ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメイン
【課題】 結晶化および化合物の検定に利用可能なペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインのタンパク質を提供する。
【解決手段】 インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメイン領域を同定し、インフルエンザ菌および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのタンパク質を製造した。また、ドメイン中に存在するループ領域を短縮化した改変タンパク質を製造した。
【解決手段】 インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメイン領域を同定し、インフルエンザ菌および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのタンパク質を製造した。また、ドメイン中に存在するループ領域を短縮化した改変タンパク質を製造した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結晶化および化合物の検定に利用するためのペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）は細菌における細胞壁を構成する構造ユニットであるムレインモノマーを基質として細胞壁ペプチドグリカンを組み立てる一連の酵素群であり、細菌のペプチドグリカンの重合および架橋反応に働く膜結合型のタンパク質である。インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）には数種類のＰＢＰが確認されているが、耐性菌として増加傾向にあるβ−ラクタマーゼ非産生アンピシリン耐性（ＢＬＮＡＲ）インフルエンザ菌においては、ＰＢＰ３における変異がβ−ラクタム薬の感受性低下に大きく関与している（非特許文献１参照）。また、配列番号１に示されるＲｄ株（ＡＴＣＣ５１９０７）由来ＰＢＰ３においては、アミノ酸残基番号３７７のメチオニン、３８５のセリン、３８９のロイシン、５１７のアルギニンおよび５２６のアスパラギンが各々イソロイシン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびリジンに置換された変異が薬剤耐性に重要であることが示唆されている（非特許文献２参照）。従って、ＰＢＰ３の立体構造を結晶構造解析により解明することは、耐性のメカニズムを説明するだけでなく、耐性菌に有効な新薬を創出する上でも非常に重要である。
【０００３】
インフルエンザ菌由来ＰＢＰ３は、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質であり、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ３可溶性部分の調製方法が明らかになっているが、０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含有した溶液で保存していることから、低塩濃度で安定に存在できるかは不明である（非特許文献３参照）。また、ＰＢＰ３可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したトランスペプチダーゼドメインの調製方法は未だ明らかとなっていない。結晶化に関しては、Ｎ末端、Ｃ末端部位は具体的に言及がなかったものの、膜結合部位を除去したＰＢＰ３を発現、精製、結晶化した報告がある。その報告では結晶の写真を提示した上で、ある方向から結晶にＸ線を照射した場合には分解能３．５Å程度の回折点が得られたものの、Ｘ線を照射する向きによっては回折点の強度が弱かったために、新規な構造を決定するために必要な回折データを収集することは困難であったと口頭で発表していた（非特許文献４参照）。さらに、現時点において、膜結合型ＰＢＰ３、ＰＢＰ３可溶性部分およびＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのいずれについても、結晶構造の報告はない。従って、結晶構造解析によりＰＢＰ３の立体構造を決定し、効率的な阻害剤の設計を可能とする高品質のＰＢＰ３結晶の創出が望まれている。
【０００４】
一般にタンパク質のＮ末端、Ｃ末端やループ領域は構造が揺らいでいる場合があり、その際には複数のコンフォメーションを取り得ることから、タンパク質の揺らいでいる領域の除去やドメインの切り出しは均一のコンフォメーションから構成される高分解能のＸ線回折能を有する結晶を作製するために有効な手段である（非特許文献５参照）。その一つの方法としてタンパク質分解酵素による限定分解を利用してドメインを推定する方法が知られている。一般に、タンパク質分解酵素は基質特異性に応じてタンパク質の特定の部分を切断するが、ドメイン構造をとっていないループ部分は切断されやすい傾向にある。そのため、タンパク質分解酵素で消化したタンパク質の断片を同定することによりドメインを推定することが可能となる（非特許文献６参照）。しかしながら、推定した領域が揺らぎの少ない結晶化に最適なドメインであるかは断定できず、推定した領域の前後の長さからなる種々のタンパク質について、実際にタンパク質を製造し、性状を確認する必要がある。インフルエンザ菌ＰＢＰ３においては、タンパク質分解酵素による限定分解の報告は知られておらず、結晶化に適したトランスペプチダーゼドメインの領域は未だ明らかでない。結晶化に適したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを新規に見出すことができれば、高品質の結晶を作製し、ＰＢＰ３の立体構造を解明することに多いに貢献できると考えられる。
【０００５】
さらに、タンパク質のＮ末端およびＣ末端以外の内部の領域に存在するループ部分に関しても、構造が揺らいでいるため、結晶化に好ましくない場合がある。例えば、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｐ１４６７７に登録されているアミノ酸配列を有する肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘでは、アミノ酸残基番号７４〜９３、１８４〜１９９、２１８〜２２９および２５７〜７５０に対応する各ポリペプチドを１から３アミノ酸残基のリンカーでつないで発現させたｍｉｎｉ−ＰＢＰ２ｘについて結晶化の報告がある（特許文献１参照）。しかしながら、インフルエンザ菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインにおいて、構造の揺らいでいるループ部分がどの領域であるのか報告はない。従って、インフルエンザ菌ＰＢＰ３において、結晶化の改善を目的としたループ部分の短縮化の方法については明らかでない。
【０００６】
また、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＰＢＰ３は、インフルエンザ菌由来ＰＢＰ３との相同性が約８０％と高く、立体構造の類似性が推測される。このため、大腸菌由来ＰＢＰ３の立体構造の解明は、大腸菌に抗菌活性を示す阻害剤の設計のみならず、インフルエンザ菌に抗菌活性を示す阻害剤の設計に有用である。大腸菌ＰＢＰ３は配列番号２５のアミノ酸番号３７および５７のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７７のアミノ酸で終わる配列からなる可溶性部分について発現、精製の報告がある（非特許文献７参照）。また、結晶化に関しては、Ｎ末端、Ｃ末端部位は具体的に記載はないが、ＰＢＰ３結晶の回折測定の報告がある。その報告では分解能６−７Å程度の回折点しか得られておらず、結晶構造の決定には至っていない（非特許文献８参照）。従って、大腸菌ＰＢＰ３においてもインフルエンザ菌ＰＢＰ３の場合と同様に、高品質の結晶の作製に適したトランスペプチダーゼドメインの領域は未だ明らかでなく、結晶化に適したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを新規に見出すことができれば、高品質の結晶を作製し、ＰＢＰ３の立体構造を解明することに多いに貢献できると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／００７５４１
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５（６）１６９３−１６９９（２００１）
【非特許文献２】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４９（７）２８３４−２８３９（２００５）
【非特許文献３】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（５）１６３０−１６３９（２００４）
【非特許文献４】朴 三用、「ペニシリン結合タンパク質の構造による新抗生物質の開発」、２００６年１２月１３日、横浜市立大学第３回産学連携フォーラム「横浜市立大学・蛋白質構造解析コンソーシアム合同シンポジウム―タンパク質研究から創薬へ―」予稿集
【非特許文献５】ＢＩＯベンチャー ３（５）、３６−３９（２００３）
【非特許文献６】ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ．３６８、７７−８４（２００３）
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ２９８、１８９−１９５（１９９４）
【非特許文献８】ＣＨＡＲＬＩＥＲ Ｐａｕｌｅｔｔｅ、外２名、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．”、［ｏｎｌｉｎｅ］、１９９９年８月３０日、ＥＳＲＦ、［２００７年２月９日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｒｆ．ｅｕ／ｓｍｉｓ／ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｅｎ／ｌｓ＿１２８６＿ａ．ｐｄｆ＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでインフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３の結晶構造は報告されていない。そのため、創薬において重要であるＰＢＰ３の立体構造情報が存在せず効率的な阻害剤の設計が困難である。また、結晶化に適したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの製造方法は不明である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＰＢＰ３可溶性部分をタンパク質分解酵素で消化することにより、トランスペプチダーゼドメイン領域を類推した後、種々の候補タンパク質に関して検証し、結晶化に適したトランスペプチダーゼドメインを製造することで上記課題を解決する。
【０００９】
本発明者らは、タンパク質分解酵素での消化による安定性が向上し、また低塩濃度下でも可溶性であるＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの製造に成功した。また、ドメイン中に存在するループ領域を短縮化することで、コンフォメーションの揺らぎが減少したと考えられる改変タンパク質の製造にも成功した。これらのタンパク質は結晶化に用いることが可能である。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を含有する。
（１）下記からなる群より選択される、トランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１において少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列のアミノ酸番号２２５〜２６２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる相同タンパク質。
（ｃ）配列番号１において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列のアミノ酸番号２２５〜２６２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる改変タンパク質。
（２）配列番号１においてアミノ酸番号３０１〜３０８に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号３１５〜３２２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、（１）記載のタンパク質。
（３）配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、（１）記載のタンパク質。
（４）配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドをグリシン、スレオニン、グリシン、グリシンである４残基のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、（１）記載のタンパク質。
（５）配列番号１においてアミノ酸番号２３５、２４２、２４９、２５２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７６、５８１、５８６、５９３、５９７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（６）配列番号２〜２４からなる群より選択される配列からなる、（１）〜（５）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（７）下記からなる群より選択される、トランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号２５のアミノ酸番号２０５〜２４２のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２５において少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列のアミノ酸番号２０５〜２４２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる相同タンパク質。
（ｃ）配列番号２５において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列のアミノ酸番号２０５〜２４２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる改変タンパク質。
（８）配列番号２５においてアミノ酸番号２１５、２３２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で始まり、アミノ酸番号５６９のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなる、（７）記載のタンパク質。
（９）配列番号２６および２７からなる群より選択される配列からなる、（７）または（８）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（１０）（１）〜（９）のいずれか一項に記載のタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されているタンパク質。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか一項に記載のタンパク質中の少なくとも１つのリジン残基が還元ジメチル化されているタンパク質。
（１２）（１）〜（１０）のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１３）（１２）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（１４）（１３）記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
（１５）（１４）記載の宿主細胞を培養する工程、および該培養によって得られる宿主細胞もしくはその培養物から（１）〜（１１）のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含むタンパク質の製造方法。
（１６）インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３に結合する化合物の検定方法において、（１）〜（１１）のいずれか一項に記載のタンパク質を化合物と接触させ、ついで上記化合物がＰＢＰ３に結合するかどうかを検出することからなる方法。
（１７）インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインの結晶を製造する方法であって、（１）〜（１１）のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する工程と、製造したタンパク質と結晶化剤とを接触させ、インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインの結晶を析出させる工程とを少なくとも含んでなる、方法。
（１８）配列番号２８〜３１のいずれか一つの配列を有することを特徴とするプライマー。
（１９）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのタンパク質に存在する揺らぎの大きいループ構造を短縮化した改変タンパク質を製造する方法であって、（１８）記載のプライマーを遺伝子増幅反応法に利用する工程を含む、（２）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは膜結合領域のみを除去した可溶性部分と比較するとコンフォメーションの揺らいでいる領域が減少しているため、良質の結晶の製造に適している。本発明は、ＰＢＰ３を阻害する化合物の効率的な設計等に役立つ結晶構造情報取得に活用できるため、創薬において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜＜ＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメイン＞＞
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼを構成するタンパク質は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のタンパク質である。また、本発明において、「トランスペプチダーゼ」とは、細菌細胞壁の一つの成分であるペプチドグリカンの生合成の最終段階に関与し、ペプチドグリカン連鎖を構成しているＮ−アセチルムラミン酸から伸びるポリペプチド鎖の架橋を触媒する酵素を意味する。さらに、「トランスペプチダーゼドメイン」とは、上記ポリペプチド鎖を架橋する能力を有し、β−ラクタム薬との結合が可能であるタンパク質の構造単位である。本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号１または２５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｆａｓｔａ−ｊ．ｈｔｍｌ）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値を示す。本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号１または２５で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「置換、欠失、付加もしくは挿入」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１２個である。改変タンパク質の具体例としては、配列番号１４〜２１からなる群より選択される点変異体タンパク質および配列番号２２〜２４からなる群より選択される、後述する実施例７および８に記載のループ領域を短縮化した改変タンパク質が挙げられる。
【００１３】
ＰＢＰ３は、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質である。ＰＢＰ３可溶性部分とは、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ３である。ＰＢＰ３可溶性部分は由来となる株およびＮ末端およびＣ末端が異なる種々のものが存在可能であるが、インフルエンザ菌においては、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号６７から６１０に相当するアミノ酸で構成され、大腸菌においては好ましくは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号３７または５７に相当するアミノ酸から始まり６１０に相当するアミノ酸で終わるタンパク質で構成される。ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは、ＰＢＰ３可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したものであり、除去する領域の違いにより種々のものが存在可能である。トランスペプチダーゼドメインの推定方法としては精製したＰＢＰ３可溶性部分を種々の濃度のタンパク質分解酵素存在下で限定分解した試料の質量分析および生じた各断片のＮ末端アミノ酸配列分析により候補部位を決定することができる。しかしながら、推定した領域が揺らぎの少ない結晶化に最適のドメインであるか断定はできず、推定した領域の前後の長さからなる種々のタンパク質について、実際にタンパク質を製造し、溶解性等の性状を確認する必要がある。
