同様に可能である。
【００２０】
添加された第Ｘａ因子が、このサンプル中に存在するヘパリンすなわち本発明に従って修飾されるヘパリン誘導体の機能として不活性化されるインキュベーション時間の後に、基質が反応混合物に添加される。第Ｘａ因子への曝露の際に色素を解放する発色性基質が好ましくは使用される。この色素は、スペクトルの可視領域で測定され得る色素、蛍光色素、又はＵＶ領域で測定され得る色素であり得る。アミド結合によってアルギニン残基のカルボキシ基に結合した色素残基を有するペプチドが好ましくは使用される。この目的に特に好適なものは、ｐ−ニトロアニリド基（ｐＮＡ）及び５−アミノ−２−ニトロ安息香酸誘導体（ＡＮＢＡ）、並びに置換によってそれらから誘導され、そしてペプチド位置が解放された後、４０５ｎｍの波長での測光法によって定量化され得る色素である。好適な基質の例は、Ｂｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ及びＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−メチルアミドである。
【００２１】
この方法は、動力学的測定又はエンドポイント（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）測定として評価され得る。動力学的方法において、この反応、すなわち残存する第Ｘａ因子の活性は、発色性基質の転換速度に基づいて、存在するヘパリン活性の尺度として定量化される。エンドポイント測定においては、この反応は、酸、例えば酢酸の添加によって所定の測定時間後に停止され、そして解放された色素量が測定される。
【００２２】
本発明の方法の好ましい実施態様において、サンプルのヘパリン活性は、すべてのヘパリン変異体に適した万能の軟正曲線によって、サンプル中に存在するヘパリンの性質とは関係なく定量化される。この評価は、規定量のヘパリンを含むキャリブレーター溶液を利用して、及び／又はこのキャリブレーター溶液の希釈を利用して生成されている基準曲線に基づいて行われる。当該分野で公知の方法とは対照的に、本発明の方法においては、この軟正に使用されるヘパリン調製物は患者サンプル中で測定されるべき調製物と同じである必要はない。本発明の方法により、任意のヘパリン、未分画ヘパリン若しくは分画ヘパリン又は五糖が軟正に使用され得、そして任意の患者サンプルのヘパリン活性が、投与される調製物とは関係なくこの生成された軟正曲線を用いて定量化され得る。例えば、ブタ粘膜由来の未分画高分子量ヘパリンであるＬｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｌｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）又は分画低分子量ヘパリンであるＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＵＳＡを用いて、すべてのヘパリン変異体に適した万能の軟正曲線を生成し得る。ＵＦヘパリン又はＬＭＷヘパリンが、等張の食塩水で１０ＩＵ／ｍｌに希釈され、そして最終的にヘパリンを含まないプール血漿、すなわち標準血漿で希釈されることが好ましく、その結果本発明の方法によって、基準曲線が治療範囲全体について生成され得る。
【００２３】
本発明の方法は、手動での実施及び自動分析器での使用の両方に好適である。
【００２４】
本発明の方法は、本発明の方法を実施するために使用されるヘパリン修飾成分を阻害する物質をさらに含むサンプル中でヘパリン活性を測定することにのみ条件付きで好適である。特許文書ＷＯ ０１／４６３８５ Ａ１は、例えば、ヘパリナーゼインヒビターとして作用し、そして治療用途に好適らしい化合物、ＣＲＭ６４６−Ａ及びＣＲＭ６４６−Ｂを記載している。このヘパリン修飾効果は、使用されるヘパリン修飾成分を阻害する物質を含むサンプル中での本発明のヘパリン活性の本発明に従う測定の際に損なわれ得る。本発明の方法を利用してあらかじめ作成された軟正曲線を用いてこのようなサンプルのヘパリン含有量を定量化することは、誤った測定をおそらく大いに導くことになる。従って本発明の方法は、好ましくは、この方法において使用されるヘパリン修飾成分を阻害する物質を含まない液体サンプル中でのヘパリン活性の測定に好適である。好ましい実施態様において、このサンプルは、グルクロニダーゼインヒビターを含まず、そして／又は例えばＣＲＭ６４６−Ａ及びＣＲＭ６４６−Ｂ（ＷＯ ０１／４６３８５ Ａ１）のようなヘパリナーゼインヒビターを含まない。本発明の趣旨の範囲内のヘパリナーゼインヒビター及び／又はグルクロニダーゼインヒビターを含まないサンプルは、例えば、インビボでこのようなインヒビターを用いて治療的に処置されてもおらず、インビトロでこのようなインヒビターと混合されてもいない１つ又はそれ以上のヒト又は動物由来の体液サンプルである。
【００２５】
本発明のさらなる局面は、本発明のＦＸａに基づくヘパリンアッセイを実施するための試験キットに関し、ここでこの試験キットは、一方はヘパリン修飾成分を含み、そして他方はＦＸａを含む少なくとも２つの試薬を含む。これらの試薬は、防腐剤をさらに含み得、そして液体試薬又は凍結乾燥物のいずれかとして提供され得る。
【００２６】
ヘパリン修飾成分を含む試薬は、ＦＸａに基づくヘパリンアッセイの実施に必要とされるさらなる成分、例えばアンチトロンビン又は基質をさらに含み得る。試験設計如何により、サンプルへの個々の成分の添加の順序は異なり得る。ある場合では、検出反応は、基質の添加によって開始されることになり、そして他の場合では、ＦＸａの添加によって開始されることになる。ＦＸａを添加する前にサンプルと混合される試薬中に存在しているヘパリン修飾成分に注意を払わなければならない。本発明の試験キットの特に好ましい実施態様は、アンチトロンビンとともにヘパリン修飾成分を含む試薬を備える。