【００１４】
インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインとしては、配列番号１においてアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。また、より好ましくは配列番号１においてアミノ酸番号２３５、２４２、２４９、２５２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７６、５８１、５８６、５９３、５９７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。具体例としては、例えば配列番号２〜２４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１５】
大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインとしては、配列番号２５においてアミノ酸番号２０５〜２４２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。また、より好ましくは配列番号２５においてアミノ酸番号２１５、２３２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６９のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。具体例としては、例えば配列番号２６〜２７からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１６】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに存在するループ構造の短縮化＞＞
一般に、一つのドメインから構成されるタンパク質の内部の領域に存在するループ部分に関しても、構造が揺らいでいるため、結晶化に好ましくない場合がある。本発明者らは、インフルエンザ菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメイン内にタンパク質分解酵素に切断されやすい領域、すなわちコンフォメーションが揺らいでいると推測されるループ領域があることを見出した。具体的には、タンパク質分解酵素であるトリプシンを用いて限定分解を試みた際に、配列番号１におけるアミノ酸番号３０６、３１０、３１５、３１７の各アミノ酸の直後で切断されることを見出し、この部分を短縮化した改変タンパク質を製造した。この改変タンパク質は配列番号１においてアミノ酸番号３０１〜３０８に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸残基番号３１５〜３２２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とするインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの改変タンパク質である。より好ましくは、配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とするインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの改変タンパク質であり、さらに好ましくは配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドをグリシン、スレオニン、グリシン、グリシンである４残基のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とするインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの改変タンパク質である。具体例としては、例えば配列番号２２〜２４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１７】
また、本発明においては、上述の改変タンパク質の発現系を構築するためのプライマーが開示される。配列番号３４〜３７、４３からなる群より選択されるプライマーに代表されるトランスペプチダーゼドメインのＮ末端部分に対応するプライマーと配列番号２８記載のプライマーを遺伝子増幅反応法に利用することで、配列番号１においてアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号３０５のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列をコードするＤＮＡの末端にグリシン、スレオニンをコードする制限酵素Kpn I 認識配列を付加した断片を増幅できる。また、配列番号３８〜４２、４４からなる群より選択されるプライマーに代表されるトランスペプチダーゼドメインのＣ末端部分に対応するプライマーと配列番号２９〜３１からなる群より選択されるプライマーを遺伝子増幅反応法に利用することで、配列番号１においてアミノ酸番号３１８のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列をコードするＤＮＡの末端にグリシン、スレオニンをコードする制限酵素Kpn I 認識配列および１〜３アミノ酸残基のグリシンからなるリンカーをコードするＤＮＡ配列を付加した断片を増幅できる。上記の二つのＤＮＡ断片を結合させ、後述する発現ベクターに導入することで、ループ構造を短縮化したインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの製造に必要な組換えベクターを作製できる。
【００１８】
＜＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードするポリヌクレオチド＞＞
本発明によれば、インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン、その相同タンパク質および改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、よって、本発明のタンパク質をコードする種々の塩基配列を選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。
【００１９】
＜＜ＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインの発現＞＞
ＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインは、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能かつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクターの形態とし、それによって宿主細胞の形質転換を行い、その形質転換体を培養することによって得られる。このＤＮＡ分子は、ベクター分子にＰＢＰ３可溶性部分またはトランスペプチダーゼドメインをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば利用可能であり、好ましくは大腸菌が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に従い回収することができる。ここで、ＰＢＰ３可溶性部分またはトランスペプチダーゼドメインに付加的ポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン残基に富むポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合タンパク質として発現することも慣用の技術により可能である。
【００２０】
＜＜ＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインの精製＞＞
大腸菌で発現させたＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインは、慣用のクロマトグラフィーの技術により精製が可能である。Ｈｉｓ−ｔａｇを付加して発現させた場合はニッケルイオンを固定化したアフィニティーカラムにより精製が可能であり、タグを付加しない場合においても、イオン交換カラム、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ等の色素を利用したブルーカラム、ハイドロキシアパタイトカラム、疎水性相互作用カラムやゲルろ過カラム等を組み合わせることで精製できる。
【００２１】
＜＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶化＞＞
上記の方法により精製したタンパク質は結晶化に用いることが可能である。精製したタンパク質は、ハンプトンリサーチ社やキアゲン社等から市販されている結晶化試薬を用いた蒸気拡散法、マイクロバッチ法による結晶化スクリーニングに使用できる。場合によっては、さらに結晶化剤の濃度、ｐＨ、塩の種類と濃度、添加剤などの条件を最適化することによって、Ｘ線結晶構造解析に供することができる良質の結晶が得られる。また、シーディング法またはリザーバー溶液にオイルを重層することにより結晶核の形成および結晶成長をコントロールすることもできる。結晶化の温度は４℃〜２０℃が一般的である。結晶化に用いるタンパク質としては、配列番号２〜２４、２６〜２７からなる群より選択されるタンパク質のいずれを用いても良い。また、前記タンパク質中のメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されたセレノメチオニン置換体やリジン残基を還元ジメチル化した修飾タンパク質も同様に結晶化に用いられる。結晶化に用いる精製タンパク質の濃度は、４〜２０ｍｇ／ｍＬ程度であることが好ましい。そして、蛋白質溶液に結晶化剤、塩類、緩衝液、添加剤などを適当量加えて、結晶化を行う。本発明のＰＢＰ３の結晶化に用いられる結晶化剤としては、硫酸アンモニウムなどの無機塩類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、イソプロパノールやエタノールなどの有機溶媒などが挙げられる。また、緩衝液としては、公知の緩衝液のいずれも用いることができる。さらに添加剤としては、種々の金属イオン、有機溶媒、還元剤等を用いることができる。セレノメチオニン置換体の場合には未置換体の場合における周辺の条件で結晶を作製できる場合が多いが、セレン原子の酸化を抑制するためにジチオスレイトール等の還元剤を添加することが好ましい。
【００２２】
＜＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを用いた酵素アッセイ＞＞
上述した精製タンパク質はＰＢＰに親和性のある標識化合物、例えばＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）や［３Ｈ］ベンジルペニシリン等、を用いた既存の方法による酵素アッセイに利用することができる。既存の方法は、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４３（５）１１２４−１１２８（１９９９）や公開特許広報２００４−２９００７０号、等に記載されている。
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。また、各種ベクターの作製、蛋白質の発現等は、特に記載のない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊（２００１））などに記載の公知の手法に従って実施できる。
【実施例１】
【００２４】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分をコードする遺伝子の構築＞＞
膜結合領域を除いたＰＢＰ３可溶性部分をコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００２５】
ＨＩ−ＰＢＰ３−６７−５：５’−ＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＴＴＡＡＴＧＣＣＧＡＴＡＣＧＴＴ−３’（配列番号３２）
ＨＩ−ＰＢＰ３−６１０−３：５’−ＴＴＡＧＴＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧＴ−３’（配列番号３３）
【００２６】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｒｄ株ゲノムＤＮＡを鋳型に、前記プライマーを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。増幅したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した。この断片を予めＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断したベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、カナマイシン耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿６７−６１０）を調製した。
【実施例２】
【００２７】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分の発現＞＞
ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿６７−６１０を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（１００ｍＬ）により３７℃で一晩振とう培養した。培養液２０ｍＬを３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地１Ｌに加え、３７℃、３時間振とう培養し、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２５℃で３時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、超音波処理により細胞を破砕した。遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例３】
【００２８】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分の精製＞＞
（１）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例２の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。アフィニティークロマトグラフィーカラムは、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量３０ｍｌのカラムを作製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル）で平衡化した後、細胞抽出液をアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル溶液中の５−２５０ｍＭ イミダゾールの直線勾配（２０カラム容量）で溶出し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００２９】
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製
上記（１）で得られたＰＢＰ３可溶性部分を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、３．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液と混合し、硫酸アンモニウムの終濃度が２Ｍになるように調製した。調製したＰＢＰ３可溶性部分を平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、２Ｍ 硫酸アンモニウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化した疎水性相互作用カラムであるＲＥＳＯＵＲＣＥＰＨＥ ６ｍｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に、流速５ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の２−０Ｍ 硫酸アンモニウムの直線勾配（１５０ｍＬ）で溶出し、主要な画分をまとめた。
【００３０】
（３）ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製
上記（２）で得られたＰＢＰ３可溶性部分を保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて濃縮し、ゲルろ過バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いてタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【実施例４】
【００３１】
＜＜トリプシン限定分解によるトランスペプチダーゼドメインの推定＞＞
実施例３で精製したインフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ ジチオスレイトールでタンパク質終濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈した。次に、希釈液１０μＬを２ｍM ＥＤＴＡ含有の０．００１−０．００３ｍｇ／ｍＬ トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液１０μＬと混合し、２６℃、１時間反応後、サンプルを２等分した。一方は終濃度１ｍＭ ＰＭＳＦおよび還元剤含有のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと等量混合し、３分間煮沸後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、主要なバンドを切り出しプロテインシークエンサーによりＮ末端アミノ酸配列を分析した。残りの一方は１０分の１量の１０％酢酸を加えた後、ＺｉｐＴｉｐＣ４（ミリポア社製）を用いて精製しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置にて分子量を測定した。その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量３９ｋ、３１ｋ付近の主要なバンドが確認された。Ｎ末端アミノ酸配列の結果では、３９ｋ付近のバンドのＮ末端アミノ酸配列はＮＩＶＡ、３１ｋ付近のバンドはＶＧＶ、ＳＥＬＭＲ、ＮＲＡＩＴおよびＡＩＴＤＴＦの混合物であった。質量分析では多数のピークが観測されたが、その中に分子量３９０００、３１０００付近にピークが存在しており、以上の結果から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの３９ｋのバンドは配列番号１に示されるアミノ酸番号２３５〜５９３、３１ｋのバンドは３０７〜５９３、３１１〜５９３、３１６〜５９３および３１８〜５９３の混合物に対応することが判明した。従って、トランスペプチダーゼドメイン領域のＮ末端の候補としてアミノ酸番号２３５および３０７〜３１８付近、Ｃ末端の候補としてアミノ酸番号５９３付近が推定された。大腸菌ではアミノ酸配列の類似性から、トランスペプチダーゼドメイン領域のＮ末端の候補としてアミノ酸番号２１５付近、Ｃ末端の候補としてアミノ酸番号５６９付近を選択した。
【実施例５】
【００３２】
＜＜インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードする遺伝子の構築＞＞
インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００３３】