【００２７】
ヘパリン修飾成分を含む試薬及びＦＸａを含む試薬に加えて、本発明の試験キットは、例えば第Ｘａ因子の基質を含む試薬及び／又はアンチトロンビンを含む試薬のようなさらなる試薬をさらに含み得る。好ましいＦＸａ試薬は、硫酸デキストランをさらに含み得る。別の好ましい試薬は、硫酸デキストランとともに、アンチトロンビンを含み得る。
【００２８】
本発明の試験キットの試薬は、液体又は凍結乾燥形態で提供され得る。この試験キットの試薬のいくつか又はすべてが凍結乾燥物の形態である場合、この試験キットは、凍結乾燥物を溶解するのに必要な溶媒、例えば蒸留水、好適な緩衝液及び／又は標準ヒト血漿をさらに含み得る。
【００２９】
以下の実施例は、本発明の方法を例示するのに役立ち、そして限定的とみなされるべきではない。
【００３０】
〔実施例〕
実施例１
凍結乾燥され、そして再構成されたヒトのクエン酸血漿を、ＵＦヘパリンであるＬｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｌｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１ＩＵ／ｍｌ又はＬＭＷヘパリンであるＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＵＳＡ）１ＩＵ／ｍｌでスパイクした。血漿サンプル２０μｌを、ヘパリナーゼＩ（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｈｅｐｚｙｍｅ（登録商標）、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）０.５５Ｕ／ｍｌ（図１Ａ）又は１.４Ｕ／ｍｌ（図１Ｂ）をさらに含んだアンチトロンビン試薬（ＡＴ試薬；凍結乾燥され、そして再構成されたもの、１ＩＵ／ｍｌ）２０μｌと３７℃で２０秒間〜９００秒間インキュベートした。次いでこの反応混合物を、第Ｘａ因子試薬［凍結乾燥され、そしてＴＲＩＳ（６ｇ／ｌ）、ＥＤＴＡ（０.７４ｇ／ｌ）及び塩化ナトリウム（１２ｇ／ｌ）を添加することにより再構成されたヒトＦＸａ］１７０μｌと混合し、そして３７℃で１分間インキュベートした。この反応を、基質試薬（Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−メチルアミド、４ｍＭ）４０μｌの添加によって開始し、そしてＡＮＢＡの形成を、自動測定器Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）ＣＡ−１５００（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において４０５ｎｍの波長及び３７℃で検出した。ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬との血漿の種々のインキュベーション時間に対する１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を図１に示す。
【００３１】
図１は、ＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））及びＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））を含む血漿の混合物において、２つの異なるヘパリナーゼ活性に対応してインキュベーション時間に渡って測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。ヘパリンを含まない標準ヒト血漿（ＳＨＰ）を、コントロールとして各場合測定した。ヘパリンを含まないこの血漿は、ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬とのサンプルのインキュベーション時間の関数として吸光度変化を示さなかった。ヘパリンを含む血漿の場合、インキュベーション時間の増加とともに吸光度変化が増大した。約３００秒後、吸光度変化はプラトーに達し、これはヘパリンを含まない血漿の値よりも明らかに低かった。ヘパリナーゼとのサンプルのインキュベーションを９００秒に延長しても、調べられたヘパリンの抗ＦＸａ活性を完全に排除することはできなかった。ここで利用されるヘパリナーゼ含有量は、達したプラトーの絶対的高さをわずかな程度だけ調節した。図１Ａ（ＦＸａの添加前に混合物中でヘパリナーゼ０.２７５Ｕ／ｍｌ）及び図１Ｂ（ＦＸａの添加前に混合物中でヘパリナーゼ０.７Ｕ／ｍｌ）を比較のこと。
【００３２】
実施例２