ＨＩ−ＰＢＰ３−２３５−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｇｇａａｔａｔｔｇｔｔｇｃａｃａｔａｔｃ−３’（配列番号３４）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２４２−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｔｃｃｇａｔｇａｇａａａａａａｔａｔｇａｔｇｃ−３’（配列番号３５）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２４９−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｃａｃａａｇａｔｇｔｔａｃｃｔｔａａｇｔａｔｃｇ−３’（配列番号３６）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｔｔａｃｃｔｔａａｇｔａｔｃｇａｔｇａａａａａｔｔｇｃ−３’（配列番号３７）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５９３−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｔｔｔｃｇｔｔｇｔｔｇｔｇｔｔｔｔｃａｇｃ−３’（配列番号３８）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５９７−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａａｃｇｔｔｔｔｇｃａｃｔｔｔｔｃｇｔｔｇ−３’（配列番号３９）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５８６−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇｃｔｔｃａｇｃａｔｃｔｔｇｃｇｇａａｔａｇ−３’（配列番号４０）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５８１−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｃｇｇａａｔａｇｃａｔｔｔｇｃａｃｇ−３’（配列番号４１）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５７６−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａａｃｇｔａａｃｇｃａｔａｇｃｃｃａｔａａｔｇｔｔａｇ−３’（配列番号４２）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２３５−５−２：５’−ｇｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇｇｇｇａａｔａｔｔｇｔｔｇｃａｃａｔａｔｃ−３’（配列番号４３）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５９３−３−２：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔｔｃｇｔｔｇｔｔｇｔｇｔｔｔｔｃａｇｃ−３’（配列番号４４）
ＨＩ−ＰＢＰ３−３０７−５：５’−ｇｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇｇｔｃｇｇｃｇｔｇａａａｔｃａｇａｇｔｔａ−３’（配列番号４５）
ＥＣ−ＰＢＰ３−２３２−５：５’−ｃａｔｇｃｔａｇｃｃｔｇｇｃｇｃｔｇａｇｔａｔｔｇａｔｇａａｃｇ−３’（配列番号４６）
ＥＣ−ＰＢＰ３−２１５−５：５’−ｃａｔｇｃｔａｇｃｇｇｔｃｇｃｇｔａａｔｔｇａａｇａｔａｔｔｔ−３’（配列番号４７）
ＥＣ−ＰＢＰ３−５６９−３：５’−ｇｔｔｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇｔｃａｇｃｇｃａｔｃｃｇｇｃｔｃ−３’（配列番号４８）
【００３４】
インフルエンザ菌Ｒｄ株ゲノムＤＮＡ、変異導入株ゲノムＤＮＡ、大腸菌菌体抽出液または既に作製したプラスミドＤＮＡを鋳型に、前記プライマーを適宜組み合わせて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。インフルエンザ菌変異導入株は、文献記載の方法により作製した（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４９（７）２８３４−２８３９（２００５）。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、これらの断片を予め制限酵素で切断したベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）またはｐＥＴ−３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）またはＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンまたは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、薬剤耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミドを調製した。組換えベクター名、発現部位、プライマー、ベクターおよび制限酵素の組み合わせは表１に示す。
【００３５】
【表１】
【実施例６】
【００３６】
＜＜インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの発現＞＞
実施例５で作製した組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を５０−１００μｇ／ｍＬのアンピシリンまたは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０７２Ｍ リン酸水素二カリウム、０．０２８Ｍ リン酸二水素カリウム）中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌した。菌体を菌体破砕バッファーに懸濁し、超音波処理を施し、細胞を破砕した。遠心分離によって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、配列番号１においてアミノ酸番号３０７のアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５９３のアミノ酸で終わる、配列番号４９に示される配列からなるインフルエンザ菌ＰＢＰ３は不溶性画分にのみタンパク質の発現が確認された。それ以外のタンパク質に関しては、一部分が不溶性画分へ発現しているものも認められたが、すべての組み合わせにおいて、可溶性画分へ発現していることが確かめられた。従って、トランスペプチダーゼドメインのＮ末端部位としては、配列番号１におけるアミノ酸番号３０７〜３１８は不適切であり、この領域はドメイン内でループ構造をとっていると推定された。組換えベクター、宿主、タグ、破砕バッファーの組み合わせは表２に示す。
【００３７】
【表２】
【実施例７】
【００３８】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに存在するループ構造を短縮化した改変タンパク質をコードする遺伝子の構築＞＞
ループ構造を短縮化した改変タンパク質をコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００３９】
ＨＩ−ＰＢＰ３−３０５−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−３：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇｔｔｇｔｔｔｇｇａｔｔａｔａａｇａｇｇｇｃｇｃａｇｔｃｇｃ−３’（配列番号２８）
ＨＩ−ＰＢＰ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−３１８−５：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇｇｔｇｃａａｔｔａｃｃｇａｔａｃｔｔｔｔｇａｇｃｃａｇｔｔ−３’（配列番号２９）
ＨＩ−ＰＢＰ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ２−３１８−５：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇｇｔｇｇｔｇｃａａｔｔａｃｃｇａｔａｃｔｔｔｔｇａｇｃｃａ−３’（配列番号３０）
ＨＩ−ＰＢＰ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ３−３１８−５：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃａａｔｔａｃｃｇａｔａｃｔｔｔｔｇａｇ−３’（配列番号３１）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２３５−５−２：５’−ｇｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇｇｇｇａａｔａｔｔｇｔｔｇｃａｃａｔａｔｃ−３’（配列番号４３）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５９３−３−２：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔｔｃｇｔｔｇｔｔｇｔｇｔｔｔｔｃａｇｃ−３’（配列番号４４）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｔｔａｃｃｔｔａａｇｔａｔｃｇａｔｇａａａａａｔｔｇｃ−３’（配列番号３７）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５８６−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇｃｔｔｃａｇｃａｔｃｔｔｇｃｇｇａａｔａｇ−３’（配列番号４０）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５７６−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａａｃｇｔａａｃｇｃａｔａｇｃｃｃａｔａａｔｇｔｔａｇ−３’（配列番号４２）
【００４０】
実施例５に記載した組換えベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３を鋳型に、前記プライマーを適宜組み合わせて用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。増幅したＤＮＡ断片とプライマーの組み合わせを表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】
増幅したＤＮＡ断片１を制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＤＮＡ断片３をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化した。これらの断片を予めＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、カナマイシン耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５９３）を調製した。
【００４３】
次に、組換えベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５９３を鋳型に、プライマーＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５とＨＩ−ＰＢＰ３−５７６−３、またはＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５とＨＩ−ＰＢＰ３−５８６−３を組み合わせて用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施し、各々ＤＮＡ断片５および６を得た。増幅したＤＮＡ断片５および６を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。これらの断片を予めＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５７６およびｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５８６）を調製した。
【実施例８】
【００４４】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに存在するループ構造を短縮化した改変タンパク質の発現＞＞
実施例７で作製した組換えベクターを大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンまたは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０７２Ｍ リン酸水素二カリウム、０．０２８Ｍ リン酸二水素カリウム）中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌した。菌体を菌体破砕バッファーに懸濁し、超音波処理を施し、細胞を破砕した。遠心分離によって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、一部が不溶性画分へ発現しているものも認められたが、目的タンパク質のすべての組み合わせにおいて、可溶性画分へ発現していることが確かめられた。組換えベクター、宿主、タグ、破砕バッファーの組み合わせは表４に示す。
【００４５】
【表４】
【実施例９】
【００４６】
＜＜インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の発現＞＞
（１）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン改変タンパク質（アミノ酸配列番号２２）のセレノメチオニン置換体の発現
ＭＡＤ法によるＸ線結晶構造解析に使用する重原子誘導体結晶を作製するために、メチオニンの硫黄原子が重原子であるセレンに置換されたセレノメチオニン置換体の発現を試みた。実施例８で得られた形質転換体（大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５９３）を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、遠心分離機で集菌後、１００ｍｌのＬｅＭａｓｔｅｒ培地（組成は表５に示す）で懸濁し、再度、遠心分離機によって集菌し、ＬｅＭａｓｔｅｒ培地１００ｍｌに再懸濁した。この懸濁液を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地に接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で１０時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、超音波処理により細胞を破砕した。遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【００４７】
【表５】
【００４８】
（２）大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号２６）のセレノメチオニン置換体の発現
ＭＡＤ法によるＸ線結晶構造解析に使用する重原子誘導体結晶を作製するために、メチオニンの硫黄原子が重原子であるセレンに置換されたセレノメチオニン置換体の発現を試みた。実施例６で得られた形質転換体（大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＥＣ＿２１５−５６９）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、半量を遠心分離機で集菌後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬｅＭａｓｔｅｒ培地で懸濁し、再度、遠心分離機によって集菌し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｅＭａｓｔｅｒ培地５０ｍｌに再懸濁した。この懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４．８ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地に２４ｍＬ接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、超音波処理により細胞を破砕した。遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例１０】
【００４９】
＜＜インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの精製＞＞
（１）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号２）の精製
（１−１）ニッケルカラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３の組換え大腸菌培養液（２Ｌ）から実施例６の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。アフィニティークロマトグラフィーカラムは、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量３０ｍｌのカラムを作製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ２―メルカプトエタノール）で平衡化した後、細胞抽出液を流速３ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ２―メルカプトエタノール溶液中の５−２５０ｍＭ イミダゾールの直線勾配（３カラム容量）で溶出した。主要なフラクションをまとめて回収した。
【００５０】
（１−２）疎水性相互作用カラムによる精製
上記（１−１）で得られたサンプルを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、３．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液と混合し、硫酸アンモニウムの終濃度が２Ｍになるように調製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、２Ｍ 硫酸アンモニウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化した疎水性相互作用カラムであるＲＥＳＯＵＲＣＥＰＨＥ ６ｍｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に、流速５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライした。３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の２−０Ｍ 硫酸アンモニウムの直線勾配（１５０ｍＬ）で溶出し、主要な画分をまとめた。
【００５１】
（１−３）ゲルろ過カラムによる精製
上記（１−２）で得られたサンプルを限外ろ過膜を用いて濃縮し、ゲルろ過バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。主要な画分を各々まとめ、終濃度５００ｍＭまたは１００ｍＭ 塩化ナトリウムの両方の条件下でタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで限外ろ過膜を用いて濃縮した。その結果、いずれの塩濃度下においても沈殿は生じなかった。また、ＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液と混合した後（終濃度１０μＭ）、３７℃で２０分間反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。励起波長４７３ｎｍのレーザーを照射し、波長５２０ｎｍ以上の蛍光を検出した結果、精製したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインはＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬとの結合能を保持していることが確かめられた。
【００５２】
（２）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号３〜５、８および９）の精製
（２−１）ニッケルカラムによる精製
以下の精製は４℃で行った。Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９７、Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２４２−５９７、Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２４２−５９３、Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２４９−５９７およびＢ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２４９−５９３の組換え大腸菌培養液（４００ｍＬ）から実施例６の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にマニュアル記載の方法でニッケルを結合させた後、平衡化バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．４、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ イミダゾール）で平衡化した。そこへ細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、流速４ｍＬ／ｍｉｎで５カラム容量の平衡化バッファーにより洗浄した後、２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．４、５００ｍＭ 塩化ナトリウム溶液中の２０ｍＭ−５００ｍＭ イミダゾールの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００５３】
（２−２）Ｈｉｓ−ｔａｇの除去
上記（２−１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した後、終濃度８ｕｎｉｔ／ｍＬのトロンビン（シグマ社製）を添加し、８℃で一晩反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。次に、終濃度２０ｍＭとなるようにイミダゾールを添加し、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）担体を加えた。４℃で一時間混合した後、遠心分離により上清を回収した。
【００５４】
（２−３）ブルーカラムによる精製
上記（２−２）で得られたサンプルをＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００５５】
（２−４）陽イオン交換カラムによる精製
上記（２−３）で得られたサンプルをＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。サンプルを平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した。平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速４ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の５０−５００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて、終濃度２００ｍＭ 塩化ナトリウムの条件下でタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。濃縮したサンプルをＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液と混合した後（終濃度１０μＭ）、室温で２０分間反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。励起波長４７３ｎｍのレーザーを照射し、波長５２０ｎｍ以上の蛍光を検出した結果、精製したサンプルはＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬとの結合能を保持していることが確かめられた。
【００５６】
（３）インフルエンザ菌ＰＢＰ３点変異体トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号１５、１６および１９）の精製
（３−１）ニッケルカラムによる精製
以下の精製は４℃で行った。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３（Ｍ３７７Ｉ， Ｓ３８５Ｔ， Ｒ５１７Ｈ）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３（Ｓ３８５Ｔ， Ｎ５２６Ｋ）およびＢ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３（Ｍ３７７Ｉ， Ｓ３８５Ｔ， Ｌ３８９Ｆ， Ｎ５２６Ｋ）の組換え大腸菌培養液（４００ｍＬ）から実施例６の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にマニュアル記載の方法でニッケルを結合させた後、平衡化バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．４、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ イミダゾール）で平衡化した。そこへ細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、流速４ｍＬ／ｍｉｎで５カラム容量の平衡化バッファーにより洗浄した後、２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．４、５００ｍＭ 塩化ナトリウム溶液中の２０ｍＭ−５００ｍＭ イミダゾールの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００５７】
（３―２）ブルーカラムによる精製
上記（３−１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめ、保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて、終濃度２００ｍＭ 塩化ナトリウムの条件下でタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【００５８】
（４）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに存在するループ構造を短縮化した改変タンパク質（アミノ酸配列番号２２）のセレノメチオニン置換体の精製
（４−１）ニッケルカラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例９（１）の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。アフィニティークロマトグラフィーカラムは、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量３０ｍｌのカラムを作製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ２―メルカプトエタノール、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ）で平衡化した後、細胞抽出液を流速３ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、平衡化バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５００ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ２―メルカプトエタノール、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ）で溶出した。
【００５９】
（４−２）疎水性相互作用カラムによる精製
上記（４−１）で得られたサンプルを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、３．５Ｍ 硫酸アンモニウム５ｍＭ ジチオスレイトール溶液と混合し、硫酸アンモニウムの終濃度が約１．５Ｍになるように調製した。調製したサンプルを平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、２Ｍ 硫酸アンモニウム、５ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化した疎水性相互作用カラムであるＲＥＳＯＵＲＣＥＰＨＥ ６ｍｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に、流速５ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の２−０Ｍ 硫酸アンモニウムの直線勾配（１５０ｍＬ）で溶出し、主要な画分をまとめた。
【００６０】
（４−３）ゲルろ過カラムによる精製
上記（４−２）で得られたサンプルを限外ろ過膜で濃縮し、ゲルろ過バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、主要な画分をまとめた。
【００６１】
（４−４）陽イオン交換カラムによる精製
上記（４−３）で得られたサンプルをＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。サンプルを平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ジチオスレイトール）に対して透析した。平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速２ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、流速３ｍＬ／ｍｉｎで３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の５０−５００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（７５ｍＬ）で溶出した。溶出画分をＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液と混合した後（終濃度１０μＭ）、３７℃で２０分間反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。励起波長４７３ｎｍのレーザーを照射し、波長５２０ｎｍ以上の蛍光を検出した結果、精製したサンプルはＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬとの結合能を保持していることが確かめられた。限外ろ過膜を用いて、終濃度５０ｍＭ 塩化ナトリウムの条件下でタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【００６２】
（５）大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号２６）のセレノメチオニン置換体の精製
（５−１）陰イオン交換カラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例９（２）の方法で得られた細胞抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量１１４ｍＬのカラムを作製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）で平衡化した後、流速２．５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、流速５ｍＬ／ｍｉｎで約２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液中の０−１Ｍ 塩化ナトリウムの直線勾配（７２０ｍＬ）で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要なフラクションをまとめて回収した。
【００６３】
（５−２）ブルーカラムによる精製
上記（５−１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ １ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。精製はサンプルを９回に分けて実施した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液中の０−２Ｍ 塩化ナトリウムの直線勾配（１７．５カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００６４】
（５−３）ゲルろ過カラムによる精製
上記（５−２）で得られたサンプルを保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸 ｐＨ ７．９、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。精製は２回に分けて実施した。主要な画分をまとめ、保持分子量１００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて、バッファー置換および濃縮し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸 ｐＨ ７．９、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール条件下、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬに調製した。
【実施例１１】
【００６５】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの還元ジメチル化＞＞
実施例１０（４）で精製したインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号２２）のセレノメチオニン置換体のリジン残基を文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０００， ２７５（２）， ５４９−５５２）記載の方法に従い還元ジメチル化した。得られたサンプルを陽イオン交換カラムであるＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の５０−５２５ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめ、塩化ナトリウムの終濃度が０．２Ｍになるように調製し、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるように濃縮した。エレクトロスプレイイオン化法による質量分析装置により解析したところ、分子量３９７９８に主要なピークが確認されたことから、今回の還元ジメチル化タンパク質は、計算値で３９８０７の分子量を示す、リジン残基２３個とＮ末端の合計２４箇所のジメチル化修飾候補部位において２２箇所がジメチル化されたと考えられた。
【実施例１２】
【００６６】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分、インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶化スクリーニング＞＞
実施例３、１０および１１で調製したサンプルは、シッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化スクリーニングを実施した。タンパク質溶液０．５μＬと結晶化剤０．５μＬを混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として結晶化剤５０−１００μＬを分注した後、密閉したプレートを４℃〜２０℃の恒温槽内に静置した。結晶化剤としてはキアゲン社等から市販されている試薬を利用した。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは新規なタンパク質であり、阻害剤の効率的な設計等に有効な結晶構造情報取得に利用できる良質の結晶の製造に利用できるため、産業上極めて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結晶化および化合物の検定に利用するためのペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）は細菌における細胞壁を構成する構造ユニットであるムレインモノマーを基質として細胞壁ペプチドグリカンを組み立てる一連の酵素群であり、細菌のペプチドグリカンの重合および架橋反応に働く膜結合型のタンパク質である。インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）には数種類のＰＢＰが確認されているが、耐性菌として増加傾向にあるβ−ラクタマーゼ非産生アンピシリン耐性（ＢＬＮＡＲ）インフルエンザ菌においては、ＰＢＰ３における変異がβ−ラクタム薬の感受性低下に大きく関与している（非特許文献１参照）。また、配列番号１に示されるＲｄ株（ＡＴＣＣ５１９０７）由来ＰＢＰ３においては、アミノ酸残基番号３７７のメチオニン、３８５のセリン、３８９のロイシン、５１７のアルギニンおよび５２６のアスパラギンが各々イソロイシン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびリジンに置換された変異が薬剤耐性に重要であることが示唆されている（非特許文献２参照）。従って、ＰＢＰ３の立体構造を結晶構造解析により解明することは、耐性のメカニズムを説明するだけでなく、耐性菌に有効な新薬を創出する上でも非常に重要である。
【０００３】
インフルエンザ菌由来ＰＢＰ３は、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質であり、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ３可溶性部分の調製方法が明らかになっているが、０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含有した溶液で保存していることから、低塩濃度で安定に存在できるかは不明である（非特許文献３参照）。また、ＰＢＰ３可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したトランスペプチダーゼドメインの調製方法は未だ明らかとなっていない。結晶化に関しては、Ｎ末端、Ｃ末端部位は具体的に言及がなかったものの、膜結合部位を除去したＰＢＰ３を発現、精製、結晶化した報告がある。その報告では結晶の写真を提示した上で、ある方向から結晶にＸ線を照射した場合には分解能３．５Å程度の回折点が得られたものの、Ｘ線を照射する向きによっては回折点の強度が弱かったために、新規な構造を決定するために必要な回折データを収集することは困難であったと口頭で発表していた（非特許文献４参照）。さらに、現時点において、膜結合型ＰＢＰ３、ＰＢＰ３可溶性部分およびＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのいずれについても、結晶構造の報告はない。従って、結晶構造解析によりＰＢＰ３の立体構造を決定し、効率的な阻害剤の設計を可能とする高品質のＰＢＰ３結晶の創出が望まれている。
【０００４】
一般にタンパク質のＮ末端、Ｃ末端やループ領域は構造が揺らいでいる場合があり、その際には複数のコンフォメーションを取り得ることから、タンパク質の揺らいでいる領域の除去やドメインの切り出しは均一のコンフォメーションから構成される高分解能のＸ線回折能を有する結晶を作製するために有効な手段である（非特許文献５参照）。その一つの方法としてタンパク質分解酵素による限定分解を利用してドメインを推定する方法が知られている。一般に、タンパク質分解酵素は基質特異性に応じてタンパク質の特定の部分を切断するが、ドメイン構造をとっていないループ部分は切断されやすい傾向にある。そのため、タンパク質分解酵素で消化したタンパク質の断片を同定することによりドメインを推定することが可能となる（非特許文献６参照）。しかしながら、推定した領域が揺らぎの少ない結晶化に最適なドメインであるかは断定できず、推定した領域の前後の長さからなる種々のタンパク質について、実際にタンパク質を製造し、性状を確認する必要がある。インフルエンザ菌ＰＢＰ３においては、タンパク質分解酵素による限定分解の報告は知られておらず、結晶化に適したトランスペプチダーゼドメインの領域は未だ明らかでない。結晶化に適したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを新規に見出すことができれば、高品質の結晶を作製し、ＰＢＰ３の立体構造を解明することに多いに貢献できると考えられる。
【０００５】
さらに、タンパク質のＮ末端およびＣ末端以外の内部の領域に存在するループ部分に関しても、構造が揺らいでいるため、結晶化に好ましくない場合がある。例えば、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｐ１４６７７に登録されているアミノ酸配列を有する肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘでは、アミノ酸残基番号７４〜９３、１８４〜１９９、２１８〜２２９および２５７〜７５０に対応する各ポリペプチドを１から３アミノ酸残基のリンカーでつないで発現させたｍｉｎｉ−ＰＢＰ２ｘについて結晶化の報告がある（特許文献１参照）。しかしながら、インフルエンザ菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインにおいて、構造の揺らいでいるループ部分がどの領域であるのか報告はない。従って、インフルエンザ菌ＰＢＰ３において、結晶化の改善を目的としたループ部分の短縮化の方法については明らかでない。