凍結乾燥され、そして再構成されたヒトのクエン酸血漿を、Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）（図２Ａ）又はＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）（図２Ｂ）各々０.２４ＩＵ／ｍｌ、０.４８ＩＵ／ｍｌ、０.７２ＩＵ／ｍｌ、１ＩＵ／ｍｌ及び１.２ＩＵ／ｍｌでスパイクした。ＡＴ試薬（凍結乾燥され、そして再構成されたもの、１ＩＵ／ｍｌ）を、０Ｕ／ｍｌ〜５.５Ｕ／ｍｌまでの漸増濃度のヘパリナーゼＩ（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｈｅｐｚｙｍｅ（登録商標））と混合した。血漿サンプル２０μｌを、ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬２０μｌと各々混合し、そして３７℃で２０秒間インキュベートした。次いでこの反応混合物を、第Ｘａ因子試薬（実施例１を参照のこと）１７０μｌと混合し、そして３７℃で１分間インキュベートした。この反応を、基質試薬（実施例１を参照のこと）４０μｌの添加によって開始し、そしてＡＮＢＡの形成を、実施例１にすでに記載されるように自動で検出した。ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬との血漿の種々の反応混合物に対する１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を図２に示す。異なるヘパリナーゼ活性を用いた軟正曲線を、このようにシミュレートした。
【００３３】
図２は、クエン酸血漿の種々のヘパリン濃度に対応して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。異なる曲線は、ＦＸａの添加前の混合物中の異なるヘパリナーゼ活性を反映した。血漿を、図２ＡではＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））、及び図２ＢではＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））でスパイクした。これらの図は、ヘパリナーゼ含有量が増大するにつれて、ＵＦＨ及びＬＭＷＨの両方の軟正曲線は緩やかな勾配になるが、一方、等しいヘパリン含有量、すなわち等しいＬｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）又はＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）活性に関して、分解の初速度は、ＬＭＷヘパリン（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））よりもＵＦヘパリン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））の方が大きいことを示した。本実施例に示された最も高いヘパリナーゼ濃度を用いても、この軟正線は、ヘパリンの初期濃度に依存して線形の単調コースを示した。ヘパリンの抗ＦＸａ活性は、ヘパリナーゼを３７℃で２０秒間インキュベーションしても本実施例で選択された最も高いヘパリナーゼ活性により完全に排除することはできなかった。
【００３４】
実施例３
例示的な試験設計を、ＵＦＨ及びＬＭＷＨの均一な修飾能力、すなわち共通の軟正曲線の可能性を説明するためにここで選択した。
凍結乾燥され、そして再構成されたヒトのクエン酸血漿を、Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）又はＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）各々０.２４ＩＵ／ｍｌ、０.４８ＩＵ／ｍｌ、０.７２ＩＵ／ｍｌ、１.００ＩＵ／ｍｌ及び１.２０ＩＵ／ｍｌでスパイクした。ＡＴ試薬（凍結乾燥され、そして再構成されたもの、１ＩＵ／ｍｌ）を、ヘパリナーゼＩ（Ｄａｄｅ（登録商標）Ｈｅｐｚｙｍｅ（登録商標））（１.４Ｕ／ｍｌ）と混合し、一方ヘパリナーゼを添加されないＡＴ試薬は、コントロールの役割をした。血漿サンプル２０μｌを、ＡＴ試薬２０μｌと各々混合し、そして３７℃で２０秒間インキュベートした。次いでこの反応混合物を、第Ｘａ因子試薬（実施例１を参照のこと）１７０μｌと混合し、そして３７℃で１分間インキュベートした。この反応を、基質試薬（実施例１を参照のこと）４０μｌの添加によって開始し、そしてＡＮＢＡの形成を、実施例１にすでに記載されるように自動で検出した。ＡＴ−ヘパリナーゼ試薬との血漿の種々の反応混合物に対する１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を図３に示す。
【００３５】
図３は、クエン酸血漿の異なるヘパリン濃度に対して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。各場合の曲線は、ヘパリン（ＵＦＨ又はＬＭＷＨ）の組み合わせ及び選択されたヘパリナーゼ活性（従来技術に対応した基礎的試験として０Ｕ／ｍｌ、及び本明細書中に記載されている発明に対応して０.７Ｕ／ｍｌ）を記載している。図３は、Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標）及びＦｒａｇｍｉｎ（登録商標）の例に関してヘパリナーゼを添加しない場合のＵＦＨ及びＬＭＷＨの軟正曲線からの逸脱を示す（黒符号）。ヘパリナーゼを含むＡＴ試薬での軟正の実施は、種々のヘパリンの軟正曲線を互いに近づけさせる（白符号）。ヘパリン修飾成分の使用を通じて示される例においては、軟正曲線の勾配はより小さくなるが、測定されたシグナルと血漿中のヘパリン濃度との間に明白な線形関連がなお存在し、これにより、これらの軟正曲線に基づいて、血漿サンプル中のヘパリン濃度の正確な測定を可能にする。
【００３６】