【０００６】
また、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＰＢＰ３は、インフルエンザ菌由来ＰＢＰ３との相同性が約８０％と高く、立体構造の類似性が推測される。このため、大腸菌由来ＰＢＰ３の立体構造の解明は、大腸菌に抗菌活性を示す阻害剤の設計のみならず、インフルエンザ菌に抗菌活性を示す阻害剤の設計に有用である。大腸菌ＰＢＰ３は配列番号２５のアミノ酸番号３７および５７のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７７のアミノ酸で終わる配列からなる可溶性部分について発現、精製の報告がある（非特許文献７参照）。また、結晶化に関しては、Ｎ末端、Ｃ末端部位は具体的に記載はないが、ＰＢＰ３結晶の回折測定の報告がある。その報告では分解能６−７Å程度の回折点しか得られておらず、結晶構造の決定には至っていない（非特許文献８参照）。従って、大腸菌ＰＢＰ３においてもインフルエンザ菌ＰＢＰ３の場合と同様に、高品質の結晶の作製に適したトランスペプチダーゼドメインの領域は未だ明らかでなく、結晶化に適したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを新規に見出すことができれば、高品質の結晶を作製し、ＰＢＰ３の立体構造を解明することに多いに貢献できると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／００７５４１
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５（６）１６９３−１６９９（２００１）
【非特許文献２】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４９（７）２８３４−２８３９（２００５）
【非特許文献３】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（５）１６３０−１６３９（２００４）
【非特許文献４】朴 三用、「ペニシリン結合タンパク質の構造による新抗生物質の開発」、２００６年１２月１３日、横浜市立大学第３回産学連携フォーラム「横浜市立大学・蛋白質構造解析コンソーシアム合同シンポジウム―タンパク質研究から創薬へ―」予稿集
【非特許文献５】ＢＩＯベンチャー ３（５）、３６−３９（２００３）
【非特許文献６】ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ．３６８、７７−８４（２００３）
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ２９８、１８９−１９５（１９９４）
【非特許文献８】ＣＨＡＲＬＩＥＲ Ｐａｕｌｅｔｔｅ、外２名、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．”、［ｏｎｌｉｎｅ］、１９９９年８月３０日、ＥＳＲＦ、［２００７年２月９日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｒｆ．ｅｕ／ｓｍｉｓ／ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｅｎ／ｌｓ＿１２８６＿ａ．ｐｄｆ＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでインフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３の結晶構造は報告されていない。そのため、創薬において重要であるＰＢＰ３の立体構造情報が存在せず効率的な阻害剤の設計が困難である。また、結晶化に適したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの製造方法は不明である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＰＢＰ３可溶性部分をタンパク質分解酵素で消化することにより、トランスペプチダーゼドメイン領域を類推した後、種々の候補タンパク質に関して検証し、結晶化に適したトランスペプチダーゼドメインを製造することで上記課題を解決する。
【０００９】
本発明者らは、タンパク質分解酵素での消化による安定性が向上し、また低塩濃度下でも可溶性であるＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの製造に成功した。また、ドメイン中に存在するループ領域を短縮化することで、コンフォメーションの揺らぎが減少したと考えられる改変タンパク質の製造にも成功した。これらのタンパク質は結晶化に用いることが可能である。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を含有する。
（１）下記からなる群より選択される、トランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１において少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列のアミノ酸番号２２５〜２６２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる相同タンパク質。
（ｃ）配列番号１において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列のアミノ酸番号２２５〜２６２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる改変タンパク質。
（２）配列番号１においてアミノ酸番号３０１〜３０８に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号３１５〜３２２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、（１）記載のタンパク質。
（３）配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、（１）記載のタンパク質。
（４）配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドをグリシン、スレオニン、グリシン、グリシンである４残基のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、（１）記載のタンパク質。
（５）配列番号１においてアミノ酸番号２３５、２４２、２４９、２５２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７６、５８１、５８６、５９３、５９７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（６）配列番号２〜２４からなる群より選択される配列からなる、（１）〜（５）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（７）下記からなる群より選択される、トランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号２５のアミノ酸番号２０５〜２４２のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２５において少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列のアミノ酸番号２０５〜２４２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる相同タンパク質。
（ｃ）配列番号２５において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列のアミノ酸番号２０５〜２４２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる改変タンパク質。
（８）配列番号２５においてアミノ酸番号２１５、２３２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で始まり、アミノ酸番号５６９のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなる、（７）記載のタンパク質。
（９）配列番号２６および２７からなる群より選択される配列からなる、（７）または（８）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（１０）（１）〜（９）のいずれか一項に記載のタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されているタンパク質。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか一項に記載のタンパク質中の少なくとも１つのリジン残基が還元ジメチル化されているタンパク質。
（１２）（１）〜（１０）のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１３）（１２）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（１４）（１３）記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
（１５）（１４）記載の宿主細胞を培養する工程、および該培養によって得られる宿主細胞もしくはその培養物から（１）〜（１１）のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含むタンパク質の製造方法。
（１６）インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３に結合する化合物の検定方法において、（１）〜（１１）のいずれか一項に記載のタンパク質を化合物と接触させ、ついで上記化合物がＰＢＰ３に結合するかどうかを検出することからなる方法。
（１７）インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインの結晶を製造する方法であって、（１）〜（１１）のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する工程と、製造したタンパク質と結晶化剤とを接触させ、インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインの結晶を析出させる工程とを少なくとも含んでなる、方法。
（１８）配列番号２８〜３１のいずれか一つの配列を有することを特徴とするプライマー。
（１９）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのタンパク質に存在する揺らぎの大きいループ構造を短縮化した改変タンパク質を製造する方法であって、（１８）記載のプライマーを遺伝子増幅反応法に利用する工程を含む、（２）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは膜結合領域のみを除去した可溶性部分と比較するとコンフォメーションの揺らいでいる領域が減少しているため、良質の結晶の製造に適している。本発明は、ＰＢＰ３を阻害する化合物の効率的な設計等に役立つ結晶構造情報取得に活用できるため、創薬において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜＜ＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメイン＞＞
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼを構成するタンパク質は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のタンパク質である。また、本発明において、「トランスペプチダーゼ」とは、細菌細胞壁の一つの成分であるペプチドグリカンの生合成の最終段階に関与し、ペプチドグリカン連鎖を構成しているＮ−アセチルムラミン酸から伸びるポリペプチド鎖の架橋を触媒する酵素を意味する。さらに、「トランスペプチダーゼドメイン」とは、上記ポリペプチド鎖を架橋する能力を有し、β−ラクタム薬との結合が可能であるタンパク質の構造単位である。本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号１または２５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｆａｓｔａ−ｊ．ｈｔｍｌ）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値を示す。本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号１または２５で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「置換、欠失、付加もしくは挿入」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１２個である。改変タンパク質の具体例としては、配列番号１４〜２１からなる群より選択される点変異体タンパク質および配列番号２２〜２４からなる群より選択される、後述する実施例７および８に記載のループ領域を短縮化した改変タンパク質が挙げられる。
【００１３】
ＰＢＰ３は、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質である。ＰＢＰ３可溶性部分とは、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ３である。ＰＢＰ３可溶性部分は由来となる株およびＮ末端およびＣ末端が異なる種々のものが存在可能であるが、インフルエンザ菌においては、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号６７から６１０に相当するアミノ酸で構成され、大腸菌においては好ましくは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号３７または５７に相当するアミノ酸から始まり６１０に相当するアミノ酸で終わるタンパク質で構成される。ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは、ＰＢＰ３可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したものであり、除去する領域の違いにより種々のものが存在可能である。トランスペプチダーゼドメインの推定方法としては精製したＰＢＰ３可溶性部分を種々の濃度のタンパク質分解酵素存在下で限定分解した試料の質量分析および生じた各断片のＮ末端アミノ酸配列分析により候補部位を決定することができる。しかしながら、推定した領域が揺らぎの少ない結晶化に最適のドメインであるか断定はできず、推定した領域の前後の長さからなる種々のタンパク質について、実際にタンパク質を製造し、溶解性等の性状を確認する必要がある。
【００１４】
インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインとしては、配列番号１においてアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。また、より好ましくは配列番号１においてアミノ酸番号２３５、２４２、２４９、２５２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７６、５８１、５８６、５９３、５９７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。具体例としては、例えば配列番号２〜２４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１５】
大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインとしては、配列番号２５においてアミノ酸番号２０５〜２４２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。また、より好ましくは配列番号２５においてアミノ酸番号２１５、２３２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６９のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。具体例としては、例えば配列番号２６〜２７からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１６】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに存在するループ構造の短縮化＞＞
一般に、一つのドメインから構成されるタンパク質の内部の領域に存在するループ部分に関しても、構造が揺らいでいるため、結晶化に好ましくない場合がある。本発明者らは、インフルエンザ菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメイン内にタンパク質分解酵素に切断されやすい領域、すなわちコンフォメーションが揺らいでいると推測されるループ領域があることを見出した。具体的には、タンパク質分解酵素であるトリプシンを用いて限定分解を試みた際に、配列番号１におけるアミノ酸番号３０６、３１０、３１５、３１７の各アミノ酸の直後で切断されることを見出し、この部分を短縮化した改変タンパク質を製造した。この改変タンパク質は配列番号１においてアミノ酸番号３０１〜３０８に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸残基番号３１５〜３２２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とするインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの改変タンパク質である。より好ましくは、配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とするインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの改変タンパク質であり、さらに好ましくは配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドをグリシン、スレオニン、グリシン、グリシンである４残基のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とするインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの改変タンパク質である。具体例としては、例えば配列番号２２〜２４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１７】
また、本発明においては、上述の改変タンパク質の発現系を構築するためのプライマーが開示される。配列番号３４〜３７、４３からなる群より選択されるプライマーに代表されるトランスペプチダーゼドメインのＮ末端部分に対応するプライマーと配列番号２８記載のプライマーを遺伝子増幅反応法に利用することで、配列番号１においてアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号３０５のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列をコードするＤＮＡの末端にグリシン、スレオニンをコードする制限酵素Kpn I 認識配列を付加した断片を増幅できる。また、配列番号３８〜４２、４４からなる群より選択されるプライマーに代表されるトランスペプチダーゼドメインのＣ末端部分に対応するプライマーと配列番号２９〜３１からなる群より選択されるプライマーを遺伝子増幅反応法に利用することで、配列番号１においてアミノ酸番号３１８のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列をコードするＤＮＡの末端にグリシン、スレオニンをコードする制限酵素Kpn I 認識配列および１〜３アミノ酸残基のグリシンからなるリンカーをコードするＤＮＡ配列を付加した断片を増幅できる。上記の二つのＤＮＡ断片を結合させ、後述する発現ベクターに導入することで、ループ構造を短縮化したインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの製造に必要な組換えベクターを作製できる。
【００１８】
＜＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードするポリヌクレオチド＞＞
本発明によれば、インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン、その相同タンパク質および改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、よって、本発明のタンパク質をコードする種々の塩基配列を選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。