当業者は、一般的な専門知識を通じて、試験手順の型通りの変更によって（例えば、サンプル量を変化させることによって、ＦＸａ不活性化時間を変化させることによって、反応温度、ｐＨ、イオン強度又は他のパラメーターを変化させることによって）軟正曲線の勾配を変化させ得、そしてこれを試験の要件に適応させ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】ＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））及びＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））を含む血漿の混合物において、ＦＸａの添加前に混合物中でヘパリナーゼ０.２７５Ｕ／ｍｌとしたヘパリナーゼ活性に対応してインキュベーション時間に渡って測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【図１Ｂ】ＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））及びＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））を含む血漿の混合物において、ＦＸａの添加前に混合物中でヘパリナーゼ０.７Ｕ／ｍｌとしたヘパリナーゼ活性に対応してインキュベーション時間に渡って測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【図２Ａ】クエン酸血漿の種々のヘパリン濃度（ＵＦＨ（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））を用いた）に対応して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【図２Ｂ】クエン酸血漿の種々のヘパリン濃度（ＬＭＷＨ（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））を用いた）に対応して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【図３】クエン酸血漿の異なるヘパリン濃度に対して測定されたシグナル（ΔＯＤ／分）の変化を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
添加された第Ｘａ因子のヘパリン依存性不活性化が定量化され、第Ｘａ因子の添加の前に、このサンプルをヘパリン修飾成分とインキュベートすることを包含する、液体サンプル中のヘパリン活性を測定する方法。
【請求項２】
サンプルが、第Ｘａ因子の添加の前にヘパリナーゼ群由来の酵素、又はグルクロニダーゼ群由来の酵素、又はこれらの群のうちの１つ由来の異なる酵素の混合物、又は両方の群由来の異なる酵素の混合物とインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、第Ｘａ因子の添加の前にヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、ヘパリナーゼＩＩＩ又はそれらの混合物とインキュベートされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、第Ｘａ因子の添加の前に混合物中で、０.０５Ｕ／ｍｌ〜５.０Ｕ／ｍｌの濃度、特に好ましくは０.２５Ｕ／ｍｌ〜１.２５Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリン修飾成分とインキュベートされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが、第Ｘａ因子の添加の前にヘパリン修飾成分と１０秒間〜９００秒間、好ましくは１５秒間〜９０秒間、特に好ましくは２０秒間〜６０秒間インキュベートされる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
添加された第Ｘａ因子のヘパリン依存性不活性化が、添加されたアンチトロンビンの存在下で定量化される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
アンチトロンビンが、ヘパリン修飾成分と同時にサンプルに添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、硫酸デキストランがサンプルに添加される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
硫酸デキストランが、第Ｘａ因子と同時にサンプルに添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヘパリン活性が、体液サンプル中、好ましくは血液、血漿、血清又は尿中で測定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
さらにサンプル中のヘパリン活性が、すべてのヘパリン変異体に好適であり、そして任意のヘパリンを用いてあらかじめ作成されている一般的な校正曲線によって、このサンプル中に存在するヘパリンの性質に関係なく定量化される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ヘパリン修飾成分を含む試薬及び第Ｘａ因子を含む試薬を備える、請求項１に記載の方法を実施するための試験キット。
【請求項１３】
第Ｘａ因子の基質を含む試薬をさらに備える、請求項１２に記載の試験キット。
【請求項１４】
アンチトロンビンを含む試薬をさらに備える、請求項１２または１３に記載の試験キット。
【請求項１５】
ヘパリン修飾成分及びアンチトロンビンを含む試薬を備える、請求項１２または１３に記載の試験キット。
【請求項１６】
第Ｘａ因子を含む試薬が硫酸デキストランをさらに含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１７】