【００１９】
＜＜ＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインの発現＞＞
ＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインは、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能かつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクターの形態とし、それによって宿主細胞の形質転換を行い、その形質転換体を培養することによって得られる。このＤＮＡ分子は、ベクター分子にＰＢＰ３可溶性部分またはトランスペプチダーゼドメインをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば利用可能であり、好ましくは大腸菌が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に従い回収することができる。ここで、ＰＢＰ３可溶性部分またはトランスペプチダーゼドメインに付加的ポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン残基に富むポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合タンパク質として発現することも慣用の技術により可能である。
【００２０】
＜＜ＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインの精製＞＞
大腸菌で発現させたＰＢＰ３可溶性部分およびトランスペプチダーゼドメインは、慣用のクロマトグラフィーの技術により精製が可能である。Ｈｉｓ−ｔａｇを付加して発現させた場合はニッケルイオンを固定化したアフィニティーカラムにより精製が可能であり、タグを付加しない場合においても、イオン交換カラム、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ等の色素を利用したブルーカラム、ハイドロキシアパタイトカラム、疎水性相互作用カラムやゲルろ過カラム等を組み合わせることで精製できる。
【００２１】
＜＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶化＞＞
上記の方法により精製したタンパク質は結晶化に用いることが可能である。精製したタンパク質は、ハンプトンリサーチ社やキアゲン社等から市販されている結晶化試薬を用いた蒸気拡散法、マイクロバッチ法による結晶化スクリーニングに使用できる。場合によっては、さらに結晶化剤の濃度、ｐＨ、塩の種類と濃度、添加剤などの条件を最適化することによって、Ｘ線結晶構造解析に供することができる良質の結晶が得られる。また、シーディング法またはリザーバー溶液にオイルを重層することにより結晶核の形成および結晶成長をコントロールすることもできる。結晶化の温度は４℃〜２０℃が一般的である。結晶化に用いるタンパク質としては、配列番号２〜２４、２６〜２７からなる群より選択されるタンパク質のいずれを用いても良い。また、前記タンパク質中のメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されたセレノメチオニン置換体やリジン残基を還元ジメチル化した修飾タンパク質も同様に結晶化に用いられる。結晶化に用いる精製タンパク質の濃度は、４〜２０ｍｇ／ｍＬ程度であることが好ましい。そして、蛋白質溶液に結晶化剤、塩類、緩衝液、添加剤などを適当量加えて、結晶化を行う。本発明のＰＢＰ３の結晶化に用いられる結晶化剤としては、硫酸アンモニウムなどの無機塩類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、イソプロパノールやエタノールなどの有機溶媒などが挙げられる。また、緩衝液としては、公知の緩衝液のいずれも用いることができる。さらに添加剤としては、種々の金属イオン、有機溶媒、還元剤等を用いることができる。セレノメチオニン置換体の場合には未置換体の場合における周辺の条件で結晶を作製できる場合が多いが、セレン原子の酸化を抑制するためにジチオスレイトール等の還元剤を添加することが好ましい。
【００２２】
＜＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを用いた酵素アッセイ＞＞
上述した精製タンパク質はＰＢＰに親和性のある標識化合物、例えばＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）や［３Ｈ］ベンジルペニシリン等、を用いた既存の方法による酵素アッセイに利用することができる。既存の方法は、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４３（５）１１２４−１１２８（１９９９）や公開特許広報２００４−２９００７０号、等に記載されている。
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。また、各種ベクターの作製、蛋白質の発現等は、特に記載のない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊（２００１））などに記載の公知の手法に従って実施できる。
【実施例１】
【００２４】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分をコードする遺伝子の構築＞＞
膜結合領域を除いたＰＢＰ３可溶性部分をコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００２５】
ＨＩ−ＰＢＰ３−６７−５：５’−ＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＴＴＡＡＴＧＣＣＧＡＴＡＣＧＴＴ−３’（配列番号３２）
ＨＩ−ＰＢＰ３−６１０−３：５’−ＴＴＡＧＴＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧＴ−３’（配列番号３３）
【００２６】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｒｄ株ゲノムＤＮＡを鋳型に、前記プライマーを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。増幅したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した。この断片を予めＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断したベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、カナマイシン耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿６７−６１０）を調製した。
【実施例２】
【００２７】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分の発現＞＞
ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿６７−６１０を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（１００ｍＬ）により３７℃で一晩振とう培養した。培養液２０ｍＬを３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地１Ｌに加え、３７℃、３時間振とう培養し、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２５℃で３時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、超音波処理により細胞を破砕した。遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例３】
【００２８】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分の精製＞＞
（１）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例２の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。アフィニティークロマトグラフィーカラムは、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量３０ｍｌのカラムを作製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル）で平衡化した後、細胞抽出液をアプライし、３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル溶液中の５−２５０ｍＭ イミダゾールの直線勾配（２０カラム容量）で溶出し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００２９】
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製
上記（１）で得られたＰＢＰ３可溶性部分を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、３．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液と混合し、硫酸アンモニウムの終濃度が２Ｍになるように調製した。調製したＰＢＰ３可溶性部分を平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、２Ｍ 硫酸アンモニウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化した疎水性相互作用カラムであるＲＥＳＯＵＲＣＥＰＨＥ ６ｍｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に、流速５ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の２−０Ｍ 硫酸アンモニウムの直線勾配（１５０ｍＬ）で溶出し、主要な画分をまとめた。
【００３０】
（３）ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製
上記（２）で得られたＰＢＰ３可溶性部分を保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて濃縮し、ゲルろ過バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。主要な画分をまとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いてタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【実施例４】
【００３１】
＜＜トリプシン限定分解によるトランスペプチダーゼドメインの推定＞＞
実施例３で精製したインフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ ジチオスレイトールでタンパク質終濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈した。次に、希釈液１０μＬを２ｍM ＥＤＴＡ含有の０．００１−０．００３ｍｇ／ｍＬ トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液１０μＬと混合し、２６℃、１時間反応後、サンプルを２等分した。一方は終濃度１ｍＭ ＰＭＳＦおよび還元剤含有のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと等量混合し、３分間煮沸後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、主要なバンドを切り出しプロテインシークエンサーによりＮ末端アミノ酸配列を分析した。残りの一方は１０分の１量の１０％酢酸を加えた後、ＺｉｐＴｉｐＣ４（ミリポア社製）を用いて精製しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置にて分子量を測定した。その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量３９ｋ、３１ｋ付近の主要なバンドが確認された。Ｎ末端アミノ酸配列の結果では、３９ｋ付近のバンドのＮ末端アミノ酸配列はＮＩＶＡ、３１ｋ付近のバンドはＶＧＶ、ＳＥＬＭＲ、ＮＲＡＩＴおよびＡＩＴＤＴＦの混合物であった。質量分析では多数のピークが観測されたが、その中に分子量３９０００、３１０００付近にピークが存在しており、以上の結果から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの３９ｋのバンドは配列番号１に示されるアミノ酸番号２３５〜５９３、３１ｋのバンドは３０７〜５９３、３１１〜５９３、３１６〜５９３および３１８〜５９３の混合物に対応することが判明した。従って、トランスペプチダーゼドメイン領域のＮ末端の候補としてアミノ酸番号２３５および３０７〜３１８付近、Ｃ末端の候補としてアミノ酸番号５９３付近が推定された。大腸菌ではアミノ酸配列の類似性から、トランスペプチダーゼドメイン領域のＮ末端の候補としてアミノ酸番号２１５付近、Ｃ末端の候補としてアミノ酸番号５６９付近を選択した。
【実施例５】
【００３２】
＜＜インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードする遺伝子の構築＞＞
インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００３３】
ＨＩ−ＰＢＰ３−２３５−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｇｇａａｔａｔｔｇｔｔｇｃａｃａｔａｔｃ−３’（配列番号３４）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２４２−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｔｃｃｇａｔｇａｇａａａａａａｔａｔｇａｔｇｃ−３’（配列番号３５）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２４９−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｃａｃａａｇａｔｇｔｔａｃｃｔｔａａｇｔａｔｃｇ−３’（配列番号３６）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｔｔａｃｃｔｔａａｇｔａｔｃｇａｔｇａａａａａｔｔｇｃ−３’（配列番号３７）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５９３−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｔｔｔｃｇｔｔｇｔｔｇｔｇｔｔｔｔｃａｇｃ−３’（配列番号３８）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５９７−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａａｃｇｔｔｔｔｇｃａｃｔｔｔｔｃｇｔｔｇ−３’（配列番号３９）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５８６−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇｃｔｔｃａｇｃａｔｃｔｔｇｃｇｇａａｔａｇ−３’（配列番号４０）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５８１−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｃｇｇａａｔａｇｃａｔｔｔｇｃａｃｇ−３’（配列番号４１）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５７６−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａａｃｇｔａａｃｇｃａｔａｇｃｃｃａｔａａｔｇｔｔａｇ−３’（配列番号４２）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２３５−５−２：５’−ｇｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇｇｇｇａａｔａｔｔｇｔｔｇｃａｃａｔａｔｃ−３’（配列番号４３）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５９３−３−２：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔｔｃｇｔｔｇｔｔｇｔｇｔｔｔｔｃａｇｃ−３’（配列番号４４）
ＨＩ−ＰＢＰ３−３０７−５：５’−ｇｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇｇｔｃｇｇｃｇｔｇａａａｔｃａｇａｇｔｔａ−３’（配列番号４５）
ＥＣ−ＰＢＰ３−２３２−５：５’−ｃａｔｇｃｔａｇｃｃｔｇｇｃｇｃｔｇａｇｔａｔｔｇａｔｇａａｃｇ−３’（配列番号４６）
ＥＣ−ＰＢＰ３−２１５−５：５’−ｃａｔｇｃｔａｇｃｇｇｔｃｇｃｇｔａａｔｔｇａａｇａｔａｔｔｔ−３’（配列番号４７）
ＥＣ−ＰＢＰ３−５６９−３：５’−ｇｔｔｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇｔｃａｇｃｇｃａｔｃｃｇｇｃｔｃ−３’（配列番号４８）
【００３４】
インフルエンザ菌Ｒｄ株ゲノムＤＮＡ、変異導入株ゲノムＤＮＡ、大腸菌菌体抽出液または既に作製したプラスミドＤＮＡを鋳型に、前記プライマーを適宜組み合わせて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。インフルエンザ菌変異導入株は、文献記載の方法により作製した（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４９（７）２８３４−２８３９（２００５）。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、これらの断片を予め制限酵素で切断したベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）またはｐＥＴ−３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）またはＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンまたは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、薬剤耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミドを調製した。組換えベクター名、発現部位、プライマー、ベクターおよび制限酵素の組み合わせは表１に示す。
【００３５】
【表１】
【実施例６】
【００３６】
＜＜インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの発現＞＞
実施例５で作製した組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を５０−１００μｇ／ｍＬのアンピシリンまたは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０７２Ｍ リン酸水素二カリウム、０．０２８Ｍ リン酸二水素カリウム）中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌した。菌体を菌体破砕バッファーに懸濁し、超音波処理を施し、細胞を破砕した。遠心分離によって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、配列番号１においてアミノ酸番号３０７のアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５９３のアミノ酸で終わる、配列番号４９に示される配列からなるインフルエンザ菌ＰＢＰ３は不溶性画分にのみタンパク質の発現が確認された。それ以外のタンパク質に関しては、一部分が不溶性画分へ発現しているものも認められたが、すべての組み合わせにおいて、可溶性画分へ発現していることが確かめられた。従って、トランスペプチダーゼドメインのＮ末端部位としては、配列番号１におけるアミノ酸番号３０７〜３１８は不適切であり、この領域はドメイン内でループ構造をとっていると推定された。組換えベクター、宿主、タグ、破砕バッファーの組み合わせは表２に示す。
【００３７】
【表２】
【実施例７】
【００３８】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに存在するループ構造を短縮化した改変タンパク質をコードする遺伝子の構築＞＞
ループ構造を短縮化した改変タンパク質をコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００３９】
ＨＩ−ＰＢＰ３−３０５−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−３：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇｔｔｇｔｔｔｇｇａｔｔａｔａａｇａｇｇｇｃｇｃａｇｔｃｇｃ−３’（配列番号２８）
ＨＩ−ＰＢＰ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−３１８−５：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇｇｔｇｃａａｔｔａｃｃｇａｔａｃｔｔｔｔｇａｇｃｃａｇｔｔ−３’（配列番号２９）
ＨＩ−ＰＢＰ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ２−３１８−５：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇｇｔｇｇｔｇｃａａｔｔａｃｃｇａｔａｃｔｔｔｔｇａｇｃｃａ−３’（配列番号３０）
ＨＩ−ＰＢＰ３−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ３−３１８−５：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃａａｔｔａｃｃｇａｔａｃｔｔｔｔｇａｇ−３’（配列番号３１）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２３５−５−２：５’−ｇｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇｇｇｇａａｔａｔｔｇｔｔｇｃａｃａｔａｔｃ−３’（配列番号４３）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５９３−３−２：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔｔｃｇｔｔｇｔｔｇｔｇｔｔｔｔｃａｇｃ−３’（配列番号４４）
ＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｔｔａｃｃｔｔａａｇｔａｔｃｇａｔｇａａａａａｔｔｇｃ−３’（配列番号３７）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５８６−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇｃｔｔｃａｇｃａｔｃｔｔｇｃｇｇａａｔａｇ−３’（配列番号４０）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５７６−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａａｃｇｔａａｃｇｃａｔａｇｃｃｃａｔａａｔｇｔｔａｇ−３’（配列番号４２）
【００４０】
実施例５に記載した組換えベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３を鋳型に、前記プライマーを適宜組み合わせて用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。増幅したＤＮＡ断片とプライマーの組み合わせを表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】
増幅したＤＮＡ断片１を制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＤＮＡ断片３をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化した。これらの断片を予めＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、カナマイシン耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５９３）を調製した。
【００４３】
次に、組換えベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５９３を鋳型に、プライマーＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５とＨＩ−ＰＢＰ３−５７６−３、またはＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５とＨＩ−ＰＢＰ３−５８６−３を組み合わせて用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施し、各々ＤＮＡ断片５および６を得た。増幅したＤＮＡ断片５および６を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。これらの断片を予めＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５７６およびｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５８６）を調製した。
【実施例８】
【００４４】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに存在するループ構造を短縮化した改変タンパク質の発現＞＞
実施例７で作製した組換えベクターを大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンまたは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０７２Ｍ リン酸水素二カリウム、０．０２８Ｍ リン酸二水素カリウム）中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌した。菌体を菌体破砕バッファーに懸濁し、超音波処理を施し、細胞を破砕した。遠心分離によって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、一部が不溶性画分へ発現しているものも認められたが、目的タンパク質のすべての組み合わせにおいて、可溶性画分へ発現していることが確かめられた。組換えベクター、宿主、タグ、破砕バッファーの組み合わせは表４に示す。
【００４５】
【表４】
【実施例９】
【００４６】
＜＜インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の発現＞＞
（１）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン改変タンパク質（アミノ酸配列番号２２）のセレノメチオニン置換体の発現
ＭＡＤ法によるＸ線結晶構造解析に使用する重原子誘導体結晶を作製するために、メチオニンの硫黄原子が重原子であるセレンに置換されたセレノメチオニン置換体の発現を試みた。実施例８で得られた形質転換体（大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−３０５−ＧＴＧＧ−３１８−５９３）を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、遠心分離機で集菌後、１００ｍｌのＬｅＭａｓｔｅｒ培地（組成は表５に示す）で懸濁し、再度、遠心分離機によって集菌し、ＬｅＭａｓｔｅｒ培地１００ｍｌに再懸濁した。この懸濁液を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地に接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で１０時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、超音波処理により細胞を破砕した。遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【００４７】
【表５】
【００４８】
（２）大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号２６）のセレノメチオニン置換体の発現
ＭＡＤ法によるＸ線結晶構造解析に使用する重原子誘導体結晶を作製するために、メチオニンの硫黄原子が重原子であるセレンに置換されたセレノメチオニン置換体の発現を試みた。実施例６で得られた形質転換体（大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＥＣ＿２１５−５６９）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、半量を遠心分離機で集菌後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬｅＭａｓｔｅｒ培地で懸濁し、再度、遠心分離機によって集菌し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬｅＭａｓｔｅｒ培地５０ｍｌに再懸濁した。この懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４．８ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地に２４ｍＬ接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、超音波処理により細胞を破砕した。遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例１０】
【００４９】
＜＜インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの精製＞＞
（１）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号２）の精製
（１−１）ニッケルカラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３の組換え大腸菌培養液（２Ｌ）から実施例６の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。アフィニティークロマトグラフィーカラムは、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量３０ｍｌのカラムを作製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ２―メルカプトエタノール）で平衡化した後、細胞抽出液を流速３ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ２―メルカプトエタノール溶液中の５−２５０ｍＭ イミダゾールの直線勾配（３カラム容量）で溶出した。主要なフラクションをまとめて回収した。
【００５０】
（１−２）疎水性相互作用カラムによる精製
上記（１−１）で得られたサンプルを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、３．５Ｍ 硫酸アンモニウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液と混合し、硫酸アンモニウムの終濃度が２Ｍになるように調製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、２Ｍ 硫酸アンモニウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化した疎水性相互作用カラムであるＲＥＳＯＵＲＣＥＰＨＥ ６ｍｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に、流速５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライした。３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の２−０Ｍ 硫酸アンモニウムの直線勾配（１５０ｍＬ）で溶出し、主要な画分をまとめた。
【００５１】
（１−３）ゲルろ過カラムによる精製
上記（１−２）で得られたサンプルを限外ろ過膜を用いて濃縮し、ゲルろ過バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。主要な画分を各々まとめ、終濃度５００ｍＭまたは１００ｍＭ 塩化ナトリウムの両方の条件下でタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで限外ろ過膜を用いて濃縮した。その結果、いずれの塩濃度下においても沈殿は生じなかった。また、ＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液と混合した後（終濃度１０μＭ）、３７℃で２０分間反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。励起波長４７３ｎｍのレーザーを照射し、波長５２０ｎｍ以上の蛍光を検出した結果、精製したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインはＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬとの結合能を保持していることが確かめられた。
【００５２】
（２）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号３〜５、８および９）の精製
（２−１）ニッケルカラムによる精製
以下の精製は４℃で行った。Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９７、Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２４２−５９７、Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２４２−５９３、Ｂ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２４９−５９７およびＢ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ｂ（＋）＿ＨＩ＿２４９−５９３の組換え大腸菌培養液（４００ｍＬ）から実施例６の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にマニュアル記載の方法でニッケルを結合させた後、平衡化バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．４、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ イミダゾール）で平衡化した。そこへ細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、流速４ｍＬ／ｍｉｎで５カラム容量の平衡化バッファーにより洗浄した後、２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．４、５００ｍＭ 塩化ナトリウム溶液中の２０ｍＭ−５００ｍＭ イミダゾールの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００５３】
（２−２）Ｈｉｓ−ｔａｇの除去
上記（２−１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した後、終濃度８ｕｎｉｔ／ｍＬのトロンビン（シグマ社製）を添加し、８℃で一晩反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。次に、終濃度２０ｍＭとなるようにイミダゾールを添加し、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）担体を加えた。４℃で一時間混合した後、遠心分離により上清を回収した。
【００５４】
（２−３）ブルーカラムによる精製
上記（２−２）で得られたサンプルをＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめた。
【００５５】
（２−４）陽イオン交換カラムによる精製
上記（２−３）で得られたサンプルをＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。サンプルを平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した。平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速４ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の５０−５００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な画分をまとめ、保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて、終濃度２００ｍＭ 塩化ナトリウムの条件下でタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。濃縮したサンプルをＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液と混合した後（終濃度１０μＭ）、室温で２０分間反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。励起波長４７３ｎｍのレーザーを照射し、波長５２０ｎｍ以上の蛍光を検出した結果、精製したサンプルはＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬとの結合能を保持していることが確かめられた。
【００５６】
（３）インフルエンザ菌ＰＢＰ３点変異体トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号１５、１６および１９）の精製
（３−１）ニッケルカラムによる精製
以下の精製は４℃で行った。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３（Ｍ３７７Ｉ， Ｓ３８５Ｔ， Ｒ５１７Ｈ）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３（Ｓ３８５Ｔ， Ｎ５２６Ｋ）およびＢ８３４（ＤＥ３）／ｐＥＴ−３０ａ（＋）＿ＨＩ＿２３５−５９３（Ｍ３７７Ｉ， Ｓ３８５Ｔ， Ｌ３８９Ｆ， Ｎ５２６Ｋ）の組換え大腸菌培養液（４００ｍＬ）から実施例６の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にマニュアル記載の方法でニッケルを結合させた後、平衡化バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．４、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ イミダゾール）で平衡化した。そこへ細胞抽出液を流速２ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、流速４ｍＬ／ｍｉｎで５カラム容量の平衡化バッファーにより洗浄した後、２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．４、５００ｍＭ 塩化ナトリウム溶液中の２０ｍＭ−５００ｍＭ イミダゾールの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し、主要なフラクションをまとめて回収した。
【００５７】
（３―２）ブルーカラムによる精製
上記（３−１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめ、保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて、終濃度２００ｍＭ 塩化ナトリウムの条件下でタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【００５８】
（４）インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに存在するループ構造を短縮化した改変タンパク質（アミノ酸配列番号２２）のセレノメチオニン置換体の精製