アンチトロンビンを含む試薬が硫酸デキストランをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１８】
１つ又はそれ以上の試薬が凍結乾燥される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法を実施するための請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の試験キットの使用。
【請求項１】
添加された第Ｘａ因子のヘパリン依存性不活性化が定量化され、第Ｘａ因子の添加の前に、このサンプルをヘパリン修飾成分とインキュベートすることを包含する、液体サンプル中のヘパリン活性を測定する方法。
【請求項２】
サンプルが、第Ｘａ因子の添加の前にヘパリナーゼ群由来の酵素、又はグルクロニダーゼ群由来の酵素、又はこれらの群のうちの１つ由来の異なる酵素の混合物、又は両方の群由来の異なる酵素の混合物とインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、第Ｘａ因子の添加の前にヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、ヘパリナーゼＩＩＩ又はそれらの混合物とインキュベートされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、第Ｘａ因子の添加の前に混合物中で、０.０５Ｕ／ｍｌ〜５.０Ｕ／ｍｌの濃度、特に好ましくは０.２５Ｕ／ｍｌ〜１.２５Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリン修飾成分とインキュベートされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが、第Ｘａ因子の添加の前にヘパリン修飾成分と１０秒間〜９００秒間、好ましくは１５秒間〜９０秒間、特に好ましくは２０秒間〜６０秒間インキュベートされる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
添加された第Ｘａ因子のヘパリン依存性不活性化が、添加されたアンチトロンビンの存在下で定量化される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
アンチトロンビンが、ヘパリン修飾成分と同時にサンプルに添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、硫酸デキストランがサンプルに添加される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
硫酸デキストランが、第Ｘａ因子と同時にサンプルに添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヘパリン活性が、体液サンプル中、好ましくは血液、血漿、血清又は尿中で測定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
さらにサンプル中のヘパリン活性が、すべてのヘパリン変異体に好適であり、そして任意のヘパリンを用いてあらかじめ作成されている一般的な校正曲線によって、このサンプル中に存在するヘパリンの性質に関係なく定量化される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ヘパリン修飾成分を含む試薬及び第Ｘａ因子を含む試薬を備える、請求項１に記載の方法を実施するための試験キット。
【請求項１３】
第Ｘａ因子の基質を含む試薬をさらに備える、請求項１２に記載の試験キット。
【請求項１４】
アンチトロンビンを含む試薬をさらに備える、請求項１２または１３に記載の試験キット。
【請求項１５】
ヘパリン修飾成分及びアンチトロンビンを含む試薬を備える、請求項１２または１３に記載の試験キット。
【請求項１６】
第Ｘａ因子を含む試薬が硫酸デキストランをさらに含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１７】
アンチトロンビンを含む試薬が硫酸デキストランをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１８】
１つ又はそれ以上の試薬が凍結乾燥される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法を実施するための請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の試験キットの使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【公開番号】特開２００７−５２０２０（Ｐ２００７−５２０２０Ａ）
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２１９２９７（Ｐ２００６−２１９２９７）
【出願日】平成１８年８月１１日（２００６．８．１１）
【出願人】（３９８０３２７５１）デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング (36)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月１１日（２００６．８．１１）
【出願人】（３９８０３２７５１）デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング (36)
【Ｆターム（参考）】
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