（４−１）ニッケルカラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例９（１）の方法で得られた細胞抽出液をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。アフィニティークロマトグラフィーカラムは、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量３０ｍｌのカラムを作製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ２―メルカプトエタノール、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ）で平衡化した後、細胞抽出液を流速３ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、平衡化バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５００ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ ２―メルカプトエタノール、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ）で溶出した。
【００５９】
（４−２）疎水性相互作用カラムによる精製
上記（４−１）で得られたサンプルを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、３．５Ｍ 硫酸アンモニウム５ｍＭ ジチオスレイトール溶液と混合し、硫酸アンモニウムの終濃度が約１．５Ｍになるように調製した。調製したサンプルを平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、２Ｍ 硫酸アンモニウム、５ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化した疎水性相互作用カラムであるＲＥＳＯＵＲＣＥＰＨＥ ６ｍｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に、流速５ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の２−０Ｍ 硫酸アンモニウムの直線勾配（１５０ｍＬ）で溶出し、主要な画分をまとめた。
【００６０】
（４−３）ゲルろ過カラムによる精製
上記（４−２）で得られたサンプルを限外ろ過膜で濃縮し、ゲルろ過バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、主要な画分をまとめた。
【００６１】
（４−４）陽イオン交換カラムによる精製
上記（４−３）で得られたサンプルをＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。サンプルを平衡化バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ジチオスレイトール）に対して透析した。平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速２ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、流速３ｍＬ／ｍｉｎで３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の５０−５００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（７５ｍＬ）で溶出した。溶出画分をＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬ（蛍光標識ベンジルペニシリン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液と混合した後（終濃度１０μＭ）、３７℃で２０分間反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。励起波長４７３ｎｍのレーザーを照射し、波長５２０ｎｍ以上の蛍光を検出した結果、精製したサンプルはＢＯＣＩＬＬＩＮ ＦＬとの結合能を保持していることが確かめられた。限外ろ過膜を用いて、終濃度５０ｍＭ 塩化ナトリウムの条件下でタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【００６２】
（５）大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号２６）のセレノメチオニン置換体の精製
（５−１）陰イオン交換カラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例９（２）の方法で得られた細胞抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量１１４ｍＬのカラムを作製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）で平衡化した後、流速２．５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、流速５ｍＬ／ｍｉｎで約２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液中の０−１Ｍ 塩化ナトリウムの直線勾配（７２０ｍＬ）で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要なフラクションをまとめて回収した。
【００６３】
（５−２）ブルーカラムによる精製
上記（５−１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ １ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。精製はサンプルを９回に分けて実施した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液中の０−２Ｍ 塩化ナトリウムの直線勾配（１７．５カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００６４】
（５−３）ゲルろ過カラムによる精製
上記（５−２）で得られたサンプルを保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸 ｐＨ ７．９、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。精製は２回に分けて実施した。主要な画分をまとめ、保持分子量１００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いて、バッファー置換および濃縮し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸 ｐＨ ７．９、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール条件下、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬに調製した。
【実施例１１】
【００６５】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの還元ジメチル化＞＞
実施例１０（４）で精製したインフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン（アミノ酸配列番号２２）のセレノメチオニン置換体のリジン残基を文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０００， ２７５（２）， ５４９−５５２）記載の方法に従い還元ジメチル化した。得られたサンプルを陽イオン交換カラムであるＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の５０−５２５ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（２０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、主要な溶出画分をまとめ、塩化ナトリウムの終濃度が０．２Ｍになるように調製し、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬになるように濃縮した。エレクトロスプレイイオン化法による質量分析装置により解析したところ、分子量３９７９８に主要なピークが確認されたことから、今回の還元ジメチル化タンパク質は、計算値で３９８０７の分子量を示す、リジン残基２３個とＮ末端の合計２４箇所のジメチル化修飾候補部位において２２箇所がジメチル化されたと考えられた。
【実施例１２】
【００６６】
＜＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３可溶性部分、インフルエンザ菌および大腸菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶化スクリーニング＞＞
実施例３、１０および１１で調製したサンプルは、シッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化スクリーニングを実施した。タンパク質溶液０．５μＬと結晶化剤０．５μＬを混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として結晶化剤５０−１００μＬを分注した後、密閉したプレートを４℃〜２０℃の恒温槽内に静置した。結晶化剤としてはキアゲン社等から市販されている試薬を利用した。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは新規なタンパク質であり、阻害剤の効率的な設計等に有効な結晶構造情報取得に利用できる良質の結晶の製造に利用できるため、産業上極めて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記からなる群より選択される、トランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１において少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列のアミノ酸番号２２５〜２６２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる相同タンパク質。
（ｃ）配列番号１において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列のアミノ酸番号２２５〜２６２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる改変タンパク質。
【請求項２】
配列番号１においてアミノ酸番号３０１〜３０８に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号３１５〜３２２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドをグリシン、スレオニン、グリシン、グリシンである４残基のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号１においてアミノ酸番号２３５、２４２、２４９、２５２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７６、５８１、５８６、５９３、５９７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
配列番号２〜２４からなる群より選択される配列からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
下記からなる群より選択される、トランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号２５のアミノ酸番号２０５〜２４２のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２５において少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列のアミノ酸番号２０５〜２４２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる相同タンパク質。
（ｃ）配列番号２５において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列のアミノ酸番号２０５〜２４２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる改変タンパク質。
【請求項８】
配列番号２５においてアミノ酸番号２１５、２３２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で始まり、アミノ酸番号５６９のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなる、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号２６および２７からなる群より選択される配列からなる、請求項７または８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されているタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質中の少なくとも１つのリジン残基が還元ジメチル化されているタンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４記載の宿主細胞を培養する工程、および該培養によって得られる宿主細胞もしくはその培養物から請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含むタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３に結合する化合物の検定方法において、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質を化合物と接触させ、ついで上記化合物がＰＢＰ３に結合するかどうかを検出することからなる方法。
【請求項１７】
インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインの結晶を製造する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する工程と、製造したタンパク質と結晶化剤とを接触させ、インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインの結晶を析出させる工程とを少なくとも含んでなる、方法。
【請求項１８】
配列番号２８〜３１のいずれか一つの配列を有することを特徴とするプライマー。
【請求項１９】
インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのタンパク質に存在する揺らぎの大きいループ構造を短縮化した改変タンパク質を製造する方法であって、請求項１８記載のプライマーを遺伝子増幅反応法に利用する工程を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する方法。
【請求項１】
下記からなる群より選択される、トランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１において少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列のアミノ酸番号２２５〜２６２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる相同タンパク質。
（ｃ）配列番号１において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列のアミノ酸番号２２５〜２６２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる改変タンパク質。
【請求項２】
配列番号１においてアミノ酸番号３０１〜３０８に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号３１５〜３２２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドを３〜５残基の任意のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号１においてアミノ酸番号３０６〜３１７に相当する配列からなるポリペプチドをグリシン、スレオニン、グリシン、グリシンである４残基のアミノ酸からなるポリペプチドに置換していることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号１においてアミノ酸番号２３５、２４２、２４９、２５２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７６、５８１、５８６、５９３、５９７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
配列番号２〜２４からなる群より選択される配列からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
下記からなる群より選択される、トランスペプチダーゼ活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号２５のアミノ酸番号２０５〜２４２のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２５において少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列のアミノ酸番号２０５〜２４２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる相同タンパク質。
（ｃ）配列番号２５において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列のアミノ酸番号２０５〜２４２に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５５９〜５７９に相当するアミノ酸番号のいずれか一つのアミノ酸で終わる配列からなる改変タンパク質。
【請求項８】
配列番号２５においてアミノ酸番号２１５、２３２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で始まり、アミノ酸番号５６９のアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなる、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号２６および２７からなる群より選択される配列からなる、請求項７または８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されているタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質中の少なくとも１つのリジン残基が還元ジメチル化されているタンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４記載の宿主細胞を培養する工程、および該培養によって得られる宿主細胞もしくはその培養物から請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含むタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３に結合する化合物の検定方法において、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質を化合物と接触させ、ついで上記化合物がＰＢＰ３に結合するかどうかを検出することからなる方法。
【請求項１７】
インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインの結晶を製造する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する工程と、製造したタンパク質と結晶化剤とを接触させ、インフルエンザ菌または大腸菌ＰＢＰ３のトランスペプチダーゼドメインの結晶を析出させる工程とを少なくとも含んでなる、方法。
【請求項１８】
配列番号２８〜３１のいずれか一つの配列を有することを特徴とするプライマー。
【請求項１９】
インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのタンパク質に存在する揺らぎの大きいループ構造を短縮化した改変タンパク質を製造する方法であって、請求項１８記載のプライマーを遺伝子増幅反応法に利用する工程を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する方法。
【公開番号】特開２００８−２２０３１７（Ｐ２００８−２２０３１７Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６６０３７（Ｐ２００７−６６０３７）
【出願日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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